CN109082385A - 羊肚菌液体菌种的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于羊肚菌人工栽培技术领域，具体涉及一种羊肚菌液体菌种的制备方法。针对现有方法制备的羊肚菌液体菌种菌丝体生长活力低，菌丝体直径大、堵塞设备等问题，本发明提供一种羊肚菌液体菌种的制备方法，包括以下步骤：a、将羊肚菌母种接种于PDA固体培养基中，于22～25℃下恒温培养5～10天；b、取固体培养基，接种于装有液体培养基的四棱大挡板摇瓶中，在摇床上培养2～4天；c、在液体菌种发酵罐中加入液体培养基，灭菌后，接种摇瓶羊肚菌液体菌种，无菌条件下，24～28℃下培养1～3天，即得到羊肚菌液体菌种。本发明液体菌种制备方法耗时短，生产周期短、菌龄一致、重复性好、菌丝球直径小，呈絮状，菌体活力大，适宜工厂化应用。

Description

羊肚菌液体菌种的制备方法
技术领域
本发明属于羊肚菌人工栽培技术领域，具体涉及一种羊肚菌液体菌种的制备方法。
背景技术
羊肚菌(Morchella deliciosa Fr.)是一种珍稀的食药用菌，不同品种的羊肚菌均含有7种人体必需氨基酸，氨基酸总量近40％，脂肪含量低于1％，同时含有丰富的纤维素、矿质元素等，属于优质蛋白食品。四百多年前《本草纲目》已记载其“味甘寒，性平，无毒，益肠胃，化痰理气”。现代医学还发现，羊肚菌能够提升机体免疫力、对肝癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞都具有一定的杀伤能力，并且能够抗疲劳、降血脂、减轻放化疗引起的毒副作用。然而，野生羊肚菌产量很低，现在还缺乏成熟的人工栽培技术，市场供不应求，羊肚菌价格高昂。
在羊肚菌人工栽培过程中，原种的制备耗时长，成本高，运输保藏条件苛刻，且制作运输保藏过程均容易染菌，全程依赖人工操作不仅费时费力，并且容易导致菌种质量参差不齐，严重阻碍羊肚菌的规模化栽培。近年来兴起的液体菌种制备有利于大规模工厂化栽培的推进，但现行的液体菌种质量评价体系单一，大多以菌丝体生物量作为优劣指标，而忽略菌丝体生长活力。
专利CN105441342A公开了一种羊肚菌液体菌种的生产工艺，采用特有配方和组分配制液体菌种，并调节液体菌种的pH值为6.5～6.8，该pH值非常适宜羊肚菌生长繁殖，能够缩短羊肚菌的周期，增强菌种活力；并且，该方法采用高压脉冲电场进行杀菌，去除杂菌能力强。该专利虽可行，但其生产成本高，不适宜工业化运用。
菌丝体结球后质地紧实，球越大生物量越大，但羊肚菌菌丝体生长过程需要丰富的营养及充足的氧气供应，结球过大的菌丝体，尤其是菌丝球内的菌丝体汲取的营养不足，导致接种后的菌丝球生长滞后；汲取的氧气不足，导致无氧呼吸，产生乙醇等副产物加速菌丝体衰败自溶。另一方面大体积的菌丝球容易堵塞工厂化制种接种设备，无法实施喷洒、注射等接种方式。
发明内容
本发明要解决的技术问题为：现有方法制备的羊肚菌液体菌种菌丝体生长活力低，菌丝体直径大、堵塞设备等问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种羊肚菌液体菌种的制备方法，包括以下步骤：
a、将羊肚菌母种接种于PDA固体培养基中，于22～25℃下恒温培养5～10天；
b、取步骤a所得固体培养基，接种于装有液体培养基的四棱大挡板摇瓶中，在摇床上培养2～4天，得到摇瓶羊肚菌液体菌种；
c、在液体菌种发酵罐中加入液体培养基，灭菌后，接种步骤b得到的摇瓶羊肚菌液体菌种，无菌条件下，24～28℃下培养1～3天，即得到羊肚菌液体菌种；
所述液体培养基组成为：按重量百分比计，麸皮4％～7％，玉米淀粉1％～3％，酵母粉0.1％～0.4％，葡萄糖1％～3％，蛋白胨0.2％～0.4％，MgSO4 0.05％～0.15％，KH2PO40.1％～0.15％，余量为水。
