CN117305121A - 一种产β-石竹烯的霉菌及其选育方法和应用 - Google Patents

一种产β-石竹烯的霉菌及其选育方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产β‑石竹烯的霉菌及其选育方法和应用,其分类命名为戴尔根霉(Rhizopus delemar),保藏号为:CCTCC M 2023879,菌株号为Rhizopus delemar HHL‑003。本发明的产β‑石竹烯的戴尔根霉HHL‑003通过实验室平板实验和强化麸曲挥发性香气成分检测实验结果显示有22种挥发性成分包括白酒健康因子β‑石竹烯37.97mg/L、2‑戊基呋喃2.56mg/L,HHL‑003糖化酶活为1357.94U/(g干曲)、液化酶活为0.029U/(g干曲)和酯化酶活为40.418U/(g干曲)。在后续功能强化小坛发酵应用中Rhizopus delemar组β‑石竹烯和2‑戊基呋喃含量较空白组分别提高了76.92%和75.36%,在地缸的扩大培养中趋势与小坛发酵相同,结果表明该菌株不仅提高了高粱酒醅中的挥发性组分与功能性成分,且有良好应用前景。

Description

一种产β-石竹烯的霉菌及其选育方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域,具体为一种产β-石竹烯的霉菌及其选育方法和应用。
背景技术
据古籍记载:“清香型白酒,产于山西省汾阳县杏花村,距今已有约1400年的历史”。清香型白酒,又称汾香型白酒,代表酒为我国南方的湖北黄鹤楼酒和北方的山西汾酒。其又分为大曲清香型白酒与小曲清香型白酒。清香型白酒的酒体清亮透明,香气纯正,余味爽净,备受消费者欢迎。曲为“酒之骨”,好曲才能酿好酒,由于酒曲中含有丰富的微生物资源以及多种酶类,是酿造过程中微生物和酶类的主要来源,同时也是酒香、口感形成的关键,因此在白酒酿造中发挥着非常重要的作用。清香型白酒主要以大麦为原料,豌豆等辅料低温制曲,然后以高粱为原料,稻壳等为辅料,以低温大曲为糖化发酵剂,通过“清蒸二次清”工艺,以地缸固态发酵,甑桶蒸馏生产而成。
β-石竹烯是双环倍半萜型化合物,主要来源于植物和真菌的代谢过程。目前在多个领域都在研究其功能,在医药领域β-石竹烯具有抗菌、降血脂、抗炎、治疗结肠炎、抗高血压、抗肿瘤和杀菌活性,同时β-石竹烯也具有局部麻醉、消炎镇痛能力。目前,β-石竹烯的研究主要是在各类食用香精、重质松节油、积雪草等,对白酒和大曲中含有的β-石竹烯研究甚少,其来源也鲜有研究。呋喃类化合物也是很多中国白酒的重要功效成分,2-戊基呋喃具有豆香、果香、泥土、青香及类似蔬菜的香韵,可用于调配面包、坚果、咖啡及蔬菜香型的香精,但白酒中2-戊基呋喃的研究较少。
在目前研究中,专利CN202310202070.4公开了一种从美汉草中提取分离β-石竹烯的方法;专利CN202211591875.4公开了石竹烯和/或芳樟醇在防治稻瘟病中的应用;专利CN202110615577.3公开了一株产β-石竹烯的霉菌及其应用,属于横梗霉属,Lichtheimiaramosa,保藏号为CCTCC M 2021424,可应用于β-石竹烯强化麸曲的生产。虽然随着菌种筛选技术的不断成熟,菌种库的不断扩大,越来越多高产β-石竹烯菌种被进一步研究,但数量仍在少数,且存在菌种活力不稳定的问题,并且白酒中产β-石竹烯的菌种的研究较少,值得深入探讨。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产β-石竹烯的霉菌,菌株为戴尔根霉,分类命名为Rhizopus delemar HHL-003,菌株号为HHL-003,菌落大、菌落形态初期为白色,后期为黑灰色,有孢子,菌丝干燥。保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为:CCTCC M 2023879,保藏时间为2023.5.30。
