CN1642418A - 4,5－二羟基－2－环戊烯－1－酮(dhcp)处理对细菌基因表达和群体感应的影响 - Google Patents

Abstract

DHCP(4，5－二羟基－2－环戊烯－1－酮)已显示出具有对大肠杆菌的抗细菌活性。通过DNA微阵列分析了响应DHCP的大肠杆菌普遍转录模式。现在表明DHCP在大肠杆菌中具有广泛的影响，影响参与常规新陈代谢和细胞膜合成和功能的蛋白编码基因。此外，rpoS和RpoS调节的、应答不同胁迫的基因被上调。DHCP也显示抑制AI－2，一种参与群体感应的自诱导物，而参与诸如毒性，运动性和外膜功能等群体调控过程的基因经DHCP处理下调。此外，cysK－一种已知的在大肠杆菌另一途径中起作用的群体感应基因响应DHCP显著地增加。这些结果显示DHCP调控大肠杆菌不同群体感应回路的打开/关闭。

Description

4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮(DHCP)处理对 细菌基因表达和群体感应的影响

发明背景

发明领域

细菌中基因表达和群体感应的调控

相关技术领域

许多抗生素能有效抵抗各种细菌；然而，近年来，多重耐药细菌的出现已经成为一种主要问题。这促使人们寻找更新的和更有效的抗细菌化合物。早先，本发明人实验室报道其中一种化合物，4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮(DHCP)，对各种革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，诸如大肠杆菌，沙门氏菌，芽孢杆菌属，葡萄球菌等具有抗细菌活性。DHCP可以通过加热处理糖醛酸或其衍生物而制备(Koyama等，1999)。它也可由烘焙或烤干的蔬菜，果实，谷物，蘑菇，海藻，树皮或软骨产生(Koyama等，1999)。它显示出作为治疗或预防药剂用于抗癌的应用潜力，以及作为抗细菌剂用于防腐剂，牙膏，化妆品和洗浴药剂的应用潜力(Koyama等，1999)。DHCP也可以通过微生物合成。当S-腺苷甲硫氨酸(SAM)被用作DNA，RMA或蛋白生物合成的甲基供体时，一些SAM-依赖的转甲基酶将甲基从SAM转移给其底物产生S-腺苷高半胱氨酸(SAH)，然后S-腺苷高半胱氨酸(SAH)通过酶Pfs降解产生S-核糖基高半胱氨酸(SRH)。SRH最终转换成高半胱氨酸和4，5-二羟基-2，3-戊二酮(Miller等，1968和Schauder等，2001)。基于其结构，DHCP可能是由后者形成。

自大肠杆菌基因组文库分离出一种DHCP毒性多拷贝抑制因子。该抑制因子编码基因命名为dep，将推断地所述基因的编码蛋白命名为Dep.Dep蛋白显示出与已知的排出蛋白具有高度同源性，这些排出蛋白赋予对氯霉素，双环霉素和四环素等许多抗生素的抗性。然而Dep蛋白并未赋予对任何检测抗生素的交叉抗性(Phadtare等，2001)。DHCP确切的作用机理是未知的。

最近，在有关大肠杆菌群体感应的研究中DHCP引起了注意(Schauder等，2001)。许多细菌能够通过分泌生长阶段相关的低分子量信号传导信息素(phermone)来控制特异基因的表达。该过程被命名为群体感应。群体感应调控的生理学过程存在于各种细菌中，包括生物发光，抗生素合成，致病性，蛋白分泌，荚膜的外多糖合成，生物薄膜形成，运动性(综述见Miller等，2001；Schauder等，2001和Whitehead等，2001)。群体感应的研究特别重要，因为调控细胞密度是其一种显著特征，而许多产生这种应答的化合物具有抗细菌活性。哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)，一种革兰氏阴性生物发光海洋细菌，可对两种不同的自诱导物AI-1和AI-2产生应答而调节光产生。AI-1是高丝氨酸内酯，用于种内通讯。AI-2用于种间通讯，其结构是未知的。AI-2由SAM产生，在大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)，哈维氏弧菌(V.harveyi)，霍乱弧菌(V.cholerae)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)中其生物合成途径和生物合成生化中间体是相同的。一些化合物被筛选作为AI-2候选物，DHCP是其中之一。然而，DHCP在筛选试验中没有显示任何活性，因此被排除作为AI-2候选物(Schauder等，2001)的可能。

此处任何文献的引用并非打算承认这些文献为本申请任何权利要求专利性的相关现有技术，或必需材料。对于所有文献内容或日期的任何陈述，乃基于申请人递交申请时所能获得的信息，并不等同于认可这些陈述的正确性。

发明概述

本发明提供了一种调节微生物基因的方法，该方法通过将要调节其基因的微生物与4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮(DHCP)接触从而调节微生物中的基因。要调节的基因包括胁迫应答基因，膜合成和膜功能相关基因，具各种功能的蛋白的编码基因，和编码未知功能的蛋白的基因。这些要调节基因的非限制实施例包括下文列于表1到7的基因及其类似物。优选地，所述基因参与诸如群体感应回路的打开/关闭或种间自诱导物AI-2活性产生的群体感应过程。

本发明也提供了一种用于筛选其基因表达水平受DHCP影响的生理活性物质的方法，以及提供了通过该方法获得的一种生理活性物质。该方法包括在候选物质存在或者缺少的情况下培养微生物，然后测定在候选物质存在或者缺少的情况下该微生物的基因表达水平，其中所述基因是表达水平受DHCP影响的那些。如果在候选物质存在的情况下基因表达水平相对于候选物质缺乏的情况下显著地增高或者降低，则鉴定这种候选物质为能显著地影响至少一种基因表达水平的生理活性物质。用于此方法基因的非限制性实施例包括下文列于表1到7的基因及其类似物。作为优选的实施方案，基于基因转录的mRNA量或通过DNA微阵列杂交测定基因的表达水平。

本发明的另一方面涉及一种增加微生物中重组多肽产量的方法，包括在有DHCP存在时培养微生物以增加重组多肽的表达和产量，然后回收培养物产生的重组多肽。

本发明的另一方面涉及一种利用DHCP作为活性成分抑制种间群体感应诱导物，例如诱导物AI-2活性的方法。

本发明的再一方面涉及根据本发明的方法应用DHCP生产一种用于调节微生物基因的组合物，以及包含DHCP作为活性成分的组合物用于调节微生物基因；用于调节群体感应，例如cysk表达；用于打开/关闭群体感应回路；用于抑制种间群体感应诱导物，例如AI-2的活性；用于调节胁迫应答基因表达；用于调节群体感应调节基因的表达；用于促进重组蛋白分泌；用于调节列于表1到7的基因的表达，或用于维持内环境平衡。

