CN102443551B - 一种枯草芽孢杆菌及其生物转化阿魏酸生产香兰素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌B7-S(Bacillus subtilis B7-S)，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO：M 2011162；该枯草芽孢杆菌通过阿魏酸浓度为0.2～2.0g/L的种子培养基诱导获得。本发明还公开了利用该枯草芽孢杆菌生物转化阿魏酸生产香兰素的方法，该方法以阿魏酸为底物的微生物转化法生产香兰素，转化效率达55％～63％，具有原料丰富易得，生产成本低、生产工艺简单、安全清洁、无污染、环境友好等优点，不但充分保持了香兰素的天然性，而且相比其它生物转化法节省成本30％，有效地解决了化学合成香兰素存在的原料毒性大，生产过程中产生的废弃物对环境污染严重，以及香兰素的纯度、香气单一、安全性低等诸多缺点。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其生物转化阿魏酸生产香兰素的方法

技术领域

本发明涉及一种微生物菌株，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌及其生物转化阿魏酸生产香兰素的方法。

背景技术

香兰素(Vanillin)，又名香草醛、香草素、香兰醛或香茅醛、甲基原儿茶醛、凡尼林，其化学名称为4-羟基-3-甲氧基苯甲醛，分子式为C₈H₈O₃，相对分子量为152.15，其分子结构如下：

香兰素具有香荚兰豆的香气，外观为白色至黄色针状或粉末状结晶，微溶于水(1g/100ml，20℃)，易溶于乙醇、苯甲基苯甲酸酯、冰醋酸、二硫化碳、吡啶、脂肪和芳香酯等有机溶剂中和强碱溶液中；易受光化作用的影响，在空气中逐渐氧化。香兰素具有较低的气味识别阈值，在生产和储存过程中容易携带其它气味；无毒，对人和动物无害，对皮肤和粘膜有局部的刺激(李士炼，2005)。香兰素是一种具有代表性的广谱香料，有“香料之王”的美称，也是重要的有机化学品中间体，在食品工业、医药工业、日化工业、烟草工业、电镀工业等领域得到了广泛的应用(陈朋等，2008)。

香兰素是目前世界上产量最大的合成香料，年消费量约1.2～1.8万吨，而且其需求量每年仍以10％的速度在增加。从香荚兰中提取制备的天然香兰素产量低，每年实际只有约20～50吨，余下的消费缺口都是通过化学合成法填补，化学合成法存在许多不可避免的弊端，如产品香型单一、易掺杂质等，价格低，工业级6～7万元/吨，食品级7～10万元/吨，而天然级产品目前售价高达40～50万元/吨，如此悬殊的价格差异，使得香兰素市场竞争越来越激烈。预计全球每年需求量以5％的速率递增，总量约15000吨/年，但是天然香兰素的供给量不到1％。生产成本是一个值得考虑的问题，就目前的技术水准来说，采用植物细胞培养法生产香兰素的成本将高达15000美元/kg，而采用传统方法从香荚兰豆中提取香兰素的成本为4000美元/kg，利用微生物发酵法的成本约1000美元/kg。

目前在市场上供应的香兰素有三种，即(1)从香子兰花荚中提取的天然香兰素；(2)用化学合成法(如愈创木酚法、木质素法、黄樟素法、丁香酚法、对羟基苯甲醛法、4-甲基愈创木酚法、对甲酚法等)生产的香兰素；(3)用微生物法生产的香兰素(郑波涛，2007)。从香子兰花荚中提取的天然香兰素获得的香兰素为天然制品，但由于目前生产天然香兰素的方法受制于香子兰荚果供应(欧仕益等，2004)。香兰素化学生产方法有产率高的特点，目前处于香兰素合成主导地位，但是大多数化学合成的香兰素在纯度、香气、安全性等方面都亚于天然提取的香兰素，并且化学工艺产生的废弃物对环境存在很大危害。

