CN114672446A - 一种丁酸梭菌制剂的制备方法及应用 - Google Patents

一种丁酸梭菌制剂的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种丁酸梭菌制剂的制备方法及应用，其制备方法包括以下步骤：将菌种活化，得到丁酸梭菌发酵液；离心，收集菌泥，然后加入保护剂溶液，混匀，再加入壁材溶液，混匀，最后冷冻干燥，得到丁酸梭菌制剂；其中，保护剂为脱脂乳、β‑环状糊精、葡萄糖和磷酸氢二钾的混合物，壁材为明胶、海藻酸钠或羧甲基纤维素钠。本发明通过保护剂和壁材的双重作用，能够有效的保证丁酸梭菌在凡纳滨对虾肠道中定植，进而能够对凡纳滨对虾肠道健康的修复提供保障。

Description

一种丁酸梭菌制剂的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及微生物制剂制备技术领域，具体涉及一种丁酸梭菌制剂的制备方法及应用。
背景技术
丁酸梭菌是一种革兰氏阳性、专性厌氧和内生孢子形成的细菌，对低pH和高温环境有很强的耐受性，对多种抗生素表现出耐药性，被认为是一种很好的饲料添加剂，此外，丁酸梭菌产生短链脂肪酸(SCFA)，特别是丁酸，为肠上皮的再生和修复以及肠道健康微生态环境的调节提供营养。丁酸梭菌细胞壁中富含多种抗原物质(肽聚糖和磷壁酸)，可诱导机体发生免疫反应，除了能够增强免疫反应外，饲料中添加丁酸梭菌还可提高动物的肠道抗氧化性能。丁酸梭菌作为益生菌，在肠道中的定植能力影响着作用的发挥，而定植能力的强弱除了与菌体本身有关外，还与制备工艺有关，冷冻干燥法是常用的菌剂制备方法之一，在真空冷冻干燥过程中，由于处于低温缺氧状态，菌体则会进入休眠状态，可以保持其原有特性，然而，在冷冻干燥过程中，细胞经历了不利的环境条件，对微生物产生损伤，主要表现为：细胞膜的损伤：干燥使得细胞膜通透性增加，对盐类敏感性增强；机械损伤：主要是结冰过程中冰晶对细胞膜的机械损伤；溶质损伤：在冰冻过程中细胞内水分溢出，细胞膜渗透压发生不可逆的改变。因此，需要在制备过程中加入冷冻保护剂，现有技术中单一保护剂已不能满足对微生物的保护。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种丁酸梭菌制剂的制备方法及应用，以解决现有技术中丁酸梭菌制剂定植效果差的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种丁酸梭菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）将菌种活化，得到丁酸梭菌发酵液；
（2）将丁酸梭菌发酵液离心，收集菌泥，然后加入保护剂溶液，混匀，再加入壁材溶液，混匀，最后冷冻干燥，得到丁酸梭菌制剂；
其中，保护剂为脱脂乳、β-环状糊精、葡萄糖和磷酸氢二钾的混合物，壁材为明胶、海藻酸钠或羧甲基纤维素钠。
本发明的有益效果为：本发明通过保护剂和壁材的双重作用，能够有效的保证丁酸梭菌在凡纳滨对虾肠道中定植。
脱脂乳作为一种大分子物质，其中的乳清蛋白能够在菌体表面形成有效的保护层，并且为菌体提供多孔且轻的结构，增强复水性；β-环状糊精是一种低聚糖，在冷冻干燥脱水的过程中起脱水保护剂的作用，能够防止在冷冻干燥升华过程中物理脱水对菌体的损害；葡萄糖中含有大量的自由羟基，在冷冻过程中。对细胞膜原有的水分子基团进行替代，进而与蛋白质和磷脂形成氢键，确保了细胞膜的完整性；磷酸氢二钾能够通过降低菌体中的自由水含量，使得菌体代谢能力降低，从而达到防冻效果。此外，脱脂乳多孔且轻的结构能够作为载体，β-环状糊精和磷酸氢二钾在附着的基础上，β-环状糊精作用于菌体外，磷酸氢二钾作用于菌体内，葡萄糖保护菌体细胞膜，四种保护剂从内到外协同对菌体起到保护作用。
