JP2016509609A - Ｈ５インフルエンザのヒトへの適応 - Google Patents

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Abstract

本発明は、とりわけ、インフルエンザの伝染および／または感染の検出、処置および／または予防のための技術および方法論を提供する。本発明は、ヒトへの適応のための変異に対する特定の程度の感受性を有するインフルエンザＨＡバリアントをモニタリングするための技術もまた提供する。例えば、本開示は、ＨＡポリペプチドを記述し、特に、そのアミノ酸配列が参照ＨＡ（例えば、参照Ｈ５）またはその関連する一部分との高い程度の配列同一性を示すが、ある特定の定義された配列特徴の存在または非存在が異なる、Ｈ５ ＨＡポリペプチドを提供する。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１３年２月７日に出願された米国仮特許出願第６１／７６２，１０３号に対する優先権を主張し、その内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号Ｒ３７ ＧＭ０５０７０７３の下、政府援助により行われた。政府は、本発明における特定の権利を有する。
一般にフルー（ｆｌｕ）と称されるインフルエンザは、鳥類および哺乳動物に共通して感染するＲＮＡウイルスによって引き起こされる感染性疾患である。Ｈ５Ｎ１株を含むトリインフルエンザは、高度に伝染性で潜在的に致死的な病原体であるが、現在のところ、ヒトに感染する限定的な能力を有するにすぎない。しかし、トリインフルエンザウイルスは、宿主特異性を変更し得、ヒト感染を潜在的に可能にし得る変異を蓄積することが公知である。２０世紀の２回の主要なインフルエンザパンデミックは、その遺伝子構造を変化させてヒト感染を可能にしたトリインフルエンザウイルスに由来した。
インフルエンザウイルスの一定の進化を考慮すると、現在のトリインフルエンザ株は、その宿主特異性を変更し、ヒトに感染することを可能にする変異を蓄積する可能性があるという懸念がある。トリインフルエンザパンデミックのコストは、２００５年に、かなりとなる可能性がある；このようなパンデミックの脅威は、潜在的なパンデミックを管理しそれと闘うための戦略を開発する試みにおいて、中央政府によって数十億ドルが費やされるという結果を生じた。したがって、高リスクのインフルエンザ株を予測するための改善された監視技法および方法は、ヒトパンデミックのリスクを予防または最小化することにおいて価値を有し得る。特にヒトのインフルエンザ感染の処置および／または予防のためのワクチンを具体的に含む治療剤の開発の必要性が、十分に認識されている。新興株およびその（ｔｈｅｉｎ）感染性の特徴を同定および／または特徴付けるための改善された監視技術もまた必要とされている。
本発明は、インフルエンザの伝染および／または感染の検出、処置および／または予防における使用のための組成物および方法を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、特にヒトにおけるインフルエンザの感染および／または伝染を処置または予防するための、ワクチン組成物などの治療剤を提供する。例えば、本開示は、ＨＡポリペプチドを記述し、特に、そのアミノ酸配列が参照ＨＡ（例えば、参照Ｈ５）またはその関連する一部分との高い程度の配列同一性を示すが、ある特定の定義された配列特徴の存在または非存在が異なる、Ｈ５ ＨＡポリペプチドを提供する。一般に、この参照ＨＡは、重大なヒト感染および／または伝染を媒介しないＨＡである（例えば、このようなヒト感染および／または伝染を評価するための１つまたは複数の確立または記載されたアッセイ系において試験した場合）。一部の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、ヒト感染および／または伝染を媒介するＨＡポリペプチドである。一部の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、このようなヒト感染および／または伝染を媒介することが既知の参照ＨＡのものと匹敵するヒト感染および／または伝染の特徴を示す。
したがって、本発明は、ある特定のＨＡポリペプチドおよびその関連する断片、それらを含有する組成物、ならびにそれらを製造または使用する方法を提供する。
本発明は、例えば提供されたＨＡポリペプチドおよび断片へ直接結合することによって、提供されたＨＡポリペプチドおよび断片を検出する作用物質（ａｇｅｎｔ）もまた提供する。一部の実施形態では、このような検出剤は、１つまたは複数の提供されたＨＡポリペプチドに直接結合する抗体である、またはこのような抗体を含む。一部の実施形態では、検出剤は、特定の提供されたＨＡポリペプチドと１つまたは複数の参照ＨＡとを識別する。一部の実施形態では、検出剤は、特定の提供されたＨＡポリペプチド配列が、本明細書に示される１つまたは複数の特徴の存在または非存在においてのみ参照ＨＡのポリペプチド配列と異なる場合であっても、該提供されたＨＡポリペプチドと１つまたは複数の参照ＨＡとを識別する；一部のこのような実施形態では、この検出剤は、診断キット間、ワクチン組成物を製造する方法間を識別する。一部の実施形態では、結合剤は、特定の提供されたＨＡポリペプチド配列が、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのこのような特徴の存在または非存在においてのみ参照ＨＡのポリペプチド配列と異なる場合であっても、該提供されたＨＡポリペプチドと１つまたは複数の参照ＨＡとを区別する。一部の実施形態では、結合剤は、特定の提供されたＨＡポリペプチド配列が、本明細書に記載される単一の特徴の存在または非存在においてのみ参照ＨＡのポリペプチド配列と異なる場合であっても、該提供されたＨＡポリペプチドと１つまたは複数の参照ＨＡとを区別する。
一部の実施形態では、本発明は、インフルエンザ感染を検出、特徴付けおよび／またはモニタリングするための技法および試薬を提供する。一部のこのような実施形態では、提供された技法および試薬は、単一の個体生物（例えば、単一のヒト）中に存在するインフルエンザ株を検出、特徴付けおよび／またはモニタリングするために利用される。一部の実施形態では、提供された技法および試薬は、生物の（例えば、ヒトの）集団中に存在するインフルエンザ株を検出、特徴付けおよび／またはモニタリングするために利用される。一部の実施形態では、提供された技法および試薬は、区域または環境中に存在するインフルエンザ株を検出、特徴付けおよび／またはモニタリングするために利用される。
図１、パネル１Ａ〜１Ｃは、ヒトおよび／またはトリ受容体に対する、例示的なＨ１、Ｈ２およびＨ５のパンデミックＨＡの結合プロファイルを示す図である。Ａ．ヒト受容体（６’ＳＬＮ−ＬＮ）およびトリ受容体（３’ＳＬＮ−ＬＮ）に対するＡ／Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ／１／１９１８の結合親和性。Ｂ．ヒト受容体（６’ＳＬＮ−ＬＮ）およびトリ受容体（３’ＳＬＮ−ＬＮ）に対するＡ／Ａｌｂａｎｙ／６／１９５８（Ａｌｂ５８）の結合親和性。Ｃ．ヒト受容体（６’ＳＬＮ−ＬＮ）およびトリ受容体（３’ＳＬＮ−ＬＮ）に対するＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９の結合親和性。パネルＤは、ヒト受容体（６’ＳＬＮ−ＬＮ）およびトリ受容体（３’ＳＬＮ−ＬＮ）に対する、ＬＳ変異の導入後のＶｉｅｔ０４ Ｈ５ ＨＡ株の結合プロファイルを示す。
図２は、代表的Ｈ２受容体結合部位と代表的Ｈ５受容体結合部位との間の比較を示す図である。
図３は、いくつかのインフルエンザサブタイプの系統樹を示す図である。密接に関連したサブタイプは、互いに近い枝上に位置付けられる。
図４、パネル４Ａおよび４Ｂは、Ｈ５ ＨＡ株における特異的ＲＢＳ特徴の、経時的な存在または非存在を示す図である。Ａ．そのＨＡがＨ２ ＨＡ ＲＢＳの特徴とマッチするように２つの特異的アミノ酸変化を獲得したトリおよびヒトのＨ５Ｎ１分離株の、経時的なパーセント分率。Ｂ．そのＨＡがＨ２ ＨＡ ＲＢＳの特徴とマッチするようにアミノ酸変化を獲得したトリおよびヒトの分離株の、経時的なパーセント分率。
図５：パネル５Ａおよび５Ｂは、野生型インフルエンザウイルスおよび一部の実施形態に従って変異したバージョンの結合プロファイルを示す図である。Ａ．いくつかの受容体に対する野生型Ｖｉｅｔ０４ ＨＡの用量依存的直接的結合を示す。Ｂ．いくつかの受容体に対するＶｉｅｔ０４ ＨＡのＶ２．３バリアントの用量依存的直接的結合を示す。バリアント形態が、その結合優先性を量的に切り替えること、即ち、野生型Ｖｉｅｔ０４ ＨＡと比較した場合、ヒト受容体、具体的には６’ＳＬＮ−ＬＮに対して高親和性の結合およびトリ受容体に対して最小の結合を示すことに留意のこと。
図６：パネルＡは、特徴１および４とマッチするように天然に進化したＥｇｙ０９ Ｈ５ ＨＡの例示的な用量依存的直接的グリカンアレイ結合プロファイルを示す図である。３’ＳＬＮを除き、このＨＡによるトリ受容体への結合は、Ｖｉｅｔ０４のものと類似である。Ｂ、その結合をヒト受容体へと量的に切り替えるためにより少ないアミノ酸変化を必要としたＥｇｙ０９のＥ４．２変異体の例示的な用量依存的直接的グリカンアレイ結合を示す。Ｃ、特徴１、２および４とマッチするための２つのアミノ酸変異Ａｓｎ−２２４→Ｌｙｓ／Ｇｌｎ−２２６→Ｌｅｕのみを有するＥｇｙ０９ Ｈ５ ＨＡの例示的な用量依存的直接的グリカンアレイ結合を示す。Ｄ、特徴１、２および４とマッチするための単一の変異Ｇｌｎ２２６→Ｌｅｕを有するｄｋＥｇｙ１０ Ｅ５．１変異体の例示的な用量依存的直接的結合を示す。
図７、パネル７Ａおよび７Ｂは、異なる株に属するＨ５Ｎ１ ＬＳ変異体の用量依存的直接的グリカンアレイ結合を示す図である；ｘ軸はＨＡ濃度であり、ｙ軸は、最大シグナルの百分率として表された結合シグナル値である。Ａ、１５８位〜１６０位におけるグリコシル化シークオンを天然に欠如したＡ／Ｅｇｙｐｔ／ＮＡＭＲＵ−３／０６（Ｅｇｙ０６）ＨＡ。Ｂ、１５８〜１６０のグリコシル化シークオンをこれもまた天然に欠如した、クレード２．２．１に属する代表的な最近のＨ５Ｎ１ ＨＡであるＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｒ２／０７。
図８は、グリカン受容体特異性を理解するためのフレームワークを示す図である。α−２−３結合型および／またはα−２−６結合型グリカンは、異なるトポロジーをとり得る。本発明によれば、これらのトポロジーのうちのある特定のものに結合するＨＡポリペプチドの能力は、異なる宿主、例えばヒトの感染を媒介する能力をそれに付与する。この図のパネルＡに示されるように、本発明は、２つの特に関連するトポロジー、「円錐型」トポロジーおよび「傘型」トポロジーを定義する。この円錐型トポロジーは、α−２−３結合型および／またはα−２−６結合型グリカンによってとられ得、コアに結合した短いオリゴ糖または分岐鎖オリゴ糖に典型的である（このトポロジーは、ある特定の長いオリゴ糖によってとられ得るが）。この傘型トポロジーは、α−２−６結合型グリカンのみによってとられ得（おそらくは、α−２−６連結中に存在する余分なＣ５−Ｃ６結合によって得られる増加したコンフォメーションの複数性に起因する）、特にモチーフＮｅｕ５Ａｃ α ２−６Ｇａｌ β １−３／４ＧｌｃＮＡｃ−を含有する、長いオリゴ糖または長いオリゴ糖分岐を有する分岐鎖グリカンによって優先的にとられる。本明細書に記載するように、ＨＡポリペプチドが傘型グリカントポロジーを結合する能力は、ヒト受容体に対する結合および／またはヒトの感染を媒介する能力を付与する。この図のパネルＢは、三糖モチーフ−−それぞれＮｅｕ５Ａｃ α ２−３Ｇａｌ β １−３／４ＧｌｃＮＡｃおよびＮｅｕ５Ａｃ α ２−６Ｇａｌ β １−４ＧｌｃＮＡｃのグリコシドねじれ角によって支配されるような、α−２−３およびα−２−６のトポロジーを具体的に示す。パラメーター（θ）−−Ｎｅｕ５ＡｃのＣ２原子とこれらの三糖モチーフ中の引き続くＧａｌおよびＧｌｃＮＡｃ糖のＣ１原子との間の角度を定義して、トポロジーを特徴付けた。
図９は、例示的な円錐型トポロジーを示す図である。この図は、円錐型トポロジーをとるある特定の例示的な（しかし網羅的ではない）グリカン構造を示す。
図１０は、例示的な傘型トポロジーを示す図である。この図は、傘型トポロジーをとり得るある特定の例示的な（しかし網羅的ではない）Ｎ結合型およびＯ結合型グリカン構造を示す。 図１０は、例示的な傘型トポロジーを示す図である。この図は、傘型トポロジーをとり得るある特定の例示的な（しかし網羅的ではない）Ｎ結合型およびＯ結合型グリカン構造を示す。
図１１は、例示的な傘型トポロジーを示す図である。この図は、傘型トポロジーをとり得るある特定の例示的な（しかし網羅的ではない）Ｏ結合型グリカン構造を示す。
ＨＡ配列エレメントの説明
ＨＡ配列エレメント１
ＨＡ配列エレメント１は、天然のインフルエンザ分離株において見出される多くのＨＡタンパク質の残基９７〜１８５（残基位置は、参照としてＨ３ ＨＡを使用して割り当てられる）におよそ対応する配列エレメントである。この配列エレメントは、以下の基本構造：
Ｃ（Ｙ／Ｆ）ＰＸ１ＣＸ２ＷＸ３ＷＸ４ＨＨＰを有し、式中：
Ｘ１は、およそ３０〜４５アミノ酸長であり、
Ｘ２は、およそ５〜２０アミノ酸長であり、
Ｘ３は、およそ２５〜３０アミノ酸長であり、かつ
Ｘ４は、およそ２アミノ酸長である。
一部の実施形態では、Ｘ１は、約３５〜４５、または約３５〜４３、または約３５、３６、３７、３８、３８、４０、４１、４２もしくは４３アミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｘ２は、約９〜１５、または約９〜１４、または約９、１０、１１、１２、１３もしくは１４アミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｘ３は、約２６〜２８、または約２６、２７もしくは２８アミノ酸長である。一部の実施形態では、Ｘ４は、配列（Ｇ／Ａ）（Ｉ／Ｖ）を有する。一部の実施形態では、Ｘ４は、配列ＧＩを有する；一部の実施形態では、Ｘ４は、配列ＧＶを有する；一部の実施形態では、Ｘ４は、配列ＡＩを有する；一部の実施形態では、Ｘ４は、配列ＡＶを有する。一部の実施形態では、ＨＡ配列エレメント１は、ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、このジスルフィド結合は、９７位および１３９位（本明細書で利用される標準的Ｈ３番号付け系に基づく）に対応する残基を架橋する。
一部の実施形態では、特にＨ５ポリペプチドでは、Ｘ１は約４２アミノ酸長であり、かつ／またはＸ２は約１３アミノ酸長であり、かつ／またはＸ３は約２６アミノ酸長である。
一部の実施形態では、特にＨ５ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント１は、以下の構造：
ＣＹＰＸ１ＡＳＳＡＣＸ２ＷＸ３ＷＸ４ＨＨＰを有し、式中：
Ｘ１Ａは、およそ２７〜４２、またはおよそ３２〜４２、またはおよそ３２〜４０、またはおよそ２３〜３８、またはおよそ２８〜３８、またはおよそ２８〜３６、またはおよそ２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０アミノ酸長であり、Ｘ２〜Ｘ４は上記の通りである。
一部の実施形態では、特にＨ５ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント１は、以下の構造：
ＣＹＰＸ１ＡＳＳＡＣＸ２ＷＬＩＸ３ＡＷＸ４ＨＨＰを有し、式中：
Ｘ１Ａは、およそ２７〜４２、またはおよそ３２〜４２、またはおよそ３２〜４０、またはおよそ３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０アミノ酸長であり、
Ｘ３Ａは、およそ２３〜２８、またはおよそ２４〜２６、またはおよそ２４、２５もしくは２６アミノ酸長であり、Ｘ２およびＸ４は上記の通りである。
一部の実施形態では、特にＨ５ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント１は、以下の配列によって延長される（即ち、残基１８６〜１９３に対応する位置において）：
ＮＤＡＡＥＸＸ（Ｋ／Ｒ）
一部の実施形態では、特にＨ５ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント１は、典型的にはＸ１内に、特にＸ１の約残基６で開始する、以下の配列：
ＹＥＥＬＫＨＬＸＳＸＸＮＨＦＥＫを含む。
ＨＡ配列エレメント２
ＨＡ配列エレメント２は、天然のインフルエンザ分離株において見出される多くのＨＡタンパク質の残基３２４〜３４０（ここでも、Ｈ３ ＨＡに基づく番号付け系を使用する）におよそ対応する配列エレメントである。この配列エレメントは、以下の基本構造：
ＧＡＩＡＧＦＩＥを有する。一部の実施形態では、ＨＡ配列エレメント２は、以下の配列：
ＰＸ１ＧＡＩＡＧＦＩＥを有し、式中：
Ｘ１は、およそ４〜１４アミノ酸長、または約８〜１２アミノ酸長、または約１２、１１、１０、９もしくは８アミノ酸長である。一部の実施形態では、この配列エレメントは、ＨＡ０切断部位を提供して、ＨＡ１およびＨＡ２の生成を可能にする。
一部の実施形態では、特にＨ５ポリペプチドでは、ＨＡ配列エレメント２は、以下の構造：
ＰＱＲＸＸＸＲＸＸＲＸ１ＡＧＡＩＡＧＦＩＥを有し、式中：
Ｘ１Ａは、およそ３アミノ酸長であり、一部の実施形態では、Ｘ１Ａは、Ｇ（Ｌ／Ｉ）Ｆである。
定義
親和性：当技術分野で公知のように、「親和性」は、特定のリガンド（例えば、ＨＡポリペプチド）がそのパートナー（例えば、ＨＡ受容体）に結合する堅固さの尺度である。親和性は、異なる方法で測定され得る。一部の実施形態では、親和性は、定量的アッセイ（例えば、グリカン結合アッセイ）によって測定される。一部のこのような実施形態では、結合パートナー濃度（例えば、ＨＡ受容体、グリカンなど）は、生理学的状態（例えば、細胞表面グリカンへのウイルスＨＡ結合）を模倣するように、リガンド（例えば、ＨＡポリペプチド）濃度が過剰になるように固定され得る。あるいはまたはさらに、一部の実施形態では、結合パートナー（例えば、ＨＡ受容体、グリカンなど）濃度および／またはリガンド（例えば、ＨＡポリペプチド）濃度は、変動され得る。一部のこのような実施形態では、親和性（例えば、結合親和性）は、匹敵する条件（例えば、濃度）下で、参照（例えば、ヒトの感染を媒介する野生型ＨＡ）と比較され得る。
アミノ酸残基ネットワーク：用語「アミノ酸残基ネットワーク」は、ポリペプチド鎖中のアミノ酸残基のセットを指すために使用され、これらのアミノ酸残基は、鎖に沿って互いに分離されていてもよいが、この鎖が折り畳まれた立体配置をとるときに空間で互いに近くでクラスター化する。タンパク質表面上のアミノ酸残基ネットワークは、本明細書で「表面残基ネットワーク」と称される：タンパク質の内側のアミノ酸残基ネットワークは、本明細書で「コア残基ネットワーク」と称される。
抗体：本明細書で使用する場合、用語「抗体」とは、特定の抗原に特異的に結合する免疫グロブリンを指す。この用語は、抗原に対して反応している生物によって生成されるという点で天然に生成される免疫グロブリン、およびまた合成により生成されるまたは操作される免疫グロブリンを包含する。一部の実施形態では、この用語は、特異的結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの構造エレメントを有する任意のポリペプチドを包含する。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。抗体は、ヒトクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＤのいずれかを含む、任意の免疫グロブリンクラスのメンバーであり得る。適切な抗体には、ヒト抗体、霊長類化抗体（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、コンジュゲート抗体（即ち、他のタンパク質、放射標識、細胞毒にコンジュゲートまたは融合した抗体）、小モジュラー免疫医薬（Ｓｍａｌｌ Ｍｏｄｕｌａｒ ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（「ＳＭＩＰ（商標）」）、単鎖抗体、ラクダ（ｃａｍｅｌｏｉｄ）抗体および抗体断片が含まれるがこれらに限定されない。本明細書で使用する場合、用語「抗体」には、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一ドメイン抗体（例えば、サメ単一ドメイン抗体（例えば、ＩｇＮＡＲまたはその断片））、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成された多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および所望の生物学的活性を示す限り抗体断片もまた含まれる。
抗体断片：本明細書で使用する場合、「抗体断片」には、例えば、抗体の抗原結合領域または可変領域などの、インタクトな抗体の一部分が含まれる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）；テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）；線状抗体；単鎖抗体分子；および抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。用語「抗体断片」には、特異的抗原に結合して複合体を形成することによって抗体と同様に作用する、任意の合成または遺伝子操作タンパク質もまた含まれる。例えば、抗体断片には、単離された断片、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって接続された組換え単鎖ポリペプチド分子（「ＳｃＦｖタンパク質」）、ならびに超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位が含まれる。
抗原：「抗原」は、抗体が結合する分子または実体である。一部の実施形態では、抗原は、ポリペプチドまたはその一部分である、またはそれらを含む。一部の実施形態では、抗原は、抗体によって認識される感染性因子の一部分である。
およそ：本明細書で使用する場合、用語「およそ」または「約」は、目的の１つまたは複数の値に適用される場合、述べられた参照値と類似した値を指す。ある特定の実施形態では、用語「およそ」または「約」は、特記しない限り、または文脈から他の方法で明らかでない限り、いずれかの方向（それよりも大きいまたはそれよりも小さい）での、述べられた参照値の２５％以内、２０％以内、１９％以内、１８％以内、１７％以内、１６％以内、１５％以内、１４％以内、１３％以内、１２％以内、１１％以内、１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内またはそれ未満に入る値の範囲を指す（このような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。
と関連する：用語「と関連する」は、２つの項目または事象間の観察された相関を記述するために、本明細書で使用される。例えば、ポリペプチドは、その存在またはレベルが感染性因子の存在またはレベルと相関する場合に、特定の感染性因子「と関連する」とみなされ得る。同様に、コアＲＢＳＮスコアの特定の集団（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）またはパターンは、その集団またはパターンがある特定のポリペプチドの構造または機能エレメントの存在と相関することが観察される場合に、その構造エレメント（例えば、折り畳み）または機能エレメント「と関連する」とみなされ得る。
結合：用語「結合」は、本明細書で使用する場合、典型的には、２つ以上の実体間またはその中の非共有結合的会合を指すことが理解される。「直接的」結合は、実体または部分間の物理的接触を含む；間接的結合は、１つまたは複数の仲介実体との物理的接触による物理的相互作用を含む。２つ以上の実体間の結合は、種々の文脈−相互作用する実体または部分が、単離においてまたはより複雑な系に関して（例えば、キャリア実体と共有結合的にもしくは他の方法で会合する一方、かつ／または生物学的系もしくは細胞において）研究される場合を含む−のいずれかにおいて評価され得る。
生物学的に活性：本明細書で使用する場合、語句「生物学的に活性」とは、生物学的系、特に生物において活性を有する任意の作用物質の特徴を指す。例えば、生物に投与される場合にその生物に対して生物学的影響を有する作用物質は、生物学的に活性とみなされる。タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性である特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するそのタンパク質またはポリペプチドの一部分は、典型的に、「生物学的に活性」な部分と称される。
特徴的部分：本明細書で使用する場合、用語「特徴的部分」は、最も広い意味で、その存在（または非存在）が物質の特定の特徴、属性または活性の存在（または非存在）と相関する、その物質の一部分を指すために使用される。一部の実施形態では、物質の特徴的部分は、その物質および特定の特徴、属性または活性を共有する関連の物質において見出されるが、特定の特徴、属性または活性を共有しない物質においては見出されない一部分である。
特徴的パンデミック特徴：本明細書で使用する場合、用語「特徴的パンデミック特徴」は、少なくとも１つの参照パンデミック株において見出されるが、少なくとも１つの非パンデミック株においては見出されない特徴である。一部の実施形態では、特徴的パンデミック特徴は、パンデミック株において共通して見出されるが、非パンデミック株においては稀にしか見出されない特徴である。一部の実施形態では、特徴的パンデミック特徴は、代表的非パンデミック株において観察される罹患率の少なくとも３０％である、代表的パンデミック株における罹患率を示す。
特徴的配列エレメント：本明細書で使用する場合、語句「特徴的配列エレメント」とは、ポリマーの特徴的部分を示す、そのポリマー中（例えば、ポリペプチドまたは核酸中）に見出される配列エレメントを指す。一部の実施形態では、特徴的配列エレメントの存在は、そのポリマーの特定の活性または特性の存在またはレベルと相関する。一部の実施形態では、特徴的配列エレメントの存在（または非存在）は、特定のポリマーの特定のファミリーまたは群のメンバーとして（またはメンバーではないとして）、このようなポリマーを定義する。特徴的配列エレメントは典型的に、少なくとも２つの単量体（例えば、アミノ酸またはヌクレオチド）を含む。一部の実施形態では、特徴的配列エレメントは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれより多くの単量体（例えば、連続的に連結された単量体）を含む。一部の実施形態では、特徴的配列エレメントは、その配列エレメントを共有するポリマー全体にわたって、その長さが変動してもしなくてもよい１つまたは複数のスペーサー領域によって間隔をあけられた連続単量体の少なくとも第１および第２のストレッチを含む。
組合せ治療：用語「組合せ治療」とは、本明細書で使用する場合、２種以上の異なる医薬品が重複するレジメンで投与されて、被験体が両方の薬剤（ａｇｅｎｔ）に同時に曝露される局面を指す。
匹敵する：用語「匹敵する」とは、本明細書で使用する場合、観察された差異または類似性に基づいて結論が合理的に引き出せるように、互いに同一でなくてもよいがそれらの間の比較を可能にするのに十分に類似した、２種以上の作用物質、実体、局面、条件のセットなどを指す。当業者は、文脈において、匹敵するとみなされる２種以上のこのような作用物質、実体、局面、条件のセットなどについて、どの程度の同一性が任意の所与の状況において必要とされるかを理解する。
に対応する：本明細書で使用する場合、用語「に対応する」は、目的のポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド）中のアミノ酸残基の位置／正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を指定するために使用される場合が多い。当業者は、単純さを目的として、ポリペプチド中の残基が、関連の参照ポリペプチドに基づいて標準的番号付け系を使用して指定される場合が多く、その結果、１９０位の残基「に対応する」アミノ酸が、例えば、実際に特定のアミノ酸鎖中の１９０番目のアミノ酸である必要はないが、むしろ参照ポリペプチド中の１９０において見出される残基に対応することを理解する；当業者は、「対応する」アミノ酸を同定する方法を容易に理解する。典型的には、ＨＡポリペプチド中の残基は、標準的野生型Ｈ３ ＨＡを参照して指定され、標準的野生型Ｈ３ ＨＡ中の残基（ｒｅｓｉｄｅ）に対応する目的のポリペプチド中の参照記号は、それらが対応する残基の番号付けを使用して記述される。
分離除去度（ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｒｅｍｏｖｅｄ）：本明細書で使用する場合、ある「分離除去度」であるアミノ酸は、グリカン結合に対して間接的な影響を有するＨＡアミノ酸である。例えば、１分離除去度のアミノ酸は、以下のいずれかを行い得る：（１）直接結合アミノ酸と相互作用する；および／または（２）別の方法で、宿主細胞ＨＡ受容体と会合するグリカンと相互作用する直接結合アミノ酸の能力に対して影響を与える；このような１分離除去度のアミノ酸は、グリカン自体に直接結合してもしなくてもよい。２分離除去度のアミノ酸は、（１）１分離除去度のアミノ酸と相互作用する；および／または（２）別の方法で、直接結合アミノ酸と相互作用する１分離除去度のアミノ酸の能力に対して影響を与える、など。
直接結合アミノ酸：本明細書で使用する場合、語句「直接結合アミノ酸」とは、宿主細胞ＨＡ受容体と会合する１つまたは複数のグリカンと直接相互作用するＨＡポリペプチドアミノ酸を指す。
