CN203474805U - 一种流感病毒分离检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种流感病毒分离检测试剂盒，包括试剂盒本体，试剂盒本体内放置小瓶离心法试剂瓶、平衡盐溶液洗液瓶、病毒维持液溶液瓶和小瓶离心法流感病毒阳性样品瓶。小瓶离心法试剂瓶为含200μL细胞休眠液的狗肾细胞的小瓶离心法试剂瓶。平衡盐溶液洗液瓶为含质量体积比为0.0625%的胰蛋白酶的平衡盐溶液洗液瓶。病毒维持液溶液瓶为含甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮处理的胰蛋白酶、青霉素、链霉素、两性霉素-B的MEM病毒维持液溶液瓶。本实用新型的试剂盒与现有技术低温保存相比较，细胞复苏率高，操作简单；保存无需程序降温仪和液氮；运输安全方便。

Description

一种流感病毒分离检测试剂盒

技术领域

本实用新型涉及低温生物学、病毒检测领域，具体涉及一种可低温保存及长途运输的小瓶离心法流感病毒分离检测试剂盒。 

背景技术

病毒检测方法包括病毒分离、病毒抗原、核酸和抗体检测。病毒分离为实验室检测的“金标准”；病毒的抗原和核酸检测可以用于早期诊断；抗体检测可以用于回顾性分析。近年来研发机构集中精力在免疫学和分子诊断技术方面开展了卓有成效的工作，无疑这些都是有益的。但是，作为“金标准”的病毒分离培养却由于要求投入比较高、技术较为复杂、见效比较慢而没有受到同等的重视。利用细胞进行病毒分离培养是唯一能够获得活病毒的方法，这对相关病毒的后续研究如病毒的遗传与变异的研究、致病机理的探索、药物敏感性的检测、相应疫苗的研制等等都是不可缺少的前提条件。同时也应该是上述免疫学和分子诊断技术方法赖以比较的基础。但是细胞培养是一个耗时的过程，其步骤需要完成复苏、传代、接种、孵育、分离。该技术无法满足病毒样品快速分离检测的需求，从而影响病毒分离检测的效率。适合临床实验室的敏感和稳定的细胞产品供应是保证医疗机构临床实验室开展常规化病毒检测的关键，但是目前市面上十分缺乏一种有效期长、可用于产业化的预制备细胞产品（低温保存的单层贴壁细胞产品），所以研发一种单层贴壁培养细胞预制备低温保存方法是十分必要。 

单层贴壁细胞预制备技术又叫单层贴壁细胞低温休眠技术，其目的是利用低温低代谢或零代谢技术，让单层贴壁细胞处于静止状态，需要使用时能立即复苏，无需接种和传代，可运用于临床病毒检测分离、抗病毒药物筛选、微量中和试验等等。 

要做到单层贴壁细胞低温休眠，目前现有的方法主要有超低温细胞休眠及非冷冻液态低温休眠。 

超低温细胞休眠是指利用低温冷冻技术将细胞保存在-80℃或-80℃以下，其方法主要包括程控降温法和玻璃化法。 

程控降温法：利用程序降温仪程序控制降温使细胞处于超低温冷冻休眠状态。其原理是从室温以-1℃/min降至-10℃，之后在以-10℃/min速度降至-80℃。程控降温采用慢速冷冻，让细胞有充足时间脱去水分，避免胞内冰晶形成，从而保护细胞。程控降温还需使用冷冻保 护剂共同保护细胞，主要包括乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(G)、二甲基亚砜(DMSO)等，作用原理是利用保护剂的超强渗透性，使细胞内外渗透压保持平衡，当胞外冰晶形成后，胞外溶液随着冰晶的形成，溶剂相对减少，而溶质浓度相对增大，胞内溶剂随渗透压流出胞外，细胞进一步脱水，保护细胞免受冰晶刺破等物理损伤。 

玻璃化休眠：通过高浓度非渗透性溶质（蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮PVP等）及高浓度渗透性保护液，让细胞迅速脱水，之后直接投入液氮中，使之快速冷冻，在1分钟（-2500℃/min）之内，达到冷冻保存液的玻璃转化温度（Tg），最后整个溶液体系形成透明的玻璃态，无冰晶存在，继而保护了细胞。 

