KR20040099280A - 세균의 유전자 발현 및 정족수-감지에 대한4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온(ｄｈｃｐ) 처리 효과 - Google Patents

Abstract

DHCP (4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온)이 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에 대하여 항균활성을 갖는것은 이미 보고되었다. E. coli의 전체 전사 패턴을 DNA 마이크로어레이에 의해 DHCP에 대한 분석하였다. 일반 대사 및 막 합성 및 작용에 관여하는 단백질들을 코딩하는 다수의 유전자에 작용하면서, E. coli에서 전체적으로 효능을 갖고 있다. 또한, rpoS 및 다양한 스트레스에 대한 RpoS-조절 유전자는 상향 조절된다. DHCP는 또한 종간 정족수-감지에 관여하는 자가 유도인자인 AI-2를 저해하고 정족수-조절 프로세스 예를 들면, 독성, 운동성 및 외막 작용을 포함하는 유전자는 DHCP 처리에 의해 하향 조절된다. 또한, E. coli에서 다른 경로(들)에서 작용하는 공지된 정족수-감지 유전자인 cysK는 DHCP에 대하여 현저하게 증가한다. 이 결과는 DHCP가 E. coli에서 상이한 정족수-감지 회로의 스위치의 온/오프를 조절할 수 있다는 것을 제안한다.

Description

세균의 유전자 발현 및 정족수-감지에 대한 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온(ＤＨＣＰ) 처리 효과{EFFECT OF TREATMENT WITH 4,5-DIHYDROXY-2-CYCLOPENTEN-1-ONE (DHCP) ON GENE EXPRESSION AND QUORUM-SENSING IN BACTERIA}

다양한 세균에 대한 다수의 항생제가 이용가능하다; 그러나, 최근에는 다약제내성 세균의 출현이 주요 관심사가 되었다. 이것이 더욱 신규하고 더욱 효능이 있는 화합물 연구에 대한 동기를 부여하고 있다. 앞서, 본 발명자들의 실험을 통해 E. coli, 살모넬라, 바실러스, 스타피로코쿠스 등과 같은 다양한 그램-음성 및 그램-양성 박테리아에 대하여 항균 활성을 갖는 화합물, 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온 (DHCP)이 보고되었다. DHCP는 우론산 또는 그의 유도체를 열-처리하여 제조된다(Koyama et al., 1999). 또한, 굽거나 볶은 야채, 과일, 시리얼, 버멋, 해조류, 외피 또는 연골로부터 제조된다. 암에 대한 치료제 또는 예방제, 및 소독제, 치약, 화장품 및 목욕제에서의 항균제로서 강력한 사용 적용성을 갖는 것으로 나타났다(Koyama et al., 1999). DHCP는 또한 미생물에 의해 합성될 수 있다. DNA, RNA 또는 단백질의 생합성에서 메틸 공여자로서 S-아데노실메티오닌 (SAM)를 사용할 때, 수개의 SAM-의존 메틸트랜스퍼라제는 메틸 그룹을 SAM으로부터 S-아데노실호모시스테인(SAH)를 생산하는 그의 기질로 이동시키고, 이어서, 효소 Pfs로 분해되므로써 S-리보실호모시스테인(SRH)을 생산하게 된다. 이는 최종적으로 호모시스테인 및 4,5-디하이드록시-2,3-펜탄디온으로 전환된다(Miller et al., 1968 and Schauder et al., 2001). 이 구조에 기초하여 후자로부터 DHCP를 형성할 수 있다.

DHCP 독성에 대한 멀티카피 억제자를 E. coli 게놈 라이브러리로부터 분리하였다. 이 억제제를 코딩하는 유전자를 dep로 디자인하고 추정의 단백질을 이 유전자에 의해 Dep로 코딩하였다. Dep 단백질은 클로람페니콜, 바이사이크로마이신 및 테트라사이클린를 포함하는 다수의 항생체에 대한 내성을 제공하는 공지된 유출 단백질와 고도의 상동성을 나타낸다. 그러나, 시험하고자 하는 항생제 어느 것에 대하여도 교차-내성은 제공하지 못했다(Phadtare et al., 2001). DHCP의 정확한 작용 기작은 공지되어 있지 않다.

최근, DHCP는 E. coli에서 정족수-감지와 관련된 연구에서 관심의 대상이 되고 있다(Schauder et al., 2001). 다수의 세균은 성장기와 관련된 저분자 시그날링 페르몬을 분비하여 특정 유전자의 발현을 조절하는 능력을 갖는다. 이 공정을 정족수-감지로 명명한다. 정족수-감지에 의해 조절되는 생리학적 과정은 다양한 종의 세균에서 발생하고 이는 생체발광, 항생제 합성, 병원성, 단백질 분비, 캡슐 엑소폴리사카라이드 합성, 균막 형성 및 운동성을 포함한다(참조: Miller et al., 2001; Schauder et al., 2001 and Whitehead et al., 2001). 세포 밀도를 조절하는 것이 그의 중요한 성질중 하나이고 그러한 반응을 형성하는 다수의 화합물은 항균 활성을 갖고 있기 때문에 정족수-감지 연구가 특히 중요하다. 그램-음성 생체발광해양세균인 비브리오 하베이(Vibrio harveyi)는 두개의 상이한 자가 유도인자 AI-1 및 AI-2에 대하여 빛 생산을 조절한다. AI-1은 호모세린 락톤이고 종내(intraspecie) 커뮤니케이션에 사용된다. AI-2는 종간 커뮤니케이션에 사용되고 그의 구조는 공지되어 있지 않다. AI-2는 SAM으로부터 제조되고 그의 생체합성에서 생체합성 경로 및 생화학 중간물질은 E. coli, S. 티피무리움(S. typhimurium), V. 하베이(V. harveyi), V. 콜레라(V. cholerae) 및 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)와 동일하다. 수개의 화합물을 AI-2에 대한 후보물질로서 선별하고, 이중 하나로 DHCP가 포함되었다. 그러나, DHCP는 선별 분석에서 어떠한 활성도 나타내지 못했기 때문에 AI-2에 대한 가능한 후보물질로서 제외되었다(Schauder et al., 2001).

