CN103981225A - 一种固定化生物膜制备香兰素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种固定化生物膜制备香兰素的方法，该方法包括以下步骤：⑴将至少一个填充有纤维载体的生物膜反应器与发酵罐串联；⑵在发酵罐中加入发酵培养基后，连同生物膜反应器一起灭菌；⑶将一环生长良好的枯草芽孢杆菌B7-S（BacillussubtilisB7-S）斜面培养物接种至含有发酵培养基的摇瓶中进行振荡培养，即得发酵液；⑷发酵液通过泵在生物膜反应器与发酵罐间不断循环，且发酵液每次循环所需要的时间不超过0.5小时，直到发酵至香兰素浓度不再增加时，换成新鲜发酵培养基，继续发酵生产香兰素。本发明可以有效提高香兰素生产效率，并具有产物浓度高、批次生产稳定等优点，适用于香兰素的工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及微生物及发酵工程技术领域，尤其涉及一种固定化生物膜制备香兰素的方法。
背景技术
香兰素(Vanillin)，又名香草醛或香兰醛或香茅醛，化合物名称4-羟基-3-甲氧基苯甲醛。它具有浓郁的香子兰花的气味，常以游离态和葡萄糖苷的形式广泛存在于自然界植物中。香兰素广泛应用于食品、饮料、烟酒、洗涤化妆品和药品的加香，也可以用于塑料、橡胶等工业品的祛臭，同时也是重要的医药原料和工业添加剂。在食品工业中，香兰素已成为各国消费者最为喜欢的一种食用香料，有“食品香料之王”的美称，广泛用作名酒、奶油、咖啡、可可、巧克力等高档食品的调香原料。香兰素具有一定的抗菌能力，可用作保鲜剂，还可用于治疗皮肤病药物的配方中。香兰素也用作植物生长促进剂、润滑油消泡剂、电镀光亮剂、印制线路板生产导电剂等。
香兰素的世界年消费量接近1.8万吨，其需求量仍以每年10%的速度在增加。当前，天然香兰素的年产量不足2000吨，余下的消费缺口都是通过化学合成法填补的。在销售价格上，合成香草素市场价低于每公斤15美元，而从香子兰荚中提取的香草素价值为合成产品的300倍，每公斤达4000美元。因此，低成本的天然香兰素具有极大的市场需求。
香兰素生产方法主要有三种，一是从天然植物中提取（包括植物提取法及植物细胞培养法），二是化学合成法（包括愈创木酚法、木质素法、黄樟素法、丁香酚法、对羟基苯甲醛法、4-甲基愈创木酚法、对甲酚法），三是生物转化法（微生物发酵法和酶转化法）。从天然植物中虽然可以获得天然香兰素，但其成本高、提取劳动强度大、难以规模化生产且产量易受气候影响。化学法合成法虽然简单、成本低，但存在很多弊端。如合成的香兰素香型单一，且在合成过程中易掺杂杂质而影响其香味与色泽，有的还容易造成环境污染。而生物转化法获得的香兰素在生产周期和规模扩大方面要优于植物提取法，生产成本低于植物提取，而产品品质优于化学合成的香兰素。用生物转化法生产的香兰素与植物提取的天然香兰素等同，被称为生物香兰素(Biologic Vanillin)。在生物转化法中，微生物发酵法因具有细胞生产与产酶同步，易于操控、成本低等优点而被认为是目前最具有产业化价值的天然香兰素制备方法。
目前，香兰素的发酵生产主要采用游离细胞发酵。在香兰素的固定细胞发酵报道方面，只有Bacillus fusiformis海藻酸钙固定化细胞用于香兰素转化的报道，但是发酵生产需要消耗大量的氧气，该传统包埋方法限制了香兰素发酵过程的氧气传递与物质交换，不利于实现香兰素的高效生产。采用固定化生物膜进行香兰素生产未见有专利研究报道，细胞固定在纤维基质表面的生物膜具有比表面积高、孔隙率高、稳定性强、吸附效果好、可重复利用以及可以为细胞提供对剪切应力的抵抗力等优点，因此能够有效提高产物的生产效率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高转化率的固定化生物膜制备香兰素的方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种固定化生物膜制备香兰素的方法，包括以下步骤：
⑴将至少一个填充有纤维载体的生物膜反应器与发酵罐串联，所述生物膜反应器体积为所述发酵罐体积的8~32%；
⑵在所述发酵罐中加入发酵培养基后，连同所述生物膜反应器一起在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min；所述发酵培养基的添加量占所述发酵罐容积的50%~90%；
