CN114410549A - 一种高产乙偶姻的复合发酵剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产乙偶姻的复合发酵剂，包含巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)CGMCC19485和瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CGMCC12225，本发明还公开了所述复合发酵剂在食醋酿造中的应用，该复合发酵剂在食醋醋酸发酵阶段接入。本发明的复合发酵剂可用于酿造固态发酵食醋和液态发酵食醋，发酵剂用量少、发酵效率快、乙偶姻和川芎嗪产量高、产品品质稳定，提升食醋产品香味及滋味。

Description

一种高产乙偶姻的复合发酵剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种复合发酵剂，本发明还涉及所述复合发酵剂在食醋酿造中的应用。

背景技术

食醋是中国家庭常见的酸味调味品，不仅含有乙酸、乳酸等多种常规调味用风味物质，还含有氨基酸、蛋白质、黄酮、多酚等功能物质，在一定程度上赋予了食醋保健功能。国内多位学者对我国多种传统食醋的功能性成分进行了研究，结果均证明川芎嗪是食醋中重要的保健功能因子及风味成分，具有明显的降血压作用。2014年实施的《地理标志产品山西老陈醋》(GB/T 19777-2013)新标准将川芎嗪作为一项特征指标添加进去，更充分说明川芎嗪这一功能物质在提高食醋品质方面具有重大意义。由于川芎嗪对食醋风味及保健品质具有重要作用，使得目前提高食醋中的川芎嗪含量已经成为一项重要研究。

研究已经证实，乙偶姻是川芎嗪的关键前体物质，在食醋的煎煮及陈酿阶段，乙偶姻通过物化反应大量转化为川芎嗪，因此，提高食醋中的乙偶姻含量是提高川芎嗪含量的策略之一。为了增加食醋中川芎嗪含量，虽然可以直接在食醋中添加前体乙偶姻，但食品级的乙偶姻价格较高，而且为了尽量避免直接外源引入化学物质造成食品安全隐患，因此优选利用内源性微生物来提高酿造体系乙偶姻的产量，此法绿色、经济、健康、安全，在保障食醋安全性的基础上，对改善食醋品质具有重要意义。

陈继承等在《食醋中川芎嗪快速检测及其生成机理初探》(中国食品学报，2013，13(05)：223-229)中公开了利用HPLC方法对全国镇江香醋、山西老陈醋、福建香醋、浙江玫瑰醋等36个食醋样品中的乙偶姻含量检测，发现不同食醋中的乙偶姻含量相差较大，含量从低至未检测出到最高含量达5.60g/kg，其中以广东香醋含量最高。公开号为CN109666616A的中国发明专利“高产乙偶姻及增香莫海威芽孢杆菌直投式发酵剂的制备方法及在山西老陈醋生产中的应用”公开了一种将增香莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋生产中，以提高新淋醋中川芎嗪含量的方法。此法利用的增香莫海威芽孢杆菌CGMCC 16910的乙偶姻产量为45.63g/L，最终生产的新淋醋中川芎嗪含量为266.47mg/L。总体而言，目前食醋中乙偶姻和川芎嗪的含量仍然偏低且含量不稳定。稳定提高食醋中的乙偶姻及川芎嗪含量，改善食醋产品风味、提高产品品质的方法鲜有报道。

发明内容

发明目的：本发明旨在提供一种用量少、发酵效率快、乙偶姻和川芎嗪产量高、产品品质稳定的复合发酵剂，本发明的另一目的是提供所述发酵剂在食醋酿造中的应用。

技术方案：本发明内容为一种复合发酵剂，所述复合发酵剂包含巴氏醋杆菌CGMCC19485和瑞士乳杆菌CGMCC12225。

所述巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)CGMCC19485保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏登记入册的编号为CGMCC No.19485，保藏日期为2020年3月17日，在公开号为CN112094769A的中国发明专利申请“一株巴氏醋杆菌巴氏亚种、微生物菌剂及其应用”中公开了该菌株。