在冻干保护剂的基础上，分别选择明胶、海藻酸钠或羧甲基纤维素钠为壁材。壁材主要起到乳化以及包被的作用，三种壁材均具有良好的成膜性能，并且都具有一定的乳化性，除了对含有保护剂的菌体二次包被外，壁材的成膜对菌剂应对环境的胁迫也起到良好的保护作用，尤其是应对动物消化道中胃酸和胆盐的胁迫。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，步骤（1）中丁酸梭菌发酵液中活菌数量≥1×108CFU/mL。
进一步，步骤（1）中活化的具体方法为：将冻干菌种接种于RCM液体培养基，于35-37℃条件下，厌氧培养12-16h，得到种子液，将种子液重复重复接种和厌氧培养操作2-3次，然后将种子液接种于RCM液体培养基，于35-37℃条件下，厌氧培养16-24h，得到丁酸梭菌发酵液。
进一步，将种子液接种于RCM液体培养基时，接种量均为2-5vt%。
进一步，步骤（2）中离心条件为：温度3-5℃，转速3000-5000r/min，时间10-15min。
进一步，步骤（2）中保护剂溶液中脱脂乳、β-环状糊精、葡萄糖和磷酸氢二钾的浓度分别为50-150g/L，80-120g/L，20-100g/L和5-15g/L，溶剂为生理盐水。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：保护剂溶液浓度太低达不到保护菌体的作用，保护剂浓度过高同样地会降低菌体活性，在本发明采用了适宜的保护剂浓度，能够有效保护菌体的成活率。
进一步，步骤（2）中丁酸梭菌发酵液和保护剂溶液的体积比为8-10：1。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：丁酸梭菌发酵液和保护剂溶液的体积比为8-10：1，能够更好的保护菌体，从而提高成活率。
进一步，步骤（2）中壁材溶液中明胶、海藻酸钠或羧甲基纤维素钠的浓度均为10-30g/L，溶剂为生理盐水。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：壁材溶液是起着乳化包被作用，它的浓度对最终的效果产生影响，当浓度太大时，成膜及乳化效果差，不利于保护剂与菌体更好的结合，从而影响最终的成活率，本发明采用了适宜的浓度，能够有效保护菌体成活率。
进一步，步骤（2）中壁材溶液和保护剂溶液的体积比为0.5-1：1。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：壁材溶液和保护剂溶液的体积比为0.5-1：1时，能够起到更好的包被作用，菌体成活率更高。
进一步，步骤（2）中保护剂溶液和壁材溶液在加入前均经过灭菌处理；其中，保护剂溶液的灭菌条件为：温度105-110℃，灭菌10-12min，壁材溶液的灭菌条件为：温度115-121℃，灭菌15-18min。
进一步，步骤（2）中冷冻干燥的条件为：-80~-75℃条件下，冷冻2-3h，然后冷冻干燥48-72h。
进一步，步骤（2）中混匀条件均为：在氮气氛围下，磁力搅拌。
本发明还提供一种丁酸梭菌制剂，该制剂是采用上述丁酸梭菌制剂的制备方法制得。
本发明还提供上述丁酸梭菌制剂在制备益生菌菌剂、饲料或饲料添加剂方面的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明通过保护剂和壁材的双重作用，能够有效的保证丁酸梭菌在凡纳滨对虾肠道中定植，进而能够对凡纳滨对虾肠道健康的修复提供保障。
2、该菌剂能够显著提高棉籽蛋白替代鱼粉后凡纳滨对虾的生长性能。
3、本发明的方法操作简单，原料易得，能够进行有效的推广。
附图说明
图1为实施例1丁酸梭菌生长曲线；
图2为不同壁材丁酸梭菌对凡纳滨对虾增重率的影响；
图3为不同壁材丁酸梭菌对凡纳滨对虾特定生长率的影响；
图4为不同壁材丁酸梭菌对凡纳滨对虾成活率的影响；
图5为不同壁材丁酸梭菌对凡纳滨对虾饲料系数的影响；
