JP2014131516A

JP2014131516A - ワクチンのための高力価組み換えインフルエンザ・ウィルス

Info

Publication number: JP2014131516A
Application number: JP2014049025A
Authority: JP
Inventors: Yoshihiro Kawaoka; 義裕河岡; Taisuke Horimoto; 泰介堀本; Susumu Murakami; 晋村上
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 2006-03-31
Filing date: 2014-03-12
Publication date: 2014-07-17
Also published as: JP2009532352A; EP2010557B1; CA2647985A1; CN101472941B; US9254318B2; US20190048324A1; AU2007245192B2; US20070231348A1; US20160208223A1; JP2016169225A; CA2647985C; WO2007126810A2; US9926535B2; CN101472941A; JP6352974B2; EP2010557A2; AU2007245192A1; WO2007126810A3

Abstract

【課題】ワクチンのための高力価組み換えインフルエンザ・ウィルスの提供。
【解決手段】本発明は、孵化鶏卵又はＭＤＣＫ細胞内で高力価に複製するインフルエンザ・ウィルス単離体に由来する少なくとも５種の内部遺伝子を含む、例えばヘルパー・ウィルスの不存在において、高力価インフルエンザ・ウィルスを調製するのに有用な組成物を提供する。
【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００６年３月３１日付けで出願された米国特許出願第６０／７８７，７６６号明細書の出願日の優先権を主張し、前記明細書の開示内容を参考のため本明細書中に引用する。

政府の支援
本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）からの認可番号ＡＩ０４４３８６のもとで政府の支援によって行われた。合衆国政府は本発明において一定の権利を有する。

背景
マイナス−センスＲＮＡウィルスは、一般的なヒト病原体、例えば呼吸器合胞体ウィルス、インフルエンザ・ウィルス、麻疹ウィルス、及びエボラ・ウィルス、並びに家禽及び畜牛産業に大きな経済的打撃を与える動物ウィルス（例えばニューカッスル病ウィルス及び牛疫ウィルス）を含む７つの科（Rhabdoviridae、Paramyxoviridae、Filoviridae、Bornaviridae、Orthomyxoviridae、Bunyaviridae、及びArenaviridae）に分類される。最初の４つの科は、非セグメント・ゲノムによって特徴付けられるのに対して、後者の３つの科は、それぞれ６〜８つ、３つ、又は２つのマイナス−センスＲＮＡセグメントから成るゲノムを有する。マイナス−センスＲＮＡウィルスの共通の特徴は、これらのＲＮＡゲノムの負の極性である。すなわちウィルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）は、ｍＲＮＡに対して相補であり、従ってそれ自体は感染性でない。ウィルス転写及び複製を開始するために、ｖＲＮＡは、ウィルス・ポリメラーゼ複合体及び核タンパク質によって、それぞれプラス−センスｍＲＮＡ又はｃＲＮＡに転写されなければならず、インフルエンザＡ型ウィルスの場合、ウィルス・ポリメラーゼ複合体は、３種のポリメラーゼタンパク質ＰＢ２、ＰＢ１、及びＰＡから成っている。ウィルス複製中、ｃＲＮＡが、新しいｖＲＮＡ分子の合成のための鋳型として役立つ。全てのマイナス鎖ＲＮＡウィルスに関して、ｖＲＮＡ及びｃＲＮＡの５’及び３’の両末端における非コード領域が、ウィルス・ゲノムの転写及び複製にとって重要である。細胞又はウィルスｍＲＮＡ転写産物とは異なり、ｃＲＮＡ及びｖＲＮＡは５’末端でキャップされることはなく、また、真の３’末端でポリアデニル化されることもない。

多くのウィルス・タンパク質の基本機能が、生化学的に、且つ／又はウイルス感染との関連において解明されている。しかしながら、逆遺伝技術系が、ウィルス複製及び病原性に関して、並びに生の弱毒化ウィルス・ワクチンの開発に関して、マイナス鎖セグメントＲＮＡウィルス及び非セグメントＲＮＡウィルスについての我々の知識を劇的に増大させている。逆遺伝技術という用語は分子ウィルス学において使用されるが、この逆遺伝技術は、クローン化ｃＤＮＡから誘導されたゲノムを有するウィルスを発生させることとして定義される（概説に関してはNeumann他、2002年を参照）。

マイナス鎖ＲＮＡウィルスのウィルス複製を開始するために、ｖＲＮＡ又はｃＲＮＡはポリメラーゼ複合体及び核タンパク質と共発現されなければならない。狂犬病ウィルスが、クローン化ｃＤＮＡから全体的に生成された最初の非セグメント・マイナス−センスＲＮＡウィルスであった。すなわちSchnell他(1994)は、完全長ｃＲＮＡをコードするｃＤＮＡ構造と、Ｌ、Ｐ、及びＮタンパク質に対応するタンパク質発現構造とを、全てＴ７ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターの制御下で共トランスフェクトすることにより、組み換え狂犬病ウィルスを生成した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを提供する、組み換えワクシニア・ウィルスによる感染の結果、感染性狂犬病ウィルスが発生した。このＴ７ポリメラーゼ系の場合、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの制御下で完全長ｃＲＮＡを一次転写する結果、非キャップｃＲＮＡ転写産物が生じた。しかし、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの最適な開始配列を形成する３つのグアニジン・ヌクレオチドが５’末端に付着された。増殖感染サイクルにとって必須のｃＲＮＡ転写産物の真正３’末端を形成するために、ｃＲＮＡ転写産物の３’末端における正確な自己触媒的切断に際してデルタ肝炎リボザイム（ＨＤＶＲｚ）が使用された。

Schnell他(1994)による最初の報告以来、同様の技術を用いた逆遺伝技術系は、多くの非セグメント・マイナス鎖ＲＮＡウィルスを発生させた（Conzelmann、1996; Conzelmann、1998; Conzelmann他、1996; Marriott他、1999； Munoz他、2000； Nagai、1999； Neumann他、2002； Roberts他、1998； Rose、1996）。元の救出処置の改良は、安定にトランスフェクトされた細胞系（Radecke他、1996)から、又はタンパク質発現プラスミド（Lawson他、1995)からのＴ７ＲＮＡポリメラーゼの発現、又は救出効率を高めるための熱ショック処置（Parks他、1999)を含んだ。Ｔ７ポリメラーゼ系に基づいて、Bridgen及びElliott（1996）は、クローン化ｃＤＮＡからBunyamweraウィルス(Bunyaviridae科）を形成し、Ｔ７ポリメラーゼ系によってセグメント・マイナス−センスＲＮＡウィルスを人工的に生成することの実現可能性を実証した。

1999年に、クローン化ｃＤＮＡからセグメント・インフルエンザＡ型ウィルスを全体的に生成するための細胞ＲＮＡポリメラーゼＩに基づいて、プラスミドをベースとする逆遺伝技術が生み出された（Fodor他、1999；Neumann及びKawaoka、1999)。ＲＮＡポリメラーゼＩ、核小体酵素は、インフルエンザ・ウィルスＲＮＡと同様に５’キャップ又は３’ポリＡ構造を含有しないリボソームＲＮＡを合成する。ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター及びターミネーター配列によってフランキングされた、インフルエンザ・ウィルスｃＤＮＡを含有する構造のＲＮＡポリメラーゼＩ転写の結果、インフルエンザｖＲＮＡ合成が生じた（Fodor他、1999； Neumann及びKawaoka、1999；Neumann及びKawaoka、2001； Pekosz他、1999)。このシステムは高効率であり、トランスフェクション後４８時間で、プラスミド・トランスフェクト細胞の上澄み１ｍｌ当たり１０^８個を上回る感染性ウィルス粒子を生成した。

必要とされるものは、クローン化ｃＤＮＡから全体的に、高力価オルトミクソウィルス、例えばインフルエンザＡ型ウィルスを調製する方法である。

発明の概要
本発明は、本発明の複数のインフルエンザ・ウィルス・ベクター、例えば７：１再構築体、６：１：１再構築体、５：１：２再構築体、５：１：１：１再構築体を含む再構築体ウィルスを調製するのに有用なインフルエンザ・ウィルス・ベクターを含んでなる組成物を提供する。本発明の１実施態様の場合、組成物は、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＰＡｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＰＢ１ｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＰＢ２ｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＨＡｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＮＰｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＮＡｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＭｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、及び転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＮＳｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、から選択されたｖＲＮＡ生成のためのベクターを含む。組成物はまた、インフルエンザ・ウィルスＰＡをコードするベクター、インフルエンザ・ウィルスＰＢ１をコードするベクター、インフルエンザ・ウィルスＰＢ２をコードするベクター、及びインフルエンザ・ウィルスＮＰをコードするベクター、及び任意には、インフルエンザ・ウィルスＮＰ、ＮＳ、Ｍ、例えばＭ１及びＭ２、ＨＡ又はＮＡをコードする１種又は２種以上のベクター、から選択されたウィルス・タンパク質生成のためのベクターを含む。好ましくは、ウィルス・タンパク質をコードするベクターはさらに、転写終結配列を含んでなる。

１実施態様の場合、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳ、及び任意にはＮＡに対応するｃＤＮＡは、孵化卵内で高力価に複製するインフルエンザ・ウィルスに由来する、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳ、及び任意にはＮＡの配列を有し、そしてＨＡに対応するｃＤＮＡは、異なるインフルエンザ・ウィルス株に由来する（同じ又は異なるＨＡサブタイプを有する異種インフルエンザ・ウィルス単離体、すなわち異種ＨＡに由来する）配列を有する。孵化卵内で高力価に成長しない病原性Ｈ５Ｎ１ウィルスに由来するＨＡの場合、少なくともＮＡに対応するｃＤＮＡが、孵化卵内で高力価に複製するＮ１インフルエンザ・ウィルスに由来する配列を有する。

１実施態様の場合、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳに対応するｃＤＮＡは、高力価、例えば１０^８ＥＩＤ_５０／ｍＬ超、例えば１０^９ＥＩＤ_５０／ｍＬ、１０^１０ＥＩＤ_５０／ｍＬ、又はこれを上回る力価のインフルエンザ・ウィルスのタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする配列に対応する核酸分子（ポリヌクレオチド）を含む。孵化卵内で高力価を有する本発明の範囲内の再構築体の力価は、５：１：１：１再構築体（ＮＳＫ５５を有する）、５：１：２再構築体（ＮＳＫ５５を有する）、及び６：１：１再構築体（ＮＳＫ５５を有する）の場合、少なくとも約１０^９ＥＩＤ_５０／ｍＬであり、また、５：１：１：１再構築体（ＮＳＫ５５Ｅを有する）、又は５：１：２再構築体（ＮＳＫ５５Ｅを有する）の場合、少なくとも４ｘ１０^８ＰＦＵ／ｍＬである。ＭＤＣＫ細胞内で高力価を有する本発明の範囲内の再構築体の力価は、５：１：１：１又は６：１：１の場合、少なくとも０．７５ｘ１０^８ＰＦＵ／ｍＬ、少なくとも２．０ｘ１０^８ＰＦＵ／ｍＬである。

１実施態様の場合、本発明は、５：１：２又は６：１：１再構築体のための複数のインフルエンザ・ウィルス・ベクターを含んでなる組成物を含む。組成物は、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＰＡｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＰＢ１ｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＰＢ２ｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＨＡｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＮＰｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＮＡｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＭｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、及び転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＮＳｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクターを含む。ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、及びＭに対応するｃＤＮＡは、孵化卵内で高力価に複製する１種又は２種以上のインフルエンザ・ウィルスに由来する配列を有し、ＮＳに対応するｃＤＮＡは、孵化卵内で高力価に複製する１種又は２種以上のインフルエンザ・ウィルスに由来し、ＮＡに対応するｃＤＮＡは、孵化卵内で高力価に複製する１種又は２種以上のインフルエンザ・ウィルスに由来するか、又は異種ＮＡの配列を有し、そしてＨＡに対応するｃＤＮＡは、少なくともＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、及びＭのウィルス遺伝子セグメントに対して異種の、異種ＨＡの配列を有する。１実施態様の場合、ＮＳに対応するｃＤＮＡは、位置５５にＧｌｕを有する。組成物はまた、インフルエンザ・ウィルスＰＡをコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、インフルエンザ・ウィルスＰＢ１をコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、インフルエンザ・ウィルスＰＢ２をコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、及びインフルエンザ・ウィルスＮＰをコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、及び任意には、インフルエンザ・ウィルスＨＡをコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、インフルエンザ・ウィルスＮＡをコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、インフルエンザ・ウィルスＭ１をコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、インフルエンザ・ウィルスＭ２をコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、又はインフルエンザ・ウィルスＮＳ２をコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、を含む。１実施態様の場合、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳに対応するｃＤＮＡは、高力価、例えば１０^８ＥＩＤ_５０／ｍＬ超、例えば１０^９ＥＩＤ_５０／ｍＬ、１０^１０ＥＩＤ_５０／ｍＬ、又はこれを上回る力価のインフルエンザ・ウィルスのタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする配列に対応する核酸分子（ポリヌクレオチド）を含む。