決定する：本明細書に記載される多くの方法論は、「決定する」ステップを含む。当業者は、本明細書を読めば、このような「決定すること」が、例えば本明細書で明確に言及される特定の技法を含む、当業者に利用可能な種々の技法のいずれかを利用し得る、またはこのような技法の使用によって達成され得ることを理解する。一部の実施形態では、決定することは、物理的試料の操作を含む。一部の実施形態では、決定することは、例えば、関連する分析を実施するように適合されたコンピュータまたは他の処理ユニットを利用した、データまたは情報の検討および／または操作を含む。一部の実施形態では、決定することは、供給源から関連する情報および／または材料を受け取ることを含む。一部の実施形態では、決定することは、試料または実体の１つまたは複数の特徴を、匹敵する参照と比較することを含む。
剤形：用語「剤形」は、患者に投与される治療組成物の、物理的に個別の単位を指すために本明細書で使用される。「単位剤形」は、単一の用量と等価な量の活性薬剤（複数可）を含有するが、複数の単位剤形または部分的な単位剤形を単一の用量として投与するように処方医が指示できることが理解される。
投薬レジメン：「投薬レジメン」（または「治療レジメン」）は、本明細書でその用語が使用される場合、典型的にはある期間をあけて、被験体に個々に投与される単位用量（典型的には１つよりも多い）のセットである。一部の実施形態では、所与の治療剤は、１つまたは複数の用量を含み得る推奨される投薬レジメンを有する。一部の実施形態では、投薬レジメンは複数の用量を含み、その各々が同じ長さの期間によって互いに間隔があけられている；一部の実施形態では、投薬レジームは、複数の用量と、個々の用量の間隔をあける少なくとも２つの異なる期間とを含む。一部の実施形態では、投薬レジメンは、特定のアウトカム、事象、またはこれらの確率と相関する。
操作された：用語「操作された」は、本明細書で使用する場合、ポリペプチドを記述し、そのアミノ酸配列が、人によって選択されており、かつ／またはその生成が人の手の作用を必要としている。例えば、操作されたＨＡポリペプチドは、天然のインフルエンザ分離株において見出されるＨＡポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、操作されたＨＡポリペプチドは、ＮＣＢＩデータベース中に含まれるＨＡポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。
発現：用語「発現」とは、核酸を参照して本明細書で使用する場合、以下の事象のうちの１つまたは複数を指す：（１）ＤＮＡ鋳型のＲＮＡ転写物の生成（例えば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、および／または３’末端形成による）；（３）ポリペプチドへのＲＮＡの翻訳；および／または（４）ポリペプチドの翻訳後修飾。
折り畳み：用語「折り畳み」は、当技術分野の理解される意味に従って本明細書で使用され、３次元構造をとったまたはとり得るポリペプチドの構造エレメントを指す。例えば、折り畳みは、１つもしくは複数のヘリックス（例えば、アルファ−ヘリックス）および／または１つもしくは複数のシート（例えば、ベータ−シート）であり得る、またはこれらを含み得る。
フォールドーム（Ｆｏｌｄｏｍｅ）：本明細書で使用する場合、用語「フォールドーム」とは、生物ゲノムによってコードされるポリペプチド折り畳みのセットを指す。当業者に理解されるように、一部の実施形態では、フォールドームは、全てのコードされたポリペプチド折り畳みを含む；一部の実施形態では、フォールドームは、発現されたポリペプチド中（例えば、全ての発現されたポリペプチド中、または発生におけるある特定の時点でのある特定の組織などにおいてある特定の条件下でのみ発現されるポリペプチド中、など）に存在するポリペプチド折り畳みを含む。
グリカンアレイ：本明細書で使用する場合、用語「グリカンアレイ」は、必要に応じて固体支持体上に固定されたグリカンのセットを指すために使用される。一部の実施形態では、グリカンアレイは、空間で物理的に分離された２つ以上の場所における組織化された整列またはパターンとして存在するグリカンの集団である、またはそれを含む。典型的には、グリカンアレイは、少なくとも４、８、１６、２４、４８、９６または数百もしくは数千の個別の場所を有する。一般に、本発明のグリカンアレイは、種々の形式のいずれかを有し得る。一部の実施形態では、グリカンアレイは、単一の固体支持体上に整列されたグリカンの集団を含む；一部の実施形態では、グリカンアレイは、例えば、粒状支持体（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願第１３／０８７，３３２号を参照のこと）などの複数の個別の固体支持体上に整列されたグリカンの集団を含む。一部の実施形態では、グリカンアレイは、試料の場所が５０〜２００ミクロン以下の距離だけ互いに離れている、および／または固定されたグリカンがナノモル〜マイクロモルの範囲もしくはナノグラム〜ピコグラムの範囲で存在するという点で、マイクロアレイである。当技術分野で公知のアレイ形式には、例えば、各個別の試料の場所が、例えば１０ミクロンの規模を有する形式が含まれる。種々の支持体のいずれかが、グリカンアレイにおいて利用され得る。例えば、本発明において使用され得る支持体材料には、疎水性膜、例えば、ニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロン膜が含まれる。このような膜は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ、ＵＫから取得され得る。あるいはまたはさらに、グリカンがアレイされる支持体は、金属酸化物を含み得る。適切な金属酸化物には、酸化チタン、酸化タンタルおよび酸化アルミニウムが含まれるがこれらに限定されない。このような材料の例は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｔｄ、Ｆａｎｃｙ Ｒｏａｄ、Ｐｏｏｌｅ、Ｄｏｒｓｅｔ．ＢＨ１２ ４ＱＨ ＵＫから取得され得る。なおさらには、一部の実施形態では、支持体は、金属酸化物ゲルである、または金属酸化物ゲルを含む。金属酸化物ゲルは、炭水化物含有分子の固定を補助するために、所与の巨視的領域内に大きい表面積を提供すると考えられる。本発明に従って使用され得るさらなるまたは代替的な支持体材料には、ゲル、例えばシリカゲルまたは酸化アルミニウムゲルが含まれる。このような材料の例は、例えば、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙから取得され得る。一部の実施形態では、グリカンアレイは、通常の使用の間のサイズまたは形状における変化に対して抵抗し得る支持体上に固定される。例えば、支持体は、グリカンをアレイするために使用されるのに適切な成分材料でコーティングされたスライドガラスであり得る。また、一部の複合材料が、望ましくは、支持体に固体性を提供し得る。一部の実施形態では、グリカンは、支持体に直接結合している。一部の実施形態では、グリカンは、例えば、支持体に結合しているリンカーまたはキャリア（例えば、ポリペプチド）に結合させることによって、支持体に間接的に結合している。一部の実施形態では、グリカンは、支持体に共有結合で結合している；一部の実施形態では、グリカンは、支持体に非共有結合で結合している。一部の実施形態では、グリカンは、支持体に可逆的に結合している（例えば、切断可能なリンカーおよび／または可逆的な非共有結合的相互作用によって）。一部の実施形態では、グリカンアレイ中のグリカンの正体および／または整列は、目的のポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド）の結合特徴が容易に評価できるように、選択される。例えば、一部の実施形態では、本発明に従う使用のためのグリカンアレイは、１つもしくは複数の円錐型トポロジーグリカンおよび／または１つもしくは複数の傘型トポロジーグリカンを含む。一部の実施形態では、円錐型トポロジーグリカンおよび傘型トポロジーグリカンは、互いに空間的に離れている。一部の実施形態では、複数の円錐型トポロジーグリカンまたは複数の傘型トポロジーグリカンは、空間的に一緒に局在し得る（しかし、他の型のグリカンとは必要に応じて離れて）。一部の実施形態では、本発明に従う使用のためのグリカンアレイは、１つもしくは複数のα２−３結合型グリカンおよび／または１つもしくは複数のα２−６結合型グリカンを含む。一部の実施形態では、α２−３結合型グリカンおよびα２−６結合型グリカンは、互いに空間的に離れている。一部の実施形態では、複数のα２−３結合型グリカンまたは複数のα２−６結合型グリカンは、空間的に一緒に局在し得る（しかし、他の型のグリカンとは必要に応じて離れて）。一部の実施形態では、このようなアレイは、ヒトＨＡ受容体上、特にヒト上気道ＨＡ受容体上に見出されるグリカン（例えば、α２−６シアル酸付加グリカン、特に長いα２−６シアル酸付加グリカンである場合が多い傘型グリカン）の約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ超を代表するグリカンを含む。一部の実施形態では、利用されるグリカンアレイは、本明細書に明確に示される傘型および／または円錐型トポロジーグリカン構造の一部または全てを含む。一部の実施形態では、アレイは、これらのグリカンのうちの少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ超を含む。
ヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド：本明細書で使用する場合、用語「ヘマグルチニンポリペプチド」（または「ＨＡポリペプチド」）とは、そのアミノ酸配列がＨＡの少なくとも１つの特徴的配列を含むポリペプチドを指す。インフルエンザ分離株由来の広範な種々のＨＡ配列が当技術分野で公知である；実際、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）は、本出願の出願時において少なくとも９７９６のＨＡ配列を含んでいたデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／）を維持している。当業者は、このデータベースを参照して、ＨＡポリペプチドに一般的に特徴的な配列、および／または特定のＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５もしくはＨ１６ポリペプチド）の配列；または特定の宿主、例えば、トリ、ラクダ、イヌ、ネコ、ジャコウネコ、環境、ウマ、ヒト、ヒョウ、ミンク、マウス、アシカ、ムナジロテン（ｓｔｏｎｅ ｍａｒｔｉｎ）、ブタ、トラ、クジラなどの感染を媒介するＨＡの配列を、容易に同定することができる。例えば、一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、インフルエンザウイルスの天然の分離株において見出されるＨＡタンパク質の約残基９７と約１８５の間、約３２４と約３４０の間、約９６と約１００の間、および／または約１３０と約２３０の間に見出される１つまたは複数の特徴的配列エレメントを含む。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、本明細書で定義されるＨＡ配列エレメント１および２のうちの少なくとも１つを含むアミノ酸配列を有する。
Ｈ５ ＨＡポリペプチド：「Ｈ５ ＨＡポリペプチド」は、その用語を本明細書で使用する場合、そのアミノ酸配列が、Ｈ５に特徴的である少なくとも１つの配列エレメントを含み、他のＨＡサブタイプからＨ５を区別する、ＨＡポリペプチドである。代表的なこのような配列エレメントは、当業者によって理解されるように、アラインメントによって決定され得る。
高親和性の結合：用語「高親和性の結合」は、本明細書で使用する場合、特定のリガンド（例えば、ＨＡポリペプチド）がそのパートナー（例えば、ＨＡ受容体）に結合する堅固さの高い程度を指す。親和性は、当技術分野で公知の方法を含む任意の利用可能な方法によって測定され得る。一部の実施形態では、結合は、結合アッセイにおけるＫｄ’が約５００ｐＭ以下（例えば、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約９０ｐＭ未満、約８０ｐＭ未満、約７０ｐＭ未満、約６０ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約５ｐＭ未満、約４ｐＭ未満、約３ｐＭ未満、約２ｐＭ未満など）である場合に、高親和性であるとみなされる。一部の実施形態では、結合は、親和性が、選択された参照ポリペプチドに対してよりも、目的のポリペプチドに対してより強い（例えば、Ｋｄ’がより低い）場合に、高親和性であるとみなされる。一部の実施形態では、結合は、目的のポリペプチドについてのＫｄ’と選択された参照ポリペプチドについてのＫｄ’との比率が、１：１以下（例えば、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、０．１：１、０．０５：１、０．０１：１またはそれ未満）である場合に、高親和性であるとみなされる。一部の実施形態では、結合は、目的のポリペプチドについてのＫｄ’が、選択された参照ポリペプチドについてのＫｄ’の約１００％以下（例えば、約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％またはそれ未満）である場合に、高親和性であるとみなされる。
宿主：用語「宿主」は、目的のポリペプチドが存在する系（例えば、細胞、生物など）を指すために本明細書で使用される。一部の実施形態では、宿主は、特定の感染性因子による感染に感受性である系である。一部の実施形態では、宿主は、目的の特定のポリペプチドを発現する系である。
ＩｇＥ結合部位：「ＩｇＥ結合部位」は、抗−抗原ＩｇＥ分子によって認識される抗原の領域である。このような領域は、（ｉ）ＩｇＥへの抗原の結合；（ｉｉ）抗−抗原ＩｇＥの架橋；（ｉｉｉ）表面結合抗−抗原ＩｇＥを含有する肥満細胞の脱顆粒；および／または（ｉｖ）アレルギー症状（例えば、ヒスタミン放出）の発症、を生じるのに必要および／または十分である。一般に、ＩｇＥ結合部位は、アレルギー個体（好ましくは、本発明の組成物が投与される種の個体）由来の血清に、特定の抗原または抗原断片を曝露させることによる、その抗原または断片について定義される。異なる個体が、同じ抗原上の異なるエピトープを認識するＩｇＥを生成し得ることが認識される。したがって、抗原または断片を、血清試料の代表的プールに曝露させることが、典型的には望ましい。例えば、ヒトＩｇＥによって認識される部位が、所与の抗原または断片において同定されることが望まれる場合、血清は、少なくとも５〜１０、好ましくは少なくとも１５の、その抗原に対するアレルギーを実証した個体から、好ましくはプールされる。当業者は、他の文脈において有用なプール戦略を十分に知っている。
免疫優性：特定のエピトープが、（ｉ）インタクトな抗原で観察されたＩｇＥ結合の有意な割合を担う場合；および／または（ｉｉ）有意な割合の感受性個体においてＩｇＥによって認識される場合、このエピトープは「免疫優性」であるとみなされる。免疫優性エピトープは、他の観察されたエピトープを参照して定義される場合が多い。例えば、所与の抗原における全てのＩｇＥエピトープが、同時にアッセイされ得（例えば、イムノブロットによって）、免疫優性エピトープは、他のエピトープと比較したその強さによって同定され得る。通常、常にではないが、免疫優性エピトープは、このような研究において観察された結合反応性の少なくとも１０％に寄与する。あるいはまたはさらに、エピトープは、感受性個体の有意な割合、好ましくは少なくとも大部分、より好ましくは少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の血清中のＩｇＥによって認識される場合、免疫優性と分類され得る。
単離された：用語「単離された」とは、本明細書で使用する場合、（ｉ）最初に生成されたときに会合していた成分の少なくとも一部から分離された（天然であれ実験設定であれ）；または（ｉｉ）人の手によって生成された、作用物質または実体を指す。単離された作用物質または実体は、それらが最初に会合していた他の成分の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％またはそれ超から、分離され得る。一部の実施形態では、単離された作用物質は、９０％を超えて、９１％を超えて、９２％を超えて、９３％を超えて、９４％を超えて、９５％を超えて、９６％を超えて、９７％を超えて、９８％を超えて、９９％を超えて、純粋である。
長いオリゴ糖：本開示の目的のために、オリゴ糖は、少なくとも４つの糖残基を有する少なくとも１つの線状鎖を含む場合に、典型的に「長い」とみなされる。
低親和性の結合：用語「低親和性の結合」とは、本明細書で使用する場合、特定のリガンド（例えば、ＨＡポリペプチド）がそのパートナー（例えば、ＨＡ受容体）に結合する堅固さの低い程度を指す。本明細書で使用する場合、親和性は、当技術分野で公知の方法を含む、任意の利用可能な方法によって測定され得る。一部の実施形態では、結合は、Ｋｄ’が約１００ｐＭ以上（例えば、約２００ｐＭよりも上、３００ｐＭよりも上、４００ｐＭよりも上、５００ｐＭよりも上、６００ｐＭよりも上、７００ｐＭよりも上、８００ｐＭよりも上、９００ｐＭよりも上、１ｎＭよりも上、１．１ｎＭよりも上、１．２ｎＭよりも上、１．３ｎＭよりも上、１．４ｎＭよりも上、１．５ｎＭよりも上など）である場合に、低親和性であるとみなされる。一部の実施形態では、結合は、親和性が、選択された参照ポリペプチドに対してよりも、目的のポリペプチドに対して同じかまたはそれよりも低い（例えば、Ｋｄ’がほぼ同じかまたはそれよりも高い）場合に、低親和性であるとみなされる。一部の実施形態では、結合は、目的のポリペプチドについてのＫｄ’と選択された参照ポリペプチドについてのＫｄ’との比率が、１：１以上（例えば、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはそれより大きい）である場合に、低親和性であるとみなされる。一部の実施形態では、結合は、目的のポリペプチドについてのＫｄ’が、選択された参照ポリペプチドについてのＫｄ’の１００％以上（例えば、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％、１９５％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％またはそれ超）である場合に、低親和性であるとみなされる。
非天然のアミノ酸：語句「非天然のアミノ酸」とは、アミノ酸（即ち：エラー！編集中のフィールドコードからオブジェクトが作成できません。）の化学構造を有する実体、したがって、少なくとも２つのペプチド結合に関与することができるが、天然に見出されるものとは異なるＲ基を有する実体を指す。一部の実施形態では、非天然のアミノ酸は、水素ではない第２のＲ基もまた有し得る、および／またはアミノ部分もしくはカルボン酸部分上に１つもしくは複数の他の置換を有し得る。
パンデミック株：「パンデミック」インフルエンザ株は、ヒト集団のパンデミック感染を引き起こした株、または引き起こす能力を有する株である。一部の実施形態では、パンデミック株は、パンデミック感染を引き起こした。一部の実施形態では、このようなパンデミック感染は、複数のテリトリーにわたる、特に通常は感染がそれらのテリトリーの間を行き来しないように（例えば、山によって、水域によって、別個の大陸の一部として、など）互いに分離されたテリトリーにわたる流行性の感染を含む。
ポリペプチド：「ポリペプチド」は、一般的に言うと、ペプチド結合によって互いに結合した少なくとも２つのアミノ酸の紐である。一部の実施形態では、ポリペプチドは、その各々が少なくとも１つのペプチド結合によって他のアミノ酸に結合した、少なくとも３〜５つのアミノ酸を含み得る。当業者であれば、それでもなおポリペプチド鎖中に必要に応じて組み込むことが可能な「非天然の」アミノ酸または他の実体を、ポリペプチドが時として含むことを理解されよう。
優勢に存在する：用語「優勢に存在する」とは、本明細書で使用する場合、集団全体にわたる、特定の場所における実体（例えば、アミノ酸残基）の存在を指す。例えば、アミノ酸は、ポリペプチドの集団にまたがって、特定のアミノ酸が、関連する集団内のポリペプチドの少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ超において、特定の位置に統計的に存在する場合に、優勢に存在し得る。
予防：用語「予防」とは、本明細書で使用する場合、特定の疾患、障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状の発生の遅延、ならびに／または特定の疾患、障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状の頻度および／もしくは重症度における低減を指す。一部の実施形態では、予防は、特定の疾患、障害または状態の１つまたは複数の症状の発症、頻度および／または強度における統計的に有意な減少が、その疾患、障害または状態に感受性である集団において観察される場合に、ある薬剤がその疾患、障害または状態を「予防する」とみなされるように、集団に基づいて評価される。
純粋：本明細書で使用する場合、作用物質または実体は、他の成分を実質的に含まない場合に、「純粋」である。例えば、特定の作用物質または実体の約９０％よりも多くを含有する調製物は、典型的に、純粋な調製物とみなされる。一部の実施形態では、作用物質または実体は、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％純粋である。
受容体結合部位（ＲＢＳ）：本明細書で使用する場合、用語「受容体結合部位」または「ＲＢＳ」は、直接結合アミノ酸を含む５６位〜７３位、８７位〜９６位、１２７位〜１６０位および１８３位〜２３０位（Ｈ５ ＨＡ結晶構造ＰＤＢ ＩＤ：２ＩＢＸに従う番号付け）に及ぶ残基を含む。
播種能：本明細書で使用する場合、用語「播種能」とは、因子（例えば、感染性因子、例えば、ウイルス、細菌など）が感染を伝播する見込みを指す。一部の実施形態では、播種能は、因子（例えば、感染性因子、例えば、ウイルス、細菌など）がバリアント子孫を生じる能力と相関する。例えば、種株は、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％のバリアント子孫を有し得る。
短いオリゴ糖：本開示の目的のために、オリゴ糖は、任意の線状鎖中に４つ未満、または確実には３つ未満の残基を有する場合に、典型的に「短い」とみなされる。
受容体結合部位ネットワーク（ＲＢＳＮ）：用語「受容体結合部位ネットワーク（ＲＢＳＮ）」とは、折り畳まれたポリペプチド鎖の状況で、互いとの相互作用を可能にするように３次元空間中に整列されたＲＢＳの一部であるアミノ酸残基のセットを指す。これらのアミノ酸残基は、円錐型様および傘型様トポロジーにおいてグリカン受容体と接触する直接結合アミノ酸を含む。
受容体結合部位ネットワーク（ＲＢＳＮ）ダイアグラム：本明細書で使用する場合、用語「受容体結合部位ネットワーク（ＲＢＳＮ）ダイアグラム」とは、ＲＢＳ中のアミノ酸間の相互作用関係を捕捉する２次元のオープンな接続性のネットワークダイアグラムを指す。
受容体結合部位ネットワーク（ＲＢＳＮ）スコア：本明細書で使用する場合、用語「受容体結合部位ネットワーク（ＲＢＳＮ）スコア」とは、ポリペプチド中のアミノ酸残基に割り当てられるスコアを指し、それは、本明細書に記載するように、その近接した空間的環境中の他のアミノ酸との相互作用のそのネットワークの程度（例えば、該ポリペプチド中の他の残基の側鎖と相互作用する残基の側鎖の能力）および／またはこのような相互作用の性質に基づく。例えば、本明細書に記載するように、このＲＢＳＮスコアは、０（いずれのネットワークも存在しない）から１（最もネットワーク化されている）まで変動する。ＲＢＳ内のアミノ酸のネットワークが高度になるほど、変異は構造的により制限される。
特異性：当技術分野で公知のように、「特異性」は、他の潜在的結合パートナー（例えば、トリＨＡ受容体）からその結合パートナー（例えば、ヒトＨＡ受容体、特にヒト上気道ＨＡ受容体）を区別する、特定のリガンド（例えば、ＨＡポリペプチド）の能力の尺度である。
実質的な数の類似性：本明細書で使用する場合、用語「実質的な数の類似性」とは、３０％よりも多くは異ならない数値を有する２つの値、例えば、２つのＲＢＳＮスコアを指す。
実質的な配列相同性：語句「実質的な相同性」は、アミノ酸配列または核酸配列間の比較を指すために本明細書で使用される。当業者に理解されるように、２つの配列は一般に、対応する位置に相同な残基を含有する場合に、「実質的に相同」であるとみなされる。相同な残基は、同一の残基であり得る。あるいは、相同な残基は、適切に類似した構造的および／または機能的特徴を有する非同一残基であり得る。例えば、当業者に周知のように、ある特定のアミノ酸は、典型的に、「疎水性」もしくは「親水性」アミノ酸として、および／または「極性」もしくは「非極性」側鎖を有するとして分類される。１つのアミノ酸の、同じ型の別のアミノ酸に代えての置換は、「相同」置換としばしばみなされ得る。典型的なアミノ酸のカテゴリー化を以下にまとめる：
Figure 2016509609
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 当技術分野で周知のように、アミノ酸配列または核酸配列は、市販のコンピュータプログラム、例えば、ヌクレオチド配列についてのＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴにおいて入手可能なものを含む種々のアルゴリズムのいずれかを使用して比較され得る。例示的なこのようなプログラムは、以下に記載されている：Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５巻（３号）：４０３〜４１０頁、１９９０年；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５巻：３３８９〜３４０２頁、１９９７年；Ｂａｘｅｖａｎｉｓら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗｉｌｅｙ、１９９８年；およびＭｉｓｅｎｅｒら（編）、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１３２巻）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、１９９９年；上述は全て、参照によって本明細書に組み込まれる。相同な配列を同定することに加えて、上述のプログラムは、典型的に、相同性の程度の指標を提供する。一部の実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基のうちの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ超が、残基の関連するストレッチにわたって相同である場合に、実質的に相同であるとみなされる。一部の実施形態では、上記関連するストレッチは、完全配列である。一部の実施形態では、上記関連するストレッチは、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７５、少なくとも５００またはそれより多くの残基である。
実質的な配列同一性：語句「実質的な同一性」は、アミノ酸配列または核酸配列間の比較を指すために本明細書で使用される。当業者に理解されるように、２つの配列は一般に、対応する位置に同一の残基を含有する場合に、「実質的に同一」であるとみなされる。当技術分野で周知のように、アミノ酸配列または核酸配列は、市販のコンピュータプログラム、例えば、ヌクレオチド配列についてのＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴにおいて入手可能なものを含む種々のアルゴリズムのいずれかを使用して比較され得る。例示的なこのようなプログラムは、以下に記載されている：Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５巻（３号）：４０３〜４１０頁、１９９０年；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５巻：３３８９〜３４０２頁、１９９７年；Ｂａｘｅｖａｎｉｓら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗｉｌｅｙ、１９９８年；およびＭｉｓｅｎｅｒら（編）、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１３２巻）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、１９９９年；上述は全て、参照によって本明細書に組み込まれる。同一の配列を同定することに加えて、上述のプログラムは、典型的に、同一性の程度の指標を提供する。一部の実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基のうちの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれ超が、残基の関連するストレッチにわたって同一である場合に、実質的に同一であるとみなされる。一部の実施形態では、上記関連するストレッチは、完全配列である。一部の実施形態では、上記関連するストレッチは、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５、少なくとも３００、少なくとも３２５、少なくとも３５０、少なくとも３７５、少なくとも４００、少なくとも４２５、少なくとも４５０、少なくとも４７５、少なくとも５００またはそれより多くの残基である。
実質的な構造類似性：本明細書で使用する場合、用語「実質的な構造類似性」とは、共有された構造的特徴の存在、例えば、特定の位置における特定のアミノ酸の存在および／または同一性を指す（「共有された配列相同性」および「共有された配列同一性」の定義を参照のこと）。一部の実施形態では、用語「実質的な構造類似性」とは、構造エレメント（例えば：ループ、シート、ヘリックス、Ｈ結合ドナー、Ｈ結合アクセプター、グリコシル化パターン、塩橋およびジスルフィド結合）の存在および／または同一性を指す。一部の他の実施形態では、用語「実質的な構造類似性」とは、互いに対する原子または部分の３次元整列および／または配向（例えば：目的の作用物質と参照作用物質との間での、原子または部分の間または原子または部分の中での距離および／または角度）を指す。
