CN103987860B - 特异识别含有5‑甲基化胞嘧啶的dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异识别含有5‑甲基化胞嘧啶的DNA的方法。该方法包括用TALE蛋白来特异性识别DNA中的5‑甲基化胞嘧啶。

Description

特异识别含有5-甲基化胞嘧啶的DNA的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地说，涉及特异识别含有5-甲基化胞嘧啶的DNA的方法。
背景技术
TALE(Transcription Activator Like Effectors，转录激活子样效应因子)是植物致病菌黄单胞菌属(Xanthomonas)的细胞内的一种蛋白质。当病原菌侵染植株时，病菌会通过其自身的III型分泌系统将包括TALE在内的一系列效应分子注入到植物细胞内。这些效应分子通过影响宿主细胞的信号传递，基因表达等方式来协助病菌进一步扩增。TALE则是这些效应分子中最大的一类，它像植物自身的转录激活子一样行使功能。
TALE家族蛋白一般由3个主要的功能结构域组成，N端结构域与TALE的分泌转运有关；C端具有转录激活结构域和入核信号肽片段；位于TALE中部的区域是DNA结合结构域，但它的DNA结合结构域不同于其他已知的DNA结合结构域，它是由一段串联的重复单元组成，大多数情况下每个重复单元由34个氨基酸组成，个别重复单元由33或35个氨基酸残基组成。这34个氨基酸中除了第12和13位的氨基酸变化较大之外，其他氨基酸高度保守。这两个不保守的氨基酸被命名为RVD(repeat variable diresidue，重复可变双残基)。J.Boch等人和M.J.Moscou等(参见J.Boch，H.Scholze，S.Schornack，A.Landgraf，S.Hahn，S.Kay，T.Lahaye，A.Nickstadt，U.Bonas，Breaking the code of DNA binding specificity ofTAL-type III effectors，Science，326(2009)1509-1512和M.J.Moscou，A.J.Bogdanove，Asimple cipher governs DNA recognition by TAL effectors，Science，326(2009)1501)已于2009年分别通过实验和生物信息学研究发现每个重复单元中第12和13位的氨基酸(RVD)与识别的核苷酸种类有特殊的对应关系，例如：
表1部分RVD与DNA碱基序列的对应关系
TALE蛋白的特异DNA序列识别以及灵活的可组装性为它们在分子生物学中的应用提供了巨大的前景，科学家们可以设计组装任意的TALE单元去识别任意的DNA双螺旋序列。这一特性已经被用来构造切割特异双链DNA序列的DNA酶TALEN(TALE nuclease，TALE核酸酶)，用于在细胞基因组中引入定点突变、定点敲除等操作(A.J.Bogdanove，D.F.Voytas，TAL effectors：customizable proteins for DNA targeting，Science，333(2011)1843-1846.)。在目前所有已知的报道中，TALE识别的都是没有修饰的双链DNA。
发明内容
一方面，本发明涉及检测DNA中的胞嘧啶甲基化的方法，包括用TALE蛋白及其衍生蛋白来特异性识别DNA中的5-甲基胞嘧啶。
在优选实施方案中，采用两种不同的TALE蛋白，分别特异性识别靶标序列中的胞嘧啶和5-甲基化胞嘧啶。
在进一步优选的实施方案中，所述方法用于检测CpG岛的甲基化。
一方面，本发明涉及TALE蛋白及其衍生蛋白用于特异性识别DNA中的5-甲基化胞嘧啶的用途。
另一方面，本发明涉及TALE蛋白及其衍生蛋白在制备用于特异性识别DNA中的5-甲基胞嘧啶的试剂中的用途。
另一方面，本发明涉及TALE蛋白及其衍生蛋白在制备用于诊断或治疗癌症的药物中的用途。
在优选实施方案中，所述诊断或治疗是通过特异性识别DNA中的5-甲基胞嘧啶来进行的。
本发明另外涉及TALE蛋白及其衍生蛋白，其用于特异性识别5-甲基胞嘧啶修饰的DNA。
本发明还涉及TALE蛋白及其衍生蛋白，其用于诊断或治疗癌症。
TALE蛋白可以为自然界已有的TALE蛋白以及在此基础上通过基因方法突变、修饰、组装获得的保持或增强特异性识别DNA中的5-甲基胞嘧啶的TALE衍生蛋白。所述TALE衍生蛋白还包含具有TALE蛋白DNA结合结构域的重组蛋白。
附图说明
图1是dHax3的DNA结合域(dHax3截短体，标记为dHax3-Δ)与双链DNA的高分辨率晶体结构(1.85埃)示意图。左图中的1-10表示dHax3的DNA结合域的每个重复单元，其识别右侧对应的DNA序列。每个重复单元由两个α螺旋组成，两个螺旋分别为a和b。该结构已上传到PDB数据库中，代码为：3V6T。其中dHax3(designed Hax3)指经过改造的TALE蛋白Hax3。
