CN101565709A - 3-甾酮-9α-羟基化酶基因、3-甾酮-9α羟基化酶还原酶基因、相关载体和工程菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种3－甾酮－9α－羟基化酶基因及3－甾酮－9α－羟基化酶还原酶基因，通过构建各种表达载体并转化相关菌株，从而获得多种高表达菌株，包括大肠杆菌、链霉菌和分枝杆菌，还可构建无3－甾酮－9α－羟基化酶活性的分枝杆菌，上述构建的高表达菌株或其粗酶液可以用于催化生产3－甾酮－9－α羟基化甾体化合物，上述无3－甾酮－9α－羟基化酶活性的分枝杆菌可以用于降解甾醇制备雄甾－4－烯－3，17－二酮或雄甾－1，4－二烯－3，17－二酮，上述这些工程菌株可以大大提高甾体药物的生产效率与产品品质，有助于降低甾体药物生产过程中的能耗、提高药物前体的利用率、简化生产步骤，降低生产成本，且反应条件温和、环境友好，适合于大力推广应用，具有较高的经济效益和社会效益。

Description

3-甾酮-9α-羟基化酶基因、3-甾酮-9α羟基化酶还原酶基因、相关载体和工程菌及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及3-甾酮-9α-羟基化酶及其还原酶技术领域，特别是指一种3-甾酮-9α-羟基化酶基因、一种3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因、相关载体和工程菌及应用。

背景技术

甾体化合物(Steroids)又称类固醇，是一类以环戊烷多氢菲为母核，结构相似的化合物。其基本结构如下所示，由三个六元环和一个五元环组成，分别称为A、B、C、D环，在母核的第10、13位有甲基，第3、11、17位可能有羟基、酮基或烷基，A、B、C与D环可有双键，17位上常有长短不同的侧链。由于甾体母核上取代基、双键位置或立体构型等的不同，形成了一系列具有独特生理功能的化合物。

9α-羟基甾体化合物是制备9-卤代肾上腺皮质激素与11-酮基甾体的重要前体物，具有9α-羟基化功能的微生物多是甾体化合物的降解菌，例如红球菌、分枝杆菌、简单节杆菌、链霉菌、诺卡氏菌等，这些菌不能直接应用于生产。国外已通过菌种选育、反应体系优化等工作，使分枝杆菌与红球菌在对甾体侧链解的同时实现甾体的-9α-羟基化，但由于生产效率不高、有甾体1-位脱氢等副反应存在，因而近几年有学者通过对红球菌甾体1-位脱氢酶的敲除研究，获得了无甾体1-位脱氢副反应的基因工程菌。因此，如果能够克隆鉴定9α-羟基化酶基因，从而构建相关高效表达载体，进而实现9α-羟基化酶的高效表达，这必将大大提高相关甾体药物的生产效率，并减少副反应发生。

当今甾体药物生产采用的是微生物转化与化学转化相结合的方法，其中一些微生物转化反应在转化效率、反应选择性、环境友好性等方面具有化学转化法不可比拟的优势，因此在甾体药物的生产中占有重要地位，得到了大规模应用。

作为甾体药物工业生产体系中的瓶颈环节，一些微生物转化反应严重制约着甾体医药产业的快速发展，同时也是甾体药物生产成本高昂的一个重要原因。我国甾体医药生产企业众多，产值巨大，针对当前一些重要的甾体微生物转化反应，成功进行高效生产菌株的改造与开发，必将受到产业界的欢迎，从而从整体上大大提升我国甾体医药产业的生产水平，其产生的经济效益将是十分可观的。

针对甾体医药工业生产体系中的重要微生物转化反应，通过基因工程技术改造，开发高效微生物转化反应，可大大提高甾体药物的生产效率与产品品质，有助于降低甾体药物生产过程中的能耗、提高药物前体的利用率、简化生产步骤，降低生产成本，从而有助于甾体药物价格的下降。此外，微生物转化反应条件温和、环境友好，属绿色化工技术，大力推广其在生产中的应用，是社会可持续性发展的必然要求。

发明内容

本发明的主要目的就是针对上述存在的问题与不足，提供一种3-甾酮-9α-羟基化酶基因、一种3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因、相关载体和工程菌及应用，采用这些工程菌可以进行3-甾酮-9α-羟基化，可以大大提高甾体药物的生产效率与产品品质，有助于降低甾体药物生产过程中的能耗、提高药物前体的利用率、简化生产步骤，降低生产成本，且反应条件温和、环境友好，适合于大力推广应用。

为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种3-甾酮-9α-羟基化酶基因，其特点是，所述3-甾酮-9α-羟基化酶基因编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其无义突变序列。根据本发明的3-甾酮-9α-羟基化酶基因，可实现多种基因工程菌株的构建，包括无3-甾酮-9α-羟基化酶活性或高3-甾酮-9α-羟基化酶活性的菌株。

较佳地，所述3-甾酮-9α-羟基化酶基因与SEQ ID NO：1所示序列的第1328-2516位核苷酸序列具有70％以上的一致性，更优的是具有87％以上的一致性或与所述SEQ ID NO：1所示序列具有60％以上的一致性。SEQ ID NO：1所示序列的其余核苷酸序列含有该酶的调控元件与邻近基因片段。

较佳地，所述3-甾酮-9α-羟基化酶基因编码的蛋白序列与所述氨基酸序列具有75％以上的一致性，更优的是具有80％以上的一致性，又更优的是具有90％以上的一致性。

较佳地，所述3-甾酮-9α-羟基化酶基因来源于分枝杆菌属微生物。

更佳地，所述分枝杆菌属微生物是快速生长型分枝杆菌。

更进一步地，所述快速生长型分枝杆菌是Mycobacterium sp.NRRL B-3683与B-3805、Mycobacterium smegmatism、Mycobacterium fortuitum、Mycobacterium gilvum、Mycobacterium neoaurum、Mycobacterium Phlei、Mycobacterium avium、Mycobacteriumvanbaalenii或Mycobacterium vanbaalenii。

更进一步地，所述快速生长型分枝杆菌是Mycobacterium neoaurum NwIB-01，保藏编号是CCTCC M 209094。

在本发明的另一方面，提供了一种3-甾酮-9α-羟基化酶，其特点是，所述3-甾酮-9α-羟基化酶是SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其无义突变序列。

较佳地，所述3-甾酮-9α-羟基化酶与所述氨基酸序列具有75％以上的一致性，更优的是具有80％以上的一致性，又更优的是具有90％以上的一致性。

在本发明的另一方面，提供了一种基因工程表达载体，其特点是，所述表达载体整合有上述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因。

较佳地，所述表达载体是细菌表达载体、酵母表达载体或哺乳动物表达载体。

更佳地，所述细菌表达载体是大肠杆菌表达载体、链霉菌表达载体或分枝杆菌表达载体。

更进一步地，所述大肠杆菌表达载体是pET表达载体，所述链霉菌表达载体是pLMJ链霉菌-大肠杆菌穿梭表达载体，所述分枝杆菌表达载体是pFZ36分枝杆菌整合载体或pAL5000或pFZ2分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体。所述pET系列质粒载体宿主菌为大肠杆菌BL21用热激方法导入，所述pLMJ链霉菌-大肠杆菌穿梭表达载体宿主菌为变铅青链霉菌用原生质体转化方法导入，所述pAL5000或pFZ2分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体、pFZ36分枝杆菌整合载体利用电转化方法导入。

可以理解，通过基因操作可以实现3-甾酮-9α-羟基化酶在多种微生物中的表达。在本发明的另一方面，提供了一种基因工程表达菌株，其特点是，所述基因工程表达菌株含有上述的细菌表达载体或者整合有上述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因。

