CN114277009A - Gtfb突变体及其在制备一系列具有不同抗水解能力异麦芽多糖中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了GTFB突变体及其在制备一系列具有不同抗水解能力异麦芽多糖中的应用，属于基因工程技术领域。先构建了16种来源于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)的4,6‑α‑葡萄糖基转移酶突变体基因，转入枯草芽孢杆菌得到16种重组枯草芽孢杆菌，利用重组枯草芽孢杆菌产16种4,6‑α‑葡萄糖基转移酶突变体。这些突变体能够以淀粉为底物，在淀粉高温糊化后，与普鲁兰酶共同作用于糊化液，制备异麦芽多糖。这些突变体制备得到的异麦芽多糖含有不同比例的α,1‑6糖苷键，并且这些异麦芽多糖产物具有一系列抗水解能力，可以满足食品、保健品或化妆品等领域中对产品不同抗水解能力的需求。

Description

GTFB突变体及其在制备一系列具有不同抗水解能力异麦芽多 糖中的应用

技术领域

本发明涉及GTFB突变体及其在制备一系列具有不同抗水解能力异麦芽多糖中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

近年来，随着社会的发展，人类生活环境发生了很大的变化，如生活节奏加快、饮食结构改变、社会竞争激烈、环境污染等。这些变化时刻威胁着人们的健康，使得大多数人处于亚健康状态。为了顺应现代食品科技发展的方向并满足消费者的健康需求，低血糖、低热量具有抗消化能力的功能性碳水化合物已成为21世纪健康食品的发展潮流。

据报道，由4,6-α-葡萄糖基转移酶以淀粉为底物合成的异麦芽多糖是一种新型的可溶性膳食纤维，由于其结构中富含人体消化系统不易水解的α,1-6糖苷键，因此其具有抗消化，低热量释放的特性。不同来源的4,6-α-葡萄糖基转移酶合成的产物含有不同比例的α,1-6糖苷键，它们在人体消化到中的抗水解能力也不一样。α,1-6键比例含量高的异麦芽多糖抗水解能力强，通过消化道后只有少部分的葡萄糖被水解释放，适合患有高血糖的人群以及减肥人群食用。而通过调节异麦芽多糖结构中的α,1-6糖苷键比例能够控制其在人体消化道中的葡萄糖释放速率和释放总量，以此满足不同人群肠道对葡萄糖供应的需求。因此调控4,6-α-葡萄糖基转移酶合成产物结构中的α,1-6糖苷键比例，制备一系列具有不同抗水解能力异麦芽多糖产品，在低热量食品以及其他功能性食品的生成应用上具有巨大意义。

发明内容

针对合成不同抗水解能力异麦芽多糖产品的需求，本发明首先提供了4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的4,6-α-葡萄糖基转移酶的第346、348以及399位突变得到的，这些突变体能够利用淀粉合成一系列具有不同抗水解能力的异麦芽多糖产物。

本发明提供了4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体，以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的4,6-α-葡萄糖基转移酶为亲本，将其第346位、348位和/或399位发生取代。

在一种实施方式中，所述4,6-α-葡萄糖基转移酶的编码基因核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

在一种实施方式中，将其第346位的丝氨酸取代为苏氨酸；将其第348位的丝氨酸取代为亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和/或苏氨酸。

在一种实施方式中，包括以下(1)～(16)任一所述：

(1)将亲本的第348位取代为亮氨酸，命名为S348L；

(2)将亲本的第348位取代为异亮氨酸，命名为S348I；

(3)将亲本的第348位取代为缬氨酸，命名为S348V；

(4)将亲本的第348位取代为苏氨酸，命名为S348T；

(5)将亲本的第346位取代为苏氨酸，并将第348位取代为亮氨酸，命名为S346T/S348L；

(6)将亲本的第346位取代为苏氨酸，并将第348位取代为异亮氨酸，命名为S346T/S348I；

(7)将亲本的第346位取代为苏氨酸，并将第348位取代为缬氨酸，命名为S346T/S348V；

(8)将亲本的第346位取代为苏氨酸，并将第348位取代为苏氨酸，命名为S346T/S348T；

(9)将亲本的第348位取代为亮氨酸，并将第399位取代为异亮氨酸，命名为S348L/L399I；

(10)将亲本的第348位取代为亮氨酸，并将第399位取代为缬氨酸，命名为S348L/L399V；

(11)将亲本的第348位取代为亮氨酸，并将第399位取代为苏氨酸，命名为S348L/L399T；

(12)将亲本的第348位取代为亮氨酸，并将第399位取代为丙氨酸，命名为S348L/L399A；

(13)将亲本的第346位取代为苏氨酸，将第348位取代为苏氨酸、并将第399位取代为异亮氨酸，命名为S346T/S348T/L399I；

(14)将亲本的第346位取代为苏氨酸，将第348位取代为苏氨酸，并将第399位取代为缬氨酸，命名为S346T/S348T/L399V；

(15)将亲本的第346位取代为苏氨酸，将第348位取代为苏氨酸，并将第399位取代为苏氨酸，命名为S346T/S348T/L399T；

(16)将亲本的第346位取代为苏氨酸，将第348位取代为苏氨酸，并将第399位取代为丙氨酸，命名为S346T/S348T/L399A；

本发明提供了编码所述4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体的基因。

本发明提供了含有所述编码所述4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体的基因的表达载体。

在一种实施方式中，所述载体为pHY系列载体。

优选地，所述载体为pHY300PLK。

本发明提供了表达所述4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体或含有所述基因的宿主细胞。

在一种实施方式中，所述宿主细胞以枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 2016536为表达宿主，所述枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M 2016536公开于公开号为CN108102996A。

