CN113736698A - 一种丁酸梭菌扩大培养基的优化 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丁酸梭菌扩大培养基的优化，属生物工程技术领域。本发明通过对丁酸梭菌发酵过程中的条件进行优化，将得到的培养条件用于丁酸梭菌的扩大培养，能够显著提升丁酸梭菌的扩繁效率和菌体量，将菌株在无氧条件下培养12h，可有效地将丁酸梭菌的菌体浓度从106CFU/mL提高至少10倍。本发明的培养条件简单、快速、能显著提升丁酸梭菌的培养效率，适于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种丁酸梭菌扩大培养基的优化，属生物工程技术领域。
背景技术
丁酸梭菌(Clostridium butyricum,C.butyricum)，又称酪酸菌、丁酸梭菌芽孢杆菌，是芽孢杆菌科、梭菌属的一种产丁酸、革兰氏阳性厌氧杆菌。丁酸梭菌是一种专性厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，两端钝圆，中间部分轻度膨胀，细菌呈直杆状或稍有弯曲，单个或成对，短链，偶见有丝状菌体，周身鞭毛，能运动。孢子卵圆，偏心或次端生。革兰氏染色初培养的菌为阳性，菌稍长可变为阴性。在琼脂平板上形成白色或奶油色的不规则圆形菌落，稍突，直径为1～3mm。不水解明胶，不消化血清蛋白，能够发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖等碳水化合物产酸，水解淀粉但不水解纤维素。水解淀粉和糖类的最终代谢产物为丁酸、醋酸和乳酸，还有少量的丙酸、甲酸。1933年由日本千叶医科大学宫入近治博士首先发现并报告的，因此又名宫入菌。1935年，俄罗斯微生物研究所Kingi miyairi博士从人的粪便和土壤中分离出丁酸梭菌，随后发现其厌氧培养的过滤物中含有较少的脂肪酸，具有极强的整肠作用，它可抑制肠道中的致病菌，促进肠道中有益菌如双歧杆菌和乳杆菌的生长，1992年黑龙江省科学院微生物研究所在俄罗斯微生物研究所引进丁酸梭菌，并在中国定植，为中国微生物有益菌起到重大贡献。
丁酸梭菌主要从肠道和土壤中筛选，采用RCM培养基扩大培养(蛋白胨10g/L，牛肉粉10g/L，酵母粉3g/L，葡萄糖5g/L，可溶性淀粉1g/L，氯化钠5g/L，醋酸钠3g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，pH 6.8)，但是在RCM培养基中丁酸梭菌的生长情况不理想，丁酸梭菌活菌数仅能达106CFU/mL。
发明内容
本发明提供了一种培养丁酸梭菌的方法，所述方法是将丁酸梭菌在含有胰蛋白胨、酵母浸粉、可溶性淀粉、氯化钠、氯化铵、L-半胱氨酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖的培养体系中，所述反应体系中还含有脱氧剂。
在一种实施方式中，调节反应体系中pH为7.5～8.5；所述氯化铵添加量为0.1～0.3g/L；所述L-半胱氨酸的浓度为0.3～0.6g/L。
在一种实施方式中，培养体系中还含有脱氧剂，所述脱氧剂包括硫酸亚铁和抗坏血酸。
在一种实施方式中，培养体系中含有5～10g/L胰蛋白胨、2～5g/L酵母浸粉、1～3g/L可溶性淀粉、5～10g/L氯化钠、1.0～2.0g/L磷酸氢二钾、1.0～2.0g/L磷酸二氢钾、2.0～3.0g/L葡萄糖、3.0～5.0g/L蔗糖、1.0～3.0g/L果糖、1.0～3.0g/L乳糖；所述硫酸亚铁的浓度为0.2～0.5g/L；所述抗坏血酸的浓度为0～2g/L。
在一种实施方式中，培养体系中含有10g/L胰蛋白胨、3g/L酵母浸粉、1g/L可溶性淀粉、5g/L氯化钠、1.5g/L磷酸氢二钾、1.5g/L磷酸二氢钾、2.5g/L葡萄糖、4.0g/L蔗糖、2.0g/L果糖、2.0g/L乳糖；所述硫酸亚铁的浓度为0.2g/L；所述抗坏血酸的浓度为1g/L。
在一种实施方式中，将OD600＝0.5±0.1的丁酸梭菌菌液按1％～4％的量添加至培养体系中，在30～37℃条件下培养不少于12h。
