CN112048423A - 新型巴氏醋酸菌和嗜酸乳杆菌混合发酵生产高品质苹果醋的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型巴氏醋酸菌和嗜酸乳杆菌混合发酵生产高品质苹果醋的方法，本发明在苹果汁发酵前先加入嗜酸乳杆菌CTCT‑RS‑LGP‑0046，然后再加入酿酒酵母共同发酵成苹果酒；再接入巴氏醋酸菌CTCT‑CS‑LGP‑0003经过醋酸发酵将苹果酒转化成苹果醋，嗜酸乳杆菌CTCT‑RS‑LGP‑0046在苹果酒发酵过程中产乳酸能力强，巴氏醋酸菌CTCT‑CS‑LGP‑0003在苹果醋发酵过程中产非挥发性有机酸能力强，采用巴氏醋酸菌CTCT‑CS‑LGP‑0003和嗜酸乳杆菌CTCT‑RS‑LGP‑0046两株菌株，结合优化后的酒精发酵和醋酸发酵工艺，所获得苹果原醋非挥发性有机酸含量更高，口感更加柔和绵润。
Description
技术领域
本发明涉及新型巴氏醋酸菌和嗜酸乳杆菌混合发酵生产高品质苹果醋的方法，属于果醋发酵技术领域。
背景技术
苹果醋以其独特的风味和诸多的保健功能越来越受到消费者的青睐，市场前景十分看好。目前，市场上供应的苹果醋多为液态发酵苹果醋，即多以浓缩苹果汁为原料，采用液态发酵技术制备，现有的发酵型苹果醋一般采用酿酒酵母先将苹果汁发酵成苹果酒，再经过醋酸菌发酵将苹果酒转化成苹果醋。采用这种单菌种发酵法生产的苹果原醋，非挥发性有机酸含量少，成分较为单一，酸味刺激性较突出，涩味明显，口感不爽。如中国专利文献CN103243012A公开了一种苹果醋的制备方法，包括以下步骤：(1)将苹果清洗破碎，控制糖度在10-12％，然后通电磁化，得磁化苹果汁；(2)将磁化苹果汁中加入苹果汁质量0.015-0.025％的酵母菌、0.5-1.5％的酒精，在33-37℃发酵2-3天，得苹果酒；(3)在苹果酒中加入苹果汁质量0.1％的醋酸菌，23-27℃发酵2-3天，得苹果醋；(4)将苹果醋进行淋醋灭菌，然后加入苹果醋质量的0.01％的甲基乙二醛，陈酿10-12天，调节酸度3.5-4％，即得成品。该方法虽然缩短了发酵周期，但产品成分单一，酸味刺激性较突出，涩味明显，口感不爽。
目前乳酸菌配合酵母菌和醋酸菌发酵生产苹果醋已有报道，乳酸菌所产乳酸使苹果原醋口感更加柔和且增加原醋中的香气。但目前所用乳酸菌株为市售普通乳酸菌菌株，未针对苹果醋发酵进行筛选，菌株专一性不高，产酸效果受到限制。同时，醋酸发酵所用醋酸菌株多针对醋酸产量进行优化，针对苹果醋发酵过程中其它有机酸产量进行筛选较少。
因此，亟需一种菌株专一性高，产酸效果好，没有刺激味，口感柔和、绵润细腻的高品质苹果醋的高效生产方法。
发明内容
针对现有技术中单菌种发酵的苹果原醋挥发酸含量高，非挥发性有机酸含量少，成分单一，酸刺激味较重，口感生、涩等问题，多菌种生产产酸效果差的问题，本发明提供一种新型巴氏醋酸菌和嗜酸乳杆菌混合发酵生产高品质苹果醋的方法。
发明简述：
本发明在苹果汁发酵前先加入嗜酸乳杆菌CTCT-RS-LGP-0046，然后再加入酿酒酵母共同发酵成苹果酒；再接入巴氏醋酸菌CTCT-CS-LGP-0003经过醋酸发酵将苹果酒转化成苹果醋，嗜酸乳杆菌CTCT-RS-LGP-0046在苹果酒发酵过程中产乳酸能力强，巴氏醋酸菌CTCT-CS-LGP-0003在苹果醋发酵过程中产非挥发性有机酸能力强，采用巴氏醋酸菌CTCT-CS-LGP-0003和嗜酸乳杆菌CTCT-RS-LGP-0046两株菌株，结合优化后的酒精发酵和醋酸发酵工艺，所获得苹果原醋非挥发性有机酸含量更高，口感更加柔和绵润。