１実施態様の場合、本発明は、５：１：１：１又は６：１：１再構築体のための複数のインフルエンザ・ウィルス・ベクターを含んでなる組成物を含む。組成物は、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＰＡｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＰＢ１ｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＰＢ２ｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＨＡｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＮＰｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＮＡｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＭｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、及び転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＮＳｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクターを含む。ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、及びＭに対応するｃＤＮＡは、ＭＤＣＫ細胞内で高力価に複製する１種又は２種以上のインフルエンザ・ウィルスに由来する配列を有し、ＮＳに対応するｃＤＮＡは、ＭＤＣＫ細胞内で高力価に複製する１種又は２種以上のインフルエンザ・ウィルスに由来し、ＮＡに対応するｃＤＮＡは、異種ＮＡの配列を有し、そしてＨＡに対応するｃＤＮＡは、異種ＨＡの配列を有する。組成物はまた、インフルエンザ・ウィルスＰＡをコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、インフルエンザ・ウィルスＰＢ１をコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、インフルエンザ・ウィルスＰＢ２をコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、及びインフルエンザ・ウィルスＮＰをコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、及び任意には、インフルエンザ・ウィルスＨＡをコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、インフルエンザ・ウィルスＮＡをコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、インフルエンザ・ウィルスＭ１をコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、インフルエンザ・ウィルスＭ２をコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、又はインフルエンザ・ウィルスＮＳ２をコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、を含む。１実施態様の場合、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳに対応するｃＤＮＡは、高力価、例えば１０^８ＥＩＤ_５０／ｍＬ超、例えば１０^９ＥＩＤ_５０／ｍＬ、１０^１０ＥＩＤ_５０／ｍＬ、又はこれを上回る力価のインフルエンザ・ウィルスのタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする配列に対応する核酸分子（ポリヌクレオチド）を含む。

本明細書中に記載されているように、組み換え（６：２再構築体）ウィルスは、野生型ＰＲ８株よりも、たとえこれらが同じＰＲ８「内部」遺伝子（すなわちＨＡ及びＮＡ以外の遺伝子）を有するとしても、卵内では成長が悪い。卵内での強い成長が、不活性化ワクチンの生成に際して使用されるワクチン種ウィルスの必須の特性であるので、卵内でＰＲ８供与体株と同じく良好に成長するＨ５Ｎ１ワクチン候補を生成した。ＨＡ−ＮＡバランス及びＰＢ１機能が重要な成長決定因子であることが判った。このような知識を持って、ＷＨＯ推奨ＮＩＢＲＧ−１４ウィルスを含むよりコンベンショナルな６：２再構築体に対する卵内の成長を評価するために、ＰＲ８バックグラウンドを有する、ＨＡ−ＮＡバランスを変化させた一連のＨ５Ｎ１ウィルスを生成した。７：１再構築体ウィルス及び６：２再構築体のうちの１つは、卵内の成長の向上を示した。このように、一般に卵内で低い力価を生じさせるワクチン・ウィルスに対して、少なくともワクチン・ウィルスのＮＡの代わりに、卵内で良好に成長するインフルエンザ・ウィルスのＮＡを使用するか、又はワクチン・ウィルスのＨＡ及びＮＡ以外の全て、又はＨＡ以外の全ての代わりに、卵内で高力価に成長するインフルエンザ・ウィルスに由来する他のウィルス遺伝子セグメントを使用する結果、著しく高いウィルス力価をもたらすことができる。本発明の再構築体ウィルスの力価は、対応する非再構築体ワクチン・ウィルスの２倍、３倍、又はそれ以上、例えば７倍以上であってよい。これも本明細書中に記載されているように、２種の異なるＰＲ８ウィルス単離体に由来する遺伝子を有する卵内の再構築体の高い成長速度に関与する内部遺伝子が見極められた。最高ウィルス力価は、内部遺伝子の大部分がＰＲ８ＨＧ（ＰＲ８（ＵＷ））に由来する場合の力価であった。具体的には、５：１：２再構築体（ＰＲ８（ＵＷ）ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ及びＭ；ＰＲ８（Ｃａｍ）ＮＳ；及びＨ５Ｎ１ＨＡ及びＮＡ）及び６：１：１再構築体（ＰＲ８（ＵＷ）ＮＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ及びＭ；ＰＲ８（Ｃａｍ）ＮＳ；及びＨ５ＨＡ）が卵内で高力価を有した。

これも本明細書中に記載されているように、ＭＤＣＫ細胞（おそらくワクチン・ウィルス源として承認されると思われる細胞）中の高い成長速度に関与するウィルス遺伝子を評価した。ＭＤＣＫ細胞中の最高成長速度は、ＰＲ８（ＵＷ）に由来するＰＢ２、ＰＲ８（Ｃａｍ）に由来するＮＳ、又はＰＲ８（ＵＷ）に由来するＫ５５Ｅ、及び長いストーク、例えば２０アミノ酸超であるがしかし約１００アミノ酸未満、例えば約４０超であり且つ最大８０アミノ酸長のストークを有するＮＡで見いだされた。このように、ＰＲ８（ＵＷ）ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、及びＭ、及びＰＲ８（ＵＷ）又はＰＲ８（Ｃａｍ）に由来するＮＳＫ５５Ｅ、ＰＲ８（ＵＷ）に由来するＮＡ、又は異種ＮＡ源、及び異種ＨＡを有する５：１：１：１及び６：１：１再構築体が、ＭＤＣＫ細胞中で最高力価に成長した。

１実施態様の場合、核酸分子は、ＳＥＱＩＤＮｏ：１〜６及び８のうちの１つによってコードされる対応ポリペプチドと実質的に同じ活性を有するＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳ、及び任意にはＮＡをコードする配列に対応する。本明細書中に使用される「実質的に同じ活性」は、対応する完全長ポリペプチドの活性の約０．１％、１％、１０％、３０％、５０％、９０％（例えば最大１００％）、又はそれを上回る活性、又は対応する完全長ポリペプチドのタンパク質レベルの約８０％、９０％、又はそれを上回る検出可能なタンパク質レベルを含む。１実施態様の場合、核酸分子は、ＳＥＱＩＤＮｏ：１〜６及び８のうちの１つによってコードされたポリペプチドと実質的に同じである、例えばこのポリペプチドに対して少なくとも８０％、例えば９０％、９２％、９５％、９７％、又は９９％の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする配列に対応する。１実施態様の場合、単離及び／又は精製された核酸分子は、ＳＥＱＩＤＮｏ：１〜６、８、又は３３〜３８のうちの１つと実質的に同じである、例えばこれに対して少なくとも５０％、例えば６０％、７０％、８０％、又は９０％、又はそれを上回る隣接核酸配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなり、そして１実施態様の場合、さらに、ＳＥＱＩＤＮｏ：１〜６、８、又は３３〜３８のうちの１つによってコードされたポリペプチドに対して少なくとも８０％、例えば９０％、９２％、９５％、９７％、又は９９％の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする。１実施態様の場合、単離及び／又は精製された核酸分子は、ＳＥＱＩＤＮｏ：１〜６、又は８のうちの１つによってコードされたポリペプチドに対して１又は２以上の、例えば２、５、１０、１５，２０又はそれを上回る同類アミノ酸置換、例えば最大１０％又は２０％の残基の同類置換を有するポリペプチドをコードする。同類アミノ酸置換は、同様の側鎖を有する残基の相互交換可能性を意味する。例えば脂肪族側鎖を有するアミノ酸の基はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の基は、セリン及びトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の基はアスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の基は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の基はリシン、アルギニン、及びヒスチジンであり、そして硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の基はシステイン及びメチオニンである。１実施態様の場合、同類アミノ酸置換は、バリン−ロイシン−イソロイシン；フェニルアラニン−チロシン；リシン−アルギニン；アラニン−バリン；グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。１実施態様の場合、単離及び／又は精製された核酸分子は、ＳＥＱＩＤＮｏ：１〜６、８、又は３３〜３８のうちの１つによってコードされたポリペプチドに対して、１又は２以上の、例えば２、３又は４の非同類アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする。例えば、Ｋ５５ＥＮＳ及びＳ３６０ＹＰＢ２置換は、非同類置換である。

別の実施態様の場合、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳ、及び任意にはＮＡを有する核酸分子の配列、又はその相補形は、低緊縮性、中緊縮性、又は緊縮条件下で、ＳＥＱＩＤＮｏ：１〜６、８、又は３３〜３８のうちの１つ、又はその相補形とハイブリッド形成する。例えば、下記条件が採用されてよい：５０℃の２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の洗浄を伴う５０℃の７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭＮａＰＯ_４、１ｍＭＥＤＴＡ中（低緊縮性）、より望ましくは、５０℃の１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の洗浄を伴う５０℃の７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭＮａＰＯ_４、１ｍＭＥＤＴＡ中（中緊縮性）、さらにより望ましくは、５０℃の０．５ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の洗浄を伴う５０℃の７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭＮａＰＯ_４、１ｍＭＥＤＴＡ中（緊縮性）、好ましくは、５０℃の０．1ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の洗浄を伴う５０℃の７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭＮａＰＯ_４、１ｍＭＥＤＴＡ中（より高緊縮性）、より好ましくは、６５℃の０．1ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の洗浄を伴う５０℃の７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５ＭＮａＰＯ_４、１ｍＭＥＤＴＡ中（極めて高緊縮性）。１実施態様の場合、核酸分子は、ＳＥＱＩＤＮｏ：１〜６、又は３３〜３８のうちの１つと実質的に同じである、例えばこれに対して少なくとも５０％、例えば６０％、７０％、８０％、又は９０％、又はそれを上回る隣接核酸配列同一性を有するポリペプチドをコードし、そして好ましくは、ＳＥＱＩＤＮｏ：１〜６、８又は３３〜３８のうちの１つによってコードされた対応する完全長ポリペプチドと実質的に同じ活性を有する。これらの核酸分子、又は卵内で良好に成長する他のＮ１株に由来する核酸分子は、任意のＨＡ、例えばＨ５に対応する核酸と共に採用されてよい。

このように、インフルエンザ・タンパク質を発現させるため、例えば他のインフルエンザ・ウィルス遺伝子を含む他のウィルス遺伝子と、キメラ遺伝子を調製するため、且つ／又は組み換えウィルスを調製するために、核酸分子が採用されてよい。こうして、本発明はまた、単離されたポリペプチド、組み換えウィルス、及び本発明の核酸分子又は組み換えウィルスと接触させられた宿主細胞を提供する。

本発明はまた単離及び／又は精製された複数の下記ベクター：転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＰＡｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＰＢ１ｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＰＢ２ｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＨＡｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＮＰｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＮＡｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＭｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、及び転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＮＳｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクターを提供し、少なくとも１つのベクターが、ＳＥＱＩＤＮｏ：１〜６又は８のうちの１つによってコードされた対応ポリペプチドと実質的に同じ活性を有する、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、及び任意にはＮＡ、又はこれらの一部をコードする配列に対応する配列、例えば、ＳＥＱＩＤＮｏ：１〜６、８又は３３〜３８のうちの１つによってコードされたポリペプチドに対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含んでなる。任意には、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＭｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクターの代わりに、２種のベクター、例えば転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＭ１ｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクター、及び転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＭ２ｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるベクターが採用されてよい。

本発明は、インフルエンザ・ウィルス・タンパク質を発現させるか又はコードする、或いは、インフルエンザｖＲＮＡ、天然及び組み換え双方のｖＲＮＡを発現させるか又はコードする、単離及び精製されたベクター又はプラスミドの使用を含む。好ましくは、ベクターは、インフルエンザｃＤＮＡ、例えばインフルエンザＡ型（例えば１５種のＨＡサブタイプ又は９種のＮＡサブタイプのいずれかを含む任意のインフルエンザＡ遺伝子）、Ｂ又はＣ型ＤＮＡ（Fields Virologyの第４５及び４６章参照、Fileds他編, Lippincott-Raven Publ., Philadelphia, PA (1996)、これを参考のため具体的に本明細書中に引用する）を含んでなるが、任意の生物の遺伝子を本発明のベクター又は方法において採用することも考えられる。ｃＤＮＡは、プロモータに対してセンス配向又はアンチセンス配向を成してよい。こうして、本発明のベクターは、インフルエンザ・ウィルス・タンパク質（センス）又はｖＲＮＡ（アンチセンス）をコードしてよい。タンパク質又はペプチド、例えばウィルス・タンパク質又はペプチド、非ウィルス病原体のタンパク質又はペプチド、又は治療用タンパク質又はペプチドを発現させるために、任意の好適なプロモーター又は転写終結配列が採用されてよい。