所述瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)CGMCC12225保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏登记入册的编号为CGMCC No.12225，保藏日期为2016年3月18日，在公开号为CN111808714A的中国发明专利申请“一种羊肚菌芦荟玉米芽醋及其制备方法”和公开号为CN106119166A的中国发明专利申请“一株瑞士乳酸菌及其应用”中公开了该菌株。

优选，所述复合发酵剂重量份包含5～10份巴氏醋杆菌CGMCC19485、10～20份瑞士乳杆菌CGMCC12225。

优选，所述复合发酵剂中巴氏醋杆菌CGMCC19485，瑞士乳杆菌CGMCC12225的活菌数均为1.0×10⁸～1.0×10¹⁰CFU/g。

本发明内容还包括一种食醋的酿造方法，包括以下步骤：

(1)制备权利要求1所述的微生物复合发酵剂；

(2)利用步骤(1)得到的微生物复合菌剂进行发酵即得。

其中，将巴氏醋杆菌CGMCC19485和瑞士乳杆菌CGMCC12225单独分别用液体肉汤培养基、液体MRS培养基进行三级扩培，培养结束后采用中空纤维膜浓缩发酵液至原发酵液体积的1/5，然后将无菌保护剂与菌体均匀混合放置在45℃的培养箱中热激8s，再利用低温喷雾干燥制得菌剂，菌剂的活菌数均为1.0×10⁸～1.0×10¹⁰CFU/g菌剂。在无菌操作环境中，将菌剂按重量份包含5～10份巴氏醋杆菌CGMCC19485、10～20份瑞士乳杆菌CGMCC12225混合，分装于真空包装袋中，即为复合发酵剂，阴凉干燥条件下贮存期为一年。

其中，无菌保护剂的制备：A：脱脂奶粉10g，蒸馏水100mL，115℃灭菌15min；B：甘油0.5g、山梨醇2g、木糖醇1g、麦芽糊精1g、蒸馏水100mL，121℃灭菌15min；A、B分别灭菌后，冷却至室温混合，即为保护剂。低温喷雾干燥工艺参数：出风温度为55℃，进风温度为120℃，干燥时间5min，水分含量为≤5％。

其中，当制备香醋、陈醋、米醋或苹果醋时，分别接入酒醪重量1～5％(w/w)的复合发酵剂进行醋酸发酵。所述复合发酵剂可以直投也可以活化后加入。

其中，所述复合发酵剂活化方法为：1g复合发酵剂溶到10mL无菌水中，35℃活化30min。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：从镇江香醋生产工艺过程的醋醅中分离筛选得到的巴氏醋杆菌CGMCC19485和瑞士乳杆菌CGMCC12225，制得的复合发酵剂应用在食醋酿造领域，可稳定显著提高食醋中乙偶姻和川芎嗪的含量，改善产品风味，提高产品品质；该复合发酵剂应用在食醋酿造中具有高产乙偶姻的活性，其中，乙偶姻含量可达59.35g/L，川芎嗪含量可达413.39mg/L；该复合发酵剂应用在食醋酿造中，产品的香味及滋味也明显优于对照组。

附图说明

图1为本发明的巴氏醋杆菌CGMCC19485的菌落形态；

图2为本发明的瑞士乳杆菌CGMCC12225的菌落形态。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

本发明实施例中：

肉汤培养基：葡萄糖25.0g、蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，碳酸钙20.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.2，115℃灭菌20min。使用前加入3％(v/v)无水乙醇。用于醋酸菌培养。

MRS培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，碳酸钙20.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH 6.2～6.6，115℃灭菌20min。用于乳酸菌培养。