发明详述：
为解决以上问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种新型巴氏醋酸菌和嗜酸乳杆菌混合发酵生产高品质苹果醋的方法，包括步骤如下：
1)浓缩苹果汁稀释：将浓缩苹果汁稀释至可溶性固形物为：11.0～13.0°Brix，得稀释苹果汁；
2)苹果酒发酵：先将经扩培的嗜酸乳杆菌CTCT-RS-LGP-0046接种到稀释苹果汁中，嗜酸乳杆菌的接种量为3～5％，搅拌均匀后，再接种经扩培的酿酒酵母2.524，通风10～30min，然后密封恒温发酵，当发酵液中的总糖＜0.5％时，发酵结束，将发酵得到的产物经过离心除去酒液中的大部分酵母，得苹果酒；
3)向苹果酒中加入经扩培的巴氏醋酸菌CTCT-CS-LGP-0003，采用自吸式发酵罐进行恒温醋酸发酵，待发酵液中总酸不再增加，得苹果醋；
4)将步骤3)的苹果醋经离心、过滤，得到高品质发酵苹果原醋。
根据本发明优选的，嗜酸乳杆菌CTCT-RS-LGP-0046是按如下方法优选驯化得到：
a、将嗜酸乳杆菌CTCT-RS-LGP-0015和酿酒酵母2.524接入苹果汁中，发酵48小时，将发酵液稀释相应倍数后涂布于加入苹果汁琼脂平板培养基，培养48小时；
b、挑取菌落周围透明圈最大的嗜酸乳杆菌菌落接入苹果汁中，接入酿酒酵母2.524，重复上述发酵和筛选过程；经过30-40次驯化筛选过程，获得一株在苹果汁酒精发酵过程中生长良好且乳酸产量较高的嗜酸乳杆菌菌株，命名为嗜酸乳杆菌CTCT-RS-LGP-0046。
根据本发明优选的，苹果汁琼脂平板培养基中苹果汁5Brix，碳酸钙5克/升，琼脂20克/升。
根据本发明优选的，嗜酸乳杆菌CTCT-RS-LGP-0046的接种量为3.8～4.5％。
根据本发明优选的，步骤2)中，扩培的酿酒酵母2.524的接种量为3～8％。
根据本发明优选的，步骤2)中，通风时间为20～30min，发酵温度为20℃～28℃。
根据本发明优选的，步骤3)中，巴氏醋酸菌CTCT-CS-LGP-0003是按如下方法优选驯化得到：
(1)从山东省烟台市苹果园采集带有腐烂苹果的土壤样品，加入无菌蒸馏水稀释，稀释液涂布于苹果汁琼脂固体培养基于30℃培养48–72小时，
(2)待单菌落长出后，根据醋酸菌菌落特征，挑取菌落直径较小但产酸透明圈较大的单菌落，接入苹果汁液体培养基于30℃，180r/min的摇床中震荡发酵96小时，取发酵液进行氯化铁定性验证，得到醋酸菌菌株；
(3)将醋酸菌菌株接种到以苹果浓缩汁为原料发酵的苹果酒中，于30℃震荡发酵120小时，进行果醋发酵，发酵结束后测果醋的总酸含量，
(4)取醋酸菌菌株总酸含量大于等于50g/L的发酵液，按照GB/T 18187-2000非挥发性有机酸的检测方法测定发酵液中非挥发性有机酸的含量，采用高效液相检测方法测定发酵液中醋酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸含量；获得一株产醋酸且有机酸产量最高的菌株，经16S rDNA鉴定为巴氏醋酸菌(Acetobacter pasteurianus)，命名为巴氏醋酸菌CTCT-CS-LGP-0003。
