WO2016139259A1 - Utilisation d'un complément nutritionnel dans la fabrication d'acide lactique - Google Patents

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WO2016139259A1
WO2016139259A1 PCT/EP2016/054447 EP2016054447W WO2016139259A1 WO 2016139259 A1 WO2016139259 A1 WO 2016139259A1 EP 2016054447 W EP2016054447 W EP 2016054447W WO 2016139259 A1 WO2016139259 A1 WO 2016139259A1
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fermentation
lactic acid
nutritional supplement
bacteria
raw material
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PCT/EP2016/054447
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Inventor
Sébastien GIVRY
Aurore THORIGNE
Guillaume BARBEDETTE
Original Assignee
Etablissements J. Soufflet
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P39/00—Processes involving microorganisms of different genera in the same process, simultaneously

Definitions

  • the present invention relates to the manufacture of lactic acid. It is known to produce lactic acid from starchy raw material by an enzymatic process comprising a step of liquefying the starch with an alpha-amylase aimed at solubilizing and hydrolyzing the starch into dextrins. This step is conventionally followed by a glucoamylase saccharification step, aimed at hydrolyzing dextrins to glucose. The glucose is then fermented during a fermentation step during which it is converted into lactic acid by a lactic acid bacterium.
  • thermophilic microorganisms such as Bacillus sp, less demanding, but for which the addition of nitrogen supplements is still necessary.
  • the application WO 201 1/098843 proposes for its part the use of lactic acid bacteria expressing degrading enzymes. starch, thus avoiding the use of commercial enzymes during the stages of saccharification and fermentation, but always involving the addition of nitrogen supplements.
  • this objective could be achieved by the use of a nutritional supplement for medium of saccharification-simultaneous fermentation in a process for the production of lactic acid by fermentation from a starchy raw material.
  • this nutritional supplement being derived from a fermentation with a mold or a bacterium, this in total or partial substitution of expensive exogenous nitrogen sources commonly used such as yeast extracts and peptones.
  • this nutritional supplement when added, during the process of producing lactic acid, in the medium of saccharification, fermentation or simultaneous saccharification-fermentation, resulted in the release, from the starchy raw material used, a quantity and a large variety of amino acids that are directly assimilated by lactic acid bacteria, thus allowing an increase in the production of lactic acid.
  • the nutritional supplement according to the invention allows the gradual release of amino acids during simultaneous fermentation or saccharification-fermentation, it avoids the appearance of an excess of nitrogen, the amino acids liberated gradually being consumed in parallel with lactic acid bacteria, which reduces the risk of microbiological contamination.
  • the inventors have found that by using this nutritional supplement, it was possible, while increasing the amount of amino acids released during saccharification, simultaneous fermentation or saccharification-fermentation, to limit the amount of free amino nitrogen (or FAN) at the end of fermentation, thus facilitating the steps generally implemented downstream of the lactic acid production process, namely the extraction and purification of lactic acid.
  • the subject of the present invention is therefore the use of a nutritional supplement, in raw or extracted form, resulting from a fermentation with a mold or a bacterium, for the manufacture, by fermentation, preferably in liquid medium, of lactic acid by a lactic acid bacterium.
  • the present invention furthermore relates to the use of a nutritional supplement, in raw or extracted form, resulting from fermentation in a solid medium with a mold or a bacterium, in order to release, in a lactic acid fermentation medium, a renewable carbohydrate raw material, the nitrogen of said raw material, during manufacture, by fermentation, preferably in liquid medium, of lactic acid by a lactic acid bacterium from said raw material.
  • the present invention also relates to a process for manufacturing lactic acid from a renewable carbohydrate raw material, comprising a fermentation step, preferably in a liquid medium, with a lactic acid bacterium in the presence of a nutritional supplement, in raw form or extracted, resulting from a fermentation in solid medium with a mold or a bacterium.
  • the subject of the present invention is also a composition
  • a composition comprising (i) a source of organic nitrogen selected from the group consisting of renewable carbohydrate raw materials, exogenous nutrient solutions, and mixtures thereof and (ii) a nutritional supplement, in raw form or extracted, resulting from a fermentation in a solid medium with a mold or a bacterium.
  • the present invention also relates to a kit comprising:
  • a source of organic nitrogen selected from the group consisting of renewable carbohydrate raw materials, exogenous nutrient solutions, and mixtures thereof, and
  • the nutritional supplement used in the context of the invention is a nutritional supplement, in raw or extracted form, resulting from a fermentation in a solid medium with a mold or a bacterium.
  • solid state fermentation is meant here the cultivation of microorganisms on wet solid supports, on inert carriers or on insoluble substrates that can be used as a source of carbon and energy.
  • the fermentation process occurs in the absence or near-absence of free water in the space between the substrate particles.
  • the nutritional supplement according to the invention is obtained by fermentation in a solid medium.
  • the nutritional supplement according to the invention comprises an active principle.
  • active principle is meant here a component or group of components responsible for the action of the nutritional supplement.
  • This active ingredient is produced by the fermentation in solid medium used to obtain the nutritional supplement according to the invention and is responsible, at least in part, for the activities observed when the nutritional supplement is added in a process for producing lactic acid by fermentation with a lactic acid bacterium.
  • the effect observed with the nutritional supplement according to the invention on the production of lactic acid is not obtained with an identical substrate which would not have undergone the fermentation in solid medium defined below.
  • the substrate used for the production of the nutritional supplement is preferably an agricultural co-product.
  • agricultural co-product is meant here a product created during the same processing process and at the same time as a main agricultural product.
  • the substrate used for the production of the nutritional supplement may in particular be a cereal co-product, an oleaginous co-product, an oilseed crop co-product, a sacchariferous culture co-product or a mixture thereof.
  • the substrate used for the production of the nutritional supplement is selected from the group consisting of wheat bran, rapeseed meal, barley rootlet, wheat ethanol soluble sorbet, and mixtures thereof. More preferably, the substrate used for the production of the nutritional supplement is wheat bran or rapeseed cake. Most preferably, the substrate used for the production of the nutritional supplement is rapeseed cake.
  • the substrate used for the production of the nutritional supplement can be ground beforehand.
  • the substrate used for the production of the nutritional supplement is preferably moistened and heat-treated for pasteurization or sterilization.
  • the heat treatment may consist of heating, for example in an autoclave, typically at 121 ° C., for example for 20 minutes or at 105 ° C., for example for 35 minutes, or pasteurization, typically at 105 ° C., for example for 15 minutes. . It is also possible to heat-treat the substrate used for the production of the nutritional supplement by injecting water vapor, which makes it possible to simultaneously operate the humidification of the substrate.
  • the pH is adjusted during wetting in a range from 4 to 5.5, preferably to 4.9, for example with nitric acid or sulfuric acid, in order to improve the effect. heat treatment and the start of fermentation in a solid medium.
  • Humidification is preferably determined so that the water content of the substrate used for the production of the nutritional supplement is between 40 and 60% of the total mass of the substrate and water.
  • the microorganism used during the fermentation in solid medium may be a mold.
  • the mold used during fermentation in a solid medium is preferably a mold of the genus Aspergillus, more preferably of the species Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubingensis or Aspergillus flavus.
  • the mold used during fermentation in solid medium is of the species Aspergillus oryzae or Aspergillus flavus species.
  • the mold used in the solid-state fermentation is Aspergillus oryzae, particularly the Aspergillus oryzae strain ATCC 12892 (available from the ATCC Collection).
  • the microorganism used during fermentation in solid medium may be a bacterium.
  • the bacterium used during fermentation in solid medium is preferably a bacterium of the genus Bacillus, more preferably of the species Bacillus subtilis or Bacillus licheniformis.
  • the bacterium used during fermentation in solid medium is of the species Bacillus subtilis.
  • the mold or bacteria used during fermentation in a solid medium is preferably selected from the group consisting of molds of the genus Aspergillus and bacteria of the genus Bacillus. More preferably, the mold or The bacterium used in solid-state fermentation is selected from the group consisting of Aspergillus flavus strains, Aspergillus oryzae strains, Aspergillus niger strains, Aspergillus tubingensis strains, and Aspergillus strains. Bacillus sp.
  • the mold or bacteria used during solid-state fermentation is a mold of the species Aspergillus flavus or of the species Aspergillus oryzae or a bacterium of the species Bacillus subtilis.
  • the inventors have also demonstrated that the use of certain molds or bacteria makes it possible to manufacture a nutritional supplement allowing to more strongly limit the presence of free amino nitrogen (FAN) at the end of the lactic acid production process by fermentation.
  • FAN free amino nitrogen
  • the mold or bacteria used during fermentation in a solid medium is a mold of the species Aspergillus oryzae or a bacterium of the species Bacillus subtilis.
  • the mold or bacteria used during fermentation in solid medium is preferably a mold of the species Aspergillus oryzae.
  • the lactic acid bacterium used for the production of lactic acid is the strain L. coryniformis DSM 20005
  • the mold or bacteria used during fermentation in solid medium is preferably a bacterium of the species Bacillus subtilis.
  • the inoculation of the substrate used for the production of the nutritional supplement can be carried out with any appropriate inoculum.
  • the molds used during fermentation in solid medium can thus be previously subjected to a sporulation stage before being inoculated in the form of spores.
  • the inoculum dose will then advantageously be at least 10 6 spores / g of initial dry matter.
  • the molds used during fermentation in solid medium can be inoculated as mycelium.
  • the dose of inoculum will then advantageously be between 100 and 300 g of liquid culture medium comprising the mycelium per kg of initial dry matter.
  • the bacteria used during fermentation in a solid medium are subjected to a pre-culture step in order to be in the exponential phase during inoculation.
  • the dose of inoculum will then advantageously be between 100 and 300 g of liquid culture medium comprising the bacteria in the exponential phase per kg of initial dry matter. Fermentation in a solid medium
  • Fermentation in solid medium can be carried out in any suitable reactor.
  • Fermentation in a solid medium is preferably carried out for controlled arrest before sporulation of the mold strain used and / or at reaching the stationary phase of the bacterial strain used. Fermentation in solid medium is thus preferably carried out for a period of 1 to 3 days, preferably between 30 and 60 hours, particularly preferably for 48 hours.
  • the temperature of the medium is preferably maintained between 28 ° C and 38 ° C, which corresponds to the optimum range of activity of the strains of mold and bacteria used to produce the nutritional supplement.
  • Moisture is preferably maintained between 40 and 60% during fermentation.
  • Aeration preferably continuously, is preferably carried out during fermentation in a solid medium in order to provide the oxygen necessary for the fermentation and to avoid the excessive accumulation of carbon dioxide produced by the fermentation.
  • Stirring may be conducted to avoid the formation of impermeable masses.
  • the agitation can be implemented by means of stirring arms, blades or spatulas or worm.
  • the agitation however, preferably remains moderate.
  • the nutritional supplement obtained following fermentation in solid medium above can be in raw form or extracted.
  • raw form is meant here that the nutritional supplement comprises the active ingredient and the substrate used during the fermentation in solid medium with the mold or bacteria, possibly milled.
  • This raw form typically contains particles having a diameter of between 50 ⁇ and 5 mm depending on the type of ground material generated.
  • the nutritional supplement obtained after fermentation in solid medium can also be dried or frozen for preservation.
  • the drying is preferably carried out at a moderate temperature so as not to affect the enzymatic activities, for example in an oven preferably at 40 ° C.
  • Freezing is preferably carried out on the moist fermented product, for example at -20 ° C.
  • the nutritional supplement obtained after the fermentation in solid medium can also undergo a new grinding before being conditioned.
  • extracted form is meant here that the active principle of the nutritional supplement is isolated from the substrate used during fermentation in solid medium with the mold or bacteria by extraction processes that can implement any technique well known to those skilled in the art, in particular by extraction in aqueous solution, extraction in alcoholic solution, extraction by solvents, high pressure homogenization, supercritical extraction, extraction by fluidized beds, grinding, cryogenic grinding, decompression, cavitation, bubbling, ultrasonic extraction, adsorption on resins or zeolites.
  • the nutritional supplement can be extracted in 0.1M sodium acetate buffer.
  • the active ingredient in liquid form can then be purified by any technique well known to those skilled in the art, in particular by centrifugation, filtration, ultrafiltration, chromatography, use of membranes or precipitation.
  • the present invention relates to the use of a nutritional supplement as defined in the section "Nutritional supplement” above, for the manufacture, by fermentation, of lactic acid by a lactic acid bacteria, in particular in the presence of this nutritional supplement. .
  • the subject of the present invention is also a process for manufacturing lactic acid from a renewable carbohydrate raw material, comprising a step of fermenting the renewable carbohydrate raw material with a lactic acid bacterium in the presence of a nutritional supplement as defined in the section "Nutritional supplement" above.
  • lactic acid or "2-hydroxypropanoic acid” is meant here the alpha hydroxylated acid of formula C 3 H 6 0 3 or its lactate ion.
  • lactic acid covers the enantiomer (R) -acetic acid or D (-) - lactic acid and the enantiomer (S) -lactic acid or L (+) - Lactic acid.
  • the lactic acid produced in the context of the invention may be D-lactic acid, L-lactic acid or a mixture thereof.
  • the lactic acid produced in the context of the invention is D-lactic acid.
  • lactic acid can be obtained by fermenting a substrate with lactic acid bacteria.
  • lactic acid bacterium is meant here a gram-positive bacterium, anaerobic partially oxygen-tolerant, generally not producing spores, in the form of shells or rods and capable of fermenting sugars lactic acid.
  • lactic acid bacteria belong to the order Lactobacillales, of the Bacilli class of the phylum Firmicutes, and to the family Bifidobacteriaceae of the order Bifidobacteriales.
  • the lactic acid bacterium used in the context of the invention is preferably a lactic bacterium of the order Lactobacillales.
  • the order Lactobacillales includes the following families: Aerococcaceae, Carnobacteriaceae, Enterococcaceae, Lactobacillaceae, Leuconostocaceae and Streptococcaceae.
  • the lactic acid bacterium used in the context of the invention is of the Lactobacillaceae family.
  • the family Lactobacillaceae includes bacteria of the genus
  • Lactobacillus Lactobacillus, Paralactobacillus, Pediococcus and Sharpea.
  • the lactic acid bacteria used in the context of the invention is of the genus
  • Lactobacillus the lactic acid bacteria used in the context of the invention may be chosen from the group consisting of L. acetotolerans, L. acidifarinae, L. acidipiscis, L. acidophilus, L. agilis, L. algidus, L. alimentarius species. , L. amylolyticus, L. amylophilus, L. amylotrophicus, L. amylovorus, L. animalis, L. antri, L. apodemi, L. aquaticus, L. aviarius, L. bifermentans, L. brantae, L. brevis, L. Buchneri, L. cacaonum, L. camelliae, L.
  • the lactic acid bacterium used in the context of the invention is selected from the group consisting of L. mindensis, L. zeae and L. coryniformis species. More preferably, the lactic acid bacterium used in the context of the invention is selected from the group consisting of L. mindensis strain LMG 21932 (available from the BCCM / LMG Collection), L. zeae strain LMG 17315 (available from the BCCM / LMG Collection), the strain L coryniformis ssp. torquens DSM 20004 (available from the DSMZ Collection), and the strain L. coryniformis ssp. torquens DSM 20005 (available from the DSMZ Collection).
  • L. mindensis strain LMG 21932 available from the BCCM / LMG Collection
  • L. zeae strain LMG 17315 available from the BCCM / LMG Collection
  • the strain L coryniformis ssp. torquens DSM 20004 available
  • Lactic acid bacteria capable of producing D-lactic acid, L-lactic acid or a mixture of D-lactic and L-lactic acid are well known to those skilled in the art and are for example described in Connolly. and Lonnerdal (2004) Nutrafoods 3: 37-49.
  • lactic acid bacteria capable of producing D-lactic acid lactic acid bacteria L. coryniformis, L. delbrueckki and L. jensenii may be mentioned.
  • the lactic acid bacteria capable of producing L-lactic acid mention may be made of the lactic acid bacteria L. zeae, L. amylophilus, L. casei and L. rhamnosus.
  • the bacteria capable of producing D-lactic acid and L-lactic acid in equivalent proportion mention may be made of the lactic acid bacteria L. mindensis, L. acidophilus, L. brevis, L. fermentum and L. plantarum.
  • the lactic acid bacterium used in the context of the invention is a lactic bacterium L coryniformis, in particular a strain of Lactobacillus coryniformis ssp. torquens, preferably the strain L. coryniformis ssp. torquens DSM 20004 or the strain L. coryniformis ssp. Torquens DSM 20005, in particular the strain L. coryniformis ssp. torquens DSM 20005.
  • a single strain of lactic acid bacterium is used both within the scope of the invention.
  • the method of manufacturing lactic acid according to the invention therefore uses only a strain of lactic bacteria, ie does not use lactic acid bacteria cocktail.
  • the lactic acid bacteria are introduced during the simultaneous fermentation or saccharification-fermentation stage.
  • the lactic acid bacteria are inoculated in the simultaneous fermentation or saccharification-fermentation medium at a dose of between 10 7 and 10 9 CFU / ml of medium, preferably at a dose of 10 8 CFU / ml of medium.
  • the lactic acid bacteria are introduced into the simultaneous fermentation or saccharification-fermentation medium after having undergone a propagation step.
  • This propagation step allows a development of lactic acid bacteria sufficient to inoculate the fermentation medium or simultaneous saccharification-fermentation at the dose mentioned above.
  • the propagation step is typically carried out by culturing lactic acid bacteria in a conventional lactic acid bacteria culture medium, such as MRS medium (Man's medium, Rogosa, Sharpe), preferably with stirring, for example at 100 rpm. at a temperature adapted to the growth of lactic acid bacteria, for example at 37 ° C., at a pH preferably adjusted for example by 6.
  • MRS medium Man's medium, Rogosa, Sharpe
  • renewable carbohydrate raw material is meant here the waste of the inexpensive, unrefined, generally non-toxic food industries and rich in sources of carbon and nitrogen more or less assimilable.
  • the renewable carbohydrate raw material used in the context of the invention may in particular be chosen from the co-products of the cereal sector, such as the wheat, maize, barley or rye sector, the co-products of the sugar industry, such as the beet sector. or sugarcane, coproducts of the high carbohydrate tuberous plant sector, such as the cassava or potato industry, and co-products from the dairy sector.
  • These renewable carbohydrate raw materials contain both starch or glucose as a source of carbon, and high molecular weight proteins, in addition to peptides and free amino acids, as a source of more or less assimilable nitrogen.
  • the renewable carbohydrate raw materials from the cereal sector include in particular liquefied and saccharified flours of wheat, maize, barley and / or rye, more particularly liquefied and saccharified flours of abraded wheat.
  • Renewable carbohydrate raw materials from the sugar industry include in particular concentrated sugar carbohydrate byproducts, especially sugar beet or sugarcane molasses.
  • the renewable carbohydrate raw materials derived from the high carbohydrate tuberous plant sector include in particular liquefied flours of tubers, more particularly liquefied flours of cassava or potato.
  • Renewable carbohydrate raw materials from the dairy sector include lactose-rich dairy co-products, particularly whey.
  • the inventors have demonstrated when the nutritional supplement as defined above was used in processes for producing lactic acid from renewable carbohydrate raw material derived from the wheat or maize cereal sector, or from the sugar cane sugar sector, it made it possible to reduce the addition of expensive exogenous nutrient solutions, as defined in the "Exogenous nutrient solutions" section below, by at least 20-25% for the same yield of lactic acid.
  • the renewable carbohydrate raw material used in the context of the invention is therefore chosen from the group consisting of renewable carbohydrate raw materials derived from the wheat cereal sector, in particular saccharified liquefied flours (musts) of abraded wheat, renewable carbohydrate raw materials from the maize cereal sector, in particular saccharified liquefied flours (musts) of maize and renewable carbohydrate raw materials from the sugar cane sugar sector, in particular sugar cane molasses.
  • the inventors have more particularly demonstrated that the same yield of lactic acid could be obtained from a renewable raw material of wheat from the cereal wheat sector, when a costly solution rich in nitrogenous elements of the MRS type was completely replaced by the nutritional supplement as defined above.
  • the renewable carbohydrate raw material used in the context of the invention is therefore a renewable carbohydrate raw material derived from the wheat cereal sector, in particular abraded wheat must.
  • the renewable carbohydrate raw material used in the context of the invention may be preconditioned so as to prepare a grind.
  • a grinding stage for example using a hammer mill, makes it possible to obtain a milling, in other words a flour.
  • Exogenous nutrient solutions can be added to the fermentation medium to meet the needs of lactic acid bacteria, including their need for assimilable nitrogen elements.
  • Nutrient solutions that can be used in the context of The present invention comprises or consists of elements commonly found in MRS (Man, Rogosa, Sharpe) broth, such as yeast extracts, casein peptones, meat extracts, dibasic potassium phosphate, sodium, ammonium citrate, magnesium sulfate, manganese sulfate and Tween and mixtures thereof. These can vary in concentration, to ensure varied contributions to the fermentation medium.