本发明还提供了一种产β-石竹烯的霉菌的选育方法,该方法具体步骤如下:
S1:将清香型白酒大曲粉碎混合均匀后,取样10g溶于90mL无菌生理盐水中制为10-1菌悬液;
S2:将其稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6,分别涂布于SDA培养基中;
S3:在30℃培养箱中培养48h,观察培养基上菌落形态,挑取合适单菌落划线纯化,在30℃培养箱中培养48h,得到单菌落;
S4:将霉菌菌种制作为孢子悬浮液,接种于麸皮培养基中,于30℃培养箱内培养3d,每隔12h扣瓶一次,后续使用HS-SPME和GC-MS联用法检测麸曲中β-石竹烯和2-戊基呋喃,采用GC法对β-石竹烯以及2-戊基呋喃进行定量。
优选的,S3中培养基成分为蛋白胨2.5g,葡萄糖10g,琼脂5g,蒸馏水250mL。
优选的,S4中孢子悬浮液制备方法为:取纯种菌株斜面一支,加入5mL灭菌后的0.9%生理盐水(含0.1%吐温20),将其孢子冲入已灭菌且装有玻璃珠的空三角瓶中,在30℃摇床下放置30min,用四层纱布过滤,利用血球计数板计数后,将孢子悬浮液稀释至10-6-10-7
优选的,S4中麸皮培养基成分为细麸皮100g,蒸馏水70mL。
本发明还提供了一种产β-石竹烯的霉菌在发酵中生产β-石竹烯的应用,强化麸曲中β-石竹烯浓度为37.97mg/L,2-戊基呋喃浓度为2.56mg/L。
本发明还提供了一种产β-石竹烯的霉菌在小坛发酵中的应用,对白酒香气成分分析,对照组中β-石竹烯含量和2-戊基呋喃含量分别1.56mg/L和0.69mg/L,强化组β-石竹烯和2-戊基呋喃含量增加到了2.76mg/L和1.21mg/L,增强了酒体风味与品质。
本发明还提供了一种产β-石竹烯的霉菌在地缸中扩大培养中的应用,对白酒香气成分分析,对照组中β-石竹烯含量和2-戊基呋喃浓度分别1.20mg/L和0.54mg/L,强化组β-石竹烯和2-戊基呋喃含量增加到了2.00mg/L和0.82mg/L,增强了酒体风味与品质。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明通过实验室平板实验和强化麸曲挥发性香气成分检测实验结果显示有22种挥发性成分包括白酒健康因子β-石竹烯37.97mg/L、2-戊基呋喃2.56mg/L,HHL-003糖化酶活为1357.94U/(g干曲)、液化酶活为0.029U/(g干曲)和酯化酶活为40.418U/(g干曲)。在后续功能强化小坛发酵应用中Rhizopus delemar组β-石竹烯和2-戊基呋喃含量较空白组分别提高了76.92%和75.36%,在地缸的扩大培养中趋势与小坛发酵相同,结果表明该菌株不仅提高了高粱酒醅中的挥发性组分与功能性成分,且有良好应用前景。
附图说明
图1为产β-石竹烯的戴尔根霉HHL-003在SDA培养基上培养48h的菌落形态;
图2为产β-石竹烯的戴尔根霉HHL-003在600倍显微镜下的菌体形态图;
图3为产β-石竹烯的戴尔根霉HHL-003系统发育树图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1产β-石竹烯的戴尔根霉HHL-003菌株的筛选
1)取黄鹤楼清香型白酒大曲一块,粉碎后混合均匀,取10g放入有玻璃珠的已灭菌处理的90mL生理盐水中,于30℃,150rpm摇床中震荡20min,取出后用无菌纱布过滤至无菌三角瓶中得到菌悬液。
2)将制得菌悬液梯度稀释得到10-2、10-3、10-4、10-5稀释液,分别均匀涂布于加了氯霉素的SDA培养基中,于30℃培养箱中倒置培养24h。
