CN1793329A - 一种普鲁兰酶产生菌及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种普鲁兰酶产生菌及制备方法。菌种分类命名为脂环酸芽孢杆菌Alieycloeacillus，其保藏登记号为：CGMCC No.1504。本发明分离得到的菌株D－1，经鉴定为脂环酸芽孢杆菌属的一个新种，其所产普鲁兰酶在pH3.5－4.5之间，极为稳定，当pH高于5.0和低于3.0，酶活开始迅速失活。当pH4.0时，酶液在60℃放置24hr后，残余酶活力为88％，最适温度为60℃，在温度55℃－65℃的范围内，酶活性变化不大，酶反应不需要金属离子的参与，说明此酶适合应用于淀粉加工的糖化阶段。相比较而言，比已报道的酸性普鲁兰酶有更好的耐热特性和pH稳定性。

Description

一种普鲁兰酶产生菌及制备方法

技术领域

本发明涉及一种普鲁兰酶产生菌及制备方法。

背景技术

普鲁兰酶(Pullululanase，EC.3.2.1.41)是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1，6糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成直链淀粉的脱枝酶。它在淀粉加工工业中有着非常重要的用途。普鲁兰酶与糖化酶并用时，在降低糖化酶用量一半以上的同时，可使DE值高达98％，从而大大提高葡萄糖的收率；应用于酒精工业中，大大提高淀粉的转化率，降低生产成本。当它与β-淀粉酶混合使用时，几乎可以全部将淀粉转化为麦芽糖，从而可以生产出80％以上的超高麦芽糖浆，在α-糖苷酶的作用下，超高麦芽糖浆转化为功能性异麦芽低聚糖。可用于糖尿病人、肥胖病人以及儿童糖果中使用，防止龋齿。在啤酒生产中添加普鲁兰酶可有效地提高麦汁中可发酵性糖含量。提高糖的利用率和缩短糖化时间。酿造出优级干啤酒。另外还可以采用普鲁兰酶生产直链淀粉，利用直链淀粉生产可生物降解的薄膜。由于普鲁兰酶在酒精、食品、环保产业上极其重要的用途，它将和淀粉酶和糖化酶一样成为一个与国民经济发展相关的重大产业。

70年代全酶法水解淀粉成葡萄糖的生产发展很快，全世界葡萄糖浆的年产量约为300万吨。在当时的生产中，葡萄糖的最高转化率约为96％，是全酶法生产工艺的一个极限数值。这是因为糖化酶对淀粉中的a-1，6-糖苷键作用力较弱，从而影响淀粉的最终水解度。降低淀粉浆浓度或者增加糖化酶的用量，在理论上可以突破这个极限，但前者大大增加生产负荷，提高了成本，后者能诱发葡萄糖的聚合反应，生产异麦芽糖等，影响最终收率。一种有效的改进方法是在糖化时加入淀粉脱枝酶，提高a-16-糖苷键的水解速度，降低糖化酶的用量，在得到最高转化的同时又最大限度地避免发生聚合反应。在降低糖化酶用量的同时，可使DE值高达98％。大大提高葡萄糖的收率。因此掀起了开发普鲁兰酶的高潮。自1961年至1979年，已经发现几十种微生物能够产生脱枝酶，但都未应用工业生产，主要原因有下列几个方面：一是耐热性差，一般最适温度在50℃左右，60℃很快失活；二是耐酸性差，pH低于5极不稳定；三是酶活力低，成本过高。直到1983年丹麦Novo公司成功分离出一株产普鲁兰酶的杆菌(B.acidopullulyticus)。经诱变育种后，能产生每毫升10个单位的普鲁兰酶。其所产生的普鲁兰酶最适pH5.0左右，pH4.0和pH6.0时酶活降至50％以下，pH3.3时酶活接近0；最适作用温度为60℃，45℃和68℃时活力为60℃的二分之一，耐热性能不是太好，但能配合糖化酶使用。该公司将这一酶制剂产业化，商品名为Promozyme，是目前国际上唯一商品化的普鲁兰酶，目前这一产品占领了中国乃至世界的95％以上市场份额。其价格相当昂贵，每升每毫升400单位的普鲁兰酶为165元。上世纪90年代，Deweer发现了普鲁兰酶产生菌Bacillus naganoensis；Tomimura筛选出Bacillus deramiificans。这两株菌所产的普鲁兰酶的酶学性质与Bacillus.Acidopullulyticus的酶学性质相似。迄今为止，国内外所报道的产耐酸耐热普鲁兰酶菌株就只有以上三株菌，但是它们有一个共同的不足之处，当温度超过65℃，或者pH值低于3.6，酶很快失活。

