CN117866923A - 一种LdCsm突变型复合物、含该突变型复合物的检测系统及其应用 - Google Patents
一种LdCsm突变型复合物、含该突变型复合物的检测系统及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因工程和生物技术领域，具体涉及一种LdCsm突变型复合物、含该突变型复合物的检测系统及其应用。具体的，本发明提供一种突变型的Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus(Ld)的III‑A亚型Csm复合物，以及包含上述突变型复合物以及更易被LdCsm切割的ssDNA报告子的检测系统、检测试剂盒，及在RNA检测中的应用。经试验验证，上述带有突变的LdCsm复合物相比突变前可以产生更强的检测活性，可以产生更强的检测信号。同时报告DNA链的序列受到LdCsm切割活性的偏好，用于检测系统时可以产生更强的检测信号，从而提高其实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和生物技术领域，具体涉及一种LdCsm突变型复合物、含该突变型复合物的检测系统及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR associated)系统是一种原核生物中的获得性免疫系统，Cas蛋白与crRNA组装成核酸蛋白效应复合物，并在crRNA介导下特异性的结合并降解外来的核酸，实现对外来感染的防御(Barrangou R et al.,2007；Horvath P et al.,2010)。III型CRISPR-Cas10系统属于1类CRISPR-Cas系统，其效应复合物由多个Cas蛋白组成，大亚基Cas10是其标志性蛋白，在其介导的免疫作用中发挥主要的作用。III型CRISPR-Cas10系统的效应复合物主要发挥三种活性，包括：(1)骨架蛋白Cas7(Csm3/Cmr4)对于和crRNA配对的目标RNA的以6nt为间隔的切割活性；(2)由目标RNA激活的大亚基Cas10(Csm1/Cmr2)的HD结构域介导的ssDNA切割活性；(3)由目标RNA激活的大亚基Cas10的Palm结构域介导的cOA合成活性。
近年鉴定的来自一株保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckiisubsp.Bulgaricus,Ld)的III-A型Csm(LdCsm)系统是一种特殊的CRISPR-Cas10系统。该系统的Cas10(Csm1)亚基与其他III型系统的Cas10亚基进化关系较远，在效应复合物被目标RNA激活时其Palm结构域没有cOA合成活性，同时其HD结构域的ssDNA切割活性很强。依据这一原理，使用LdCsm识别目标RNA后激活的ssDNA切割活性去切割荧光淬灭的ssDNA报告子，可以将对目标RNA的特异性识别转化为可检测的荧光信号，可用于核酸检测。通过对LdCsm的骨架蛋白Csm3进行失活突变，构建LdCsm-dCsm3突变体复合物，还可以通过减少目标RNA的切割增强大亚基Csm1的活性，产生更强的检测效果。
尽管相关文献报道展示的技术方案(Lin et al.,2021)显示了LdCsm系统在RNA检测方面的良好前景，但发明人发现，其仍没有对LdCsm的潜力进行彻底的挖掘。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明目的在于提供一种突变型的Lactobacillusdelbrueckii subsp.Bulgaricus(Ld)的III-A亚型Csm(LdCsm)复合物，以及包含上述突变型复合物以及更易被LdCsm切割的单链DNA(ssDNA)报告子的检测系统、检测试剂盒，及在RNA检测中的应用。经试验验证，上述带有突变的LdCsm复合物相比突变前可以产生更强的检测活性，可以产生更强的检测信号。同时报告DNA链的序列受到LdCsm切割活性的偏好，用于检测系统时可以产生比其他序列的报告DNA链更强的检测信号，从而提高其实际应用之价值。
本发明通过研究发现，位于LdCsm复合物Csm1亚基HD结构域中负责与ssDNA底物结合的三个亚结构域，包括HD-L1,HD-L2和HD基序，通过试验首次证明，改变HD-L1,HD-L2的长度和内部氨基酸电荷水平可以调节LdCsm的DNase活性，进而实现检测效率的优化。因此本发明的第一个方面，提供一种LdCsm突变型复合物，所述LdCsm突变型复合物是在野生型LdCsm的大亚基LdCsm1的两个亚结构域HD-L1和HD-L2中的任意一个或多个氨基酸发生替换、截短或插入后突变获得；
其中，在序列上，所述亚结构域HD-L1包括第58～78位氨基酸，分布在LdCsm1四号和五号α螺旋序列之间，所述亚结构域HD-L2包括第92～114位氨基酸，分布在LdCsm1五号α螺旋序列的C端下游，包含一段GxDRR基序；在结构上，所述HD-L1和HD-L2位于HD结构域的催化中心两侧。
具体的，所述LdCsm突变型复合物为如下任意一种或多种：
一种LdCsm突变型复合物LdCsm-dCsm3-Csm1E98AE99A，其由Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5五种蛋白亚基以及crRNA组装而成，其中Csm3亚基的第34位氨基酸由天冬氨酸(Asp，D)突变为丙氨酸(Ala，A)，Csm1亚基的第98和第99位氨基酸由谷氨酸(Glu，E)突变为丙氨酸(Ala，A)；或，
一种LdCsm突变型复合物LdCsm-dCsm3-Csm1A705K，其由Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5五种蛋白亚基以及crRNA组装而成，其中Csm3亚基的第34位氨基酸由天冬氨酸(Asp，D)突变为丙氨酸(Ala，A)，Csm1亚基的第705位氨基酸由丙氨酸(Ala，A)突变为赖氨酸(Lys，K)；或，
一种LdCsm突变型复合物LdCsm-dCsm3-Csm1E776K，其由Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5五种蛋白亚基以及crRNA组装而成，其中Csm3亚基的第34位氨基酸由天冬氨酸(Asp，D)突变为丙氨酸(Ala，A)，Csm1亚基的第776位氨基酸由谷氨酸(Glu，E)突变为赖氨酸(Lys，K)。
本发明的第二个方面，提供一种检测系统，所述检测系统至少包含上述LdCsm突变型复合物。
所述检测系统还包括ssDNA报告子，具体的，所述报告子长度为15nt，具有如SEQID NO.7(5’-CTCTCCTCCTTCTTC-3’)所示的序列；进一步的，所述ssDNA报告子修饰有荧光基团和荧光淬灭基团，在本发明的一个具体实施方式中，所述ssDNA报告子的5’端修饰FAM荧光基团，3’端修饰BHQ1荧光淬灭基团。相比5’-FAM-TTTTTTTTTTTTTTTT-BHQ1-3’报告子，5’-FAM-CTCTCCTCCTTCTTC-BHQ1-3’更易被激活后的LdCsm系统切割，在基于LdCsm的检测系统中使用时释放的检测信号更强。
本发明的第三个方面，提供一种RNA检测试剂盒，所述检测试剂盒包含上述LdCsm突变型复合物或者上述检测系统。
本发明的第四个方面，提供上述LdCsm突变型复合物、检测系统、RNA检测试剂盒在制备RNA检测制剂或在制备表达目标RNA的病原体检测制剂中的应用。
本发明的第五个方面，提供一种RNA的检测方法，所述检测方法包括将向待测样本中加入上述LdCsm突变型复合物、检测系统或RNA检测试剂盒进行反应，从而分析待测样本中RNA的有无或浓度。本领域技术人员知晓，所述检测方法显然可以不涉及疾病的诊断和治疗。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案提供三种突变型的Lactobacillus delbrueckiisubsp.Bulgaricus(Ld)的III-A亚型Csm(LdCsm)复合物及其表达体系，一种ssDNA报告子，以及分别包含这三种复合物的和包含该报告子的检测系统。
上述技术方案通过试验证明，三种突变型复合物具有更高的ssDNA切割效率，在识别相同浓度目标RNA后产生的检测信号更强，更有利于检测，可以替代LdCsm-dCsm3复合物。上述技术方案使用的ssDNA报告子的序列更受LdCsm复合物的ssDNA切割活性的偏好，用于检测时可以产生更强的检测信号，更有利于检测，因此可以替代5’-FAM-TTTTTTTTTTTTTTTT-BHQ1-3’ssDNA报告子，具有良好的实际应用之价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明与LdCsm1同源的不同III-A系统的Csm1亚基氨基酸序列的比对结果。虚线框标出HD基序(HD motif)，HD-L1和HD-L2的位置。三角号标出LdCsm1序列。在HD-L1/L2内部，实线框标出带电荷氨基酸的位置。
图2为本发明LdCsm1亚基的拟合结构。实线框标出HD结构域的催化中心，HD基序(HDmotif)位于其中央，HD-L1和HD-L2位于其两侧。虚线框标出HD-L1和HD-L2。HD-L1/L2中的带电荷氨基酸按所在位置进行了标注。
图3为本发明野生型LdCsm与不同LdCsm-Csm1X突变型复合物的ssDNA切割活性的比较。(A)HD-L1/L2截短的突变体；(B)HD-L1/L2内部带电荷氨基酸替换的突变体。Blank代表空白组，即不加LdCsm复合物。WT代表加野生型LdCsm复合物。以野生型LdCsm的ssDNA切割活性为100％。
