CN113957017A - 一种枯草芽孢杆菌及利用枯草芽孢杆菌生产香兰素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了枯草芽孢杆菌，该菌株名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Imau 2‑12，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2021774。本发明公开了一种可以生物转化阿魏酸生产香兰素的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Imau 2‑12，为香兰素的提取和生产提供了新的工程菌株。本发明菌株可用于在阿魏酸发酵培养基中制备发酵液，所述发酵液可应用于卷烟中，增添特殊香气，提高抽吸体验。
Description
技术领域
本申请涉及微生物技术领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌以及枯草芽孢杆菌生产香兰素的方法。
背景技术
香兰素(Vanillin)，化学名称为3-甲氧基-4-羟基苯甲醛(3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde)，在秘鲁香脂、丁子香芽油、香子兰、咖啡、葡萄和白兰地中有发现，具有香子兰气味，味甜。作为赋香剂、矫味剂、协调剂、增香剂应用于食品、烟草、日化和农业。因其用途广泛，每年的需求量以10％的速度增长。
目前常用的香兰素生产方法有植物原料提取法、化学合成法和生物合成法。香兰素在豆荚兰豆中含量约为15～20g/kg，且香荚兰种植受到地域和气候环境的限制，植物中提取的天然香兰素产量远不能满足市场的需求。而化学合成法则存在分离过程复杂、收率低、环境污染严重、原料消耗高等问题。
香兰素的生物合成方法主要有微生物发酵、酶工程、细胞工程等，与化学合成相比，生物法合成香兰素反应条件温和，副产物少，提取步骤简单，生产清洁，环境污染低，产品可靠等优点。并且，国外的立法机构，也认可采用生物活细胞或其中的组成部分(例如酶)所生产的物质为天然产物，由此，利用微生物发酵法生产的香兰素即属于天然香兰素。综合考虑技术可行性、经济性、安全性等因素，微生物发酵法被认为是目前最实际的天然香兰素制取方法。
微生物法合成香兰素的底物较多，相比而言底物阿魏酸广泛存在于麸皮和谷壳等农副产物中，价格低廉，原料充足，通过一步或两步法，就可以生物转化生成香兰素。从安全性方面考虑，以含有阿魏酸的原料为底物，利用生物转化生产香兰素符合欧盟(EU)和食品药品监督管理局(FDA)对天然香精的食用安全要求。
但目前利用微生物转化香兰素，尤其是以阿魏酸为底物生物转化生产香兰素的效率还有待提高。
发明内容
本发明的目的是提供一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Imau 2-12，及其可以生物转化阿魏酸生产香兰素的方法。该菌具有对外抵抗能力强，生长繁殖快，具有较强的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性等优点，十分适用于生物转化阿魏酸生产香兰素的过程。
一方面，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Imau 2-12，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M 2021774(保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2021年7月10日)。菌落颜色为不透明乳白色，圆形菌落边缘整体中间略有拱起。
另一方面，包含所述枯草芽孢杆菌的菌剂。
另一方面，所述的枯草芽孢杆菌和/或所述的菌剂在生产香兰素中的应用。
进一步的，所述应用，利用阿魏酸作为生产香兰素的发酵底物。
另一方面，一种生产香兰素的方法，所述方法包括：向阿魏酸发酵培养基中接种所述的枯草芽孢杆菌进行发酵生产。
进一步的，所述枯草芽孢杆菌采用枯草芽孢杆菌种子液，所述枯草芽孢杆菌种子液采用以下方法培养获得：
将枯草芽孢杆菌菌种接种于摇瓶中，于转速150～200r/min、温度36℃～38℃的条件下恒温震荡培养20～30h；
优选的，所述枯草芽孢杆菌种子液的浓度为10万～100万cfu/mL，优选为60万～70万cfu/mL，接种量为5％～20％，优选接种量10％。
进一步的，所述阿魏酸培养基的组成包括：胰蛋白胨8～15g/L，氯化钠3～6g/L，酵母提取物3～6g/L，阿魏酸0.5～2g/L。
进一步的，所述发酵生产包括恒温震荡培养的步骤，
所述恒温震荡培养的发酵时间为1～8天，优选2～6天，更优选3～5天，更优选4天；和/或，