附图说明

图1是显示DHCP对mRNAs水平影响的凝胶。如实施例1材料和方法部分所述使用热酚法提取RNA，用osmY，dps，rpoS，katG，cysK，tehA，zipA和ompF相应的寡核苷酸进行引物延伸分析。对每个基因泳道1和2分别表示由对照(未处理的)和DHCP处理细胞分离的mRNAs。

图2A和2B是显示DHCP抑制AI-2活性的图表。如实施例1材料和方法部分所述进行AI-2活性试验。哈维氏弧菌BB152中所见的发光度假定为100％，其它活性表示为相对的百分率(％)。在附图2A中，泳道如下：无菌的AB培养基，泳道1；哈维氏弧菌BB152培养液，泳道2；DHCP(250μM)泳道3；DHCP(250μM)加哈维氏弧菌BB152培养液，泳道4。在附图2B中，用AI-2产生最大量发光后，以250μM(实心圆)和100μM(空心正方形)将DHCP添加给反应混合物。不添加DHCP的相应AI-2对照活性也显示出来(空心三角形)。用液体闪烁计数器监控不同时间点的发光量。

发明详述

通过参考下列实施例可更容易理解本发明，下列实施例是作为示例提供而不是要用来限定本发明的。

实施例1

本发明人用DNA微阵列来分析大肠杆菌(E.coli)应答DHCP的普遍转录模式以(i)研究DHCP抗细菌活性的表现(ii)研究DHCP参与大肠杆菌群体感应途径的可能性。本发明人获得的结果表明(i)DHCP在大肠杆菌中具有广泛的影响，影响参与常规新陈代谢和膜合成和功能的蛋白的编码基因，以及(ii)包括群体调节过程，例如毒性，运动性和外膜功能在内的基因受DHCP处理的影响。在DHCP处理的细胞中诸如sapF(Lopez-Solanilla等，1998)，potA，和potB(DeLisa等，2001)等毒性相关基因的表达水平下降。来自大肠杆菌的sapF基因和来自费希氏弧菌的sapF同源，后者被证明可被LuxR-AI复合体增强，有人建议sapF在费希氏弧菌生物发光中起作用(Chen等，2000)。此外，一种已知在大肠杆菌替代的途径中起作用的群体感应基因cysK(Baca-DeLancey等，1999)响应DHCP显著地增强。本实施例展现的结果显示，DHCP调节大肠杆菌中不同群体感应回路的打开/关闭。

材料和方法

细菌菌株

大肠杆菌野生型菌株 JM83[F-araΔ(lac-proAB)rpsL(strr)](Yanisch-Perron等，1985)生长在Luria肉汤(LB)中。哈维氏弧菌BB152和BB170菌株由Bonnie Bassler博士惠赠(普林斯顿大学)。这些菌株如前所述生长在AB培养基中(Yanisch-Perron等，1985)。

RNA分离

将在LB培养基中生长过夜的大肠杆菌细胞稀释到新鲜的LB培养基中。生长达到50Klett单位后，加入DHCP(250μM)并进一步监控生长。生长达到90-100Klett单位后，将其稀释10倍到含有如前所述相同浓度DHCP的培养基中(Phadtare等，2001)。DHCP温育8小时后收获细胞。不加入DHCP以同样方式培养对照细胞，并在OD600相当于DHCP处理细胞的最终OD600时收获细胞。如前所述使用热酚法抽提总RNA(Sarmientos等，1983)。用RNeasy微量试剂盒(Qiagen)作进一步纯化，然后用DNase I处理，继之以酚-氯仿处理和乙醇沉淀。通过测定260nm吸光率进行定量。用琼脂糖凝胶电泳确认RNA纯度。

DNA微阵列分析

用Cy3-dUTP和Cy5-dUTP(Amersham Pharmacia公司)标记mRNAs。用随机六聚物pd(N)6作为引物，使用IntelliGene大肠杆菌芯片1版本(Takara Shuzo有限公司，日本)进行DNA微阵列分析。它代表大肠杆菌K-12 W3110的全部ORF。

引物延伸

用于检测相应的mRNA的引物为：引物750077，5′-TACAGCCAGCAGAGTTTTCGAAAT-3′(SEQ ID NO：1)，相应于osmY第15到第8密码子序列(Yim等，1992)；引物750078，5′-ATAAAGCAGATTGGTCGCTTTTGA-3′(SEQ ID NO：2)，相应于dps第16到第9密码子序列(Altuvia等，1994)；引物979747，5′-CAGCGTATTCTGACTCATAAGGTG-3′(SEQ ID NO：3)，相应于rpoS自第6密码子的区域(Takayanagi等，1994)；引物956660，5′-AGTGGCTGTGGTGTTATGGATATC-3′(SEQ ID NO：4)，相应于katG第13到第16密码子区域(Triggs-Raine等，1998)；引物3969805，5′-CAGGCGAACCAGCGGCGTGTGACC-3′(SEQ ID NO：5)，相应于cysK第20到第13密码子区域(Byrne等，1988)；引物3969806，5′-GTAGCCTGCCGGCAAATTGAGCAC-3′(SEQ ID NO：6)，相应于tehA第13到第6密码子区域(Walter等，1991)；引物3969807，5′-GATTAATATCAGACGCAAATCCTG-3′(SEQ ID NO：7)，相应于zipA第10到第3密码子区域(Hale等，1997)；和引物7018，5′-ACGGGATCCTTCATCATTATTTATTA-3′(SEQ ID NO：8)，包括含有自ompF第1密码子的区域(登录号，J01655，M10311和M10312)。使用T4多核苷酸激酶(Gibco BRL公司)用[γ-32P]腺苷三磷酸(Du-Pont-New Bngland Nuclear公司)标记引物。使用5微克RNA在42℃进行引物延伸，反应进行1小时，最终反应体积为10微升，含有50μMTris-HCl(pH 8.5)，8μM MgCl₂，30μM KCl，1μM二硫苏糖醇，0.4pmol ³²P标记的引物，0.5μM的各种dNTP，10单位RNase抑制剂(Boehringer Mannheim公司)和6.25单位逆转录酶(BoehringerMannheim公司)。在变性条件下用6％聚丙烯酰胺凝胶分析产物。通过直接放射性测量定量引物延伸产物。

AI-2分析

如Surette和Bassler所述使用哈维氏弧菌报道分子菌株(BB170)进行AI-2分析(Surette等，1999)。使用哈维氏弧菌BB152菌株无细胞的培养液作为阳性对照。使用无菌的AB培养基作为阴性对照。简要地，在AB培养基中30℃过夜培养哈维氏弧菌BB170菌株，然后将细胞以1∶5000倍稀释到新鲜培养基中。将稀释的培养物(90微升)加入到分析混合物中，其中包含10微升AB培养基或者哈维氏弧菌Bb152/DHCP(100-250μm)无细胞培养液。为检查DHCP对AI-2产生的发光量的影响，在反应混合物达到最大发光后将其加入。用液体闪烁计数器监控发光量。