发明内容

本发明的目的是提供一种产普鲁兰酶的菌株，酶极为稳定，性能较好；本发明还提供该菌种和用该菌种生产普鲁兰酶的制备方法。

本发明是从腾冲酸性温泉中分离得到一株产普鲁兰酶的菌株，分类命名为脂环酸芽孢杆菌(Alicycloeacillus)，其保藏登记号为：CGMCC No.1504。其所产酶最适pH为3.8～4.4，最适温度为60℃左右，酶在pH3.5-4.5之间，60-65℃之间时，酶极为稳定。

本发明的菌株的分离方法是：采集腾冲温泉的水样及温泉周围的土样，在实验过程中称取土样5g至45ml生理盐水中，加入玻璃珠充分震荡后静置1小时。取土样上清液100μl于试管中，做梯度稀释，取适宜稀释度涂板，于电热恒温培养箱中50℃培养48hr。在分离平板中滴加浓度为1％的碘液适量，挑取有蓝色透明圈者，划线分离纯化，50℃培养24小时，然后把有蓝色透明圈的菌株转入鉴别培养基，于温箱中培养48小时后，把在红色普鲁兰板上能产生白色分解圈的菌株挑选出继续纯化两次。所用分离培养基：(1000ml)支链淀粉10.0g，酵母膏5.0g，KH₂PO4 3.0g，MgSO₄·7H2O 0.1g，CaCl₂0.025g，(NH₄)₂SO₄ 1.0g，pH 3.8；鉴别培养基：(1000ml)糯米淀粉10.0g，酵母膏5.0g，KH₂PO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，琼脂25.0g，red-pullulan 0.5g，pH 5.0，分离得到产普鲁兰酶菌株D-1。本菌株的16S rRNA基因为：＞D-1GCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGTGCGGACATCTTCGGATGTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCTTTCAGACCGGAATAACACTCGGAAACGGGTGCTAATGCCGGATAGGTCACGAGGAGGCATCTTCTTGTGAGGAAAGCTGCAAATGCAGCGCTGGAAGAGGAGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGCGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCTCTGTTGCTCGGGGAGAGCGATAAGGAGAGTGGAAAGCTCCTTAGGAGACGGTACCGAGTGAGGAAGCCCCGGCAAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATCACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGCGGTTGTGTAAGTCTGGAGTGAAAGTCCATGGCTCAACCATGGGATGGCTTTGGAAACTGCATGACTTGAGTGCTGGAGAGGCAAGGGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATGTGGAGGAATACCAGTGGCGAAGGCGCCTTGCTGGACAGTGACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGGGGGATACACCTCAGTGCCGAAGGAAACCCAATAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGGCTTGACATCCCTCTGACGGGTGCAGAGATGTACCTTCCCTTCGGGGCAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGACCTGTGTTACCAGCACGTAGAGGTGGGGACTCACAGGTGACTGCCGGCGTAAGTCGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCTTTATGTCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCGGTACAACGGGAAGCGAAGCCGCGAGGTGGAGCCAAACCCAGAAAGCCGTTCGTAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATCCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTCGGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCCGCAAGGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGGCGGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGT。

菌株的鉴定：根据形态特征、培养特征，生理生化测定，细胞化学组分分析，16SrDNA序列相似性比对，基因组DNA G+C mol％和DNA-DNA同源性测定等相结合的多相分类技术进行系统的分类研究。

菌株D-1为革兰氏阳性芽孢杆菌，长为2.0～3.5μm，宽为0.4～0.7μm，具有中生膨胀芽孢。在BAM培养基中生长48hr后，菌落大小为1～2mm，不产色素，生长温度范围是30～60℃，最适温度为45～50℃，生长pH是2.5～6.0，最适pH为4.0～4.5，能水解淀粉，2％的NaCl中生长，形成吲哚、硝酸盐还原、甲基红实验结果为阳性，接触酶实验、硫化氢实验、V.P实验、柠檬酸盐及丙酸盐利用、亚硝酸盐还原、苯丙氨酸脱氨酶、明胶水解、酪素水解结果为阴性，在无氧条件下生长不发生。

D-1的基因组DNA G+C mol％值都为48.6，而且与参照菌株的之间的G+C含量差别都比较大。脂肪酸与已知的环酸芽孢杆菌不同，18∶1ω7c含量最高，达70.96％，不具有脂环酸。主要的醌是MK-7。

D-1和其参照菌株A.hesperidensis DSM 12489^T菌株，A.acidiphilus DSM14558^T，A.acidoterrestris ATCC 49025^T的16S rRNA序列相似性为99.5％、97％、96.6％，但菌株间的基因组DNA-DNA杂交值分别为40.1％、35％、31％，低于70％这一基因种的区分界限。所以结合这四株菌的菌落特征、生理生化特性、化学分类特征、基因组G+C mol％、DNA-DNA同源性分析等方面的区别性特征，确定菌株D-1位脂环酸芽孢杆菌属的一个新种，命名为Alicyclobacillus.tengchongensis。