治療剤：本明細書で使用する場合、語句「治療剤」とは、所望の生物学的効果または薬理学的効果を惹起する任意の作用物質を指す。
処置：本明細書で使用する場合、用語「処置」とは、疾患、障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状もしくは態様を軽減する、疾患、障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状もしくは態様の発生を遅延させる、疾患、障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状もしくは態様の重症度もしくは発生率を低減させる、または疾患、障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状もしくは態様の予防を生じるために使用される、任意の方法を指す。処置は、症状の発生の前、その間および／またはその後に投与され得る。
傘型トポロジー：語句「傘型トポロジー」は、ある特定のグリカン、特にＨＡ受容体上のグリカンによってとられる３次元整列を指すために本明細書で使用される。これは、図８Ａおよび９に示される「円錐型トポロジー」を有するグリカンとは対照的である。ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／３００５６号および同第ＰＣＴ／ＵＳ０７／１８１６０号に記載されるように、傘型トポロジーグリカンへの結合は、ヒト宿主の感染を媒介するＨＡタンパク質に特徴的である。この傘型トポロジーは、典型的には、α２−６シアル酸付加グリカンのみによってとられ、長い（例えば、四糖よりも長い）オリゴ糖に典型的である。一部の実施形態では、傘型トポロジーグリカンは、図８Ｂに示される、構造と実質的に類似した３次元構造を示すグリカンである。一部の実施形態では、傘型トポロジーグリカンは、図８Ｂに示されるアミノ酸残基を介してＨＡポリペプチドと接触するグリカンである。一部の実施形態では、傘型トポロジーグリカンは、図８Ｂに示される、アミノ酸結合ポケットと接触することができ、かつ／またはそれに特異的に結合することができるグリカンである。一部の実施形態では、グリカンの構造トポロジーは、ＳｉａのＣ２と、ＧａｌのＣ１と、ＧｌｃＮＡｃのＣ１との間の角度として定義されるパラメーターθに基づいて分類される。θ＜１００°の値は、α２−３グリカンおよび短いα２−６グリカンによってとられる円錐型様トポロジーを示す。θ＞１１０°の値は、長いα２−６グリカンによってとられるトポロジーなどの傘型様トポロジーを示す。傘型トポロジーの一例は、おおよそ−６０の、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌ連結のΦ角度によって与えられる。一部の実施形態では、傘型トポロジーグリカン（例えば、１つの部位における）は、短いα２−６（例えば、単一のラクトサミン）分岐よりも高い割合の、長い（例えば、複数のラクトサミン単位）α２−６オリゴ糖分岐を含む。傘型トポロジーをとることが可能な例示的なＮ結合型およびＯ結合型グリカン構造は、図１０および１１中に見出される。一部の実施形態では、傘型トポロジーグリカン（例えば、１つの部位における）は、短いα２−６（例えば、単一のラクトサミン）分岐よりも、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍、または約５０倍を超える多くの長いα２−６オリゴ糖分岐を含む。一部の実施形態では、傘型トポロジーグリカンおよび／またはグリカンデコイとのＨＡ相互作用の独自の特徴は、非還元末端においてシアル酸（ＳＡ）および／またはＳＡアナログを含むグリカンとのＨＡ接触である。一部の実施形態では、オリゴ糖の鎖長は、少なくとも三糖（ＳＡまたはＳＡアナログは除く）である。
一部の実施形態では、傘型トポロジーグリカンは、以下の形態：
Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｓｕｇ１−Ｓｕｇ２−Ｓｕｇ３
のオリゴ糖であり、式中：
（ａ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６は、典型的には（本質的にではないが）非還元末端に存在し；
（ｂ）Ｓｕｇ１は、以下であり：
（ｉ）αもしくはβ立体配置（高頻度で、Ｎ結合型およびＯ結合型の伸長についてはβ−立体配置、ならびに糖タンパク質にＯ結合したＧａｌＮＡｃα−の場合にはα−立体配置）のヘキソース（高頻度でＧａｌまたはＧｌｃ）もしくはヘキソサミン（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）である；
（ｉｉ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６以外の糖で、Ｓｕｇ１の非還元位置のいずれに結合したものも存在しない（Ｓｕｇ１が、糖タンパク質にＯ結合したＧａｌＮＡｃα−である場合を除く）；ならびに／または
（ｉｉｉ）例えば、サルフェート、ホスフェート、グアニジウム、アミン、Ｎ−アセチルなどの非糖部分が、Ｓｕｇ１の非還元位置（典型的には６位）に結合し得る（例えば、ＨＡとの接触を改善するため）；
（ｃ）Ｓｕｇ２および／またはＳｕｇ３は、以下である：
（ｉ）αもしくはβ立体配置（高頻度でβ）のヘキソース（高頻度でＧａｌまたはＧｌｃ）もしくはヘキソサミン（ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ）；ならびに／または
（ｉｉ）糖（例えばＦｕｃ）、もしくは例えば、サルフェート、ホスフェート、グアニジウム、アミン、Ｎ−アセチルなどの非糖部分が、Ｓｕｇ２、Ｓｕｇ３および／またはＳｕｇ４の非還元位置に結合し得る；
（ｄ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６連結とは別のオリゴ糖中の任意の２つの糖間の連結は、１−２、１−３、１−４および／または１−６（典型的には１−３または１−４）であり得る；ならびに／あるいは
（ｅ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６が、糖タンパク質にＯ結合したＧａｌＮＡｃαに連結しており、追加の糖がＧａｌＮＡｃαの非還元末端に連結された構造、例えば、
（ｉ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃα−
（ｉｉ）Ｎｅｕ５Ａｃα２−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃα−。
ほんの一例として、一部の実施形態では、傘型トポロジーグリカンは、以下の形態：Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３／４ＧｌｃＮＡｃ−、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ ＧａｌＮＡｃα−β１−３Ｇａｌα２−３Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３／６ＧａｌＮＡｃα、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３／６ＧａｌＮＡｃα、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３／６ＧａｌＮＡｃα、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３／６ＧａｌＮＡｃα、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６ＧａｌＮＡｃα−β１−３Ｇａｌα２−３Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３／６ＧａｌＮＡｃα−β１−３／６ＧｌｃＮＡｃβ１−４Ｇａｌα２−３／６Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３／６ＧａｌＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３／６ＧａｌＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌα１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５α２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃα、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃ（β１−３Ｇａｌ−）β１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃ（β１−３Ｇａｌ−）β１−３Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、のオリゴ糖およびそれらの組合せである。
単位用量：表現「単位用量」とは、本明細書で使用する場合、被験体への投与のために製剤化された医薬組成物の物理的に個別の単位を指す。多くの実施形態では、単位用量は、所定の量の活性薬剤を含有する。一部の実施形態では、単位用量は、全単一用量の薬剤を含有する。一部の実施形態では、１つよりも多い単位用量が、総単一用量を達成するために投与される。一部の実施形態では、複数の用量の投与が、意図した効果を達成するために、必要とされる、または必要とされると予測される。この単位用量は、例えば、所定の量の１種または複数の治療剤を含有するある体積の液体（例えば、許容されるキャリア）、所定の量の固形形態の１種または複数の治療剤、所定の量の１種または複数の治療剤を含有する徐放性製剤または薬物送達デバイスなどであり得る。単位用量は、治療剤（複数可）に加えて、種々の成分を含有し得ることが理解される。例えば、許容されるキャリア（例えば、薬学的に許容されるキャリア）、希釈剤、安定剤、緩衝剤、防腐剤などが、以下に記載されるように含まれ得る。しかし、本開示の製剤の毎日の総使用量は、正しい医療的判断の範囲内で主治医によって決定される場合が多いことが理解される。一部の実施形態では、任意の特定の被験体または生物についての特定の有効用量レベルは、処置されている障害および障害の重症度；使用される特定の活性化合物の活性；使用される特定の組成物；被験体の年齢、体重、全般的健康、性別および食餌；使用される特定の活性化合物の投与の時間および排泄の速度；処置の持続時間；使用される特定の化合物（複数可）と組み合わせてまたは同時に使用される薬物および／またはさらなる治療、ならびに医療分野で周知の同様の因子を含む種々の因子に依存し得る。
ワクチン接種：本明細書で使用する場合、用語「ワクチン接種」とは、例えば疾患原因因子に対する免疫応答を生じることを意図した組成物の投与を指す。ワクチン接種は、疾患原因因子への曝露および／または１つもしくは複数の症状の発症の前、その間および／またはその後に投与され得、一部の実施形態では、この因子への曝露の前、その間および／またはその直後に、投与され得る。一部の実施形態では、ワクチン接種は、適切に時間間隔をあけた、ワクチン接種組成物の複数回の投与を含む。
バリアント：本明細書で使用する場合、用語「バリアント」とは、参照実体との顕著な構造的同一性を示すが、参照実体と比較して、１つまたは複数の化学的部分の存在またはレベルにおいて参照実体とは構造的に異なる実体を指す。多くの実施形態では、バリアントは、その参照実体とは機能的にも異なっている。一般に、特定の実体が参照実体の「バリアント」であると適切にみなされるかどうかは、参照実体との構造的同一性の程度に基づく。当業者に理解されるように、任意の生物学的または化学的参照実体は、ある特定の特徴的構造エレメントを有する。定義によれば、バリアントは、１つまたは複数のこのような特徴的構造エレメントを共有する別個の化学的実体である。ほんの数例を挙げると、小分子は、特徴的コア構造エレメント（例えば、マクロサイクルコア（ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅ ｃｏｒｅ））および／または１つもしくは複数の特徴的張り出し部分を有し得、その結果、小分子のバリアントは、コア構造エレメントおよび特徴的張り出し部分を共有するが、他の張り出し部分および／またはコア内に存在する結合の型（単結合対二重結合、Ｅ対Ｚなど）において異なるバリアントであり、ポリペプチドは、線状もしくは３次元空間において互いに対して指定された位置を有するおよび／または特定の生物学的機能に寄与する複数のアミノ酸から構成される特徴的配列エレメントを有し得、核酸は、線状もしくは３次元空間において互いに対して指定された位置を有する複数のヌクレオチド残基から構成される特徴的配列エレメントを有し得る。例えば、バリアントポリペプチドは、アミノ酸配列における１つもしくは複数の差異および／またはポリペプチド骨格に共有結合で結合した化学的部分（例えば、炭水化物、脂質など）における１つもしくは複数の差異の結果として、参照ポリペプチドとは異なり得る。一部の実施形態では、バリアントポリペプチドは、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％または９９％である、参照ポリペプチドとの全体的配列同一性を示す。あるいはまたはさらに、一部の実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照ポリペプチドと、少なくとも１つの特徴的配列エレメントを共有しない。一部の実施形態では、参照ポリペプチドは、１つまたは複数の生物学的活性を有する。一部の実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照ポリペプチドの１つまたは複数の生物学的活性を共有する。一部の実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照ポリペプチドの１つまたは複数の生物学的活性を欠く。一部の実施形態では、バリアントポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較して、低減されたレベルの１つまたは複数の生物学的活性を示す。多くの実施形態では、目的のポリペプチドは、目的の該ポリペプチドが、特定の位置における少数の配列変更以外は親の配列と同一のアミノ酸配列を有する場合に、親または参照ポリペプチドの「バリアント」であるとみなされる。典型的には、バリアント中の残基の２０％未満、１５％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満が、親と比較して置換される。一部の実施形態では、バリアントは、親と比較して、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つの置換された残基を有する。しばしば、バリアントは、非常に少数（例えば、５未満、４未満、３未満、２未満または１未満）の数の置換された機能的残基（即ち、特定の生物学的活性に関与する残基）を有する。さらに、バリアントは、親と比較して、５以下、４以下、３以下、２以下または１以下の付加または欠失を典型的には有し、しばしば付加も欠失も有さない。さらに、任意の付加または欠失は、典型的には、約２５未満、約２０未満、約１９未満、約１８未満、約１７未満、約１６未満、約１５未満、約１４未満、約１３未満、約１０未満、約９未満、約８未満、約７未満、約６未満の残基であり、一般的には、約５未満、約４未満、約３未満または約２未満の残基である。一部の実施形態では、親または参照ポリペプチドは、天然に見出されるポリペプチドである。当業者に理解されるように、目的の特定のポリペプチドの複数のバリアントは一般に、特に目的のポリペプチドが感染性因子ポリペプチドである場合、天然に見出され得る。
進化に対する高抵抗性のクラスター（Ｖｅｒｙ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ−ｔｏ−Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｌｕｓｔｅｒ）（ＶＲＥＣ）：本明細書で使用する場合、用語「進化に対する高抵抗性のクラスター」および「ＶＲＥＣ」とは、高いＲＢＳＮスコアおよび／または変異に対する低い許容性を実証するアミノ酸残基のクラスターを指す。即ち、一部の実施形態では、ＶＲＥＣクラスターは、変異が典型的にはポリペプチドの構造および／または機能の破壊を生じるクラスターである。一部の実施形態では、ＶＲＥＣクラスター残基は、正のＢＬＯＳＵＭ６２置換スコアを有さない。
ある特定の実施形態の詳細な説明
本発明は、とりわけ、インフルエンザの伝染および／または感染の検出、処置および／または予防に関する方法および組成物を提供する。
インフルエンザ感染
インフルエンザは、パンデミック、流行、再流行および大流行の長い歴史を有する。Ｈ５Ｎ１株を含むトリインフルエンザは、高度に伝染性で潜在的に致死的な病原体であるが、現在のところ、ヒトに感染する限定的な能力を有するにすぎない。
インフルエンザウイルスは、ウイルス粒子の膜に埋め込まれた２種の糖タンパク質、ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含有する脂質膜外被によって特徴付けられるＲＮＡウイルスである。そのウイルスゲノムは、いくつかのマイナス鎖の一本鎖ＲＮＡ分子から構成される。いくつかのタンパク質は、ウイルスゲノムによってコードされる。ノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、感染細胞の表面上の炭水化物部分から末端シアル酸残基を切断するウイルス表面糖タンパク質であり、子孫ウイルスの放出を促進する。ヘマグルチニン（ＨＡ）は、主要なウイルス表面糖タンパク質の１つであり、感受性細胞の表面上のシアル酸へのウイルスの結合に関与する（Ｕｉｐｒａｓｅｒｔｋｕｌら、Ｅｍｅｒｇ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．１１巻：１０３６頁、２００５年）。
インフルエンザＨＡは、ウイルス粒子上の三量体である。インフルエンザＨＡは、細胞に感染した後のウイルスによってＨＡ０として合成され、塩基性切断部位において細胞性プロテアーゼによってＨＡ１およびＨＡ２成熟形態へと切断され、その切断は、この表面タンパク質の適切な機能およびウイルス生活環に必要とされる。Ｍ２タンパク質は、イオンチャネルタンパク質である。ＨＡ、ＮＡおよびＭ２タンパク質は、宿主細胞の原形質膜に由来するウイルス外被に存在する。リボヌクレオタンパク質複合体は、ヌクレオタンパク質（ＮＰ）ならびに３種のポリメラーゼＰＡ、ＰＢ１およびＰＢ２と会合するＲＮＡセグメントを含む。Ｍ１タンパク質は、リボヌクレオタンパク質（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｉｅｎ）および外被の両方と会合する。
インフルエンザの毎年の流行は、ウイルスのＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質の抗原性特性が変更される場合に生じる。変更された抗原性の機構は、２要素からなる：パンデミックを引き起こし得る、宿主細胞の二重感染後にヒトウイルスと動物ウイルスとの間の遺伝子再編成によって引き起こされる抗原不連続変異；ならびにインフルエンザ流行を引き起こし得る、ウイルス表面上のＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質における小さい変化によって引き起こされる抗原連続変異。
１６の公知のＨＡサブタイプおよび９のＮＡサブタイプが存在し、異なるインフルエンザ株は、株のＨＡサブタイプおよびＮＡサブタイプの番号に基づいて命名される。アミノ酸配列同一性の比較および結晶構造の比較に基づいて、ＨＡサブタイプは、２つの主要な群および４つのより小さいクレードへと分割されている。異なるＨＡサブタイプは、必ずしも強いアミノ酸配列同一性を共有していなくてもよいが、異なるＨＡサブタイプの全体的な３Ｄ構造は互いに類似しており、分類目的で使用され得るいくつかのわずかな差異が存在する。例えば、中心α−ヘリックスに関して、膜遠位サブドメインの特定の配向は、ＨＡサブタイプを決定するために一般に使用される１つの構造的特徴である（Ｒｕｓｓｅｌｌら、２００４年 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３２５巻：２８７頁、２００４年；参照によって本明細書に組み込まれる）。当業者は、インフルエンザウイルスの異なるサブタイプおよび／またはクレードを定義および／または区別するために使用され得る配列ならびに他の構造的な類似性および差異について、よく承知している。
したがって、１６のＨＡサブタイプのうちの３つのみ（Ｈ１、Ｈ２およびＨ３）が、ヒト感染にはるかに適応するようになっている。ヒトに感染するように適応したＨＡの（例えば、パンデミックＨ１Ｎ１（１９１８）およびＨ３Ｎ２（１９６７−６８）インフルエンザサブタイプ由来のＨＡの）１つの報告された特徴は、α２−３シアル酸付加グリカンに優先的に結合するトリ前駆体と比較して、α２−６シアル酸付加グリカンに優先的に結合するその能力である（ＳｋｅｈｅｌおよびＷｉｌｅｙ、２０００年 Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ、６９巻：５３１頁；ＲｏｇｅｒｓおよびＰａｕｌｓｏｎ、１９８３年 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１２７巻：３６１頁；Ｒｏｇｅｒｓら、１９８３年 Ｎａｔｕｒｅ、３０４巻：７６頁；Ｓａｕｔｅｒら、１９９２年 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１巻：９６０９頁；Ｃｏｎｎｏｒら、１９９４年 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２０５巻：１７頁；Ｔｕｍｐｅｙら、２００５年 Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１０巻：７７頁；これらは全て、参照によって本明細書に組み込まれる）。
（α２−３連結およびα２−６連結の両方の）シアル酸付加オリゴ糖に結合したＨ１（ヒトおよびブタ）、Ｈ２（ヒトおよびトリ）、Ｈ３（トリ）およびＨ５（トリ）サブタイプ由来のＨＡのいくつかの結晶構造が入手可能であり、これらのグリカンとＨＡとの区別可能な相互作用に関与する特異的アミノ酸に関する分子的洞察を提供する（Ｅｉｓｅｎら、１９９７年 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２３２巻：１９頁；Ｈａら、２００１年 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９８巻：１１１８１頁；Ｈａら、２００３年 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３０９巻：２０９頁；Ｇａｍｂｌｉｎら、２００４年 Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０３巻：１８３８頁；Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００４年 Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０３巻：１８６６頁；Ｒｕｓｓｅｌｌら、２００６年 Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ２３巻：８５頁；Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００６年 Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１２巻：４０４頁；Ｘｕ Ｒら、２０１０年 Ｊ Ｖｉｒｏｌ８４巻（４号）：１７１５頁；Ｌｉｕ Ｊら、２００９年 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ１０６巻（４０号）：１７１７５頁、これらは全て、参照によって本明細書に組み込まれる）。
インフルエンザ感染は、糖タンパク質受容体への結合を介した細胞の表面とＨＡとの相互作用によって媒介される。ＨＡのＨＡ受容体への結合は、ＨＡ受容体上のＮ結合型グリカンによって優勢に媒介される。具体的には、インフルエンザウイルス粒子の表面上のＨＡは、細胞宿主の表面上のＨＡ受容体と会合するシアル酸付加グリカンを認識する。認識および結合の後、宿主細胞はウイルス細胞を取り込み、ウイルスは複製でき、隣の細胞へと分配されるもっと多くのウイルス粒子を生成できる。例示的なＨＡ−グリカン相互作用のいくつかの結晶構造が同定されており、表１に示される：
Figure 2016509609
 ＨＡ−α２−６シアル酸付加グリカン複合体を、ＡＳＩ３０＿Ｈ１＿２６およびＡＰＲ３４＿Ｈ１＿２６（Ｈ１）上にＡＤＵ６３＿Ｈ３およびＡＤＳ９７＿Ｈ５およびＶｉｅｔ０４＿Ｈ５のＨＡ１サブユニットのＣＡトレースをスーパーインポーズすることによって生成した。ヒトＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）とα２−６シアル酸付加グリカンとの構造複合体が公開されているが（Ｅｉｓｅｎら、１９９７年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２３２巻：１９頁）、その座標は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋでは入手できなかった。ＳＡＲＦ２（ｈｔｔｐ：／／１２３ｄ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／ｓａｒｆ２．ｈｔｍｌ）プログラムを使用して、スーパーインポーズのため異なるＨＡ１サブユニットの構造アラインメントを得た。
ＨＡ受容体は、該受容体のＨＡ結合部位近傍でα２−３シアル酸付加グリカンまたはα２−６シアル酸付加グリカンのいずれかによって改変され、該受容体結合グリカンの連結の型は、該受容体のＨＡ結合部位のコンフォメーションに影響を与えることによって、異なるＨＡに対する該受容体の特異性に影響を与え得る。
例えば、トリＨＡのグリカン結合ポケットは狭い。本発明によれば、このポケットは、α２−３シアル酸付加グリカンのトランスコンフォメーションに結合し、かつ／またはα２−３連結であれα２−６連結であれ、円錐型トポロジーグリカンに結合する。
トリ組織、ならびにまたヒトの深部肺および胃腸（ＧＩ）管組織におけるＨＡ受容体は、α２−３シアル酸付加グリカン連結によって特徴付けられ、さらに（本発明によれば）、円錐型トポロジーを優先してとる、α２−３シアル酸付加グリカンおよび／またはα２−６シアル酸付加グリカンを含むグリカンによって特徴付けられる。このような円錐型トポロジーグリカンを有するＨＡ受容体は、本明細書でＣＴＨＡｒと称され得る。
対照的に、上気道の気管支および気管におけるヒトＨＡ受容体は、例えば多くのα２−６シアル酸付加グリカンを含む、傘型トポロジーを優先してとるグリカンによって改変される。α２−３モチーフとは異なり、α２−６モチーフは、Ｃ６−Ｃ５結合に起因する、コンフォメーションのさらなる自由度を有する（Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ２３巻：８５頁、２００６年）。このようなα２−６シアル酸付加グリカンに結合するＨＡは、このコンフォメーションの自由度から生じる構造の多様性を提供する、より開いた結合ポケットを有する。さらに、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／３００５６号および同第ＰＣＴ／ＵＳ０７／１８１６０号に記載されるように、ＨＡは、ヒト上気道組織の感染を効果的に媒介するために、傘型トポロジーのグリカン（例えば、α２−６シアル酸付加グリカン）に結合する必要があり得、特に、強い親和性および／または特異性でこのような傘型トポロジーグリカンに結合する必要があり得る。傘型トポロジーグリカンを有するＨＡ受容体は、本明細書でＵＴＨＡｒと称され得る。
これらの空間的に制限されたグリコシル化プロファイルの結果として、ヒトには、多くの野生型トリＨＡ（例えば、トリＨ５）を含有するウイルスは通常は感染しない。具体的には、ウイルスに遭遇する可能性が最も高いヒト気道の一部分（即ち、気管および気管支）は、円錐型グリカン（例えば、α２−３シアル酸付加グリカン、および／または短いグリカン）を有する受容体を欠き、野生型トリＨＡは、典型的には、円錐型グリカン（例えば、α２−３シアル酸付加グリカン、および／または短いグリカン）と会合する受容体に主にまたはもっぱら結合するので、ヒトは、稀にしかトリウイルスに感染しない。ウイルスが傘型グリカン（例えば、長いα２−６シアル酸付加グリカン）を有する深部肺および／または胃腸管受容体にアクセスできるように、十分に密接してウイルスと接触する場合にのみ、ヒトは感染する。
ＨＡポリペプチド
本発明は、参照ＨＡとの全体的配列同一性を示し、本明細書に記載される特定の構造的特徴もまた含むＨ５ ＨＡポリペプチドを具体的に含むある特定のＨＡポリペプチドを、定義および記載する。本発明は、特徴的断片（即ち、そのアミノ酸配列が少なくとも１つの特徴的配列エレメントを含む断片）を含むこのようなＨＡポリペプチドの断片もまた提供する。一部の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、有意なヒト受容体結合ならびに／またはヒト感染および／もしくは伝染を媒介する（例えば、確立または記載されたアッセイ系において評価したとおり）。