结果

本发明人实验室先前已经表明，在DHCP(250μM)存在经3小时培养后严重损害大肠杆菌JM83的生长，而在5小时后细胞停止生长(Phadtare等，2001)。本研究主要目的是鉴定DHCP处理可引起mRNA丰度显著增减的所有大肠杆菌读码框。对照(未处理的)和DHCP处理细胞的细胞密度是相同的；因此，微阵列所见的改变基本上不受细胞差异的影响。使用从相应细胞分离的RNA作为DNA阵列杂交的探针，如本实施例材料和方法部分所述测定数据。计算相应点的对数表达比值可以对在两种生长条件下各个大肠杆菌基因的相对转录水平进行配对比较。只考虑表达水平的对数比值至少是4的基因。一些情况下考虑属于相同操纵子或者相同种类的基因，即使对数比值倍数相差仅仅是3或者稍微小于3。对数比值高于零值表明DHCP处理诱导表达而低于零表明抑制表达。使用相应于那些被显著影响基因的寡核苷酸进行引物延伸来确证DNA微阵列分析所见结果。结果如附图1所示并被概括在表1，两种方法的结果彼此相符合。

表1 DNA微阵列和引物延伸的结果比较

            基因        微阵列        引物延伸

            osmY        12.00         15.00

            dps         13.00         12.00

            rpoS        4.00          4.00

            katG        9.00          9.00

            cysK        20.00         18.00

            tehA        5.00          5.00

            zlpA        4.50          6.00

            ompF        0.06          0.06

显示DHCP处理相对对照(未处理)细胞各种基因相应mRNA水平的比值。

本发明人实验室观察到许多包括广泛功能的应答基因：(i)编码核醣体蛋白的基因，(ii)编码胁迫应答普遍调节因子-RpoS和RpoS调节蛋白的基因，(iii)参与膜合成与诸如转运等膜功能的基因，(iv)编码参与常规新陈代谢蛋白的基因，(v)编码具各种功能的蛋白的基因，和(vi)编码推测的蛋白和未知功能或者种类的蛋白的基因。

核醣体蛋白的编码基因受DHCP处理的影响

因为本实验选择的DHCP浓度严重危害生长，显著的次级效应可能是由于生长抑制本身引起，并不一定反映DHCP的作用靶点。生长率减慢的一种现象是细胞的翻译机制受到影响，证据是核醣体蛋白水平下降。见表2，大多数编码核醣体L蛋白的基因显示出水平下降，尽管大多数情况下影响不严重(2-3倍)。

        表2.DHCP对核醣体蛋白编码基因的影响

基因        基因产物和/或功能    比值(DHCP-处理/对照)

rplA        核糖体蛋白L1              0.23

rplB        核糖体蛋白L2              0.25

rplC        核糖体蛋白L3              0.28

rplD        核糖体蛋白L4              0.27

rplE        核糖体蛋白L5              0.34

rplF        核糖体蛋白L6              0.30

rplI        核糖体蛋白L9              0.25

rplJ        核糖体蛋白L10             0.28

rplK        核糖体蛋白L11             0.39

rplM        核糖体蛋白L13             0.49

rplN        核糖体蛋白L14             0.44

rplO        核糖体蛋白L15             0.36

rplP        核糖体蛋白L16             0.36

rplQ        核糖体蛋白L17             0.47

rplR        核糖体蛋白L18             0.38

rplS        核糖体蛋白L19             0.35

rplV        核糖体蛋白L22             0.28

rplW        核糖体蛋白L23             0.27

rplX        核糖体蛋白L24             0.31

rplY        核糖体蛋白L25             0.28

rpmB        核糖体蛋白L28             0.45

rpmE        核糖体蛋白L31             0.39

DHCP对膜相关功能的影响

接着，检测了DHCP对不同种类基因的影响。如表3所示，40种细胞膜相关蛋白的编码基因受到显著影响。突出地，特别是参与铁转运(fecA，fecB，fecC，fecD，fepA和fepC)和亚精胺/腐胺转运(potA，potB，potC和potD)的细胞转运系统受到影响。外膜蛋白编码基因(Omp)水平也降低(5-15倍)。参与运动功能的蛋白的编码基因诸如motA，motB和cheA降低4-6倍。有趣地，锌-转运ATPase编码基因atzN增高11倍。CreD编码基因creD表现出最显著的差异(47倍增加)。因为CreD的确切功能是未知的(Avison等，2001)，所以难以判断这一观察结果的生理意义。creD一个重要特点是受CreBC调节，CreBC是cre调节子的第一个成员和一种假定的普遍调节因子(Avision等，2001)。另一个受CreBC调节的基因是talA(Avision等，2001)，它在本研究中也增加7.6倍(表6)。talA编码参与甘油醛-3-磷酸动员到戊糖磷酸途径的酶。其它CreBC调节的基因诸如yidS，和yieI，虽然其产物没有确定任何功能，也增加4倍(表7)。然而其它CreBC调节的基因诸如ackA，pta，radC，malE和trgB不受DHCP诱导。事实上，ackA降低3.6倍(表5)。其它一些因子可能也参与这些基因的表达调控。

编码赋予对亚碲酸盐抗性的蛋白的tehA基因的水平有5倍的显著增加。亚碲酸盐在许多革兰氏阴性细菌中产生毒性，这些毒性的确切的机制是来知的，然而已经表明它产生氧化胁迫和可能在不同蛋白中替代硫，致使它们变成无功能的(Garberg等，1999和Summers等，1977)。tehA超表达也赋予对诸如四苯基氯化砷，溴化乙锭，结晶紫和原黄素等化合物的抗性，类似于推断的多重药物抗性泵的功能(Turner等，1997)。

    表3 DHCP对参与膜合成和膜相关功能基因的影响

                                           比率

基因        基因产物和/或功能              (DHCP-处理/对照)