所述恒温震荡培养的温度为30℃～50℃，优选37℃～45℃，更优选43℃；和/或，
所述恒温震荡培养的转速为120～220r/min，优选160～220r/min，更优选160r/min；和/或，
所述阿魏酸发酵培养基的pH为5～12，优选9～11，更优选10；和/或，
所述阿魏酸发酵培养基的装液量为10％～50％，优选20％～50％，更优选44％。
另一方面，所述的方法制备获得的发酵液，所述发酵液中香兰素含量不低于30mg/L，优选不低于32mg/L。
另一方面，所述的发酵液在烟草产品中的应用。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明公开了一种可以生物转化阿魏酸生产香兰素的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Imau 2-12，本发明的菌株可以在阿魏酸液体培养基中生产香兰素，其中，发酵液中香兰素含量大于30mg/L，最大可达到34.5mg/L。为香兰素的提取和生产提供了新的工程菌株。所生产的香兰素不仅充分保持了香兰素的天然性，有效解决了植物原料提取法产量低，化学合成香兰素存在的原料毒性大，生产过程中产生的废弃物对环境污染严重，以及香兰素的纯度低、安全性低等诸多缺点。
2、在本发明之前，未有报道显示枯草芽孢杆菌可以在阿魏酸培养液中发酵制备奶香型发酵液，本发明的菌株为其制备提供了一种新的途径，填补了奶香型发酵液制备的技术空白。
3、本发明制备的奶香型发酵液可应用于卷烟中，使得卷烟具有特殊奶香风味，提高抽吸体验。
4、本发明中枯草芽孢杆菌参与的制备奶香型发酵液及生产香兰素应用途径具有原料丰富易得、生产成本低、生产工艺简单、安全清洁、无污染等优点。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1是香兰素标准曲线图；
图2是香兰素标品液相色谱图；
图3是菌株Imau 2-12发酵产生香兰素液相色谱图；
图4是菌株Imau 2-12平板培养菌落形态图；
图5是菌株Imau 2-12镜检形态图；
图6是菌株Imau 2-12PCR产物电泳图，其中2-12指Imau 2-12泳道，M指2000bpMarker泳道；
图7是菌株Imau 2-12系统发育树，其中2-12指Imau 2-12菌株；
图8是香草酸、香兰素、阿魏酸混标标准曲线图；
图9是发酵时间对菌株Imau 2-12转化阿魏酸产香兰素的影响图；
图10是温度对菌株Imau 2-12转化阿魏酸产香兰素的影响图；
图11是底物pH对菌株Imau 2-12转化阿魏酸产香兰素的影响图；
图12是装液量对菌株Imau 2-12转化阿魏酸产香兰素的影响图；
图13是转速对菌株Imau 2-12转化阿魏酸产香兰素的影响图。
具体实施方式
为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面结合说明书附图以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
如未特殊说明，在以下实施方式中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
其中：磷酸氢二铵(AR)由天津市智远化学试剂有限公司提供；胰蛋白胨，酵母提取粉，琼脂，Na2EDTA·2H2O(AR)，结晶紫(AR)，Tris-base由广东桓凯微生物科技有限公司提供；甲醇(HPLC)，三氟乙酸(HPLC)由天津市广大化学试剂有限公司提供；香兰素(色谱纯)、香草酸(色谱纯)、阿魏酸(色谱纯)由上海麦克林生化科技有限公司提供；HCB-1300V洁净工作台由上海一恒科学仪器有限公司提供；THZ-98C恒温振荡器由上海一恒科学仪器有限公司提供；SX-500全自动高压灭菌锅由上海新普仪器设备有限公司提供；DHG-9053A电热恒温鼓风干燥箱由上海一恒科学仪器有限公司提供；真空抽滤装置由天津津腾实验设备有限公司提供；Sigma高速离心机由上海成贯仪器有限公司提供；U3000液相色谱仪由上海赛默飞世尔科技提供；7890气相色谱质谱联用仪由安捷伦科技有限公司提供；PCR仪Veriti96由上海赛默飞世尔科技提供。
该菌株名为枯草芽孢杆菌Imau 2-12，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2021774(保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2021年7月10日)。菌落颜色为不透明乳白色，圆形菌落边缘整体中间略有拱起。
下述实施例所涉及的培养基具体成分比配比如表1所示。
表1培养基成分表
实施例1菌株的筛选分离