一部の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、高い親和性で、傘型トポロジーグリカン（例えば、例えばＮｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−などの長いα２−６シアル酸付加（ｓｉｌａｙｌａｔｅｄ）グリカン）に結合する。例えば、一部の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、ヒトの感染を媒介する野生型ＨＡ（例えば、Ｈ１Ｎ１ ＨＡまたはＨ３Ｎ２ ＨＡ）について観察される親和性と匹敵する親和性で、傘型トポロジーグリカンに結合する。一部の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、ヒトの感染を媒介する野生型ＨＡについて匹敵する条件下で観察される親和性の少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である親和性で、傘型グリカンに結合する。一部の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、ヒトの感染を媒介する野生型ＨＡについて匹敵する条件下で観察される親和性よりも高い親和性で、傘型グリカンに結合する。
ある特定の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドの結合親和性は、ある濃度範囲にわたって評価される。このような戦略は、特に多価結合アッセイにおいて、単一濃度分析よりも、顕著により多くの情報を提供する。一部の実施形態では、例えば、提供されたＨＡポリペプチドの結合親和性は、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれより大きな倍数にわたる範囲の濃度にわたって評価される。
ある特定の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、それが本明細書に記載されるものなどの多価グリカンアレイ結合アッセイにおいて飽和シグナルを示す場合に、高い親和性を示す。一部の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、それらがこのような研究において約４０００００以上を上回る（例えば、約５０００００を上回る、６０００００を上回る、７０００００を上回る、８０００００を上回るなど）シグナルを示す場合に、高い親和性を示す。一部の実施形態では、本明細書に記載される結合剤は、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍またはそれより大きな倍数の濃度範囲にわたって、一部の実施形態では、１０倍またはそれより大きな倍数の濃度範囲にわたって、傘型グリカンへの飽和結合を示す。
さらに、一部の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、それらが円錐型トポロジーグリカンに結合する場合よりも強く、傘型トポロジーグリカンに（および／または傘型トポロジーグリカン模倣物に）結合する。一部の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、約１０、９、８、７、６、５、４、３または２である、傘型グリカン対円錐型グリカンについての相対的親和性を示す。
一部の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、α２−６シアル酸付加グリカンに結合する；一部の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、α２−６シアル酸付加グリカンに優先的に結合する。ある特定の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、複数の異なるα２−６シアル酸付加グリカンに結合する。一部の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、α２−３シアル酸付加グリカンに結合することができず、他の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、α２−３シアル酸付加グリカンに結合することができる。
一部の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、ヒト上気道上皮細胞上に見出される受容体に結合する。ある特定の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、気管支および／または気管におけるＨＡ受容体に結合する。一部の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、深部肺における受容体には結合することができず、他の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、深部肺における受容体にできる。
一部の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、ヒト上気道組織（例えば、上皮細胞）におけるＨＡ受容体上に見出されるグリカンの少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ超に結合する。
一部の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、インフルエンザのパンデミック株によって利用される受容体結合部位に結合するという点によって特徴付けられ、一部の実施形態では、このような部位への結合について、このようなパンデミック株（またはその受容体結合部分）と競合する。一部の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、それらのＲＢＳＮスコアとパンデミックインフルエンザ株において見出されるＨＡポリペプチドのＲＢＳＮスコアとの間の実質的な数の類似性によって特徴付けられる。
一部の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、本明細書に記載されるグリカンアレイ分析を使用して測定されるように、例えば傘型トポロジーグリカンに結合する目的の活性（例えば、ヒト感染性および／または伝染性を媒介する、傘型トポロジーグリカンへの結合など）を示し、Ｋｄ’は、ピコモル濃度未満〜１０ナノモル濃度の範囲にあり、円錐型トポロジーグリカンへの結合と比較して２桁よりも大きい大きさのレベルにある；一部の実施形態では、このような相対レベルは、同じＨＡポリペプチドの異なる活性（例えば、非ヒト感染性（ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）および／または伝染性を媒介する、円錐型トポロジーグリカンへの結合など）に対するものである。一部の実施形態では、このような相対レベルは、異なるＨＡポリペプチドの同じ活性（例えば、参照ＨＡによる）に対するものである。
一部の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、親または参照ＨＡのバリアントである。一部のこのような実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、本明細書に記載される特徴のうちの１つまたは複数の存在対非存在において親または参照ＨＡのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、本明細書に記載される特徴のうちの１つだけの存在対非存在において親または参照ＨＡのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドは、本明細書に記載される特徴のうちの１つ、２つ、３つまたは４つの存在対非存在において親または参照ＨＡのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドが特定の程度の配列同一性を示す参照ＨＡは、有意なヒト受容体結合ならびに／またはヒト感染および／もしくは伝染を媒介しないＨＡである；一部のこのような実施形態では、この提供されたＨＡは、本明細書に記載される１つまたは複数の構造的特徴の存在対非存在と、有意なヒト受容体結合ならびに／または有意なヒト感染および／もしくは伝染を媒介する能力との両方において、参照非ヒト感染ＨＡ（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ−ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ＨＡ）とは異なる。一部の実施形態では、提供されたＨＡポリペプチドが特定の程度の配列同一性を示す参照ＨＡは、有意なヒト受容体結合ならびに／または有意なヒト感染および／もしくは伝染を媒介する；一部のこのような実施形態では、この提供されたＨＡポリペプチドは、本明細書に記載される１つまたは複数の構造的特徴および１つまたは複数の生物学的活性（例えば、有意なヒト受容体結合ならびに／または有意なヒト感染および／もしくは伝染を媒介する能力）の両方を、ヒト感染性参照ＨＡと共有する。
有意なヒト受容体結合ならびに／またはヒト感染および／もしくは伝染を媒介しない代表的ＨＡ（即ち、非ヒト感染ＨＡ）には、Ｈ５ ＨＡ、例えば、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｈｕｎａｎ／７９５／２００２（クレード２．１）、Ａ／Ｖｉｅｔ Ｎａｍ／１１９４／２００４（クレード１）、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（クレード２．１．３．２）、Ａ／ｂａｒ−ｈｅａｄｅｄ ｇｏｏｓｅ／Ｑｉｎｇｈａｉ／１Ａ／２００５（クレード２．２）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（クレード２．３．４）、Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕｉｙａｎｇ／３３７／２００６（クレード４）、Ａ／Ｃａｍｂｏｄｉａ／Ｒ０４０５０５０／２００７（クレード１．１）、Ａ／ｃｏｍｍｏｎ ｍａｇｐｉｅ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／５０５２／２００７（クレード２．３．２．１）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｖｉｅｔ Ｎａｍ／ＮＣＶＤ−０１６／２００８（クレード７．１）、Ａ／Ｅｇｙｐｔ／Ｎ０３０７２／２０１０（クレード２．２．１）、Ａ／Ｈｕｂｅｉ／１／２０１０（クレード２．３．２．１）が含まれる。
有意なヒト受容体結合ならびに／またはヒト感染および／もしくは伝染を媒介する代表的ＨＡ（即ち、ヒト感染ＨＡ）には、例えば、Ａ／Ｐｏｒｔ Ｃｈａｌｍｅｒｓ／１／１９７３（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／８４０／７４（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／７５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｂａｎｇｋｏｋ／０１／１９７９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ／２／８２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ／４／１９８５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ／１／８５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ／３６０／１９８６（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１１／８７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｓｉｃｈｕａｎ／０２／８７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｇｕｉｚｈｏｕ／５４／８９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３２／９２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／９／９３（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／３３／９４（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｕｈａｎ／３５９／９５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００４（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ／１／２００４（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９（Ｈ３Ｎ２）およびＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２）が含まれるがこれらに限定されないＨ３Ｎ２株、Ａ／Ｃｈｉｌｅ／１／８３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／６／１９８６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂａｙｅｒｎ／７／９５（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）が含まれるがこれらに限定されないＨ１Ｎ１株（ｓｔａｉｎ）、Ａ／Ｐａｎａｍａ／１／６６（Ｈ２Ｎ２）およびＡ／Ｋｏｒｅａ／４２６／１９６８（Ｈ２Ｎ２）が含まれるがこれらに限定されないＨ２Ｎ２株、ならびにある特定の場合には、Ａ／ｇｕｉｎｅａ ｆｏｗｌ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／ＷＦ１０／９９（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／ｗｉｌｄ ｄｕｃｋ／Ｎａｎｃｈａｎｇ／２−０４８０／２０００（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｉｓｒａｅｌ／６８９／２００８（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｚｈｅｊｉａｎｇ／ＨＥ１／２００９（Ｈ９Ｎ２）およびＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｅｇｙｐｔ／１１５６１７Ｖ／２０１１（Ｈ９Ｎ２）が含まれるがこれらに限定されないＨ９Ｎ２株が含まれる。
一部の実施形態では、本発明は、結合優先性におけるヒトグリカン受容体への量的切り替えを生じ得る、循環しているトリインフルエンザ株のヘマグルチニン（ＨＡ）におけるアミノ酸変異を定義するための新規フレームワークを提供する。一部の実施形態では、本発明は、その最も近縁の、ヒトに適応した系統発生学的に関連するパンデミックインフルエンザＨＡと関連した、候補インフルエンザＨＡのグリカン受容体結合部位（ＲＢＳ）の分子特徴を分析するための新規フレームワークを提供する。一部の実施形態では、本発明は、そのＲＢＳ分子特徴がパンデミックインフルエンザＨＡのＲＢＳ分子特徴と類似し、受容体特異性を切り替えるためにより少ないアミノ酸変化を必要とするように、現在循環している候補インフルエンザＨＡが進化したことを実証する。このような提供されたフレームワークの適用は、本明細書に記載される配列特徴および活性を有するＨＡポリペプチドバリアントを定義する。
特に、本発明は、本明細書に記載されるＨ５ ＨＡポリペプチド中に存在する場合に、ヒト受容体結合、ヒト感染および／またはヒト伝染からなる群から選択される１つまたは複数の活性の有意なレベルを生じる、４つの構造的特徴を記載する。一部の実施形態では、活性は、指定された閾値を超えるレベルで観察される場合に、有意とみなされる。一部の実施形態では、活性は、参照活性−例えば、例えば１つもしくは複数の特定の配列エレメントもしくは特徴を欠く匹敵する参照ＨＡポリペプチドにおける同じ活性、または同じＨＡポリペプチドによる異なる活性（例えば、異なる標的への結合）−よりも相対的に高いレベルで観察される場合に、有意とみなされる。
本明細書に記載するように、本発明は、Ｈ５ ＨＡポリペプチドの関連する活性に寄与する少なくとも４つの構造的特徴を定義する。特に、本発明によれば、提供されたＨ５ ＨＡポリペプチドは、典型的には、参照ＨＡと（例えば、参照Ｈ５ ＨＡと）、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い全体的配列同一性を示すが、提供されたＨＡが、以下：
１）参照Ｈ５ ＨＡのアミノ酸１３０に対応するアミノ酸の欠失である第１の特徴；
２）以下：
ｉ．Ｘａａ２２６＋ｓｅｒ２２８、
ｉｉ．Ｌｙｓ２２４＋Ｘａａ２２６、
ｉｉｉ．Ｘａａ１３７＋Ｘａａ２２６＋ｓｅｒ２２８、
ｉｖ．Ｘａａ１＋ｇｌｙ２２７＋ｓｅｒ２２８、
ｖ．Ｘａａ１３７＋ｐｒｏ２２１＋Ｘａａ２２６＋ｓｅｒ２２８、および
ｖｉ．Ｘａａ１３７＋ｔｈｒ１５５＋ｐｒｏ２２１＋Ｘａａ２２６＋ｇｌｙ２２７＋ｓｅｒ２２８
である、またはこれらを含む、第２の特徴であって、Ｘａａ２２６は、群Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＭｅｔおよびＡｌａから選択され、Ｘａａ１３７は、群Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＨｉｓおよびＡｓｎから選択される、第２の特徴；
３）以下：
ｉ．ｇｌｕ１８８＋Ｘａａ１９２＋Ｘａａ１９３、
ｉｉ．ａｓｐ１８７＋Ｘａａ１９３、および
ｉｉｉ．Ｘａａ１９３
である、またはこれらを含む、第３の特徴であって、Ｘａａ１９２は、群Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され、Ｘａａ１９３は、群Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓから選択される、第３の特徴；ならびに
４）以下：
ｉ．ａｌａ１６０、
ｉｉ．ａｓｎ１５８＋ａｌａ１６０、および
ｉｉｉ．ａｓｎ１５８＋ｔｈｒ１６０
である、またはこれらを含む、さらなる特徴、
のうちの少なくとも１つを含むアミノ酸配列を有するという点で、参照ＨＡとは１００％同一でない配列を有し、第２、第３および第４の特徴のアミノ酸の位置は、参照Ｈ５ ＨＡの参照された位置に対応する。
核酸および発現系
本発明はまた、例えばＨＡポリペプチド、抗体などおよび／またはそれらの断片を含めた、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明はまた、このようなコードする核酸に相補的であり、かつ／またはこのようなコードする核酸とハイブリダイズする核酸を提供する。
一部の実施形態では、提供される核酸は、一本鎖であり、一部の実施形態では、二本鎖である。
一部の実施形態では、提供される核酸は、当業者に理解される通り、プライマー、プローブ、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスなどとしてのそれらの使用に適した配列および長さを有する。わずかであるが例を挙げると、このような核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーとして、ハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む）のためのプローブとして、および／または逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）のためのプライマーとして使用することができる。
ある特定の実施形態では、核酸は、ＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡであってよく、またはＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡを含むことができる。一部の実施形態では、本発明の核酸は、１つまたは複数の非天然ヌクレオチドを含むことができ、他の実施形態では、本発明の核酸は、天然ヌクレオチドだけを含む。
本発明はまた、提供されるポリペプチドおよび／またはそれらの断片を生成する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系、細胞系および生物を含む発現系を提供する。
検出剤
本発明は、提供されるＨＡポリペプチドを検出する（例えば直接的または間接的結合を介して）作用物質を提供する。
一部の実施形態では、提供される検出剤は、１つまたは複数の提供されるＨＡポリペプチドに直接的または間接的に結合する。一部の実施形態では、提供される検出剤は、１つまたは複数の提供されるＨＡポリペプチドに特異的に結合する。一部の実施形態では、提供される検出剤は、提供されるＨＡポリペプチドと参照ＨＡポリペプチドとを区別し、この参照ＨＡポリペプチドに対して、提供されるＨＡポリペプチドは、本明細書に記載の通りある特定の程度の全体的配列同一性を示し、かつ／またはこの参照ＨＡポリペプチドは、本明細書に記載の特徴の１つもしくは複数に関して、提供されるＨＡポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。
一部の特定の実施形態では、提供される検出剤は、提供されるＨＡポリペプチドに結合する抗体または抗体様の実体である。一部の実施形態では、このような抗体または抗体様の実体は、提供されるＨＡポリペプチドに特異的に結合する。一部の実施形態では、提供される抗体または抗体様の実体は、提供されるＨＡポリペプチドと、それらの同族の参照ＨＡとを識別する。一部の実施形態では、提供される抗体または抗体様の実体は、ＨＡポリペプチドと、ここに具体的に記載されている特徴の１つまたは複数が存在することまたは存在しないことだけが異なる以外は同一のＨＡとを識別する。
抗体
一部の実施形態では、提供されるＨＡポリペプチドに結合する抗体または抗体様の実体は、このようなＨＡポリペプチドとＨＡ受容体の結合を妨害する方式で結合し、したがって、観測される結合のレベルは、抗体または抗体様の実体が存在しない場合と比較して、存在する場合に低下する。一部の実施形態では、提供されるＨＡポリペプチドに結合する抗体または抗体様の実体は、このようなＨＡポリペプチドとＨＡ受容体の結合を有意に妨害しない方式で結合する。
提供されるＨＡポリペプチドに結合する、本発明に従って有用な適切な抗体として、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、コンジュゲート抗体（即ち、他のタンパク質、放射標識、細胞毒にコンジュゲートまたは融合した抗体）、小モジュラー免疫医薬（「ＳＭＩＰ（商標）」）、単鎖抗体、ラクダ（ｃａｍｅｌｏｉｄ）抗体、および抗体断片が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、用語「抗体」には、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一ドメイン抗体（例えば、サメ単一ドメイン抗体（例えば、ＩｇＮＡＲまたはその断片））、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成された多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および所望の生物活性を呈する限り抗体断片も含まれる。本明細書で使用するための抗体ポリペプチドは、いかなるタイプのもの（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）であってもよい。
本明細書で使用される場合、「抗体断片」には、例えば、抗体の抗原結合領域または可変領域などのインタクトな抗体の一部分が含まれる。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；トリアボディ；テトラボディ；線状抗体；単鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。また、用語「抗体断片」には、特異的抗原に結合して複合体を形成することによって抗体のように作用する、任意の合成または遺伝子操作タンパク質が含まれる。例えば、抗体断片には、単離された断片、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって接続された組換え単鎖ポリペプチド分子（「ＳｃＦｖタンパク質」）、ならびに超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位が含まれる。
抗体は、当技術分野で周知の方法を使用して作製することができる。例えば、抗体を生成するためのプロトコールは、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（１９８８年）に記載されている。典型的に、抗体は、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ラクダ、ラマ、サメまたは他の適切な宿主において作製することができる。あるいは、抗体を、ＩｇＹ分子を生成するニワトリにおいて作製することができる（Ｓｃｈａｄｅら、（１９９６年）ＡＬＴＥＸ １３巻（５号）：８０〜８５頁）。一部の実施形態では、本発明に適した抗体は、ヒトに近い霊長類の抗体である。例えば、ヒヒにおいて治療上有用な抗体を生じさせるための一般的技法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、国際特許公開第ＷＯ９１／１１４６５号（１９９１年）、およびＬｏｓｍａｎら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４６巻：３１０頁（１９９０年）に見出すことができる。一部の実施形態では、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法を使用して調製することができる（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、（１９８３年）Ｎａｔｕｒｅ ３０５巻（５９３４号）：５３７〜４０頁）。一部の実施形態では、モノクローナル抗体は、組換え法によって作製することもできる（米国特許第４，１６６，４５２号、１９７９年）。
一部の実施形態では、本発明に適した抗体には、ヒト化抗体またはヒト抗体が含まれ得る。非ヒト抗体のヒト化形態は、キメラＩｇ、Ｉｇ鎖または非ヒトＩｇから誘導された最小配列を含有する断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＡｂの他の抗原結合部分配列）である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入」残基と呼ばれ、典型的に「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列を、げっ歯類の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはＣＤＲ配列で置換することによって達成される（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２巻（６１６２号）：３２３〜７頁、１９８８年；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２３９巻（４８４７号）：１５３４〜６頁、１９８８年）。このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に少ないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されたキメラＡｂである（米国特許第４，８１６，５６７号、１９８９年）。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、典型的に、いくつかのＣＤＲ残基およびあるいはいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類Ａｂにおける類似部位に由来する残基によって置換されたヒト抗体である。ヒト化抗体には、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲに由来する残基によって、レシピエントのＣＤＲに由来する残基が置き換えられている、ヒトＩｇ（レシピエント抗体）が含まれる。ある場合には、対応する非ヒト残基は、ヒトＩｇのＦｖフレームワーク残基を置き換える。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列のいずれにも見出されない残基を含むことができる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的に２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、そのＣＤＲ領域の全てではないとしてもほとんどが、非ヒトＩｇのＣＤＲ領域に相当し、ＦＲ領域の全てではないとしてもほとんどが、ヒトＩｇコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、Ｉｇ定常領域（Ｆｃ）、典型的にヒトＩｇのＩｇ定常領域の少なくとも一部を含む（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２巻（６１６２号）：３２３〜７頁、１９８８年；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２３９巻（４８４７号）：１５３４〜６頁、１９８８年）。