其中，上述羊肚菌液体菌种的制备方法中，所述液体培养基的制备方法包括以下步骤：将4％～7％的麸皮加配方量的水煮沸20～30min，过滤，在滤液中加入经超微粉碎的玉米淀粉1％～3％，酵母粉0.1％～0.4％，葡萄糖1％～3％，蛋白胨0.2％～0.4％，MgSO40.05％～0.15％，KH2PO4 0.1％～0.15％，搅拌均匀后在压力0.1～0.2MPa，121℃，灭菌20～40min。
进一步的，上述羊肚菌液体菌种的制备方法中，所述超微粉碎后的各原料全部粒径在50～70μm范围内。
更进一步的，上述超微粉碎的具体操作步骤为：将原料烘干至水分含量低于5％，经粗粉碎机处理6～10h，再经一级剪切粉碎机重复粉碎20～30次、二级剪切粉碎机重复粉碎10～20次，共计耗时6～8h，最后经高速分散粉碎机粉碎2～3h，最终原料粒径为50～70μm。
其中，上述羊肚菌液体菌种的制备方法中，步骤a所述的接种量为：每90×15mmPDA培养基中接种3～7mm×3～7mm母种。
其中，上述羊肚菌液体菌种的制备方法中，步骤a所述的PDA固体培养基的组成包括：按重量份数计，土豆150～250份，葡萄糖20～30份，琼脂15～20份，水1000份。
进一步的，上述羊肚菌液体菌种的制备方法中，步骤a所述的PDA固体培养基的制备方法如下：每1000mL水里加入土豆150～250g，煮沸20～30min后过滤，弃滤渣，加入葡萄糖20～30g，琼脂15～20g，搅拌均匀后在压力0.1～0.2MPa，121℃，灭菌15～30min，倒板时平板培养皿内的PDA培养基厚度为2～3mm。
其中，上述羊肚菌液体菌种的制备方法中，步骤b所述接种量为：每100ml液体培养基中接种3～5个直径3～7mm的固体培养基，所述接种时将固体培养基分切为小于1mm×1mm的小块。
其中，上述羊肚菌液体菌种的制备方法中，步骤b所述四棱大挡板摇瓶底部四棱凸起呈四叶草状平均分布，每条棱长3.4～3.8cm，棱高1.6～2.0cm。
其中，上述羊肚菌液体菌种的制备方法中，步骤b所述摇床震荡速度为150～200rpm，温度为24～28℃。
其中，上述羊肚菌液体菌种的制备方法中，步骤c所述的灭菌的具体操作过程为：在压力0.12～0.15MPa，121℃下，灭菌20～40min。
其中，上述羊肚菌液体菌种的制备方法中，步骤c所述接种量为培养基体积的5～10％。
其中，上述羊肚菌液体菌种的制备方法中，步骤c所述羊肚菌液体菌种发酵罐培养的条件为：转速150～350rpm，溶氧量50～90％。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种羊肚菌液体菌种的制备方法，通过采用超微粉碎的原料制备液体培养基，溶解更加完全，有助于羊肚菌菌丝体利用培养基有效成分，显著缩短菌丝体接种到发酵罐后所需适应时间(从5～8天缩短至1～3天)。另外，本发明采用特有的四棱大挡板摇瓶，改变了普通摇瓶中流体力场，加剧液体搅拌，增加培养基溶氧量，促进新生菌丝体萌发，抑制菌丝体结球，培养得到的摇瓶菌丝体呈絮状，无结球，菌丝球的活力更好，不容易堵塞设备。本发明还有效的缩短了从母种到栽培种的时间，仅需13～19天，比现有的37～55天，缩短了2/3的制种周期，制备的液体菌种成本更低，生长活力更强，菌丝体生物量更丰富，生长点更多，能充分满足大规模生产需要。
附图说明
图1所示为实施例3制备的液体菌种，呈絮状；
图2所示为实施例3制备的液体菌种，呈絮状；
图3所示为对比例4制备的液体菌种，呈球状；
图4所示为实施例所用的四棱大挡板摇瓶。
具体实施方式
本发明提供了一种羊肚菌液体菌种的制备方法，包括以下步骤：
