CN104178435A - 一种适合于高糖面团发酵的高活性干酵母 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适合于高糖面团发酵的高活性干酵母，所述适合高糖面团发酵的高活性干酵母是将一株面包酵母重组菌株经菌种活化、种子液制备、发酵罐培养、分离洗涤、过滤、干燥及包装过程制得，所述面包酵母重组菌株是通过敲除酵母出发菌株中编码蔗糖转换酶的SUC2基因全序列所得。该高活性干酵母高糖面团发酵2h CO₂产生量为1025mL以上，该活性干酵母在高糖面团中的发酵能力能力强，解决了甜面包制作过程中的技术障碍和质量缺陷，提高了我国烘焙食品工业的生产技术水平，并且选育得到的高活性干酵母对发酵设备及条件没有任何特殊要求，一般工厂的设备和条件均可使用，因而具有广泛的应用前景。

Description

一种适合于高糖面团发酵的高活性干酵母

技术领域

本发明涉及一种活性干酵母，特别是一种适合高糖面团发酵的高活性干酵母。

背景技术

甜面包在我国习惯称为点心面包，其入口香甜而松软，面包内质和外观均质地细腻、组织均匀，外观上漂亮诱人，给人以美的享受，特别是各种包馅的甜面包，更是风格迥异，能满足不同消费者的饮食需要。但是甜面包制作过程中，除添加面粉、酵母、盐和水4种要素原料外，还需加入较多的蔗糖、鸡蛋、奶粉和油脂等高级原辅料，有些甜面包含蔗糖量甚至高达25％，此时普通面包酵母的发酵速度就不可避免的受到抑制。一般工业制作上，为了解决这个问题，通常采用加大酵母用量的方法，这无疑会带来一定的负面影响，如面包酵母味较重，生产成本较高等。正是这些缺陷所在限制了高糖面团技术的发展。

中国专利CN101948762B公开了一种利用微波真空干燥制备活性干酵母的方法，通过酵母乳液的制备、添加保护剂、微波真空干燥等步骤制备得到活性较高的活性干酵母。中国专利CN101173222A公开了一种红薯生淀粉水解发酵的活性干酵母的制备方法，将酵母菌株Y-3L培养发酵，通过对获得的发酵液进行离心分离、洗涤，板框过滤，混合造粒，真空干燥等工艺，得到具有良好发酵和应用特性的活性干酵母Y-3L。

但是在我国，对于高糖面团的工艺研究较多，而有关面包酵母高糖面团发酵机制和菌种选育的研究较少，尤其是在适合高糖面团发酵的酵母产品方面还是一个空白。

高糖面包酵母菌株是高糖面团技术的关键所在，为此，国内外科研人员对酵母的耐高糖机制进行了大量的研究工作。据报道，面包酵母在高糖中的发酵力与胞内海藻糖含量、甘油含量和蔗糖酶酶活以及细胞的呼吸能力有关。其中，蔗糖酶酶活对面包酵母高糖面团发酵力起着重要作用。在高糖面团发酵中，蔗糖酶将蔗糖水解成D-葡萄糖和D-果糖，随后葡萄糖和果糖进入糖酵解途径以供酵母利用。由于蔗糖的快速分解生成葡萄糖和果糖会使酵母细胞渗透压增加，同时，葡萄糖的积累使得酵母的面团产气量低、发酵速度缓慢。

因此，为了减轻渗透压的抑制作用以及葡萄糖效应，可以通过降低蔗糖转换酶活力来实现，从而提高面包酵母高糖环境下的耐受性，并以此制备适合高糖面团发酵的高活性干酵母产品，为解决高糖面团发酵开辟新的途径。

发明内容

本发明所解决的技术问题是，构建一株适合高糖面团发酵的酵母重组菌株，并将其制备为易保存、流通和使用方便的高活性干酵母，运用于高糖面团的发酵。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种面包酵母重组菌株，是通过缺失酵母出发菌株中编码蔗糖转换酶的SUC2基因全序列来获得。

所述SUC2基因其Gene ID为：854644，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

优选的，所述酵母出发菌株为面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32253。

所述面包酵母重组菌株的构建过程如下：

(1)将含有SUC2基因的上、下游序列的DNA分子及标记基因KanMX插入质粒中，得到重组质粒；

(2)以重组质粒为模板扩增出含有SUC2基因的上、下游序列的DNA分子及标记基因KanMX的重组片段，将重组片段转化入出发菌株的a型和α型单倍体菌株中，得到重组后的基因工程单倍体菌株；