从香兰素作为一种重要的香料被使用至今，香兰素的方法就在不断的更新，就其生产工艺的不同，所得到的转化效率也相差悬殊，化学合成法相对于生物合成法产率要高很多，这也是目前大多数香兰素合成都采用化学合成法的一个主要原因。但是随着对香兰素生产环境要求的不断提高，传统的化学合成方法将会不断受到生物合成法的冲击，努力提高生物转化效率是当前生物法的主要突破口。相比其它生物合成方法，微生物转化法以其转化率高、成本低、环境污染低、天然性的优点应用于生产天然香兰素。随着现代生物学的发展，微生物转化法生产天然香兰素随即成为研究焦点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种枯草芽孢杆菌。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供采用该枯草芽孢杆菌生物转化阿魏酸生产香兰素的方法。

为解决上述问题，本发明所述的一种枯草芽孢杆菌，其特征在于：该枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌B7-S(Bacillus subtilis B7-S)，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2011162(保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2011年5月5日)。

如上所述的一种枯草芽孢杆菌的制备方法，包括以下步骤：

(1)出发菌种的选择：出发菌种为枯草芽孢杆菌B7(Bacillus subtilis)，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC NO：1.210；

(2)制备种子培养基：将10.0～20.0g胰蛋白胨、2.0～6.0g牛肉浸膏、5.0～20.0g氯化钠、0.2～2.0g阿魏酸与1.0L蒸馏水混合均匀后，在压强为1.05Kg/cm²、温度为121℃的条件下灭菌20min，即得阿魏酸浓度为0.2～2.0g/L的种子培养基；

(3)诱导：将一环生长良好的所述出发菌种枯草芽孢杆菌B7(Bacillussubtilis)斜面培养物，按5～20％的接种量接种至含有50～150ml的所述种子培养基的摇瓶中，按阿魏酸浓度自低浓度至高浓度进行继代培养，并置于恒温振荡器上，在25～45℃的条件下以50～200r/min的速率进行振荡培养，诱导周期为45～60天，即获得枯草芽孢杆菌B7-S。

如上所述的一种枯草芽孢杆菌生物转化阿魏酸生产香兰素的方法，包括以下步骤：

(1)制备种子培养基：将10.0～20.0g胰蛋白胨、2.0～6.0g牛肉浸膏、5.0～20.0g氯化钠、0.2～2.0g阿魏酸与1.0L蒸馏水混合均匀后，在压强为1.05Kg/cm²、温度为121℃的条件下灭菌20min即得阿魏酸浓度为0.2～2.0g/L的种子培养基；

(2)将一环生长良好的所述枯草芽孢杆菌B7-S斜面培养物按5～20％的接种量接种至含有50～200ml所述种子培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在25～45℃的条件下以50～200r/min的速率进行振荡培养30～60h，至菌液OD_660nm为0.5～0.8时即获得枯草芽孢杆菌B7-S转化用菌液；

(3)收集菌体细胞：取所述枯草芽孢杆菌B7-S转化用菌液在离心机上以1000～4000r/min的转速离心5～20min，收集上清液；对所述上清液以5000～20000r/min的转速离心5～20min，得到菌体细胞沉淀；

(4)转化：将0.2M且pH值为7.4的磷酸盐缓冲液加到所述菌体细胞沉淀中，形成菌体浓度为3.0×10⁷～8.0×10⁷个/ml的菌悬液；然后加入浓度为0.2～2.0g/L的阿魏酸，在25～45℃温度下、通气量为0.5～1.5L/min，以200～500r/min的转速进行转化，40～60h后，得到转化液；

(5)香兰素的分离：将所述转化液在离心机上以2000～4000r/min的转速离心5～20min，得到香兰素粗沉淀物；

(6)香兰素粗品的制备：将所述香兰素粗沉淀物在温度为50～80℃、压力为0.05～0.10Mpa的条件下，真空干燥60～100h，得到干燥的沉淀物，该干燥的沉淀物用研钵研成粒度为200～300目的粉末后，即得香兰素粗品。