a、将羊肚菌母种接种于PDA固体培养基中，于22～25℃下恒温培养5～10天；
b、取步骤a所得固体培养基，接种于装有液体培养基的四棱大挡板摇瓶中，在摇床上培养2～4天，得到摇瓶羊肚菌液体菌种；
c、在液体菌种发酵罐中加入液体培养基，灭菌后，接种步骤b得到的摇瓶羊肚菌液体菌种，无菌条件下，24～28℃下培养1～3天，即得到羊肚菌液体菌种；
所述液体培养基组成为：按重量百分比计，麸皮4％～7％，玉米淀粉1％～3％，酵母粉0.1％～0.4％，葡萄糖1％～3％，蛋白胨0.2％～0.4％，MgSO4 0.05％～0.15％，KH2PO40.1％～0.15％，余量为水。
其中，上述羊肚菌液体菌种的制备方法中，所述液体培养基的制备方法包括以下步骤：将4％～7％的麸皮加配方量的水煮沸20～30min，过滤，在滤液中加入经超微粉碎的玉米淀粉1％～3％，酵母粉0.1％～0.4％，葡萄糖1％～3％，蛋白胨0.2％～0.4％，MgSO40.05％～0.15％，KH2PO4 0.1％～0.15％，搅拌均匀后在压力0.1～0.2MPa，121℃，灭菌20～40min。
进一步的，为了使菌丝体更容易吸收培养基中的养分，所述超微粉碎后的各原料全部粒径在50～70μm范围内。粒径大于70μm，不利于物质溶解被菌丝体吸收。粒径小于50μm，增加超微粉碎成本。
更进一步的，上述超微粉碎的具体操作步骤为：将原料烘干至水分含量低于5％，经粗粉碎机处理6～10h，再经一级剪切粉碎机重复粉碎20～30次、二级剪切粉碎机重复粉碎10～20次，共计耗时6～8h，最后经高速分散粉碎机粉碎2～3h，最终原料粒径为50～70μm。
超微粉碎的方式不局限于上述方式，任何能使原料粉碎至粒径在50～70μm的粉碎方法都可以，但采用上述超微粉碎方法有其特别的优势：整个工艺流程为纯物理过程，不引入任何杂质，且粉碎过程中物料能够保持常温，避免了物料在粉碎期间因高温引发其他副反应。
其中，为了让菌丝体快速生长，步骤a所述的接种量为：每90×15mmPDA培养基中接种3～7mm×3～7mm母种。羊肚菌菌丝体生长速度快，该范围内接种已经能够保证接种后羊肚菌菌丝体正常生长，若接种量过低羊肚菌菌丝体无法萌发、生长速度慢，接种量过高导致母种浪费，超出范围后羊肚菌菌丝体萌发生长速度并不和接种量呈正比。
其中，上述羊肚菌液体菌种的制备方法中，步骤a所述的PDA固体培养基的组成包括：按重量份数计，土豆150～250份，葡萄糖20～30份，琼脂15～20份，水1000份。
进一步的，上述羊肚菌液体菌种的制备方法中，步骤a所述的PDA固体培养基的制备方法如下：每1000mL水里加入土豆150～250g，煮沸20～30min后过滤，弃滤渣，加入葡萄糖20～30g，琼脂15～20g，搅拌均匀后在压力0.1～0.2MPa，121℃，灭菌15～30min，倒板时平板培养皿内的PDA培养基厚度为2～3mm。
其中，为了使液体菌种品质更稳定，步骤b所述接种量为：每100ml液体培养基中接种3～5个直径3～7mm的固体培养基，所述接种时将固体培养基分切为小于1mm×1mm的小块。接种量过低，少量含有菌种的固体培养基进入液体培养环境后需要适应时间延长，菌丝体萌发和生长速度迟缓，接种量过高，导致上一级菌种及液体培养基的浪费，菌丝体未能充分利用液体培养基营养。
其中，上述羊肚菌液体菌种的制备方法中，步骤b所述四棱大挡板摇瓶底部四棱凸起呈四叶草状平均分布，每条棱长3.4～3.8cm，棱高1.6～2.0cm。本发明将棱状凸起置于瓶底能够打断摇瓶震荡产生的圆形流体力场，避免平滑的液体流动增加菌丝体结球概率。本发明所用的四棱大挡板摇瓶容积为250mL，瓶高13.8cm，瓶底直径8.0cm，装液量为100mL，此时效果最好。采用瓶底三棱、两棱或瓶周三棱、两棱凸起的挡板摇瓶均无法达到本发明采用的四棱大挡板摇瓶抑制菌丝体结球的效果。