본 명세서에서 문헌을 인용하는 것은 상기 문헌이 적절한 선행 기술이거나, 본 출원의 청구범위의 특허성에 중요한 것으로 판단되는 것이다. 문헌의 내용 및 날짜에 대한 언급은 출원시 출원이이 이용할 수 있는 정보에 기초하고 그 언급에 대한 허용까지 포함하지는 않는다.

세균에서의 유전자 발현 및 정족수-감지(quorum-sensing).

발명의 요약

본 발명은 조절하고자 하는 유전자를 포함하고 있는 미생물을 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온(DHCP)과 접촉시켜 미생물내 유전자를 조절하여, 미생물내 유전자를 조절하는 방법을 제공한다. 조절하고자 하는 유전자는 스트레스에 반응하는 유전자, 막 합성 및 막 기능에 관여하는 유전자, 다양한 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자, 및 미지의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 제한하는 것은 아니지만, 조절하고자 하는 유전자의 예로서 하기 표 1-7에 열거된 유전자 및 그의 상동체를 포함한다. 바람직하게, 유전자는 정족수-감지 회로(circuit) 또는 종간 자가 유도인자 AI-2의 활성의 스위치 온/오프 결과와 같은 정족수-감지 프로세스에 관여한다.

본 발명은 또한 DHCP에 발현 수준이 영향을 받는 유전자의 발현 수준에 영향을 주는 생리학적으로 활성인 물질을 선별하는 방법, 및 이 방법에 의해 수득할 수 있는 생리학적으로 활성인 물질을 제공하는 것이다. 이 방법은 후보물질의 존재 및 부재하에서 미생물을 인큐베이션시킨 후 후보물질의 존재 및 부재하에서 미생물내 DHCP에 발현 수준이 영향을 받는 유전자의 발현 수준을 측정하는 것을 포함한다. 후보 물질의 부재하에서의 발현 수준에 비하여 후보 물질의 존재하에서의 발현 수준이 현저히 증가되거나 감소된 경우, 상기 후보 물질을 적어도 하나의 유전자의 발현 수준에 상당히 영향을 주는 생리학적으로 활성인 물질로서 동정한다. 선별 방법에 사용하기 위한 유전자의 예로서 제한하는 것은 아니지만, 하기 표 1-7에 열거된 유전자 및 그의 상동체를 포함한다. 바람직한 일례로, 유전자로부터 전사된 mRNA의 양에 기초하거나 DNA 마이크로어레이를 사용하는 하이브리제이션에 의해 유전자의 발현 수준을 측정한다.

본 발명의 또다른 일면은 재조합 폴리펩티드의 발현 및 생산을 증진시키기 위하여 DHCP의 존재하에 미생물을 배양한 후 배양액으로부터 생산된 재조합 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 미생물에서 재조합 폴리펩티드 생산을 증진시키는방법에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 일면은 활성 성분으로서 DHCP을 사용하여 종내 정족수-감지 유도인자, 예로서 유도인자 AI-2의 활성을 저해하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 일면은 본 발명의 방법에 의해 미생물내 유전자 조절을 위한 조성물의 제조에 사용하기 위한 DHCP의 용도 및 미생물내 유전자 조절; 정족수-감지, 예를 들면, cysK 발현 조절; 정족수-감지 회로의 스위치의 온/오프; 종내 정족수-감지 유도인자, 예를 들면, AI-2의 저해; 스트레스 반응에 대한 유전자의 발현 조절; 정족수-감지를 위한 조절 유전자의 발현 조절; 재조합 단백질의 분비 촉진; 표 1-78에 열거한 것으로부터 선택된 유전의 발현 조절, 또는 항상성 유지를 위한 활성 성분으로서 DHCP를 포함하는, 조성물에 관한 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 mRNAs의 수준에 대한 DHCP의 효능을 보여주는 겔이다. 실시예 1의 재료 및 방법부에 기술된 바와 같이 뜨거운 페놀에 의해 전체 RNA를 추출하고, osmY, dps, rpoS, katG, cysK, tehA, zipA, 및 ompF에 상응하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 프라이머 신장 분석을 수행하였다. 각각의 경우에서 래인 1 및 2는 각각 대조군(비처리군) 및 DHCP 처리 세포로부터 분리된 mRNAs를 나타낸다.

도 2A 및 2B는 DHCP가 AI-2 활성을 저해하는 것을 보여주는 그래프이다. 실시예 1의 재료 및 방법부에 기술된 바와 같이 AI-2 활성 분석을 수행하였다. V. harveyi BB152로 나타낸 형광을 100%로 가정하고 다른 활성을 상대값(%)으로 나타내었다.

본 발명은 일례를 제공하며 본 발명의 제한하고자 하는 것이 아닌 하기 실시예를 참고로 하여 더욱 용이하게 이해될 것이다.

실시예 1

본 발명자들은 (i) DHCP의 항균활성을 갖는다는 것을 조사하고 (ii) E. coli의 정족수-감지 경로에 DHCP가 관여할 수 있다는 가능성을 조사하기 위하여 DNA 마이크로어레이에 의해 DHCP에 대한 E. coli의 전체 전사 패턴을 분석하였다. 본 발명자들이 얻은 결과를 통해 (i) DHCP는 E. coli에서 단백질 involved 통상의 대사 및 막 합성 및 및 작용에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자에 영향을 주는, 광범위한 효과를 갖고, (ii) 정족수-조절 프로세스 예를 들면, 독성, 운동성 및 외막 작용을 포함하는 유전자는 DHCP 처리에 의해 영향을 받는다. 독성과 관련된 유전자, 예를 들면, sapF(Lopez-Solanilla et al., 1998), potA, 및 potB(DeLisa et al., 2001)의 발현 수준은 DHCP로 처리된 세포에서 감소하였다. E. coli로부터의 sapF 유전자는 V. fischeri로부터의 sapF 유전자와 상동성이며, 후자는 LuxR-AI 복합체에 의해 증진되는 것으로 나타났고, 이로써, sapF가 V. fischeri의 생체발광에 중요한 작용을 한다고 제안되었다(Chen et al., 2000). 또한, E. coli의 대체 경로에서 작용하는 공지된 정족수 감지 유전자인 cysK(Baca-DeLancey et al., 1999)는 DHCP에 대하여 현저하게 증가하였다. 실시예에 나타낸 바와 같이 이 결과를 통해 DHCP는 E. coli의 상이한 정족수-감지 회로의 온/오프 조절한다고 제안되었다.