本发明提供了制备异麦芽多糖的方法，所述方法是利用所述4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体以淀粉为底物，制备异麦芽多糖。

在一种实施方式中，具体步骤为：

(1)将淀粉加水调制成15～25％的悬浊液，并升温至60～80℃糊化得到糊化液；

(2)将步骤(1)得到的糊化液冷却至30～45℃调节pH值6.5～7.0，同时添加普鲁兰酶20～40U/g底物和4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体3000～4000U/g底物，放入恒温式水浴摇床，30～40℃反应不少于20h；

(3)将步骤(2)得到的反应液升温至95℃、10-20min灭酶；

(4)将反应产物经离心后取上清，喷雾干燥，最终得到淡黄色粉末成品。

在一种实施方式中，所述淀粉为谷物淀粉，或薯类淀粉，或淀粉衍生物：所述谷物淀粉为玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、绿豆淀粉、豌豆淀粉；所述薯类淀粉为木薯淀粉、马铃薯淀粉、红薯淀粉等薯类淀粉；所述淀粉衍生物为麦芽糊精、糊精、可溶性淀粉等淀粉衍生物；所述含有淀粉的物质为大米蛋白肽。

本发明提供了所述4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体，或所述基因，或所述宿主细胞在生产异麦芽多糖中的应用。

本发明提供了所述制备异麦芽多糖的方法得到的异麦芽多糖在食品、保健品或化妆品领域中的应用。

本发明的有益效果：

本发明通过对来源于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)4,6-α-葡萄糖基转移酶进行突变，得到的一系列突变体能够以淀粉为底物，在淀粉高温糊化后，与普鲁兰酶共同作用于糊化液，制备异麦芽多糖。这些突变体制备得到的异麦芽多糖含有不同比例的α,1-6糖苷键，并且这些异麦芽多糖产物在体外消化模拟实验中具有一系列的抗消化能力，这种性质可以满足食品、保健品或化妆品等领域中对产品不同抗水解能力的需求。

附图说明

图1为突变体的异麦芽多糖产物的¹H NMR图谱。

图2为突变体的异麦芽多糖产物的抗水解曲线。

图3为16种突变体的异麦芽多糖产物的抗水解曲线。

具体实施方式

(一)培养基

LB培养基(g/L)：蛋白胨10g/L，酵母提取物5，NaCl 10。

TB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉24，甘油5，K₂HPO₄·3H₂O 16.43，KH₂PO₄ 2.31。

(二)酶活的定义及测定方法

用碘法测定4,6-α-葡萄糖基转移酶的突变体总酶活：1g/L直链淀粉母液：40mg的直链淀粉加入2mL的蒸馏水充分润湿，加入2mL的2M的NaOH溶液，漩涡振荡充分溶解；用时取500μL的直链淀粉母液加250μL的2M的HCI溶液，然后加入3250μL的磷酸-柠檬酸缓冲液(pH7.0)配成0.125％的底物。

鲁戈碘液：0.26g碘与2.60g碘化钾溶于10mL的容量瓶中(提前3天配制，确保碘完全溶解)；用时取100μL的鲁戈碘液，加入50μL的2M的HCl溶液然后补水到26mL配成碘显色液。

反应时，取200uL的底物于1.5mL离心管中，35℃温浴10min。加入200μL的4,6-α-葡萄糖基转移酶酶液35℃反应10min，反应结束后取200μL反应液加入到3800μL的碘显色液中显示5min，分光光度计测定660nm下的吸光度。对照用缓冲液代替酶液，空白取200μL的缓冲液加入到3800μL的碘显色液中显示5min。

一个相对酶活单位定义为，单位时间吸光值下降一个百分点为一个酶活单位。

酶活计算公式：

酶活(U/mL)＝[100×稀释倍数×(A_对照-A_实验)]/[10minх0.1mLх(A_对照-A_空白)]。

实施例1：4,6-α-葡萄糖基转移酶的突变体的构建

(1)346和348位点突变体的制备

根据核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型4,6-α-葡萄糖基转移酶的序列，分别设计并合成S348T、S348V、S348I、S348L、S346T/S348T、S346T/S348V、S346T/S348I、S346T/S348L突变的引物，对4,6-α-葡萄糖基转移酶进行定点突变，分别测序确认4,6-a-葡萄糖基转移酶突变体的编码基因是否正确；将携带突变体基因的载体导入枯草芽孢杆菌CCTCC M 2016536中进行表达，得到突变4,6-α-葡萄糖基转移酶。

