CN105263954A - H5流感的人类适应 - Google Patents

Abstract

本申请案涉及H5流感的人类适应。本发明尤其提供用于检测、治疗和/或预防流感传播和/或感染的技术和方法。本发明还提供用于监测对人类适应的突变具有特定敏感性程度的流感HA变异体的技术。

Description

H5流感的人类适应

相关申请案的交叉参考

本申请案要求2013年2月7日提交的美国临时申请案第61/762,103号的优先权，所述申请案的内容以全文引用的方式并入本文中。

政府支持

本发明在政府支持下在由美国国家卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的合同号R37GM057073下进行。政府具有本发明中的某些权利。

背景技术

流行性感冒(通常被称为流感)是一种由通常感染禽类和哺乳动物的RNA病毒引起的感染性疾病。禽流感(包括H5N1病毒株)是一种高度传染性并潜在致命的病原体，但目前其仅具有有限的感染人类的能力。然而，已知禽流感病毒会积累可改变宿主特异性并潜在地允许人类感染的突变。上个世纪的主要流感大流行中有两次起源于禽流感病毒，所述禽流感病毒改变了其基因组成从而允许人类感染。

鉴于流感病毒的不断进化，所担忧的是，当前的禽流感病毒株可能积累了改变其宿主特异性并允许其感染人类的突变。在2005年，禽流感大流行的代价很可能是相当大的；此类大流行的威胁使得各国政府花费数十亿美元来试图研发管理并对抗潜在大流行的策略。因此，改进的预测高风险流感病毒株的监测技术和方法可在预防人类大流行风险或使人类大流行风险降到最低的方面具有价值。已充分认识到需要开发用于治疗和/或预防尤其人类的流感感染的治疗剂(具体来说包括疫苗)。还需要用于鉴别和/或表征新出现的病毒株和其感染性特征的改进的监测技术。

发明内容

本发明提供用于检测、治疗和/或预防流感传播和/或感染的组合物和方法。

在一些实施例中，本发明提供用于治疗或预防尤其人类的流感感染和/或传播的治疗剂，如疫苗组合物。举例来说，本发明描述HA多肽，且尤其提供H5HA多肽，其氨基酸序列展示出与参考HA(例如参考H5)或其相关部分的较高序列一致性程度，但在存在或不存在特定定义的序列特点方面有所不同。一般来说，参考HA是并不介导显著人类感染和/或传播的HA(例如当在一或多种已确立或描述的用于评估此类人类感染和/或传播的分析系统中测试时)。在一些实施例中，所提供的HA多肽是介导人类感染和/或传播的HA多肽。在一些实施例中，所提供的HA多肽展示出与已知会介导此类人类感染和/或传播的参考HA的人类感染和/或传播特征可比的人类感染和/或传播特征。

因此，本发明提供特定HA多肽和其相关片段、含有其的组合物以及制造或使用其的方法。

本发明还提供检测所提供的HA多肽和片段(例如通过直接与其结合来检测)的药剂。在一些实施例中，此类检测剂为或包含直接结合于一或多种所提供的HA多肽的抗体。在一些实施例中，检测剂在特定所提供的HA多肽与一或多种参考HA之间进行区分。在一些实施例中，检测剂甚至在所提供的HA多肽序列与参考HA序列的不同之处仅在于存在或不存在一或多种如本文阐述的特点时也在特定所提供的HA多肽和一或多种参考HA之间进行区分；在一些此类实施例中，检测剂在诊断试剂盒、制造疫苗组合物的方法之间进行区分。在一些实施例中，结合剂甚至在所提供的HA多肽序列与参考HA序列的不同之处仅在于存在或不存在1、2、3、4或5种此类特点时也在特定所提供的HA多肽与一或多种参考HA之间进行区分。在一些实施例中，结合剂甚至在所提供的HA多肽序列与参考HA序列的不同之处仅在于存在或不存在如本文所述的单一特点时也在特定所提供的HA多肽与一或多种参考HA之间进行区分。

在一些实施例中，本发明提供用于检测、表征和/或监视流感感染的技术和试剂。在一些此类实施例中，所提供的技术和试剂用于检测、表征和/或监视单一个别生物体(例如单一人类)中所存在的流感病毒株。在一些实施例中，所提供的技术和试剂用于检测、表征和/或监视生物体(例如人类)的群体中所存在的流感病毒株。在一些实施例中，所提供的技术和试剂用于检测、表征和/或监视区域或环境中所存在的流感病毒株。

附图说明

图1：图1的图1A-1C示出了示例性H1、H2和H5流行性HA对人类和/或禽类受体的结合概况。A.A/南卡罗来纳(SouthCarolina)/1/1918对人类受体(6′SLN-LN)和禽类受体(3′SLN-LN)的结合亲和力B.A/奥尔巴尼(Albany)/6/1958(Alb58)对人类受体(6′SLN-LN)和禽类受体(3′SLN-LN)的结合亲和力。C.A/加利福尼亚(California)/04/2009对人类受体(6′SLN-LN)和禽类受体(3′SLN-LN)的结合亲和力。图D示出了Viet04H5HA病毒株在LS突变引入人类受体(6′SLN-LN)和禽类受体(3′SLN-LN)之后的结合概况。

图2：示出了在代表性H2受体结合位点与代表性H5受体结合位点之间的比较。

图3：展示数种流感亚型的系统发生树。紧密相关的亚型定位于彼此接近的分支上。

图4：图4的图4A和4B展示出随时间推移H5HA病毒株中的特定RBS特点的存在或不存在。A.HA获得两个特定氨基酸变化以匹配随时间推移H2HARBS的特点的禽类和人类H5N1分离株的百分率。B.HA获得氨基酸变化以匹配随时间推移H2HARBS的特点的禽类和人类分离株的百分率。

图5：图5A和5B展示出野生型流感病毒和根据一些实施例突变的型式的结合概况。A.展示野生型Viet04HA与数种受体的剂量依赖性直接结合。B.展示Viet04HA的V2.3变异体与数种受体的剂量依赖性直接结合。应注意，变异体形式定量地转变其结合偏好，即，在与野生型Viet04HA相比时展示出对人类受体(具体来说6′SLN-LN)的高亲和力结合和对禽类受体的最低限度结合。

图6：图A展示出已自然进化以匹配特点1和4的Egy09H5HA的示例性剂量依赖性直接聚糖阵列结合概况。除3′SLN之外，此HA对禽类受体的结合与Viet04的类似。B展示出需要更少氨基酸变化以定量地转变其对人类受体的结合的Egy09的E4.2突变体的示例性剂量依赖性直接聚糖阵列结合。C展示出仅具有两个氨基酸突变Asn-224→Lys/Gln-226→Leu以匹配特点1、2和4的Egy09H5HA的示例性剂量依赖性直接聚糖阵列结合。D展示出具有单一突变Gln226→Leu以匹配特点1、2和4的dkEgy10E5.1突变体的示例性剂量依赖性直接结合。

图7：图7的图7A和7B示出了属于不同病毒株的H5N1LS突变体的剂量依赖性直接聚糖阵列结合；x轴是HA浓度，且y轴是表示为最大信号百分比的结合信号值。A，在158-160位置处天然缺乏糖基化序列子的A/埃及(Egypt)/NAMRU-3/06(Egy06)HA。B，A/鸡/R2/07，其为同样天然缺乏158-160糖基化序列子的属于进化枝2.2.1的代表性新近H5N1HA。

图8：用于了解聚糖受体特异性的构架。α-2-3-和/或α-2-6-连接的聚糖可以采用不同拓扑。根据本发明，HA多肽结合于这些拓扑中的某些的能力赋予其介导不同宿主(例如人类)感染的能力。如此图中图A所示，本发明定义两种尤其相关的拓扑，“锥形”拓扑和“伞形”拓扑。α-2-3-和/或α-2-6-连接的聚糖可以采用锥形拓扑，并且此锥形拓扑是连接于核心的短寡糖或支链寡糖所特有的(不过某些长寡糖也可以采用这种拓扑)。伞形拓扑只可以由α-2-6-连接的聚糖采用(这可能归因于由α-2-6键联中存在的额外C5-C6键提供的构象多样性增加)，并且其主要是由长寡糖或具有长寡糖分支、尤其含有基序Neu5Acα2-6Galβ1-3/4GlcNAc-的支链聚糖采用。如本文所述，HA多肽结合伞形聚糖拓扑的能力能够使其与人类受体结合和/或具有介导人类感染的能力。此图中的图B明确展示如分别由三糖基序-Neu5Acα2-3Galβ1-3/4GlcNAc和Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAc的糖苷扭转角度决定的α-2-3和α-2-6的拓扑。确定参数(.θ.)-这些三糖基序中Neu5Ac的C2原子与后续Gal和GlcNAc糖的C1原子之间的角度以表征所述拓扑。

图9示例性锥形拓扑。此图示出了采用锥形拓扑的某些示例性(但不详尽)聚糖结构。

图10示例性伞形拓扑。此图展示可以采用伞形拓扑的某些示例性(但不详尽)N连接和O连接聚糖结构。

图11示例性伞形拓扑。此图展示可以采用伞形拓扑的某些示例性(但不详尽)O连接聚糖结构。

具体实施方式

HA序列元件1

HA序列元件1是近似对应于在天然流感分离株中发现的许多HA蛋白的残基97-185(其中使用H3HA作为参考指定残基位置)的序列元件。此序列元件具有基本结构：

C(Y/F)PX₁CX₂WX₃WX₄HHP，其中：

X₁为约30-45个氨基酸长；

X₂为约5-20个氨基酸长；

X₃为约25-30个氨基酸长；且

X₄为约2个氨基酸长。

在一些实施例中，X₁为约35-45或约3543或约35、36、37、38、38、40、41、42或43个氨基酸长。在一些实施例中，X₂为约9-15或约9-14或约9、10、11、12、13或14个氨基酸长。在一些实施例中，X₃为约26-28或约26、27或28个氨基酸长。在一些实施例中，X₄具有序列(G/A)(I/V)。在一些实施例中，X₄具有序列GI；在一些实施例中，X₄具有序列GV；在一些实施例中，X₄具有序列AI；在一些实施例中，X₄具有序列AV。在一些实施例中，HA序列元件1包含二硫键。在一些实施例中，此二硫键桥残基对应于位置97和139(基于本文中所用的标准H3编号系统)。

在一些实施例中，并且尤其在H5多肽中，X₁为约42个氨基酸长，和/或X₂为约13个氨基酸长，和/或X₃为约26个氨基酸长。

在一些实施例中，并且尤其在H5多肽中，HA序列元件1具有以下结构：

CYPX_1ASSACX₂WX₃WX₄HHP，其中：

X_1A为约27-42或约32-42或约32-40或约23-38或约28-38或约28-36或约28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸长，且X₂-X₄如上文所述。

在一些实施例中，并且尤其在H5多肽中，HA序列元件1具有以下结构：

CYPX_1ASSACX₂WLIX3_AWX₄HHP，其中：

X_1A为约27-42或约32-42或约32-40或约32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸长，且

X_3A为约23-28或约24-26或约24、25或26个氨基酸长，且X₂和X₄如上文所述。

在一些实施例中，并且尤其在H5多肽中，HA序列元件1是用以下序列延伸(即在对应于残基186-193的位置处)：

NDAAEXX(K/R)

在一些实施例中，并且尤其在H5多肽中，HA序列元件1包括以下序列：

YEELKHLXSXXNHFEK，

其通常在X₁内，并且尤其约在X₁的残基6处开始。

HA序列元性2

HA序列元件2为近似对应于在天然流感分离株中发现的许多HA蛋白的残基324-340(再次使用基于H3HA的编号系统)的序列元件。此序列元件具有以下基本结构：

GAIAGFIE

在一些实施例中，HA序列元件2具有以下序列：

PX₁GAIAGFIE，其中：

X₁为约4-14个氨基酸长或约8-12个氨基酸长或约12、11、10、9或8个氨基酸长。在一些实施例中，此序列元件提供HA0裂解位点，从而允许产生HA1和HA2。

在一些实施例中，并且尤其在H5多肽中，HA序列元件2具有以下结构：

PQRXXXRXXRX_1AGAIAGFIE，其中：

X_1A为约3个氨基酸长；在一些实施例中，X_1A为G(L/I)F。

定义

亲和力：如所属领域中已知，“亲和力”为特定配体(例如HA多肽)与其搭配物(例如HA受体)结合的紧密度的量度。亲和力可以用不同方式测量。在一些实施例中，亲和力通过定量分析(例如聚糖结合分析)测量。在一些此类实施例中，结合搭配物浓度(例如HA受体、聚糖等)可固定为超过配体(例如HA多肽)浓度以便模拟生理条件(例如病毒HA结合于细胞表面聚糖)。可替代地或另外，在一些实施例中，结合搭配物(例如HA受体、聚糖等)浓度和/或配体(例如HA多肽)浓度可改变。在一些此类实施例中，亲和力(例如结合亲和力)可在可比的条件(例如浓度)下与参考物(例如，介导人类感染的野生型HA)相比。

氨基酸残基网络：术语“氨基酸残基网络”用于指多肽链中的一组氨基酸残基，尽管所述氨基酸残基可沿着链彼此分开，但当链采用折叠构型时在空间中彼此成簇接近。蛋白质表面上的氨基酸残基网络在本文中被称作“表面残基网络”：蛋白质内部的那些在本文中被称作“核心残基网络”。

抗体：如本文中所用，术语“抗体”是指特异性结合于特定抗原的免疫球蛋白。所述术语涵盖天然产生的免疫球蛋白(因为其是由对抗原产生反应的生物体产生的)，并且还涵盖合成产生或经工程化的免疫球蛋白。在一些实施例中，所述术语涵盖具有足以赋予特异性结合的免疫球蛋白结构元件的任何多肽。抗体可为单克隆或多克隆。抗体可为任何免疫球蛋白类别的成员，包括人类类别IgG、IgM、IgA和IgD中的任一者。合适的抗体包括(但不限于)人类抗体、灵长类化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人类化抗体、偶联抗体(即偶联或融合于其它蛋白质、放射性标记、细胞毒素的抗体)、小型模块化免疫药物(“SMIPs^TM”)、单链抗体、骆驼抗体以及抗体片段。如本文所用，术语“抗体”还包括完整单克隆抗体、多克隆抗体、单域抗体(例如鲨鱼单域抗体(例如IgNAR或其片段))、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段，只要这些抗体片段展现所需生物活性即可。

抗体片段：如本文中所用，“抗体片段”包括完整抗体的一部分，如抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2以及Fv片段；三功能抗体；四功能抗体；直链抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。术语“抗体片段”还包括像抗体一样通过与特定抗原结合以形成复合物来起作用的任何合成或基因工程化蛋白。举例来说，抗体片段包括经分离的片段、由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段、轻链和重链可变区通过肽连接子连接的重组单链多肽分子(“ScFv蛋白”)以及由模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位。

抗原：“抗原”是抗体所结合的分子或实体。在一些实施例中，抗原为或包含多肽或其部分。在一些实施例中，抗原是由抗体识别的感染物的一部分。

大约：如本文中所用，术语“大约”或“约”在应用于一或多个相关值时是指与所述参考值类似的值。在某些实施例中，除非另行说明或另外从上下文显而易见，否则术语“大约”或“约”是指落入所述参考值的任一方向(大于或小于)25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或1％以下内的一系列值(除了其中所述数目将超过100％的可能值)。

与……相关：术语“与……相关”在本文中用于描述在两个项目或事件之间观察到的相关性。举例来说，如果多肽的存在或含量与感染物的存在或含量相关，那么可以认为所述多肽“与特定感染物相关”。类似地，如果观察到核心RBSN分数的特定集合或模式与特定多肽结构元件(例如折叠)或功能元件的存在相关，那么可以认为所述集合或模式“与所述结构元件或功能元件相关”。

结合：应了解，如本文中所用，术语“结合”通常是指两个或两个以上实体之间或之中的非共价缔合。“直接”结合涉及实体或部分之间的物理接触；间接结合涉及借助于与一或多个中间实体物理接触的物理相互作用。两个或两个以上实体之间的结合可在多种情形中的任一者中加以评估，包括其中相互作用的实体或部分在分离或更复杂系统的情形中进行研究(例如同时共价或以其它方式与载剂实体缔合和/或在生物学系统或细胞中。

生物活性：如本文所用，短语“生物活性”是指在生物系统中并且尤其是在生物体中具有活性的任何试剂的特征。举例来说，认为当投与生物体时对此生物体具有生物作用的试剂具有生物活性。在一些实施例中，当蛋白质或多肽具有生物活性时，共有此蛋白质或多肽的至少一种生物活性的蛋白质或多肽的一部分通常称为“生物活性”部分。

特征部分：如本文所用，术语“特征部分”在最广泛意义上用于指物质中其存在(或不存在)与所述物质的具体特点、属性或活性的存在(或不存在)相关的一部分。在一些实施例中，物质的特征部分为在所述物质中和在共有所述具体特点、属性或活性的相关物质中可见而不在不共有所述具体特点、属性或活性的物质中可见的部分。

特征性流行性特点：如本文所用，术语“特征性流行性特点”是在至少一个参考流行性病毒株中可见而不在至少一个非流行性病毒株中可见的特点。在一些实施例中，特征性流行性特点是在流行性病毒株中通常可见而很少在非流行性病毒株中可见的特点。在一些实施例中，特征性流行性特点展示出在代表性流行性病毒株之中的流行率，其为代表性非流行性病毒株之中观察到的流行率的至少30％。

特征性序列元件：如本文所用，短语“特征性序列元件”是指聚合物中(例如多肽或核酸中)可见的代表聚合物的特征部分的序列元件。在一些实施例中，特征性序列元件的存在与聚合物的具体活性或特性的存在或水平相关。在一些实施例中，特征性序列元件的存在(或不存在)将具体聚合物定义为此类聚合物的具体家族或群组的成员(或非成员)。特征性序列元件通常包含至少两个单体(例如氨基酸或核苷酸)。在一些实施例中，特征性序列元件包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50个或50个以上单体(例如连续连接的单体)。在一些实施例中，特征性序列元件包括由一或多个间隔区隔开的连续单体的至少第一和第二延伸，其长度在共有所述序列元件的聚合物中可能改变或可能不改变。

组合疗法：如本文所用，术语“组合疗法”是指以重叠方案投与两种或两种以上不同医药剂以使个体同时暴露于两种药剂的那些情形。

可比的：如本文所用，术语“可比的”是指彼此可能并非一致但充分类似以允许在其间比较使得可基于所观察到的差异或相似性而合理地得到结论的两种或两种以上药剂、实体、情形、状况组等。所属领域的技术人员将了解，在情形中，在待视为可比的两种或两种以上此类药剂、实体、情形、状况组的任何给定情况中需要何种程度的一致性。

对应于：如本文所用，术语“对应于”常用于指定相关多肽(例如HA多肽)中氨基酸残基的位置/身份。所属领域的技术人员将了解，出于简单化的目的，多肽中的残基通常使用标准编号系统(基于参考相关多肽)指定，因此，举例来说，“对应于”位置190处的残基的氨基酸无需实际上为具体氨基酸链中的第190位氨基酸，而是对应于在参考多肽中位置190处发现的残基；所属领域的技术人员易于了解如何鉴别“对应的”氨基酸。通常，HA多肽中的残基参照标准野生型H3HA指定，且对应于标准野生型H3HA中残基的相关多肽中的参考物使用其所对应的残基的编号描述。

分隔度(degreeofseparationremoved)：如本文所用，一定“分隔度”的氨基酸为对聚糖结合具有间接影响的HA氨基酸。举例来说，一分隔度的氨基酸可以：(1)与直接结合氨基酸相互作用；和/或(2)以其它方式影响直接结合氨基酸与宿主细胞HA受体所缔合的聚糖相互作用的能力；所述一分隔度的氨基酸可以或可以不直接结合于聚糖本身。二分隔度的氨基酸(1)与一分隔度的氨基酸相互作用；和/或(2)以其它方式影响一分隔度的氨基酸与直接结合氨基酸相互作用的能力等。