ansP        L-天冬酰胺透性酶               0.29

atoE        短链脂肪酸                     0.17

atzN        锌-转运ATPase                  11.30

cheA        趋化蛋白CheA                   0.25

cpxP        周质蛋白前体                   4.95

creD        内膜蛋白CreD                   47.00

czcD        阳离子排出蛋白CzcD             3.60

fadL        长链脂肪酸转运蛋白             0.10

fecA        二柠檬酸铁(III)转运蛋白FecA    0.16

fecB        二柠檬酸铁(III)结合蛋白        0.15

fecC        FecC蛋白                       0.21

fecD        二柠檬酸铁(III)转运系统蛋白    0.15

fecE        二柠檬酸铁(III)转运蛋白        0.11

fepA        铁螫合素受体前体               0.25

fepC        铁肠杆菌素转运蛋白FepC         0.40

glf         UDP-吡喃半乳糖变位酶           0.20

lysP        细胞溶素特异性透性酶           0.16

motA        趋化蛋白MotA                   0.18

motB        趋化蛋白MotB                   0.40

msyB        膜蛋白                         4.25

nmpC        外膜孔道蛋白前体               0.01

ompA        外膜蛋白a前体                  0.23

ompC        外膜蛋白c前体                  0.20

ompF        外膜蛋白f前体                  0.06

ompT        蛋白酶VII                      0.11

pheP        苯丙氨酸转运蛋白pheP           0.13

plsX        PlsX蛋白                       0.28

potA        亚精胺/腐胺转运蛋白A           0.13

potB        亚精胺/腐胺转运系统            0.13

potC        亚精胺/腐胺转运系统               0.20

potD        亚精胺/腐胺转运蛋白D              0.19

rfc         可能的O-抗原聚合酶                0.23

sdaC        可能的丝氨酸转运蛋白              0.25

secF        分泌蛋白SecF                      0.26

secG        P12细胞质膜蛋白                   0.30

secY        SecY蛋白                          0.40

tehA        亚碲酸盐抗性蛋白TehA              5.00

tsr         甲基接受性趋化蛋白(mcp-1)         0.22

tsx         核苷特异性通道形成蛋白            0.22

znu         高亲合性锌摄取系统蛋白            0.13

DHCP诱导RpoS和RpoS调节的蛋白

RpoS是一种普遍的胁迫应答调节因子，已知它也参与大肠杆菌中的群体感应(Hengge-Aronis，2000和Sitnikov等，1996)。接下来，检验了DHCP对rpoS水平的影响，发现在DHCP处理之后诱导rpoS4倍增加。Dps，一种受氧化和渗透压力诱导的蛋白(Altuvia等，1994和Martinez等，1997)，其编码基因dps被诱导13倍(表4)。其它基因诸如RpoS调节的胁迫蛋白OsmY和KatG的编码基因osmY和katG，各自也显著受到诱导(Hengge-Aronis，2000和Yim等，1994)。有趣地是，其它一些不参与胁迫应答的RpoS调节蛋白的编码基因也受到诱导，这可能和RpoS本身的较高水平有关。这些例子包括hdeB，otsA，poxB和wrbA(表4)。

    表4 DHCP对参与膜合成和膜相关功能基因的影响

                                              比率

基因        基因产物和/或功能                (DHCP-处理/对照)

dps         DNA结合蛋白Dps                    13.00

hdeB        10k-1蛋白前体                     6.00

katG        过氧化氢酶HPI                     9.00

osmY        高渗诱导蛋白                      12.00

otsA        海藻糖-6-磷酸合酶                 11.00

poxB        丙酮酸脱氢酶                      15.00

rpoS        核糖核蛋白聚合酶sigma因子RpoS     4.00

wrbA        色氨酸阻遇物结合蛋白              14.00

DHCP对参与常规新陈代谢基因的影响

接下来检测DHCP处理如何影响细胞常规新陈代谢。类似于对膜的影响，DHCP处理影响许多参与细胞常规新陈代谢的过程，其中一些可能是DHCP处理的次级效应。44种基因在DHCP处理之后显示显著不同的表达水平(表5)。最突出的基因是参与半胱氨酸合成的蛋白的编码基因。观察到诸如cysA，cysD，cysH，cysI，cysJ，cysK，cysM，cysN，cysP，cysQ，cysU，和cysW等属于参与半胱氨酸合成的调节子的基因表达水平显著增加(3-20倍)。其中，cysK显示20倍的最大增加。有趣地是，不属于这些调节子的cysG和cysS不受DHCP处理的影响。属于其它操纵子的受DHCP处理诱导的基因分别属于涉及半乳糖和钼代谢的半乳糖操纵子和moa操纵子。另一方面，属于Ent操纵子的基因减少。fru(fruB和fruK)系统也被严重地抑制(分别为8和33倍)。

    表5.对DHCP产生应答的参与常规新陈代谢的基因

                                             比率

基因          基因产物和/或功能             (DHCP-处理/对照)