醋醅模拟培养体系：取自镇江香醋醋酸发酵第0天的醋醅(麸皮、糠、酒醪混合物，未接菌种)。

本发明的复合发酵剂制备方法如下：将巴氏醋杆菌CGMCC19485和瑞士乳杆菌CGMCC12225单独分别用液体肉汤培养基、液体MRS培养基进行三级扩培，培养结束后采用中空纤维膜浓缩发酵液至原发酵液体积的1/5，然后将无菌保护剂与菌体均匀混合放置在45℃的培养箱中热激8s，再利用低温喷雾干燥制得菌剂，菌剂的活菌数均为1.0×10⁸～1.0×10¹⁰CFU/g菌剂。在无菌操作环境中，将菌剂按重量份包含5～10份巴氏醋杆菌CGMCC19485、10～20份瑞士乳杆菌CGMCC12225混合，分装于真空包装袋中，即为复合发酵剂，阴凉干燥条件下贮存期为一年。其中，无菌保护剂的制备：A：脱脂奶粉10g，蒸馏水100mL，115℃灭菌15min；B：甘油0.5g、山梨醇2g、木糖醇1g、麦芽糊精1g、蒸馏水100mL，121℃灭菌15min；A，B分别灭菌后，冷却至室温混合，即为保护剂。低温喷雾干燥工艺参数：出风温度为55℃，进风温度为120℃，干燥时间5min，水分含量为≤5％。

本发明实施例中复合发酵剂活化方法为：1g复合发酵剂溶到10mL无菌水中，35℃活化30min。

实施例中各项指标检测方法如下：总酸和不挥发酸参照《GB18187-2000》方法进行测定，总酸以乙酸计，不挥发酸以乳酸计；有机酸、川芎嗪采用HPLC法进行测定；乙偶姻采用肌酸比色法进行测定。

本发明的复合发酵剂不仅可应用于下述食醋的酿造，也适用于其它固态和液态发酵食醋的酿造。

实施例1：巴氏醋杆菌和瑞士乳杆菌的分离与鉴定

本实施例中碳酸钙、葡萄糖、琼脂粉、无水乙醇、乙酸和氢氧化钠均购自国药集团化学试剂有限公司，酵母提取物购自英国OXOID公司。

(1)菌株分离

分别称取镇江香醋醋醅样品10g，置于90mL已灭菌的肉汤液体培养基、MRS液体培养基中，温度37℃、转速200r/min，振荡培养20min后，对样品进行10倍梯度稀释，选取稀释梯度为10^-3、10^-4、10^-5和10^-6的稀释液，各梯度稀释液各吸取100μL涂布肉汤培养基平板、MRS培养基平板，37℃倒置培养24-48h。

(2)产酸菌株的纯化与复筛

分别挑取肉汤培养基平板、MRS培养基平板产透明圈较大的菌落，将单个菌落平板划线分离3次，取单菌落接种到复筛液体培养基中，培养72h后测定产酸量，分别选取产酸量最大的菌株4℃冰箱保存以供使用。

(3)菌株分子鉴定

纯化筛选得到的细菌，取指数生长期的新鲜菌液，离心收集菌体，采用基因组抽提试剂盒提取基因组DNA。采用细菌通用引物P0-P6扩增其16S rDNA全长序列。PCR扩增产物的测序由上海生工生物技术公司完成。将测得的16S rDNA序列，在NCBI数据库中进行BLAST比对确定其种属。肉汤培养基平板上筛得的菌株16S rDNA全长序列为1352bp，与其具有最高同源性的菌株为Acetobacter pasteurianus，相似度为99％，16S rDNA序列见SEQ ID No：1，将该菌株命名为巴氏醋杆菌HSCY1014。MRS培养基平板上筛得的菌株16S rDNA全长序列为1432bp，与其具有最高同源性的菌株为Lactobacillus helveticus，相似度为99％，16SrDNA序列见SEQ ID No：2，将该菌株命名为瑞士乳杆菌HSCY2160。

上述菌株分别于2020年3月17日、2016年3月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏登记入册的编号分别为保藏登记入册的编号分别为CGMCC No.19485、CGMCCNo.12225，其分类命名分别为Acetobacter pasteurianus、Lactobacillus helveticus。

实施例2菌株在醋醅模拟体系中产乙偶姻含量的测定

试验组：

取发酵第0天的镇江香醋醋醅6kg置于10L塑料桶中，新鲜活化的巴氏醋杆菌CGMCC19485菌液，接种量为醋醅重量的1％，再接种新鲜活化的瑞士乳杆菌CGMCC12225菌液，接种量为醋醅重量的1％，再按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。

对照组1：

取发酵第0天的镇江香醋醋醅6kg置于10L塑料桶中，接种新鲜活化的巴氏醋杆菌CGMCC19485菌液，接种量为醋醅重量的1％，再按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。