  • MRS Man, Rogosa, Sharpe
  • Exogenous nutrient solutions of the MRS type can thus be conventionally added as a source of organic nitrogen at a dose corresponding to 5 g of yeast extract, 10 g of casein peptones, 10 g of meat extract, 2 g of potassium dibasic phosphate, 5 g of sodium acetate, 2 g of ammonium citrate, 0.2 g of magnesium sulphate, 0.05 g of manganese sulphate and 1 g of Tween, per liter of fermentation broth.
  • exogenous nutrient solutions that may be used in the context of the invention may in particular be chosen from the group consisting of solutions A, B, C, D, E, F and G, the compositions of which are described in Table 1.
  • Table 1 Composition of the exogenous nutrient solutions A, B, C, D, E, F and G.
  • concentrations in elements are those found in the fermentation medium.
  • solution G in the fermentation medium will ensure a nutrient supply similar to MRS broth (excluding carbon source).
  • the fermentation step implemented in the lactic acid production process according to the invention is preferably a step of saccharification-simultaneous fermentation.
  • the step of saccharification-simultaneous fermentation consists in bringing the renewable raw material, which may be liquefied and pre-saccharified, into contact with a lactic acid bacterium in order to produce the metabolism of interest, namely lactic acid.
  • a lactic acid bacterium in order to produce the metabolism of interest, namely lactic acid.
  • the characteristics of the step of simultaneous saccharification-fermentation of the process according to the invention are as follows:
  • the nutritional supplement according to the invention added during the lactic acid production process makes it possible to improve the production of lactic acid without the optimal conditions of the lactic acid used being used, thus generating gains in lactic acid. energy and cost savings.
  • the simultaneous fermentation or saccharification-fermentation step is preferably carried out for 48 to 72 hours, particularly preferably for 48 hours.
  • the nutritional supplement used in the context of the invention advantageously makes it possible to assimilate the nitrogen present in the renewable carbohydrate raw material, which could, in the absence of this nutritional supplement, be very little and hardly assimilated by the lactic acid bacteria. Therefore, in the context of the invention, the first renewable carbohydrate matrix is a source of organic nitrogen for lactic acid bacteria.
  • This source of organic nitrogen can be supplemented by other sources of "exogenous” organic nitrogen (different from the renewable carbohydrate raw material as defined in the section “Carbohydrate raw material” above) conventionally used in fermentation or saccharification simultaneous fermentation.
  • exogenous organic nitrogen sources are well known to those skilled in the art and typically include exogenous nutrient solutions as described in the "Exogenous Nutrient Solutions” section above.
  • the step of fermentation or saccharification-simultaneous fermentation is carried out in the presence of a source organic nitrogen derived from a renewable carbohydrate raw material as defined in the section "Renewable carbohydrate raw material” above and, optionally, exogenous nutrient solutions, as described in the section “Exogenous nutrient solutions” above.
  • additives conventionally used in lactic acid production processes may further be introduced into the simultaneous saccharification, fermentation or saccharification-fermentation medium in order to improve the lactic acid production yield.
  • the nutritional supplement as defined in the "Nutritionnet supplement” section above is preferably introduced during the step of saccharification, fermentation or saccharification-simultaneous fermentation.
  • the nutritional supplement as defined in the "nutritionnet supplement” section above is preferably introduced during the pre-saccharification, saccharification, fermentation or saccharification-simultaneous fermentation step at a dose of 1, 3 to 5 kg / t of renewable carbohydrate raw material, more preferably at a dose of 5 kg / t of renewable carbohydrate raw material.
  • the step of saccharification, fermentation or saccharification-simultaneous fermentation is carried out in the presence of the nutritional supplement as defined in the section "nutritionnet supplement” above, preferably at a minimum a dose of 1.3 to 5 kg / t of renewable carbohydrate raw material, more preferably at a dose of 5 kg / t of renewable carbohydrate raw material, and an "exogenous" organic nitrogen source, preferably a nutrient solution exogenously as defined in the section "Exogenous nutrient solutions” above, at a dose corresponding to 1 to 1 fermentation broth additions, 25 g of yeast extract, 2 to 2.5 g of peptones of casein, 2 to 2.5 g of meat extract, 0.4 to 0.5 g of dibasic potassium phosphate, 1 to 1, 25 g of sodium acetate, 0.4 to 0.5 g of citrate d ammonium, 0.04 to 0.05 g of magnesium sulphate, 0.05 g of manga sulphate and 0.2
  • the inventors have also demonstrated that the same yield of lactic acid can be obtained from a renewable carbohydrate raw material derived from the wheat sector, when expensive exogenous nutrient solutions, rich in nitrogenous elements were completely replaced by the nutritional supplement as defined above.
  • the step of saccharification, fermentation or simultaneous saccharification-fermentation is carried out in the presence of the nutritional supplement as defined in the section "Nutritional supplement” above, preferably at least one a dose of 1, 3 to 5 kg / t of renewable carbohydrate raw material, more preferably at a dose of 5 kg / t of renewable carbohydrate raw material, and in the absence of an "exogenous" organic nitrogen source , especially in the absence of exogenous nutrient solutions as defined in the section "Exogenous nutrient solutions” above, containing assimilable nitrogen source elements.
  • the nutritional supplement as defined in the section "Nutritional supplement” above, preferably at least one a dose of 1, 3 to 5 kg / t of renewable carbohydrate raw material, more preferably at a dose of 5 kg / t of renewable carbohydrate raw material, and in the absence of an "exogenous" organic nitrogen source , especially in the absence of exogenous nutrient solutions as defined in the section "Exogenous nutrient solutions” above
  • the lactic acid production process according to the invention may comprise a liquefaction step of the renewable carbohydrate raw material before the step of saccharification, fermentation or simultaneous saccharification-fermentation.
  • a liquefaction stage may in particular be implemented when the renewable carbohydrate raw material is a millet of starch.
  • the liquefaction stage of the starch mills makes it possible to hydrolyze the starch into dextrins.
  • the liquefaction stage consists in mixing the milling with water, acid and liquefying enzymes, so as to form a liquefied paste mash.
  • the grind is incorporated in the water so as to obtain a mixture, preferably homogeneous, having a solids content of between 20 and 30%.
  • the thus-formed mash is stirred between 250 and 350 rpm.
  • the pH may be adjusted with a solution of acid, for example sulfuric acid.
  • the pH can conventionally be adjusted between 5 and 6.5.
  • a calcium salt may also be added.
  • the liquefaction is preferably carried out by applying the temperature kinetics shown in FIG.
  • This kinetics typically includes a temperature rise phase of preferably 15 min allowing to reach a temperature of 55 ° C, a plateau of a duration for example of 30 min at 55 ° C, a second phase of temperature rise of preferably 15 minutes to reach a temperature of 85 ° C, a second step of a duration of for example 2 hours at 85 ° C, and a cooling phase liquefied pulp liquefied at room temperature.
  • the 55 ° C. plateau typically corresponds to the pre-liquefaction phase and the 85 ° C plateau typically corresponds to the liquefaction phase.
  • the liquefaction enzymes used preferably include an alpha-amylase, such as the Lyvanol Liquid Plus ® alpha-amylase marketed by Lyven, and possibly a hemicellulolytic gutting complex, such as Lyvanol Devisco Plus ® sold by Lyven.
  • the alpha-amylase is typically added between 0.17 and 0.36 kg / t dry matter and the gutting hemicellulolytic complex is typically added between 0.17 and 0.36 kg / t dry matter.
  • Liquefaction enzymes are preferably added after the first temperature rise phase at 55 ° C.
  • the liquefied pasteurized mull has a dry matter content of about 20-25%, preferably a pH of between 5.5 and 6, and preferably viscosity of the order of 50 mPa.s -1 , the viscosity being typically measured using a rotational rheometer, for example Kinexus Pro ® model marketed by Malvern, at a temperature of 35 ° C, the viscosity being preferably measured at 180 rpm for 5 min, after a first homogenization phase of the product with a stirring speed at 960 rpm for 15 s, the value taken into account being typically the average of the last 30 seconds of measurement.
  • a rotational rheometer for example Kinexus Pro ® model marketed by Malvern
  • the lactic acid production process according to the invention may furthermore comprise a step of pre-saccharification of the liquefied musts.
  • This step makes it possible to hydrolyze the dextrins into fermentable sugars.
  • the liquefied beetle is placed in the presence of a glucoamylase, such as the Lyvanol GA 480 ® glucoamylase marketed by Lyven.
  • Glucoamylase is typically added between 0.89 and 1.45 kg / t dry matter.
  • Other enzymes may also be used during this pre-saccharification step according to the renewable carbohydrate raw material used.
  • invertase can be used to hydrolyze sucrose to fructose and glucose.
  • sugarcane and beet molasses can be placed in the presence of an invertase, such as the Inverlyve P ® sold by Lyven.
  • Invertase is typically added at 50 g / t feedstock.
  • the liquefied meal is stirred at 250 to 350 rpm.
  • the pH can also be adjusted with a solution of acid, for example sulfuric acid.
  • the pH can conventionally be adjusted between 4 and 5, preferably between 4.4 and 4.6.
  • the pre-saccharification is preferably carried out by heating at a temperature of between 50 and 60 ° C, preferably at 55 ° C, for less than 24 hours, preferably for 1 hour.
  • the nutritional supplement as defined in the section "Nutritional supplement” above is preferably added at the beginning of this step.
  • the additives and sources of exogenous organic nitrogen defined in the section “Solutions Exogenous nutrients "above may be added during the pre-saccharification step, but the nutritional supplement may also be introduced during the saccharification, fermentation or saccharification-fermentation step.
  • simultaneous ferment or saccharification-fermentation the lactic acid produced can be separated from the fermenting medium or saccharification-simultaneous fermentation by any known conventional technique of separating lactic acid from aqueous solutions. lactic acid can be removed with separation to increase the efficiency of the separation The separation can be carried out for example by centrifugation, filtration, flocculation, flotation or membrane filtration.
  • the lactic acid produced by the process according to the invention may also be subjected to one or more purification steps such as extraction, distillation, crystallization, filtration, etc. .
  • the inventors have demonstrated that the use of the nutritional supplement as defined above during the lactic acid production process made it possible to reduce the presence of free amino nitrogen (FAN) at the end of fermentation or simultaneous saccharification-fermentation.
  • FAN free amino nitrogen
  • the inventors have furthermore demonstrated that the increase in the production of lactic acid observed during the use of the nutritional supplement as defined above was linked to the improvement of the nitrogen source available in the fermentation broth. for lactic acid bacteria.
  • the performance of the nutritional supplement according to the invention can thus be related to its ability to release soluble nitrogen, in particular in a progressive manner, into the fermentation medium or simultaneous saccharification-fermentation.
  • the present invention therefore also relates to the use of the nutritional supplement as defined in the section "Nutritional supplement” above, for releasing, in a lactic acid fermentation medium, a renewable carbohydrate raw material, as defined above. above, the nitrogen of said raw material, preferably progressively, during manufacture, by fermentation, preferably in liquid medium, lactic acid from said raw material.
  • the inventors have demonstrated that by adding to the fermentation broth a combination consisting of the nutritional supplement according to the invention and a reduced amount of an exogenous organic nitrogen source, in particular an expensive source of exogenous organic nitrogen.
  • an exogenous organic nitrogen source in particular an expensive source of exogenous organic nitrogen.
  • the present invention therefore also relates to a composition
  • a composition comprising:
  • a source of organic nitrogen selected from the group consisting of renewable carbohydrate raw materials as defined in the section "Renewable carbohydrate raw material” above, exogenous nutrient solutions as defined in the section “Exogenous nutrient solutions” and mixtures thereof,
  • the present invention also relates to a kit comprising:
  • a source of organic nitrogen selected from the group consisting of renewable carbohydrate raw materials as defined in the section “Renewable carbohydrate raw material” above, exogenous nutrient solutions as defined in the section “Exogenous nutrient solutions” , and mixtures thereof,
  • the inventors have in particular demonstrated that by adding to the fermentation broth a combination consisting of the nutritional supplement according to the invention and the exogenous nutrient solution B as defined in the section "Exogenous nutrient solutions", it was possible to obtain the same lactic acid production performance as using the exogenous nutrient solution G alone (corresponding to a nitrogen source intake similar to that of a MRS-type broth).
  • the organic nitrogen source (i) of the composition according to the invention or of the kit according to the invention corresponds to a contribution in the fermentation mash of 0.25 to 2.5 g. of yeast extract, 0.5 to 5 g / l of peptones of casein, 0.5 to 5 g / 1 of meat extract, 0.1 to 1 g / l of dibasic potassium phosphate, 0.25 to 2.5 g / l of sodium acetate, 0.1 to 1 g g / l of ammonium citrate, 0.01 to 0.1 g / l of magnesium sulphate, 0.05 g / l of manganese sulphate, and 0.05 to 0.5 g / l of Tween 80.
  • the organic nitrogen source (i) of the composition according to the invention or of the kit according to the invention corresponds to a contribution in the fermentation broth of 0.25 g / l of extract. of yeast, 0.5 g / l of casein peptones, 0.5 g / l of meat extract, 0.1 g / l of dibasic potassium phosphate, 0.25 g / l of sodium acetate, , 1 g / l of ammonium citrate, 0.01 g / l of magnesium sulphate, 0.05 g / l of manganese sulphate, and 0.05 g / l of Tween 80.
  • FIG. 1 represents the temperature kinetics preferably applied to the liquefaction stage of the renewable carbohydrate raw material, in particular to pasteurized wheat flour.
  • A addition of liquefaction enzymes;
  • B first temperature level at 55 ° C corresponding to the pre-liquefaction;
  • C second temperature level at 85 ° C corresponding to the liquefaction of the mout.
  • Figure 2 shows the granulometric profile of an abraded wheat mill obtained after grinding with a hammer on a 0.8 mm grid.
  • FIG. 4 represents the impact of the addition of exogenous nutrient solutions or of the nutritional supplement according to the invention on the lactic yields obtained in a vial after 48 hours of fermentation of a mill consisting of a saccharified liquefied abraded wheat ( 13% MS), by one of the 4 lactic acid strains tested, namely the strain Lactobacillus coryniformis ssp. torquens DSM 20004 (A), Lactobacillus coryniformis ssp. torquens 20005 (B), Lactobacillus mindensis LMG 21932 (C), or Lactobacillus zeae LMG 17315 (D), inoculated at 10 7 CFU / ml in Example 3.
  • FIG. 5 represents the impact of the strain used for the production of the nutritional supplement (CN) according to the invention on the lactic yields obtained in a vial at the end of the 72 h of fermentation of a liquefied, saccharified wheat flour supplemented with the nutrient solution B, by L. coryniformis DSM 20004 inoculated at 1 ⁇ 10 7 CFU / ml in example 5.
  • Dotted band yield zone obtained with a millet supplemented with the solution G.
  • FIG. 6 represents the positioning of each nutritional supplement (CN) tested in Example 5 as a function of the final concentrations of FAN and lactic acid (after 72 hours of fermentation of a liquefied wheat flour, saccharified and supplemented with solution B, by L. coryniformis DSM 20004 inoculated at 1 x 10 7 CFU / ml). The plotted curve corresponds to the linear regression.
  • FIG. 7 represents the positioning of each nutritional supplement tested in Example 5 as a function of the FAN coefficients per kg of nutritional supplement and lactic yields obtained after 72 hours of fermentation of a liquefied, saccharified wheat flour and added to the solution.
  • B by L. coryniformis DSM 20004 inoculated at 1 x 10 7 CFU / ml. The plotted curve corresponds to the linear regression.
  • FIG. 8 represents the impact of the type of nutritional supplement used on the lactic yields obtained in the reactor after the 50 h of fermentation of a saccharified liquefied wheat flour supplemented with the nutrient solution B, by L. coryniformis DSM 20004 or DSM 20005 inoculated at 10 9 CFU / ml, in Example 6.
  • FIG. 9 represents the relative distribution of the free amino acids (AAL) released by the nutritional supplements according to the invention as a function of the genera and species of the strains used in example 6.
  • the AAL profile is determined after 72 hours of incubation at 30 ° C. of a liquefied and saccharified wheat mill with 13% DM, adjusted to pH 5.5, in the presence of sodium azide and a solubilized and filtered 0.2 ⁇ nutritional supplement, incorporated in the dose of 5 kg / t of renewable carbohydrate raw material.
  • Figure 10 represents the positioning of each nutritional supplement tested as a function of the final concentrations of FAN or ALA and lactic acid, after 50 hours of fermentation of a saccharified liquefied wheat broth supplemented with solution B, by the strain L. coryniformis DSM 20004 or DSM 20005 inoculated at 10 9 CFU / ml, in example 6.
  • FIG. 11 shows the comparison of commercial enzymes (types, doses) and of the nutritional supplement (CN) according to the invention on the lactic yields obtained in the reactor at the end of the 48 h of fermentation of a saccharified liquefied wheat mash supplemented with solution B, by L. coryniformis DSM 20005 inoculated at 10 9 CFU / ml, in example 6.
  • Figure 12 represents the relative distribution of free amino acids (AAL) released by Fermgen enzymes, concentrated Prolyve BS and the nutritional supplement according to the invention produced with strain 029 on rapeseed cake, in Example 6.
  • AAL profile is determined after 72 hours of incubation at 37 ° C of a lamb wheat and saccharified 13% DM, adjusted to pH 5.5, in the presence of sodium azide and a nutritional supplement solubilized and filtered at 0.2 ⁇ , incorporated in the dose of 5 kg / t of renewable carbohydrate raw material.
  • Figure 13 represents the impact of the type of nutritional supplement implemented in the presence of nutrient solution (A or B) on the lactic acid bacteria population (discontinuous traits) and the production of lactic acid (continuous traits) during the 50 h fermentation of liquefied wheat must and saccharified at 20% MS by L. coryniformis DSM 20005 inoculated at 10 9 CFU / ml, as described in Example 7.
  • Example 1 Manufacture of the nutritional supplement This example describes the production of the nutritional supplement used in the context of the invention.
  • the method of manufacturing the nutritional supplement by solid fermentation comprises the following different stages: the cereal co-products (wheat bran, rapeseed meal, etc.) used as raw material are conditioned and pretreated.
  • the molds or bacteria that will be used for fermentation are sporulated or cultured for inoculation. These molds or bacteria are then brought into contact with the pretreated cereal co-products in a fermentation step in a solid medium.
  • the product resulting from the fermentation can then be treated or not, for example be ground or extracted.
  • the inventors have used as a cereal co-product a rapeseed meal and as a mold a Aspergillus flavus strain.
  • the nutrient medium was thus constituted by a meal rapeseed cake pre-moistened with 60% dry matter and autoclaved for 35 min at 105 ° C. After cooling, the medium was inoculated with a spore solution of Aspergillus flavus in order to obtain a concentration of 1 ⁇ 10 7 spores per gram of dry matter and an initial humidity of 45%. The pH was adjusted to 4.9 by addition of sulfuric acid. The culture medium thus obtained was divided into flasks of Erlenmeyer flask with 10 g of dry matter per flask. The Erlenmeyer flasks were then incubated at 33 ° C under aerobic conditions in the dark for 48 hours without shaking. The humidity remained between 40 and 60% during the fermentation. Aeration allowed the supply of oxygen necessary for fermentation and avoided the accumulation of carbon dioxide produced by the fermentation. The fermentation was stopped at the appearance of the first spores in the culture medium.
  • the mixture obtained at the end of fermentation can be dried and used as such, that is to say in raw form, in the lactic acid production process or be extracted in 0.1 M sodium acetate buffer, (ratio 10% w / v nutritional supplement / buffer) then filtered at 0.2 ⁇ to be added in liquid form.
  • EXAMPLE 2 Effect of Nutritional Supplement on Different Raw Materials Used to Produce Lactic Acid
  • This example shows that the nutritional supplement according to the invention can be used with many renewable carbohydrate raw materials to make lactic acid.
  • the inventors have studied in a comparative manner the quantity of lactic acid produced during a lactic acid production process implementing a step of saccharification-simultaneous fermentation (SSF) of different renewable raw materials (wheat, maize, cassava). , sugarcane) by introducing either an exogenous nutrient solution more or less concentrated in elements such as extracts of meat, yeast and casein peptones, or the nutritional supplement obtained in Example 1.
  • SSF saccharification-simultaneous fermentation
  • the lactic acid production method used comprises the following steps: the renewable raw material (wheat, corn, etc.) is packaged and then liquefied before being subjected to a pre-saccharification step.
  • the lactic acid bacteria used for lactic fermentation are pre-fermented in a pre-fermenter. This lactic acid bacterium is then contacted with the raw material in a SSF step. The lactic acid produced during this SSF step can then be extracted and purified.
  • the raw material has been conditioned to obtain a grind.
  • a milling step resulted in milling, ie flour.
  • the abraded wheat grains were ground using a hammer mill (Electra).
  • the size of the grid used was set at 0.8 mm.
  • the grind obtained has a moisture content of 10% ( ⁇ 2%) and a granulometric profile as represented in FIG. 2.
  • corn mills were obtained by hammer milling.
  • these raw materials are stored away from light in a dry place at room temperature. Liquefaction stage
  • the liquefaction stage of the millings generated makes it possible to hydrolyze the starch into dextrins.
  • the principle is to mix the wheat flour (for example) with water, acid and liquefying enzymes, so as to form a liquefied paste paste.