直接结合氨基酸：如本文所用，短语“直接结合氨基酸”是指与一或多个与宿主细胞HA受体缔合的聚糖直接相互作用的HA多肽氨基酸。

测定：本文所述的许多方法包括“测定”步骤。所属领域的技术人员阅读本发明说明书时将了解，所述“测定”可以利用所属领域的技术人员可用的多种技术中的任一者或经由使用所属领域的技术人员可用的多种技术中的任一者来实现，包括例如本文中明确提及的特定技术。在一些实施例中，测定涉及操纵物理样品。在一些实施例中，测定涉及数据或信息的考量和/或操纵，例如利用被调适成用于执行相关分析的计算机或其它处理单元。在一些实施例中，测定涉及从来源接收相关信息和/或材料。在一些实施例中，测定涉及比较样品或实体与可比的参考的一或多种特点。

剂型：术语“剂型”在本文中用于指待投与患者的治疗组合物的物理上分散的单元。“单位剂型”含有相当于单一剂量的活性剂的量，不过应理解，处方医生可指示多个单位剂型或部分单位剂型作为单一剂量投与。

给药方案：“给药方案”(或“治疗方案”)在所述术语在本文中使用时是通常间隔开时间段向个体个别投与的一组单位剂量(通常是一个以上)。在一些实施例中，给定治疗剂具有推荐的给药方案，其可能涉及一或多个剂量。在一些实施例中，给药方案包含多个剂量，其中的每一者彼此间隔开相同长度的时间段；在一些实施例中，给药方案包含多个剂量以及间隔开个别剂量的至少两个不同时间段。在一些实施例中，给药方案与具体结果、事件或此类的概率相关。

工程化：如本文所用，术语“工程化”描述氨基酸序列已由人选择和/或制造需要人手工作用的多肽。举例来说，工程化HA多肽具有不同于天然流感分离株中所见的HA多肽的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施例中，工程化HA多肽具有与NCBI数据库中所包括的HA多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列。

表达：术语“表达”当关于本文中核酸使用时是指以下事件中的一或多者：(1)产生DNA模板的RNA转录物(例如通过转录进行)；(2)加工RNA转录物(例如通过剪接、编辑、5′帽形成和/或3′端形成进行)；(3)将RNA翻译成多肽；和/或(4)多肽的翻译后修饰。

折叠：术语“折叠”在本文中根据其领域了解的含义使用，指代已采用或可采用三维结构的多肽的结构元件。举例来说，折叠可为或包含一或多个螺旋(例如α-螺旋)和/或一或多个折叠(例如β-折叠)。

折叠组：如本文所用，术语“折叠组”是指由生物体基因组编码的多肽折叠组。如所属领域的技术人员将了解，在一些实施例中，折叠组包括所有编码的多肽折叠；在一些实施例中，折叠组包括所表达多肽中(例如在所有表达的多肽中或在仅在某些条件下(如在某些组织中，在发育的某些时间等)表达的多肽中)所存在的多肽折叠。

聚糖阵列：如本文所用，术语“聚糖阵列”用于指任选地固定在固体支撑物上的一组聚糖。在一些实施例中，聚糖阵列为或包含以有组织的排列或模式存在于在空间上物理分开的两个或两个以上位置的聚糖集合。通常，聚糖阵列将具有至少4、8、16、24、48、96个或数百或数千个分散的位置。一般来说，本发明聚糖阵列可具有多种格式中的任一者。在一些实施例中，聚糖阵列包含排列在单一固体支撑物上的聚糖集合；在一些实施例中，聚糖阵列包含排列在多个分散的固体支撑物(如微粒支撑物)上的聚糖集合(参见例如美国专利申请案第13/087,332号，其以引用的方式并入本文中)。在一些实施例中，聚糖阵列是样品位置彼此隔开50-200微米或更小距离和/或固定的聚糖以纳摩尔到微摩尔范围或纳克到皮克范围存在的微阵列。所属领域中已知的阵列格式包括例如其中每一分散的样品位置具有例如十微米标度的那些。多种支撑物中的任一者可用于聚糖阵列。举例来说，可以用于本发明中的支撑物材料包括疏水性膜，例如硝化纤维素、PVDF或尼龙膜。所述膜为所属领域中众所周知的并且可以从例如英国赫默尔享普斯特德的伯乐公司(Bio-Rad，HemelHempstead，UK)获得。可替代地或另外，上面排列聚糖的支撑物可以包含金属氧化物。合适的金属氧化物包括(但不限于)氧化钛、氧化钽以及氧化铝。所述材料的实例可以从英国多塞特普尔凡西路BH124QH的西格玛-奥德里奇有限公司(Sigma-AldrichCompanyLtd，FancyRoad，Poole，Dorset.BH124QHUK)获得。再者，在一些实施例中，支撑物为或包含金属氧化物凝胶。认为金属氧化物凝胶在既定宏观区域内提供大的表面积以帮助固定含有碳水化合物的分子。根据本发明可以使用的其它或替代性支撑材料包括凝胶，例如二氧化硅凝胶或氧化铝凝胶。所述材料的实例可以从例如德国达姆施塔特的默克集团(MerckKGaA，Darmstadt，Germany)获得。在一些实施例中，聚糖阵列固定于可在正常使用期间抵抗尺寸或形状变化的支撑物上。举例来说，支撑物可以为涂布有适用于排列聚糖的组分材料的载玻片。另外，一些复合材料可以合意地为支撑物提供坚固性。在一些实施例中，聚糖直接连接于支撑物。在一些实施例中，聚糖间接连接于支撑物，例如通过连接于与支撑物连接的连接基团或载体(例如多肽)来连接。在一些实施例中，聚糖共价连接于支撑物；在一些实施例中，聚糖非共价连接于支撑物。在一些实施例中，聚糖可逆地连接于支撑物(例如借助于可裂解连接基团和/或可逆的非共价相互作用)。在一些实施例中，选择聚糖在聚糖阵列中的身份和/或排列，使得可易于评估相关多肽(例如HA多肽)的结合特征。举例来说，在一些实施例中，根据本发明使用的聚糖阵列包括一或多个锥形拓扑聚糖和/或一或多个伞形拓扑聚糖。在一些实施例中，锥形拓扑聚糖和伞形拓扑聚糖在空间上彼此隔开。在一些实施例中，多个锥形拓扑聚糖或多个伞形拓扑聚糖可在空间上定位在一起(但任选地除其它类型聚糖之外)。在一些实施例中，根据本发明使用的聚糖阵列包括一或多个α2-3-连接的聚糖和/或一或多个α2-6-连接的聚糖。在一些实施例中，α2-3-连接的聚糖和α2-6-连接的聚糖在空间上彼此隔开。在一些实施例中，多个α2-3-连接的聚糖或多个α2-6-连接的聚糖可在空间上定位在一起(但任选地除其它类型聚糖之外)。在一些实施例中，所述阵列包括代表在人类HA受体上、且尤其在人类上呼吸道HA受体上发现的约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或95％以上聚糖(例如伞形聚糖，其通常将是α2-6唾液酸化聚糖，尤其是长α2-6唾液酸化聚糖)的聚糖。在一些实施例中，所使用的聚糖阵列包括本文中明确阐述的伞形和/或锥形拓扑聚糖结构中的一些或全部。在一些实施例中，阵列包括至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或95％以上的这些聚糖。

血球凝集素(HA)多肽：如本文所用，术语“血球凝集素多肽”(或“HA多肽”)是指氨基酸序列包括至少一个HA特征序列的多肽。所属领域中已知多种来自流感分离株的HA序列；实际上，美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI)保存有一个到本申请案申请时为止包括9796个HA序列的数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/)。所属领域的技术人员通过参考这一数据库，可以容易地识别通常作为HA多肽和/或作为特定HA多肽(例如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16多肽)或作为介导特定宿主(例如禽类、骆驼、犬、猫、麝猫、环境、马、人类、豹、貂、小鼠、海豹、石貂、猪、虎、鲸等)感染的HA的特征的序列。举例来说，在一些实施例中，HA多肽包括在流感病毒的天然分离株中发现的HA蛋白的约残基97与约185、约324与约340、约96与约100和/或约130与约230之间发现的一或多个特征序列元件。在一些实施例中，HA多肽具有包含如本文中所定义的HA序列元件1和2中的至少一者的氨基酸序列。

H5HA多肽：“H5HA多肽”(在所述术语在本文中使用时)是氨基酸序列包括至少一个作为H5特征且区分H5与其它HA亚型的序列元件的HA多肽。代表性的此类序列元件可通过如所属领域的技术人员将了解的比对来确定。

高亲和力结合：如本文所用的术语“高亲和力结合”是指特定配体(例如HA多肽)结合于其搭配物(例如HA受体)的高紧密度。亲和力可通过任何可用的方法(包括所属领域中已知的那些)测量。在一些实施例中，如果Kd′在结合分析中是约500pM或500pM以下(例如低于约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约90pM、约80pM、约70pM、约60pM、约50pM、约40pM、约30pM、约20pM、约10pM、约5pM、约4pM、约3pM、约2pM等)，那么结合被视为高亲和力。在一些实施例中，如果亲和力对相关多肽比对所选参考多肽强(例如Kd′较低)，那么结合被视为高亲和力。在一些实施例中，如果相关多肽的Kd′与所选参考多肽的Kd′的比率是1∶1或1∶1以下(例如0.9∶1、0.8∶1、0.7∶1、0.6∶1、0.5∶1、0.4∶1、0.3∶1、0.2∶1、0.1∶1、0.05∶1、0.01∶1或0.01∶1以下)，那么结合被视为高亲和力。在一些实施例中，如果相关多肽的Kd′是所选参考多肽的Kd′的约100％或100％以下(例如约99％、约98％、约97％、约96％、约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％或1％以下)，那么结合被视为高亲和力。

宿主：术语“宿主”在本文中用于指其中存在相关多肽的系统(例如细胞、生物体等)。在一些实施例中，宿主是易被特定感染物感染的系统。在一些实施例中，宿主是表达特定相关多肽的系统。

IgE结合位点：“IgE结合位点”是抗原中由抗-抗原IgE分子识别的区域。所述区域必需和/或足以引起(i)抗原结合于IgE；(ii)抗-抗原IgE的交联；(iii)含有表面结合的抗-抗原IgE的肥大细胞的脱颗粒；和/或(iv)过敏性症状(例如组胺释放)的出现。一般来说，通过使抗原或片段暴露于来自过敏性个体(优选地属于待向其投与本发明组合物的物种)的血清来定义特定抗原或抗原片段的IgE结合位点。应认识到，不同个体可能产生会识别同一抗原上的不同表位的IgE。因此，通常需要使抗原或片段暴露于代表性血清样品池。举例来说，当需要在给定抗原或片段中鉴别由人类IgE识别的位点时，优选地从至少5-10个、优选地至少15个对所述抗原展示过敏症的个体合并血清。所属领域的技术人员将深知其它情形中适用的合并策略。

免疫显性：特定表位在其(i)引起观察到的与完整抗原的IgE结合的显著百分率；和/或(ii)在显著百分率的敏感性个体中由IgE识别时被视为“免疫显性”。免疫显性表位通常参考其它观察到的表位定义。举例来说，给定抗原中的所有IgE表位可同时分析(例如通过免疫印迹分析)，且免疫显性表位可通过其强度与其它表位相比来鉴别。通常(但非总是)，免疫显性表位将促成此类研究中观察到的至少10％的结合反应性。可替代地或另外，表位可在其由敏感性个体的血清中显著百分率、优选地至少大多数、更优选地至少约60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的IgE识别时被归类为免疫显性。

经分离：如本文中所使用，术语“经分离”是指如下药剂和/或实体：(i)已与最初产生时与其相关的至少一些组分分离(无论在自然界中和/或在实验环境中)；和/或(ii)通过人工产生。经分离药剂和/或实体可与至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或90％以上的与其最初相关的其它组分分离。在一些实施例中，经分离药剂是超过90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％纯。

长寡糖：出于本发明的目的，寡糖通常在其包括至少一个具有至少四个糖类残基的直链时被视为“长”。

低亲和力结合：如本文所用的术语“低亲和力结合”是指特定配体(例如HA多肽)结合于其搭配物(例如HA受体)的低紧密度。如本文所述，亲和力可通过任何可用的方法(包括所属领域中已知的方法)测量。在一些实施例中，如果Kd′是约100pM或100pM以上(例如高于约200pM、300pM、400pM、500pM、600pM、700pM、800pM、900pM、1nM、1.1nM、1.2nM、1.3nM、1.4nM、1.5nM等)，那么结合被视为低亲和力。在一些实施例中，如果亲和力对相关多肽与对所选参考多肽相比相同或较低(例如Kd′大约相同或较高)，那么结合被视为低亲和力。在一些实施例中，如果相关多肽的Kd′与所选参考多肽的Kd′的比率是1∶1或1∶1以上(例如1.1∶1、1.2∶1、1.3∶1、1.4∶1、1.5∶1、1.6∶1、1.7∶1、1.8∶1、1.9∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或10∶1以上)，那么结合被视为低亲和力。在一些实施例中，如果相关多肽的Kd′是所选参考多肽的Kd′的100％或100％以上(例如100％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、155％、160％、165％、170％、175％、180％、185％、190％、195％、200％、300％、400％、500％、1000％或1000％以上)，那么结合被视为低亲和力。

非天然氨基酸：短语“非天然氨基酸”是指一种实体，其具有氨基酸化学结构(即，错误！对象无法从编辑域码创建。

并且因此能够参与至少两个肽键，但R基团与自然界中所发现的不同。在一些实施例中，非天然氨基酸也可具有不为氢的第二R基团和/或可在氨基或羧酸部分上具有一或多个其它取代。

流行性病毒株：“流行性”流感病毒株为已引起人类群体流行性感染或具有引起人类群体流行性感染的能力的病毒株。在一些实施例中，流行性病毒株已引起流行性感染。在一些实施例中，所述流行性感染涉及跨越多个地区、且尤其跨越(例如通过山脉、水体、作为不同大陆的一部分等)彼此隔开从而感染通常不在其间传递的地区的流行病感染。

多肽：一般来说，“多肽”为一串至少两个彼此通过肽键连接的氨基酸。在一些实施例中，多肽可以包括至少3-5个氨基酸，其各自借助于至少一个肽键与其它氨基酸连接。所属领域的技术人员将了解，多肽有时包括“非天然”氨基酸或仍能够任选地整合到多肽链中的其它实体。

主要存在：如本文所用的术语“主要存在”是指实体(例如氨基酸残基)在群体中在特定位置的存在。举例来说，如果在多肽群体中，特定氨基酸在统计学上以相关群体内的多肽的至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或99％以上存在于特定位置，那么氨基酸可为主要存在。

预防：如本文所用的术语“预防”是指延缓特定疾病、病症或病况的一或多种症状的发作和/或降低其频率和/或严重度。在一些实施例中，以群体为基础评估预防，使得如果在易患特定疾病、病症或病况的群体中观察到所述疾病、病症或病况的一或多种症状的出现、频率和/或强度在统计学上显著降低，那么药剂被视为“预防”所述疾病、病症或病况。

纯：如本文所用，如果试剂或实体实质上不含其它组分，那么其为“纯”的。举例来说，通常认为含有超过约90％特定试剂或实体的制剂为纯制剂。在一些实施例中，试剂或实体为至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％纯。

受体结合位点(RBS)：如本文所用，术语“受体结合位点”或“RBS”包含跨越位置56到73、87-96、127-160和183-230(根据H5HA晶体结构PDBID：2IBX编号)的残基，其包括直接结合氨基酸。

播种潜力：如本文所用，术语“播种潜力”是指介质(例如感染物，如病毒、细菌等)传播感染的可能性。在一些实施例中，播种潜力与介质(例如感染物，如病毒、细菌等)产生变异体后代的能力相关。举例来说，种子病毒株可能具有10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％变异体后代。

短寡糖：出于本发明的目的，如果寡糖在任何直链中具有小于4个或肯定小于3个残基，那么通常认为其为“短”的。

受体结合位点网络(RBSN)：术语“受体结合位点网络”(RBSN)是指作为RBS的一部分被排列在三维空间中以允许在折叠多肽链的情况下彼此相互作用的一组氨基酸残基。氨基酸残基包括在锥样和伞样拓扑中与聚糖受体接触的直接结合氨基酸。

受体结合位点网络(RBSN)囷：如本文所用，术语“受体结合位点网络(RBSN)图”是指捕获RBS中的氨基酸之间的相互作用关系的二维开放式连接性网络图。

受体结合位点网络(RBSN)分数：如本文所用，术语“受体结合位点网络(RBSN)分数”是指如本文中所述，基于多肽中的氨基酸残基与其它氨基酸在其接近空间环境中的相互作用网络的程度(如所述残基侧链与所述多肽中的其它残基侧链相互作用的能力)和/或基于此类相互作用的性质，指定给所述多肽中的氨基酸的分数。举例来说，如本文中所述，RBSN分数在从0(不存在任何网络)到1(最大网络化)之间变化。RBS内的氨基酸的网络越高，其结构上被限制到突变的越多。

物异性：如所属领域中已知，“特异性”为特定配体(例如HA多肽)区别其结合搭配物(例如人类HA受体，并且尤其是人类上呼吸道HA受体)与其它潜在的结合搭配物(例如禽类HA受体)的能力的量度。

实质数值相似性：如本文所用，术语“实质数值相似性”是指数值的差异不超过30％的两个值(例如两个RBSN分数)。

实质序列同源性：短语“实质同源性”在本文中用于指氨基酸或核酸序列之间的比较。如所属领域的技术人员将了解，如果两个序列在对应位置中含有同源残基，那么通常认为其是“实质上同源的”。同源残基可以是一致残基。或者，同源残基可以是适当地具有类似结构和/或功能特征的非一致残基。举例来说，如所属领域的技术人员众所周知的，某些氨基酸通常被归类为“疏水性”或“亲水性”氨基酸，和/或归类为具有“极性”或“非极性”侧链。一种氨基酸取代相同类型的另一种氨基酸常可以被认为是“同源”取代。典型氨基酸分类概述如下：

丙氨酸	Ala	A	非极性	中性	1.8
						精氨酸	Arg	R	极性	正电性	-4.5
天冬酰胺	Asn	N	极性	中性	-3.5
						天冬氨酸	Asp	D	极性	负电性	-3.5
半胱氨酸	Cys	C	非极性	中性	2.5
						谷氨酸	Glu	E	极性	负电性	-3.5
谷氨酰胺	Gln	Q	极性	中性	-3.5
						甘氨酸	Gly	G	非极性	中性	-0.4
组氨酸	His	II	极性	正电性	-3.2
						异亮氨酸	Ile	I	非极性	中性	4.5
亮氨酸	Leu	L	非极性	中性	3.8
						赖氨酸	Lys	K	极性	正电性	-3.9
甲硫氨酸	Met	M	非极性	中性	1.9
						苯丙氨酸	Phe	F	非极性	中性	2.8
脯氨酸	Pro	P	非极性	中性	-1.6
						丝氨酸	Ser	S	极性	中性	-0.8
苏氨酸	Thr	T	极性	中性	-0.7
						色氨酸	Trp	W	非极性	中性	-0.9
酪氨酸	Tyr	Y	极性	中性	-1.3
						缬氨酸	Val	V	非极性	中性	4.2

不明确氨基酸	3字母	1字母
			天冬酰胺或天冬氨酸	Asx	B
谷氨酰胺或谷氨酸	Glx	Z
			亮氨酸或异亮氨酸	Xle	J
未规定或未知的氨基酸	Xaa	X

如所属领域中众所周知，可以使用多种算法中的任一种来比较氨基酸或核酸序列，包括在商业计算机程序中可获得的那些算法，如用于核苷酸序列的BLASTN和用于氨基酸序列的BLASTP、空隙BLAST以及PSI-BLAST。示例性所述程序描述于阿尔丘尔(Altschul)等人，基础局部比对检索工具(Basiclocalalignmentsearchtool)，分子生物杂志(J.Mol.Biol.)，215(3)：403-410，1990；阿尔丘尔等人，酶学方法(MethodsinEnzymology)；阿尔丘尔等人，“空隙BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白质数据库检索程序(GappedBLASTandPSI-BLAST：anewgenerationofproteindatabasesearchprograms)”，核酸研究(NucleicAcidsRes.)，25：3389-3402，1997；巴谢瓦尼斯(Baxevanis)等人，生物信息学：基因和蛋白质分析的实用指南(Bioinformatics：APracticalGuidetotheAhalysisofGenesandProteins)，威利出版社(Wiley)，1998；以及密申纳(Misener)等人(编)，生物信息学方法和方案(BioinformaticsMethodsandProtocols)(分子生物学方法(MethodsinMolecularBiology)，第132卷)，胡马纳出版社(HumanaPress)，1999；所有前述文献均以引用的方式并入本文中。除识别同源序列以外，上述程序通常还指示同源程度。在一些实施例中，如果两个序列中在相关段残基上至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或99％以上的对应残基为同源的，那么认为其为实质上同源的。在一些实施例中，相关段为整个序列。在一些实施例中，相关段为至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少225、至少250、至少275、至少300、至少325、至少350、至少375、至少400、至少425、至少450、至少475、至少500或500个以上的残基。

