CN109563140B - α-溶血素变体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文描述了具有至少一个突变(诸如突变为正电荷)的α‑溶血素的变体。在某些实例中，所述突变选自成熟、野生型α‑溶血素氨基酸序列中的V149K、E287R、H35G、T109K、P151K、K147N、E111N、M113A或其组合。α‑溶血素变体还可以包括成熟、野生型α溶血素的H144A处的取代和/或跨越残基127至131的一系列甘氨酸残基。还提供了包括α‑溶血素变体的纳米孔组装体，所述组装体具有减少的穿入时间。例如，减少的穿入时间增加DNA测序效率和准确度。

Description

α-溶血素变体及其用途
序列表
本申请含有已经以ASCII形式电子提交且在此以其整体通过引用并入的序列表。所述ASCII拷贝，在2017年4月17日生成，名为P33551-WO_SL.txt，且大小为43,124字节。
技术领域
公开了与金黄色葡萄球菌(Staphylococcal aureaus)α-溶血素变体相关的组合物和方法。所述α-溶血素(α-HL)变体可用作例如用于测定聚合物序列信息的设备中的纳米孔组分。本文所述的纳米孔、方法和系统采用具有改善的特征的基于纳米孔的单分子技术提供单链核酸诸如DNA、RNA等的定量检测。
背景
溶血素是由多种生物体产生的蛋白毒素家族的成员。一些溶血素(例如α溶血素)可以通过在膜中形成孔或通道来破坏细胞膜(例如，宿主细胞膜)的完整性。由成孔蛋白在膜中形成的孔或通道可以用于将某些聚合物(例如，多肽或多核苷酸)从膜的一侧运输到另一侧。
α-溶血素(α-HL、a-HL或alpha-HL)是在宿主细胞膜中形成通道的自组装毒素。α-HL已成为纳米孔测序界的主要组分。它具有许多有利的性质，包括高稳定性、自组装和足够宽以容纳单链DNA、但不容纳双链DNA的孔径(Kasianowicz等人, 1996)。
以前关于a-HL孔中DNA检测的工作已经集中在分析随着DNA通过孔转移的离子电流特征(Kasianowicz等人, 1996, Akeson等人, 1999, Meller等人, 2001)，考虑到转移速率(在100 mV为~1 nt/ μs)和离子电流信号中的固有噪声，这是一项非常困难的任务。通过并入永久束缚到孔内部的探针分子，已经在基于纳米孔的传感器中实现了更高的特异性(Howorka等人, 2001a和Howorka等人, 2001b; Movileanu等人, 2000)。
野生型a-HL导致显著数目的缺失错误，即没有测量到碱基。因此，需要具有改善的性能的α-HL纳米孔。
发明概述
如本文所述，提供了含有氨基酸变异的突变葡萄球菌α溶血素(αHL)多肽，所述氨基酸变异增强穿入时间(time to thread)，例如减少捕获目标分子的时间。例如，公开的变体减少目标分子(例如，各种标记的核苷酸或待测序的核苷酸)的穿入时间。
在某些实例方面，α-溶血素(α-HL)变体在对应于SEQ ID NO:14(成熟的野生型α溶血素序列)的V149K、E287R、H35G、T109K、P151K、K147N、E111N、M113A或其组合中的任一个的位置处包含取代。α-溶血素的取代也可以是正电荷。α-溶血素变体还可以包括SEQ ID NO:14的H144A处的取代。在某些方面，α-溶血素变体还可以包括SEQ ID NO:14的残基127-131处的一个或多个甘氨酸残基，诸如跨越SEQ ID NO:14的残基127至131的整个长度的一系列甘氨酸残基。
在某些实例方面，α-溶血素变体包括具有本文所述的取代中的至少一个的氨基酸序列，而α-溶血素变体的序列与如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少80%、90%、95%、98%或更多序列同一性。在某些实例方面，所述α-溶血素变体包括与如SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少80%、90%、95%、98%或更多序列同一性的氨基酸序列。
在某些实例方面，α-溶血素变体可以包括对应于SEQ ID NO:14的H35G+V149K的取代。另外或可替代地，α-溶血素变体可以包括对应于SEQ ID NO:14的V149K+E287R+H35G的取代。另外或可替代地，α-溶血素变体可以包括对应于SEQ ID NO:14的V149K+E287R的取代。另外或可替代地，α-溶血素变体可以包括对应于SEQ ID NO:14的T109K+H35G的取代。另外或可替代地，α-溶血素变体可以包括对应于SEQ ID NO:14的P151K+H35G的取代。另外或可替代地，α-溶血素变体可以包括对应于SEQ ID NO:14的V149K+P151K+H35G的取代。另外或可替代地，α-溶血素变体可以包括对应于SEQ ID NO:14的T109K+V149K+H35G的取代。另外或可替代地，α-溶血素变体可以包括对应于SEQ ID NO:14的V149K+K147N+E111N+127-131G+M113A+H35G的位置处的取代。另外或可替代地，α-溶血素变体可以包括对应于SEQ IDNO:14的V149K+K147N+E111N+127-131G+M113A的取代。另外或可替代地，α-溶血素变体可以包括对应于T109K+V149K+P151K+H35G的取代。在某些实例方面，任何这样的组合还可以包括SEQ ID NO:14的H144A处的取代。
在某些实例方面，本文所述的氨基酸取代允许添加异源分子，诸如聚乙二醇(PEG)。在某些实例方面，a-HL变体具有一个或多个翻译后修饰。在某些实例方面，所述取代是在约5至约8.5的pH下碱性或带正电荷的非天然氨基酸。
在某些实例方面，本文所述的α-溶血素变体与DNA聚合酶结合(诸如经由共价键)。例如，α-溶血素变体经由SpyTag/SpyCatcher连接与DNA聚合酶结合。在某些实例方面，α-溶血素变体经由异肽键与DNA聚合酶结合。
在某些实例方面，提供了七聚体纳米孔组装体。该组装体例如包括本文所述的α-溶血素变体中的至少一种或多种。例如，七聚体纳米孔组装体可以包括一种或多种α-溶血素分子，其在SEQ ID NO:14的V149K、E287R、H35G、T109K、P151K、K147N、E111N、M113A或其组合处具有取代，如本文所述。
在某些实例方面，提供了包括突变αHL多肽(M)的异聚体孔组装体，例如，含有野生型(WT)葡萄球菌αHL多肽和突变αHL多肽的孔组装体，其中所述突变αHL多肽的氨基酸变体(如本文所提供)占据孔结构的跨膜通道中的位置。例如，WT和变体αHL多肽的比率由式WT7- nMn表示，其中n是1、2、3、4、5、6或7。在某些方面，异七聚体中的αHL多肽的比率是WT7-nMn。在其它方面，所述比率是WT6M1。本文提供的公开内容还涵盖这样的同聚体孔：其中七聚体的每个亚基是突变的αHL多肽(即，其中n=7)。
例如，相对于由天然(野生型)α-溶血素组成的孔复合物，本文所述的纳米孔蛋白组装体可以具有改变的穿入时间(TTT)。例如，与包括天然(野生型)α-溶血素的七聚体纳米孔组装体相比，TTT可以降低，诸如降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多。
在某些实例方面，还提供了编码本文所述的任何α溶血素变体的核酸。例如，核酸序列可以衍生自金黄色葡萄球菌(SEQ ID NO:1)。在某些实例方面，还提供了包括编码本文所述的溶血素变体中的任何一种的任何此类核酸的载体。还提供了用所述载体转化的宿主细胞。
在某些实例方面，提供了产生如本文所述的α-溶血素变体的方法。所述方法包括，例如，在合适的条件下在合适的培养基中培养包括所述载体的宿主细胞以产生α-溶血素变体的步骤。然后使用本领域已知的方法从培养物中获得所述变体。
