JP2019516361A - アルファ溶血素バリアントおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
[0025]本明細書において示している見出しは、本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではなく、本発明は、明細書を全体として参照によって理解され得る。したがって、直下で定義する用語は、明細書を全体として参照によってより充分に定義される。
[0026]アルファ溶血素:本明細書において使用する場合、「アルファ溶血素」、「α−溶血素」、「a−HL」および「α−HL」は、互換的に使用され、モノマー、モノマーのコンカテマーまたはモノマーおよびモノマーのコンカテマーの組合せから、七量体の水が満たされた膜貫通チャネルに自己構築する単量体タンパク質を指す(すなわち、ナノポア)。文脈に応じて、この用語はまた、7つの単量体タンパク質によって形成された膜貫通チャネルを指す場合もある。
[0050]2つ以上の配列間での「同一性%」を決定するための、選択された配列の好ましいアライメントは、例えば、MacVectorバージョン13.0.7のCLUSTAL−Wプログラムを使用し、10.0のオープンギャップペナルティー、0.1のエクステンディッドギャップペナルティーを含むデフォルトパラメータ、およびBLOSUM30類似度マトリックスを用いて動作させて行う。
[0051]本明細書および特許請求の範囲において、アミノ酸残基の従来の1文字表記および3文字表記を使用する。
Val149LysまたはV149K
複数の変異は、+記号によって分けられる、例えば、それぞれ、グリジンをヒスチジンと、およびリジンをバリンと置換する位置35および149における変異を表す:
His35Gly+Val149LysまたはH35G+V149K
アミノ酸置換のスパンは、ダッシュによって表される、例えば、残基127〜131のグリシン残基のスパンである:127−131Glyまたは127−133G。
[0053]黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)アルファ溶血素野生型配列は、本明細書において示しており(配列番号1、核酸コード領域;配列番号14、タンパク質コード領域)、他の場所で入手可能である(National Center for BioinformaticsまたはGenBank受入番号M90536およびAAA26598)。
アルファ溶血素バリアント
[0056]本明細書において提供されるアルファ溶血素バリアントは、ナノポアベースのシーケンシング反応において通り抜ける時間を改善する特定の置換または1つもしくは複数の置換の組合せを含む。通り抜ける時間を改善することによって、決定された配列に、より少ない欠失しか伴わない、高精度DNAシーケンシングを達成できる。
H35G+V149K;
V149K+E287R+H35G;
V149K+E287R;
T109K+H35G;
P151K+H35G;
V149K+P151K+H35G;
T109K+V149K+H35G;
V149K+K147N+E111N+127−131G+M113A+H35G;
V149K+K147N+E111N+127−131G+M113A;または
T109K+V149K+P151K+H35G。
[0062]本明細書において記載する方法は、ポリメラーゼがナノポアに付いたナノポアを使用することができる。特定の例示的な実施形態においては、(例えば、各ナノポアで1つのみの核酸分子がシーケンシングされるように)ナノポア1つ当たりただ1つのポリメラーゼを有することが望ましい。しかしながら、アルファ溶血素(aHL)を含めた多くのナノポアは、複数のサブユニット(例えば、aHLでは7サブユニット)を有する多量体タンパク質であり得る。サブユニットは、同じポリペプチドの同一複製物であり得る。本明細書においては、無改変サブユニット(例えば、a−HL)に対する改変サブユニット(例えば、a−HLバリアント)の規定された比を有する多量体タンパク質(例えば、ナノポア)を提供する。
100Pm=100[n!/m!(n−m)!]・fmut m・fwt n〜m、式中
Pm=m個の変異体サブユニットを有する細孔の確率
n=サブユニットの総数(例えば、aHLでは7個)
m=「変異体」サブユニットの数
fmut=一緒に混合した変異体サブユニットの割合または比
fwt=一緒に混合した野生型サブユニットの割合または比