图6为不同壁材丁酸梭菌对凡纳滨对虾肠道丁酸梭菌数量的影响。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下实施例中丁酸梭菌(Clostridium butyricum)菌种购自于广东微生物菌种保藏中心(广东省广州市越秀区先烈中路100号大院实验大楼5楼)，编号：GDMCC 1.676。
实施例1：
一种丁酸梭菌制剂，其制备方法包括以下步骤：
（1）菌种活化：将冻干菌接种于灭菌后的RCM液体培养基，于36℃条件下，厌氧培养13h，得到种子液，重复接种和厌氧培养操作2次（即按2vt%的接种量将种子液再次接种至新的RCM液体培养基中）；按3vt%的接种量，将种子液接种于装有RCM液体培养基的500ml厌氧瓶中，进行扩大培养，于36℃条件下，厌氧培养20h，使得丁酸梭菌发酵液活菌数达到1×108CFU/mL，得到丁酸梭菌发酵液；
（2）保护剂溶液制备：将脱脂乳、β-环状糊精、葡萄糖和磷酸氢二钾加入生理盐水中，制得保护剂溶液，然后于107℃条件下，灭菌9min，备用；其中，保护剂溶液中脱脂乳、β-环状糊精、葡萄糖和磷酸氢二钾的浓度分别为100g/L，100g/L，100g/L，10g/L；
（3）壁材溶液制备：将明胶加入生理盐水中，制得壁材溶液，然后于118℃条件下，灭菌16min，备用；其中，壁材溶液中明胶浓度为30g/L；
（4）将丁酸梭菌发酵液于3℃条件下，以4000r/min转速，离心13min，收集菌泥，加入丁酸梭菌发酵液体积1/9的保护剂溶液，在氮气保护的情况下，在磁力搅拌器上搅拌30min，然后加入保护剂溶液体积0.75倍的壁材溶液，继续在氮气保护的情况下，在磁力搅拌器上搅拌20min，再于-78℃条件下，冷冻2.2h，最后冷冻干燥50h，得到丁酸梭菌菌粉。
实施例2：
一种丁酸梭菌制剂，其制备方法包括以下步骤：
（1）菌种活化：将冻干菌接种于灭菌后的RCM液体培养基，于37℃条件下，厌氧培养12h，得到种子液，重复接种和厌氧培养操作2次（即按2vt%的接种量将种子液再次接种至新的RCM液体培养基中）；按5vt%接种量，将种子液接种于装有RCM液体培养基的500ml厌氧瓶中，进行扩大培养，于37℃条件下，厌氧培养16h，使得丁酸梭菌发酵液活菌数达到1.3×108CFU/mL，得到丁酸梭菌发酵液；
（2）保护剂溶液制备：将脱脂乳、β-环状糊精、葡萄糖和磷酸氢二钾加入生理盐水中，制得保护剂溶液，然后于110℃条件下，灭菌10min，备用；其中，保护剂溶液中脱脂乳、β-环状糊精、葡萄糖和磷酸氢二钾的浓度分别为150g/L，120g/L，80g/L，5g/L；
（3）壁材溶液制备：将海藻酸钠加入生理盐水中，制得壁材溶液，然后于121℃条件下，灭菌15min，备用；其中，壁材溶液中海藻酸钠浓度为20g/L；
（4）将丁酸梭菌发酵液于4℃条件下，以5000r/min转速，离心10min，收集菌泥，加入丁酸梭菌发酵液体积1/10的保护剂溶液，在氮气保护的情况下，在磁力搅拌器上搅拌20min，然后加入保护剂溶液体积1倍的壁材溶液，继续在氮气保护的情况下，在磁力搅拌器上搅拌30min，再于-80℃条件下，冷冻2h，最后冷冻干燥48h，得到丁酸梭菌菌粉。
实施例3：
一种丁酸梭菌制剂，其制备方法包括以下步骤：
（1）菌种活化：将冻干菌接种于灭菌后的RCM液体培养基，于35℃条件下，厌氧培养16h，得到种子液，重复接种和厌氧培养操作3次（即按5vt%的接种量将种子液再次接种至新的RCM液体培养基中）；按5vt%接种量，将种子液接种于装有RCM液体培养基的500ml厌氧瓶中，进行扩大培养，于35℃条件下，厌氧培养24h，使得丁酸梭菌发酵液活菌数达到1.4×108CFU/mL，得到丁酸梭菌发酵液；
（2）保护剂溶液制备：将脱脂乳、β-环状糊精、葡萄糖和磷酸氢二钾加入生理盐水中，制得保护剂溶液，然后于105℃条件下，灭菌12min，备用；其中，保护剂溶液中脱脂乳、β-环状糊精、葡萄糖和磷酸氢二钾的浓度分别为50g/L，80g/L，20g/L，15g/L；