在某些实例方面，提供了检测靶分子的方法。所述方法包括，例如，提供芯片，其包含在膜中的如本文所述的纳米孔组装体，所述膜被布置为邻近或接近传感电极。所述方法然后包括引导核酸分子通过纳米孔。所述核酸分子与报告分子缔合，并包括寻址区域和探针区域。所述报告分子与探针区域的核酸分子缔合，并与靶分子偶联。所述方法进一步涉及在引导所述核酸分子通过所述纳米孔的同时对寻址区域进行测序，以确定所述寻址区域的核酸序列。借助计算机处理器，基于确定的所确定的寻址区域的核酸序列，鉴定靶分子。
本发明的其它目的、特征和优点将从下面的详细描述体现。然而，应当理解，尽管详述和具体实例指示本发明的优选实施方案，但是它们仅以示例的方式给出，因为在本发明的范围和精神内的各种改变和修改将从该详细描述变得对于本领域技术人员而言显而易见。
附图简述
图1是显示对照七聚体纳米孔与七聚体纳米孔相比的穿入时间的图，所述七聚体纳米孔包括一个α-溶血素/phi29 DNA聚合酶缀合物和六个α-溶血素变体(即1:6比率)，各变体在H35G+V149K+H144A处具有取代，如SEQ ID NO:4所示。对照纳米孔(标记为“WT”)包括1:6比率的α-溶血素/phi29 DNA聚合酶缀合物与6个野生型α-溶血素。这些数据由许多孔组合，所述孔捕获标记的核苷酸，表明所述孔具有聚合酶和模板DNA分子两者。如对于每种标签(对应于A、C、G、T)所示，与对照纳米孔相比，包括变体α溶血素的纳米孔的穿入率显著增加，因此证明改善(减少)的穿入时间。在C-核苷酸标签的情况下，穿入率的平均值从221.62s-1 (标准偏差13.6 s-1)增加至663.15 (标准偏差172 s-1)。其它核苷酸标签显示类似的增加，如图1中所示。
图2是显示用于生成图1的原始数据的图。图2代表用于我们的AC耦合系统的模数转换器(ADC)值，其当施加的偏压为正(175个ADC单位)时以及当施加的偏压为负(45个ADC单位)时产生用于开放通道的ADC值。当标记的核苷酸穿入孔中时，施加正偏压期间的ADC值从开放通道水平降低至145个ADC单位。在图2的放大的下侧图中显示了从1020至1040s的这样的几个实例。当施加的偏压为负时，标记的核苷酸离开孔，这是负开放通道水平没有显著降低的原因。为了计算穿入率，对于其前一个周期在穿入ADC值结束的周期，计算每个正偏压周期中ADC值达到穿入水平所需的时间分布。然后，将该柱状图拟合至标准的单指数函数，其衰减率是穿入率。
详述
现在将使用下述定义和实例仅通过参考来详细描述本发明。在本文中参考的所有专利和出版物(包括在这样的专利和出版物中公开的所有序列)都明确地通过引用并入。
除非在本文中另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGYAND MOLECULAR BIOLOGY，第2版，John Wiley and Sons，New York(1994)和Hale＆Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)给技术人员提供了在本发明中使用的许多术语的一般词典。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料都可以用在本发明的实践或测试中，但描述了优选的方法和材料。关于本领域的定义和术语，将从业人员特别引向Sambrook等人,1989,和Ausubel FM等人, 1993。应当理解，本发明不限于所描述的具体方法、规程和试剂，因为这些可能变化。
数字范围包括限定所述范围的数字。术语“约”在本文中用于表示值的加或减百分之十(10％)。例如，“约100”是指在90和110之间的任何数字。
除非另有说明，否则核酸以5'至3'取向从左到右书写；氨基酸序列分别以从氨基到羧基取向从左到右书写。
本文提供的标题不是本发明的各个方面或实施方案的限制，其可以通过参考整个说明书来获得。因此，在下面紧接着定义的术语通过参考整个说明书更完整地定义。
定义
α-溶血素：如本文所用，“alpha-溶血素”、“α-溶血素”、“a-HL”和“α-HL”可互换使用，且是指自组装成七聚体充水跨膜通道(即纳米孔)的单体蛋白。根据上下文，该术语还可以指由七个单体蛋白形成的跨膜通道。
氨基酸：如本文所用，术语“氨基酸”在其最宽的含义是指可以并入多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有一般结构H2N-C(H)(R)-COOH。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是合成的氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是D-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”是指通常在天然存在的肽中发现的二十种标准L-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除了标准氨基酸以外的任何氨基酸，无论它是合成制备的还是从天然来源获得的。如本文所用，“合成的氨基酸”或“非天然的氨基酸”包括化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(诸如酰胺)和/或取代物。氨基酸(包括在肽中的羧基端和/或氨基端氨基酸)可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化和/或用其它化学物质取代进行修饰，而没有不利地影响它们的活性。氨基酸可以参与二硫键。术语“氨基酸”与“氨基酸残基”可互换使用，并且可以是指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。从使用该术语的上下文显而易见，它是指游离氨基酸还是指肽的残基。应当指出，所有氨基酸残基序列在本文中都用这样的式表示：其左右取向为氨基端到羧基端的常规方向。
碱基对(bp)：如本文所用，碱基对是指在双链核酸中腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)或胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的配对关系。
互补：如本文所用的术语“互补”是指通过碱基配对在两个多核苷酸链的区域之间或在两个核苷酸之间的序列互补性的广义概念。已知腺嘌呤核苷酸能够与胸腺嘧啶或尿嘧啶核苷酸形成特异性氢键(“碱基配对”)。类似地，已知胞嘧啶核苷酸能够与鸟嘌呤核苷酸碱基配对。
表达盒：“表达盒”或“表达载体”是重组地或合成地产生的核酸构建体，其具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列指定的核酸元件。重组表达盒可以并入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，表达载体的重组表达盒部分除其它序列外还包括要转录的核酸序列和启动子。
异源的：“异源的”核酸构建体或序列具有这样的序列的一部分：所述序列对于它在其中表达的细胞而言不是天然的。关于控制序列，异源的是指这样的控制序列(即，启动子或增强子)，它在自然界中不起作用以调节它目前调节其表达的相同基因。通常，异源核酸序列对于它们存在于其中的细胞或部分基因组而言不是内源性的，并且已经通过感染、转染、转化、显微注射、电穿孔等添加至细胞中。“异源”核酸构建体可以含有与在天然细胞中发现的控制序列/DNA编码序列组合相同或不同的控制序列/DNA编码序列组合。
宿主细胞：术语“宿主细胞”是指含有载体并支持表达构建体的复制和/或转录，或转录和翻译(表达)的细胞。在本发明中使用的宿主细胞可以是原核细胞诸如大肠杆菌(E. coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)，或真核细胞诸如酵母、植物、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞。一般而言，宿主细胞是原核的，例如大肠杆菌。