[0069]本方法は、複数のタンパク質を分画して、第2のサブユニット2725に対する第1のサブユニットの第2の比を有するタンパク質を増やすことをさらに含むことができる。例えば、ただ1つの改変サブユニットを有するナノポアタンパク質を単離することができる(例えば、第2の比は1:6)。しかしながら、いずれの第2の比も好適である。第2の比の分布も分画することができ、例えば、1つまたは2つのいずれかの改変サブユニットを有するタンパク質を増やすことができる。WO2014/074727の図27に示されているように、タンパク質を形成するサブユニットの総数は、常に7個であるとは限らない(例えば、異なるナノポアを使用することができ、または6個のサブユニットを有するアルファ溶血素ナノポアが形成し得る)。一部の場合においては、1つのみの改変サブユニットを有するタンパク質を増やす。このような場合においては、第2の比は、第1のサブユニット(n−1)個当たり、第2のサブユニット1個であり、nはタンパク質を構成するサブユニットの数である。
[0074]特定の例示的な実施形態においては、ポリメラーゼ(例えば、DNAポリメラーゼ)は、ナノポアに付けられ、かつ/または、ナノポアの近傍に配置される。DNA合成反応の間にDNAを合成可能な任意のDNAポリメラーゼを、本明細書において記載される方法および組成物と一致して使用できる。例示的DNAポリメラーゼとして、それだけには限らないが、phi29(バチルスバクテリオファージφ29)、pol6(クロストリジウム(Clostridium)ファージphiCPV4;GenBank:AFH27113.1)またはpol7(アクチノマイセス(Actinomyces)ファージAv−1;GenBank:ABR67671.1)が挙げられる。特定の例示的実施形態では、リガーゼ、ヌクレアーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、トランスフェラーゼまたはトポイソメラーゼなどのDNA操作酵素または修飾酵素をナノポア会合体に付ける。
[0088]ナノポアは、集積回路などの検出回路の検出電極に隣接して配置された膜に形成するか、または他の方法で埋め込んでもよい。集積回路は、特定用途向け集積回路(ASIC)としてもよい。一部の例においては、集積回路は、電界効果トランジスターまたは相補型金属酸化膜半導体(CMOS)である。検出回路は、ナノポアを有するチップもしくは他のデバイスに位置するか、または、チップもしくはデバイスの外部に、例えばオフチップ配置などで位置することができる。半導体は任意の半導体とすることができ、IV族半導体(例えば、ケイ素)、およびIII−V族半導体(例えば、ヒ化ガリウム)が含まれるが、これらに限定されない。ヌクレオチドまたはタグを検出するための装置およびデバイスのセットアップについては、例えば、WO2013/123450を参照のこと。
発現および回収
[0093]この実施例は、細菌宿主細胞、例えば、大腸菌(E.coli)に由来するタンパク質の発現および回収を例示する。
[0095]プラスミド構築。野生型またはバリアントα−溶血素のいずれかをコードする遺伝子を、pPR−IBA2プラスミド(IBA Life Sciences、Germany)中、T7プロモーターの制御下に挿入した。
実施例2
アルファ溶血素バリアント
[00100]以下の実施例は、所望の残基での変異の導入を詳述する。
実施例3
バリアントを含むナノポアの会合
[00103]この実施例は、6つのa−HLバリアントサブユニットおよび1つの野生型サブユニットを含むナノポアの会合を説明する。
ポリメラーゼの取付け
[00110]この実施例は、ナノポアへのポリメラーゼの取付けを提供する。
バリアントの活性
[00114]この実施例は、実施例4(ポリメラーゼが付けられたナノポア)によって提供されるようなナノポアの活性を示す。
[00121]本明細書において記載される実施例および実施形態は、単に例示目的のものであり、それを鑑みて種々の改変または変法は、当業者には示唆され、本出願の趣旨および管轄ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれものとするということは理解される。本明細書において引用されたすべての刊行物、特許および特許出願は、すべての目的のために参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
配列表フリーテキスト
配列番号1(WT aHL DNA)
特許文献
[1] PCT/US2013/026514 (published as WO2013/123450) entitled “Methods for Creating Bilayers for Use with Nanopore Sensors”
[2] PCT/US2013/068967 (published as WO 2014/074727) entitled “Nucleic Acid Sequencing Using Tags”
[3] PCT/US14/61853 filed 23 October 2014 entitled “Methods for Forming Lipid Bilayers on Biochips”