较佳地，所述细菌表达载体是大肠杆菌表达载体、链霉菌表达载体或分枝杆菌表达载体，相应地，所述基因工程表达菌株是大肠杆菌、链霉菌或分枝杆菌。

更佳地，所述大肠杆菌表达载体是pET表达载体，所述链霉菌表达载体是pLMJ链霉菌-大肠杆菌穿梭表达载体，所述分枝杆菌表达载体是pFZ2分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体、pFZ36分枝杆菌整合载体或pAL5000或pFZ2分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体，相应地，所述大肠杆菌是BL21菌株，所述链霉菌是变铅青链霉菌Streptomyces lividans，所述分枝杆菌是Mycobacterium sp.NRRL B-3683与B-3805、Mycobacterium smegmatism、Mycobacterium fortuitum、Mycobacterium gilvum、Mycobacterium neoaurum、MycobacteriumPhlei、Mycobacterium avium、Mycobacterium vanbaalenii或Mycobacterium vanbaalenii。

在本发明的另一方面，提供了上述的基因工程表达菌株在降解甾醇制备9α-羟基雄甾-4-烯-3，17-二酮(9αOH-AD)中的应用。

在本发明的另一方面，提供了上述的基因工程表达菌株在对3-酮甾体化合物进行9α-羟基化反应制备3-酮-9α-羟基甾体化合物中的应用。

在本发明的另一方面，提供了一种分枝杆菌基因工程突变菌株，其特点是，通过突变上述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因，并通过同源重组构建获得。即通过基因操作实现3-甾酮-9α-羟基化酶功能的失活，失活可以是活性完全丧失或部分丧失，来构建无3-甾酮-9α-羟基化酶活性的分枝杆菌基因工程菌株，其通过对3-甾酮-9α-羟基化酶基因进行靶向性的、无标记性的基因工程操作实现。

较佳地，所述突变是缺失或点突变所述3-甾酮-9α-羟基化酶基因。可对SEQ ID NO：1的任一部分与任一长度的基因片段进行缺失或对SEQ ID NO：1中任一位点进行点突变。

在本发明的另一方面，提供了上述的分枝杆菌基因工程突变菌株在降解甾醇制备雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)中的应用。

在本发明的另一方面，提供了上述的分枝杆菌基因工程突变菌株在降解甾醇制备雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)中的应用。

在本发明的另一方面，提供了上述的分枝杆菌基因工程突变菌株在降解甾醇制备9α-雄甾-4-烯-3，17-二酮(9αOH-AD)中的应用。

在本发明的另一方面，提供了一种3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因，其特点是，所述3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因编码SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或其无义突变序列。

较佳地，所述3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列具有70％以上的一致性，更优的是具有80％以上的一致性，又更优的是具有85％以上的一致性。

较佳地，所述3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因编码的蛋白序列与所述氨基酸序列具有70％以上的一致性，更优的是具有80％以上的一致性，又更优的是具有85％以上的一致性。

较佳地，所述3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因来源于分枝杆菌属微生物。

更佳地，所述分枝杆菌属微生物是快速生长型分枝杆菌。

更进一步地，所述快速生长型分枝杆菌是Mycobacterium sp.NRRL B-3683与B-3805、Mycobacterium smegmatism、Mycobacterium fortuitum、Mycobacterium gilvum、Mycobacterium neoaurum、Mycobacterium Phlei、Mycobacterium avium、Mycobacteriumvanbaalenii或Mycobacterium vanbaalenii。

更进一步地，所述快速生长型分枝杆菌是Mycobacterium neoaurum NwIB-01，保藏编号是CCTCC M 209094。

在本发明的另一方面，提供了一种3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶，其特点是，所述3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶是SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或其无义突变序列。

较佳地，所述3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶与所述氨基酸序列具有70％以上的一致性，更优的是具有80％以上的一致性，又更优的是具有85％以上的一致性。

在本发明的另一方面，提供了一种基因工程表达载体，其特点是，所述表达载体整合有上述的3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因。

较佳地，所述表达载体是细菌表达载体、酵母表达载体或哺乳动物表达载体。

更佳地，所述细菌表达载体是大肠杆菌表达载体、链霉菌表达载体或分枝杆菌表达载体。

在本发明的另一方面，提供了一种基因工程表达菌株，其特点是，所述基因工程表达菌株含有整合有上述的3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因的细菌表达载体或者整合有上述的3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因。

较佳地，所述细菌表达载体是大肠杆菌表达载体、链霉菌表达载体或分枝杆菌表达载体，相应地，所述基因工程表达菌株是大肠杆菌、链霉菌或分枝杆菌。

较佳地，所述基因工程表达菌株还含有整合有上述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因和/或整合有上述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因的细菌表达载体。可以用含有3-甾酮-9α-羟基化酶基因和/或3-甾酮-9α-羟基化酶的还原酶基因的载体转化分枝杆菌或链霉菌或大肠杆菌，使3-甾酮-9α-羟基化酶体系在分枝杆菌或链霉菌或大肠杆菌中高活性表达。

分枝杆菌或链霉菌较佳地如上所述。3-甾酮-9α-羟基化酶和3-甾酮-9α-羟基化酶的还原酶在分枝杆菌或链霉菌中可以通过表达性重组载体进行表达，所用重组基因工程载体为低拷贝型或高拷贝型的分枝杆菌基因表达载体；3-甾酮-9α-羟基化酶和3-甾酮-9α-羟基化酶的还原酶在分枝杆菌中可以是整合在染色体上进行表达的，通过靶向、无标记的方式进行整合，3-甾酮-9α-羟基化酶基因和3-甾酮-9α-羟基化酶的还原酶基因在染色体上是单拷贝或多拷贝整合的。

在本发明的另一方面，提供了上述的具有3-甾酮-9α-羟基化酶基因和/或3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因的基因工程表达菌株在对3-酮基甾体化合物进行9α-羟基化反应制备3-酮-9α羟基甾体化合物中的应用。

在本发明的另一方面，提供了一种新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)，所述新金分枝杆菌的保藏编号是CCTCC M 209094。

较佳地，包括上述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因和/或上述的3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因。

在本发明的另一方面，提供了一种双组分式IA型末端氧化酶体系，其特点是，包括上述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因编码的3-甾酮-9α-羟基化酶和上述的3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因编码的3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶。因此，3-甾酮-9α-羟基化酶与3-甾酮-9α-羟基化酶的还原酶组成了双组分式IA型末端氧化酶体系，即3-甾酮-9α-羟基化酶体系，该酶体系可催化3-酮基甾体化合物为3-酮基-9α-羟基化甾体化合物。

在本发明的另一方面，提供了上述的双组分式IA型末端氧化酶体系在对3-酮甾体化合物进行9α-羟基化反应制备3-酮-9α羟基甾体化合物中的应用。

在上述应用中可以采用上述基因工程菌株的全细胞或粗酶液进行。

本发明提供了一种3-甾酮-％-羟基化酶基因及3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因，通过构建各种表达载体并转化相关菌株，从而获得多种高表达菌株，采用该高表达菌株或其粗酶液可以用于催化生产3-甾酮9-α羟基化甾体化合物，可以大大提高甾体药物的生产效率与产品品质，有助于降低甾体药物生产过程中的能耗、提高药物前体的利用率、简化生产步骤，降低生产成本，且反应条件温和、环境友好，适合于大力推广应用，具有较高的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为本发明的3-甾酮-9α-羟基化酶催化甾体化合物生成9α-羟基化产物的反应示意图。

图2为扩增本发明的3-甾酮-9α-羟基化酶基因的一具体实施例的保守序列时的核酸电泳图。其中泳道1是DNA标准marker，泳道2～4是相同的PCR重复。

图3为扩增图2的具体实施例的全序列的电泳图。其中泳道1是DNA标准marker，泳道2～3是相同的PCR重复。

图4为pET-MS.KSH载体构建过程的酶切验证图谱。其中泳道1是DNA标准marker，泳道2是pET-MS.KSH经Nco I、Hind III双酶切结果，泳道3是pET-MS.KSH重组质粒单酶切结果。

图5为基因工程菌BL21/MS.KSH(NwIB-901)的表达产物的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道1为0小时的全菌，泳道2为加IPTG诱导4小时后的全细胞蛋白电泳图；泳道3为加IPTG诱导4小时后破菌离心上清可溶表达蛋白；泳道4为加IPTG诱导4小时后破菌离心包涵体；泳道5为蛋白电泳标准Marker；泳道6为加IPTG诱导过夜后的全细胞蛋白电泳图；泳道7为加IPTG诱导过夜后破菌离心上清可溶表达蛋白。