在一种实施方式中，所述丁酸梭菌包括但不限于丁酸梭状芽孢杆菌CGMCC0313.1，记载于授权公告号为CN105769928B的专利文献中。
本发明提供了一种培养基，所述培养基由胰蛋白胨、酵母浸粉、可溶性淀粉、氯化钠、氯化铵、L-半胱氨酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、硫酸亚铁和抗坏血酸组成。
在一种实施方式中，培养基中的成分的工作浓度分别为胰蛋白胨5～10g/L、酵母浸粉2～5g/L、可溶性淀粉1～3g/L、氯化钠5～10g/L、磷酸氢二钾1.0～2.0g/L、磷酸二氢钾1.0～2.0g/L、葡萄糖2.0～3.0g/L、蔗糖3.0～5.0g/L、果糖1.0～3.0g/L、乳糖1.0～3.0g/L，0.2～0.5g/L硫酸亚铁，0～2g/L抗坏血酸。
在一种实施方式中，培养基中的成分的工作浓度分别为胰蛋白胨10g/L、酵母浸粉3g/L、可溶性淀粉1g/L、氯化钠5g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、葡萄糖2.5g/L、蔗糖4.0g/L、果糖2.0g/L、乳糖2.0g/L，0.2g/L硫酸亚铁，1g/L抗坏血酸。
本发明提供了所述培养基在食品、生物领域培养丁酸梭菌中的应用。
在一种实施方式中，所述丁酸梭菌包括但不限于丁酸梭状芽孢杆菌CGMCC0313.1，记载于授权公告号为CN105769928B的专利文献中。
有益效果：本发明通过对丁酸梭菌发酵过程中的条件进行优化，将得到的培养条件用于丁酸梭菌的扩大培养，能够显著提升丁酸梭菌的扩繁效率和菌体量，将菌株在无氧条件下培养12h，可有效地将丁酸梭菌的菌体浓度从106CFU/mL提高至少10倍。培养条件简单、快速、能显著提升丁酸梭菌的培养效率。
附图说明
图1为酸碱度对丁酸梭菌培养基OD600值的影响。
图2为L-半胱氨酸浓度对丁酸梭菌培养基OD600值的影响。
图3为缓冲体系对丁酸梭菌培养基OD600值的影响。
图4为硫酸亚铁浓度对丁酸梭菌培养基OD600值的影响。
图5为抗坏血酸浓度对丁酸梭菌培养基OD600值的影响。
图6为丁酸梭菌在ICM培养基和RCM培养基中的生长曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明技术方案作进一步说明，但此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明实施例中使用到的培养基(ICM)：每升培养基中含有胰蛋白胨10g，酵母浸粉3g，葡萄糖2.5g，乳糖2g，蔗糖4g，果糖2g，可溶性淀粉1g，氯化钠5g，氯化铵0.2g，L-半胱氨酸0.5g，磷酸氢二钾1.5g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸亚铁0.2g、抗坏血酸1g。
本发明中所使用的丁酸梭菌记载于授权公告号为CN105769928B的专利文献中，为其中的丁酸梭状芽孢杆菌CGMCC0313.1。
丁酸梭菌种子液的获得：从-80℃取出保存的丁酸梭菌菌液，将其在37℃、厌氧条件下培养至OD600约为0.5。
实施例1：碳源对丁酸梭菌菌体浓度的影响
培养体系为1L，培养基中含有胰蛋白胨10g，酵母浸粉3g，可溶性淀粉1g，氯化钠5g，氯化铵0.2g，L-半胱氨酸0.4g，磷酸氢二钾1.5g，磷酸二氢钾1.5g，调pH至7.5-8。选取四种可能合适丁酸梭菌生长的糖作为碳源：葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖。
设置乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖四种碳源的不同浓度，如表1所示，设置四因素四水平正交实验表，如表2所示。在培养基中按照正交实验表分别添加不同配比的121℃高温高压灭菌的糖，并接种4％(v/v)的丁酸梭菌，37℃厌氧培养12h后，测OD600，结果如表2所示：在乳糖：2.0g/L，葡萄糖：2.5g/L，蔗糖：4.0g/L，果糖：2.0g/L时OD600值最高，菌体浓度达到2.7×107CFU/mL。
表1不同碳源及其配比情况