  • the pasted meal was prepared by incorporating the flour into the water so as to obtain a homogeneous mixture having a solids content of about 20 to 30%. This well thus constituted was distributed in reactor and agitated between 250 and 350 rpm.
  • the temperature kinetics applied to wheat wheat is presented in Figure 1.
  • the pH of the sheep was adjusted to 5.4 (by addition of H 2 SO 4 ) in order to optimize the work of the liquefaction enzymes added after reaching 55 ° C.
  • Two liquefaction enzymes were used, one corresponding to a deviscant (Lyvanol Devisco Plus ® - LYVEN) added to 0.24 kg / t dry matter, the other corresponding to an alpha-amylase (Lyvanol Liquid Plus ® - LYVEN) also added at 0.24 kg / t dry matter.
  • the mice was liquefied at 85 ° C for 2 h in a stirred reactor.
  • the roast was cooled to room temperature.
  • Wheat and maize must have a solids content of 13% and 30% respectively, a pH of between 5.5 and 6 and a viscosity of the order of 50 mPa ⁇ s -1 .
  • the pre-saccharification stage of the liquefied musts makes it possible to hydrolyze the dextrins into fermentable sugars (glucose, maltose, maltotriose).
  • An amyloglucosidase type enzyme (Lyvanol GA 480 ® - LYVEN) was used at 0.890 kg / t dry matter: the liquefied musts of wheat and corn were divided into 250 ml baffled flasks agitated between 250 and 350 rpm. , each containing 100 ml of mutton, supplemented with Lyvanol GA 480 ® at 0.890 kg / t dry matter and CaCO 3 (at 30 g / l of sheep).
  • the lactic acid bacterium used is a bacterium of the genus Lactobacillus, a producer of D-lactic acid, the strain Lactobacillus coryniformis ssp. torquens DSM 20005.
  • This strain was introduced into simultaneous saccharification-fermentation medium (SSF) after being cultured in rich broth medium Man, Rogosa and Sharpe (MRS).
  • SSF simultaneous saccharification-fermentation medium
  • MRS rich broth medium
  • This propagation step allows a development of the sufficient strain necessary for the inoculation of SSF medium at 10 8 CFU / ml of sheep.
  • the propagation conditions were as follows: stirring at 100 rpm, temperature set at 37 ° C. and keeping the pH at 6 by adding NaOH.
  • the SSF stage consists of placing a pre-saccharified mice with a lactic acid bacterium in order to produce the metabolism of interest: lactic acid.
  • the musts were inoculated with 10 8 CFU of lactic acid bacterium obtained at the propagation stage per ml of sheep.
  • mice were stirred at 100 rpm. The temperature was kept constant throughout this step at 37 ° C. Maintaining the pH between 5.5 and 6 was ensured by the initial addition of calcium carbonate buffer. The fermentation lasted 48 hours.
  • the fermentation musts are composed of one of the liquefied, or saccharified, renewable carbohydrate materials, supplemented with one of the exogenous nutrient solutions defined in Table 2, or the nutritional supplement according to the invention:
  • a + nutritional supplement renewable carbohydrate material with addition of solution A and the nutritional supplement obtained from a rapeseed meal (TC) fermented by the strain of Aspergillus flavus, according to the method described in the example 1.
  • TC rapeseed meal
  • Potential glucose of musts between 100 and 150 g / l of mutton (variable according to the raw material). Contribution of the nutritional supplement in the fermentation mash between 1, 3 and 5 kg / t of raw material); Initial pH of musts: between 5.5 and 6.
  • the production of lactic acid is improved by the addition of exogenous nutrient solutions more or less concentrated in nitrogen elements.
  • the yield gain is variable according to the renewable carbohydrate material implemented.
  • the addition of the nutritional supplement according to the invention allows, as well as the nutritional solutions, but at lower cost, to improve the production yields of lactic acid by the strain Lactobacillus coryniformis ssp. torquens DSM 20005. Its effect is also variable depending on the carbohydrate renewable material implemented.
  • the nutritional supplement can totally replace the addition of so-called expensive nutrient solutions (eg solution G) and guarantee the maintenance of lactic efficiency.
  • the nutritional supplement may partly replace the addition of nutrient solutions.
  • the nutritional supplement allows to achieve the same yield as with the addition of the solution D.
  • the complement can substitute a costly input of yeast extract, meat extract and peptones of 1 .25, 2.5 and 2.5 g / l respectively.
  • the nutritional supplement makes it possible to improve the lactic efficiency of 30% compared to the only one.
  • Example 3 Effect of the nutritional supplement on different strains of lactic acid bacteria used to produce lactic acid
  • This example shows that the nutritional supplement can be used with different types of lactic acid bacteria conventionally used to produce lactic acid.
  • the inventors have compared in a comparative manner the amount of lactic acid produced during the SSH of wheat wheat by different strains of lactic acid bacteria, producing D- and / or L-lactate, by introducing either an exogenous nutrient solution plus or less concentrated in elements such as extracts of meat, yeast and casein peptones, the nutritional supplement obtained in Example 1, or a mixture of both.
  • the inventors first carried out liquefaction of abraded wheat bran for 2 hours at 85 ° C. in a stirred reactor having a final solids content of 13%.
  • the liquefied wheat flour was divided into 250 ml stirred flasks, each containing 100 ml of must, supplemented with Lyvanol GA 480 ® (amyloglucosidase at 0.890 kg / t dry matter), and CaCO 3 (at 30 g / l). of mutton).
  • the fermentation musts are composed of liquefied abraded wheat, supplemented with one of the exogenous nutrient solutions defined in Table 3 or the nutritional supplement according to the invention, or both:
  • the contribution of the nutritional supplement is 5 kg / t of raw material.
  • the vials thus formed were incubated at 50 ° C for 2 h.
  • the latter have a glucose potential of 100 g / l of sheep.
  • the musts were inoculated with 10 7 CFU of lactic bacteria per ml of sheep.
  • the bacterial strains used in this example are:
  • Lactobacillus mindensis LMG 21932 (L & D-lactate producer)
  • Lactobacillus zeae LMG 17315 (L-lactate producer)
  • Lactobacillus coryniformis ssp. torquens DSM 20004 (D-lactate producer)
  • the nutritional supplement By adding the nutritional supplement to 5 kg / t of wheat, accessibility to the nitrogen source intrinsic to the raw material used is improved, which increases the lactic yields.
  • the yields in flasks reach 55% with the strain DSM 20004, 45% with the strain DSM 20005.
  • the nutritional supplement can, in part or totally, substitute for these expensive inputs (including yeast extracts, peptones, meat extracts, ).
  • the lactic yield obtained with the addition of the nutrient solution richest in nitrogenous elements can be exceeded by combining the nutritional supplement with a nutrient solution whose concentration of nitrogenous elements is reduced by 95% (solution B).
  • solution G a nutrient solution whose concentration of nitrogenous elements is reduced by 95%
  • This example shows that the nutritional supplement can be used effectively in conducting lactic acid production process at different scales.
  • the inventors have compared in a comparative manner the amount of lactic acid produced during wheat sheep SSF by the strain L. coryniformis DSM 20004, by introducing either an exogenous nutrient solution concentrated in elements such as meat extracts, yeast and peptone casein, the nutritional supplement obtained in Example 1, and by varying the fermentation line, namely either a fermentation line in a vial for which the pH control is not optimal, or a Batch type reactor with continuous pH maintenance.
  • the liquified lamb wheat 20% MS was divided into reactors, each containing 3000 ml of must, supplemented with Lyvanol GA 480 ® (amyloglucosidase at 0.890 Kg / t DM) and put under control of the pH by the addition of acid. 5 N sulfuric acid and 7 N sodium hydroxide for a pH keeping set point of 6 throughout the fermentation.
  • the fermentation musts are composed of liquefied abraded wheat, added with one of the exogenous nutrient solutions defined in Table 4 or the nutritional supplement according to the invention:
  • the vials thus formed were incubated at 50 ° C for 2 h.
  • the latter have a glucose potential of 100 g / l of sheep.
  • the musts were inoculated with at least 10 8 CFU of lactic bacteria per ml of sheep.
  • the bacterial strain used in this example is Lactobacillus coryniformis ssp. Torquens DSM 20004. The fermentation was conducted for 48 h at 37 ° C with shaking (100 rpm).
  • pre-saccharification was performed at 60 ° C for 1 h.
  • the glucose potential is 135-145 g / l of sheep.
  • the musts were inoculated with at least 10 8 CFU of lactic acid bacteria per ml of sheep.
  • the bacterial strain used in this example is Lactobacillus coryniformis ssp. Torquens DSM 20004.
  • the fermentation was conducted for 48 h at 30 ° C with stirring (300 rpm).
  • the scale-up of the vial to the batch reactor makes it possible to improve the performance of the strain: the best control of the fermentation parameters (temperature / stirring) and the regulation continuous pH make it possible to increase the lactic acid production yields by the L. coryniformis strain DSM 20004, whatever the origin of the source of nitrogenous elements available for the strain (exogenous with the nutrient solution G or intrinsic under the action of the nutritional supplement).
  • the yield gain observed in scale-up for the condition mout supplemented with the nutritive solution G is 18% (improvement of the yield from 78.8% to 93.4%). This gain is 71% for the condition mout supplemented with the nutritional supplement.
  • Table 5 Lactic yields obtained in flask and batch reactor at the end of
  • the nutritional supplement can be obtained by means of different substrates and different molds and bacteria.
  • the inventors have compared in a comparative manner the amount of lactic acid produced during wheat sheep SSF by the strain L. coryniformis DSM 20004, by introducing either an exogenous nutrient solution concentrated in elements such as meat extracts, yeast and casein peptones, the nutritional supplement according to the invention, by varying the strain and the substrate used for the manufacture of the nutritional supplement.
  • the fermentation musts are composed of liquefied abraded wheat supplemented with the nutritive solution B with or without the addition of one of the nutritional supplements according to the invention listed in table 6.
  • Table 6 List of different nutritional supplements (CN) implemented in
  • the strain "Aspergillus oryzae 044" is the strain Aspergillus oryzae ATCC 12892.
  • the vials thus formed were incubated at 50 ° C for 2 h.
  • the latter have a glucose potential of 100 g / l of sheep.
  • the musts were inoculated with 10 7 CFU of lactic bacteria per ml of sheep.
  • the bacterial strain used in this example is Lactobacillus coryniformis ssp. Torquens DSM 20004.
  • the fermentation was conducted for 72 h at 30 ° C with shaking (100 rpm).
  • FIG. 5 illustrates the fact that nutritional supplements produced by solid state fermentation (FMS) from different substrates and different strains make it possible to increase the lactic yield of a fermentation in a liquid medium by a strain of the genus Lactobacillus with respect to the condition Mout + solution B.
  • FMS solid state fermentation
  • the nutritional supplements obtained by FMS make it possible to increase the lactic yield of the fermentation by a factor of 1, 6 to 2 compared to the simple addition of a nutritive solution B (corresponding, among other things, to an addition of 0.25% yeast extract. g / l of mutton, in meat extract of 0.5 g / l of sheep and in peptones of 0.5 g / l of mutton).
  • a nutritive solution B corresponding, among other things, to an addition of 0.25% yeast extract. g / l of mutton, in meat extract of 0.5 g / l of sheep and in peptones of 0.5 g / l of mutton.
  • the concentrations of FAN Free Amino Nitrogen
  • the concentrations of FAN present at the end of fermentation in the musts, representative of the soluble nitrogen (amino acids and small peptides)
  • FAN Free Amino Nitrogen
  • the inventors were able to form three distinct groups under the tested conditions: a first group represented by the dashed circle comprising the four most basic nutritional supplements, a second group represented by the dashed circle consisting of 4 nutritional supplements with more advantageous performances, and a third group represented by the solid circle with the 2 most effective nutritional supplements.
  • the "solid line” group consists of 2 of 3 strains of Aspergillus flavus, the "dotted” group consists of strains of Aspergillus oryzae, and the "dashes” group includes strains of Aspergillus niger and A. tubigensis, two closely related species, as well as the two strains of Bacillus sp.
  • strains of Aspergillus flavus 029 and 046 tested are the two best performing strains to meet the nitrogen requirements of the lactic strain implemented in saccharification-simultaneous fermentation.
  • Example 6 Specific Benefits of Certain Nutritional Supplements
  • the inventors have studied in a comparative way the quantity of lactic acid produced during the saccharification-simultaneous fermentation of wheat wheat with the L coryniformis strains DSM 20004 or L. coryniformis DSM 20005, by introducing either a protease solution of variable concentration. , or the nutritional supplement according to the invention by varying the strain used for fermentation in solid medium.
  • the inventors evaluated the specific advantages that the nutritional supplement could confer for different strains of lactic acid bacteria, in response to their nutritional needs, by comparing them to commercial proteases.
  • the inventors first carried out liquefaction of abraded wheat bran for 2 hours at 85 ° C. in a stirred reactor having a final solids content of 20%.
  • This liquefied beetle was divided into reactors, each containing 3000 ml of must, supplemented with Lyvanol GA 480 (amyloglucosidase at 0.890 kg / t dry matter), and placed under control of the pH by the addition of 5 N sulfuric acid and of sodium hydroxide 7 N for a set point of keeping the pH at 6 all along the fermentation.
  • the fermentation musts consisted of liquefied, saccharified abraded wheat, supplemented with the nutritive solution B with the addition of one of the nutritional supplements according to the invention listed in Tables 7 and 8, or of one of the solutions.
  • CN nutritional supplement obtained by the process described in Example 1 using the mold or bacterium strain mentioned in the table
  • NCs could be tested in excess (20 kg / t of wheat) in Run 1 for better determination of amino acid profiles.
  • Different concentrations of commercial proteases could be tested in Trial 2 for a better evaluation of their potential and comparison with the nutritional supplement.
  • the musts After 1 h 30 of pre-saccharification at 60 ° C., the musts have a glucose potential of 150 g / l. The latter were inoculated with 10 9 CFU of lactic acid bacteria per ml of sheep.
  • the bacterial strains used in trials 1 and 2 are Lactobacillus coryniformis ssp. Torquens DSM 20004 and DSM 20005. The fermentation was conducted for 50 h at 30 ° C with stirring (300 rpm) and maintaining the pH at 6 by adding 7 N sodium hydroxide.
  • FIG. 8 shows that the 4 nutritional supplements according to the invention can respond optimally and analogously to the needs of the two lactic acid strains in fermentation (when the latter have the same yields, as for example for the nutritional supplements obtained with strains 029 or 046), but also to respond particularly more favorably to the needs of one or other of the lactic acid strains.
  • the nutritional supplement obtained with strain CL260 allows a higher lactic yield with the strain of bacteria.
  • the nutritional supplement obtained with strain 044 allows a higher lactic yield with the strain of lactic bacteria DSM 20004.
  • FIG. 9 also shows that, depending on the type of strain used for the production of the nutritional supplement, the profile of free amino acids (AAL) released by the latter in the fermentation broth can be different and therefore specifically provide a particularly advantageous response. the needs of the lactic acid strains used in the lactic acid production process.
  • AAL free amino acids
  • the ALA profile for type A niger reflects a very diverse release of ALA, mainly glutamine (13% of LAA released), but also Alanine, Glycine, Leucine, Valine, etc., in proportions between 2% and 5% of the LAA.
  • this type of profile seems to be interestingly suited to the two lactic acid strains tested since the two nutritional supplements 029 and 046 (A flavus strains, a species similar to A niger) have similar performances. on the production of lactic acid in saccharification-simultaneous fermentation.
  • the AAL profile for type A oryzae also reflects a large diversity of LAA released in the fermentation broth, most of which are glutamine (more than 20% of LAA), Tyrosine (6%), Proline, Leucine, etc. In fermentation, this profile found with the nutritional supplement obtained with the strain 044 seems to respond particularly advantageously to the needs of the lactic strain DSM 20004.
  • LAA profile for the Bacillus subtilis type reflects a less diversified AAL release, mainly Tyrosine (+ 20% of ALA), Aspartic acid, Methionine, Glutamine and Asparagine in proportions of less than 10% of LAA. released.
  • Tyrosine (+ 20% of ALA
  • Methionine Aspartic acid
  • Methionine Aspartic acid
  • Glutamine Asparagine in proportions of less than 10% of LAA. released.
  • this profile found with the nutritional supplement obtained with the strain CL260 seems to meet particularly advantageously the needs of the lactic strain DSM 20005.
  • the diversity of ALA profiles released in fermentation substrates by the different types of nutritional supplements is an advantage for fermentation because it makes it possible to provide the different lactic acid strains, potentially used for the production of lactic acid, assimilable nitrogen source corresponding more specifically to their nutritional needs.
  • the specific use of the nutritional supplement obtained with the strain 029 in lactic acid production by the lactic strain DSM 20004 has an additional advantage.
  • a nutritional supplement allowing to limit the presence FAN at the end of fermentation therefore has an additional advantage, for the same effect on the production of lactic acid.
  • the nutritional supplement produced with the strain 044 therefore has an additional advantage over the nutritional supplement produced with the strain 029.
  • the complement Nutritional product produced with the CL260 strain has an additional advantage over the nutritional supplement produced with the equivalent FAN 044 strain.
  • Figure 12 shows the profile of the LAA released in the fermentation broth under the action of the nutritional supplement produced with the strain 029 or under the action of each of the two commercial proteases Prolyve BS conc. (marketed by Lyven) and Fermgen (marketed by Genencor International).
  • Prolyve BS conc. (marketed by Lyven) and Fermgen (marketed by Genencor International).
  • the inventors have observed that the diversity of ALAs released in the presence of the nutritional supplement according to the invention is greater than with commercial proteases.
  • For the nutritional supplement we observed the release of 19 different amino acids, including Glutamine in greater proportion, Proline and Leucine around the 5% of LAA released.
  • the profile of LAA released in the medium is restricted to 8 amino acids including Glutamine and Aspartic Acid.
  • the profile of the LAA released is rather diversified with 16 different amino acids but in proportions other than those found with the nutritional supplement.
  • protease Prolyve BS conc are mainly found Tyrosine and Methionine.
  • the advantage of adding a nutritional supplement according to the invention with respect to commercial proteases in the lactic acid production process can thus be related to the diversity of LAAs (quality and relative quantity) potentially released in the fermentation substrate, which makes it possible to provide an assimilable nitrogen source that more specifically meets the nutritional requirements of the lactic acid strains used in fermentation.
  • Example 7 Effect of the nutritional supplement on bacterial growth
  • the inventors have studied in a comparative manner the quantity of lactic acid produced during the saccharification-simultaneous fermentation of wheat wheat with the L coryniformis strains DSM 20004 or L. coryniformis DSM 20005, by introducing the nutritional supplement according to the invention into varying the strain used for the production of the nutritional supplement, supplemented with one of the two nutritive solutions A or B defined above.
  • concentrations and yields of lactic acid and concentrations of lactic acid bacteria they evaluated the specificity of the effects of nutritional supplements.
  • the musts After 1.5 hours of pre-saccharification at 60 ° C., the musts have a glucose potential of 150 g / l. The latter are inoculated with 10 9 CFU of lactic acid bacteria per ml of sheep. The bacterial strains used in this test are Lactobacillus coryniformis ssp. Torquens DSM 20004 and DSM 20005. The fermentation was conducted for 50 h at 30 ° C with stirring (300 rpm) and maintaining the pH at 6 by adding 7N sodium hydroxide.
  • the bacterial population was determined during fermentation by performing counting on Thoma cell.
  • the dynamics of bacterial growth and lactic acid production are illustrated in FIG. 13 through results obtained with the DSM 20005 strain, respectively in dashed lines and in solid lines.
  • the evolution of the bacterial population, initially inoculated at 10 9 CFU / ml, during saccharification-simultaneous fermentation (SSF) is similar regardless of the nutritional supplements used, in combination or not with a source of nitrogen exogenous (here provided by solution B in combination with CN 029 TC).
  • the bacterial population stabilizes around 10 10 bacteria / ml of sheep.
  • the concentrations of bacteria in the musts are very close for all the conditions tested. If the conditions of addition of nutritional supplement and exogenous nutrient solutions do not affect the bacterial population dynamics, on the other hand, they affect the ability of lactic acid bacteria to produce lactic acid.
  • DSM 20005 is favored by the implementation of the nutritional supplement obtained with strain CL260 or by the nutritional supplement obtained with strain 029 associated with solution B. It is the same with the lactic acid bacterium DSM 20004: the production of lactic acid is greater by the implementation of the nutritional supplement obtained with the strain 029 compared to the nutritional supplement obtained with the strain 0248, without this gain linked to an increase in the lactic acid bacteria population (Table 10).
  • Table 10 Impact of the type of nutritional supplement used in combination of nutrient solutions on the lactic acid bacteria L. coryniformis DSM 20004 at the end of the 50 h of fermentation of a liquefied and saccharified wheat mill at 20% MS.
  • the advantageous effect of adding a nutritional supplement according to the invention to the lactic acid production process can not be linked to a simple increase in lactic biomass but to an improvement in production capacities.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un complément nutritionnel, sous forme brute ou extraite, issu d'une fermentation avec une moisissure ou une bactérie, pour la fabrication, par fermentation, d'acide lactique.