取样：在无菌操作台中，采用四分法称取酱香大曲20g。用研钵研磨样品后，180mL生理盐水洗涤，振荡培养箱150rpm混匀30min，样品混合均匀后在80℃水浴锅中恒温水浴30min。
菌种富集培养：水浴后吸取5mL曲液接种于富集培养液基中，37℃、150rpm摇床中富集培养24h。
稀释涂布：富集培养后，移液枪吸取1mL菌悬液至9mL生理盐水的试管中稀释。吸取100μL稀释倍数为10-4、10-5、10-6的菌悬液涂布于平板分离培养基中。
分离：于37℃培养箱中培养24h，培养结束后观察菌落形态，挑取单一菌落用划线法接种于平板培养基中分离纯化。
培养基具体配比见表1中富集培养基、平板分离培养基。
实施例2菌株生物转化阿魏酸生产香兰素的发酵方法
S1：将保藏菌株接种到活化培养基上，35～40℃下静置培养12～24h。
S2：种子培养基接种菌株后，在温度为35～40℃、转速为150r/min培养条件下，培养12～24小时得到种子液。
S3：阿魏酸发酵培养基接种种子液后，在温度为35～40℃、转速为100～180rpm培养条件下，发酵100～150小时。
菌株生物转化葡萄糖产香兰素过程中所需活化培养基及葡萄糖发酵培养基如表1所示。
实施例3菌株产香兰素能力试验
本实验对菌株进行初步筛选，得到了24株产香兰素能力较强的菌株，具体结果见表2。
表2产量较高菌株筛选
以香兰素含量(x,mg/L)为横坐标，OD280(y)为纵坐标绘制香兰素标准曲线，结果见图1。由图1可知，标准曲线回归方程为y＝71.716x+13.049，相关系数R2＝0.9999。香兰素含量与吸光度值呈现良好的线性关系。
本试验参照赵建芬等人所用的高效液相色谱法对香兰素标品进行HPLC检测(参考文献：赵建芬,韦寿莲,张素斌.HPLC法监测香兰素的发酵合成[J].食品工业科技,2009(05):332-333.)。得到的液相色谱图如图2所示，香兰素标品的保留时间为11.680min。对菌株Imau 2-12发酵后发酵液中的香兰素进行HPLC检测，得到的得到的液相色谱图如图3所示，香兰素的保留时间约为11.518min。
进一步测定发酵液检测香兰素的浓度。菌株Imau 2-12是24株待测菌株中香兰素产量最高的菌株，因此选择菌株Imau 2-12作为下一步的试验菌株。
实施例4菌株的分类鉴定
检测菌株Imau 2-12在平板分离培养基上的生长情况，菌落形态与颜色，观察结果如图4所示，由图可得，菌落颜色为不透明乳白色，圆形菌落边缘整体中间略有拱起。对菌株Imau 2-12进行芽孢染色，镜检结果如图5所示，菌体为单细胞杆状，芽孢为椭圆或卵圆形。
对株菌Imau 2-12进行鉴定。使用细菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株基因组DNA，用通用引物进行PCR，PCR结果如图6所示，后送上海生工生物工程有限公司进行测序，通过NCBI序列比对，确定所筛菌株的种属为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌。
采用多种生物学软件对测得的序列进行分析，构建系统发育树，构建结果如图7所示，系统发育学分析显示菌株Imau 2-12与Bacillus subtilis strain N601(MK629827.1)聚为单独的一支。
通过微生物形态学、生理生化、16S rDNA序列鉴定，系统发育学分析Imau 2-12号菌为芽孢杆菌属中的枯草芽孢杆菌。
实施例5发酵液中香兰素、阿魏酸、香草酸含量测定
在香兰素的转化过程中，会产生和积累一些中间代谢物和香兰素进一步降解物，如阿魏酸、香草酸、愈创木酚、香草醇和原儿茶酸。阿魏酸是香兰素合成的重要前体物，香草酸是香兰素进一步转化的主要产物，因此本研究通过HPLC法测定发酵液中阿魏酸、香兰素和香草酸含量的变化，来进一步探究各因素对菌株生长细胞转化产香兰素的影响。
根据图8可知，用40％甲醇溶液配制的香草酸、香兰素和阿魏酸的混合标准溶液在2～100mg/L线性范围内，阿魏酸、香兰素和香草酸的线性回归方程为依次为y＝0.6711x-1.7968，y＝0.6022x-0.562，y＝0.4019x-0.0941，相关系数依次为R2＝0.9994，R2＝0.9996，R2＝0.9996，其线性关系均良好，可以用来定量分析发酵液中香兰素等物质。
实施例6不同发酵时间对菌株Imau 2-12转化阿魏酸产香兰素的影响
以发酵时间作为变量进行单因素实验。具体操作方法为：将培养24h的种子液按10％的接种量接种于装液量为20％的阿魏酸发酵培养基中，在180r/min恒温震荡培养箱中，37℃发酵培养，每隔一天取样测定发酵液中香兰素、阿魏酸和香草酸的含量。