本発明の組成物は、当該遺伝子又はオープン・リーディング・フレーム、例えばワクチンとして有用な免疫原性ペプチド又はタンパク質をコードする外来遺伝子を含んでもよい。こうして、本発明の別の実施態様は、ベクターのうちの１つの代わりに、転写終結配列に結合された３’インフルエンザ・ウィルス・コード配列又はこれらの一部を任意に含む３’インフルエンザ・ウィルス配列に結合された、所期核酸配列、例えば所期ｃＤＮＡに結合された、５’インフルエンザ・ウィルス・コード配列又はこれらの一部を任意に含む５’インフルエンザ・ウィルス配列に結合されたプロモーターを含むベクターが使用されるか、又は組成物がさらにこのベクターを含むような上記本発明の組成物を含んでなる。好ましくは、所期核酸配列、例えばｃＤＮＡはアンチセンス配向を成している。インフルエンザ・ウィルス複製に対して許容状態の宿主細胞にこのような組成物を導入する結果、ベクターの配列に対応するｖＲＮＡを含んでなる組み換えウィルスが生じる。ｖＲＮＡ生成のためのこのようなベクター内のプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、Ｔ７プロモーター、及びＴ３プロモーターであってよく、そして任意にはベクターは、転写終結配列、例えばＲＮＡポリメラーゼＩ転写終結配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写終結配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写終結配列、又はリボザイムを含んでなる。１実施態様の場合、所期核酸配列を含むベクターは、当該ｃＤＮＡを含んでなる。当該ｃＤＮＡは、ｖＲＮＡ生成のためのベクター内にあろうとタンパク質生成のためのベクター内にあろうと、免疫原性エピトープ、例えば癌治療又はワクチンにおいて有用なエピトープ、又は癌治療において有用なペプチド又はポリペプチドをコードすることができる。ウィルスを調製するとき、当該遺伝子又はｃＤＮＡを含んでなるベクター又はプラスミドは、インフルエンザ・ウィルス遺伝子のためのベクター又はプラスミドの代わりとなってよく、或いは、全てのインフルエンザ・ウィルス遺伝子のためのベクター又はプラスミドに追加されてもよい。

本発明の複数のベクターは、物理的に結合されてよく、或いは各ベクターは、個々のプラスミド又はその他の、例えば線状の核酸送達ビヒクル上に存在していてよい。

ｖＲＮＡ又はウィルス・タンパク質発現ベクター内のプロモーター又は転写終結配列は、プロモーター又は任意の他のベクターに対して同じであるか又は異なっていてよい。好ましくは、インフルエンザｖＲＮＡを発現させるベクター又はプラスミドは、少なくとも１種の特定の宿主細胞、例えば鳥類又は哺乳類宿主細胞、例えば犬、猫、馬、牛、羊、又はヒト細胞を含む霊長類細胞における発現、又は好ましくは２種以上の宿主における発現に適したプロモーターを含んでなる。

１実施態様の場合、ｖＲＮＡ生成のための１つ又は２つ以上のベクターは、例えばＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、例えばヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、Ｔ７プロモーター、又はＴ３プロモーターを含むプロモーターを含んでなる。ｖＲＮＡベクターのための好ましい転写終結配列の一例としては、ＲＮＡポリメラーゼＩ転写終結配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写終結配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写終結配列、又はリボザイムが挙げられる。本発明の範囲内に含まれるリボザイムの一例としては、テトラヒメナ・リボザイム、ＲＮａｓｅＰ、ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム、肝炎リボザイム、並びに合成リボザイムが挙げられる。

１実施態様の場合、ｖＲＮＡのための少なくとも１つのベクターは、任意にはＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写終結配列に結合された別のリボザイム配列に結合されたウィルス・コード配列に結合されたリボザイム配列に結合されたＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含んでなる。１実施態様の場合、ｖＲＮＡ生成のための少なくとも２つの、好ましくは３つ以上、例えば３、４、５、６、７又は８つのベクターは、転写終結配列に対して５’方向の第２リボザイム配列、第２リボザイム配列に対して５’方向のウィルス・コード配列を含むウィルス配列に対応する配列、ウィルス配列に対応する配列に対して５’方向の第１リボザイム配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含んでなる。各ｖＲＮＡベクター内の各ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、任意の他のｖＲＮＡベクターにおけるＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターと同じ又はこれとは異なっていてよい。同様に、各ｖＲＮＡベクター内の各リボザイム配列も、任意の他のｖＲＮＡベクターにおけるリボザイム配列と同じ又はこれとは異なっていてよい。１実施態様の場合、単一のベクター内のリボザイム配列は同じではない。

本発明はまた、インフルエンザ・ウィルスを調製する方法を提供する。この方法は、例えば感染性インフルエンザ・ウィルスを産出するのに効果的な量の本発明の組成物を採用して、細胞を本発明の複数のベクターと、例えば逐次的に又は同時に接触させることを含んでなる。本発明はまた、組成物と接触させた細胞からウィルスを単離することを含む。このように、本発明はさらに、単離されたウィルス、並びに、本発明の組成物又はウィルスと接触させられた宿主細胞を提供する。別の実施態様の場合、本発明は、細胞を１種又は２種以上のベクター、ｖＲＮＡ又はタンパク質生成ベクターと、他のベクター、ｖＲＮＡ又はタンパク質生成ベクターの前に接触させることを含む。

ヘルパーウィルス感染を必要としない本明細書に記載されたウィルスを製造する方法は、ウィルス突然変異誘発研究、及びワクチンの製造（例えばＡＩＤＳ、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ライノウィルス、フィロウィルス、マラリア、ヘルペス、及び口蹄疫用）、及び遺伝子治療ベクター（例えば癌、ＡＩＤＳ、アデノシン・デアミナーゼ、筋ジストロフィー、オルニチン・トランスカルバミラーゼ欠損症、及び中枢神経系腫瘍用）において有用である。こうして、医学的治療（例えばワクチン又は遺伝子治療）において使用するためのウィルスが提供される。

本発明はまた、病原体、例えばバクテリア、ウィルス、又は寄生生物、又は悪性腫瘍に対して個体を免疫化する方法を提供する。この方法は、個体を免疫化するのに効果的な量の少なくとも１種の本発明の単離ウィルスを、任意にはアジュバントと組み合わせて個体に投与することを含んでなる。ウィルスは、病原体又は腫瘍特異的ポリペプチドによってコードされるポリペプチドを含むｖＲＮＡを含んでなる。

また、内在性タンパク質の量の減少又は欠如によって特徴付けられる兆候又は疾患を有する哺乳動物において、内在性タンパク質の発現を増加又は増大させる方法も提供される。この方法は、哺乳動物における内在性タンパク質量を増加又は増大させるのに効果的な量の本発明の単離ウィルスを哺乳動物に投与することを含んでなる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

図１は、種々のインフルエンザ・ウィルスの力価を示す図である。図２は、逆遺伝技術によってＨ５Ｎ１／ＰＲ８再構築体ウィルスを生成するために使用されるＮ１ＮＡを示す概略図である。ＶＮ１２０３ｆｉｌｌは、Ｈ５Ｎ１前駆体株ＧｓＧｄ９６のＮ１から誘導された２０アミノ酸（ａａ）挿入部を含有する。ＶＮ１２０３ｆｉｌｌ．Ｎ２は、ＧｓＧｄ９６ＮＡからの２０ａａに加えて、Ｎ２ＮＡからの１４−ａａ挿入部を含有し、その結果、ＶＮ１２０３ＮＡのストーク内には３４−ａａ挿入部が生じる。ＶＮ１２０２ｆｉｌｌ．Ｎ２Ｎ９は、ＧｓＧｄ９６ＮＡからの２０ａａ、及びＮ２ＮＡからの１４ａａに加えて、Ｎ９ＮＡからの１４−ａａ挿入部を含有し、その結果、ＶＮ１２０３のストーク内には４８−ａａ挿入部が生じる。各ＮＡの予想総ストーク領域長は、各分子の下に与えられている。図３は、孵化鶏卵内のＨ５Ｎ１／ＰＲ８再構築体ウィルスの成長を示す図である。無毒形ＶＮ１２０３ＨＡ、及び異種ＮＡ（ＶＮ１２０３）又は異種ＮＡ（ＶＮ１２０３ｆｉｌｌ、ＶＮ１２０３ｆｉｌｌ．Ｎ２、ＨＫ２１３、又はＰＲ８）をＰＲ８バックグラウンドと共に含有する再構築体ウィルスの力価を、ＭＤＣＫ細胞を用いたプラーク滴定によって比較した。野生型（卵適応）ＰＲ８の力価も比較のために含まれる。データは、各ウィルスを接種された３つの卵に対する平均力価及び標準偏差として報告する。図４は、孵化鶏卵内のＨ５Ｎ１再構築体ウィルスの成長動態を示す。我々は、ＰＲ８ＮＡ（ＰＲ８）、ＶＮ１２０３ＮＡ（ＶＮ１２０３）、又はＶＮ１２０３ｆｉｌｌＮＡ（ＶＮ１２０３ｆｉｌｌ）を含有する同量（１０^４ＥＩＤ_５０）のウィルスを卵に接種した。各ウィルスを接種された３つの卵に対する平均ＨＡ力価及び標準偏差を、指示時点で測定した。図５は、鶏赤血球からのウィルス溶離を示す図である。異なるストーク長を有するＶＮ１２０３ＮＡ、又はＰＲ８ＮＡを含有する各ウィルス（ＨＡ力価１：１０２４）の二倍希釈体を、１時間にわたって４℃のマイクロタイター・プレート内で鶏赤血球と共にインキュベートした。次いでプレートを３７℃で貯蔵し、ＨＡ力価の低減を８時間にわたって記録した。図６は、孵化鶏卵内のＨ５Ｎ１／ＰＲ８再構築体ウィルスの成長の比較を示す図である。ＷＨＯ推奨のＮＩＢＲＧ−１４株（ＶＮ１１９４／ＰＲ８６：２再構築体ウィルス）を含む６：２及び７：１再構築体ウィルスのウィルス力価を、ＭＤＣＫ細胞によるプラーク滴定によって比較した。各ウィルスを接種された３つの卵の平均力価及び標準偏差を示す。このように、Ｈ５Ｎ１のＮＡだけをＰＲ８のＮＡと置き換えることにより、卵内の力価を改善することができる。図７は、孵化鶏卵におけるＰＲ８（ＵＷ）又はＰＲ８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）内部遺伝子を有する再構築体Ｈ５Ｎ１ウィルスの成長を示す図である。アスタリスクは、ＰＲ８（ＵＷ）／１１９４と比較した感染価の有意な（ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）低減を示す図である。図８は、孵化鶏卵におけるウィルスの成長に対するＭ及びＮＳ遺伝子の効果を示す。アスタリスクは、ＰＲ８（ＵＷ）／１１９４と比較した感染価の有意な（ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）増大を示す図である。図９は、ＭＤＣＫ細胞における、ＰＲ８（ＵＷ）／１１９４及びＮＩＢＲＧ−１４ウィルスの成長を示す図である。図１０は、ＭＤＣＫ細胞内でＮＩＢＲＧ−１４と比較してＰＲ８（ＵＷ）／１１９４の成長が高められることに関与する遺伝子セグメントの同定を示す図である。図１１は、ＭＤＣＫ細胞内のワクチン種ウィルスの高い成長速度に関与するＰＢ２内のアミノ酸の同定を示す図である。図１２は、異なるＨＡ、ＮＡ、及びＮＳ遺伝子を有する再構築体のＭＤＣＫ細胞における成長速度を示す図である。アスタリスクは、ＰＲ８（ＵＷ）／１１９４と比較して著しく良好なウィルス成長を示す。二重のアスタリスクは、ＰＲ８（ＵＷ）ＮＳを発現させるウィルスと比較して著しく良好なウィルス成長を示す。図１３は、異種ＮＳセグメントを含有するＨ５Ｎ１ワクチン種ウィルスのＭＤＣＫ細胞における成長を示す図である。図１４は、孵化鶏卵又はＭＤＣＫ細胞内に高成長能力を有するＨ５Ｎ１ワクチン種ウィルスの遺伝子タイプを示す概略図である。ＰＲ８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）遺伝子（ＳＥＱＩＤＮｏ：２８〜３３）に対応するヌクレオチド配列である。ＰＲ８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）遺伝子（ＳＥＱＩＤＮｏ：２８〜３３）に対応するヌクレオチド配列である。ＰＲ８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）遺伝子（ＳＥＱＩＤＮｏ：２８〜３３）に対応するヌクレオチド配列である。

発明の詳細な説明
定義
本明細書中に使用される「単離及び／又は精製された」という用語は、本発明のベクター、プラスミド、又はウィルスのin vitroの調製、単離、及び／又は精製を意味し、この場合これはin vivo物質とは関連せず、実質的にin vitro物質から調製が行われる。単離ウィルスの調製は、一般にin vitroの培養及び増殖によって、及び／又は卵内の継代を介して達成され、そして他の感染性物質は実質的に存在しない。
本明細書中に使用される「実質的に存在しない」は、特定の感染性物質に対する標準的な検出方法を用いたときに、その物質の検出レベルを下回ることを意味する。

「組み換え」ウィルスは、ウィルス・ゲノムに変化を導入するために、例えば組み換えＤＮＡ技術を用いて、in vitroで操作されたウィルスである。組み換え又は非組み換え技術によって再構築体ウィルスを調製することができる。