分离的：“分离的”分子是这样的核酸分子，其与至少一种通常伴随它(例如，在它的天然环境中)的其它分子分离。分离的核酸分子包括被包含在通常表达所述核酸分子的细胞中的核酸分子，但是所述核酸分子在染色体外存在或位于不同于其天然染色体位置的染色体位置。
修饰的α-溶血素：如本文所用，术语“修饰的α-溶血素”是指起源于另一种(即亲本)α-溶血素的α-溶血素，并且与亲本α-溶血素相比含有一个或多个氨基酸改变(例如，氨基酸取代、缺失或插入)。在一些实施方案中，本发明的修饰的α-溶血素源自天然存在的或野生型α-溶血素或由其修饰而来。在一些实施方案中，本发明的修饰的α-溶血素源自重组的或工程改造的α-溶血素或由其修饰而来，包括但不限于嵌合α-溶血素、融合α-溶血素或另一种修饰的α-溶血素。通常，与亲本α-溶血素相比，修饰的α-溶血素具有至少一个改变的表型。
突变：如本文所用，术语“突变”是指引入亲本序列中的改变，包括但不限于取代、插入、缺失(包括截短)。突变的后果包括但不限于在由亲本序列编码的蛋白中未发现的新特性、性质、功能、表型或性状的建立。
纳米孔：如本文所用的术语“纳米孔”通常是指在膜中形成或以其它方式提供的孔、通道或通路。膜可以是有机膜，诸如脂质双层，或合成的膜，诸如由聚合材料形成的膜。膜可以是聚合材料。可以将纳米孔布置为邻近或接近传感电路或与传感电路偶联的电极，诸如例如，互补金属氧化物半导体(CMOS)或场效应晶体管(FET)电路。在一些实例中，纳米孔具有在0.1纳米(nm)至约1000nm的量级的特征宽度或直径。一些纳米孔是蛋白。α-溶血素是蛋白纳米孔的一个例子。
核酸分子：术语“核酸分子”包括RNA、DNA和cDNA分子。应当理解，作为遗传密码的简并性的结果，可以产生许多编码给定蛋白诸如α-溶血素和/或其变体的核苷酸序列。本发明预见到编码变体α-溶血素的每种可能的变体核苷酸序列，所有这些在考虑遗传密码的简并性的情况下都是可能的。
启动子：如本文所用，术语“启动子”是指起作用以指导下游基因的转录的核酸序列。启动子通常将适合于靶基因正在其中表达的宿主细胞。启动子与其它转录和翻译调节核酸序列(也称为“控制序列”)一起是表达给定基因所必需的。一般而言，转录和翻译调节序列包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列。
纯化的：如本文所用，“纯化的”是指，分子以含有它的样品的至少95重量%或至少98重量%的浓度存在于样品中。
纯化：如本文所用，术语“纯化”通常表示对含有转基因核酸或蛋白的细胞进行生物化学纯化和/或柱色谱法。
标签：如本文所用，术语“标签”是指可检测的部分，其可以是原子或分子，或原子或分子的集合。标签可以提供光学、电化学、磁学或静电(例如，感应的、电容的)特征，该特征可以借助于纳米孔来检测。通常，当核苷酸附接至标签时，它称为“标记的核苷酸”。标签可以通过磷酸酯部分附接至核苷酸。
穿入时间：术语“穿入时间”或“TTT”是指聚合酶-标签复合物或核酸链将所述标签穿入纳米孔的筒体所需的时间。
变体：如本文所用，术语“变体”是指与亲本蛋白相比表现出改变的特征(例如，改变的离子电导)的修饰的蛋白。
变体溶血素：术语“变体溶血素基因”或“变体溶血素”分别是指，通过除去、添加和/或操作编码序列已经改变了来自金黄色葡萄球菌的α-溶血素基因的核酸序列，或表达的蛋白的氨基酸序列已经根据本文所述的发明进行了修饰。
载体：如本文所用，术语“载体”是指被设计成在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”是指具有在外来细胞中并入并表达异源DNA片段的能力的载体。许多原核和真核表达载体是商购可得的。合适的表达载体的选择在本领域技术人员的知识范围内。
野生型：如本文所用，术语“野生型”是指这样的基因或基因产物：其具有该基因或基因产物从天然存在的来源分离时的特征。
同源性百分比：术语“％同源性”与本文中的术语“％同一性”在本文中可互换使用，并且是指当使用序列比对程序进行比对时，编码任何一个本发明多肽的核酸序列或本发明多肽的氨基酸序列之间的核酸或氨基酸序列同一性的水平。例如，本文中使用的80%同源性是指，与通过明确的算法确定的80%序列同一性相同的事物，且因此给定序列的同源物在给定序列的长度上具有大于80%序列同一性。序列同一性的示例性水平包括但不限于与给定序列(例如，本文所述的任何一种本发明多肽的编码序列)的80%、85%、90%、95%、98%或更高序列同一性。
可以用于确定两个序列之间的同一性的示例性计算机程序包括但不限于在因特网上可公开获得的BLAST程序的套装软件，例如，BLASTN、BLASTX和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN。也参见Altschul等人, 1990和Altschul等人, 1997。
在相对于GenBank DNA序列和其它公共数据库中的核酸序列评价给定的核酸序列时，通常使用BLASTN程序进行序列检索。BLASTX程序优选用于针对GenBank蛋白序列和其它公共数据库中的氨基酸序列检索已经在所有读码框中翻译的核酸序列。BLASTN和BLASTX都使用11.0的开放缺口罚分(open gap penalty)和1.0的延伸缺口罚分(extended gappenalty)的默认参数运行，并利用BLOSUM-62矩阵(参见例如，Altschul, S. F., 等人,Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)。
使用例如MacVector 13.0.7版中的CLUSTAL-W程序来执行所选择的序列的优选比对以确定两个或更多个序列之间的“％同一性”，其用默认参数运行，包括10.0的开放缺口罚分、0.1的延伸缺口罚分和BLOSUM 30相似度矩阵。
命名法
在本说明书和权利要求书中，使用氨基酸残基的常规单字母和三字母代码。
为了易于提及，使用以下命名法来描述本申请的变体：原始氨基酸；位置；取代的氨基酸。根据这个命名法，例如，在位置149的赖氨酸对缬氨酸的取代显示为：Val149Lys或V149K。
多种突变由加号分隔，诸如：His35Gly+Val149Lys或H35G+V149K代表位置35和149的突变，其分别用甘氨酸取代组氨酸和用赖氨酸取代缬氨酸。氨基酸取代的跨度用破折号代表，诸如从残基127至131的甘氨酸残基的跨度为：127-113Gly或127-133G。
α-溶血素的定点诱变
在本文中提供了金黄色葡萄球菌α溶血素野生型序列(SEQ ID NO:1, 核酸编码区; SEQ ID NO:14, 蛋白编码区)，且可在其它地方获得(国家生物信息学中心(NationalCenter for Bioinformatics)或GenBank登录号M90536和AAA26598)。
可以通过本领域已知的任何方法引入点突变。例如，可以使用QuikChangeLightning 2试剂盒(Stategene/Agilent)遵循生产商的说明书进行点突变。
引物可以从商业公司例如IDT DNA订购。
α-溶血素变体
本文提供的α-溶血素变体包括特定取代，或一种或多种取代组合，其改善基于纳米孔的测序反应中的穿入时间。通过改善穿入时间，可以在测定的序列中以较少缺失实现高精度DNA测序。
在某些实例实施方案中，本文提供的α-溶血素变体在如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的一个或多个位置处包括一个或多个突变。例如，可以突变表1中鉴定的残基中的任何一个或其组合，以形成α-溶血素变体。在某些实例实施方案中，由突变表1中鉴定的SEQID NO:14的氨基酸中的一个或多个而形成的α-溶血素变体与SEQ ID NO:14所示的序列具有80%、85%、90%、95%、98%或更多序列同一性。在某些实例实施方案中，所述突变导致添加正电荷。例如，所述突变可以导致表1中鉴定的氨基酸残基被取代为精氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬酰胺或可以携带正电荷的其它氨基酸。