图4为本发明MST实验分析结果。(A)在不结合目标RNA(Apo)，结合NTR，和结合CTR三种状态下，野生型(WT)LdCsm的ssDNA底物结合能力的差异；(B)在结合CTR的状态下，野生型(WT)LdCsm与不同LdCsm-Csm1X突变型复合物的ssDNA结合能力的差异。
图5为本发明在LdCsm-dCsm3反应体系中使用polyT报告子或CT报告子时产生的检测信号。
图6为本发明使用LdCsm-dCsm3(dCsm3)或LdCsm-dCsm3-Csm1E98AE99A(dCsm3-Csm1E98AE99A)对不同浓度目标RNA进行检测时的检测效率。
图7为本发明使用LdCsm-dCsm3(dCsm3)，LdCsm-dCsm3-Csm1A705K(dCsm3-Csm1A705K)或LdCsm-dCsm3-Csm1E776K(dCsm3-Csm1E776K)对目标RNA进行检测时检测效率的比较。以LdCsm-dCsm3(dCsm3)的效率为100％。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
如前所述，现有技术(Lin et al.,2021)仍没有对LdCsm的潜力进行彻底的挖掘。首先，对于LdCsm复合物本身的优化并不充分，只通过失活骨架蛋白Csm3亚基间接提高了Csm1亚基的活性，但对于直接提供ssDNA切割活性的Csm1亚基，却并没有进行进一步的改造和优化。如果对于Csm1负责介导ssDNA切割的HD结构域以及与目标RNA结合的有关区域进行改造，有可能获得活性更高的LdCsm突变体复合物；其次，虽然通过5’FAM-TTTTTTTTTTTTTTTT-BHQ13’，成功将LdCsm识别目标RNA后激活的ssDNA切割活性转化为了荧光检测信号，但并没有考虑LdCsm对ssDNA切割时的序列偏好性。如果使用更易于被LdCsm切割的序列合成ssDNA报告子，由于其被LdCsm切割的效率更高，检测信号的释放效率也会提高。
有鉴于此，本发明立足于使用LdCsm系统进行RNA检测的原理，从以下三个角度对检测系统进行了改造：(1)由于LdCsm系统被激活后用于产生检测信号的活性来自于LdCsm1亚基HD结构域介导的DNase活性，因此HD结构域催化中心对底物ssDNA的结合能力必然影响对ssDNA的切割能力，与检测信号的强弱直接相关。本发明通过序列比对和结构拟合的分析方式，筛选了HD催化中心附近可能影响ssDNA底物结合的区域，选出了其中的带电荷氨基酸残基，并以突变的方式验证了它们电荷水平的变化是否影响LdCsm复合物ssDNA切割活性的强弱；(2)由于LdCsm系统通过识别、结合目标RNA被激活，因此目标RNA与LdCsm的结合能力强弱必然影响LdCsm的激活状态是否稳定，这也关系到其是否能更好的产生检测信号。本发明通过序列比对和结构拟合的分析方式，筛选了LdCsm1亚基中可能影响目标RNA结合能力的氨基酸残基，并以突变的方式验证了对它们的电荷水平进行改变是否能促进LdCsm的ssDNA切割活性；(3)由于LdCsm检测系统产生的检测信号来自荧光淬灭ssDNA报告子被切开后释放的荧光信号，HD催化中心对ssDNA底物进行切割的序列偏好性必然导致其对不同序列的ssDNA报告子产生不同的切割效率。本发明通过比较LdCsm系统对不同ssDNA序列进行切割的产物条带，总结了其序列偏好性并设计了新的荧光淬灭ssDNA报告子的序列。
经以上研究，针对改造思路(1)，本发明发现了LdCsm复合物位于大亚基LdCsm1HD结构域内部含有负责与ssDNA底物结合的三个亚结构域，即：HD-L1,HD-L2和HD基序。这三个亚结构域对于ssDNA底物与LdCsm1 HD结构域活性位点的结合缺一不可。目标RNA被LdCsm复合物识别后，导致其大亚基LdCsm1变构，这一过程中其HD结构域DNase活性位点包括HD-L1,HD-L2和HD基序发生重构，使HD活性位点可以结合和捕获ssDNA底物，导致了DNase活性的激活，可以对ssDNA进行切割。其中HD-L1和HD-L2可以通过长度和内部氨基酸电荷水平的变化影响LdCsm复合物ssDNA切割活性的强弱。因此，对这两段loop区域的长度或内部的氨基酸残基的电荷水平进行改造可以实现对LdCsm复合物ssDNA切割活性的优化。
结合改造思路(1)～(3)的优化结果，本发明提供了三种突变型的Lactobacillusdelbrueckii subsp.Bulgaricus(Ld)的III-A亚型Csm(LdCsm)复合物及其表达体系，一种ssDNA报告子，以及分别包含这三种复合物的和包含该报告子的检测系统。本发明的三种突变型复合物具有更高的ssDNA切割效率，在识别相同浓度目标RNA后产生的检测信号更强，更有利于检测，可以替代LdCsm-dCsm3复合物。本发明使用的ssDNA报告子的序列更受LdCsm复合物的ssDNA切割活性的偏好，用于检测时可以产生更强的检测信号，更有利于检测，可以替代5’-FAM-TTTTTTTTTTTTTTTT-BHQ1-3’ssDNA报告子。
具体的，本发明找到了LdCsm复合物中位于大亚基LdCsm1的HD结构域中三个负责结合ssDNA底物的亚结构域，包括两段loop区域HD-L1和HD-L2，以及HD活性中心的高保守性的HD基序。序列上，HD-L1包含从第58位组氨酸(His，H)到第78位丝氨酸(Ser，S)的共21个氨基酸，位于LdCsm1亚基第4号和第5号α螺旋结构编码区的间隔区；HD-L2包含从第92位甘氨酸(Gly，G)到第114位异亮氨酸(I，Ile)的共23个氨基酸，位于LdCsm1亚基第5号α螺旋结构编码区的C端下游，包含一段GxDRR基序；HD基序包含第15位组氨酸和第16位天冬氨酸(Asp，D)两个氨基酸，位于LdCsm1亚基第1号和第2号α螺旋结构编码区的间隔区。结构上，HD-L1和HD-L2位于LdCsm1亚基HD结构域的催化中心的两侧，HD基序位于HD结构域催化中心的中央。
首先，证明了这三个亚结构域对于ssDNA的结合必不可少；第二，证明靶标RNA结合LdCsm导致了其HD结构域DNase活性位点，包括HD-L1,HD-L2和HD基序的重构，使得活性位点可以结合、捕捉ssDNA底物，最终激活DNase活性并切割报告子，实现核酸检测的目的；第三，证明了对HD-L1和HD-L2的长度和内部电荷水平进行改变时，可以对HD结构域的DNase活性产生影响，从而实现活性优化和检测效率优化的目的。
因此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种LdCsm突变型复合物，所述LdCsm突变型复合物是在野生型LdCsm的大亚基LdCsm1的两个亚结构域HD-L1和HD-L2中的任意一个或多个氨基酸发生替换、截短或插入后突变获得；
其中，在序列上，所述亚结构域HD-L1包括第58～78位氨基酸，分布在LdCsm1四号和五号α螺旋序列之间，所述亚结构域HD-L2包括第92～114位氨基酸，分布在LdCsm1五号α螺旋序列的C端下游，包含一段GxDRR基序；在结构上，所述HD-L1和HD-L2位于HD结构域的催化中心两侧。
本发明的又一具体实施方式中，所述LdCsm-Csm1X突变型复合物通过三种质粒pUCE-S1，p15AIE-Cas-Csm1X和pET30a-Csm2在Escherichia coli BL21(DE3)菌株中表达合成；其中，LdCsm-Csm1X中的X表示位于HD-L1、HD-L2或HD基序内部的突变X，包括截短突变d-L1b(删除I74～E76)，d-L1c(删除A72～E76)，d-L1d(删除N68～L69和A72～E76)，d-L2c(删除E98～K102)和d-L2d(删除E98～G104)，以及氨基酸替换突变D16N(HN)，E63A，K65A，K66A，K65AK66A，R70A，E73AE76A，D94A，R95AR96A，E98AE99A(2E)，K102A，D106A，D113A和D113N中的任意一种。
本发明的又一具体实施方式中，所述LdCsm突变型复合物为如下任意一种或多种：
一种LdCsm突变型复合物LdCsm-dCsm3-Csm1E98AE99A，其由Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5五种蛋白亚基以及crRNA组装而成，其中Csm3亚基的第34位氨基酸由天冬氨酸(Asp，D)突变为丙氨酸(Ala，A)，Csm1亚基的第98和第99位氨基酸由谷氨酸(Glu，E)突变为丙氨酸(Ala，A)；或，
一种LdCsm突变型复合物LdCsm-dCsm3-Csm1A705K，其由Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5五种蛋白亚基以及crRNA组装而成，Csm3亚基的第34位氨基酸由天冬氨酸(Asp，D)突变为丙氨酸(Ala，A)，Csm1亚基的第705位氨基酸由丙氨酸(Ala，A)突变为赖氨酸(Lys，K)；或，
一种LdCsm突变型复合物LdCsm-dCsm3-Csm1E776K，其由Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5五种蛋白亚基以及crRNA组装而成，其中Csm3亚基的第34位氨基酸由天冬氨酸(Asp，D)突变为丙氨酸(Ala，A)，Csm1亚基的第776位氨基酸由谷氨酸(Glu，E)突变为赖氨酸(Lys，K)。