其中，为了更有利于菌丝体的生长，步骤b所述摇床震荡速度为150～200rpm，温度为24～28℃。
该温度范围最适宜羊肚菌菌丝体萌发生长；摇床震荡速度越高，摇瓶内液体搅动越剧烈，培养基溶氧量越高，越有利于羊肚菌菌丝体耗氧生长。震荡速度低于150rpm，液体培养基溶氧量不足，震荡速度高于200rpm，液体搅动过于剧烈，过强的剪切力将伤害菌丝体抑制其生长。
其中，上述羊肚菌液体菌种的制备方法中，步骤c所述的灭菌的具体操作过程为：在压力0.12～0.15MPa，121℃下，灭菌20～40min。
其中，上述羊肚菌液体菌种的制备方法中，步骤c所述接种量为培养基体积的5～10％。
接种量低于该范围，因接种量过小，菌种进入新环境所需适应时间增长，既有菌丝体生物量低，扩繁到目标生物量耗时更长；接种量高于该范围，培养时间并不随着接种量的增长而呈线性增长，继续增加接种量会导致液体菌种来不及消耗而浪费。
其中，上述羊肚菌液体菌种的制备方法中，步骤c所述羊肚菌液体菌种发酵罐培养的条件为：转速150～350rpm，溶氧量50～90％。
具体的，本发明所述的羊肚菌液体菌种的制备方法，包括以下步骤：
a、将3～7mm×3～7mm羊肚菌母种接种于90×15mmPDA固体培养基中，于22～25℃下恒温培养7～10天；所述的PDA培养基组成包括：按重量份数计，土豆150～250份，葡萄糖20～30份，琼脂15～20份，水1000份；
b、取3～5个直径3～7mm的步骤a所得固体培养基，接种于装有100ml液体培养基的四棱大挡板摇瓶中，在摇床上培养2～4天，震荡速度为150～200rpm，温度为24～28℃，得到摇瓶羊肚菌液体菌种；所述四棱大挡板摇瓶底部四棱凸起呈四叶草状平均分布，每条棱长3.4～3.8cm，棱高1.6～2.0cm；
c、在液体菌种发酵罐中加入液体培养基，灭菌后，接种步骤b得到的摇瓶羊肚菌液体菌种，接种量为培养基体积的5～10％，无菌条件下，转速150～350rpm，溶氧量50～90％，24～28℃下培养1～3天，即得到羊肚菌液体菌种；
所述液体培养基组成为：按重量百分比计，麸皮4％～7％，玉米淀粉1％～3％，酵母粉0.1％～0.4％，葡萄糖1％～3％，蛋白胨0.2％～0.4％，MgSO4 0.05％～0.15％，KH2PO40.1％～0.15％，余量为水。
本发明制备液体菌种时采用了特别设计的四棱大挡板摇瓶，该摇瓶底部四棱凸起呈四叶草状平均分布，每条棱长3.4～3.8cm，棱高1.6～2.0cm。使用本发明的摇瓶不同于普通摇瓶中流体力场，能够加剧液体搅拌，增加培养基溶氧量，促进新生菌丝体萌发，抑制菌丝体结球；培养得到的摇瓶菌丝体呈絮状，无结球状况，再经发酵罐培养得到的菌丝体仍呈絮状。采用本发明方法，最后的成球菌丝体直径为0.5～1.2mm，菌丝体直径小；菌丝球密度达到约2967个/mL，干重约16mg/mL，在降低菌丝球直径的同时，菌丝体生物量达到现有羊肚菌液体菌种培育的较优水平。本发明菌种可应用于液体菌种工厂化生产、接种的各种设备，包括喷洒、注射、拌料等多种方式，避免了现阶段液体菌种生产接种时效率低下、菌丝球过大堵塞设备等问题。
除此之外，本发明还将制备液体菌种培养基的原料进行了超微粉碎，粉碎至粒径50～70μm范围内。超微粉碎的好处在于：(1)培养基养分溶解更加完全，有助于羊肚菌菌丝体利用培养基有效成分，显著缩短菌丝体接种到发酵罐后所需适应时间；(2)超微粉碎后原料增加了发酵液粘度，降低了发酵过程中菌丝体所受剪切力，促进菌丝体生物量增加，菌丝球直径减小；(3)超微颗粒增大了培养基的缓冲功能，羊肚菌菌丝体液体培养pH耐受范围扩展到3.5～7.5，该品系羊肚菌最适pH约为5.0，该培养基配置完成后天然pH达到5.5，整个发酵过程无需调节培养环境pH，羊肚菌菌丝体就能呈良好生长态势，有利于提升菌丝体活力。