(3)将pGAPza质粒导入所述重组后的基因工程单倍体菌株中，纯化并融合后得到所述基因工程菌。

一种适合高糖面团发酵的活性干酵母，其制备方法如下：

(1)菌种活化及种子液制备

①将所述面包酵母重组菌株进行斜面活化和二级摇瓶种子培养后接入种子罐培养；

②将二级摇瓶种子培养液按培养基重量2％～4％的接种量接入装有12°～14°Bx糖蜜培养基的种子罐，同时补加氮、磷、镁等无机盐以及适量的生物素，其中可发酵性糖类含量50～70g/L，N含量为1.4～1.6g/L，P₂O₅含量0.4～0.6g/L，pH4.5～5.0，28-32℃,150rpm培养20-24h。

所述糖蜜培养基为：将处理后的糖蜜(30～35Brix)稀释至10～14Brix，添加酵母粉5g/L，硫酸铵0.5g/L，pH5.0，115℃灭菌15min制得。

(2)发酵罐培养

第一代酵母培养：将种子罐种子培养液按发酵培养基体积5％-10％的接种量接入发酵罐，30-34℃，180rpm培养24～30h，发酵液离心、洗涤获得鲜酵母乳。

第二代酵母培养：将第一代培养的鲜酵母乳按发酵培养基体积10％～15％的接种量接入发酵罐，30-37℃180rpm培养16～24h。

所述发酵培养基为12°～14°Bx糖蜜培养基。

(3)分离与洗涤

发酵结束后，将发酵液于离心机中4000r/min离心分离20-30min，并用清水洗涤2～3次。

(4)过滤

将上述分离洗涤得到的鲜酵母乳通过真空转鼓过滤机进行过滤，得到含水量为65％～70％的鲜酵母。

(5)干燥

鲜酵母加入其重量0.5％-1.0％的保护剂，通过挤压机挤压成条状，直接进入流化床干燥。干燥室温度控制在25～45℃，干燥时间为40～60min，出口物料含水量为4％～5％。

所述保护剂为山梨醇单硬脂酸酯；

(6)包装

按国标GB/T20886-2007检测发酵力，并进行真空包装，即可得到适合高糖面团发酵的高活性干酵母。

有益效果：

本发明解决了了普通活性干酵母高糖面团发酵力不足的难题，提供一种适合于高糖面团发酵的高活性干酵母。所述高糖面团发酵的高活性干酵母是在保持优良发酵性能的前提下降低了蔗糖酶酶活，降低了高糖面团发酵室的渗透压抑制和葡萄糖效应，能够加快高糖面团的发酵速度，拥有在高糖面团中较高的发酵能力，所述适合高糖面团发酵的高活性干酵母产品，在高糖面团中2h CO₂产生量为1025mL以上，解决了甜面包制作过程中的技术障碍和质量缺陷，提高了我国烘焙食品工业的生产技术水平，对促进我国酵母工业的发展和高糖面团技术的推广应用具有重要意义。优质的适合高糖面团发酵的高活性干酵母产品的出现，必将带动我国高糖面团工业、焙烤食品行业、馒头产业和零售行业的发展。