图2表示dHax3与DNA碱基间的相互作用。A、dHax3中RVD的侧链指向，RVD中的第一个氨基酸并没有伸向DNA大沟内部，同时第二个氨基酸将氨基酸侧链伸向DNA大沟；B、RVD中第一个氨基酸通过氢键稳定loop区域构象，当DNA结合结构域重复单元的第一位的氨基酸为天冬酰胺(N)或者组氨酸(H)时，它们与自身所在重复序列的第八位的氨基酸主链上的羰基氧原子形成氢键相互作用，起到稳定整个RVD所在loop构象的作用；C、RVD中第二个氨基酸与DNA碱基直接相互作用，当氨基酸残基为天冬氨酸(D)时，天冬氨酸的羧基氧会通过氢键与DNA中胞嘧啶的氨基直接形成氢键相互作用；当氨基酸残基为丝氨酸(S)时，丝氨酸中羟基与腺嘌呤中的N7形成直接氢键相互作用；当氨基酸残基为甘氨酸(G)时，它与胸腺嘧啶甲基之间会有范德华力相互作用，但是D、如A图所示的分子中，RVD为NG的loop构象；E、如B图所示的分子中，RVD为NG的loop构象。
图3是胸腺嘧啶(左)与5-甲基胞嘧啶(右)结构比较图。从图中对比可以清楚的发现胸腺嘧啶(左)与5-甲基胞嘧啶(右)的唯一区别是六位上的氨基和羰基氧原子。而不论是氨基，还是羰基氧原子都可能通过范德华力与蛋白质的氨基酸残基相互作用。
图4显示生化实验和晶体结构解析揭示了TALE蛋白通过NG识别5-甲基胞嘧啶。a、dHax3识别的含5-甲基胞嘧啶(5mC)的DNA序列(该序列称为dHax3-5mC，含有3个5mC，只显示dHax3的RVD所识别的碱基，具体序列详见实施例)以及dHax3蛋白中的相应的RVD；b、EMSA检测dHax3对不含5mC的DNA序列(称为dHax3box，其与dHax3-5mC序列相同，除了5mC为C)以及dHax3对含5mC的DNA序列(dHax3-5mC)的结合能力，每个泳道中加入大约4nM的核酸探针；同时泳道0～10的样品中加入了梯度浓度的dHax3蛋白，分别为浓度0，8nM，16nM，31.5nM，62.5nM，125nM，250nM，500nM，1000nM，2000nM，4000nM；c、dHax3的DNA结合域(dHax3-Δ)与含5mC的DNA序列(dHax3-5mC)的复合物晶体结构，显示侧链的碱基为5-甲基胞嘧啶，甘氨酸与5-甲基胞嘧啶形成范德华力相互作用，这种相互作用与甘氨酸与胸腺嘧啶。
图5是电泳图，显示了dHax3全长蛋白的纯化结果。泳道标注说明：1.全菌破碎液；2.全菌破碎离心沉淀；3.全菌破碎离心上清液；4.镍柱培养弃液；5.镍柱清洗液；6.镍柱洗脱回收液；7.镍柱柱材；8.分子量标志物。
图6是电泳图，显示了dHax3截短体蛋白(dHax3-Δ)的纯化结果。泳道标注说明：A.全菌破碎液；P.全菌破碎离心沉淀；S.全菌破碎离心上清液；F.镍柱穿透液；W1.镍柱清洗液1；W1.镍柱清洗液2；E.镍柱洗脱回收液；R.镍柱柱材；M.分子量标志物。
图7显示DNA结合实验证明NG可以特异性识别甲基化胞嘧啶。a，用于检测DNA结合的不同DNA探针(只显示dHax3的RVD所识别的碱基，详见实施例)。6T-6C表示将dHax3-box中的6个胸腺嘧啶(T)用6个胞嘧啶(C)替换；6T-6mC表示将dHax3-box中的6个胸腺嘧啶(T)用6个甲基化胞嘧啶(5mC)替换；5C-5mC表示将dHax3-box中的5个胞嘧啶(C)用5个甲基化胞嘧啶(5mC)替换；5C-5mC表示将dHax3-box中的5个胞嘧啶(C)用5个甲基化胞嘧啶(5mC)替换；5C-5T表示将dHax3-box中的5个胞嘧啶(C)用5个胸腺嘧啶(5T)替换；5C-5A表示将dHax3-box中的5个胞嘧啶(C)用5个腺嘌呤(A)替换；5C-5G表示将dHax3-box中的5个胞嘧啶(C)用5个鸟嘌呤(G)替换。b，dHax3与含有六个甲基化修饰的DNA序列(6T-6mC)具有与对照组实验(dHax3-box)相似的结合能力。c，dHax3中的一种RVD——NG——不能结合没有甲基化修饰的胞嘧啶(C)。d，dHax3中的一种RVD——HD——对于胞嘧啶(C)是特异性的识别，并且甲基化修饰会影响HD与胞嘧啶的识别。在EMSA实验中，向泳道1～5、6～10、11～15、16～20中加入梯度浓度的dHax3全长蛋白，浓度分别为0、146nM、440nM、1330nM和4000nM。
图8是dHax3-NN变体的DNA结合结构域(dHax3-NN-Δ，即将dHax3的DNA结合域的第七个重复单元中的RVD(NS)通过点突变技术变成NN并将第九个重复单元中RVD(HD)通过点突变技术变成NN，以形成对两个甲基化CpG岛的识别，其具体识别序列参见实施例)结合含有两个甲基化CpG岛DNA的晶体结构示意图。
具体实施方式