根据本发明优选的，步骤(1)中，苹果汁琼脂固体培养基中，苹果汁5Brix，碳酸钙5克/升，琼脂20克/升，121℃灭菌15分钟，冷却后加入40克/升无水乙醇，倾倒平板。
根据本发明优选的，步骤(2)中，苹果汁液体培养基中，苹果汁5Brix，121℃灭菌15分钟，冷却后加入40克/升无水乙醇。
根据本发明优选的，步骤3)中，巴氏醋酸菌CTCT-CS-LGP-0003的接种量为5～10％。
根据本发明优选的，步骤3)中，发酵温度控制在30℃-35℃，测总酸含量不再增加，终止发酵。
根据本发明优选的，步骤3)中，自吸式发酵罐的搅拌转速为800～1800r/min。
根据本发明优选的，步骤4)中，膜过滤的孔径为0.22的孔。
与现有的苹果醋的制备工艺相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明的嗜酸乳杆菌CTCT-RS-LGP-0046为一株高产乳酸的苹果醋专用乳酸菌，产乳酸能力强，可以增加果醋中乳酸的含量，减轻果醋的醋酸刺激感，提高果醋的柔和度。
2、本发明的巴氏醋酸菌CTCT-CS-LGP-0003为一株高产有机酸苹果醋专用醋酸菌，具有较好代谢多种非挥发性有机酸，能够进一步提高苹果醋的品质，促使果醋更加柔和绵润。
3、本发明采用巴氏醋酸菌CTCT-CS-LGP-0003和嗜酸乳杆菌CTCT-RS-LGP-0046两株菌株，结合优化后的酒精发酵和醋酸发酵工艺，所获得苹果原醋非挥发性有机酸含量更高，口感更加柔和绵润。
附图说明
图1为氯化铁定性验证实验结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明进行进一步说明。
实例中使用的设备，自吸式发酵罐，南京汇科生物工程设备有限公司，型号：AAF-S-5L；离心机，上海安亭科学仪器厂，型号：LXJ-IIB。
嗜酸乳杆菌CTCT-RS-LGP-0015为现有市购菌。
高产非挥发性有机酸醋酸菌的选育
从山东省烟台市三处果园采集带有腐烂苹果的土壤样品共30份，装入无菌自封袋中，带回实验室用于醋酸菌筛选。取每份土壤样品1克加入三角瓶中，加入无菌蒸馏水稀释相应倍数，稀释液涂布于醋酸菌筛选苹果汁琼脂固体培养基(苹果汁5Brix，碳酸钙5克/升，琼脂20克/升，121℃灭菌15分钟，冷却后加入40克/升无水乙醇，倾倒平板)。涂布后的平板于30℃培养48–72小时，待单菌落长出后，根据醋酸菌菌落特征，挑取菌落直径较小但产酸透明圈较大的单菌落40个，接入醋酸菌筛选苹果汁琼脂液体培养基(苹果汁5Brix，121℃灭菌15分钟，冷却后加入40克/升无水乙醇)。于30℃，180r/min的摇床中震荡发酵96小时，取发酵液进行氯化铁定性验证实验，定性醋酸菌(实验结果见图1)，得到醋酸菌菌株21株。将21株醋酸菌接种到以苹果浓缩汁为原料发酵的苹果酒中(苹果酒的酒精度为6％)，于30℃震荡发酵120小时，进行果醋发酵，发酵结束后测果醋的总酸含量，得3株菌发酵的总酸含量高于50g/L，分别为54.1、54.6、56.2g/L。对3株菌发酵的总酸含量高于50g/L的发酵液按照GB/T 18187-2000非挥发性有机酸的检测方法测定发酵液中非挥发性有机酸的含量和