在某些实例实施方案中，所述突变包括特定取代。例如，所述变体可以包括SEQ IDNO:14的V149K、E287R、H35G、T109K、P151K、K147N、E111N、M113A或其组合中的任一个的氨基酸取代。在其它实例实施方案中，所述变体可以包括一个或多个这些相同的取代，而整个序列可以与如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有最高达80%、85%、90%、95%、98%或更多序列同一性。在某些实例实施方案中，SEQ ID NO:14的前17个氨基酸中的一个或多个被突变为A、N、K或其组合。
为了改善纳米孔稳定性，例如，本文所述的α-溶血素变体中的任一种还可以包括SEQ ID NO:14的H144A处的氨基酸取代。另外或可替代地，任何变体可以包括跨越如SEQ IDNO:14所示的序列的残基127至残基131的一系列甘氨酸残基取代。
表1：可以被突变以形成α-溶血素变体的成熟α-溶血素的残基
位置* 残基 位置 残基 位置 残基 位置 残基 位置 残基
1 ALA 65 TYR 124 VAL 175 VAL 229 ALA
2 ASP 66 ARG 125 THR 176 ASN 235 ASP
3 SER 67 VAL 126 GLY 177 GLN 236 ARG
4 ASP 68 TYR 127 ASP 178 ASN 237 LYS
5 ILE 69 SER 128 ASP 179 TRP 238 ALA
6 ASN 70 GLU 129 THR 180 GLY 239 SER
8 LYS 71 GLU 130 GLY 181 PRO 240 LYS
9 THR 72 GLY 131 LYS 182 TYR 241 GLN
10 GLY 73 ALA 132 ILE 183 ASP 244 ASN
11 THR 74 ASN 134 GLY 184 ARG 246 ASP
13 ASP 75 LYS 135 LEU 185 ASP 250 GLU
14 ILE 79 ALA 136 ILE 186 SER 252 VAL
15 GLY 82 SER 137 GLY 187 TRP 253 ARG
16 SER 83 ALA 138 ALA 188 ASN 255 ASP
17 ASN 85 LYS 139 ASN 189 PRO 257 GLN
18 THR 87 GLN 140 VAL 190 VAL 259 HIS
19 THR 89 GLN 141 SER 191 TYR 260 TRP
20 VAL 90 LEU 142 ILE 193 ASN 261 THR
21 LYS 91 PRO 143 GLY 194 GLN 262 SER
22 THR 92 ASP 144 HIS 197 MET 263 THR
24 ASP 93 ASN 145 THR 198 LYS 264 ASN
25 LEU 94 GLU 146 LEU 199 THR 266 LYS
26 VAL 95 VAL 147 LYS 200 ARG 268 THR
27 THR 97 GLN 148 TYR 201 ASN 269 ASN
28 TYR 102 TYR 149 VAL 202 GLY 270 THR
29 ASP 103 PRO 150 GLN 203 SER 271 LYS
30 LYS 104 ARG 151 PRO 204 MET 272 ASP
31 GLU 105 ASN 152 ASP 205 LYS 273 LYS
32 ASN 106 SER 153 PHE 207 ALA 274 TRP
33 GLY 107 ILE 154 LYS 208 ASP 275 THR
35 HIS 108 ASP 155 THR 210 PHE 276 ASP
36 LYS 109 THR 156 ILE 211 LEU 277 ARG
37 LYS 110 LYS 158 GLU 212 ASP 278 SER
40 TYR 111 GLU 159 SER 213 PRO 280 GLU
44 ASP 112 TYR 160 PRO 214 ASN 281 ARG
45 ASP 113 MET 161 THR 215 LYS 282 TYR
46 LYS 114 SER 162 ASP 216 ALA 283 LYS
47 ASN 115 THR 163 LYS 218 SER 285 ASP
48 HIS 116 LEU 164 LYS 221 SER 286 TRP
49 ASN 117 THR 168 LYS 222 SER 287 GLU
50 LYS 118 TYR 170 ILE 224 PHE 288 LYS
51 LYS 120 PHE 171 PHE 225 SER 289 GLU
56 ARG 121 ASN 172 ASN 226 PRO 291 MET
62 ALA 122 GLY 173 ASN 227 ASP 292 THR
64 GLN 123 ASN 174 MET 228 PHE 293 ASN
* 位置对应于SEQ ID NO: 14中的特定氨基酸位置。
尽管α-溶血素变体可以包括如本文所述的取代的各种组合，但在某些实例实施方案中，α-溶血素变体包括取代的特定组合。例如，α-溶血素变体可以包括如SEQ ID NO:14所示序列的氨基酸取代的以下组合：
H35G+V149K；
V149K+E287R+H35G；
V149K+E287R；
T109K+H35G；
P151K+H35G；
V149K+P151K+H35G；
T109K+V149K+H35G；
V149K+K147N+E111N+127-131G+M113A+H35G；
V149K+K147N+E111N+127-131G+M113A；或，
T109K+V149K+P151K+H35G。
这样的组合还可以包括，例如，SEQ ID NO:14的H144A处的取代和/或SEQ ID NO:14的氨基酸127-113处的一系列甘氨酸残基。在某些实例实施方案中，所述α-溶血素变体包括与如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少80%、90%、95%、98%或更多序列同一性的氨基酸序列，其中在所述变体中保存了每个序列中鉴定的取代。
为了可以操纵所述变体和WT α-溶血素，在某些实例实施方案中，本文描述的任何氨基酸序列，诸如如SEQ ID NO:4-14所示的那些，也可以包括在C端末端处的接头/TEV/HisTAG序列，其具有序列GLSAENLYFQGHHHHHH (SEQ ID NO:16，其中TEV序列加下划线)。如本领域技术人员将理解，这样的序列允许纯化所述变体。
纳米孔组装和插入
本文描述的方法可以使用具有与纳米孔附接的聚合酶的纳米孔。在某些实例实施方案中，合乎需要的是，每个纳米孔具有一个且仅一个聚合酶(例如，使得在每个纳米孔处仅将一个核酸分子测序)。然而，许多纳米孔(包括α-溶血素(aHL))可以是具有多个亚基(例如，对于aHL而言7个亚基)的多聚体蛋白。亚基可以是相一多肽的相同拷贝。本文提供了具有修饰的亚基(例如a-HL变体)与未修饰的亚基(例如a-HL)的确定比率的多聚体蛋白(例如纳米孔)。
本文还提供了用于产生具有修饰的亚基与未修饰的亚基的确定比率的多聚体蛋白(例如，纳米孔或纳米孔组装体)的方法。例如，所述纳米孔组装体可以包括本文所述的任何α-溶血素变体。例如，七聚体纳米孔组装体可以包括一个或多个α-溶血素亚基，其具有对应于SEQ ID NO:14的V149K、E287R、H35G、T109K、P151K、K147N、E111N、M113A或其组合中的任一个的取代的氨基酸序列。在某些实例实施方案中，所述亚基中的一个或多个可以包括如本文所述的取代的特定组合。在纳米孔组装体中(诸如在七聚体组装体中)使用的任何变体也可以包括SEQ ID NO:14的H144A取代。