Description

Utilisation d'un complément nutritionnel dans la fabrication d'acide lactique
La présente invention concerne la fabrication d'acide lactique. II est connu de produire de l'acide lactique à partir de matière première amylacée par un procédé enzymatique comprenant une étape de liquéfaction de l'amidon par une alpha-amylase visant à solubiliser et hydrolyser l'amidon en dextrines. Cette étape est classiquement suivie d'une étape de saccharification par une glucoamylase, visant à hydrolyser les dextrines en glucose. Le glucose est alors fermenté au cours d'une étape de fermentation pendant laquelle il est transformé en acide lactique par une bactérie lactique.
Toutefois, les microorganismes habituellement utilisés des genres Lactobacillus, Bacillus et Sporolactobacillus ne peuvent croître et produire de l'acide lactique de manière industrielle sans l'ajout d'une source d'azote organique composée d'acide aminés libres ou liés sous forme d'oligopeptides et de peptides, que sa composition soit définie ou qu'il s'agisse d'un extrait naturel. Des exemples de telles sources d'azote organique conventionnellement utilisés sont les autolysats et hydrolysats de levure, les hydrolysats de protéines végétales et animales (peptone de caséine, ...) et également les sous-produits solubles de trempe de blé et de maïs. Néanmoins, ces sources d'azote organique sont vendues à des prix relativement élevés, ce qui grève fortement le coût de fabrication de l'acide lactique. Des sources d'azote organique définies, reconstituées à partir d'acides aminés, de vitamines et de promoteurs de croissance purifiés peuvent également être utilisées mais avec des coûts encore supérieurs.
Des solutions ont été envisagées pour tenter de réduire l'apport exogène de source azotée, et ainsi limiter les coûts de production. Il a ainsi été proposé, dans la demande EP 1 205 557, de réaliser des traitements physique et enzymatique en amont de la fermentation de la matière première et de mettre en œuvre des microorganismes nutritionnellement moins exigeants tels que Lactococcus lactis. Cependant, l'ajout d'étapes supplémentaires au procédé de production induit également un coût non négligeable et ne semble pas limiter l'ajout exogène de sources nutritionnelles. La demande EP 1 953 234 propose quant à elle de mettre en œuvre une matière première spécifique (Jus de canne et dérivés) adaptée à certains microorganismes tels que les Bacillus sp. et Sporolactobacillus sp., mais restant inadaptée aux microorganismes appartenant à d'autres genres tels que les Lactobacilles. La demande US 2004/203122 propose de mettre en œuvre des microorganismes thermophiles tels que les Bacillus sp, moins exigeants, mais pour lesquels l'ajout de compléments azotés reste nécessaire. La demande WO 201 1/098843 propose quant à elle d'utiliser des bactéries lactiques exprimant des enzymes dégradant l'amidon, évitant ainsi l'utilisation d'enzymes commerciales au cours des étapes de saccharification et fermentation, mais impliquant toujours l'ajout de compléments azotés.
Il existe donc toujours un besoin important de procédés de production d'acide lactique moins coûteux, nécessitant l'utilisation de sources d'azote organique moins coûteuses ou en quantité moins importantes.
Les inventeurs ont constaté, de manière surprenante, que cet objectif pouvait être atteint par l'utilisation d'un complément nutritionnel pour milieu de saccharification- fermentation simultanée dans un procédé de fabrication d'acide lactique par fermentation à partir d'une matière première amylacée, ce complément nutritionnel étant issu d'une fermentation avec une moisissure ou une bactérie, ceci en substitution totale ou partielle des sources azotées exogènes coûteuses communément utilisées tels que les extraits de levure et peptones.
Les inventeurs ont ainsi constaté que ce complément nutritionnel, lorsqu'il était ajouté, au cours du procédé de production d'acide lactique, dans le milieu de saccharification, de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanée, entraînait la libération, à partir de la matière première amylacée utilisée, d'une quantité et d'une variété importante d'acides aminés qui sont directement assimilables par les bactéries lactiques, permettant ainsi une augmentation de la production d'acide lactique.
Ainsi, l'ajout de ce complément nutritionnel au cours du procédé de production d'acide lactique à partir d'une matière première amylacée rend inutile le pré-traitement de la matière première amylacée qui est généralement réalisé dans les procédés de production d'acide lactique de l'état de la technique.
De plus, le complément nutritionnel selon l'invention permettant la libération progressive des acides aminés au cours de la fermentation ou de la saccharification- fermentation simultanées, il évite l'apparition d'un excès d'azote, les acides aminés libérés progressivement étant consommés en parallèle par les bactéries lactiques, ce qui diminue donc les risques de contamination microbiologique.
Par ailleurs, les inventeurs ont constaté qu'en utilisant ce complément nutritionnel, il était possible, tout en augmentant la quantité d'acides aminés libérés au cours de la saccharification, de la fermentation ou de la saccharification-fermentation simultanée, de limiter la quantité d'azote aminé libre (ou FAN) en fin de fermentation, facilitant ainsi les étapes généralement mises en œuvre en aval du procédé de production d'acide lactique, à savoir l'extraction et la purification d'acide lactique.
La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'un complément nutritionnel, sous forme brute ou extraite, issu d'une fermentation avec une moisissure ou une bactérie, pour la fabrication, par fermentation, de préférence en milieu liquide, d'acide lactique par une bactérie lactique.
La présente invention concerne en outre l'utilisation d'un complément nutritionnel, sous forme brute ou extraite, issu d'une fermentation en milieu solide avec une moisissure ou une bactérie, pour libérer, dans un milieu de fermentation en acide lactique, d'une matière première glucidique renouvelable, l'azote de ladite matière première, au cours de la fabrication, par fermentation, de préférence en milieu liquide, d'acide lactique par une bactérie lactique à partir de ladite matière première.
La présente invention concerne également un procédé de fabrication d'acide lactique à partir d'une matière première glucidique renouvelable, comprenant une étape de fermentation, de préférence en milieu liquide, par une bactérie lactique en présence d'un complément nutritionnel, sous forme brute ou extraite, issu d'une fermentation en milieu solide avec une moisissure ou une bactérie.
La présente invention a également pour objet une composition comprenant (i) une source d'azote organique sélectionnée dans le groupe constitué des matières premières glucidiques renouvelables, des solutions nutritives exogènes, et des mélanges de celles-ci et (ii) un complément nutritionnel, sous forme brute ou extraite, issu d'une fermentation en milieu solide avec une moisissure ou une bactérie.
La présente invention a également pour objet un kit comprenant :
(i) une source d'azote organique sélectionnée dans le groupe constitué des matières premières glucidiques renouvelables, des solutions nutritives exogènes, et des mélanges de celles-ci, et
(ii) un complément nutritionnel, sous forme brute ou extraite, issu d'une fermentation en milieu solide avec une moisissure ou une bactérie.
Description détaillée de l'invention
Complément nutritionnel
Le complément nutritionnel utilisé dans le cadre de l'invention est un complément nutritionnel, sous forme brute ou extraite, issu d'une fermentation en milieu solide avec une moisissure ou une bactérie.
Par "fermentation en milieu solide", on entend ici la culture de microorganismes sur des supports solides humides, sur des supports inertes ou sur des substrats insolubles qui peuvent être utilisés comme source de carbone et d'énergie. Le processus de fermentation a lieu en absence ou quasi-absence d'eau libre dans l'espace entre les particules de substrat.
Par "issu d'une fermentation en milieu solide", on entend ici que le complément nutritionnel selon l'invention est obtenu par fermentation en milieu solide.
Le complément nutritionnel selon l'invention comprend un principe actif.
Par "principe actif", on entend ici un composant ou groupe de composants responsable de l'action du complément nutritionnel.
Ce principe actif, non identifié de manière structurelle par les inventeurs, est produit par la fermentation en milieu solide utilisée pour obtenir le complément nutritionnel selon l'invention et est responsable, au moins en partie, des activités observées lorsque le complément nutritionnel est ajouté dans un procédé de fabrication d'acide lactique par fermentation par une bactérie lactique. Autrement dit, l'effet observé avec le complément nutritionnel selon l'invention sur la production d'acide lactique n'est pas obtenu avec un substrat identique qui n'aurait pas subi la fermentation en milieu solide définie ci-dessous.
Substrat
Le substrat utilisé pour la production du complément nutritionnel est de préférence un coproduit agricole.
Par "coproduit agricole", on entend ici un produit créé au cours du même processus de transformation et en même temps qu'un produit agricole principal.
Le substrat utilisé pour la production du complément nutritionnel peut en particulier être un coproduit céréalier, un coproduit de culture oléagineuse, un coproduit de culture oléaprotéagineuse, un coproduit de culture saccharifère ou un mélange de ceux-ci.
Des exemples de substrats pouvant être utilisés pour produire le complément nutritionnel utilisé dans le cadre de l'invention incluent le son de blé, le tourteau de colza, le tourteau de soja, la pulpe de betterave, la radicelle d'orge, la drêche soluble éthanolière de blé et des mélanges de ceux-ci.
De préférence, le substrat utilisé pour la production du complément nutritionnel est choisi dans le groupe constitué du son de blé, du tourteau de colza, la radicelle d'orge, la drèche soluble éthanolière de blé, et des mélanges de ceux-ci. De manière davantage préférée, le substrat utilisé pour la production du complément nutritionnel est du son de blé ou du tourteau de colza. De manière préférée entre toutes, le substrat utilisé pour la production du complément nutritionnel est du tourteau de colza.
Le substrat utilisé pour la production du complément nutritionnel peut être préalablement broyé. Le substrat utilisé pour la production du complément nutritionnel est de préférence humidifié et traité thermiquement en vue de le pasteuriser ou le stériliser. Le traitement thermique peut consister en un chauffage, par exemple dans un autoclave, typiquement à 121 °C par exemple pendant 20 min ou à 105°C par exemple pendant 35 min, ou une pasteurisation, typiquement à 105°C par exemple pendant 15 min. Il est également possible d'opérer un traitement thermique du substrat utilisé pour la production du complément nutritionnel en y injectant de la vapeur d'eau, ce qui permet d'opérer simultanément l'humidification du substrat.
De préférence, le pH est réglé lors de l'humidification dans une gamme de 4 à 5,5, de préférence à 4,9 par exemple avec de l'acide nitrique ou de l'acide sulfurique, afin d'améliorer l'effet du traitement thermique et le démarrage de la fermentation en milieu solide.
L'humidification est de préférence déterminée de manière que la teneur en eau du substrat utilisé pour la production du complément nutritionnel soit comprise entre 40 et 60% de la masse totale du substrat et de l'eau.
Moisissures et bactéries
Le microorganisme utilisé lors de la fermentation en milieu solide peut être une moisissure.
La moisissure utilisée lors de la fermentation en milieu solide est de préférence une moisissure du genre Aspergillus, de manière davantage préférée de l'espèce Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubingensis ou Aspergillus flavus. De manière particulièrement préférée, la moisissure utilisée lors de la fermentation en milieu solide est de l'espèce Aspergillus oryzae ou de l'espèce Aspergillus flavus. De manière préférée entre toutes, la moisissure utilisée lors de la fermentation en milieu solide est de l'espèce Aspergillus oryzae, en particulier la souche d' 'Aspergillus oryzae ATCC 12892 (disponible auprès de la Collection ATCC).
Alternativement, le microorganisme utilisé lors de la fermentation en milieu solide peut être une bactérie.
La bactérie utilisée lors de la fermentation en milieu solide est de préférence une bactérie du genre Bacillus, de manière davantage préférée de l'espèce Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis. De manière particulièrement préférée, la bactérie utilisée lors de la fermentation en milieu solide est de l'espèce Bacillus subtilis.
Ainsi, la moisissure ou bactérie utilisée lors de la fermentation en milieu solide est de préférence sélectionnée dans le groupe constitué des moisissures du genre Aspergillus et des bactéries du genre Bacillus. De manière davantage préférée, la moisissure ou bactérie utilisée lors de la fermentation en milieu solide est sélectionnée dans le groupe constitué des souches d' 'Aspergillus flavus, des souches d' Aspergillus oryzae, des souches d' 'Aspergillus niger, des souches d' 'Aspergillus tubingensis, et des souches de Bacillus sp.
Les inventeurs ont en outre démontré de manière surprenante que l'utilisation de certaines moisissures ou bactéries permettait de fabriquer un complément nutritionnel plus particulièrement adapté à certaines bactéries lactiques. Ainsi, de manière particulièrement préférée, la moisissure ou bactérie utilisée lors de la fermentation en milieu solide est une moisissure de l'espèce Aspergillus flavus ou de l'espèce Aspergillus oryzae ou une bactérie de l'espèce Bacillus subtilis.
Les inventeurs ont également démontré que l'utilisation de certaines moisissures ou bactéries permettait de fabriquer un complément nutritionnel permettant de limiter plus fortement la présence d'azote aminé libre (FAN) en fin de procédé de production d'acide lactique par fermentation.
Ainsi, de manière particulièrement préférée, la moisissure ou bactérie utilisée lors de la fermentation en milieu solide est une moisissure de l'espèce Aspergillus oryzae ou une bactérie de l'espèce Bacillus subtilis.
En particulier, lorsque la bactérie lactique utilisée pour la production d'acide lactique est la souche L. coryniformis DSM 20004, la moisissure ou bactérie utilisée lors de la fermentation en milieu solide est de préférence une moisissure de l'espèce Aspergillus oryzae. De même, lorsque la bactérie lactique utilisée pour la production d'acide lactique est la souche L. coryniformis DSM 20005, la moisissure ou bactérie utilisée lors de la fermentation en milieu solide est de préférence une bactérie de l'espèce Bacillus subtilis.
L'inoculation du substrat utilisé pour la production du complément nutritionnel peut être mise en œuvre avec tout inoculum approprié. Les moisissures utilisées lors de la fermentation en milieu solide peuvent ainsi être préalablement soumises à une étape de sporulation avant d'être inoculées sous forme de spores. La dose d'inoculum sera alors avantageusement d'au moins 106 spores/g de matière sèche initiale. Alternativement, les moisissures utilisées lors de la fermentation en milieu solide peuvent être inoculées sous forme de mycélium. La dose d'inoculum sera alors avantageusement comprise entre 100 et 300 g de milieu de culture liquide comprenant le mycélium par kg de matière sèche initiale.
De préférence, les bactéries utilisées lors de la fermentation en milieu solide sont soumises à une étape de pré-culture afin d'être en phase exponentielle lors de l'inoculation. La dose d'inoculum sera alors avantageusement comprise entre 100 et 300 g de milieu de culture liquide comprenant les bactéries en phase exponentielle par kg de matière sèche initiale. Fermentation en milieu solide
La fermentation en milieu solide peut être conduite dans tout réacteur approprié.
La fermentation en milieu solide est de préférence conduite pour un arrêt maîtrisé avant la sporulation de la souche de moisissure utilisée et/ou à l'atteinte de la phase stationnaire de la souche bactérienne utilisée. La fermentation en milieu solide est ainsi de préférence conduite pendant une période de 1 à 3 jours, de préférence entre 30 et 60 h, de manière particulièrement préférée pendant 48 h.
La température du milieu est de préférence maintenue entre 28°C et 38°C, ce qui correspond au domaine d'activité optimum des souches de moisissures et bactéries utilisées pour produire le complément nutritionnel.
L'humidité est de préférence maintenue entre 40 et 60% au cours de la fermentation.
Une aération, de préférence en continu, est de préférence mise en place pendant la fermentation en milieu solide, afin d'apporter l'oxygène nécessaire à la fermentation et éviter l'accumulation excessive de dioxyde de carbone produit par la fermentation.
Une agitation peut être conduite en vue d'éviter la formation de masses imperméables. L'agitation peut être mise en œuvre au moyen de bras agitateurs, de lames ou spatules ou de vis sans fin. L'agitation reste toutefois de préférence modérée. Conditionnement du produit fermenté
Le complément nutritionnel obtenu suite à la fermentation en milieu solide ci-dessus peut être sous forme brute ou extraite.
Par "forme brute", on entend ici que le complément nutritionnel comprend le principe actif ainsi que le substrat mis en œuvre lors de la fermentation en milieu solide avec la moisissure ou bactérie, éventuellement broyé. Cette forme brute contient typiquement des particules ayant un diamètre comprise entre 50 μηι et 5 mm selon le type de broyât généré.
Le complément nutritionnel obtenu à l'issue de la fermentation en milieu solide peut en outre être séché ou congelé en vue de sa conservation.
Le séchage est de préférence réalisé à une température modérée pour ne pas affecter les activités enzymatiques, par exemple en étuve de préférence à 40°C.
La congélation est de préférence réalisée sur le produit fermenté humide, par exemple à -20°C.
Le complément nutritionnel obtenu à l'issue de la fermentation en milieu solide peut également subir un nouveau broyage avant d'être conditionné.
Par "forme extraite", on entend ici que le principe actif du complément nutritionnel est isolé du substrat mis en œuvre lors de la fermentation en milieu solide avec la moisissure ou bactérie par des procédés d'extractions pouvant mettre en œuvre toute technique bien connue de l'homme du métier, en particulier par extraction en solution aqueuse, extraction en solution alcoolique, extraction par solvants, homogénéisation haute pression, extraction supercritique, extraction par lits fluidisés, broyage, broyage cryogénique, décompression, cavitation, bullage, extraction par ultrasons, adsorption sur résines ou zéolites. Typiquement, le complément nutritionnel peut être extrait dans du tampon acétate de sodium 0,1 M. Le principe actif sous forme liquide peut être ensuite purifié par toute technique bien connue de l'homme du métier, en particulier par centrifugation, filtration, ultrafiltration, chromatographie, utilisation de membranes ou précipitation.
Utilisation pour la fabrication d'acide lactique
La présente invention concerne l'utilisation d'un complément nutritionnel tel que défini dans la section "Complément nutritionnel' ci-dessus, pour la fabrication, par fermentation, d'acide lactique par une bactérie lactique, en particulier en présence de ce complément nutritionnel.
La présente invention a également pour objet un procédé de fabrication d'acide lactique à partir d'une matière première glucidique renouvelable, comprenant une étape de fermentation de la matière première glucidique renouvelable par une bactérie lactique en présence d'un complément nutritionnel tel que défini à la section "Complément nutritionnel' ci-dessus.
Acide lactique
Par "acide lactique" ou "acide 2-hydroxypropanoïque", on entend ici l'acide alpha hydroxylé de formule C3H603 ou son ion lactate. Dans le contexte de l'invention, le terme "acide lactique" couvre l'énantiomère (R)-ac\de lactique ou D(-)-acide lactique et l'énantiomère (S)-acide lactique ou L(+)-acide lactique.
Ainsi, l'acide lactique produit dans le cadre de l'invention peut être de l'acide D- lactique, de l'acide L-lactique ou un mélange de ceux-ci. De préférence, l'acide lactique produit dans le cadre de l'invention est de l'acide D-lactique.
Bactéries lactiques
Comme il est bien connu de l'homme du métier, l'acide lactique peut être obtenu par fermentation d'un substrat par des bactéries lactiques. Par "bactérie lactique", on entend ici une bactérie à Gram positif, anaérobie partiellement tolérante à l'oxygène, ne produisant pas en général de spores, se présentant sous formes de coques ou de bâtonnets et capable de fermenter les sucres en acide lactique. Comme il est bien connu de l'homme du métier, les bactéries lactiques appartiennent à l'ordre des Lactobacillales, de la classe des Bacilli du phylum des Firmicutes, ainsi qu'à la famille des Bifidobacteriaceae de l'ordre des Bifidobacteriales.
La bactérie lactique utilisée dans le cadre de l'invention est de préférence une bactérie lactique de l'ordre de Lactobacillales. Comme il est bien connu de l'homme du métier, l'ordre des Lactobacillales inclut les familles suivantes : Aerococcaceae, Carnobacteriaceae, Enterococcaceae, Lactobacillaceae, Leuconostocaceae et Streptococcaceae.
De préférence, la bactérie lactique utilisée dans le cadre de l'invention est de la famille des Lactobacillaceae. La famille des Lactobacillaceae inclut les bactéries du genre
Lactobacillus, Paralactobacillus, Pediococcus et Sharpea.