定点突变体编码基因的PCR扩增：利用快速PCR技术，以携带编码4,6-α-葡萄糖基转移酶基因的表达载体pHY300PLK-gtfB(记载于公开号为C111411117A的中国专利申请文本中)为模板。

引入S348T单点突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-CCTGATAACTCAGGTACGGTCGATGATGATCAG-3’(SEQ ID NO.3)，

反向引物：5’-CTGATCATCATCGACCGTACCTGAGTTATCAGG-3’(SEQ ID NO.4)；

引入S348V单点突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-CCTGATAACTCAGGTGTTGTCGATGATGATCAG-3’(SEQ ID NO.5)，

反向引物：5’-CTGATCATCATCGACAACACCTGAGTTATCAGG-3’(SEQ ID NO.6)；

引入S348I单点突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-CCTGATAACTCAGGTATTGTCGATGATGATCAG-3’(SEQ ID NO.7)，

反向引物：5’-CTGATCATCATCGACAATACCTGAGTTATCAGG-3’(SEQ ID NO.8)；

引入S348L单点突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-CCTGATAACTCAGGTCTGGTCGATGATGATCAG-3’(SEQ ID NO.9)，

反向引物：5’-CTGATCATCATCGACCAGACCTGAGTTATCAGG-3’(SEQ ID NO.10)；

引入S346T/S348T双点突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-TAAACCTGATAACACGGGTACGGTCGATGATGATC-3’(SEQ ID NO.11)，

反向引物：5’-GATCATCATCGACCGTACCCGTGTTATCAGGTTTA-3’(SEQ ID NO.12)；

引入S346T/S348V双点突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-TAAACCTGATAACACGGGTGTTGTCGATGATGATC-3’(SEQ ID NO.13)，

反向引物：5’-GATCATCATCGACAACACCCGTGTTATCAGGTTTA-3’(SEQ ID NO.14)；

引入S346T/S348I双点突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-TAAACCTGATAACACGGGTATTGTCGATGATGATC-3’(SEQ ID NO.15)，

反向引物：5’-GATCATCATCGACAATACCCGTGTTATCAGGTTTA-3’(SEQ ID NO.16)；

引入S346T/S348L双点突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-TAAACCTGATAACACGGGTCTGGTCGATGATGATC-3’(SEQ ID NO.17)，

反向引物：5’-GATCATCATCGACCAGACCCGTGTTATCAGGTTTA-3’(SEQ ID NO.18)。

(2)399位点叠加突变体的制备

根据核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因序列，分别设计并合成L399A、L399T、L399V、L399I突变的引物，对4,6-α-葡萄糖基转移酶进行叠加定点突变。

利用快速PCR技术，以携带编码4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体S348L基因的表达载体为模板。分别测序确认4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体的编码基因是否正确；将携带突变体基因的载体导入枯草芽孢杆菌CCTCC M 2016536中进行表达，获得叠加突变的4,6-α-葡萄糖基转移酶S348L/L399A、S348L/L399T、S348L/L399V、S348L/L399I。

利用快速PCR技术，以携带编码4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体S346T/S348T基因的表达载体为模板，构建叠加定点突变的质粒。对质粒分别测序确认4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体的编码基因是否正确；将携带突变体基因的载体导入枯草芽孢杆菌CCTCC NO：M2016536中进行表达，获得叠加突变的4,6-α-葡萄糖基转移酶S346T/S348T/L399A、S346T/S348T/L399T、S346T/S348T/L399V、S346T/S348T/L399I。

引入L399A点突变的定点突变引物为：

正向引物：5'-GATAGCCCGGAACTGGCAGTAGGCAATGATATT-3’(SEQ ID NO.19)

反向引物：5'-AATATCATTGCCTACTGCCAGTTCCGGGCTATC-3’(SEQ ID NO.20)

引入L399T点突变的定点突变引物为：

正向引物：5'-GATAGCCCGGAACTGACCGTAGGCAATGATATT-3’(SEQ ID NO.21)

反向引物：5'-AATATCATTGCCTACGGTCAGTTCCGGGCTATC-3’(SEQ ID NO.22)

引入L399V点突变的定点突变引物为：

正向引物：5'-GATAGCCCGGAACTGGTCGTAGGCAATGATATT-3’(SEQ ID NO.23)

反向引物：5'-AATATCATTGCCTACGACCAGTTCCGGGCTATC-3’(SEQ ID NO.24)

引入L399I点突变的定点突变引物为：

正向引物：5'-GATAGCCCGGAACTGATTGTAGGCAATGATATT-3’(SEQ ID NO.25)

反向引物：5'-AATATCATTGCCTACAATCAGTTCCGGGCTATC-3’(SEQ ID NO.26)