参考WO2014/074727的图27，用于组装具有多个亚基的蛋白的方法包括提供多个第一亚基2705并提供多个第二亚基2710，其中当与第一亚基比较时第二亚基被修饰。在一些情况下，第一亚基是野生型(例如，从天然来源纯化或重组产生)。可以以任何合适的方式修饰第二亚基。在一些情况下，第二亚基具有附接(例如，作为融合蛋白)的蛋白(例如，聚合酶)。
在某些实例实施方案中，修饰的亚基可以包含化学反应性部分(例如，适于形成键的叠氮基或炔基)。在一些情况下，该方法还包括进行反应(例如，点击化学环加成)，以将实体(例如聚合酶)附接至化学反应性部分。
在某些实例实施方案中，所述方法可以进一步包括以第一比率使第一亚基与第二亚基接触2715以形成多个具有第一亚基和第二亚基的蛋白2720。例如，一份修饰的具有适合于附接聚合酶的反应性基团的aHL亚基可以与六份野生型aHL亚基混合(即第一比率为1:6)。多个蛋白可以具有多个第一亚基与第二亚基的比率。例如，混合的亚基可以形成几个纳米孔，其具有修饰的亚基与未修饰的亚基的化学计量分布(例如1:6、2:5、3:4)。
在某些实例实施方案中，通过简单混合亚基形成蛋白。例如，在aHL纳米孔的情况下，去污剂(例如，脱氧胆酸)可以触发aHL单体呈现孔构象。纳米孔也可以例如使用脂质(例如，1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhPC)或1,2-二-O-植烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DoPhPC))和适度的温度(例如，小于约100℃)形成。在一些情况下，将DPhPC与缓冲溶液混合产生大的多层囊泡(LMV)，并且向该溶液中加入aHL亚基并将混合物在40℃孵育30分钟导致孔形成。
如果使用两种不同类型的亚基(例如，天然野生型蛋白和可以含有单个点突变的第二aHL单体)，则所得蛋白可以具有混合的化学计量(例如，野生型和突变蛋白的混合的化学计量)。在某些实例实施方案中，这些蛋白的化学计量可以遵循取决于在成孔反应中使用的两种蛋白的浓度的比率的公式。这个公式如下：
100 Pm= 100[n!/m!(n-m)!]·fmut m·fwt n~m，其中
Pm=具有m个突变亚基的孔的概率
n=亚基总数(例如，对于aHL为7)
m=“突变”亚基的数目
fmut=混合在一起的突变亚基的分数或比率
fwt=混合在一起的野生型亚基的分数或比率。
该方法可以进一步包括分级分离多个蛋白，以富集具有第一亚基与第二亚基的第二比率的蛋白2725。例如，可以分离具有一个且仅一个修饰的亚基的纳米孔蛋白(例如，1:6的第二比率)。但是，任何第二比率都是合适的。第二比率的分布也可以被分级分离，诸如富集具有一个或两个修饰的亚基的蛋白。形成蛋白的亚基的总数不总是7 (例如，可以使用不同的纳米孔，或者可以形成具有六个亚基的α-溶血素纳米孔)，如在WO2014/074727的图27所示。在一些情况下，仅具有一个修饰的亚基的蛋白被富集。在这种情况下，第二比率是每(n-1)个第一亚基1个第二亚基，其中n是构成蛋白的亚基的数目。
第一比率可以与第二比率相同，但是这不是必需的。在一些情况下，具有突变的单体的蛋白可以以比不具有突变的亚基的蛋白更低的效率形成。如果是这种情况，那么第一比率可以大于第二比率(例如，如果在纳米孔中需要1个突变的亚基与6个非突变的亚基的第二比率，则形成适当数目的1:6蛋白可能需要以大于1:6的比率混合所述亚基)。
具有亚基的不同第二比率的蛋白在分离中可以不同地表现(例如，具有不同的保留时间)。在某些实例实施方案中，使用色谱法(诸如离子交换色谱法或亲和色谱法)分级分离蛋白。由于除了修饰之外，第一亚基和第二亚基可以是相同的，所以蛋白上的修饰的数目可以充当分离的基础。在一些情况下，第一或第二亚基具有纯化标签(例如，在修饰之外)以允许或提高分级分离的效率。在一些情况下，使用多组氨酸标签(His-标签)、抗生蛋白链菌素标签(Strep-标签)或其它肽标签。在一些情况下，第一亚基和第二亚基各自包含不同的标签，且分级分离步骤基于每个标签进行分级分离。在His-标签的情况下，在低pH在标签上产生电荷(组氨酸残基在侧链的pKa以下变得带正电荷)。利用与其它aHL分子相比aHL分子之一上的电荷的显著差异，可以使用离子交换色谱法来分离具有0、1、2、3、4、5、6或7个“电荷-标记的”αHL亚基的寡聚体。原则上，该电荷标签可以是携带均匀电荷的任何氨基酸的串。图28和图29显示了基于His-标签的纳米孔的分级分离的实例。图28显示在280纳米的紫外吸光度、在260纳米的紫外吸光度和电导率的图。峰对应于具有修饰的亚基和未修饰的亚基的不同比率的纳米孔。WO2014/074727的图29显示了使用His-标签和Strep-标签的aHL纳米孔和其突变体的分级分离。
在某些实例实施方案中，实体(例如，聚合酶)在分级分离后附接至蛋白。所述蛋白可以是纳米孔，且实体可以是聚合酶。在一些情况下，该方法还包括将具有第二比率亚基的蛋白插入双层。
在某些实例实施方案中，纳米孔可以包含多个亚基。如本文所述，聚合酶可以附接至亚基之一，并且至少一个且少于所有的亚基包含第一纯化标签。在一些实例实施方案中，纳米孔是α-溶血素或其变体。在一些情况下，所有亚基都包含第一纯化标签或第二纯化标签。第一纯化标签可以例如是多组氨酸标签(例如，在具有附接的聚合酶的亚基上)。
附接至纳米孔的聚合酶
在某些实例实施方案中，聚合酶(例如，DNA聚合酶)附接至纳米孔和/或位于纳米孔附近。可以根据本文所述的方法和组合物使用能够在DNA合成反应期间合成DNA的任何DNA聚合酶。实例DNA聚合酶包括但不限于phi29 (芽孢杆菌噬菌体φ29)、pol6 (梭菌噬菌体phiCPV4；GenBank：AFH27113.1)或pol7 (放线菌噬菌体Av-1；GenBank：ABR67671.1)。在某些实例实施方案中，附接至纳米孔组装体的是DNA操纵或修饰酶，诸如连接酶、核酸酶、磷酸酶、激酶、转移酶或拓扑异构酶。
在某些实例实施方案中，所述聚合酶是聚合酶变体。例如，所述聚合酶变体可以包括美国专利申请号15/012,317 (“'317申请”)中鉴定的任何聚合酶变体。这样的变体包括，例如，SEQ ID NO:15 (其对应于'317申请的SEQ ID NO:2)的以下位置处的一个或多个氨基酸取代：H223A、N224Y/L、Y225L/T/I/F/A、H227P、I295W/F/M/E、Y342L/F、T343N/F、I357G/L/Q/H/W/M/A/E/Y/P、S360G、L361M/W/V、I363V、S365Q/W/M/A/G、S366A/L、Y367L/E/M/P/N、P368G、D417P、E475D、Y476V、F478L、K518Q、H527W/R/L、T529M/F、M531H/Y/A/K/R/W/T/L/V、N535L/Y/M/K/I、G539Y/F、P542E/S、N545K/D/S/L/R、Q546W/F、A547M/Y/W/F/V/S、L549Q/Y/H/G/R、I550A/W/T/G/F/S、N552L/M/S、G553S/T、F558P/T、A596S、G603T、A610T/E、V615A/T、Y622A/M、C623G/S/Y、D624F、I628Y/V/F、Y629W/H/M、R632L/C、N635D、M641L/Y、A643L、I644H/M/Y、T647G/A/E/K/S、I648K/R/V/N/T、T651Y/F/M、I652Q/G/S/N/F/T、K655G/F/E/N、W656E、D657R/P/A、V658L、H660A/Y、F662I/L、L690M或其组合。在某些实例实施方案中，所述聚合酶包括一个或多个这样的取代，并且与如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列具有80%、90%、95%、98%或更多序列同一性。如'317申请中所述，所述聚合酶变体相对于亲本聚合酶具有改变的酶活性、保真度、持续性、延伸率、测序精度、长连续读取能力、稳定性或溶解度。