非特許文献
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Claims (26)
- 配列番号14のV149K、E287R、H35G、T109K、P151K、K147N、E111N、M113Aのうちいずれか1つまたはそれらの組合せに対応する位置にアミノ酸置換を含む、アルファ溶血素バリアント。
- 前記置換が、1または複数の正電荷を含む、請求項1に記載のアルファ溶血素バリアント。
- H144Aに置換をさらに含む、請求項1または2に記載のアルファ溶血素バリアント。
- 残基127〜131に1個または複数のグリシン残基をさらに含む、請求項1〜3のいずれかに記載のアルファ溶血素バリアント。
- 前記置換がV149Kである、請求項1〜4のいずれかに記載のアルファ溶血素バリアント。
- 前記置換がE287Rである、請求項1〜4のいずれかに記載のアルファ溶血素バリアント。
- 前記置換がH35Gである、請求項1〜4のいずれかに記載のアルファ溶血素バリアント。
- 前記置換がT109Kである、請求項1〜4のいずれかに記載のアルファ溶血素バリアント。
- 前記置換がP151Kである、請求項1〜4のいずれかに記載のアルファ溶血素バリアント。
- 前記置換がK147Nである、請求項1〜4のいずれかに記載のアルファ溶血素バリアント。
- 前記置換がE111Nである、請求項1〜4のいずれかに記載のアルファ溶血素バリアント。
- 前記置換がM113Aである、請求項1〜4のいずれかに記載のアルファ溶血素バリアント。
- 配列番号14として示される配列に対して少なくとも80%、90%、95%、98%またはそれ以上の配列同一性を有する配列を有する、請求項5〜12のいずれかに記載のアルファ溶血素バリアント。
- 配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12または配列番号13として示される配列に対して少なくとも80%、90%、95%、98%またはそれ以上の配列同一性を有する配列を有する、請求項1〜4のいずれかに記載のアルファ溶血素バリアント。
- DNAポリメラーゼに共有結合によって結合している、請求項1〜14のいずれかに記載のアルファ溶血素バリアント。
- DNAポリメラーゼにイソペプチド結合によって結合している、請求項15に記載のアルファ溶血素バリアント。
- 請求項1〜16のいずれか一項に記載の少なくとも1つのアルファ溶血素バリアントを含む七量体ナノポア会合体。
- 天然アルファ溶血素からなる細孔複合体に対して、変更された通り抜ける時間(TTT)を有する、請求項17に記載の七量体ナノポア会合体。
- 前記TTTが低減される、請求項18に記載の七量体ナノポア会合体。
- 前記TTTが、天然アルファ溶血素からなる七量体ナノポア会合体と比較して、約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%またはそれ以上低減される、請求項19に記載の七量体ナノポア会合体。
- 請求項1〜16のいずれか一項に記載のアルファ溶血素バリアントをコードする核酸。
- 黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)(配列番号1)に由来する、請求項21または20に記載の核酸分子。
- 請求項21〜22のいずれか一項に記載のアルファ溶血素バリアントをコードする核酸を含むベクター。
- 請求項23に記載のベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
- アルファ溶血素バリアントを作製する方法であって、
(a)請求項24に記載の宿主細胞を、アルファ溶血素バリアントを産生するのに好適な条件下、好適な培養培地中で培養するステップ、および、
(b)前記産生されたアルファ溶血素バリアントを得るステップ、
を含む、前記方法。 - 標的分子を検出するための方法であって、
(a)検出電極に隣接して、またはその近傍に配置された膜中に、請求項17〜20に記載のナノポアを含むチップを設置するステップ、
(b)核酸分子を前記ナノポア中に通過させるステップであって、前記核酸分子が、リポーター分子と会合され、前記核酸分子が、アドレス領域およびプローブ領域を含み、前記リポーター分子が、前記プローブ領域で前記核酸分子と会合され、前記リポーター分子が、標的分子と連結されるステップ、
(c)前記核酸分子が前記ナノポア中を通過させられる間に前記アドレス領域をシーケンシングして、前記アドレス領域の核酸配列を調べるステップ、および、
(d)(c)において調べられた前記アドレス領域の核酸配列に基づいて、コンピュータプロセッサーを利用して前記標的分子を同定するステップ、
を含む、前記方法。
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