PCR反应体系均为：5×PS buffer 10μL，dNTPs Mix(2.5mmol/L)4μL，正向引物(10μmol/L)lμL，反向引物(10μmol/L)1μL，模板DNA 1μL，Primer Star HS(5U/μL)0.5μL，加入蒸馏水至50μL。

PCR扩增程序设定为：首先，94℃预变性5min；然后进入30个循环：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸7min 50s；最后72℃延伸10min，4℃保温。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

在验证正确的PCR产物中加入Dpn I，37℃，水浴2h，降解模板，之后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，将转化产物涂布于含有100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养10～12h，挑取阳性克隆接种于LB液体培养基，37℃培养8-10h。将测序正确的重组菌从甘油管接种至LB液体培养基，过夜培养，提取质粒，将质粒转化表达宿主枯草芽孢杆菌CCTCC M2016536感受态细胞，得到能够表达16种突变体的重组菌株，分别为表达S348T、S348V、S348I、S348L、S346T/S348T、S346T/S348V、S346T/S348I、S346T/S348L、S348L/L399A、S348L/L399T、S348L/L399V、S348L/L399I、S346T/S348T/L399A、S346T/S348T/L399T、S346T/S348T/L399V、S346T/S348T/L399I的重组枯草芽孢杆菌。

实施例2：4,6-α-葡萄糖基转移酶的突变体的表达

将实施例1中得到的16种重组枯草芽孢杆菌分别接种于LB培养基中，在37℃下培养8h后，以发酵培养基体积5％的接种量转接至50mL TB发酵培养基中，先放至37℃、200rpm恒温培养1-2h，在菌体OD₆₀₀为0.5～0.7时添加0.4μM浓度的IPTG并转至33℃、200rpm诱导发酵48h。发酵结束后，将发酵液经高压匀浆破碎(破碎条件为4'℃，80MPa)后离心(10000rpm、20min、4℃)，上清即为重组枯草芽孢杆菌所产的4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体酶液。

实施例3：4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体酶转化制备异麦芽多糖

包括如下步骤：

(1)以淀粉为底物，将淀粉加水调成20％的悬浊液，升温至60-80℃糊化；

(2)将糊化后的淀粉冷却至30-45℃调节pH值6.5-7.0，同时添加普鲁兰酶30U/g底物和4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体3500U/g底物，放入恒温式水浴摇床，37℃反应24h；

(3)将步骤(2)得到的反应液升温至95℃、10-20min灭酶；

(4)将反应产物8000rpm离心20min取上清，喷雾干燥，最终得到淡黄色粉末成品。

实施例4：NMR光谱分析各个突变体的异麦芽多糖产物的键型比例

分别将40mg上述4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体异麦芽多糖产物与500uLD₂O(99.9原子％D)混合，超声处理5分钟以完全溶解样品。在AVANCE III 400MHz数字NMR光谱仪(Bruker Biospin International AG)上记录样品的一维^lH和¹³C核磁共振(NMR)光谱，温度为60℃。将三甲基甲硅烷基丙酸(TMSP 0.03％)溶解在样品中作为内标，以校准化学位移(δ)并通过在δ5.36和δ4.97处的信号峰面积的积分来估计产物中α,1-6糖苷键的百分比(如图1)。

在上述条件下检测到16个4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体异麦芽多糖产物的α,1-6键的百分比如表1所示，突变体产物的α,1-6糖苷键的百分比由野生型产物的72％变成分布在7％-86％范围之间。

表1突变体异麦芽多糖产物的α,1-6糖苷键的百分比

实施例5：体外消化模拟实验测定异麦芽多糖产的抗水解能力

混合水解酶的配置：称取2g的猪胰酶，加入24mL的蒸馏水悬浮，用漩涡振荡器4℃振荡10min充分混匀，离心后(1500×g，10min)吸取20mL上清液，加入0.4mL的葡萄糖苷酶以及3.6mL的蒸馏水，充分混匀即得混合水解酶。

将用16中4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体制备的异麦芽多糖产物分别配成4％(w/v)浓度，取1mL于5mL离心管中37℃温浴10min，加入1mL的混合水解酶于37℃下温浴，分别在0min、20min、60min、120min时取0.1mL的反应液加入到0.3mL的90％乙醇溶液中终止反应，离心(10000×g，10min)取上清液GOD法测定葡萄糖含量。分别计算各酶转化产物在混合水解酶的水解作用下0-20min，20-120min的葡萄糖转化率。

定义120min前转化为葡萄糖的成分为可消化成分，其中0-20min为快速消化成分，20-120min为慢速消化成分；120min后未转化为葡萄糖的成分为抗性成分。

检测到16个4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体异麦芽多糖产物在体外消化模拟实验中表现出不同的抗水解能力曲线(如图2、3)。各个异麦芽多糖产物在体外模拟条件中，不同的反应时间被水解的葡萄糖成分如表2所示。