图6为图5的基因工程菌BL21/MS.KSH(NwIB-901)的表达产物转化AD的反应产物TLC层析图谱。泳道1，2分别为BL21/MS.KSH转化AD的反应产物；泳道3为底物AD层析图谱；泳道4，5分别为原始菌种Mycobacterium neoaurum NwIB-01转化底物的层析图。

图7为含有本发明的3-甾酮-9α-羟基化酶基因及3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶的表达载体的酶切验证电泳图。泳道1为DNA标准Marker；泳道2为XhoI Nco I双酶切验证；泳道3为Hind III XhoI双酶切验证；泳道4为Hind III单双酶切验证。

图8基因工程菌NwIB-901、NwIB-906、NwIB-907、NwIB-908转化雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)制备9α-羟基雄甾-4-烯-3，17-二酮(9α-OH-AD)。

图9基因工程菌NwIB-902、NwIB-903、NwIB-904、NwIB-905、NwIB-909、NwIB-910转化降解甾醇生产9α-羟基雄甾-4-烯-3，17-二酮(9α-OH-AD)、雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)与雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)。

菌株Mycobacterium neoaurum NwIB-01，保藏时间2009年4月28号，保藏地点是武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC M 209094。

具体实施方式

为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。

在本发明的实施例中使用的大肠杆菌BL21、JM109、DH5a、TOP10、及pET22、pET28、pET32载体均购自Novagen公司，引物均由大连宝生物(Takara)公司合成。

实施例1  3-甾酮-9α-羟基化酶基因(KSH)的获得

发明人自行筛选到了一株降解甾体化合物的菌株，经鉴定为分支杆菌属，命名为Mycobacterium neoaurum NwIB-01，保藏编号是CCTCC M 209094。本实施例通过PCR方法从该菌株克隆到3-甾酮-9α-羟基化酶的全基因序列。

1.1、3-甾酮-9α-羟基化酶基因保守序列的获得

通过基因同源比对以下四株分支杆菌(数据来源于NCBI，序列号见后)：

·Mycobacterium avium 104(gb|CP000479.1|)

·Mycobacterium vanbaalenii PYR-1(gb|CP000511.1|)

·Mycobacterium gilvum_PYR-GCK(gb|CP000656.1|)

·Mycobacterium smegmatis str.MC2 155(gb|CP000480.1|)

得到分支杆菌中3-甾酮9α-羟基化酶的保守序列，利用软件Oligo 6.0及Primer 5.0设计兼并引物，利用降落及热不均衡PCR扩增新金分支杆菌3-甾酮9α-羟基化酶基因的部分序列。PCR引物为KSH-1和KSH-2，其序列分别如下：

KSH-1：5’-TGCCCGTTCCACGACTG-3’；

KSH-2：5’-CAGCAGCGGRTTGTCGAT-3’。

以所筛选的菌株总DNA为模板，以引物KSH-1和KSH-2为引物对，进行PCR扩增，具体条件如下：

取适量的模板DNA 2μL，10×PCR Buffer 2μL，25mM MgCl₂1.6μL，2.5mM dNTP1.6μL，引物(20μmol/L)各1μL，Taq DNA聚合酶1U，补水至总体积20μL。见下表。

表1PCR反应体系(20μL)

Table 1 PCR amplification system(20μL)

反应过程：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃60s，30个循环；72℃10min。

将获得的PCR产物(3个重复)进行琼脂糖电泳检测，根据图2结果，回收约500-800bp的片段，并将其克隆至载体pMD19-T(购于TaKaRa公司)中测序，测序结果显示，获得的PCR产物符合预期，经比对后发现为M.S-KSH基因的保守序列。

1.2、全长3-甾酮9α-羟基化酶基因M.S-KSH的获得：

根据保守序列，设计并合成用于扩增全长M.S-KSH基因的PCR引物up-1、up-2和down-1、down-2，其中，up-1、up-2用于扩增保守序列的上游片段，down-1、down-2用于扩增保守序列的下游片段，其序列分别如下所示：

up-1：5’CCCTCGTGGTCATGCCAGACGAAGAGCAG-3’；

up-2：5’-GCCACTACCCGGTCAGTCAGGACTCCTT-3’；

down-1：5’-CGCATACTGCGCCAACTGCCGTTTTGTAG-3’；

down-2：5’-CGGCTTGCCGTCGAGGTAGTCCTTCAC-3’。

染色体走读(Chromosome walking)具体实施方法如下：

1.从菌液样本提取全基因组DNA；

2.根据保守片段序列设计染色体走读引物；

3.分别用粘性末端DNA内切酶(EcoRI，HindIII，Sau3AI和PstI)将基因组消化并分别纯化；

4.将纯化的片段分别与相应接头Cassette(EcoRI Cassette，HindIII Cassette，Sau3AICassette和PstI Cassette)连接，即得到四种GenomeWalker libraries，直接以这四种GenomeWalkerlibraries作模板，用通用引物C1(设计为与Cassette配对退火)和基因特异性引物S1(分别用upstream和downstream)为引物对，进行PCR。采用巢式和嵌套PCR程序：30循环：(94℃，30秒；55℃2分钟；72℃，1分钟)有PCR产物胶回收纯化；

5.为提高扩增特异性，采用巢式PCR策略，将上步产物稀释50倍作模板，用通用引物C2(设计为与Cassette配对退火)和基因特异性引物S2(分别用upstream和downstream)为引物对，进一步PCR。产物纯化、克隆、测序分析，得到保守序列上、下游序列，拼接后得全长基因，命名为M.S-KSH。

运用GeneBank中的ORF finder将测序得到的DNA序列翻译成氨基酸序列，再用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)程序对核酸和蛋白序列进行比对，结果如下：

根据测序和比对结果，得到的全长3-甾酮9α-羟基化酶基因M.S-KSH序列如SEQ IDNO：1所示，同时，根据比对结果，扩增到的酶为新的3-甾酮9α-羟基化酶，与已报道Rhodococcus erythropolis中3-甾酮9α-羟基化酶的核苷酸同源度为70％，蛋白同源度为69％(Rhodococcus erythropolis中的KSH是GeneBank中唯一标示的3-甾酮-9α-羟基化酶基因)。

实施例2  3-甾酮-9α-羟基化酶过表达的大肠杆菌基因工程菌的构建

2.1、基因3-甾酮9α-羟基化酶的克隆

根据3-甾酮9α-羟基化酶(M.S-KSH)全长基因序列，设计并合成扩增引物KSH-Q和KSH-H，其序列如下所示：

KSH-Q：5’-CGCCCATGGCCGTGACTACCGAGACAG-3’；

KSH-H：5’-CGAAGCTTTCAGCTCGGCTGCGCGGACT-3’。

其中，在引物KSH-Q上引入Nco I酶切位点，在引物KSH-H上引入Hind III酶切位点。

以所筛选的野生菌株总DNA为模板，以引物KSH-Q和KSH-H为引物对，进行PCR扩增，具体条件如下：

反应体系：Tag酶1μl，缓冲液5μl，模板1μl，dNTP 4μl，上下游引物各1μl，纯水33μl。

反应过程：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。

将PCR产物(2个重复)进行琼脂糖电泳检测，结果如图3所示，根据图3结果，回收大小约1200bp的片段。

2.2、重组表达载体的构建和转化

将实施例2.1得到的片段经Nco I、Hind III双酶切，目的DNA片段回收纯化后，与同样经限制性内切酶酶切过的质粒pET-22b(+)(约5.5kb)在T4DNA连接酶的作用下，16℃连接，筛选，得到重组质粒pET-MS.KSH。双酶切验证所得的重组质粒，见图4。将其测序，测序结果显示，克隆入的3-甾酮9α-羟基化酶基因序列如SEQ ID NO：1所示。按常规方法将质粒转化大肠杆菌BL21，获得生产3-甾酮-9α-羟基化酶的基因工程菌NwIB-901。