本明細書中に使用される「組み換え核酸」又は「組み換えＤＮＡ配列又はセグメント」という用語は、源から誘導又は単離され、続いてin vitroで化学的に変更されてよい核酸、例えばＤＮＡを意味し、この場合、その配列は天然には発生せず、又は、天然ゲノム内で配置されるであろうようには配置されない天然発生配列に相当する。源から「誘導」されたＤＮＡの例は、有用な断片として同定され、次いで本質的に純粋な形で化学的に合成されたＤＮＡ配列である。源から「単離」されたこのようなＤＮＡの例は、化学手段によって、例えば制限エンドヌクレアーゼの使用によって、前記源から切除又は除去された有用なＤＮＡ配列であり、この場合、ＤＮＡは遺伝子工学の方法によって、本発明における使用のために、さらに操作、例えば増幅することができる。

本明細書中に使用される「異種」インフルエンザ・ウィルス遺伝子又は遺伝子セグメントは、再構築体インフルエンザ・ウィルス内の他のインフルエンザ・ウィルス遺伝子又は遺伝子セグメントの大部分とは異なるインフルエンザ・ウィルス源に由来する。

インフルエンザ・ウィルス複製
インフルエンザＡ型ウィルスは、全部で１０種のタンパク質をコードする８つの単鎖マイナス−センス・ウィルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）のゲノムを有する。インフルエンザ・ウィルス寿命サイクルは、宿主細胞の表面上のシアル酸含有受容体に対する血球凝集素（ＨＡ）の結合で始まり、これに、受容体媒介エンドサイトーシスが続く。後期エンドソームにおける低ｐＨが、ＨＡ内のコンフォメーション・シフトを引き起こし、これにより、ＨＡ２サブユニット（いわゆる融合ペプチド）のＮ末端を露出させる。融合ペプチドは、ウィルス膜とエンドソーム膜との融合を開始し、そしてマトリックス・タンパク質（Ｍ１）及びＲＮＰの複合体が細胞質内に放出される。ＲＮＰは、ｖＲＮＡをカプシドで包む核タンパク質（ＮＰ）と、ＰＡ、ＰＢ１、及びＰＢ２タンパク質によって形成されたウィルス・ポリメラーゼ複合体とから成る。ＲＮＰは核内に輸送され、この場所で転写及び複写が行われる。ＲＮＡポリメラーゼ複合体は、３つの異なる反応、すなわち：５’キャップ及び３’ポリＡ構造を有するｍＲＮＡの合成、完全長相補ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）の合成、及びｃＤＮＡを鋳型として使用したゲノムｖＲＮＡの合成を触媒する。次いで、新たに合成されたｖＲＮＡ、ＮＰ、及びポリメラーゼ・タンパク質が集成されてＲＮＰになり、核から搬出され、そして原形質膜に輸送され、この場所で子孫ウィルス粒子の発芽が発生する。ノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質は、シアリルオリゴ糖からシアル酸を除去し、ひいては新たに集成されたビリオンを細胞表面から放出し、そしてウィルス粒子の自己会合を防止することにより、感染後期に重要な役割を演じる。ウィルス集成体はタンパク質−タンパク質、及びタンパク質−ｖＲＮＡの相互作用に関与するが、これらの相互作用の性質はほとんど知られていない。

インフルエンザＢ型及びＣ型ウィルスは構造上及び機能上、インフルエンザＡ型ウィルスに類似しているが、いくつかの相違点がある。例えばインフルエンザＢ型ウィルスはＭ２タンパク質を有さない。同様にインフルエンザＣ型ウィルスもＭ２タンパク質を有さない。

本発明において使用することができる細胞系及びインフルエンザ・ウィルス
本発明によれば、インフルエンザ・ウィルスのための受容体である、低減又は減少したレベルの１種又は２種以上のシアル酸を発現させる突然変異細胞を含む、インフルエンザ・ウィルスの効率的な複製を支援する任意の細胞を採用することができる。本発明により得られたウィルスを再構築体ウィルスに形成することができる。

好ましくは、細胞は、ＷＨＯによって認定された、又は認定可能な連続した細胞系である。このような細胞系を認定する要件は、系統、成長特性、免疫学的マーカー、ウィルス感受性、腫瘍原性、及び貯蔵条件のうちの少なくとも１つに関する特徴付け、並びに、動物、卵、及び細胞培養における試験による特徴付けを含む。このような特徴付けは、これらの細胞に、検出可能な偶発性物質が存在しないことを確認するために使用される。いくつかの国では核学が必要とされることもある。加えて、ワクチン生成のために使用されるのと同じ継代レベルにある細胞中で、腫瘍原性が好ましくは試験される。ウィルスは好ましくは、ワクチン生成のために不活性又は弱毒化されるまえに、一貫した結果をもたらすことが判っているプロセスによって精製される（例えばWorld Health Organization、1982参照）。

最終生成物の純度のための適切な試験を含むことができるように、使用されるべき細胞系の完全な特徴付けを確立することが好ましい。本発明において使用されるべき細胞を特徴付けするために用いることができるデータは、（ａ）その起源、派生、及び継代履歴に関する情報；（ｂ）その成長及び形態学的特徴に関する情報；（ｃ）偶発性物質の試験結果；（ｄ）際立った特徴、例えば細胞が他の細胞系の中から明らかに認識されるのを可能にする生化学的、免疫学的、及び細胞遺伝学的パターン；及び（ｅ）腫瘍原性の試験結果を含む。使用される宿主細胞の継代レベル、又は集団倍加時間は、可能な限り低いことが好ましい。

細胞内で生成されるウィルスが、ワクチン又は遺伝治療製剤の前に高精製される。一般に、精製処置は、細胞ＤＮＡ、他の細胞成分、及び偶発性物質の広範囲の除去をもたらすことになる。ＤＮＡを広範囲に分解又は変性させる処置を利用することもできる。例えばMizrahi、1990参照。

ワクチン
本発明のワクチンは、任意の病原体の糖タンパク質を含む免疫原性タンパク質、例えば１種又は２種以上のバクテリア、ウィルス、酵母、又は真菌に由来する免疫原性タンパク質を含んでよい。このように、１実施態様の場合、本発明のインフルエンザ・ウィルスは、インフルエンザ・ウィルス、又は一例としてはレンチウィルス、例えばＨＩＶ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎ウィルス、ヘルペス・ウィルス、例えばＣＭＶ又はＨＳＶ又は口蹄疫ウィルスを含むその他のウィルス病原体のためのワクチン・ベクターであってよい。

完全なビリオン・ワクチンは、限外濾過によって濃縮され、次いで、ゾーン遠心分離によって、又はクロマトグラフィによって精製される。これは例えばホルマリン又はベータ−プロピオラクトンを使用して精製の前又は後で不活性化される。

サブユニット・ワクチンは、精製糖タンパク質を含んでなる。このようなワクチンは下記のように調製されてよい：洗剤で処理することにより断片化されたウィルス懸濁液を使用して、例えば超遠心分離によって表面抗原を精製する。サブユニット・ワクチンはこうして、主にＨＡタンパク質、そしてＮＡをも含有する。使用される洗剤は例えばカチオン性洗剤、例えば臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（Bachmeyer、1975）、アニオン性洗剤、例えばデオキシコール酸アンモニウム（Laver & Webster、1976）；又は非イオン性洗剤、例えばTRITON X100という名称で商業化されている洗剤であってよい。血球凝集素は、プロテアーゼ、例えばブロメリンでビリオンを処理した後で単離され、次いでGrand及びSkehel（1972）によって記載されているような方法によって精製されてもよい。

スプリット・ワクチンは、脂質を溶解する物質による処理を施されたビリオンを含んでなる。スプリット・ワクチンは下記のように調製することができる：上記のように得られ、不活性化された又はされていない精製ウィルスの水性懸濁液を、洗剤と関連する脂質溶媒、例えばエチルエーテル又はクロロホルムによって、攪拌しながら処理する。ウィルス・エンベロープ脂質の溶解の結果、ウィルス粒子が断片化される。主に、最初の脂質環境が除去された血球凝集素及びノイラミニダーゼ、及びコア又はその分解生成物から成るスプリット・ワクチンを含有する水性相が回収される。次いで、残留感染性粒子が、不活性化がすでに行われていない場合には不活性化される。

不活性化ワクチン。本発明の不活性化インフルエンザ・ウィルス・ワクチンは、周知の方法、例えばホルマリン又はβ−プロピオラクトン処理を用いて、本発明の複製ウィルスを不活性化することにより提供される。本発明において使用することができる不活性化ワクチン・タイプは、全ウィルス（ＷＶ）ワクチン又はサブビリオン（ＳＶ）（スプリット）ワクチンを含むことができる。ＷＶワクチンはインタクトの不活性化ウィルスを含有するのに対して、ＳＶワクチンは、脂質含有ウィルス・エンベロープを可溶化する洗剤で分裂され、続いて残存ウィルスの化学的不活性化を施された精製ウィルスを含有する。

加えて、使用することができるワクチンは、単離されたＨＡ及びＮＡ表面タンパク質を含有するワクチンを含む。これらのタンパク質は表面抗原又はサブユニット・ワクチンと呼ばれる。一般に、ＳＶ及び表面抗原（すなわち精製ＨＡ又はＮＡ）ワクチンに対する応答は同様である。流行性ウィルスに免疫学的に関連するＮＡ抗原及び無関係のＨＡを含有する実験的な不活性ＷＶワクチンは、コンベンショナルなワクチンよりも効果が低いように思われる（Ogra他、1977)。両方の関連表面抗原を含有する不活性ワクチンが好ましい。

生の弱毒化ウィルス・ワクチン。周知の方法ステップに従って、インフルエンザ・ウィルス感染を予防又は治療するために、生の弱毒化ウィルス・ワクチンを使用することもできる。弱毒化は好ましくは、弱毒化遺伝子を弱毒化供与体ウィルスから、複製された単離体又は再構築ウィルスへ、周知の方法に従って移す（例えばMurphy, 1993）ことにより単一のステップで達成される。インフルエンザＡ型ウィルスに対する耐性がＨＡ及びＮＡ糖タンパク質に対する免疫応答の発生により媒介されるので、これらの表面抗原をコードする遺伝子は、再構築ウィルス又は高成長臨床単離体に由来しなければならない。弱毒化遺伝子は、弱毒化された親から誘導される。このアプローチにおいて、弱毒化をもたらす遺伝子は好ましくは、ＨＡ及びＮＡ糖タンパク質をコードしない。さもなければ、これらの遺伝子は、臨床ウィルス単離体の表面抗原を含有する再構築体に移すことができないおそれがある。

多くの供与体ウィルスが、インフルエンザ・ウィルスを再生可能に弱毒化する能力に関して評価されている。一例としては、弱毒化ワクチン生成のために、Ａ／ＡｎｎＡｒｂｏｒ（ＡＡ）／６／６０（Ｈ２Ｎ２）低温適応型（ｃａ）供与体ウィルスを使用することができる（例えばEdwards, 1994；Murphy, 1993)。加えて、生の弱毒化再構築体ウィルス・ワクチンは、ｃａ供与体ウィルスと、本発明の毒性複製ウィルスとを接合することにより発生させることができる。再構築体子孫を次いで、弱毒化Ａ／ＡＡ／６／６０（Ｈ２Ｎ２）ｃａ供与体ウィルスの表面抗原を含有するウィルスの複製を阻害するＨ２Ｎ２抗血清の存在において、２５℃（悪性ウィルスの複製にとって制限的）で選択される。

数多くの一連のＨ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２再構築体は、ヒトにおいて評価されており、また申し分なく：（ａ）感染性であり、（ｂ）血清反応陰性の小児及び免疫学的にプライミングされた成人に対して弱毒化されており、（ｃ）免疫原性であり、そして（ｄ）遺伝子的に安定であることが判っている。ｃａ再構築体の免疫原性はこれらの複製レベルと平行する。こうして、ｃａ供与体ウィルスの６つの移動可能な遺伝子を新しい野生型ウィルスによって捕捉することにより、感染しやすい成人及び小児にワクチン接種する際に使用するためのこれらのウィルスを再現可能に弱毒化している。

他の弱毒突然変異を部位特異的突然変異誘発によってインフルエンザ・ウィルス遺伝子内に導入することにより、これらの突然変異遺伝子を含有する感染性ウィルスを救出することができる。弱毒突然変異は、ゲノムの非コード領域内に、並びにコード領域内に導入することができる。このような弱毒突然変異は、ＨＡ又はＮＡ以外の遺伝子、例えばＰＢ２ポリメラーゼ遺伝子内に導入することもできる（Subbarao他、1993）。このように、部位特異的突然変異誘発によって導入された弱毒突然変異を含有する新しい供与体ウィルスを生成することもでき、またこのような新しい供与体ウィルスは、Ａ／ＡＡ／６／６０ｃａ供与体ウィルスに関して上述したものと同様に、生の弱毒化再構築体Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２ワクチン候補を低減するのに使用することができる。同様に、哺乳動物のワクチン接種時に使用するのに適した弱毒化ワクチンを得るために、他の周知のそして好適な弱毒化供与体株を本発明のインフルエンザ・ウィルスと共に再構築することもできる（Enami他、1990；Muster他、1991；Subbarao他、1993）。

このような弱毒化ウィルスは、元の臨床単離体と実質的に同様の抗原決定因子をコードするウィルスから遺伝子を維持することが好ましい。その理由は、弱毒化ウィルスの目的が、ウィルスの元の臨床単離体と実質的に同じ抗原性を提供すると同時に、ワクチンがワクチン接種された哺乳動物において深刻な病原性状態を誘発するという変化を最小限にしかもたらさない程度まで感染性を欠くことであるからである。

