CN111480746A - 一种抗鸡心包积液综合征饲料添加剂制备方法及应用 - Google Patents

一种抗鸡心包积液综合征饲料添加剂制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

一种抗鸡心包积液综合征饲料添加剂制备方法及其应用，本发明涉及一种饲料添加剂制备方法及应用。本发明解决了目前采用疫苗预防鸡心包积液综合征的方法成本高、效果差的问题。制备方法：一、制备鸡心包积液综合征的卵黄抗体溶液；二、制备鸡心包积液综合征的卵黄抗体冻干粉；三、卵黄冻干粉与黄芪多糖、当归多糖、枸杞多糖混合得到饲料添加剂。本发明饲料添加剂在抗鸡心包积液综合征的应用。本发明方法简单，成本低，在抗鸡心包积液综合征的应用中，因鸡心包积液综合征病鸡的死亡率降低到8％以下，效果好。

Description

一种抗鸡心包积液综合征饲料添加剂制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种饲料添加剂制备方法及应用。
背景技术
鸡心包积液综合征主要是由4型禽腺病毒感染引起一种以心包内出现淡黄色液体为主要临床症状的鸡急性传染病，也常见包涵体肝炎症状，病鸡通常表现精神沉郁，死亡率可达90％。自2015年以来开始在中国的河南、河北、辽宁、吉林、新疆、安徽、山东、江西、湖北和江苏等省份迅速传播，2016年以来，黑龙江省内不同地区出现爆发的现象，给养鸡业造成了严重的经济损失。
目前4型禽腺病毒引起的鸡心包积液综合征主要通过接种疫苗的方式预防，但国内尚未见自主研发的商品化疫苗，一般使用国外的疫苗，成本较高，在国内的应用效果却一般。另外，疫苗主要在于预防该病，在发病之后紧急接种，很难控制发病。
发明内容
本发明为了解决目前采用疫苗预防鸡心包积液综合征的方法成本高、效果差的问题，而提供了一种抗鸡心包积液综合征饲料添加剂制备方法及应用。
本发明抗鸡心包积液综合征饲料添加剂制备方法按照以下步骤进行：
一、制备鸡心包积液综合征的卵黄抗体溶液：含有鸡心包积液综合征抗体的蛋黄液、浓度为1.5％～2％氯化钠水溶液和浓度为10％～11％的PEG6000溶液按体积比为1：1：1的比例搅拌混合，然后用60目筛子过滤后置于温度为 3～5℃的条件下静置11～13h，然后离心去沉淀得到上清液，上清液过滤、除菌，即得到鸡心包积液综合征的卵黄抗体溶液；
二、制备鸡心包积液综合征的卵黄抗体冻干粉：步骤一中的鸡心包积液综合征的卵黄抗体溶液与甲醛、硫柳汞、维生素C、聚乙烯比咯烷酮、甘氨酸、山梨醇、葡萄糖按照重量份数比为 95～97:0.2～0.4:0.01～0.03:0.05～0.15:0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2的比例混合得到混合液，混合液经过冷冻干燥后得到含有鸡心包积液综合征抗体的卵黄冻干粉；
三、步骤二中得到的卵黄冻干粉与黄芪多糖、当归多糖、枸杞多糖按照重量份数比为3～5：25～28：8～12：8～12的比例混合即得到抗鸡心包积液综合征饲料添加剂。
上述饲料添加剂在抗鸡心包积液综合征上的应用。具体的应用方法：上述抗鸡心包积液综合征饲料添加剂按照质量比为3～10：100的比例添加到鸡饲料中进行饲喂。
本发明在制备鸡心包积液综合征的卵黄抗体溶液时，采用PEG6000作为主要提取试剂，PEG6000无毒、无刺激性，具有良好的水溶性，不需要使用任何有污染试剂或材料，本发明的方法安全环保；另外，卵黄抗体溶液在3～5℃条件下进行反应，经过一步离心取上清过滤即可，制备方法简便，易于规模化生产。
本发明制备过程中的添加剂—多糖具有提高免疫力，增强机体适应性和抵抗能力、抗菌、抗病毒、调节机体代谢的作用，本发明中分别添加了黄芪多糖、当归多糖以及枸杞多糖。黄芪多糖是黄芪的主要成分，黄芪，归肺经，益气升阳，固表止汗，利水消肿，脱毒生肌，主治一切气虚血亏之症，主要作用于肾，有利尿作用，可以缓解心包的积水，减轻心包积水对心脏的损伤作用，减弱临床症状，而且黄芪多糖能够促进细胞中DNA合成，提高淋巴细胞的增殖和白细胞诱生干扰素能力的增强，增强抗病毒效果。当归多糖是当归的主要成分，当归，甘、辛、苦、温。归心、肝经，补血活血，强心保肝，有研究表明，当归多糖能够有效修复心肌细胞损伤，对于4型禽腺病毒感染导致的心肌损伤、包涵体肝炎具有缓解作用。枸杞多糖是枸杞的主要有效成分，枸杞，归肾经，养肝补肾，能够有效缓解肾脏排水代谢造成的肾负担，另外，枸杞多糖在抑制脂肪肝方面效果显著。