上述Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5与crRNA的化学计量关系为Csm1123344151:crRNA1。
本发明的又一具体实施方式中，Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5与crRNA的空间关系为Csm3(约4个)和Csm2(约3个)亚基沿crRNA形成双螺旋状的骨架，Csm1(约1个)亚基与Csm4(约1个)亚基结合在(1个)crRNA的5’端，Csm5(约1个)亚基结合在(同一个)crRNA的3’端。
本发明的又一具体实施方式中，crRNA的长度为34～38个碱基，5’端前8个碱基序列为5’-ACGAGAAC-3’。其余碱基与需要检测的目标RNA匹配。
本发明的又一具体实施方式中，所述LdCsm-dCsm3-Csm1E98AE99A突变型复合物通过三种质粒pUCE-X，p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1E98AE99A和pET30a-Csm2在Escherichiacoli BL21(DE3)菌株中表达合成；其中，pUCE-X质粒中，X表示目标RNA。
本发明的又一具体实施方式中，所述LdCsm-dCsm3-Csm1A705K突变型复合物通过三种质粒pUCE-X，p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1A705K和pET30a-Csm2在Escherichia coliBL21(DE3)菌株中表达合成；其中，pUCE-X质粒中，X表示目标RNA。
本发明的又一具体实施方式中，所述LdCsm-dCsm3-Csm1E776K突变型复合物通过三种质粒pUCE-X，p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1E776K和pET30a-Csm2在Escherichia coliBL21(DE3)菌株中表达合成；其中，pUCE-X质粒中，X表示目标RNA。
本发明的又一具体实施方式中，pUCE-X质粒的构建方法包括：(1)根据目标RNA X选定Spacer；(2)设计重叠延伸引物；(3)pUCE-X质粒的构建。最终获得表达crRNA的质粒pUCE-X。具体细节引用文献《Characterization of a novel type III CRISPR-Caseffector provides new insights into the allostericactivation andsuppression of the Cas10 DNase》(Lin et al.,2019,Cell Discovery)中pUCE-S1的构建方法。
本发明的又一具体实施方式中，合成菌株经IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactoside，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达前体crRNA，Cas6蛋白和Csm1、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5五种蛋白亚基。Cas6蛋白将前体crRNA切割为单体crRNA，单体crRNA与Csm1、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5五种蛋白亚基组装形成成熟的复合物。复合物的表达与纯化方法参考文献《Characterization of a novel type III CRISPR-Caseffector providesnew insights into the allostericactivation and suppression of the Cas10DNase》中LdCsm的纯化方法。纯化获得的产品蛋白浓度为1～1.3mg/ml，摩尔浓度为4100nM，工作浓度为50～100nM。
E98E99残基位于LdCsm复合物LdCsm1亚基中提供ssDNA切割活性的HD结构域一侧的loop内部，该结构可能影响ssDNA底物与HD结构域的结合。LdCsm1E98AE99A突变可能通过促进ssDNA底物与HD结构域的结合提高了对ssDNA底物的切割效率。A705和E776残基位于LdCsm复合物LdCsm1亚基中与目标RNA相邻近的位置，可能影响目标RNA与LdCsm复合物的结合。A705K或E776K突变可能通过促进目标RNA与LdCsm复合物的结合使得激活状态更加稳定，进而促进了对ssDNA底物的切割效率。总而言之，LdCsm-dCsm3-Csm1E98AE99A，LdCsm-dCsm3-Csm1A705K和LdCsm-dCsm3-Csm1E776K突变型复合物被目标RNA激活后的ssDNA切割活性比LdCsm-dCsm3更高，用于检测时产生的检测信号更强。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种检测系统，所述检测系统至少包含上述LdCsm突变型复合物的其中一种。
所述检测系统还包括ssDNA报告子，具体的，所述报告子长度为15nt，具有如SEQID NO.7(5’-CTCTCCTCCTTCTTC-3’)所示的序列；进一步的，所述ssDNA报告子修饰有荧光基团和荧光淬灭基团，在本发明的一个具体实施方式中，所述ssDNA报告子的5’端修饰FAM荧光基团，3’端修饰BHQ1荧光淬灭基团。相比5’-FAM-TTTTTTTTTTTTTTTT-BHQ1-3’报告子，5’-FAM-CTCTCCTCCTTCTTC-BHQ1-3’更易被激活后的LdCsm系统切割，在基于LdCsm的检测系统中使用时释放的检测信号更强。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种RNA检测试剂盒，所述检测试剂盒包含上述LdCsm突变型复合物或者上述检测系统。
本发明的又一具体实施方式中，所述检测试剂盒还包括反应缓冲液，所述反应缓冲液包括10×反应Buffer，所述10×反应Buffer中包含Tris-Cl、MgCl2、KCl和牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)。在一个具体地实施方式中，10×反应Buffer的成分为500mM Tris-Cl(pH 6.8)，100mM MgCl2，500mM KCl，1mg/ml牛血清白蛋白。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述LdCsm突变型复合物、检测系统、RNA检测试剂盒在制备RNA检测制剂或在制备表达目标RNA的病原体检测制剂中的应用。
所述检测制剂可以为药物。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种RNA的检测方法，所述检测方法包括将向待测样本中加入上述LdCsm突变型复合物、检测系统或RNA检测试剂盒进行反应，从而分析待测样本中RNA的有无或浓度。所述反应温度可以为30-40℃(如37℃)；本领域技术人员知晓，所述检测方法显然可以不涉及疾病的诊断和治疗。
需要说明的是，本发明能够检测的目标RNA包括但不限于天然RNA、DNA体外转录产生的RNA、以及DNA经过体外扩增后再经过体外转录产生的RNA。
下面结合实施例对本发明进一步说明。下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围中。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性前提下，任何对本发明的变化都归属本发明的保护范围。同时下述实施例中的目标RNA仅用于展示检测效果。
本发明涉及的序列如表1-3中所示。
表1本发明中使用或涉及的RNA序列
*目标RNA中的3’antitag由下划线标出。CTR中的3’antitag与5’repeat tag不匹配，NTR中的3’antitag与5’repeat tag匹配‘。
表2本发明中涉及的DNA序列
注：标注下划线的部分与LdCsm-dCsm3-crRNA的5’端8个碱基同源。
表3本发明使用的引物
实施例1
本实施例的目的是介绍LdCsm复合物中位于大亚基的HD催化中心的HD基序，HD-L1和HD-L2三个亚结构域的序列和结构特点，并展示HD-L1和HD-L2对HD结构域介导的ssDNA切割活性的影响。
序列上，HD基序包含第15位组氨酸(His，H)和第16位天冬氨酸(Asp，D)，位于LdCsm1亚基第1号和第2号α螺旋结构编码区的间隔区；HD-L1包含从第58位组氨酸到第78位丝氨酸(Ser，S)间的共21个氨基酸，位于LdCsm1亚基第4号和第5号α螺旋结构编码区的间隔区；HD-L2包含从第92位甘氨酸(Gly，G)到第114位异亮氨酸(I，Ile)间的共23个氨基酸，位于LdCsm1亚基第5号α螺旋结构编码区的C端下游，包含一段GxDRR基序(图1)。结构上，HD基序位于LdCsm1亚基HD结构域催化中心的中央，HD-L1和HD-L2位于催化中心的两侧(图2)。HD-L2前后两端有保守的带电荷氨基酸，包括第94位天冬氨酸，第95和第96位精氨酸(Arg，R)，第106位天冬氨酸，和第113位天冬氨酸。HD-L1和HD-L2内部还有多个非保守的带电荷氨基酸残基，包括第63位谷氨酸(Glu，E)，第65和第66位赖氨酸(Lys，K)，第70位精氨酸，第73位谷氨酸，第76位谷氨酸，第98和第99位谷氨酸和第102位赖氨酸。