实质序列一致性：短语“实质一致性”在本文中用于指氨基酸或核酸序列之间的比较。如所属领域的技术人员将了解，如果两个序列在对应位置中含有一致残基，那么通常认为其是“实质上一致的”。如所属领域中众所周知，可以使用多种算法中的任一种来比较氨基酸或核酸序列，包括在商业计算机程序中可获得的那些算法，如用于核苷酸序列的BLASTN和用于氨基酸序列的BLASTP、空隙BLAST以及PSI-BLAST。示例性所述程序描述于阿尔丘尔等人，基础局部比对检索工具，分子生物杂志，215(3)：403-410，1990；阿尔丘尔等人，酶学方法；阿尔丘尔等人，“空隙BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白质数据库检索程序”，核酸研究，25：3389-3402，1997；巴谢瓦尼斯等人，生物信息学：基因和蛋白质分析的实用指南，威利出版社，1998；以及密申纳等人(编)，生物信息学方法和方案(分子生物学方法，第132卷)，胡马纳出版社，1999；所有前述文献均以引用的方式并入本文中。除识别一致序列以外，上述程序通常还指示一致程度。在一些实施例中，如果两个序列中在相关段残基上至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或99％以上的对应残基为一致的，那么认为其为实质上一致的。在一些实施例中，相关段为整个序列。在一些实施例中，相关段为至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少225、至少250、至少275、至少300、至少325、至少350、至少375、至少400、至少425、至少450、至少475、至少500或500个以上的残基。

实质结构相似性：如本文所用，术语“实质结构相似性”是指存在共有的结构特点，如特定氨基酸在特定位置的存在和/或一致性(参见“共有序列同源性”和“共有序列一致性”的定义)。在一些实施例中，术语“实质结构相似性”是指结构元件(例如：环、折叠、螺旋、H键供体、H键接受体、糖基化模式、盐桥和二硫键)的存在和/或一致性。在一些其它实施例中，术语“实质结构相似性”是指原子或部分相对于彼此的三维排列和/或定向(例如：相关试剂与参考试剂之间或之间其中的距离和/或角度)。

治疗剂：如本文所用，短语“治疗剂”是指引发所需生物或药理学效应的任何试剂。

治疗：如本文所用，术语“治疗”是指用于减轻疾病、病症或病况的一或多种症状或方面、延缓其发作、降低其严重程度或发病率或获得其预防的任何方法。可在症状发作之前、期间和/或之后投与治疗。

伞形拓扑：短语“伞形拓扑”在本文中用于指由某些聚糖并且具体来说是由HA受体上的聚糖采用的3维排列。这与具有如图8A和9中所示的“锥形拓扑”的聚糖形成对比。如PCT专利申请案第PCT/US09/30056号和第PCT/US07/18160号中所述，结合于伞形拓扑聚糖是介导人类宿主感染的HA蛋白的特征。伞形拓扑通常仅由α2-6唾液酸化聚糖采用，且是长(例如大于四糖)寡糖所特有的。在一些实施例中，伞形拓扑聚糖是展现实质上类似于图8B中所呈现的结构的三维结构的聚糖。在一些实施例中，伞形拓扑聚糖为图8B中所示的通过氨基酸残基接触HA多肽的聚糖。在一些实施例中，伞形拓扑聚糖为图8B中所示的能够接触和/或特异性结合于氨基酸结合袋的聚糖。在一些实施例中，聚糖结构拓扑是基于参数θ来分类，此参数θ定义为Sia的C₂、Gal的C₁以及GlcNAc的C₁之间的角度。θ＜100°的值表示由α2-3和短α2-6聚糖采用的锥样拓扑。θ＞110°的值表示伞样拓扑，如由长α2-6聚糖采用的拓扑。伞形拓扑的一个实例是由约-60的Neu5Acα2-6Gal键联的φ角提供。在一些实施例中，伞形拓扑聚糖(例如在一位点处)包含比例大于短α2-6(例如单乳糖胺)分支的长(例如多个乳糖胺单元)α2-6寡糖分支。能够采用伞形拓扑的示例性N连接和O连接聚糖结构见于图10和11。在一些实施例中，伞形拓扑聚糖(例如在一位点处)包含的长α2-6寡糖分支是短α2-6(例如单乳糖胺)分支的约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍或大于约50倍。在一些实施例中，HA与伞形拓扑聚糖和/或聚糖诱饵相互作用的独特特征为HA与在非还原性末端处包含唾液酸(SA)和/或SA类似物的聚糖接触。在一些实施例中，寡糖的链长为至少三糖(不包括SA或SA类似物)。

在一些实施例中，伞形拓扑聚糖为具有以下形式的寡糖：

Neu5Aca2-6Sug1-Sug2-Sug3

其中：

(a)Neu5Acα2-6通常(但未必)处于非还原性末端；

(b)Sug1：

(i)为呈α或β构型(常常对于N连接和O连接延伸为β构型，而在O连接于糖蛋白的GalNAcα-情况下为α构型)的己糖(常常为Gal或Glc)或己糖胺(GlcNAc或GalNAc)；

(ii)除Neu5Acα2-6以外没有糖连接于Sug1的任何非还原性位置(除了当Sug1为O连接于糖蛋白的GalNAcα-时)；和/或

(iii)如硫酸盐、磷酸盐、胍、胺、N-乙酰基等非糖部分可以连接于Sug1的非还原性位置(通常为位置6)(例如以改善与HA的接触)；

(c)Sug2和/或Sug3：

(i)为呈α或β构型(常常为β)的己糖(常常为Gal或Glc)或己糖胺(GlcNAc或GalNAc)；和/或

(ii)糖(如Fuc)或如硫酸盐、磷酸盐、胍、胺、N-乙酰基等非糖部分可以连接于Sug2、Sug3和/或Sug4的非还原性位置；

(d)寡糖中任两个糖之间的键联与Neu5Acα2-6键联的间隔可以为1-2、1-3、1-4和/或1-6(通常为1-3或1-4)；和/或

(e)Neu5Acα2-6与O连接于糖蛋白的GalNAcα连接并且其它糖连接于GalNAcα的非还原性末端的结构，例如

(i)Neu5Acα2-6(Neu5Acα2-3Galβ1-3)GalNAcα-

(ii)Neu5Acα2-6(Galβ1-3)GalNAcα-。

仅借助于实例，在一些实施例中，伞形拓扑聚糖是以下形式的寡糖：Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-、Neu5Acα2-6GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3GalNAcβ1-4GlcNAc-、Neu5Acα2-6GlcNAcβ1-3Galβ1-3/4GlcNAc-、Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAcα、Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAcα、Neu5Acα2-6GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAcα、Neu5Acα2-6GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAcα、Neu5Acα2-6GalNAcα-β1-3Galα2-3Neu5Ac、Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3/6GalNAcα、Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3/6GalNAcα、Neu5Acα2-6GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3/6GalNAcα、Neu5Acα2-6GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3/6GalNAcα、Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-6GalNAcα-β1-3Galα2-3Neu5Ac、Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3/6GalNAcα-β1-3/6GlcNAcβ1-4Galα2-3/6Neu5Ac、Neu5Acα2-6GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAc、Neu5Acα2-6GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAcβ1-3/6GalNAc、Neu5Acα2-6GlcNAcβ31-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3/6GalNAc、Neu5Acα2-6Galβ1-3GalNAcβ1-4Galα1-3Galβ1-4Glc、Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc、Neu5Acα2-6Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc、Neu5Acα2-6Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc、Neu5α2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3GalNAccα、Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAcα、Neu5Acα2-6GalNAc(β1-3Gal-)β1-4Galβ1-4Glc、Neu5Acα2-6GalNAc(β1-3Gal-)β1-3Galαl-4Galβ1-4Glc和其组合。

单位剂量：如本文所用的表述“单位剂量”是指经调配用于投与个体的医药组合物的物理上分散的单位。在许多实施例中，单位剂量含有预定数量的活性剂。在一些实施例中，单位剂量含有整个单一剂量的药剂。在一些实施例中，投与一个以上单位剂量以实现总的单一剂量。在一些实施例中，需要或预期需要投与多个剂量以便实现既定作用。单位剂量可为例如含有预定数量的一或多种治疗剂的一定体积的液体(例如可接受的载剂)、呈固体形式的预定量的一或多种治疗剂、含有预定量的一或多种治疗剂的持续释放调配物或药物递送装置等。应了解，单位剂量可含有除治疗剂之外的多种组分。举例来说，可接受的载剂(例如医药学上可接受的载剂)、稀释剂、稳定剂、缓冲剂、防腐剂等可如下文所述包括在内。然而，应了解，本发明的调配物的总日用量通常将由主治医生在合理的医学判断范围内决定。在一些实施例中，对于任何具体个体或生物体的特定有效剂量水平可视多种因素而定，包括所治疗的病症和病症的严重度；所用特定活性化合物的活性；所用的特定组合物；个体的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；投药时间和所用特定活性化合物的排泄速率；治疗持续时间；与所用特定化合物组合或同时使用的药物和/或其它疗法和医疗领域中熟知的类似因素。

疫苗接种：如本文中所用，术语“疫苗接种”是指投与一种打算例如对引起疾病的试剂产生免疫反应的组合物。疫苗接种可在暴露于引起疾病的试剂和/或一或多种症状的出现之前、期间和/或之后投与，且在一些实施例中，在暴露于所述药剂之前、期间和/或之后立即投与。在一些实施例中，疫苗接种包括间隔适当时间的接种疫苗组合物的多次投与。

变异体：如本文中所用，术语“变异体”是指这样的实体：其展示出与参考实体的显著结构一致性，但与参考实体结构上的不同之处在于与参考实体相比一或多种化学部分的存在或水平。在许多实施例中，变异体在功能上也与其参考实体不同。一般来说，具体实体是否被恰当地视为参考实体的“变异体”是基于其与参考实体的结构一致性的程度。如所属领域的技术人员将了解，任何生物或化学参考实体具有某些特征性结构元件。通过定义，变异体是共有一或多种所述特征性结构元件的不同的化学实体。仅举几例，小分子可具有特征性核心结构元件(例如大环核心)和/或一或多个特征性侧位部分，使得小分子的变异体是共有所述核心结构元件和所述特征性侧位部分但在其它侧位部分方面和/或在核心内存在的键的类型(单对双，E对Z等)方面有所不同的一者，多肽可具有包含多个氨基酸的特征性序列元件，所述多个氨基酸在线形或三维空间中相对于彼此具有指定的位置和/或有助于具体生物功能，核酸可具有包含多个核苷酸残基的特征性序列元件，所述多个核苷酸残基在线形或三维空间中相对于彼此具有指定的位置。举例来说，变异体多肽可因氨基酸序列中的一或多个差异和/或共价连接于多肽主链的化学部分(例如碳水化合物、脂质等)中的一或多个差异而不同于参考多肽。在一些实施例中，变异体多肽展示出与参考多肽至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％的总体序列一致性。可替代地或另外，在一些实施例中，变异体多肽并不与参考多肽共有至少一种特征性序列元件。在一些实施例中，参考多肽具有一或多种生物活性。在一些实施例中，变异体多肽共有参考多肽的生物活性中的一或多者。在一些实施例中，变异体多肽缺乏参考多肽的生物活性中的一或多者。在一些实施例中，变异体多肽与参考多肽相比展示出一或多种生物活性水平降低。在许多实施例中，如果相关多肽的氨基酸序列与亲本或参考多肽的氨基酸序列一致但在特定位置有少量序列变化，那么相关多肽被视为所述亲本的“变异体”。通常，与亲本相比，变异体中少于20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％的残基被取代。在一些实施例中，与亲本相比，变异体具有10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个被取代的残基。变异体常具有极小数目(例如少于5、4、3、2或1个)的被取代功能残基(即参与特定生物活性的残基)。此外，与亲本相比，变异体通常具有不超过5、4、3、2或1个添加或缺失，并且常不具有添加或缺失。此外，任何添加或缺失通常均少于约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约10、约9、约8、约7、约6，并且通常少于约5、约4、约3或约2个残基。在一些实施例中，亲本或参考多肽多肽为在自然界中发现的多肽。如所属领域的技术人员将了解，特定相关多肽的多个变异体通常可见于自然界中，尤其当相关多肽是感染物多肽时。

极耐进化簇(VREC)：如本文所用，术语“极耐进化簇”和“VREC”是指展示高RBSN分数和/或对突变的低耐受性的氨基酸残基簇。也就是说，在一些实施例中，VREC簇是突变通常引起多肽结构和/或功能破坏的簇。在一些实施例中，VREC簇残基不具有正的BLOSUM62取代分数。

某些实施例的详细描述

本发明尤其提供与流感传播和/或感染的检测、治疗和/或预防相关的方法和组合物。

流感感染

流感具有流行、传染、复发以及爆发的悠久历史。禽流感(包括H5N1病毒株)是一种高度传染性并潜在致命的病原体，但目前其仅具有有限的感染人类的能力。

流感病毒为RNA病毒，其特征为脂膜包膜含有嵌入病毒粒子膜内的两个糖蛋白，血球凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)。病毒基因组由数种负义单链RNA分子组成。数种蛋白质由病毒基因组编码。神经氨酸酶(NA)是病毒表面糖蛋白，其使来自经感染细胞表面上的碳水化合物部分的末端唾液酸残基裂解，促进后代病毒的释放。血球凝集素(HA)是主要病毒表面糖蛋白之一，且参与病毒对易感细胞表面上的唾液酸的结合(尤普瑞瑟库(Uiprasertkul)等人新发传染性疾病Emerg.Infect.Dis.)11：1036，2005)。

流感HA是病毒粒子上的三聚体。流感HA通过细胞中的病毒感染后以HA0形式合成，所述HA0由细胞蛋白酶在碱性裂解位点裂解成HA1和HA2成熟形式，所述HA1和HA2成熟形式为此表面蛋白的适当功能和病毒生命周期所需。M2蛋白是离子通道蛋白。HA、NA和M2蛋白存在于来源于宿主细胞质膜的病毒包膜中。核糖核蛋白复合物包含与核蛋白(NP)和三种聚合酶(PA、PB1和PB2)缔合的RNA区段。M1蛋白与核糖核蛋白和包膜两者缔合。

每年流感流行在病毒HA和NA蛋白的抗原特性改变时发生。抗原性改变的机制是两方面的：抗原转换，由在宿主细胞的双重感染之后可引起大流行的人类与动物病毒之间的基因重排引起；和抗原漂移，由病毒表面上可引起流感流行的HA和NA蛋白上的小变化引起。

存在16种已知的HA亚型和9种NA亚型，并且不同流感病毒株是基于病毒株的HA和NA亚型的数目来命名。基于氨基酸序列一致性和晶体结构的比较，已将HA亚型划分成两个主要群组和四个较小的进化枝。不同HA亚型未必共有高度的氨基酸序列一致性，但不同HA亚型的整体3D结构彼此类似，具有可以用于达成分类目的的若干细微差异。举例来说，膜远端子域相对于中心α-螺旋的特定取向为一种通常用于判定HA亚型的结构特征(拉塞尔(Russell)等人，2004，病毒学(Virology)，325：287，2004；其以引用的方式并入本文中)。所属领域的技术人员完全熟悉可用于定义和/或区分流感病毒的不同亚型和/或进化枝的序列和其它结构相似性和差异。

迄今为止，十六种HA亚型中仅三种(H1、H2以及H3)已适应于人类感染。已适应于感染人类的HA(例如来自流行性H1N1(1918)和H3N2(1967-68)流感亚型的HA)的一种已报导的特征为与优先结合于α2-3唾液酸化聚糖的其禽类祖细胞相比，其能够优先结合于α2-6唾液酸化聚糖(斯科尔(Skehel)和怀利(Wiley)，2000，生物化学年度评论(AnnuRevBiochem)，69：531；罗格(Rogers)和波尔逊(Paulson)，1983，病毒学，127：361；罗格等人，1983，自然(Nature)，304：76；苏特(Sauter)等人，1992，生物化学(Biochemistry)，31：9609；康诺(Connor)等人，1994，病毒学，205：17；塔姆佩(Tumpey)等人，2005，科学(Science)，310：77；所有这些文献均以引用的方式并入本文中)。

与唾液酸化寡糖(具有α2-3与α2-6键联两者)结合的来自H1(人类和猪)、H2(人类和禽类)、H3(禽类)以及H5(禽类)亚型的HA的若干晶体结构为可得的，并且可在分子水平上了解HA与这些聚糖的不同相互作用中所涉及的特定氨基酸(艾森(Eisen)等人，1997，病毒学，232：19；哈(Ha)等人，2001，美国国家科学院院刊(ProcNatlAcadSciUSA)，98：11181；哈等人，2003，病毒学，309：209；盖博林(Gamblin)等人，2004，科学，303：1838；斯提芬斯(Stevens)等人，2004，科学，303：1866；拉塞尔等人，2006，糖偶联物杂志(GlycoconjJ)，23：85；斯提芬斯等人，2006，科学，312：404；许R(XuR)等人，2010病毒学杂志(JVirol)84(4)：1715；刘J(LiuJ)等人，2009美国国家科学院院刊106(40)：17175，所有这些文献均以引用的方式并入本文中)。

流感感染通过HA经由结合于糖蛋白受体与细胞表面的相互作用介导。HA与HA受体的结合主要由HA受体上的N连接聚糖介导。具体来说，流感病毒粒子表面上的HA识别与细胞宿主表面上的HA受体缔合的唾液酸化聚糖。在识别和结合之后，宿主细胞吞没病毒细胞，且病毒能够复制并产生更多的有待分布到相邻细胞的病毒粒子。已鉴别示例性HA-聚糖相互作用的一些晶体结构并且呈现于表1中：

表1.HA-聚糖复合物的晶体结构

HA-α2-6唾液酸化聚糖复合物是通过将约痕量的ADU63_H3和ADS97_H5和Viet04_H5的HA1亚单元叠加于ASI30_H1_26和APR34_H1_26(H1)上而产生。虽然已公开人类A/爱知/2/68(H3N2)与α2-6唾液酸化聚糖的结构复合物(艾森(Eisen)等人，1997，病毒学，232：19)，但在蛋白质数据库(ProteinDataBank)中无法获得其坐标。使用SARF2(http：//123d.ncifcrf.gov/sarf2.html)程序来获得用于叠加的不同HA1亚单元的结构比对。

HA受体是由靠近受体的HA结合位点的α2-3或α2-6唾液酸化聚糖修饰，并且受体结合的聚糖的键联类型可以影响受体的HA结合位点的构象，因此影响受体对不同HA的特异性。

举例来说，禽类HA的聚糖结合袋狭窄。根据本发明，此袋结合于α2-3唾液酸化聚糖的反式构象和/或无论α2-3还是α2-6连接的锥形拓扑聚糖。

禽类组织以及人类深肺和胃肠(GI)道组织中的HA受体的特征为α2-3唾液酸化聚糖键联，并且此外(根据本发明)特征为包括α2-3唾液酸化和/或α2-6唾液酸化聚糖的主要采用锥形拓扑的聚糖。具有所述锥形拓扑聚糖的HA受体在本文中可以称为CTHAr。

相比之下，上呼吸道中的支气管和气管中的人类HA受体是由主要采用伞形拓扑的聚糖(例如包括许多α2-6唾液酸化聚糖)修饰。与α2-3基序不同，α2-6基序由于C6-C5键而具有额外的构象自由度(拉塞尔等人，糖偶联物杂志23：85，2006)。结合于所述α2-6唾液酸化聚糖的HA具有更开放的结合袋以容纳由此构象自由所引起的结构多样性。此外，如PCT专利申请案第PCT/US09/30056号和第PCT/US07/18160号中所述，HA可能需要结合于呈伞形拓扑的聚糖(例如α2-6唾液酸化聚糖)且尤其可能需要以强亲和力和/或特异性结合于所述伞形拓扑聚糖，以便有效介导人类上呼吸道组织的感染。具有伞形拓扑聚糖的HA受体在本文中可称为UTHAr。