⑶将一环生长良好的枯草芽孢杆菌B7-S（Bacillus subtilis B7-S）斜面培养物按5~20%的接种量接种至含有50~200mL且冷却至20~55℃的所述步骤⑵中的发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在20~40℃的条件下以100~500r/min的速率进行振荡培养12~36h，即得发酵液；
⑷所述发酵液通过泵在所述生物膜反应器与所述发酵罐间不断循环，且所述发酵液每次循环所需要的时间不超过0.5小时，直到发酵至香兰素浓度不再增加时，换成新鲜发酵培养基，继续发酵生产香兰素。
所述步骤⑴中的纤维载体是由纤维材料和支撑材料构成，该纤维材料经所述支撑材料绕成桶状或螺旋状固定于所述生物膜反应器中；所述纤维材料是指植物纤维、动物纤维、合成纤维中的一种；所述支撑材料是指耐高温塑料、不锈钢材料、铝制材料中的一种。
所述步骤⑴中的生物膜反应器体积为所述发酵罐体积的10~20%。
所述步骤⑵或所述步骤⑷中的发酵培养基是指将0.2~1g阿魏酸、5~15g蛋白胨、2~10g酵母浸出粉、2~15g NaCl与1L蒸馏水混合均匀后，加入5mol/L NaOH溶液，使pH值为6.0~10.0即得。
所述步骤⑶中的枯草芽孢杆菌B7-S（Bacillus subtilis B7-S）其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2011162；其菌株16S rRNA在美国Genbank的访问号为JQ086379；菌株全基因组测序草图在DDBJ/EMBL/GenBank访问号为AZNI00000000。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、在本发明之前，生物膜反应器从未被使用在香兰素生产的研究中。生物膜固定化不同于传统的细胞固定技术如包埋法或吸附法，它是微生物被包裹在其自身分泌的多聚物中形成的一种特殊胞群体结构。相对与传统固定化细胞，生物膜中的微生物具有更好的耐受性、氧传递与物质交换易于维持。
经测试，挂膜之前，碳纤维载体表面空隙分布均匀，具有较高的比表面积如图1所示；挂膜之后，碳纤维载体表明己经形成一层浅白色的微生物膜，且分布均匀如图2所示。也就是说，枯草芽孢杆菌B7-S（Bacillus subtilis B7-S）在纤维材料表面能形成生物膜，相对于游离细胞，固定化生物膜的生长速率及阿魏酸消耗速率高于游离培养的菌株，可以获得更高的香兰素发酵浓度。
2、细胞的高效吸附与不断更新：
本发明细胞的固定化是在发酵过程中自动形成的，不需要专门在反应器外制备固定化细胞，因而，减少了污染风险。同时，纤维床反应器中的纤维材料利用自身的网状结构，能够保证一定数量菌体的高效吸附，发酵液长时间按同一方向通过反应器在纤维材料上形成生物膜。与以前的固定化方法不同，只有具有高效活性的细胞才能结合于生物膜上，处于衰退期或菌体活力较差时细胞会自动脱落，因而保证了生物膜的活力，可实现连续多批次固定化发酵生产。
3、传质传氧效率及耐受力提高：
与传统的固定化细胞不同，本发明微生物细胞是由于生存需要而在载体表面形成的生物膜，因此其结合更为紧密，同时生物膜上的细胞可以直接同发酵液接触，从而可以直接利用培养基中的氧和营养物质；另外，在同发酵液持续接触过程中，生物膜也在不断变化，使得细胞具有更强的对剪切应力的抵抗力以及香兰素生产能力。
4、采用本发明方法，可以有效提高香兰素生产效率，并具有产物浓度高、批次生产稳定等优点，适用于香兰素的工业化生产。
附图说明
下面结合附图对发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明挂膜前碳纤维载体样品的照片。
图2为本发明挂膜后碳纤维载体样品的照片。
具体实施方式
单批次：
实施例1 一种固定化生物膜制备香兰素的方法，包括以下步骤：
⑴将至少一个填充有纤维载体的生物膜反应器与发酵罐串联，生物膜反应器体积为发酵罐体积的8%。
其中：纤维载体是由纤维材料和支撑材料构成，该纤维材料经支撑材料绕成桶状或螺旋状固定于生物膜反应器中。纤维材料是指植物纤维；支撑材料是指耐高温塑料。
⑵在发酵罐中加入发酵培养基后，连同生物膜反应器一起在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min；发酵培养基的添加量占发酵罐容积的50%。
其中：发酵培养基是指将1g阿魏酸、10g蛋白胨、3g酵母浸出粉、5g NaCl与1L蒸馏水混合均匀后，加入5mol/L NaOH溶液，使pH值为8.0即得。
⑶将一环生长良好的枯草芽孢杆菌B7-S（Bacillus subtilis B7-S）斜面培养物按5%的接种量接种至含有50mL且冷却至35℃的步骤⑵中的发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在20℃的条件下以100r/min的速率进行振荡培养36h，即得发酵液。