表2突变体异麦芽多糖产物不同时间段被水解成分

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> GTFB突变体及其在制备一系列具有不同抗水解能力异麦芽多糖中的应用

<130> BAA210343A

<160> 26

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3144

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgcaggcca acgatggtca ttggtatctg tttacggccg atggtacggc ggcgagccgt 60

gttgcgaaat gggccggtac gtattattat tttgatccgc agacgcatct gcgtgttgat 120

gataattatg ttcagagcca gtggggtgat tggtatatgt ttggtaaaga tggtcgtatt 180

gcaaccggcc tgtataaatg ggataaaaat aatcagtggt attattttga tcctgtgaca 240

tatctgaaag tgacaaataa atgggttgat ggtaattatt atgatgaaga tggtgcgcag 300

gcaattagca aactggttac cattaataac cgtctgtatt attttgatga tcagggcaaa 360

gaaatcagta atcagtttcg tacgattcat ggtgataaat attattttgg caacgatagt 420

gcagcagtga ccggccagca gaccatcgat ggtaaagttt ataaatttag caactatggc 480

tatctgctgg gtaatcgtta tggtaaaatt gaaaacggta aactgaacat ttatagcctg 540

gcagataaca gtctgattaa aaccgttgaa gcaggtccgt gggaaaatat ggcatatagc 600

atggatagta acagcattaa taacattgat ggttatatca gctatacggg ctggtatcgt 660

ccgtatggta caagccagga tggtaaaaca tggtatccga caaccgttgc agattggcgt 720

ccgattctga tgtatgtttg gccgagcaaa gatgttcagg ttaaatttat tcagtatttt 780

gtgaaccacg gttatgaaaa ttcaaattat ggcctgaccg caggtagtgt taaagattta 840

agcgaaaaca ccgcaagcat taaactgaat gaagttgcac agaatctgcg ttatgtcatt 900

gaacagcatg tcgtggcagc caaaagcacc agccagctgg caaatgatat taataatttt 960

atcaccacca tcccggaact gagcaaagca agcgaactga gcgtagttaa tagttatggc 1020

tataaacctg ataactcagg ttccgtcgat gatgatcagg tgatttttgt taacaatgat 1080

agcaaaaacc agaaaatcgg taataccagc tatgcagatt caaattatcg cctgatgaac 1140

cgcaccatta ataatcagaa tggtgataat aacagcgatg atagcccgga actgctggta 1200

ggcaatgata ttgataatag caatccagtt gtgcaggccg aaaatctgaa ttgggaatat 1260

tttctgctga attatggtaa atttatgaac tataacccta acggtaactt tgatggtttt 1320

cgcattgatg cagccgataa cattgatgcg gatgttctgg atcaggccgc ccagctgatt 1380

aatagcatct ataataccaa aggtaaccag gcaaatgcaa atgatcatct gatttataac 1440

gaaggttatc atctgggcgc agcaaatatg ctggatcgta aaagcaatcc tgaactgtat 1500

atggatagcg gctattttta taccctggaa aatgtactgg gtcgtgcaag cgatcgtgat 1560

gatattaata acctgattac caactctatc gtgaatcgtc agaacgatgt gtcagaaaac 1620

gtggcaaccc cgaattggag ctttgttacg aatcatgatc agcgtaaaaa tctgattaac 1680

cagatcgtga tcgatgatca tccgggcgtt gcggatatta tgagcgatgg ttataaagca 1740

gaatatgtta accaggcatg gaaagaattt tatgcagatc aggcacgcac cgataaaaag 1800

tatacccagt ataatctgcc ggcacagtat gcactgctgc tgacgaataa agatacagtg 1860

ccgcaggtgt attatggtga tctgtatgat gaaaccgatc agtatatgca gaataaaagc 1920

gtttattatg atgccattac caccctgatg aaagcccgta aaagctatgt gagcggtggt 1980

cagagcatga ttaaaattaa tgatcatctg ctgaccagcg tgcgttatgg taaaggtatt 2040

attgatggta atgtgagcat gaccgatatt ctgggtcgta atagcggtat tgcagttgtt 2100

gttggtaacg atgcccagat ggcaaatcag acaattagta ttaacatggg taaagcccat 2160

gcaaatcagg catataaaca gctgctgggt acaatcgatt caggtctgac cagttctgat 2220

acaacaattt atcataccga tagcaacggc gtgctgaacg tcaccgtgaa aggttatagc 2280

aacccatacg ttagcggtta tctgggtgtt tgggttccgc tgaatggcgg tgccaatatt 2340

accaccaaag ccagcgaagt taccaatcag agcgataaaa cctatagcag taatgcagca 2400

ctggatagcc atgttattta tgaagatttt agcctgtttc agccggaacc gaccagcaaa 2460