3)选择合适梯度,挑取不同形态的霉菌进行多次划线纯化,直至得到单菌落。
4)将得到的菌株保藏于甘油管中,冷冻于-80℃冰箱中。
实施例2产β-石竹烯的戴尔根霉HHL-003菌株的鉴定
1.该菌株HHL-003外观形态见图1。该菌菌落形态特征为菌落大、菌落形态初期为为白色,后期为黑灰色,有孢子,菌丝易挑起,干燥。
1)该菌株HHL-003镜检图片见图2。
2)菌株HHL-003经18srDNA序列分析,由NCBI中BLAST比对分析后结果显示与Rhizopus delemar同源较高,相似度达100%,并结合其菌落特征及生理生化特性,初步鉴定该菌株为Rhizopus delemar。
3)该菌株HHL-003 18srDNA系统发育树见图3。
3)菌株HHL-003生理生化性质见表1。
注:“+”为阳性,“-”为阴性
实施例3产β-石竹烯的戴尔根霉HHL-003菌株的强化麸曲制作
1)将HHL-003菌株的甘油管取150μL涂布SDA培养基中,30℃培养箱中倒置培养24h后多次划线纯化得到单菌落。
2)挑取1环单菌落接种于SDA斜面培养基上,于30℃培养箱培养3d,得到菌株HHL-003斜面。
3)取纯种HHL-003斜面一支,用无菌生理盐水(含0.1%吐温20)将孢子冲洗入装有玻璃珠的三角瓶,30℃摇床下放置30min,用四层纱布过滤,利用血球计数板计数后,将孢子悬浮液稀释至10^6~10^7
4)按接种量5%,将孢子悬浮液接种于麸皮培养基中(料水比10:7),在30℃培养3d、每隔12h扣瓶一次。
实施例4产β-石竹烯的戴尔根霉HHL-003菌株产酶能力
1)糖化酶检测:DNS法,取1g麸曲于20mL纯水中萃取1h,取1mL粗酶液于9mL10g/L淀粉缓冲液中,50℃水浴精准反应20min后吸取0.5mL反应液到1.5mLDNS试剂中,沸水浴15min,冷却后加入10.5mL蒸馏水,在550nm下检测其OD值。
2)液化酶检测:取10g麸曲加入200mL的乙酸乙酸钠缓冲液(PH=4.6)中,于35℃水浴锅水浴1h。取20mL可溶性淀粉、5mL缓冲液,与35℃水浴预热,加入10mL粗酶液并计时,定时取反应液于装有稀碘液的白瓷板上,直到于标准比色液颜色一致,记录反应时间。
3)酯化酶检测:取15mL己酸、25mL无水乙醇、75mL蒸馏水、25g绝干麸曲于锥形瓶中,35℃保温反应7d,酯化后蒸馏,皂化滴定,记录消耗硫酸的体积。
3)经检测,HHL-003强化麸曲的糖化酶活力为1357.94U/(g干曲),HHL-003强化麸曲的液化酶活力为0.029U/(g干曲),HHL-003强化麸曲的酯化酶活力为40.418U/(g干曲)。
实施例5产β-石竹烯的戴尔根霉HHL-003菌株产β-石竹烯定量
1)采用HS-SPME-GC-MS定性:取3g样品和2gNacl放入顶空瓶中,盖上瓶盖,60℃磁力搅拌器上平衡15min,然后插入萃取头,再60℃顶空萃取45min;GC-MS进样口解吸5min,进行GC-MS分析,出峰时间为18.263min,相对含量占比为1.04%。
2)取2g麸曲,加入10mL99.9%乙醇静置浸提一段时间,于8000rpm离心5min,取上清液2.5mL于5mL容量瓶中,加入100μL十二烷内标,定容至5mL,过膜后取0.2μL进样进行GC分析
3)经测试,强化麸曲中β-石竹烯浓度为37.97mg/L,2-戊基呋喃浓度为2.56mg/L。
实施例6产β-石竹烯的戴尔根霉HHL-003菌株强化小坛应用
1)实验组将HHL-003强化麸曲按照黄鹤楼清香型白酒大曲添加量的5%接于高粱、稻壳、10%清香型大曲混合物中,在入坛时接入,高粱、稻壳、10%清香型大曲混合物为空白组。
2)装坛密封发酵20天后上甑蒸酒,上甑时两边比中间略高1-2cm,采用“掐头去尾”的方法收集馏分,当原酒度数低与50度时停止接酒。