附图说明：

图1为重组菌株BS-1构建的技术路线图

图2为pUC-AKB质粒构建过程

图3为pUC-AKB重组质粒酶切验证图

a中M为DNA maker泳道1为BamHI和PstI双酶切pUC-B质粒

泳道2为BamHI和PstI双酶切pUC-19质粒泳道3为BamHI和PstI双酶切SB片段

b中M为DNA maker泳道1为EcoRI和KpnI双酶切pUC-B质粒

泳道2为EcoRI-KpnI双酶切SA片段泳道3为EcoRI和KpnI双酶切pUC-AB质粒

c中M为DNA maker泳道1为KpnI和BamHI双酶切KanMX片段

泳道2为KpnI和BamHI pUC-AB质粒泳道3为KpnI和BamHI双酶切pUC-AKB质粒

图4为基因盒SA-KanMX-SB片段与酵母基因组重组过程

图5为重组单倍体验证图

其中M为DNA Marker；

泳道1为以单倍体亲本基因组为模板，Y-U和Y-K-D为引物进行PCR扩增的产物；

泳道2为以重组单倍体基因组为模板，Y-U和Y-K-D为引物进行PCR扩增的产物；

泳道3为以单倍体亲本基因组为模板，Y-K-U和Y-D为引物进行PCR扩增的产物；

泳道4为以重组单倍体基因组为模板，Y-K-U和Y-D为引物进行PCR扩增的产物；

图6为KanMX抗性基因剔除PCR验证

其中M为DNA Marker；

泳道1为以重组菌株单倍体基因组为模板，K1和K2为引物进行PCR扩增的产物；

泳道2为以去除KanMX抗性基因的重组菌株单倍体基因组为模板，K1和K2为引物进行PCR扩增的产物；

图7为pGAPza质粒丢失PCR验证

其中M为DNA Marker；

泳道1为以去除KanMX抗性基因的重组单倍体菌株的第一代酵母质粒为模板，Z-U和Z-D为引物进行PCR扩增的产物；

泳道2为以去除KanMX抗性基因的重组单倍体菌株的第十代酵母质粒为模板，Z-U和Z-D为引物进行PCR扩增的产物。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明的一种适合高糖面团发酵的高活性干酵母。若无特别说明，本发明中所采用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而不是限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动均属于本发明的保护范围。

实施例1：适合高糖面团发酵的面包酵母菌株的构建

重组菌株的构建流程如图1所示。

双倍体出发菌株CICC32253经过单倍体化生成a型和α型单倍体菌株70a和24α，通过两次同源重组的方法构建重组单倍体菌株，去除KanMX抗性基因并杂交该单倍体菌株，生成双倍体重组菌株BS-1。

(1)重组质粒pUC-AKB的构建

重组质粒pUC-AKB的构建流程如图2所示.

①以酵母出发菌株CICC32253总DNA为模板，PCR扩增出SUC2基因的下游序列SB；

上游引物SB1：CGGGATCCACCCACAATCGTAATGTAGTTGC(SEQ ID NO:2)

下游引物SB2：AACTGCAGTCCATTATTGTTTTTCCGCCTTCTG(SEQ ID NO:3)

划线部分为酶切位点；

PCR反应条件：95℃5min；94℃45s；58℃1min；72℃30s，30个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；

PCR反应体系(20μL)

PCR buffer

dNTP

上、下游引物

模板

Taq酶

DdH2O

总体积

2.0μL

1.5μL

各1.0μL

1.0μL

0.5μL

13.0μL

20.0μL

将PCR产物连接到含有Amp抗性的pUC19质粒载体上，获得重组质粒pUC-B。

②以酵母出发菌株CICC32253总DNA为模板，PCR扩增出SUC2基因的上游序列SA；

上游引物SA1：CGGAATTCATTTACCGTATGGGAGTT(SEQ ID NO:4)

下游引物SA2：GGGGTACCTTTCAGGAGGAAGGATT(SEQ ID NO:5)

划线部分为酶切位点

PCR反应条件：95℃5min；94℃45s；63℃1min；72℃30s，30个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；

将PCR产物连接到重组质粒pUC-B上，得到重组质粒pUC-AB。

③以pUC6质粒为模板，PCR扩增出KanMX抗性基因；

上游引物K1：GGGGTACCCAGCTGAAGCTTCGTACGC(SEQ ID NO:6)

下游引物K2：CGGGATCCGCATAGGCCA CTAGTGGATC TG(SEQ ID NO:7)

划线部分为酶切位点

PCR反应条件：95℃5min；94℃45s；61℃1min；72℃90s，30个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；

将PCR产物连接到重组质粒pUC-AB上，得到重组质粒pUC-AKB，图3为重组质粒酶切验证图。

(2)SUC2基因的敲除

基因盒SA-KanMX-SB片段与酵母基因组重组过程如图4所示。

以重组质粒pUC-AKB为模板，PCR扩增获得重组基因盒SA-KanMX-SB片段。通过醋酸锂转化的方法将重组基因盒导入面包酵母出发菌株CICC32253的a型和α型单倍体菌——70a和24α中，转化后通过G418抗性筛选重组子，通过SA和SB片段与酵母染色体上SUC2基因两侧的同源序列同源重组，从而整合到酵母染色体上并随染色体一起复制，KanMX片段同源重组替换了酵母染色体上的SUC2基因，从而实现SUC2基因的完全敲除，得到a型和α型单倍体重组菌株ΔSUC2-a和ΔSUC2–α，图5为重组单倍体验证图。