由于这些空间受限的糖基化型态，人类通常不会感染含有许多野生型禽类HA(例如禽类H5)的病毒。具体来说，由于最可能碰到病毒的人类呼吸道部分(即气管和支气管)缺乏具有锥形聚糖(例如α2-3唾液酸化聚糖和/或短聚糖)的受体，并且野生型禽类HA通常主要或仅结合于与锥形聚糖(例如α2-3唾液酸化聚糖和/或短聚糖)缔合的受体，故人类很少感染禽类病毒。只有在与病毒充分紧密接触以致其可以进入深肺和/或胃肠道中时，具有伞形聚糖(例如长α2-6唾液酸化聚糖)的受体才使人类受到感染。

HA多肽

本发明定义并描述某些HA多肽，具体来说包括展示出与参考HA的总体序列一致性并且还包括如本文所述的特定结构特点的H5HA多肽。本发明还提供此类HA多肽的片段，包括特征片段(即，氨基酸序列包括至少一种特征性序列元件的片段)。在一些实施例中，所提供的HA多肽介导显著人类受体结合和/或人类感染和/或传播(例如，如在已确立或描述的分析系统中所评估)。

在一些实施例中，所提供的HA多肽以高亲和力结合于伞形拓扑聚糖(例如长α2-6唾液酸化聚糖，如Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-)。举例来说，在一些实施例中，所提供的HA多肽以与对介导人类感染的野生型HA(例如H1N1HA或H3N2HA)所观察到的亲和力可比的亲和力结合于伞形拓扑聚糖。在一些实施例中，所提供的HA多肽以一定的亲和力结合于伞形聚糖，所述亲和力为在可比的条件下对介导人类感染的野生型HA所观察到的亲和力的至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，所提供的HA多肽以比在可比的条件下对介导人类感染的野生型HA所观察到的亲和力大的亲和力结合于伞形聚糖。

在某些实施例中，所提供的HA多肽的结合亲和力在一定浓度范围内评估。这种策略比单一浓度分析提供显著更多的信息，尤其是在多价结合分析中。举例来说，在一些实施例中，在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或10倍以上的浓度范围内评估所提供的HA多肽的结合亲和力。

在一些实施例中，如果所提供的HA多肽在多价聚糖阵列结合分析(如本文所述的那些分析)中显示饱和信号，那么其显示高亲和力。在一些实施例中，如果所提供的HA多肽在所述研究中显示高于约400000或400000以上(例如高于约500000、600000、700000、800000等)的信号，那么其显示高亲和力。在一些实施例中，如本文所述的结合剂在至少2倍、3倍、4倍、5倍或5倍以上的浓度范围内，并且在一些实施例中在大到10倍或10倍以上的浓度范围内显示饱和结合于伞形聚糖。

此外，在一些实施例中，所提供的HA多肽与伞形拓扑聚糖(和/或伞形拓扑聚糖模拟物)结合比其与锥形拓扑聚糖结合得强。在一些实施例中，相较于锥形聚糖，所提供的HA多肽对伞形聚糖显示约10、9、8、7、6、5、4、3或2的相对亲和力。

在一些实施例中，所提供的HA多肽结合于α2-6唾液酸化聚糖；在一些实施例中，所提供的HA多肽优先结合于α2-6唾液酸化聚糖。在一些实施例中，所提供的HA多肽结合于多种不同的α2-6唾液酸化聚糖。在一些实施例中，所提供的HA多肽不能结合于α2-3唾液酸化聚糖，而在其它实施例中所提供的HA多肽能够结合于α2-3唾液酸化聚糖。

在一些实施例中，所提供的HA多肽与在人类上呼吸道上皮细胞上发现的受体结合。在某些实施例中，所提供的HA多肽与支气管和/或气管中的HA受体结合。在一些实施例中，所提供的HA多肽不能结合深肺中的受体，而在其它实施例中，所提供的HA多肽能够结合深肺中的受体。

在一些实施例中，所提供的HA多肽与至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或95％以上的在人类上呼吸道组织(例如上皮细胞)中的HA受体上发现的聚糖结合。

在一些实施例中，所提供的HA多肽的特征在于其结合于被流感的流行性病毒株利用的受体结合位点，并且在一些实施例中与此类流行性病毒株(或其受体结合部分)竞争结合于此类位点。在一些实施例中，所提供的HA多肽的特征在于其RBSN分数与流行性流感病毒株中发现的HA多肽的RBSN分数之间的实质数值相似性。

在一些实施例中，所提供的HA多肽展示相关活性(例如结合于伞形拓扑聚糖、介导人类感染性和/或传播性等)，例如结合于伞形拓扑聚糖，如使用这里描述的聚糖阵列分析所测量，其中Kd′在亚皮摩尔到10纳摩尔范围内并且处于相对于结合于锥形拓扑聚糖大于2个数量级的水平；在一些实施例中，所述相对水平是相对于相同HA多肽的不同活性(例如结合于锥形拓扑聚糖、介导非人类感染性和/或传播性等)。在一些实施例中，所述相对水平是相对于不同HA多肽(例如参考HA)的相同活性。

在一些实施例中，所提供的HA多肽是亲本或参考HA的变异体。在一些此类实施例中，所提供的HA多肽的氨基酸序列与亲本或参考HA的氨基酸序列的不同之处在于本文所述的一或多种特点的存在相对于不存在。在一些实施例中，所提供的HA多肽的氨基酸序列与亲本或参考HA的氨基酸序列的不同之处在于本文所述的仅一种特点的存在相对于不存在。在一些实施例中，所提供的HA多肽的氨基酸序列与亲本或参考HA的氨基酸序列的不同之处在于本文所述的1、2、3或4种特点的存在相对于不存在。

在一些实施例中，所提供的HA多肽展示出指定的序列一致性程度时的参考HA是并不介导显著人类受体结合和/或人类感染和/或传播的HA；在一些此类实施例中，所提供的HA与参考非人类感染性HA的不同之处在于以下两个方面：如本文所述的一或多个结构特点的存在相对于不存在；和介导显著人类受体结合和/或显著人类感染和/或传播的能力。在一些实施例中，所提供的HA多肽展示指定序列一致性程度时的参考HA会介导显著人类受体结合和/或显著人类感染和/或传播；在一些此类实施例中，所提供的HA多肽与人类感染性参考HA共有如本文所述的一或多个结构特点和一或多种生物活性(例如介导显著人类受体结合和/或显著人类感染和/或传播的能力)两者。

不介导显著人类受体结合和/或人类感染和/或传播的代表性HA(即，非人类感染性HA)包括H5HA，例如A/鸭/湖南(Hunan)/795/2002(进化枝2.1)、A/越南/1194/2004(进化枝1)、A/印度尼西亚(Indonesia)/5/2005(进化枝2.1.3.2)、A/斑头雁/青海(Qinghai)/1A/2005(进化枝2.2)、A/安徽(Anhui)/1/2005(进化枝2.3.4)、A/鹅/贵阳(Guiyang)/337/2006(进化枝4)、A/柬埔寨(Cambodia)/R0405050/2007(进化枝1.1)、A/喜鹊/香港(HongKong)/5052/2007(进化枝2.3.2.1)、A/鸡/越南/NCVD-016/2008(进化枝7.1)、A/埃及/N03072/2010(进化枝2.2.1)、A/湖北(Hubei)/1/2010(进化枝2.3.2.1)。

会介导显著人类受体结合和/或人类感染和/或传播的代表性HA(即，人类感染性HA)包括例如H3N2病毒株，包括(但不限于)A/查默斯港(PortChalmers)/1/1973(H3N2)、A/苏格兰(Scotland)/840/74(H3N2)、A/维多利亚(Victoria)/3/75(H3N2)、A/德克萨斯(Texas)/1/77(H3N2)、A/曼谷(Bangkok)/01/1979(H3N2)、A/菲律宾(Philippines)/2/82(H3N2)、A/基督城(Christchurch)/4/1985(H3N2)、A/密西西比(Mississippi)/1/85(H3N2)、A/列宁格勒(Leningrad)/360/1986(H3N2)、A/上海(Shanghai)/11/87(H3N2)、A/四川(Sichuan)/02/87(H3N2)、A/北京(Beijing)/353/89(H3N2)、A/贵州(Guizhou)/54/89(H3N2)、A/北京/32/92(H3N2)、A/山东(Shangdong)/9/93(H3N2)、A/约翰内斯堡(Johannesburg)/33/94(H3N2)、A/武汉(Wuhan)/359/95(H3N2)、A/悉尼(Sydney)/5/97(H3N2)、A/莫斯科(Moscow)/10/99(H3N2)、A/福建(Fujian)/411/2002(H3N2)、A/加利福尼亚(California)/7/2004(H3N2)、A/惠灵顿(Wellington)/1/2004(H3N2)、A/布里斯班(Brisbane)/10/2007(H3N2)、A/佩思(Perth)/16/2009(H3N2)和A/维多利亚/361/2011(H3N2)；H1N1病毒株，包括(但不限于)A/智利(Chile)/1/83(H1N1)、A/新加坡/6/1986(H1N1)、A/拜仁(Bayern)/7/95(H1N1)、A/北京/262/95(H1N1)、A/新喀里多尼亚(NewCaledonia)/20/1999(H1N1)、A/所罗门群岛(SolomonIslands)/3/2006(H1N1)、A/布里斯班/59/2007(H1N1)和A/加利福尼亚/07/2009(H1N1)；H2N2病毒株，包括(但不限于)A/巴拿马(Panama)/1/66(H2N2)和A/韩国(Korea)/426/1968(H2N2)；以及在某些情况下，H9N2病毒株，包括(但不限于)A/珍珠鸡/香港/WF10/99(H9N2)、A/野鸭/南昌(Nanchang)/2-0480/2000(H9N2)、A/火鸡/以色列(Israel)/689/2008(H9N2)、A/鸡/浙江(Zhejiang)/HE1/2009(H9N2)和A/鸡/埃及/115617V/2011(H9N2)。

在一些实施例中，本发明提供定义循环禽流感病毒株的血球凝集素(HA)中的氨基酸突变的新颖构架，所述氨基酸突变可引起在对人类聚糖受体的结合偏好方面的定量转变。在一些实施例中，本发明提供分析候选流感HA相对于其最接近的人类适应的系统发生相对流行性流感HA的聚糖受体结合位点(RBS)的分子特征的新颖构架。在一些实施例中，本发明展示出目前循环候选流感HA已进化，使得其RBS分子特征类似流行性流感HA的RBS分子特征，并且需要更少氨基酸变化来转变受体特异性。所述所提供的构架的应用定义了具有如本文所述的序列特征和活性的HA多肽变异体。

确切地说，本发明描述四种结构特征，所述结构特征当存在于如本文所述的H5HA多肽中时，产生显著水平的一或多种选自由人类受体结合、人类感染和/或人类传播组成的群组的活性。在一些实施例中，如果观察到活性的水平高于指定阈值，那么认为活性是显著的。在一些实施例中，如果观察到活性的水平相对高于参考活性(如可比的参考HA多肽中的相同活性，例如缺乏一或多种特定序列元件或特征，或相同HA多肽的不同活性(例如结合于不同目标))，那么认为活性是显著的。

如本文所述，本发明定义至少四种促进H5HA多肽的相关活性的结构特征。确切地说，根据本发明，所提供的H5HA多肽通常展示出与参考HA(例如与参考H5HA)至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高总体序列一致性，但其序列与参考HA并非100％一致，因为所提供的HA的氨基酸序列包括以下各者中的至少一者：

1)第一特征，其为对应于参考H5HA的氨基酸130的氨基酸的缺失；

2)第二特征，其为或包含

i.Xaa₂₂₆+ser228，

ii.Lys₂₂₄+Xaa₂₂₆，

iii.Xaa₁₃₇+Xaa₂₂₆+ser228，

iv.Xaa1+gly227+ser228，

v.Xaa₁₃₇+pro221+Xaa₂₂₆+ser228，以及

vi.Xaa₁₃₇+thr155+pro221+Xaa₂₂₆+gly227+ser228；

其中Xaa₂₂₆是选自Leu、Ile、Val、Met和Ala群组，Xaa₁₃₇是选自Arg、Lys、Gln、Glu、His和Asn群组；

3)第三特征，其为或包含

i.glul88+Xaa₁₉₂+Xaa₁₉₃，

ii.asp187+Xaa₁₉₃，以及

iii.Xaa₁₉₃；且

其中Xaa₁₉₂是选自Arg、Thr、Ala、Val、Leu和Ile群组，且Xaa₁₉₃是选自Thr、Ala、Lys、Arg和His群组；以及

4)另一特征，其为或包含

i.ala160，

ii.asn158+ala160，以及

iii.asn158+thr160，

其中第二、第三和第四特征的氨基酸位置对应于参考H5HA的参考位置。

核酸和表达系统

本发明还提供编码本文所述的多肽(包括例如HA多肽、抗体等)和/或其片段的核酸。本发明还提供与所述编码核酸互补和/或杂交的核酸。

在一些实施例中，所提供的核酸是单链的；在一些实施例中，其是双链的。

在一些实施例中，如所属领域的技术人员将了解，所提供的核酸具有合适于其作为引物、探针、适体、siRNA、反义等用途的序列和长度。仅举几个实例，所述核酸可用作聚合酶链反应(PCR)中的引物、用于杂交(包括原位杂交)的探针和/或用于反转录-PCR(RT-PCR)的引物。

在某些实施例中，核酸可为或包含DNA和/或RNA。在一些实施例中，本发明核酸可包括一或多种非天然核苷酸；在其它实施例中，本发明核酸仅包括天然核苷酸。

本发明还提供产生所提供的多肽和/或其片段的表达系统，包括体外系统、细胞系统以及生物体。

检测剂

本发明提供检测(例如经由直接或间接结合)所提供的HA多肽的试剂。

在一些实施例中，所提供的检测剂直接或间接结合于一或多种所提供的HA多肽。在一些实施例中，所提供的检测剂特异性地结合于一或多种所提供的HA多肽。在一些实施例中，所提供的检测剂区分所提供的HA多肽与参考HA多肽，在所述参考HA多肽情况下，所提供的HA多肽展示出如本文所述的指定总体序列一致性程度，和/或所述参考HA多肽的氨基酸序列与所提供的HA多肽的氨基酸序列在本文所述的一或多种特点方面有所不同。

在一些具体实施例中，所提供的检测剂是结合于所提供的HA多肽的抗体或抗体样实体。在一些实施例中，所述抗体或抗体样实体特异性地结合于所提供的HA多肽。在一些实施例中，所提供的抗体或抗体样实体在所提供的HA多肽与其同源参考HA之间进行区分。在一些实施例中，所提供的抗体或抗体样实体在HA多肽与仅在其中专门阐述的一或多种特点的存在或不存在方面不同否则一致的HA之间进行区分。

抗体

在一些实施例中，结合于所提供的HA多肽的抗体或抗体样实体以干扰所述HA多肽与HA受体之间的结合的方式进行区分，使得与在抗体或抗体样实体不存在时相比，在抗体或抗体样实体存在时观察到的结合水平降低。在一些实施例中，结合于所提供的HA多肽的抗体或抗体样实体以并不显著干扰所述HA多肽与HA受体之间的结合的方式进行区分。

结合于所提供的HA多肽并且根据本发明适用的合适的抗体包括(但不限于)人类抗体、灵长类化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人类化抗体、偶联抗体(即偶联或融合于其它蛋白质、放射性标记、细胞毒素的抗体)、小型模块化免疫药物(“SMIPs^TM”)、单链抗体、骆驼抗体以及抗体片段。如本文所用，术语“抗体”还包括完整单克隆抗体、多克隆抗体、单域抗体(例如鲨鱼单域抗体(例如IgNAR或其片段))、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段，只要这些抗体片段展现所需生物活性即可。用于本文中的抗体多肽可以具有任何类型(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM)。

如本文所用，“抗体片段”包括完整抗体的一部分，如抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2以及Fv片段；三功能抗体；四功能抗体；直链抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。术语“抗体片段”还包括像抗体一样通过与特定抗原结合以形成复合物来起作用的任何合成或基因工程化蛋白。举例来说，抗体片段包括经分离的片段、由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段、轻链和重链可变区通过肽连接子连接的重组单链多肽分子(“ScFv蛋白”)以及由模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位。

可以使用所属领域中众所周知的方法来产生抗体。举例来说，用于产生抗体的方案由哈洛(Harlow)和兰尼(Lane)，抗体：实验室手册(Antibodies：ALaboratoryManual)，(1988)。通常，可以在小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、骆驼、美洲驼、鲨鱼或其它适当宿主中产生抗体。或者，可以在产生IgY分子的鸡中制成抗体(谢德(Schade)等人，(1996)，ALTEX13(5)：80-85)。在一些实施例中，合适于本发明的抗体为低于人类的灵长类动物抗体。举例来说，用于在狒狒中产生治疗适用抗体的一般技术可见于例如以下文献中：戈登伯格(Goldenberg)等人，国际专利公开案第WO91/11465号(1991)以及洛斯曼(Losman)等人，国际癌症杂志(Int.J.Cancer)46：310(1990)。在一些实施例中，可以使用杂交瘤方法制备单克隆抗体(米尔斯坦(Milstein)和奎洛(Cuello)，(1983)，自然305(5934)：537-40)。在一些实施例中，也可以通过重组方法制成单克隆抗体(美国专利第4,166,452号，1979)。

在一些实施例中，合适于本发明的抗体可以包括人类化或人类抗体。非人类抗体的人类化形式为含有来源于非人类Ig的最小序列的嵌合Ig、Ig链或片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或Ab的其它抗原结合子序列)。人类化抗体通常具有一或多个从非人类来源引入的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基常称为“引进”残基，其通常是从“引进”可变域获得。人类化是通过用啮齿动物互补决定区(CDR)或CDR序列取代人类抗体的相应序列来实现(莱克曼(Riechmann)等人，自然332(6162)：323-7，1988；韦荷恩(Verhoeyen)等人，科学239(4847)：1534-6，1988)。所述“人类化”抗体为嵌合Ab(美国专利第4,816,567号，1989)，其中实质上小于完整人类可变域已由来自非人类物种的相应序列取代。在一些实施例中，人类化抗体通常为一些CDR残基以及可能一些FR残基由来自啮齿动物Ab中的类似位点的残基取代的人类抗体。人类化抗体包括具有所需特异性、亲和力以及能力的人类Ig(接受体抗体)，其中来自接受体的CDR的残基由来自如小鼠、大鼠或兔的非人类物种(供体抗体)的CDR的残基代替。在一些情况下，相应非人类残基代替人类Ig的Fv构架残基。人类化抗体可以包含在接受体抗体与引进的CDR或构架序列中均不存在的残基。一般来说，人类化抗体包含至少一个并且通常两个可变域的实质上全部，其中大部分(如果不是所有)CDR区与非人类Ig的CDR区对应，并且大部分(如果不是所有)FR区为人类Ig共同序列的FR区。人类化抗体最佳还包含Ig恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人类Ig的至少一部分(莱克曼等人，自然332(6162)：323-7，1988；韦荷恩等人，科学.239(4847)：1534-6，1988)。

人类抗体还可使用各种技术产生，包括噬菌体展示文库(霍根布姆(Hoogenboom)等人，分子免疫学(MolImmunol.)(1991)28(9)∶1027-37；马克斯(Marks)等人，分子生物学杂志(1991)222(3)：581-97)和制备人类单克隆抗体(雷斯菲尔德(Reisfeld)和赛尔(Sell)，1985，癌症调查(CancerSurv.)4(1)：271-90)。类似地，可以通过将人类Ig基因引入内源性Ig基因已部分或完全失活的转基因动物中来合成人类抗体。攻击后，观察到人类抗体产生，其在所有方面均与在人类中所见非常类似，包括基因重排、组装以及抗体库(费雪威尔德(Fishwild)等人，来自新颖微型基因座转基因小鼠品系的高亲合力人IgGκ单克隆抗体(High-avidityhumanIgGkappamonoclonalantibodiesfromanovelstrainofminilocustransgenicmice)，自然·生物技术(NatBiotechnol.)1996年7月；14(7)：845-51；隆伯格(Lonberg)等人，来自包含四种不同基因修饰的小鼠的抗原特异性人类抗体(Antigen-specifichumanantibodiesfrommicecomprisingfourdistinctgeneticmodifications)，自然1994年4月28日；368(6474)：856-9；隆伯格和胡萨尔(Huszar)，来自转基因小鼠的人类抗体(Humanantibodiesfromtransgenicmice)，国际免疫学评论(Int.Rev.Immunol.)1995；13(1)：65-93；马克斯等人，旁路免疫接种：通过链改组构建高亲和力人类抗体(By-passingimmunization：buildinghighaffinityhumanantibodiesbychainshuffling).生物技术(纽约州)(Biotechnology(NY).)1992年7月；10(7)：779-83)。