（3）壁材溶液制备：将羧甲基纤维素钠加入生理盐水中，制得壁材溶液，然后于115℃条件下，灭菌18min，备用；其中，壁材溶液中羧甲基纤维素钠浓度为10g/L；
（4）将丁酸梭菌发酵液于5℃条件下，以3000r/min转速，离心15min，收集菌泥，加入丁酸梭菌发酵液体积1/8的保护剂溶液，在氮气保护的情况下，在磁力搅拌器上搅拌40min，然后加入保护剂溶液体积0.5倍的壁材溶液，继续在氮气保护的情况下，在磁力搅拌器上搅拌15min，再于-75℃条件下，冷冻3h，最后冷冻干燥72h，得到丁酸梭菌菌粉。
对比例1：
一种丁酸梭菌制剂，其制备方法包括以下步骤：
不进行丁酸梭菌发酵液的离心浓缩操作，其余步骤同实施例1。
对比例2：
一种丁酸梭菌制剂，其制备方法包括以下步骤：
加入丁酸梭菌发酵液体积1/5的保护剂溶液，其余步骤同实施例1。
试验例
一、丁酸梭菌发酵液检测
将实施例1扩大培养过程中丁酸梭菌发酵液的pH值和光吸收度（OD600）每隔4小时进行测量，生长曲线结果见图1，发酵成的丁酸梭菌经16S rDNA测序，得到序列具体为：GTCGAGCGATGAAGCTCCTTCGGGAGTGGATTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTCATAGAGGGGAATAGCCTTTCGAAAGGAAGATTAATACCGCATAAGATTGTAGTACCGCATGGTACAGCAATTAAAGGAGTAATCCGCTATGAGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGTGATGACGGTCTTCGGATTGTAAAGCTCTGTCTTTAGGGACGATAATGACGGTACCTAAGGAGGAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTACTGGGCGTAAAGGGAGCGTAGGTGGATATTTAAGTGGGATGTGAAATACCCGGGCTTAACCTGGGTGCTGCATTCCAAACTGGATATCTAGAGTGCAGGAGAGGAAAGGAGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTAGGAAGAATACCAGTGGCGAAGGCGCCTTTCTGGACTGTAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATACTAGGTGTAGGGGTTGTCATGACCTCTGTGCCGCCGCTAACGCATTAAGTATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTAGACTTGACATCTCCTGAATTACTCTGTAATGGAGGAAGCCACTTCGGTGGCAGGGAAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCACCCCTTATTGTTAGTTGCTCCCATTTAGTTGAGCTCTCTAGCGAGACTGCCCGGGTTAACCGGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATCCCCCTTATGTCTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAATGAGATGCAACCTCGCGAGAGTGAGCAAAACTATAAAACCGATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGAAACTCGCCTACATGAAGCTGGAGTTGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACCCCATGAGAGTTGGCAATACCCAAAGTTCGTGAGCTACCGCAAGGAGGCA。