所述步骤(4)中0.2M且pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)是指首先将71.6g Na₂HPO₄·12H₂O溶于1000ml水，得到0.2M Na₂HPO₄；然后将31.2gNaH₂PO₄·2H₂O溶于1000ml水，得到0.2M NaH₂PO₄；最后，将19ml 0.2M的NaH₂PO₄和81ml 0.2M的Na₂HPO₄混合均匀后即得。

所述步骤(4)中通气量中的空气是指将空气经活性炭过滤后得到的无菌空气。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明枯草芽孢杆菌B7-S(Bacillus subtilis B7-S)的鉴定：

(1)菌体的形态特征：需氧革兰氏阳性菌，无荚膜，周生鞭毛，能运动，细胞多呈不规则的球形，外部不平整，粗糙，细胞质收缩，胞液靠近细胞壁一侧。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，细菌交联形成一层菌膜。

(2)菌体的生理生化鉴定：将枯草芽孢杆菌B7-S(Bacillus subtilis B7-S)与枯草芽孢杆菌标准菌株B7在相同实验条件下进行生理生化性状检测，结果如表1。

表1枯草芽孢杆菌B7-S鉴定项目及结果

对转化前后菌株的形貌变化进行了SEM和TEM的观察，发现转化细胞形态外部及内部均发生明显变化，以适应高浓度的阿魏酸环境。

2、本发明以阿魏酸为底物的微生物转化法生产香兰素，转化效率达55％～63％，具有原料丰富易得，生产成本低、生产工艺简单、安全清洁、无污染、环境友好等优点，不但充分保持了香兰素的天然性，而且相比其它生物转化法节省成本30％，有效地解决了化学合成香兰素存在的原料毒性大，生产过程中产生的废弃物对环境污染严重，以及香兰素的纯度、香气单一、安全性低等诸多缺点。因此，微生物转化法生产的香兰素有望替代或部分替代化学方法生产的香兰素。

3、经SEM分析显示，未经驯化和诱导的野生型菌株作为出发菌株时，其菌细胞为长的棒状外观，4.0～6.0μm大小(参见图1A)；本发明枯草芽孢杆菌B7-S细胞形态发生明显变化，细胞由棒状杆菌收缩变形为0.5～1.0μm大小的球菌(参见图1B)，这表明菌体为适应高浓度阿魏酸环境收缩呈球形。

4、经TEM分析，出发菌株菌体细胞呈棒状杆菌，细胞壁较厚，外部有明显的鞭毛(参见图2A、图2C)；而本发明枯草芽孢杆菌B7-S的细胞多呈不规则的球形，细胞壁明显变薄，且外部不平整，粗糙，细胞质收缩，胞液靠近细胞壁一侧，鞭毛不可见(参见图2B、图2D)。由此可见，枯草芽孢杆菌为适应外部高浓度阿魏酸，对自身细胞进行了变形，同时，阿魏酸对于细胞具有明显的抑制作用。

5、采用本发明枯草芽孢杆菌B7-S以阿魏酸作转化底物生产香兰素获得的转化液按香兰素国标(GB/T 5009.74；GB/T 5009.76)进行了重金属含量的测定和分析，该香兰素中铅和砷含量都小于0.018mg/kg，低于国家标准GB/T5009.74食品添加剂中重金属限量试验。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1A本发明出发菌种枯草芽孢杆菌B7(Bacillus subtilis)的SEM图。

图1B为本发明B7-S(Bacillus subtilis B7-S)的SEM图。

图2A、图2C本发明出发菌种枯草芽孢杆菌B7(Bacillus subtilis)的TEM图。

图2B、图2D为本发明B7-S(Bacillus subtilis B7-S)的TEM图。

具体实施方式

试剂：阿魏酸为上海中秦化学试剂有限公司生产。

仪器：Mettler Toledo AL204分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；LDZM型立式智能压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；HWS-150型恒温恒湿培养箱(上海森信实验仪器有限公司)；SHA-B水浴恒温振荡器(江苏常州)；FJA-3型电化学离子测定仪(南京传滴仪器设备有限公司)；德国OPTON万能显微镜(West Germany)；UV-1800PC紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