非冷冻液态低温休眠：一般临床学术认为在冰点之上，将哺乳动物细胞的温度控制在细胞冰晶形成温度之上至细胞休眠的温度之下范围内（学术届认为-5℃以上，27℃以下）。不同的动物、不同的器官、不同的细胞类型，其最佳休眠温度也不同，所以笔者认为只要掌握冰晶形成温度之上选择一个适合的休眠温度，就可以让多种类的细胞休眠起来。如肿瘤细胞及神经细胞难以忍受10℃以下的低温，而在20℃却不容易出现细胞损伤。绝大多数细胞（上皮细胞、成纤维细胞等）能长时间承受15℃的低温压力，所以选择一个大众低温休眠温度，能有效的抑制多种细胞增值，使之处于休眠状态。 

程控降温法缺陷：当在慢速降温时，细胞虽能脱水避免胞内冰晶损伤，对悬浮细胞来说能起到很好的保护作用，但对单层贴壁细胞，其细胞间质（贴壁细胞及组织细胞的间隙仍然存在着组织液）一样会形成冰晶，刺破细胞膜，所以使用程序降温法对单层贴壁细胞来说，存在着诸多的不确定性，还有程控降温仪成本昂贵，冷冻量不多（一次冷冻两三块96孔板），且相当耗时。所以对单层贴壁细胞预制备的推广得不到有效的帮助，研发意义不大。 

玻璃化休眠缺陷,主要有四点: 

1、当单层贴壁细胞在高浓度溶质的冷冻保护液中，因极度脱水而收缩，这使单层贴壁细胞非常容易脱落。 

2、玻璃化冷冻保护液的毒性也很高，通常玻璃化冷冻使用20%的DMSO保护液，DMSO本身有毒，能破坏细胞骨架。 

3、玻璃化冷冻还存在反玻璃化现象，如当温度高于玻璃化转化温度Tg时候，会出现大量的冰晶，导致细胞损伤。也意味着玻璃化法必须长期保存在液氮中。产品运输无法得到安全保证。 

4、玻璃化冷冻操作危险，我们制备单层贴壁细胞通常使用多孔培养板和玻璃小瓶。温差巨大的情况下，这些器皿容易爆裂，可能伤害到实验操作者。 

非冷冻液态低温休眠缺陷：保存期受到限制（无保护液情况下，最长2周）。主要原因细胞在非冷冻液态低温休眠过程中，仍然有少量的代谢，其代谢产物主要有氧自由基等过氧化物，这些物质长期存在细胞内能使细胞膜、线粒体膜、内质网膜等发生脂质过氧化，同时这些过氧化物还能破坏DNA、蛋白质结构等。其次，细胞长期处于低温液体体系中，Na+-K+-ATP酶活性受到影响，Ca2+离子内流等，这些都会引起高浓度溶质损伤。此外，低温效应也延迟粘附分子L-选择素（L-selectin）、β2-整合素（β2-integrin）等的表达。 

实用新型内容

针对上述现有技术的缺点，本发明的目的在于利用细胞休眠保护液及非冷冻间断性低温休眠保护方法共同结合，有效抑制非冷冻低温损伤，提供一种可低温保存且长途运输的小瓶离心法流感病毒分离检测试剂盒,使小瓶离心法技术产品化，并在有效期内能立即运用于临床病毒分离检测，无需传代，无需接种细胞，有效提高临床病毒分离检测速率。 

本实用新型的一种流感病毒分离检测试剂盒，包括试剂盒本体，在所述试剂盒本体内放置小瓶离心法试剂瓶、平衡盐溶液洗液瓶、病毒维持液溶液瓶和小瓶离心法流感病毒阳性样品瓶。 

所述小瓶离心法试剂瓶为含200μL细胞休眠保护液的单层贴壁状态的狗肾细胞的小瓶离心法试剂瓶。 

所述小瓶离心法试剂瓶有40个。 

所述平衡盐溶液Hanks洗液瓶为含质量体积比为0.0625%的胰蛋白酶的平衡盐溶液洗液瓶。 

所述病毒维持液溶液瓶为含5μg/ml的TPCK处理的胰蛋白酶、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10μg/ml两性霉素-B的MEM病毒维持液溶液瓶。 