⑷发酵液通过泵在生物膜反应器与发酵罐间不断循环，且发酵液每次循环所需要的时间不超过0.5小时，直到发酵至香兰素浓度不再增加。发酵液中香兰素浓度为0.37 g/L，阿魏酸转化为香兰素的摩尔转化率为47.2%。
对比实施例
6L发酵液装入10L发酵罐中，间歇发酵，发酵培养基同实施例1，发酵过程不断搅拌，经过40 h的运行，发酵液香兰素浓度为0.32 g/L，阿魏酸转化为香兰素的摩尔转化率为40.8%。
实施例2 一种固定化生物膜制备香兰素的方法，包括以下步骤：
⑴将至少一个填充有纤维载体的生物膜反应器与发酵罐串联，生物膜反应器体积为发酵罐体积的32%。
其中：纤维载体是由纤维材料和支撑材料构成，该纤维材料经支撑材料绕成桶状或螺旋状固定于生物膜反应器中。纤维材料是指动物纤维；支撑材料是指不锈钢材料。
⑵在发酵罐中加入发酵培养基后，连同生物膜反应器一起在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min；发酵培养基的添加量占发酵罐容积的90%。
其中：发酵培养基是指将0.2g阿魏酸、5g蛋白胨、2g酵母浸出粉、2g NaCl与1L蒸馏水混合均匀后，加入5mol/L NaOH溶液，使pH值为6.0即得。
⑶将一环生长良好的枯草芽孢杆菌B7-S（Bacillus subtilis B7-S）斜面培养物按20%的接种量接种至含有200mL且冷却至55℃的步骤⑵中的发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在40℃的条件下以500r/min的速率进行振荡培养12h，即得发酵液。
⑷发酵液通过泵在生物膜反应器与发酵罐间不断循环，且发酵液每次循环所需要的时间不超过0.5小时，直到发酵至香兰素浓度不再增加。发酵液中香兰素浓度为0.34 g/L，阿魏酸转化为香兰素的摩尔转化率为43.4%。
实施例3 一种固定化生物膜制备香兰素的方法，包括以下步骤：
⑴将至少一个填充有纤维载体的生物膜反应器与发酵罐串联，生物膜反应器体积为发酵罐体积的10%。
其中：纤维载体是由纤维材料和支撑材料构成，该纤维材料经支撑材料绕成桶状或螺旋状固定于生物膜反应器中。纤维材料是指合成纤维；支撑材料是指铝制材料。
⑵在发酵罐中加入发酵培养基后，连同生物膜反应器一起在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min；发酵培养基的添加量占发酵罐容积的60%。
其中：发酵培养基是指将1g阿魏酸、15g蛋白胨、10g酵母浸出粉、15g NaCl与1L蒸馏水混合均匀后，加入5mol/L NaOH溶液，使pH值为10.0即得。
⑶将一环生长良好的枯草芽孢杆菌B7-S（Bacillus subtilis B7-S）斜面培养物按10%的接种量接种至含有75mL且冷却至20℃的步骤⑵中的发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在25℃的条件下以150r/min的速率进行振荡培养18h，即得发酵液。
⑷发酵液通过泵在生物膜反应器与发酵罐间不断循环，且发酵液每次循环所需要的时间不超过0.5小时，直到发酵至香兰素浓度不再增加。发酵液中香兰素浓度为0.44 g/L，阿魏酸转化为香兰素的摩尔转化率为56.2%。
实施例4 一种固定化生物膜制备香兰素的方法，包括以下步骤：
⑴将至少一个填充有纤维载体的生物膜反应器与发酵罐串联，生物膜反应器体积为发酵罐体积的20%。
其中：纤维载体是由纤维材料和支撑材料构成，该纤维材料经支撑材料绕成桶状或螺旋状固定于生物膜反应器中。纤维材料是指植物纤维；支撑材料是指不锈钢材料。
⑵在发酵罐中加入发酵培养基后，连同生物膜反应器一起在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min；发酵培养基的添加量占发酵罐容积的70%。
其中：发酵培养基是指将0.4g阿魏酸、8g蛋白胨、4g酵母浸出粉、4g NaCl与1L蒸馏水混合均匀后，加入5mol/L NaOH溶液，使pH值为6.5即得。
⑶将一环生长良好的枯草芽孢杆菌B7-S（Bacillus subtilis B7-S）斜面培养物按8%的接种量接种至含有100mL且冷却至30℃的步骤⑵中的发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在30℃的条件下以200r/min的速率进行振荡培养24h，即得发酵液。