综上，本发明方法培育羊肚菌液体菌种，培育时间短，仅需13～19天，相比现有的37～55天，时间节省了近2/3，大幅度缩短了制种周期；本发明方法制备的液体菌种品质稳定，从母种开始定质定量接种，培养条件严格控制，可重复性强，同批次及批次间收获液体菌种菌丝体质量及数量稳定，避免了固体菌种个体间质量差异大、连带污染的情况，适宜工业化实施。
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
实施例中所述四棱大挡板摇瓶是根据实验要求自行设计，由郑州市兴华玻璃仪器厂生产，其余各设备和原料均为普通市售产品。
实施例1用本发明方法制备羊肚菌液体菌种
具体操作步骤如下：
a、选取菌核分布较多的羊肚菌母种试管，避开原始接种块，用无菌手术刀片切取面积3mm×3mm的培养基，接种于90×15mm倒有PDA固体培养基的平板培养皿正中央，接种完成后，将平板培养皿倒置，于25℃恒温培养箱培养7天，至菌丝体布满平板培养皿。
所述PDA固体培养基的制备方法如下：每1000mL水里加入切碎成1厘米见方的土豆150g，煮沸20min后用双层纱布过滤，弃滤渣，加入葡萄糖20g，琼脂15g，搅拌均匀，在压力0.1MPa，121℃条件下，灭菌15min，倒板时控制平板培养皿内PDA培养基厚度为2～3mm。
b、采用孔径5mm的打孔器在布满菌丝体的平板培养皿打孔，避开中央原始接种块并取其半径5mm外的样品，每100mL液体培养基取3颗打孔的圆形固体培养基，在无菌条件下进一步分切为约1mm×1mm小块，接种于液体培养基中，将接种后装有液体培养基的四棱大挡板摇瓶置于摇床中培养，150rpm，24℃下培养4天，得到摇瓶羊肚菌液体菌种。
上述液体培养基的制备方法如下：麸皮4％，将麸皮加水煮沸30min后用纱布过滤，弃滤渣，在滤液中加入其余成分，玉米淀粉1％，酵母粉0.1％，葡萄糖1％，蛋白胨0.2％，MgSO40.05％，KH2PO4 0.1％，所述羊肚菌液体培养基的pH值约为6.0，搅拌均匀后在压力0.1MPa，121℃条件下，灭菌30min。
c、在扩大培养的发酵罐中也注入上述羊肚菌液体培养基，在压力0.12MPa，121℃条件下，灭菌40min。冷却后，按照发酵罐5％的接种量接种摇瓶羊肚菌液体菌种，通入无菌空气，在24℃下培养5天，即得到羊肚菌液体菌种。
所述羊肚菌液体菌种发酵罐培养的条件为：转速150rpm，溶氧量50～90％，pH值为5～6。
实施例1中从母种开始通过限定接种块的大小和位置，使用打孔器平板培养皿定量取样，控制接种量，并将接入摇瓶液体培养基的母种分切至微小体积，不仅增加了菌丝体生长点的数量，同时减小了菌丝体结球的初始体积，确保每批次摇瓶种子的数量及品质稳定，有利于控制进一步扩大培养时因参数放大而引起的批次间差异。
实施例2用本发明方法制备羊肚菌液体菌种
具体操作步骤如下：
a、选取菌核分布较多的羊肚菌母种试管，避开原始接种块，用无菌手术刀片切取面积7mm×7mm、厚度3mm的培养基，接种于90×15mm倒有PDA固体培养基的平板培养皿正中央，接种完成后，将平板培养皿倒置，于25℃恒温培养箱培养5天，至菌丝体布满平板培养皿。
所述PDA固体培养基的制备方法如下：每1000mL水里加入切碎成1厘米见方的土豆250g，煮沸20min后用双层纱布过滤，弃滤渣，加入葡萄糖30g，琼脂15g，搅拌均匀，在压力0.1MPa，121℃条件下，灭菌15min，倒板时控制平板培养皿内PDA培养基厚度为2～3mm。