菌株的发酵：

将种子培养液倒入装有25ml发酵培养基的三角瓶中，置于回转式恒温调速摇瓶柜中进行好氧发酵，转速为200转/分，37℃或50℃发酵3天。发酵液离心，取上清液，置于4℃保存。所用发酵培养基：(1000ml)支链淀粉5.0g，酵母膏5.0g，KH₂PO4 3.0g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，CaCl₂ 0.025g，(NH₄)₂SO₄1.0g，pH 3.8。

酶活测定方法和粗酶酶学性质

(1)酶活测定方法

①原理：普鲁兰酶在一定条件下，催化水解普鲁兰糖生成葡萄糖等还原糖，3，5-二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原为显棕红色的氨基络合物，在一定范围内其颜色的深浅与还原糖的量成正比故可以在550nm的波长下进行比色，计算酶活力。

②酶反应体系：1mL稀释后发酵液，1mL溶于pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲液中的0.5％普鲁兰糖溶液，60℃反应30min，生成还原糖采用3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)测定。

③葡萄糖标准曲线的绘制：分别吸取0.1％标准葡萄糖液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4mL，依次加入到刻度试管中，用蒸馏水补加至2.0mL，配制成每毫升分别含有葡萄糖100，200，300，400，500，600，700μg的标准液。各加入DNS试剂3mL，于沸水浴中沸腾7分钟(样品放入重新沸腾时算起)，取出后立即加入蒸馏水10mL混匀，冷却后，在分光光度计550nm比色测定，用空白管溶液调零点，记录光密度值。以所得的光密度OD₅₅₀值为纵坐标，以对应的标准葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

空白的制作：以0.5mL蒸馏水代替0.5mL标准葡萄糖液，以下操作步骤同标准曲线制作。

表1  葡萄糖标准曲线的绘制

	葡萄糖浓度(μg/mL)	OD550(平均值)
			空白1234567	0100200300400500600700	00.175±0.0030.433±0.0030.666±0.0020.921±0.0061.148±0.0061.377±0.0061.592±0.001

④测定步骤：1mL适当稀释后发酵液加1mL0.5％的普鲁兰糖溶液于试管中，60℃保温30min，立即加入DNS试剂3mL，在沸水中煮沸7min，冷却后加蒸馏水10mL混匀，以煮沸5min的灭活酶液加1mL0.5％的普鲁兰糖反应30min作对照，按制作标准曲线时同样的操作测定光密度值(OD₅₅₀)。

酶活计算公式：

酶活(U/ml)＝((ΔOD₅₅₀+0.0257)/(0.0023*30*180))*2m

式中：ΔOD₅₅₀：酶反应后样品测定与空白实验光密度值之差；180：葡萄糖的分子量；30：酶反应时间；2：反应总体积；m：发酵液稀释倍数。

酶活定义：在上述条件下，每min产生相当于1μmol葡萄糖还原力的酶活力为一个酶活单位。

(2)粗酶酶学性质(见附图)

本发明分离得到的菌株D-1，经鉴定为脂环酸芽孢杆菌属的一个新种，其所产普鲁兰酶在pH3.5-4.5之间，极为稳定，当pH高于5.0和低于3.0，酶活开始迅速失活。当pH4.0时，酶液在60℃放置24hr后，残余酶活力为88％，最适温度为60℃，在温度55℃-65℃的范围内，酶活性变化不大，酶反应不需要金属离子的参与，说明此酶适合应用于淀粉加工的糖化阶段。相比较而言，比已报道的酸性普鲁兰酶有更好的耐热特性和pH稳定性。

附图说明

图1是本发明的葡萄糖浓度标准曲线。

图2是本发明的菌种所产粗普鲁兰酶的最适温度曲线。

图3是本发明的菌种所产粗普鲁兰酶的最适pH曲线。

图4是本发明的菌种所产粗普鲁兰酶的温度稳定性曲线。

图5是pH对酶稳定性的影响。

本发明的微生物保藏日期为2005年10月23日，保藏单位简称CGMCC，保藏编号：CGMCC No.1504。

具体实施方式

实施例：

1、菌株的分离：

采集云南腾冲温泉的水样及温泉周围的土样，在实验过程中称取土样5g至45ml生理盐水中，加入玻璃珠充分震荡后静置1小时。取土样上清液100μl于试管中，做梯度稀释，取适宜稀释度涂板，于电热恒温培养箱中50℃培养48hr。在分离平板中滴加浓度为1％的碘液适量，挑取有蓝色透明圈者，划线分离纯化，50℃培养24小时，然后把有蓝色透明圈的菌株转入鉴别培养基，于温箱中培养48小时后，把在红色普鲁兰板上能产生白色分解圈的菌株挑选出继续用平板划线的方法纯化两次。所用分离培养基：(1000ml)由支链淀粉10.0g，酵母膏5.0g，KH₂PO₄ 3.0g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，CaCl₂ 0.025g，(NH₄)₂SO₄ 1.0g组成，pH 3.8；鉴别培养基：(1000ml)由糯米淀粉10.0g，酵母膏5.0g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，琼脂25.0g，red-pullulan 0.5g组成，pH 5.0，分离得到产普鲁兰酶菌株D-1。