发明人成功解析了经过改造的TALE蛋白Hax3(在本文中称为dHax3(designedHax3))的DNA结合结构域与dsDNA的复合物晶体结构。该结构揭示出RVD特异识别每一个DNA碱基的分子基础，RVD中的NG依靠范德华力与胸腺嘧啶的5-甲基相互作用，胸腺嘧啶其他基团不参与反应。这一发现提示，TALE蛋白可能通过NG特异识别DNA双链中的5-甲基胞嘧啶，因为5-甲基胞嘧啶与胸腺嘧啶具有类似的结构。发明人还成功解析了dHax3的DNA结合结构域与具有5-甲基胞嘧啶的dsDNA的复合物晶体结构。
这个发现提供了一种新型的检测以及干扰胞嘧啶甲基化的方法，并且可以用于以下方面：
1.癌细胞CpG岛的检测
因为5-甲基胞嘧啶出现在表观遗传学(epigenetics)中的一个重要修饰-DNA甲基化。DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5′碳位共价键结合一个甲基基团。由于DNA甲基化与人类发育和肿瘤疾病的密切关系，特别是CpG岛甲基化所致抑癌基因转录失活问题，
在癌症细胞的基因组中会出现一些甲基化区域，而在正常的细胞中这些甲基化现象并不会出现。由于本发明的方法能够有效区分某一特定基因组位点上甲基化发生与否，因此可以作为一种新的癌症细胞检测手段。
2.治疗癌症的新方法
癌症细胞的DNA甲基化抑制了很多抑癌基因的表达。由于本发明的方法能特异地重新开启癌症细胞中这些基因的表达，因此就可以促使癌症细胞的凋亡。TALE本身就具有激活转录的功能，通过设计TALE的重复序列上的RVD，让它特异性结合有甲基化修饰的抑癌基因上游启动子序列，特异地开启癌症细胞的抑癌基因的大量表达，达到杀死癌症细胞的目的。
除非本文另有定义，本发明使用的相关科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。而且，除非上下文有其它规定，单数形式的术语应当包括复数，而复数形式的术语应当包括单数。通常，与本文所述的分子生物学、生物化学、结构生物学及相关使用的命名以及技术，是本领域众所周知且普遍使用的那些。除非另有说明，下面的术语应当理解为具有下述含义：
本文所用的术语“TALE蛋白”是指Transcription Activator Like Effectors，即转录激活子样效应因子。TALE蛋白可以为自然界已有的TALE蛋白以及在此基础上通过基因方法突变、修饰、组装获得的保持或增强DNA、或DNA-RNA杂合链结合能力的TALE衍生蛋白。
本文所用的术语“Hax3”是指TALE蛋白家族的成员之一。Hax的全称为“Homolog ofavrBs3in Xanthomonas”，而Hax3是从野油菜黄单胞菌变种Armoraciae(Xanthomonascampestris pv.Armoraciae)鉴定出的3个同源蛋白之一。作为TALE蛋白家族的成员之一，它的功能与其他已知的TALE蛋白如avrBs3的功能类似(参见S.Kay，J.Boch，U.Bonas，Characterization of AvrBs3-like effectors from a Brassicaceae pathogenreveals virulence and avirulence activities and a protein with a novel repeatarchitecture，Molecular plant-microbe interactions：MPMI，18(2005)838-848.)。
本文所用的术语“dHax3”是指人工改造的Hax3(designed Hax3)，其基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，氨基酸序列可参见SEQ ID NO：2(其中插入了6XHis标签)。M.M.Mahfouz等人设计了dHax3以使其具有特异识别如下DNA序列的能力：TCCCTTTATCTCT(M.M.Mahfouz，L.Li，M.Shamimuzzaman，A.Wibowo，X.Fang，J.K.Zhu，Denovo-engineeredtranscription activator-like effector(TALE)hybrid nuclease with novel DNAbinding specificity creates double-strand breaks，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America，108(2011)2623-2628.)。
本文所用的术语“dHax3截短体蛋白”(“dHax3-Δ”)是指去除了N端结构域和C端结构域的dHax3截短体蛋白，其为dHax3蛋白序列230-721，具有11.5个重复单元。