表2碳源及对丁酸梭菌培养基OD600值的影响
实施例2：无机氮源对丁酸梭菌菌体浓度的影响
培养体系为1L，培养基中含有胰蛋白胨10g，酵母浸粉3g，葡萄糖2.5g，乳糖2g，蔗糖4g，果糖2g，可溶性淀粉1g，氯化钠5g，L-半胱氨酸0.4g，磷酸氢二钾1.5g，磷酸二氢钾1.5g，调pH至7.5-8。选取三种可能合适丁酸梭菌生长的无机盐作为无机氮源：氯化铵、硫酸铵、尿素。设置氯化铵、硫酸铵、尿素的不同浓度，如表3所示，设置三因素四水平正交实验表，如表4所示。在培养基中按照正交实验表分别添加不同配比的121℃高温高压灭菌的补充氮源，并接种4％的丁酸梭菌，37℃厌氧培养12h后，测OD600，结果如表4所示：在氯化铵添加量为0.2g/L时OD600值最高，菌体浓度达到3.2×107CFU/mL，而硫酸铵、尿素对菌体浓度无影响。
表3不同无机氮源及其配比情况
表4无机氮源对丁酸梭菌培养基OD600值的影响
实施例3：酸碱度对丁酸梭菌菌体浓度的影响
培养体系为1L，培养基中含有胰蛋白胨10g，酵母浸粉3g，葡萄糖2.5g，乳糖2g，蔗糖4g，果糖2g，可溶性淀粉1g，氯化钠5g，氯化铵0.2g，L-半胱氨酸0.4g，磷酸氢二钾1.5g，磷酸二氢钾1.5g。设置不同酸碱度环境：培养基的pH分别调至4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0，分别115℃高压灭菌20min，接种4％的丁酸梭菌。37℃厌氧培养12h后，测OD600，结果如图3所示，在pH为7.5-8.5的时候，OD600可达0.8以上，菌体浓度可达4.5×108CFU/mL。
实施例4：L-半胱氨酸浓度对丁酸梭菌菌体浓度的影响
培养体系为1L，培养基中含有胰蛋白胨10g，酵母浸粉3g，葡萄糖2.5g，乳糖2g，蔗糖4g，果糖2g，可溶性淀粉1g，氯化钠5g，氯化铵0.2g，磷酸氢二钾1.5g，磷酸二氢钾1.5g。设置不同L-半胱氨酸浓度：在培养基中分别加入0％、0.004％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.06％、0.08％的L-半胱氨酸，调pH至8.0，115℃高压灭菌20min，接种4％的丁酸梭菌。37℃厌氧培养12h后，测OD600，结果如图2所示，最适添加量是0.04％(即0.4g/L)。
实施例5：缓冲体系对丁酸梭菌菌体浓度的影响
添加缓冲体系。两组培养基的培养体系均为1L，
第一组培养基成分：胰蛋白胨10g、酵母浸粉3g、氯化钠5g、可溶性淀粉1g、葡萄糖2.5g、蔗糖4g、果糖2g、乳糖2g、氯化铵0.2g，L-半胱氨酸0.4g；
第二组培养基成分：胰蛋白胨10g、酵母浸粉3g、氯化钠5g、可溶性淀粉1g、葡萄糖2.5g、蔗糖4g、果糖2g、乳糖2g、氯化铵0.2g，L-半胱氨酸0.4g，磷酸二氢钾1.5g，磷酸氢二钾1.5g。
将两组分别调pH至8.0，115℃高压灭菌20min，冷却后并接种4％(v/v)的丁酸梭菌。37℃厌氧培养12h后，测OD600，结果所示如图3，加入PBS之后，能够显著提升菌浓。
发明人应用实施例1-5优化后的结果，利用优化后的条件在1L体系中对丁酸梭菌进行多次培养，培养条件为37℃厌氧培养12h，并分别计数，丁酸梭菌菌体浓度分别可达到8.3×106CFU/mL、4.5×106CFU/mL、1.2×107CFU/mL、2.8×107CFU/mL，均达到106CFU/mL以上，与现有的梭菌培养基相比，大大提高了丁酸梭菌的培养密度。
实施例6：脱氧剂对丁酸梭菌菌体浓度的影响
选取硫酸亚铁和抗坏血酸(VC)作为脱氧剂，并设置不同的浓度梯度。
培养体系为1L，培养基中含有胰蛋白胨10g，酵母浸粉3g，葡萄糖2.5g，乳糖2g，蔗糖4g，果糖2g，可溶性淀粉1g，氯化钠5g，氯化铵0.2g，L-半胱氨酸0.4g，磷酸氢二钾1.5g，磷酸二氢钾1.5g。在培养基中分别加入不同浓度的脱氧剂：硫酸亚铁和抗坏血酸，调pH至8.0，115℃灭菌20min，并接种4％的丁酸梭菌。37℃厌氧培养12h后，测OD600，结果如图4和5所示，硫酸亚铁最适添加量为0.02％(即0.2g/L)，菌液OD600约为0.60；VC最适添加量为0.1％(即1g/L)，此时菌液OD600约为0.63。