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１年）２８巻（９号）：１０２７〜３７頁；Ｍａｒｋｓら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（１９９１年）２２２巻（３号）：５８１〜９７頁）、およびヒトモノクローナル抗体の調製（ＲｅｉｓｆｅｌｄおよびＳｅｌｌ、１９８５年、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖ．４巻（１号）：２７１〜９０頁）を含む様々な技法を使用して生成することもできる。同様に、内因性Ｉｇ遺伝子が部分的または完全に不活化されたトランスジェニック動物にヒトＩｇ遺伝子を導入することを活用して、ヒト抗体を合成することができる。チャレンジすると、遺伝子再構成、アセンブリ、および抗体レパートリーを含むあらゆる点において、ヒトにおいて見られるものに酷似しているヒト抗体の生成が観測される（Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｈｉｇｈ−ａｖｉｄｉｔｙ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｋａｐｐａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９６年７月；１４巻（７号）：８４５〜５１頁；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｍｉｃｅ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｆｏｕｒ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ １９９４年４月２８日；３６８巻（６４７４号）：８５６〜９頁；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ， Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９５年；１３巻（１号）：６５〜９３頁；Ｍａｒｋｓら、Ｂｙ−ｐａｓｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ： ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ）．１９９２年７月；１０巻（７号）：７７９〜８３頁）。
アプタマー
一部の実施形態では、提供される検出剤は、アプタマーである。アプタマーは、特異的分子標的（例えば、傘型トポロジーグリカン）に強く結合する核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）から構成された巨大分子である。特定のアプタマーは、線状ヌクレオチド配列によって記載することができ、典型的に約１５〜６０ヌクレオチド長である。いかなる理論にも拘泥するものではないが、アプタマーにおけるヌクレオチド鎖が、分子を複雑な三次元形状に折り畳む分子内相互作用を形成し、この三次元形状によって、アプタマーがその標的分子の表面に強く結合できると想定される。全ての可能なヌクレオチド配列の領域内に存在する分子形状の膨大な多様性を考慮して、タンパク質および小分子を含む豊富な分子標的のためのアプタマーを取得することができる。アプタマーは、高い特異性に加えて、それらの標的に対して非常に高い親和性（例えば、タンパク質に対してピコモル濃度から低ナノモル濃度の範囲の親和性）を有する。アプタマーは、化学的に安定であり、活性を喪失することなく煮沸または凍結することができる。アプタマーは合成分子なので、様々な改変を受けることができ、それによって、特定の適用に合わせてそれらの機能を最適化することができる。例えば、アプタマーは、ｉｎ ｖｉｖｏ適用で使用するために、血中酵素による分解に対してそれらの感受性が劇的に低下するように改変することができる。さらに、アプタマーは、それらの体内分布または血漿滞留時間を変えるように改変することができる。
提供されるＨＡポリペプチドに結合する（直接的または間接的および／または特異的に）アプタマーの同定および／または特徴付けは、当業者によって理解される通り、様々な手法のいずれかを介して実現することができる。
例えば、アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（指数富化によるリガンドの系統進化）法を使用して選択することができる（Ｔｕｅｒｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９巻：５０５頁、１９９０年）。典型的に、ＳＥＬＥＸ法では、標的実体（例えば、提供されるＨＡポリペプチドまたはその断片）と接触する核酸分子の巨大（例えば、１０１５個の異なる分子）ライブラリーを準備することを含む。実体は、相互作用（例えば、特異的相互作用）を生じさせるのに十分な時間および条件で、ライブラリーのメンバーと接触する。
当技術分野では、標的実体と相互作用するアプタマーを物理的に単離しかつ／または増幅するための様々な技術のいずれかが公知である。一部の実施形態では、目的の標的実体に結合するメンバーが富化された新しいライブラリーになり得るこのような単離されたアプタマーを、再びスクリーニングして、例えば特定のレベルの親和性および／または特異性を示す結合アプタマーをさらに同定することができる。
典型的に、反復的な選択、分配および増幅プロセスを約５〜１５サイクル行った後、ライブラリーを、標的分子に強く結合する少数のアプタマーまで低減する。個々のアプタマー分子は、単離し、それらのヌクレオチド配列を決定し、結合親和性および／または特異性に関するそれらの特性を測定し、かつ／または比較することができる。
次に、単離されたアプタマーを精製して、例えば標的結合および／またはアプタマー構造に寄与しないヌクレオチドを排除し、それによって、コア結合ドメインに切断されたアプタマーを生成することができる。例えば、教示全体が参照によって本明細書に組み込まれる、アプタマー技術の概要に関するＪａｙａｓｅｎａ、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４５巻：１６２８頁、１９９９年を参照されたい。
競合剤
本発明は、ＨＡ受容体、特にヒトＨＡ受容体との結合について、提供されるＨＡポリペプチドと競合する作用物質を同定しかつ／または特徴付けるための系を提供する。このような作用物質は、例えば、本明細書に記載の１つまたは複数の構造的特徴を有するＨＡポリペプチドによって媒介される感染症の処置または予防に有用となり得る。一部の実施形態では、上記の検出剤（例えば、抗体および／またはアプタマーを含む）も、競合剤である。一部の実施形態では、競合剤は、検出剤ではなく、かつ／または提供されるＨＡポリペプチドに直接的にも間接的にも結合しない。
組成物
本発明は、活性剤としての、提供されるＨＡポリペプチドおよびそれらの断片、それらをコードする核酸、それらを生成する発現系、それらを検出する検出剤、および／またはそれらの相互作用について１つもしくは複数のＨＡ受容体と競合する競合剤（ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ ｔｈａｔ ｃｏｍｐｅｔｅ ｔｈｅｉｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ＨＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）を含む組成物を提供する。
診断および監視組成物
本発明は、インフルエンザウイルスおよび／または感染症（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ）の検出、同定および／または特徴付けに有用な様々な組成物を提供する。特定の実施形態では、本発明は、検出剤を含む組成物を提供し、この組成物は、例えば特定のインフルエンザ株の存在またはレベル、インフルエンザ感染の程度または進行などを評価するために、臨床試料、病理学的試料または環境試料と接触させることができる。
ある特定の実施形態では、本発明は、特定のグリカン結合の特徴および／または感染性の特徴を有する本明細書に記載のＨＡポリペプチドを特異的に検出する組成物および／またはキットを提供する。このような組成物またはキットは、例えば、特定のＨＡポリペプチドを特異的に認識する（例えば、傘型グリカンおよび／またはα２−６シアル酸付加グリカンおよび／または長いα２−６シアル酸付加グリカンに結合する）抗体などの検出剤を含むことができ、このようなＨＡポリペプチドを、例えばＥＬＩＳＡ、免疫蛍光および／または免疫ブロットによって特異的に検出するために使用することができる。
ＨＡポリペプチドに結合する抗体は、ウイルス中和試験で使用することもでき、この試験では、試料を、目的のＨＡポリペプチドに特異的な抗体で処理し、培養細胞へのその感染能について未処理試料と比較して試験する。試料中のウイルスがこのようなＨＡポリペプチドを含有する場合、抗体は、ウイルスを中和し、ウイルスが培養細胞に感染するのを予防する。あるいはまたはさらに、このような抗体は、ＨＡ阻害試験で使用することもでき、この試験では、ＨＡタンパク質を、所与の試料から単離し、特定のＨＡポリペプチドまたは特定の組のＨＡポリペプチドに特異的な抗体で処理し、赤血球の凝集能について未処理試料と比較して試験する。試料中のウイルスがこのようなＨＡポリペプチドを含有する場合、抗体は、ＨＡポリペプチドの活性を中和し、ＨＡポリペプチドが赤血球を凝集させるのを予防する（Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８年；ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｓｒ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｉｎｆｌｕｅｎｚａ／ＷＨＯ＿ＣＤＳ＿ＣＳＲ＿ＮＣＳ＿２００２＿５／ｅｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｓｒ／ｄｉｓｅａｓｅ／ａｖｉａｎ＿ｉｎｆｌｕｅｎｚａ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ／ｌａｂｔｅｓｔｓ／ｅｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。他の実施形態では、このような作用物質は、特定のＨＡポリペプチドをコードするヌクレオチドに特異的に結合し、ＲＴ−ＰＣＲまたはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによってこのようなＨＡポリペプチドを特異的に検出するために使用できる核酸を含むことができる（ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｓｒ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｉｎｆｌｕｅｎｚａ／ＷＨＯ＿ＣＤＳ＿ＣＳＲ＿ＮＣＳ＿２００２＿５／ｅｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｓｒ／ｄｉｓｅａｓｅ／ａｖｉａｎ＿ｉｎｆｌｕｅｎｚａ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ／ｌａｂｔｅｓｔｓ／ｅｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。ある特定の実施形態では、試料から単離された核酸は、検出前に増幅される。ある特定の実施形態では、診断試薬は、検出可能に標識することができる。
本発明はまた、インフルエンザウイルスおよびワクチンの作製のための、本発明による試薬を含有するキットを提供する。このようなキットの内容物には、目的のＨＡポリペプチドをコードするＨＡ（ヌクレオチド（または特徴的な断片などの断片）を含有する発現プラスミドが含まれるが、これらに限定されない。あるいはまたはさらに、キットは、目的のＨＡポリペプチド（または特徴的なもしくは生物学的に活性な部分）を発現する発現プラスミドを含有することができる。使用者が、目的の任意のインフルエンザウイルス由来のＨＡヌクレオチドを組み込むことができるように、ウイルス遺伝子を含有していない発現プラスミドが含まれていてもよい。限定されるものではないが、ベロ細胞株およびＭＤＣＫ細胞株を含む哺乳動物細胞株を、キットと共に含めることもできる。ある特定の実施形態では、診断試薬は、検出可能に標識することができる。
ある特定の実施形態では、本発明に従って使用するためのキットは、参照試料、試料を処理するための指示、試験を実施するための指示、結果を解釈するための指示、試験を実施するのに必要なバッファーおよび／または他の試薬を含むことができる。ある特定の実施形態では、キットは、抗体のパネルを含むことができる。
本発明の一部の実施形態では、上で論じたグリカンアレイを、診断および／またはキットとして利用することができる。
ある特定の実施形態では、本発明のグリカンアレイおよび／またはキットは、ＨＡポリペプチドと傘型グリカンの結合を複数用量で評価する用量応答研究を実施するために使用される（例えば、本明細書に記載の通り）。このような研究によって、試験されるＨＡポリペプチドの結合特徴に関して特に有益な洞察が得られ、このような研究は、特異的結合を評価するのに特に有用である。このタイプの用量応答結合研究には、多くの有用な適用がある。一例を挙げると、このような研究は、関係する一連のＨＡポリペプチドバリアントが、自然進化、意図的操作またはこれら２つの組合せのいずれによって作製されるかに関わらず、この関係する一連のＨＡポリペプチドバリアントの結合特徴の進化を追跡するのに役立てることができる。
ある特定の実施形態では、本発明のグリカンアレイおよび／またはキットは、所望の結合特徴を有する結合剤（例えば、ＨＡポリペプチドおよび／またはＨＡポリペプチドバリアント）を誘導、同定および／または選択するために使用される。例えば、一部の実施形態では、本発明のグリカンアレイおよび／またはキットは、ポリペプチド結合剤（例えば、ＨＡポリペプチド）の集団に対して進化的（例えば、スクリーニングおよび／または選択）圧力をかけるために使用される。
一部の実施形態では、提供されるキットは、使用のための指示を含む。
治療組成物
本発明は、本明細書に記載のＨＡポリペプチドまたはそれらの断片、検出剤、競合剤などを含む、またはそうでなければ送達する様々な組成物を提供する。一部の実施形態では、提供される組成物は、感染症の開始および／または感染症の１つもしくは複数の症状の発症の前または後に、インフルエンザ感染症を処置するのに有用である。
本発明は、このような本発明の治療組成物を投与することによって、インフルエンザ感染症を処置することを包含する。一部の実施形態では、本発明の治療組成物は、インフルエンザ感染症に罹患しているまたは感受性である被験体に投与される。一部の実施形態では、被験体は、該被験体がインフルエンザ感染症に一般に関連する１つまたは複数の症状を呈している場合、インフルエンザ感染症に罹患しているとみなされる。一部の実施形態では、被験体は、該被験体がインフルエンザウイルスに曝露されたことが分かっている、または曝露されたと考えられる。一部の実施形態では、被験体は、該被験体がインフルエンザウイルスに曝露されたことが分かっている、または曝露されたと考えられる場合、インフルエンザ感染症に感受性であるとみなされる。一部の実施形態では、被験体は、インフルエンザウイルスに感染したことが分かっている、もしくは感染したことが疑われる他の個体と接触した場合、および／または該被験体がインフルエンザ（ｉｎｆｌｕｚｅｎａ）感染症が流行していることが公知である、もしくは流行していると考えられる場所に存在している、もしくは存在していた場合、インフルエンザウイルスに曝露されたことが分かっている、または曝露されたと考えられる。
一部の実施形態では、インフルエンザ感染症に罹患しているまたは感受性である被験体は、本発明の治療組成物の投与前、最中または後に、本発明の結合剤に対する抗体について試験される。一部の実施形態では、このような抗体を有する被験体は、本発明の結合剤を含む治療組成物を投与されない。一部の実施形態では、医薬組成物および／または結合剤の適切な用量は、このような抗体の検出（またはその欠如）に基づいて選択される。
一部の実施形態では、処置のための特定の被験体、投与のための特定の結合剤もしくは組成物、および／または投与のための特定の用量もしくはレジメンの選択は、例えば筆記による、印刷による、または電子的な保存形態で記憶される。
本発明の治療組成物は、インフルエンザ感染症の１つまたは複数の症状が発症する前または発症した後に投与することができる。
一般に、治療組成物は、治療剤に加えて、限定されるものではないが、滅菌水、食塩水、緩衝食塩水、またはデキストロース溶液を含めた無菌の生体適合性のキャリアなどの１つまたは複数の不活性な剤（ａｇｅｎｔ）を含む。あるいはまたはさらに、組成物は、様々な添加剤、例えば安定剤、バッファー、賦形剤（例えば、糖、アミノ酸など）、または保存剤のいずれかを含有することができる。
例示的な不活性な剤として、例えば限定されるものではないが、滅菌水、食塩水、緩衝食塩水、またはデキストロース溶液を含めた無菌の生体適合性のキャリアが含まれる。あるいはまたはさらに、所望される特定の製剤または剤形に適した、様々な溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散助剤もしくは懸濁助剤、崩壊剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、保存剤、緩衝剤、固体結合剤、造粒剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、香味剤、賦香剤などのいずれかを利用することができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、２００６年；参照によって本明細書に組み込まれる）は、治療組成物を製剤化するのに使用される様々な賦形剤、および組成物の調製のための公知の技法を開示している。任意の従来の賦形剤媒体が、任意の望ましくない生物学的作用を生じる、または別の方法で医薬組成物の任意の他の成分と有害な方式で相互作用するなどによって、物質またはその誘導体と適合性がない場合を除き、賦形剤媒体の使用は、本発明の範囲に含まれることが企図される。
一部の実施形態では、医薬組成物は、脂質小胞、生体利用可能なおよび／もしくは生体適合性および／もしくは生分解性マトリックス、または他の微粒子内に封入、捕捉または結合された治療剤を含む。
一部の実施形態では、提供される組成物は、１つまたは複数のアジュバントをさらに含む。本発明に従って、いかなるアジュバントを使用することもできる。多数のアジュバントが公知であり、多くのこのような化合物の有用な概論は、国立衛生研究所によって準備されており、インターネット（ｗｗｗ．ｎｉａｉｄ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄａｉｄｓ／ｖａｃｃｉｎｅ／ｐｄｆ／ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ．ｐｄｆ）上で見出すことができる。また、Ａｌｌｉｓｏｎ（１９９８年、Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄ．、９２巻：３〜１１頁；参照によって本明細書に組み込まれる）、Ｕｎｋｅｌｅｓｓら（１９９８年、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６巻：２５１〜２８１頁；参照によって本明細書に組み込まれる）、およびＰｈｉｌｌｉｐｓら（１９９２年、Ｖａｃｃｉｎｅ、１０巻：１５１〜１５８頁；参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。数百種類もの異なるアジュバントが当技術分野で公知であり、本発明の実施において用いることができる。
治療組成物は、処置および／またはワクチン接種に有効な任意の量および任意の投与経路を使用して投与することができる。正確な必要量は、被験体の種、年齢および全体的な状態、感染症の重症度、特定の組成物、その投与形態、その活性形態などに応じて、被験体ごとに変わる。治療組成物は、典型的に、投与の容易さおよび投与量の均一性のために、単位剤形に製剤化される。しかし、本発明の組成物の毎日の総使用量は、主治医によって、良好な医学的判断の範囲内で決定されることを理解されよう。任意の特定の被験体または生物のための具体的な治療上有効な用量レベルは、処置されるおよび／またはワクチン接種される障害、ならびに障害の重症度；用いられる具体的なワクチン組成物の活性；投与後の組成物の半減期；被験体の年齢、体重、全体的な健康状態、性別および食事；用いられる具体的な化合物の投与時間、投与経路および排泄速度；処置期間；用いられる具体的な化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；ならびに医療分野で周知の同様の因子を含む様々な因子に応じて変わる。
本発明の治療組成物は、任意の経路によって投与することができる。一部の実施形態では、本発明の治療組成物は、経口（ＰＯ）、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、動脈内、髄内、髄腔内、皮下（ＳＱ）、室内、経皮、皮膚間（ｉｎｔｅｒｄｅｒｍａｌ）、皮内、直腸（ＰＲ）、膣内、腹腔内（ＩＰ）、胃内（ＩＧ）、局所（例えば、散剤、軟膏、クリーム、ゲル、ローションおよび／または液滴によって）、粘膜、鼻腔内、頬側、経腸、硝子体、舌下；気管内滴注、気管支滴注および／もしくは吸入によって；経口スプレー、鼻腔用スプレーおよび／もしくはエアロゾルとして、ならびに／または門脈カテーテルを介するものを含めた様々な経路によって投与される。
現在のところ、肺および呼吸器系に治療剤を直接送達するために、経口または鼻腔用スプレーまたはエアロゾル経路（例えば、吸入による）が最も一般的に使用されている。しかし本発明は、薬物送達の科学の進歩が見込まれることを考慮して、任意の適切な経路によって本発明の医薬組成物を送達することを包含する。
一部の実施形態では、吸入またはエアロゾル送達のための調製物は、複数の粒子を含む。一部の実施形態では、このような調製物は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３ミクロンの平均粒径を有する。一部の実施形態では、吸入またはエアロゾル送達のための調製物は、乾燥粉末として製剤化される。一部の実施形態では、吸入またはエアロゾル送達のための調製物は、例えば湿潤剤を含ませることによって、湿潤粉末として製剤化される。一部の実施形態では、湿潤剤は、水、食塩水、または生理的ｐＨの他の液体からなる群から選択される。
一部の実施形態では、本発明の組成物は、鼻または口腔に液滴として投与される。一部の実施形態では、用量は、複数の液滴（例えば、１〜１００、１〜５０、１〜２０、１〜１０、１〜５など）を含むことができる。
一部の実施形態では、本発明の組成物は、定量投与量の組成物（例えば結合剤）を送達するデバイスを使用して投与される。
本明細書に記載の皮内治療組成物の送達に使用するのに適したデバイスとして、米国特許第４，８８６，４９９号、米国特許第５，１９０，５２１号、米国特許第５，３２８，４８３号、米国特許第５，５２７，２８８号、米国特許第４，２７０，５３７号、米国特許第５，０１５，２３５号、米国特許第５，１４１，４９６号、米国特許第５，４１７，６６２号に記載のものなどの短針デバイスが含まれる。皮内組成物は、参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ９９／３４８５０に記載のものなどの、皮膚への針の有効な貫通長さを制限するデバイス、およびその機能的等価物によって投与することもできる。液体ジェット注射器によって、または角質層に穿刺し、真皮に到達するジェットを生成する針によって、液体ワクチンを真皮に送達するジェット注射デバイスも適している。ジェット注射デバイスは、例えば米国特許第５，４８０，３８１号、米国特許第５，５９９，３０２号、米国特許第５，３３４，１４４号、米国特許第５，９９３，４１２号、米国特許第５，６４９，９１２号、米国特許第５，５６９，１８９号、米国特許第５，７０４，９１１号、米国特許第５，３８３，８５１号、米国特許第５，８９３，３９７号、米国特許第５，４６６，２２０号、米国特許第５，３３９，１６３号、米国特許第５，３１２，３３５号、米国特許第５，５０３，６２７号、米国特許第５，０６４，４１３号、米国特許第５，５２０，６３９号、米国特許第４，５９６，５５６号、米国特許第４，７９０，８２４号、米国特許第４，９４１，８８０号、米国特許第４，９４０，４６０号、ＷＯ９７／３７７０５およびＷＯ９７／１３５３７に記載されている。粉末形態のワクチンの、皮膚の外層を介する真皮への送達を加速させるために、圧縮ガスを使用する弾道粉末／粒子送達デバイスも適している。さらに、皮内投与の古典的なマントー法では、従来のシリンジを使用することができる。
医薬品の製剤化および製造における一般的考察は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９５年に見出すことができる。
本発明の治療組成物は、所望の成果を実現するのに適した任意の用量で投与することができる。一部の実施形態では、所望の成果は、感染症（例えば、インフルエンザ感染症）の１つまたは複数の症状の強度、重症度および／もしくは頻度の低減、ならびに／または発生の遅延である。
本発明による治療組成物は、単独で、または１つもしくは複数の他の治療剤と組み合わせて投与することができる。「と組み合わせて」とは、薬剤が、同時に投与され、および／または一緒に送達するために製剤化されなければならないことを意図するものではないが、これらの送達方法は、本発明の範囲に含まれる。組成物は、１つまたは複数の他の所望の治療法または医療手順と同時、その前または後に投与することができる。組み合わせて利用される治療活性のある薬剤は、単一組成物で一緒に投与することができ、または異なる組成物で別個に投与できることを理解されよう。一般に、各薬剤は、その薬剤について決定された用量および／またはタイムスケジュールで投与される。
一部の実施形態では、本発明の治療組成物は、含まれる薬剤の免疫原性を低減するように製剤化される。例えば、一部の実施形態では、含まれる活性剤は、その免疫原性をマスクする、ポリエチレングリコールおよび／またはカルボキシメチルセルロースなどの剤と会合（例えば結合）している。一部の実施形態では、含まれる活性剤は、免疫原性を低減する追加のグリコシル化を有する。
一部の実施形態では、本発明は、本発明の治療組成物を投与するためのキットを提供する。例えば、一部の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの用量の結合剤を含むキットを提供する。一部の実施形態では、本発明は、結合剤の初期単位用量およびその後の単位用量を含むキットを提供する。いくつかのこのような実施形態では、初期単位用量は、その後の単位用量よりも多く、またはこれらの２つの用量は等しい。
一部の実施形態では、本発明のキット（特に、本発明の組成物を投与するためのもの）は、送達デバイスの少なくとも１つの構成要素、例えば吸入器を含む。いくつかのこのような実施形態では、本発明は、送達デバイスの少なくとも１つの構成要素、例えば吸入器、およびある用量の結合剤を含むキットを提供する。
ワクチン組成物
一部の特定の実施形態では、本発明は、特にインフルエンザ感染症がヒト適合化Ｈ５ ＨＡによって媒介される場合、この感染症の予防に使用されるワクチン組成物である治療組成物を提供する。一部の実施形態では、このようなワクチン組成物は、１つもしくは複数の提供されるＨＡポリペプチドもしくはそれらの断片、それらをコードする核酸、それらを生成する発現系、および／またはそれらの相互作用について１つもしくは複数のＨＡ受容体と競合する競合剤を含む。一部の実施形態では、このようなワクチン組成物は、ワクチン組成物が投与される個体の免疫応答を促進または刺激するための１つまたは複数のアジュバントを含む。
一部の実施形態では、本発明は、ワクチン、およびヒト被験体へのこれらのワクチンの投与を提供する。ある特定の実施形態では、ワクチンは、以下：（１）不活化ウイルス、（２）弱毒化生インフルエンザウイルス、例えば複製欠損ウイルス、（３）本明細書に記載の本発明のＨＡポリペプチドもしくはそれらの断片、検出剤、結合剤、核酸、発現系、細胞または生物、の１つまたは複数を含む組成物である。
一部の実施形態では、本発明は、不活化インフルエンザワクチンを提供する。ある特定の実施形態では、不活化インフルエンザワクチンは、以下の抗原調製物の３つのタイプのうち１つを含む：不活化全ウイルス、精製されたウイルス粒子を洗浄剤もしくは脂質エンベロープを可溶化するための他の試薬で破壊した、サブビリオン（「スプリット」ワクチン）、または精製ＨＡポリペプチド（「サブユニット」ワクチン）。ある特定の実施形態では、ウイルスは、ホルムアルデヒド、ベータ−プロピオラクトン、エーテル、洗浄剤を含有するエーテル（例えばＴｗｅｅｎ−８０）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）およびＴｒｉｔｏｎ Ｎ１０１、デオキシコール酸ナトリウムおよびトリ（ｎ−ブチル）ホスフェートを用いる処理によって不活化することができる。不活化は、尿膜腔液（卵において生成されたウイルス由来）の清澄化の後または前に起こり得、ビリオンは、遠心分離によって単離され精製される（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら編、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｌｄｅｎ、ＭＡ、１９９８年）。ワクチンの効力を評価するために、一元放射免疫拡散（ＳＲＤ）試験を使用することができる（Ｓｃｈｉｌｄら、Ｂｕｌｌ． Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎ．、５２巻：４３〜５０頁＆２２３〜３１頁、１９７５年；Ｍｏｓｔｏｗら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２巻：５３１頁、１９７５年）。
本発明はまた、弱毒化生インフルエンザワクチンを提供し、弱毒化方法は、当技術分野で周知である。ある特定の実施形態では、弱毒化は、部位特異的変異誘発などの逆遺伝学を使用することによって実現される。