高效液相检测方法测定发酵液中醋酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸含量。最终从40株产酸且具有醋酸菌菌落特征的菌株中获得一株产醋酸且有机酸产量最高的菌株。经16S rDNA鉴定为巴氏醋酸菌(Acetobacter pasteurianus)，命名为CTCT-CS-LGP-0003。
优选驯化适合果醋混菌发酵的乳酸菌
取先期实验室自筛储备的乳酸菌菌株(嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌和双歧杆菌等)40株，将其分别接入苹果汁中进行发酵，以发酵液中乳酸含量为评价指标。结果显示嗜酸乳杆菌CTCT-RS-LGP-0015产酸量较优，故采用嗜酸乳杆菌CTCT-RS-LGP-0015进行苹果汁发酵驯化筛选实验。筛选实验过程如下所述。将嗜酸乳杆菌CTCT-RS-LGP-0015和酿酒酵母2.524接入苹果汁中，发酵48小时，将发酵液稀释相应倍数后涂布于加入苹果汁琼脂培养基平板(苹果汁5Brix，碳酸钙5克/升，琼脂20克/升)，培养48小时。由于乳酸菌和酵母菌单菌落有明显形态差异，嗜酸乳杆菌菌落和其周围透明圈显而易见。挑取透明圈最大的嗜酸乳杆菌菌落接入苹果汁中，接入酿酒酵母2.524，重复上述发酵和筛选过程。经过三十余次的驯化筛选过程后，获得一株在苹果汁酒精发酵过程中生长良好且乳酸产量较高的嗜酸乳杆菌菌株，命名为嗜酸乳杆菌CTCT-RS-LGP-0046。
实施例1
采用上述新型巴氏醋酸菌和嗜酸乳杆菌混合发酵生产高品质苹果醋的方法，包括步骤如下：
1)浓缩苹果汁稀释：将浓缩苹果汁稀释至可溶性固形物为12.0°Brix，得稀释苹果汁；
2)苹果酒发酵：将经扩培的嗜酸乳杆菌CTCT-RS-LGP-0046接种到步骤2)中，嗜酸乳杆菌的接种量为4％，搅拌均匀后，再接种经扩培的酿酒酵母2.524，接种量为5％，通风20min，然后于25℃恒温发酵，当发酵液中的总糖＜0.5％，认为苹果酒发酵结束，发酵好的苹果酒液经过离心除去酒液中的大部分酵母，得苹果酒；
3)向步骤2)中加入经扩培的巴氏醋酸菌CTCT-CS-LGP-0003，醋酸菌的接种量为6％，采用自吸式发酵罐进行恒温醋酸发酵，温度为32℃，搅拌转速为1200r/min待发酵液中总酸不再增加，得苹果醋；
4)将苹果醋离心，经孔径为0.22加，的膜过滤，即得到高品质苹果原醋。
对比例1
一种苹果醋的生产方法，采用市售乳酸菌和市售醋酸菌进行，
1)浓缩苹果汁稀释：将浓缩苹果汁稀释至可溶性固形物为12.0°Brix，得稀释苹果汁；
2)苹果酒发酵：将经活化的活性乳酸菌菌粉(川秀牌乳酸菌发酵粉)接种到步骤2)中，嗜酸乳杆菌的接种量为4％，搅拌均匀后，再接种经扩培的酿酒酵母2.524，接种量为5％，通风20min，然后于25℃恒温发酵，当发酵液中的总糖＜0.5％，认为苹果酒发酵结束，发酵好的苹果酒液经过离心除去酒液中的大部分酵母，得苹果酒；
3)向步骤2)中加入经扩培的醋酸菌AS1.41，醋酸菌的接种量为6％，采用自吸式发酵罐进行恒温醋酸发酵，温度为32℃，搅拌转速为1200r/min待发酵液中总酸不再增加，得苹果醋；
4)将苹果醋离心，经孔径为0.22μm的膜过滤，即得到苹果原醋。
实验例
总酸的测定按照国家标准：GB/T 12456-2008测定方法测定；