De préférence, la bactérie lactique utilisée dans le cadre de l'invention est du genre
Lactobacillus. En particulier, la bactérie lactique utilisée dans le cadre de l'invention peut être choisie dans le groupe constitué des espèces L. acetotolerans, L. acidifarinae, L. acidipiscis, L. acidophilus, L. agilis, L. algidus, L. alimentarius, L. amylolyticus, L. amylophilus, L. amylotrophicus, L. amylovorus, L. animalis, L. antri, L. apodemi, L. aquaticus, L. aviarius, L. bifermentans, L. brantae, L. brevis, L. buchneri, L. cacaonum, L. camelliae, L. capillatus, L. casei, L. ceti, L. coleohominis, L. collinoides, L. composti, L. concavus, L. coryniformis, L. crispatus, L. crustorum, L. curieae, L. curvatus, L. delbrueckii subsp. delbrueckii, L. delbrueckii subsp. indicus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. delbrueckii subsp. lactis, L. delbrueckii subsp. sunkii, L. dextrinicus, L. diolivorans, L. equi, L. equicursoris, L. equigenerosi, L. fabifermentans, L. farraginis, L. farciminis, L. fermentum,
L. floricola, L. florum, L. fornicalis, L. fructivorans, L. frumenti, L. fuchuensis, L. fusaii, L. gallinarum, L. gasseri, L. gastricus, L. ghanensis, L. gigeriorum, L. graminis, L. hammesii, L. hamsteri, L. harbinensis, L. hayakitensis, L. helveticus, L. hilgardii, L. hokkaidonensis, L. hominis, L. homohiochii, L. hordei, L. iners, L. ingluviei, L. intestinalis, L. jensenii, L. johnsonii, L. kalixensis, L. kefiranofaciens, L. kefiri, L. kimchicus, L. kimchiensis, L. kimchii,
L. kisonensis, L. kitasatonis, L. koreensis, L. kunkeei, L. leichmannii, L. lindneri, L. malefermentans, L. mali, L. manihotivorans, L. mindensis, L. mucosae, L. murinus, L. nagelii, L. namurensis, L. nantensis, L. nasuensis, L. odoratitofui, L. oeni, L. oligofermentans, L. oris, L. oryzae, L. otakiensis, L. ozensis, L. panis, L. pantheris, L. parabrevis, L. parabuchneri, L. paracasei, L. paracollinoides, L. parafarraginis, L. parakefiri,
L. paralimentarius, L. paraplantarum, L. pasteurii, L. paucivorans, L. pentosus, L. perolens, L. plantarum, L. pobuzihii, L. pontis, L. porcinae, L. psittaci, L. rapi, L. rennini, L. reuteri, L. rhamnosus, L. rimae, L. rogosae, L. rossiae, L. ruminis, L. saerimneri, L. sakei, L. salivarius, L. sanfranciscensis, L. saniviri, L. satsumensis, L. secaliphilus, L. selangorensis, L. senioris, L. sharpeae, L. siliginis, L. similis, L. sobrius, L. spicheri, L. sucicola, L. suebicus, L. sunkii, L. suntoryeus, L. taiwanensis, L. thailandensis, L. tucceti, L. uli, L. ultunensis, L. uvarum, L. vaccinostercus, L. vaginalis, L. versmoldensis, L. vini, L. vitulinus, L. xiangfangensis, L. yonginensis, L. zeae et L. zymae. De préférence, la bactérie lactique utilisée dans le cadre de l'invention est sélectionnée dans le groupe consistant en les espèces L. mindensis, L. zeae et L. coryniformis. De manière encore préférée, la bactérie lactique utilisée dans le cadre de l'invention est sélectionnée dans le groupe consistant en la souche L. mindensis LMG 21932 (disponible auprès de la Collection BCCM/LMG), la souche L. zeae LMG 17315 (disponible auprès de la Collection BCCM/LMG), la souche L coryniformis ssp. torquens DSM 20004 (disponible auprès de la Collection DSMZ), et la souche L. coryniformis ssp. torquens DSM 20005 (disponible auprès de la Collection DSMZ).
Les bactéries lactiques capables de produire de l'acide D-lactique, de l'acide L- lactique ou un mélange d'acide D-lactique et L-lactique sont bien connues de l'homme du métier et sont par exemple décrites dans Connolly et Lonnerdal (2004) Nutrafoods 3:37-49. Ainsi, parmi les bactéries lactiques capables de produire de préférence de l'acide D- lactique, on peut citer les bactéries lactiques L. coryniformis, L. delbrueckki et L. jensenii. Parmi les bactéries lactiques capables de produire de préférence de l'acide L-lactique, on peut citer les bactéries lactiques L. zeae, L. amylophilus, L. casei et L. rhamnosus. Parmi les bactéries capables de produire de l'acide D-lactique et L-lactique en proportion équivalente, on peut citer les bactéries lactiques L. mindensis, L. acidophilus, L. brevis, L. fermentum et L. plantarum.
Les inventeurs ont montré que le complément nutritionnel décrit ci-dessus était particulièrement efficace pour améliorer la production d'acide lactique par des bactéries lactiques L. coryniformis. Par conséquent, dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la bactérie lactique utilisée dans le cadre de l'invention est une bactérie lactique L coryniformis, en particulier une souche de Lactobacillus coryniformis ssp. torquens, de préférence la souche L. coryniformis ssp. torquens DSM 20004 ou la souche L. coryniformis ssp. torquens DSM 20005, en particulier la souche L. coryniformis ssp. torquens DSM 20005.
De préférence, une seule souche de bactérie lactique est utilisée à la fois dans le cadre de l'invention. De préférence, le procédé de fabrication d'acide lactique selon l'invention n'utilise donc qu'une souche de bactérie lactique, i.e. n'utilise pas de cocktail de bactéries lactiques.
Au cours du procédé de fabrication d'acide lactique, les bactéries lactiques sont introduites au cours de l'étape de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanée.
De préférence, les bactéries lactiques sont inoculées dans le milieu de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanée à une dose comprise entre 107 et 109 UFC/ml de milieu, de préférence à une dose de 108 UFC/ml de milieu.
De préférence, les bactéries lactiques sont introduites dans le milieu de fermentation ou de saccarification-fermentation simultanée après avoir subi une étape de propagation. Cette étape de propagation permet un développement des bactéries lactiques suffisant à l'inoculation du milieu de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanée à la dose mentionnée ci-dessus. L'étape de propagation est typiquement mise en œuvre par culture des bactéries lactiques dans un milieu conventionnel de culture des bactéries lactiques, tel que le milieu MRS (milieu de Man, Rogosa, Sharpe), de préférence sous agitation, par exemple à 100 rpm, à une température adaptée à la croissance des bactéries lactiques, par exemple à 37°C, à pH préférentiellement ajusté par exemple de 6.
Matière première glucidique renouvelable
Par "matière première glucidique renouvelable", on entend ici les déchets des industries alimentaires peu coûteux, non raffinés, généralement non toxiques et riches en sources de carbone et d'azote plus ou moins assimilable. La matière première glucidique renouvelable utilisée dans le cadre de l'invention peut en particulier être choisie parmi les coproduits de la filière céréalière, telle que la filière blé, maïs, orge ou seigle, les coproduits de la filière sucrière, telle que la filière betterave ou canne à sucre, les coproduits de la filière des végétaux tubérisés riches en glucides, telle que la filière manioc ou pomme de terre, et les coproduits de la filière laitière. Ces matières premières glucidiques renouvelables contiennent à la fois de l'amidon ou du glucose comme source de carbone, et des protéines de haut poids moléculaire, en plus des peptides et acides aminés libres, comme source d'azote plus ou moins assimilable.
Les matières premières glucidiques renouvelables issues de la filière céréalière incluent en particulier les farines liquéfiées et saccharifiées de blé, de maïs, d'orge et/ou de seigle, plus particulièrement des farines liquéfiées et saccharifiées de blé abrasé.
Les matières premières glucidiques renouvelables issues de la filière sucrière incluent en particulier les coproduits sucriers concentrés de glucides, plus particulièrement les mélasses de betterave ou de canne à sucre. Les matières premières glucidiques renouvelables issues de la filière des végétaux tubérisés riches en glucides incluent en particulier les farines liquéfiées de tubercules, plus particulièrement les farines liquéfiées de manioc ou de pomme de terre.
Les matières premières glucidiques renouvelables issues de la filière laitière incluent en particulier les coproduits laitiers riches en lactose, plus particulièrement le lactosérum.
Les inventeurs ont démontré lorsque le complément nutritionnel tel que défini ci- dessus était utilisé dans les procédés de production d'acide lactique à partir de matière première glucidique renouvelable issue de la filière céréalière blé ou maïs, ou de la filière sucrière canne à sucre, il permettait de diminuer l'ajout de solutions nutritives exogènes coûteuses, telles que définies dans la section "Solutions nutritives exogènes" ci-après, d'au moins 20-25% pour un même rendement en acide lactique.
De préférence, la matière première glucidique renouvelable utilisée dans le cadre de l'invention est donc choisie dans le groupe consistant en les matières premières glucidiques renouvelables issues de la filière céréalière blé, en particulier les farines liquéfiées saccharifiées (moûts) de blé abrasé, les matières premières glucidiques renouvelables issues de la filière céréalière maïs, en particulier les farines liquéfiées saccharifiées (moûts) de maïs et les matières premières glucidiques renouvelables issues de la filière sucrière canne à sucre, en particulier la mélasse de canne à sucre.
Les inventeurs ont plus particulièrement démontré qu'un même rendement d'acide lactique pouvait être obtenu, à partir d'une matière première glucidique renouvelable issue de la filière céréalière blé, quand une solution coûteuse riche en éléments azotés de type MRS était totalement remplacée par le complément nutritionnel tel que défini ci-dessus.
De manière particulièrement préférée, la matière première glucidique renouvelable utilisée dans le cadre de l'invention est donc une matière première glucidique renouvelable issue de la filière céréalière blé, en particulier du moût de blé abrasé.
La matière première glucidique renouvelable utilisée dans le cadre de l'invention peut être préalablement conditionnée de manière à préparer une mouture. En particulier, pour les matières premières glucidiques renouvelables issues de la filière céréalière blé, maïs ou de la filière manioc, une étape de broyage, par exemple à l'aide d'un broyeur à marteau, permet d'obtenir une mouture, autrement dit une farine.
Solutions nutritives exogènes
Des solutions nutritives exogènes peuvent être ajoutées au milieu de fermentation pour couvrir les besoins des bactéries lactiques, et notamment leurs besoins en éléments azotés assimilables. Les solutions nutritives pouvant être utilisées dans le cadre de la présente invention comprennent ou consistent en des éléments communément retrouvés dans le bouillon MRS (de Man, Rogosa, Sharpe), tels que les extraits de levure, les peptones de caséine, les extraits de viande, du potassium phosphate dibasique, de l'acide de sodium, du citrate d'ammonium, du sulfate de magnésium, du sulfate de manganèse et du Tween et les mélanges de ceux-ci. Ces derniers peuvent varier en concentration, pour garantir des apports variés au milieu de fermentation.
Les solutions nutritives exogènes de type MRS peuvent ainsi être conventionnellement ajoutées comme source d'azote organique à une dose correspondant à 5 g d'extrait de levure, 10 g de peptones de caséine, 10 g d'extrait de viande, 2 g de potassium phosphate dibasique, 5 g d'acétate de sodium, 2 g de citrate d'ammonium, 0,2 g de sulfate de magnésium, 0,05 g de sulfate de manganèse et 1 g de Tween, par litre de mout de fermentation.
Les solutions nutritives exogènes pouvant être utilisées dans le cadre de l'invention peuvent en particulier être choisies dans le groupe constitué des solutions A, B, C, D, E, F et G, dont les compositions sont décrites dans le tableau 1 .
Tableau 1 : Composition des solutions nutritives exogènes A, B, C, D, E, F et G. Les concentrations en éléments sont celles retrouvées dans le milieu de fermentation.
Apport dans le
Solution Solution Solution Solution Solution Solution Solution milieu de
A B C D E F G
fermentation (g/1)
Extrait de levure 0 0,25 0,5 1 ,25 2,5 3,75 5
Peptones de
0 0,5 1 ,0 2,5 5,0 7,5 10 caséine
Extrait de viande 0 0,5 1 ,0 2,5 5,0 7,5 10
Potassium
phosphate 0 0,1 0,2 0,5 1 ,0 1 ,5 2 dibasique
Acétate de sodium 0 0,25 0,5 1 ,25 2,5 3,75 5
Citrate
0 0,1 0,2 0,5 1 ,0 1 ,5 2 d'ammonium
Sulfate de
0 0,01 0,02 0,05 0,1 0,15 0,2 magnésium
Tween 0 0,05 0,1 0,25 0,5 0,75 1
Sulfate de
0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 manganèse
L'ajout de la solution G dans le milieu de fermentation garantira un apport en éléments nutritifs similaires à un bouillon MRS (hors source carbonée).
Procédé de fabrication L'étape de fermentation mise en œuvre dans le procédé de fabrication d'acide lactique selon l'invention est de préférence une étape de saccharification-fermentation simultanée.
L'étape de saccharification-fermentation simultanée consiste à mettre en présence la matière première glucidique renouvelable, éventuellement liquéfiée et pré-saccharifiée, avec une bactérie lactique afin de produire le métabolisme d'intérêt, à savoir ici l'acide lactique. De préférence, les caractéristiques de l'étape de saccharification-fermentation simultanée du procédé selon l'invention sont les suivantes :
- maintien du milieu à une température constante tout au long de l'étape, de préférence entre 30 et 37°C, de manière particulièrement préférée à 37°C ;
- maintien du pH de préférence entre 5,5 et 6, par exemple par ajout de NaOH pendant l'étape ou par ajout initial en tampon carbonate de calcium ;
- agitation comprise entre 100 et 350 rpm ;
- niveau de matière sèche du milieu compris entre 10 et 30%.
Le complément nutritionnel selon l'invention ajouté au cours du procédé de fabrication d'acide lactique permet d'améliorer la production d'acide lactique sans que les conditions optimales de la souche lactique utilisée ne soient mises en œuvre, générant ainsi des gains d'énergie et des économies de coûts.
L'étape de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanée est de préférence mise en œuvre pendant 48 à 72 h, de manière particulièrement préférée pendant 48 h.
Le complément nutritionnel utilisé dans le cadre de l'invention permet avantageusement de rendre assimilable l'azote présent dans la matière première glucidique renouvelable, qui ne pourrait, en l'absence de ce complément nutritionnel, qu'être très peu et difficilement assimilé par les bactéries lactiques. Par conséquent, dans le cadre de l'invention, la matrice première glucidique renouvelable constitue une source d'azote organique pour les bactéries lactiques.
Cette source d'azote organique peut être complétée par d'autres sources d'azote organique "exogènes" (différentes de la matière première glucidique renouvelable telle que définie dans la section "Matière première glucidique" ci-dessus) conventionnellement utilisées en fermentation ou saccharification-fermentation simultanée. De telles sources d'azote organique "exogènes" sont bien connues de l'homme du métier et incluent typiquement les solutions nutritives exogènes telles que décrites dans la section "Solutions nutritives exogènes" ci-dessus.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, l'étape de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanée est mise en œuvre en présence d'une source d'azote organique issue d'une matière première glucidique renouvelable telle que définie à la section "Matière première glucidique renouvelable" ci-dessus et, éventuellement de solutions nutritives exogènes, telles que décrites dans la section "Solutions nutritives exogènes" ci-dessus.
D'autres additifs conventionnellement utilisés dans les procédés de production d'acide lactique peuvent en outre être introduits dans le milieu de saccharification, de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanée afin d'améliorer le rendement de production d'acide lactique.
Le complément nutritionnel tel que défini à la section "Complément nutritionnet' ci- dessus est de préférence introduit lors de l'étape de saccharification, de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanée.
Le complément nutritionnel tel que défini à la section "Complément nutritionnet' ci- dessus est de préférence introduit lors de l'étape de pré-saccharification, de saccharification, de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanée à une dose de 1 ,3 à 5 kg/t de matière première glucidique renouvelable, de manière davantage préférée à une dose de 5 kg/t de matière première glucidique renouvelable.
Les inventeurs ont démontré que l'utilisation du complément nutritionnel tel que défini ci-dessus permettait de substituer en partie, voire totalement, l'ajout de solutions nutritives exogènes telles que définies à la section "Solutions nutritives exogènes" ci- dessus, dans les procédés de production d'acide lactique à partir de matière première glucidique renouvelable issue des filières céréalières amlylacées ou non, ou encore sucrière.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, l'étape de saccharification, de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanée est mise en œuvre en présence du complément nutritionnel tel que défini à la section "Complément nutritionnet' ci-dessus, de préférence à une dose de 1 ,3 à 5 kg/t de matière première glucidique renouvelable, de manière davantage préférée à une dose de 5 kg/t de matière première glucidique renouvelable, et une source d'azote organique "exogène", de préférence une solution nutritive exogène telle que définie à la section "Solutions nutritives exogènes" ci- dessus, à une dose correspondant à des apports dans le mout de fermentation de 1 à 1 ,25 g d'extrait de levure, 2 à 2,5 g de peptones de caséine, 2 à 2,5 g d'extrait de viande, 0,4 à 0,5 g de potassium phosphate dibasique, 1 à 1 ,25 g d'acétate de sodium, 0,4 à 0,5 g de citrate d'ammonium, 0,04 à 0,05 g de sulfate de magnésium, de 0,05 g de sulfate de manganèse et 0,2 à 0,25 g de Tween, par litre de mout.
Les inventeurs ont également démontré qu'un même rendement d'acide lactique pouvait être obtenu, à partir d'une matière première glucidique renouvelable issue de la filière blé, quand les solutions nutritives exogènes coûteuses, riches en éléments azotés étaient totalement remplacées par le complément nutritionnel tel que défini ci-dessus.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, l'étape de saccharification, de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanée est mise en œuvre en présence du complément nutritionnel tel que défini à la section "Complément nutritionnel' ci-dessus, de préférence à une dose de 1 ,3 à 5 kg/t de matière première glucidique renouvelable, de manière davantage préférée à une dose de 5 kg/t de matière première glucidique renouvelable, et en l'absence d'une source d'azote organique "exogène", en particulier en absence des solutions nutritives exogènes telles que définies à la section "Solutions nutritives exogènes" ci-dessus, contenant des éléments source d'azote assimilable.
Le procédé de fabrication d'acide lactique selon l'invention peut comprendre une étape de liquéfaction de la matière première glucidique renouvelable avant l'étape de saccharification, de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanée. Une étape de liquéfaction peut en particulier être mise en œuvre lorsque la matière première glucidique renouvelable est une mouture d'amidon. L'étape de liquéfaction des moutures d'amidon permet en effet d'hydrolyser l'amidon en dextrines.
L'étape de liquéfaction consiste à mélanger la mouture avec de l'eau, de l'acide et des enzymes de liquéfaction, de manière à former un moût empâté liquéfié. De préférence, la mouture est incorporée dans l'eau de manière à obtenir un mélange, de préférence homogène, présentant un taux de matière sèche compris entre 20 et 30%. De préférence, le mout ainsi constitué est mis sous agitation entre 250 et 350 rpm. Selon l'enzyme de liquéfaction utilisée, le pH peut être ajusté avec une solution d'acide, par exemple d'acide sulfurique. Le pH peut classiquement être ajusté entre 5 et 6,5. Selon l'enzyme utilisée, un sel de calcium peut également être ajouté.
La liquéfaction est de préférence réalisée en appliquant la cinétique de température représentée dans la Figure 1 . Cette cinétique inclut typiquement une phase de montée en température de préférence de 15 min permettant d'atteindre une température de 55°C, un palier d'une durée par exemple de 30 min à 55°C, une deuxième phase de montée en température de préférence de 15 min permettant d'atteindre une température de 85°C, un deuxième palier d'une durée par exemple de 2 h à 85°C, et une phase de refroidissement du mout empâté liquéfié à température ambiante. Le palier à 55°C correspond typiquement à la phase de pré-liquéfaction et le palier à 85°C correspond typiquement à la phase de liquéfaction. Les enzymes de liquéfaction utilisées incluent de préférence une alpha-amylase, telle que l'alpha-amylase Lyvanol Liquide Plus® commercialisée par Lyven, et éventuellement un complexe hémicellulolytique déviscosant, tel que le complexe Lyvanol Devisco Plus® commercialisé par Lyven. L'alpha-amylase est typiquement ajoutée entre 0,17 et 0,36 kg/t de matière sèche et le complexe hémicellulolytique déviscosant est typiquement ajouté entre 0,17 et 0,36 kg/t de matière sèche. Les enzymes de liquéfaction sont de préférence ajoutées après la première phase de montée en température à 55°C.
De préférence, à l'issue de l'étape de liquéfaction, le mout empâté liquéfié présente un taux de matière sèche de l'ordre de 20-25%, de préférence un pH compris entre 5,5 et 6, et de préférence une viscosité de l'ordre de 50 mPa.s"1 , la viscosité étant typiquement mesurée à l'aide d'un rhéomètre rotationnel, par exemple de modèle Kinexus Pro® commercialisé par Malvern, à une température de 35°C, la viscosité étant de préférence mesurée à 180 rpm pendant 5 min, après une première phase d'homogénéisation du produit par une vitesse d'agitation à 960 rpm pendant 15 s, la valeur prise en compte étant typiquement la moyenne des 30 dernières secondes de mesure.
Le procédé de fabrication d'acide lactique selon l'invention peut comprendre en outre une étape de pré-saccharification des moûts liquéfiés. Cette étape permet d'hydrolyser les dextrines en sucres fermentescibles. Lors de cette étape, le mout liquéfié est mis en présence d'une glucoamylase, telle que la glucoamylase Lyvanol GA 480® commercialisée par Lyven. La glucoamylase est typiquement ajoutée entre 0,89 et 1 ,45 kg/t de matière sèche. D'autres enzymes peuvent en outre être utilisées au cours de cette étape de pré-saccharification selon la matière première glucidique renouvelable utilisée. Ainsi, l'invertase peut être utilisée pour hydrolyser le saccharose en fructose et glucose. Typiquement, les mélasses de canne à sucre et de betterave peuvent être mises en présence d'une invertase, telle que l'inverlyve P® commercialisée par Lyven. L'invertase est typiquement ajoutée à 50 g/t de matière première. De préférence, pendant l'étape de pré- saccharification le mout liquéfié est mis sous agitation entre 250 et 350 rpm. Le pH peut également être ajusté avec une solution d'acide, par exemple d'acide sulfurique. Le pH peut classiquement être ajusté entre 4 et 5, de préférence entre 4,4 et 4,6.