本发明鸡心包积液综合征的卵黄抗体冻干粉通过与多重辅料复配，大大延长了卵黄抗体的保存时间，保证了卵黄抗体的稳定性，同时，本发明的添加剂加入多糖，有效的避免患病鸡在治疗过程中的应激损伤，减少死亡率，本发明的饲料添加剂制备方法简单，成本低，用本发明添加剂进行饲喂，患因鸡心包积液综合征病鸡的死亡率降低到8％以下，本发明饲料添加剂效果好。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式抗鸡心包积液综合征饲料添加剂制备方法按照以下步骤进行：
一、制备鸡心包积液综合征的卵黄抗体溶液：含有鸡心包积液综合征抗体的蛋黄液、浓度为1.5％～2％氯化钠水溶液和浓度为10％～11％的PEG6000溶液按体积比为1：1：1的比例搅拌混合，然后用60目筛子过滤后置于3～5℃的条件下静置11～13h，然后离心去沉淀得到上清液，上清液过滤、除菌，即得到鸡心包积液综合征的卵黄抗体溶液；
二、制备鸡心包积液综合征的卵黄抗体冻干粉：向步骤一中的鸡心包积液综合征的卵黄抗体溶液与甲醛、硫柳汞、维生素C、聚乙烯比咯烷酮、甘氨酸、山梨醇、葡萄糖按照重量份数比为 95～97:0.2～0.4:0.01～0.03:0.05～0.15:0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2的比例混合得到混合液，混合液经过冷冻干燥后得到含有鸡心包积液综合征抗体的卵黄冻干粉；
三、步骤二中得到的卵黄冻干粉与黄芪多糖、当归多糖、枸杞多糖按照重量份数比为3～5：25～28：8～12：8～12的比例混合即得到抗鸡心包积液综合征饲料添加剂。
本实施方式步骤一中含有鸡心包积液综合征抗体的蛋黄液的制备方法按照以下步骤进行：
1、病毒增殖
利用保存于黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院兽药研究室的4型禽腺病毒种毒接种9日龄SPF鸡胚卵黄囊，37℃培养72～96h。4型禽腺病毒种毒记载于 2019年发表在动物医学进展杂志上，作者是朱庆贺等，文献名称是《黑龙江省 1群4型禽腺病毒分离鉴定及致病性试验》；
2、病毒的收集
24h死亡鸡胚弃去，收集72～96h死亡鸡胚尿囊液，于-20℃反复冻融两次，10000r/min 4℃10min后收集上清液，即病毒原液；对上清病毒液进行效价测定，即为疫苗病毒液；
3、病毒含量测定
将疫苗病毒液用生理盐水做10倍稀释，10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，5个稀释度接种spf鸡胚，每个鸡胚每个稀释度重复4次，同时设生理盐水对照孔。 37℃培养7天，观察鸡胚存活情况，计算LED50，每0.1ml病毒含量，10-4 . 33/0.1mLELID50以上，方可用于制备疫苗；
4、病毒灭活
疫苗病毒液中加入终浓度0.3％的甲醛溶液37℃灭活24h，即为疫苗抗原；
5、疫苗制备
油相制备：按照重量份数取优质注射用96份的白油，4份的司本-80。先将白油缓缓加温，加入4％的司班-80，边搅拌边加温，直到充分溶解至透明，高压灭菌备用；
水相制备：按照重量份数取96份疫苗抗原加入灭菌后的4份吐温-80中，开始搅拌使吐温80完全溶解为止，制成水相。
利用IKA乳化机乳化油相与水相6min，即得灭活疫苗(4型禽腺病毒)。
6、蛋鸡免疫
基础免疫：开产前2～3周健康产蛋鸡，颈部皮下注射4型禽腺病毒灭活疫苗(简称免疫原)，1.0mL/只。
加强免疫：在基础免疫后14日进行第2次接种，颈部皮下注射免疫原， 1.0mL/只；强化免疫：在加强免疫后14日进行第3次接种，肌肉多点注射免疫原，1.0mL/只。
维持免疫：在强化免疫接种后，跟踪测定抗体水平，抗体效价<24时，进行加强免疫，肌肉多点注射免疫原，1.0mL/只。
7、卵黄抗体的制备
强化免疫后持续监测卵黄抗体效价，当效价达到25开始收集高免蛋，将高免蛋置于水龙头下冲洗10min，除去高免蛋表面污染物，冲洗好后的高免蛋浸入新洁尔灭水溶液中消毒15min。
