CN111333721A - 抗心包积水综合征卵黄抗体的制备方法及相应抗体的用途 - Google Patents

抗心包积水综合征卵黄抗体的制备方法及相应抗体的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗心包积水综合征卵黄抗体的制备方法，包括免疫抗原的制备、高免疫蛋的获得及卵黄抗体的制备等步骤；本发明还公开了所制心包积水综合征受精卵黄抗体的一种用途。本发明所制抗心包积水综合征卵黄抗体特异性强、性质稳定、制备简单、无毒副作用、制备成本低，本发明的制备方法简单、成本低、无毒害、无污染，本发明制备的卵黄抗体，滴度高、活性好、吸收好、见效快，本发明适用于制备抗心包积水综合征卵黄抗体，所制抗体进一步地可应用于预防和治疗鸡心包积水综合征。

Description

抗心包积水综合征卵黄抗体的制备方法及相应抗体的用途
技术领域
本发明属于免疫技术领域，涉及卵黄抗体的制备，具体地说，是一种抗心包积水综合征卵黄抗体的制备方法及相应抗体的用途。
背景技术
心包积水综合征是由禽腺病毒引起的一种新型禽类疾病。近年来，心包积水综合征在我国引起大量肉鸡死亡。该病一般发生于3-6周龄的生长期肉鸡，也可见于肉种鸡和蛋鸡。发病鸡群多于3周龄开始死亡，4-5周龄达高峰，高峰持续期4-8d，5-6周龄死亡减少。该病病程8-15d，死亡率达20-80％，如此高的死亡率给肉鸡养殖业造成了巨大的经济损失。
该病暂无有效的治疗方案，并且抗病毒效果不理想。在临床上用已感染的肝脏匀浆制备的福尔马林灭活苗可降低死亡率并在预防上已被应用。用在鸡胚肝脏细胞生长病毒的细胞培养物制备的疫苗也可产生保护力。但防控效果仍待观察，并且这种福尔马林灭活苗吸收效果不佳，会在肌肉内形成结节，影响肉质。
卵黄抗体又名卵黄免疫球蛋白(yolk antibody,IgY)，在特异性抗原的刺激下由鸡类B淋巴细胞产生并转移到卵黄中的抗体，可用于相应疾病的预防和治疗，其具有特异性强、性质稳定、吸收良好、制备简单、无毒副作用、成本低等特点。目前，IgY是最有效的治疗鸡腺病毒感染的方法，并且，IgY在低于75℃条件下，热稳定性良好，易于储存。
发明内容
为解决现有技术中存在的以上不足，本发明旨在提供一种抗心包积水综合征卵黄抗体的制备方法及相应抗体的用途，以达到该抗体在用于治疗鸡抗心包积水综合征时具有疗效好、见效快的目的。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种抗心包积水综合征卵黄抗体的制备方法，该抗体的制备方法按照以下步骤顺序进行：
S1.免疫抗原的制备
将检测为心包积水综合征的鸡病料组织，按1∶3的重量体积比加入无菌生理盐水，反复打磨混匀，得到混合液；将混合液置于冰箱中，反复冻融3次经过滤后得到的滤液进行离心，收集上清液并过滤、除菌，加入甲醛溶液灭活，得到免疫抗原；
S2.高免疫蛋的获得
选取健康产蛋鸡连续注射步骤S1中制得的免疫抗原，免疫三次，免疫间隔为14天，用量为1mL/只/次；完成第三次免疫7天后，经AGPT检测血清抗体，滴度≥64，开始收集高免疫蛋；
S3.卵黄抗体的制备
分离高免疫蛋卵黄，倒入无菌容器内，按体积比1:5～1∶9加入无菌水稀释卵黄液，充分搅拌，用盐酸调pH值至5.0～6.5，继续搅拌得到卵黄混合液；然后将卵黄混合液静置4-5h或静置过夜；之后收集卵黄混合液中的上清液，经超滤浓缩后得到浓缩液，之后在浓缩液中加入甲醛溶液，制得抗抗心包积水综合征卵黄抗体。
作为对本发明的一种限定：所述步骤S1中的冰箱温度为-80℃。