本文所用的术语“dHax3-NN变体”是指dHax3的一种变体，其中dHax3的DNA结合域的第七个重复单元中的RVD(NS)通过点突变技术变成NN并且第九个重复单元中RVD(HD)通过点突变技术变成NN，以形成对两个两个甲基化CpG岛的识别，dHax3-NN如下DNA序列：TCCCTTTATCTCT。
本文所用的术语“dHax3-NN-Δ”是指dHax3-NN变体的蛋白序列230-721的截短体，即保留DNA结合结构域。
由于所有TALE蛋白中的RVD识别DNA碱基的分子机制相同，虽然不同的TALE蛋白存在一定序列差异性，但是涉及实施例中dHax3的RVD——NG——特异性识别胞嘧啶甲基化的能力也同样适用于其他不同于实施例dHax3序列的其他TALE蛋白，也在本专利的保护范围之内。
实施例中所采用的各种试剂，包括缓冲液、酶、载体、试剂盒等，均可通过商业途径购得或者按照《分子克隆实验指南》第三版(黄培堂，科学出版社，2002)所推荐的方法配制。
实施例
实施例1：几种TALE蛋白的构建以及纯化
1.分子克隆及表达载体构建的实验方法如下：
●PCR扩增目的基因片段
50μl标准PCR反应体系组成如下表所示，如有需要可按照比例扩增体系；
50μl PCR反应标准体系
成功扩增目的片段后，直接使用普通DNA回收试剂盒回收扩增的目的基因片段。注意，如果是点突变的扩增基因片段需要先使用琼脂糖凝胶电泳去除DNA模板，然后使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的基因。
●限制性内切酶处理扩增片段和载体
使用相同的限制性内切酶处理扩增片段和载体，从而产生相同的DNA粘性末端。50μl双酶切反应体系成分如下表所示：
50μl标准双酶切反应体系
37℃温浴30～180min，估计反应完全后，进行凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒切胶回收DNA片段。
●DNA连接
使用T4DNA连接酶将酶切后的目的基因片段连入载体，16℃或室温反应30～120min。连接体系如下表所示：
10μl标准连接体系
●转化
将连接产物按照下述方法转入DH5α感受态细胞中，准备筛选阳性克隆：在连接产物中加入50～100μl DH5α感受态细胞，冰上放置30min；42℃热击90s；冰上放置2min；将所有产物加到氨苄抗性琼脂平板上，用涂布棒涂匀，37℃倒置培养14-16小时。
●使用菌落PCR法筛选阳性克隆
在前一步得到的平板上标记4～8个菌落，使用如下体系检验阳性克隆：
菌落PCR体系
使用凝胶电泳确认结果，挑取阳性克隆，在氨苄抗性LB培养基中37℃、220rpm培养过夜。
●质粒提取
使用普通质粒小提试剂盒提取质粒，测序由金唯智(genewiz)生物科技有限公司完成。
●重组蛋白的诱导表达
为了获得大量纯化的蛋白，需要进行过量表达。现有的过量表达体系有大肠杆菌(E.coli)、酵母、昆虫细胞等。不同的蛋白可能适合在不同的体系中表达。目的蛋白是革兰氏阴性菌中的一种蛋白，所以选择大肠杆菌作为表达体系进行蛋白表达纯化。
纯化出性质好，纯度高的蛋白质是进行生化实验及结晶实验的前提条件。从大肠杆菌中纯化重组表达蛋白技术已经相当成熟。为了方便的使用亲和层析进行纯化，构建了带有各种标签的重组蛋白。经过比较，采用带有组氨酸标签的重组蛋白进行后续实验。6个组氨酸组成的组氨酸标签可以以配位键的形式结合到带有镍等金属原子的柱材上。经过镍柱亲和层析和肝素亲和层析纯化就可以得到纯度大约95％以上的蛋白。
具体纯化步骤如下：
a.将转有TAL effector表达质粒的BL21(DE3)或者ROSETTA(DE3)接入50ml含有氨苄青霉素或者氨苄青霉素/氯霉素双抗的LB培养基，并置于37℃摇床培养过夜。
b.将5-10ml的小瓶培养液转接到1L含有抗生素的LB培养基于37℃摇床培养约3小时。当0D600＝0.8～1.0时，加入0.2mM终浓度的IPTG22℃诱导表达14～16小时。
c.完成诱导的大肠杆菌于4℃4400rpm离心10min，弃上清。每升培养液离心收集的湿菌用20ml裂菌液(25mM Tris-HCl pH 8.0，500mM NaCl)重悬。
d.超声破菌后，14000rpm离心50min，取上清进行后续纯化。
e.将上清缓缓加入事先用裂菌液(25mM Tris-HCl pH8.0，500mM NaCl)平衡好的镍柱中。将穿过液重复上述操作1～2次。
f.加入清洗缓冲液I(25mM Tris-HCl pH 8.0，1000mM NaCl)10ml，除去部分杂质。重复上述操作3次。
g.加入清洗缓冲液II(25mM Tris-HCl pH 8.0；100mM NaCl；10mM Imidazole)10ml，进一步除去杂蛋白。
h.加入洗脱缓冲液(25mM Tris-HCl pH 8.0，50mM NaCl，300mM Imidazole)10ml，将目的蛋白从镍柱上洗脱。用考马斯亮蓝G-250检测是否洗脱干净，如洗脱不完全，重复上述操作。