对照组2：

取发酵第0天的镇江香醋醋醅6kg置于10L塑料桶中，接种新鲜活化的巴氏醋杆菌CGMCC19485菌液，接种量为醋醅重量的1％，再接种新鲜活化的购自CICC、菌株保藏编号为CICC 22171的瑞士乳杆菌菌液，接种量为醋醅重量的1％，再按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。

对照组3：

取发酵第0天的镇江香醋醋醅6kg置于10L塑料桶中，接种新鲜活化的巴氏醋杆菌CGMCC19485菌液，接种量为醋醅重量的1％，再接种新鲜活化的购自CICC、菌株保藏编号为CICC 21790的植物乳杆菌菌液，接种量为醋醅重量的1％，再按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。

对照组4：

取发酵第0天的醋醅6kg置于10L塑料桶中，接种新鲜活化的购自CICC、菌株保藏编号为CICC 20056的巴氏醋杆菌菌液，接种量为醋醅重量的1％，再接种新鲜活化的瑞士乳杆菌CGMCC12225菌液，接种量为醋醅重量的1％，再按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。

对照组5：

取发酵第0天的醋醅6kg置于10L塑料桶中，接种新鲜活化的购自CICC、菌株保藏编号为CICC 20064的巴氏醋杆菌菌液，接种量为醋醅重量的1％，再接种新鲜活化的瑞士乳杆菌CGMCC12225菌液，接种量为醋醅重量的1％，再按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。

对照组6：

取发酵第0天的醋醅6kg置于10L塑料桶中，接种新鲜活化的购自CICC、菌株保藏编号为CICC 20056的巴氏醋杆菌菌液，接种量为醋醅重量的1％，再接种新鲜活化的购自CICC、菌株保藏编号为CICC 22171的瑞士乳杆菌菌液，接种量为醋醅重量的1％，再按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。

发酵结束时，取各组醋卤检测总酸、乙偶姻。总酸以乙酸计，采用酸碱滴定法测定。采用肌酸比色法测定乙偶姻含量，具体方法为：精准配制浓度分别为25、50、75、100、125、175、225mg/L的一系列乙偶姻标准溶液。分别取标准液100μL，加入2.4mL去离子水、0.5mL肌酸溶液(0.5％，w/v)、0.5mL l-萘酚溶液(5％，w/v)、0.5mL氢氧化钠溶液(10％，w/v)，混匀，于30℃水浴1h后，测定溶液OD_520nm。以乙偶姻浓度为横坐标，OD_520nm为纵坐标绘制标准曲线。取稀释后样品100μL，根据标准曲线测定方法得到样品OD_520nm，利用标准曲线计算乙偶姻含量。发酵结束醋卤中总酸、乙偶姻的检测结果如表1所示。

表1发酵结束醋卤中总酸、乙偶姻含量

组别	总酸(g/100mL)	乙偶姻(g/L)
			试验组	7.72	23.15
对照组1	7.43	1.46
			对照组2	7.28	3.17
对照组3	7.30	0.63
			对照组4	7.29	2.46
对照组5	6.94	1.87
			对照组6	7.12	2.91

实施例3复合发酵剂在镇江香醋酿造中的应用

1、酒精发酵

选取500kg大缸，倒入50kg糯米加水浸泡过夜。然后再将糯米捞出、冲净、沥干，再将糯米经蒸饭机蒸煮，得到糯米熟料。用冷水淋洗糯米熟料，再取温水进行回淋，使糯米熟料温度上下均匀。将淋洗后的糯米熟料置于大缸中，加入熟料重量1.5％的麦曲和0.5％的购自CICC、菌株保藏编号为CICC 1001的酿酒酵母，拌匀后进行酒精发酵，发酵周期为5-7d，得酒醪。

2、醋酸发酵

试验组：

选取500kg大缸，加入酒醪190kg，麸皮61kg，大糠29kg，将所投原料充分拌匀后，接种复合发酵剂。称取酒醪重量1％的复合发酵剂活化(1g发酵剂溶到10mL无菌水中，35℃活化30min)后接种，再按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。