ackA          乙酰激酶                       0.28

AldH          醛脱氢酶同系物                 6.50

CtsA          硫酸盐/硫代硫酸盐转运蛋白      3.00

CysD          硫酸盐腺苷酰(基)转移酶         5.88

CysH          硫酸腺苷酸还原酶               6.50

CysI          亚硫酸盐还原酶(NADPH)α亚基    7.30

CysJ          硫酸盐还原酶(NADPH)β亚基      4.70

CysK          半胱氨酸合成酶                 20.00

CysM          O-乙酰丝氨酸(硫醇)-裂解酶B     3.00

CysN          硫酸盐腺苷酸转移酶             5.00

CysP          硫代硫酸盐-结合蛋白CysP前体    3.55

CysQ          铵基转运蛋白CysQ               3.28

cysU          硫酸盐转运系统透性酶           4.99

CysW          硫酸盐/硫代硫酸盐转运蛋白CysW  15.00

EntA          2，3-二氢-2，3-二羟基安息香酸  0.44

EntB          异分支酸酶                     0.23

EntC          异分支酸合成酶                 0.45

EntE          肠螯合素合成酶                 0.32

Fbp           果糖-1，6-二磷酸酶             4.00

FruB          PTS系统                        0.12

FruK          I-磷酸果糖激酶                 0.03

Gale          UDP-葡萄糖-4-差向异构酶        4.60

GalM          醛糖-1-差向异构酶              4.00

GalP          半乳糖质子同向转移蛋白         5.21

GalT          半乳糖-1-磷酸盐尿苷酰转移酶    6.50

GlnH          谷氨酰胺-结合蛋白前体          4.90

GltB          谷氨酸合酶(NADPH)大链          3.50

Gsp           谷胱甘酰亚精胺合酶/酰胺酶      3.80

HmpA      黄素血红蛋白                            3.80

HyfG      氢化酶-4组分G                           10.00

IlvB      乙酰乳酸合酶                            4.00

LysU      赖氨酸-tRNA连接酶                       4.00

MoaA      钼辅因子生物合成蛋白                    3.55

MoaB      MoaB蛋白                                4.00

MoaC      MoaC蛋白                                2.86

MoaD      蝶呤钼蛋白(mpt)转换因子                 4.30

Ndk       二磷酸核苷激酶                          0.20

PfkB      6-磷酸果糖激酶同工酶                    4.91

PheS      苯丙氨酸-tRNA连接酶                     0.25

PheT      苯丙氨酸-tRNA合成酶                     0.25

PtfB      磷酸转移酶系统酶II                      0.08

PyrD      二氢乳清酸氧化酶                        0.22

rfnC      DTDP-6-脱氧-D-葡萄糖-3，5-差向异构酶    0.21

RfbD      DTDP-6-脱氧-L-甘露糖-脱氢酶             0.27

DHCP影响许多具各种功能的蛋白

表6列举了在DHCP处理之后表现出显著的表达水平诱导或者抑制的35种基因。有趣地是，参与亚碲酸盐抗性的TehB蛋白的编码基因tehB，受诱导后增加5倍(表3)，类似于tehA。分别编码应答氧胁迫的烷基氢过氧化物还原酶，细菌铁蛋白和SoxS蛋白的AhpF，bfr和soxS基因受诱导时也增加4倍(Agnez-Lima等，2001；Cha等，1995和Chen等，1999)。编码MdaB的基因(mdaB)诱导后增加10倍。MdaB超量产生可能通过调节拓扑异构酶IV活性而赋予对两种拓扑异构酶抑制剂，阿霉素和鬼臼亚乙苷的抗性(Chatterjee等，1995)。然而，在本研究中，DHCP处理时编码拓扑异构酶IV两个亚基的基因parC和parE的水平不改变。编码多重抗生素抗性蛋白的marA基因诱导后增加5倍。谷氧还蛋白编码基因nrdH和nrdI显著地受DHCP诱导增加。有趣地是，参与毒性的基因诸如sap(对抗微生物肽的灵敏度)操纵子基因在DHCP处理后受到抑制。

表7列举了对DHCP产生应答的编码功能不明确蛋白的基因。

    表6 DHCP对具各种功能的蛋白的编码基因的影响

                                             比率

基因        基因产物和/或功能               (DHCP-处理/对照)

ahpF        烷基氢过氧化物还原酶             3.50

Bfr         细菌铁蛋白                       4.60

CirA        大肠杆菌素I受体前体              0.16

CspA        冷激蛋白                         0.38

CspB        冷激蛋白                         0.38

CspF        冷激蛋白                         0.14

CspI        冷激蛋白                         0.19

DnaJ        DnaJ蛋白                         0.28

FlhC        鞭毛转录激活因子FlhC             0.29

FlhD        鞭毛转录激活因子FlhD             0.11

FliC        鞭毛蛋白                         0.30

FliY        FliY蛋白前体                     9.00

Hns         DNA-结合蛋白H-NS                 0.30

HsdS        类型I限制性内切酶                0.21

MarA        多重抗生素抗性蛋白MarA           5.00

McrB        5-甲基胞嘧啶特异性限制性内切酶B  0.10

McrC        McrC蛋白                         0.11

MdaB        药物活性调节剂                   10.00

MrdA        青霉素结合蛋白                   0.25

MrdB        杆状决定蛋白MrdB                 0.24

NemA        N-乙基马来酰亚胺还原酶           8.00

NrdH        谷氧还蛋白类蛋白                 21.00

NrdI        NrdI蛋白                         9.50

SapA        肽转运周质蛋白SapA               0.28

SapC        肽转运系统透性酶蛋白             0.28

SapD        肽转运系统ATP-结合蛋白           0.17

SapF        肽转运系统ATP-结合蛋白           0.24

Sfa         Sfa蛋白                          0.24

SoxS        SoxS蛋白                     4.34

Sped        腺苷甲硫氨酸脱羧酶           0.23

Spot        SpoT蛋白                     0.22

SuhB        基因外抑制因子蛋白SuhB       0.23

TalA        Patatire转醛酶               7.60

TehB        亚碲酸盐抗性蛋白TehB         5.00

ZipA        细胞分裂蛋白                 4.50

        表7 DHCP对未知功能或者种类蛋白编码基因的影响

                                         比率

基因                                     (DHCP-处理/对照)

yafB                                      6.5

YbgS                                      24

YdiC                                      11

YedU                                      5

YeeD                                      9

YggG                                      4

YhbW                                      4.5

YhcN                                      5.5

YhhQ                                      6.5

YhjX                                      9

YidS                                      4

yieI                                      4

yjbJ                                      8

YmdD                                      0.2

YmgA                                      13

YnhA                                      3.8

YnhC                                      7.5

YnhD                                      8.2

YnhE                                      10

                DHCP抑制AI-2活性

在本研究中，使用Suretter和Basslerr设计的AI-2试验(Surette等，1999)。哈维氏弧菌BB170菌株报道分子菌株具有群体感应表现型，传感器1^-，传感器2⁺。它通过信号系统2检测器诱导lux表达。添加由哈维氏弧菌BB170菌株(含有系统2自诱导物)制备的10％无细胞培养液刺激报道分子菌株发光表达。DHCP被考虑作为参与种间群体感应自诱导物AI-2的候选物，而据报道DHCP不具有这种活性(Schauder等，2001)。本发明人实验室检验了DHCP是否抑制AI-2活性。如附图2A所示，与先前的报道一致(Schauder等，2001)，分离自哈维氏弧菌BB152菌株的AI-2显示出发光性(泳道2)，而DHCP不显示AI-2活性(泳道3)。使用无菌的AB培养基作为阴性对照(泳道1)。在添加包含无细胞提取物的AI-2前将DHCP(250μM-与用作DNA微阵列分析的浓度相同)加到试验中，AI-2活性被完全地抑制(泳道4)。据报道在大约10μM浓度时，AI-2产生最大量发光(Schauder等，2001)。应注意本试验使用的DMCP浓度超过AI-2浓度。同时试验了在AI-2产生最大量发光后加入DHCP是否可抑制AI-2活性。如附图2B所示，当以250μM浓度(实心圆)加入DHCP时，AI-2活性在8分钟内减小为零。当以100μM浓度(空心正方形)加入DHCP时，AI-2活性在40分钟后减小为零。不添加DHCP(空心三角形)的相应对照活性是完全稳定的。本发明人推断DHCP可有效地抑制AI-2活性。

讨论

DHCP处理的大肠杆菌细胞DNA阵列分析结果有两个重要方面：数据表明DHCP引起广泛效应以及参与复杂的大肠杆菌群体感应网络。

DHCP的抗细菌活性

本研究结果表明DHCP在大肠杆菌中有普遍的影响，影响许多参与常规新陈代谢以及膜合成与功能的蛋白编码基因。有趣地是，许多应答氧和渗透胁迫的基因被上调。此外，赋予亚碲酸盐抗性的tehA，tehB和cysK被显著地上调。对亚碲酸盐产生抗性的方式和其毒性机制对研究人员来说具有重大意义，且未被完全了解。已经表明(i)cysK介导大肠杆菌亚碲酸盐抗性，(ii)TehA和TehB赋予对亚碲酸盐的抗性；这些蛋白中的半胱氨酸残基参与与亚碲酸盐的结合并且TehB需要S-腺苷甲硫氨酸(SAM)以结合亚碲酸盐。在介导对亚碲酸盐的抗性时，它是一种可结合这两种化合物的二聚体，以及(iii)亚碲酸盐产生氧胁迫并在不同的蛋白中替换硫，致使它们成为无功能的(Syllick-Brenzinger等，2000；Garberg等，1999；Summers等，1977和Vasquez等，2001)。在本研究中，除cysK，tehA和tehB之外，应答氧胁迫的蛋白诸如AhpF，Dps，KatG，SoxS，和Bfr的编码基因被上调。这暗示DHCP可能在细胞中产生胁迫而其体现为本研究中观察到的许多次级效应。