(3)抗性基因KanMX的去除

采用Cre-LoxP报告基因挽救系统来剔除KanMX抗性基因，具体实施方法如下：

①利用醋酸锂转化法将pGAPza质粒导入ΔSUC2-a和ΔSUC2-α工程菌株中，并用Zeocin抗性浓度为500mg/mL的YEPD平板筛选转化子,避光培养2-3天；

②将带有pGAPza质粒的转化子在半乳糖培养基中诱导表达5h左右，梯度稀释后取适量菌液涂布于YEPD平板，培养1-2天；

③挑取步骤②中长出的单菌落对应点接到无G418的YEPD平板和含有300μg/mL G418的YEPD平板上，30℃培养2-3d；

④挑取上述步骤③中在无G418平板上可以生长但在含有G418平板上不能生长的单菌落进行提基因组，同时提取单倍体重组菌株ΔSUC2-a与ΔSUC2-α菌株基因组；

⑤以步骤④提取的基因组为模板，进行PCR扩增，所用引物如前实施例1：适合高糖面团发酵的面包酵母菌株的构建中的(1)重组质粒pUC-AKB的构建过程中的K1和K2，PCR条件如下：95℃5min；94℃45s；61℃1min；72℃90s，25个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，以单倍体重组菌株ΔSUC2-a与ΔSUC2-α基因组为模板扩增出约1600bp的条带，而步骤③中在无G418平板上可以生长但在含有G418平板上不能生长的单菌落基因组不能扩增出1600bp的条带，证明KanMX抗性基因去除成功，验证图如图6；

(4)pGAPza质粒的丢失

①将去除KanMX抗性基因的菌株于YEPD培养基中进行以丢失其导入的pGAPza质粒，传代10次；

②选取去除KanMX抗性基因的菌株的第一代和第十代提取酵母质粒，然后利用提取质粒为模板，利用Z-U和Z-D引物进行PCR扩增，PCR反应条件如下：95℃5min；94℃45s；62℃1min；72℃80s，25个循环；72℃10min，0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，第一代酵母质粒上可以扩增出1200bp左右大小的Zeocin抗性基因片段，而从第十代酵母质粒上则扩增不出，证明突变株中的pGAPza质粒已丢失，进而得到去除KanMX抗性基因同时丢失pGAPza质粒的单倍体重组菌株，验证图如图7。

Z-U：5′-ATCGTCGACCCCACACACCATAGCTTCA-3′(SEQ ID NO:8)

Z-D：5′-GCGGTCGACAGCTTGCAAATTAAAGCCTT-3′(SEQ ID NO:9)

(5)重组菌株的获得

将步骤(4)得到的去除KanMX抗性基因同时丢失pGAPza质粒的单倍体重组菌株进行融合，筛选双倍体，即得双倍体重组菌株BS-1。

实施例2：高活性干酵母在高糖面团中发酵性能测定方法

称面粉(于30℃恒温箱保温1～2h)280g，高活性干酵母4.0g、NaCl2.8g、蔗糖44.8g，将蔗糖、NaCl和高活性干酵母分别用100mL和30mL的30℃蒸馏水溶解，混匀倒入面粉中，快速揉成面团，揉面时间控制在6min内，面团终温度30±1℃。将面团放入发酵测定仪的不锈钢盒中，送入活力室内，发酵温度30±0.5℃。调节记录仪零点，关闭放气小孔，发酵力以2h内面团体积的增加量表示。

实施例3：适合高糖面团发酵的高活性干酵母制备方法:

(1)菌种活化

将适合高糖面团发酵的菌株BS-1接入麦芽汁琼脂培养基试管斜面，28℃培养40h，麦芽汁琼脂培养基由麦芽粉碎糖化制得，糖度10-12BriX，pH自然，加入2％琼脂，121℃灭菌30min制得。

(2)实验室一级种子：

挑取麦芽汁琼脂培养基试管斜面菌种1环接种于装有100mL麦芽汁液体培养基的250mL三角瓶中，28℃培养30h，期间每隔12小时摇动1次，直到瓶内发酵产生大量泡沫即可，所述麦芽汁液体培养基由麦芽粉碎糖化制得，糖度10-12BriX，pH自然，121℃灭菌30min制得。