为验证HD-L1和HD-L2对LdCsm的ssDNA切割活性的影响，设计了以下突变，包括：(1)对HD-L1/L2进行截短，包括d-L1b(删除I74～E76)，d-L1c(删除A72～E76)，d-L1d(删除N68～L69和A72～E76)，d-L2c(删除E98～K102)和d-L2d(删除E98～G104)；(2)将HD-L2中保守的带电荷氨基酸残基突变为丙氨酸，包括D94A，R95AR96A，D106A和D113A；(3)将HD-L1/L2中带正电荷的非保守氨基酸残基突变为丙氨酸，包括K65AK66A，R70A和K102A；(4)将loop1/loop2中带负电荷的非保守氨基酸残基突变为丙氨酸，包括E63A，E73AE76A，E98AE99A。构建了带有这些突变“X”的质粒并表达了对应的LdCsm-Csm1X突变体复合物。
(1)p15AIE-Cas-Csm1X质粒的构建。
p15AIE-Cas-Csm1X质粒在p15AIE-Cas质粒基础上进行改造。p15AIE-Cas-Csm1X表达Csm1X，Csm2，Csm3，Csm4，Csm5五种构成LdCsm-Csm1X突变体复合物的蛋白亚基以及Cas6蛋白。
以申请人所在实验室保存的p15AIE-Cas质粒为模板，分别以引物对X-F/Csm5-R，和Csm5-F:X-R进行PCR扩增。引物订购自青岛擎科，序列见表3。使用Phanta polymerase进行扩增。胶回收纯化试剂盒购自康为世纪公司。反应体系和反应条件如下。
15-X-1片段，50μL PCR反应体系
Phanta polymerase 1μL
2×Phanta buffer 25μL
dNTP(10mM each) 1μL
p15AIE-Cas-Csm3D34A质粒0.2ng
X-F(10μM) 1μL
Csm5-R(10μM) 1μL
ddH2O up to 50μL
反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；延伸5min；结束反应，置于冰上待用。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在5100bp位置左右有条带，使用胶回收纯化试剂盒回收PCR产物，获得15-X-1片段。
15-X-2片段，50μL PCR反应体系
Phanta polymerase 1μL
2×Phanta buffer 25μL
dNTP(10mM each) 1μL
p15AIE-Cas质粒 0.2ng
Csm5-F(10μM) 1μL
X-R(10μM) 1μL
ddH2O up to 50μL
反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；延伸5min；结束反应，置于冰上待用。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在5100bp位置左右有条带，使用胶回收纯化试剂盒回收PCR产物，获得15-X-2片段。
15-X-1片段和15-X-2片段进行同源重组连接反应和转化。无缝克隆AssemblyMix购买自Thermo Scientific公司。E.coli DH5α感受态购买自上海唯地生物技术公司。抗生素购买自Coolaber公司。反应体系和反应过程如下。
15-X-1片段和15-X-2片段，10μL同源重组连接反应体系
15-X-1片段100ng
15-X-2片段100ng
2ⅹAssemblyMix 5μL
ddH2O up to 10μL
50℃反应20min，置于冰上待用。连接产物加入E.coli DH5α感受态，冰浴30min，42℃水浴热激90s，立即置于冰上冷却3min。无菌环境下加入800μL LB培养基，37℃220rpm孵育1h。菌液涂布氨苄青霉素(Amp)100μg/ml的平板，37℃倒置培养16h，获得单菌落。
p15AIE-Cas-Csm1X质粒的验证。质粒提取试剂盒购买自康为世纪公司。单菌落接种10ml LB(Amp 100μg/ml)，37℃220rpm培养16h，取1mL菌液保菌，其余菌液提取质粒。提取的质粒样品送青岛擎科生物公司测序，测序引物为C-S-F:C-S-R。经过测序结果与p15AIE-Cas的比对，确定成功获得了p15AIE-Cas-Csm1X质粒。
(2)LdCsm-Csm1X突变型复合物的纯化
LdCsm-Csm1X突变体复合物表达菌株的获得。E.coli BL21(DE3)感受态购买自上海唯地生物技术公司。抗生素购买自Coolaber公司。30ng p15AIE-Cas-Csm1X质粒，30ngpUCE-S1，以及30ng pET30a-Csm2质粒加入100μL E.coli BL21(DE3)感受态，冰浴30min，42℃水浴热激90s，立即置于冰上冷却3min。无菌环境下加入800μL LB培养基，37℃220rpm孵育1h。菌液涂布氨苄青霉素(Amp)100μg/ml，卡那霉素(Kan)50μg/ml,氯霉素(Cm)25μg/ml的平板，37℃倒置培养16h，获得表达菌株的单菌落。
复合物表达与纯化流程参考《Characterization of a novel type III CRISPR-Caseffector provides new insights into the allostericactivation andsuppression of the Cas10 DNase》(Lin et al.,2019,Cell Discovery)。最终产品中，蛋白浓度为1.3mg/mL，LdCsm-dCsm1X突变体复合物的摩尔浓度为4100nM。放入-80℃保存待用。
(3)野生型LdCsm复合物与LdCsm-Csm1X突变型复合物的ssDNA切割反应
反应体系20μL，加入50nM的野生型LdCsm复合物或LdCsm-CsmX突变体复合物，1μMFAM-poly-16T-BHQ1单链DNA reporter。反应体系含50mM Tris-HCl(pH 6.8)，10mM MgCl2，50mM KCl，0.1mg/ml bovine serum albumin(BSA)。
每种复合物的实验组各分别加入500nM的目标RNAS1进行反应。空白组不加复合物。
反应体系加入384孔黑色酶标板，放入酶标仪中进行荧光动力学检测(检测波长λex:485nm；λem:535nm，37℃下每5min读数一次)。扣除背景荧光值后，计算指荧光值增长速率(min-1)。
(4)反应结果
不同复合物在目标RNA激活下的相对ssDNA切割活性如图3所示。相比野生型LdCsm，LdCsm-Csm1-d-L1b，LdCsm-Csm1-d-L1c和LdCsm-Csm1-d-L1d的活性分别降低了80％，92％和94％，LdCsm-Csm1-d-L2c和LdCsm-Csm1-d-L2d则完全失去了活性(图3A)。这说明维持HD-L1和HD-L2的完整性对于HD结构域介导的DNase活性十分重要，说明HD-L1/L2的长度变化直接影响DNase活性的强弱。对HD-L2保守位点进行突变的突变体中，LdCsm-Csm1D94A，LdCsm-Csm1R95AR96A和LdCsm-Csm1D113A彻底失去了活性，而LdCsm-Csm1D106A的活性相比野生型降低了44％(图3B)。这说明HD-L2在HD结构域的DNase活性中发挥重要作用。除此之外，相比野生型LdCsm，LdCsm-Csm1K65AK66A，LdCsm-Csm1R70A和LdCsm-Csm1K102A的活性分别降低了93％,64％,和40％，LdCsm-Csm1E63A，LdCsm-Csm1E73AE76A和LdCsm-Csm1E98AE99A的活性分别上升了10％，20％和180％(图3B)。这些结果说明，HD-L1和HD-L2内部氨基酸残基的电荷水平影响HD催化中心介导的ssDNA切割反应的效率。根据以上结果进一步推测，通过改变HD-L1/L2的长度或HD-L1/L2中氨基酸残基的电荷水平，可以调节LdCsm复合物在目标RNA作用下的ssDNA切割活性，优化LdCsm检测系统的检测效率。这说明HD-L1/L2是对LdCsm系统进行改造和优化的潜在功能位点，在原有系统的基础上为进一步的效率提升指出了方向。
实施例2
本实施例的目的是展示HD结构域中的HD基序，HD-L1和HD-L2三个亚机构在结合ssDNA底物过程中发挥的作用，以及HD结构域在激活/抑制过程中对ssDNA结合能力的变化。
根据实施例1的结果，HD-L1/L2中正电荷减少导致DNase活性减弱，负电荷减少导致DNase活性增强，因此我们推测HD-L1/L2通过自身电荷水平影响了带负电荷的ssDNA底物的结合，进而影响了HD结构域的DNase活性。为证明这一推测，我们纯化了不同的LdCsm-Csm1X突变体复合物，包括d-L1b，d-L1c，d-L2c，E63A，K65A，K66A，D94A，R95AR96A，E98AE99A(2E)和D113N，比较了它们和野生型LdCsm对ssDNA底物的结合能力的差异。
根据文献报道，HD基序在HD结构域中起着催化中心的作用，突变后导致III型RNP复合物HD结构域失去ssDNA切割能力(Lin et al.,2019,Cell Discovery)。为检验HD基序在ssDNA底物结合中扮演的角色，构建了对HD基序进行突变的LdCsm-dCsm3-HN(dCsm3-HN)突变体，以及在此基础上叠加能促进DNase活性的E63AE98AE99A(3E)突变的LdCsm-dCsm3-HN-3E(dCsm3-HN-3E)突变体，比较它们对ssDNA底物结合能力的差异。