재료 및 방법

세균 균주

E. coli 야생형 균주 JM83 [F^-araΔ((lac-proAB) rpsL(str^r)](Yanisch-Perron et al., 1985)를 Luria 브로쓰 (LB)에서 배양하였다. V. harveyi 균주 BB152 및 BB170는 Dr. Bonnie Bassler (Princeton University)로부터 제공받았다. 이들 균주를 앞서 기술된 바와 같이 AB 배지에서 배양하였다 (Surette et al., 1999).

RNA 분리

LB 배지에서 밤새도록 배양된 E. coli 세포를 신선한 LB 배지로 희석하였다. 성장이 50 Klett 유니트에 도달한 후, DHCP를 가하고(250μM) 추가로 성장을 모니터하였다. 성장이 90-100 Klett 유니트에 도달한 후, 상기 기술된 바와 같은 동일한 농도의 DHCP를 포함하는, 배지로 10배 희석시켰다(Phadtare et al. , 2001). DHCP와 함꼐 총 8h동안 인큐베이션시킨 후 세포를 수거하였다. 대조군 세포는 DHCP를 사용하지 않고 동일한 방식으로 배양시키고 DHCP-처리 세포의 최종 OD₆₀₀에 비교할 만한 OD₆₀₀에서 수거하였다. 상기 기술된 바와 같이 뜨거운 페놀에 의해 전체 RNA를 추출하였다(Sarmientos et al. , 1983). 추가로 RNeasy Minikit (Qiagen)에 의해 정제한 후DNase I로 처리한 후 페놀-클로로포름 처리하고 에탄올 침전시켰다. 260nm에서 흡광도를 측정하여 측량하였다. RNA의 순도는 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인하였다.

DNA 마이크로어레이 분석

mRNAs를 Cy3-dUTP 및 Cy5-dUTP (Amersham Pharmacia)로 표지하였다. 랜덤 Hexamer pd (N)₆(Amersham Pharmacia)을 프라이머로서 사용하고 IntelliGene E. coli CHIP Version 1 (Takara Shuzo, Co. Ltd. , Japan) DNA 마이크로어레이마이크로어레이를 사용하였다. 이는 E. coli K-12 W3110의 전체 ORF를 나타낸다.

프라이머 신장

각 mRNAs 검출을 위해 사용되는 프라이머는 프라이머 750077, 5'-TACAGCCAGCAGAGTTTTCGAAAT-3' (서열번호 : 1)(osmY의 15 내지 8번째 코돈 서열과 일치(Yim et al. , 1992)); 프라이머 750078, 5'- ATAAAGCAGATTGGTCGCTTTTGA-3' (서열번호 : 2)(dps의 16 내지 9번째 코돈 서열과 일치(Altuvia et al. , 1994)); 프라이머 979747, 5'-CAGCGTATTCTGACTCATAAGGTG-3' (서열번호 : 3)(rpoS의 6번째 코돈으로부터의 부위에 일치 (Takayanagi et al. , 1994)); 프라이머 956660, 5'-AGT GGCTGTGGTGTTATGGATATC-3' (서열번호 : 4)(katG의 13 내지 6번째 코돈으로부터의 부위와 일치(Triggs-Raine et al., 1998); 프라이머 3969805, 5'-CAGGCGAACCAGCGGCGTGTGACC-3' (서열번호 : 5)(cysK의 20 내지 13번째 코돈으로부터의 부위와 일치(Byrne et al. , 1988)); 프라이머 3969806,5'- GTAGCCTGCCGGCAAATTGAGCAC-3' (서열번호 : 6)(tehA의 13 내지 6번째 코돈으로부터의 부위와 일치(Walter et al., 1991)); 프라이머 3969807, 5'GATTAATATCAGACGCAAATCCTG-3' (서열번호 : 7)(zipA의 1 내지 3번째 코돈으로부터의 부위와 일치 (Hale et al. , 1997)); 및 프라이머 7018 5'-ACGGGATCCTTCATCATTATTTATTA-3' (서열번호 : 8)(ompF의 1번째 코돈으로부터 포함하는 부위를 포함)(수탁번호, J01655, M10311 and M10312)이었다. T4 폴리뉴클레오티드 키나제(Gibco BRL)를 사용하여 프라이머를 [ν-³²P]ATP (Du-Pont-New England Nuclear]로 표지하였다. 50 mM Tris-HCl (pH 8.5), 8 mM MgCl₂, 30 mM KCl, 1mM 디티오트레이톨, 0.4 pmol의³²P-표지된 프라이머, 0.5 mM의 각 dNTPs, 10 U RNase 저해제 (Boehringer Mannheim) 및 6.25 U의 역전사효소(Boehringer Mannheim)를 포함하는 최종 반응 부피 10㎕로 1h동안 42℃에서 5μg의 RNA로 프라이머 신장을 수행하였다. 산물을 변성 조건하에 6% 폴리아크릴아미드 겔상에서 분석하였다. 직접 방사능을 측정하여 프라이머 신장 산물의 측량하였다.

AI-2 분석

Surette and Bassler (Surette et al. , 1999)에 의해 기술된 바와 같이 V. harveyi 리포터 균주 (BB170)를 사용하여 AI-2 분석을 수행하였다. V. harveyi BB152 균주로부터의 무세포 배양액을 양성 대조군으로 사용하였다. 무균 AB 배지를 음성 대조군으로서 사용하였다. 간단하게, V. harveyi BB170 균주를 AB 배지에서 30℃에 밤새도록 통기시키면서 배양하고 세포를 신선한 배지에서 1: 5000로 희석시켰다. 희석된 배양액(90㎕)을 10㎕의 AB 배지 또는 V. harveyi BB152/DHCP의 무세포 배양액(100-250μM)을 포함하는 분석 혼합물에 가하였다. DHCP가 AI-2에 의한 빛 생산에 미치는 효과를 체크하기 위하여 최대 형광에 도달한 후 반응 혼합물에가하였다. 빛 생산은 액체 섬광 계수기로 모니터하였다.