适体

在一些实施例中，所提供的检测剂是适体。适体为由核酸(例如RNA、DNA)构成的与特定分子目标(例如伞形拓扑聚糖)紧密结合的大分子。特定适体可用直链核苷酸序列来描述并且长度通常为约15-60个核苷酸。在不希望受任何理论束缚的情况下，预期适体中的核苷酸链形成分子内相互作用，使分子折叠成复杂的三维形状，并且此三维形状使适体紧密结合于其目标分子的表面。鉴于在所有可能的核苷酸序列世界内存在的分子形状极其多样，故可以针对广泛范围的分子目标(包括蛋白质和小分子)获得适体。除高特异性以外，适体对其目标还具有极高亲和力(例如对蛋白质的亲和力在皮摩尔到低纳摩尔范围内)。适体具有化学稳定性并且可以煮沸或冷冻而不损失活性。因为其为合成分子，所以可进行多种修饰，所述修饰可以优化其在特定应用中的功能。举例来说，可以修饰适体以显著降低其用于活体内应用时在血液中被酶降解的敏感性。另外，可以修饰适体以改变其生物分布或血浆滞留时间。

如所属领域的技术人员将了解，可经由多种方法中的任一者获得(直接或间接和/或特异性地)结合于所提供的HA多肽的适体的鉴别和/或表征。

举例来说，可以使用SELEX(配体指数级富集的系统进化(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment))方法来选择适体(图尔克(Tuerk)等人，科学249：505，1990)。通常，SELEX方法涉及提供与目标实体(例如所提供的HA多肽或其片段)接触的核酸分子的较大(例如10¹⁵个不同分子)文库。实体持续一段时间且在足以允许发生相互作用(例如特异性相互作用)的条件下与文库成员接触。

所属领域中已知将与目标实体相互作用的适体物理分离和/或对其进行扩增的多种技术中的任一者。在一些实施例中，可重新筛选所述经分离适体(其可代表针对结合于相关目标实体的成员富集的新文库)以进一步鉴别例如展示出特定水平亲和力和/或特异性的结合适体。

通常，在约5-15轮反复选择、分开以及扩增过程后，所述文库减小到与目标分子紧密结合的少量适体。可分离个别适体分子，测定其核苷酸序列，且测量和/或比较其关于结合亲和力和/或特异性的特性。

接着，可以例如提纯经分离的适体以消除无助于目标结合和/或适体结构的核苷酸，进而产生截短到核心结合域的适体。关于适体技术的评论，参见例如贾亚塞纳(Jayasena)，临床化学(Clin.Chem.)45：1628，1999；其全部教示内容以引用的方式并入本文中。

竞争试剂

本发明提供用于鉴别和/或表征与所提供的HA多肽竞争结合于HA受体(且尤其人类HA受体)的试剂的系统。所述试剂可例如适用于治疗或预防由具有一或多种如本文所述的结构特点的HA多肽介导的感染。在一些实施例中，如上文所述的检测剂(包括例如抗体和/或适体)也是竞争试剂。在一些实施例中，竞争试剂不是检测剂和/或不直接或间接结合于所提供的HA多肽。

组合物

本发明提供包括所提供的HA多肽和其片段、编码其的核酸、产生其的表达系统、检测其的检测剂和/或竞争其与一或多种HA受体的相互作用的竞争试剂作为活性剂的组合物。

诊断和监测组合物

本发明提供多种适用于检测、鉴别和/或表征流感病毒和/或感染的组合物。在特定实施例中，本发明提供包含检测剂的组合物，所述组合物可与临床、病理学或环境样品接触以便评估例如特定流感病毒株的存在或水平、流感感染的程度或进展等。

在某些实施例中，本发明提供特异性检测如本文中所述的具有特定聚糖结合和/或感染力特征的HA多肽的组合物和/或试剂盒。所述组合物或试剂盒可包括检测剂，例如特异性识别特定HA多肽(例如结合于伞形聚糖和/或α2-6唾液酸化聚糖和/或长α2-6唾液酸化聚糖的HA多肽)的抗体，其可用于例如通过ELISA、免疫荧光和/或免疫印迹法来特异性检测所述HA多肽。

结合于HA多肽的抗体也可以用于病毒中和测试，其中用对相关HA多肽具有特异性的抗体处理样品，并且测试其相对于未经处理的样品感染所培养细胞的能力。如果所述样品中的病毒含有所述HA多肽，那么抗体将中和病毒并且阻止其感染所培养的细胞。可替代地或另外，所述抗体也可以用于HA抑制测试，其中将HA蛋白与既定样品分离，用对特定HA多肽或HA多肽组具有特异性的抗体处理，并且测试其相对于未经处理的样品凝集红细胞的能力。如果样品中的病毒含有所述HA多肽，那么抗体将中和HA多肽的活性并且阻止其凝集红细胞(哈洛和兰尼，抗体：实验室手册，冷泉港实验室出版社(CSHLPress)，1988；www.who.int/csr/resources/publications/influenza/WHO_CDS_CSR_NCS_2002_5/en/index.html；www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/labtests/en/index.html)。在一些实施例中，所述试剂可以包括核酸，其特异性结合于编码特定HA多肽的核苷酸并且可以用于通过RT-PCR或原位杂交特异性检测所述HA多肽(www.who.int/csr/resources/publications/influenza/WHO_CDS_CSR_NCS_2002_5/en/index.html；www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/labtests/en/index.html)。在一些实施例中，在检测前，将已与样品分离的核酸扩增。在一些实施例中，诊断剂可以被可检测地标记。

本发明还提供含有根据本发明用于产生流感病毒和疫苗的试剂的试剂盒。所述试剂盒的内含物包括(但不限于)含有编码相关HA多肽的HA(核苷酸(或片段，如特征片段))的表达质粒。可替代地或另外，试剂盒可以含有表达相关HA多肽(或特征或生物学活性部分)的表达质粒。也可以包括不含病毒基因的表达质粒，以使得用户能够将来自任何相关流感病毒的HA核苷酸并入。试剂盒还可以包括哺乳动物细胞系，包括(但不限于)Vero和MDCK细胞系。在一些实施例中，诊断试剂可以被可检测地标记。

在一些实施例中，根据本发明使用的试剂盒可以包括参考样品、用于加工样品、进行测试的说明书、用于解释结果的说明书、进行测试所必需的缓冲剂和/或其它试剂。在一些实施例中，试剂盒可以包含一组抗体。

在本发明的一些实施例中，可以使用如上文所论述的聚糖阵列作为诊断剂和/或试剂盒。

在一些实施例中，使用聚糖阵列和/或试剂盒进行剂量反应研究，以评估HA多肽与伞形聚糖在多个剂量(例如如本文所述)下的结合。所述研究提供的对所测试HA多肽的结合特征的了解尤其有价值，并且所述研究尤其适用于评估特异性结合。这种类型的剂量反应结合研究发现有许多有用的应用。仅举一个实例，其可以帮助追踪相关系列的HA多肽变异体中的结合特征的进化，无论所述系列是通过天然进化、有意工程化还是这两种的组合产生。

在一些实施例中，本发明的聚糖阵列和/或试剂盒用于诱导、鉴别和/或选择具有所需结合特征的结合剂(例如HA多肽和/或HA多肽变异体)。举例来说，在一些实施例中，使用本发明的聚糖阵列和/或试剂盒来对一群多肽结合剂(例如HA多肽)施加进化(例如筛选和/或选择)压力。

在一些实施例中，所提供的试剂盒包含使用说明书。

治疗组合物

本发明提供多种组合物，其包含或以其它方式递送如本文所述的HA多肽或其片段、检测剂、竞争试剂等。在一些实施例中，所提供的组合物适用于在感染开始和/或一或多种感染症状出现之前或之后治疗流感感染。

本发明涵盖通过投与所述本发明的治疗性化合物来治疗流感感染。在一些实施例中，本发明的治疗组合物投与罹患或易患流感感染的个体。在一些实施例中，个体被视为罹患流感感染，因为个体呈现一或多种通常与流感感染相关的症状。在一些实施例中，已知或相信个体已暴露于流感病毒。在一些实施例中，如果已知或相信个体已暴露于流感病毒，那么认为个体易患流感感染。在一些实施例中，如果个体已与其它已知或怀疑已感染有流感病毒的个体接触和/或如果个体是或已存在于已知或认为流感感染流行的场所中，那么已知或相信个体已暴露于流感病毒。

在一些实施例中，在投与本发明治疗组合物之前、期间或之后，测试罹患或易患流感感染的个体中针对本发明结合剂的抗体。在一些实施例中，不投与具有所述抗体的个体包含本发明结合剂的治疗组合物。在一些实施例中，基于所述抗体的检测(或其缺乏)来选择医药组合物和/或结合剂的适当剂量。

在一些实施例中，对进行治疗的特定个体、进行投与的特定结合剂或组合物和/或进行投与的特定剂量或方案的选择是例如以书写、印刷或电子存储形式记住。

可以在一或多种流感感染症状出现之前或之后投与本发明的治疗组合物。

一般来说，治疗组合物将包括治疗剂以及一或多种非活性试剂，如无菌生物相容性载剂，包括(但不限于)无菌水、盐水、缓冲盐水或右旋糖溶液。可替代地或另外，组合物可以含有多种添加剂中的任一种，如稳定剂、缓冲剂、赋形剂(例如糖、氨基酸等)或防腐剂。

示例性非活性试剂包括例如无菌生物相容性载剂，包括(但不限于)无菌水、盐水、缓冲盐水或右旋糖溶液。可替代地或另外，可使用如适于所需特定调配物或剂型的多种溶剂、分散介质、稀释剂、或其它液体媒剂、分散或悬浮助剂、崩解剂、表面活性剂、等张剂、增稠或乳化剂、防腐剂、缓冲剂、固体粘合剂、粒化剂、润滑剂、着色剂、甜味剂、调味剂、芳香剂等中的任一者。雷明顿氏药学科学和实践(Remington′sTheScienceandPracticeofPharmacy)，第2l版，A.R.根纳罗(A.R.Gennaro)，(马里兰州巴尔的摩的利平科特威廉姆斯和威尔金斯公司(Lippincott，Williams&Wilkins，Baltimore，MD)，2006；以引用的方式并入本文中)公开了用于调配治疗组合物的各种赋形剂和用于制备其的已知技术。除非任何常规赋形剂介质均不与物质或其衍生物相容，如因产生任何非所需生物作用，或另外与医药组合物的任何其它组分以有害方式相互作用，否则预期其使用在本发明的范围内。

在一些实施例中，医药组合物将包括囊封、封闭或束缚在脂质小泡、生物可用和/或生物相容性和/或可生物降解基质或其它微粒内的治疗剂。

在一些实施例中，所提供的组合物进一步包含一或多种佐剂。任何佐剂均可根据本发明使用。大量佐剂是已知的；许多所述化合物适用纲要由美国国家卫生研究院拟制且可见于互联网(www.niaid.nih.gov/daids/vaccine/pdf/compendium.pdf)。也参见艾利森(Allison)(1998，生物标准化进展(Dev.Biol.Stand.)，92：3-11；以引用的方式并入本文中)、翁克莱斯(Unkeless)等人(1998，免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.)，6：251-281；以引用的方式并入本文中)和菲利浦(Phillips)等人(1992，疫苗(Vaccine)，10：151-158；以引用的方式并入本文中)。此项技术中已知数百种不同的佐剂，并且都可用于实施本发明。

治疗组合物可使用对于治疗和/或疫苗接种有效的任何量和任何投药途径投与。所需的确切量将在个体与个体间变化，取决于个体的种类、年龄和一般状况、感染的严重度、具体组合物、其投与模式、其活性模式等。治疗组合物通常以单位剂型形式调配以易于投药且使剂量均一。然而，应了解，本发明的组合物的总日用量将由主治医生在合理的医学判断范围内决定。用于任何具体个体或生物体的特定治疗有效剂量将取决于多种因素，包括所治疗和/或接种的病症和所述病症的严重度；所采用的特定疫苗组合物的活性；组合物在投与之后的半衰期：个体的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的特定化合物的投与时间、投与途径和排泄速率；治疗的持续时间；与所采用的特定化合物组合或同时使用的药物；和医学领域中熟知的类似因素。

本发明的治疗组合物可通过任何途径投与。在一些实施例中，本发明的治疗组合物通过多种途径投与，包括口服(PO)、静脉内(IV)、肌内(IM)、动脉内、髓内、鞘内、皮下(SQ)、心室内、经皮、皮内、皮内、经直肠(PR)、经阴道、腹膜内(IP)、胃内(IG)、局部(例如利用粉末、软膏、乳膏、凝胶、洗剂和/或滴剂)、粘膜、鼻内、颊内、经肠、玻璃体、舌下；通过气管内滴入、支气管滴入和/或吸入；作为口服喷雾、经鼻喷雾和/或气溶胶和/或经由门静脉导管。

目前，最常使用经口或经鼻喷雾或气溶胶途径(例如通过吸入)来将治疗剂直接递送到肺部和呼吸道系统中。然而，考虑到药物递送科学中可能的进展，本发明涵盖通过任何适当途径递送本发明的医药组合物。

在一些实施例中，用于吸入或气溶胶递送的制剂包含多个粒子。在一些实施例中，所述制剂的平均粒径为4、5、6、7、8、9、10、11、12或13微米。在一些实施例中，用于吸入或气溶胶递送的制剂调配成干粉末。在一些实施例中，用于吸入或气溶胶递送的制剂例如通过包括湿润剂而调配成湿粉末。在一些实施例中，湿润剂是选自由水、盐水或具有生理pH值的其它液体组成的群组。

在一些实施例中，本发明的组合物是以滴剂形式投与鼻腔或口腔中。在一些实施例中，一剂可以包含多滴(例如1-100、1-50、1-20、1-10、1-5等)。

在一些实施例中，本发明的组合物是使用递送计量剂量的组合物(例如结合剂)的装置来投与。

适用于递送本文所述的皮内治疗组合物的装置包括短针装置，如描述于美国专利第4,886,499号、美国专利第5,190,521号、美国专利第5,328,483号、美国专利第5,527,288号、美国专利第4,270,537号、美国专利第5,015,235号、美国专利第5,141,496号、美国专利第5,417,662号中的那些短针装置。也可以通过限制针有效穿透到表皮中的长度的装置(如描述于WO99/34850(以引用的方式并入本文中)中的那些装置)以及其功能等效物来投与皮内组合物。同样合适的是通过刺入角质层并且产生到达真皮的射流的液体射流注射器或针将液体疫苗递送到真皮的射流注射装置。射流注射装置描述于例如美国专利第5,480,381号、美国专利第5,599,302号、美国专利第5,334,144号、美国专利第5,993,412号、美国专利第5,649,912号、美国专利第5,569,189号、美国专利第5,704,911号、美国专利第5,383,851号、美国专利第5,893,397号、美国专利第5,466,220号、美国专利第5,339,163号、美国专利第5,312,335号、美国专利第5,503,627号、美国专利第5,064,413号、美国专利第5,520,639号、美国专利第4,596,556号、美国专利第4,790,824号、美国专利第4,941,880号、美国专利第4,940,460号、WO97/37705以及WO97/13537中。同样合适的是使用压缩气体加速疫苗以粉末形式穿过皮肤外层到达真皮的弹道式粉末/粒子递送装置。另外，在皮内投药的经典曼托方法(classicalmantouxmethod)中可以使用常规注射器。

医药试剂的调配和制造中的一般考虑因素可见于例如雷明顿氏药学科学(Remington′sPharmaceuticalSciences)，第19版，宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(MackPublishingCo.，Easton，PA)，1995。

本发明的治疗组合物可以呈适于实现所需结果的任何剂量来投与。在一些实施例中，所需结果为一或多种感染(例如流感感染)症状的强度、严重性和/或频率降低和/或发作延迟。

根据本发明的治疗组合物可单独或与一或多种其它治疗剂组合投与。“与……组合”并不欲暗示所述试剂必须同时投与和/或调配用于一起递送，不过这些递送方法在本发明的范围内。组合物可在一或多种其它所需治疗剂或医学程序的同时、之前或之后投与。应了解，组合中所用的治疗活性剂可同时以单一组合物投与或分别以不同组合物投与。一般来说，各药剂将按照对于所述药剂所确定的剂量和/或时间表来投与。

在一些实施例中，本发明治疗组合物经调配以降低所包括的试剂的免疫原性。举例来说，在一些实施例中，所包括的结合剂与遮蔽其免疫原性的试剂(如聚乙二醇和/或羧甲基纤维素)缔合(例如结合)。在一些实施例中，所包括的结合剂具有降低免疫原性的其它糖基化。

在一些实施例中，本发明提供用于投与本发明治疗组合物的试剂盒。举例来说，在一些实施例中，本发明提供一种包含至少一个剂量的结合剂的试剂盒。在一些实施例中，本发明提供一种包含初始单位剂量和后续单位剂量的结合剂的试剂盒。在一些所述实施例中，初始单位剂量大于后续单位剂量或其中两种剂量相等。

在一些实施例中，本发明的试剂盒(尤其用于投与本发明的组合物的那些试剂盒)包含至少一个递送装置组件，例如吸入器。在一些所述实施例中，本发明提供一种包含至少一个递送装置组件(例如吸入器)以及一剂结合剂的试剂盒。

疫苗组合物

在一些特定实施例中，本发明提供治疗组合物，其为用于预防流感感染的疫苗组合物，尤其当所述感染由人类适应的H5HA介导时。在一些实施例中，所述疫苗组合物包含一或多种所提供的HA多肽或其片段、编码其的核酸、产生其的表达系统和/或竞争其与一或多种HA受体的相互作用的竞争试剂。在一些实施例中，所述疫苗组合物包含一或多种用于促进或刺激向其投与疫苗组合物的个体中的免疫反应的佐剂。

在一些实施例中，本发明提供疫苗并且向人类个体投与这些疫苗。在一些实施例中，疫苗为包含以下各者中的一或多者的组合物：(1)失活病毒，(2)活的减毒流感病毒，例如复制缺陷病毒，(3)如本文所述的本发明的HA多肽或其片段、检测剂、结合剂、核酸、表达系统、细胞或生物体。

在一些实施例中，本发明提供失活流感疫苗。在一些实施例中，失活流感疫苗包含三种类型抗原制剂中的一种：失活全病毒、用清洁剂或其它试剂将经纯化的病毒粒子破碎以溶解脂质包膜的亚病毒粒子(“裂解”疫苗)或经纯化的HA多肽(“亚单位”疫苗)。在一些实施例中，可以通过用甲醛、β-丙内酯、醚、含有清洁剂(如TWEEN-80)的醚、溴化十六基三甲铵(CTAB)和TritonN101、脱氧胆酸钠以及磷酸三(正丁)酯处理使病毒失活。失活可以发生在净化尿囊液(来自蛋中产生的病毒)之后或之前；通过离心分离并且纯化病毒粒子(尼克尔森(Nicholson)等人编，流感教科书(TextbookofInfluenza)，马萨诸塞州摩顿的布莱克威尔科学出版社(BlackwellScience，Malden，MA)，1998)。为评估疫苗的效能，可以使用单向放射免疫扩散(SRD)测试(斯切尔德(Schild)等人，世界卫生组织简报(Bull.WorldHealthOrgan.)，52：43-50和223-31，1975；莫斯托(Mostow)等人，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)，2：531，1975)。

本发明还提供活的减毒流感疫苗并且用于减毒的方法为所属领域中众所周知的。在一些实施例中，通过使用反向遗传学(如定点突变诱发)来实现减毒。

在一些实施例中，用于疫苗的流感病毒在蛋中(例如在含胚鸡蛋中)生长，在此情况下所收获的材料为尿囊液。可替代地或另外，可以由使用组织培养使病毒生长的任何方法来获得流感病毒。适用于使病毒生长的细胞基质包括例如狗肾脏细胞(如MDCK或来自MDCK的克隆的细胞)、、MDCK样细胞、猴肾脏细胞(如AGMK细胞，包括Veto细胞)、呈连续细胞系培养的上皮细胞、293T细胞、BK-21细胞、CV-1细胞或合适于产生用于疫苗目的的流感病毒的任何其它哺乳动物细胞类型(包括上气管上皮细胞)，其易于从商业来源(例如马里兰州罗克维尔的美国模式培养物保藏中心(ATCC，Rockville，Md))获得。合适的细胞基质还包括人类细胞，如MRC-5细胞。合适的细胞基质不限于细胞系；例如也包括如鸡胚成纤维细胞的原代细胞。

