CN113462815A - 病毒培养基及其制备方法、病毒转运培养瓶和病毒采样管 - Google Patents
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Abstract
本发明第一方面提供了一种病毒培养基，制备原料包含Hankes缓冲液、亲水胶、血清白蛋白、氨基酸、pH缓冲剂和复配抗菌剂，复配抗菌剂包含庆大霉素和馨鲜醇类化合物。本发明的病毒培养基使用了庆大霉素与抑菌剂的结合，馨鲜醇类化合物包含馨鲜醇及馨鲜醇衍生物，馨鲜醇类化合物与庆大霉素具有类似的化学结构，实验发现在病毒培养基中同时使用二者可以产生协同作用，一方面提高病毒培养基的抑菌能力，另一方面可以降低病毒培养基对细胞的毒性，同时本发明的病毒培养基能够维持较高的病毒感染活性，并且降低了生产成本。本发明没有局限于经典配方的常规优化，而是引入了新的成分，并且获得了更好的病毒保存效果。
Description
技术领域
本发明涉及病毒培养液领域，具体涉及一种病毒培养基、病毒转运培养瓶和病毒采样管。
背景技术
病毒一般由核酸(DNA或RNA)和包裹核酸的蛋白质外壳组成，必须在活细胞内寄生增殖。大部分病毒是一种病原体微生物，能够使宿主发病并可以在生物体间传播而具备传染性。现有技术中，可以通过采集样本进行体外诊断，检测是否感染某种病毒。常见的检测方法是对病人的样本进行抗原检测或核酸检测，但是病毒一般离开宿主细胞会很快失活，病毒完整性会被破坏，病毒外壳崩解，核酸发生降解。因此，为了保证体外诊断的准确性，病毒的样本运输和保存都需要采用特定的器皿或保存液。现有技术中，病毒样本的保存运输，一般采用生理盐水、PBS缓冲溶液、抗生素和Hank’s液组成的病毒转运培养基对病毒进行转运。由于病毒采样和转运过程中需要面临复杂的环境，因此对于病毒转运培养基的抗菌性能要求较高，所以目前的病毒转运培养基多采用高含量的复合抗生素的方式来实现较高的抗菌性能，但是如此会明显提高生产成本，同时复杂的成分容易影响病毒的活性。病毒培养基包含灭活型和非灭活型，其中灭活型病毒培养基可以将病毒裂解，适用于核酸检测；而非灭活型病毒培养基保存的病毒除了需要满足核酸检测的需要，还被应用于抗原检测、临床基础研究等，因此需要保证病毒结构的完整性及感染活性。
病毒培养基被用于病毒的运输及培养，病毒容易发生裂解和失活，病毒培养基中各成分的选择及组合对于病毒的保存至关重要，因此目前针对病毒培养基的改良局限于经典配方，引入其它成分可能对病毒培养基的性能带来巨大影响。
发明内容
本发明第一方面提供了一种病毒培养基，制备原料包含Hankes缓冲液、亲水胶、血清白蛋白、氨基酸、pH缓冲剂和复配抗菌剂，复配抗菌剂包含庆大霉素和馨鲜醇类化合物。
本发明的病毒培养基使用了庆大霉素与抑菌剂的结合，馨鲜醇类化合物包含馨鲜醇及馨鲜醇衍生物，馨鲜醇类化合物与庆大霉素具有类似的化学结构（馨鲜醇含苯环+羟基，庆大霉素有很多六碳环+羟基+氨基，这些基团可以相互吸引），实验发现在病毒培养基中同时使用二者可以产生协同作用，一方面提高病毒培养基的抑菌能力，另一方面可以降低病毒培养基对细胞的毒性，同时本发明的病毒培养基能够维持较高的病毒感染活性，并且降低了生产成本。本发明没有局限于经典配方的常规优化，而是引入了新的成分，并且获得了更好的病毒保存效果。
馨鲜醇类化合物一般被应用于人皮肤护理保存液体中，而病毒和细胞对于外界环境各种物质很敏感，同时馨鲜醇类化合物被发现具有一定的毒性，先前并没有应用到生物中，并且发明人通过实验证实，在病毒培养基中加入馨鲜醇类化合物会导致病毒培养基对细胞的毒性显著上升，但是加入馨鲜醇类化合物和庆大霉素后，病毒培养基的细胞毒性显著降低，其内在机制可能是馨鲜醇类化合物和庆大霉素具有类似的结构，可以产生相似相溶作用，对二者表面的基团产生修饰作用，因此同时加入馨鲜醇类化合物和庆大霉素的病毒培养基具有更低对细胞的毒性和更高的抑菌能力，因此本发明的病毒培养基更有利于收集的样本的病毒的保存和进一步培养。