i.将洗脱下来的蛋白缓缓加入事先已用缓冲液(25mM Tris-HCl PH 8.0，50mMNaCl)平衡好的肝素柱(heparin sepharose6Fast Flow)。将穿过液重复上述操作1～2次。
j.加入清洗缓冲液I(25mM Tris-HCl pH 8.0，100mM NaCl)10ml，除去杂质。重复上述操作3次。
k.加入洗脱缓冲液(25mM Tris-HCl pH8.0，1000mM NaCl，10mM DTT)10ml，将目的蛋白从肝素柱上洗脱。用考马斯亮蓝G-250检测是否洗脱干净。如洗脱不完全，重复上述操作。使用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。
1.经过上述两步亲和层析纯化得到的蛋白，使用超滤浓缩管浓缩到～10mg/ml。最后使用分子筛(Superdax 200)进一步纯化蛋白并检测蛋白性质，分子筛所使用的缓冲液为25mM Tris-HCl pH8.0，150mM NaCl，10mM DTT。使用脱盐柱(Hiprep 26/10)将dHax3(231～720)蛋白所在缓冲液置换为25mM MES pH 6.0，50mM NaCl，5mM MgCl2，10mM DTT。
2.dHax3及dHax3-Δ的构建与表达
dHax3(designed Hax3)基因通过全基因合成得到，序列如下(SEQ ID NO：1)：
ATGGACCCAATACGAAGCAGAACGCCATCACCAGCTAGGGAACTTCTCTCTGGACCACAGCCTGATGGAGTTCAGCCAACTGCAGATCGAGGTGTTTCTCCGCCAGCCGGTGGCCCTTTAGATGGTCTCCCAGCAAGAAGAACAATGTCCCGTACCAGACTCCCAAGTCCCCCTGCCCCGTCGCCAGCCTTTTCAGCTGACTCCTTCTCTGATCTTCTTAGGCAATTTGACCCTTCTCTTTTCAATACATCCCTTTTCGATTCACTTCCTCCTTTCGGCGCACATCATACTGAGGCAGCCACCGGCGAATGGGACGAAGTCCAAAGTGGTTTAAGGGCAGCTGATGCTCCACCACCGACGATGAGAGTCGCTGTTACCGCCGCACGTCCTCCTAGAGCCAAGCCAGCCCCTAGAAGACGAGCTGCGCAACCCTCCGATGCAAGCCCTGCAGCTCAAGTAGACCTTCGAACACTAGGTTACTCCCAGCAACAACAAGAAAAAATAAAGCCAAAGGTTAGATCTACAGTTGCACAACATCACGAAGCCCTAGTCGGACACGGATTTACACATGCTCATATCGTGGCTCTTTCACAACATCCTGCAGCTCTTGGAACAGTCGCTGTCAAATATCAGGATATGATTGCTGCATTGCCAGAAGCTACTCACGAAGCTATCGTCGGAGTTGGGAAACAATGGTCAGGCGCAAGAGCATTAGAGGCGCTTCTCACCGTAGCTGGTGAATTACGAGGTCCTCCACTCCAATTGGATACTGGGCAATTATTAAAAATCGCTAAACGAGGTGGAGTCACTGCTGTCGAAGCCGTTCATGCATGGCGTAACGCTCTCACGGGCGCACCACTAAACCTTACTCCTGAACAGGTTGTCGCAATAGCTTCACATGATGGCGGAAAACAAGCTCTTGAAACAGTGCAACGTCTCCTTCCCGTCCTCTGTCAGGCTCACGGATTGACTCCTCAGCAGGTCGTCGCAATTGCATCACATGATGGAGGCAAACAAGCTTTAGAAACAGTACAAAGACTATTGCCCGTTCTTTGCCAAGCGCATGGGTTAACTCCCGAACAAGTCGTTGCCATTGCAAGTCACGACGGAGGTAAACAAGCTCTCGAAACGGTTCAAGCACTTTTACCCGTTCTCTGTCAAGCACATGGACTCACACCTGAACAAGTAGTTGCTATCGCATCGAATGGAGGTGGAAAACAAGCACTGGAAACTGTACAAAGACTTTTGCCAGTTTTATGTCAAGCGCACGGTCTTACTCCTCAACAAGTTGTCGCCATTGCCTCTAACGGTGGTGGAAAACAAGCTCTTGAAACTGTCCAGAGACTTCTGCCCGTTCTATGTCAGGCTCATGGGCTAACCCCTCAACAGGTTGTTGCAATCGCATCTAATGGAGGAGGAAAACAAGCTTTAGAAACTGTCCAACGACTACTGCCCGTTCTCTGCCAAGCACACGGACTTACCCCACAACAAGTTGTGGCAATAGCTTCTAATTCTGGTGGTAAACAAGCCCTTGAGACGGTTCAAAGACTTCTACCAGTTCTTTGTCAGGCACATGGATTGACCCCACAACAGGTCGTAGCAATCGCATCTAATGGAGGTGGTAAGCAAGCTCTAGAAACGGTACAAAGATTACTTCCCGTGCTTTGTCAAGCTCATGGACTCACTCCTCAACAAGTGGTCGCTATTGCAAGTCATGATGGTGGAAAGCAAGCACTAGAAACCGTCCAACGACTCCTTCCTGTTCTCTGTCAAGCACATGGTCTTACGCCCGAACAAGTTGTTGCTATAGCTTCGAACGGAGGTGGAAAACAAGCTCTCGAAACCGTCCAAAGGCTCCTCCCAGTACTTTGCCAAGCACATGGATTAACCCCTGAGCAAGTAGTTGCAATTGCCTCGCACGACGGAGGAAAGCAAGCATTAGAAACTGTTCAGAGACTTTTGCCTGTCCTGTGTCAAGCCCACGGTCTAACACCACAACAAGTCGTCGCAATCGCTAGTAATGGAGGAGGTAGACCTGCATTGGAGTCGATAGTCGCACAACTATCACGACCTGATCCCGCTCTTGCAGCATTGACAAACGATCATTTAGTCGCACTTGCATGTTTAGGAGGACGACCAGCACTTGATGCCGTTAAGAAAGGACTACCGCACGCCCCTGCATTGATTAAAAGAACAAACAGACGAATCCCGGAGAGAACTTCACATCGTGTAGCCGATCATGCTCAAGTCGTAAGAGTTTTGGGTTTCTTCCAATGTCATTCCCACCCAGCTCAAGCTTTTGACGATGCAATGACTCAATTTGGAATGAGTAGACATGGACTCCTGCAATTATTTCGAAGGGTCGGAGTTACAGAGCTCGAAGCCAGGTCAGGAACGCTGCCCCCCGCATCTCAACGATGGGATAGAATTCTCCAAGCCTCTGGAATGAAAAGAGCTAAACCTTCACCAACGTCCACACAAACACCAGACCAAGCTTCTCTCCACGCTTTTGCCGACTCACTAGAGAGAGATCTAGATGCACCGTCACCTATGCATGAAGGAGACCAAACAAGAGCCTCTTCAAGAAAACGTTCTCGTTCTGATAGAGCTGTCACTGGACCTTCCGCCCAACAATCTTTCGAAGTCCGAGTTCCTGAGCAACGAGATGCCCTACACCTGCCTTTGCTTTCTTGGGGAGTTAAGCGACCACGTACTAGAATTGGTGGACTACTCGATCCAGGTACACCAATGGATGCTGATCTCGTTGCTTCCTCTACCGTAGTATGGGAGCAAGACGCAGACCCCTTCGCTGGAACTGCTGACGATTTCCCAGCCTTTAACGAGGAAGAATTGGCTTGGTTAATGGAACTTCTACCGCAATGA
合成的基因直接被连入pET300(invitrogen)质粒。表达出来的全长蛋白，N端有6个组氨酸标签，用于蛋白纯化时通过镍柱的亲和纯化。全长蛋白序列如下(SEQ ID NO：2)：
MHHHHHHITSLYKKAGLMDPIRSRTPSPARELLSGPQPDGVQPTADRGVSPPAGGPLDGLPARRTMSRTRLPSPPAPSPAFSADSFSDLLRQFDPSLFNTSLFDSLPPFGAHHTEAATGEWDEVQSGLRAADAPPPTMRVAVTAARPPRAKPAPRRRAAQPSDASPAAQVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNSGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVADHAQVVRVLGFFQCHSHPAQAFDDAMTQFGMSRHGLLQLFRRVGVTELEARSGTLPPASQRWDRILQASGMKRAKPSPTSTQTPDQASLHAFADSLERDLDAPSPMHEGDQTRASSRKRSRSDRAVTGPSAQQSFEVRVPEQRDALHLPLLSWGVKRPRTRIGGLLDPGTPMDADLVASSTVVWEQDADPFAGTADDFPAFNEEELAWLMELLPQ
dHax3全长蛋白的纯化图如图5所示(利用6×组氨酸标签经由镍柱亲和层析纯化，SDS-PAGE电泳后经考马斯亮蓝显色)。