La pré-saccharification est de préférence mise en œuvre par chauffage à une température comprise entre 50 et 60°C, de préférence à 55°C, pendant moins de 24 h, de préférence pendant 1 h.
Lorsque le procédé de fabrication d'acide lactique selon l'invention comprend une étape de pré-saccharification, le complément nutritionnel tel que défini à la section "Complément nutritionnel' ci-dessus est de préférence ajouté au début de cette étape. De même, les additifs et sources d'azote organique exogènes définis à la section "Solutions nutritives exogènes", ci-dessus peuvent être ajoutés lors de l'étape de pré-saccharification. Le complément nutritionnel peut toutefois également être introduit au cours de l'étape de saccharification, de fermentation ou de saccharification-fermentation. Après l'étape de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanée, l'acide lactique produit peut être séparé du milieu de fermentation ou de saccharification- fermentation simultanée par toute technique conventionnelle connue de séparation de l'acide lactique de solutions aqueuses. Les particules de matière première ou les bactéries lactiques peuvent être éliminées avec la séparation pour augmenter l'efficacité de la séparation. La séparation peut être mise en œuvre par exemple par centrifugation, filtration, floculation, flottation ou filtration sur membrane.
Après séparation du milieu de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanée, l'acide lactique produit par le procédé selon l'invention peut en outre être soumis à une ou plusieurs étapes de purification telles qu'une extraction, distillation, cristallisation, filtration, etc.
Les inventeurs ont démontré que l'utilisation du complément nutritionnel tel que défini ci-dessus au cours du procédé de production d'acide lactique permettait de réduire la présence d'azote aminé libre (FAN) en fin de fermentation ou saccharification-fermentation simultanée. Or, la présence de FAN en fin de fermentation peut poser des problèmes lors des étapes subséquentes d'extraction et de purification de l'acide lactique.
Par conséquent, l'utilisation du complément nutritionnel tel que défini à la section "Complément nutritionnel' ci-dessus permet avantageusement d'accroître les performances des étapes subséquentes d'extraction et de purification de l'acide lactique. Libération d'azote
Les inventeurs ont par ailleurs démontré que l'augmentation de la production d'acide lactique observée lors de l'utilisation du complément nutritionnel tel que défini ci-dessus était liée à l'amélioration de la source d'azote disponible dans le mout de fermentation pour la bactérie lactique. Les performances du complément nutritionnel selon l'invention peuvent donc être reliées à sa capacité à libérer l'azote soluble, en particulier de manière progressive, dans le milieu de fermentation ou de saccharification-fermentation simultanée.
La présente invention concerne donc également l'utilisation du complément nutritionnel tel que défini à la section "Complément nutritionnel' ci-dessus, pour libérer, dans un milieu de fermentation en acide lactique d'une matière première glucidique renouvelable, telle que définie ci-dessus, l'azote de ladite matière première, de préférence de manière progressive, au cours de la fabrication, par fermentation, de préférence en milieu liquide, d'acide lactique à partir de ladite matière première.
Composition et kit
Les inventeurs ont démontré qu'en ajoutant au mout de fermentation une combinaison constituée du complément nutritionnel selon l'invention et d'une quantité réduite d'une source d'azote organique exogène, en particulier d'une source d'azote organique exogène coûteuse telle que les solutions nutritives exogènes définies à la section "Solutions nutritives exogènes" ci-dessus, il était possible d'obtenir la même performance de production d'acide lactique qu'en utilisant seulement une quantité importante de source d'azote organique exogène coûteuse.
La présente invention concerne donc également une composition comprenant :
(i) une source d'azote organique sélectionnée dans le groupe constitué des matières premières glucidiques renouvelables telles que définies à la section "Matière première glucidique renouvelable" ci-dessus, des solutions nutritives exogènes telles que définies à la section "Solutions nutritives exogènes" et des mélanges de celles-ci,
(ii) un complément nutritionnel tel que défini à la section "Complément nutritionnel' ci-dessus.
La présente invention a également pour objet un kit comprenant :
(i) une source d'azote organique sélectionnée dans le groupe constitué des matières premières glucidiques renouvelables telles que définies à la section "Matière première glucidique renouvelable" ci-dessus, des solutions nutritives exogènes telles que définies à la section "Solutions nutritives exogènes", et des mélanges de celles-ci,
(ii) un complément nutritionnel tel que défini à la section "Complément nutritionnel' ci-dessus, et
(iii) éventuellement un emballage.
Les inventeurs ont en particulier démontré qu'en ajoutant au mout de fermentation une combinaison constituée du complément nutritionnel selon l'invention et de la solution nutritive exogène B telle que définie à la section "Solutions nutritives exogènes", il était possible d'obtenir la même performance de production d'acide lactique qu'en utilisant la solution nutritive exogène G seule (correspondant à un apport en source azotée similaire à celui d'un bouillon de culture type MRS).
Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, la source d'azote organique (i) de la composition selon l'invention ou du kit selon l'invention correspond à un apport dans le mout de fermentation de 0,25 à 2,5 g/l d'extrait de levure, 0,5 à 5 g/l de peptones de caséine, 0,5 à 5 g/1 d'extrait de viande, 0,1 à 1 g/l de potassium phosphate dibasique, 0,25 à 2,5 g/l d'acétate de sodium, 0,1 à 1 g/l de citrate d'ammonium, 0,01 à 0,1 g/l de sulfate de magnésium, 0,05 g/l de sulfate de manganèse, et 0,05 à 0,5 g/l de Tween 80.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la source d'azote organique (i) de la composition selon l'invention ou du kit selon l'invention correspond à un apport dans le mout de fermentation de 0,25 g/l d'extrait de levure, 0,5 g/l de peptones de caséine, 0,5 g/l d'extrait de viande, 0,1 g/l de potassium phosphate dibasique, 0,25 g/l d'acétate de sodium, 0,1 g/l de citrate d'ammonium, 0,01 g/l de sulfate de magnésium, 0,05 g/l de sulfate de manganèse, et 0,05 g/l de Tween 80.
La présente invention sera illustrée plus en détail par les figures et exemples ci- dessous.
Brève description des figures
La Figure 1 représente la cinétique de température préférablement appliquée à l'étape de liquéfaction de la matière première glucidique renouvelable, en particulier au mout empâté de blé. A : ajout d'enzymes de liquéfaction ; B : premier palier de température à 55°C correspondant à la pré-liquéfaction ; C : deuxième palier de température à 85°C correspondant à la liquéfaction du mout.
La Figure 2 représente le profil granulométrique d'une mouture de blé abrasé obtenue après broyage au marteau sur grille 0,8 mm.
La Figure 3 représente l'impact de l'ajout de solutions nutritives exogènes ou du complément nutritionnel selon l'invention sur les rendements lactiques obtenus en fiole au terme de 48h de fermentation d'un mout de blé abrasé (A), de mélasses de canne à sucre (B), de maïs (C) ou de manioc (D), par la souche Lactobacillus coryniformis ssp. torquens DSM 20005 inoculée à 108 UFC/ml dans l'exemple 2.
La Figure 4 représente l'impact de l'ajout de solutions nutritives exogènes ou du complément nutritionnel selon l'invention sur les rendements lactiques obtenus en fiole au terme de 48 h de fermentation d'un mout constitué d'un blé abrasé liquéfié saccharifié (13% MS), par une des 4 souches lactiques testées, à savoir la souche Lactobacillus coryniformis ssp. torquens DSM 20004 (A), Lactobacillus coryniformis ssp. torquens 20005 (B), Lactobacillus mindensis LMG 21932 (C), ou Lactobacillus zeae LMG 17315 (D), inoculée à 107 UFC/ml dans l'exemple 3.
La Figure 5 représente l'impact de la souche utilisée pour la production du complément nutritionnel (CN) selon l'invention sur les rendements lactiques obtenus en fiole au terme des 72 h de fermentation d'un mout de blé liquéfié, saccharifié et additionné de la solution nutritive B, par L. coryniformis DSM 20004 inoculée à 1 x 107 UFC/ml dans l'exemple 5. Bandeau pointillé : zone de rendements obtenus avec un mout additionné de la solution G. La Figure 6 représente le positionnement de chaque complément nutritionnel (CN) testé dans l'exemple 5 en fonction des concentrations finales en FAN et acide lactique (après 72 h de fermentation d'un mout de blé liquéfié, saccharifié et additionné de la solution B, par L. coryniformis DSM 20004 inoculée à 1 x 107 UFC/ml). La courbe tracée correspond à la régression linéaire.
La Figure 7 représente le positionnement de chaque complément nutritionnel testé dans l'exemple 5 en fonction des coefficients FAN par kg de complément nutritionnel et des rendements lactiques obtenus après 72 h de fermentation d'un mout de blé liquéfié, saccharifié et additionné de la solution B, par L. coryniformis DSM 20004 inoculée à 1 x 107 UFC/ml. La courbe tracée correspond à la régression linéaire.
La Figure 8 représente l'impact du type de complément nutritionnel mis en œuvre sur les rendements lactiques obtenus en réacteur au terme des 50 h de fermentation d'un mout de blé liquéfié saccharifié additionné de la solution nutritive B, par L. coryniformis DSM 20004 ou DSM 20005 inoculée à 109 UFC/ml, dans l'exemple 6.
La Figure 9 représente la distribution relative des acides aminés libres (AAL) libérés par les compléments nutritionnels selon l'invention en fonction des genres et espèces des souches mises en œuvre dans l'exemple 6. Le profil AAL est déterminé après 72 h d'incubation à 30°C d'un mout blé liquéfié et saccharifié à 13% de MS, ajusté à pH 5,5, en présence d'azoture de sodium et d'un complément nutritionnel solubilisé et filtré à 0,2 μηι, incorporé à la dose de 5 kg/t de matière première glucidique renouvelable.
La Figure 10 représente le positionnement de chaque complément nutritionnel testé en fonction des concentrations finales en FAN ou AAL et acide lactique, après 50 h de fermentation d'un mout de blé liquéfié saccharifié additionné de la solution B, par la souche L. coryniformis DSM 20004 ou DSM 20005 inoculée à 109 UFC/ml, dans l'exemple 6.
La Figure 11 montre la comparaison d'enzymes commerciales (types, doses) et du complément nutritionnel (CN) selon l'invention sur les rendements lactiques obtenus en réacteur au terme des 48 h de fermentation d'un mout de blé liquéfié saccharifié additionné de la solution B, par L. coryniformis DSM 20005 inoculée à 109 UFC/ml, dans l'exemple 6.
La Figure 12 représente la distribution relative des acides aminés libres (AAL) libérés par les enzymes Fermgen, Prolyve BS concentrée et le complément nutritionnel selon l'invention produit avec la souche 029 sur tourteau de colza, dans l'exemple 6. Le profil AAL est déterminé après 72 h d'incubation à 37°C d'un mout blé liquéfié et saccharifié à 13% de MS, ajusté à pH 5,5, en présence d'azoture de sodium et d'un complément nutritionnel solubilisé et filtré à 0,2 μηι, incorporé à la dose de 5 kg/t de matière première glucidique renouvelable.
La Figure 13 représente l'impact du type de complément nutritionnel mis en œuvre en présence de solution nutritive (A ou B) sur la population de bactéries lactiques (traits discontinus) et la production d'acide lactique (traits continus) au cours des 50 h de fermentation d'un moût de blé liquéfié et saccharifié à 20% MS par L. coryniformis DSM 20005 inoculée à 109 UFC/ml, comme décrit dans l'exemple 7.
Exemples
Exemple 1 : Fabrication du complément nutritionnel Cet exemple décrit la production du complément nutritionnel utilisé dans le cadre de l'invention.
Le procédé de fabrication du complément nutritionnel par fermentation solide comporte les différentes étapes suivantes : les coproduits céréaliers (son de blé, tourteau de colza, ...) utilisés comme matière première sont conditionnés et prétraités. En parallèle, les moisissures ou bactéries qui seront utilisées pour la fermentation sont sporulées ou cultivées en vue de l'inoculation. Ces moisissures ou bactéries sont ensuite mises en contact avec les coproduits céréaliers prétraités dans une étape de fermentation en milieu solide. Le produit issu de la fermentation peut ensuite être ou non traité, par exemple être broyé ou être extrait.
Dans cet exemple, les inventeurs ont utilisé comme coproduit céréalier un tourteau de colza et comme moisissure une souche d'Aspergillus flavus.
Le milieu nutritif était ainsi constitué par un tourteau de colza en farine pré-humidifié à 60% de matière sèche et autoclavé pendant 35 min à 105°C. Après refroidissement, le milieu a été inoculé par une solution de spores d'Aspergillus flavus afin d'obtenir une concentration de 1 x 107 spores par gramme de matière sèche et une humidité initiale de 45%. Le pH a été ajusté à 4,9 par ajout d'acide sulfurique. Le milieu de culture ainsi obtenu a été réparti dans des fioles d'erlenmeyer à raison de 10 g de matière sèche par fiole. Les fioles d'erlenmeyer ont ensuite été incubées à 33°C en conditions aérobies à l'obscurité pendant 48 h sans agitation. L'humidité est restée comprise entre 40 et 60% au cours de la fermentation. Une aération a permis l'apport d'oxygène nécessaire à la fermentation et évité l'accumulation de dioxyde de carbone produit par la fermentation. La fermentation a été arrêtée à l'apparition des premières spores dans le milieu de culture.
Le mélange obtenu en fin de fermentation peut être séché et utilisé tel quel, c'est-à- dire sous forme brute, dans le process de fabrication de l'acide lactique ou être extrait dans du tampon acétate de sodium 0,1 M, (ratio 10% p/v complément nutritionnel/tampon) puis filtré à 0,2 μηι pour être ajouté sous forme liquide. Exemple 2: Effet du complément nutritionnel sur différentes matières premières utilisées pour produire de l'acide lactique
Cet exemple montre que le complément nutritionnel selon l'invention peut être utilisé avec de nombreuses matières premières glucidiques renouvelables pour fabriquer de l'acide lactique.
Les inventeurs ont étudié de façon comparative la quantité d'acide lactique produite au cours d'un procédé de production d'acide lactique mettant en œuvre une étape de saccharification-fermentation simultanée (SSF) de différentes matières premières renouvelables (blé, maïs, manioc, canne à sucre) en introduisant soit une solution nutritive exogène plus ou moins concentrée en éléments tels que les extraits de viande, de levure et de peptones de caséine, soit le complément nutritionnel obtenu dans l'exemple 1 .
Matériel et méthodes
Description générale du procédé de production d'acide lactique
Le procédé de production d'acide lactique mis en œuvre comporte les étapes suivantes: la matière première renouvelable (blé, maïs, ...) est conditionnée puis liquéfiée avant d'être soumise à une étape de pré-saccharification. En parallèle, la bactérie lactique utilisée pour la fermentation lactique est pré-fermentée dans un pré-fermenteur. Cette bactérie lactique est ensuite mise en contact avec la matière première dans une étape de SSF. L'acide lactique produit au cours de cette étape de SSF peut ensuite être extrait et purifié.
Conditionnement de la matière première
La matière première a été conditionnée de manière à obtenir une mouture. Pour le blé, le maïs et le manioc, une étape de broyage a permis d'obtenir une mouture, autrement dit une farine.
Pour le blé, les grains de blé abrasé ont été broyés à l'aide d'un broyeur à marteau (Electra). La taille de la grille utilisée a été fixée à 0,8 mm. La mouture obtenue présente un taux d'humidité de 10% (± 2%) et un profil granulométrique tel que représenté sur la Figure 2.
Selon ce même principe, des moutures de maïs ont été obtenues par broyage au marteau. Sous forme de farines, ces matières premières sont stockées à l'abri de la lumière dans un endroit sec à température ambiante. Etape de liquéfaction
L'étape de liquéfaction des moutures générées permet d'hydrolyser l'amidon en dextrines. Le principe est de mélanger la farine de blé (par exemple) avec de l'eau, de l'acide et des enzymes de liquéfaction, de manière à former un mout empâté liquéfié.
Le mout empâté a été préparé en incorporant la farine dans l'eau de manière à obtenir un mélange homogène présentant un taux de matière sèche de l'ordre de 20 à 30%. Ce mout ainsi constitué a été réparti en réacteur et mis sous agitation entre 250 et 350 rpm. La cinétique de température appliquée au mout de blé est présentée dans la Figure 1 .
Au début de la montée en température, le pH du mout a été ajusté à 5,4 (par ajout de H2S04) afin d'optimiser le travail des enzymes de liquéfaction ajoutées après atteinte de 55°C. Deux enzymes de liquéfaction ont été utilisées, l'une correspondant à une déviscosante (Lyvanol Devisco Plus® - LYVEN) ajoutée à 0,24 kg/t de matière sèche, l'autre correspondant à une alpha-amylase (Lyvanol Liquide Plus® - LYVEN) également ajoutée à 0,24 kg/t de matière sèche. Après 30 min de pré-liquéfaction à 55°C, le mout a été liquéfié à 85°C pendant 2 h dans un réacteur agité. Au terme de la liquéfaction, le mout a été refroidi à température ambiante. Les moûts de blé et de maïs présentaient alors un taux de matière sèche respectivement de 13 et 30%, un pH compris entre 5,5 et 6 et une viscosité de l'ordre de 50 mPa.s"1.
Etape de pré-saccharification
L'étape de pré-saccharification des moûts liquéfiés permet d'hydrolyser les dextrines en sucres fermentescibles (glucose, maltose, maltotriose). Une enzyme de type amylo-glucosidase (Lyvanol GA 480® - LYVEN) a été utilisée à 0,890 kg/t de matière sèche : les moûts liquéfiés de blé et de maïs ont été répartis en fioles bafflées de 250 ml agitées entre 250 et 350 rpm, contenant chacune 100 ml de mout, complétées en Lyvanol GA 480® à 0,890 kg/t de matière sèche et CaC03 (à 30 g/l de mout). Une solution nutritive exogène, riche en éléments azotés, ou le complément nutritionnel obtenu selon l'exemple 1 , ont en outre été ajoutés le cas échéant. Le pH a été ajusté à un pH acide (autour de 4,4 et 4,6) et les fioles ont été maintenues à une température de 50°C pendant 2 h.
Etape de propagation des bactéries lactiques
Au terme des 2 h de pré-saccharification, les moûts ont été ensemencés avec une bactérie lactique. La bactérie lactique utilisée est une bactérie du genre Lactobacillus, productrice d'acide D-lactique, la souche Lactobacillus coryniformis ssp. torquens DSM 20005. Cette souche a été introduite dans le milieu de saccharification-fermentation simultanée (SSF) après avoir été cultivée en milieu riche type bouillon Man, Rogosa et Sharpe (MRS). Cette étape de propagation permet un développement de la souche suffisant et nécessaire à l'inoculation du milieu de SSF à 108 UFC/ml de mout. Les conditions de propagation ont été les suivantes : agitation de 100 rpm, température fixée à 37°C et maintien du pH à 6 par ajout de NaOH.
Etape de saccharification-fermentation simultanée
L'étape de SSF consiste à mettre en présence un mout pré-saccharifié avec une bactérie lactique afin de produire le métabolisme d'intérêt : l'acide lactique.
Pour ce faire, les moûts ont été ensemencés avec 108 UFC de bactérie lactique obtenue à l'étape de propagation par ml de mout.
Le mout a été mis sous agitation à 100 rpm. La température a été maintenue constante au tout long de cette étape à 37°C. Le maintien du pH entre 5,5 et 6 a été assuré grâce à l'ajout initial de tampon carbonate de calcium. La fermentation a ainsi duré 48 h.
Moûts de fermentation
Les moûts de fermentation sont composés d'une des matières glucidiques renouvelables liquéfiées, ou saccharifiées ou les deux, additionnée d'une des solutions nutritives exogènes définies dans le tableau 2, ou du complément nutritionnel selon l'invention :
- Mout + A : matière glucidique renouvelable avec ajout de la solution A
- Mout + D : matière glucidique renouvelable avec ajout de la solution D
- Mout + E : matière glucidique renouvelable avec ajout de la solution E
- Mout + F : matière glucidique renouvelable avec ajout de la solution F
- Mout + G : matière glucidique renouvelable avec ajout de la solution G
- Mout + A + complément nutritionnel : matière glucidique renouvelable avec ajout de la solution A et du complément nutritionnel obtenu à partir d'un tourteau de colza (TC) fermenté par la souche d'Aspergillus flavus, suivant le procédé décrit dans l'exemple 1 .
Tableau 2 : Composition des solutions nutritives exogènes mises en œuvre dans l'exemple 2
Concentration en g/1 de mout
Solution A Solution D Solution E Solution F Solution G
Extrait de levure 0 1 ,25 2,5 3,75 5
Peptones de caséine 0 2,5 5 7,5 10
Extrait de viande 0 2,5 5 7,5 10 Concentration en g/1 de mout
Solution A Solution D Solution E Solution F Solution G
Potassium phosphate 0 0,5 1 1 ,5 2 dibasique
Acétate de sodium 0 1 ,25 2,5 3,75 5
Citrate d'ammonium 0 0,5 1 1 ,5 2
Sulfate de magnésium 0 0,05 0,1 0,15 0,2
Tween 0 0,25 0,5 0,75 1
Sulfate de manganèse 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05
Potentiel glucose des moûts : entre 100 et 150 g/l de mout (variable selon la matière première). Apport du complément nutritionnel dans le mout de fermentation compris entre 1 ,3 et 5 kg/t de matière première) ; pH initial des moûts : entre 5,5 et 6.
