CN103789429B - 一种检测dna中的5-甲基胞嘧啶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测DNA中5-甲基胞嘧啶方法，该方法以不对称PCR原理为基础运用含荧光基团的（脱氧鸟苷三磷酸）dGTP来检测DNA中的5甲基胞嘧啶。具体检测步骤如下：先用亚硫酸氢钠法处理含5甲基胞嘧啶的DNA，将DNA中的胞嘧啶转化为尿嘧啶,再通过不对称PCR可以得到大量目标DNA的互补链，这样与DNA中的胞嘧啶互补的是不带荧光的腺嘌呤，而与5甲基基胞嘧啶互补的是带荧光的dGTP。再通过DNA凝胶电泳（PAGE）可以检测DNA中的5-甲基胞嘧啶。此后在492nm处激发可以对DNA中的5-甲基胞嘧啶进行荧光检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测DNA中的5-甲基胞嘧啶的方法，属于核酸分析领域。
背景技术
表观遗传学被定义为研究基因表达水平(量变)信息的遗传。而DNA甲基化是表观遗传学的主要形式。
DNA甲基化与肿瘤有极大的关系。不同于正常细胞，肿瘤细胞中全基因组DNA处于低甲基化水平，从而引起染色体的不稳定以及原癌基因的激活等等。而在某些特定基因的高甲基化（如抑癌基因启动子CpG岛）导致的抑癌基因失活也是肿瘤发生的重要原因之一。因此，启动子CpG岛高甲基化的检测可用于肿瘤的早期检测；同时，特定基因的高甲基化也可作为肿瘤类型分类的依据。
现有的5甲基胞嘧啶的检测方法主要有亚硫酸氢钠法、甲基化特异性PCR、亚硫酸氢钠联合限制性内切酶法等等。然而，他们都有自身的局限性。限制性内切酶需要特定的酶切位点，因此只能反映特定酶切位点的甲基化情况。而对于甲基化特异性PCR，其引物必须包含一定数量的CpG岛来保证引物的特异性，从而有效识别甲基化和非甲基化模板DNA；因此，该方法不能有效反映除了引物之外的其他甲基化位点。而且其引物设计需要一定的技巧，否则容易引起假阳性和假阴性。基于以上各方法的局限性，发明一种能定性定量检测基因组甲基化的简易方法显得尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测DNA中的5-甲基胞嘧啶的方法，使用该方法能定性定量地检测DNA中特定抑癌基因的甲基化水平。
本发明的思路：由于在经过亚硫酸氢钠处理后，DNA中的普通胞嘧啶会被特异性地转化成为尿嘧啶，而5甲基胞嘧啶则不发生任何反应。这一表观遗传学差异可以进一步在PCR中通过碱基序列的差异反映出来，尿嘧啶在PCR扩增中被替换为胸腺嘧啶，而不反应的5甲基胞嘧啶则仍然读作为胞嘧啶。基于这一原理，我们特异性地引入了不对称PCR和带荧光基团（FAM）的Fluorescein-dGTP。由于不对称PCR产生的是模板的互补单链，因此在这条单链中鸟嘌呤所在的位置和个数就对应着样本DNA中5甲基胞嘧啶的位置和个数。再加上Fluorescein-dGTP的引入，5甲基胞嘧啶的定性和定量检测就可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光的方法来检测。
对于基因组DNA，我们分别提取了乳腺癌细胞株MDA-MB-231和肝癌细胞97L的基因组DNA，并分析了E-cadherin抑癌基因启动子的甲基化水平。
本发明方法的具体操作步骤如下：
1)设计待测DNA的引物，引物不包含CpG岛；
2)将DNA进行亚硫酸氢钠处理，将不含甲基的胞嘧啶转化成为尿嘧啶(对于基因组DNA，先用提取试剂盒提取细胞内的基因组DNA，再进行亚硫酸氢钠处理)；
3)进行不对称PCR，限制性引物和非限制性引物的比例为1:100，四种dNTP的终浓度为100μM，Fluorescein-dGTP占总dGTP的75%；
4)定性检测：将PCR产物用pore除盐柱除去未反应的Fluorescein-dGTP，用超纯水溶解纯化后的PCR产物，以492nm波长激发，扫荧光光谱，若发现荧光，则目标DNA中含有5甲基胞嘧啶；
定量检测：将PCR产物进行12%中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据相应电泳条带的荧光强度来定量分析5甲基胞嘧啶的含量。