결과

앞서, 본 발명자들의 실험을 통해 E. coli JM83의 성장은 3h동안 인큐베이션시킨 후 DHCP (250μM)의 존재하에서 심각하게 약화되었고, 5h후 세포는 성장을 멈추었다(Phadtare et al. , 2001). 본 연구의 주된 목적은 DHCP 처리에 의해 mRNA의 양을 현저히 증가 또는 감소시키는 모든 E. coli ORFs를 확인하는 것이다. 사용된 대조군(비처리군) 및 DHCP-처리 세포의 세포 밀도는 동일하였다; 따라서 마이크로어레이에서 나타난 변화는 실질적으로 세포 밀도차에 의해 실질적으로 영향을 받지 않는다. 각 세포로부터 분리된 RNAs를 사용하여 DNA 어레이의 하이브리제이션용 프로브를 제조하고 실시예 재료 및 방법에 기술된 바와 같이 데이타를 측량하였다. 상응하는 스팟의 로그식 비를 추정하므로써 2기의 성장 조건하의 각 E. coli 유전자에 대한 상대적인 전사 수준을 쌍(pair-wise)으로 비교할 수 있었다. 로그비가 적어도 4개까지 상이한 발현 수준의 유전자만을 주시하였다. 일부 경우, 로그비가 단지 3개 또는 3개미만까지 상이한 경우에도 동일한 오페론 또는 카테고리에 속하는 유전자로 주시하였다. 값이 0 초과인 로그비는 DHCP 처리에 의한 유도이고 0 미만인 값은 DHCP 처리에 의한 억제로 나타낸다. 상당히 영향을 받은 몇몇 유전자에 상응하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 프라이머 신장에 의해 DNA 마이크로어레이 분석에서 나타난 결과를 확인하였다. 이 결과를 도 1에 나타내고 표 1에 요약한다. 양 방법의 결과는 서로 일치한다.

표 1. DNA 마이크로어레이 및 프라이머 신장으로부터의 데이타 비교

대조군(비처리군) 세포에 대한 DHCP-처리군에서의 각 mRNA 수준의 비를 나타낸다.

본 발명자들은 실험을 통해 다수의 반응 유전자가 광범위한 작용 카테고리에 포함하고 있다는 것을 관찰하게 되었다: (i) 리포솜 단백질을 코딩하는 유전자, (ii) 스트레스 반응-RpoS 및 RpoS-조절 단백질의 전체 조절자를 코딩하는 유전자, (iii) 운반체와 같이 막 합성 및 작용에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자, (iv)일반 대사에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자, (v) 여러 작용을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자, 및 (vi) 알려져 있지 않는 작용을 갖는 가정의 단백질 또는 그 부류를 코딩하는 유전자.

리포솜 단백질을 코딩하는 유전자는 DHCP 처리에 영향을 받는다.

본 실험에서 선택되는 DHCP의 농도는 성장을 심각하게 약화시키기 때문에, 성장 저해 그 자체에 기이하여 현저한 2차 효과를 예상할 수 있고, DHCP의 작용 부위는 반영할 필요가 없을 것이다. 리보좀 단백질의 수준이 저하되는 것으로 입증되는 바 성장 속도가 느려진다는 것은 세포의 해독 수단이 영향을 받았을 의미한다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 리보솜 L 단백질을 코딩하는 대부분의 유전자는 효능은심각하지 않은 대부분의 경우에도(2-3배) 수준이 감소한 것으로 나타났다.

표 2. 리포솜 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 DHCP,의 효능

막-관련 작용에 대한 DHCP의 효능

상이한 부류의 유전자에 대한 DHCP의 효능을 조사하였다. 표 3에 나타낸 같이, 세포막과 관련된 단백질을 코딩하는 40개의 유전자는 현저하게 영향을 받았다. 무엇보다도, 세포 운반 시스템 특히, 철 운반에 관여하는 것(fecA, fecB, fecC, fecD, fepA 및 fepC) 및 스퍼미딘/푸트레신(potA, potB, potC 및 potD)이 영향을 받았다. 외막 단백질을 코딩하는 유전자(Omp) 또한 감소하였다(5-15배). motA, motB 및 cheA같이 운동 작용에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자는 4-6배 감소하였다. 흥미롭게도, 아연-운반 ATPase를 코딩하는 atzN는 11배 증가하였다. 가장 뚜렷한 차이(47배 증가)는 CreD을 코딩하는 creD에서 나타났다. CreD의 정확한 작용은 알려져 있지 않기 때문에(Avison et al. , 2001), 이러한 관찰의 생리학적 유의성을 판단하기는 어렵다. 흥미로운 점은 creD이 cre 레굴론의 1번째 구성원이자 저체 조절자로서 가정된 CreBC에 의해 조절된다는 것이다(vision et al. , 2001). CreBC에 의해 조절되는 또다른 유전자는 talA(Avision et al. , 2001)로, 본 연구에서 7.6배 증가하였다(표 6). talA는 글리세랄데히드-3-포스페이트를 펜토스 포스페이트 경로로 이동시키는데 관여하는 효소를 코딩한다. 다른 CreBC-조절 유전자, 예를 들면 yidS, 및 yieI(이는 그 산물에 어떤 작용도 제공하지 않는다)는 4배 증가하였다(표 7). 그러나 CreBC에 의해 조절되는 것으로 알려진 유전자, 예로서 ackA, pta, radC, malE 및 trgB는 DHCP에 의해 유도되지 않는다. 실제로, ackA 3.6배 감소하였다(표 5). 일부 추가의 인자가 이들 유전자 발현 조절에 관여할 수 있다.

중요하게도 텔루라이드에 내서을 제공하는 단백질을 코딩하는 tehA의 수준은 5배 증가하였다. 텔루라이드는 다수의 그램-음성 세균에서 독성을 일으키고, 이 독성에 대한 정확한 기작은 알려져 있지 않지만 이는 다양한 단백질에서 산소성 스트레스를 유발하고, 황으로 대체시켜 이를 비작용성으로 만들 수 있다(Garberg et al. , 1999 and Summers et al. , 1977). 또한, tehA의 과잉발현은 다중약물 내성 펌프에 의해 추론되는 것과 유사하게 테트라페닐아르소늄 CI, 에티디움 브로마이드, 결정형 바이올렛 및 프로플라빈과 같은 화합물에 내성을 제공한다(Turner et al. , 1997).

표 3 막 합성 및 막-관련 작용에 관여하는 유전자에 대한 DHCP의 효능

DHCP는 RpoS 및 RpoS에 의해 조절된 단백질을 유도한다.