2、菌株的鉴定：

菌株D-1为革兰氏阳性芽孢杆菌，长为2.0～3.5μm，宽为0.4～0.7μm，具有中生膨胀芽孢。在BAM培养基中生长48hr后，菌落大小为1～2mm，不产色素，生长温度范围是30～60，最适温度为45～50℃，生长pH是2.5～6.0，最适pH为4.0～4.5，能水解淀粉，2％的NaCl中生长，形成吲哚、硝酸盐还原、甲基红实验结果为阳性，接触酶实验、硫化氢实验、V.P实验、柠檬酸盐及丙酸盐利用、亚硝酸盐还原、苯丙氨酸脱氨酶、明胶水解、酪素水解结果为阴性，在无氧条件下生长不发生。

D-1的基因组DNA G+C mol％值都为48.6，而且与参照菌株之间的G+C含量差别都比较大。脂肪酸与已知的环酸芽孢杆菌不同，18∶1ω7c含量最高，达70.96％，不具有脂环酸。主要的醌是MK-7。

D-1和其参照菌株A.hesperidensis DSM 12489^T菌株，A.acidiphilus DSM14558^T，A.acidoterrestris ATCC 49025^T的16S rRNA序列相似性为99.5％、97％、96.6％，但菌株间的基因组DNA-DNA杂交值分别为40.1％、35％、31％，低于70％这一基因种的区分界限。所以结合这四株菌的菌落特征、生理生化特性、化学分类特征、基因组G+C mol％、DNA-DNA同源性分析等方面的区别性特征，确定菌株D-1位脂环酸芽孢杆菌属的一个新种，命名为Alicyclobacillus.tengchongensis。

3、菌株的发酵：

将种子培养液倒入装有25ml发酵培养基的三角瓶中，置于回转式恒温调速摇瓶柜中进行好氧发酵，诱导产酶。转速为200转/分，37℃或50℃发酵3天。发酵液离心，取上清液，置于4℃保存。所用发酵培养基：(1000ml)由支链淀粉5.0g，酵母膏5.0g，KH₂PO₄ 3.0g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，CaCl₂ 0.025g，(NH₄)₂SO₄1.0g组成，pH 3.8。

Claims (2)

1、一种普鲁兰酶产生菌，其分类命名为脂环酸芽孢杆菌Alicycloeacillus，其保藏登记号为：CGMCC No.1504。

2、根据权利要求1所述的普鲁兰酶产生菌，其特征在于本菌株的16SrRNA基因为：

＞D-1

GCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGTGCGGACATCTTCGGATGTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAA

CACGTGGGCAATCTGCCTTTCAGACCGGAATAACACTCGGAAACGGGTGCTAATGCCGGATAGGTC

ACGAGGAGGCATCTTCTTGTGAGGAAAGCTGCAAATGCAGCGCTGGAAGAGGAGCCCGCGGCGCAT

TAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGG

CCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATG

GGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGCGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCTCTGTTGC

TCGGGGAGAGCGATAAGGAGAGTGGAAAGCTCCTTAGGAGACGGTACCGAGTGAGGAAGCCCCGGC

AAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATCACTGGGCGTAA

AGCGTGCGTAGGCGGTTGTGTAAGTCTGGAGTGAAAGTCCATGGCTCAACCATGGGATGGCTTTGG

AAACTGCATGACTTGAGTGCTGGAGAGGCAAGGGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAT

ATGTGGAGGAATACCAGTGGCGAAGGCGCCTTGCTGGACAGTGACTGACGCTGAGGCACGAAAGCG

TGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGG

GGGATACACCTCAGTGCCGAAGGAAACCCAATAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACT

GAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACG

CGAAGAACCTTACCAGGGCTTGACATCCCTCTGACGGGTGCAGAGATGTACCTTCCCTTCGGGGCA

GAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAC

GAGCGCAACCCTTGACCTGTGTTACCAGCACGTAGAGGTGGGGACTCACAGGTGACTGCCGGCGTA

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ACAATGGGCGGTACAACGGGAAGCGAAGCCGCGAGGTGGAGCCAAACCCAGAAAGCCGTTCGTAGT

TCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCC

GCGGTGAATCCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTCGGCAACACCCGA

AGTCGGTGAGGTAACCCGCAAGGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGGCGGATGATTGGGGTGAAGTCG

TAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGT。

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