DHCP参与群体感应

在革兰氏阴性细菌中，群体感应一般地参与酰化的高丝氨酸内酯(HSL)自诱导物，其合成依赖于一种‘LuxI’自诱导物合酶和一种同源的‘LuxR’自诱导物结合/转录激活因子蛋白。HSL诱导物与一种LuxR蛋白结合导致特异性靶基因的转录激活。首先在费希氏弧菌中鉴定出参与生物发光的LuxI-LuxR信号级联放大(Hastings等，1977和Nealson等，1979)。这种海洋革兰氏阴性细菌调节群体感应回路的虫萤光素酶的表达。另一方面，在哈维氏弧菌中，用于种内和种间通讯的两个自诱导物AI-1和AI-2分别被鉴定出来(综述见Schauder等，2001)。AI-2是高丝氨酸内酯而AI-2确切结构是未知的。最近认为AI-2可能是一种呋喃糖酰硼酸盐二酯(Chen等，2002)。Shauder等检查了DHCP的群体感应活性并发现它并不具有AI-2功能(schauder等，2001)。有趣地是，本研究结果表明DHCP事实上抑制AI-2活性。此外，DHCP可能通过参与AI-2合成的生物合成途径产生。这引起一种推测的可能性，即，DHCP参与大肠杆菌中AI-2功能的调控并随后调节基于AI-2的群体感应。

最近，对大肠杆菌响应AI-2的普遍转录模式进行了DNA微阵列分析(DeLisa等，2001)。一些实验包括：(i)参与运动性的蛋白诸如MotA和MotB的编码基因增加3倍，(ii)参与亚精胺/腐胺转运的蛋白的编码基因potABCD增加3-5倍。这些蛋白显示出与植物中由att操纵子编码的参与毒性的蛋白具有同源性(matthysse等，1996)，(iii)OmpA和OmpF的编码基因分别增加3.2和5.1倍，以及(iv)cysK和rpoS分别增加3和1.2倍。有趣地是，除了cysK和rpoS外(表4和5)，用DHCP处理看到相反的结果。这和报道分子试验中DHCP抑制AI-2活性相一致。在大肠杆菌另一群体感应途径中显示cysK是由不类似于AI-2的信号诱导的。与AI-2不同，这些信号是由大肠杆菌DH5α菌株产生，与葡萄糖无关并出现在静止期(Baca-DeLancey等，1999)。然而按照推测由这些信号诱导的基因诸如astD，tnaB和gabT不被DHCP诱导。还表明，吲哚作为信号诱导cysK，然而并不诱导gabT，显示参与不同的群体感应途径(Wang等，2001)。本结果可能与此相似。同样重要的是注意到用DHCP处理时一些受AI-2影响的基因的水平不改变。诸如rfa，wzb或者hha等基因用DHCP处理没有显著改变，而用AI-2处理显示改变。这些影响的确切原因是未知的，但是可能这些基因还由除了AI-2之外的其它因子调节，因此仅仅抑制AI-2活性并不导致它们的下调。最近，据报道鼠伤寒沙门氏菌AI-2控制在其吸收中起作用的ABC转运蛋白的表达。这些操纵子功能未知但是预测编码与核糖体转运操纵子(Rbs)显著相似的ABC转运蛋白复合体。它们被命名为lsr操纵子(Taga等，2001)。但是，AI-2普遍性影响的DNA阵列分析并未显示这一操纵子(DeLisa等，2001)。而同样在本研究中，有趣地是，AI-2诱导另一个编码ABC转运蛋白系统的操纵子即pot操纵子(DeLisa等，2001)。与此一致，在我们的研究中，DHCP处理导致这些操纵子的显著抑制(表3)。这暗示AI-2可能也参与其它ABC转运系统的调控，而其被DHCP抑制反映在至少其中一些操纵子的随后抑制中。

sap操纵于(sapA到sapF)显示参与菊欧文氏菌的毒性(Lopez-Solanilla等，1998)。报道说在费希氏弧菌中sap操纵子被LuxR-AI复合体调节，因此推断sap操纵子在生物发光中起作用(Chen等，2000)。费希氏弧菌的Sap蛋白和大肠杆菌Sap蛋白同源。DHCP抑制sap基因(表6)，这和报道分子试验中生物发光的抑制一致。一种特异性调节区类似的序列R&R*存在于费希氏弧菌的sap和lux调节子中。LuxR-AI结合到这个区域来调节相应的基因表达(Chen等，2000)。可能DHPC干扰LuxR-AI复合体结合到R&R*序列并反过来抑制诸如报道分子试验中的虫萤光素酶操纵子或者大肠杆菌sap操纵子等基因的转录。由此可推测DHCP可能关闭一个涉及AI-2的群体感应途径而打开涉及cysK诱导的另一途径。最近，在大肠杆菌低和高细胞密度培养物中，一些质粒编码的基因诱导后AI-2活性显示出显著降低。AI-2水平与每一蛋白产量线性相关(DeLisa等，2001)。这使得群体感应途径作为潜在的靶可用于设计优化策略来提高重组蛋白产量。DHCP对AI-2活性的抑制在这一方面可能非常重要。

总之，DHCP在大肠杆菌中具有广泛的影响。它抑制一些参与群体感应过程诸如毒性和运动性的基因，并抑制一种群体感应自诱导物本身活性。另一方面，已知参与替代群体感应途径的特定基因诸如cysK被极大地诱导，暗示DHCP可能调节大肠杆菌不同群体感应回路的打开/关闭。

现在已完全地描述本发明，本领域技术人员可以理解，不脱离本发明的精神和范围并且不经非常规实验，在广泛范围的各类同等参数，浓度，和条件下可完成同类的工作。虽然本发明的叙述与其具体的实施方案相关，应当理解它能够作进一步修饰。本申请将对本发明所作的任何变动，应用，或者修改包括在如下附加权利要求的的范围内，这些改变大体上遵循本发明的原则并包含有在本发明从属的技术领域中已知或者惯例范围内，适用于以上阐明的基本特征对本发明公开的偏离。

此处引用的所有参考文献，包括已出版杂志的文章或者摘要，或者相应的美国或外国专利申请，已出版美国或外国专利，或任何其它参考文献，是由此处引用的参考文献，包括出现在文献中的所有数据，表格，图片，和正文完整组成的。此外，此处引用文献中所引用的参考文献的完整内容也是由文献完整组成的。