Résultats
Comme le montre la figure 3, la production d'acide lactique est améliorée par l'ajout de solutions nutritives exogènes plus ou moins concentrées en éléments azotés. Le gain de rendement est variable selon la matière glucidique renouvelable mise en œuvre.
Sur blé abrasé, le rendement maximal en fioles est atteint avec l'ajout de la solution
G (0,64 g/g de glucose), soit avec un apport en éléments azotés pour la souche lactique similaire à celui qu'elle peut avoir dans un bouillon de culture type MRS. Sur mélasses de canne à sucre, la souche lactique est incapable de produire de l'acide lactique sans ajout d'une solution nutritive riche en éléments azotés. Le rendement maximal en fioles de 0,4 g/g de glucose est obtenu avec un ajout de la solution F. Sur maïs, l'ajout de la solution D permet d'améliorer le rendement de production d'acide lactique en fioles d'un facteur 5 (0,28 g/g contre 0.05 g/g sur mout + A). L'ajout de solutions nutritives plus concentrées permet d'augmenter le rendement jusqu'à un maximum en fiole de 0.36 g/g. Enfin sur manioc, le rendement maximal en fioles peut être atteint avec l'ajout de la solution D (0,33 g/g de glucose), soit avec un apport en éléments azotés pour la souche lactique similaire à celui qu'elle pourrait avoir dans un bouillon de culture type MRS dilué au quart.
L'ajout du complément nutritionnel selon l'invention permet au même titre que les solutions nutritives, mais à moindres coûts, d'améliorer les rendements de production de l'acide lactique par la souche Lactobacillus coryniformis ssp. torquens DSM 20005. Son effet est également variable selon la matière glucidique renouvelable mise en œuvre.
Ainsi, sur le blé abrasé, le complément nutritionnel peut substituer totalement l'ajout de solutions nutritives dites coûteuses (ex : solution G) et garantir le maintien du rendement lactique. Sur les autres matières glucidiques renouvelables, le complément nutritionnel peut substituer en partie l'ajout de solutions nutritives. Sur mélasses de canne à sucre et maïs, le complément nutritionnel permet d'atteindre le même rendement qu'avec l'ajout de la solution D. En permettant une meilleure assimilation du potentiel azoté des matières glucidiques renouvelables par la souche, le complément peut substituer un apport coûteux en extrait de levure, d'extrait de viande et de peptones de 1 .25, 2.5 et 2.5 g/l respectivement. Sur manioc, le complément nutritionnel permet d'améliorer le rendement lactique de 30% par rapport au mout seul.
Exemple 3: Effet du complément nutritionnel sur différentes souches de bactéries lactiques utilisées pour produire de l'acide lactique
Cet exemple montre que le complément nutritionnel peut être utilisé avec différents types de bactéries lactiques conventionnellement utilisées pour produire de l'acide lactique.
Les inventeurs ont étudié de façon comparative la quantité d'acide lactique produite au cours de la SSF de mout de blé par différentes souches de bactéries lactiques, productrices de D- et/ou de L-lactate, en introduisant soit une solution nutritive exogène plus ou moins concentrée en éléments tels que les extraits de viande, de levure et de peptones de caséine, soit le complément nutritionnel obtenu dans l'exemple 1 , soit un mélange des deux.
Matériel et méthodes
Dans ces essais, les inventeurs ont réalisé au préalable une liquéfaction de mout de blé abrasé, pendant 2 heures à 85°C dans un réacteur agité présentant un taux de matière sèche final de 13%.
Le mout liquéfié de blé a été réparti en fioles bafflées de 250 ml agitées, contenant chacune 100 ml de moût, complétées en Lyvanol GA 480® (amyloglucosidase à 0.890 kg/t de matière sèche), et CaC03 (à 30 g/l de mout).
Moûts de fermentation
Les moûts de fermentation sont composés de blé abrasé liquéfié, additionnés d'une des solutions nutritives exogènes définies dans le tableau 3 ou du complément nutritionnel selon l'invention, ou les deux :
- Mout + A : blé abrasé liquéfié avec ajout de la solution A
- Mout + C : blé abrasé liquéfié avec ajout de la solution C
- Mout + D : blé abrasé liquéfié avec ajout de la solution D
- Mout + E : blé abrasé liquéfié avec ajout de la solution E
- Mout + G : blé abrasé liquéfié avec ajout de la solution G - Mout + A + complément nutritionnel : blé abrasé liquéfié avec ajout de la solution A et du complément nutritionnel obtenu à partir de tourteau de colza (TC) fermenté par la souche d'Aspergillus flavus, suivant le procédé décrit dans l'exemple 1
- Mout + B + complément nutritionnel : blé abrasé liquéfié avec ajout de la solution B et du complément nutritionnel obtenu à partir de tourteau de colza (TC) fermenté par la souche d'Aspergillus flavus, suivant le procédé décrit dans l'exemple 1 .
Tableau 3 : Composition des solutions nutritives exogènes mises en œuvre dans l'exemple 3
Figure imgf000030_0001
L'apport du complément nutritionnel est de 5 kg/t de matière première.
pH initial du mout : entre 5,5 et 6.
Les fioles ainsi constituées ont été incubées à 50°C pendant 2 h. Ces dernières présentent un potentiel glucose de 100 g/l de mout. Au terme de ces 2 h de pré- saccharification, les moûts ont été ensemencés avec 107 UFC de bactérie lactique par ml de mout. Les souches bactériennes utilisées dans cet exemple sont :
Lactobacillus mindensis LMG 21932 (productrice L&D-lactate)
Lactobacillus zeae LMG 17315 (productrice L-lactate)
Lactobacillus coryniformis ssp. torquens DSM 20004 (productrice D-lactate)
- Lactobacillus coryniformis ssp. torquens DSM 20005 (productrice D-lactate)
La fermentation a été conduite pendant 48 h à 37°C sous agitation (100 rpm). Résultats
Comme le montre la figure 4, la production d'acide lactique est améliorée par l'ajout du complément nutritionnel, et ce quelle que soit la souche mise en œuvre.
Les rendements lactiques obtenus avec les souches Lactobacillus coryniformis ssp. torquens DSM 20004 et DSM 20005, inoculées initialement à 1 χ 1 07 UFC/ml dans le mout de fermentation (condition mout + A), ne dépassent pas les 5%. Par l'ajout du complément nutritionnel à 5 kg/t de blé, l'accessibilité à la source azotée intrinsèque à la matière première mise en œuvre est améliorée, ce qui permet d'augmenter les rendements lactiques. Ainsi, les rendements en fioles atteignent les 55% avec la souche DSM 20004, 45% avec la souche DSM 20005. Comparés aux rendements obtenus avec l'ajout de solutions nutritives (solutions C, G), le complément nutritionnel peut, en partie ou totalement, se substituer à ces intrants coûteux (dont extraits de levure, peptones, extraits de viande, ...). Pour la souche DSM 20005, le rendement lactique obtenu avec ajout de la solution nutritive la plus riche en éléments azotés (solution G) peut être dépassé en associant le complément nutritionnel à une solution nutritive dont la concentration en éléments azotés est réduite de 95% (solution B). Ainsi, les quantités et donc les coûts d'intrants peuvent être réduits par la mise en œuvre du complément nutritionnel.
Pour les souches Lactobacillus mindensis LMG 21 932 et Lactobacillus zeae LMG 17315, les rendements lactiques après 48h de fermentation sur mout liquéfié saccharifié de blé abrasé sont plutôt faibles avec 6.6% et 17% respectivement. L'ajout de solutions nutritives riches en éléments azotés permet d'améliorer ces rendements (ici solutions C, D et E). Pour atteindre les 50% de rendement en fioles, il faut apporter une source azotée correspondant à la solution D pour la souche LMG 21 932, correspondant à la solution C pour la souche LMG 1731 5. De par son action sur la matière première mise en œuvre, l'ajout du complément nutritionnel permet de réduire l'apport nutritif exogène nécessaire à la souche tout en maintenant les rendements à 50%. En combinaison avec le complément nutritionnel, l'ajout d'une source azotée moins coûteuse, correspondant dans cet exemple à la solution B, peut alors suffire pour répondre aux besoins des souches lactiques. Exemple 4: Effet du complément nutritionnel en conduite de procédé de production d'acide lactique en réacteur type batch
Cet exemple montre que le complément nutritionnel peut être utilisé de manière efficace en conduite de procédé de production d'acide lactique à différentes échelles.
Les inventeurs ont étudié de façon comparative la quantité d'acide lactique produite au cours de la SSF de mout de blé par la souche L. coryniformis DSM 20004, en introduisant soit une solution nutritive exogène concentrée en éléments tels que les extraits de viande, de levure et de peptones de caséine, soit le complément nutritionnel obtenu dans l'exemple 1 , et en faisant varier la conduite de fermentation, à savoir soit une conduite de fermentation en fiole pour laquelle le contrôle du pH n'est pas optimal, soit une conduite en réacteur type batch avec maintien du pH en continu.
Matériel et méthodes
Dans ces essais, les inventeurs ont réalisé au préalable une liquéfaction de mout de blé abrasé, pendant 2 h à 85°C dans un réacteur agité présentant un taux de matière sèche final de 13% pour la condition fiole, de 20% pour la condition réacteur de type batch.
Le mout liquéfié de blé 13% de matière sèche (MS) a été réparti en fioles bafflées de 250 ml agitées, contenant chacune 100 ml de moût, complétées en Lyvanol GA 480® (amyloglucosidase à 0.890 kg/t de matière sèche) et CaC03 (à 30 g/l de mout).
Le mout liquéfié de blé 20% MS a été réparti en réacteurs, contenant chacun 3000 ml de moût, complétés en Lyvanol GA 480® (amyloglucosidase à 0.890 Kg/t de MS) et mis sous contrôle du pH par l'ajout d'acide sulfurique 5 N et de soude 7 N pour une consigne de maintien du pH à 6 tout le long de la fermentation.
Moûts de fermentation
Les moûts de fermentation sont composés de blé abrasé liquéfié, additionnés d'une des solutions nutritives exogènes définies dans le tableau 4 ou du complément nutritionnel selon l'invention :
- Mout + G : blé abrasé liquéfié avec ajout de la solution G
- Mout + A + complément nutritionnel : blé abrasé liquéfié avec ajout de la solution A et du complément nutritionnel obtenu à partir de tourteau de colza (TC) fermenté par la souche d'Aspergillus flavus, suivant le procédé décrit dans l'exemple 1 , pour une concentration à 5 kg/t de blé. Tableau 4 : Composition des solutions nutritives exogènes mises en œuvre dans l'exemple 4
Figure imgf000033_0001
pH initial du mout : entre 5,5 et 6.
Les fioles ainsi constituées ont été incubées à 50°C pendant 2 h. Ces dernières présentent un potentiel glucose de 100 g/l de mout. Au terme de ces 2 h de pré- saccharification, les moûts ont été ensemencés avec au moins 108 UFC de bactérie lactique par ml de mout. La souche bactérienne utilisée dans cet exemple est Lactobacillus coryniformis ssp. torquens DSM 20004. La fermentation a été conduite pendant 48 h à 37°C sous agitation (100 rpm).
En réacteur, la pré-saccharification a été effectuée à 60°C pendant 1 h. Le potentiel glucose est de 135-145 g/l de mout. Les moûts ont été ensemencés avec au moins 108 UFC de bactérie lactique par ml de mout. La souche bactérienne utilisée dans cet exemple est Lactobacillus coryniformis ssp. torquens DSM 20004. La fermentation a été conduite pendant 48 h à 30°C sous agitation (300 rpm).
Résultats
Comme le montre le tableau 5, le changement d'échelle (scale-up) de la fiole au réacteur type batch permet d'améliorer les performances de la souche : la meilleure maîtrise des paramètres de fermentation (température/agitation) ainsi que la régulation du pH en continu permettent d'augmenter les rendements de production de l'acide lactique par la souche L. coryniformis DSM 20004, quelle que soit l'origine de la source en éléments azotés disponibles pour la souche (exogène avec la solution nutritive G ou intrinsèque sous l'action du complément nutritionnel). Le gain de rendement observé en scale-up pour la condition mout additionné de la solution nutritive G est de 18% (amélioration du rendement de 78.8% à 93.4%). Ce gain est de 71 % pour la condition mout additionné du complément nutritionnel. Tableau 5 : Rendements lactiques obtenus en fiole et en réacteur type batch au terme de
48h de fermentation d'un mout liquéfié saccharifié de blé abrasé, par Lactobacillus coryniformis DSM 20004 inoculé à 1 χ 108 UFC/ml
Figure imgf000034_0001
Le changement d'échelle, via une meilleure maîtrise des paramètres de saccharification et fermentation, permet d'amplifier l'impact du complément nutritionnel sur le rendement lactique.
Exemple 5: Effet de compléments nutritionnels produits avec différents substrats et différentes moisissures et bactéries
Cet exemple montre que le complément nutritionnel peut être obtenu au moyen de différents substrats et différentes moisissures et bactéries. Les inventeurs ont étudié de façon comparative la quantité d'acide lactique produite au cours de la SSF de mout de blé par la souche L. coryniformis DSM 20004, en introduisant soit une solution nutritive exogène concentrée en éléments tels que les extraits de viande, de levure et de peptones de caséine, soit le complément nutritionnel selon l'invention, en faisant varier la souche et le substrat utilisés pour la fabrication du complément nutritionnel.
Matériel et méthodes
Dans ces essais, les inventeurs ont réalisé au préalable une liquéfaction de mout de blé abrasé, pendant 2 h à 85°C dans un réacteur agité présentant un taux de matière sèche (MS) final de 13%.
Le mout liquéfié de blé a été réparti en fioles bafflées de 250 ml agitées, contenant chacune 100 ml de moût, complétées en Lyvanol GA 480® (amyloglucosidase à 0,890 kg/t de MS) et CaC03 (à 30 g/l de mout). Moûts de fermentation
Les moûts de fermentation sont composés de blé abrasé liquéfié additionné de la solution nutritive B avec ou sans ajout d'un des compléments nutritionnels selon l'invention listés dans le tableau 6.
Tableau 6 : Liste des différents compléments nutritionnels (CN) mis en œuvre en
fermentation à valeur de 5 kg/t de blé
Souche Substrat
Genre, espèce Codification
CN 1 Aspergillus flavus 0248 Tourteau de Colza
CN 2 Aspergillus flavus 029 Tourteau de Colza
CN 3 Aspergillus flavus 046 Son de blé et radicelles d'orge CN 4 Aspergillus oryzae 030 Tourteau de Colza
CN 5 Aspergillus oryzae 044 Tourteau de Colza
CN 6 Aspergillus oryzae CL228 Tourteau de Colza
CN 7 Aspergillus niger 043 Tourteau de Colza
Aspergillus 027
CN 8 Drèche soluble éthanolière de blé tubigensis
CN 9 Bacillus subtilis CL260 Son de blé
CN 10 Bacillus licheniformis OB62 Tourteau de Colza pH initial du mout : entre 5,5 et 6.
La souche a" Aspergillus oryzae 044 est la souche ô'Aspergillus oryzae ATCC 12892.
Les fioles ainsi constituées ont été incubées à 50°C pendant 2 h. Ces dernières présentent un potentiel glucose de 100 g/l de mout. Au terme de ces 2 h de pré- saccharification, les moûts ont été ensemencés avec 107 UFC de bactérie lactique par ml de mout. La souche bactérienne utilisée dans cet exemple est Lactobacillus coryniformis ssp. torquens DSM 20004. La fermentation a été conduite pendant 72 h à 30°C sous agitation (100 rpm).
Résultats
La figure 5 illustre le fait que des compléments nutritionnels produits par fermentation en milieu solide (FMS) à partir de différents substrats et différentes souches permettent d'accroître le rendement lactique d'une fermentation en milieu liquide par une souche du genre Lactobacillus par rapport à la condition Mout + solution B.
Les compléments nutritionnels obtenus par FMS permettent d'augmenter le rendement lactique de la fermentation d'un facteur 1 ,6 à 2 par rapport au simple ajout d'une solution nutritive B (correspondant entre-autres à un ajout en extrait de levure de 0.25 g/l de mout, en extrait de viande de 0.5 g/l de mout et en peptones de 0.5 g/l de mout). Ce résultat démontre qu'il est possible de produire des compléments nutritionnels efficaces pour la production d'acide lactique à partir de différents types de microorganismes, des bactéries sporulantes telles que Bacillus sp. ou encore des champignons tels qu'Aspergillus sp.
Par ailleurs, comme le montre la figure 6, les concentrations en FAN (Free Amino Nitrogen) présents en fin de fermentation dans les moûts, représentatives de l'azote soluble (acides aminés et petits peptides), peuvent être reliées à celles de l'acide lactique produit. D'après la régression linéaire tracée avec l'ensemble des compléments nutritionnels produits par FMS testés ici, l'augmentation de la production d'acide lactique, rendue possible par l'action des compléments nutritionnels, est liée à l'amélioration de la disponibilité de la source azotée intrinsèque au mout de fermentation pour la bactérie lactique (r2 = 88,5%).
Les performances des compléments nutritionnels en saccharification-fermentation simultanée (SSF) peuvent donc être reliées à leur capacité à libérer de l'azote soluble dans le milieu de fermentation. Ainsi, la figure 7 montre le lien qui existe entre la capacité du complément nutritionnel à libérer des FAN dans le mout de fermentation (en absence de la souche lactique), autrement appelé coefficient FAN (déterminé après 24 h d'incubation à 35°C d'un mout de blé liquéfié et saccharifié à 13% de MS, ajusté à pH 5,5, en présence d'azoture de sodium, pour une incorporation de complément nutritionnel solubilisé et filtré à 0,2 μηι de 5 kg/t de matière première), et les rendements lactiques obtenus en SSF avec la souche L. coryniformis DSM 20004 sous l'action du même complément nutritionnel (r2 = 70,5%).
En analysant les performances des compléments nutritionnels testés (figure 7), les inventeurs ont pu former trois groupes distincts, dans les conditions testées : un premier groupe représenté par le cercle en tirets comprenant les 4 compléments nutritionnels aux performances les plus basales, un deuxième groupe représenté par le cercle en pointillés constitué de 4 compléments nutritionnels aux performances plus avantageuses, et un troisième groupe représenté par le cercle en trait plein avec les 2 compléments nutritionnels les plus performants. Le groupe « trait plein » est constitué de 2 des 3 souches d'Aspergillus flavus, le groupe « pointillés » est constitué des souches d'Aspergillus oryzae, et le groupe « tirets » comprend les souches d'Aspergillus niger et A. tubigensis, deux espèces proches, ainsi que les deux souches de Bacillus sp. Dans cet exemple, les souches d'Aspergillus flavus 029 et 046 testées sont les deux souches les plus performantes pour répondre aux besoins azotés de la souche lactique mise en œuvre en saccharification-fermentation simultanée. Exemple 6: Avantages spécifiques de certains compléments nutritionnels
Cet exemple montre que l'utilisation de certaines souches de moisissures ou bactéries pour la fabrication du complément nutritionnel peut être particulièrement avantageuse pour la production d'acide lactique par certaines souches de bactéries lactiques.
Les inventeurs ont étudié de façon comparative la quantité d'acide lactique produite au cours de la saccharification-fermentation simultanée de mout de blé par les souches L coryniformis DSM 20004 ou L. coryniformis DSM 20005, en introduisant soit une solution de protéase de concentration variable, soit le complément nutritionnel selon l'invention en faisant varier la souche utilisée pour la fermentation en milieu solide. Au regard des profils d'acides aminés libérés et des concentrations en azote solubles en fin de fermentation, les inventeurs ont évalué les avantages spécifiques que pouvait conférer le complément nutritionnel pour différentes souches de bactéries lactiques, en réponse à leurs besoins nutritionnels, en les comparant à des protéases commerciales.
Matériel et méthodes
Dans ces essais, les inventeurs ont réalisé au préalable une liquéfaction de mout de blé abrasé, pendant 2 h à 85°C dans un réacteur agité présentant un taux de matière sèche final de 20%. Ce mout liquéfié a été réparti en réacteurs, contenant chacun 3000 ml de moût, complétés en Lyvanol GA 480 (amyloglucosidase à 0,890 kg/t de matière sèche), et mis sous contrôle du pH par l'ajout d'acide sulfurique 5 N et de soude 7 N pour une consigne de maintien du pH à 6 tout le long de la fermentation. Ainsi, les moûts de fermentation étaient composés de blé abrasé liquéfié, saccharifié, additionné de la solution nutritive B avec l'ajout soit d'un des compléments nutritionnels selon l'invention listés dans les tableaux 7 et 8, soit d'une des solutions de protéases commerciales listées dans le tableau 8.