聚合酶可以以任何合适的方式附接至纳米孔。例如，聚合酶可以以本领域已知的任何合适方式附接至纳米孔组装体。参见例如，PCT/US2013/068967 (公开为WO2014/074727; Genia Technologies)，PCT/US2005/009702 (公开为WO2006/028508)，和PCT/US2011/065640 (公开为WO2012/083249; Columbia Univ)。在某些实例实施方案中，聚合酶附接至纳米孔(例如，溶血素)蛋白单体，并且然后组装完整的纳米孔七聚体(例如，以1个具有附接的聚合酶的单体与6个没有附接的聚合酶的纳米孔(例如，溶血素)单体的比率)。然后可以将纳米孔七聚体插入膜中。
将聚合酶附接至纳米孔的另一种方法包括将接头分子附接至溶血素单体或使溶血素单体突变以具有附接位点，并然后组装完整的纳米孔七聚体(例如，以1个具有接头和/或附接位点的单体与6个没有接头和/或附接位点的溶血素单体的比率)。然后可以将聚合酶附接至附接位点或附接接头(例如，在插入膜内之前，整批)。还可以在膜中形成(例如，七聚体)纳米孔之后，将聚合酶附接至附接位点或附接接头。在一些情况下，将多个纳米孔-聚合酶对插入生物芯片的多个膜(例如，布置在孔和/或电极上)中。在一些情况下，聚合酶与纳米孔复合物的附接发生在每个电极上面的生物芯片上。
可以用任何合适的化学法(例如，共价键和/或接头)，将聚合酶附接至纳米孔。在一些情况下，用分子钉(molecular staple)，将聚合酶附接至纳米孔。在一些情况下，分子钉包含三个氨基酸序列(表示为接头A、B和C)。接头A可以从溶血素单体伸出，接头B可以从聚合酶伸出，并且接头C则可以结合接头A和B (例如，通过缠绕在接头A和B周围)，且由此可以使聚合酶结合由此可以使聚合酶结合至纳米孔。还可以将接头C构造为接头A或接头B的部分，从而减少接头分子的数目。
在某些实例实施方案中，使用SolulinkTM化学法将聚合酶连接至纳米孔。SolulinkTM可以是HyNic (6-肼基烟酸，一种芳族肼)和4FB (4-甲酰基苯甲酸酯，一种芳族醛)之间的反应。在一些情况下，使用点击化学(例如可从Life Technologies获得)，将聚合酶连接至纳米孔。在一些情况下，将锌指突变引入溶血素分子中，并然后使用分子(例如，DNA中间分子)将聚合酶连接至溶血素上的锌指位点。
另外或可替代地，在生理条件下自发形成共价异肽键的SpyTag/SpyCatcher系统可用于将α-溶血素单体与聚合酶连结。参见，例如，Li等人, J Mol Biol. 2014 Jan 23;426(2):309-17。例如，可以表达具有SpyTag结构域的α-溶血素蛋白。进一步，待与α-溶血素连结的DNA聚合酶可以单独表达为具有SpyCatcher结构域的融合蛋白。通过将α-溶血素/SpyTag融合蛋白与DNA聚合酶/SpyCatcher蛋白混合，SpyTag和SpyCatcher蛋白相互作用以形成α-溶血素单体，其经由共价异肽键与DNA聚合酶连接。
在某些实例实施方案中，可以在将纳米孔单体并入纳米孔组装体之前，将所述聚合酶附接至纳米孔单体。例如，在表达和纯化α-溶血素/SpyTag融合蛋白之后，将纯化的α-溶血素/SpyTag融合蛋白与纯化的聚合酶/SpyCatcher融合蛋白混合，因此允许SpyTag和SpyCatcher蛋白彼此结合以形成α-溶血素/聚合酶单体。然后可以将单体并入如本文所述的纳米孔组装体中以形成七聚体组装体。
在某些实例实施方案中，在形成纳米孔组装体之后，将聚合酶附接至纳米孔组装体。例如，在表达和纯化α-溶血素/SpyTag融合蛋白之后，将融合蛋白并入纳米孔组装体中以形成七聚体纳米孔组装体。然后将聚合酶/SpyCatcher融合蛋白与七聚体组装体混合，因此允许SpyTag和SpyCatcher蛋白彼此结合，这进而导致聚合酶与纳米孔组装体的结合。
由于基于纳米孔的测序反应的性质，本领域技术人员将理解，仅具有与每个纳米孔组装体缔合的单一聚合酶(而不是多个聚合酶)是有利的。为了实现这样的组装体，纳米孔组装体可以被配置为例如仅具有单个SpyTag，其因此允许附接单个聚合酶/SpyCatcher。
例如，在α-溶血素的情况下，将α-溶血素/SpyTag蛋白与额外的α-溶血素蛋白混合产生具有0、1、2、3、4、5、6或7个α-溶血素/SpyTag亚基的七聚体。然而，由于与每个七聚体缔合的SpyTag序列的数量不同(0、1、2、3、4、5、6或7个)，所述七聚体具有不同的电荷。因此，在某些实例实施方案中，可以通过本领域已知的方法(诸如经由用阳离子交换色谱法洗脱)分离七聚体。然后可以检查洗脱的级分以确定何种级分包括具有单个SpyTag的组装体。然后可以使用具有单个SpyTag的级分来将单个聚合酶附接至单个组装体，由此产生具有与之附接的单个聚合酶的纳米孔组装体。
尽管多种方法可以适合于确定哪个七聚体级分含有单个SpyTag (并且因此能够每个七聚体结合仅单个聚合酶/SpyCatcher融合蛋白)，但在某些实例实施方案中，不同的七聚体级分可以基于分子量(诸如经由SDS-PAGE)分离。然后可以使用试剂来证实与每种级分缔合的SpyTag的存在。例如，可以在经由SDS-PAGE分离之前，将SpyCatcher-GFP (绿色荧光蛋白)添加至级分中。
因为具有较少数量的SpyTag的七聚体比具有较大数量的SpyTag的七聚体更小，所以可以鉴定具有单个SpyTag的级分，如最远的条带迁移和SDS-PAGE凝胶中对应于所述条带的GFP荧光的存在所证明。例如，含有七个α-溶血素单体和零个SpyTag融合蛋白的级分将迁移最远，但当与SpyCatcher-GFP混合时不会发荧光，因为不存在与七聚体结合的SpyTag。然而，含有单个SpyTag的级分将迁移次远(与其它荧光条带相比)并且将发荧光，由此允许鉴定具有与七聚体结合的单个SpyTag的级分。在鉴定具有与七聚体结合的单个SpyTag的级分之后，然后可以将聚合酶/SpyCatcher融合蛋白添加至该级分中，由此将聚合酶连接至纳米孔组装体。
通过使用本文所述的方法和组合物，可以实现拴系至单个DNA聚合酶 -- 并且包括如本文所述的α溶血素变体中的一种或多种的纳米孔组装体。例如，七聚体纳米孔可以包括一个具有对应于SEQ ID NO:14的V149K、E287R、H35G、T109K、P151K、K147N、E111N、M113A或其组合中的任一个的取代的α-溶血素变体、五个成熟野生型α溶血素单体和第七个与聚合酶融合的α-溶血素单体(七聚体的总共七个亚基)。在某些实例实施方案中，所述纳米孔七聚体组装体可以包括1、2、3、4、5、6或7个本文所述的变体，其中所述亚基之一附接至本文所述的聚合酶。
装置设置
纳米孔可以形成在或以其它方式嵌入配置在与传感电路(诸如集成电路)的传感电极邻近的膜中。集成电路可以是专用集成电路(ASIC)。在一些实例中，集成电路是场效应晶体管或互补金属氧化物半导体(CMOS)。传感电路可以位于具有纳米孔的芯片或其它设备中，或者位于所述芯片或设备外，诸如处于芯片外(off-chip)构型。半导体可以是任何半导体，包括但不限于IV族(例如硅)和III-V族半导体(例如砷化镓)。关于用于检测核苷酸或标签的装置和设备设置，参见例如，WO 2013/123450。
基于孔的传感器(例如，生物芯片)可以用于单分子的电询问(electro-interrogation)。基于孔的传感器可以包括形成于膜中的本公开内容的纳米孔，所述膜被布置为邻近或接近传感电极。传感器可以包括对电极。膜包括反侧(即，面向传感电极的一侧)和顺侧(即，面向对电极的一侧)。