通过蛋白质二级结构预测，发明人发现蛋白质的N端和C端都有一大段没有二级结构区域。这些区域不适合蛋白质结晶，发明人于是设计了截短体蛋白(dHax3截短体，标记为dHax3-Δ)，包含蛋白序列230-721)来获得性质更加稳定的蛋白质。dHax3截短体被克隆到pET21(Novagen)表达载体中。表达出来的dHax3截短体蛋白序列如下，其中C端含有His6标签，用于蛋白纯化时通过镍柱的亲和纯化(SEQ ID NO：3)：
MQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNSGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKLEHHHHHH
dHax3截短体蛋白的纯化图如图6所示(利用Histidine6标签经由镍柱亲和层析纯化，SDS-PAGE电泳后经考马斯亮蓝显色)。
3.dHax3-NN-Δ的构建与表达
发明人还构建并表达了dHax3-NN-Δ蛋白用于与含有CpG岛的DNA序列的共结晶实验。
表2显示了实验中涉及的TALE重复单元的RVD与其识别的DNA对应关系：
实施例2：获得dHax3晶体结构以及dHax3-Δ与双链DNA的复合物晶体结构
●单双链DNA的获得
为了检验dHax3与单双链DNA的结合能力，以及获得蛋白质与dsDNA复合物的晶体，发明人通过化学合成的方法得到单链DNA(17nt)：(Invitrogen&Takara)
5’TG TCCCTTTATCTCT CT 3’(SEQ ID NO：4)
3’AC AGGGAAATAGAGA GA 5’(SEQ ID NO：5)
将合成得到的单链DNA溶解至1mM，等摩尔比将两条单链DNA混合，85℃温浴3min以上，缓慢降温到22℃，此过程不得少于3个小时。为了长期保存退火的双链DNA可以进行冻干超低温保存。
●复合物结晶的获得
将纯化好的dHax3截短体蛋白(全长序列中的231-721)调整蛋白浓度在6～7mg/ml，加入摩尔比1.5∶1的退火后的双链DNA，4℃孵育30min.
前期的结晶条件筛选主要是基于商业化的Screen Kit，包括：Hampton公司的SaltRX，Natrix，PEG/Ion，Crystal Screen，Index；Emerald公司的Wizard I，II，III；Molecular dimension的ProPlex。
从上述Kit中筛选出蛋白结晶的条件，通过调节沉淀剂浓度，种类；盐离子的浓度和种类；缓冲液的浓度和种类优化结晶条件。使用Addtive Screen和Detergent ScreenKit对晶体进行优化。同时对晶体进行脱水，退火等尝试，以提高晶体的衍射质量。
使用蛋白质结晶没有规律可循，所以到目前为止仍然还是一门艺术。起始阶段常用Sparse matrix screen，即购买各公司配置的结晶条件进行筛选。大多数情况下，初筛得到的结晶条件中并不能长出衍射质量高的晶体，在接下来的实验中，发明人又进一步对初始结晶条件的基础上进一步细化，包括调整沉淀剂、pH缓冲液、盐、添加还原剂、去垢剂或醇；调整结晶实验的温度，时间等。最后采用的结晶条件为将如下结晶母液与孵育好的蛋白核酸复合物通过1∶1的体积比混合，通过悬滴法(hanging drop vapor diffusion method)在18℃培养两天，即可获得晶体。
结晶母液：8-10％PEG3350(w/v)，12％ethanol，0.1M MES pH 6.0。
●数据收集及处理
使用上海同步辐射中心(SSRF)BL17U线束站或者日本SPRING-8BL41XU线束站进行数据收集。所有收集的衍射数据用HKL2000软件进行积分计算，进一步的数据处理通过CCP4软件实现。使用不结合DNA的dHax3作为置换的模式，通过分子置换的方法，解析dHax3与DNA复合物的结构。最后使用Phenix和COOT两个软件完成对结构的修正处理。数据处理和结构解析、修正完成之后，dHax3蛋白的结构分辨率达到dHax3蛋白与dsDNA＝复合物结构达到数据收集和结构修正的统计数据，见下表：
表3dHax3晶体结构以及dHax3-Δ与双链DNA的复合物晶体结构的数据收集和结构修正的统计数据
发明人解析了dHax3-Δ与双链DNA(dsDNA)的高分辨率晶体结构(1.8埃)。该结构清晰地展示了dHax3展现右手螺旋结构，将dsDNA包裹于整个复合体的中间。蛋白质缠绕在DNA外面，嵌入DNA的大沟(见图1)。
结构显示位于每个重复序列中第12位氨基酸(组氨酸/天冬酰胺)并不直接与DNA直接相互作用，相反它们都会与自身所在的重复序列的第8个氨基酸(丙氨酸)的主链氧原子形成一个氢键，从而起到固定整个RVD所在环的作用。
每个重复序列中的第13位氨基酸，如果是丝氨酸/天冬氨酸，那么它们与DNA中的碱基形成氢键直接相互作用；如果是甘氨酸，那么它与胸腺嘧啶的甲基之间形成范德华力相互作用(见图2)。
实施例3.获得dHax3-Δ与dHax3-5mC的复合物晶体结构以及dHax3-NN-Δ与dHax3-CpG的复合物晶体结构