所述小瓶离心法流感病毒阳性样品瓶为经多聚甲醛灭活处理的小瓶离心法流感病毒阳性样品瓶。 

本实用新型的试剂盒的使用方法如下： 

含0.0625%胰蛋白酶洗液为A液，含5μg/ml的TPCK处理的胰蛋白酶、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10μg/ml两性霉素B的MEM病毒维持液为B液。 

1、将低温保存的MDCK细胞小瓶离心法小瓶置37℃培养箱复温30分钟，除去细胞低温休眠液，加A液静置1分钟。 

2、B液与标本（床鼻、咽拭子）震荡混合。去A液加含标本B液，之后，用离心机3000 转60分钟离心小瓶离心法小瓶后（实验条件限制可不离心），至37℃恒温培养箱。 

使用离心技术，24小时内可观察细胞病变。并结合免疫荧光技术检测病毒。 

本实用新型的最大优势是可分离活的流感病毒。这是PCR和免疫荧光无法代替的。 

本实用新型的小瓶离心法试剂瓶中的细胞休眠液配方是根据非冷冻低温损伤机制的基础上研制出来的，配方中分别含有80μM/L维生素E、3.7μM/L番茄红素两种抗氧化剂，能有效抑制细胞膜脂质过氧化，保护细胞膜不破损。以及含有30mM/L海藻糖，海藻糖能保护细胞膜上及膜内蛋白与核酸的结构，维持蛋白和核酸功能。配方中还含有1.5%明胶和0.5%海藻酸，组成温敏凝胶（低于15℃凝固，反之融化），能使细胞在运输途中得以固定，保证细胞及小瓶离心法小瓶内的细胞载玻片不脱落。 

非冷冻间断性低温休眠技术：黄鼠冬眠习性观察得出，原理是让小瓶离心法MDCK细胞处于4℃～10℃低温保存7-10天，37℃复温30分钟再继续处于4℃～10℃低温保存7-10天再37℃复温，组成的一个非冷冻间断性低温休眠模式，此法用于shell vial流感病毒分离试剂盒，能有效抑制MDCK细胞的细胞膜脂质过氧化。有效延迟单层贴壁细胞的保存时间。保存有效期为1个月。 

本实用新型的试剂盒与现有单层贴壁细胞低温保存相比较，具有操作简单，无需程序降温仪，无需液氮，运输方便。 

操作方面，与现有程序降温和玻璃化比较，这两种现有低温保存方法需要严格遵从低温冷冻步骤，及快速复温程序，而本实用新型复温和冷冻速度没有限制，适合广大技术员操作。 

运输方面，与现有程序降温和玻璃化比较，无需液氮与干冰，不会出现反玻璃化现象。本发明使用低温水凝胶技术，能有效固定细胞在运输过程不受振动而脱落。 

附图说明

图1本实用新型流感病毒分离检测试剂盒组成的一个优选实施例。 

具体实施方式

为使本实用新型更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本实用新型。应理解，这些实施例仅用于说明本实用新型而不用于限制本实用新型的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。 

实施例1：本实用新型的一个优选实施例的流感病毒分离检测试剂盒组成 

该优选实施例的试剂盒组成见图1，由图1可见，本优选实施例的试剂盒含试剂盒本体1，在所述试剂盒本体1内放置小瓶离心法试剂瓶2、平衡盐溶液Hanks洗液瓶3、病毒维持液溶液瓶4和小瓶离心法阳性样品瓶5。所述小瓶离心法试剂瓶2为含200μL细胞休眠液的狗肾细胞MDCK细胞的小瓶离心法试剂瓶。所述小瓶离心法试剂瓶2有40个。所述平衡盐溶液HBSS洗液瓶3为含质量体积比为0.0625%的胰蛋白酶的平衡盐溶液HBSS洗液瓶。所述病毒维持液溶液瓶4为含5μg/ml的TPCK处理的胰蛋白酶、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10μg/ml两性霉素-B的MEM病毒维持液溶液瓶。所述小瓶离心法流感病毒阳性样品瓶5为经多聚甲醛灭活处理的小瓶离心法流感病毒阳性样品瓶。 