2.3、工程菌表达及优化

从转化平板上任意挑取1个实施例2中获得的NwIB-01菌落，接入2mL含有75μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃培养至对数生长期后，加入IPTG至终浓度1mmol/L，在诱导的不同时间(如0.5、1、2、3、4和5h)。离心收集菌体，超声破菌，离心收集上清，SDS-PAGE电泳，结果如图5所示。根据图5结果，MS.KSH蛋白主要为可溶表达，且蛋白表达量较高，在约40kDa处看到清晰条带，与预期的3-甾酮9α-羟基化酶大小吻合。随着诱导时间的延长，可溶性蛋白所占比例明显提高，在低温诱导过夜情况下，大部分蛋白为可溶性表达。

2.4、表达产物鉴定

取适量上述工程菌细胞胞浆，加入终浓度分别为3.5μM的spinach ferredoxin，0.1units的ferredoxin-NADP⁺reductase和20μM的AD，于30℃下保温5min。再加入终浓度为1mM的NADPH，使反应体积最终定格在2ml，于30℃空气浴中缓慢摇动2h，进行转化反应。最终用同体积的乙酸乙酯萃取反应液三次，真空干燥，适量色谱纯甲醇复溶后，用C-18柱HPLC液质联用(LC-MS)分析。结果如图8所示，加入的底物AD中有一部分被转化为产物9α-OH-AD。

薄层层析(TLC)：展开剂采用石油醚/乙酸乙酯(6∶4至7∶3)；薄板采用烟台硅胶厂出品的5×10cm的预制板；显色，采用20％的硫酸溶液均匀喷淋，并于100℃烘箱内烘烤5min至显出斑点。结果如图6所示

实施例3  3-甾酮-9α-羟基化酶基因在分枝杆菌的过表达和整合表达

利用pAL5000和pFZ2分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体将3-甾酮9α-羟基化酶基因重新导入分枝杆菌，以使原始分枝杆菌菌种中的3-甾酮-9α-羟基化酶基因过表达。

所用引物序列如下：

U：CGGGGATCCGTGACTACCGAGACAG

D：GGCAAGCTTTCAGCTCGGCTGCGCGGACT

PCR反应体系退火条件经优化确定为56.5℃90s。从分枝杆菌中克隆出1.2kb的KSH基因，经回收与载体pMD19-T连接，构建重组克隆质粒，测序验证。用限制性内切酶BamHI、HindIII双酶切克隆载体，回收插入到经相同酶切的分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达质粒pAL5000和pFZ2中，构建重组质粒pAL5000-KSH和pFZ2-KSH，经序列测定证实含有KSH基因，且基因序列和阅读框架正确。

电转重组质粒pAL5000-KSH或pFZ2进入分枝杆菌(以NwIB-201例，该菌是NwIB-01的衍生菌株，该菌株的3-甾酮-△¹-脱氢酶已被失活，因而该菌降解甾醇只生成AD)并用卡那霉素平板进行筛选。所得工程菌命名为NwIB-902(低拷贝)，NwIB-903(多拷贝)

利用pFZ36分枝杆菌整合表达载体将3-甾酮9α-羟基化酶基因导入分枝杆菌整合(以NwIB-201例，该菌是NwIB-01的衍生菌株，该菌株的3-甾酮-△¹-脱氢酶已被失活，因而该菌降解甾醇只生成AD)。最终基因整合表达菌种命名为NwIB-904(单拷贝)，NwIB-905(多拷贝)。

所用引物序列如下：

U：GACGAATTC GTGACTACCGAGACAG

D：CGCAAGCTTTCAGCTCGGCTGCGCGGACT

整合质粒pFZ36构建、电转及筛选同上。PCR反应体系退火条件经优化确定为58℃，2min，PCR产物克隆入质粒pMD19-T中，用限制性内切酶ECORI、HindIII双酶切克隆载体，回收插入到经相同酶切的分枝杆菌-大肠杆菌穿梭整合质粒pFZ36。

实施例4  3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因的得到

通过对已知分枝杆菌3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因的分析，选择了红串红球菌和三株分枝杆菌的3-甾酮-9α-羟基化酶基因进行基因同源比对(数据来源于NCBI，序列号见后)：

Rhodococcus erythropolis(gb|AY083509.1|)；

Mycobacterium avium104(gb|CP000479.1|)；

Mycobacterium vanbaalenii PYR-1(gb|CP000511.1|)；

Mycobacterium smegmatis str.MC2 155(gb|CP000480.1|)；

在得到分枝杆菌中3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶保守序列的相关信息之后，利用软件Oligo 6.0及Primer 5.0设计兼并引物，利用降落及热不均衡PCR扩增分枝杆菌Mycobacterium neoaurum NwIB-01的部分序列。

设计的兼并引物如下：

KSHB-U1：5’-TGRCAGGCCAGGAWSAGNCC-3’；

KSHB-U2：5’-CCGCAGYKGCCCTCNCGGCA-3’；

KSHB-U3：5’-SANCGAYTCCAGCCAGTGCA-3’；

KSHB-U4：5’-SCTCGTCRCGGTTGGCGTAG-3’；

KSHB-D1：5’-TCACMCCGRTSATGTCGATC-3’；

KSHB-D2：5’-SAACTGGYTGTGYGACAACG-3’；

KSHB-D3：5’-TCGGTGGCNCGCTGCTAYTC-3’；

以Mycobacterium neoaurum NwIB-01的基因组DNA为模板进行PCR扩增，所用PCR反应体系如下：取适量的模板DNA 2μL，10×PCR Buffer 2μL，25mM MgCl₂1.6μL，2.5mMdNTP 1.6μL，引物(20μmol/L)各1μL，Taq DNA聚合酶1U，补水至总体积20μL。所用PCR反应程序如下：94℃1分钟，50℃30秒，72℃1.5分钟，30个循环。

通过NCBI Blastn比对，通过上述方法获得的3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因的保守序列。与红串红球菌Rhodococcus erythropolis中3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶有65％的同源性，和耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis str.MC2 155有77％的同源性，和结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis有73％的同源性。

得到部分保守序列后利用Genome-Walking克隆基因全长(方法如前所述)。

实施例5  3-甾酮-9α-羟基化酶及其还原酶基因的共表达

根据Mycobacterium neoaurum NwIB-01的基因走读已知序列分别设计3-甾酮-9α-羟基化酶及3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶引物。

KSHU：5’-CGCCCATGGCCGTGACTACCGAGACAG-3’；

KSHD：5’-CGAAGCTTTCAGCTCGGCTGCGCGGACT-3’

KSHBU：5’-GGAAAAGCTTAAGAAGGAGATATACCATGACGGAGGACCGCT-3’

KSHBD：5’-GAGACTCGAGCTANTCGTCRTAGGTGACTT-3’

其中，在引物KSHU上引入Nco I酶切位点，在引物KSHD上引入Hind III酶切位点，在引物KSHBU上引入Hind III酶切位点，在引物KSHBD上引入XhoI酶切位点。在引物两端分别引入酶切位点和保护碱基，为了增加翻译效率在正向引物还引入了核糖体结合位点序列(SD)和间隔序列(aagaaggagatatacc)，并把起始密码子由GTG改为ATG，终止密码子由TAG改为TAA，符合大肠杆菌密码子偏好。

将3-甾酮-9α-羟基化酶基因(KSHA)的克隆片段经Nco I、Hind III双酶切，目的DNA片段回收纯化后，与同样经限制性内切酶酶切过的质粒pET-22b(+)(约5.5kb)在T4 DNA连接酶的作用下，16℃连接，筛选，得到重组质粒pET-MS.KSHA。

将3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因(KSHB)克隆片段经Hind III、XhoI双酶切，目的DNA片段回收纯化后，与同样经限制性内切酶酶切过的质粒pET-MS.KSH(约6.8kb)在T4DNA连接酶的作用下，16℃连接，筛选，得到重组质粒GB-MS.KSHAB(约8.0kb)。酶切验证(图7)构建的质粒并按常规方法将质粒转化大肠杆菌BL21，获得共表达3-甾酮-9α-羟基化酶与3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶的基因工程菌。所得工程菌命名为NwIB-906。

