CN107082801A - 一种提高蛋白分泌效率的pelB信号肽突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高蛋白分泌效率的pelB信号肽突变体及其应用，属于基因工程技术领域。本发明的pelB突变型分泌型表达信号肽序列如SEQ ID NO,1所示，该信号肽能够使目的蛋白环糊精葡萄糖基转移酶的胞外酶活提升了1.6倍，采用该信号肽改造后重组大肠杆菌胞外产蛋白能力有所增强，更有利于工业化生产。

Description

一种提高蛋白分泌效率的pelB信号肽突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种提高蛋白分泌效率的pelB信号肽突变体及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGT酶)的应用范围较广，主要用于催化生产环糊精。环糊精葡萄糖基转移酶可通过环化作用将淀粉转化生成环糊精。除了催化生产环糊精，环糊精葡萄糖基转移酶还具有其他作用。例如，环糊精葡萄糖基转移酶作为保鲜剂用在面包烘焙中，可以延长食品的保质期。另外，环糊精葡萄糖基转移酶可用来催化将一个或多个糖基转移到碳水化合物上，来改善其特性(如提高溶解性，稳定性，降低细胞毒性，苦味等)。

环糊精葡萄糖基转移酶经常通过在合适的宿主细胞中异源表达来提高其产量。但是通过简单的异源表达提高环糊精葡萄糖基转移酶的产量非常有限，往往需要通过分子改造进一步增强其异源表达量。pelB信号肽已被用于提高环糊精葡萄糖基转移酶的分泌表达量，然而该信号肽的提高能力仍然有限。因此，对该信号肽的结构或分泌效率进行进一步改进，对于环糊精葡萄糖基转移酶高效表达具有重要的指导意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种信号肽突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述信号肽突变体的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述信号肽突变体是在SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的基础上，将第9～21位的十三个核苷酸CCTGCTGCCGACC突变为TGTATGTATTACA。

本发明的第三个目的是提供一种携带所述信号肽突变体的载体或细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述载体包括pET-20b(+)或pET-28a(+)。

本发明的第四个目的是提供一种基因工程菌，是以pET-20b(+)为载体，以大肠杆菌为宿主，表达连接有SEQ ID NO.1所示信号肽的CGT酶。

在本发明的一种实施方式中，所述CGT酶的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述CGT酶的5’端克隆了SEQ ID NO.2所示编码pelB信号肽突变体的核苷酸序列。

本发明的第五个目的是提供构建所述基因工程菌的方法，所述方法以pET-20b(+)为载体，以大肠杆菌为宿主，表达连接有SEQ ID NO.1所示信号肽的CGT酶。

在本发明的一种实施方式中，所述构建方法包括如下步骤：

(1)以Geobacillus stearothermophilus str.NO.2菌株的基因组为模板，采用序列如SEQ ID NO.5所示的F1primer、序列如SEQ ID NO.6所示的R1primer为引物，用PCR扩增环糊精葡萄糖基转移酶的基因，将得到的SEQ ID NO.4所示的环糊精葡萄糖基转移酶的基因序列连接到pET-20b(+)的信号肽下游，得到重组质粒pET-20b(+)-CGT；

(2)将pET-20b(+)-CGT载体上第9～21位的核苷酸CCTGCTGCCGACC利用密码子的简并性设计为十三个简并碱基，突变成：TGTATGTATTACA，得到重组质粒pET-20b(+)-DB1-CGT(以及pET-20b(+)-DB2-CGT，突变后的序列为TGCCCTGTCCGCT)；

(3)将重组质粒转化到大肠宿主菌中，得到分泌表达环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌CGTaseBL21(DE3)。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coliJM109、E.coli DH5α、E.coli TOP10中的任意一种。

在本发明的一种实施方式中，所述的大肠杆菌为Escherichia coli BL21(DE3)。

本发明的第六个目的在于提供一种环糊精葡萄糖基转移酶的生产方法，所述方法是将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，发酵至OD₆₀₀为0.6～0.8，加入IPTG，诱导3～5d。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导是培养温度为25℃～30℃，摇床转速200～220r/min，当菌体培养至OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入0.1～0.25mM IPTG诱导85～100h。