一部の実施形態では、ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルスは、卵、例えば発育鶏卵において増殖させられ、この場合、回収材料は尿膜腔液である。あるいはまたはさらに、インフルエンザウイルスは、ウイルスを増殖させるために組織培養を使用する任意の方法から誘導され得る。このウイルスの増殖に適した細胞基質として、例えばイヌ腎細胞、例えばＭＤＣＫまたはＭＤＣＫのクローン由来の細胞、ＭＤＣＫ様細胞、サル腎細胞、例えばベロ細胞を含めたＡＧＭＫ細胞、連続細胞株としての培養上皮細胞、２９３Ｔ細胞、ＢＫ−２１細胞、ＣＶ−１細胞、または商業的供給源（例えば、ＡＴＣＣ、メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）から容易に利用可能な、ワクチン目的のためのインフルエンザウイルス生成に適した任意の他の哺乳動物細胞型（上気道上皮細胞を含む）が含まれる。適切な細胞基質として、ＭＲＣ−５細胞などのヒト細胞も挙げられる。適切な細胞基質は、細胞株に限定されず、例えばニワトリ胚線維芽細胞などの初代細胞も含まれる。
一部の実施形態では、本発明のワクチンは、１つまたは複数のアジュバントをさらに含む。例えば、アルミニウム塩（Ｂａｙｌｏｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２０巻：Ｓ１８頁、２００２年）およびモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ；Ｒｉｂｉら（１９８６年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌ． Ｃｏｒｐ．、ＮＹ、４０７頁、１９８６年）は、ヒトワクチンにおけるアジュバントとして使用することができる。あるいはまたはさらに、新しい化合物は、現在、ＭＦ５９（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｉｒｏｎ．ｃｏｍ／ｉｎｖｅｓｔｏｒｓ／ｐｒｅｓｓｒｅｌｅａｓｅｓ／２００５／０５１０２８．ｈｔｍｌ）、ＣＰＧ７９０９（Ｃｏｏｐｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２２巻：３１３６頁、２００４年）、およびＱＳ２１などのサポニン（Ｇｈｏｃｈｉｋｙａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２４巻：２２７５頁、２００６年）などの、ヒトワクチンにおけるアジュバントとして試験されている。
さらに、ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（ＰＣＣＰ；Ｐａｙｎｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１６巻：９２頁、１９９８年）、インターフェロン−γ（Ｃａｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１０巻：２３８頁、１９９２年）、ブロックコポリマーＰ１２０５（ＣＲＬ１００５；Ｋａｔｚら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１８巻：２１７７頁、２０００年）、インターロイキン−２（ＩＬ−２；Ｍｂｗｕｉｋｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ、８巻：３４７頁、１９９０年）、およびポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ；Ｋｒｅｕｔｅｒら、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．、７０巻：３６７頁、１９８１年）などの、インフルエンザワクチンの免疫原性を増強するためのいくつかのアジュバントが、当技術分野で公知である。
一部の実施形態では、本発明のワクチン組成物は、アジュバントを含まない（例えば、提供される組成物は、アジュバントを本質的に含まない）。一部の実施形態では、本発明のワクチン組成物は、ミョウバンアジュバントを含まない（例えば、提供される組成物は、ミョウバンを本質的に含まない）。
一部の実施形態では、ワクチン組成物は、症状および／または曝露の前に投与に合わせて製剤化され、または別の方法で設計もしくは調製される。しかし多くの実施形態では、ワクチン組成物は、あるいはまたはさらに、曝露、感染および／または症状の発症の後に投与できることを、当業者は理解されよう。
組合せ治療
本明細書に記載の治療組成物は、単独で、または限定されるものではないが、ワクチンおよび／もしくは抗体を含む１つもしくは複数の他の治療剤と組み合わせて投与することができる。「と組み合わせて」とは、薬剤が、同時に投与され、または一緒に送達するために製剤化されなければならないことを意図するものではないが、これらの送達方法は、本発明の範囲に含まれる。一般に、各薬剤は、その薬剤について決定された用量およびタイムスケジュールで投与される。さらに本発明は、本発明の治療組成物のバイオアベイラビリティを改善し、それらの代謝を低減もしくは改変し、それらの排泄を阻害し、または体内でのそれらの分布を改変できる作用物質と組み合わせて、本発明の治療組成物を送達することを包含する。本発明の治療組成物は、それを必要としている任意の被験体（例えば、任意の動物）を処置するために使用することができるが、最も好ましくは、ヒトの処置に使用される。一部の実施形態では、本発明の治療組成物は、抗ウイルス剤（例えば、オセルタミビル［タミフル］、ザナミビル（Ｚａｎａｍａｖｉｒ）［リレンザ（Ｒｅｌｅｚａ）］など）および／またはシアリダーゼの１つまたは複数と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、本発明の治療組成物は、インフルエンザ感染症またはその症状を処置するために一般的に使用される、１つまたは複数の他の治療剤（例えば、疼痛緩和剤、うっ血除去薬（ｄｅｃｏｎｇｅｎｓｔａｎｔ）、咳止め薬、睡眠助剤など）と組み合わせて投与される。
使用
一部の実施形態では、本発明は、処置し、モニタリングし、またはさらにはトリインフルエンザＨＡ株の配列の進化を予測するための技術および方法論を提供する。
インフルエンザ感染症の処置
本発明は、インフルエンザ感染症を処置する方法を提供する。ある特定の実施形態では、このような方法は、１つもしくは複数の本発明のＨＡポリペプチドもしくはそれらの断片、それらをコードする核酸、それらを生成する発現系、および／またはそれらの相互作用について１つもしくは複数のＨＡ受容体と競合する競合剤を、それを必要としている被験体に投与するステップを含む。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドもしくはそれらの断片、それらをコードする核酸、それらを生成する発現系、および／またはそれらの相互作用について１つもしくは複数のＨＡ受容体と競合する競合剤は、ＨＡ（例えばインフルエンザウイルスの表面上に発現するＨＡ）が傘型トポロジーグリカン（例えば、ヒト上気道上皮組織、例えば気管および気管支に関連するグリカン）に結合する能力を阻害する。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドもしくはそれらの断片、それらをコードする核酸、それらを生成する発現系、および／またはそれらの相互作用について本発明の１つもしくは複数のＨＡ受容体と競合する競合剤は、以下の症状：発熱、咽頭痛、筋肉痛、重症頭痛、咳嗽、脱力感、全般的不快感、肺炎、悪心、および／または嘔吐、の１つまたは複数の処置に使用される。ある特定の実施形態では、これらの症状は、インフルエンザ感染症によって引き起こされる。
一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、インフルエンザ感染症に罹患しているまたは感受性である被験体に投与される。一部の実施形態では、被験体は、該被験体においてインフルエンザ感染症に一般に関連する１つまたは複数の症状を呈している場合、インフルエンザ感染症に罹患しているとみなされる。一部の実施形態では、被験体は、インフルエンザウイルスに曝露されたことが分かっている、または曝露されたと考えられる。一部の実施形態では、被験体は、該被験体がインフルエンザウイルスに曝露されたことが分かっている、または曝露されたと考えられる場合、インフルエンザ感染症に感受性であるとみなされる。一部の実施形態では、被験体は、該被験体がインフルエンザウイルスに感染したことが分かっている、もしくは感染したことが疑われる他の個体と接触した場合、および／または該被験体がインフルエンザ感染症が流行していることが公知であり、もしくは流行していると考えられる場所に存在している、もしくは存在していた場合、インフルエンザウイルスに曝露されたことが分かっている、または曝露されたと考えられる。
一部の実施形態では、本発明は、（１）インフルエンザ感染症の症状を呈している患者を提供するステップ、ならびに（２）治療量の１つもしくは複数のＨＡポリペプチドもしくはそれらの断片、それらをコードする核酸、それらを生成する発現系、および／またはそれらの相互作用について１つもしくは複数のＨＡ受容体と競合する競合剤を、該患者に投与するステップを含む、インフルエンザ感染症を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、（１）インフルエンザ感染症に罹患している患者を提供するステップ、ならびに（２）治療量の１つもしくは複数のＨＡポリペプチドもしくはそれらの断片、それらをコードする核酸、それらを生成する発現系、および／またはそれらの相互作用について１つもしくは複数のＨＡ受容体と競合する競合剤を、該患者に投与するステップを含む、インフルエンザ感染症を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、（１）インフルエンザ感染症に感受性である患者を提供するステップ、ならびに（２）治療量の１つもしくは複数のＨＡポリペプチドもしくはそれらの断片、それらをコードする核酸、それらを生成する発現系、および／またはそれらの相互作用について１つもしくは複数のＨＡ受容体と競合する競合剤を、該患者に投与するステップを含む、インフルエンザ感染症を処置する方法を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、（１）インフルエンザ感染症の症状を呈している患者、インフルエンザ感染症に罹患している患者および／またはインフルエンザ感染症に感受性である患者を提供するステップ、ならびに（２）ＨＡポリペプチド（例えば、インフルエンザウイルス粒子に関連するＨＡポリペプチド）と、ヒト上気道組織における傘型トポロジーグリカンとの結合に競合する物質を投与するステップを含む、インフルエンザ感染症を処置する方法を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、（１）インフルエンザ感染症に感受性である患者を提供するステップ、ならびに（２）治療量の１つもしくは複数のＨＡポリペプチドもしくはそれらの断片、それらをコードする核酸、それらを生成する発現系、および／またはそれらの相互作用について１つもしくは複数のＨＡ受容体と競合する競合剤を、該患者に投与するステップを含む、インフルエンザ感染症の発生を予防および／または遅延する方法を提供する。
監視／モニタリング
本発明より前に、Ｈ５ ＨＡの定量的グリカン−受容体結合親和性に対する変異の効果は、特徴付けられていなかった。本明細書では、とりわけ、受容体結合部位の分子環境の変化の文脈において、ヒトに適合したＨＡに特徴的な方式で、Ｈ５ ＨＡがその結合優先性をヒト受容体へ量的に切り替えるための要件を定義し、理解する方法が提示される。一部の実施形態では、構造分析および残基間相互作用ネットワーク分析の組合せは、パンデミックＨ１およびＨ２ ＨＡ株に類似の方式で、そのグリカン受容体の結合優先性をヒト受容体へ量的に切り替えることができるＨ５ ＨＡの受容体結合部位の変異を定義するために組み合わされる。
一部の実施形態では、本発明は、ヒト感染性および／またはヒト伝染性インフルエンザの集団をモニタリングする方法を提供する。一部の実施形態では、インフルエンザの株から、パンデミックのリスクを決定する方法が提供される。一部の実施形態では、インフルエンザをモニタリングする方法は、インフルエンザを含有することが疑われる供給源から試料を取得するステップ、その試料を、Ｈ５ ＨＡポリペプチドに特異的に結合する１種または複数の作用物質と接触させるステップ、作用物質と試料との結合を検出し、その結果試料中のＨ５ ＨＡの存在および／またはレベルを決定するステップを含む。一部の実施形態では、１種または複数の作用物質と試料との結合は、ヒト感染性Ｈ５ ＨＡの存在を示す。一部の実施形態では、１種または複数の作用物質と試料との結合は、ヒト感染性Ｈ５ ＨＡの非存在を示す。
一部の実施形態では、本発明による方法は、例えば環境供給源、ヒト患者供給源、または動物供給源を含めた様々な試料供給源のいずれかを分析するために使用することができる。一部の実施形態では、１つまたは複数の試料の分析は、少なくとも２回行われる。一部の実施形態では、各分析は、例えば被験体または集団を長期的にモニタリングできるように、一定期間を隔てて行われる。一部の実施形態では、一定期間は、１時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、または１年であり得る。
有用な作用物質および／または相互作用の検出および／または特徴付け
本発明は、有用な作用物質（例えば、インフルエンザ感染症の処置、予防および／または分析に有用な作用物質）および／または相互作用の同定および／または特徴付けのための様々な技術を提供する。
例えば、様々な結合研究および／または型式が、本明細書に記載の有用な作用物質の同定および／または特徴付けに有用である。一部の実施形態では、本発明は、ＨＡポリペプチドとＨＡ受容体の間の結合相互作用を分析するための系を利用する。いくつかのこのような実施形態では、分析方法は、１）ＨＡポリペプチドまたはそれらの結合成分の供給源を提供するステップ、２）ＨＡ受容体またはそれらの結合成分の供給源を提供するステップ、ならびに３）ＨＡポリペプチド（またはそれらの結合成分）とＨＡ受容体（またはそれらの結合成分）との結合が評価され得るのに十分な条件および時間で、提供した供給源を互いに接触させるステップを含む。このような手法は、例えば、目的のＨＡポリペプチド、特にバリアントＨＡポリペプチドを同定しもしくは特徴付け、ならびに／またはそれに結合し、および／またはＨＡ受容体とのその相互作用を阻害する作用物質を同定しおよび／もしくは特徴付けるために利用することができる。
一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドまたはそれらの結合成分の適切な供給源として、病理学的試料、例えば血液、血清／血漿、末梢血単核球／末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ／ＰＢＬ）、痰、尿、糞、喉スワブ、皮膚病変スワブ、脳脊髄液、子宮頸部スミア、膿汁試料、食品マトリックス、ならびに身体の様々な部分、例えば脳、脾臓および肝臓からの組織が含まれるが、これらに限定されない。あるいはまたはさらに、ＨＡポリペプチドを含有する試料の他の適切な供給源として、環境試料、例えば土壌、水および細菌叢が含まれるが、これらに限定されない。さらに他の試料として、例えば、研究者によって設計および／または調製された、操作されたＨＡポリペプチドの実験室試料が含まれる。列挙されていない他の試料を適用することもできる。一部の実施形態では、供給源（および／またはＨＡ受容体もしくはそれらの結合成分と接触した試料）は、インタクトなウイルスまたはウイルス様粒子を含み、一部の実施形態では、このような供給源および／または試料は、ＨＡポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＨＡポリペプチドは、三量体形態で利用される。
一部の実施形態では、ＨＡ受容体またはそれらの結合成分の適切な供給源として、組織試料が含まれ、一部の実施形態では、適切な供給源として、単離されたＨＡ受容体またはそれらの結合成分が含まれる。一部の実施形態では、適切な供給源として、例えばＨＡ受容体グリカンを含むグリカンアレイにおけるグリカンの集団が含まれる。一部の実施形態では、適切な供給源として、α２−３結合型および／またはα２−６結合型グリカンを含むグリカン集団が含まれる。一部の実施形態では、適切な供給源として、円錐型トポロジーグリカンおよび／または傘型トポロジーグリカンを含むグリカン集団が含まれる。一部の実施形態では、適切な供給源として、ヒト上気道ＨＡ受容体上で見出されるグリカンが含まれる。
本発明に従って、様々な結合相互作用が有用に研究され得ることを理解されよう。ＨＡポリペプチド−ＨＡ受容体の相互作用に加えて、様々な抗体−抗原の相互作用または他のリガンド−標的の相互作用が、本明細書に記載の通りに研究され得る。例えば、ＨＡポリペプチドと検出剤または競合剤との相互作用は、ＨＡ受容体（またはそれらの結合成分）の存在下または非存在下で分析することができる。
一部の実施形態では、結合研究で利用される一方または両方の相互作用成分は、接触ステップの前、最中、または後に、検出可能に標識される（直接的または間接的に）。いくつかのこのような実施形態では、少なくとも１つの相互作用成分は、例えばアレイ上に空間的に局在している。一例を挙げると、一部の実施形態では、検出可能に標識されたＨＡポリペプチドまたはそれらの結合成分は、例えば異なるグリカンが明確に局在しているアレイ上のグリカンの集団と接触する。いくつかのこのような実施形態では、結合は、局在化標識を検出および／または定量化することによって（例えば走査デバイスを使用して）評価することができる。
あるいはまたはさらに、相互作用成分または実体の間またはその中の結合は、例えば、熱量測定検出系、蛍光検出系もしくは放射性検出系、または他の標識法、または標識を必要としない他の方法を使用して測定することができる。一般に蛍光検出は、典型的に、蛍光分子で標識され、または標識されるようになる第１の相互作用パートナー（例えば、ＨＡポリペプチドもしくはそれらの結合成分、またはＨＡ受容体もしくはそれらの結合部分）を利用すること、および蛍光シグナルをモニタリングすることを含む。あるいはまたはさらに、相互作用成分または実体の一方または両方は、タグ（例えば、ビオチンまたはストレプトアビジン、抗原エピトープ、核酸など）でタグ付けすることができ、このタグは、これ自体、パートナー（例えば、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｇ）またはビオチン、抗体（ａｎｄｉｂｏｄｙ）、相補的（ｃｏｍｐｌｅｔｍｅｎｔａｒｙ）核酸）と検出可能に相互作用する。
一部の実施形態では、一方の相互作用成分または実体が蛍光標識され、他方が、結合が生じる場合／生じるときに蛍光をスケルチする（ｓｑｕｅｌｃｈ）文脈で提供される、蛍光消光法を利用することができる。
あるいはまたはさらに、結合研究では、放射性物質の存在下で増殖させた生細胞または組織試料を利用し、放射標識されたプローブを得ることができる。このような実施形態では、結合は、放射発光を測定することによって検出することができる。
このような方法は、相互作用成分または実体の間の結合の事実および／または結合の程度を決定するのに有用である。一部の実施形態では、このような方法はさらに、目的の相互作用を妨害し、または他の方法で変える作用物質を同定しおよび／または特徴付けるために使用することができる。
本明細書に記載の方法は、例えば、炭水化物と相互作用することができると考えられる分子が、実際に相互作用できるかどうかを同定し、または分子が、炭水化物と相互作用する能力を予想外に有しているかどうかを同定するのに、特に使用することができる。
本発明はまた、例えば、試験試料中の特定の作用物質を検出するために、グリカン集団を使用する方法を提供する。例えば、このような方法は、（１）グリカンの集団（例えば、グリカンアレイ）を、試験試料（例えば、ＨＡポリペプチドを含有することが公知のまたは含有すると考えられる試料）と接触させるステップ、および（２）試験試料中の任意の作用物質とグリカン集団との結合を検出するステップを含むことができる。
結合研究は、本発明に従って、例えば結合剤とグリカンの相互作用の動態を決定するために利用することができる。例えば、相互作用の動態を決定するための本発明の方法は、（１）グリカン集団を、試験される作用物質を含む試料と接触させるステップ、および（２）結合剤とグリカン（複数可）の相互作用の動態を測定するステップを含むことができる。
結合実体または成分（例えば、結合剤および例えばアレイ上の集団のグリカン）の間の相互作用の動態は、上で詳説した通り、例えば比色シグナルまたは蛍光シグナルのリアルタイム変化によって測定することができる。このような方法は、例えば、特定の結合剤が、特定の炭水化物と相互作用する異なる結合剤よりも強い程度の結合により、その特定の炭水化物と相互作用することができるかどうかを決定するのに、特に使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の結合研究、特にＨＡポリペプチドまたはそれらの結合成分と、ＨＡ受容体またはそれらの結合成分との間の相互作用を特徴付ける結合研究は、一方または両方の結合成分または実体の様々な濃度範囲にわたって実施される。
一部の実施形態では、結合（および／または感染および／または伝染）研究は、動物宿主（ｈｏｓｅ）において、または動物宿主を利用して実施される。本明細書で使用される場合、「動物宿主」には、インフルエンザの調査に適した任意の動物モデルが含まれる。例えば、本発明に適した動物宿主は、霊長類、フェレット、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、げっ歯類、例えばマウス、ハムスター、ウサギおよびラットを含めた任意の哺乳動物宿主であり得る。ある特定の実施形態では、本発明で使用される動物宿主は、フェレットである。特に、一部の実施形態では、動物宿主は、本発明の結合剤（必要に応じて本発明の組成物における）の投与の前に、ウイルスの曝露または感染に対してナイーブである。一部の実施形態では、動物宿主は、本発明の結合剤の投与前または投与と同時に、ウイルスを接種され、ウイルスに感染し、または他の方法でウイルスに曝露される。本発明の実施において使用される動物宿主は、当技術分野で公知の任意の方法によって、ウイルスを接種され、ウイルスに感染し、または他の方法でウイルスに曝露され得る。一部の実施形態では、動物宿主は、鼻腔内でウイルスを接種され、ウイルスに感染し、またはウイルスに曝露され得る。
一部の実施形態では、適切な動物宿主は、ヒト呼吸器に見出される分布と類似の傘型トポロジーグリカン対円錐型トポロジーグリカンおよび／またはα２−６グリカン対α２−３グリカンの分布を有することができる。例えば、動物宿主としてのフェレットは、ヒトにおいてインフルエンザウイルスによって引き起こされる疾患モデルとして使用される場合、マウスよりも代表的であり得ると想定される（Ｔｕｍｐｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７年）３１５巻；６５５〜６５９頁）。いかなる理論にも拘泥するものではないが、本発明は、フェレットが、マウスよりも、ヒト呼吸器におけるグリカンの分布とより一層類似した、呼吸器におけるグリカンの分布を有することができるという考えを包含する。
ナイーブ動物および／または接種された動物は、様々な研究のいずれかのために使用することができる。例えば、このような動物モデルは、当技術分野で公知のウイルス伝染研究のために使用することができる。ウイルス伝染研究におけるフェレットの使用は、ヒトにおけるウイルス伝染に関する信頼できる予測因子として機能を果たし得ると想定される。例えば、接種された動物（例えばフェレット）からナイーブ動物へのウイルス性インフルエンザの空気伝染は、当技術分野で公知である（Ｔｕｍｐｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７年）３１５巻；６５５〜６５９頁）。ウイルス伝染研究は、本発明の結合剤であるポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド）を試験するために使用することができる。例えば、本発明の結合剤は、動物宿主におけるウイルス結合および／または感染性を遮断することにおける前記結合剤の有効性を決定するために、ウイルス伝染研究の前、最中または後に適切な動物宿主に投与することができる。動物宿主におけるウイルス伝染研究から集めた情報を使用して、ヒト宿主におけるウイルス結合および／または感染性を遮断することにおける結合剤の有効性を予測することができる。
ポリペプチドの生成
提供されるポリペプチド（例えば、ＨＡポリペプチド、抗体などおよび／またはそれらの断片、例えば特徴的な断片）は、任意の利用可能な手段によって生成することができる。
ポリペプチドは、例えば、目的のポリペプチドをコードする核酸を発現するように操作された宿主細胞系を利用することによって生成することができる。一部の実施形態では、このようなコードする核酸は、宿主細胞系に対して異種であり、ヒトの手作業によって系に導入される。あるいはまたはさらに、宿主細胞系は、特定の（例えば高）レベルおよび／または特定の時間にコードするポリペプチドを発現するように操作することができる。
当業者は、本明細書に記載のポリペプチドを生成するために適切に使用できる多種多様な宿主細胞系を認識されよう。例えば、ポリペプチドは、微生物細胞系、哺乳動物細胞系、トリ細胞系または植物細胞系において生成され得る。一部の実施形態では、真核細胞系が利用される。一部の実施形態では、利用される細胞系は、インタクトな組織および／または生物であり、またはそれらを含む。わずかであるが例を挙げると、一部の実施形態では、提供されるポリペプチドは、卵、バキュロウイルス、植物、酵母、メイディン−ダービーイヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）、またはベロ（アフリカミドリザルの腎臓）細胞系において発現される。
あるいはまたはさらに、提供されるポリペプチドは、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写系および／もしくは翻訳系を利用することで、および／または化学合成を介して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成することができる。
一部の実施形態では、提供されるＨＡポリペプチド（またはある特定のそれらの断片）は、インタクトなウイルスまたはウイルス様粒子の文脈で生成され得る。
一部の実施形態では、提供されるＨＡポリペプチド（またはある特定のそれらの断片）は、インフルエンザウイルスから単離および／または精製され得る。例えば、ウイルスは、卵、例えば発育鶏卵において増殖させられ得、この場合、回収材料は、典型的に尿膜腔液である。あるいはまたはさらに、ウイルスは、組織培養系で増殖させることができる。ウイルスの増殖に適した細胞基質として、例えばイヌ腎細胞、例えばＭＤＣＫまたはＭＤＣＫのクローン由来の細胞、ＭＤＣＫ様細胞、サル腎細胞、例えばベロ細胞を含めたＡＧＭＫ細胞、連続細胞株としての培養上皮細胞、２９３Ｔ細胞、ＢＫ−２１細胞、ＣＶ−１細胞、または商業的供給源（例えば、ＡＴＣＣ、メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）から容易に利用可能な、ワクチン目的のためのインフルエンザウイルス生成に適した任意の他の哺乳動物細胞型が含まれる。適切な細胞基質として、ＭＲＣ−５細胞などのヒト細胞も挙げられる。適切な細胞基質は、細胞株に限定されず、例えばニワトリ胚線維芽細胞などの初代細胞も含まれる。
また、本明細書に記載のポリペプチド、特にＨＡポリペプチドは、本明細書に記載の所望の結合の特徴および／または活性の特徴を示すポリペプチドを容易にスクリーニングし、かつ／または選択できる条件下で、ポリペプチド（単独で、またはウイルス粒子もしくはウイルスの一部として含む複合体の一部としてのいずれか）を生成する培養細胞または生物によって、作製、同定、単離および／または生成され得ることを、当業者は理解されよう。
（実施例１）
新規Ｈ５ ＨＡバリアントの設計および特徴付け
導入
インフルエンザＡウイルスは、季節性大流行の観点、およびまたヒト宿主に適応するトリウイルス（ヒトにとって抗原的に新規）の能力の観点の両方から、世界的な健康に対して重大な脅威をもたらす。トリ、ブタおよびヒトのウイルス由来のインフルエンザ遺伝子セグメントの多重再集合（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）からの抗原的に新規な２００９ Ｈ１Ｎ１株の突然の出現は、世界経済に実質的に影響を与え、将来のこのような自然発生的パンデミック大流行に対する適切な監視がより準備されることの欠くことのできない必要性を強調した。Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２などのヒトに適応したウイルスの特徴的特性は、トリ受容体への低い〜最小の結合と比較して、ヒト受容体へのウイルスＨＡの量的に高い結合親和性である。
ウイルス表面糖タンパク質（ＨＡ）およびポリメラーゼ（ＰＢ２）におけるアミノ酸変異は、トリＨ１Ｎ１インフルエンザ分離株に空気伝染を付与することができた（Ｖａｎ Ｈｏｅｖｅｎら、２００９年 ＰＮＡＳ、１０６巻：３３６６頁）。ヒトに感染することが公知のトリサブタイプの中で、Ｈ５Ｎ１は、最も高い死亡率を有する。したがって、Ｈ５Ｎ１ウイルスの進化に対する改善されたモニタリングのための新たな戦略を実行し、ヒト宿主に適応するその潜在力を追跡することは、重要である。
高度に病原性のＨ５Ｎ１インフルエンザＡウイルスサブタイプは、２００３年以来、高い死亡率（約６０％）でヒトにおいて数回の局地的大流行を既にもたらした点を考慮すると、世界的な健康の懸念をもたらす（Ｎｅｕｍａｎｎら、２０１０年 Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、２０巻：５１頁；Ｇｕａｎら、２００９年 Ｒｅｖ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ、２８巻：３９頁）。しかし、Ｈ５Ｎ１サブタイプは、呼吸の飛沫を介した持続性のヒトからヒトへの伝染（または空気伝染）を確立するようになるには、ヒト宿主にいまだ適応していない。