实施例1一种枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌B7-S(Bacillus subtilis B7-S)，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO：M 2011162(保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2011年5月5日)。

该枯草芽孢杆菌的制备方法，包括以下步骤：

(1)出发菌种的选择：出发菌种为枯草芽孢杆菌B7(Bacillus subtilis)，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC NO：1.210。

(2)制备种子培养基：将10.0g胰蛋白胨、2.0g牛肉浸膏、5.0g氯化钠、0.2g阿魏酸与1.0L蒸馏水混合均匀后，在压强为1.05Kg/cm²、温度为121℃的条件下灭菌20min，即得阿魏酸浓度为0.2～2.0g/L的种子培养基。

(3)诱导：将一环生长良好的出发菌种枯草芽孢杆菌B7(Bacillus subtilis)斜面培养物，按5％的接种量接种至含有50ml的种子培养基的摇瓶中，按阿魏酸浓度自低浓度至高浓度进行继代培养，胁迫菌株耐受高浓度阿魏酸，并置于恒温振荡器上，在25℃的条件下以50r/min的速率进行振荡培养，诱导周期为60天，即获得枯草芽孢杆菌B7-S。

实施例2一种枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌B7-S(Bacillus subtilis B7-S)，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO：M 2011162(保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2011年5月5日)。

该枯草芽孢杆菌的制备方法，包括以下步骤：

(1)出发菌种的选择同实施例1。

(2)制备种子培养基：将20.0g胰蛋白胨、6.0g牛肉浸膏、20.0g氯化钠、2.0g阿魏酸与1.0L蒸馏水混合均匀后，在压强为1.05Kg/cm²、温度为121℃的条件下灭菌20min，即得阿魏酸浓度为0.2～2.0g/L的种子培养基。

(3)诱导：将一环生长良好的出发菌种枯草芽孢杆菌B7(Bacillus subtilis)斜面培养物，按20％的接种量接种至含有150ml的种子培养基的摇瓶中，按阿魏酸浓度自低浓度至高浓度进行继代培养，胁迫菌株耐受高浓度阿魏酸，并置于恒温振荡器上，在45℃的条件下以200r/min的速率进行振荡培养，诱导周期为45天，即获得枯草芽孢杆菌B7-S。

实施例3一种枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌B7-S(Bacillus subtilis B7-S)，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO：M 2011162(保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2011年5月5日)。

该枯草芽孢杆菌的制备方法，包括以下步骤：

(1)出发菌种的选择同实施例1。

(2)制备种子培养基：将15.0g胰蛋白胨、4.0g牛肉浸膏、15.0g氯化钠、1.0g阿魏酸与1.0L蒸馏水混合均匀后，在压强为1.05Kg/cm²、温度为121℃的条件下灭菌20min，即得阿魏酸浓度为0.2～2.0g/L的种子培养基。

(3)诱导：将一环生长良好的出发菌种枯草芽孢杆菌B7(Bacillus subtilis)斜面培养物，按15％的接种量接种至含有100ml的种子培养基的摇瓶中，按阿魏酸浓度自低浓度至高浓度进行继代培养，胁迫菌株耐受高浓度阿魏酸，并置于恒温振荡器上，在35℃的条件下以150r/min的速率进行振荡培养，诱导周期为50天，即获得枯草芽孢杆菌B7-S。

实施例4一种枯草芽孢杆菌生物转化阿魏酸生产香兰素的方法，包括以下步骤：

(1)制备种子培养基：将10.0g胰蛋白胨、2.0g牛肉浸膏、5.0g氯化钠、0.2g阿魏酸与1.0L蒸馏水混合均匀后，在压强为1.05Kg/cm²、温度为121℃的条件下灭菌20min即得阿魏酸浓度为0.2～2.0g/L的种子培养基。

(2)将一环生长良好的枯草芽孢杆菌B7-S斜面培养物按5％的接种量接种至含有50ml种子培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在25℃的条件下以50r/min的速率进行振荡培养60h，至菌液OD_660nm为0.5～0.8时即获得枯草芽孢杆菌B7-S转化用菌液。

