CN105154558B - 一种检测dna中甲基化胞嘧啶的方法 - Google Patents

一种检测dna中甲基化胞嘧啶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测DNA中甲基化胞嘧啶的方法。具体检测方法如下：将DNA链用亚硫酸氢钠进行处理，将DNA上不含甲基的胞嘧啶变为尿嘧啶；然后以亚硫酸氢钠处理后的DNA链为模板链，利用不对称PCR扩增出与模板链互补的DNA链；与模板链互补的DNA链先用钨酸钾‑过氧化氢混合液处理，将非双链区域的鸟嘌呤氧化损伤；再用哌啶进行热处理，使氧化损伤的鸟嘌呤的位置特异性断裂；将DNA链用冰乙醇沉淀旋干后上样至电泳槽，通过聚丙烯酰胺变性胶中DNA条带对应的鸟嘌呤的位置确定甲基化胞嘧啶的位置和个数；甲基化胞嘧啶为5‑甲基胞嘧啶和/或5‑羟甲基胞嘧啶。

Description

一种检测DNA中甲基化胞嘧啶的方法
技术领域
本发明涉及DNA中甲基化胞嘧啶的化学检测方法，属于DNA测序领域。
背景技术
表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达可遗传的变化的一门遗传学分支学科。表观遗传学是对遗传学的补充。遗传学主要研究的是基因序列不同从而导致基因的表达发生变化，例如基因突变，染色体杂交等。表观遗传学研究的是在基因序列保持不变的情况下由于基因损伤而导致基因表达发生变化，例如DNA甲基化、染色体的结构变化及非编码的RNA调控过程等。这些对研究生命过程有十分重要的作用。目前研究较多的有母体效应、基因组印记、基因沉默和DNA甲基化等。研究者们发现基因损伤与人类的发育和肿瘤疾病有着密切关系，因此DNA甲基化已经成为了近些年来的研究热点之一。
DNA甲基化指的是DNA胞嘧啶(C)碱基的5号位共价修饰上了一个甲基，由于其有着特殊的作用，人们将其称为第5种碱基。5-甲基胞嘧啶(5mC)是1925年在研究结核杆菌过程中发现的。近些年，通过对5mC的深入研究发现，5mC在CpG岛中的含量与遗传变异有着密切的关系。CpG岛通常位于基因的启动子区，作为转录的起始位点，当CpG岛中5mC的含量异常时就会影响到转录的进行，从而阻断翻译的过程，使相关的蛋白无法正常表达，危害到人类的健康。5mC能够通过脱氨基作用形成胸腺嘧啶(T)，从而导致基因突变，如果不被纠正，将会导致癌症或遗传病。由于5mC与C只相差一个甲基，而且甲基也是惰性基团，这使得5mC的检测有一定难度。已报道的甲基化的检测方法有亚硫酸氢钠法、锇酸钾法及高碘酸钠法等。但是这些方法仍需要进一步改进提高其精确度。基于此，我们发明了一种特异性检测5mC的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供了一种快速、有效和灵敏的检测甲基胞嘧啶的方法。
本发明的技术方案具体如下：
一种检测DNA中甲基化胞嘧啶的方法，包括以下步骤：
（1）将DNA链用亚硫酸氢钠进行处理，将DNA上不含甲基的胞嘧啶变为尿嘧啶；
（2）以亚硫酸氢钠处理后的DNA链为模板链，利用不对称PCR扩增出与模板链互补的DNA链；
（3）与模板链互补的DNA链先用钨酸钾-过氧化氢混合液处理，将非双链区域的鸟嘌呤氧化损伤；再用哌啶进行热处理，使氧化损伤的鸟嘌呤的位置特异性断裂；
（4）将步骤（3）处理后的DNA链用冰乙醇沉淀旋干后上样至电泳槽，通过聚丙烯酰胺变性胶中DNA条带对应的鸟嘌呤的位置确定甲基化胞嘧啶的位置和个数；
所述的甲基化胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶和/或5-羟甲基胞嘧啶。
步骤（1）中将DNA链用亚硫酸氢钠进行处理的方式为：将DNA链与0.3M 的NaOH溶液在42℃下反应0.5小时；再加入氢醌、NaHSO3，然后液体石蜡液封，50℃反应16小时。
所述的钨酸钾-过氧化氢混合液中，钨酸钾和过氧化氢的摩尔比为1:10。
步骤（3）中与模板链互补的DNA链与钨酸钾-过氧化氢混合液在37℃反应2小时。
步骤（3）中，哌啶热处理的方式为：钨酸钾-过氧化氢混合液处理的与模板链互补的DNA链用冰乙醇沉淀后旋干，再加入哌啶90℃处理0.5小时。
如图1所示，DNA链用亚硫酸氢钠处理后，以其为模板，进行不对称PCR，再用钨酸钾与过氧化氢氧化损伤，最后用哌啶处理。通过变性胶中DNA条带可以清楚的看到5-甲基胞嘧啶和/或5-羟甲基胞嘧啶的位置和个数。
本发明是通过亚硫酸氢钠的处理，使得DNA上胞嘧啶变为尿嘧啶，而甲基胞嘧啶不受影响，以亚硫酸氢钠处理后的DNA为模板进行不对称PCR，通过钨酸钾和过氧化氢的氧化损伤，哌啶的热处理会使氧化损伤后的鸟嘌呤的位置特异性的断裂。从而会在DNA聚丙烯酰胺变性胶上看到特异性的DNA断裂条带，从而确定5-甲基胞嘧啶和/或5-羟甲基胞嘧啶的位置和个数。
附图说明
图1为本发明检测DNA中甲基化胞嘧啶的流程示意图。
图2 为含有2个5-甲基胞嘧啶按照本发明处理后的变性胶图；其中，条带1代表标记物；
条带2代表PCR后产物不经过任何处理；条带3代表PCR后产物经过钨酸钾和过氧化氢处理后再用哌啶处理。
图3含有4个5-甲基胞嘧啶按照本发明处理后的变性胶图；其中，条带1代表标记物；
条带2代表PCR后产物不经过任何处理；条带3代表PCR后产物经过钨酸钾和过氧化氢处理后再用哌啶处理。
具体实施方式
以下以具体实例对本发明的技术方案做进一步的说明。
实施例1
（1）DNA链的亚硫酸氢钠处理
首先将5 μL（10μM）的DNA稀释至50μL，然后加5.5μL的3M NaOH溶液，在42℃下反应0.5小时。再加入30μL (10μM)氢醌、520μL (3.6M) NaHSO3溶液、200μL液体石蜡50℃反应16小时，将DNA上不含甲基的胞嘧啶变为尿嘧啶。
（2）不对称PCR
以亚硫酸氢钠处理后的DNA链（10 ng）为模板，加入4μL (2.5mM) dNTP 混合物，5μL 10×PCR 缓冲液，1μL（1μM）正向引物，10μL (10μM)反向引物，0.5μL (5U/μL) TaKaRaTaq HS，加水补齐至50μL。不对称PCR扩增程序是：95℃ 15min； 94℃ 30 S、48℃ 30 S；72℃ 30 S，40个循环；72℃ 3min。PCR结束后冰乙醇沉淀旋干，得到与模板链互补的DNA链。
（3）钨酸钾与过氧化氢氧化损伤
将30μL (10mM，pH=7.0) Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液 、5μL (100mM) K2WO4、5μL (1M)H2O2、10μL PCR产物混合后在37℃反应2小时，将非双链区域的鸟嘌呤氧化损伤；冰乙醇沉淀后旋干，加入哌啶90℃处理0.5小时，使氧化损伤的鸟嘌呤的位置特异性断裂。冰乙醇沉淀旋干后上样至电泳槽，观察照胶结果，通过与G序列的比较，可以明显的看到反应后DNA条带对应着鸟嘌呤的位置从而对应着5-甲基胞嘧啶和/或5-羟甲基胞嘧啶的个数和位置。