(3)实验室二级种子：

将一级种子培养液按培养基重量8％接种量接入装有10L 12⁰Bx麦芽汁、糖蜜混合培养基的卡氏罐，28℃静置培养24h。

(4)种子罐培养

将二级种子培养液按培养基重量2％的接种量接入装有12⁰Bx糖蜜培养基的种子罐，同时补加氮、镁、磷等无机盐以及适量的生物素，其中可发酵性糖类含量50g/L，N含量为1.4g/L，P₂O₅含量0.4g/L，pH4.5，28℃,150rpm培养20h。

所述糖蜜培养基为：将处理后的糖蜜(30～35Brix)稀释至120Bx，添加酵母粉5g/L，硫酸铵0.5g/L，pH5.0，115℃灭菌15min制得。

所述麦芽汁、糖蜜混合培养基为：上述灭好菌的麦芽汁液体培养基和糖蜜培养基按体积比1:1混合制得。

(5)发酵罐培养

第一代酵母培养：将种子罐种子培养液按培养基体积以5％的接种量接入发酵罐，30℃,180rpm培养24h，通气量300L/h，,pH自然，发酵液离心、洗涤获得鲜酵母乳,发酵罐培养基同种子罐培养基。

第二代酵母培养：将第一代培养的鲜酵母乳按10％接种量接入发酵罐，30℃,180rpm培养16h，通气量300L/h，pH自然，发酵罐培养基同种子罐培养基。

(6)分离与洗涤

发酵结束后，将发酵液于离心机中4000r/min离心分离20min，并用清水洗涤2次。

(7)过滤

将上述分离洗涤得到的鲜酵母乳通过真空转鼓过滤机进行过滤，得到含水量为65％的鲜酵母。

(8)干燥

鲜酵母加入其重量0.5％的山梨醇单硬脂酸酯，通过挤压机挤压成条状，直接进入流化床干燥。干燥室温度控制在25℃，干燥时间60min，出口物料水份为4％。

(9)包装

按国标GB/T20886-2007检测发酵力，并进行真空包装，即可得到适合高糖面团发酵的高活性干酵母。

上述高活性干酵母在其它发酵性能不受影响的情况下，在高糖面团2h CO₂产生量为1045mL。

实施例4：适合高糖面团发酵的高活性干酵母制备方法如下：

(1)菌种活化

将适合高糖面团发酵的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BS-1试管菌种接入麦芽汁琼脂培养基试管斜面，30℃培养45h，，麦芽汁琼脂培养基由麦芽粉碎糖化制得，糖度10-12BriX，pH自然，加入2％琼脂，121℃灭菌30min制得。

(2)实验室一级种子：

挑取麦芽汁琼脂培养基试管斜面菌种1环接种于装有100mL麦芽汁液体培养基的250mL三角瓶中，30℃静置培养33h，期间每隔12小时摇动1次，待瓶内发酵产生大量泡沫即可，麦芽汁液体培养基由麦芽粉碎糖化制得，糖度10-12BriX，pH自然，121℃灭菌30min制得。

(3)实验室二级种子：

将一级种子培养液按培养基重量9％接种量接入装有10L13⁰Bx麦芽汁、糖蜜混合培养基的卡氏罐，30℃静置培养30h。

(4)种子罐培养

将二级种子培养液按培养基重量3％的接种量接入装有13⁰Bx糖蜜培养基的种子罐，同时补加氮、镁、磷等无机盐和适量的生物素，其中可发酵性糖类含量60g/L，N含量为1.5g/L，P₂O₅含量0.5g/L，pH5.0，30℃，150rpm培养22h。

所述麦芽汁液体培养基由麦芽粉碎糖化制得，糖度10-12BriX，pH自然，121℃灭菌30min制得；

所述糖蜜培养基为：将处理后的糖蜜(30～35Brix)稀释至13Brix，添加酵母粉5g/L，硫酸铵0.5g/L，pH5.0，115℃灭菌15min制得。

所述麦芽汁、糖蜜混合培养基为：上述灭好菌的麦芽汁液体培养基和糖蜜培养基按体积比1:1混合制得。

(5)发酵罐培养

第一代酵母培养：将种子罐种子培养液按培养基体积8％的接种量接入发酵罐，32℃,180rpm培养28h，通气量300L/h，,pH自然，离心、洗涤发酵液即可获得鲜酵母乳，发酵罐培养基同种子罐培养基。