本发明还提供所述信号肽突变体在制备蛋白质或含蛋白质的产品中的应用。

有益效果：1、本发明提供一种将pelB信号肽上自起始密码子(ATG)起，下游第9～21位(ATG分别为第1～3位)的十三个氨基酸CCTGCTGCCGACC利用密码子的简并性进行优化而得到的信号肽，该信号肽能顺利将蛋白质跨膜转运至胞外；2、利用本发明提供的信号肽分泌表达环糊精葡萄糖基转移酶，发酵液中环糊精葡萄糖基转移酶的浓度为6.75g/L,酶活为179U/ml，相比含有DB2序列的突变型信号肽更高效地分泌蛋白。

附图说明

图1为构建重组pET-20b(+)-DB1-CGT质粒图谱。

图2为环糊精葡萄糖基转移酶基因PCR琼脂糖电泳图；M，Marker，泳道2：pelB，对应重组大肠杆菌pET-20b(+)-CGT；泳道3：DB1，对应pET-20b(+)-DB1-CGT；泳道4：DB2，对应pET-20b(+)-DB2-CGT；

图3为含有不同信号肽的环糊精葡萄糖基转移酶菌株分泌表达发酵液上清蛋白电泳图；泳道1，融合pelB信号肽的原始菌株；泳道2：Marker；泳道3：融合DB1信号肽的重组大肠杆菌，泳道4：融合DB2信号肽的重组大肠杆菌。

图4为发酵液中环糊精葡萄糖基转移酶的浓度及酶活；1为融合原始pelB信号肽；2，融合信号肽DB2；3，融合信号肽DB1。

具体实施方式

歧化活力测定方法参考van der Veen BA等的方法并做了部分改动。取600μL含有终浓度4mmo1.L^-1的EPS和20mmo1.L^-1的麦芽糖溶液于50℃水浴保温10min,加入0.1mL适当稀释的酶液，反应10min，加入50μL 3mo1.L^-1HC1终止反应，5min后加入50μL 3mo1.L^-1NaOH中和，然后加入100μLα-葡萄糖苷酶于60℃反应60min，加入100μL 1mo1.L^-1Na₂CO₃溶液将pH调节到8.0以上，在401nm处测定吸光值。一个酶活单位(U)定义为在该测定条件下每分钟转化1μmo1EPS所需的酶量。

实施例1环糊精葡萄糖基转移酶基因的获取

本发明中使用的目的蛋白为环糊精葡萄糖基转移酶，通过PCR的方法获得。

1、Geobacillus stearothermophilus str.NO.2(该菌株编号为ATCC 7953)菌株的基因组的提取，提取方法参见Takara基因组提取试剂盒。

2、引物设计及PCR获得环糊精葡萄糖基转移酶基因。

引物设计根据NCBI数据库中Geobacillus stearothermophilus CGTase基因序列(GenBank登陆号为X59043.1)设计，分别含BamHI和XhoI位点的上下游引物(由上海生工生物工程合成)：

上游引物F1primer：5’-CGCGGATCCGCAATCTTCATCGTGTCCGACACCCAAAAG-3’(下划线序列为BamHI酶切位点)；

下游引物R1primer5’-CCGCTCGAGTTAATTCTGCCAATCCACGATAATTTTGCCGGT-3’

(下划线序列为XhoI酶切位点)。

使用LATaq HS DNA聚合酶扩增不含自身信号肽序列的cgt基因。

以提取的Geobacillus stearothermophilus str.NO.2的基因组为模板，PCR条件为：95℃预变性3min；98℃变性1min；55℃退火1min；72℃延伸2min15s，反应30个循环；最后72℃延伸l0min。PCR产物用DNA纯化试剂盒回收，获得环糊精葡萄糖基转移酶基因。

实施例2产环糊精葡萄糖基转移酶大肠杆菌工程菌构建及诱导表达

1：重组质粒的构建及转化。

用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切上一步所得环糊精葡萄糖基转移酶基因PCR产物，验证用酶切体系为：PCR产物DNA 5μL，BamHI 0.5μL，XhoI 0.5μL，10×H buffer 2μL，加入双蒸水至20μL；回收用酶切体系为：质粒DNA 16μL，Nco I 1μL，EcoR I 1μL，10×Hbuffer 2μL。进行1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物或回收目的片段。同时将质粒pET-20b(+)做同样的双酶切处理，然后胶回收酶切产物。

连接插入片段和质粒,采用连接试剂盒。将载体和插入片段按1∶1到1∶10的分子数比混合，加入等量的连接混合溶液，16℃下采用T4连接酶连接1h或过夜。然后转化Escherichia coli.BL21(DE3)感受态细胞，大肠杆菌感受态制备方法参见感受态细胞制备试剂盒(TaKaRa)的说明书。