进一步，馨鲜醇类化合物包含馨鲜醇和馨鲜醇的衍生物中的至少一种。更进一步的，馨鲜醇的衍生物包含馨鲜酮。上述化合物与馨鲜醇的结构十分接近，本领域技术人员可以预期上述化合物具有和庆大霉素具有协同作用。
进一步的，病毒培养基，包含以下浓度的制备原料：
亲水胶 1~5g/L；
血清白蛋白 5~15g/L；
氨基酸 1~5g/L；
pH缓冲剂 4~10g/L；
复配抗菌剂 5~20g/L。
上述比例的化合物于市售Hankes缓冲液中混合得到的病毒培养基，可以保护细胞蛋白，维持环境渗透压和pH，具有较高的抑菌性能、较低的细胞毒性并能够更好的维持细胞活性。
进一步的，庆大霉素的浓度为50μg~250μg。含有该浓度范围内的庆大霉素病毒培养基，具有很好的抑菌效果、较低的细胞毒性和成本。
进一步的，亲水胶为明胶。
进一步的，血清白蛋白为BSA。
本发明第二方面提供了一种病毒培养基的制备方法，包含以下步骤：
称取氨基酸、血清白蛋白、亲水胶和pH缓冲剂，用Hankes缓冲液溶解，然后加入复配抑菌剂，然后调节pH值至7.4~7.5，最后用Hankes缓冲液定容。
本发明第三方面提供了一种病毒转运培养瓶，包含病毒转运培养基，病毒转运培养基为上述病毒培养基。
本发明第四方面提供了一种病毒采样管，包含病毒培养基，病毒培养基为上述病毒培养基。
附图说明
图1 细菌抑菌实验（TSA）的实验结果。
图2 真菌抑菌实验（SDA）的实验结果。
图3 细胞毒性测试结果的图表。
图4 阳性对照的病毒滴度测试结果。
图5 阴性对照的病毒滴度测试结果。
图6 实施例1的病毒滴度测试结果。
图7 对比例1的病毒滴度测试结果。
图8 对比例2的病毒滴度测试结果。
图9 对比例3的病毒滴度测试结果。
具体实施方式
本发明提供了一种病毒培养基，制备原料包含Hankes缓冲液、亲水胶、血清白蛋白、氨基酸、pH缓冲剂和复配抗菌剂，复配抗菌剂包庆大霉素和馨鲜醇类化合物。
其中，亲水胶的的浓度可以为但不限于为1、2、3、4、5g/L，血清白蛋白的浓度可以为但不限于为5、6、8、10、12、13、15g/L，氨基酸的浓度可以为但不限于为1、2、3、4、5g/L，pH缓冲剂的浓度可以为但不限于为4、5、6、7、8、9、10g/L，复配抗菌剂的浓度可以为但不限于为1、2、3、5、7、9、10g/L。
本发明的病毒培养基中，抗生素的浓度可以为但不限于为50、100、150、200、250μg/L，馨鲜醇类化合物的浓度可以为但不限于为1、2、3、5、6、7、8、9、10g/L。
血清白蛋白可以为BSA，也可以是其它血清白蛋白。
为更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。需说明的是，下述实施所述实施例是对本发明的进一步解释说明，不应当作为对本发明的限制。本实施例涉及的原料皆可通过市售而获得。
实施例1
一种病毒采样管，包含病毒转运培养基，病毒转运培养基按照下述方法配置：
甘氨酸 1g
BSA 10g
灭菌明胶 1g
Hepes 4.766g
馨鲜酮 10g
庆大霉素 75μg
按照上述配方称取甘氨酸、BSA、灭菌明胶和Hepes，用Hankes缓冲液溶解，然后加入复配抑菌剂的成分，调节pH值至7.4~7.5，然后用Hankes缓冲液定容到1L。
对比例1
一种病毒采样管，包含病毒转运培养基，病毒转运培养基按照下述方法配置：
甘氨酸 1g
BSA 10g
灭菌明胶 1g
Hepes 4.766g
庆大霉素 75μg
按照上述配方称取甘氨酸、BSA、灭菌明胶和Hepes，用Hankes缓冲液溶解，然后加入庆大霉素，调节pH值至7.4~7.5，然后用Hankes缓冲液定容到1L。
对比例2
一种病毒采样管，包含病毒转运培养基，病毒转运培养基按照下述方法配置：