⑷发酵液通过泵在生物膜反应器与发酵罐间不断循环，且发酵液每次循环所需要的时间不超过0.5小时，直到发酵至香兰素浓度不再增加。发酵液中香兰素浓度为0.41 g/L，阿魏酸转化为香兰素的摩尔转化率为52.3%。
多批次：
实施例5 一种固定化生物膜制备香兰素的方法，包括以下步骤：
⑴将至少一个填充有纤维载体的生物膜反应器与发酵罐串联，生物膜反应器体积为发酵罐体积的12%。
其中：纤维载体是由纤维材料和支撑材料构成，该纤维材料经支撑材料绕成桶状或螺旋状固定于生物膜反应器中。纤维材料是指动物纤维；支撑材料是指耐高温塑料。
⑵在发酵罐中加入发酵培养基后，连同生物膜反应器一起在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min；发酵培养基的添加量占发酵罐容积的80%。
其中：发酵培养基是指将0.6g阿魏酸、12g蛋白胨、6g酵母浸出粉、6g NaCl与1L蒸馏水混合均匀后，加入5mol/L NaOH溶液，使pH值为7.0即得。
⑶将一环生长良好的枯草芽孢杆菌B7-S（Bacillus subtilis B7-S）斜面培养物按12%的接种量接种至含有1250mL且冷却至40℃的步骤⑵中的发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在35℃的条件下以250r/min的速率进行振荡培养30h，即得发酵液。
⑷发酵液通过泵在生物膜反应器与发酵罐间不断循环，且发酵液每次循环所需要的时间不超过0.5小时，直到发酵至香兰素浓度不再增加时，换成新鲜发酵培养基，如此替换新鲜发酵培养基5次，共计发酵200 h后，香兰素总产量达14.08 g，平均批次香兰素浓度达0.35 g/L。
实施例6 一种固定化生物膜制备香兰素的方法，包括以下步骤：
⑴将至少一个填充有纤维载体的生物膜反应器与发酵罐串联，生物膜反应器体积为发酵罐体积的25%。
其中：纤维载体是由纤维材料和支撑材料构成，该纤维材料经支撑材料绕成桶状或螺旋状固定于生物膜反应器中。纤维材料是指合成纤维；支撑材料是指不锈钢材料。
⑵在发酵罐中加入发酵培养基后，连同生物膜反应器一起在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min；发酵培养基的添加量占发酵罐容积的55%。
其中：发酵培养基是指将0.8g阿魏酸、14g蛋白胨、8g酵母浸出粉、8g NaCl与1L蒸馏水混合均匀后，加入5mol/L NaOH溶液，使pH值为7.5即得。
⑶将一环生长良好的枯草芽孢杆菌B7-S（Bacillus subtilis B7-S）斜面培养物按14%的接种量接种至含有150mL且冷却至45℃的步骤⑵中的发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在28℃的条件下以300r/min的速率进行振荡培养26h，即得发酵液。
⑷发酵液通过泵在生物膜反应器与发酵罐间不断循环，且发酵液每次循环所需要的时间不超过0.5小时，直到发酵至香兰素浓度不再增加时，换成新鲜发酵培养基，如此替换新鲜发酵培养基5次，共计发酵200 h后，香兰素总产量达12.72 g，平均批次香兰素浓度达0.32 g/L。
实施例7 一种固定化生物膜制备香兰素的方法，包括以下步骤：
⑴将至少一个填充有纤维载体的生物膜反应器与发酵罐串联，生物膜反应器体积为发酵罐体积的15%。
其中：纤维载体是由纤维材料和支撑材料构成，该纤维材料经支撑材料绕成桶状或螺旋状固定于生物膜反应器中。纤维材料是指植物纤维；支撑材料是指耐高温塑料。
⑵在发酵罐中加入发酵培养基后，连同生物膜反应器一起在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min；发酵培养基的添加量占发酵罐容积的65%。
其中：发酵培养基是指将1g阿魏酸、15g蛋白胨、10g酵母浸出粉、10g NaCl与1L蒸馏水混合均匀后，加入5mol/L NaOH溶液，使pH值为8.5即得。
⑶将一环生长良好的枯草芽孢杆菌B7-S（Bacillus subtilis B7-S）斜面培养物按16%的接种量接种至含有175mL且冷却至50℃的步骤⑵中的发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在36℃的条件下以350r/min的速率进行振荡培养16h，即得发酵液。
⑷发酵液通过泵在生物膜反应器与发酵罐间不断循环，且发酵液每次循环所需要的时间不超过0.5小时，直到发酵至香兰素浓度不再增加时，换成新鲜发酵培养基，如此替换新鲜发酵培养基5次，共计发酵200 h后，香兰素总产量达16.36 g，平均批次香兰素浓度达0.41 g/L。