对照组：

选取500kg大缸，加入酒醪190kg，麸皮61kg，大糠29kg，将所投原料充分拌匀后，接种自制醋酸菌菌剂(醋酸菌购自CICC、菌株保藏编号为CICC 20001，菌剂的活菌数为1.0×10⁸～1.0×10¹⁰CFU/g菌剂)。称取酒醪重量1％的自制醋酸菌菌剂活化(1g菌剂溶到10mL无菌水中，35℃活化30min)后接种，再按照镇江香醋酿造工艺进行带种、固态分层翻醅发酵至发酵结束。

3、加盐封醅7天，然后加入炒米色进行淋醋。经煎醋、陈酿、杀菌灌装，即得成品。对照组步骤与试验组保持一致。

4、总酸含量

发酵结束时，取两组醋卤检测总酸，总酸以乙酸计，采用酸碱滴定法测定。添加复合发酵剂组的总酸含量为8.31g/100mL，对照组为7.73g/100mL，相比于对照组，总酸提升了7.5％。

5、有机酸含量

采用HPLC对发酵结束的醋卤中7种有机酸含量进行分析，结果如表2所示。发酵结束后，醋卤中的有机酸主要以乙酸与乳酸为主，二者在添加复合发酵剂组中的含量分别为58.35mg/mL和17.37mg/mL，相比于对照组分别提高了17.59％和87.18％。

表2发酵结束醋卤中的有机酸含量

6、生醋液中乙偶姻和川芎嗪含量

采用肌酸比色法测定乙偶姻含量。采用HPLC法测定川芎嗪含量，具体方法为：精准配制浓度分别为5、10、25、50、100mg/L的一系列川芎嗪标准溶液，利用HPLC法得到标准曲线。准确量取10mL醋液，用氢氧化钠调节pH大于8，用10mL氯仿分两次萃取醋液，合并两次氯仿相，再用9mL稀盐酸溶液(0.2mol/L)分两次萃取氯仿相，合并水相后用稀盐酸定容至10mL，所得溶液按照标准曲线的测定方法得到川芎嗪峰面积，根据标准曲线计算川芎嗪含量。生醋液中乙偶姻和川芎嗪含量的检测结果如表3所示。

表3生醋液中的乙偶姻、川芎嗪含量

组别	乙偶姻(g/L)	川芎嗪(mg/L)
			试验组	56.71	272.30
对照组	5.93	24.36

7、成品醋感官指标分析

试验组与对照组的食醋产品感官指标评分结果见表4。试验组的成品醋香味及滋味明显优于对照组，说明在醋酸发酵阶段添加复合发酵剂，显著提高了产品品质。

表4成品醋感官指标分析

组别	色泽(10分)	体态(10分)	香味(10分)	滋味(10分)
					试验组	9.2	9.1	9.3	9.5
对照组	9.0	9.0	7.9	6.8

实施例4复合发酵剂在山西老陈醋中的应用

1、酒精发酵

将高粱粉碎成四六瓣后，加入50℃温水浸泡过夜，将浸泡好的高粱蒸煮2h，每100kg高粱加入60kg大曲拌匀，控制发酵温度为28-32℃，接种购自CICC、菌株保藏编号为CICC 1001的酿酒酵母进行酒精发酵，前3天为敞口发酵，之后再封口静置发酵15天。

2、醋酸发酵

试验组：

选取500kg大缸，加入酒醪200kg，麸皮92kg，大糠107kg，将所投原料充分拌匀后，接种复合发酵剂。称取酒醪重量5％的复合发酵剂活化(1g发酵剂溶到10mL无菌水中，35℃活化30min)后接种，再按照山西老陈醋的固态发酵工艺进行翻醅操作至发酵结束。

对照组：

选取500kg大缸，加入酒醪200kg，麸皮92kg，大糠107kg，将所投原料充分拌匀后，接种自制醋酸菌菌剂(醋酸菌购自CICC、菌株保藏编号为CICC 20001，菌剂的活菌数为1.0×10⁸～1.0×10¹⁰CFU/g菌剂)。称取酒醪重量5％的自制醋酸菌菌剂活化(1g菌剂溶到10mL无菌水中，35℃活化30min)后接种，再按照山西老陈醋的固态发酵工艺进行翻醅操作至发酵结束。