甘氨酸 1g
BSA 10g
灭菌明胶 1g
Hepes 4.766g
庆大霉素 150μg
按照上述配方称取甘氨酸、BSA、灭菌明胶和Hepes，用Hankes缓冲液溶解，然后加入庆大霉素，调节pH值至7.4~7.5，然后用Hankes缓冲液定容到1L。
对比例3
一种病毒采样管，包含病毒转运培养基，病毒转运培养基按照下述方法配置：
甘氨酸 1g
BSA 10g
灭菌明胶 1g
Hepes 4.766g
馨鲜酮 10g
按照上述配方称取甘氨酸、BSA、灭菌明胶和Hepes，用Hankes缓冲液溶解，然后加入庆大霉素，调节pH值至7.4~7.5，然后用Hankes缓冲液定容到1L。
对上述病毒采样管中的病毒转运培养基进行抗菌能力测试、毒性测试和病毒保存效果测试。
病毒转运培养基的抗菌能力测试。
1.操作台紫外消毒20min，75%酒精擦拭台面；
2.取两个平板，在无菌操作要求下分别倾注约20mL TSA和20mL SDA培养基，加盖后室温放至凝固做阴性对照；
3.另取平板各加入1mL病毒运送培养基，分别在无菌操作要求下倾注约20mL TSA培养基，加盖后室温放至凝固；
4.另外平板各加入1mL病毒运送培养基，分别在无菌操作要求下倾注约20mL SDA培养基，加盖后室温放至凝固；
5.将加入TSA的平板置于恒温培养箱中37℃培养48h观察结果；
6.将加入SDA的平板置于恒温培养箱中28℃培养48h观察结果。
病毒转运培养基的毒性测试。
1.细胞接种：按5×104个/孔的接种密度接种细胞至96孔板中，培养箱（37℃、5%CO2）中培养24h；
2.实验分组：实验设置调零组（仅加入DMEM培养基，不接种细胞）、阳性药物组（加入Cisplatin ）、溶剂对照（加入正常DMEM培养基培养细胞液体）与样品组。样品组中，每个培养基设置6个浓度梯度，每组设置6个平行；
3.培养基浓度设置如下：取一个96孔板，第一个孔加入200μL待测病毒培养基,后面每孔含有180μL DMEM，从第一个孔吸取20μL待测病毒培养基加入180μL DMEM中，混匀后吸取20μL混合液至第三个孔，如此稀释至第六个孔（即稀释105倍），稀释方法详见表1；
表1：细胞毒性测试的培养基稀释方法
4.吸取100μL培养基混合液到相对应的96孔板中，置于37℃，5% CO2 培养箱培养中培养24h；
5.每孔加入10μL CCK-8溶液，轻轻敲击培养板混匀，培养箱中孵育1小时，孵育完成后在450nm处读取OD值；
6.细胞相对活力计算：根据公式计算，细胞相对活力（%）=
。
病毒转运培养基的病毒保存效果测试（病毒滴度法）。
1.按5×104个/孔的接种密度接种细胞至48孔板中，培养箱（37℃、5%CO2）中培养24h；
2.10倍梯度稀释病毒，具体做法如下：取一个48孔板，每孔含有90μL培养基，第一个孔加入10μL待测病毒原液，混匀后吸取10μL病毒混合液至第二个孔，如此稀释至第六个孔（即稀释105倍），稀释方法参见表2；
表2 病毒保存效果测试的培养基稀释方法；
3.各吸取10μL病毒稀释液到相对应的48孔板中，置于37℃，5% CO2 培养箱培养过夜，24h后用新鲜的DMEM培养基换液；
4.置于37℃，5% CO2 培养箱培养48h后，用荧光显微镜计数荧光细胞数量。
实验数据与结果。
1.抑菌能力实验的结果。
抑菌能力实验的结果请参见图1、图2，统计数据见表3。
表3 实施例1和对比例1~3在TSA和SDA上的菌落数的统计表。
2.细胞毒性测试结果。
细胞毒性测试结果请参考表4，将表4的结果转化为图表，请参见图3。
表4 细胞毒性测试结果表。
3.病毒转运培养基的病毒保存效果测试结果（病毒滴度法）。
病毒转运培养基的病毒保存效果测试结果（病毒滴度法）请参见图4-8，统计数据请参见表5。
表5 病毒转运培养基的病毒保存效果测试结果表。