实施例2：实施例1的试剂盒的使用方法 

含0.0625%胰蛋白酶平衡盐洗液为A液，含5μg/ml的甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）处理的胰蛋白酶及常用青霉素、链霉素、两性霉素B的MEM病毒维持液为B液。 

该试剂盒的使用方法如下： 

1、将低温保存的MDCK细胞小瓶离心法小瓶置37℃培养箱复温30分钟，除去细胞低温休眠液，加A液静置1分钟后，再用A液洗一遍。 

2、B液与标本（床鼻、咽拭子）震荡混合。去A液加含标本B液，之后，离心机3000转60分钟离心小瓶离心法小瓶后（实验条件限制可不离心），至37℃恒温培养箱。 

使用离心技术，24小时内可观察细胞病变。并结合免疫荧光技术检测病毒。 

实施例3：使用实施例1的试剂盒的多种流感病毒检测效果 

接种滴度为1.0TCID₅₀/0.1ml多种常见流感病毒，48小时观察细胞病变（CPE），比较低温保存一个月的本实用新型与程控降温法、玻璃化法的检测效果，见表一。 

表一 

注：病变效果均参照每组未接病毒的阴性对照做比较。 

实施例4：使用实施例1的试剂盒的细胞复苏率效果 

将本实用新型的试剂盒与现有低温保存法进行比较。利用台盼蓝染色法，比较四种低温休眠方法，MDCK单层贴壁细胞持续保存1个月的复苏率，程控降温法的复苏率为55%±10.25%，玻璃化法的复苏率为30%±8.21%，未加任何保护剂的复苏率为1%，本试剂盒的复苏率为90%±4.12%。本试剂盒与现有低温保存方法优势明显，SPSS分析技术P<0.01，统计学差异显著。 

实施例5：实施例1的试剂盒的压力测试效果 

比较本实用新型与传统低温运输的，长途运输的压力测试，接种1.0X10⁴/ml细胞到小瓶离心法小瓶中待长满后，加入低温保存液低温保存。比较三种方法在37℃摇床震荡环境中，模拟低温运输的细胞损伤情况，见表二。从表二可知，本试剂盒：普通低温冰盒运输，低温保存运输范围-5℃～10℃。40小时后冰盒内仍然保持15℃以下，细胞存活率不变；程控法：干冰运输，低温保存运输范围-80℃，干冰16小时后开始升华，温度上升，冰晶形成，细胞存活率降低；玻璃化法：干冰运输，低温保存运输范围-80℃，用干冰运输则因为反玻璃现象，4小时细胞基本死亡。本试剂盒与两种冷冻法比较，P<0.01，统计学差异显著。 

表二 

实施例6：实施例1的试剂盒的运用间断休眠法的保护效果 

比较本实用新型、未加低温保护液组、含低温保护液不实施间断性休眠法组的细胞保存效果，见表三。当细胞处于-5℃～10℃低温保存中，受氧自由基氧化，细胞膜会发生脂质过氧化，而丙二醛含量随着细胞氧化程度的增强而增高。所以通过检测丙二醛含量可以评价细胞脂质过氧化程度，从而评价本实用新型的低温保存优势。从表三数据结果可知，未加低温保护液组丙二醛含量保存第6天比保存第3天增加了5倍，而加低温保护液未实施间断性休 眠的第12天开始丙二醛含量成倍增加。本实用新型21天中，丙二醛含量保持较低水平。 

表三 

Claims (4)

1.一种流感病毒分离检测试剂盒，包括试剂盒本体，其特征在于，在所述试剂盒本体内放置小瓶离心法试剂瓶、平衡盐溶液洗液瓶、病毒维持液溶液瓶和小瓶离心法流感病毒阳性样品瓶。 

2.根据权利要求1所述的流感病毒分离检测试剂盒，其特征在于，所述小瓶离心法试剂瓶为含200μL细胞休眠液的狗肾细胞的小瓶离心法试剂瓶。 

3.根据权利要求2所述的流感病毒分离检测试剂盒，其特征在于，所述小瓶离心法试剂瓶有40个。 

4.根据权利要求1所述的流感病毒分离检测试剂盒，其特征在于，所述小瓶离心法流感病毒阳性样品瓶为经多聚甲醛灭活处理流感病毒的小瓶离心法阳性样品瓶。 

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