对已知方法步骤，常规方法步骤，已知方法或者常规方法的参考并不是以任何方式承认本发明的任何部分，叙述或者实施方案于相关的技术领域中被公开，讲授或者提出。

前述的特定实施方案完全展现了本发明的总体特征，通过应用本技术领域中的知识(包括此处引用的参考文献的内容)，人们不难在没有不当的实验方法和不脱离本发明的总体概念的情况下修饰和/或改变这些特定的实施方案以作不同的应用。因此，基于此处出现的指导，这些修饰和改变不超出所公开实施方案同等的内涵和范围。应当理解，此处的措辞或者术语是因叙述起见而非进行限制，因此根据此处给出的技术和指导，结合本领域普通技术人员的知识，本说明的术语和措辞可以为本领域的技术人员理解。

参考文献

Agnez-Lima，L.F.，P.Di Mascio，B.Demple，和C.F.Menck.2001。单一分子氧触发大肠杆菌soxRS调节于。Biol Chem382：1071-5。

Altuvia，S.，M.Almiron，G.Huisman，R.Kolter，和G.Storz.1994。dps启动子在生长期被OxyR激活而静止期被IHF和sigma S激活。Mol Microbiol 13：265-72。

Avison，M.B.，R.E.Horton，T.R.Walsh，和P.M.Bennett.2001。大肠杆菌CreBC是基本培养基中应答生长的基因表达的普遍调节子。J Biol Chem 276：26955-61。

Baca-DeLancey，R.R.，M.M.South，X.Ding，和P.N.Rather.1999。大肠杆菌基因为细胞-细胞间信号传导调节。Proc Natl AcadSci USA 96：4610-4。

Byrne，C.R.，R.S.Monroe，K.A.Ward，和N.M.Kredich.1988。鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌cysK区域的DNA序列和其cysK区域与ptsH的连接。J Bacteriol 170：3150-7。

Cha，M.K.，H.K.Kim，和I.H.Kim.1995。大肠杆菌周质间隙硫氧还蛋白关联的″硫醇过氧化物酶″。J Biol Chem 270：28635-41。

Chatterjee，P.K.，和N.L.S ternberg.1995。大肠杆菌中决定杀肿瘤药剂作用机制的一种普通遗传方法：DMP 840，一种杀肿瘤药剂的应用。Proc Natl Acad Sci USA 92：8950-4。

Chen，C.Y.，和S.A.Morse.1999。淋病奈瑟氏菌细菌铁蛋白：结构异质性，对铁存储和防氧化胁迫的参与。Microbiology 145(Pt10)：2967-75。

Chen，H.Y.，S.F.Weng，和J.W.Lin.2000。费希氏弧菌sap基因的鉴定和分析-其属于ATP结合基因家族且为肽转运和抗微生物肽抗性必比需。Biochem Biophys Res Commun 269：743-8。

Chen，X.，S.Schauder，N.Pot ier，A.Van Dorsselaer，I.Pelczer，B.L.Bassler，和F.M.Hughson.2002。细菌含硼的群体感应信号的结构鉴定。Nature 415：545-9。

DeLisa，M.P.，J.J.Valdes，和W.E.Bentley.2001。通过AI-2的群体信号传导传达与大肠杆菌异源蛋白产量关联的″新陈代谢负担″。Biotechnol Bioeng 75：439-50。

DeLisa，M.P.，C.F.Wu，L.Wang，J.J.Valdes，和W.E.Bentley.2001。基于DNA微阵列鉴定大肠杆菌自诱导物2刺激的群体感应控制的基因。J Bacteriol 183：5239-47。

Dyllick-Brenzinger，M.，M.Liu，T.L.Winstone，D.E.Taylor，和R.J.Turner.2000。半胱氨酸残基在TehAB决定子介导的亚碲酸盐抗性中的作用。Biochem Biophys Res Commun 277：394-400。

Garberg，P.，L.Engman，V.Tolmachev，H.Lundqvist，R.G.Gerdes，和I.A.Cotgreave.1999。碲在用无机亚碲酸盐温育时结合到肝细胞的含硒蛋白：硒依赖的谷胱甘肽过氧化物酶活性的结果。Int J Biochem Cell Biol 31：291-301。

Hale，C.A.，和P.A.de Boer.1977.FtsZ直接结合到ZipA，一种隔膜环状结构的主要成分其介导大肠杆菌细胞分裂。Cell88：175-85。

Hastings，J.W.，和K.H.Nealson.1977。细菌生物发光。AnnuRev Microbiol 31：549-95。

Hengge-Aronis，R.2000。细菌胁迫应答。ASM Press，Washington D.C.p 161-178。

Koyama，N.等，1999.环戊酮，制备同类物的过程，和其应用。

Lopez-Solanilla，E.，F.Garcia-Olmedo，和P.Rodriguez-Palenzuela.1998。菊欧文氏菌sapA到sapF位点的失活显示植物和动物细菌发病机理的共同特征。Plant Cell 10：917-24。

Mahasreshti，P.J.，G.L.Murphy，J.H.Wyckoff，3rd，S.Farmer，R.E.Hancock，和A.W.Confer.1997。溶血巴斯德氏菌OmpA家族蛋白的和部分特征分析。Infect Immun 65：211-8。

Martinez，A.，和R.Kolter.1997。非特异性的DNA结合蛋白Dps在氧化胁迫期间保护DNA.J Bacteriol 179：5188-94。

Matthysse，A.G.，H.A.Yarnall，和N.Young.1996。根癌土壤杆菌的附着和毒性需要ABC转运系统同源的基因。J Bacteriol178：5302-8。

Milller，C.H.，和J.A.Duerre.1968。大肠杆菌S-核糖基高半胱氨酸裂解酶。J Biol Chem 243：92-7。

Miller，M.B.，和B.L.Bassler.2001。细菌中的群体感应。AnnuRev Microbiol 55：165-99。

Nealson，K.H.，和J.W.Hastings.1979。细菌生物发光：其控制和生态意义。Microbiol Rev 43：496-518。

Phadtare，S.，K.Yamanaka，I.Kato，和M.Inouye.2001.4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮(DHCP)的抗细菌活性和赋予大肠杆菌DHCP抗性的基因的克隆。J Mol Microbiol Biotechnol 3：461-5。

Sarmientos，P.，J.E.Sylyester，S.Contente，和M.Cashel.1983。来自rrnA操纵子体内表达多拷贝质粒的串联大肠杆菌核糖体RNA启动子的差别严谨型控制。Cell 32：1337-46。

Schauder，S.，和B.L.Bassler.2001.细菌的语言。Genes Dev15：1468-80。

Schauder，S.，K.Shokat，M.G.Surette，和B.L.Bassler.2001.LuxS家族细菌自诱导物：一种新的群体感应信号分子的生物合成。Mol Microbiol 41：463-76。

Sitnikov，D.M.，J.B.Schineller，和T.O.Baldwin.1996.大肠杆菌细胞分裂的控制：ftsQA转录调控参与rpoS和SdiA介导的自诱导。Proc Natl Acad Sci USA 93：336-41。

Summers，A.O.，和G.A.Jacoby.1977。质粒决定的碲化合物抗性。J Bacteriol 129：276-81。

Surette，M.G.，和B.L.Bassler.1999.鼠伤寒沙门氏菌自诱导物产量的调控。Mol Microbiol 31：585-95。

Taga，M.E.，J.L.Semmelhack，和B.L.Bassler.2001.LuxS依赖的自诱导物AI-2控制鼠伤寒沙门氏菌AI-2吸收中起作用的ABC转运蛋白的表达。Mol Microbiol 42：777-93。

Takayanagi，Y.，K.Tanaka，和H.Takahashi.1994。大肠杆菌rpoS基因5′上游区域的结构和其调控。Mol Gen Genet 243：525-31.