由图1可知，丁酸梭菌在RCM培养基中生长迅速，4h进入对数生长期，12h进入稳定期，此外，发酵液PH随着培养时间的增加而降低，培养至16h时发酵液PH值稳定为4.84左右。将其序列与NCBI数据库进行比对，与Clostridium butyricum的相似性最高，匹配度达到99.49%，进一步验证了该菌就是丁酸梭菌。
二、丁酸梭菌活菌数
将实施例1-3和对比例1-2制得的丁酸梭菌菌粉中丁酸梭菌活菌数进行检测，检测方法为：采用倾注法进行计数，称取1g菌粉，按照10-1-10-8稀释度进行梯度稀释，用于计数的稀释梯度为10-6-10-8，固体平板培养基采用亚硫酸铁琼脂，于121℃高压灭菌15min后，冷却至50℃左右，倒入培养皿中，同时注入100微升稀释液摇匀后静置，待其凝固后放入厌氧箱培养14h进行计数。
结果为实施例1-3制得的丁酸梭菌菌粉中丁酸梭菌活菌数分别为4.6×108 CFU/g、5.1×108CFU/g和5.6×108CFU/g，而对比例1-2制得的丁酸梭菌菌粉中丁酸梭菌活菌数分别为1×104CFU/g和2.1×106CFU/g，远不及本发明的活菌数量，说明本发明的丁酸梭菌制剂的制备方法能够有效保护丁酸梭菌。
三、丁酸梭菌在凡纳滨对虾中的应用
将实施例1-3制得的丁酸梭菌菌粉对凡纳滨对虾的作用进行检测，具体方法为：
本试验分为正对照(FM)、负对照(MR)以及实验组。FM组饲料为常规鱼饲料中添加25wt%的鱼粉；MR组饲料为浓缩棉籽蛋白替代FM组40wt%的鱼粉蛋白；实验组在MR组基础上，分别添加实施例1-3制得的丁酸梭菌菌粉，以明胶为壁材的冻干菌粉添加量为0.065wt%、0.26wt%、1.04wt%和4.16wt%，记为M1、M2、M3和M4；以海藻酸钠为壁材的冻干菌粉添加量为0.06wt%、0.24wt%、0.96wt%和3.84wt%，记为H1、H2、H3和H4；以羧甲基纤维素钠为壁材的冻干菌粉添加量为0.05wt%、0.2wt%、0.8wt%和3.2wt%，记为S1、S2、S3和S4。每组三个重复，每个重复30尾虾，共14组，每天投喂四次，分别在6:00、10:00、17:00和21:00按体重的2%、3%、3%和2%进行投喂，养殖周期为5周。
1、养殖结束时，停饲24h，然后对每个养殖桶中的虾进行称重和计数，对增重率、特定生长率、成活率和饲料系数进行检测，检测方法具体为：根据养殖结束后的称重和计数，以及摄食的饲料数量，根据以下公式计算各个指标：
增重率(%)=100×[终末体重(g)-初始体重(g)]/初始体重(g)
特定生长率(%)=100×[ln终末体重(g)-ln初始体重(g)]/养殖天数(d)
成活率(%)=100×(实验结束虾尾数/实验初始虾尾数)
饲料系数=摄食饲料总重量(g)/(终末体重-初始体重)
结果见图2-5。由图2-5可知，不同壁材的丁酸梭菌制剂的添加提高了凡纳滨对虾的增重率和特定生长率，M3、M4、H3、H4、S3以及S4组增重率和特定生长率显著高于MR组（P<0.05），与FM组无显著差异（P>0.05）。H3、FM和S3组成活率显著高于MR组（P<0.05），与其余各组相比无显著差异（P>0.05）。FM和H3组饲料系数显著低于MR、S1和S2组（P<0.05），与其它各组相比无显著差异（P>0.05）。
2、养殖结束时，停饲24h，每桶虾随机取2尾虾用于虾体成分分析，结果见表1。由表1可知，不同壁材丁酸梭菌的丁酸梭菌对凡纳滨对虾体成分产生了积极的影响。各组随着不同壁材丁酸梭菌的添加，粗蛋白、粗脂肪和粗灰分呈上升趋势，M4、H3以及H4组粗蛋白含量显著高于FM和MR组（P<0.05）。M3、M4、H3、H4、S3和S4组粗脂肪含量显著高于FM和MR组（P<0.05），以H3组含量最高。M1和H3组粗灰分含量显著高于FM和MR组（P<0.05）。M3和H3组水分含量显著低于MR组P<0.05）。