RpoS는 전체 스트레스 반응 조절자이고 이는 또한 E. coli의 정족수-감지에 관여하는 것으로 알려져 있다(Hengge- Aronis, 2000 and Sitnikov et al. , 1996). 다음으로, rpoS 수준에 대한 DHCP의 효능을 조사하고 DHCP로 처리한 후 rpoS이 4배 유도되었음을 발견하였다. 산소성 및 삼투압성 스트레스에 의해 유도되는 단백질인Dps를 코딩하는 유전자 dps(Altuvia et al. , 1994 and Martinez et al. , 1997)는 13배 유도되었다(표 4). RpoS-조절 스트레스 단백질 OsmY 및 KatG을 코딩하는 osmY 및 katG(Hengge-Aronis, 2000 and Yim et al. , 1994)과 같은 다른 유전자 또한 현저히 유도되었다. 흥미롭게도, 스트레스 반응에 관여하지 않는 일부 다른 RpoS-조절 단백질을 코딩하는 유전자 또한 대부분 RpoS 그 자체보다 더욱 높은 수준으로 유도되었다. 이들 예는 hdeB,. otsA, poxB 및 wrbA을 포함한다(표 4).

표 4 막 합성 및 막-관련 작용에 관여하는 유전자에 대한 DHCP의 효능

통상의 기작에 관여하는 유전자에 대한 DHCP의 효능

다음으로 DHCP 처리가 통상의 세포 기작에 영향을 주는 방법에 대하여 조사하였다. 막에 대한 효능과 유사하게, DHCP 처리는 통상의 기작에 관여하는 다수의 프로세스에 영향을 주었고, 이중 일부는 처리의 2차 효과일 수 있다. DHCP 처리후 44개의 유전자는 현저히 다른 발현 수준을 나타내었다(표 5). 가장 현저한 유전자들은 시스테인 합성에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자들이다. Cys의 합성에 관여하는 레굴론에 속하는 유전자, 예를 들면, cysA, cysD, cysH, cysl, cysJ, cysK, cysM, cysN, cysP, cysQ, cyst, 및 cysW에서 현저히 증가하였다(3-20배). 이중, cysK는 최대 20배까지 증가하였다. 흥미롭게도, 이 레굴론에 속하지 않는 cysG 및cysS는 DHCP 처리에 영향을 받지 않았다. DHCP 처리에 의해 유도되는 다른 오페론에 속하는 유전자는 각각 갈락토스 및 몰리브덴 대사에 관여하는 gal 오페론 및 moa 오페론에 속하는 것이었다. 한편, Ent 오페론에 속하는 유전자는 감소하였다. fru (fruB 및 fruK) 시스템 또한 심하게 저해되었다(각각 8 및 33배).

표 5. DHCP에 반응하는, 일반 대사에 관여하는 유전자

DHCP는 다양한 작용알 갖는 다수의 단백질에 영향을 미친다.

표 6에 DHCP 처리 후 현저한 수준의 유도 또는 저해를 나타내는 35개의 유전자를 열거한다. 흥미롭게도, 텔루라이드 내성에 관여하는 TehB를 코딩하는 tehB는TehA(표 3)와 유사하게 5배 유도되었다. 산소성 스트레스에 반응하는 알킬 하이드로퍼옥시드 리덕타제, 박테리오페리틴 및 SoxS 단백질 각각을 코딩하는 AhpF, bfr 및 soxS(Agnez-Lima et al. , 2001 Cha et. al., 1995 and Chen et al. , 1999) 또한 약 4배 유도되었다. MdaB (약물 활성 조절자)를 코딩하는 유전자(mdaB) 또한 10배 유도되었다. MdaB의 과잉생산은 두개의 토포이소머라제 저해제, 아드리아마이신 및 에토포시드에 대한 내성을 손상시키고 가능하게는 토포이소머라제 IV 활성을 조절하여 작용한다(Chatterjee et al., 1995). 그러나, 본 연구에서, DHCP 처리시 토포이소머라제 IV의 두개의 서브유니트를 코딩하는 유전자인 parC 및 parE의 수준은 변함이 없었다. 다중 항생제 내성 단백질 MarA를 코딩하는 유전자 marA 또한 5배 유도되었다. 글루타레독신 단백질을 코딩하는 유전자 nrdH 및 nrdl 또한 DHCP에 의해 현저히 유도되었다. 흥미롭게도, sap (sensitivity toantimicrobialpeptides)(항미생물 펩티드에 민감성) 오페론 유전자와 같은 병독성에 관여하는 유전자는 DHCP 처리에 의해 저해되었다.

표 7에 DHCP에 대하여 반응하는 어떤 작용도 갖지 않는 단백질을 코딩하는 유전자를 열거한다.

표 6. 다양한 작용을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 DHCP의 효과

표 7 작용이 미지의 단백질 또는 그 부류의 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 DHCP의 효과

DHCP는 AI-2의 활성을 저해한다.

본 연구에서, Suretter 및 Bassler에 의한 디자인된 AI-2 분석을 사용하였다(Surette et al. , 1999). V. harveyi BB170 리포터 균주는 정족수-감지 표현형, 센서 1^-, 센서 2⁺를 갖는다. 시그날링 시스템 2 탐지기를 통해 luxm 발현을 유도한다. V. harveyi BB152 균주로부터 제조된 10% 무세포 배양액 (시스템 2 자가 유도인자를 포함)의 첨가는 리포터 균주에서 발광 발현을 자극한다. DHCP는 종간 정족수-감지에 관여하는 자가 유도인자 AI-2에 대한 후보 물질로 판단되었으나, DHCP는 이 활성을 갖지 않는 것으로 보고되었다(Schauder et al. , 2001). 본 발명자들의 실험을 통해 DHCP가 AI-2의 활성을 저해하는지 조사하였다. 사전 보고(Schauder et al. , 2001)와 동일하게 도 2A에 나타난 바와 같이, V. harveyi BB152 균주로부터분리된 AI-2는 발광을 나타낸 반면(레인 2), DHCP는 AI-2 활성을 나타내지 않았다(레인 3). 무균 AB 배지를 음성 대조군으로 사용하였다(레인 1). 무세포 추출을 포함하는 AI-2를 가하기 바로 직전 DHCP(250μM-DNA 마이크로어레이 분석에서 사용된 것과 동일한 농도)을 분석물에 가하였을 때, AI-2 활성은 완전히 저해되었다(레인 4). AI-2는 대략 10μM 농도에서 최대 발광을 나타낸다고 보고되었다(Schauder et al. , 2001). 본 분석에서 사용된 DHCP의 농도는 AI-2 농도를 초과한다는 것에 주목하여야 한다. 최대 발광이 AI-2에 의해 형성된 후 DHCP를 가하였을 때 DHCP가 AI-2 활성을 저해할 수 있는지를 시험하였다. 도 2B에 나타낸 바, DHCP를 250μM의 농도로 가하였을 때(닫힌 써클), AI-2 활성은 8분 이내 0으로 감소하였다. 100μM 농도로 가하였을 때(개방 스퀘어), AI-2 활성은 40분후 0으로 감소하였다. DHCP를 가하지 않는 상응되는 대조군의 활성은 완전하게 안정적이었다(개방 트라이앵글). 본 발명자들은 DHCP가 AI-2의 활성을 효과적으로 저해한다고 결론지었다.