作为对本发明的另一种限定：所述步骤S1中的离心转速为12000rpm，离心时间为10min。
作为对本发明的再一种限定：所述步骤S1中的甲醛溶液浓度为10％，滤液中加入10％甲醛溶液后的甲醛终浓度为0.1％。
作为对本发明的限定：所述步骤S1中的灭活温度为37℃，灭活时间为24h。
作为本使用新型的进一步限定：所述步骤S3中的盐酸溶液浓度为10％。
作为本使用新型的再进一步限定：所述步骤S3中的甲醛溶液浓度为10％，浓缩液中加入10％甲醛溶液后的甲醛终浓度为0.1％。
抗心包综合征卵黄抗体的一种用途：即将所述抗心包综合征卵黄抗体用于制备预防和治疗鸡心包积水综合征的药物。
所述抗心包综合征卵黄抗体按照肉鸡每1kg体重0.2mL的量进行肌内注射。
抗心包综合征卵黄抗体的应用：对于所制得的上述抗心包综合征卵黄抗体，检测应用效果，通过对比试验和采用琼脂凝胶沉淀试验来测定抗体滴度，来对所制得的抗体的应用效果进行评定。
免疫对比试验：选取150只21日龄的健康AA肉鸡,随机分为三组：
实验组：注射抗心包积水综合征卵黄抗体注射液0.5ml/只；
对照组：注射福尔马林灭活苗0.5ml/只；
空白组。
三组肉鸡均在28日龄注射心包积水综合征抗原0.2ml/只，其他饲养条件保持一致，连续观察7-10天，，结果如下表所示：
免疫对比试验结果
Figure BDA0002418322970000031
对比试验结果表明：肉鸡注射这种抗心包积水综合征卵黄抗体注射液与注射福尔马林灭活苗有同样的免疫效果，鸡群状况无明显差别，且可提高鸡肉品质。
由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的有益效果在于：
本发明利用高免疫蛋的卵黄制备卵黄抗体，制备方法简单、成本低、无毒害、无污染，且使用方便；所制的卵黄抗体具有特异性强、性质稳定、无毒副作用的特点，滴度高、活性好，可用于预防和治疗抗心包积水综合征；且本发明中的卵黄抗体属于免疫球蛋白，分子量较小，在注入机体后易吸收，并且不会在肌肉内形成结节，不会影响肉质，与现有的疫苗相比，具有吸收好、见效快的特点；本发明利用甲醛溶液作为灭活剂，灭活效果好，利用盐酸溶液作为调节pH值试剂，成本低、调节速度快。
综上所述，本发明所制抗心包积水综合征卵黄抗体特异性强、性质稳定、制备简单、无毒副作用、制备成本低，本发明的制备方法简单、成本低、无毒害、无污染，本发明制备的卵黄抗体，滴度高、活性好、吸收好、见效快，本发明适用于制备抗心包积水综合征卵黄抗体，所制抗体进一步地可应用于预防和治疗鸡心包积水综合征。
附图说明
图1为实施例1中的免疫鸡血清及蛋黄抗体的AGPT检测图。
下面对本发明作更进一步详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的抗心包积水综合征卵黄抗体的制备方法及相应抗体的用途为优选实施例，仅用于说明和解释本发明，并不构成对本发明的限制。
实施例1抗心包积水综合征卵黄抗体的制备方法
本实施例为一种抗心包积水综合征卵黄抗体的制备方法。该抗体的制备方法按照以下步骤顺序进行：
S1.免疫抗原的制备
A1.将检测为心包积水综合征的鸡病料组织，按1∶3(w/V)加入无菌生理盐水，之后在组织匀浆器中反复打磨混匀得到混合液；
A2.将混合液置于温度为-80℃冰箱中，反复冻融3次经过滤后得到滤液；
A3.将滤液经转速为12000rpm离心10min后收集上清液；
A4.将上清液利用四层无菌纱布过滤除菌，加入10％甲醛溶液(滤液中加入10％甲醛溶液后的甲醛终浓度为0.1％)，37℃下灭活24h，制得免疫抗原；