将转化的受体菌涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃培养过夜，挑选测序正确菌株在含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒并采用酶切电泳和测序鉴定。序列测定由上海生工生物工程有限公司完成，从而得到pET-20b(+)-CGT重组质粒。

实施例3含有不同DB序列的信号肽突变体的制备

以信号肽pelB(SEQ ID NO.3所示)信号肽为出发序列，进行突变。

将载体上起始密码子下游+9至+21位的十三个氨基酸CCTGCTGCCGACC利用密码子的简并性设计为十三个简并碱基，以pET-20b(+)-CGT质粒为模板，在序列SEQ ID NO.3所示的核苷酸的基础上，序列如SEQ ID NO.7所示的F2primer、序列如SEQ ID NO.8所示的R2primer为引物，进行PCR，突变成：TGTATGTATTACA，得到重组质粒pET-20b(+)-DB1-CGT，利用密码子的简并性，同时也得到重组质粒pET-20b(+)-DB2-CGT，DB2信号肽核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。(重组质粒pET-20b(+)-DB1-CGT的结构图如图1所示；含有pET-20b(+)-CGT、pET-20b(+)-DB1-CGT和pET-20b(+)-DB2-CGT重组质粒的大肠杆菌菌落PCR验证结果如图2所示。pET-20b(+)-DB1-CGT和pET-20b(+)-DB2-CGT重组质粒突变后基因的+9至+21位核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。)

上游引物(SEQ ID NO.7)：5’-GAAACAGAATTCTATGAAATANNNNNNNNNNNNNGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCA-3’

下游引物(SEQ ID NO.8)：5’-AGACCAGCAGCAGCNNNNNNNNNNNNNTATTTCATAGAATTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTAT-3’

实施例4重组大肠杆菌的诱导表达。

种子培养：将保藏的菌种接入装有50mL LB培养基的250mL三角瓶中，回旋式摇床转速200r/min，培养温度为37℃，培养8h。发酵培养：将培养好的种子培养液按4％(v/v)的接种量接种至装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中进行培养，开始培养温度为30℃，摇床转速200r/min，当菌体培养至OD₆₀₀为0.6时，加入IPTG后迅速转至不同温度的摇床，继续诱导90h。各培养基使用前添加100μg/mL氨苄青霉素。

经过发酵后取发酵上清液进行SDS-PAGE电泳(图3)，并测量发酵上清液的酶活(图4)，同时用考马斯亮蓝法测定样品中的蛋白浓度(图4)。测得DB1和DB2发酵液上清中的蛋白浓度分别为6.39mg/ml,，3.94mg/ml；环糊精葡萄糖基转移酶的酶活分别为179U/ml,28U/ml，由此可见DB区的序列在改变环糊精葡萄糖基转移酶胞外酶活的同时也影响了其胞外产量。其中突变型DB1的信号肽相对于原始pelB信号肽蛋白转运效果更佳，提高了环糊精葡萄糖基转移酶发酵上清液中单位体积酶活和胞外蛋白表达量。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高蛋白分泌效率的pelB信号肽突变体及其应用

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Tyr Val Cys Ile Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala

20

<210> 2

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgaaatatg tatgtattac agctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60

atggcc 66

<210> 3

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60

atggcc 66

<210> 4

<211> 2106

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcaatcttca tcgtgtccga cacccaaaag gtgaccgtcg aggcagctgg taatctgaac 60