논의

DHCP로 처리된 E. coli 세포의 DNA 어레이 분석 결과는 2가지 면에서 흥미롭다: 상기 데이타를 통해 DHCP는 광범위한 효능을 유발하고 E. coli의 복잡한 정족수-감지 에 관여한다는 것을 나타났다.

DHCP의 항균 활성

본 연구는 DHCP가 일반 대사 및 막 합성 및 작용에 관여하는 단백질들을 코딩하는 다수의 유전자에 작용하면서, E. coli에서 전체적으로 효능을 갖고 있다고 나타내고 있다. 흥미롭게도, 산소성 및 삼투압성 스트레스에 반응하는 다수의 유전자는 상향 조절되었다. 또한, 텔루라이드에 내성을 제공하는 tehA, tehB 및 cysK 는 현저하게 상향 조절되었다. 텔루라이드에 대한 내성 모드 및 그의 독성 기작은 연구자들에게 있어 엄청난 관심의 대상이 되고 있고, 완전하게 이해되지 못하고 있다. (i) cysK가 E. coli에서 텔루라이드 내성을 매개하고, (ii) TehA 및 TehB가 텔루라이드에 내성을 제공을 제공하고; 이들 단백질에 있어 Cys 잔기가 텔루라이드와의 결합에 관여하고 TehB는 텔루라이드와의 결합을 위해 S-아데노실-메티오닌(SAM)을 필요로 한다고 밝혀졌다. 텔루라이드에 대한 내성을 매개하는 이들 화합물 모두 결합할 수 있는 다이머이고 (iii) 텔루라이드는 산소성 스트레스를 형성하고 다양한 단백질에서 황을 대체하여 그를 비작용성으로 만든다(Syllick-Brenzinger et al. , 2000; Garberg et al. , 1999 ; Summers et al. , 1977 and Vasquez et al. , 2001). 본 연구에서, cysK, tehA 및 tehB외에 AhpF, Dps, KatG, SoxS, 및 Bfr과 같은 산소성 스트레스에 반응하는 단백질을 코딩하는 유전자도 상향 조절되었다. 이는 DHCP가 세포내에서 스트레스를 형성할 수 있고, 이는 본 연구에서 관찰된 것과 같은 다수의 2차 효과로 나타날 수 있다고 제안되었다.

DHCP의 정족수 감지에 대한 관여

그램-음성 세균에서 정족수 감지는 통상 합성이 'LuxI' 자가 유도인자 신타제 및 동족의 'LuxI' 자가 유도인자 결합/전사 활성자 단백질에 의존하는 아실화된 호모세린 락톤(HSL) 자가 유도인자를 포함한다. LuxR 단백질에 의한 HSL 유도 인자의 결합을 통해 특정 표적 유전자의 전사는 활성화된다. 생체발광에 관여하는 LuxI-LuxR 시그날링 캐스케이드는 최초로 V. fisheri에서 확인되었다(Hastings etal. , 1977 and Nealson et al. , 1979). 이 해양 그램-음성 세균은 이 정족수-감지 회로내에서 루시퍼라제의 발현을 조절한다. 한편 V. harveyi에서 두개의 자가 유도인자, 각각 종내 및 종간 커뮤니케이션을 위한 AI-1 및 AI-2가 확인되었다(참조: ref. Schauder et al. , 2001). AI-2는 호모 세린 락톤이고 AI-2의 정확한 구조는 알려져 있지 않다. 최근 AI-2가 푸라노실 보레이트 디에스테르일 수 있다고 제안되었다(Chen et al. , 2002). Shauder 등은 DHCP의 정족수-감지 활성을 조사하고 이는 AI-2 작용은 갖고 있지 않다고 밝혀냈다(Schauder et al. , 2001). 흥미롭게도, 본 연구에서 DHCP가 실제로 AI-2의 활성을 저해하는 것으로 나타났다. 또한, DHCP는 AI-2 합성에 관여하는 생합성 경로에 의해 형성될 수 있다.DHCP가 AI-2 작용 조절에 관여하고, 결국은 E. coli에서 AI-2-기초 정족수-감지을 조절할 수 있다는 흥미로운 가능성에 대한 관심을 일으켰다.