ウィルスはこのように、動物、例えば哺乳動物において免疫応答を誘発するためのワクチンとして、周知の方法に従って、弱毒化又は不活性化し、製剤し、そして投与することができる。このような弱毒化又は不活性化ワクチンが、臨床単離体又はそれから誘導された高成長株と同様の抗原性を維持しているかどうかを見極める方法が当業者によく知られている。このような周知の方法は、供与体ウィルスの抗原決定因子を発現させるウィルスを排除するための抗血清又は抗体の使用；化学的選択（例えばアマンタジン又はリマンチジン）；ＨＡ及びＮＡ活性及び阻害；及び、抗原決定因子をコードする供与体遺伝子（ＨＡ又はＮＡ遺伝子）が弱毒化ウィルス内に存在しないことを確認するためのＤＮＡスクリーニング（例えばプローブ・ハイブリダイゼーション又はＰＣＲ）を含む。例えばRobertsn他、1988；Kilbourne、1969；Aymard-Henry他、1985；Robertson他、1992を参照されたい。

医薬組成物
接種に適した、又は非経口又は経口投与に適した本発明の医薬組成物は、弱毒化又は不活性化されたインフルエンザ・ウィルスを含んでなり、任意にはさらに、滅菌水性又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンを含んでなる。組成物はさらに、当業者によく知られた助剤又は賦形剤を含んでなる。例えばBerkow他、1987；Avery's Drug Treatment, 1987; Osol、1980；Katzung、1992を参照されたい。本発明の組成物は、一般に、個々の投与量（単位投与量）の形態で提供される。

コンベンショナルなワクチンは一般に、これらの組成物中に進入する株のそれぞれから約０．１〜２００μｇ、好ましくは１０〜１５μｇの血球凝集素を含有する。本発明のワクチン組成物の主成分を形成するワクチンは、Ａ、Ｂ又はＣ型ウィルス、又はこれらの組み合わせ、例えば３つのタイプのうちの少なくとも２種、異なるサブタイプのうちの少なくとも２種、同じタイプのうちの少なくとも２種、同じサブタイプのうちの少なくとも２種、又は異なる単離体又は再構築体を含んでなる。ヒト・インフルエンザ・ウィルスＡ型は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、及びＨ３Ｎ２サブタイプを含む。

非経口投与のための製剤は、滅菌水性又は非水性溶液、懸濁液、及び／又はエマルジョンを含み、これらは、当業者に知られた助剤又は賦形剤を含有してよい。非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。皮膚浸透性を高め、そして抗原吸収率を高めるために、キャリヤ又は密封包帯を使用することができる。経口投与のための液状投与形態は、一般に液状投与形態を含有するリポソーム溶液を含んでいてよい。リポソームを懸濁させるのに適した形態は、当業者に広く知られた不活性希釈剤、例えば精製水を含有するエマルジョン、懸濁液、溶液、シロップ、及びエリキシルを含む。不活性希釈剤の他に、このような組成物はアジュバント、湿潤剤、乳化・懸濁剤、又は甘味剤、矯味剤、又は芳香剤を含むこともできる。例えばBerkow他、1992；Avery、1987; Osol、1980；Katzung、1992を参照されたい。

本発明の組成物が個体への投与のために使用されるときには、この組成物はさらに、塩、緩衝剤、アジュバント、又は組成物の効力を改善するために望ましい他の物質を含むこともできる。ワクチンの場合には、アジュバント、つまり特異的な免疫応答を増強することができる物質を使用することができる。通常、アジュバントと組成物とは、免疫系への提供前に混合されるか、又は別々に、しかし免疫化される生物の同じ部位内に提供される。ワクチン組成物中の使用に適した材料の例は、Osol (1980)において提供されている。

ワクチンにおける異質性は、少なくとも２種のインフルエンザ・ウィルス株、例えば２〜５０株又はこの中の任意の範囲又は値に対応する複製インフルエンザ・ウィルスを混合することによって提供されてよい。最新の抗原組成物を有するインフルエンザＡ型又はＢ型ウィルス株が好ましい。本発明によれば、当業者に知られた技術を用いて、インフルエンザ・ウィルスの単一株を変化させるようにワクチンを提供することができる。

本発明による医薬組成物はさらに又は付加的に、少なくとも１種の化学療法化合物、例えば、遺伝子治療の場合には免疫抑制剤、抗炎症剤、又は免疫促進剤、そしてワクチンの場合には、例えばガンマ・グロブリン、アマンタジン、グアニジン、ヒドロキシベンズイミダゾール、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子アルファ、チオセミカルバルゾン、メチサゾン、リファンピン、リバビリン、ピリミジン類似体、プリン類似体、フォスカルネット、ホスホノ酢酸、アシクロビル、ジデオキシヌクレオシド、プロテアーゼ阻害剤、又はガンシクロビルを含む化学療法薬を含んでよい。例えばKatzung (1992)、及びそれぞれその第７９８〜８００頁及び第６８０〜６８１頁に引用された文献を参照されたい。

組成物は可変の、しかし少量の内毒素非含有ホルムアルデヒド、及び組成物が投与される生物において安全であり、また望ましくない効果に関与しないことが判っている保存剤を含有することもできる。

医薬上の目的
組成物（又は組成物が誘発する抗血清）は、「予防」又は「治療」目的で投与されてよい。予防的に提供されるときには、ワクチンである本発明の組成物は、病原体感染の症状が明らかになる前に提供される。組成物の予防的投与は、後続の感染を防止又は軽減するのに役立つ。予防的に提供されるときには、本発明の遺伝子治療組成物は、疾患の症状が明らかになる前に提供される。組成物の予防的投与は、疾患と関連する１つ又は２つ以上の症状を防止又は軽減するのに役立つ。

治療的に抵抗されるときには、弱毒化又は不活性化されたウィルス・ワクチンは、実際の感染の症状を検出したときに提供される。化合物の治療的投与は、実際の感染を軽減するのに役立つ。例えばBerkow他、1992；Avery、1987；及びKatzung、1992を参照されたい。治療的に抵抗されるときには、遺伝子治療組成物は、疾患の症状又は兆候を検出したときに提供される。化合物の治療的投与は、その疾患の症状又は兆候を軽減するのに役立つ。

従って、本発明の弱毒化又は不活性化されたワクチン組成物はこうして、（予想される感染を防止又は軽減するように）感染の開始前に、又は実際の感染の開始後に提供されてよい。同様に、遺伝子治療の場合にも、組成物が、症状又は疾患の症状が明らかになる前、又は１つ又は２つ以上の症状が検出された後に提供されてよい。

組成物の投与を受容患者が耐容し得る場合、その組成物は「薬理学的に許容し得る」と言われる。このような薬剤は、その投与量が生理学的に有意である場合に、「治療上効果的な量」で投与されると言われる。本発明の組成物は、その存在が受容患者の生理学的特性の検出可能な変化をもたらす、例えば感染性インフルエンザ・ウィルスの少なくとも１種の株に対する少なくとも１つの一次的又は二次的な液性又は細胞性免疫応答を向上させる場合、生理学的に有意である。

対照個体群又は患者群と比較して統計的に有意な改善があるならば、提供される「防御」は絶対的なものである必要はなく、すなわち、インフルエンザ感染は全体的に予防又は根絶される必要はない。防御は、インフルエンザ・ウィルス感染の症状の開始の重症度又は速さを軽減することに制限されてよい。

医薬投与
本発明の組成物は、受動免疫法又は能動免疫法によって、１種又は２種以上の病原体、例えば１種又は２種以上のインフルエンザ・ウィルス株に対する耐性を与えることができる。能動免疫法の場合、不活性化又は弱毒化された生ワクチン組成物が宿主（例えば哺乳動物）に予防的に投与され、そしてこの投与に対する宿主の免疫応答が、感染及び／又は疾患に対する防御を行う。受動免疫法の場合、誘発された抗血清を回収し、そして少なくとも１種のインフルエンザ・ウィルス株によって引き起こされる感染を有することが疑われる受容者にこれを投与することができる。本発明の遺伝子治療は、能動免疫法によって予防的又は治療的レベルの所期遺伝子生成物を産出することができる。

１実施態様の場合、ワクチンは哺乳動物の女性（妊娠又は出産時又は前）に、女性及び胎児又は新生児の双方を守るのに役立つ免疫応答の生成を引き起こすのに十分な時間及び量の条件下で提供される（胎盤を介した又は母乳中の抗体の受動的取り込みを介して）。

本発明はこのように、障害又は疾患、例えば少なくとも１種の病原体株による感染を防止又は軽減する方法を含む。本明細書中に使用されるワクチンは、その投与の結果、疾患の症状又は状態の全体的又は部分的な軽減（すなわち抑制）、又は疾患に対する個体の全体的又は部分的な免疫が生じる場合、疾患を防止又は軽減すると言われる。遺伝子治療組成物は、その投与の結果、疾患の症状又は状態の全体的又は部分的な軽減（すなわち抑制）、又は疾患に対する個体の全体的又は部分的な免疫が生じる場合、疾患を防止又は軽減すると言われる。

本発明の少なくとも１種の活性化又は弱毒化されたインフルエンザ・ウィルス、又はその組成物は、前記医薬組成物を使用して、所期の目的を達成する任意の手段によって投与されてよい。

例えば、このような組成物は、種々の非経口経路、例えば皮下、静脈内、皮内、筋内、腹腔内、鼻腔内、経口又は経皮経路によって投与されてよい。非経口投与は、ボーラス注入によって、又は所定の時間にわたる漸次灌流によって行うことができる。本発明の医薬組成物の好ましい使用様式は、筋内又は皮下適用によるものである。例えばBerkow他、1992；Avery、1987；及びKatzung、1992を参照されたい。

インフルエンザ・ウィルス関連病理を防止、抑制、又は治療するための典型的な投与計画は、単回治療として投与されるか、又は１週間〜約２４か月まで（この値を含む）、又はこの中の任意の範囲又は値の期間にわたって促進投与又はブースター投与として繰り返される、本明細書中に記載された効果的な量のワクチン組成物の投与を含んでなる。

本発明によれば、組成物の「効果的な量」は、所期の生物学的効果を達成するのに十分な量である。効果的な投与量が、受容者の年齢、性別、健康状態、及び体重、もしあるならば並行治療の種類、治療の頻度、及び望まれる効果の性質に依存することは明らかである。下に示す効果的な投与量の範囲は、本発明を限定しようとするものではなく、好ましい投与量範囲を表す。しかしながら、最も好ましい投与量は、当業者によって理解され見極めることができるように、その個体に合わせて調整されることになる。例えばBerkow他、1992；Avery、1987；及びKatzung、1992を参照されたい。

哺乳動物（例えばヒト）又は鳥類の成体生物のための弱毒化ウィルスの投与量は、約１０^３〜１０^７プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｋｇ、又はその中の任意の範囲又は値であることが可能である。不活性化ワクチンの投与量は約０．１〜２００、例えば５０μｇの血球凝集素タンパク質であることが可能である。しかしながら、投与量は、既存のワクチンを出発点として、コンベンショナルな方法によって見極められた安全且つ効果的な量であるべきである。

複製ウィルス・ワクチンの各投与量における免疫反応性ＨＡの投与量は、好適な量、例えば１〜５０μｇ又はその中の任意の範囲又は値、又は通常、３歳の年長児に対しては１成分当たり１５μｇ、そして３歳未満の年長児に対しては１成分当たり７．５μｇという米国公衆衛生局(PHS)によって推奨された量を含有するように標準化することができる。ＮＡの量は標準化することもできるが、しかしこの糖タンパク質は、処理装置による精製及び貯蔵中に不安定であるおそれがある（Kendal他、1980)。各０．５ｍｌのワクチン投与量は好ましくは、ほぼ１０億〜５００億個のウィルス粒子、好ましくは１００億個の粒子を含有する。
下記非限定的な例によって本発明をさらに説明する。

例１
インフルエンザＡ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４の逆遺伝技術系を開発するために、製造業者のプロトコルに従ってRNeasy Miniキット（Qiagen）を使用して、ウィルスＲＮＡをＡ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Madison高成長変異形（ＰＲ８ＨＧ）の尿膜腔液から抽出した。MMLV-RTase（Promega）及びUni12プライマーを使用して、ｃＤＮＡを合成した。下記のものを用いたＰＣＲによってｃＤＮＡを一晩増幅した：
プライマー・セット

ＤＮＡポリメラーゼ：pfu Native DNAポリメラーゼ（Stratagene）
ＰＣＲ生成物をゲル電気泳動によって分離し、そしてゲル抽出キット（Qiagen）を使用してアガロース・ゲルから抽出した。Takaraライゲーション・キットver.II（Takara）を使用して、抽出された遺伝子をｐＴ７Ｂｌｕｅ平滑ベクター（Novagen)内にライゲートした。５時間後、ライゲートされた遺伝子がＪＭ１０９（ＰＢ２、Ｍ、及びＮＳ遺伝子）又はＤＨ５アルファ（ＰＡ、ＰＢ１、及びＮＰ）に形質転換された。各遺伝子毎に６つのコロニーを８時間にわたってＴＢ中で培養した。バクテリア培地からプラスミドを抽出し、そして１遺伝子当たり４つのクローンを配列決定した。