表1不同壁材丁酸梭菌对凡纳滨对虾体成分的影响
Figure 564495DEST_PATH_IMAGE001
3、养殖结束时，停饲24h，每个养殖桶中随机取10尾虾，并将肠道取出置于2ml冻存管，立即放入液氮待测，在无菌条件下称取0.1g肠道内容物样品，溶于9ml无菌生理盐水，进行梯度稀释，固体培养基选用亚硫酸铁琼脂，采用倾注法进行平板计数，固体平板置于厌氧箱中培养16h，进行肠道丁酸梭菌计数，结果见图6。由图6可知，MR组肠道丁酸梭菌计数显著低于对照组和实验组（P<0.05），三种壁材丁酸梭菌的添加均改善了肠道丁酸梭菌的数量，显著高于FM和MR组。说明本发明的方法制得的丁酸梭菌菌粉能够有效使丁酸梭菌定值于凡纳滨对虾肠道，这为丁酸梭菌进一步在肠道中发挥作用奠定了基础。
综上所述，使用浓缩棉籽蛋白替代40wt%的鱼粉蛋白时，饲料中添加本发明不同壁材的丁酸梭菌，可显著提高凡纳滨对虾生长性能以及肠道丁酸梭菌数量，其中，以H3组效果最佳。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种丁酸梭菌制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将菌种活化，得到丁酸梭菌发酵液；
（2）将丁酸梭菌发酵液离心，收集菌泥，然后加入保护剂溶液，混匀，再加入壁材溶液，混匀，最后冷冻干燥，得到丁酸梭菌制剂；
其中，保护剂为脱脂乳、β-环状糊精、葡萄糖和磷酸氢二钾的混合物，壁材为明胶、海藻酸钠或羧甲基纤维素钠。
2.根据权利要求1所述的丁酸梭菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中丁酸梭菌发酵液中活菌数量≥1×108CFU/mL。
3.根据权利要求1所述的丁酸梭菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）中活化的具体方法为：将冻干菌种接种于RCM液体培养基，于35-37℃条件下，厌氧培养12-16h，得到种子液，将种子液重复接种和厌氧培养操作2-3次，然后将种子液接种于RCM液体培养基，于35-37℃条件下，厌氧培养16-24h，得到丁酸梭菌发酵液。
4.根据权利要求1所述的丁酸梭菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中离心条件为：温度3-5℃，转速3000-5000r/min，时间10-15min。
5.根据权利要求1所述的丁酸梭菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中保护剂溶液中脱脂乳、β-环状糊精、葡萄糖和磷酸氢二钾的浓度分别为50-150g/L，80-120g/L，20-100g/L和5-15g/L，溶剂为生理盐水。
6.根据权利要求1所述的丁酸梭菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中丁酸梭菌发酵液和保护剂溶液的体积比为8-10：1。
7.根据权利要求1所述的丁酸梭菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中壁材溶液中明胶、海藻酸钠或羧甲基纤维素钠的浓度均为10-30g/L，溶剂为生理盐水。
8.根据权利要求1所述的丁酸梭菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中壁材溶液和保护剂溶液的体积比为0.5-1：1。
9.一种丁酸梭菌制剂，其特征在于，该制剂是采用权利要求1-8任一项所述的丁酸梭菌制剂的制备方法制得。
10.权利要求9所述的丁酸梭菌制剂在制备益生菌菌剂、饲料或饲料添加剂方面的应用。
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