如图3所示，胸腺嘧啶(T)与5-甲基胞嘧啶(5mC)表示5-甲基胞嘧啶都在第五位有甲基，而此甲基是与NG识别唯一的基团，因此，NG可能识别5mC。据此，发明人设计了DNA序列dHax-5mC(图4a)
5’ TCCT5mCTA5mCCTC5mC 3’(SEQ ID NO：6)
3’ AGGA GAT GGAG G 5’(SEQ ID NO：7)
为了研究dHax3-NN变体CpG岛的识别能力，对发明人设计了DNA序列dHax3-CpG
5’TG TCCCTT(mC)G(mC)GTCTCT 3’(SEQ ID NO：8)
3′AC AGGGAA GC GCAGAGA 5′(SEQ ID NO：9)
采用实施例2中所述的方法，发明人获得并解析了两种复合物晶体结构，数据收集和结构修正的统计数据如表4所示。
表4dHax3-Δ与dHax3-5mC的复合物晶体结构以及dHax3-NN-Δ与dHax3-CpG的复合物晶体结构的数据收集和结构修正的统计数据
发明人解析了dHax3蛋白与含有3个5mC的DNA的复合物结构，分辨率高达1.85埃。高分辨率的结构清晰地揭示了dHax3蛋白识别mC的分子机理(图4c)。
图8显示了dHax3-NN变体的DNA结合结构域与含有两个甲基化CpG岛DNA的晶体结构示意图，其证实了dHax3-NN-Δ结合含有两个甲基化CpG岛DNA。在哺乳动物细胞中，DNA甲基化只发生在CpG岛中的C上。申请人解析了TALE与含有两个CpG岛的DNA序列的晶体结构示意图，进一步证明TALE对于甲基化修饰的DNA具有特异的识别能力。这对于TALE应用的拓展具有十分重要的意义。
实施例4.凝胶阻滞实验验证dHax3与具有5-甲基胞嘧啶(5mC)的DNA双链的结合能力
●EMSA(electrophoretic mobility shift assay，电泳迁移率变动分析，又称凝胶阻滞实验)
凝胶阻滞实验是一种体外研究DNA/RNA与蛋白质相互作用的特殊的凝胶电泳技术。其基本原理为：在凝胶电泳中，由于电场的作用，小分子的核酸片段比其结合了蛋白质的核酸片段向阳极移动的速度快。因此，可标记短的核酸片段，将其与蛋白质混合，对混合物进行凝胶电泳，若目的DNA与特异性蛋白质结合，其移动的速度受到阻滞，对凝胶进行放射自显影，就可以找到核酸结合蛋白。同时通过统计结合蛋白的DNA和未结合蛋白的DNA的量，可以比较准确的拟合计算出，蛋白质对核酸的结合能力(binding affinity)。
●DNA/DNA oligo
用于凝胶阻滞实验的DNA/DNA oligo的片段，如下表5所示：
表5用于凝胶阻滞实验的DNA/DNA oligo的片段序列
1表示甲基化胞嘧啶
识别序列突出显示。
●DNA/RNA末端标记
按照上表设置好反应体系后，轻轻混匀，置于37℃孵育30min；使用G25预装脱盐层析柱出去多余的[γ-32p]-ATP，加入过量的未标记的互补链，退火生成双链DNA或者DNA-RNA杂合双链。
●DNA/RNA和蛋白相互作用体系
将反应成分按上述比例加入反应体系中，混匀后4℃孵育20min；
将反应好的样品跑6％非变性胶；
跑完胶用干胶仪将胶干透，放在磷屏上曝光过夜；
用Typhoon 9400varible scanner读取图像数据。
通过EMSA检测了dHax3蛋白与具有5-甲基胞嘧啶(5mC)的DNA的相互作用。结合能力没有明显减弱(详见图4b)。图7显示dHax3中的一种RVD——NG——不能结合没有甲基化修饰的胞嘧啶；而dHax3中的一种RVD——HD——对于胞嘧啶(C)是特异性的识别，并且胞嘧啶的甲基化修饰会影响HD与胞嘧啶的识别。
尽管在本文中参考示例性的实施方案详细描述了本发明，但是应当理解的是，本发明不限于所述实施方案。具有本领域普通技能且可获取本文教导的人员会认识到在本发明范围内的其它变化、修改和实施方案。因此，本发明应与后面所述的权利要求一致地被广义地解释。

Claims (5)

1. TALE蛋白变体在制备用于检测DNA中的胞嘧啶甲基化的试剂中的用途，其中所述TALE蛋白变体选自：RVD为HD、NG或NN的TALE蛋白。
2.权利要求1的用途，其中采用两种不同的TALE蛋白变体的重组蛋白，分别特异性识别靶标序列中的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶。
3.权利要求1或2的用途，其中所述用途用于检测CpG岛的甲基化。
4.权利要求1或2的用途，其用于特异性识别DNA中的5-甲基胞嘧啶。
5. TALE蛋白变体在制备用于诊断或治疗癌症的药物中的用途，所述诊断或治疗是通过特异性识别DNA中的5-甲基胞嘧啶来进行的，其中所述TALE蛋白变体选自：RVD为HD、NG或NN的TALE蛋白。
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