在一些实施例中，本发明的疫苗进一步包含一或多种佐剂。举例来说，可以使用铝盐(拜勒(Baylor)等人，疫苗(Vaccine)，20：S18，2002)和单磷酰脂A(MPL；里比(Ribi)等人，(1986，细菌内毒素免疫学和免疫药理学(ImmunologyandImmunopharmacologyofBacterialEndotoxins)，纽约普莱南出版公司(PlenumPubl.Corp.，NY，第407页，1986))作为人类疫苗中的佐剂。可替代地或另外，目前正在测试在人类疫苗中用作佐剂的新化合物，如MF59(凯龙公司(ChironCorp.)，http：//www.chiron.com/investors/pressreleases/2005/051028.html)、CPG7909(库柏(Cooper)等人，疫苗，22：3136，2004)以及皂角苷，如QS21(弗奇克安(Ghochikyan)等人，疫苗，24：2275，2006)。

另外，所属领域中已知一些佐剂提高流感疫苗的免疫原性，如聚[二(羧根基苯氧基)磷腈](PCCP；派恩(Payne)等人，疫苗，16：92，1998)、干扰素-T(曹(Cao)等人，疫苗，10：238，1992)、嵌段共聚物P1205(CRL1005；卡茨(Katz)等人，疫苗，18：2177，2000)、白介素-2(IL-2；姆乌克(Mbwuike)等人，疫苗，8：347，1990)以及聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA；克如特(Kreuter)等人，医药科学杂志(J.Pharm.Sci.)，70：367，1981)。

在一些实施例中，本发明的疫苗组合物不包括佐剂(例如，所提供的组合物基本上不含佐剂)。在一些实施例中，本发明的疫苗组合物不包括矾佐剂(例如所提供的组合物基本上不含矾)。

在一些实施例中，疫苗组合物经调配或以其它方式设计或制备以便在症状之前和/或在暴露之前投与。然而，所属领域的技术人员应了解，在许多实施例中，疫苗组合物可能可替代地或另外在暴露、感染和/或症状出现之后投与。

组合疗法

如本文所述的治疗组合物可单独或与一或多种其它治疗剂(包括(但不限于)疫苗和/或抗体)组合投与。“与……组合”并不欲暗示所述试剂必须同时投与或调配用于一起递送，不过这些递送方法在本发明的范围内。一般来说，各药剂将按照对于所述药剂所确定的剂量和时间表来投与。另外，本发明涵盖本发明的治疗组合物与可改进其生物可用性、减少和/或修改其代谢、抑制其排泄和/或修改其体内分布的药剂的组合的递送。虽然本发明的治疗组合物可以用于治疗有需要的任何个体(例如任何动物)，但其最优选地用于治疗人类。在一些实施例中，本发明的治疗组合物是与一或多种抗病毒剂(例如奥司他韦(Oseitamivir)[tamiflu]、扎那米韦(Zanamavir)[Releza]等)和/或唾液酸酶组合投与。在一些实施例中，本发明的治疗组合物与一或多种常用于治疗流感感染或其症状的其它疗法(例如疼痛缓解剂、解充血药、咳嗽抑制剂、睡眠助剂等)组合投与。

用途

在一些实施例中，本发明提供用于治疗、监测以及甚至预测禽流感HA病毒株序列进化的技术和方法。

治疗流感感染

本发明提供治疗流感感染的方法。在某些实施例中，所述方法涉及向有需要的个体投与一或多种本发明的HA多肽或其片段、编码其的核酸、产生其的表达系统、和/或竞争其与一或多种HA受体的相互作用的竞争试剂。在一些实施例中，HA多肽或其片段、编码其的核酸、产生其的表达系统和/或竞争其与一或多种HA受体的相互作用的竞争试剂会抑制HA(例如在流感病毒表面上表达的HA)结合于伞形拓扑聚糖(例如与人类上呼吸道上皮组织(如气管和支气管)相关的聚糖)的能力。

在一些实施例中，在一些实施例中，本发明的HA多肽或其片段、编码其的核酸、产生其的表达系统和/或竞争其与一或多种HA受体的相互作用的竞争试剂用于治疗以下症状中的一或多者：发热、喉咙痛、肌肉痛、严重头痛、咳嗽、无力、一般不适、肺炎、恶心和/或呕吐。在某些实施例中，这些症状由流感感染引起。

在一些实施例中，向罹患或易患流感感染的个体投与本发明的医药组合物。在一些实施例中，个体被视为罹患流感感染，因为个体呈现一或多种通常与流感感染相关的症状。在一些实施例中，已知或相信个体已暴露于流感病毒。在一些实施例中，如果已知或相信个体已暴露于流感病毒，那么认为个体易患流感感染。在一些实施例中，如果个体已与其它已知或怀疑已感染有流感病毒的个体接触和/或如果个体是或已存在于已知或认为流感感染流行的场所中，那么已知或相信个体已暴露于流感病毒。

在一些实施例中，本发明提供一种治疗流感感染的方法，其包含以下步骤：(1)提供展现流感感染症状的患者，和(2)向患者投与治疗量的一或多种HA多肽或其片段、编码其的核酸、产生其的表达系统、和/或竞争其与一或多种HA受体的相互作用的竞争试剂。在一些实施例中，本发明提供一种治疗流感感染的方法，其包含以下步骤：(1)提供罹患流感感染的患者，和(2)向患者投与治疗量的一或多种HA多肽或其片段、编码其的核酸、产生其的表达系统、和/或竞争其与一或多种HA受体的相互作用的竞争试剂。在一些实施例中，本发明提供一种治疗流感感染的方法，其包含以下步骤：(1)提供易患流感感染的患者，和(2)向患者投与治疗量的一或多种HA多肽或其片段、编码其的核酸、产生其的表达系统、和/或竞争其与一或多种HA受体的相互作用的竞争试剂。

在一些实施例中，本发明提供治疗流感感染的方法，其包含以下步骤：(1)提供展现流感感染症状、罹患流感感染和/或易患流感感染的患者，和(2)投与会在人类上呼吸道组织中与伞形拓扑聚糖竞争掉结合HA多肽(例如与流感病毒粒子相关的HA多肽)的物质。

在一些实施例中，本发明提供一种预防和/或延缓流感感染发作的方法，其包含以下步骤：(1)提供易患流感感染的患者，和(2)向患者投与治疗量的一或多种HA多肽或其片段、编码其的核酸、产生其的表达系统、和/或竞争其与一或多种HA受体的相互作用的竞争试剂。

监测/监视

在本发明之前，突变对H5HA的定量聚糖受体结合亲和力的影响尚未经表征。本文中呈现的尤其是用于定义和理解H5HA在受体结合位点的分子环境变化的情况下以人类适应的HA所特有的方式定量转变其对人类受体的结合偏好的需求的方法。在一些实施例中，将结构和残基间相互作用网络分析的组合进行组合以定义可以与流行性H1和H2HA病毒株类似的方式定量转变其对人类受体的聚糖受体结合偏好的H5HA的受体结合位点的突变。

在一些实施例中，本发明提供监测人类感染性和/或人类可传播的流感的群体的方法。在一些实施例中，提供确定来自流感病毒株的流行性风险的方法。在一些实施例中，监测流感的方法包括以下步骤：从怀疑含有流感的来源获得样品，使样品与一或多种特异性结合于H5HA多肽的试剂接触，检测试剂与样品的结合，以便测定样品中H5HA的存在和/或水平。在一些实施例中，一或多种试剂与样品的结合指示人类感染性H5HA的存在。在一些实施例中，一或多种试剂与样品的结合指示人类感染性H5HA的不存在。

在一些实施例中，根据本发明的方法可用于分析多种样品来源中的任一者，包括例如环境来源、人类患者来源、或动物来源。在一些实施例中，进行一或多种样品的分析至少两次。举例来说，在一些实施例中，每一分析隔开一段时间以允许个体或群体的纵向监测。在一些实施例中，时间段可为：1小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或1年。

检测和/或表征适用的试剂和/或相互作用

本发明提供用于鉴别和/或表征适用的试剂(例如适用于治疗、预防和/或分析流感感染的试剂)和/或相互作用的多种技术。

举例来说，多种结合研究和/或格式适用于鉴别和/或表征如本文所述的适用的试剂。在一些实施例中，本发明利用了分析HA多肽与HA受体之间的结合相互作用的系统。在一些此类实施例中，分析方法包含以下步骤：1)提供HA多肽或其结合组分的来源；2)提供HA受体或其结合组分的来源；和3)使所提供的来源在足以可评估HA多肽(或其结合组分)与HA受体(或其结合组分)之间的结合的条件和时间下彼此接触。所述方法可例如用于鉴别或表征相关HA多肽(尤其变异型HA多肽)和/或鉴别和/或表征与其结合的试剂和/或抑制其与HA受体的相互作用。

在一些实施例中，合适的HA多肽或其结合组分的来源包括(但不限于)病理学样品，如血液、血清/血浆、外周血液单核细胞/外周血液淋巴细胞(PBMC/PBL)、痰液、尿液、粪便、咽喉拭子、皮肤病变拭子、脑脊髓流体、子宫颈刮片、脓液样品、食物基质以及来自身体各个部分(如脑、脾和肝)的组织。可替代地或另外，含有HA多肽的样品的其它合适来源包括(但不限于)环境样品，如土壤、水以及植物群。其它样品包括例如由研究人员设计和/或制备的工程化HA多肽的实验室样品。也可以应用其它未列出的样品。在一些实施例中，来源(和/或与HA受体或其结合组分的样品)包含完整病毒或病毒样粒子；在一些实施例中，所述来源和/或样品包含HA多肽。在一些实施例中，HA多肽以三聚体形式使用。

在一些实施例中，合适的HA受体或其结合组分来源包括组织样品；在一些实施例中，合适的来源包括经分离HA受体或其结合组分。在一些实施例中，合适的来源包括包含HA受体聚糖的聚糖集合(例如呈聚糖阵列形式)。在一些实施例中，合适的来源包括包含α2-3-连接和/或a2-6-连接的聚糖的聚糖集合。在一些实施例中，合适的来源包括包含锥形拓扑和/或伞形拓扑聚糖的聚糖集合。在一些实施例中，合适的来源包括在人类上呼吸道HA受体上发现的聚糖。

应了解，多种结合相互作用可有效地根据本发明研究。除了HA多肽-HA受体相互作用之外，如本文所述，可研究各种抗体-抗原相互作用或其它配体-目标相互作用。举例来说，可在HA受体(或其结合组分)存在或不存在的情况下分析HA多肽与检测或竞争试剂之间的相互作用。

在一些实施例中，一种或两种用于结合研究的相互作用组分在接触步骤之前、期间或之后经可检测地标记(直接或间接)。在一些此类实施例中，至少一种相互作用组分例如在空间上定位在阵列上。仅举一个实例，在一些实施例中，经可检测标记的HA多肽或其结合组分与聚糖集合例如在其中不同聚糖清楚定位的阵列上接触。在一些此类实施例中，可通过(例如使用扫描装置)检测和/或量化定位的标记来评估结合。

可替代地或另外，相互作用组分或实体之间或之中的结合可使用例如量热、荧光或放射性检测系统或其它标记方法或其它不要求标记的方法测量。一般来说，荧光检测通常涉及使用已或变得标记有荧光分子的第一相互作用搭配物(例如HA多肽或其结合组分，或HA受体或其结合部分)以及监测荧光信号。可替代地或另外，相互作用组分或实体中的一或两者可经标签(例如生物素或链霉亲和素、抗原表位、核酸等)标记，所述标签自身与搭配物(例如链霉亲和素或生物素、抗体、互补核酸)可检测地相互作用。

在一些实施例中，可使用荧光淬灭方法，其中一种相互作用组分或实体经荧光标记，且另一种在如果结合进行/当结合进行时淬灭荧光的情形中提供。

可替代地或另外，结合研究可以使用已在放射性物质存在下生长从而产生放射性标记探针的活细胞或组织样品。在所述实施例中，可以通过测量放射性发射来检测结合。

所述方法适用于确定相互作用组分或实体之间结合的事实和/或结合的程度。在一些实施例中，所述方法可以进一步用于鉴别和/或表征干扰或以其它方式改变相关相互作用的试剂。

本文描述的方法尤其可用于例如鉴别被认为能够与碳水化合物相互作用的分子实际上是否可以确实如此，或鉴别分子是否出乎意料地具有与碳水化合物相互作用的能力。

本发明还提供使用聚糖集合来例如检测测试样品中的特定试剂的方法。举例来说，所述方法可包含以下步骤：(1)使聚糖集合(例如聚糖阵列)与测试样品(例如与已知或认为含有HA多肽的样品)接触；并且(2)检测测试样品中任何试剂与聚糖集合的结合。

根据本发明，结合研究可用于例如测定结合剂与聚糖之间的相互作用动力学。举例来说，用于测定相互作用动力学的本发明方法可包括以下步骤：(1)使聚糖集合与包含所测试的试剂的样品接触；以及(2)测量结合剂与聚糖之间的相互作用动力学。

可以通过例如上文详述的比色或荧光信号的实时改变来测量结合实体或组分(例如结合剂与集合中(例如阵列上)的聚糖)之间的相互作用动力学。所述方法尤其可用于例如测定特定结合剂是否能够以比不同结合剂与特定碳水化合物相互作用高的结合程度与相同碳水化合物相互作用。

在一些实施例中，如本文所述的结合研究、且尤其表征HA多肽或其结合组分与HA受体或其结合组分之间的相互作用的结合研究在一种或两种结合组分或实体的一定浓度范围内进行。

在一些实施例中，在动物宿主中或使用动物宿主进行结合(和/或感染和/或传播)研究。如本文所用，“动物宿主”包括合适于流感研究的任何动物模型。举例来说，合适于本发明的动物宿主可以为任何哺乳动物宿主，包括灵长类动物、雪貂、猫、狗、牛、马、啮齿动物，如小鼠、仓鼠、兔以及大鼠。在一些实施例中，用于本发明的动物宿主为雪貂。具体来说，在一些实施例中，动物宿主在投与本发明的结合剂(任选地在本发明的组合物中)之前未暴露于或感染病毒。在一些实施例中，动物宿主在投与本发明的结合剂之前或同时接种、感染或以其它方式暴露于病毒。用于本发明实践中的动物宿主可以通过所属领域中已知的任何方法接种、感染或以其它方式暴露于病毒。在一些实施例中，动物宿主可以经鼻内接种、感染或暴露于病毒。

在一些实施例中，合适的动物宿主可以具有与在人类呼吸道中发现的分布类似的伞形对比锥形拓扑聚糖和/或α2-6聚糖对比α2-3聚糖的分布。举例来说，预期当雪貂用作由人类中流感病毒引起的疾病模型时，其作为动物宿主可能比小鼠更具代表性(塔姆佩等人，科学(2007)315；655-659)。在不希望受任何理论束缚的情况下，本发明提出，雪貂呼吸道中的聚糖分布与人类呼吸道中的聚糖分布的相似性可能高于小鼠与人类的相似性。

可以使用未经处理和/或已接种的动物来进行多种研究中的任一种。举例来说，如所属领域中已知，所述动物模型可以用于病毒传播研究。预期在病毒传播研究中使用雪貂可以充当人类中病毒传播的可靠预报因子。举例来说，所属领域中已知病毒性流感从接种动物(例如雪貂)气溶胶传播到未经处理的动物中(塔姆佩等人，科学(2007)315；655-659)。可以使用病毒传播研究来测试本发明的结合剂多肽(例如HA多肽)。举例来说，可以在病毒传播研究之前、期间或之后向合适的动物宿主投与本发明的结合剂，以测定所述结合剂在阻断动物宿主中的病毒结合和/或感染方面的功效。使用从动物宿主中病毒传播研究收集到信息，可以预测结合剂在阻断人类宿主中的病毒结合和/或感染方面的功效。

产生多肽

其所提供的多肽(例如HA多肽、抗体等和/或其片段，如特征片段)可通过任何可获得的方式产生。

多肽可例如通过使用经工程化以表达编码相关多肽的核酸的宿主细胞系统来产生。在一些实施例中，所述编码核酸对宿主细胞系统是异源的且经由人工作用引入到系统中。可替代地或另外，宿主细胞系统可经操纵以按特定(例如升高)水平和/或在特定时间下表达编码多肽。

所属领域的技术人员将知道可恰当地用于产生如本文所述的多肽的多种宿主细胞系统。举例来说，多肽可在微生物、哺乳动物、禽类或植物细胞系统中产生。在一些实施例中，使用真核细胞系统。在一些实施例中，所用细胞系统为或包含完整组织和/或生物体。仅举几个例子，在一些实施例中，所提供的多肽在蛋、杆状病毒、植物、酵母、马丁-达比犬肾细胞(Madin-DarbyCanineKidneycells，MDCK)或Vero(非洲绿猴肾脏)细胞系统中表达。

可替代地或另外，所提供的多肽可例如使用体外转录和/或翻译系统和/或经由化学合成来体外合成。

在一些实施例中，所提供的HA多肽(或其特定特定片段)可在完整病毒或病毒样粒子的情况下产生。

在一些实施例中，所提供的HA多肽(或其特定部分)可以由流感病毒分离和/或纯化。举例来说，病毒可以在蛋(如含胚鸡蛋)中生长，在这种情况下所收获的材料通常为尿囊液。可替代地或另外，病毒可在组织培养系统中生长。适用于使病毒生长的细胞基质包括例如狗肾脏细胞(如MDCK或来自MDCK的克隆的细胞)、MDCK样细胞、猴肾脏细胞(如AGMK细胞，包括Vero细胞)、呈连续细胞系培养的上皮细胞、293T细胞、BK-21细胞、CV-1细胞或合适于产生用于疫苗目的的流感病毒的任何其它哺乳动物细胞类型，其易于从商业来源(例如马里兰州罗克维尔的美国模式培养物保藏中心)获得。合适的细胞基质还包括人类细胞，如MRC-5细胞。合适的细胞不限于细胞系；例如也包括如鸡胚成纤维细胞的原代细胞。

另外，所属领域的技术人员将了解，可以通过在允许迅速筛选和/或选择展示如本文所述的所需结合和/或活性特征的多肽的条件下培养产生多肽(无论单独还是作为复合物的一部分，包括作为病毒粒子或病毒的一部分)的细胞或生物体来产生、鉴别、分离和/或制备如本文所述的多肽和尤其HA多肽。

例证

实例1：新颖H5HA变异体的设计和表征

引言

从季节性爆发的观点以及从禽类病毒(对人类来说抗原新颖)适应人类宿主的能力的观点来看，A型流感病毒对全球健康构成重大威胁。来自禽类、猪和人类病毒的多个流感基因区段重配的抗原新颖2009H1N1病毒株的突然出现实质性冲击了全球经济且突显了对于适当监测以便为将来此类自发性流行性爆发作更多准备的迫切需要。人类适应的病毒(如H1N1、H2N2和H3N2)的特征特性为相对于病毒HA对禽类受体的低到最低限度的结合，其对人类受体的定量高结合亲和力。

病毒表面糖蛋白(HA)和聚合酶(PB2)中的氨基酸突变能够赋予对禽类H1N1流感分离株的气溶胶传播(范胡芬(VanHoeven)等人，2009美国国家科学院院刊(PNAS)，106：3366)。在已知感染人类的禽类亚型之中，H5N1的死亡率最高。因此，重要的是实施改进的监测H5N1病毒进化以及跟踪其适应人类宿主的潜力的新策略。

鉴于高度病原性H5N1A型流感病毒亚型从2003年起已在人类中引起数次高死亡率(约60％)的局部爆发，故其提出了一个全球性的健康问题(纽曼(Neumann)等人，2010细胞研究(CellRes.)，20：51；关(Guan)等人，2009科学和技术评论(RevSciTech)，28：39)。然而，H5N1亚型尚未适应人类宿主从而建立持久的人与人经由呼吸道飞沫的传播(或气溶胶传播)。