aaggtcaact tcacctctga cgttgtatac cagatcgtcg tagaccgttt cgtagacggt 120

aacacttcca acaacccgtc tggtgcactg ttctctagcg gttgtactaa cctgcgtaag 180

tactgcggtg gcgattggca aggtattatc aacaagatca acgacggcta tctgacggat 240

atgggtgtga ctgcaatctg gatcagccag cctgtcgaaa acgtattctc cgtgatgaac 300

gacgcttccg gttctgctag ctaccatggt tactgggcac gtgatttcaa gaaaccaaac 360

ccgttctttg gcacgctgag cgacttccag cgtctggttg atgcagcaca tgctaaaggt 420

atcaaagtga tcatcgactt cgccccaaac cacactagcc cggcttctga aactaaccca 480

agctacatgg agaacggtcg tctgtacgat aacggtaccc tgctgggtgg ttatactaac 540

gacgccaata tgtacttcca ccacaacggt ggcaccactt tctcttctct ggaggatggt 600

atctaccgta acctgttcga cctggcggat ctgaaccacc aaaacccggt tatcgatcgt 660

tacctgaaag acgcagtaaa aatgtggatc gacatgggta tcgacggtat ccgcatggat 720

gcggtaaaac acatgccgtt cggttggcaa aaaagcctga tggacgagat tgacaactac 780

cgcccggtct tcactttcgg tgaatggttc ctgagcgaaa acgaagtgga cgctaacaac 840

cactacttcg cgaacgaaag cggcatgagc ctgctggatt tccgtttcgg tcagaaactg 900

cgtcaggtac tgcgtaacaa cagcgataac tggtacggtt tcaatcagat gatccaggac 960

acggcttccg cttatgacga ggtcctggac caggtaactt tcatcgacaa ccacgacatg 1020

gaccgtttta tgatcgacgg cggtgatcct cgtaaagtgg atatggcact ggctgtactg 1080

ctgacttctc gtggtgtacc aaacatctac tacggtaccg aacagtacat gaccggtaac 1140

ggtgacccga acaaccgtaa aatgatgtcc tcctttaaca aaaacacccg cgcctaccag 1200

gtgatccaaa aactgtcctc cctgcgccgc aacaatccgg ctctggctta tggtgatact 1260

gaacagcgct ggattaatgg cgatgtttac gtgtacgaac gccagtttgg caaagatgtc 1320

gtgctggtcg ccgttaaccg ctctagcagc tccaactact ccatcaccgg tctgtttacc 1380

gcgctgccgg cgggtactta tactgatcaa ctgggcggtc tgctggacgg taataccatt 1440

caggttggct ctaacggctc tgttaacgcg tttgatctgg gccctggcga agttggcgta 1500

tgggcgtatt ctgcgaccga atctaccccg attattggcc acgttggccc gatgatgggc 1560

caggtgggcc accaggttac cattgatggc gaaggcttcg gcactaacac cggcacggtt 1620

aaatttggca ctaccgcggc gaacgttgtg tcttggtcta ataaccagat tgttgttgcc 1680

gttccgaacg tttctccggg taaatataac attaccgttc agtcctccag cggccagacc 1740

tctgcggcgt atgacaattt tgaagttctg acgaacgatc aggtttctgt tcgctttgtt 1800

gttaataacg ccaccaccaa cctgggccag aacatttata ttgttggcaa cgtgtatgaa 1860

ctgggcaact gggatacgtc taaagcgatt ggtccgatgt tcaaccaggt tgtgtattcc 1920

tatccgacct ggtacatcga cgtgtccgtt ccggaaggca aaaccatcga attcaaattt 1980

atcaaaaaag attcccaggg caatgtgacg tgggaaagcg gttccaacca cgtttacacc 2040

accccgacca acaccaccgg caaaattatc gtggattggc agaatcatca tcaccatcac 2100

cactaa 2106

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgcggatccg caatcttcat cgtgtccgac acccaaaag 39

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccgctcgagt taattctgcc aatccacgat aattttgccg gt 42

<210> 7

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(34)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 7

gaaacagaat tctatgaaat annnnnnnnn nnnngctgct gctggtctgc tgctcctcgc 60

tgccca 66

<210> 8

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(27)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 8

agaccagcag cagcnnnnnn nnnnnnntat ttcatagaat tctgtttcct gtgtgaaatt 60

gttat 65

<210> 9

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgaaatatg ccctgttctc tgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60

atggcc 66

<210> 10

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgtatgtatt aca 13

<210> 11

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgccctgtcc gct 13

Claims (10)

1.一种提高蛋白分泌效率的信号肽突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述信号肽突变体的基因。

3.一种携带权利要求1所述信号肽突变体的载体或细胞。

4.一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达连接有SEQ ID NO.1所示信号肽的CGT酶。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述载体包括pET-20b(+)或pET-28a(+)。

6.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述CGT酶的基因序列如SEQ IDNO.4所示。

7.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α、E.coli TOP10中的任意一种。

8.一种构建权利要求4所述基因工程菌的方法，其特征在于，所述方法以pET-20b(+)为载体，以大肠杆菌为宿主，表达连接有SEQ ID NO.1所示信号肽的CGT酶。

9.一种环糊精葡萄糖基转移酶的生产方法，其特征在于，所述方法是将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，发酵至OD₆₀₀为0.6～0.8，加入0.1～0.25mM IPTG，诱导3～5d。

10.权利要求1所述信号肽突变体在制备蛋白质或含蛋白质的产品中的应用。