非挥发性有机酸的测定按照国家标准：GB 18187测定方法测定；
酒石酸的按照国家标准：GB/T 5009.157测定方法测定；
苹果酸的测定按照国家标准：GB/T 5009.157测定方法测定；
柠檬酸的测定按照国家标准：GB/T 5009.157测定方法测定；
乳酸的测定按照国家标准：GB/T 5009.157测定方法测定；
琥珀酸的按照国家标准：GB/T 5009.157测定方法测定；
一、苹果醋理化指标对比
将实施例及对比例制得的苹果醋样品进行各项理化成分检测，检测结果见表1
表1苹果醋理化指标对比
| 项目 | 实施例1 | 对比例1 |
| 总酸(以乙酸计)，g/Kg | 55.4 | 44.6 |
| 非挥发性酸，g/Kg | 6.12 | 3.21 |
| 酒石酸，g/Kg | 0.1981 | 0.1115 |
| 苹果酸，g/Kg | 1.6729 | 1.2215 |
| 柠檬酸，g/Kg | 0.4273 | 0.3146 |
| 乳酸，g/Kg | 0.4895 | 0.3263 |
| 琥珀酸，g/Kg | 0.1301 | 0.0587 |
通过表1可以看出，比较实施例和对比例苹果醋的理化指标，对比例中总酸、非挥发性酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸各项指标均明显低于实施例的。本发明的新型巴氏醋酸菌和嗜酸乳杆菌混合发酵生产高品质苹果醋的方法与对比例1苹果醋发酵方法对比，该方法比传统方法提高苹果醋非挥发性酸2.99g/Kg，且优选的新菌种发酵制备的苹果醋在酒石酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸等非挥发性含量均高于采用市场菌种制备的苹果醋。使其苹果醋的醋酸气味柔和，口感协调，提高了苹果醋的品质。
二、苹果醋感官评定
将制得的实施例1与对比例1苹果醋样品进行感官评定，结果如下表2所示。
表2感官指标
通过感官评定产品的品质后会发现实施例较对比例发酵制得的苹果醋口感更加柔和绵润、果醋的品质更加优异。
Claims (10)
1.一种新型巴氏醋酸菌和嗜酸乳杆菌混合发酵生产高品质苹果醋的方法，包括步骤如下：
1)浓缩苹果汁稀释：将浓缩苹果汁稀释至可溶性固形物为：11.0～13.0°Brix，得稀释苹果汁；
2)苹果酒发酵：先将经扩培的嗜酸乳杆菌CTCT-RS-LGP-0046接种到稀释苹果汁中，嗜酸乳杆菌的接种量为3～5％，搅拌均匀后，再接种经扩培的酿酒酵母2.524，通风10～30min，然后密封恒温发酵，当发酵液中的总糖＜0.5％时，发酵结束，将发酵得到的产物经过离心除去酒液中的大部分酵母，得苹果酒；
3)向苹果酒中加入经扩培的巴氏醋酸菌CTCT-CS-LGP-0003，采用自吸式发酵罐进行恒温醋酸发酵，待发酵液中总酸不再增加，得苹果醋；
4)将步骤3)的苹果醋经离心、过滤，得到高品质发酵苹果原醋。
2.根据权利要求1所述的新型巴氏醋酸菌和嗜酸乳杆菌混合发酵生产高品质苹果醋的方法，其特征在于，嗜酸乳杆菌CTCT-RS-LGP-0046是按如下方法优选驯化得到：
a、将嗜酸乳杆菌CTCT-RS-LGP-0015和酿酒酵母2.524接入苹果汁中，发酵48小时，将发酵液稀释相应倍数后涂布于加入苹果汁琼脂平板培养基，培养48小时；