实施例6  3-甾酮-9α-羟基化酶链霉菌基因工程菌株的构建

利用pLMJ链霉菌-大肠杆菌穿梭表达载体将3-甾酮-9α-羟基化酶基因重新导入链霉菌宿主菌，以使链霉菌宿主菌中的3-甾酮-9α-羟基化酶基因过表达。宿主菌为变铅青链霉菌用原生质体转化方法导入。最终基因过表达菌种命名为NwIB-907(单拷贝)、NwIB-908(多拷贝)。

所用引物序列如下：

U：CGCCATATGGTGACTACCGAGACAG

D：CGGAATTCTCAGCTCGGCTGCGCGGACT

PCR反应体系退火条件经优化确定为56℃1.5min。从分枝杆菌中克隆出1.2kb的KSH基因，经回收与载体pMD19-T连接，构建重组克隆质粒，测序验证。用限制性内切酶NdeI、EcoRI双酶切克隆载体，回收插入到经相同酶切的pLMJ链霉菌-大肠杆菌穿梭表达质粒中，构建重组质粒pLMJ-KSH，经序列测定证实含有KSH基因，且基因序列和阅读框架正确。

利用原生质体转化方法将重组质粒pLMJ-KSH导入链霉菌。整合质粒pLMJ72构建、电转及筛选同上。

链霉菌原生质体的制备：在250ml三角瓶中加入25ml链霉菌液体培养基然后加入一定量的孢子悬液及所需的生长因子后在200rpm摇床上培养36-40h离心收集菌丝体小心倒去上清液重新用10.3％蔗糖悬浮洗涤2次后离心倒去上清液打散，然后取适量的菌丝体加入到5ml缓冲液配制的溶菌酶溶液中溶菌酶终浓度2mg/ml，30℃温育15-60min。3000r/min离心10min去上清用手指弹动轻轻打散原生质体沉淀块后加入15ml P缓冲液洗涤3次离心及去上清。

实施例7  3-甾酮-9α-羟基化酶缺失的分枝杆菌基因工程菌株的构建方法

构建分枝杆菌基因敲除质粒，该质粒经电转化进入分枝杆菌。利用卡纳青霉素及潮霉素进行双抗筛选，然后利用蔗糖平板进行复筛，得到基因敲除克隆子。利用PCR方法对上述克隆子进行验证。最终针对不同的分枝杆菌菌株，进行3-甾酮-9α-羟基化酶基因的缺失，所得菌种分别命名为NwIB-909、NwIB-910。其中NwIB-909来源于NwIB-01；NwIB-910来源于NwIB-206，NwIB-206来源于NwIB-01，具有高3-甾酮-△¹-脱氢酶活性。

具体步骤如下：

敲除质粒构建：根据分枝杆菌Mycobacterium neoaurumNwIB-01序列设计敲除上下游引物。

ksh-uu GGCCTGCAGCGATGCCGCCGAGGTGTACG

ksh-ud GGCAAGCTTCGGCTGTCTCGGTAGTCACG

ksh-du CGCAAGCTTCGCAGCCGAGCTGATGACCA

ksh-dd CAGCGGCCGCCCCCCGCACTGACCGAGTCC

分别将目标基因3-甾酮-9α-羟基化酶的上下游基因克隆到pMD19-T载体上，然后分别用PstI、HindIII，HindIII、NotI酶切，酶切产物分别连接在经相应酶切的分枝杆菌基因敲除质粒pIL上。分别用PacI酶切上述质粒和pGOAL19质粒后进行非定向连接，构建基因敲除质粒MS-QCKSH。

2.敲除质粒导入：分支杆菌感受态制备：一级种子OD长到1.0左右，1％转接二级种子；24h后加入2％甘氨酸继续培养24h。离心收集菌体，分四次用10％甘油冲洗悬浮菌体并离心，最后加入1ml甘油悬浮菌体，并分装保存。电转化：10μl质粒加入300μl感受态菌体中放置10min，电击条件如下12.5kv/cm、25μF、20ms。

3.重组子筛选：电转产物加入培养基恢复培养3-24h，涂布培养基成分如下hyg50μg/ml、Kn 20μg/ml、X-gal 50μg/ml。经SCO单交换菌挑取：挑取带蓝斑菌落，pcr验证和DSO双交换菌挑取：将验证好的SCO菌涂布含2％的蔗糖平板，挑取白色菌落。

实施例8  基因工程菌NwIB-901、NwIB-906、NwIB-907、NwIB-908在3-酮基甾体9α位羟基化中的应用

以AD作为底物为例，投料量为0.5-3％的条件下，转化时间为5-10天，这些工程菌株对AD的转化结果如图8所示，除NwIB-01外，AD的转化率均在95％以上。

具体反应过程可参照如下方式进行：

利用1％-10％的表面活性剂、聚合物或有机溶剂(例Tween80、乙醇、硅油、豆油等等)等物质对甾体化合物进行助溶。采用两级或三级培养，以1％-50％的种子接种最终的转化培养基，甾体化合物可以在任一时间进行投加。甾体转化的条件是：培养温度25-37℃，高溶氧值，pH可控在5.0-8.0之间，以薄层层析(TLC)或高效液相色谱(HPLC)分析确定转化反应的结束时间。反应结束后，甾体转化物可用同体积的乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂萃取三次，合并反应液，真空干燥，进而进行分析与产品制备。

对于AD为底物，采用1％-10％的Tween80和硅油为AD的助溶剂，在装样量为30毫升的250毫升摇瓶中采用两级培养，其中以3-30％的种子量接种含有0.5-3％植物甾醇的二级培养基，在26-35℃，200-300rpm，pH 5.0-8.0之间的条件下进行培养，经3-7天，AD转化率高于95％，生成9α-OH-AD。

薄层层析(TLC)的操作条件为：展开剂采用石油醚∶乙酸乙酯(6∶4至7∶3)；薄板采用烟台硅胶厂出品的5×10cm的预制板；显色，采用20％的硫酸溶液均匀喷淋，并于100℃烘箱内烘烤5min至显出斑点。

实施例9  基因工程菌NwIB-902、NwIB-903、NwIB-904、NwIB-905、NwIB-909、NwIB-910在甾醇降解制备AD与ADD中的应用

以植物甾醇为底物，基因工程菌NwIB-902、NwIB-903、NwIB-904、NwIB-905、NwIB-909、NwIB-910可以降解转化甾醇生产雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)或雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)或9α-雄甾-4-烯-3，17-二酮(9α-OH-AD)，如图9所示。具体反应过程类同于实施例8。

NwIB-902、NwIB-903、NwIB-904、NwIB-905转化降解甾醇可生产9α-OH-AD；NwIB-909可降解转化甾醇同时生成AD和ADD，其中ADD与AD的摩尔数之比约为10比1；NwIB-910则降解转化甾醇只生成ADD，无其它代谢中间产物的积累。

综上所述，采用本发明的3-甾酮-9α-羟基化酶基因和/或3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因构建的工程菌，可以大大提高甾体药物的生产效率与产品品质，有助于降低甾体药物生产过程中的能耗、提高药物前体的利用率、简化生产步骤，降低生产成本，且反应条件温和、环境友好，适合于大力推广应用。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

序列表

<110>华东理工大学

<120>3-甾酮-9α-羟基化酶基因、3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因、相关载体和工程菌及应用

<160>4

<210>1

<211>3717

<212>DNA

<213>新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)

<220>

<221>gene

<222>(1328)..(2516)