根据文献报导，LdCsm复合物在不结合目标RNA和结合NTR(non-cognate targetRNA，3’antitag与crRNA 5’repeat tag匹配)状态下不激活DNase活性，在结合CTR(cognatetarget RNA，3’antitag与crRNA 5’repeat tag不匹配)状态下激活DNase活性(Lin etal.,2019,Cell Discovery)，以此实现自身活性的调控。比较了这三种状态下LdCsm对ssDNA结合能力的差异，以对变构调控的机制做出解释。
为反映不同条件下LdCsm的ssDNA结合能力，我们选择了使用微量热涌动(Microthermophoresis，MST)实验来分析LdCsm与ssDNA底物之间相互作用的强弱差异。
(1)LdCsm-Csm1突变体的构建和纯化
详见实施例1。
(2)使用MST实验分析LdCsm与ssDNA的相互作用
MST实验具体流程参考《Molecular interaction studies using microscalethermophoresi》。野生型LdCsm/不同突变型LdCsm复合物与目标RNA按摩尔浓度比值1:1进行添加，浓度梯度为4μM至0.122nM。每个梯度下FAM标记的30nt ssDNA荧光底物(序列见表2)浓度都为5nM。各组样品在含50mM Tris-HCl(pH 7.0)，125mM NaCl和25mM乙二胺四乙酸(EDTA)的buffer中短暂孵育后加入Monolith NT.115毛细管中，然后放入MonolithNT.115MST设备进行反应。LED功率100％，MST功率40％。LdCsm复合物与ssDNA底物的解离常数使用软件MO.Affinity Analysis进行分析。
(3)分析结果
根据MST分析结果，野生型(WT)LdCsm在结合CTR时，与ssDNA底物间的相互作用可以检测到，在不结合目标RNA(Apo)或结合NTR时，与ssDNA底物间的相互作用无法检测到(表4，图4A)。这说明LdCsm在不同状态下对DNase活性的控制，是通过改变对ssDNA底物的结合能力实现的。
野生型LdCsm与ssDNA的解离常数Kd为2.5μM，而LdCsm-Csm1E63A和LdCsm-Csm1-E98AE99A的Kd相比野生型分别降低了2.7倍和10.2倍(表4)，这说明E63A和E98AE99A突变提高了LdCsm复合物Csm1亚基HD结构域对ssDNA底物的结合能力。相比之下，LdCsm-Csm1-d-L1b，LdCsm-Csm1-d-L1c，LdCsm-Csm1-d-L2c，LdCsm-Csm1-K65A，LdCsm-Csm1-D94A，LdCsm-Csm1-R95AR96A，LdCsm-Csm1-R95AR96A和LdCsm-Csm1-D113N与ssDNA底物之间的相互作用无法检测到(表4，图4B)，说明对应的突变降低了HD结构域对ssDNA底物的结合能力。这些结果说明HD结构域中，HD-L1和HD-L2都是ssDNA底物的结合位点，且自身的长度和电荷水平都会影响ssDNA的结合。
另一方面，LdCsm-dCsm3-Csm1HN和LdCsm-dCsm3-Csm1HN+3E突变体与ssDNA底物之间的相互作用同样无法检测到(表4，图4B)。尽管已证明E63A和E98AE99A突变能增强与ssDNA底物的相互作用，但是在HN突变的基础上叠加E63A和E98AE99A突变时，仍然无法检测到HD结构域与ssDNA的相互作用。这说明在HD结构域中，HD基序也是结合ssDNA的必不可少的位点。
综合以上结果，我们发现了LdCsm系统Csm1亚基HD结构域中用于结合ssDNA的三个亚结构域，包括HD-L1，HD-L2和HD基序。由于LdCsm只有在CTR结合状态下能够结合ssDNA底物，且HD-L1、HD-L2和HD基序对于结合ssDNA底物都是必不可少的，可以证明LdCsm被目标RNA激活后，其Csm1亚基的变构导致HD结构域中HD-L1，HD-L2和HD基序的构象发生了重排，使HD活性中心能够结合、捕捉ssDNA底物并对其切割。此外，HD-L1和HD-L2的长度和内部电荷水平的变化还可以调节HD结构域的ssDNA结合能力，进而改变DNase位点的催化效率。基于这一发现，可以针对HD-L1和HD-L2进行长度和电荷水平的改造，实现LdCsm的DNase活性的提高，进而提升LdCsm检测系统的检测效率。
表4 MST实验反映的不同LdCsm复合物与ssDNA底物的结合常数
实施例3
本实施例的目的是介绍检测试剂盒的组成与性质。
检测既定的目标RNA S1使用的物质：包括LdCsm-dCsm3-Csm1E98AE99A/LdCsm-dCsm3-Csm1A705K/LdCsm-dCsm3-Csm1E776K突变型复合物，RNA标准品，DNA荧光报告子，10×反应buffer，DEPC H2O。长期储藏条件-20℃。
(1)性质与成分介绍：
LdCsm-dCsm3-Csm1E98AE99A、LdCsm-dCsm3-Csm1A705K或LdCsm-dCsm3-Csm1E776K三种突变型复合物，都是整合有crRNA的多亚基核酸蛋白复合物，五种蛋白亚基和crRNA的化学计量关系为Csm1123344151:crRNA1，总分子量317kDa。crRNA的核酸序列见表1。形态为液体，总体积1mL，蛋白浓度为1.3mg/ml，复合物的摩尔浓度4100nM，储存buffer成分为10mMTris-HCl(pH8.5)，125mM NaCl和50％甘油。
RNA S1标准品，含46个碱基的核糖核酸样品，序列见表1。形态为干粉，使用时加320μL DEPC H2O溶解，液体浓度5μM。
DNA荧光报告子，含15个碱基的脱氧核糖核酸样品，5’端修饰有FAM荧光集团，3’端修饰有BHQ1荧光淬灭基团，序列为5’-FAM-CTCTCCTCCTTCTTC-BHQ1-3’。形态为干粉，使用时加800μL DEPC H2O溶解，液体浓度10μM。
10×反应buffer，液体，总体积1mL，液体成分500mM Tris-HCl(pH7.0)，100mMMgCl2，500mM KCl，1mg/ml bovine serum albumin(BSA)。
DEPC H2O，液体，总体积10mL。
(2)用途与来源介绍：
LdCsm-dCsm3-Csm1E98AE99A，LdCsm-dCsm3-Csm1A705K或LdCsm-dCsm3-Csm1E776K三种突变型复合物，用于检测既定的目标RNA S1。三种突变型复合物在野生型LdCsm复合物的基础上突变而来，特点是：(1)三种突变型复合物Csm3亚基的第34位氨基酸都从天冬氨酸变为丙氨酸，失去对目标RNA的切割能力；(2)在Csm3D34A突变的基础上，三种突变型复合物分别将各自Csm1亚基第98、99位谷氨酸突变为丙氨酸，第705位丙氨酸突变为赖氨酸，第776位谷氨酸突变为赖氨酸。LdCsm-dCsm3-Csm1E98AE99A突变型复合物由p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1E98AE99A质粒，pET30-Csm2质粒和pUCE-S1质粒在E.coli BL21(DE3)菌株中共同表达产生。LdCsm-dCsm3-Csm1A705K突变型复合物由p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1A705K质粒，pET30-Csm2质粒和pUCE-S1质粒在E.coli BL21(DE3)菌株中共同表达产生。LdCsm-dCsm3-Csm1E776K突变型复合物由p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1E776K质粒，pET30-Csm2质粒和pUCE-S1质粒在E.coli BL21(DE3)菌株中共同表达产生。经过纯化后，获得三种突变型复合物的产品。
p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1E98AE99A质粒表达Csm1～5五种蛋白亚基和Cas6蛋白，其中对编码Csm1和Csm3亚基的序列进行了点突变，导致Csm1第98和99位谷氨酸的密码子突变为丙氨酸的密码子，Csm3第34位天冬氨酸的密码子突变为丙氨酸的密码子，使得表达产生的LdCsm-dCsm3-Csm1E98AE99A突变型复合物中，Csm1亚基中带有第98位、99位谷氨酸到丙氨酸的突变，Csm3亚基带有第34位天冬氨酸到丙氨酸的突变。
p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1A705K质粒表达Csm1～5五种蛋白亚基和Cas6蛋白，其中对编码Csm1和Csm3亚基的序列进行了点突变，导致Csm1第705位丙氨酸的密码子突变为赖氨酸的密码子，Csm3第34位天冬氨酸的密码子突变为丙氨酸的密码子，使得表达产生的LdCsm-dCsm3-Csm1A705K突变型复合物中，Csm1亚基中带有第705位丙氨酸到赖氨酸的突变，Csm3亚基带有第34位天冬氨酸到丙氨酸的突变。
p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1E776K质粒表达Csm1～5五种蛋白亚基和Cas6蛋白，其中对编码Csm1和Csm3亚基的序列进行了点突变，导致Csm1第776位谷氨酸的密码子突变为赖氨酸的密码子，Csm3第34位天冬氨酸的密码子突变为丙氨酸的密码子，使得表达产生的LdCsm-dCsm3-Csm1E776K突变型复合物中，Csm1亚基中带有第776位谷氨酸到赖氨酸的突变，Csm3亚基带有第34位天冬氨酸到丙氨酸的突变。