来自禽类亚型的HA通常结合于α2→3唾液酸化聚糖(或禽类受体)(葛(Ge)等人，2011微生物学重要评论(CritRevMicrobiol)，37：157)。人类适应的亚型(如H1N1、H2N2和H3N2)的标志特征是其对α2→6唾液酸化聚糖受体(或人类受体)的结合偏好的定量转变，其由相较于禽类受体对人类受体的相对较高的结合亲和力定义。已展示此定量转变与流行性H1N1和H2N2病毒在雪貂中的呼吸道飞沫传播性相关(塔姆佩等人，2007科学，315：655；斯里尼瓦桑(Srinivasan)等人，2008美国国家科学院院刊，105：2800；帕帕斯(Pappas)等人，2010公共科学图书馆·综合(PLoSOne)，5：e11158；维斯瓦纳坦(Viswanathan)等人，2010公共科学图书馆·综合，5：e13768)。因此，禽类适应的H5N1亚型的人类适应的必需决定因素是其HA获得会定量转变其对人类受体的结合偏好的突变(葛等人，2011微生物学重要评论，37：157；夏伍(Shriver)等人，2009化学与生物学(ChemBiol.)，16：803)。鉴别会转变H5HA的聚糖受体结合特异性的突变已是先前数项研究的焦点(冈巴彦(Gambaryan)等人，2006病毒学，344：432；斯提芬斯等人，2006科学，312：404；山田(Yamada)等人，2006自然，444：378；钱德拉塞克兰(Chandrasekaran)等人，2008自然·生物技术，26：107；斯提芬斯等人，2008分子生物学杂志(JMol.Biol.)，381：1382；王(Wang)等人，2009美国国家科学院院刊，106：18137；渡边(Watanabe)等人，2012微生物学趋势(TrendsInMicrobiology)，20：11)。这些研究中的一些包括分析在受体结合位点(RBS)中具有天然变异的H5HA的聚糖受体结合(山田等人，2006自然，444：378)。其它研究使突变的H5HA包括H2/H3HA(Q226L和G228S或LS)和/或H1HA(E190D、G225D或DD)的人类适应的标志变化。变异型H5HA中没有一者(无论工程化的还是见于天然来源的)展示出在以人类适应的‘流行性’病毒株HA(如1918H1N1、1958H2N2和2009H1N1，参见图1)特有的方式结合人类受体方面的定量转变。

近来，由今井(Imai)等人(今井等人，2012自然，出版中)和赫斯特(Herfst)(赫斯特等人，2012科学，336：1534)进行的两项研究展示出，来自人类H5N1分离株A/越南/1203/2004(Viet04)和A/印度尼西亚/5/2005(Ind05)的HA中的特定突变组分别转变受体偏好且赋予雪貂对具有这些变异型H5HA的病毒的呼吸道飞沫病毒传播。从这些研究显而易见，在遗传背景和选择压力策略方面的差异产生与雪貂中气溶胶传播相关的Viet04和Ind05HA中的不同组的氨基酸变化。基于这些研究，由拉塞尔等人(拉塞尔等人，2012科学，336：1541)进行的另一项研究使用HA和聚合酶PB2核苷酸序列的数学模型和统计分析来评估H5N1病毒株在其系统发生分歧的情况下获得针对Viet04和Ind05报导的特定氨基酸变化的潜力。基于序列分析，这项研究指出当前H5N1HA有清晰的序列分歧(如进化枝2.2.1)以及在Viet04和Ind05HA中鉴别的基因变化可能不是唯一会引起呼吸道飞沫传播的变化。

H5HA序列的进化对其RBS中定量转变其对人类受体的结合偏好所需的氨基酸变化尤其具有重要暗示。在此情形下，尚未解答的重要问题是当前H5HA将如何在其RBS中因来自原型病毒株(如Viet04和Ind05)的序列分歧引起的其它分子变化的情况下定量转变到人类受体结合(渡边等人，2012微生物学趋势，20：11；渡边等人，2011公共科学图书馆·病原体(PLoSPathogens)，7：e1002068)。鉴于从2006年起所分离的H5HA已显著不同于已成为上述许多研究焦点的原型病毒株Viet04和Ind05的观察结果，此问题尤其重要。

这里描述了一种通过考虑H5HA的序列进化和其天然禽类受体的结构拓扑来系统地研究其RBS的新颖构架。我们先前已发展了一种基于禽类和人类受体的三维结构拓扑来区分HA对这些受体的结合的构架。禽类受体当结合于HA时尝试类似于锥形的构象空间(且因此术语锥形拓扑用于描述此受体)。H5HA(使用Viet04晶体结构(斯提芬斯等人，2006科学，312：404；斯提芬斯等人，2008，分子生物学杂志，381：1382))与采用锥形拓扑的禽类受体的大部分接触涉及Neu5Acα2-3Gal-基序。H5HARBS中参与此相互作用的氨基酸主要位于RBS基部，涉及残基130环中的Ser-136、150环中的Trp-153和Ile-155、220环中的Lys-222、Gln-226，且来自190-螺旋a中Glu-190、Lys-193和Leu-194的特定额外接触位于RBS顶部(图2)。

特定人类适应的Ha是已知的，包括来自H1N1、H3N2和流行性H2N2亚型的各种季节性和流行性病毒株。基于H5HA与H2HA的系统发生‘接近性’(图3)，选择会结合于人类受体的人类适应的H2N2HA(A/奥尔巴尼/6/58或Alb58)以与会结合于禽类受体的H5HA的结构分析对比(斯提芬斯等人，2006科学，312：404；斯提芬斯等人，2008，分子生物学杂志，381：1382)。鉴于Alb58病毒株是原型流行性病毒株以及其定量聚糖受体结合和表型特性(如气溶胶传播性)已经研究，选择其作为代表性H2N2病毒株。由于Alb58HA的x射线晶体结构不可获得，故使用与Alb58HA具有较高序列一致性的另一人类适应的H2HA(A/新加坡/1/57)的模板晶体结构(与人类受体共结晶)构建此HA的基于同源性的模型。

结果

观察到人类受体在类似充分接近于完全开放伞形的较大构象空间上结合于HA样品。因此，术语伞形拓扑可用于定义此受体。人类受体的伞形拓扑中有两个区域，包含Neu5Acα2→6GalB1→基序的基部区以及包含除此基序以外的糖残基(通常是GlcNAcβ1→3Galβ1→)的扩展区。这两个区域跨越H2HARBS中的更宽范围的相互作用氨基酸。结合于呈锥形拓扑的禽类受体的H5HA与结合于呈伞形拓扑的人类受体的H2HA的比较展示出至少四种重要差异(图2)。第一，H2HA的130环的组成不同于H5HA，因为其包括位于位置130(H3编号)处的缺失。第二，在与Neu5Acα2→6Galβ1→基序相互作用中起作用的RBS的‘基部’中的氨基酸(如在位置136-138、219-228中的氨基酸)不同。第三，与H2HA中人类受体的扩展区相互作用的主要包含‘190-螺旋’(残基188-196)的RBS的‘顶部’不同(具体来说在位置188、189、192和193处)。第四，位置158在H5HA中但不在H2HA中经糖基化。在此位点处的糖基化可潜在地干扰人类受体的扩展区(参见斯提芬斯等人，2008，分子生物学杂志，381：1382)。

在此实例中，将这四种主要差异归类成区分H2与H5HA的RBS的分子特点。在不希望受特定理论约束的情况下，可通过匹配这四种特点作出氨基酸改变以使H5HA的RBS转化成H2HA的RBS将引起H5HA对人类受体的结合的定量转变。

为了理解所设计的氨基酸改变在RBS中的其它残基的情况下的作用，发展一种量度(RBS网络或RBSN)来捕捉RBS中与呈适当拓扑的聚糖受体接触的重要残基与其接近空间环境中的其它残基之间的相互作用网络。重要RBS残基与其环境之间的相互作用关系使用二维开放连接性网络图(RBSN图)表示。RBS中的氨基酸的相互作用网络的程度使用在从0(不存在任何网络)到1(最大网络化)之间变化的标准化网络分数(RBSN分数)定量。RBS内的氨基酸的网络越高，其结构上被限制到突变的越多。出于本实例的目的，RBS内的此网络关系指导通过如下文所例示般匹配四种特点来将H5HARBS转化成类似H2HARBS的方法。

匹配特点1涉及对130环作出改变，具体来说通过引入缺失来进行。130环中的缺失影响RBSN图，涉及131、133和155位置。在位置131和133处的残基在H5HA中具有较低RBSN分数(＜0.04)，并且因此可能易于突变以匹配涉及H2HA中的这些位置的RBSN图。匹配特点2涉及对在RBS基部处的130环和220环中的残基位置的组合的改变。在H5HA中，Gln-226在与禽类受体的Neu5Acα2→3Gal-基序接触中起重要作用，且Ser137和Gln-226参与残基间相互作用网络。

相反地，在H2HA中，对应的Leu-226和Arg-137不相关。H2HA中的Arg-137和Ser-228提供与唾液酸的额外稳定接触。因此，根据本发明，一种匹配特点2的方式涉及改变H5HA中的137和226位置处的残基以匹配H2HA的RBSN图。位于137处的残基鉴于其在H2和H5HA中的较低RBSN分数(约0.01)而是易于可突变的。然而，在226处的残基在H2和H5HA中的RBSN分数高得多(＞0.25)。因此，对此残基作出改变也涉及作出其它改变：具体来说除了Ser-137→Arg突变之外改变Gly-228→Ser。虽然Gln-226→Leu突变控制从Neu5Acα2→3Gal到Neu5Acα2→6Gal-基序的接触的转变，但从氨基酸间网络连接以及与聚糖受体改进的接触的观点来看，Ser-137→Arg和Gly-228→Ser突变为在H5RBS的基部处的130环和220环提供额外的稳定(斯提芬斯等人，2006科学，312：404；斯提芬斯等人，2008，分子生物学杂志，381：1382)。这种稳定也可通过使Asn-224突变成Lys或Arg(在流行性1918H1N1HA中观察到Arg-224)来实现，因为这将增强其与Asp-96、Leu-97和Pro-99的氨基酸间相互作用网络(图2)。因此，特点2还可通过组合224位置处的突变来匹配。H5HA中在221位置处的残基的RBSN图与H2HA中的一致，不过这一位置在H5HA中具有Ser而在H2HA中具有Pro(图2)。Pro可能控制邻近Lys-222残基(其在与H2HA中人类受体接触中起关键作用)的构象和侧链取向。因此，在H5HA中改变Ser-221→Pro将允许特点2的更全面匹配。

区别H2与H5HA的RBS的第三特征在位置188、189、192和193处的残基和描绘其相互作用网络的RBSN图方面有许多差异(图2)。H5HA中的残基Ala-188、Ala-189和Thr-192与RBS中的其它残基不具有任何残基间接触。另一方面，残基Glu-188、Thr-189和Arg-192参与多个相互作用网络。因此，匹配特点3涉及在H5HA中在位置188、189、192和193处作出氨基改变以匹配其在H2HA中的对应相互作用网络。鉴于H5HA中所有这些残基位置的RBSN分数均较低(＜0.1)，故其为易于可突变的。最后，匹配特点4涉及去除位置158处的糖基化序列子。这可通过使Asn-158突变成如Asp的残基或通过使Thr-160突变成Ala来实现。使用这些分子特点作为导引构架，本实例首次展示出H5HA对人类受体的结合中的定量转变。

在区分H5HARBS与H2HARBS的特点方面已描述过H5HARBS，搜索这些特点的整个H5HA序列空间(来自GISAIDEpiFlu数据库(platform.gisaid.org/epi3/)的2,959个全长非冗余H5序列)，而非搜索如先前研究中所述的特定标志人类适应性突变(斯提芬斯等人，2008，分子生物学杂志，381：1382；拉塞尔等人，2012，科学，336：1541；纽曼等人，2012，公共科学图书馆·病原体，8：e1002932；梅因斯(Maines)等人，2011，病毒学，413：139)。

这一分析的结果(图4)允许在H5HA天然进化的情况下跟踪这些特点且呈现以下四个关键的观察结果：1)来自许多近期禽类和人类分离株(在2007年之后)的H5HA已获得130环中的缺失，并且因此更接近于匹配特点1；2)一些病毒株也已在220环中获得改变，如Asn-224→Lys和Ser221→Pro突变，并且因此更接近于匹配特点2；3)已在‘190-螺旋’中观察到关键氨基酸改变，具体来说在188、192和193位置处，使其更接近于匹配特点3；和4)从1959起也在许多H5HA序列中观察到158位置处的糖基化损失(特点4)。在HARBS的关键结构特点的情况下，同一HA中的130环中的缺失与同时发生的糖基化损失(特点1和4)是在H5HA在2007之后经由进化枝2序列的进一步多样化的进化中观察到的最重要变化(图4A)。具有这些关键特征的分离株从其在2007年初次出现起的百分比已显著增加。这些分离株的序列的系统发生分析已展示其属于进化枝2.2.1。相对较小百分比的H5N1分离株已在‘190-螺旋’中获得氨基酸改变更接近于匹配H2RBS的特点3(图4B)，且这些分离株属于进化枝7(戴维斯(Davis)等人，2010，禽类疾病(Aviandiseases)，54：307)。值得注意的是，我们观察到糖基化损失伴随有130环残基的缺失，但反过来并非如此。这一发现表明特定当前H5HA病毒株不仅显著不同于早期的人类分离株(如Viet04)，而且已获得匹配流行性H2HARBS所必需的关键分子特点。

基于跟踪H5HA序列的天然进化中的分子特点，选择来自不同进化枝和时间段的HA以验证我们的方法。Viet04HA在匹配特点方面最远，并且因此预测其需要最多的突变来匹配特点以便转变。其它HA选自进化枝2.2.1或进化枝7，其在匹配特点方面与H2HARBS远为更接近，并且因此预测其需要较少突变来转变成人类受体结合。这些Ha的野生型和突变型形式系统地产生且以重组方式表达，且在剂量依赖性直接结合分析中评估其聚糖结合特性(25)。结果概述在表2中。

如此实例中描述的模型所预测，在与野生型相比时，当在Viet04(表2中的V2.3)上制备时为了全面匹配特点1、2和3作出的13个氨基酸变化(包括并入残基间相互作用网络)定量地转变其对人类受体的结合(图5)。使用如先前(斯里尼瓦桑等人，2008，美国国家科学院院刊，105：2800)所描述的表观结合常数Kd′(Kd′约3pM)定量的V2.3对人类受体的结合亲和力与针对1918H1N1HA计算的结合亲和力(斯里尼瓦桑等人，2008，美国国家科学院院刊，105：2800)处于相同范围内。虽然部分匹配一或两种特点(如特点2(Gln-226→Leu/Gly-228→Ser)和4(Thr-160→Ala)(表2中的V2.1))展示对人类受体的结合实质上增加，但此突变体也保留对禽类受体的高亲和力结合，这不是定量转变所特有的。匹配特点2也经由通过在匹配特点4的情形下引入Gln-226→Leu/Asn-224→Lys突变来改进涉及220环的残基间和RBS-聚糖接触的替代性策略进行研究(Thr-160→Ala(表2中的V2.2)。此突变体展示极低聚糖-受体结合，且因此不可能将用于检核的结合亲和力确定为定量转变。因此，在此实例中，且在进化枝1HA(如Viet04)的情况下，定量转变可能需要最少匹配三种特点。

在进化枝2.2.1HA之中，选择新近的人类分离物A/埃及/N03450/2009(或Egy09)用于进一步研究，因为发现其是2.2.1中的最佳代表性病毒株，归因于其与进化枝2.2.1共有序列的高度序列相似性。Egy09HA已具有在130环处的缺失，在158位置处的糖基化序列子损失，由此匹配特点1和4(表2)。此外，Egy09HA中涉及Glu-13l、Ser-133和Thr-155的RBSN图与Alb58HA中涉及Thr-131、Thr-133和Thr-155的对应图一致(RBSN图未示出)。同时，Egy09中涉及残基Ala-188和Thr-192的RBSN图与H2HARBS中涉及残基Glu-188和Arg-192的对应图类似。因此，如由本实例的“特点匹配”分析所预测，Egy09HA中需要较少氨基酸变化来匹配所有四种特点(表2中的E4.2)，从而定量地转变其对人类受体的结合(图6A和6B)。E4.2的人类受体亲和力通过Kd′(约25pM)定量。经由在Egy09中引入Gln-226→Leu和Asn224→Lys的替代性策略进行的匹配特点2产生突变型HA，其中特点1、2和4匹配(E4.3)，其也展示出从禽类到人类受体结合的可观察的定量转变(图6C)。E4.3对人类受体的结合亲和力是约50pM。因此，即使在进化枝2.2.1的情况下，匹配4种特点中的3种也定量地转变其对人类受体的结合偏好。此外，Egy09的RBS似乎已进化，使得仅两个氨基酸变化足以匹配4种特点中的3种以实现具有病毒传播所必需的特征性人类受体结合的转变。

根据我们在Egy09中仅用2个氨基酸变化就匹配特点2的成功以及Asn-224→Lys已在一些新近H5N1分离株中观察到的事实，我们寻求确定此突变是否天然出现在任何进化枝2.2.1HA序列中。搜索产生选择序列，在这之中我们选择另一进化枝2.2.1HA，即A/鸭/埃及/10185SS/2010(Egy10)HA，其将仅需要Gln→226Leu改变来匹配4种特点中的3种。与此预测一致，Egy10仅需要单一碱基对突变引起Gln-226→Leu改变来以约100pM的结合亲和力Kd′(图6D)以与2009H1N1流行性HA类似的方式定量地转变其对人类受体的结合偏好，且通过病毒传播所必需的阈值(图1)。

在进化枝7HA之中，选择鸡/越南/NCVD-093/08(ckViet08)，因为其似乎为此进化枝的最佳代表，且已在‘190-螺旋’中(具体地在位置188、192和193处)获得氨基酸变化，以使其更接近于匹配H2HARBS的特点3。在此HA上，为了匹配特点1(引入130环缺失和Leu-133→Thr突变)、特点2(LS+Ser137→Arg)、特点3(Asn-187→Asp和Met-193→Thr)和特点4(在158处的糖基化损失)的系统氨基酸变化定量地转变其对人类受体的结合偏好(表2中的V4.3)。

综上所述，使用定义表征H5HA的RBS的分子特点的新颖方法，本实例展示了来自特定新近进化枝2.2.1H5N1分离株的HA仅需要单一Gln226→Leu氨基酸突变来定量地转变其对人类受体的结合。在此实例中描述的方法强调了分析将定量地转变对人类受体的结合的RBS特点的需要。从此方法看很明显的是，对于既定H5HA，有不同的方式来匹配RBS特点，且人类适应所需的氨基酸数量是可变参数，其关键取决于H5HA天然序列进化。实际上，当在代表性进化枝2.2.1HA中引入赋予Ind05病毒在雪貂中的气溶胶传播性的相同氨基酸变化时，观察到显著不同的聚糖结合特性(图7)。此外，在进化枝lHA(如Viet04)中在不存在l30环缺失的情况下仅匹配特点2(Asn-224→Lys和Gly226→Leu突变)和特点4展示出实质上较低的聚糖结合信号。此发现强调了本发明方法的重要性，在H5HA进化的情形下捕获RBS特点，而非简单地使用针对Viet04(今井等人，2012，自然，486：420)或Ind05(赫斯特等人，2012，科学，336：1534)报导的特定氨基酸变化作为所有H5HA的人类适应的起始点。

已天然获得特点1和4的H5N1HA的系统发生分析展示出其属于进化枝2.2.1，且已获得特点3的那些属于进化枝7。值得注意的是，来自属于这些进化枝的病毒株的HA更接近于人类适应。重要的是，除Ser137→Arg、Gln226→Leu和Gly228→Ser之外，所有其它氨基酸变化(以及130环中的缺失)已在H5N1中观察到(在2006年后的更为新近的病毒株中)，且这些变化也维持H5N1HA序列的进化。因此，一种如此实例所需展现的前瞻性监督策略可涉及监测这些变化在目前循环H5HA中的共同出现。应注意，大多数当前流感监测努力集中在亚洲次大陆(中国、越南和泰国)。然而，属于进化枝2.2.1的所有人类H5N1分离株均来自埃及和以色列。密切监视进化枝2.2.1和进化枝7病毒株的进化将是很重要的。关于人类H5N1适应和疫苗策略的许多焦点是围绕2003年-2006年的病毒株。目前五种批准用于临床用途的人类H5N1疫苗也是基于来自先前进化枝的病毒株。