根据图1-2和表3的结果可知，实施例1的抑菌能力相对于对比例1~3均明显增强，说明将馨鲜酮与庆大霉素组合相对于单独使用相同浓度的庆大霉素、单独使用馨鲜酮和使用双倍浓度的庆大霉素，都具有更好的抑菌效果，因此馨鲜酮和庆大霉素的组合不是简单的增加抑菌物质的浓度，而是产生了协同作用。其内在机理可能是馨鲜醇类化合物和庆大霉素具有类似化学结构，因此可以产生相似相溶作用，彼此相互靠近，更好的发挥抑菌作用。
根据表4和图3的结果可知，对比例3的细胞毒性相对于对比例1~2高，这说明单独引入馨鲜酮会增加细胞转运培养基的细胞毒性，但是实施例1的细胞毒性相对于对比例3更低，甚至比对比例1~2更低，其内在机理可能是馨鲜醇类化合物和庆大霉素具有类似的化学结构，可以产生相似相溶作用，对二者表面的基团产生修饰作用，因此同时加入馨鲜醇类化合物和庆大霉素的病毒培养基具有更低的细胞毒性。
根据图4-9和表5的结果可知，实施例1（图6）保存的病毒感染活性虽然较对比例1（图7）、2（图8）低，但是仍然能够满足实验和检测的需要，并且基于上述论述，实施例1的病毒转运培养基具有更高的抑菌能力和更低的细胞毒性，可以更好的满足实验和检测的需求。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，但是也并不仅限于实施例中所列，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种病毒培养基，其特征在于，制备原料包含Hankes缓冲液、亲水胶、血清白蛋白、氨基酸、pH缓冲剂和复配抗菌剂，所述复配抗菌剂包含庆大霉素和馨鲜醇类化合物。
2.根据权利要求1所述的病毒培养基，其特征在于，所述馨鲜醇类化合物包含馨鲜醇和馨鲜醇的衍生物中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的病毒培养基，其特征在于，所述馨鲜醇的衍生物包含馨鲜酮。
4.根据权利要求1所述的病毒培养基，其特征在于，包含以下浓度的制备原料：
氨基酸 1~5g/L；
血清白蛋白 5~15g/L；
亲水胶 1~5g/L；
pH缓冲剂 4~10g/L；
馨鲜醇类化合物 1~10g/L；
庆大霉素 50~100μg/L。
5.根据权利要求1所述的病毒培养基，其特征在于，所述馨鲜醇类化合物的浓度为1~3g/L。
6.根据权利要求1所述的病毒培养基，其特征在于，所述亲水胶为明胶。
7.根据权利要求1所述的病毒培养基，其特征在于，所述血清白蛋白为BSA。
8.根据权利要求1~7任一项所述的病毒培养基的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
称取所述氨基酸、所述血清白蛋白、所述亲水胶和所述pH缓冲剂，用所述Hankes缓冲液溶解，然后加入所述复配抑菌剂，然后调节pH值至7.4~7.5，最后用所述Hankes缓冲液定容。
9.一种病毒转运培养瓶，包含病毒转运培养基，其特征在于，所述病毒转运培养基为权利要求1~7任一项所述的病毒培养基。
10.一种病毒采样管，包含病毒转运培养基，其特征在于，所述病毒转运培养基为权利要求1~7任一项所述的病毒培养基。
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| I G MAMEDOV ET AL.: "Antibacterial and antifungal activities of some hydroxyacetophenone derivatives", INDIAN JOURNAL OF CHEMISTRY, pages 1 * |
| 王云等: "洗护发产品无防腐剂技术的研究与应用", 广东化工, pages 2 * |
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