トリサブタイプ由来のＨＡは、典型的には、α２→３シアル酸付加グリカン（またはトリ受容体）に結合する（Ｇｅら、２０１１年 Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３７巻：１５７頁）。Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２などのヒトに適応したサブタイプの著しい特徴は、トリ受容体を超えた相対的に高いヒト受容体への結合親和性によって定義される、α２→６シアル酸付加グリカン受容体（またはヒト受容体）へのその結合優先性における量的切り替えである。この量的切り替えは、フェレットにおけるパンデミックＨ１Ｎ１ウイルスおよびＨ２Ｎ２ウイルスの呼吸飛沫による伝染性と相関することが示されている（Ｔｕｍｐｅｙら、２００７年 Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１５巻：６５５頁；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら、２００８年 ＰＮＡＳ、１０５巻：２８００頁；Ｐａｐｐａｓら、２０１０年 ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、５巻：ｅ１１１５８頁；Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎら、２０１０年 ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、５巻：ｅ１３７６８頁）。したがって、トリに適応したＨ５Ｎ１サブタイプのヒトへの適応の必要な決定因子は、その結合優先性をヒト受容体に量的に切り替える変異をそのＨＡが獲得することである（Ｇｅら、２０１１年 Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３７巻：１５７頁；Ｓｈｒｉｖｅｒら、２００９年 Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．、１６巻：８０３頁）。Ｈ５ ＨＡのグリカン受容体結合特異性を切り替える変異を同定することは、いくつかの以前の研究の焦点となってきた（Ｇａｍｂａｒｙａｎら、２００６年 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３４４巻：４３２頁；Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００６年 Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１２巻：４０４頁；Ｙａｍａｄａら、２００６年 Ｎａｔｕｒｅ、４４４巻：３７８頁；Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋａｒａｎら、２００８年 Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２６巻：１０７頁；Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００８年 Ｊ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３８１巻：１３８２頁；Ｗａｎｇら、２００９年 ＰＮＡＳ、１０６巻：１８１３７頁；Ｗａｔａｎａｂｅら、２０１２年 Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０巻：１１頁）。これらの研究のいくつかは、受容体結合部位（ＲＢＳ）に天然のバリエーションを有するＨ５ ＨＡのグリカン受容体結合の分析を含む（Ｙａｍａｄａら、２００６年 Ｎａｔｕｒｅ、４４４巻：３７８頁）。他の研究は、Ｈ２／Ｈ３ ＨＡ（Ｑ２２６ＬおよびＧ２２８ＳまたはＬＳ）および／またはＨ１ ＨＡ（Ｅ１９０Ｄ、Ｇ２２５ＤまたはＤＤ）のヒトへの適応のための重要な変化のいずれかを含むように、Ｈ５ ＨＡを変異させた。操作されたものであれ天然の供給源において見出されるものであれ、いずれのバリアントＨ５ ＨＡも、ヒトに適応した「パンデミック」株ＨＡに特徴的な様式で、ヒト受容体への結合における量的切り替えを示したものはない（例えば、１９１８ Ｈ１Ｎ１、１９５８ Ｈ２Ｎ２および２００９ Ｈ１Ｎ１、図１を参照のこと）。
最近、Ｉｍａｉら（Ｉｍａｉら、２０１２年 Ｎａｔｕｒｅ、印刷中）およびＨｅｒｆｓｔら（Ｈｅｒｆｓｔら、２０１２年 Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３６巻：１５３４頁）による２つの研究が、それぞれヒトＨ５Ｎ１分離株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｖｉｅｔ０４）およびＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｉｎｄ０５）由来のＨＡにおける特定のセットの変異が、受容体優先性を切り替え、これらのバリアントＨ５ ＨＡを有するウイルスに、フェレットにおける呼吸飛沫によるウイルス伝染を付与することを実証した。遺伝的背景における差異および選択圧戦略が、フェレットにおける空気伝染と関連したＶｉｅｔ０４ ＨＡおよびＩｎｄ０５ ＨＡにおける別個のセットのアミノ酸変化を生じることが、これらの研究から明らかである。これらの研究に基づいて、Ｒｕｓｓｅｌｌらによる別の研究（Ｒｕｓｓｅｌｌら、２０１２年 Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３６巻：１５４１頁）は、その系統発生学的分岐に関して、Ｖｉｅｔ０４およびＩｎｄ０５について報告された特定のアミノ酸変化を獲得する潜在性をＨ５Ｎ１株について評価するために、ＨＡおよびポリメラーゼＰＢ２のヌクレオチド配列の数学的モデルおよび統計的分析を使用した。配列分析に基づいて、この研究は、現在のＨ５Ｎ１ ＨＡ（例えば、クレード２．２．１）において明確な配列の分岐が存在すること、ならびにＶｉｅｔ０４ ＨＡおよびＩｎｄ０５ ＨＡにおいて同定された遺伝的変化が、呼吸飛沫による伝染をもたらす唯一のものではない可能性があることを指摘している。
特に、Ｈ５ ＨＡ配列の進化は、その結合優先性をヒト受容体に量的に切り替えるために必要なそのＲＢＳにおけるアミノ酸変化についての欠くことのできない密接な関係を有する。この文脈では、重要な答えの出ていない質問は、現在のＨ５ ＨＡが、Ｖｉｅｔ０４およびＩｎｄ０５などの原型株からの配列分岐に起因するそのＲＢＳにおける他の分子変化の文脈において、ヒト受容体結合に如何にして量的に切り替わるかである（Ｗａｔａｎａｂｅら、２０１２年 Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０巻：１１頁；Ｗａｔａｎａｂｅら、２０１１年 ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、７巻：ｅ１００２０６８頁）。この質問は、２００６年以降、単離されたＨ５ ＨＡが、上で議論した研究の多くの焦点であった原型株Ｖｉｅｔ０４およびＩｎｄ０５から相当に分岐したという観察を考慮すると、特に重要である。
Ｈ５ ＨＡの配列進化およびその天然のトリ受容体の構造トポロジーを考慮することによって、Ｈ５ ＨＡのＲＢＳを体系的に調査するための新規フレームワークが、本明細書に記載される。以前、本発明者らは、トリ受容体およびヒト受容体の３次元構造トポロジーに基づいて、これらの受容体へのＨＡの結合を区別するためのフレームワークを開発した。トリ受容体は、ＨＡに結合すると、円錐型と類似するコンフォメーション空間の実例となった（したがって、用語円錐型様トポロジーを、この受容体を記述するために使用した）。円錐型様トポロジーをとるトリ受容体とＨ５ ＨＡ（Ｖｉｅｔ０４結晶構造を使用する（Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００６年 Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１２巻：４０４頁；Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００８年、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３８１巻：１３８２頁）との接触の大部分には、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌ−モチーフが関与する。この相互作用に関与するＨ５ ＨＡ ＲＢＳにおけるアミノ酸は、１３０−ループ中の残基Ｓｅｒ−１３６、１５０−ループ中のＴｒｐ−１５３およびＩｌｅ−１５５、２２０−ループ中のＬｙｓ−２２２、Ｇｌｎ−２２６を含むＲＢＳの基部中に優勢に存在し、ＲＢＳの上部、１９０−ヘリックス中のＧｌｕ−１９０、Ｌｙｓ−１９３およびＬｅｕ−１９４からの特異的なさらなる接触が存在する（図２）。
Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２およびパンデミックＨ２Ｎ２サブタイプ由来の種々の季節性株およびパンデミック株を含む、ある特定のヒトに適応したＨａが公知である。Ｈ５ ＨＡとＨ２ ＨＡとの系統発生学的な「近さ」（図３）に基づいて、ヒト受容体に結合したヒトに適応したＨ２Ｎ２ ＨＡ（Ａ／Ａｌｂａｎｙ／６／５８またはＡｌｂ５８）を選択して、トリ受容体に結合したＨ５ ＨＡの構造分析と対比させた（Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００６年 Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１２巻：４０４頁；Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００８年、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３８１巻：１３８２頁）。Ａｌｂ５８株を、原型パンデミック株であること、ならびにその量的グリカン受容体結合および表現型特性（例えば、空気伝染性）が研究されていることを考慮して、代表的Ｈ２Ｎ２株として選択した。Ａｌｂ５８ ＨＡのｘ線結晶構造は利用可能でないので、このＨＡについての相同性ベースのモデルを、Ａｌｂ５８ ＨＡに対する高い配列同一性を有する別のヒトに適応したＨ２ ＨＡ（Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７）（ヒト受容体と共結晶化した）の鋳型結晶構造を使用して構築した。
結果
ヒト受容体が、完全に閉じた状態から完全に開いた状態の傘に似たより大きいコンフォメーション空間にわたってＨＡ試料に結合することが観察された。したがって、用語、傘型様トポロジーは、この受容体を定義するために使用され得る。ヒト受容体の傘型様トポロジー中には２つの領域が存在する：Ｎｅｕ５Ａｃα２→６Ｇａｌβ１→モチーフから構成されるベース領域、およびこのモチーフを超えた糖残基を含む伸長領域（典型的にはＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→）。これら２つの領域は、Ｈ２ ＨＡ ＲＢＳ中のより広い範囲の相互作用性アミノ酸に及ぶ。円錐型様トポロジーにあるトリ受容体に結合したＨ５ ＨＡと傘型様トポロジーにあるヒト受容体に結合したＨ２ ＨＡとの比較は、少なくとも４つの重要な差異を示した（図２）。第１に、Ｈ２ ＨＡの１３０ループの組成は、１３０位（Ｈ３番号付け）において欠失を含むので、Ｈ５ ＨＡとは異なる。第２に、Ｎｅｕ５Ａｃα２→６Ｇａｌβ１→モチーフとの相互作用において役割を果たすＲＢＳの「基部」中のアミノ酸（例えば、１３６位〜１３８位、２１９位〜２２８位にあるアミノ酸）が異なっている。第３に、Ｈ２ ＨＡ中の、ヒト受容体の伸長領域と相互作用する「１９０−ヘリックス」（残基１８８〜１９６）を主に含むＲＢＳの「上部」が異なっている（具体的には、１８８位、１８９位、１９２位および１９３位において）。第４に、１５８位は、Ｈ５ ＨＡではグリコシル化されるが、Ｈ２ ＨＡではグリコシル化されない。この部位におけるグリコシル化は、ヒト受容体の伸長領域を潜在的に妨害し得る（Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００８年、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３８１巻：１３８２頁を参照のこと）。
この実施例では、これら４つの主要な差異を、Ｈ２ ＨＡおよびＨ５ ＨＡのＲＢＳを区別する分子特徴へとカテゴリー化した。特定の理論に束縛されることは望まないが、これら４つの特徴とマッチさせることによってＨ５ ＨＡのＲＢＳをＨ２ ＨＡのＲＢＳに変換するアミノ酸変化を起こすことにより、Ｈ５ ＨＡのヒト受容体への結合における量的切り替えを生じることが可能である。
ＲＢＳ中の他の残基の文脈における設計されたアミノ酸変化の影響を理解するために、測定基準（ＲＢＳネットワークまたはＲＢＳＮ）を開発して、適切なトポロジーにあるグリカン受容体と接触するＲＢＳ中の欠くことのできない残基とその近接した空間的環境にある他の残基との間の相互作用のネットワークを捕捉した。欠くことのできないＲＢＳ残基とその環境との間の相互作用的関係を、２次元のオープンな接続性のネットワークダイアグラム（ＲＢＳＮダイアグラム）を使用して表す。ＲＢＳ中のアミノ酸の相互作用ネットワークの程度を、０（いずれのネットワークも存在しない）から１（最もネットワーク化されている）まで変動する正規化されたネットワークスコア（ＲＢＳＮスコア）を使用して定量する。ＲＢＳ内のアミノ酸のネットワークが高度になるほど、変異することが構造的により制限される。この実施例の目的のために、ＲＢＳ内のこのネットワーク関係は、以下に例示されるように４つの特徴とマッチさせることによって、Ｈ５ ＨＡ ＲＢＳをＨ２ ＨＡ ＲＢＳに似るように変換するプロセスを導いた。
特徴１とマッチさせることは、具体的には欠失を導入することによって、１３０ループに変化を起こすことを含んだ。１３０ループ中の欠失は、１３１位、１３３位および１５５位が関わるＲＢＳＮダイアグラムに影響を与える。１３１位および１３３位における残基は、Ｈ５ ＨＡにおいて低いＲＢＳＮスコア（＜０．０４）を有し、したがって、Ｈ２ ＨＡ中のこれらの位置が関わるＲＢＳＮダイアグラムとマッチするように容易に変異され得た。特徴２とマッチさせることは、ＲＢＳの基部における１３０−ループおよび２２０−ループ中の残基位置の組合せに対する変化を含んだ。Ｈ５ ＨＡでは、Ｇｌｎ−２２６は、トリ受容体のＮｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌ−モチーフとの接触において欠くことのできない役割を果たし、Ｓｅｒ−１３７およびＧｌｎ−２２６は、残基間相互作用ネットワークに関与する。
逆に、Ｈ２ ＨＡでは、対応するＬｅｕ−２２６およびＡｒｇ−１３７は関連しない。Ｈ２ ＨＡ中のＡｒｇ−１３７およびＳｅｒ−２２８は、シアル酸との接触のさらなる安定化を提供する。したがって、本発明によれば、特徴２とマッチさせるための１つの方法は、Ｈ５ ＨＡ中の１３７位および２２６位における残基を、Ｈ２ ＨＡのＲＢＳＮダイアグラムとマッチするように変化させることを含む。１３７における残基位置は、Ｈ２ ＨＡおよびＨ５ ＨＡにおけるその低いＲＢＳＮスコア（約０．０１）を考慮すると、容易に変異可能であった。しかし、２２６における残基は、Ｈ２ ＨＡおよびＨ５ ＨＡにおいてかなり高いＲＢＳＮスコア（＞０．２５）を有する。したがって、この残基に変化を起こすことは、他の変化を起こすこと：Ｓｅｒ−１３７→Ａｒｇ変異に加えて、Ｇｌｙ−２２８→Ｓｅｒに特異的に変化させること、もまた含んだ。Ｇｌｎ−２２６→Ｌｅｕ変異は、接触において、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌ−モチーフからＮｅｕ５Ａｃα２→６Ｇａｌ−モチーフへの切り替えを支配するが、Ｓｅｒ−１３７→ＡｒｇおよびＧｌｙ−２２８→Ｓｅｒ変異は、アミノ酸間ネットワーク化の観点からＨ５ ＲＢＳの基部における１３０−ループおよび２２０−ループへのさらなる安定化、ならびにグリカン受容体との改善された接触を提供する（（Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００６年 Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１２巻：４０４頁；Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００８年、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３８１巻：１３８２頁）。この安定化は、Ａｓｎ−２２４のＬｙｓまたはＡｒｇへの変異（Ａｒｇ−２２４は、パンデミック１９１８ Ｈ１Ｎ１ ＨＡにおいて観察される）によっても達成され得るが、これは、この変異が、Ａｓｐ−９６、Ｌｅｕ−９７およびＰｒｏ−９９との、そのアミノ酸間相互作用ネットワークを増強するからである（図２）。したがって、特徴２は、２２４位における変異を組み合わせることによってマッチさせることもできる。Ｈ５ ＨＡ中の２２１位における残基のＲＢＳＮダイアグラムは、Ｈ２ ＨＡ中のものと同一であるが、この位置は、Ｈ５ ＨＡではＳｅｒを有し、Ｈ２ ＨＡではＰｒｏを有する（図２）。Ｈ２ ＨＡ中の、ヒト受容体と接触することにおいて重要な役割を果たす隣接Ｌｙｓ−２２２残基のコンフォメーションおよび側鎖配向を、Ｐｒｏが支配している可能性がある。したがって、Ｈ５ ＨＡ中のＳｅｒ−２２１→Ｐｒｏの変化は、特徴２のより包括的なマッチングを可能にする。
Ｈ２ ＨＡのＲＢＳとＨ５ ＨＡのＲＢＳとを区別した第３の特徴は、１８８位、１８９位、１９２位および１９３位における残基、ならびにその相互作用ネットワークを示すＲＢＳＮダイアグラムに関して、多くの差異を有した（図２）。Ｈ５ ＨＡ中の残基Ａｌａ−１８８、Ａｌａ−１８９およびＴｈｒ−１９２は、ＲＢＳ中の他の残基といずれの残基間接触も有さない。他方で、残基Ｇｌｕ−１８８、Ｔｈｒ−１８９およびＡｒｇ−１９２は、複数の相互作用ネットワークに関与する。したがって、特徴３とマッチさせることは、Ｈ２ ＨＡ中の対応する相互作用ネットワークとマッチさせるために、Ｈ５ ＨＡ中の１８８位、１８９位、１９２位および１９３位においてアミノ変化を起こすことを含んだ。これら全ての残基位置のＲＢＳＮスコアがＨ５ ＨＡにおいて低い（＜０．１）ことを考慮すると、これらは容易に変異可能である。最後に、特徴４とマッチさせることは、１５８位におけるグリコシル化シークオンの除去を含んだ。これは、Ａｓｎ−１５８をＡｓｐなどの残基に変異させることによって、またはＴｈｒ−１６０をＡｌａに変異させることによって、達成され得た。これらの分子特徴をガイドフレームワークとして使用して、この実施例は、ヒト受容体への、Ｈ５ ＨＡの結合における量的切り替えを初めて実証する。
Ｈ２ ＨＡ ＲＢＳからＨ５ ＨＡ ＲＢＳを区別する特徴に関してＨ５ ＨＡ ＲＢＳを記載してきたが、Ｈ５ ＨＡ配列空間全体（ＧＩＳＡＩＤ ＥｐｉＦｌｕデータベース（ｐｌａｔｆｏｒｍ．ｇｉｓａｉｄ．ｏｒｇ／ｅｐｉ３／）からの２，９５９の全長非冗長Ｈ５配列）を、以前の研究に記載された特定の重要なヒトへの適応性変異について調査する代わりに、これらの特徴について調査した（Ｓｔｅｖｅｎｓら、２００８年、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３８１巻：１３８２頁；Ｒｕｓｓｅｌｌら、２０１２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３６巻：１５４１頁；Ｎｅｕｍａｎｎら、２０１２年、ＰＬｏＳ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、８巻：ｅ１００２９３２頁；Ｍａｉｎｅｓら、２０１１年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、４１３巻：１３９頁）。
この分析の結果（図４）は、Ｈ５ ＨＡの天然の進化に関してこれらの特徴を追跡することを可能にし、以下の４つの重要な観察を提供した：１）最近のトリ分離株およびヒト分離株（２００７年以降）の多くに由来するＨ５ ＨＡは、１３０−ループ中の欠失を既に獲得しており、したがって、特徴１とマッチさせることにより近い、２）これらの株の一部は、Ａｓｎ−２２４→ＬｙｓおよびＳｅｒ２２１→Ｐｒｏ変異などの２２０ループ中の変化もまた獲得しており、したがって、特徴２とマッチさせることにより近い、３）重要なアミノ酸変化が、１８８位、１９２位および１９３位において特異的に「１９０−ヘリックス」において既に観察されており、それにより特徴３とマッチすることにより近づけた、ならびに４）１５８位におけるグリコシル化の喪失（特徴４）もまた、１９５９年以来、多くのＨ５ ＨＡ配列において観察されている。ＨＡ ＲＢＳの重要な構造的特徴に関して、同じＨＡにおけるグリコシル化の同時発生的喪失を伴う１３０ループ中の欠失（特徴１および４）は、２００７年以降のクレード２配列のさらなる多様化を介したＨ５ ＨＡの進化において観察された最も必要不可欠な変化であった（図４Ａ）。２００７年の最初の出現以来、これらの重要な特徴を有する分離株の百分率において劇的な増加があった。これらの分離株の配列の系統発生学的分析により、これらがクレード２．２．１に属することが示された。比較的低い百分率のＨ５Ｎ１分離株が、Ｈ２ ＲＢＳの特徴３とマッチすることにより近づく「１９０−ヘリックス」中のアミノ酸変化を獲得しており（図４Ｂ）、これらの分離株は、クレード７に属する（Ｄａｖｉｓら、２０１０年、Ａｖｉａｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ、５４巻：３０７頁）。注目に値することに、本発明者らは、グリコシル化の喪失は、１３０−ループ残基の欠失と相伴うが、逆はそうではないことを観察した。この知見は、特定の現在のＨ５ ＨＡ株が、より古いヒト分離株（例えばＶｉｅｔ０４）からかなり分岐しているだけでなく、パンデミックＨ２ ＨＡ ＲＢＳとマッチさせるのに必要な重要な分子特徴もまた獲得していることを示唆している。
Ｈ５ ＨＡ配列の天然の進化にわたって分子特徴を追跡することに基づいて、異なるクレードおよび期間由来のＨＡを選択して、本発明者らのアプローチを検証した。Ｖｉｅｔ０４ ＨＡは、特徴とマッチさせることに関して最も遠く、したがって、切り替えのために特徴をマッチさせるために最も多くの変異を必要とすると予測された。他のＨＡは、特徴をＨ２ ＨＡ ＲＢＳとマッチさせることに関してかなり近いクレード２．２．１またはクレード７のいずれかから選択し、したがって、ヒト受容体結合へと切り替えるためにより少ない変異を必要とすると予測された。これらのＨａの野生型形態および変異体形態を、体系的に生成し、組換え発現させ、そのグリカン結合特性を、用量依存的直接的結合アッセイ（２５）において評価した。結果を表２にまとめる。
Figure 2016509609
この実施例に記載されるモデルによって予測されるように、特徴１、２および３を包括的にマッチさせるために起こした１３のアミノ酸変化（残基間相互作用ネットワークの取り込みを含む）は、Ｖｉｅｔ０４（表２中のＶ２．３）に対して起こした場合、野生型と比較して、ヒト受容体へのその結合を量的に切り替えた（図５）。以前に記載されたように（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら、２００８年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、１０５巻：２８００頁）、見かけの結合定数Ｋｄ’を使用して定量したヒト受容体に対するＶ２．３の結合親和性（Ｋｄ’約３ｐＭ）は、１９１８ Ｈ１Ｎ１ ＨＡについて計算されたものと同じ範囲内であった（Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら、２００８年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、１０５巻：２８００頁）。１つまたは２つの特徴、例えば特徴２（Ｇｌｎ−２２６→Ｌｅｕ／Ｇｌｙ−２２８→Ｓｅｒ）および特徴４（Ｔｈｒ−１６０→Ａｌａ）と部分的にマッチさせること（表２中のＶ２．１）は、ヒト受容体への実質的に増加した結合を示したが、この変異体は、量的切り替えに特徴的ではない、トリ受容体への高親和性の結合もまた維持した。特徴２とマッチさせることもまた、特徴４（Ｔｈｒ−１６０→Ａｌａ（表２中のＶ２．２）とマッチさせることに関して、Ｇｌｎ−２２６→Ｌｅｕ／Ａｓｎ−２２４→Ｌｙｓ変異を導入することによって、残基間接触および２２０−ループが関与するＲＢＳ−グリカン接触を改善するための代替的な戦略を介して調査した。この変異体は、非常に低いグリカン−受容体結合を示し、したがって、量的切り替えとしての適格性のために結合親和性を決定することは不可能であった。したがって、この実施例では、およびＶｉｅｔ０４などのクレード１ ＨＡの場合、最少で３つの特徴においてマッチさせることが、量的切り替えに必要とされ得る。
クレード２．２．１のＨＡの中で、最近のヒト分離株Ａ／Ｅｇｙｐｔ／Ｎ０３４５０／２００９（またはＥｇｙ０９）は、クレード２．２．１コンセンサス配列とのその高い配列類似性に起因して、２．２．１中の最良の代表的株であることが見出されたので、それをさらなる研究のために選択した。Ｅｇｙ０９ ＨＡは既に、１３０−ループにおける欠失、１５８位におけるグリコシル化シークオンの喪失を有しており、それにより、特徴１および４とマッチしていた（表２）。さらに、Ｅｇｙ０９ ＨＡ中のＧｌｕ−１３１、Ｓｅｒ−１３３およびＴｈｒ−１５５が関わるＲＢＳＮダイアグラムは、Ａｌｂ５８ ＨＡ中のＴｈｒ−１３１、Ｔｈｒ−１３３およびＴｈｒ−１５５が関わる対応するダイアグラムと同一であった（ＲＢＳＮダイアグラムは示さず）。並行して、Ｅｇｙ０９中の残基Ａｌａ−１８８およびＴｈｒ−１９２が関わるＲＢＳＮダイアグラムは、Ｈ２ ＨＡ ＲＢＳ中の残基Ｇｌｕ−１８８およびＡｒｇ−１９２が関わる対応するダイアグラムと類似していた。結果として、この実施例の「特徴−マッチング」分析によって予測されるように、Ｅｇｙ０９ ＨＡにおいて、その結合をヒト受容体に量的に切り替えるためには、４つ全ての特徴とマッチさせる（表２中のＥ４．２）、より少ないアミノ酸変化が必要とされた（図６Ａおよび６Ｂ）。Ｅ４．２のヒト受容体親和性を、Ｋｄ’約２５ｐＭで定量した。Ｅｇｙ０９中にＧｌｎ−２２６→ＬｅｕおよびＡｓｎ２２４→Ｌｙｓを導入する代替的な戦略によって特徴２とマッチさせることで、特徴１、２および４がマッチされた変異体ＨＡが生じ（Ｅ４．３）、トリ受容体結合からヒト受容体結合への観察可能な量的切り替えもまた示された（図６Ｃ）。ヒト受容体に対するＥ４．３の結合親和性は、約５０ｐＭであった。したがって、クレード２．２．１の場合であっても、４つの特徴のうちの３つとマッチさせることは、その結合優先性をヒト受容体に量的に切り替えた。さらに、Ｅｇｙ０９のＲＢＳは、たった２つのアミノ酸変化が、４つの特徴のうちの３つとマッチさせて、ウイルス伝染に必要な特徴的ヒト受容体結合での切り替えを達成するために十分であるように、進化したようである。
Ｅｇｙ０９におけるたった２つのアミノ酸変化で特徴２とマッチさせることにおける本発明者らの成功と、Ａｓｎ−２２４→Ｌｙｓが最近のＨ５Ｎ１分離株の一部において観察されたという事実とを考慮して、本発明者らは、この変異がクレード２．２．１のＨＡ配列のいずれかにおいて天然に存在したかどうかを決定しようとした。この調査により結果として選択配列が得られ、その中で、本発明者らは、４つの特徴のうちの３つとマッチさせるためにＧｌｎ→２２６Ｌｅｕ変化のみを必要とする別のクレード２．２．１のＨＡ−Ａ／ｄｕｃｋ／Ｅｇｙｐｔ／１０１８５ＳＳ／２０１０（Ｅｇｙ１０）ＨＡを選択した。この予測と一致して、Ｅｇｙ１０は、２００９ Ｈ１Ｎ１パンデミックＨＡと類似の様式で、結合親和性Ｋｄ’約１００ｐＭでその結合優先性をヒト受容体に量的に切り替えるためにＧｌｎ−２２６→Ｌｅｕ変化をもたらすただ１つの単一塩基対変異を必要とした（図６Ｄ）。Ｅｇｙ１０は、ウイルス伝染に必要な閾値を超えている（図１）。
クレード７のＨＡ中で、ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｖｉｅｔｎａｍ／ＮＣＶＤ−０９３／０８（ｃｋＶｉｅｔ０８）は、このクレードを最も代表することが明らかであり、Ｈ２ ＨＡ ＲＢＳの特徴３とマッチすることにより近づけるために、１８８位、１９２位および１９３位において特異的に「１９０−ヘリックス」中のアミノ酸変化を既に獲得しているので、これを選択した。このＨＡ上で、特徴１（１３０−ループ欠失の導入およびＬｅｕ−１３３→Ｔｈｒ変異）、特徴２（ＬＳ＋Ｓｅｒ１３７→Ａｒｇ）、特徴３（Ａｓｎ−１８７→ＡｓｐおよびＭｅｔ−１９３→Ｔｈｒ）および特徴４（１５８におけるグリコシル化の喪失）とマッチするための体系的アミノ酸変化により、その結合優先性をヒト受容体に量的に切り替えた（表２中のＶ４．３）。
まとめると、Ｈ５ ＨＡのＲＢＳを特徴付ける分子特徴を定義するための新規アプローチを使用して、この実施例は、特定の最近のクレード２．２．１のＨ５Ｎ１分離株由来のＨＡが、その結合をヒト受容体に量的に切り替えるために、単一のＧｌｎ２２６→Ｌｅｕアミノ酸変異のみを必要とすることを実証している。この実施例に記載されるアプローチは、結合をヒト受容体に量的に切り替えるＲＢＳ特徴を分析する必要性を強調している。このアプローチから、所与のＨ５ ＨＡについて、ＲＢＳ特徴とマッチするための別個の方法が存在すること、およびヒトへの適応に必要とされるアミノ酸の数が、Ｈ５ ＨＡの天然の配列進化に決定的に依存する変数パラメーターであることが明らかである。実際、フェレットにおける空気伝染性をＩｎｄ０５ウイルスに付与した同じアミノ酸変化を、代表的なクレード２．２．１のＨＡ中に導入した場合、劇的に異なるグリカン結合特性が観察された（図７）。さらに、Ｖｉｅｔ０４などのクレード１のＨＡにおける１３０−ループ欠失の非存在下で特徴２（Ａｓｎ−２２４→ＬｙｓおよびＧｌｙ２２６→Ｌｅｕ変異）ならびに特徴４単独とマッチさせることで、実質的に低いグリカン結合シグナルが示された。この知見は、全てのＨ５ ＨＡのヒトへの適応のための出発点として、Ｖｉｅｔ０４（Ｉｍａｉら、２０１２年、Ｎａｔｕｒｅ、４８６巻：４２０頁）またはＩｎｄ０５（Ｈｅｒｆｓｔら、２０１２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３６巻：１５３４頁）について報告された特定のアミノ酸変化を単に使用するのではなく、Ｈ５ ＨＡ進化に関してＲＢＳ特徴を捕捉する本発明のアプローチの意義を強調する。