由图9可知，发酵液中香草酸浓度随着发酵时间的增加而不断升高，当发酵到第7天时香草酸发生跳跃式增加，浓度达到了28.3mg/L，随后浓度基本保持稳定不变，一方面有可能是在第7天时发酵液各酚类物质积累量起到了一定的诱导作用，促进了香草酸的产生；另一方面菌体生长量在第7天时也急剧升高，说明菌株Imau 2-12具有较强的产香草酸的能力。发酵液中残留的阿魏酸随着发酵时间的推移呈现M型变化趋势，有可能是产生的其它酚类物质又转化生成了阿魏酸。随着发酵时间的不断推移，发酵液中香兰素的含量逐渐增加，发酵到第4天时，发酵液中的香兰素浓度达到最大25.4mg/L，当发酵时间超过4天时，香兰素浓度逐渐降低。因此选择发酵4天为菌株Imau 2-12转化阿魏酸产香兰素的最适发酵时间。
实施例7不同温度对菌株Imau 2-12转化阿魏酸产香兰素的影响
以温度作为变量进行单因素实验。具体操作方法为：将培养24h的种子液按10％的接种量接种于装液量为20％的阿魏酸发酵培养基中，在180r/min恒温震荡培养箱中，设置30℃、35℃、37℃、40℃、45℃和50℃等6个发酵温度梯度，发酵培养4天。
由图10可知，在30℃、35℃时，大部分阿魏酸转化成了香草酸，香兰素浓度较低。当温度在37～45℃时，发酵液中产生了大量的香兰素，香草酸含量降低；在40℃时香兰素的浓度达到最大23.8mg/L，其菌体生长量也迅速升高；在45℃时菌体生长量达到最大0.744(OD600)。当温度超过45℃时，发酵液中香兰素和香草酸含量减少，发酵液中剩余的阿魏酸基本不变。由此可以看出，菌株Imau 2-12最适转化温度范围为37～45℃，产香兰素的最佳转化温度为40℃。因此选择40℃为菌株Imau 2-12转化阿魏酸产香兰素的最适发酵温度。
实施例8不同底物pH对菌株Imau 2-12转化阿魏酸产香兰素的影响
以底物pH作为变量进行单因素实验。具体操作方法为：将培养24h的种子液按10％的接种量接种于pH为5、6、7、8、9、10、11、12的阿魏酸发酵培养基的锥形瓶中，在180r/min恒温震荡培养箱中，37℃发酵培养4天。
由图11可知，底物pH为5、6、7和8时，发酵液中剩余的阿魏酸较多，并随着pH的增大而增大。当pH大于8时，发酵液中残留的阿魏酸减少并趋于稳定在5.2mg/L，这主要是因为随着pH的不断增大，发酵液中的阿魏酸大部分以阿魏酸钠的形式存在。香草酸在酸性条件含量大于碱性条件下，主要是因为在碱性条件下，香草酸被中和成香草酸纳溶液了。菌体生长量随着pH的增高而不断升高，当底物pH升高至9时，菌体生长量达到最大为0.472(OD600)。当pH为10时，菌体生长量迅速降低，随后并保持恒定，同时香兰素浓度达到最大43.1mg/L，由此推断，高浓度的香兰素对菌株Imau 2-12的生长具有一定的抑制作用，在碱性环境下更有利于阿魏酸转化产香兰素。因此选择pH＝10为菌株Imau 2-12转化阿魏酸产香兰素的最适底物pH。
实施例9不同装液量对菌株Imau 2-12转化阿魏酸产香兰素的影响
以装液量作为变量进行单因素实验。具体操作方法为：将培养24h的种子液按10％的接种量接种于装液量为10％、20％、30％、40％、50％的阿魏酸发酵培养基中，在180r/min恒温震荡培养箱中，37℃发酵培养4天。
由图12可知，随着装液量的增加发酵液中剩余的阿魏酸含量逐渐增大，香草酸的浓度逐渐减小，菌体生长量也逐渐减小，这说明香草酸转化过程中需要较多的氧气，菌株Imau 2-12是好氧微生物。随着装液量的不断增大，香兰素的浓度液随之增加，当装液量为40％时，发酵液中的香兰素浓度达到最大22.5mg/L，随后缓慢降低。由此可以推断，Imau 2-12菌株在高氧浓度下转化阿魏酸生成香兰素的速度小于转化香兰素生成阿魏酸的速度，在低氧浓度下更有利于生成香兰素。为了防止香兰素变成香草酸，应该控制发酵液中的溶氧量，因此选择装液量为40％为菌株Imau 2-12转化阿魏酸产香兰素的最适装液量。
实施例10不同摇床转速对菌株Imau 2-12转化阿魏酸产香兰素的影响
以转速作为变量进行单因素实验。具体操作方法为：将培养24h的种子液按10％的接种量接种于装液量为20％阿魏酸发酵培养基中，在120r/min、140r/min、160r/min、180r/min、200r/min、220r/min的不同恒温震荡培养箱中，37℃发酵培养4天。
摇瓶装液量和转速是影响发酵液溶氧量的两个重要因素，同时也影响发酵液中氧化还原反应和各酚类化合物的转化。
由图13可知，随着转速的不断增加，发酵液中剩余的阿魏酸和生成的香草酸成负相关，说明随着溶氧量的增加，发酵液中的阿魏酸更有利于转化成香草酸。发酵液中的香兰素和菌体生长量随着转速的增加先增加后减小，香兰素和菌体生长量均在160r/min时最大，香兰素浓度达到了23.0mg/L。这表明在160r/min时，菌株Imau 2-12具有较强的转化阿魏酸产香兰素能力。
实施例11菌株Imau 2-12转化阿魏酸产香兰素正交试验工艺优化