S2.高免疫蛋的获得
B1.选取健康产蛋鸡连续注射步骤S1中制得的免疫抗原，免疫3次，免疫间隔为14天，1mL/只/次；
B2.三次免疫后7天，经AGPT检测血清抗体，如图1所示，图中0为含禽腺病毒的抗原液，1-6为免疫鸡血清，1’-6’为制备的蛋黄抗体；免疫鸡血清、卵黄抗体与抗原液之间的白色线为沉淀线，即存在抗原抗体结合的免疫反应，无沉淀线则表明抗体量少；图中血清抗体滴度达2㏒5，符合制备需要，制备的卵黄抗体滴度达2㏒3，符合实际应用需要，开始收集高免疫蛋；
S3.卵黄抗体的制备
C1.分离高免疫蛋卵黄，倒入无菌容器内，按体积比1∶8加入无菌注射用水，充分搅拌，用10％盐酸调pH值至6.0，继续搅拌得到卵黄混合液；
C2.将卵黄混合液静置4-5h或静置过夜；
C3.收集卵黄混合液中的上清液，经超滤浓缩后得到浓缩液；
C4.在浓缩液中加入10％甲醛溶液(浓缩液中加入10％甲醛溶液后的甲醛终浓度为0.1％)，制得抗心包积水综合征卵黄抗体。制得的卵黄抗体经AGPT检测其抗体滴度≥3㏒2；并取100μL涂布于含2％牛血清的TSA平板，37℃培养24-48h，检测制得的卵黄抗体为无菌。
实施例2抗心包积水综合征卵黄抗体的制备方法
本实施例为一种抗心包积水综合征卵黄抗体的制备方法。该抗体的制备方法按照以下步骤顺序进行：
S1.免疫抗原的制备
A1.将检测为心包积水综合征的鸡病料组织，按1∶3(w/V)加入无菌生理盐水，之后在组织匀浆器中反复打磨混匀得到混合液；
A2.将混合液置于温度为-80℃冰箱中，反复冻融3次经过滤后得到滤液；
A3.将滤液经转速为12000rpm离心10min后收集上清液；
A4.将上清液利用四层无菌纱布过滤除菌，加入10％甲醛溶液(滤液中加入10％甲醛溶液后的甲醛终浓度为0.1％)，37℃下灭活24h，制得免疫抗原；
S2.高免疫蛋的获得
B1.选取健康产蛋鸡连续注射步骤S1中制得的免疫抗原，免疫3次，免疫间隔为14天，1mL/只/次；
B2.三次免疫后7天，经AGPT检测血清抗体，经检测血清抗体的滴度≥5㏒2，符合制备需要，制备的卵黄抗体滴度达≥3㏒2，符合实际应用需要，开始收集高免疫蛋；
S3.卵黄抗体的制备
C1.分离高免疫蛋卵黄，倒入无菌容器内，按体积比1∶5加入无菌注射用水，充分搅拌，用10％盐酸调pH值至5.0，继续搅拌得到卵黄混合液；
C2.将卵黄混合液静置4-5h或静置过夜；
C3.收集卵黄混合液中的上清液，经超滤浓缩后得到浓缩液；
C4.在浓缩液中加入10％甲醛溶液(浓缩液中加入10％甲醛溶液后的甲醛终浓度为0.1％)，制得抗心包积水综合征卵黄抗体。制得的卵黄抗体经AGPT检测其抗体滴度≥3log2；并取100μL涂布于含2％牛血清的TSA平板，37℃培养24-48h，检测制得的卵黄抗体为无菌。
实施例3抗心包积水综合征卵黄抗体的制备方法
本实施例为一种抗心包积水综合征卵黄抗体的制备方法。该抗体的制备方法按照以下步骤顺序进行：
S1.免疫抗原的制备
A1.将检测为心包积水综合征的鸡病料组织，按1∶3(w/V)加入无菌生理盐水，之后在组织匀浆器中反复打磨混匀得到混合液；
A2.将混合液置于温度为-80℃冰箱中，反复冻融3次经过滤后得到滤液；
A3.将滤液经转速为12000rpm离心10min后收集上清液；
A4.将上清液利用四层无菌纱布过滤除菌，加入10％甲醛溶液(滤液中加入10％甲醛溶液后的甲醛终浓度为0.1％)，37℃下灭活24h，制得免疫抗原；
S2.高免疫蛋的获得