b、采用孔径5mm的打孔器在布满菌丝体的平板培养皿打孔，避开中央原始接种块并取其半径5mm外的样品，每100mL液体培养基取3颗打孔的圆形固体培养基，在无菌条件下进一步分切为约1mm×1mm小块，接种于液体培养基中，将接种后装有液体培养基的四棱大挡板摇瓶置于摇床中培养，180rpm，28℃下培养3天，得到摇瓶羊肚菌液体菌种。
上述液体培养基的制备方法如下：麸皮4.6％，将麸皮加水煮沸30min后用纱布过滤，弃滤渣，在滤液中加入其余成分，玉米淀粉2.6％，酵母粉0.24％，葡萄糖1％，蛋白胨0.2％，MgSO4 0.05％，KH2PO4 0.1％，所述羊肚菌液体培养基的pH值约为6.0，搅拌均匀后在压力0.1MPa，121℃条件下，灭菌30min。
c、在扩大培养的发酵罐中也注入上述羊肚菌液体培养基，在压力0.12MPa，121℃条件下，灭菌40min。冷却后，按照发酵罐10％的接种量接种摇瓶羊肚菌液体菌种，通入无菌空气，在28℃下培养4天，即得到羊肚菌液体菌种。
所述羊肚菌液体菌种发酵罐培养的条件为：转速200rpm，溶氧量50～90％，pH5.0。
实施例2进一步优化了液体培养基的配方组成和培养条件，显著增加了菌丝体生物量，一定程度减小了菌丝球直径。
实施例3用本发明方法制备羊肚菌液体菌种
具体操作步骤如下：
a、选取菌核分布较多的羊肚菌母种试管，避开原始接种块，用无菌手术刀片切取面积5mm×5mm、厚度3mm的培养基，接种于90×15mm倒有PDA固体培养基的平板培养皿正中央，接种完成后，将平板培养皿倒置，于25℃恒温培养箱培养5天，至菌丝体布满平板培养皿。
所述PDA固体培养基的制备方法如下：每1000mL水里加入切碎成1厘米见方的土豆250g，煮沸30min后用双层纱布过滤，弃滤渣，加入葡萄糖30g，琼脂15g，搅拌均匀，在压力0.2MPa，121℃条件下，灭菌20min，倒板时控制平板培养皿内PDA培养基厚度为2～3mm。
b、采用孔径5mm的打孔器在布满菌丝体的平板培养皿打孔，避开中央原始接种块并取其半径5mm外的样品，每100mL液体培养基取3颗打孔的圆形固体培养基，在无菌条件下进一步分切为约1mm×1mm小块，接种于液体培养基中，将接种后装有液体培养基的四棱大挡板摇瓶置于摇床中培养，180rpm，27℃下培养2～3天，得到摇瓶羊肚菌液体菌种。
所述液体培养基的制备方法如下：麸皮4.6％，将麸皮加水煮沸30min后用纱布过滤，弃滤渣保留滤液。将2.6％玉米淀粉，0.24％酵母粉，1％葡萄糖，0.2％蛋白胨，0.05％MgSO4，0.1％KH2PO4，进行超微粉碎。每100kg原料首先烘箱50℃烘干3～8小时至水分含量低于5％，然后送入粗粉碎机处理8h，再经过一级剪切粉碎机重复粉碎30次、二级剪切粉碎机重复粉碎20次，剪切粉碎机共计耗时8h，最后经过高速分散粉碎机处理2.5h。将超微粉碎后的原料溶入上述滤液中，此时液体培养基的pH值约为5.5，搅拌均匀后在压力0.15MPa，121℃条件下，灭菌30min。
c、在扩大培养的发酵罐中注入上述同样液体培养基，在压力0.15MPa，121℃条件下，灭菌40min。冷却后，按照发酵罐10％的接种量接种摇瓶羊肚菌液体菌种，通入无菌空气，在27℃下培养1～3天，即得羊肚菌液体菌种。
羊肚菌液体菌种发酵罐培养的条件为：转速200rpm，溶氧量50～90％，pH无需调节。
实施例3进一步优化了各项参数，通过超微粉碎培养基原料进一步有效缩短液体发酵时间，提高菌丝体生物量，降低菌丝球直径，最后得到的菌丝体呈絮状(如图1和图2所示)。
对比例4采用现有方法制备羊肚菌液体菌种
具体操作步骤如下：
a、选取菌核分布较多的羊肚菌母种试管，避开原始接种块，用无菌手术刀片切取面积5mm×5mm、厚度3mm的培养基，接种于斜面试管PDA培养基上，接种完成后，将平板培养皿倒置，于22℃恒温培养箱培养7天，至菌丝体布满试管斜面。