3、加盐封醅10天，经熏醅、淋煎醋、陈酿、杀菌灌装，即得成品。对照组步骤与试验组保持一致。

4、总酸含量

发酵结束时，取两组醋卤检测总酸，总酸以乙酸计，采用酸碱滴定法测定。试验组的总酸含量为5.37g/100mL，对照组为4.82g/100mL，相比于对照组，总酸提升了11.41％。

5、有机酸含量

采用HPLC法对发酵结束的醋卤中7种有机酸含量进行分析，结果如表5所示。发酵结束后，醋卤中的有机酸主要以乙酸与乳酸为主，二者在添加复合发酵剂组中的含量分别为35.28mg/mL和14.51mg/ml，相比于对照组分别提高了27.87％和68.33％。

表5发酵结束醋卤中的有机酸含量

6、生醋液中乙偶姻和川芎嗪含量

采用肌酸比色法测定乙偶姻含量，采用HPLC法测定川芎嗪含量，结果如表6所示。

表6生醋液中的乙偶姻、川芎嗪含量

组别	乙偶姻(g/L)	川芎嗪(mg/L)
			试验组	59.35	413.39
对照组	5.67	36.21

7、成品醋感官指标分析

试验组与对照组的食醋产品感官指标评分结果见表7。试验组的成品醋香味及滋味明显优于对照组，说明在醋酸发酵阶段添加复合发酵剂，显著提高了产品品质。

表7成品醋感官指标分析

组别	色泽(10分)	体态(10分)	香味(10分)	滋味(10分)
					试验组	9.2	9.4	9.7	9.2
对照组	8.9	9.2	7.3	6.0

实施例5复合发酵剂在液态米醋酿造中的应用

1、酒精发酵

将糯米经粉碎机粉碎成细粉后，与水按照1：5(w/w)的比例加入糊化罐中。加入2万U/mL的高温α-淀粉酶，添加量为每吨糯米加入0.5L。利用螺旋式冷却器将醪液温度降至60℃后，转入糖化罐，加入10万U/g的糖化酶，添加量为每吨糯米加入50g，55℃保温40min。保温结束后，利用螺旋式冷却器将温度降至30℃后，转入酒精发酵罐。接种购自CICC、菌株保藏编号为CICC 1001的酿酒酵母，接种量为5％(v/v)，控制温度为30℃，发酵至酒精度为8％vol。

2、醋酸发酵

试验组：

选取1个500L发酵罐，加入250L酒精度为8％vol的米酒，称取米酒重量1％的复合发酵剂活化(1g发酵剂溶到10mL无菌水中，35℃活化30min)后接种，温度为30℃，调整通气量为0.4vvm，搅拌速度为200r/min进行醋酸发酵。

对照组：

选取1个500L发酵罐，加入250L酒精度为8％vol的米酒，接种自制醋酸菌菌剂(醋酸菌购自CICC、菌株保藏编号为CICC 20001，菌剂的活菌数为1.0×10⁸～1.0×10¹⁰CFU/g菌剂)。称取米酒重量1％的自制醋酸菌菌剂活化(1g菌剂溶到10mL无菌水中，35℃活化30min)后接种，温度为30℃，调整通气量为0.4vvm，搅拌速度为200r/min进行醋酸发酵。