gcagaacatg cctataatat tatcgcagat aatgcaagcc tgtttaatga actgggtatt 2520

accgattttt ggatggcccc ggcatatacc ccgtttaata caagccgtta taatgaaggt 2580

tattccatga ccgatcgtta taatctgggt acagaagcca atctgaccaa atatggcagc 2640

ggtgaagaac tgagtaatgc aatcgctgca ctgcatgatg caggtctgaa agtgcaggaa 2700

gatttagtta tgaatcagat gatcggtttt agtggtcagg aagcagtgac cgttacccgt 2760

accgatggtc atgccaaaca gctgaccgtt gatggtaaaa cgtttgcaaa tcagatttat 2820

tttgcgtata cccgtggtgg tggtgaaggt cagaaaaatt atggtggcaa atatctggat 2880

gaactgcaaa aaaaatatcc ggaactgttt accaccaaag cagttagcac cggcgttgca 2940

ccggacccta gcgttcatat taccgaatgg agcgcaaaat atcagaatgg tacaagcctg 3000

caaaatattg gtattggtct ggcagttaaa ctggcaaatg gtgattatgc ctatctgaat 3060

gatagcaata ataaagcatt taataccacc ctgccggaaa ccatgagcag cgcagattat 3120

tatgcaaata ttgaagatga ttaa 3144

<210> 2

<211> 1047

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Gln Ala Asn Asp Gly His Trp Tyr Leu Phe Thr Ala Asp Gly Thr

1 5 10 15

Ala Ala Ser Arg Val Ala Lys Trp Ala Gly Thr Tyr Tyr Tyr Phe Asp

20 25 30

Pro Gln Thr His Leu Arg Val Asp Asp Asn Tyr Val Gln Ser Gln Trp

35 40 45

Gly Asp Trp Tyr Met Phe Gly Lys Asp Gly Arg Ile Ala Thr Gly Leu

50 55 60

Tyr Lys Trp Asp Lys Asn Asn Gln Trp Tyr Tyr Phe Asp Pro Val Thr

65 70 75 80

Tyr Leu Lys Val Thr Asn Lys Trp Val Asp Gly Asn Tyr Tyr Asp Glu

85 90 95

Asp Gly Ala Gln Ala Ile Ser Lys Leu Val Thr Ile Asn Asn Arg Leu

100 105 110

Tyr Tyr Phe Asp Asp Gln Gly Lys Glu Ile Ser Asn Gln Phe Arg Thr

115 120 125

Ile His Gly Asp Lys Tyr Tyr Phe Gly Asn Asp Ser Ala Ala Val Thr

130 135 140

Gly Gln Gln Thr Ile Asp Gly Lys Val Tyr Lys Phe Ser Asn Tyr Gly

145 150 155 160

Tyr Leu Leu Gly Asn Arg Tyr Gly Lys Ile Glu Asn Gly Lys Leu Asn

165 170 175

Ile Tyr Ser Leu Ala Asp Asn Ser Leu Ile Lys Thr Val Glu Ala Gly

180 185 190

Pro Trp Glu Asn Met Ala Tyr Ser Met Asp Ser Asn Ser Ile Asn Asn

195 200 205

Ile Asp Gly Tyr Ile Ser Tyr Thr Gly Trp Tyr Arg Pro Tyr Gly Thr

210 215 220

Ser Gln Asp Gly Lys Thr Trp Tyr Pro Thr Thr Val Ala Asp Trp Arg

225 230 235 240

Pro Ile Leu Met Tyr Val Trp Pro Ser Lys Asp Val Gln Val Lys Phe

245 250 255

Ile Gln Tyr Phe Val Asn His Gly Tyr Glu Asn Ser Asn Tyr Gly Leu

260 265 270

Thr Ala Gly Ser Val Lys Asp Leu Ser Glu Asn Thr Ala Ser Ile Lys

275 280 285

Leu Asn Glu Val Ala Gln Asn Leu Arg Tyr Val Ile Glu Gln His Val

290 295 300

Val Ala Ala Lys Ser Thr Ser Gln Leu Ala Asn Asp Ile Asn Asn Phe

305 310 315 320

Ile Thr Thr Ile Pro Glu Leu Ser Lys Ala Ser Glu Leu Ser Val Val

325 330 335

Asn Ser Tyr Gly Tyr Lys Pro Asp Asn Ser Gly Ser Val Asp Asp Asp

340 345 350

Gln Val Ile Phe Val Asn Asn Asp Ser Lys Asn Gln Lys Ile Gly Asn

355 360 365

Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Asn Tyr Arg Leu Met Asn Arg Thr Ile Asn

370 375 380

Asn Gln Asn Gly Asp Asn Asn Ser Asp Asp Ser Pro Glu Leu Leu Val

385 390 395 400

Gly Asn Asp Ile Asp Asn Ser Asn Pro Val Val Gln Ala Glu Asn Leu

405 410 415

Asn Trp Glu Tyr Phe Leu Leu Asn Tyr Gly Lys Phe Met Asn Tyr Asn

420 425 430

Pro Asn Gly Asn Phe Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Ala Asp Asn Ile