所述PDA固体培养基的制备方法如下：每1000mL水里加入切碎成1厘米见方的土豆150g，煮沸20min后用双层纱布过滤，弃滤渣，加入葡萄糖20g，琼脂15g，搅拌均匀，在压力0.1MPa，121℃条件下，灭菌15min，倒板时控制平板培养皿内PDA培养基厚度为2～3mm。
b、将斜面试管中固体培养基划分为约5mm×5mm、厚度3mm小块，每100mL液体培养基取3小块接种到液体培养基中，将接种后装有液体培养基的三棱挡板摇瓶置于普通摇床中培养，150rpm，22℃下培养4天，得到摇瓶羊肚菌液体菌种。
所述液体培养基的制备方法如下：麸皮4％，将麸皮加水煮沸30min后用纱布过滤，弃滤渣，在滤液中加入其余成分，玉米淀粉1％，酵母粉0.1％，葡萄糖1％，蛋白胨0.2％，MgSO40.05％，KH2PO4 0.1％，所述羊肚菌液体培养基的pH值约为6.0，搅拌均匀后在压力0.1MPa，121℃条件下，灭菌30min。
c、在扩大培养的发酵罐中也注入上述羊肚菌液体培养基，在压力0.12MPa，121℃条件下，灭菌40min。冷却后，按照发酵罐5％的接种量接种摇瓶羊肚菌液体菌种，通入无菌空气，在22℃～25℃下培养5天，即得到羊肚菌液体菌种。
羊肚菌液体菌种发酵罐培养的条件为：转速150rpm，溶氧量50～90％，pH5～6。
对比例4采用三棱挡板摇瓶，并且液体培养基原料不采用超微粉碎，制种时间长，菌丝体直径比实施例的大，并且最后得到的菌丝体呈球状，不是絮状(如图3所示)。
对比例5不采用本发明方法制备羊肚菌液体菌种
具体操作步骤如下：
a、选取菌核分布较多的羊肚菌母种试管，避开原始接种块，用无菌手术刀片切取面积5mm×5mm、厚度3mm的培养基，接种于90×15mm倒有PDA固体培养基的平板培养皿正中央，接种完成后，将平板培养皿倒置，于25℃恒温培养箱培养7天，至菌丝体布满平板培养皿。
所述PDA固体培养基的制备方法如下：每1000mL水里加入切碎成1厘米见方的土豆250g，煮沸30min后用双层纱布过滤，弃滤渣，加入葡萄糖30g，琼脂15g，搅拌均匀，在压力0.2MPa，121℃条件下，灭菌20min，倒板时控制平板培养皿内PDA培养基厚度为2～3mm。
b、采用孔径5mm的打孔器在布满菌丝体的平板培养皿打孔，避开中央原始接种块并取其半径5mm外的样品，每100mL液体培养基取3颗打孔的圆形固体培养基，接种于液体培养基中，将接种后装有液体培养基的三棱挡板摇瓶置于摇床中培养，180rpm，25℃下培养3天，得到摇瓶羊肚菌液体菌种。
所述液体培养基的制备方法如下：麸皮4％，将麸皮加水煮沸30min后用纱布过滤，弃滤渣保留滤液。将1％玉米淀粉，0.1％酵母粉，1％葡萄糖，0.2％蛋白胨，0.15％MgSO4，0.15％KH2PO4，进行超微粉碎。每100kg原料首先烘箱50℃烘干3～8小时至水分含量低于5％，然后送入粗粉碎机处理4h，再经过一级剪切粉碎机重复粉碎20次、二级剪切粉碎机重复粉碎10次，剪切粉碎机共计耗时4h，最后经过高速分散粉碎机处理1h。将超微粉碎后的原料溶入上述滤液中，搅拌均匀后在压力0.15MPa，121℃条件下，灭菌30min。
c、在扩大培养的发酵罐中注入上述同样液体培养基，在压力0.15MPa，121℃条件下，灭菌40min。冷却后，按照发酵罐10％的接种量接种摇瓶羊肚菌液体菌种，通入无菌空气，在25℃下培养3～4天，即得羊肚菌液体菌种。
羊肚菌液体菌种发酵罐培养的条件为：转速180rpm，溶氧量50～90％，pH5.0。
对比例5采用三棱挡板摇瓶，采用超微粉碎，将液体培养基的原料粉碎后，制种时间较对比例4短，菌丝体直径较对比例4小。