在此实例中，使用比较HA之间的抗原一致性的量度(萨拉卡拉曼K(Tharakaraman，K)等人；手稿已提交)，以便使抗原一致性与中和雪貂中的抗血清反应的交叉反应性相关。此分析展示出与较差交叉保护相关的低抗原一致性。延伸此分析，我们展示了2003年-2006年的病毒株(如Viet04和Ind05)与进化枝2.2.1和进化枝7共有低抗原一致性。因此，目前批准的人类H5N1疫苗不大可能有效地保护由在这一研究中描述的进化枝2.2.1和进化枝7病毒株的野生型和突变型形式引起的感染。来自我们方法的结果提供了以下见解：监测当前H5N1病毒株进化可能是潜在有价值的，且也可强化现有疫苗策略以便在H5N1在人类群体中可能的爆发的情况下更好地作好流行前准备。

材料与方法

HA的克隆、杆状病毒合成、表达以及纯化

为进行昆虫细胞表达，对H5野生型和变异型HA序列进行密码子优化并且在DNA2.0(加利福尼亚州门洛帕克(MenloPark，CA))合成。接着，将合成的基因亚克隆到pAcGP67A质粒中，并且使用巴库洛戈德系统(Baculogoldsystem)(加利福尼亚州圣何塞的碧迪生物科学公司(BDBiosciences，SanJose，CA)根据制造商的说明产生杆状病毒。接着使用重组杆状病毒感染于BD巴库洛戈德Max-XPSFM(BDBaculogoldMax-XPSFM)(加利福尼亚州圣何塞的碧迪生物科学公司)中培养的Sf9细胞悬浮培养物。监测感染并且在感染后3-4天收获条件培养基。使用镍亲和色谱法(HisTrapHP柱，新泽西州皮斯卡塔韦的通用电气医疗集团(GEHealthcare，Piscataway，NJ))将来自所收获的条件培养基的可溶性HA纯化。将含有HA的洗脱份汇集，浓缩并且使用100KMWCO旋转柱(马萨诸塞州比勒利卡的密理博公司(Millipore，Billerica，MA))缓冲交换到1×PBSpH8.0(吉卜可(Gibco))中。使用BCA方法(皮尔斯(Pierce))定量已纯化的蛋白。

为进行哺乳动物表达，对基因进行密码子优化，合成(DNA2.0，加利福尼亚州门洛帕克)且亚克隆到经修饰的pcDNA3.3载体中以便在CMV启动子下表达。HA的重组表达在HEK293-FFreeStyle悬浮细胞(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA))中进行，所述悬浮细胞培养在293-FFreeStyle表达培养基(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)中，维持在37℃80％湿度和8％CO₂下。细胞经HA质粒以聚-乙烯-亚胺Max(PEI-MAX，宾夕法尼亚州沃林顿的波利塞斯公司(PolySciences，Warrington，PA))转染，且在感染后七天收集。上清液通过离心收集，经由0.45μm过滤器系统(纽约州罗契斯特的奈尔津公司(Nalgene，Rochester，NY))过滤，且补充有1∶1000稀释的蛋白酶抑制剂混合液(卡尔生物化学公司(Calbiochem)过滤且补充有1∶1000稀释的蛋白酶抑制剂混合液(马萨诸塞州比勒利卡的EMD密理博公司(EMDMillipore，Billerica，MA))。使用His-trap柱(通用电气医疗集团(GEHealthcare))在AKTA纯化器FPLC系统上从上清液中纯化HA。将含有HA的洗脱份汇集，浓缩并且使用100KMWCO旋转柱(马萨诸塞州比勒利卡的密理博公司)缓冲交换到1×PBSpH7.4中。经纯化蛋白质使用BCA方法(伊利诺伊州罗克福德的皮尔斯公司(Pierce，Rockford，IL))定量。

两种表达系统均用于此实例。重要的是，在与来源于哺乳动物表达的物质的聚糖结合特性相比时，在来源于杆状病毒的HA的聚糖结合特性中未观察到差异。

HA的同源性建模

Alb58HA三聚体的结构模型使用MODELLER同源性建模软件建立。为了建立模型，将A/新加坡/1/57血球凝集素与人类受体(PDB：2WR7)的解析的晶体结构用作模板，其HA1与Alb58具有99％序列一致性。在建模期间，将配体(人类受体)从模板结构复制到模型结构中。将最终模型最小化以释放内部约束。

野生型和变异型HA与HA受体聚糖的剂量依赖性直接结合

为研究多价HA-聚糖相互作用，如先前所述使用包含代表性生物素化α2→3和α2→6唾液酸化聚糖的链霉亲和素板阵列。3′SLN、3′SLN-LN、3′SLN-LN-LN为代表性禽类受体。6′SLN和6′SLN-LN为代表性人类受体。LN对应于乳糖胺(Galβ1-4GlcNAc)，而3′SLN和6′SLN分别对应于连接于LN的Neu5Acα2-3和Neu5Acα2-6。从功能糖组学联盟通过其资源申请项目获得生物素化聚糖。通过将孔在4℃下与50μl的2.4μM生物素化聚糖一起培育过夜来将链霉亲和素涂布的高结合容量384孔板(皮尔斯公司)的每一孔装到满容量。通过用PBS大量洗涤去除过量聚糖。三聚HA单元包含三个HA单体(并且因此三个RBS，每一单体一个RBS)。生物素化聚糖在链霉亲和素板阵列的孔中的空间排列有利于与三聚HA单元中的三个HA单体中的仅一者结合。因此，为特别提高HA-聚糖相互作用的多价性，将重组HA蛋白与一级和二次抗体以摩尔比4∶2∶l(HA：一级：二级)预复合。4个三聚HA单元在所有HA的预复合物中的一致排列允许在其聚糖结合亲和力之间进行比较。储备溶液含有适当量的组氨酸标记HA蛋白、一次抗体(来自艾碧康(Abcam)的小鼠抗6×His标签IgG)以及二次抗体(来自圣克鲁兹生物技术公司(SantacruzBiotechnology)的HRP偶联山羊抗小鼠IgG)，比率为4∶2∶1，并且在冰上培育20分钟。使用含1％BSA的PBS将适当量的预复合储备HA稀释到250μl。将50μl此预复合HA添加到每一个聚糖涂布孔中并且在室温下培育3小时，随后进行使用PBS和PBST(1×PBS+0.05％Tween-20)的洗涤步骤。基于HRP活性使用Amplex红色过氧化酶分析试剂盒(加利福尼亚州的英杰公司)根据制造商的说明测定结合信号。实验一式三份地进行。最小结合信号在阴性对照中观察到，包括预复合单元结合于无聚糖的孔以及仅抗体结合于有聚糖的孔。通过将平均结合信号值(来自一式三份的分析)和HA浓度拟合于线性化形式的希尔方程式(Hillequation)来计算HA聚糖结合的结合参数、协同性(n)和表观结合常数(Kd′)：

$log\left(\frac{y}{1-y}\right)=n*log(\[HA\])-log\left({K_d}^{\′}\right)$

其中y是饱和分率(平均结合信号/观察到的最大结合信号)。为了比较Kd′值，将这一研究中报导的值对应于适当代表性禽类(3′SLN-LN或3′SLN-LN-LN)和人类(6′SLN-LN)受体，其得到对上述方程式的最佳拟合和相同斜率值(n约1.3)。

如上文所指出，在与经由哺乳动物表达产生的HA的聚糖结合特性相比时，来源于杆状病毒的HA的聚糖结合特性不存在差异。

捕获RBS残基网络(RBSN).

将H5HA-禽类受体和Alb58HA-人类受体复合物的座标上载到PDBePISA服务器(http：//www.ebi.ac.uk/msd-srv/prot_int/pistart.html)中以确定HARBS中与对应的聚糖受体接触的关键残基(使用30％的界面截止)。对于这些残基，其环境使用的距离阈值定义，且如先前所描述计算在这一阈值距离内的残基对之间出现的接触，包括推定的氢键(包括水桥联氢键)、二硫键、π键、极性相互作用、盐桥和范德华相互作用(VanderWaalsinteraction；非氢)(桑德拉拉汗(Soundararajan)等人，2011，科学报导(Sci.Rep.)，1)。将这些数据组合到八原子相互作用矩阵的阵列中。接着，使用从相对原子相互作用能量获得的加权，计算八原子相互作用矩阵的加权和，产生解释RBS内残基对之间的原子相互作用强度的单一矩阵(桑德拉拉汗等人，2011，科学报导，1)。以这一方式计算的残基间相互作用网络产生了描述由关键RBS残基与其环境中空间接近的邻近残基作出的所有接触的矩阵。每一要素i，j是残基i与j之间的所有路径的路径分数总和。通过跨矩阵行求和来计算每一残基的网络连接分数程度，其意欲对应于每一残基的“网络连接”程度。将网络连接分数程度归一化(RBSN分数)，且每一蛋白的分数最大，以使分数从0(不存在任何网络)到1(最大网络化)之间变化。

H5HA的序列分析以及关键特征的估计

从EpiFlu数据库下载总共6,014个H5HA序列。从这之中，仅考虑具有包括开始和终止密码子的完整编码区的那些序列。为了避免因多次表示的序列所致的估计错误，数据集中所有一致的序列群组由所述群组中最原先的序列表示。将剩余的2,959个序列按分离时间排序，比对，且计算每一特点的发生率(定义为从含有所述特点的既定年份起序列的百分率)。

Claims (33)

1.一种多肽，其序列包括对应于参考序列元件的元件，所述参考序列元件包含不介导显著人类感染性的参考H5HA的残基130-228，

其中所述多肽的序列元件展示出与所述参考序列元件至少80％总体序列一致性但并不与所述参考序列元件一致，因为其包括以下各者中的至少一者：

i.第一特征，其为对应于所述参考H5HA的氨基酸130的氨基酸的缺失；

ii.第二特征，其选自由以下组成的群组：

i.Xaa₂₂₆+ser228，

ii.Lys₂₂₄+Xaa₂₂₆，

iii.Xaa₁₃₇+Xaa₂₂₆+ser228，

iv.Xaa₂₂₆+gly227+ser228，

v.Xaa₁₃₇+pro221+Xaa₂₂₆+ser228，以及

vi.Xaa₁₃₇+thr155+pro221+Xaa₂₂₆+gly227+ser228；

iii.第三特征，其选自由以下组成的群组：

i.glu188+Xaa₁₉₂+Xaa₁₉₃，

ii.asp187+Xaa₁₉₃，以及

iii.Xaa₁₉₃；以及

iv.第四特征，其选自由以下组成的群组：

i.ala160，

ii.asn158+ala160，以及

iii.asn158+thr160，

其中所述第二、第三和第四特征的所述氨基酸的位置对应于所述参考H5HA的参考位置，且其中Xaa₂₂₆是选自Leu、Ile、Val、Met和Ala群组，Xaa₁₃₇是选自Arg、Lys、Gln、Glu、His和Asn群组，Xaa₁₉₂是选自Arg、Thr、Ala、Val、Leu和Ile群组，且Xaa₁₉₃是选自Thr、Ala、Lys、Arg和His群组。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包括至少两种特征。

3.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包括至少三种特征。

4.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包括所有四种特征。

5.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽的长度在98个氨基酸与400个氨基酸之间且包括端点。

6.根据权利要求1所述的多肽，其中所述肽的序列元件的长度在98个氨基酸与230个氨基酸之间且包括端点。

7.一种疫苗组合物，其包含至少一种抗原，所述至少一种抗原包含

多肽，其序列包括对应于参考序列元件的元件，所述参考序列元件包含不介导显著人类感染性的参考H5HA的残基130-228，

其中所述多肽的序列元件展示出与所述参考序列元件至少80％总体序列一致性但并不与所述参考序列元件一致，因为其包括以下各者中的至少一者：

第一特征，其为对应于所述参考H5HA的氨基酸130的氨基酸的缺失；

第二特征，其选自由以下组成的群组：

i.Xaa₂₂₆+ser228，

ii.Lys₂₂₄+Xaa₂₂₆，

iii.Xaa₁₃₇+Xaa₂₂₆+ser228，

iv.Xaa1+gly227+ser228，

v.Xaa₁₃₇+pro221+Xaa₂₂₆+ser228，以及

vi.Xaa₁₃₇+thr155+pro221+Xaa₂₂₆+gly227+ser228；

第三特征，其选自由以下组成的群组：

iv.glu188+Xaa₁₉₂+Xaa₁₉₃，

v.asp187+Xaa₁₉₃，以及

vi.Xaa₁₉₃；以及

第四特征，其选自由以下组成的群组：

iv.ala160，

v.asn158+ala160，以及

vi.asn158+thr160，

其中所述第二、第三和第四特征的所述氨基酸的位置对应于所述参考H5HA的参考位置，且其中Xaa₂₂₆是选自Leu、Ile、Val、Met和Ala群组，Xaa₁₃₇是选自Arg、Lys、Gln、Glu、His和Asn群组，Xaa₁₉₂是选自Arg、Thr、Ala、Val、Leu和Ile群组，且Xaa₁₉₃是选自Thr、Ala、Lys、Arg和His群组；和

医药学上可接受的载剂。

8.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中所述多肽包括至少两种特征。

9.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中所述多肽包括至少三种特征。

10.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中所述多肽包括所有四种特征。

11.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中所述多肽的长度在98个氨基酸与400个氨基酸之间且包括端点。

12.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中所述肽的序列元件的长度在98个氨基酸与230个氨基酸之间且包括端点。

13.一种提供疫苗的方法，其包含

提供至少一种抗原，所述至少一种抗原包含多肽，所述多肽的序列包括对应于参考序列元件的元件，所述参考序列元件包含不介导显著人类感染性的参考H5HA的残基130-228，

其中所述多肽的序列元件展示出与所述参考序列元件至少80％总体序列一致性但并不与所述参考序列元件一致，因为其包括以下各者中的至少一者：

第一特征，其为对应于所述参考H5HA的氨基酸130的氨基酸的缺失；

第二特征，其选自由以下组成的群组：

i.Xaa₂₂₆+ser228，

ii.Lys₂₂₄+Xaa₂₂₆，

iii.Xaa₁₃₇+Xaa₂₂₆+ser228，

iv.Xaa₂₂₆+gly227+ser228，

v.Xaa₁₃₇+pro221+Xaa₂₂₆+ser228，以及

vi.Xaa₁₃₇+thr155+pro221+Xaa₂₂₆+gly227+ser228；

第三特征，其选自由以下组成的群组：

i.glu188+Xaa₁₉₂+Xaa₁₉₃，

ii.asp187+Xaa₁₉₃，以及

iii.Xaa₁₉₃；以及

第四特征，其选自由以下组成的群组：

i.ala160，

ii.asn158+ala160，以及

iii.asn158+thr160，

其中所述第二、第三和第四特征的所述氨基酸的位置对应于所述参考H5HA的参考位置，且其中Xaa₂₂₆是选自Leu、Ile、Val、Met和Ala群组，Xaa₁₃₇是选自Arg、Lys、Gln、Glu、His和Asn群组，Xaa₁₉₂是选自Arg、Thr、Ala、Val、Leu和Ile群组，且Xaa₁₉₃是选自Thr、Ala、Lys、Arg和His群组；以及

将所述提供的至少一种抗原调配到疫苗组合物中。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述多肽包括至少两种特征。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述多肽包括至少三种特征。

16.根据权利要求13所述的方法，其中所述多肽包括所有四种特征。

17.根据权利要求13所述的方法，其中所述多肽的长度在98个氨基酸与400个氨基酸之间且包括端点。

18.根据权利要求13所述的方法，其中所述肽的序列元件的长度在98个氨基酸与230个氨基酸之间且包括端点。

19.一种诊断试剂盒，其用于测定H5流感病毒株的流行性风险，所述试剂盒包含

至少一种抗体，其结合于多肽，所述多肽的序列包括对应于参考序列元件的元件，所述参考序列元件包含不介导显著人类感染性的参考H5HA的残基130-228，

其中所述多肽的序列元件展示出与所述参考序列元件至少80％总体序列一致性但并不与所述参考序列元件一致，因为其包括以下各者中的至少一者：

第一特征，其为对应于所述参考H5HA的氨基酸130的氨基酸的缺失；

第二特征，其选自由以下组成的群组：

i.Xaa₂₂₆+ser228，

ii.Lys₂₂₄+Xaa₂₂₆，

iii.Xaa₁₃₇+Xaa₂₂₆+ser228，

iv.Xaa₂₂₆+gly227+ser228，

v.Xaa₁₃₇+pro221+Xaa₂₂₆+ser228，以及

vi.Xaa₁₃₇+thr155+pro221+Xaa₂₂₆+gly227+ser228；

第三特征，其选自由以下组成的群组：

i.glu188+Xaa₁₉₂+Xaa₁₉₃，

ii.asp187+Xaa₁₉₃，以及

iii.Xaa₁₉₃；以及

第四特征，其选自由以下组成的群组：

i.ala160，

ii.asn158+ala160，以及

iii.asn158+thr160，

其中所述第二、第三和第四特征的所述氨基酸的位置对应于所述参考H5HA的参考位置，且其中Xaa₂₂₆是选自Leu、Ile、Val、Met和Ala群组，Xaa₁₃₇是选自Arg、Lys、Gln、Glu、His和Asn群组，Xaa₁₉₂是选自Arg、Thr、Ala、Val、Leu和Ile群组，且Xaa₁₉₃是选自Thr、Ala、Lys、Arg和His群组。

20.根据权利要求19所述的诊断试剂盒，其中所述多肽包括至少两种特征。

21.根据权利要求19所述的诊断试剂盒，其中所述多肽包括至少三种特征。

22.根据权利要求19所述的诊断试剂盒，其中所述多肽包括所有四种特征。

23.根据权利要求19所述的诊断试剂盒，其中所述多肽的长度在98个氨基酸与400个氨基酸之间且包括端点。

24.根据权利要求19所述的诊断试剂盒，其中所述肽的序列元件的长度在98个氨基酸与230个氨基酸之间且包括端点。

25.根据权利要求19所述的诊断试剂盒，其中所述参考序列元件在位置158处未经糖基化。

26.根据权利要求19所述的诊断试剂盒，其进一步包含结合于不感染人类的参考H5HA的抗体。

27.一种监测样品中的流感的方法：

a.从怀疑含有流感的来源获得样品；

b.使所述样品与一或多种特异性结合于根据权利要求1所述的H5HA多肽的试剂接触；

c.检测所述试剂与所述样品的结合，以便测定所述H5HA在所述样品中的存在和/或水平。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述来源是环境来源。

29.根据权利要求27所述的方法，其中所述来源是人类患者。

30.根据权利要求27所述的方法，其中所述获得、接触和检测步骤在从所述第一次获得、接触和检测步骤完成起经过一段时间之后重复至少一次。

31.根据权利要求27所述的方法，其进一步包含使来自所述来源的样品与一或多种特异性结合于不感染人类的H5HA的试剂接触。

32.一种多肽，其序列包括对应于参考序列元件的元件，所述参考序列元件包含不介导显著人类感染性的参考H5HA的残基130-228，

其中所述多肽的序列元件展示出与所述参考序列元件至少80％总体序列一致性但并不与所述参考序列元件一致，因为其包括以下各者中的至少一者：

第一特征，其为对应于所述参考H5HA的氨基酸130的氨基酸的缺失；

第二特征，其为arg137+thr155+pro221+leu226+gly227+ser228；

第三特征，其为glu188+arg192+ala193；以及

第四特征，其为asn158+thr160，

其中所述第二、第三和第四特征的所述氨基酸的位置对应于所述参考H5HA的参考位置。

33.一种多肽，其序列包括对应于参考序列元件的元件，所述参考序列元件包含不介导显著人类感染性的参考H5HA的残基130-228，

其中所述多肽的序列元件展示出与所述参考序列元件至少80％总体序列一致性但并不与所述参考序列元件一致，因为其包括以下各者中的至少一者：

第一特征，其为对应于所述参考H5HA的氨基酸130的氨基酸的缺失；

第二特征，其为arg137+lys226+ser228，

第三特征，其为asp187+thr193；以及

第四特征，其为asn158+ala160，

其中所述第二、第三和第四特征的所述氨基酸的位置对应于所述参考H5HA的参考位置。