b、挑取菌落周围透明圈最大的嗜酸乳杆菌菌落接入苹果汁中，接入酿酒酵母2.524，重复上述发酵和筛选过程；经过30-40次驯化筛选过程，获得一株在苹果汁酒精发酵过程中生长良好且乳酸产量较高的嗜酸乳杆菌菌株，命名为嗜酸乳杆菌CTCT-RS-LGP-0046。
3.根据权利要求2所述的新型巴氏醋酸菌和嗜酸乳杆菌混合发酵生产高品质苹果醋的方法，其特征在于，苹果汁琼脂平板培养基中苹果汁5Brix，碳酸钙5克/升，琼脂20克/升。
4.根据权利要求1所述的新型巴氏醋酸菌和嗜酸乳杆菌混合发酵生产高品质苹果醋的方法，其特征在于，嗜酸乳杆菌CTCT-RS-LGP-0046的接种量为3.8～4.5％。
5.根据权利要求1所述的新型巴氏醋酸菌和嗜酸乳杆菌混合发酵生产高品质苹果醋的方法，其特征在于，步骤2)中，扩培的酿酒酵母2.524的接种量为3～8％。
6.根据权利要求1所述的新型巴氏醋酸菌和嗜酸乳杆菌混合发酵生产高品质苹果醋的方法，其特征在于，步骤2)中，通风时间为20～30min，发酵温度为20℃～28℃。
7.根据权利要求1所述的新型巴氏醋酸菌和嗜酸乳杆菌混合发酵生产高品质苹果醋的方法，其特征在于，步骤3)中，巴氏醋酸菌CTCT-CS-LGP-0003是按如下方法优选驯化得到：
(1)从山东省烟台市苹果园采集带有腐烂苹果的土壤样品，加入无菌蒸馏水稀释，稀释液涂布于苹果汁琼脂固体培养基于30℃培养48–72小时，
(2)待单菌落长出后，根据醋酸菌菌落特征，挑取菌落直径较小但产酸透明圈较大的单菌落，接入苹果汁液体培养基于30℃，180r/min的摇床中震荡发酵96小时，取发酵液进行氯化铁定性验证，得到醋酸菌菌株；
(3)将醋酸菌菌株接种到以苹果浓缩汁为原料发酵的苹果酒中，于30℃震荡发酵120小时，进行果醋发酵，发酵结束后测果醋的总酸含量，
(4)取醋酸菌菌株总酸含量大于等于50g/L的发酵液，按照GB/T 18187-2000非挥发性有机酸的检测方法测定发酵液中非挥发性有机酸的含量，采用高效液相检测方法测定发酵液中醋酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸含量；获得一株产醋酸且有机酸产量最高的菌株，经16S rDNA鉴定为巴氏醋酸菌(Acetobacter pasteurianus)，命名为巴氏醋酸菌CTCT-CS-LGP-0003。
8.根据权利要求7所述的新型巴氏醋酸菌和嗜酸乳杆菌混合发酵生产高品质苹果醋的方法，其特征在于，步骤(1)中，苹果汁琼脂固体培养基中，苹果汁5Brix，碳酸钙5克/升，琼脂20克/升，121℃灭菌15分钟，冷却后加入40克/升无水乙醇，倾倒平板；步骤(2)中，苹果汁液体培养基中，苹果汁5Brix，121℃灭菌15分钟，冷却后加入40克/升无水乙醇。
9.根据权利要求1所述的新型巴氏醋酸菌和嗜酸乳杆菌混合发酵生产高品质苹果醋的方法，其特征在于，步骤3)中，巴氏醋酸菌CTCT-CS-LGP-0003的接种量为5～10％。
10.根据权利要求1所述的新型巴氏醋酸菌和嗜酸乳杆菌混合发酵生产高品质苹果醋的方法，其特征在于，步骤3)中，发酵温度控制在30℃-35℃，测总酸含量不再增加，终止发酵，自吸式发酵罐的搅拌转速为800～1800r/min。
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