对实施例和对比例中得到的羊肚菌液体菌种进行性能测定，测定指标包括：菌丝球直径(随机取10个菌丝球直线排列，用游标卡尺测量总长度，重复3次，取平均值)、菌丝球密度(取1mL发酵液，用9mL水稀释，混匀后吸取1mL稀释液于平板培养皿中计数)、菌丝球干重(用两层纱布过滤发酵液，弃滤液，收集菌丝体，去离子水清洗后50℃烘干至恒重后称重)，菌丝体满袋天数(将不同方法制得的羊肚菌液体发酵菌种分别接种于套环栽培袋(高18cm)，液体菌种每袋20mL，在18℃恒温恒湿环境培养，观测羊肚菌菌丝体长满栽培袋所需天数)得到了如下表1所示的结果。
表1 不同方法制备得到的羊肚菌液体菌种质量表
由实施例和对比例的结果可知：逐步经过定量接种、接种块最小化、培养基成分优化、摇瓶参数改进、超微粉碎原料，本发明所得羊肚菌液体菌种制种时间短，菌丝体生物量大，菌丝体结球程度低，生长活力旺盛，是切实可行且适合大规模工厂化栽培羊肚菌的最佳方法。

Claims (10)

1.羊肚菌液体菌种的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、将羊肚菌母种接种于PDA固体培养基中，于22～25℃下恒温培养5～10天；
b、取步骤a所得固体培养基，接种于装有液体培养基的四棱大挡板摇瓶中，在摇床上培养2～4天，得到摇瓶羊肚菌液体菌种；
c、在液体菌种发酵罐中加入液体培养基，灭菌后，接种步骤b得到的摇瓶羊肚菌液体菌种，无菌条件下，24～28℃下培养1～3天，即得到羊肚菌液体菌种；
所述液体培养基组成为：按重量百分比计，麸皮4％～7％，玉米淀粉1％～3％，酵母粉0.1％～0.4％，葡萄糖1％～3％，蛋白胨0.2％～0.4％，MgSO4 0.05％～0.15％，KH2PO40.1％～0.15％，余量为水。
2.根据权利要求1所述的羊肚菌液体菌种的制备方法，其特征在于：所述液体培养基的制备方法包括以下步骤：将4％～7％的麸皮加配方量的水煮沸20～30min，过滤，在滤液中加入经超微粉碎的玉米淀粉1％～3％，酵母粉0.1％～0.4％，葡萄糖1％～3％，蛋白胨0.2％～0.4％，MgSO4 0.05％～0.15％，KH2PO4 0.1％～0.15％，搅拌均匀后在压力0.1～0.2MPa，121℃，灭菌20～40min。
3.根据权利要求2所述的羊肚菌液体菌种的制备方法，其特征在于：所述超微粉碎后的各原料全部粒径在50～70μm范围内。
4.根据权利要求1或3所述的羊肚菌液体菌种的制备方法，其特征在于：步骤a所述的接种量为：每90×15mmPDA培养基中接种3～7mm×3～7mm母种。
5.根据权利要求1或3所述的羊肚菌液体菌种的制备方法，其特征在于：步骤a所述的PDA固体培养基的组成包括：按重量份数计，土豆150～250份，葡萄糖20～30份，琼脂15～20份，水1000份。
6.根据权利要求1或3所述的羊肚菌液体菌种的制备方法，其特征在于：步骤b所述接种量为：每100ml液体培养基中接种3～5个直径3～7mm的固体培养基，所述接种时将固体培养基分切为小于1mm×1mm的小块。
7.根据权利要求1或3所述的羊肚菌液体菌种的制备方法，其特征在于：步骤b所述四棱大挡板摇瓶底部四棱凸起呈四叶草状平均分布，每条棱长3.4～3.8cm，棱高1.6～2.0cm。
8.根据权利要求1或3所述的羊肚菌液体菌种的制备方法，其特征在于：步骤b所述摇床震荡速度为150～200rpm，温度为24～28℃。
9.根据权利要求1或3所述的羊肚菌液体菌种的制备方法，其特征在于：步骤c所述接种量为培养基体积的5～10％。
10.根据权利要求1或3所述的羊肚菌液体菌种的制备方法，其特征在于：步骤c所述羊肚菌液体菌种发酵罐培养的条件为：转速150～350rpm，溶氧量50～90％。
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