在某些实例实施方案中，相对于包括野生型α-溶血素的纳米孔(即，没有本文所述的取代中的任一个的纳米孔)，包括本文所述的α-溶血素变体中的一个或多个的纳米孔将具有改变的穿入时间。例如，可以减少标签穿过孔的时间(穿入时间或TTT)。在某些实例实施方案中，与由天然α-溶血素组成的七聚体纳米孔组装体相比，包含本文所述的变体中的一个或多个的纳米孔的TTT可以降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多。
在下面的实验公开内容中，应用以下缩写：eq (当量)；M (摩尔浓度)；μM (微摩尔浓度)；N (标准的)；mole (摩尔)；mmol (毫摩尔)；μmol (微摩尔)；nmol (纳摩尔)；g(克)；mg (毫克)；kg (千克)；μg (微克)；L (升)；ml (毫升)；μl (微升)；cm (厘米)；mm(毫米)；μm (微米)；nm (纳米)；℃ (摄氏度)；h (小时)；min (分钟)；sec (秒)；msec (毫秒)。
实施例
在以下实施例中更详细地描述本发明，以下实施例不以任何方式意图限制所要求保护的本发明的范围。附图意图被视作本发明的说明书和描述的组成部分。引用的所有参考文献对于其中描述的所有内容都通过引用特别并入本文中。提供下述实施例来解释、而不是限制要求保护的发明。
实施例1：表达和回收
本实施例解释了来自细菌宿主细胞(例如大肠杆菌)的蛋白的表达和回收。
编码野生型a-HL的DNA购自商业来源。通过测序验证序列。
质粒构建. 将编码野生型或变体α-溶血素的基因插入pPR-IBA2质粒(IBA LifeSciences, 德国)中，在T7启动子的控制下。
转化. 使用本领域众所周知的技术，将大肠杆菌BL21 DE3 (来自LifeTechnologies)细胞用包含编码野生型或变体α-溶血素的DNA的表达载体转化。简言之，将细胞在冰上解冻(如果冷冻的话)。接着，将期望的DNA (在合适的载体/质粒中)直接添加至感受态细胞中(不应超过感受态细胞的5％)，并通过轻弹管来混合。将管置于冰上20分钟。接着，将细胞置于42℃水浴中45秒而不混合，然后将管置于冰上2分钟。然后将细胞转移到含有0.9 ml SOC培养基的15 ml灭菌的培养管(在室温预热)中，并在振荡器中于37℃培养1小时。最后，将细胞的等分试样涂布在含有适当抗生素的LB琼脂平板上，并将平板在37℃孵育过夜。
蛋白表达. 转化后，挑取菌落，并接种到小体积(例如，3 ml)的含有合适抗生素的生长培养基(例如，LB液体培养基)中，在37℃振荡下过夜。
次日早晨，将1 ml过夜培养物转移到新的100 ml自诱导培养基，例如，含有适当抗生素的Magic Media (Life Technologies)，以选择表达质粒。在25℃振荡下使培养物生长大约16小时，但这取决于表达质粒。通过在4℃在3,000g离心20 min收获细胞，并在使用前储存在-80℃。
纯化. 通过超声处理裂解细胞。通过亲和柱色谱法将α-溶血素纯化至均质。
实施例2：α-溶血素变体
以下实施例详述了突变在所期望的残基处的引入。
突变. 使用QuikChange多位点定向诱变试剂盒(Stratagene, La Jolla, CA)进行定点诱变，以制备实例H35G+V149K+H144A，如SEQ ID NO:4中所述，但还包括C-端接头/TEV/HisTag用于纯化。
如在实施例1中表达和纯化变体。
实施例3：包括变体的纳米孔的组装
该实施例描述了包含六个a-HL变体亚基和一个野生型亚基的纳米孔的组装。
将野生型a-HL如实施例1所述与SpyTag和HisTag一起表达，并使用钴洗脱缓冲液(200mM NaCl, 300mM咪唑, 50mM tris, pH 8)在钴亲和柱上纯化。将H35G+V149K+H144Aa-HL变体如在实施例1中所述与HisTag一起表达，并使用钴洗脱缓冲液(200mM NaCl,150mM咪唑, 50mM tris, pH 8)在钴亲和柱上进行纯化。然后将蛋白与1mg TEV蛋白酶(每5mg蛋白)在4℃下孵育4小时。在与TEV蛋白酶孵育之后，在钴亲和柱上纯化混合物以除去TEV蛋白酶和未消化的蛋白。如果在5天内使用，则将蛋白在4℃储存，否则加入8％海藻糖并在-80℃储存。
使用大约10mg总蛋白，将α-HL/SpyTag与期望的α-HL-变体蛋白溶液以1:9的比率混合在一起以形成七聚体的混合物。预期这样的混合物将产生包括各种比率的α-HL/SpyTag和α-HL-变体蛋白(0:7；1:6，2:5，3:4，等)的各种级分，其中SpyTag组分作为七聚体的0、1、2、3、4、5、6或7个单体亚基存在。
将二植烷酰基磷脂酰胆碱(DPhPC)脂质溶解于50mM Tris、200mM NaCl(pH 8)或150mM KCl、30mM HEPES (pH 7.5)中至50mg/ml的终浓度，并添加至a-HL单体的混合物中至5mg/ml的终浓度。将a-HL单体的混合物在37℃孵育至少60min。其后，添加正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(βOG)至5％(重量/体积)的最终浓度以溶解所得脂质-蛋白混合物。将样品离心以澄清蛋白聚集物并留下脂质复合物，并收集上清液用于进一步纯化。
然后将七聚体的混合物进行阳离子交换纯化并收集洗脱级分。对于每种级分，制备两个样品用于SDS-PAGE。第一样品仅包括15 uL的α-HL洗脱液，并将第二样品与3 ug的SpyCatcher-GFP合并。然后将样品孵育并避光，且在室温下持续1-16小时。在孵育之后，将5uL 4x Laemmli SDS-PAGE缓冲液(Bio-RadTM)添加至每个样品中。然后将样品和PrecisionPlusTM无染料蛋白梯上样至4-20% Mini-PROTEAN无染料蛋白预制凝胶(Bio-Rad)上。将凝胶在200 mV下运行30分钟。然后将凝胶使用无染料滤光片成像。
可以通过SDS-PAGE期间的分子量条带移位观察到SpyCatcher-GFP与七聚体α-HL/SpyTag的缀合。含有单个SpyTag的七聚体将结合单个SpyCatcher-GFP分子，且将因此具有对应于七聚体孔的分子量加上单个SpyCatcher-GFP的分子量的移位，而具有两个或更多个SpyTag的七聚体应当具有相应地更大的分子量移位。因此，可以分析上述七聚体α-HL纯化期间从阳离子交换柱洗脱的峰的α-HL/SpyTag与α-HL-变体的比率。此外，当将SDS-PAGE凝胶成像时，可以使用GFP荧光滤光片观察到SpyCatcher-GFP附接的存在。
基于该基本原理，使用分子量标准蛋白梯测定其分子量移位对应于SpyCatcher-GFP的单次添加的级分。Bio-Rad的无染料成像系统用于测定分子量移位。使用蓝色滤光片测定GFP荧光的存在。荧光的存在用于证实SpyTag蛋白的存在。然后将对应于1:6比率(即一个α-HL/SpyTag:六个α-HL-变体)的洗脱级分用于进一步实验。
实施例4：聚合酶的附接
该实施例提供聚合酶向纳米孔的附接。
可以通过任何合适的方式将聚合酶与纳米孔偶联。参见例如PCT/US2013/068967(公开为WO2014/074727；Genia Technologies)，PCT/US2005/009702 (公开为WO2006/028508)和PCT/US2011/065640 (公开为WO2012/083249；Columbia Univ)。
将聚合酶(例如，phi29 DNA聚合酶)通过接头分子与蛋白纳米孔(例如，α-溶血素)偶联。具体地，使用SpyTag和SpyCatcher系统，其在生理条件下自发地形成共价的异肽键。参见，例如，Li等人, J Mol Biol. 2014 Jan 23;426(2):309-17。
简言之，将粘性phi29 SpyCatcher HisTag根据实施例1表达，并使用钴亲和柱进行纯化。将SpyCatcher聚合酶和SpyTag寡聚化蛋白在4℃在3mM SrCl2中以1:1摩尔比孵育过夜。然后使用尺寸排阻色谱法纯化1:6-聚合酶-模板复合物。
实施例5：变体的活性