卵黄分离采用手工或机械打蛋，打蛋时应充分除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄，去除卵黄膜和卵黄系带后利用组织捣碎匀浆机进行破碎4～6min，得含有鸡心包积液综合征抗体的蛋黄液。
本实施方式中步骤一中的含有鸡心包积液综合征抗体的蛋黄液卵黄抗体效价为1:32。
本实施方式步骤二所述的冷冻干燥的方法：混合液-80℃条件下充分冷冻，然后放入预冷的冻干机中，冻干机北京博医康FD-1D-50(压盖型)。
技术参数为：冷凝温度<-50℃
真空度<20Pa
冻干面积0.07㎡(样品盘面积)
盘装物料0.7升
样品盘Φ180mm共3层
冻干时间约24小时(物料厚度10mm)
冻干瓶8只
冻干瓶规格100ml、250ml、500ml、1000ml
冻干时间冻干瓶冻干时间约8小时
捕水能力3kg/24h
电源要求220V 50Hz 800W
主机尺寸W380×D600×H345mm
本实施方式步骤一中在制备鸡心包积液综合征的卵黄抗体溶液时，采用 PEG6000作为主要提取试剂，PEG6000无毒、无刺激性，具有良好的水溶性，不需要使用例如氯仿等有毒有害试剂，本发明的方法安全环保；另外，卵黄抗体溶液对温度较为依赖，而本发明仅在3～5℃条件下，PEG6000即可达到良好的分离效果，一次离心就可以轻松分离出卵黄抗体溶液；本发明方法对温度要求不高，仅需一次离心，操作简便，克服了多次离心给规模化生产带来的不便。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一所述的搅拌混合时间为8～12min，搅拌充分。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一所述的离心是在转速为4000～6000r/min的条件下离心15～25min。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一所述的上清液过滤采用的是3～5层的纱布进行过滤。其他与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至三不同的是：步骤一所述的除菌是采用0.45μM微膜进行过滤除菌。其他与具体实施方式一至三相同。
具体实施方式六：具体实施方式一所述的抗鸡心包积液综合征饲料添加剂在抗鸡心包积液综合征上的应用。
本实施方式抗鸡心包积液综合征饲料添加剂的应用方法是：具体实施方式一所述的抗鸡心包积液综合征饲料添加剂按照质量比为3～10：100的比例添加到鸡饲料中进行饲喂。
具体实施方式七：本实施方式抗鸡心包积液综合征饲料添加剂制备方法按照以下步骤进行：
一、制备鸡心包积液综合征的卵黄抗体溶液：含有鸡心包积液综合征抗体的蛋黄液、浓度为1.5％～2％氯化钠水溶液和浓度为10％～11％的PEG6000溶液按体积比为1：1：1的比例搅拌混合，然后用60目筛子过滤后置于3～5℃的条件下静置11～13h，然后离心去沉淀得到上清液，上清液经过过滤、除菌，即得到鸡心包积液综合征的卵黄抗体溶液；
二、制备鸡心包积液综合征的卵黄抗体冻干粉：向步骤一中的鸡心包积液综合征的卵黄抗体溶液与甲醛、硫柳汞、维生素C、聚乙烯比咯烷酮、甘氨酸、山梨醇、葡萄糖按照重量份数比为96:0.3:0.01:0.1:1:1:1:1的比例混合得到混合液，混合液经过冷冻干燥后得到含有鸡心包积液综合征抗体的卵黄冻干粉；
三、步骤二中得到的卵黄冻干粉与黄芪多糖、当归多糖、枸杞多糖按照重量份数比为4：26：10：10的比例混合即得到抗鸡心包积液综合征饲料添加剂。其中步骤一所述的搅拌混合时间为10min，搅拌充分；步骤一所述的离心是在转速为5000r/min的条件下离心20min；步骤一所述的上清液过滤采用的是4 层纱布进行过滤；步骤一所述的除菌是采用0.45μM微膜进行过滤除菌。
实施例1本发明抗鸡心包积液综合征饲料添加剂的质量检测
1、饲料添加剂质量检测
将本发明的饲料添加剂保存在37℃培养箱中，保存24个月，分别于2周、 1个月、3个月、6个月、12个月、24个月、48个月后，用琼脂扩散(AGP) 方法检测每个时间点样品的卵黄抗体效价变化情况，结果表明在存放48个月后抗体效价仍维持24，说明保质期为2年。具体见表1。
表1卵黄抗体效价变化情况
Figure DEST_PATH_IMAGE001
2、支衣原体检验和外源病毒检验