Tableau 7 : Conditions de fermentation pour l'essai 1
Réacteur Complément nutritionnel Bactérie lactique
Type Souche Concentration (kg/t blé) Souche
R1 CN A. flavus 029 20.0 DSM 20004
R2 CN 8. subtilis CL260 20.0 DSM 20004
R3 CN A. flavus 046 20.0 DSM 20004
R4 CN A. orizae 044 20.0 DSM 20004
R5 CN A. flavus 029 20.0 DSM 20005
R6 CN 8. subtilis CL260 20.0 DSM 20005
R7 CN A. flavus 046 20.0 DSM 20005
R8 CN A. orizae 044 20.0 DSM 20005 CN : complément nutritionnel obtenu par le procédé décrit dans l'exemple 1 en utilisant la souche de moisissure ou de bactérie mentionnée dans le tableau
Tableau 8 : Conditions de fermentation pour l'essai 2
Figure imgf000038_0001
2 protéase commercialisée par Lyven
CN : complément nutritionnel obtenu par le procédé décrit dans l'exemple 1 en utilisant la souche de moisissure ou de bactérie mentionnée dans le tableau
Les CN ont pu être testés en excès (20 kg/t de blé) dans l'essai 1 pour une meilleure détermination des profils en acides aminés. Différentes concentrations de protéases commerciales ont pu être testées dans l'essai 2 pour une meilleure évaluation de leur potentiel et comparaison avec le complément nutritionnel.
Après 1 h30 de pré-saccharification à 60°C, les moûts présentent un potentiel glucose de 150 g/l. Ces derniers ont été ensemencés avec 109 UFC de bactérie lactique par ml de mout. Les souches bactériennes utilisées dans les essais 1 et 2 sont Lactobacillus coryniformis ssp. torquens DSM 20004 et DSM 20005. La fermentation a été conduite pendant 50 h à 30°C sous agitation (300 rpm) et maintien du pH à 6 par ajout de soude 7 N.
Résultats
Essai 1
La figure 8 montre que les 4 compléments nutritionnels selon l'invention peuvent répondre de manière optimale et analogue aux besoins des deux souches lactiques en fermentation (lorsque ces dernières présentent les mêmes rendements, comme par exemple pour les compléments nutritionnels obtenus avec les souches 029 ou 046), mais aussi répondre de manière particulièrement plus avantageuse aux besoins de l'une ou l'autre des souches lactiques. Par exemple le complément nutritionnel obtenu avec la souche CL260 permet un rendement lactique plus élevé avec la souche de bactérie lactique DSM 20005 ; le complément nutritionnel obtenu avec la souche 044 permet un rendement lactique plus élevé avec la souche de bactérie lactique DSM 20004.
La Figure 9 montre par ailleurs que selon le type de souche utilisé pour la fabrication du complément nutritionnel, le profil d'acides aminés libres (AAL) libérés par ce dernier dans le mout de fermentation peut être différent et donc répondre de façon spécifique particulièrement avantageuse aux besoins des souches lactiques mises en œuvre dans le procédé de production de l'acide lactique.
Ainsi, le profil des AAL pour le type A niger traduit une libération d'AAL très diversifiés, principalement de la glutamine (13% des AAL libérés), mais également de l'Alanine, Glycine, Leucine, Valine, etc., dans des proportions comprises entre 2 et 5% des AAL. Au regard des résultats présentés dans la Figure 8, ce type de profil semble convenir de manière intéressante aux deux souches lactiques testées puisque les deux compléments nutritionnels 029 et 046 (souches d'A flavus, espèce proche d'A niger) présentent des performances similaires sur la production d'acide lactique en saccharification-fermentation simultanée.
Le profil des AAL pour le type A oryzae traduit également une grande diversité des AAL libérés dans le mout de fermentation, la glutamine en majorité (plus de 20% des AAL), de la Tyrosine (6%), Proline, Leucine, etc. En fermentation, ce profil retrouvé avec le complément nutritionnel obtenu avec la souche 044 semble répondre de manière particulièrement avantageuse aux besoins de la souche lactique DSM 20004.
Enfin, le profil des AAL pour le type Bacillus subtilis traduit une libération d'AAL moins diversifiés, principalement de la Tyrosine (+ de 20% des AAL), Acide aspartique, Méthionine, Glutamine et Asparagine dans des proportions inférieures à 10% des AAL libérés. En fermentation, ce profil retrouvé avec le complément nutritionnel obtenu avec la souche CL260 semble répondre de manière particulièrement avantageuse aux besoins de la souche lactique DSM 20005.
La diversité des profils des AAL libérés dans les substrats de fermentation par les différents types de compléments nutritionnels est un avantage pour la fermentation car elle permet d'apporter aux différentes souches lactiques, potentiellement mises en œuvre pour la fabrication d'acide lactique, de la source azotée assimilable correspondant plus spécifiquement à leurs besoins nutritionnels.
Par ailleurs, en considérant à la fois les concentrations finales en acide lactique et en FAN dans le mout de fermentation (figure 10), les inventeurs ont pu montrer que, selon la souche lactique mise en œuvre pour la production d'acide lactique par saccharification- fermentation simultanée, les compléments nutritionnels obtenus avec certaines souches de moisissure ou de bactéries se révélaient particulièrement avantageux, aussi bien du point de vue de la capacité du complément nutritionnel à libérer des FAN dans le milieu qu'à favoriser la production d'acide lactique.
Par exemple avec le complément nutritionnel obtenu avec la souche 029, pour une même concentration d'acide lactique obtenue avec la souche lactique DSM 20004 et DSM 20005, il y a moins de FAN libérés dans le mout en fin de fermentation avec la souche lactique DSM 20004. Par conséquent, l'utilisation spécifique du complément nutritionnel obtenu avec la souche 029 dans la production d'acide lactique par la souche lactique DSM 20004 présente un avantage supplémentaire.
Comme la présence de FAN en fin de fermentation peut poser des problèmes sur les étapes en aval du procédé de fabrication de l'acide lactique, à savoir l'extraction et la purification de l'acide lactique, un complément nutritionnel permettant de limiter la présence de FAN en fin de fermentation présente donc un avantage supplémentaire, pour un même effet sur la production d'acide lactique.
Dans l'exemple avec la souche L. coryniformis DSM 20004, le complément nutritionnel produit avec la souche 044 a donc un avantage supplémentaire par rapport au complément nutritionnel produit avec la souche 029. De même avec la souche L. coryniformis DSM 20005, le complément nutritionnel produit avec la souche CL260 présente un avantage supplémentaire par rapport au complément nutritionnel produit avec la souche 044 à FAN équivalent.
Essai 2
Comme le montre la figure 1 1 , les performances du complément nutritionnel ajouté à 5 kg/t de matière première renouvelable sur la production d'acide lactique par saccharification-fermentation simultanée sont supérieures à celles des deux protéases commerciales testées ici. On peut noter l'effet saturant de la protéase Prolyve BS conc qui, ajoutée à plus de 600 g/t de matière première renouvelable, ne permet plus d'améliorer le rendement lactique.
La figure 12 présente le profil des AAL libérés dans le mout de fermentation sous l'action du complément nutritionnel produit avec la souche 029 ou sous l'action de chacune des deux protéases commerciales Prolyve BS conc. (commercialisée par Lyven) et Fermgen (commercialisée par Genencor International). Les inventeurs ont observé que la diversité des AAL libérés en présence du complément nutritionnel selon l'invention est plus importante qu'avec les protéases commerciales. Pour le complément nutritionnel, on observe la libération de 19 acides aminés différents, dont la Glutamine en plus forte proportion, la Proline et la Leucine autour des 5% des AAL libérés. Sous l'action de la protéase Fermgen, le profil des AAL libérés dans le milieu se restreint à 8 acides aminés dont la Glutamine et l'acide aspartique. Pour la protéase Prolyve BS conc, le profil des AAL libérés est plutôt diversifié avec 16 acides aminés différents mais dans des proportions autres que celles retrouvées avec le complément nutritionnel. Avec la protéase Prolyve BS conc, sont principalement retrouvées la Tyrosine et la Méthionine.
L'avantage de l'ajout d'un complément nutritionnel selon l'invention par rapport à des protéases commerciales dans le procédé de fabrication de l'acide lactique peut ainsi être relié à la diversité des AAL (qualité et quantité relative) potentiellement libérés dans le substrat de fermentation, ce qui permet l'apport d'une source azotée assimilable répondant plus spécifiquement aux besoins nutritionnels des souches lactiques mises en œuvre en fermentation.
Exemple 7: Effet du complément nutritionnel sur la croissance bactérienne
Cet exemple démontre que l'effet du complément nutritionnel sur l'augmentation de la production ou du rendement de production d'acide lactique n'est pas lié à une augmentation de la population bactérienne dans le mout de fermentation.
Les inventeurs ont étudié de façon comparative la quantité d'acide lactique produite au cours de la saccharification-fermentation simultanée de mout de blé par les souches L coryniformis DSM 20004 ou L. coryniformis DSM 20005, en introduisant le complément nutritionnel selon l'invention en faisant varier la souche utilisée pour la production du complément nutritionnel, additionnée d'une des deux solutions nutritives A ou B définies ci- dessus. Au regard des concentrations et rendements en acide lactique et des concentrations en bactéries lactiques, ils ont évalué la spécificité des effets des compléments nutritionnels.
Matériel et méthodes
Dans cet essai, les inventeurs ont réalisé au préalable une liquéfaction de mout de blé abrasé, pendant 2 heures à 85°C dans un réacteur agité présentant un taux de matière sèche final de 20%. Ce mout liquéfié a été réparti en réacteurs, contenant chacun 3000 ml de moût, complétés en Lyvanol GA 480® (amyloglucosidase à 0.890 kg/t MS), et mis sous contrôle du pH par l'ajout d'acide sulfurique 5N et de soude 7N pour une consigne de maintien du pH à 6 tout le long de la fermentation. Les conditions de fermentation sont respectivement présentées dans le tableau 9, les compléments nutritionnels ayant été préparés comme dans l'exemple 5. Tableau 9 : Conditions de fermentation de l'exemple 7
Figure imgf000042_0001
Après 1 ,5 h de pré-saccharification à 60°C, les moûts présentent un potentiel glucose de 150 g/l. Ces derniers sont ensemencés avec 109 UFC de bactérie lactique par ml de mout. Les souches bactériennes utilisées dans cet essai sont Lactobacillus coryniformis ssp. torquens DSM 20004 et DSM 20005. La fermentation a été conduite pendant 50 h à 30°C sous agitation (300 rpm) et maintien du pH à 6 par ajout de soude 7N.
La population bactérienne a été déterminée en cours de fermentation par la réalisation de comptage sur cellule de Thoma.
Résultats
Les dynamiques de croissance bactérienne et de production d'acide lactique sont illustrées dans la figure 13 au travers de résultats obtenus avec la souche DSM 20005, respectivement en pointillés et en traits pleins. L'évolution de la population bactérienne, inoculée initialement à 109 UFC/ml, au cours de la saccharification-fermentation simultanée (SSF) est similaire quels que soient les compléments nutritionnels mis en œuvre, en combinaison ou non avec une source d'azote exogène (ici apportée par la solution B en combinaison avec le CN 029 TC).
Après 24 h de SSF, la population bactérienne se stabilise autour de 1010 bactéries/ml de mout. Au terme des 50 h de fermentation, les concentrations en bactéries dans les moûts sont très proches pour toutes les conditions testées. Si les conditions d'ajout de complément nutritionnel et de solutions nutritives exogènes n'impactent pas la dynamique de population bactérienne, en revanche, elles impactent les capacités des bactéries lactiques à produire de l'acide lactique.
Comme le montre la Figure 13, la production d'acide lactique par la bactérie lactique
DSM 20005 est favorisée par la mise en œuvre du complément nutritionnel obtenu avec la souche CL260 ou encore par le complément nutritionnel obtenu avec la souche 029 associé à la solution B. Il en est de même avec la bactérie lactique DSM 20004 : la production d'acide lactique est plus importante par la mise en œuvre du complément nutritionnel obtenu avec la souche 029 par rapport au complément nutritionnel obtenu avec la souche 0248, sans que ce gain ne soit relié à une augmentation de la population de bactéries lactiques (tableau 10).
Tableau 10 : Impact du type de complément nutritionnel mis en œuvre en combinaison de solutions nutritives sur la bactérie lactique L. coryniformis DSM 20004 au terme des 50 h de fermentation d'un mout de blé liquéfié et saccharifié à 20% MS.
Figure imgf000043_0001
Ainsi, l'effet avantageux de l'ajout d'un complément nutritionnel selon l'invention dans le procédé de fabrication d'acide lactique ne peut pas être relié à une simple augmentation de la biomasse lactique mais bien à une amélioration des capacités de production de l'acide lactique par les souches lactiques mises en œuvre en fermentation.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un complément nutritionnel, sous forme brute ou extraite, issu d'une fermentation en milieu solide avec une moisissure ou une bactérie, pour la fabrication, par fermentation, d'acide lactique par une bactérie lactique.
2. Utilisation d'un complément nutritionnel, sous forme brute ou extraite, issu d'une fermentation en milieu solide avec une moisissure ou une bactérie, pour libérer, dans un milieu de fermentation en acide lactique d'une matière première glucidique renouvelable, l'azote de ladite matière première, au cours de la fabrication, par fermentation, d'acide lactique par une bactérie lactique à partir de ladite matière première.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle ladite moisissure ou bactérie est sélectionnée dans le groupe constitué des moisissures du genre Aspergillus et des bactéries du genre Bacillus.
4. Utilisation selon la revendication 3, dans laquelle ladite moisissure ou bactérie est sélectionnée dans le groupe constitué des souches d' 'Aspergillus flavus, des souches d' 'Aspergillus oryzae, des souches d' 'Aspergillus niger, des souches d' Aspergillus tubingensis, et des souches de Bacillus sp.
5. Procédé de fabrication d'acide lactique à partir d'une matière première glucidique renouvelable, comprenant une étape de fermentation de la matière première glucidique renouvelable par une bactérie lactique en présence d'un complément nutritionnel, sous forme brute ou extraite, issu d'une fermentation en milieu solide avec une moisissure ou une bactérie.
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel l'étape de fermentation est une étape de saccharification-fermentation simultanée.
7. Procédé selon la revendication 5 ou 6, dans lequel la bactérie lactique est sélectionnée dans le groupe consistant en les espèces L. mindensis, L. zeae et L. coryniformis.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, dans lequel l'étape de fermentation est mise en œuvre en présence d'une source d'azote organique issue de la matière première glucidique renouvelable et, éventuellement de solutions nutritives exogènes.
9. Composition comprenant (i) une source d'azote organique sélectionnée dans le groupe constitué des matières premières glucidiques renouvelables, des solutions nutritives exogènes, et des mélanges de celles-ci et (ii) un complément nutritionnel, sous forme brute ou extraite, issu d'une fermentation en milieu solide avec une moisissure ou une bactérie.
10. Kit comprenant :
(i) une source d'azote organique sélectionnée dans le groupe constitué des matières premières glucidiques renouvelables, des solutions nutritives exogènes, et des mélanges de ceux-ci, et
(ii) un complément nutritionnel, sous forme brute ou extraite, issu d'une fermentation en milieu solide avec une moisissure ou une bactérie.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109294940A (zh) * 2018-09-04 2019-02-01 湖南肯基因科技有限公司 玉米乳杆菌诱变菌及高产乳酸的用途

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5464760A (en) * 1990-04-04 1995-11-07 University Of Chicago Fermentation and recovery process for lactic acid production
EP1205557A1 (fr) 2000-11-09 2002-05-15 Roquette FrÀ¨res Procédé de préparation d'un milieu de fermentation à partir d'une matière première renouvelable
EP1308505A2 (fr) * 2001-10-30 2003-05-07 Roquette FrÀ¨res Procédé de préparation d'un milieu de fermentation autosuffisant
US20040203122A1 (en) 2003-01-13 2004-10-14 Purac Biochem Bv Preparation of lactic acid from a pentose-containing substrate
EP1953234A1 (fr) 2007-01-31 2008-08-06 Galactic S.A. Procédé de production d'acide lactique par fermentation d'un milieu autosuffisant à base de jus vert de canne
WO2011098843A2 (fr) 2010-02-10 2011-08-18 Sveučilište u Zagrebu Production d'acide lactique à partir de matières à base d'amidon par des bactéries lactiques amylolytiques
CN102424831A (zh) * 2011-12-16 2012-04-25 天津北洋百川生物技术有限公司 一种利用餐厨垃圾生产乳酸的方法
EP1996695B1 (fr) * 2006-03-17 2013-10-30 Etablissements J. Soufflet Complement nutritionnel pour milieu de fermentation alcoolique

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5464760A (en) * 1990-04-04 1995-11-07 University Of Chicago Fermentation and recovery process for lactic acid production
EP1205557A1 (fr) 2000-11-09 2002-05-15 Roquette FrÀ¨res Procédé de préparation d'un milieu de fermentation à partir d'une matière première renouvelable
EP1308505A2 (fr) * 2001-10-30 2003-05-07 Roquette FrÀ¨res Procédé de préparation d'un milieu de fermentation autosuffisant
US20040203122A1 (en) 2003-01-13 2004-10-14 Purac Biochem Bv Preparation of lactic acid from a pentose-containing substrate
EP1996695B1 (fr) * 2006-03-17 2013-10-30 Etablissements J. Soufflet Complement nutritionnel pour milieu de fermentation alcoolique
EP1953234A1 (fr) 2007-01-31 2008-08-06 Galactic S.A. Procédé de production d'acide lactique par fermentation d'un milieu autosuffisant à base de jus vert de canne
WO2011098843A2 (fr) 2010-02-10 2011-08-18 Sveučilište u Zagrebu Production d'acide lactique à partir de matières à base d'amidon par des bactéries lactiques amylolytiques
CN102424831A (zh) * 2011-12-16 2012-04-25 天津北洋百川生物技术有限公司 一种利用餐厨垃圾生产乳酸的方法

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"ACS Symposium Series", vol. 1186, 1 January 2014, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY/OXFORD UNIVERSITY PRESS, US, ISSN: 0097-6156, article WAN CHI LAM ET AL: "Food Waste Valorisation for High Value Chemicals and Energy Production", pages: 187 - 202, XP055235494, DOI: 10.1021/bk-2014-1186.ch010 *
CONNOLLY; LÔNNERDAL, NUTRAFOODS, vol. 3, 2004, pages 37 - 49
DANIEL PLEISSNER ET AL: "Fungal hydrolysis in submerged fermentation for food waste treatment and fermentation feedstock preparation", BIORESOURCE TECHNOLOGY., vol. 158, 10 February 2014 (2014-02-10), GB, pages 48 - 54, XP055235480, ISSN: 0960-8524, DOI: 10.1016/j.biortech.2014.01.139 *
DATABASE WPI Week 201249, Derwent World Patents Index; AN 2012-F34582, XP002752200 *
GOBINATH RAJAGOPALAN ET AL: "Optimization of agro-residual medium for [alpha]-amylase production from a hyper-producing Bacillus subtilis KCC103 in submerged fermentation", JOURNAL OF CHEMICAL TECHNOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 84, no. 4, 1 April 2009 (2009-04-01), pages 618 - 625, XP055236141, ISSN: 0268-2575, DOI: 10.1002/jctb.2090 *
HETENYI K, NEMETH A, SEVELLA B: "First steps in the development of a wheat flour based lactic acid fermentation technology. Culture medium optimization.", CHEM. BIOCHEM. ENG. Q., vol. 24, no. 2, 2010, pages 195 - 201, XP002752201 *
HUZAIRY HASSAN AND KHAIRIAH ABD. KARIM: "Utilization of Agricultural By-Products for Alpha-Amylase Production under Solid State Fermentation by Bacillus Subtilis", vol. 16, no. 5, 16 July 2012 (2012-07-16), pages 1 - 6, XP002752202, Retrieved from the Internet <URL:http://engj.org/index.php/ej/article/view/266/260> *
JOHN R P ET AL: "Direct lactic acid fermentation: Focus on simultaneous saccharification and lactic acid production", BIOTECHNOLOGY ADVANCES, ELSEVIER PUBLISHING, BARKING, GB, vol. 27, no. 2, 1 March 2009 (2009-03-01), pages 145 - 152, XP025873360, ISSN: 0734-9750, [retrieved on 20081031], DOI: 10.1016/J.BIOTECHADV.2008.10.004 *
MUKUND G. ADSUL ET AL: "Lactic acid production from waste sugarcane bagasse derived cellulose", GREEN CHEMISTRY, vol. 9, no. 1, 1 January 2007 (2007-01-01), GB, pages 58 - 62, XP055235376, ISSN: 1463-9262, DOI: 10.1039/B605839F *
RAMACHANDRAN ET AL: "Oil cakes and their biotechnological applications - A review", BIORESOURCE TECHNOLOGY, ELSEVIER BV, GB, vol. 98, no. 10, 11 February 2007 (2007-02-11), pages 2000 - 2009, XP005884975, ISSN: 0960-8524, DOI: 10.1016/J.BIORTECH.2006.08.002 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109294940A (zh) * 2018-09-04 2019-02-01 湖南肯基因科技有限公司 玉米乳杆菌诱变菌及高产乳酸的用途
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