特徴１および４を天然に獲得したＨ５Ｎ１ ＨＡの系統発生学的分析により、それらがクレード２．２．１に属すること、および特徴３を獲得したＨ５Ｎ１ ＨＡがクレード７に属することが示された。これらのクレードに属する株由来のＨＡが、ヒトへの適応により近づいていることに注目すべきである。重要なことに、Ｓｅｒ１３７→Ａｒｇ、Ｇｌｎ２２６→ＬｅｕおよびＧｌｙ２２８→Ｓｅｒとは別に、全ての他のアミノ酸変化−およびまた１３０−ループにおける欠失−が、Ｈ５Ｎ１において（２００６年以降のより最近の株において）観察され、これらの変化はまた、Ｈ５Ｎ１ ＨＡ配列の進化を維持した。したがって、この実施例によって所望により明らかにされる１つの前向き監視戦略は、現在循環しているＨ５ ＨＡにおけるこれらの変化の共出現をモニタリングすることを含み得る。現在のインフルエンザ監視の試みの大部分は、アジア亜大陸（中国、ベトナムおよびタイ）に焦点を当てていることに留意すべきである。しかし、クレード２．２．１に属するヒトＨ５Ｎ１分離株の全ては、エジプトおよびイスラエルに由来する。クレード２．２．１株およびクレード７株の進化を綿密にモニタリングすることが重要である。ヒトへのＨ５Ｎ１適応およびワクチン戦略に対する焦点の多くは、２００３〜２００６年の株についてであった。臨床使用のために現在承認されている５種のヒトＨ５Ｎ１ワクチンもまた、初期のクレード由来の株に基づく。
この実施例では、抗原性の正体（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を、フェレットにおける交差反応性中和抗血清応答と相関させるために、ＨＡ間の抗原性の正体を比較する測定基準を使用した（Ｔｈａｒａｋａｒａｍａｎ， Ｋ．ら；原稿提出済み）。この分析により、低い抗原性の正体が、低い交差防御と相関したことが示された。この分析を拡張して、本発明者らは、２００３〜２００６年の株、例えばＶｉｅｔ０４およびＩｎｄ０５が、クレード２．２．１およびクレード７と、低い抗原性の正体を共有することを示した。したがって、現在承認されているヒトＨ５Ｎ１ワクチンは、この研究に記載されるクレード２．２．１株およびクレード７株の野生型形態および変異体形態による感染を効果的に防御する可能性が低い。本発明者らのアプローチからの結果は、現在のＨ５Ｎ１株の進化の監視にとって潜在的に有用であり得、ヒト集団におけるＨ５Ｎ１の可能な大流行の事件におけるパンデミック前のより良い準備のために既存のワクチン戦略を強化できる洞察を提供する。
材料および方法
クローニング、バキュロウイルス合成、ＨＡの発現および精製
Ｈ５のＷＴ ＨＡ配列およびＨ５のバリアントＨＡ配列を、昆虫細胞発現のためにコドン最適化し、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）において合成した。次いで、合成した遺伝子を、ｐＡｃＧＰ６７Ａプラスミド中にサブクローニングし、バキュロウイルスを、製造業者の指示に従ってＢａｃｕｌｏｇｏｌｄシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して作製した。次いで、これらの組換えバキュロウイルスを使用して、ＢＤ Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ Ｍａｘ−ＸＰ ＳＦＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）において培養したＳｆ９細胞の懸濁培養物に感染させた。感染をモニタリングし、馴化培地を、感染の３〜４日後に回収した。回収した馴化培地からの可溶性ＨＡを、Ｎｉｃｋｅｌアフィニティクロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して精製した。ＨＡを含有する溶出画分をプールし、濃縮し、１００Ｋ ＭＷＣＯスピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して１×ＰＢＳ ｐＨ８．０（Ｇｉｂｃｏ）へと緩衝液交換した。精製したタンパク質を、ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して定量した。
この遺伝子を、哺乳動物発現のためにコドン最適化し、合成し（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）、ＣＭＶプロモーター下での発現のために、改変型ｐｃＤＮＡ３．３ベクター中にサブクローニングした。ＨＡの組換え発現を、３７℃、８０％湿度および８％ＣＯ２に維持した２９３−Ｆ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で培養したＨＥＫ ２９３−Ｆ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ懸濁細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）において実施した。細胞に、Ｐｏｌｙ−ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｉｍｉｎｅ Ｍａｘ（ＰＥＩ−ＭＡＸ、ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）を用いてＨＡプラスミドをトランスフェクトし、感染の７日後に回収した。上清を遠心分離によって収集し、０．４５μｍフィルターシステム（Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を介して濾過し、１：１０００希釈プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ濾過を補充し、および１：１０００希釈プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を補充した。ＨＡを、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ ＦＰＬＣシステム上でＨｉｓ−ｔｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して上清から精製した。ＨＡを含有する溶出画分をプールし、濃縮し、１００Ｋ ＭＷＣＯスピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して１×ＰＢＳ ｐＨ７．４へとバッファー交換した。精製したタンパク質を、ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して定量した。
両方の発現系をこの実施例で使用した。重要なことに、バキュロウイルスから誘導されたＨＡのグリカン結合特性において、哺乳動物発現から誘導された材料のグリカン結合特性と比較した場合に差異は観察されなかった。
ＨＡの相同性モデリング
Ａｌｂ５８ ＨＡ三量体の構造モデルを、ＭＯＤＥＬＬＥＲ相同性モデリングソフトウェアを使用して構築した。このモデルを構築するために、Ａｌｂ５８に対してＨＡ１において９９％配列同一性を有する、ヒト受容体とのＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７ヘマグルチニン（ＰＤＢ：２ＷＲ７）の解明された結晶構造を、鋳型として使用した。モデリングの間に、リガンド（ヒト受容体）を、鋳型構造からモデル構造へとコピーした。最終モデルを最小化して、内部拘束を外した。
ＷＴおよびバリアントＨＡのＨＡ受容体グリカンへの用量依存的直接的結合
多価ＨＡ−グリカン相互作用を調査するために、代表的ビオチン化α２→３シアル酸付加グリカンおよびα２→６シアル酸付加グリカンを含むストレプトアビジンプレートアレイを、以前に記載されたように使用した。３’ＳＬＮ、３’ＳＬＮ−ＬＮ、３’ＳＬＮ−ＬＮ−ＬＮは、代表的なトリ受容体である。６’ＳＬＮおよび６’ＳＬＮ−ＬＮは、代表的なヒト受容体である。ＬＮはラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）に対応し、３’ＳＬＮおよび６’ＳＬＮはそれぞれ、ＬＮに連結されたＮｅｕ５Ａｃα２−３およびＮｅｕ５Ａｃα２−６に対応する。ビオチン化グリカンは、Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓから、その資源要求プログラムを介して得た。Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｃｏａｔｅｄ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃａｐａｃｉｔｙ ３８４ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）に、２．４μＭのビオチン化グリカン５０μｌを含むウェルを４℃で一晩インキュベートすることによって、各ウェルの全キャパシティまでロードした。過剰のグリカンを、ＰＢＳでの広範な洗浄によって除去した。三量体ＨＡ単位は、３つのＨＡ単量体から構成される（したがって、３つのＲＢＳ、各単量体につき１つ）。ストレプトアビジンプレートアレイのウェル中のビオチン化グリカンの空間的整列は、三量体ＨＡ単位における３つのＨＡ単量体のうちの１つだけへの結合に有利である。したがって、ＨＡ−グリカン相互作用における多価性を特異的に増強するために、組換えＨＡタンパク質を、４：２：１（ＨＡ：一次抗体：二次抗体）の分子比で、一次抗体および二次抗体とプレ複合体化した（ｐｒｅ−ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ）。全てのＨＡについてのプレ複合体（ｐｒｅｃｏｍｐｌｅｘ）中の４つの三量体ＨＡ単位の同一の整列は、それらのグリカン結合親和性間の比較を可能にする。比率４：２：１で適切な量のヒスチジンタグ化ＨＡタンパク質、一次抗体（Ａｂｃａｍのマウス抗６Ｘ ＨｉｓタグＩｇＧ）および二次抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ）を含有するストック溶液を２０分間氷上でインキュベートした。適切な量のプレ複合体化したストックＨＡを、ＰＢＳ中１％ＢＳＡで２５０μｌに希釈した。このプレ複合体化したＨＡの５０μｌを、グリカンコーティングしたウェルの各々に添加し、室温で３時間インキュベートし、その後、ＰＢＳおよびＰＢＳＴ（１Ｘ ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）による洗浄ステップを行った。結合シグナルを、製造業者の指示に従ってＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ａｓｓａｙキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を使用して、ＨＲＰ活性に基づいて決定した。これらの実験は三連で実施した。最小結合シグナルを、グリカンなしのウェルへのプレ複合体化した単位の結合およびグリカンありのウェルへの抗体単独の結合を含む陰性対照において観察した。結合パラメーター、協同性（ｎ）および見かけの結合定数（Ｋｄ’）を、ＨＡ−グリカン結合について、平均結合シグナル値（三連分析から）およびＨＡ濃度を、Ｈｉｌｌ方程式の線形化形態にフィッティングさせることによって計算した：
Figure 2016509609
 式中、ｙは、飽和度（平均結合シグナル／観察された最大結合シグナル）である。Ｋｄ’の値を比較するために、この研究において報告された値は、適切な代表的トリ（３’ＳＬＮ−ＬＮまたは３’ＳＬＮ−ＬＮ−ＬＮ）受容体およびヒト（６’ＳＬＮ−ＬＮ）受容体に対応し、上記方程式へのベストフィットおよび同じ勾配値を与えた（ｎ約１．３）。
上述のように、バキュロウイルスから誘導されたＨＡについてのグリカン結合特性において、哺乳動物発現を介して生成されたＨＡのものと比較した場合に差異は存在しなかった。
ＲＢＳ残基のネットワーク（ＲＢＳＮ）を捕捉する
Ｈ５ ＨＡ−トリ受容体およびＡｌｂ５８ ＨＡ−ヒト受容体複合体の座標を、ＰＤＢｅＰＩＳＡサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｍｓｄ−ｓｒｖ／ｐｒｏｔ＿ｉｎｔ／ｐｉｓｔａｒｔ．ｈｔｍｌ）中にアップロードして、対応するグリカン受容体と接触するＨＡ ＲＢＳ中の重要な残基を決定した（３０％のインターフェースカットオフを使用した）。これらの残基について、それらの環境を、７Åの距離閾値を使用して定義し、この閾値距離内の残基の対間に存在する推定水素結合（水架橋されたものを含む）、ジスルフィド結合、パイ結合、極性相互作用、塩橋およびファンデルワールス相互作用（非水素）を含む接触を、以前に記載されたように計算した（Ｓｏｕｎｄａｒａｒａｊａｎら、２０１１年、Ｓｃｉ． Ｒｅｐ．、１巻）。これらのデータを、一群の８つの原子相互作用行列へとアセンブルした。次いで、８つの原子相互作用行列の加重和を計算して、相対的原子相互作用エネルギーから誘導された加重（ｗｅｉｇｈｔ）を使用して、ＲＢＳ内の残基対間の原子相互作用の強さを説明する単一の行列を得た（Ｓｏｕｎｄａｒａｒａｊａｎら、２０１１年、Ｓｃｉ． Ｒｅｐ．、１巻）。この様式で計算した残基間相互作用ネットワークは、それらの環境中の空間的に近位の隣の残基との、欠くことのできないＲＢＳ残基によって行われる全ての接触を記述する行列を生成する。各成分ｉ、ｊは、残基ｉとｊとの間の全てのパスのパススコアの合計である。各残基についてのネットワーク化スコアの程度を、行列の行にわたって合計することによって計算し、これは、各残基の「ネットワーク化」の程度に対応することを意味した。ネットワーク化スコアの程度を、０（いずれのネットワークも存在しない）から１（最もネットワーク化されている）までスコアが変動するように、各タンパク質についての最大スコアで正規化した（ＲＢＳＮスコア）。
Ｈ５ ＨＡの配列分析および重要な特徴の推定
合計６，０１４のＨ５ ＨＡ配列を、ＥｐｉＦｌｕデータベースからダウンロードした。ここから、開始コドンおよび終始コドンを含む完全コード領域を有した配列のみを検討した。複数回提示される配列に起因する推定エラーを回避するために、データセット中の同一配列の全ての群を、その群中の最も古い配列によって示した。残りの２，９５９の配列を、単離時点によって順序付け、アラインし、各特徴の発生率（その特徴を含有する所与の年からの配列のパーセント分率として定義する）を計算した。

Claims (33)

  1. ポリペプチドであって、その配列が参照配列エレメントに対応するエレメントを含み、前記参照配列エレメントは、重大なヒト感染性を媒介しない参照Ｈ５ ＨＡの残基１３０〜２２８を含み、
    該ポリペプチドの配列エレメントは、該参照配列エレメントと少なくとも８０％の全体的配列同一性を示すが、以下：
    ｉ．該参照Ｈ５ ＨＡのアミノ酸１３０に対応するアミノ酸の欠失である第１の特徴；
    ｉｉ．以下：
    ｉ．Ｘａａ２２６＋ｓｅｒ２２８、
    ｉｉ．Ｌｙｓ２２４＋Ｘａａ２２６
    ｉｉｉ．Ｘａａ１３７＋Ｘａａ２２６＋ｓｅｒ２２８、
    ｉｖ．Ｘａａ２２６＋ｇｌｙ２２７＋ｓｅｒ２２８、
    ｖ．Ｘａａ１３７＋ｐｒｏ２２１＋Ｘａａ２２６＋ｓｅｒ２２８、および
    ｖｉ．Ｘａａ１３７＋ｔｈｒ１５５＋ｐｒｏ２２１＋Ｘａａ２２６＋ｇｌｙ２２７＋ｓｅｒ２２８
    からなる群から選択される第２の特徴；
    ｉｉｉ．以下：
    ｉ．ｇｌｕ１８８＋Ｘａａ１９２＋Ｘａａ１９３、
    ｉｉ．ａｓｐ１８７＋Ｘａａ１９３、および
    ｉｉｉ．Ｘａａ１９３
    からなる群から選択される第３の特徴；ならびに
    ｉｖ．以下：
    ｉ．ａｌａ１６０、
    ｉｉ．ａｓｎ１５８＋ａｌａ１６０、および
    ｉｉｉ．ａｓｎ１５８＋ｔｈｒ１６０
    からなる群から選択される第４の特徴
    のうち少なくとも１つを含むという点で、該参照配列エレメントとは同一でなく、
    該第２の特徴、第３の特徴および第４の特徴のアミノ酸の位置は、該参照Ｈ５ ＨＡの参照された位置に対応し、Ｘａａ２２６は、群Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＭｅｔおよびＡｌａから選択され、Ｘａａ１３７は、群Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＨｉｓおよびＡｓｎから選択され、Ｘａａ１９２は、群Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され、Ｘａａ１９３は、群Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓから選択される、
    ポリペプチド。
  2. 少なくとも２つの特徴を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 少なくとも３つの特徴を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  4. ４つ全ての特徴を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  5. ９８アミノ酸長と４００アミノ酸長との間（両端を含む）である、請求項１に記載のポリペプチド。
  6. 前記ペプチドの配列エレメントが、９８アミノ酸長と２３０アミノ酸長との間（両端を含む）である、請求項１に記載のポリペプチド。
  7. ポリペプチドであって、その配列が参照配列エレメントに対応するエレメントを含み、前記参照配列エレメントは、重大なヒト感染性を媒介しない参照Ｈ５ ＨＡの残基１３０〜２２８を含み、
    該ポリペプチドの配列エレメントは、該参照配列エレメントと少なくとも８０％の全体的配列同一性を示すが、以下：
    該参照Ｈ５ ＨＡのアミノ酸１３０に対応するアミノ酸の欠失である第１の特徴；
    以下：
    ｉ．Ｘａａ２２６＋ｓｅｒ２２８、
    ｉｉ．Ｌｙｓ２２４＋Ｘａａ２２６
    ｉｉｉ．Ｘａａ１３７＋Ｘａａ２２６＋ｓｅｒ２２８、
    ｉｖ．Ｘａａ１＋ｇｌｙ２２７＋ｓｅｒ２２８、
    ｖ．Ｘａａ１３７＋ｐｒｏ２２１＋Ｘａａ２２６＋ｓｅｒ２２８、および
    ｖｉ．Ｘａａ１３７＋ｔｈｒ１５５＋ｐｒｏ２２１＋Ｘａａ２２６＋ｇｌｙ２２７＋ｓｅｒ２２８
    からなる群から選択される第２の特徴；
    以下：
    ｉｖ．ｇｌｕ１８８＋Ｘａａ１９２＋Ｘａａ１９３、
    ｖ．ａｓｐ１８７＋Ｘａａ１９３、および
    ｖｉ．Ｘａａ１９３
    からなる群から選択される第３の特徴；ならびに
    以下：
    ｉｖ．ａｌａ１６０、
    ｖ．ａｓｎ１５８＋ａｌａ１６０、および
    ｖｉ．ａｓｎ１５８＋ｔｈｒ１６０
    からなる群から選択される第４の特徴
    のうち少なくとも１つを含むという点で、該参照配列エレメントとは同一でなく、
    該第２の特徴、第３の特徴および第４の特徴のアミノ酸の位置は、該参照Ｈ５ ＨＡの参照された位置に対応し、Ｘａａ２２６は、群Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＭｅｔおよびＡｌａから選択され、Ｘａａ１３７は、群Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＨｉｓおよびＡｓｎから選択され、Ｘａａ１９２は、群Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され、Ｘａａ１９３は、群Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓから選択される、ポリペプチド
    を含む少なくとも１種の抗原と、
    薬学的に許容されるキャリアと
    を含む、ワクチン組成物。
  8. 前記ポリペプチドが少なくとも２つの特徴を含む、請求項７に記載のワクチン組成物。
  9. 前記ポリペプチドが少なくとも３つの特徴を含む、請求項７に記載のワクチン組成物。
  10. 前記ポリペプチドが４つ全ての特徴を含む、請求項７に記載のワクチン組成物。
  11. 前記ポリペプチドが、９８アミノ酸長と４００アミノ酸長との間（両端を含む）である、請求項７に記載のワクチン組成物。
  12. 前記ペプチドの配列エレメントが、９８アミノ酸長と２３０アミノ酸長との間（両端を含む）である、請求項７に記載のワクチン組成物。
  13. ワクチンを提供する方法であって、
    ポリペプチドであって、その配列が参照配列エレメントに対応するエレメントを含み、その参照配列エレメントは、重大なヒト感染性を媒介しない参照Ｈ５ ＨＡの残基１３０〜２２８を含み、
    該ポリペプチドの配列エレメントは、該参照配列エレメントと少なくとも８０％の全体的配列同一性を示すが、以下：
    該参照Ｈ５ ＨＡのアミノ酸１３０に対応するアミノ酸の欠失である第１の特徴；
    以下：
    ｉ．Ｘａａ２２６＋ｓｅｒ２２８、
    ｉｉ．Ｌｙｓ２２４＋Ｘａａ２２６
    ｉｉｉ．Ｘａａ１３７＋Ｘａａ２２６＋ｓｅｒ２２８、
    ｉｖ．Ｘａａ２２６＋ｇｌｙ２２７＋ｓｅｒ２２８、
    ｖ．Ｘａａ１３７＋ｐｒｏ２２１＋Ｘａａ２２６＋ｓｅｒ２２８、および
    ｖｉ．Ｘａａ１３７＋ｔｈｒ１５５＋ｐｒｏ２２１＋Ｘａａ２２６＋ｇｌｙ２２７＋ｓｅｒ２２８
    からなる群から選択される第２の特徴；
    以下：
    ｉ．ｇｌｕ１８８＋Ｘａａ１９２＋Ｘａａ１９３、
    ｉｉ．ａｓｐ１８７＋Ｘａａ１９３、および
    ｉｉｉ．Ｘａａ１９３
    からなる群から選択される第３の特徴；ならびに
    以下：
    ｉ．ａｌａ１６０、
    ｉｉ．ａｓｎ１５８＋ａｌａ１６０、および
    ｉｉｉ．ａｓｎ１５８＋ｔｈｒ１６０
    からなる群から選択される第４の特徴
    のうち少なくとも１つを含むという点で、該参照配列エレメントとは同一でなく、
    該第２の特徴、第３の特徴および第４の特徴のアミノ酸の位置は、該参照Ｈ５ ＨＡの参照された位置に対応し、Ｘａａ２２６は、群Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＭｅｔおよびＡｌａから選択され、Ｘａａ１３７は、群Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＨｉｓおよびＡｓｎから選択され、Ｘａａ１９２は、群Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され、Ｘａａ１９３は、群Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓから選択される、ポリペプチドを含む少なくとも１種の抗原を提供するステップ；ならびに
    該提供された少なくとも１種の抗原をワクチン組成物へと製剤化するステップ
    を含む、方法。
  14. 前記ポリペプチドが少なくとも２つの特徴を含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記ポリペプチドが少なくとも３つの特徴を含む、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記ポリペプチドが４つ全ての特徴を含む、請求項１３に記載の方法。
  17. 前記ポリペプチドが、９８アミノ酸長と４００アミノ酸長との間（両端を含む）である、請求項１３に記載の方法。
  18. 前記ペプチドの配列エレメントが、９８アミノ酸長と２３０アミノ酸長との間（両端を含む）である、請求項１３に記載の方法。
  19. Ｈ５インフルエンザの株におけるパンデミックのリスクを決定するための診断キットであって、
    ポリペプチドであって、その配列が参照配列エレメントに対応するエレメントを含み、前記参照配列エレメントは、重大なヒト感染性を媒介しない参照Ｈ５ ＨＡの残基１３０〜２２８を含み、
    該ポリペプチドの配列エレメントは、該参照配列エレメントと少なくとも８０％の全体的配列同一性を示すが、以下：
    該参照Ｈ５ ＨＡのアミノ酸１３０に対応するアミノ酸の欠失である第１の特徴；
    以下：
    ｉ．Ｘａａ２２６＋ｓｅｒ２２８、
    ｉｉ．Ｌｙｓ２２４＋Ｘａａ２２６
    ｉｉｉ．Ｘａａ１３７＋Ｘａａ２２６＋ｓｅｒ２２８、
    ｉｖ．Ｘａａ２２６＋ｇｌｙ２２７＋ｓｅｒ２２８、
    ｖ．Ｘａａ１３７＋ｐｒｏ２２１＋Ｘａａ２２６＋ｓｅｒ２２８、および
    ｖｉ．Ｘａａ１３７＋ｔｈｒ１５５＋ｐｒｏ２２１＋Ｘａａ２２６＋ｇｌｙ２２７＋ｓｅｒ２２８
    からなる群から選択される第２の特徴；
    以下：
    ｉ．ｇｌｕ１８８＋Ｘａａ１９２＋Ｘａａ１９３、
    ｉｉ．ａｓｐ１８７＋Ｘａａ１９３、および
    ｉｉｉ．Ｘａａ１９３
    からなる群から選択される第３の特徴；ならびに
    以下：
    ｉ．ａｌａ１６０、
    ｉｉ．ａｓｎ１５８＋ａｌａ１６０、および
    ｉｉｉ．ａｓｎ１５８＋ｔｈｒ１６０
    からなる群から選択される第４の特徴
    のうち少なくとも１つを含むという点で、該参照配列エレメントとは同一でなく、
    該第２の特徴、第３の特徴および第４の特徴のアミノ酸の位置は、該参照Ｈ５ ＨＡの参照された位置に対応し、Ｘａａ２２６は、群Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＭｅｔおよびＡｌａから選択され、Ｘａａ１３７は、群Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＨｉｓおよびＡｓｎから選択され、Ｘａａ１９２は、群Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅから選択され、Ｘａａ１９３は、群Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓから選択される、ポリペプチドに結合する少なくとも１種の抗体
    を含む、診断キット。
  20. 前記ポリペプチドが少なくとも２つの特徴を含む、請求項１９に記載の診断キット。
  21. 前記ポリペプチドが少なくとも３つの特徴を含む、請求項１９に記載の診断キット。
  22. 前記ポリペプチドが４つ全ての特徴を含む、請求項１９に記載の診断キット。
  23. 前記ポリペプチドが、９８アミノ酸長と４００アミノ酸長との間（両端を含む）である、請求項１９に記載の診断キット。
  24. 前記ペプチドの配列エレメントが、９８アミノ酸長と２３０アミノ酸長との間（両端を含む）である、請求項１９に記載の診断キット。
  25. 前記参照配列エレメントが、１５８位においてグリコシル化されていない、請求項１９に記載の診断キット。
  26. ヒトに感染しない参照Ｈ５ ＨＡに結合する抗体をさらに含む、請求項１９に記載の診断キット。
  27. 試料中のインフルエンザをモニタリングする方法であって、以下：
    ａ．インフルエンザを含有することが疑われる供給源から試料を取得するステップ；
    ｂ．該料を、請求項１に記載のＨ５ ＨＡポリペプチドに特異的に結合する１種または複数の作用物質と接触させるステップ；
    ｃ．該作用物質と該試料との結合を検出し、その結果該試料中のＨ５ ＨＡの存在および／またはレベルを決定するステップ
    を含む、方法。
  28. 前記供給源が環境供給源である、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記供給源がヒト患者である、請求項２７に記載の方法。
  30. 前記取得するステップ、接触させるステップおよび検出するステップを、第１の取得するステップ、接触させるステップおよび検出するステップが完了してから一定の期間が経過した後に、少なくとも１回反復する、請求項２７に記載の方法。
  31. 前記供給源由来の試料を、ヒトに感染しないＨ５ ＨＡに特異的に結合する１種または複数の作用物質と接触させるステップをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
  32. ポリペプチドであって、その配列が参照配列エレメントに対応するエレメントを含み、その参照配列エレメントは、重大なヒト感染性を媒介しない参照Ｈ５ ＨＡの残基１３０〜２２８を含み、
    該ポリペプチドの配列エレメントは、該参照配列エレメントと少なくとも８０％の全体的配列同一性を示すが、以下：
    該参照Ｈ５ ＨＡのアミノ酸１３０に対応するアミノ酸の欠失である第１の特徴；
    ａｒｇ１３７＋ｔｈｒ１５５＋ｐｒｏ２２１＋ｌｅｕ２２６＋ｇｌｙ２２７＋ｓｅｒ２２８である第２の特徴；
    ｇｌｕ１８８＋ａｒｇ１９２＋ａｌａ１９３である第３の特徴；および
    ａｓｎ１５８＋ｔｈｒ１６０である第４の特徴
    のうち少なくとも１つを含むという点で、該参照配列エレメントとは同一でなく、
    該第２の特徴、第３の特徴および第４の特徴のアミノ酸の位置は、該参照Ｈ５ ＨＡの参照された位置に対応する、
    ポリペプチド。
  33. ポリペプチドであって、その配列が参照配列エレメントに対応するエレメントを含み、その参照配列エレメントは、重大なヒト感染性を媒介しない参照Ｈ５ ＨＡの残基１３０〜２２８を含み、
    該ポリペプチドの配列エレメントは、該参照配列エレメントと少なくとも８０％の全体的配列同一性を示すが、以下：
    該参照Ｈ５ ＨＡのアミノ酸１３０に対応するアミノ酸の欠失である第１の特徴；
    ａｒｇ１３７＋ｌｙｓ２２６＋ｓｅｒ２２８である第２の特徴、
    ａｓｐ１８７＋ｔｈｒ１９３である第３の特徴；および
    ａｓｎ１５８＋ａｌａ１６０である第４の特徴
    のうち少なくとも１つを含むという点で、該参照配列エレメントとは同一でなく、
    該第２の特徴、第３の特徴および第４の特徴のアミノ酸の位置は、該参照Ｈ５ ＨＡの参照された位置に対応する、
    ポリペプチド。
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