435 440 445

Asp Ala Asp Val Leu Asp Gln Ala Ala Gln Leu Ile Asn Ser Ile Tyr

450 455 460

Asn Thr Lys Gly Asn Gln Ala Asn Ala Asn Asp His Leu Ile Tyr Asn

465 470 475 480

Glu Gly Tyr His Leu Gly Ala Ala Asn Met Leu Asp Arg Lys Ser Asn

485 490 495

Pro Glu Leu Tyr Met Asp Ser Gly Tyr Phe Tyr Thr Leu Glu Asn Val

500 505 510

Leu Gly Arg Ala Ser Asp Arg Asp Asp Ile Asn Asn Leu Ile Thr Asn

515 520 525

Ser Ile Val Asn Arg Gln Asn Asp Val Ser Glu Asn Val Ala Thr Pro

530 535 540

Asn Trp Ser Phe Val Thr Asn His Asp Gln Arg Lys Asn Leu Ile Asn

545 550 555 560

Gln Ile Val Ile Asp Asp His Pro Gly Val Ala Asp Ile Met Ser Asp

565 570 575

Gly Tyr Lys Ala Glu Tyr Val Asn Gln Ala Trp Lys Glu Phe Tyr Ala

580 585 590

Asp Gln Ala Arg Thr Asp Lys Lys Tyr Thr Gln Tyr Asn Leu Pro Ala

595 600 605

Gln Tyr Ala Leu Leu Leu Thr Asn Lys Asp Thr Val Pro Gln Val Tyr

610 615 620

Tyr Gly Asp Leu Tyr Asp Glu Thr Asp Gln Tyr Met Gln Asn Lys Ser

625 630 635 640

Val Tyr Tyr Asp Ala Ile Thr Thr Leu Met Lys Ala Arg Lys Ser Tyr

645 650 655

Val Ser Gly Gly Gln Ser Met Ile Lys Ile Asn Asp His Leu Leu Thr

660 665 670

Ser Val Arg Tyr Gly Lys Gly Ile Ile Asp Gly Asn Val Ser Met Thr

675 680 685

Asp Ile Leu Gly Arg Asn Ser Gly Ile Ala Val Val Val Gly Asn Asp

690 695 700

Ala Gln Met Ala Asn Gln Thr Ile Ser Ile Asn Met Gly Lys Ala His

705 710 715 720

Ala Asn Gln Ala Tyr Lys Gln Leu Leu Gly Thr Ile Asp Ser Gly Leu

725 730 735

Thr Ser Ser Asp Thr Thr Ile Tyr His Thr Asp Ser Asn Gly Val Leu

740 745 750

Asn Val Thr Val Lys Gly Tyr Ser Asn Pro Tyr Val Ser Gly Tyr Leu

755 760 765

Gly Val Trp Val Pro Leu Asn Gly Gly Ala Asn Ile Thr Thr Lys Ala

770 775 780

Ser Glu Val Thr Asn Gln Ser Asp Lys Thr Tyr Ser Ser Asn Ala Ala

785 790 795 800

Leu Asp Ser His Val Ile Tyr Glu Asp Phe Ser Leu Phe Gln Pro Glu

805 810 815

Pro Thr Ser Lys Ala Glu His Ala Tyr Asn Ile Ile Ala Asp Asn Ala

820 825 830

Ser Leu Phe Asn Glu Leu Gly Ile Thr Asp Phe Trp Met Ala Pro Ala

835 840 845

Tyr Thr Pro Phe Asn Thr Ser Arg Tyr Asn Glu Gly Tyr Ser Met Thr

850 855 860

Asp Arg Tyr Asn Leu Gly Thr Glu Ala Asn Leu Thr Lys Tyr Gly Ser

865 870 875 880

Gly Glu Glu Leu Ser Asn Ala Ile Ala Ala Leu His Asp Ala Gly Leu

885 890 895

Lys Val Gln Glu Asp Leu Val Met Asn Gln Met Ile Gly Phe Ser Gly

900 905 910

Gln Glu Ala Val Thr Val Thr Arg Thr Asp Gly His Ala Lys Gln Leu

915 920 925

Thr Val Asp Gly Lys Thr Phe Ala Asn Gln Ile Tyr Phe Ala Tyr Thr

930 935 940

Arg Gly Gly Gly Glu Gly Gln Lys Asn Tyr Gly Gly Lys Tyr Leu Asp

945 950 955 960

Glu Leu Gln Lys Lys Tyr Pro Glu Leu Phe Thr Thr Lys Ala Val Ser

965 970 975

Thr Gly Val Ala Pro Asp Pro Ser Val His Ile Thr Glu Trp Ser Ala

980 985 990

Lys Tyr Gln Asn Gly Thr Ser Leu Gln Asn Ile Gly Ile Gly Leu Ala

995 1000 1005

Val Lys Leu Ala Asn Gly Asp Tyr Ala Tyr Leu Asn Asp Ser Asn

1010 1015 1020

Asn Lys Ala Phe Asn Thr Thr Leu Pro Glu Thr Met Ser Ser Ala

1025 1030 1035

Asp Tyr Tyr Ala Asn Ile Glu Asp Asp

1040 1045

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctgataact caggtacggt cgatgatgat cag 33