최근, AI-2에 대한 E. coli의 전체 전사 패턴에 대한 DNA 마이크로어레이 분석이 연구되고 있다(DeLisa et al. , 2001). 하기와 같이 관찰되었다: (i) MotA 및 MotB와 같이 운동성에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자는 3배 증가하였고, (ii) 스포미딘/푸트레신 운반에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자는 3-5배 증가하였다. 이들 단백질들은 병독성에 관여하는 것으로 공지된 식물에 att 오페론에 의해 코딩되는 단백질과 상동성을 나타낸다(Matthysse et al. , 1996), (iii) OmpA 및 OmpF를 코딩하는 유전자는 각각 3.2 및 5.1배 증가하였다. OmpA는 가능하게는 파스튜렐랄 하에모리티카(Pasturella haemolytica)의 병독성에 관여하고(Mahasreshti et al. , 1997), (iv) cysK 및 rpoS는 각각 3 및 1.2배 증가하였다. 흥미롭게도,DHCP 처리에 의해 cysK 및 rpoS에 대한 것을 제외한 반대 효과도 나타났다(표 4 및 5). 이는 리포터 분석에서 DHCP가 AI-2 활성을 저해하였다는 사실과 일치한다. cysK는 E. coli의 다른 정족수-감지 경로에서 AI-2과는 상이한 시그날에 의해 유도된다고 나타났다. AI-2와 달리, 이 시그날은 글루코스와 상관없이 E. coli DH5α균주에 의해 정체기에 생산된다(Baca-DeLancey et al. , 1999). 그러나, 가능하게는 astD, tnaB 및 gabT과 같이 이 시그날에 의해 유도되는 유전자는 DHCP에 의해 유도되지 않았다. 인돌이 시그날로서 작용하고 gabT를 제외하고 cysK를 유도하였으며, 이는 상이한 정족수-감지 경로에 관여하고 있음을 제시한다(Wang et al. , 2001). 본 결과는 이것과 유사할 수 있다. 또한, AI-2에 영향을 받은 일부 유전자의 수준은 DHCP 처리로 변하지 않았다는 점에 주목하여야 한다. rfa, wzb 또는 hha와 같은 유전자는 DHCP 처리로 현저하기 변하지 않았지만, AI-2 처리시 변화를 나타내었다. 이러한 효과에 대한 정확한 이유는 알려져 있지 않지만, 이들 유전자는 AI-2외의 다른 유전자에 의해 조절되고 AI-2 활성에 의한 단순한 저해는 그를 하향조절시킬 수 없다. 최근, S. 티피무리움(S. typhimurium)으로부터의 AI-2이 그의 흡수에서 작용하는 ABC 운반체의 발현을 조절한다고 보고되었다. 이 오페론의 작용은 알려져 있지 않지만 리보솜 운반 오페론(Rbs)와 상당 유사한 ABC 운반체 복합체를 코딩할 것으로 예측되고 있다. lsr 오페론으로 명명되었다(Taga et al., 2001). 이 오페론은 AI-2의 전체적이 효과에 대한 DNA 어레이 분석에서 나타나지 않았지만 (DeLisa et al., 2001) 본 연구에서, 흥미롭게도, AI-2는 pot 오페론로 명명되는 ABC 운반체 시스템을 코딩하는 또다른 오페론을 유도하였다(DeLisa et al. , 2001). 시종일관 본 연구에서, DHCP 처리는 이 오페론을 현저시 저해하였다(표 3). 이는 AI-2가 다른 ABC 운반체 시스템의 조절에 관여할 수 있고, DHCP에 의한 이러한 저해는 결과적으로 적어도 일부의 이 오페론을 저해한다고 제시한다.

sap 오페론 (sapA 내지 sapF)이 에르위니아 크리산테미(Erwinia chrysanthemi)의 병독성에 관여하는 것으로 나타났다(Lopez- Solanilla et al. , 1998). V. fisheri의 sap 오페론은 LuxR-AI 복합체에 의해 조절외어 생체발광에서 중요한 작용을 하는 것으로 가정되고 있다고 보고되었다(Chen et al., 2000). V. Fisheri의 Sap 단백질은 E. coli로부터의 Sap 단백질과 상동성이다. DHCP는 sap 유전자를 저해하였고(표 6), 이는 리포터 분석에서의 생체발광 저해와 일치한다. V. fisheri의 sap 및 lux 레굴론내 특이적 조절 부위-양 서열 R & R^*가 존재한다. LuxR-AI는 이 부위에 결합하여 각 유전자의 발현을 조절한다(Chen et al. , 2000). DHCP가 LuxR-AI 복합체와 R & R^*서열의 결합을 방해하여 결과적으로는 리포터 분석 또는 E. coli sap 오페론에서 루시퍼라제 오페론과 같은 유전자의 전사를 저해할 수 있다. DHCP가 AI-2를 포함하는 정족수-감지 경로를 '오프'할 수 있고, cysK를 포함하는 또다른 경로를 '온'할 수 있다고 추측할 만하다. 최근, 저밀도 및 고밀도의 E. coli 배양액 모두에서 수개의 플라스미드-코딩 유전자를 유도한 후 AI-2 활성은 현저히 감소하였다고 나타났다. AI-2 수준은 각 단백질 산물의 누적 수준관 선형으로 관련된다(DeLisa et al. , 2001). 이로써 재조합 생산율을 개선시키기 위하여 디자인된 최적화 방법을 위한 가능성이 있는 타깃으로서 quorum- sensing 경로가 소개되었다. DHCP에 의한 AI-2 활성 저해가 이러한 점에서 관심의 대상이 된다고 증명될 수 있다.

결론적으로, DHCP는 E. coli에서 광범위한 효과를 갖고 있다. 이는 병독성 및 운동성과 같은 정족수-감지 프로세스에 관연하는 일부 유전자를 저해하고 자가 유도인자중 하나 그 자체의 활성을 저해한다. 한편, 다른 정족수-감지 경로에 관여하는 것으로 알려지 특정 유전자, 예로서 cyst는 현저히 유도되었으며, 이믄 DHCP가 E. coli의 상이한 정족수-감지 회로에서 스위치의 온/오프할 수 있다는 것을 제안한다.

본 명세서에서 전체적으로 기술하는 바, 본 분야의 기술자는 본 발명의 범위 및 정신을 벗어나지 않고, 적절한 실험을 통해 광범위한 범위의 동등한 파라미터, 농도 및 조건을 사용하여 동일하게 수행될 수 있다.

본 발명은 그의 특정 일례와 관련하여 기술된 바, 이는 추가로 수정될 수 있다고 이해되어야 한다. 본 출원은 통상 본 발명의 원리를 따르고, 그를 포함하는 본 발명의 변형, 사용, 또는 적용을 모두 포함하고, 본 발명이 포함하는 본 분야의 공지 또는 통상의 원리내의 본 출원으로부터 출발하여, 하기 첨부되는 청구범위의 범위와 같은 상기 기술한 본질적인 성질에 적용될 수 있다.

본 명세서에서 인용되는 모든 참고 문헌, 예로서, 저널 논문 또는 요약서, 공개된 또는 대응 U.S. 또는 외국 특허출원, 또는 다른 참고문헌는 본 명세서에서 전체적으로 참조문헌으로서 인용되며, 이는 모든 데이타, 표, 또 및 텍스트를 포함한다. 또한, 본 명세서에서 인용되는 참고 문헌내의 모든 내용 또한 본 명세서에서 전체적으로 참조문헌으로서 인용된다.