pET30-Csm2质粒表达带有his-tag的Csm2亚基蛋白，使LdCsm-dCsm3突变型复合物带有his-tag，从而可以使用镍柱亲和层析进行纯化。pUCE-S1质粒表达特定crRNA的前体(含10个crRNA的连续重复单元)，经Cas6切割后产生单体crRNA。crRNA整合进LdCsm-dCsm3突变型复合物后，引导复合物特异性的识别目标RNA，并激活复合物的检测活性。表达特定crRNA的质粒是根据目标RNA的序列，即S1的序列进行设计的。p15AIE-Cas-Csm3D34A质粒中点突变的引入过程，pUCE-S1质粒的设计和构建过程，以及LdCsm-dCsm3突变型复合物的纯化过程，具体见实施例2。
RNA S1标准品，目标RNA标准样品，用于展示产品检测活性，作为阳性对照。RNA S1的序列见表1，订购自金维智公司。
DNA荧光报告子，序列为5’-FAM-CTCTCCTCCTTCTTC-BHQ1-3’。用于释放检测信号。订购自金维智公司。
10×反应buffer，用于在检测反应中提供适宜的pH环境以及金属离子。
DEPC H2O，用于补足反应体系的总体积。购自Solibio公司。
实施例4
本部分描述LdCsm-dCsm3-Csm1E98AE99A/LdCsm-dCsm3-Csm1A705K/LdCsm-dCsm3-Csm1E776K突变型复合物表达系统的构建以及复合物的纯化过程。
(1)p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1E98AE99A质粒的构建。
p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1E98AE99A质粒在p15AIE-Cas-Csm3D34A质粒基础上进行改造。p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1E98AE99A表达Csm1E98AE99A，Csm2，Csm3D34A，Csm4，Csm5五种构成LdCsm-dCsm3-Csm1E98AE99A突变体复合物的蛋白亚基以及Cas6蛋白。
以申请人所在实验室保存的p15AIE-Cas-Csm3D34A质粒为模板，分别以引物对E98AE99A-F/Csm5-R，和Csm5-F:E98AE99A-R进行PCR扩增。引物订购自青岛擎科，序列见表2。使用Phanta polymerase进行扩增。胶回收纯化试剂盒购自康为世纪公司。反应体系和反应条件如下。
15-E98AE99A-1片段，50μL PCR反应体系
Phanta polymerase 1μL
2×Phanta buffer 25μL
dNTP(10mM each) 1μL
p15AIE-Cas-Csm3D34A 质粒0.2ng
E98AE99A-F(10μM) 1μL
Csm5-R(10μM) 1μL
ddH2O up to 50μL
反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；延伸5min；结束反应，置于冰上待用。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在5121bp位置有条带，使用胶回收纯化试剂盒回收PCR产物，获得15-E98AE99A-1片段。
15-E98AE99A-2片段，50μL PCR反应体系
Phanta polymerase 1μL
2×Phanta buffer 25μL
dNTP(10mM each) 1μL
p15AIE-Cas质粒 0.2ng
Csm5-F(10μM) 1μL
E98AE99A-R(10μM) 1μL
ddH2O up to 50μL
反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；延伸5min；结束反应，置于冰上待用。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在5060bp位置有条带，使用胶回收纯化试剂盒回收PCR产物，获得15-E98AE99A-2片段。
15-E98AE99A-1片段和15-E98AE99A-2片段进行同源重组连接反应和转化。无缝克隆AssemblyMix购买自Thermo Scientific公司。E.coli DH5α感受态购买自上海唯地生物技术公司。抗生素购买自Coolaber公司。反应体系和反应过程如下。
15-E98AE99A-1片段和15-E98AE99A-2片段，10μL同源重组连接反应体系
15-E98AE99A-1片段 100ng
15-E98AE99A-2片段 100ng
2ⅹAssemblyMix5μL
ddH2O up to 10μL
50℃反应20min，置于冰上待用。连接产物加入E.coli DH5α感受态，冰浴30min，42℃水浴热激90s，立即置于冰上冷却3min。无菌环境下加入800μL LB培养基，37℃220rpm孵育1h。菌液涂布氨苄青霉素(Amp)100μg/ml的平板，37℃倒置培养16h，获得单菌落。
p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1E98AE99A质粒的验证。质粒提取试剂盒购买自康为世纪公司。单菌落接种10ml LB(Amp 100μg/ml)，37℃220rpm培养16h，取1mL菌液保菌，其余菌液提取质粒。提取的质粒样品送青岛擎科生物公司测序，测序引物为Lid-S-F:Lid-S-R。经过测序结果与p15AIE-Cas-Csm3D34A的比对，确定成功获得了p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1E98AE99A质粒。
(2)p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1A705K质粒的构建。
p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1A705K质粒在p15AIE-Cas-Csm3D34A质粒基础上进行改造。p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1A705K表达Csm1A705K，Csm2，Csm3D34A，Csm4，Csm5五种构成LdCsm-dCsm3-Csm1A705K突变体复合物的蛋白亚基以及Cas6蛋白。
以申请人所在实验室保存的p15AIE-Cas-Csm3D34A质粒为模板，分别以引物对A705K-F/Csm5-R，和Csm5-F:A705K-R进行PCR扩增。引物订购自青岛擎科，序列见表2。使用Phanta polymerase进行扩增。胶回收纯化试剂盒购自康为世纪公司。反应体系和反应条件如下。
15-A705K-1片段，50μL PCR反应体系
Phanta polymerase 1μL
2×Phanta buffer 25μL
dNTP(10mM each) 1μL
p15AIE-Cas-Csm3D34A 质粒0.2ng
A705K-F(10μM) 1μL
Csm5-R(10μM) 1μL
ddH2O up to 50μL
反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；延伸5min；结束反应，置于冰上待用。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在6941bp位置有条带，使用胶回收纯化试剂盒回收PCR产物，获得15-A705K-1片段。
15-A705K-2片段，50μL PCR反应体系
Phanta polymerase 1μL
2×Phanta buffer 25μL
dNTP(10mM each) 1μL
p15AIE-Cas质粒 0.2ng
Csm5-F(10μM) 1μL
A705K-R(10μM) 1μL
ddH2O up to 50μL
反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；延伸5min；结束反应，置于冰上待用。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在3236bp位置有条带，使用胶回收纯化试剂盒回收PCR产物，获得15-A705K-2片段。
15-A705K-1片段和15-A705K-2片段进行同源重组连接反应和转化。无缝克隆AssemblyMix购买自Thermo Scientific公司。E.coli DH5α感受态购买自上海唯地生物技术公司。抗生素购买自Coolaber公司。反应体系和反应过程如下。
15-A705K-1片段和15-A705K-2片段，10μL同源重组连接反应体系
15-A705K-1片段100ng
15-A705K-2片段100ng
2ⅹAssemblyMix 5μL
ddH2O up to 10μL
50℃反应20min，置于冰上待用。连接产物加入E.coli DH5α感受态，冰浴30min，42℃水浴热激90s，立即置于冰上冷却3min。无菌环境下加入800μL LB培养基，37℃220rpm孵育1h。菌液涂布氨苄青霉素(Amp)100μg/ml的平板，37℃倒置培养16h，获得单菌落。