实施例8 一种固定化生物膜制备香兰素的方法，包括以下步骤：
⑴将至少一个填充有纤维载体的生物膜反应器与发酵罐串联，生物膜反应器体积为发酵罐体积的30%。
其中：纤维载体是由纤维材料和支撑材料构成，该纤维材料经支撑材料绕成桶状或螺旋状固定于生物膜反应器中。纤维材料是指合成纤维；支撑材料是指铝制材料。
⑵在发酵罐中加入发酵培养基后，连同生物膜反应器一起在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min；发酵培养基的添加量占发酵罐容积的75%。
其中：发酵培养基是指将1g阿魏酸、5g蛋白胨、2g酵母浸出粉、2g NaCl与1L蒸馏水混合均匀后，加入5mol/L NaOH溶液，使pH值为6.0即得。
⑶将一环生长良好的枯草芽孢杆菌B7-S（Bacillus subtilis B7-S）斜面培养物按18%的接种量接种至含有200mL且冷却至55℃的步骤⑵中的发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在40℃的条件下以500r/min的速率进行振荡培养12h，即得发酵液。
⑷发酵液通过泵在生物膜反应器与发酵罐间不断循环，且发酵液每次循环所需要的时间不超过0.5小时，直到发酵至香兰素浓度不再增加时，换成新鲜发酵培养基，如此替换新鲜发酵培养基5次，共计发酵200 h后，香兰素总产量达15.92 g，平均批次香兰素浓度达0.40 g/L。
上述实施例1~8中，枯草芽孢杆菌B7-S（Bacillus subtilis B7-S）其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2011162；其菌株16S rRNA在美国Genbank的访问号为JQ086379；菌株全基因组测序草图在DDBJ/EMBL/GenBank访问号为AZNI00000000。
Claims (5)
1.一种固定化生物膜制备香兰素的方法，包括以下步骤：
⑴将至少一个填充有纤维载体的生物膜反应器与发酵罐串联，所述生物膜反应器体积为所述发酵罐体积的8~32%；
⑵在所述发酵罐中加入发酵培养基后，连同所述生物膜反应器一起在压强为1.05Kg/cm2、温度为121℃的条件下灭菌20min；所述发酵培养基的添加量占所述发酵罐容积的50%~90%；
⑶将一环生长良好的枯草芽孢杆菌B7-S（Bacillus subtilis B7-S）斜面培养物按5~20%的接种量接种至含有50~200mL且冷却至20~55℃的所述步骤⑵中的发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在20~40℃的条件下以100~500r/min的速率进行振荡培养12~36h，即得发酵液；
⑷所述发酵液通过泵在所述生物膜反应器与所述发酵罐间不断循环，且所述发酵液每次循环所需要的时间不超过0.5小时，直到发酵至香兰素浓度不再增加时，换成新鲜发酵培养基，继续发酵生产香兰素。
2.如权利要求1所述的一种固定化生物膜制备香兰素的方法，其特征在于：所述步骤⑴中的纤维载体是由纤维材料和支撑材料构成，该纤维材料经所述支撑材料绕成桶状或螺旋状固定于所述生物膜反应器中；所述纤维材料是指植物纤维、动物纤维、合成纤维中的一种；所述支撑材料是指耐高温塑料、不锈钢材料、铝制材料中的一种。
3.如权利要求1所述的一种固定化生物膜制备香兰素的方法，其特征在于：所述步骤⑴中的生物膜反应器体积为所述发酵罐体积的10~20%。
4.如权利要求1所述的一种固定化生物膜制备香兰素的方法，其特征在于：所述步骤⑵或所述步骤⑷中的发酵培养基是指将0.2~1g阿魏酸、5~15g蛋白胨、2~10g酵母浸出粉、2~15g NaCl与1L蒸馏水混合均匀后，加入5mol/L NaOH溶液，使pH值为6.0~10.0即得。
5.如权利要求1所述的一种固定化生物膜制备香兰素的方法，其特征在于：所述步骤⑶中的枯草芽孢杆菌B7-S（Bacillus subtilis B7-S）其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2011162；其菌株16S rRNA在美国Genbank的访问号为JQ086379；菌株全基因组测序草图在DDBJ/EMBL/GenBank访问号为AZNI00000000。
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