Triggs-Raine，B.L.，B.W.Doble，M.R.MuIvey，P.A.Sorby，和P.C.Loewen.1988。大肠杆菌过氧化氢酶HPI编码基因katG的核苷酸序列。J Bacteriol 170：4415-9。

Turner，R.J.，D.E.Taylor，和J.H.Weiner.1997。大肠杆菌TehA表达产生类似多重药物抗性排除泵的防腐剂和消毒剂抗性。Antimicrob Agents Chemother 41：440-4。

Vasquez，C.C.，C.P.Saavedra，C.A.Loyola，M.A.Araya，和S.Pichuantes.2001。嗜热脂肪芽孢杆菌V cysK基因产物介导大肠杆菌亚碲酸钾抗性。Curr Microbiol 43：418-23。

Walter，E.G.，J.H.Weiner，和D.E.Taylor.1991。来自IncHII质粒pHH1508a的亚碲酸盐抗性决定子的核苷酸序列和超表达。Gene 101：1-7。

Wang，D.，X.Ding，和P.N.Rather.2001。吲哚作为大肠杆菌胞外信号。J Bacteriol 183：4210-6。

Whitehead，N.A.，A.M.Barnard，H.Slater，N.J.Simpson，和G.P.Salmond.2001。革兰氏阴性细菌群体感应。FEMS MicrobiolRev 25：365-404。

Yanisch-Perron，C.，J.Vieira，和J.Messing.1985。改进的M13噬菌体克隆载体和宿主菌株：M13mp18和pUC19载体核苷酸序列。Gene 33：103-19。

Yim，H.H.，R.L.Brems，和M.Villarejo.1994.一种rpoS依赖的基因，osmY的启动子的分子鉴定。J Bacteriol 176：100-7.

Yim，H.H.，和M.Villarejo.1992。一种新的高渗诱导基因，osmY，编码一种大肠杆菌周质蛋白。J Bacteriol 174：3637-44。

                    序列表

<110>S.普拉德塔雷(PHADTARE，Sangita)

加藤郁之进(KATO，Ikunoshin)

井上正顺(INOUYE，Masayori)

<120>4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮(DHCP)处理对细菌基因表达和群体感应的影响(EFFECTOF TREATMENT WITH 4，5-DIHYDROXY-2-CYCLOPENTEN-1-ONE(DHCP)ON GENE EXPRESSION ANDQUORUM-SENSING IN BACTERIA)

<130>PHADTARE＝1.1PCT

<150>60/363,548

<151>2002-03-13

<150>60/402,041

<151>2002-08-09

<160>8

<170>PatentIn 3.2版

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>1

tacagccagc agagtt ttcg aaat                                           24

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>2

tacagccagc agagttttcg aaat                                            24

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>3

cagcgtattc tgactcataa ggtg                                            24

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>4

agtggctgtg gtgttatgga tatc                                            24

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>5

caggcgaacc agcggcgtgt gacc                                            24

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>6

caggcgaacc agcggcgtgt gacc                                            24

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>7

gattaatatc agacgcaaat cct                                             23

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的

<400>8

acgggatcct tcatcat tat ttatta                                         26

Claims (25)

1.一种调控微生物基因的方法，包括：

将其中基因需要进行调控的微生物与4，5-二羟基-2-环戊烯-1-酮(DHCP)接触；以及

调控微生物中的基因，其中所述基因选自编码核醣体蛋白的基因、应答胁迫的基因、参与膜合成以及膜功能的基因、参与常规新陈代谢的基因、编码具各种功能的蛋白的基因以及编码未知功能的蛋白的基因。

2.根据权利要求1的方法，其中所述基因选自列于表1-7的基因及其同系物。

3.根据权利要求1的方法，其中所述基因参与群体感应过程。

4.根据权利要求3的方法，其中所述基因由于种间自诱导物AI-2活性的抑制而受到调控。

5.根据权利要求3的方法，其中所述基因由于群体感应回路的打开/关闭而受到调控。

6.一种用于通过权利要求1所述方法来调控微生物基因的组合物，其中含有作为活性成分的DHCP。

7.DHCP在制备用于通过权利要求1所述方法调控微生物基因的组合物中的应用。

8.一种筛选生理活性物质的方法，包括：

(a).在候选物质存在以及缺少的情况下培养微生物；

(b).在候选物质存在以及缺少的情况下测定微生物中的基因表达水平，其中所述基因是其表达水平受DHCP影响的那些基因；

(c).将影响至少一种基因表达水平的候选物质鉴定为生理活性物质，其中所述基因在候选物质存在下的表达水平与缺少候选物质时的表达水平相比有显著地增强或减弱。

9.根据权利要求8的方法，其中所述基因选自列于表1-7的基因及其同系物。

10.根据权利要求8的方法，其中所述基因的表述水平基于基因转录的mRNA量进行测定。

11.根据权利要求10的方法，其中通过利用DNA微阵列杂交测定基因的表达水平。

12.一种可以通过权利要求8的方法获得的生理活性物质。

13.一种用于增加微生物中重组多肽产量的方法，包括：

(i)在DHCP存在的情况下培养微生物以增加重组多肽的表达和产量；以及

(ii)回收从培养物中产生的重组多肽。

14.一种抑制种间群体感应诱导物活性的方法，其中DHCP用作活性成分。

15.根据权利要求14的方法，其中该诱导物是AI-2。

16.一种用于调控群体感应的组合物，其中含有DHCP。

17.根据权利要求16的组合物，其调控cysK的表达。

18.一种用于打开/关闭群体感应回路的组合物，其中含有DHCP。

19.一种用于抑制种间群体感应诱导物活性的组合物，其中含有DHCP。

20.根据权利要求19的组合物，其中所述诱导物是自诱导物AI-2。

21.一种用于调控胁迫应答基因表达的组合物，其中含有DHCP。

22.一种用于调控群体感应调控基因表达的组合物，其中含有DHCP。

23.一种用于调控选自表1-7所列基因的基因的表达的组合物，其中含有DHCP。

24.一种用于促进重组蛋白分泌的组合物，其中含有DHCP。

25.一种用于保持内环境稳态的组合物，其中含有DHCP。

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