该实施例显示了由实施例4提供的纳米孔(具有附接的聚合酶的纳米孔)的活性。
测定野生型和H35G+V149K+H144A变体纳米孔以确定所述取代的影响。更具体地，将该测定设计为使用交变电压(即，方波)测量通过附接至纳米孔的DNA聚合酶捕获标记的分子所花费的时间。
如于2014年10月23日提交的PCT/US14/61853中所述的，形成双层并插入孔。用于检测分子(和/或对核酸测序)的纳米孔设备(或传感器)如WO2013123450中所述设置。
为了测量在我们的测序复合物中DNA聚合酶捕获标记的核苷酸所花费的时间，我们已经设计了一种使用交变的正电压和负电压(方波)来确定所花费的时间量的测定。我们的测序复合物包含附接至单个DNA聚合酶的蛋白纳米孔(αHL)(参见实施例4)。标记的核苷酸是带负电荷的，且因此当施加的电压在性质上为正时被吸引到纳米孔，并且当施加到纳米孔测序复合物的电压为负时被排斥。所以我们可以通过在正电位和负电位之间循环的电压来测量标签穿入孔所花费的时间，并确定与当标签穿入时(减小的电流通量)相比纳米孔的电流有多少时间是无阻塞的(开放通道)。
为了进行“穿入时间”测定，将Genia测序设备与Genia测序芯片(GeniaSequencing Chip)一起使用。如在PCT/US2013/026514中所解释的，调节电极并且在芯片上建立磷脂双层。将Genia的测序复合物按照PCT/US2013/026514(公开为WO2013/123450)中描述的方案插入双层。使用包含20mM HEPES pH 8、300mM KGlu、3uM标记的核苷酸、3mM Mg2+的缓冲系统收集穿入时间数据，其中施加235mV峰-峰的电压，且占空比为80Hz。
在收集数据之后，针对显示标记的核苷酸的捕获(穿入水平)的方波对其进行分析，所述标记的核苷酸的捕获持续到方波的正部分结束且随后为在后续方波上的另一个标签捕获。通过确定第二个方波报告多长时间的无阻塞的开放通道电流来测量穿入时间。作为一个例子，如果10个连续方波显示持续到方波的正部分结束的标记的核苷酸捕获，则将从方波2-10计算穿入时间参数(因为在先前方波中聚合酶不具有与其结合的标签，所以第一个方波不计入计算)。然后收集实验中所有孔的这些穿入时间数值，并从它们提取统计参数(诸如平均值、中位数、标准差等)。
H35G+V149K+H144A变体(与对照相比)的结果显示于图1-2中。
应当理解的是，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且鉴于其的各种改变或变化将提示于本领域技术人员并且应当包括在本申请的精神和范围和随附权利要求的范围之内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请在此出于所有目的以其整体通过引用并入。
序列表自由文本
Figure 517300DEST_PATH_IMAGE001
SEQ ID NO:2 (WT aHL氨基酸) [如在大肠杆菌中表达]
Figure 700019DEST_PATH_IMAGE002
SEQ ID NO:3 (成熟WT aHL，具有纯化标签)
Figure 10915DEST_PATH_IMAGE003
Figure 406124DEST_PATH_IMAGE004
Figure 49858DEST_PATH_IMAGE005
Figure 872320DEST_PATH_IMAGE006
Figure 670512DEST_PATH_IMAGE007
Figure 869412DEST_PATH_IMAGE008
SEQ ID NO:14 (成熟WT aHL; AAA26598)
Figure 803870DEST_PATH_IMAGE009
SEQ ID NO:15 (Pol6，具有His标签)
Figure 797234DEST_PATH_IMAGE010
Figure 82722DEST_PATH_IMAGE011
Figure 819733DEST_PATH_IMAGE012
SEQ ID NO:16 (接头/TEV/HisTag (TEV部分加下划线)
Figure 671015DEST_PATH_IMAGE013
。
引文列表
专利文献
[1] 标题为“Methods for Creating Bilayers for Use with NanoporeSensors”的PCT/US2013/026514 (公开为WO2013/123450)
[2] 标题为“Nucleic Acid Sequencing Using Tags”的PCT/US2013/068967 (公开为WO 2014/074727)
[3] 2014年10月23日提交的标题为“Methods for Forming Lipid Bilayers onBiochips”的PCT/US14/61853
非专利文献
Figure 632017DEST_PATH_IMAGE014
Figure 873643DEST_PATH_IMAGE015
Figure 915811DEST_PATH_IMAGE016
本文引用的每篇专利、专利申请、出版物、文件、GENBANK序列、网站和其它出版的材料的整个内容特此通过引用并入，包括所有表、图和数字。所有专利和出版物通过引用并入本文，其程度如同具体地且单独地指出各自通过引用并入。上述专利、专利申请、出版物和文件的引用不是承认上述的任一项是相关的现有技术，也不构成关于这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。本文提及的所有专利和出版物指示本发明所属领域的普通技术人员的技能水平。
Figure IDA0001920286550000011
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Figure IDA0001920286550000221

Claims (12)

1.α-溶血素(α-HL)变体，其由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的α-溶血素变体，其中所述变体中的V149K取代包含一个正电荷。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的α-溶血素变体，其中所述α-溶血素变体与DNA聚合酶共价结合。
4.根据权利要求3所述的α-溶血素变体，其中所述变体经由异肽键与DNA聚合酶结合。
5.七聚体纳米孔组装体，其包含至少一个根据权利要求1-4中任一项所述的α-溶血素(α-HL)变体。
6.根据权利要求5所述的七聚体纳米孔组装体，其中所述孔组装体相对于由天然α-溶血素组成的孔复合物具有降低的穿入时间(TTT)。
7.编码根据权利要求1-4中任一项所述的α-HL变体的核酸。
8.权利要求7的核酸分子，其中所述核酸分子编码SEQ ID NO:4的α-溶血素变体。
9.载体，其包含根据权利要求7-8中任一项所述的编码α-溶血素变体的核酸。
10.用权利要求9的载体转化的宿主细胞。
11.产生α-溶血素变体的方法，其包括以下步骤：
(a) 在合适的条件下在合适的培养基中培养根据权利要求10所述的宿主细胞以产生α-溶血素变体；
(b) 获得所述产生的α-溶血素变体。
12.用于检测靶分子的方法，其包括：
(a) 提供芯片，其包含在膜中的根据权利要求5-6所述的纳米孔，所述膜被布置为邻近或接近传感电极；
(b) 引导核酸分子通过所述纳米孔，其中所述核酸分子与报告分子缔合，其中所述核酸分子包含寻址区域和探针区域，其中所述报告分子与所述核酸分子在所述探针区域缔合，并且其中所述报告分子与靶分子偶联；
(c) 在引导所述核酸分子通过所述纳米孔的同时对所述寻址区域进行测序，以确定所述寻址区域的核酸序列；和
(d) 借助于计算机处理器，基于在(c)中确定的所述寻址区域的核酸序列鉴定所述靶分子。
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