<223>3-甾酮-9α-羟基化酶基因

<400>1

ggcactgggt cacgcctatg gcggcggcgc gcagtacttc tcgatgtggg tcgtcggggc     60

cgacaagccc acccggtgac cgcaccggtg acgctggcgg gtcgacggtc gcgggaggcg    120

gccgtcgccc gcgacaaggc ggcctggctg gcggtgttcg ccgacgacgc gatcgtcgag    180

gatccgatcg gaccgtcgca tttcgacccc gagggtaagg gccatcgcgg caaggaggcc    240

atcgccgcct tcttcgacaa ggcgatcgcc ccgagtcagc tcgaattccg cttcgagaag    300

acctatgtct gcggccccga agaggccaac gtcgggcata tcgtgatcgt cgccggcggc    360

taccgcgtgg tggcagaggg cgtgttcacc taccgcgtga acgccgaggg caagattgct    420

gcgctgcgcg cctactggga agtggacaag gcgaccgcca gcgcacaacg ggtgtgacgg    480

ccgggtgtgc gggctccgat cgcgtaggct gggcagcgat ttcgtccgct aggtgtctcg    540

aattgatgtt gtcccgatca catgtagtcg ctgccgcact gctcgccgtc ggcctctccg    600

cctgcgctcc cagccagccg ggtgccccga gcagcgctgc gccgacgctg cccgcattca    660

ccaccagcgc cactcccacg accaccgcgc ccgcgcaggc caccgactac acccggctac    720

tggtcaccgc cgccgatctc agtgacgccg aggacacctt caccgagcgg cacatcgaag    780

cctcaccagg cgggctgccg ggggcgagtg cgtttttcgt caacgccgag gacacccgcg    840

ccatcagctc gacgatcctg gtctacgaca acccgggcac cgccgcgacc gcgctcaagg    900

aagcgcgggg cacgctgggt agcagggtga cgggaaaccc ggtgcccggc ggggtgggtc     960

cggacagcgt gatggtccgt ggcgccgacc cggacgaggc caaggacatc accgtgctga    1020

tgttcaccca gggtcgcgcg ctggcgcgcc tggaattcca gagcgcgggc ggcgacgcca    1080

ccaccgacgg ctacgtgacc accgtcggca agatgcagca gatcgcgctg cgctccggtc    1140

tgcaagacga gaactgagcc ggcgcccggt accgccgggc gtgttcgata gctccagcta    1200

tctccagccg agccgcattc cgtcggttca tggctacaaa acggcagttg gcgcagtatg    1260

cgttgcgcac tgcccggtca aaactgtaac gtgttctagt tagagagacc agatacggga    1320

ggcccaccgt gactaccgag acagccggca ttcgcgagat cgacaccggc gacctgcccg    1380

accgctatgc gcgcggttgg cattgcctgg gaccggtgaa ggactacctc gacggcaagc    1440

cgcacggggt ggagatcttc gacaccatgc tggtcgtctt cgccgactcc gagggtgagc    1500

tcaaggttct ggacggttac tgccggcaca tgggcggcaa cctcgcccag ggcaccatca    1560

agggtgacac cgtggcctgc ccgttccacg attggcgctg gggtggcgac ggcaagtgca    1620

agctcgtccc ctacgccaaa cgcacaccgc gcctggcccg cacccgcgcc tggcacaccg    1680

acgtacgcgg cgggctgctc ttcgtctggc atgaccacga gggcaaccca ccgcagcccg    1740

aggttcggat ccccgagatc cccgagttcg ccagcgacga ctggaccgac tggcggtgga    1800

acacgatgct catcgagggc tccaactgcc gcgagatcat cgacaacgtc accgacatgg    1860

cgcacttctt ctacatccac tacgggttgc cgacgtactt caagaacgtc ttcgagggcc    1920

acatcgccag ccagtaccta cacaacgtcg gccgtcccga cgtcaacgac ctgggcacca    1980

cctacggtga ggcgcacctg gattccgagg cgtcctactt cggtccgtcg ttcatgatca    2040

actggctgca caacaactac ggcgggttca aggccgagtc gatcctgatc aaccgccact    2100

acccggtcag tcaggactcc ttcgtgctgc agtggggcgt catcgtcgaa aagcccaagg    2160

ggctcgatga gaagaccacc gacaagctgg cccgcgtctt caccgagggc gtctccaagg    2220

ggttcctgca ggacgtcgag atctggaagc acaagacccg gatcgacaac ccgctgctgg    2280

tcgaggagga cggcgccgtc tatcagatgc gccgctggta tcagcagttc tacgtcgacg    2340

tcgccgacgt gacacccgat atgaccgacc gcttcgagat ggaggtcgac accaccatcg    2400

ccaacgagaa gtggcatgtc gaggtcgagg aaaacctgaa gctgcagcag gacgccgccg    2460

agcaggacgc cgccgaacag ggtgagccgc aaaaagagtc cgcgcagccg agctgatgac    2520

cacgcatgac gagcgggccg gaacaccaga tattgacgat ctggcccgct ccatgctgct    2580

cctgcacggc ggacacgacg acgaggacga ccacgaccac ccggaccccg tacgagtacc    2640

gggaactggt ccaaggcacc ggatttcagc tccgatccgc tccgggcggc ggcggtgcac    2700

gaagccaccg agcgggacaa gcagcggtat ctgacctccg ggttggcctc agtggactgc    2760

cggtactgtc atgccaccgt gcaggtcaag aagctgggca ccgaacacac gtcggtgcag    2820

tggaattcgg cggcgaccaa gcgctgcgcg gtctttcgac gagatccgtt cctccggcgg    2880

cgatccggca cgggcacgct cgtgccaccg gctcaccgac agcatcaagc acgccatcgc    2940

cgagggatgc ctggaggaat tctccagcgc accctccccc ggcgacggct aggttctctc    3000

ttgcgatttc ggtgaggata cgtgcgcacg gcgtacgtat cctcaccgaa atccaaattc    3060

ccttgaagcg ctccttgacc tgctcgtcgg tcagcccgta atcgctgagc gagtaggtat    3120

gcttgggtgc ccgcggcctt cttgctctcc tcgtggctgg cggtcatggc ctggcgcgcc    3180

gcatcggtga actcgatccc gaacgtgctg tagatcccct ccactgcggc gaccggatcc    3240

ttgatgaact cgaaatagtc gacatcgcag aactgtgccg gatcatgctt ggcccgttcg    3300

gcgttgaaca gttccagccc acgggaccag gtctccaggg agtcctcgcc gatgaccttg    3360

ccggagaagc tgttcgacca gccctcggtg gtgtgctggg ccagtgagca catcgaggcc    3420

atgatcgtct cggccggccg gtggcattgc accaccagcg catcggggta ggcagcgaac    3480

aacgcgtcga gggcgaacag gtggctcgga ttcttgagca cccagcgctt ttcgggctcg    3540

ttgaggccga tcaactgcag gttcttgcga tgccgctgat aggacttggt ccagtcctgc    3600

tgggccagcc aacgcgaata ggtggggatg tgcgccaggg tctcatagga caccgaatgc    3660

agcgattgcc gtaacagctg ccagcactct tcgacctcgt cggcggtcat gtagtgc       3717

<210>2

<211>395

<212>PRT

<213>新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)