检验按照《中国兽药典》进行，两项试验均符合规定要求。
3、安全性试验
选取2周龄雏鸡100只，随机分为4组，分别为普通饲料饲喂组，饲料添加剂组(5％添加)，3倍饲料添加剂组(15％添加)，5倍饲料添加剂组(25％添加)，观察两周。结果表明，4组雏鸡生长情况无异常，无发病死亡现象。说明饲料添加剂安全性好。
4、雏鸡保护性试验及防治效果分析
选取2周龄雏鸡250只，随机分为5组，具体如下。
第一组：普通饲料+攻毒；
第二组：普通饲料+5％饲料添加剂+攻毒，普通饲料和具体实施方式七制备得到的饲料添加剂的质量比为100:5；
第三组：普通饲料+4型禽腺病毒卵黄抗体冻干粉组+攻毒组，普通饲料与具体实施方式七制备得到的含有鸡心包积液综合征抗体的卵黄冻干粉的质量比为100:5；
第四组：普通饲料+复合多糖+攻毒，普通饲料与复合多糖质量比为100：5，所述的复合多糖由黄芪多糖、当归多糖、枸杞多糖按照重量份数比为26：10： 10的比例混合；
第五组：空白对照组即普通饲料不进行攻毒；
饲喂方式为自由采食，自由饮水，第一组至第四组在饲喂24h后，进行攻毒，即在每只雏鸡颈部皮下接种病毒(病毒滴度为EID50＝10-4.33)，接种量为 0.2mL/只，记录120h内发病情况。
观察雏鸡患病及死亡情况，结果如表2所示。
表2雏鸡保护性试验及防治效果分析
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从表2可以看出，普通饲料+攻毒组死亡率达92％，说明4型禽腺病毒毒力强。复合多糖饲喂后降低18％的死亡率，说明复合多糖的确能够增强机体的抗病毒能力，增强雏鸡体质。4型禽腺病毒卵黄抗体冻干粉组显著降低了68％的死亡率，说明卵黄抗体粉具有特异性抗病毒的能力，显著增加雏鸡的成活率。而本发明的饲料添加剂组中大群状态良好，死亡率仅仅为8％，与攻毒组相比降低了84％，本发明制备得到的饲料添加剂用于抗鸡心包积液综合征上的时，雏鸡的死亡率低，本发明方法制备得到的饲料添加剂中卵黄抗体粉和复合多糖在抗病毒时协同作用，卵黄抗体的针对4型禽腺病毒病原的抗体作用，又有复合多糖广谱抗病毒，缓解心包积液症状，减轻心脏和肝脏压力的作用，本发明的饲料添加剂具有双重功效，抗病毒效果显著。

Claims (6)

1.一种抗鸡心包积液综合征饲料添加剂制备方法，其特征在于抗鸡心包积液综合征饲料添加剂制备方法按照以下步骤进行：
一、制备鸡心包积液综合征的卵黄抗体溶液：含有鸡心包积液综合征抗体的蛋黄液、浓度为1.5％～2％氯化钠水溶液和浓度为10％～11％的PEG6000溶液按体积比为1：1：1的比例搅拌混合，然后用60目筛子过滤后置于3～5℃的条件下静置11～13h，然后离心去沉淀得到上清液，上清液过滤、除菌，即得到鸡心包积液综合征的卵黄抗体溶液；
二、制备鸡心包积液综合征的卵黄抗体冻干粉：向步骤一中的鸡心包积液综合征的卵黄抗体溶液与甲醛、硫柳汞、维生素C、聚乙烯比咯烷酮、甘氨酸、山梨醇、葡萄糖按照重量份数比为95～97:0.2～0.4:0.01～0.03:0.05～0.15:0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2的比例混合得到混合液，混合液经过冷冻干燥后得到含有鸡心包积液综合征抗体的卵黄冻干粉；
三、步骤二中得到的卵黄冻干粉与黄芪多糖、当归多糖、枸杞多糖按照重量份数比为3～5：25～28：8～12：8～12的比例混合即得到抗鸡心包积液综合征饲料添加剂。
2.根据权利要求1所述的一种抗鸡心包积液综合征饲料添加剂制备方法，其特征在于步骤一所述的搅拌混合时间为8～12min。
3.根据权利要求1所述的一种抗鸡心包积液综合征饲料添加剂制备方法，其特征在于步骤一所述的离心是在转速为4000～6000r/min的条件下离心15～25min。
4.根据权利要求1所述的一种抗鸡心包积液综合征饲料添加剂制备方法，其特征在于步骤一所述的过滤采用的是3～5层的纱布进行过滤。
5.根据权利要求1所述的一种抗鸡心包积液综合征饲料添加剂制备方法，其特征在于步骤一所述的除菌是采用0.45μM微膜进行过滤除菌。
6.权利要求1所述的饲料添加剂在抗鸡心包积液综合征上的应用。
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