B1.选取健康产蛋鸡连续注射步骤S1中制得的免疫抗原，免疫3次，免疫间隔为14天，1mL/只/次；
B2.三次免疫后7天，经AGPT检测血清抗体，如图1所示，图中0为含禽腺病毒的抗原液，1-6为免疫鸡血清，1’-6’为制备的蛋黄抗体；免疫鸡血清、卵黄抗体与抗原液之间的白色线为沉淀线，即存在抗原抗体结合的免疫反应，无沉淀线则表明抗体量少；图中血清抗体滴度达5㏒2-，符合制备需要，制备的卵黄抗体滴度达3㏒2-，符合实际应用需要，开始收集高免疫蛋；
S3.卵黄抗体的制备
C1.分离高免疫蛋卵黄，倒入无菌容器内，按体积比1∶9加入无菌注射用水，充分搅拌，用10％盐酸调pH值至6.5，继续搅拌得到卵黄混合液；
C2.将卵黄混合液静置4-5h或静置过夜；
C3.收集卵黄混合液中的上清液，经超滤浓缩后得到浓缩液；
C4.在浓缩液中加入10％甲醛溶液(浓缩液中加入10％甲醛溶液后的甲醛终浓度为0.1％)，制得抗心包积水综合征卵黄抗体。制得的卵黄抗体经AGPT检测其抗体滴度≥3log2；并取100μL涂布于含2％牛血清的TSA平板，37℃培养24-48h，检测制得的卵黄抗体为无菌。
实施例4实施例1-3所制得的抗心包积水综合征卵黄抗体的应用
抗心包综合征卵黄抗体的一种用途：即将所述抗心包综合征卵黄抗体用于制备预防和治疗鸡心包积水综合征的药物。
所述抗心包综合征卵黄抗体按照肉鸡每1kg体重0.2mL的量进行肌内注射。
抗心包综合征卵黄抗体的应用：对于所制得的上述抗心包综合征卵黄抗体，检测应用效果，通过免疫对比试验和琼脂凝胶沉淀试验来测定抗体滴度，来对所制得的抗体的应用效果进行评定。
免疫对比试验：选取150只28日龄的健康肉鸡均匀分为三组，分别为：
实验组：注射抗心包积水综合征卵黄抗体注射液0.5ml/只；
对照组：注射福尔马林灭活苗0.5ml/只；
空白组。
三组肉鸡均在35日龄注射心包积水综合征抗原0.2ml/只，其他饲养条件保持一致，观察至出栏，结果如下表所示：
免疫对比试验结果
Figure BDA0002418322970000081
对比试验结果表示：肉鸡注射这种抗心包积水综合征卵黄抗体注射液与注射福尔马林灭活苗的鸡群，鸡群状况无明显差别，但可提高肌肉品质。
实施例5实施例1-3所制得的抗心包积水综合征卵黄抗体的质量标准
【性状】无色或淡黄色透明液体，静置后有少量沉淀。
【无菌检测】按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
【安全检验】用21日龄健康肉鸡10只，肌肉注射2mL；观察10-14天，肉鸡应全部健活。
【效力检验】琼脂凝胶沉淀试验测定抗体滴度。其操作方法为：取8g氯化钠，1.2-1.5g琼脂，加蒸馏水或磷酸盐缓冲液100mL，加热融化，加2滴苯酚，根据需要浇制琼脂板，每个平皿约20mL，琼脂厚度约3-5mm，待冷却凝固后，4℃下保存备用；制备好的琼脂平板，用直径4mm的打孔器，按梅花形打孔，孔距3-5mm，小心去除孔内残留的琼脂块，平板加热封底。中央孔加抗原，外周孔加阳性、阴性及待测血清，各孔以加满不溢为宜；加样完毕后，将平板放于湿盒内，至37℃恒温箱中，经24-48h后观察结果，测得的抗体滴度应≥3㏒2。
【肉鸡效检】21日龄肉鸡30只，随机分为3组，每组10只；第一组肌肉注射卵黄抗体0.5mL，第2组肌肉注射生理盐水0.5mL；24小时后，这两组鸡用皮下注射心包积水综合征抗原0.2ml/只；第3组为空白对照组，不注射任何药品；观察7-10日；第1组接种卵黄抗体组，肉鸡应至少8只未出现临床症状；第2攻毒对照组，肉鸡应至少8只死亡；第3组空白对照组应全部健活。