<400>2

Val Thr Thr Glu Thr Ala Gly Ile Arg Glu Ile Asp Thr Gly Asp Leu

1                5                   10                  15

Pro Asp Arg Tyr Ala Arg Gly Trp His Cys Leu Gly Pro Val Lys Asp

            20                  25                  30

Tyr Leu Asp Gly Lys Pro His Gly Val Glu Ile Phe Asp Thr Met Leu

        35                  40                  45

Val Val Phe Ala Asp Ser Glu Gly Glu Leu Lys Val Leu Asp Gly Tyr

    50                  55                  60

Cys Arg His Met Gly Gly Asn Leu Ala Gln Gly Thr Ile Lys Gly Asp

65                  70                  75                  80

Thr Val Ala Cys Pro Phe His Asp Trp Arg Trp Gly Gly Asp Gly Lys

                85                  90                  95

Cys Lys Leu Val Pro Tyr Ala Lys Arg Thr Pro Arg Leu Ala Arg Thr

            100                 105                 110

Arg Ala Trp His Thr Asp Val Arg Gly Gly Leu Leu Phe Val Trp His

        115                 120                 125

Asp His Glu Gly Asn Pro Pro Gln Pro Glu Val Arg Ile Pro Glu Ile

    130                 135                 140

Pro Glu Phe Ala Ser Asp Asp Trp Thr Asp Trp Arg Trp Asn Thr Met

145                 150                 155                 160

Leu Ile Glu Gly Ser Asn Cys Arg Glu Ile Ile Asp Asn Val Thr Asp

                165                 170                 175

Met Ala His Phe Phe Tyr Ile His Tyr Gly Leu Pro Thr Tyr Phe Lys

            180                 185                 190

Asn Val Phe Glu Gly His Ile Ala Ser Gln Tyr Leu His Asn Val Gly

        195                 200                 205

Arg Pro Asp Val Asn Asp Leu Gly Thr Thr Tyr Gly Glu Ala His Leu

    210                 215                 220

Asp Ser Glu Ala Ser Tyr Phe Gly Pro Ser Phe Met Ile Asn Trp Leu

225                 230                 235                 240

His Asn Asn Tyr Gly Gly Phe Lys Ala Glu Ser Ile Leu Ile Asn Arg

                245                 250                 255

His Tyr Pro Val Ser Gln Asp Ser Phe Val Leu Gln Trp Gly Val Ile

            260                 265                 270

Val Glu Lys Pro Lys Gly Leu Asp Glu Lys Thr Thr Asp Lys Leu Ala

        275                 280                 285

Arg Val Phe Thr Glu Gly Val Ser Lys Gly Phe Leu Gln Asp Val Glu

    290                 295                 300

Ile Trp Lys His Lys Thr Arg Ile Asp Lys Pro Leu Leu Val Glu Glu

305                 310                 315                 320

Asp Gly Ala Val Tyr Gln Met Arg Arg Trp Tyr Gln Gln Phe Tyr Val

                325                 330                 335

Asp Val Ala Asp Val Thr Pro Asp Thr Thr Asp Arg Phe Glu Met Glu

            340                 345                 350

Val Asp Thr Thr Ile Ala Asn Glu Lys Trp His Val Glu Val Glu Glu

        355                 360                 365

Asn Leu Lys Leu Gln Gln Asp Ala Ala Glu Gln Asp Ala Ala Glu Gln

    370                 375                 380

Gly Glu Pro Gln Lys Glu Ser Ala Gln Pro Ser

385                 390                 395

<210>3

<211>1056

<212>DNA

<213>新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)

<220>

<221>基因

<222>(1)..(1056)

<223>3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因

<400>3

atgacggagg agccgctcgg cagccatgtg ctggaactgg agatcgccgc cgtcgttgag     60

gagaccgccg atgcccggtc gctcgtgttc gacatcccgg ccggcagcga tatgcccgcc    120

gagaggttgc ggtactcgcc cggccagttc ctgacgctgc gcgtgcccag cgagcggacc    180

ggatcggtgg cccgctgcta ctccctgtcg agctcgcccg cacacggcga gaagctgacc    240

gtgaccgtca agcggaccgc cgacgggtac gcgtcgaatt ggctgtgcga caacgcccat    300

cgcggtatgc gcatgcatgt gctggcacca tcgggcacct tcgtccccac gacgctggac    360

accgacttcc tgctgttggc cgcgggcagc gggatcaccc cgatgatggc gatctgtaag    420

tccgccctcg ccgagggctc cggaaaggtc gtcctggtct acgccaaccg tgacgagaac    480

tcggtcatct tcgccgatgc gctgcgtgag ttggccgccg cgcacccgga ccggctgacg    540

gtgatccact ggctggagac cgtacagggg ttgcccaaca ccgatgcgct ggcgacgctg    600

gtgcgaccgt tcgccgcata tgaggcattc atctgcgggc ccggcccgtt catgtccgcc    660

gccgaagcgg cgtgcaagac cgtcgatgcc aggcatatcc acatcgaggt gttcaagtcg    720

ctggattccg acccgttcgc tcaggtcgtc atagacgtgg acgaagacga cgaccgcggc    780

cccgcgcagg cgatcgtcga actcgacggc accacccacg agatcgaatg gccgcgtaag    840

gccaagttgc tcgatgtgct gctgaacaag ggtctggacg caccgttctc ctgccgggag    900

ggccactgcg gggcgtgcgc ggtgctgatg cgcaagggcg atgtcgagat ggagatcaac    960

gatgtcctgg agccgtccga actcgacgag ggcctcatcc tggcctgcca ggctttgccg   1020

acatcggatc cggtggaagt cacctacgac gaatag                             1056

<210>4

<211>351

<212>PRT

<213>新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)

<400>4

Met Thr Glu Glu Pro Leu Gly Ser His Val Leu Glu Leu Glu Ile Ala

1                5                   10                  15

Ala Val Val Glu Glu Thr Ala Asp Ala Arg Ser Leu Val Phe Asp Ile

            20                  25                  30

Pro Ala Gly Ser Asp Met Pro Ala Glu Arg Leu Arg Tyr Ser Pro Gly

        35                  40                  45

Gln Phe Leu Thr Leu Arg Val Pro Ser Glu Arg Thr Gly Ser Val Ala

    50                  55                  60

Arg Cys Tyr Ser Leu Ser Ser Ser Pro Ala His Gly Glu Lys Leu Thr

65                  70                  75                  80

Val Thr Val Lys Arg Thr Ala Asp Gly Tyr Ala Ser Asn Trp Leu Cys

                85                  90                  95

Asp Asn Ala His Arg Gly Met Arg Met His Val Leu Ala Pro Ser Gly

            100                 105                 110

Thr Phe Val Pro Thr Thr Leu Asp Thr Asp Phe Leu Leu Leu Ala Ala

        115                 120                 125

Gly Ser Gly Ile Thr Pro Met Met Ala Ile Cys Lys Ser Ala Leu Ala

    130                 135                 140

Glu Gly Ser Gly Lys Val Val Leu Val Tyr Ala Asn Arg Asp Glu Asn

145                 150                 155                 160

Ser Val Ile Phe Ala Asp Ala Leu Arg Glu Leu Ala Ala Ala His Pro

                165                 170                 175

Asp Arg Leu Thr Val Ile His Trp Leu Glu Thr Val Gln Gly Leu Pro

            180                 185                 190

Asn Thr Asp Ala Leu Ala Thr Leu Val Arg Pro Phe Ala Ala Tyr Glu

        195                 200                 205

Ala Phe Ile Cys Gly Pro Gly Pro Phe Met Ser Ala Ala Glu Ala Ala

     210                 215                 220

Cys Lys Thr Val Asp Ala Arg His Ile His Ile Glu Val Phe Lys Ser

225                 230                 235                 240

Leu Asp Ser Asp Pro Phe Ala Gln Val Val Ile Asp Val Asp Glu Asp

                245                 250                 255

Asp Asp Arg Gly Pro Ala Gln Ala Ile Val Glu Leu Asp Gly Thr Thr

            260                 265                 270

His Glu Ile Glu Trp Pro Arg Lys Ala Lys Leu Leu Asp Val Leu Leu

        275                 280                 285

Asn Lys Gly Leu Asp Ala Pro Phe Ser Cys Arg Glu Gly His Cys Gly

    290                 295                 300

Ala Cys Ala Val Leu Met Arg Lys Gly Asp Val Glu Met Glu Ile Asn

305                 310                 315                 320

Asp Val Leu Glu Pro Ser Glu Leu Asp Glu Gly Leu Ile Leu Ala Cys

                325                 330                 335

Gln Ala Leu Pro Thr Ser Asp Pro Val Glu Val Thr Tyr Asp Glu

            340                 345                 350

Claims (49)

1.一种3-甾酮-9α-羟基化酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9α-羟基化酶基因编码SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列或其无义突变序列。

2.根据权利要求1所述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9α-羟基化酶基因与SEQ ID NO：1所示序列的第1328-2516位核苷酸序列具有70％以上的一致性或与所述SEQ ID NO：1所示序列具有60％以上的一致性。

3.根据权利要求2所述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9α-羟基化酶基因与SEQ ID NO：1所示序列的第1328-2516位核苷酸序列具有87％以上的一致性。