实施例7：丁酸梭菌培养基的应用——生长曲线的绘制
将本专利优化的培养基(ICM)与目前常用的丁酸梭菌培养基(RCM)进行对照，并绘制生长曲线。培养体系为1L，37℃厌氧环境下培养至36小时。结果如图6所示，ICM培养基无论是在丁酸梭菌生长速度上，还是在丁酸梭菌浓度上都优于RCM培养基。
实施例8：丁酸梭菌冻干粉的制备
菌液在37℃培养12h，菌悬液在4℃，4000g离心15min，弃上清，菌体以无菌稀释液(0.85％氯化钠、0.1％胰蛋白胨)重悬1次，4℃，3000g离心15min，收集菌体备用。
冷冻干燥：添加2.5倍的冻干保护剂(13％脱脂乳，105℃下灭菌10min)，重悬，分装到玻璃平板，-20℃预冻一夜，冷冻干燥。收集冻干粉末于-80℃下保存。
按照实施例5的实施方式，用稀释液(0.85％氯化钠、0.1％胰蛋白胨)对丁酸梭菌冻干粉进行梯度稀释，倾注法注入固体培养基，多次培养，并分别计数，丁酸梭菌菌体浓度达到108CFU/g以上，与市面现有的丁酸梭菌药剂——阿泰宁酪酸梭菌活菌胶囊(活菌数6.3×106CFU/g)相比，大大提高了丁酸梭菌的活菌数。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种培养丁酸梭菌的方法，其特征在于，将丁酸梭菌在含有胰蛋白胨、酵母浸粉、可溶性淀粉、氯化钠、氯化铵、L-半胱氨酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖的培养体系中，所述反应体系中还含有脱氧剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，调节反应体系中pH为7.5～8.5；所述氯化铵添加量为0.1～0.3g/L；所述L-半胱氨酸的浓度为0.3～0.6g/L。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，培养体系中还含有脱氧剂，所述脱氧剂包括硫酸亚铁和抗坏血酸。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，培养体系中含有5～10g/L胰蛋白胨、2～5g/L酵母浸粉、1～3g/L可溶性淀粉、5～10g/L氯化钠、1.0～2.0g/L磷酸氢二钾、1.0～2.0g/L磷酸二氢钾、2.0～3.0g/L葡萄糖、3.0～5.0g/L蔗糖、1.0～3.0g/L果糖、1.0～3.0g/L乳糖；所述硫酸亚铁的浓度为0.2～0.5g/L；所述抗坏血酸的浓度为0～2g/L。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将OD600＝0.5±0.1的丁酸梭菌菌液按1％～4％的量添加至培养体系中，在30～37℃条件下培养不少于12h。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述丁酸梭菌包括但不限于丁酸梭状芽孢杆菌CGMCC0313.1。
7.一种培养基，其特征在于，由胰蛋白胨、酵母浸粉、可溶性淀粉、氯化钠、氯化铵、L-半胱氨酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、硫酸亚铁和抗坏血酸组成。
8.根据权利要求7所述的培养基，其特征在于，培养基中的成分的工作浓度分别为胰蛋白胨5～10g/L、酵母浸粉2～5g/L、可溶性淀粉1～3g/L、氯化钠5～10g/L、磷酸氢二钾1.0～2.0g/L、磷酸二氢钾1.0～2.0g/L、葡萄糖2.0～3.0g/L、蔗糖3.0～5.0g/L、果糖1.0～3.0g/L、乳糖1.0～3.0g/L，硫酸亚铁0.2～0.5g/L，抗坏血酸0～2g/L。
9.权利要求7或8所述培养基在食品、生物领域培养丁酸梭菌中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述丁酸梭菌包括但不限于丁酸梭状芽孢杆菌CGMCC0313.1。
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