ｐＴ７Ｂｌｕｅ内のＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳ遺伝子をＢｓｍＢＩ酵素（New England Biolabs）によって切除した。ＰＢ１遺伝子をＢｓａＩ（New England Biolabs）によって切除した。切除された遺伝子を、ＢｓｍＢＩで消化されたヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター及びマウスＲＮＡポリメラーゼＩターミネーターを含有するｐＰｏｌＩＲベクターと一晩ライゲートした。ｐＴ７Ｂｌｕｅ内のＰＢ２遺伝子の前側断片を、ＢｓｒＧＩ（New England Biolabs）及びＢａｍＨＩ（Ｒｏｃｈｅ）によって切除し、そして後側断片をＢｓｒＧＩ（New England Biolabs）及びＳｐｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）によって切除した。切除された断片を混合し、そしてＢｓａＩによって消化させた。６時間後、消化された遺伝子を、ＰＣＲ精製キット（Qiagen）を使用して精製し、そしてｐＰｏｌＩＲベクターのＢｓｍＢＩ部位間で一晩にわたってライゲートした。

ＪＭ１０９（Ｍ及びＮＳ遺伝子）又はＤＨアルファ（ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ遺伝子）を一晩にわたって形質転換するために、ライゲートされたＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳ−ｐＰｏｌＩＲ遺伝子を使用した。形質転換されたバクテリアのコロニーをＬＢ中で一晩培養した。ＪＭ１０９を一晩形質転換するために、ライゲートされたＰＢ２−ｐＰｏｌＩＲ遺伝子を使用した。

プラスミドをバクテリア培地から抽出し、そして遺伝子挿入を酵素消化によって確認した。ＰＢ２−ｐＰｏｌＩＲによって形質転換されたバクテリアのコロニーをＬＢ中で８時間にわたって培養した。プラスミドを次いで抽出し、そして遺伝子挿入を酵素消化によって確認した。ｐＰｏｌＩ構造が望ましくない突然変異を含有しないことを保証するために、全てのｐＰｏｌＩ構造を配列決定した。

ＰＲ８ＨＧに対応するｐＰｏｌＩＲ構造を、Ａ／ＷＳＮ／３３（ＷＳＮ）−ＨＡ及びＮＡ、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／４８３／９７（ＨＫ）−ＨＡａｖｉｒ及びＮＡ、又はＡ／Ｋａｗａｓａｋｉ／０１（Ｋａｗａｓａｋｉ）−ＨＡ及びＮＡＰｏｌＩ構造、及びポリメラーゼ・タンパク質のための４つのタンパク質発現構造、及びＡ／ＷＳＮ／３３のＮＰを有する２９３Ｔヒト胚腎臓細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞から得られた上澄みを連続希釈し（無希釈から１０^-７）、そして９日齢の孵化鶏卵の尿膜腔内に感染させた。感染させた卵の尿膜腔液を収穫し、そしてこれらのウィルス力価をＨＡアッセイによって試験した（表１）。

ＨＡ陽性試料（１０^-２のＷＳＮ−ＨＡＮＡを有するウィルス、及び無希釈のＨＫ−ＨＡａｖｉｒＮＡを有するウィルス）を、１０^-２から１０^-８まで連続希釈し、１００μｌの各希釈液を孵化鶏卵内に感染させた。感染させた卵の尿膜腔液を収穫し、そしてこれらのウィルス力価をＨＡアッセイによって試験した（表２）。プラスミドから調製されたＡ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）の５０％卵感染用量（ＥＩＤ_５０）は１０^{１０．３３}／ｍｌであり、またＨＡ力価は１：３２００であった。

Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／２００３（Ｈ５Ｎ１）に由来するＨＡ及びＮＡ遺伝子、及びＰＲ８ＨＧに由来するＡ型インフルエンザ・ウィルス遺伝子の残りを有する組み換えウィルスを調製した。組み換えウィルスの力価は１０^{１０．６７}／ｍｌであり、またＨＡ力価は１：１６００であった。

ＰＲ８遺伝子の配列：

例２
インフルエンザ・ウィルスＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／２００３（Ｈ５Ｎ１、ＨＫ２１３）は鶏において全身的に複製し、致死的な感染を引き起こす。さらに、このウィルスは、鶏胚にとって致死的である。このように、その表面タンパク質は現在循環している病原性鳥インフルエンザ・ウィルスに大きく関連してはいるが、ＨＫ２１３は、孵化鶏卵内でこれを成長させようという試みが低品質の尿膜腔液を生成することになるため、ワクチン株として使用することはできない。加えて、ワクチン生成におけるこのような高毒性ウィルスの使用は、ワクチン作業者にとって安全でない。マスター・ワクチン株としてＡ／ＰＲ／８／３４を使用することの実現可能性を試験するために、ＨＫ２１３の血球凝集素（ＨＡ）遺伝子の切断部位（複数の塩基性アミノ酸を含有する）を、毒性表現型から無毒表現型へ（ＲＥＲＲＲＫＫＲ（ＳＥＱＩＤＮｏ：２９）から----ＴＥＴＲ（ＳＥＱＩＤＮｏ：３０）へ）突然変異させた。突然変異ＨＡ遺伝子を含有するウィルスは、鶏において非致死的な局在化感染をもたらした。加えて、突然変異ウィルスは、鶏胚に対して非致死的であった。このように、孵化卵内の突然変異ウィルスの成長は、高品質の尿膜腔液を産出し、そしてこの弱毒化形態において、ウィルスはワクチン製造者にとって安全である。

ノイラミニダーゼ（ＮＡ）及びＨＫ２１３に由来する突然変異ＨＡ遺伝子、及び高力価Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１、ＨＧ−ＰＲ８）ウィルス（例１）に由来する残りの全ての遺伝子を含有する、卵内の他のＡ／ＰＲ／８／３４ＰＲ８株よりも１０倍良好に成長する（１０^１０ＥＩＤ_５０／ｍｌ；ＨＡ力価：１：８，０００）組み換えウィルスを、孵化鶏卵内で発生させた。現在循環している病原性鳥インフルエンザ・ウィルスに関連する表面タンパク質を発現させるこの組み換えウィルスは、孵化鶏卵内で高力価に成長した（図１）。このように、ＨＧ−ＰＲ８のＨＡ及びＮＡ遺伝子の代わりに、現在循環しているインフルエンザ・ウィルス株を使用する結果、安全に生成することができるワクチン株をもたらし、そしてＰＲ８−ＨＧのマスター・ワクチン株としての使用を実証する。

例３
１９９７年香港において、高病原性Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザ・ウィルスが鳥からヒトへ直接伝染し、１８件の感染が確認され、６名が死亡するに至った（Subbarao他、1998；Claas他、1998）。２００４〜６年には、Ｈ５Ｎ１ウィルスの地理的分布はアジアにおいて拡大し、いくつかの隣接するヨーロッパの国々及びアフリカに広がった。全体で、ウィルスに感染した９６名の人々がベトナム、タイ、カンボジア、インドネシア、中国、トルコ、及びイラクで死亡した（Li他、2004；WHO）。汎流行病のこのような致命的な発生及び持続する脅威が、ヒトに使用するためのＨ５Ｎ１ウィルス・ワクチンの開発をもたらした。しかし、病原性Ｈ５Ｎ１ウィルスは孵化鶏卵内ではよく成長せず、ワクチン製造者に対する深刻なバイオセーフティの懸念をもたらすので、ワクチン候補を生成するために、逆遺伝技術が利用されている（Subbarao他、2003；Webby他、2004；Stephanson他、2004；Wood & Robertson、2004)。

両方とも病原性Ｈ５Ｎ１株から誘導された修飾無毒型血球凝集素（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子を、卵内で良好に成長する供与体ウィルスに由来する全ての残りの遺伝子と共に有する組み換え（６：２再構築体）ウィルスが、この方法によって生成されるべき候補の中にある。世界保健機関（WHO）は、人体における安全性及び卵内の強い成長により、供与体ウィルスとしてＡ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ５Ｎ１；ＰＲ８）を推奨している（Wood & Robertson、2004；Webby & Webster、2003）。最近、このような組み換えウィルスは、同じＰＲ８「内部」遺伝子（すなわち、ＨＡ及びＮＡ以外の遺伝子）を有しているとしても、野生型ＰＲ８株よりも卵内での成長がよくないことが判った（Horimoto他、2006)。

卵内の強い成長が、下記のように、不活性化ワクチンの生成に使用されるワクチン種ウィルスの必須の特性であるので、卵内でＰＲ８供与体株と同じく良好に成長するＨ５Ｎ１ワクチン候補を生成した。先ず、ＰＲ８と、卵内での成長が悪いＷＳＮ株との間の再構築体分析を用いてこの特性に関与する遺伝子を定義することにより、卵におけるＰＲ８の高成長の分子基盤を見極めた。ＨＡ−ＮＡバランス及びＰＢ１機能が重要な成長決定因子であることが判った。このような知識を持って、ＷＨＯ推奨ＮＩＢＲＧ−１４ウィルスを含むよりコンベンショナルな６：２再構築体に対する卵内の成長を評価するために、ＰＲ８バックグラウンドを有する、ＨＡ−ＮＡの組み合わせを変化させた一連のＨ５Ｎ１ウィルスを生成した。

方法
細胞及びウィルス
１０％ウシ胎仔血清及び抗生物質を含むDulbecco変性イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）中に、２９３Ｔヒト胚腎臓細胞を維持した。Madin-Darbyイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を、５％新生ウシ血清及び抗生物質を含むＭＥＭ中で成長させた。ヒト・ワクチン製造に使用するためのバイオセーフティ試験（Sugawara他、2002）後に樹立されたアフリカミドリザルＶｅｒｏＷＣＢ細胞を、抗生物質を含む無血清ＶＰ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）中に維持した。細胞を５％ＣＯ^２中に３７℃で維持した。ヒトから単離されたＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４及びＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１；ＶＮ１１９４及びＶＮ１２０３）株を、１０日齢孵化鶏卵内で２日間にわたって３７℃で増殖させ、その後、ウィルスを含有する尿膜腔液を収穫し、そして更なる試験のために使用した。これらのウィルスを用いた試験は、バイオセーフティ・レベル３の閉じ込め実験室内で行った。ＷＨＯ推奨ワクチン種ウィルスＮＩＢＲＧ−１４（ＶＮ１１９４／ＰＲ８６：２再構築体ウィルス）は、英国National Institute for Biological Standards and ControlのJohn Wood及びJim Robertson両博士の厚意により贈呈された。

プラスミドの構成及び逆遺伝技術
インフルエンザＡ型ウィルスの再構築体を生成するために、プラスミドに基づく逆遺伝技術（Neumann他、1999）を用いた。ＶＮ１１９４又はＶＮ１２０３に由来するウィルスＲＮＡを、商業的キット（ISOGEN LS, Nippon Gene）を使用することにより、尿膜腔液から抽出し、そして逆転写酵素（SuperScript III；GIBCO-BRL)、及びＨ５ウィルスのＲＮＡセグメントの３’末端のコンセンサス配列を含有するプライマーを使用することにより、ｃＤＮＡに変換した。次いで、完全長ｃＤＮＡを、ProofStartポリメラーゼ（QIAGEN)及びＨ５サブタイプ特異的プライマー対でＰＣＲ増幅し、そしてヒト・ポリメラーゼＩプロモーター及びマウスＲＮＡポリメラーゼＩターミネーター（ＰｏｌＩプラスミド）の制御下でプラスミド内にクローニングし、それぞれＶＮ１１９４又はＶＮ１２０３ＨＡ遺伝子を含有するＰｏｌＩ−ＶＮ１１９４／ＨＡ又はＰｏｌＩ−ＶＮ１２０３／ＨＡ構造を生成した。Horimoto他（2006)に記載されているように、バック−トゥ−バック・プライマー対を使用した逆ＰＣＲ法に続いてライゲーションを行うことによって、無毒型配列（ＲＥＴＲ；ＳＥＱＩＤＮｏ：３１）を形成するために、野生型ＶＮ１１９４又はＶＮ１２０３（ＲＥＲＲＲＫＫＲ；ＳＥＱＩＤＮｏ：２９）ウィルスのＨＡ切断部位配列を変更した。この文献の開示内容を参考のため本明細書中に引用する。Ｎ１特異的プライマーを有するＲＴ−ＰＣＲ処置（上記）によって、ＶＮ１２０３ＮＡ遺伝子を含有するＰｏｌＩ−ＶＮ１２０３ＮＡを構成した。逆ＰＣＲによって、一連のｐＰｏｌＩＮＡ突然変異プラスミドを調製した。ＰｏｌＩ−ＶＮ１２０３ＮＡを鋳型として使用して、ｐＰｏｌＩ−ＮＡｆｉｌｌを構成した。ｐＰｏｌＩ−ＮＡｆｉｌｌは、Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６（Ｈ５Ｎ１；ＧｓＧｄ９６）ＮＡから誘導された、４８−Ｐｒｏと４９−Ｉｌｅとの間のＮＡストーク内への２０アミノ酸（ａａ）（ＣＮＱＳＩＩＴＹＥＮＮＴＷＶＮＱＴＹＶＮ；ＳＥＱＩＤＮｏ．３２）挿入部を含有する突然変異体ＮＡをコードする。各ＮＡサブタイプのストーク領域から誘導されたＮ２（１２ａａ）又はＮ２＋Ｎ９（１２＋１２ａａ）配列が、４２−Ａｓｎと４３−Ｇｌｎとの間のＮＡストーク内に挿入されたｐＰｏｌＩ−ＮＡｆｉｌｌ．Ｎ２及び−ＮＡｆｉｌｌ．Ｎ２Ｎ９を、Castrucci他(1993)に記載されているように構成した。これらの構造の全てを、望ましくない突然変異が存在しないことを保証するために配列決定した。

Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ５Ｎ１；ＷＳＮ）及びＰＲ株から誘導された、前に生成された一連のＰｏｌＩ構造を、逆遺伝技術のために使用した（Horimoto他、2006；Neumann他、1999）。加えてＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／０３（Ｈ５Ｎ１；ＨＫ２１３）、及びＡ／Ｋａｎａｇａｗａ／１７３／２００１（Ｈ１Ｎ１；Ｋａｎａｇａｗａ）から誘導されたＮＡ遺伝子を含有するＰｏｌＩ構造をこの研究に使用した（Horimoto他、2006；Kobasa他、1999；Peiris他、2004）。

鶏βアクチン・プロモーターの制御下でＷＳＮ又はＰＲ８ＮＰ、ＰＡ、ＰＢ１、又はＰＢ２を発現させるプラスミドを、全ての逆遺伝子学試験のために使用した（Horimoto他、2006；Neumann他、1999）。手短に述べると、ＰｏｌＩプラスミド及びタンパク質発現プラスミドを、トランスフェクション試薬Trans-IT 293T（Panvera）と混合し、１５分間にわたって室温でインキュベートし、次いで２９３Ｔ細胞に添加した。トランスフェクトされた細胞を４８時間にわたってOpti-MEM I（GIMCO-BRL)中にインキュベートした。ＶｅｒｏＷＣＢ細胞における逆遺伝子学のために、エレクトロポレーター（Amaxa）を使用することにより、製造業者の指示書に従ってプラスミド混合物をトランスフェクトした。トランスフェクションから１６時間後に、調製されたばかりのＶｅｒｏＷＣＢ細胞を、トランスフェクトされた細胞上に添加し、そしてＴＰＣＫ−トリプシン（１μｇ／ｍｌ）を６時間後に培地に添加した。トランスフェクトされた細胞を全部で４日間にわたって無血清ＶＰ−ＳＦＭ中でインキュベートした。感染性ウィルスを含有する上澄みを収穫し、孵化卵内で限界希釈を行うことによって生物学的にクローニングし、そして更なる試験に使用した。

卵内のウィルス複製の特性
ウィルスを１０日齢の孵化鶏卵の尿膜腔内に接種し、４８時間にわたって３７℃でインキュベートした。０．５％鶏赤血球又は０．８％モルモット赤血球を使用した、又は卵内のＨＡアッセイによって尿膜腔液中のウィルスを滴定することにより、ウィルス１ｍｌ当たりのメディアン卵感染用量（ＥＩＤ_５０）を見極めた。いくつかのウィルスの場合、ＭＤＣＫ細胞及びＴＰＣＫ−トリプシン（１μｇ／ｍｌ）を用いてプラーク滴定を実施した。１０^４ＥＩＤ_５０のウィルスを接種した後、いくつかのウィルスの成長動態を卵内で評価した。

鶏赤血球からのウィルス溶離アッセイ
ＨＡ力価１：１０２４を含有するウィルスの２倍希釈液５０μｌを、０．５％鶏赤血球５０μｌと共に１時間にわたって４℃でマイクロタイター・プレート内でインキュベートした。プレートを次いで３７℃で貯蔵し、ＨＡ力価の低減を定期的に記録した。６．８ｍＭＣａＣｌ_２を有するリン酸緩衝生理食塩水を希釈剤として使用した。

結果
鶏卵におけるＰＲ８の高成長特性の分子基盤
逆遺伝子学に基づくＨ５インフルエンザ・ワクチンを生成するための供与体ウィルスとして使用するために、ＰＲ８がＷＨＯによって推奨されているが、その高成長特性の分子基盤は十分には理解されていない。Ｍ遺伝子は、卵内のＰＲ８の強い成長に関与すると言われているが（Subbarao他、2003）、しかしこの主張は、発表されたオリジナル・データ（Kilbourne他、1969）には一見したところ見いだされない。従って卵内の成長が悪いＷＳＮ株を使用して、再構築体分析を行った。表３は、孵化鶏卵におけるウィルス成長に関して、ＰＲ８対ＷＳＮ株のＨＡとＮＡとの適合性を示す。全ての再構築体試験ウィルスは、野生型ＷＳＮよりも良好に成長するが、しかし卵適応ＰＲ８よりも成長が良くない。このことは表面糖タンパク質及び内部タンパク質の両方が、ＰＲ８の高成長特性に関与していることを実証する。

ＰＲ８糖タンパク質の両方、及びＷＳＮから誘導された６種全ての内部タンパク質を含有する再構築体ウィルスの成長は、ＰＲ８と比較して卵内で大幅に低減された（表３及び４）ので、この特性に関与する内部タンパク質を定義するために一連の再構築体ウィルスを生成した。ＷＳＮＰＢ１、及びＰＲ８に由来する全ての残りの遺伝子を含有する単一遺伝子再構築ウィルスは成長が悪く、内部タンパク質をコードするＷＳＮ遺伝子の全てを含有する再構築体と同様の成長レベルであるのに対して、ＰＲ８ＰＢ１、及び全ての残りの内部タンパク質をコードするＷＳＮ遺伝子を含有する再構築体は、高力価に複製した（表４）。このように、この役割にＭセグメントが関係しているとみなしている以前の報告（Subbarao他、2003）とは対照的に、ＰＲ８ＰＢ１が卵内のウィルス・ゲノム複製のための最適なポリメラーゼ活性を有していると思われる。

鶏卵内で高められた成長能力を有するＨ５Ｎ１ワクチン種候補の生成
以前の研究において、卵内のＷＳＮの成長は、ＮＡ機能を増大させるためにＮＡストークを長くすることによって高められる、すなわちストークが長ければ長いほど、ウィルスの複製がより良好に行われることが示された（Castrucci他、1993）。この発見は、ＰＲ８バックグラウンドと共に突然変異又は異種Ｎ１を含んでなる一連のＨ５Ｎ１ワクチンの生成、及び卵内のこれらの成長の比較を促した。Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１；ＶＮ１２０３）ＮＡは、ストーク領域内に２０アミノ酸（２０−ａａ）末梢部を含有する（すなわち、ストーク内に２４ａａ）。従って、前駆体ウィルスＡ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６（Ｈ５Ｎ１）（Xu他、1999）と同様に４４−ａａストークを含有する突然変異体ＮＡ、ＶＮ１０２３ｆｉｌｌ、並びに他のＮＡ突然変異体、すなわち、より長いストーク、５８−及び７２−ａａをそれぞれ含有するＶＮ１０２３ｆｉｌｌ．Ｎ２及びＶＮ１０２３ｆｉｌｌ．Ｎ２Ｎ９を構成した（図２）。ストーク内に４４−ａａを含有するＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／０３（Ｈ５Ｎ１；ＨＫ２１３）に由来する異種Ｎ１も試験した。Ｈ１Ｎ１株、例えば、全てストーク内に２４ａａを有するＰＲ８、Ａ／Ｋａｎａｇａｗａ／１７３／２００１（Ｈ１Ｎ１；Ｋａｎａｇａｗａ）、及びＷＳＮに由来するＮＡも試験した。これらのＮＡ構造を使用して、全部で８種の再構築体ウィルス、すなわち、修飾無毒型ＶＮ１２０３ＨＡ及びＰＲ８バックグランドを有する７種の６：２及び１種の７：１再構築体を生成した（表５）。修飾無毒型Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１；ＶＮ１１９４）ＨＡを有する別の一連の再構築体ウィルスを構成した。親ＶＮ１２０３ＮＡを含有する構造と比較することにより７：１再構築体ウィルス、及び修飾されたＶＮ１１９４ＨＡとＶＮ１２０３ｆｉｌｌＮＡとの組み合わせを含有する６：２再構築体だけが、卵内の成長の向上を示した。

ストック・ウィルスのプラーク・アッセイによって、選択された再構築体ウィルスをさらに試験することにより、ＰＲ８ＮＡを含有する再構築体ウィルスが、卵適応ＰＲ８ほど良好に成長することはないものの、親ＶＮ１２０３ＮＡを含有するウィルスと比較して３倍超高い力価（ｐ＝０．００３、スチューデントｔ検定）を示した（図３）。卵内のＰＲ８、ＶＮ１２０３ｆｉｌｌ、又はＶＮ１２０３ＮＡを有する再構築ウィルスの成長動態を評価することにより、ＰＲ８ＮＡ（７：１再構築体）を有するウィルスの高い成長速度が明らかになった（図４）。

７：１再構築体ウィルスにおいて観察された高成長特性の分子基盤を見極めるために、鶏赤血球からのウィルス溶離を評価するアッセイによって、再構築体ウィルスのＮＡ機能を試験した（図５）。ＰＲ８又はＶＮ１２０３ｆｉｌｌＮＡを含有する再構築体ウィルスが、親ＶＮ１２０３ＮＡを有する再構築体ウィルスよりも急速に赤血球から溶離され、このことは、ＰＲ８又はＶＮ１２０３ｆｉｌｌＮＡのＮＡ活性がより大きいことを示す。これらの結果は、高いＮＡ機能が卵内のウィルス成長を促進するという考え（Castrucci他、1993）を支持する。

この研究で生成されたＨ５Ｎ１ワクチン種候補と、卵内のＷＨＯ推奨ワクチン種ウィルスＮＩＢＲＧ−１４との成長比較
Ｈ５Ｎ１ワクチンの生成における候補種ウィルスの潜在能力の有効性を確認するために、これらの感染価を、同じ試験条件下でＷＨＯ提供のＮＩＢＲＧ−１４ウィルスの感染価と比較した。ＶＮ１１９４又はＮＶ１２０誘導型ＨＡ、及びＰＲ８株に由来する全ての他の遺伝子を含有する７：１再構築体ウィルスは、ＥＩＤ_５０（表６）及びプラーク滴定（図６）によって評価して、卵内のＮＩＢＲＧ−１４ウィルスよりも著しく高い力価（ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）を示した。興味深いことに、ＶＮ１１９４ウィルスに由来するＨＡ及びＮＡの両方を含有する６：２再構築体ウィルスでさえ（またＶＮ１１９４／ＰＲ８６：２再構築体ウィルスも）、プラーク滴定（図５）によって測定して、ＮＩＢＲＧ−１４よりも著しく良好に（約７倍、ｐ＝０．０４７）成長した。同一のＶＮ１１９４ＨＡ及びＮＡを有する２種の６：２再構築体ウィルスの成長の差は、この研究で使用されるＰＲ８株が、卵内のワクチン生成中の高いウィルス成長を支援するためのＮＩＢＲＧ−１４を生成するために使用されるＰＲ８株よりも優れていることを示す。

考察
両方ともＨ５Ｎ１ヒト単離体から誘導された修飾無毒型ＨＡ及びＮＡ遺伝子と、ＰＲ８株に由来する全ての残りの遺伝子とを有する組み換えウィルス（６：２再構築体）が生成されており、そして、ヒト臨床試験において今や試験されようとする不活性インフルエンザ・ワクチンのための種ウィルスとして使用されている（Wood & Robertson、2004)。このように使用される種株は、孵化卵内で良好に成長しなければならない。卵適応ＰＲ８はこの要件を満たすが、いくつかの６：２再構築体ウィルスは、ＰＲ８に由来する６種の内部遺伝子を含有しているにもかかわらず、卵内ではよく成長しない（表３及び５）。ここで、鶏卵内の卵適応ＰＲ８の成長が、ＨＡ及びＮＡ表面糖タンパク質の機能バランスによって影響を受けることが実証される。

ＰＲ８バックグラウンド、及び高病原性鳥ウィルスに由来する表面糖タンパク質を有するいくつかの６：２再構築体ウィルスの低い収率は、卵内の成長に対するＨＡ−ＮＡ機能アンバランスから生じるだけでなく、鳥表面糖タンパク質とＰＲ８に由来する内部遺伝子との遺伝的（及び／又は機能的）不適合性から生じるものと考えられる。ここでは、ここでは、ＰＲ８の内部遺伝子の中で、卵内の高い成長に関してＰＢ１が極めて重要である。この情報は、逆遺伝技術に基づくＨ５Ｎ１ワクチン生成のための別の戦略を示唆する。すなわち、ワクチン種ウィルスのための、強く成長する再構築体を生成するためには、ＰＢ８ＰＢ１遺伝子単独で十分である場合がある。このように、ＰＲ８以外の株から非ＰＢ１内部タンパク質をコードする遺伝子を使用することにより、鳥ウィルスとＰＲ８ウィルスとの遺伝的不適合性が回避されるかもしれない。卵内のＰＢ８ＰＢ１の高成長特性の分子基盤を分析するための研究は、相当に重要となる。例えば、ＰＢ８のＰＢ１又はＰＢ１−Ｆ２とＷＳＮとの間の構造的及び機能的相違（それぞれアミノ酸が１８個及び１０個だけ異なる；Chen他、2004）を分析することもできるはずである。