공지된 방법 단계, 통상의 방법 단계과 관련하여 공지된 방법 또는 통상의 방법은 어떠한 방식으로든 본 발명의 일면, 설명 또는 일례는 관련 분야에서 기술, 교시 또는 제시할 수 없다

특정 일례의 상기 설명으로 본 발명의 일반적인 성질을 밝혀낼 수 있으며, 본 분야의 기술내 지식(본 명세서에서 인용되는 참조문헌의 내용 포함)을 적용하여 적절한 실험을 하지 않고도, 본 발명의 일반적인 개념으로부터 출발하지 않고도 특정 일례와 같은 다양한 적용을 위해 수정 및/또는 조절할 수 있다. 따라서, 그러한 조절 및 수정은 기술된 일면과 동등한 의미 및 범위내 있고, 이는 본 명세서에서 제시된 교시 및 가이던스에 기초한다. 본 명세서에서의 표현 및 용어는 제한하고자 나는 것이 아닌, 설명하기 위한 것이며 본 명세어상의 표현 및 용어는 본 명세서에서 제시된 교시 및 가이던스과 관련하여 본 분야의 기술자에 의해 그가 갖는 지식과 결부되어 해석되어야 한다.

참고 문헌

SEQUENCE LISTING <110> PHADTARE, Sangita KATO, Ikunoshin INOUYE, Masayori <120> EFFECT OF TREATMENT WITH 4,5-DIHYDROXY-2-CYCLOPENTEN-1-ONE (DHCP) ON GENE EXPRESSION AND QUORUM-SENSING IN BACTERIA <130> PHADTARE=1.1PCT <150> 60/363,548 <151> 2002-03-13 <150> 60/402,041 <151> 2002-08-09 <160> 8 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 tacagccagc agagttttcg aaat 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 tacagccagc agagttttcg aaat 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 cagcgtattc tgactcataa ggtg 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 agtggctgtg gtgttatgga tatc 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 caggcgaacc agcggcgtgt gacc 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 caggcgaacc agcggcgtgt gacc 24 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 gattaatatc agacgcaaat cct 23 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 acgggatcct tcatcattat ttatta 26

Claims (25)

1. 조절하고자 하는 유전자를 포함하고 있는 미생물을 4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온(DHCP)과 접촉시키고;

   미생물내 유전자를 조절하여, 미생물내 유전자를 조절하는 방법(여기에서, 유전자는 리보솜 단백질을 코딩하는 유전자, 스트레스에 반응하는 유전자, 막 합성 및 막 기능에 관여하는 유전자, 일반적인 대사에 관여하는 유전자, 다양한 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자, 및 미지의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자로 구성된 그룹으로부터 선택된다).
2. 제 1항에 있어서, 유전자가 표 1-7에 열거된 유전자 및 그의 상동체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
3. 제 1항에 있어서, 유전자가 정족수-감지 프로세스에 관여하는 방법.
4. 제 3항에 있어서, 유전자가 종간 자가 유도인자 AI-2의 활성 저해 결과로서 조절되는 방법.
5. 제 3항에 있어서, 유전자가 정족수-감지 회로의 스위치 온/오프의 결과로서 조절되는 방법.
6. 활성 성분으로서 DHCP를 포함하는, 제 1항에 정의된 방법에 의해 미생물내 유전자를 조절하기 위한 조성물.
7. 제 1항에 정의된 방법에 의해 미생물내 유전자를 조절하기 위한 조성물을 제조하기 위한 DHCP의 용도.
8. (a) 후보물질의 존재 및 부재하에서 미생물을 인큐베이션시키고;

   (b) 후보물질의 존재 및 부재하에서 DHCP에 발현 수준이 영향을 받는 미생물내 유전자의 발현 수준을 측정하고;

   (c) 후보 물질의 부재하에서의 발현 수준에 비하여 후보 물질의 존재하에서의 발현 수준이 현저히 증가되거나 감소된 경우, 상기 후보 물질을 적어도 하나의 유전자의 발현 수준에 상당히 영향을 주는 생리학적으로 활성인 물질로서 동정하는 것을 포함하는, 생리학적으로 활성인 물질을 선별하는 방법.
9. 제 8항에 있어서, 유전자가 표 1-7에 열거된 유전자 및 그의 상동체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
10. 제 8항에 있어서, 유전자의 발현 수준을 유전자로부터 전사된 mRNA의 양에 기초하여 결정하는 방법.
11. 제 10항에 있어서, 유전자의 발현 수준을 DNA 마이크로어레이를 사용하는 하이브리제이션에 의해 결정하는 방법.
12. 제 8항의 방법에 의해 수득할 수 있는 생리학적으로 활성인 물질.
13. (i) 재조합 폴리펩티드의 발현 및 생산을 증진시키기 위하여 DHCP의 존재하에 미생물을 배양하고;

    (ii) 배양액으로부터 생산된 재조합 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 , 미생물에서 재조합 폴리펩티드 생산을 증진시키는 방법.
14. 활성 성분으로서 DHCP을 사용하여 종간 정족수-감지 유도인자의 활성을 저해하는 방법.
15. 제 14항에 있어서, 유도인자가 AI-2인 방법.
16. DHCP를 포함하는, 정족수-감지를 조절하는 조성물.
17. 제 16항에 있어서, cysK의 발현을 조절하는 조성물.
18. DHCP를 포함하는, 정족수-감지 회로를 스위치의 온/오프시키기 위한 조성물.
19. DHCP를 포함하는, 종간 정족수-감지 유도인자의 활성을 저해하기 위한 조성물.
20. 제 19항에 있어서, 유도인자가 자가 유도인자 AI-2인 조성물.
21. DHCP를 포함하는, 스트레스에 반응하는 유전자의 발현을 조절하는 조성물.
22. DHCP를 포함하는, 정족수-감지용 조절 유전자의 발현을 조절하기 위한 조성물.
23. DHCP를 포함하는, 표 1-7에 열거된 유전자로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유전자의 발현을 조절하기 위한 조성물.
24. DHCP를 포함하는, 재조합 단백질의 분비를 증진시키기 위한 조성물.
25. DHCP를 포함하는, 항상성을 유지시키기 위한 조성물.