p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1A705K质粒的验证。质粒提取试剂盒购买自康为世纪公司。单菌落接种10ml LB(Amp 100μg/ml)，37℃220rpm培养16h，取1mL菌液保菌，其余菌液提取质粒。提取的质粒样品送青岛擎科生物公司测序，测序引物为C-S-F:C-S-R。经过测序结果与p15AIE-Cas-Csm3D34A的比对，确定成功获得了p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1A705K质粒。
(3)p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1A776K质粒的构建。
p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1A776K质粒在p15AIE-Cas-Csm3D34A质粒基础上进行改造。p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1A776K表达Csm1A776K，Csm2，Csm3D34A，Csm4，Csm5五种构成LdCsm-dCsm3-Csm1A776K突变体复合物的蛋白亚基以及Cas6蛋白。
以申请人所在实验室保存的p15AIE-Cas-Csm3D34A质粒为模板，分别以引物对A776K-F/Csm5-R，和Csm5-F:A776K-R进行PCR扩增。引物订购自青岛擎科，序列见表2。使用Phanta polymerase进行扩增。胶回收纯化试剂盒购自康为世纪公司。反应体系和反应条件如下。
15-A776K-1片段，50μL PCR反应体系
Phanta polymerase 1μL
2×Phanta buffer 25μL
dNTP(10mM each) 1μL
p15AIE-Cas-Csm3D34A 质粒0.2ng
A776K-F(10μM) 1μL
Csm5-R(10μM) 1μL
ddH2O up to 50μL
反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；延伸5min；结束反应，置于冰上待用。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在7151bp位置有条带，使用胶回收纯化试剂盒回收PCR产物，获得15-A776K-1片段。
15-A776K-2片段，50μL PCR反应体系
Phanta polymerase 1μL
2×Phanta buffer 25μL
dNTP(10mM each) 1μL
p15AIE-Cas质粒 0.2ng
Csm5-F(10μM) 1μL
A776K-R(10μM) 1μL
ddH2O up to 50μL
反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；延伸5min；结束反应，置于冰上待用。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在3026bp位置有条带，使用胶回收纯化试剂盒回收PCR产物，获得15-A776K-2片段。
15-A776K-1片段和15-A776K-2片段进行同源重组连接反应和转化。无缝克隆AssemblyMix购买自Thermo Scientific公司。E.coli DH5α感受态购买自上海唯地生物技术公司。抗生素购买自Coolaber公司。反应体系和反应过程如下。
15-A776K-1片段和15-A776K-2片段，10μL同源重组连接反应体系
15-A776K-1片段 100ng
15-A776K-2片段 100ng
2ⅹAssemblyMix 5μL
ddH2O up to 10μL
50℃反应20min，置于冰上待用。连接产物加入E.coli DH5α感受态，冰浴30min，42℃水浴热激90s，立即置于冰上冷却3min。无菌环境下加入800μL LB培养基，37℃220rpm孵育1h。菌液涂布氨苄青霉素(Amp)100μg/ml的平板，37℃倒置培养16h，获得单菌落。
p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1A776K质粒的验证。质粒提取试剂盒购买自康为世纪公司。单菌落接种10ml LB(Amp 100μg/ml)，37℃220rpm培养16h，取1mL菌液保菌，其余菌液提取质粒。提取的质粒样品送青岛擎科生物公司测序，测序引物为C-S-F:C-S-R。经过测序结果与p15AIE-Cas-Csm3D34A的比对，确定成功获得了p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1A776K质粒。
(4)LdCsm-dCsm3-Csm1X突变型复合物的纯化
LdCsm-dCsm3突变体复合物表达菌株的获得。E.coli BL21(DE3)感受态购买自上海唯地生物技术公司。抗生素购买自Coolaber公司。30ng p15AIE-Cas-Csm3D34A-X质粒，30ng pUCE-S1，以及30ng pET30a-Csm2质粒(Lin et al.Cell Discovery(2020)6:29)加入100μL E.coli BL21(DE3)感受态，冰浴30min，42℃水浴热激90s，立即置于冰上冷却3min。无菌环境下加入800μL LB培养基，37℃220rpm孵育1h。菌液涂布氨苄青霉素(Amp)100μg/ml，卡那霉素(Kan)50μg/ml,氯霉素(Cm)25μg/ml的平板，37℃倒置培养16h，获得表达菌株的单菌落。
复合物表达与纯化流程参考《Characterization of a novel type III CRISPR-Caseffector provides new insights into the allostericactivation andsuppression of the Cas10 DNase》(Lin et al.,2019,Cell Discovery)。最终产品中，蛋白浓度为1.3mg/mL，LdCsm-dCsm3突变体复合物的摩尔浓度为4100nM。放入-80℃保存待用。
实施例5
本实施例的目的是检验序列为：5’FAM-CTCTCCTCCTTCTTC-3’BHQ1的CT荧光报告子在基于LdCsm-dCsm3的RNA检测反应中的使用效果，并与序列为：5’FAM-TTTTTTTTTTTT-3’BHQ1的PolyT荧光报告子进行效果的比较。
(1)LdCsm-dCsm3突变体复合物的表达与纯化
将pUCE-S1，p15AIE-Cas-Csm3D34A，pET30a-Csm2质粒转入E.coli BL21(DE3)菌株，涂布含有氨苄青霉素(Amp)100μg/mL，卡那霉素(Kan)25μg/mL，氯霉素(Cm)10μg/mL的LB固体平板，获得LdCsm表达菌株的单菌落。
复合物表达与纯化流程参考《Characterization of a novel type III CRISPR-Caseffector provides new insights into the allostericactivation andsuppression of the Cas10 DNase》。纯化产物经SDS-PAGE初步鉴定各蛋白组分。使用Nanodrop检测蛋白样品浓度S(mg/ml)。
复合物的浓度计算方式为：
N(μM)＝S×1000/317
(2)目标RNA的检测
反应体系20μL，加入50nM的LdCsm-dCsm3突变体复合物。反应体系含50mM Tris-Cl(pH 6.8)，10mM MgCl2，50mM KCl，0.1mg/ml bovine serum albumin(BSA)。共四个反应体系，其中两个加入序列为：5’FAM-CTCTCCTCCTTCTTC-3’BHQ1的ssDNA报告子(CT荧光报告子)，另外两个加入序列为5’FAM-TTTTTTTTTTTTTTTT-3’BHQ1的ssDNA报告子(PolyT荧光报告子)。
含有CT报告子/polyT报告子的两个反应体系中，一个为实验组，另一个为空白组。实验组加入50nM的RNA S1进行检测，空白组加入等体积的DEPC H2O。
反应体系加入384孔黑色酶标板，放入酶标仪中进行荧光动力学检测(检测波长λex:485nm；λem:535nm，37℃下每5min读数一次)。扣除空白组的背景荧光值后，计算实验组的荧光值作为检测信号。
(3)检测结果
目标RNA检测结果如图5所示。可以看到LdCsm-dCsm3识别目标RNA S1后，可以切割CT报告子/polyT报告子产生检测信号。其中，在检测相同浓度的目标RNA，且ssDNA报告子浓度相同时，在反应体系中添加CT报告子时产生的检测信号是添加polyT报告子时的2.5倍。这说明LdCsm-dCsm3复合物被目标RNA激活时，对CT报告子的切割效率比对polyT报告子的切割效率高，使用ssDNA报告子可以产生更强，更显著的检测信号。
实施例6
本实施例的目的是检验LdCsm-dCsm3-Csm1E98AE99A复合物对目标RNA的检测效率，并与LdCsm-dCsm3进行比较。
(1)LdCsm-dCsm3/LdCsm-dCsm3-Csm1E98AE99A突变体复合物的表达与纯化
将pUCE-S1，p15AIE-Cas-Csm3D34A/p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1E98AE99A，pET30a-Csm2质粒转入E.coli BL21(DE3)菌株，涂布含有氨苄青霉素(Amp)100μg/mL，卡那霉素(Kan)25μg/mL，氯霉素(Cm)10μg/mL的LB固体平板，获得LdCsm表达菌株的单菌落。