(3)收集菌体细胞：取枯草芽孢杆菌B7-S转化用菌液在离心机上以1000r/min的转速离心20min，收集上清液；对上清液以5000r/min的转速离心20min，得到菌体细胞沉淀。

(4)转化：将0.2M且pH值为7.4的磷酸盐缓冲液加到菌体细胞沉淀中，形成菌体浓度为3.0×10⁷～8.0×10⁷个/ml的菌悬液；然后加入浓度为0.2g/L的阿魏酸，在25℃温度下、通气量为0.5L/min，以200r/min的转速进行转化，60h后，得到转化液。

(5)香兰素的分离：将转化液在离心机上以2000r/min的转速离心20min，得到香兰素粗沉淀物。

(6)香兰素粗品的制备：将香兰素粗沉淀物在温度为50℃、压力为0.05Mpa的条件下，真空干燥60h，得到干燥的沉淀物，该干燥的沉淀物用研钵研成粒度为200～300目的粉末后，即得香兰素粗品。

实施例5一种枯草芽孢杆菌生物转化阿魏酸生产香兰素的方法，包括以下步骤：

(1)制备种子培养基：将20.0g胰蛋白胨、6.0g牛肉浸膏、20.0g氯化钠、2.0g阿魏酸与1.0L蒸馏水混合均匀后，在压强为1.05Kg/cm²、温度为121℃的条件下灭菌20min即得阿魏酸浓度为0.2～2.0g/L的种子培养基。

(2)将一环生长良好的枯草芽孢杆菌B7-S斜面培养物按20％的接种量接种至含有200ml种子培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在45℃的条件下以200r/min的速率进行振荡培养30h，至菌液OD_660nm为0.5～0.8时即获得枯草芽孢杆菌B7-S转化用菌液。

(3)收集菌体细胞：取枯草芽孢杆菌B7-S转化用菌液在离心机上以4000r/min的转速离心5min，收集上清液；对上清液以20000r/min的转速离心5min，得到菌体细胞沉淀。

(4)转化：将0.2M且pH值为7.4的磷酸盐缓冲液加到菌体细胞沉淀中，形成菌体浓度为3.0×10⁷～8.0×10⁷个/ml的菌悬液；然后加入浓度为2.0g/L的阿魏酸，在45℃温度下、通气量为1.5L/min，以500r/min的转速进行转化，40h后，得到转化液。

(5)香兰素的分离：将转化液在离心机上以4000r/min的转速离心5min，得到香兰素粗沉淀物。

(6)香兰素粗品的制备：将香兰素粗沉淀物在温度为80℃、压力为0.10Mpa的条件下，真空干燥100h，得到干燥的沉淀物，该干燥的沉淀物用研钵研成粒度为200～300目的粉末后，即得香兰素粗品。

实施例6一种枯草芽孢杆菌生物转化阿魏酸生产香兰素的方法，包括以下步骤：

(1)制备种子培养基：将15.0g胰蛋白胨、4.0g牛肉浸膏、15.0g氯化钠、1.0g阿魏酸与1.0L蒸馏水混合均匀后，在压强为1.05Kg/cm²、温度为121℃的条件下灭菌20min即得阿魏酸浓度为0.2～2.0g/L的种子培养基。

(2)将一环生长良好的枯草芽孢杆菌B7-S斜面培养物按15％的接种量接种至含有150ml种子培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在35℃的条件下以150r/min的速率进行振荡培养45h，至菌液OD_660nm为0.5～0.8时即获得枯草芽孢杆菌B7-S转化用菌液。

(3)收集菌体细胞：取枯草芽孢杆菌B7-S转化用菌液在离心机上以2500r/min的转速离心15min，收集上清液；对上清液以10000r/min的转速离心15min，得到菌体细胞沉淀。