第二代酵母培养：将第一代培养的鲜酵母乳按12％接种量接入发酵罐，34℃,180rpm培养20h，通气量300L/h，,pH自然，发酵罐培养基同种子罐培养基。

(6)分离与洗涤

发酵结束后，将发酵液于离心机中4000r/min离心分离30min，并用清水洗涤3次。

(7)过滤

将上述分离洗涤得到的鲜酵母乳通过真空转鼓过滤机进行过滤，得到含水量为68％的鲜酵母。

(8)干燥

鲜酵母加入其重量0.8％的山梨醇单硬脂酸酯，通过挤压机挤压成条状，直接进入流化床干燥。干燥室温度控制在35℃，干燥时间50min，出口物料含水量为5％。

(9)包装

按国标GB/T20886-2007检测发酵力，并进行真空包装，即得适合高糖面团发酵的高活性干酵母。

上述适合高糖面团发酵的高活性干酵母在其它发酵性能不受影响的情况下，在高糖面团发酵时2h CO₂产生量为1060mL。

实施例5：所述耐冷冻活性干酵母制备方法如下：

(1)菌种活化

将适合高糖面团发酵的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BS-1试管菌种接入麦芽汁琼脂培养基试管斜面，32℃培养48h，麦芽汁琼脂培养基由麦芽粉碎糖化制得，糖度10-12BriX，pH自然，加入2％琼脂，121℃灭菌30min制得。

(2)实验室一级种子：

挑取麦芽汁琼脂培养基试管斜面菌种1环接种于装有100mL麦芽汁液体培养基的250mL三角瓶中，32℃静置培养36h，期间每隔12小时摇动1次，直到瓶内发酵产生大量泡沫即可，麦芽汁液体培养基由麦芽粉碎糖化制得，糖度10-12BriX，pH自然，121℃灭菌30min制得。

(3)实验室二级种子：

将一级种子培养液按培养基重量10％接种量接入装有10L14 ⁰Bx麦芽汁、糖蜜混合培养基的卡氏罐，32℃静置培养36h。

(4)种子罐培养

将二级种子培养液按培养基重量4％的接种量接入装有14 ⁰Bx糖蜜培养基的种子罐，同时补加氮、镁、磷等无机盐以及适量的生物素，其中可发酵性糖类含量70g/L，N含量为1.6g/L，P₂O₅含量0.6g/L，pH5.0，32℃,150rpm培养24h。

所述麦芽汁液体培养基由麦芽粉碎糖化制得，糖度10-12BriX，pH自然，121℃灭菌30min制得；

所述糖蜜培养基为：将处理后的糖蜜(30～35Brix)稀释至14Brix，添加酵母粉5g/L，硫酸铵0.5g/L，pH5.0，115℃灭菌15min制得。

所述麦芽汁、糖蜜混合培养基为：上述灭好菌的麦芽汁液体培养基和糖蜜培养基按体积比1:1混合制得。

(5)发酵罐培养

第一代酵母培养：将种子罐种子培养液按培养基体积10％的接种量接入发酵罐，34℃,180rpm培养30h，通气量300L/h，,pH自然，离心、洗涤发酵液即可获得鲜酵母乳，发酵罐培养基同种子罐培养基。

第二代酵母培养：将第一代培养的鲜酵母乳按15％接种量接入发酵罐，37℃,180rpm培养24h，通气量300L/h，,pH自然，发酵罐培养基同种子罐培养基。

(6)分离与洗涤

发酵结束后，将发酵液于离心机中4000r/min离心分离30min，并用清水洗涤3次。

(7)过滤

将上述分离洗涤得到的鲜酵母乳通过真空转鼓过滤机进行过滤，得到含水量为70％的鲜酵母。

(8)干燥

鲜酵母加入其重量1.0％的山梨醇单硬脂酸酯，通过挤压机挤压成条状，直接进入流化床干燥。干燥室温度控制在45℃，干燥时间一般为40min，出口物料含水为5％。

(9)包装

按国标GB/T20886-2007检测发酵力，真空包装，即得适合高糖面团发酵的高活性干酵母。

上述适合高糖面团发酵的高活性干酵母在其它发酵性能不受影响的情况下，在高糖面团2h CO₂产生量为1050mL。

Claims (6)