この研究で生成された７：１再構築体ウィルスは、ＷＨＯ推奨６：２再構築体ウィルスＮＩＢＲＧ−１４よりも著しく良好に（プラーク滴定で測定して２０倍超）複製した。起源のＰＲ８株を除いてＮＩＢＲＧ−１４と同一の６：２再構築体でさえ、推奨ウィルスよりも７倍良好に複製した。これらの発見は、この研究において使用されたＰＲ８株が、逆遺伝技術に基づく汎流行病ワクチンの生成のための優れた供与体ウィルスであり得ることを示唆している。

（ＰＲ８及び高病原性ウィルスの双方がＮ１ＮＡを含有するとしても）７：１再構築体ウィルスがＮＡタンパク質内の抗原性の差異により防御免疫応答の損失を引き起こすことが論議され得る（Murphy他、1972；Kilbourne他、1968；Chen他、2000）。しかし、ＨＡは不活性化ワクチン中の主要な防御抗原であるので、ＰＲ８ＮＡによって与えられるより高い成長特性が、このような少量の防御抗原における限られた抗原性不一致を相殺すると思われる。高病原性鳥インフルエンザ・ウィルスによって引き起こされる汎流行病の場合、鶏卵が不足することになる。このような条件下では、卵内に高められた成長特性を有する７：１再構築体に基づくワクチン種ウィルスが、逆遺伝技術に基づくＨ５ワクチン・ウィルスの生成のための魅力的な選択肢を提供することが提案される。

例４
孵化鶏卵内のＨ５Ｎ１ワクチン種ウィルスの高い成長速度に関与する遺伝子を同定するために、孵化鶏卵内にＰＲ８（ＵＷ）又はＰＲ８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）内部遺伝子を有する再構築体Ｈ５Ｎ１ウィルスの成長を評価した（図７）。再構築体ウィルス全てのＨＡ及びＮＡ遺伝子は、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００２から誘導された。全てのその他の遺伝子は、ＮＩＢＲＧ−１４ワクチン株の非ＨＡ及び非ＮＡ遺伝子をも提供するＰＲ８（ＵＷ）又はＰＲ８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）から誘導された。内部遺伝子の大部分がＰＲ８（ＵＷ）に由来するときには、より高い力価が得られた。

孵化鶏卵内のウィルスの成長に対するＭ及びＮＳ遺伝子の効果を図８に示す。ＰＲ８（ＵＷ）／１１９４−ＣａｍＭ及びＰＲ８（ＵＷ）／１１９４−ＣａｍＮＳの場合、Ｍ及びＮＳ遺伝子セグメントはそれぞれＰＲ８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）から誘導されたのに対して、他の内部セグメントはＰＲ８（ＵＷ）に由来した。ＨＡ及びＮＡセグメントは、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４から誘導された。ＰＲ８（ＵＷ）のＭ遺伝子セグメント及びＰＲ８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）のＮＳ遺伝子によって、最高力価が得られた。

図７〜８の結果は、ポリメラーゼ・サブユニット（ＰＡ、ＰＢ１、及びＰＢ２）及びＰＲ８（ＵＷ）のＮＰ遺伝子が、孵化鶏卵内のＨ５Ｎ１ワクチン種ウィルスの成長を向上させたことを示している。また、ＰＲ８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）のＮＳ遺伝子も、孵化鶏卵内のＨ５Ｎ１ワクチン種ウィルスの成長を向上させた。

ＭＤＣＫ細胞内のＨ５Ｎ１ワクチン種ウィルスの高い成長速度に関与する遺伝子及びアミノ酸を同定するために、ＭＤＣＫ細胞内のＰＲ８（ＵＷ）／１１９４及びＮＩＢＲＧ−１４ウィルスの成長を評価した。図９のデータは、ＰＲ８（ＵＷ）／１１９４の成長がＭＤＣＫ細胞内のＮＩＢＲＧ−１４の成長よりも著しく良好であったことを示している。さらに、ＰＲ８（ＵＷ）のＰＢ２セグメントは、ＭＤＣＫ細胞内のワクチン種ウィルスの成長を向上させた（図１０）。ＰＲ８（ＵＷ）のＰＢ２中の位置３６０におけるチロシン残基は、ＭＤＣＫ細胞内のワクチン種ウィルスの高い成長速度に関与すると考えられる（図１１）。

ＭＤＣＫ細胞内のＨ５Ｎ１ワクチン種ウィルスの高い成長に関与する遺伝子の組み合わせを同定するために、種々異なるＨＡ、ＮＡ、及びＮＳ遺伝子を有する再構築体の、ＭＤＣＫ細胞内の成長速度を測定した。ＰＲ８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）に由来するＮＳ及び長いストークを有するＮＡ（例えばＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／２１３／２００３又はＶＮ１２０３Ｆｉｌｌに由来する）が、ＭＤＣＫ細胞内のウィルス成長を向上させた（図１２）。

ＮＳ中のどのアミノ酸が、ＭＤＣＫ細胞中のＨ５Ｎ１ワクチン種ウィルスの成長速度に関与するかを見極めるために、異種ＮＳセグメントを含有するＨ５Ｎ１ワクチン種ウィルスのＭＤＣＫ細胞中の成長を測定した。ＮＳ１の位置５５でＫ［ＰＲ８（ＵＷ）ＮＳ］からＥ［ＰＲ８（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）］へアミノ酸置換することによって、ＭＤＣＫ細胞中のＨ５Ｎ１ワクチン種ウィルスの成長を向上させた（図１３）。

図１４は、孵化鶏卵又はＭＤＣＫ細胞内の高成長能力を有するＨ５Ｎ１ワクチン種ウィルスの遺伝子型を要約する。

全ての刊行物、特許明細書、及び特許出願明細書を参考のために本明細書中に引用する。本明細書において或る好ましい実施態様と関連して本発明を記述し、また多くの詳細を例示の目的で説明してきたが、当業者には明らかなように、本発明は更なる実施態様を受け入れることができ、また、本明細書中に記載した詳細のうちの或るものを、本発明の基本原理を逸脱することなしに大幅に変化させることができる。

Claims

再構築体インフルエンザ・ウィルスのための複数のインフルエンザ・ウィルス・ベクターを含んでなる組成物であって、
ａ）転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＰＡｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるｖＲＮＡ生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＰＢ１ｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるｖＲＮＡ生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＰＢ２ｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるｖＲＮＡ生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＨＡｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるｖＲＮＡ生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＮＰｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるｖＲＮＡ生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＮＡｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるｖＲＮＡ生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＭｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるｖＲＮＡ生産用ベクター、及び転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＮＳｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるｖＲＮＡ生産用ベクター、ここで、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳに対応するｃＤＮＡは、配列番号１〜６によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも９７％の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳの配列を有し、ＨＡに対応するｃＤＮＡは、異種ＨＡの配列を有し、ここで、ＮＳに対するｃＤＮＡは、位置５５にＧｌｕ残基を有し、そしてＮＡに対応するｃＤＮＡは、異種ＮＡの配列を有するか又は配列番号８によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも９５％の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする、ＨＡとＮＡの両者が異種である場合、それらは異なる単離物に由来する；並びに
ｂ）インフルエンザ・ウィルスＰＡをコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスＰＢ１をコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスＰＢ２をコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、及びインフルエンザ・ウィルスＮＰをコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、並びに任意には、インフルエンザ・ウィルスＨＡをコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスＮＡをコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスＭ１をコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスＭ２をコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、又はインフルエンザ・ウィルスＮＳ２をコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、
を含んでなる、組成物。
前記プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、Ｔ３プロモーター又はＴ７プロモーターである、請求項１に記載の組成物。
前記ＨＡがＡ型ＨＡであるか又はＢ型ＨＡである、請求項１に記載の組成物。
前記ＨＡがＨ５である、請求項１に記載の組成物。
前記ａ）の複数の該ベクターが、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、又はＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む、請求項１に記載の組成物。
前記ｂ）の該ベクターの全てが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む、請求項１に記載の組成物。
前記ａ）の各ベクター又は前記ｂ）の各ベクターが別個のプラスミド上にある、請求項１に記載の組成物。
前記ＮＡ又はＨＡがキメラＮＡ又はＨＡである、請求項１に記載の組成物。
前記ＨＡに対応するｃＤＮＡは、ＳＥＱＩＤＮｏ．７によってコードされるポリペプチドに対応するポリペプチドをコードしない、請求項１に記載の組成物。
前記ＮＡ内のストークが２０超のアミノ酸長である、請求項１に記載の組成物。
前記ＨＡが無毒形Ｈ５ＨＡである、請求項１に記載の組成物。
前記ＮＡに対応するｃＤＮＡは、配列番号８によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも９７％の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の組成物。
前記ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ、及びＮＳに対応するｃＤＮＡは、配列番号１〜６、及び８によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも９９％の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ、及びＮＳの配列を有する、請求項１に記載の組成物。
前記ＮＳに対応するｃＤＮＡは、配列番号３８によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも９７％の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の組成物。
前記ＮＡは、Ｎ１である、請求項１に記載の組成物。
インフルエンザ・ウィルスの製造方法であって、細胞を、感染性インフルエンザ・ウィルスを産出するために有効な量の、
ａ）転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＰＡｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるｖＲＮＡ生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＰＢ１ｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるｖＲＮＡ生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＰＢ２ｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるｖＲＮＡ生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＨＡｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるｖＲＮＡ生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＮＰｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるｖＲＮＡ生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＮＡｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるｖＲＮＡ生産用ベクター、転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＭｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるｖＲＮＡ生産用ベクター、及び転写終結配列に結合されたインフルエンザ・ウィルスＮＳｃＤＮＡに作用結合されたプロモーターを含んでなるｖＲＮＡ生産用ベクター、ここで、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳに対応するｃＤＮＡは、配列番号１〜６によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも９７％の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳの配列を有し、ＨＡに対応するｃＤＮＡは、異種ＨＡの配列を有し、ここで、ＮＳに対するｃＤＮＡは、位置５５にＧｌｕ残基を有し、そしてＮＡに対応するｃＤＮＡは、異種ＮＡの配列を有するか又は配列番号８によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも９５％の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする、ＨＡとＮＡの両者が異種である場合、それらは異なる単離物に由来する；並びに
ｂ）インフルエンザ・ウィルスＰＡをコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスＰＢ１をコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスＰＢ２をコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、及びインフルエンザ・ウィルスＮＰをコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、並びに任意には、インフルエンザ・ウィルスＨＡをコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスＮＡをコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスＭ１をコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、インフルエンザ・ウィルスＭ２をコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、又はインフルエンザ・ウィルスＮＳ２をコードするＤＮＡセグメントに作用結合されたプロモーターを含んでなるウィルス・タンパク質生産用ベクター、
と接触させることを含む、インフルエンザ・ウィルスの製造方法。
前記該ウィルスを単離することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
請求項１７に記載の方法によって得られたウィルス。
孵化卵内で高力価に複製するインフルエンザ・ウィルスに由来するＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＡのウィルス・セグメントと、配列番号１〜５、及び８によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも９７％の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドの配列と、位置５５にＧｌｕ残基を有するＮＳのウィルス・セグメントと、異種ＨＡのウィルス・セグメントとを含む、単離された組み換えインフルエンザ・ウィルス。
前記高力価に複製する該インフルエンザ・ウィルスがＰＲ８ＨＧである、請求項１９に記載の単離された組み換えインフルエンザ・ウィルス。
前記ＨＡの該ウィルス・セグメントがＨ５に対応する、請求項１９に記載の単離された組み換えインフルエンザ・ウィルス。
医薬として使用するための請求項１８〜２１のいずれか１項に記載のウィルス。
不活性化インフルエンザ・ウィルス・ワクチンの製造における請求項１８〜２２のいずれか１項に記載のウィルスの使用。
該個体を免疫化するために有効な医薬の製造における請求項１８〜２２のいずれか１項に記載のウィルスの使用。
前記ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳに対応するｃＤＮＡは、配列番号１〜６によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも９９％の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳの配列を有する、請求項１に記載の組成物。
前記ＮＡに対応するｃＤＮＡは、異種ＮＡの配列を有する、請求項２５に記載の組成物。
前記ＮＡに対応するｃＤＮＡは、配列番号８によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも９５％の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項２６に記載の組成物。
前記ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳに対応するｃＤＮＡは、配列番号１〜６によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも９９％の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳの配列を有する、請求項１６に記載の方法。
前記ＮＡに対応するｃＤＮＡは、異種ＮＡの配列を有する、請求項２８に記載の方法。
前記ＮＡに対応するｃＤＮＡは、配列番号８によりコードされる対応ポリペプチドに少なくとも９５％の隣接アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項２８に記載の方法。