4.根据权利要求1所述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9α-羟基化酶基因编码的蛋白的氨基酸序列与所述氨基酸序列具有75％以上的一致性。

5.根据权利要求4所述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9α-羟基化酶基因编码的蛋白的氨基酸序列与所述氨基酸序列具有80％以上的一致性。

6.根据权利要求1所述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9α-羟基化酶基因来源于分枝杆菌属微生物。

7.根据权利要求6所述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因，其特征在于，所述分枝杆菌属微生物是快速生长型分枝杆菌。

8.根据权利要求7所述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因，其特征在于，所述快速生长型分枝杆菌是Mycobacterium sp.NRRL B-3683与B-3805、Mycobacterium smegmatism、Mycobacterium fortuitum、Mycobacterium gilvum、Mycobacterium neoaurum、Mycobacterium Phlei、Mycobacterium avium、Mycobacterium vanbaalenii或Mycobacterium vanbaalenii。

9.根据权利要求7所述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因，其特征在于，所述快速生长型分枝杆菌是Mycobacterium neoaurum NwIB-01，保藏编号是CCTCC M 209094。

10.一种3-甾酮-9α-羟基化酶，其特征在于，所述3-甾酮-9α-羟基化酶是SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其无义突变序列。

11.根据权利要求10所述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9α-羟基化酶与所述氨基酸序列具有75％以上的一致性。

12.根据权利要求11所述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9α-羟基化酶与所述氨基酸序列具有80％以上的一致性。

13.一种基因工程表达载体，其特征在于，所述表达载体整合有权利要求1所述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因。

14.根据权利要求13所述的基因工程表达载体，其特征在于，所述表达载体是细菌表达载体、酵母表达载体或哺乳动物表达载体。

15.根据权利要求14所述的基因工程表达载体，其特征在于，所述细菌表达载体是大肠杆菌表达载体、链霉菌表达载体或分枝杆菌表达载体。

16.根据权利要求15所述的基因工程表达载体，其特征在于，所述大肠杆菌表达载体是pET表达载体，所述链霉菌表达载体是pLMJ链霉菌-大肠杆菌穿梭表达载体，所述分枝杆菌表达载体是pFZ36分枝杆菌整合载体或pAL5000或pFZ2分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体。

17.一种基因工程表达菌株，其特征在于，所述基因工程表达菌株含有权利要求13所述的基因工程表达载体或者整合有权利要求1所述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因，其中所述基因工程表达载体是细菌表达载体。

18.根据权利要求17所述的基因工程表达菌株，其特征在于，所述细菌表达载体是大肠杆菌表达载体、链霉菌表达载体或分枝杆菌表达载体，相应地，所述基因工程表达菌株是大肠杆菌、链霉菌或分枝杆菌。

19.根据权利要求18所述的基因工程表达菌株，其特征在于，所述大肠杆菌表达载体是pET表达载体，所述链霉菌表达载体是pLMJ链霉菌-大肠杆菌穿梭表达载体，所述分枝杆菌表达载体是pFZ36分枝杆菌整合载体或pAL5000或pFZ2分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体，相应地，所述大肠杆菌是BL21菌株，所述链霉菌是变铅青链霉菌Streptomyceslividans，所述分枝杆菌是Mycobacterium sp.NRRL B-3683与B-3805、Mycobacteriumsmegmatism、Mycobacterium fortuitum、Mycobacterium gilvum、Mycobacteriumneoaurum、Mycobacterium Phlei、Mycobacterium avium、Mycobacterium vanbaalenii或Mycobacterium vanbaalenii。

20.根据权利要求17所述的基因工程表达菌株在降解甾醇制备9α-羟基雄甾-4-烯-3，17-二酮中的应用。

21.根据权利要求17所述的基因工程表达菌株在对3-酮甾体化合物进行9α-羟基化反应制备3-酮-9α-羟基甾体化合物中的应用。

22.一种分枝杆菌基因工程突变菌株，其特征在于，通过突变权利要求1所述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因，并通过同源重组构建获得。

23.根据权利要求22所述的分枝杆菌基因工程突变菌株，其特征在于，所述突变是缺失或点突变所述3-甾酮-9α-羟基化酶基因。

24.根据权利要求22所述的分枝杆菌基因工程突变菌株在降解甾醇制备雄甾-4-烯-3，17-二酮中的应用。

25.根据权利要求22所述的分枝杆菌基因工程突变菌株在降解甾醇制备雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮中的应用。

26.根据权利要求22所述的分枝杆菌基因工程突变菌株在降解甾醇制备9α-雄甾-4-烯-3，17-二酮中的应用。

27.一种3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因编码SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或其无义突变序列。

28.根据权利要求27所述的3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列具有70％以上的一致性。

29.根据权利要求28所述的3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列具有80％以上的一致性。

30.根据权利要求27所述的3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因编码的蛋白序列与所述氨基酸序列具有70％以上的一致性。

31.根据权利要求30所述的3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因编码的蛋白序列与所述氨基酸序列具有80％以上的一致性。

32.根据权利要求27所述的3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因来源于分枝杆菌属微生物。

33.根据权利要求32所述的3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因，其特征在于，所述分枝杆菌属微生物是快速生长型分枝杆菌。

34.根据权利要求33所述的3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因，其特征在于，所述快速生长型分枝杆菌是Mycobacterium sp.NRRL B-3683与B-3805、Mycobacterium smegmatism、Mycobacterium fortuitum、Mycobacterium gilvum、Mycobacterium neoaurum、Mycobacterium Phlei、Mycobacterium avium、Mycobacterium vanbaalenii或Mycobacterium vanbaalenii。

35.根据权利要求33所述的3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因，其特征在于，所述快速生长型分枝杆菌是Mycobacterium neoaurum NwIB-01，保藏编号是CCTCC M 209094。

36.一种3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶，其特征在于，所述3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶是SEQID NO：4所示的氨基酸序列或其无义突变序列。

37.根据权利要求36所述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶与所述氨基酸序列具有70％以上的一致性。

38.根据权利要求37所述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶与所述氨基酸序列具有80％以上的一致性。

39.一种基因工程表达载体，其特征在于，所述表达载体整合有权利要求27所述的3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因。

40.根据权利要求39所述的基因工程表达载体，其特征在于，所述表达载体是细菌表达载体、酵母表达载体或哺乳动物表达载体。

41.根据权利要求40所述的基因工程表达载体，其特征在于，所述细菌表达载体是大肠杆菌表达载体、链霉菌表达载体或分枝杆菌表达载体。

42.一种基因工程表达菌株，其特征在于，所述基因工程表达菌株含有权利要求39所述的基因工程表达载体或者整合有权利要求27所述的3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因，其中所述基因工程表达载体是细菌表达载体。

43.根据权利要求42所述的基因工程表达菌株，其特征在于，所述细菌表达载体是大肠杆菌表达载体、链霉菌表达载体或分枝杆菌表达载体，相应地，所述基因工程表达菌株是大肠杆菌、链霉菌或分枝杆菌。

44.根据权利要求42所述的基因工程表达菌株，其特征在于，所述基因工程表达菌株还含有权利要求13所述的基因工程表达载体或者整合有权利要求1所述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因，其中所述基因工程表达载体是细菌表达载体。

45.根据权利要求44所述的基因工程表达菌株在对3-酮甾体化合物进行9α-羟基化反应制备3-酮-9α羟基甾体化合物中的应用。

46.一种新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)，所述新金分枝杆菌的保藏编号是CCTCC M 209094。

47.根据权利要求46所述的新金分枝杆菌，其特征在于，包括权利要求1所述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因和权利要求27所述的3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因。

48.一种双组分式IA型末端氧化酶体系，其特征在于，包括权利要求1所述的3-甾酮-9α-羟基化酶基因编码的3-甾酮-9α-羟基化酶和权利要求27所述的3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶基因编码的3-甾酮-9α-羟基化酶还原酶。

49.根据权利要求48所述的双组分式IA型末端氧化酶体系在在对3-酮甾体化合物进行9α-羟基化反应制备3-酮-9α羟基甾体化合物中的应用。

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