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctgatcatca tcgaccgtac ctgagttatc agg 33

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cctgataact caggtgttgt cgatgatgat cag 33

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctgatcatca tcgacaacac ctgagttatc agg 33

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cctgataact caggtattgt cgatgatgat cag 33

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctgatcatca tcgacaatac ctgagttatc agg 33

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cctgataact caggtctggt cgatgatgat cag 33

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctgatcatca tcgaccagac ctgagttatc agg 33

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

taaacctgat aacacgggta cggtcgatga tgatc 35

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gatcatcatc gaccgtaccc gtgttatcag gttta 35

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

taaacctgat aacacgggtg ttgtcgatga tgatc 35

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gatcatcatc gacaacaccc gtgttatcag gttta 35

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

taaacctgat aacacgggta ttgtcgatga tgatc 35

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gatcatcatc gacaataccc gtgttatcag gttta 35

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

taaacctgat aacacgggtc tggtcgatga tgatc 35

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gatcatcatc gaccagaccc gtgttatcag gttta 35

<210> 19

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gatagcccgg aactggcagt aggcaatgat att 33

<210> 20

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

aatatcattg cctactgcca gttccgggct atc 33

<210> 21

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gatagcccgg aactgaccgt aggcaatgat att 33

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

aatatcattg cctacggtca gttccgggct atc 33

<210> 23

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gatagcccgg aactggtcgt aggcaatgat att 33

<210> 24

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

aatatcattg cctacgacca gttccgggct atc 33

<210> 25

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gatagcccgg aactgattgt aggcaatgat att 33

<210> 26

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

aatatcattg cctacaatca gttccgggct atc 33

Claims (10)

1.4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的4,6-α-葡萄糖基转移酶为亲本，将其第346位、348位和/或399位发生取代。

2.根据权利要求1所述的4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，将其第346位的丝氨酸取代为苏氨酸；将其第348位的丝氨酸取代为亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和/或苏氨酸。

3.根据权利要求3所的4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，包括以下(1)～(16)任一所述：

(1)将亲本的第348位取代为亮氨酸；

(2)将亲本的第348位取代为异亮氨酸；

(3)将亲本的第348位取代为缬氨酸；

(4)将亲本的第348位取代为苏氨酸；

(5)将亲本的第346位取代为苏氨酸，并将第348位取代为亮氨酸；

(6)将亲本的第346位取代为苏氨酸，并将第348位取代为异亮氨酸；

(7)将亲本的第346位取代为苏氨酸，并将第348位取代为缬氨酸；

(8)将亲本的第346位取代为苏氨酸，并将第348位取代为苏氨酸；

(9)将亲本的第348位取代为亮氨酸，并将第399位取代为异亮氨酸；

(10)将亲本的第348位取代为亮氨酸，并将第399位取代为缬氨酸；

(11)将亲本的第348位取代为亮氨酸，并将第399位取代为苏氨酸；

(12)将亲本的第348位取代为亮氨酸，并将第399位取代为丙氨酸；

(13)将亲本的第346位取代为苏氨酸，将第348位取代为苏氨酸、并将第399位取代为异亮氨酸；

(14)将亲本的第346位取代为苏氨酸，将第348位取代为苏氨酸，并将第399位取代为缬氨酸；

(15)将亲本的第346位取代为苏氨酸，将第348位取代为苏氨酸，并将第399位取代为苏氨酸；

(16)将亲本的第346位取代为苏氨酸，将第348位取代为苏氨酸，并将第399位取代为丙氨酸；

4.编码权利要求1～3任一所述4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体的基因。

5.含有权利要求4所述基因的表达载体。

6.表达权利要求1～3任一所述4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体或含有权利要求4所述基因的宿主细胞。

7.制备异麦芽多糖的方法，其特征在于，利用权利要求1～3任一所述4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体以淀粉为底物，制备异麦芽多糖。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，具体步骤为

(1)将淀粉加水调制成15～25％的悬浊液，并升温至60～80℃糊化；

(2)将步骤(1)糊化后的反应液冷却至30～45℃调节pH值6.5～7.0，同时添加普鲁兰酶20～40U/g底物和4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体3000～4000U/g底物，放入恒温式水浴摇床，30～40℃反应不少于20h；

(3)将步骤(2)得到的反应液升温至95℃、10-20min灭酶；

(4)将反应产物经离心后取上清，喷雾干燥，最终得到淡黄色粉末成品。

9.权利要求7或8所述方法制备得到的异麦芽糖。

10.权利要求1～3任一所述4,6-α-葡萄糖基转移酶突变体，或权利要求4所述基因，或权利要求6所述宿主细胞在生产异麦芽多糖中的应用，或是权利要求9所述的异麦芽糖在食品、保健品或化妆品领域中的应用。

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