复合物表达与纯化流程参考《Characterization of a novel type III CRISPR-Caseffector provides new insights into the allostericactivation andsuppression of the Cas10 DNase》。纯化产物经SDS-PAGE初步鉴定各蛋白组分。使用Nanodrop检测蛋白样品浓度S(mg/ml)。
复合物的浓度计算方式为：N(μM)＝S×1000/317
(2)目标RNA的检测
反应体系20μL，加入200nM的LdCsm-dCsm3/LdCsm-dCsm3-Csm1E98AE99A突变体复合物，1μM FAM-poly-16T-BHQ1单链DNA reporter。反应体系含50mM Tris-Cl(pH 6.8)，10mM MgCl2，50mM KCl，0.1mg/ml bovine serum albumin(BSA)。
两种复合物的实验组各8个，分别加入50pM，100pM，200pM，500pM，1nM，2nM，5nM和10nM的RNAS1进行检测。两种复合物的空白组中各加入等体积的水。
反应体系加入384孔黑色酶标板，放入酶标仪中进行荧光动力学检测(检测波长λex:485nm；λem:535nm，37℃下每5min读数一次)。扣除背景荧光值后，计算指荧光值增长速率(min-1)。
(3)检测结果
目标RNA检测结果如图6所示。可以看到LdCsm-dCsm3和LdCsm-dCsm3-Csm1E98AE99A突变体复合物都能够高效检测目标RNA S1。其中，在目标RNA浓度相同时，LdCsm-dCsm3-Csm1E98AE99A突变体复合物产生的检测信号强度是LdCsm-dCsm3突变体复合物的3倍。在目标RNA浓度低于500pM时，与空白对照相比，LdCsm-dCsm3不能产生显著的检测信号。当在目标RNA浓度在50～100pM时，与空白对照相比，LdCsm-dCsm3-Csm1E98AE99A仍能产生显著的检测信号。这说明Csm1E98AE99A突变增强了LdCsm-dCsm3复合物的检测信号，并降低了其检测极限，说明通过优化在原有产品基础上获得了显著的增益效果。
实施例7
本实施例的目的是检验LdCsm-dCsm3-Csm1A705K复合物和LdCsm-dCsm3-Csm1E776K复合物对目标RNA的检测效率，并与LdCsm-dCsm3进行比较。
(1)LdCsm-dCsm3-Csm1A705K和LdCsm-dCsm3-Csm1E776K突变体复合物的表达与纯化
将pUCE-S1，p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1A705K/p15AIE-Cas-Csm3D34A-Csm1E776K，pET30a-Csm2质粒转入E.coli BL21(DE3)菌株，涂布含有氨苄青霉素(Amp)100μg/mL，卡那霉素(Kan)25μg/mL，氯霉素(Cm)10μg/mL的LB固体平板，获得LdCsm表达菌株的单菌落。
复合物表达与纯化流程参考《Characterization of a novel type III CRISPR-Caseffector provides new insights into the allostericactivation andsuppression of the Cas10 DNase》。纯化产物经SDS-PAGE初步鉴定各蛋白组分。使用Nanodrop检测蛋白样品浓度S(mg/ml)。
复合物的浓度计算方式为：N(μM)＝S×1000/317
(2)目标RNA的检测
反应体系20μL，加入200nM的LdCsm-dCsm3，LdCsm-dCsm3-Csm1A705K或LdCsm-dCsm3-Csm1E776K突变体复合物，1μM FAM-poly-16T-BHQ1单链DNA reporter。反应体系含50mM Tris-HCl(pH 6.8)，10mM MgCl2，50mM KCl，0.1mg/ml bovine serum albumin(BSA)。
三种复合物的实验组各分别加入50nM的RNA S1进行检测。空白组不加复合物。
反应体系加入384孔黑色酶标板，放入酶标仪中进行荧光动力学检测(检测波长λex:485nm；λem:535nm，37℃下每5min读数一次)。扣除背景荧光值后，计算指荧光值增长速率(min-1)。
(3)检测结果
目标RNA检测结果如图7所示。可以看到LdCsm-dCsm3，LdCsm-dCsm3-Csm1A705K和LdCsm-dCsm3-Csm1E776K突变体复合物都能够检测目标RNA S1。其中，在目标RNA浓度相同时，LdCsm-dCsm3-Csm1A705K和LdCsm-dCsm3-Csm1E776K突变体复合物产生的检测信号强度分别是LdCsm-dCsm3突变体复合物的4.2和4.4倍。这说明Csm1A705K和Csm1E776K突变增强了LdCsm-dCsm3复合物的检测信号，说明通过优化在原有产品基础上获得了显著的增益效果。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种LdCsm突变型复合物，其特征在于，所述LdCsm突变型复合物是在野生型LdCsm的大亚基LdCsm1的两个亚结构域HD-L1和HD-L2中的任意一个或多个氨基酸发生替换、截短或插入后突变获得；
其中，在序列上，所述亚结构域HD-L1包括第58～78位氨基酸，分布在LdCsm1四号和五号α螺旋序列之间，所述亚结构域HD-L2包括第92～114位氨基酸，分布在LdCsm1五号α螺旋序列的C端下游，包含一段GxDRR基序；在结构上，所述HD-L1和HD-L2位于HD结构域的催化中心两侧。
2.如权利要求1所述的LdCsm突变型复合物，其特征在于，所述LdCsm突变型复合物为如下任意一种或多种：
一种LdCsm突变型复合物LdCsm-dCsm3-Csm1E98AE99A，其由Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5五种蛋白亚基以及crRNA组装而成，其中Csm3亚基的第34位氨基酸由天冬氨酸(Asp，D)突变为丙氨酸(Ala，A)，Csm1亚基的第98和第99位氨基酸由谷氨酸(Glu，E)突变为丙氨酸(Ala，A)；或，
一种LdCsm突变型复合物LdCsm-dCsm3-Csm1A705K，其由Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5五种蛋白亚基以及crRNA组装而成，其中Csm3亚基的第34位氨基酸由天冬氨酸(Asp，D)突变为丙氨酸(Ala，A)，Csm1亚基的第705位氨基酸由丙氨酸(Ala，A)突变为赖氨酸(Lys，K)；或，
一种LdCsm突变型复合物LdCsm-dCsm3-Csm1E776K，其由Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5五种蛋白亚基以及crRNA组装而成，其中Csm3亚基的第34位氨基酸由天冬氨酸(Asp，D)突变为丙氨酸(Ala，A)，Csm1亚基的第776位氨基酸由谷氨酸(Glu，E)突变为赖氨酸(Lys，K)。
3.如权利要求2所述的LdCsm突变型复合物，其特征在于，上述Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5与crRNA的化学计量关系为Csm1123344151:crRNA1。
4.一种检测系统，其特征在于，所述检测系统至少包含权利要求1-3任一项所述LdCsm突变型复合物。
5.如权利要求4所述的检测系统，其特征在于，所述检测系统还包括ssDNA报告子，所述ssDNA报告子具有如SEQ ID NO.7所示的序列。
6.如权利要求5所述的检测系统，其特征在于，所述ssDNA报告子修饰有荧光基团和荧光淬灭基团，进一步的，所述ssDNA报告子的5’端修饰FAM荧光基团，3’端修饰BHQ1荧光淬灭基团。
7.一种RNA检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含权利要求1-3任一项所述LdCsm突变型复合物或者权利要求4-6任一项所述检测系统。
8.如权利要求7所述的RNA检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括反应缓冲液，所述反应缓冲液包括10×反应Buffer。
9.权利要求1-3任一项所述LdCsm突变型复合物、权利要求4-6任一项所述检测系统、权利要求7所述RNA检测试剂盒在制备RNA检测制剂或在制备表达目标RNA的病原体检测制剂中的应用。
10.一种RNA的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括将向待测样本中加入权利要求1-3任一项所述LdCsm突变型复合物、权利要求4-6任一项所述检测系统或权利要求7所述RNA检测试剂盒进行反应，从而分析待测样本中目标RNA的有无或浓度；
进一步的，所述目标RNA包括天然RNA、DNA体外转录产生的RNA、以及DNA经过体外扩增后再经过体外转录产生的RNA，所述检测方法不涉及疾病的诊断和治疗。
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