(4)转化：将0.2M且pH值为7.4的磷酸盐缓冲液加到菌体细胞沉淀中，形成菌体浓度为3.0×10⁷～8.0×10⁷个/ml的菌悬液；然后加入浓度为1.0g/L的阿魏酸，在35℃温度下、通气量为1.0L/min，以350r/min的转速进行转化，50h后，得到转化液。

(5)香兰素的分离：将转化液在离心机上以3000r/min的转速离心15min，得到香兰素粗沉淀物。

(6)香兰素粗品的制备：将香兰素粗沉淀物在温度为65℃、压力为0.08Mpa的条件下，真空干燥80h，得到干燥的沉淀物，该干燥的沉淀物用研钵研成粒度为200～300目的粉末后，即得香兰素粗品。

上述实施例4～6中步骤(4)0.2M且pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)是指首先将71.6g Na₂HPO₄·12H₂O溶于1000ml水，得到0.2M Na₂HPO₄；然后将31.2g NaH₂PO₄·2H₂O溶于1000ml水，得到0.2M NaH₂PO₄；最后，将19ml 0.2M的NaH₂PO₄和81ml 0.2M的Na₂HPO₄混合均匀后即得。

步骤(4)中通气量中的空气是指将空气经活性炭过滤后得到的无菌空气。

Claims (4)

1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于：该枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌B7-S(Bacillus subtilis B7-S)，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M2011162。

2.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌生物转化阿魏酸生产香兰素的方法，包括以下步骤：

(1)制备种子培养基：将10.0～20.0g胰蛋白胨、2.0～6.0g牛肉浸膏、5.0～20.0g氯化钠、0.2～2.0g阿魏酸与1.0L蒸馏水混合均匀后，在压强为1.05Kg/cm²、温度为121℃的条件下灭菌20min即得阿魏酸浓度为0.2～2.0g/L的种子培养基；

(2)将一环生长良好的所述枯草芽孢杆菌B7-S斜面培养物按5～20％的接种量接种至含有50～200ml所述种子培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在25～45℃的条件下以50～200r/min的速率进行振荡培养30～60h，至菌液OD_660nm为0.5～0.8时即获得枯草芽孢杆菌B7-S转化用菌液；

(3)收集菌体细胞：取所述枯草芽孢杆菌B7-S转化用菌液在离心机上以1000～4000r/min的转速离心5～20min，收集上清液；对所述上清液以5000～20000r/min的转速离心5～20min，得到菌体细胞沉淀；

(4)转化：将0.2M且pH值为7.4的磷酸盐缓冲液加到所述菌体细胞沉淀中，形成菌体浓度为3.0×10⁷～8.0×10⁷个/ml的菌悬液；然后加入浓度为0.2～2.0g/L的阿魏酸，在25～45℃温度下、通气量为0.5～1.5L/min，以200～500r/min的转速进行转化，40～60h后，得到转化液；

(5)香兰素的分离：将所述转化液在离心机上以2000～4000r/min的转速离心5～20min，得到香兰素粗沉淀物；

(6)香兰素粗品的制备：将所述香兰素粗沉淀物在温度为50～80℃、压力为0.05～0.10Mpa的条件下，真空干燥60～100h，得到干燥的沉淀物，该干燥的沉淀物用研钵研成粒度为200～300目的粉末后，即得香兰素粗品。

3.如权利要求2所述的一种枯草芽孢杆菌生物转化阿魏酸生产香兰素的方法，其特征在于：所述步骤(4)中0.2M且pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)是指首先将71.6g Na₂HPO₄·12H₂O溶于1000ml水，得到0.2M Na₂HPO₄；然后将31.2g NaH₂PO₄·2H₂O溶于1000ml水，得到0.2M NaH₂PO₄；最后，将19ml 0.2M的NaH₂PO₄和81ml 0.2M的Na₂HPO₄混合均匀后即得。

4.如权利要求2所述的一种枯草芽孢杆菌生物转化阿魏酸生产香兰素的方法，其特征在于：所述步骤(4)中通气量中的空气是指将空气经活性炭过滤后得到的无菌空气。

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