进一步对菌株Imau 2-12转化阿魏酸产香兰素发酵条件，即奶香型发酵液生产条件进行正交试验，探究影响菌株生长细胞转化生产香兰素的主要因素：A发酵温度(℃)、B底物pH、C装液量(％)、D转速(r/min)进行L9(34)正交试验。
由正交试验结果表3可得，菌株Imau 2-12转化阿魏酸产香兰素的最优工艺为A3B2C3D2，即温度43℃、pH＝10、装液量44％、转速160r/min。从表4中的极差比较可以得到，各因素对菌株Imau 2-12产香兰素的影响大小为A>B>D>C，即发酵温度对菌株产香兰素的影响最大，装液量影响最小。由方差分析表可知，各因素均不显著。
表3菌株Imau 2-12产香兰素工艺正交试验结果
表4菌株Imau 2-12产香兰素工艺正交试验方差分析结果
注：F0.05(2,8)＝4.459
在确定的最优条件，做三组平行验证试验，结果表明，菌株Imau 2-12在温度43℃、pH为10、装液量44％、转速160r/min、接种量10％条件下发酵4天，发酵液中的香兰素浓度为34.5mg/L。
以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
Claims (10)
1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，该枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Imau 2-12，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2021774。
2.包含权利要求1所述枯草芽孢杆菌的菌剂。
3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌和/或权利要求2所述的菌剂在生产香兰素中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，利用阿魏酸作为生产香兰素的发酵底物。
5.一种生产香兰素的方法，其特征在于，所述方法包括：向阿魏酸发酵培养基中接种如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌进行发酵生产。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌采用枯草芽孢杆菌种子液，所述枯草芽孢杆菌种子液采用以下方法培养获得：
将枯草芽孢杆菌菌种接种于摇瓶中，于转速150～200r/min、温度36℃～38℃的条件下恒温震荡培养20～30h；
优选的，所述枯草芽孢杆菌种子液的浓度为10万～100万cfu/mL，优选为60万～70万cfu/mL，接种量为5％～20％，优选接种量10％。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述阿魏酸培养基的组成包括：胰蛋白胨8～15g/L，氯化钠3～6g/L，酵母提取物3～6g/L，阿魏酸0.5～2g/L。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵生产包括恒温震荡培养的步骤，
所述恒温震荡培养的发酵时间为1～8天，优选2～6天，更优选3～5天，更优选4天；和/或，
所述恒温震荡培养的温度为30℃～50℃，优选37℃～45℃，更优选43℃；和/或，
所述恒温震荡培养的转速为120～220r/min，优选160～220r/min，更优选160r/min；和/或，
所述阿魏酸发酵培养基的pH为5～12，优选9～11，更优选10；和/或，
所述阿魏酸发酵培养基的装液量为10％～50％，优选20％～50％，更优选44％。
9.如权利要求5-8任一所述的方法制备获得的发酵液，其特征在于，所述发酵液中香兰素含量不低于30mg/L，优选不低于32mg/L。
10.如权利要求9所述的发酵液在烟草产品中的应用。
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Non-Patent Citations (1)
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| PENG CHEN等: "Optimizing bioconversion of ferulic acid to vanillin by Bacillus subtilis in the stirred packed reactor using Box-Behnken design and desirability function", FOOD SCI. BIOTECHNOL * |
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