3)HS-SPME-GC-MS检测白酒风味成分,GC定量。实验组中β-石竹烯浓度为2.76mg/L,较空白组升高了76.92%,而其他一些健康风味物质如2-戊基呋喃提高了75.36%,糖化酶活力、液化酶活力、淀粉酶活力也有20%~30%的提高。
实施例7产β-石竹烯的戴尔根霉HHL-003菌株的扩大培养应用
1)实验组将HHL-003强化麸曲按照黄鹤楼清香型白酒大曲添加量的5%接于高粱、稻壳、21%清香型大曲混合物中,在入地缸时接入,每一地缸原料250kg,高粱、稻壳、21%清香型大曲为空白组。
2)密封发酵20天后上甑蒸酒,上甑时两边比中间略高1-2cm,采用“掐头去尾”的方法收集馏分,当原酒度数低与50度时停止接酒。
3)HS-SPME-GC-MS检测白酒风味成分,GC定量。实验组中β-石竹烯浓度为2.00mg/L,较空白组升高了66.67%,而其他一些健康风味物质如2-戊基呋喃也提高了51.85%,糖化酶活力、液化酶活力、淀粉酶活力也有20%~30%的提高,与小坛发酵结果一致,由此该HHL-003菌株在提升白酒香气和酒质方面有突出表现。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种产β-石竹烯的霉菌,其特征在于:菌株为戴尔根霉,菌株号为HHL-003,菌落大、菌落形态初期为白色,后期为黑灰色,有孢子,菌丝干燥。
2.一种根据权利要求1所述的产β-石竹烯的霉菌的选育方法,其特征在于:该方法具体步骤如下:
S1:将清香型白酒大曲粉碎混合均匀后,取样10g溶于90mL无菌生理盐水中制为10-1菌悬液;
S2:将其稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6,分别涂布于SDA培养基中;
S3:在30℃培养箱中培养48h,观察培养基上菌落形态,挑取合适单菌落划线纯化,在30℃培养箱中培养48h,得到单菌落;
S4:将霉菌菌种制作为孢子悬浮液,接种于麸皮培养基中,于30℃培养箱内培养3d,每隔12h扣瓶一次,后续使用HS-SPME和GC-MS联用法检测麸曲中β-石竹烯和2-戊基呋喃,采用GC法对β-石竹烯以及2-戊基呋喃进行定量。
3.根据权利要求2所述的一种产β-石竹烯的霉菌的选育方法,其特征在于:S3中培养基成分为蛋白胨2.5g,葡萄糖10g,琼脂5g,蒸馏水250mL。
4.根据权利要求2所述的一种产β-石竹烯的霉菌的选育方法,其特征在于:S4中孢子悬浮液制备方法为:取纯种菌株斜面一支,加入5mL灭菌后的0.9%生理盐水,将其孢子冲入已灭菌且装有玻璃珠的空三角瓶中,在30℃摇床下放置30min,用四层纱布过滤,利用血球计数板计数后,将孢子悬浮液稀释至10-6-10-7
5.根据权利要求2所述的一种产β-石竹烯的霉菌的选育方法,其特征在于:S4中麸皮培养基成分为细麸皮100g,蒸馏水70mL。
6.一种根据权利要求1所述的产β-石竹烯的霉菌在发酵中生产β-石竹烯的应用,其特征在于:强化麸曲中β-石竹烯浓度为37.97mg/L,2-戊基呋喃浓度为2.56mg/L。
7.一种根据权利要求1所述的产β-石竹烯的霉菌在小坛发酵中的应用,其特征在于:对白酒香气成分分析,对照组中β-石竹烯含量和2-戊基呋喃含量分别1.56mg/L和0.69mg/L,强化组β-石竹烯和2-戊基呋喃含量增加到了2.76mg/L和1.21mg/L,增强了酒体风味与品质。
8.一种根据权利要求1所述的产β-石竹烯的霉菌在地缸中扩大培养中的应用,其特征在于:对白酒香气成分分析,对照组中β-石竹烯含量和2-戊基呋喃浓度分别1.20mg/L和0.54mg/L,强化组β-石竹烯和2-戊基呋喃含量增加到了2.00mg/L和0.82mg/L,增强了酒体风味与品质。
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