1.一种适合高糖面团发酵的高活性干酵母，其特征在于，所述适合高糖面团发酵的高活性干酵母菌是将一株面包酵母重组菌株经菌种活化、种子液制备、发酵罐培养、分离洗涤、过滤、干燥及包装过程制得，所述面包酵母重组菌株是通过敲除酵母出发菌株中编码蔗糖转换酶的SUC2基因全序列所得。

2.如权利要求1所述的一种适合高糖面团发酵的高活性干酵母，其特征在于，所述酵母出发菌株为面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32253。

3.如权利要求1或2所述的一种适合高糖面团发酵的高活性干酵母，其特征在于，所述SUC2基因其Gene ID为：854644，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

4.如权利要求1所述的一种适合高糖面团发酵的高活性干酵母，其特征在于，所述面包酵母重组菌株的制备方法如下：

(1)将含有SUC2基因的上、下游序列的DNA分子及标记基因KanMX插入质粒中，得到重组质粒；

(2)以重组质粒为模板扩增出含有SUC2基因的下、下游序列的DNA分子及标记基因KanMX的重组片段，将重组片段转化入出发菌株的a型和α型单倍体菌株中，得到重组后的基因工程单倍体菌株；

(3)将pGAPza质粒导入所述重组后的基因工程单倍体菌株中，纯化并融合后得到所述基因工程菌。

5.如权利要求1所述的一种适合高糖面团发酵的高活性干酵母，其特征在于，所述高活性干酵母的制备方法如下：

(1)菌种活化

将权利要求1所述的面包酵母重组菌株接入麦芽汁琼脂培养基试管斜面，28-32℃培养40-48h；

(2)实验室一级种子：

挑取麦芽汁琼脂培养基试管斜面菌种1环接种于装有100mL液体麦芽汁培养基的250mL三角瓶中，28-32℃静置培养30-36h，期间每12小时摇动1次；

(3)实验室二级种子：

将一级种子培养液按培养基重量8％-10％接种量接入装有10L12°～14°Bx麦芽汁、糖蜜混合培养基的卡氏罐，28-32℃静置培养24～36h；

(4)种子罐培养

将二级种子培养液按培养基重量以2％～4％的接种量接入装有12°～14°Bx糖蜜培养基的种子罐，同时补加含氮、镁、磷的无机盐和生物素，其中可发酵性糖类含量50～70g/L，N含量为1.4～1.6g/L，P₂O₅含量0.4～0.6g/L，pH4.5～5.0，28-32℃，150rpm培养20-24h；

(5)发酵罐培养

第一代酵母培养：将种子罐种子培养液按培养基体积以5％-10％的接种量接入发酵罐，30-34℃,180rpm培养24～30h，离心、洗涤发酵液即可获得鲜酵母乳；

第二代酵母培养：将第一代培养的鲜酵母乳按10％～15％接种发酵罐，30-37℃,180rpm培养16～24h；

发酵培养基为12°～14°Bx糖蜜培养基；

(6)分离与洗涤

发酵结束后，将发酵液于离心机中4000r/min离心分离20-30min，并用清水洗涤2～3次；

(7)过滤

将上述分离洗涤得到的鲜酵母乳通过真空转鼓过滤机进行过滤，得到含水量为65％～70％的鲜酵母；

(8)干燥

鲜酵母中加入其重量0.5％-1.0％的保护剂，通过挤压机挤压成条状，直接进入流化床干燥。干燥室温度控制在25～45℃，干燥时间为40～60min，出口物料含水量为4％～5％；

所述保护剂为山梨醇单硬脂酸酯；

(9)包装

按照国标GB/T20886-2007检测发酵力，并进行真空包装，即可得适合高糖面团发酵的高活性干酵母。

6.如权利要求5所述的一种适合高糖面团发酵的高活性干酵母，其特征在于，所述麦芽汁琼脂培养基为由麦芽粉碎糖化制得，糖度10-12BriX，pH自然，加入2％琼脂，121℃灭菌30min制得；

所述麦芽汁液体培养基由麦芽粉碎糖化制得，糖度10-12BriX，pH自然，121℃灭菌30min制得；

所述糖蜜培养基为：将处理后的糖蜜稀释至10～14Brix，添加酵母粉5g/L，硫酸铵0.5g/L，pH5.0，115℃灭菌15min制得；

所述麦芽汁、糖蜜混合培养基为：上述灭好菌的麦芽汁液体培养基和糖蜜培养基按体积比1:1混合制得。