3、发酵结束的醋液采用0.01μm陶瓷膜过滤后，调配酸度，灌装即得成品。

4、理化指标检测

发酵结束后分别对酿造的米醋中总酸、不挥发酸及乙偶姻含量进行检测，如表8所示。

表8米醋主要理化指标对比

组别	总酸(g/100mL)	不挥发酸(g/100mL)	乙偶姻(g/L)
				试验组	7.73	0.92	4.72
对照组	7.35	0.12	0.23

5、成品醋感官指标分析

试验组与对照组的米醋产品感官指标评分结果见表9。试验组成品醋的滋味得分明显优于对照组，说明在醋酸发酵阶段添加复合发酵剂，对米醋滋味贡献明显，显著提升了产品品质。

表9成品醋感官指标分析

组别	色泽(10分)	体态(10分)	香味(10分)	滋味(10分)
					试验组	9.8	9.7	9.5	9.3
对照组	9.5	9.6	6.7	6.4

实施例6复合发酵剂在苹果醋酿造中的应用

1、酒精发酵

将新鲜苹果汁调配至糖含量为16～18％(w/w)，pH值为4.5～5.0后，接种购自CICC，菌株保藏编号为CICC 1001的酿酒酵母，接种量为5％(v/v)，28～30℃发酵至酒精度约为7％vol。

2、醋酸发酵

试验组：

选取1个500L发酵罐，加入250L酒精度为7％vol的苹果酒，称取苹果酒重量3％的复合发酵剂直投式接种，温度为30℃，调整通气量为0.4vvm，搅拌速度为200r/min进行醋酸发酵。

对照组：

选取1个500L发酵罐，加入250L酒精度为7％vol的苹果酒，接种自制醋酸菌菌剂(醋酸菌购自CICC、菌株保藏编号为CICC 20001，菌剂的活菌数为1.0×10⁸～1.0×10¹⁰CFU/g菌剂)。称取苹果酒重量3％的自制醋酸菌菌剂直投式接种，温度为30℃，调整通气量为0.4vvm，搅拌速度为200r/min进行醋酸发酵。

3、发酵结束的醋液采用0.01μm陶瓷膜过滤后，调配酸度，灌装即得成品。

4、理化指标检测

发酵结束后分别对酿造的苹果醋中总酸、不挥发酸及乙偶姻含量进行检测，如表10所示。

表10苹果醋主要理化指标对比

组别	总酸(g/100mL)	不挥发酸(g/100mL)	乙偶姻(g/L)
				试验组	6.80	0.83	4.17
对照组	6.24	0.10	0.13

5、成品醋感官指标分析

试验组与对照组的苹果醋产品感官指标评分结果见表11。试验组成品醋的滋味得分明显优于对照组，说明在醋酸发酵阶段添加复合发酵剂，对苹果醋滋味贡献明显，显著提升了产品品质。

表11成品醋感官指标分析

组别	色泽(10分)	体态(10分)	香味(10分)	滋味(10分)
					试验组	9.6	9.8	9.8	9.5
对照组	9.3	9.7	7.2	7.8

Claims (10)

1.一种高产乙偶姻的复合发酵剂，包含巴氏醋杆菌CGMCC19485和瑞士乳杆菌CGMCC12225。

2.根据权利要求1所述的一种高产乙偶姻的复合发酵剂，其特征在于，所述复合发酵剂重量份包含5～10份巴氏醋杆菌CGMCC19485和10～20份瑞士乳杆菌CGMCC12225。

3.根据权利要求2所述的一种高产乙偶姻的复合发酵剂，其特征在于，巴氏醋杆菌CGMCC19485和瑞士乳杆菌CGMCC12225的活菌数均为1.0×10⁸～1.0×10¹⁰CFU/g。

4.根据权利要求3所述的一种高产乙偶姻的复合发酵剂，其特征在于，菌剂的制备方法为将巴氏醋杆菌CGMCC19485和瑞士乳杆菌CGMCC12225进行三级扩培，培养结束后采用中空纤维膜浓缩发酵液，然后将无菌保护剂与菌体均匀混合放置在培养箱中热激，再利用低温喷雾干燥制得菌剂。

5.权利要求1至4任一所述的高产乙偶姻的复合发酵剂在食醋酿造中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述高产乙偶姻的复合发酵剂在醋酸发酵阶段加入。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述食醋酿造为固态食醋发酵或液态食醋发酵。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述高产乙偶姻的复合发酵剂采用直投方式加入。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述食醋为镇江香醋、山西老陈醋、米醋或苹果醋。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在制备所述镇江香醋、山西老陈醋、米醋或苹果醋时，所述的复合发酵剂的接种量为酒醪重量的1～5％。

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