【作用与用途】用于治疗和紧急预防心包积水综合征。
【用法与用量】皮下或肌肉注射均可。按Kg体重0.2mL接种。
【注意事项】1.本品被动免疫保护期为5-10天；
2.本品可连续应用2-3次；
3.本品可与抗生素联用；
【贮藏】2～8℃保存，有效期18个月。

Claims (9)

1.一种抗心包积水综合征卵黄抗体的制备方法，其特征在于：该抗体的制备方法按照以下步骤顺序进行：
S1.免疫抗原的制备
将检测为心包积水综合征的鸡病料组织，按1∶3的重量体积比加入无菌生理盐水，反复打磨混匀，得到混合液；将混合液置于冰箱中，反复冻融3次经过滤后得到的滤液进行离心，收集上清液并过滤、除菌，加入甲醛溶液灭活，得到免疫抗原；
S2.高免疫蛋的获得
选取健康产蛋鸡连续注射步骤S1中制得的免疫抗原，免疫三次，免疫间隔为14天，用量为1mL/只/次；完成第三次免疫7天后，经AGPT检测血清抗体，滴度≥64，开始收集高免疫蛋；
S3.卵黄抗体的制备
分离高免疫蛋卵黄，倒入无菌容器内，按体积比1:5～1∶9加入无菌水稀释卵黄液，充分搅拌，用盐酸调pH值至5.0～6.5，继续搅拌得到卵黄混合液；然后将卵黄混合液静置4-5h或静置过夜；之后收集卵黄混合液中的上清液，经超滤浓缩后得到浓缩液，之后在浓缩液中加入甲醛溶液，制得抗抗心包积水综合征卵黄抗体。
2.根据权利要求1所述的抗心包积水综合征卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中的冰箱温度为-80℃。
3.根据权利要求2所述的抗心包积水综合征卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中的离心转速为12000rpm，离心时间为10min。
4.根据权利要求3所述的抗心包积水综合征卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中的甲醛溶液浓度为10%，滤液中加入10%甲醛溶液后的甲醛终浓度为0.1%。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的抗心包积水综合征卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中的灭活温度为37℃，灭活时间为24h。
6.根据权利要求5所述的抗心包积水综合征卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中的盐酸溶液浓度为10%。
7.根据权利要求1-4、6中任意一项所述的抗心包积水综合征卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中的甲醛溶液浓度为10%，浓缩液中加入10%甲醛溶液后的甲醛终浓度为0.1%。
8.根据权利要求5所述的抗心包积水综合征卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中的甲醛溶液浓度为10%，浓缩液中加入10%甲醛溶液后的甲醛终浓度为0.1%。
9.抗心包积水综合征卵黄抗体的一种用途，其特征在于：所述抗心包积水综合征卵黄抗体为由权利要求1-9中任一项所述的抗心包积水综合征卵黄抗体的制备方法制得，所述抗心包积水综合征卵黄抗体用于制备预防和治疗鸡心包积水综合征的药物。
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