Claims (5)

1.一种检测DNA中甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将DNA链用亚硫酸氢钠进行处理，将DNA上不含甲基的胞嘧啶变为尿嘧啶；
（2）以亚硫酸氢钠处理后的DNA链为模板链，利用不对称PCR扩增出与模板链互补的DNA链；
（3）与模板链互补的DNA链先用钨酸钾-过氧化氢混合液处理，将非双链区域的鸟嘌呤氧化损伤；再用哌啶进行热处理，使氧化损伤的鸟嘌呤的位置特异性断裂；
（4）将步骤（3）处理后的DNA链用冰乙醇沉淀旋干后上样至电泳槽，通过聚丙烯酰胺变性胶中DNA条带对应的鸟嘌呤的位置确定甲基化胞嘧啶的位置和个数；
所述的甲基化胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶和/或5-羟甲基胞嘧啶。
2.根据权利要求1所述的检测DNA中甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于：步骤（1）中将DNA链用亚硫酸氢钠进行处理的方式为：将DNA链与0.3M 的NaOH溶液在42℃下反应0.5小时；再加入氢醌、NaHSO3，然后液体石蜡液封，50℃反应16小时。
3.根据权利要求1所述的检测DNA中甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于：所述的钨酸钾-过氧化氢混合液中，钨酸钾和过氧化氢的摩尔比为1:10。
4.根据权利要求3所述的检测DNA中甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于：步骤（3）中与模板链互补的DNA链与钨酸钾-过氧化氢混合液在37℃反应2小时。
5.根据权利要求1所述的检测DNA中甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于：步骤（3）中加入哌啶热处理的方式为：将钨酸钾-过氧化氢混合液处理后的与模板链互补的DNA链用冰乙醇沉淀后旋干，再加入哌啶于90℃处理0.5小时。
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