本发明方法的引物设计不需要包含任何CpG岛，能同时对甲基化和未甲基化的模板进行扩增。但是对于未甲基化的DNA，由于所有的胞嘧啶都转化为了胸腺嘧啶，因此在不对称PCR产物中就没有Fluorescein-dGTP的插入。在凝胶电泳和荧光结果中也就没有相应的荧光带和放射峰，以此从甲基化的DNA中区别出来，实现甲基化的定性检测。
由于Fluorescein-dGTP插入的个数不同能通过聚丙烯酰胺凝胶上荧光带的强弱表现出来，因此，该方法还能实现甲基化的定量检测。
附图说明
图1聚丙烯酰胺凝胶电泳定量检测不同DNA中5甲基胞嘧啶的含量；
图2通过荧光的方法检测MDA-MB-231和97L细胞基因组E-cadherin抑癌基因启动子的甲基化水平。
具体实施方式
以下以具体实例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不限制本发明的内容。
以下为本发明实施例1和实施例2中使用的含有不同5甲基胞嘧啶个数的待测DNA序列。
实施例1：亚硫酸氢钠处理DNA
取小于2μg的DNA溶解在50μl的超纯水中，加5.5μl新鲜配制的NaOH(起始浓度为3M)，在42℃水浴锅中温育30分钟。在水浴期间配制10mM的对苯二酚（氢醌）。待30分钟水浴结束后加30μl至DNA混合溶液中，溶液变黄。再加入520μl3.6M的NaHSO3,轻柔颠倒溶液使混合均匀。最后加200μl石蜡油在50℃水浴锅中反应16小时。待反应结束后，将混合液用pore膜除盐，并在-80℃冰乙醇沉淀2h，干燥后溶于一定量的超纯水中并进行紫外定量。
实施例2：通过中性聚苯烯酰胺凝胶电泳的方法来定量检测5甲基胞嘧啶的含量。
上游引物GGGTTTTATTATTTTAATTAATATTATATT（SEQIDNo2），下游引物TCACCACTTCTCCCTCAAT（SEQIDNo3）。
不对称PCR反应溶液中包含1×PCR反应缓冲液,1μldATP，dTTP和dCTP(起始浓度为2mM),0.5μldGTP（起始浓度为1mM）,1.5μlFluorescein-dGTP(起始浓度为1mM)，最终保证这四种碱基终浓度相同，为200μM；2.5UHotstartTaq聚合酶，0.5μl上游引物(起始浓度为1μM),5μl下游引物(起始浓度为10μM)以及亚硫酸氢钠处理后的DNA模板（20ng）；最终的反应体积为20μl。不对称PCR的反应条件为：95℃变性15分钟，再经过35个扩增循环（94℃变性30秒，48℃退火30秒，72℃延伸30秒），最后再在72℃下延伸5分钟。
反应结束后，在20μl反应体系中加入4μl6×loadingbuffer，在12%的中性聚丙烯酰胺凝胶上上样，200V电压跑2h，最后扫胶得到相应的荧光带。
实验发现，含有不同5甲基胞嘧啶的模板链具有不同荧光强度的电泳带。DNA模板链中含有的5甲基胞嘧啶越多，互补链中的Fluorescein-dGTP就越多，相应的荧光带就越强。但如果模板链中没有5甲基胞嘧啶，就不能检测到相应的电泳带。同时，我们发现5甲基胞嘧啶的个数正好与电泳带荧光强度成线性关系，以此就可以用来准确定量DNA链中的5甲基胞嘧啶数量。
实施例3：通过荧光的方法检测MDA-MB-231和97L细胞基因组E-cadherin抑癌基因启动子的甲基化水平。
上游引物TAGTAATTTTAGGTTAGAGGGTTAT（SEQIDNo4），下游引物AAACTCACAAATACTTTACAATTCC（SEQIDNo5）。
MDA-MB-231和97L细胞均在含有10%胎牛血清，1%的链霉素-青霉素的改良型-1640培养基，5%CO2的培养箱中进行培养。随后用基因组DNA提取试剂盒提取该两株细胞的DNA，再进行亚硫酸氢钠处理和不对称PCR。不对称PCR的条件基本与实施例2一致。1×PCR反应缓冲液,1μldATP,dTTP和dCTP(起始浓度为2mM),0.5μldGTP（起始浓度为1mM）,1.5μlFluorescein-dGTP(起始浓度为1mM)，2.5UHotstartTaq聚合酶，0.5μl上游引物(起始浓度为1μM),5μl下游引物(起始浓度为10μM)以及亚硫酸氢钠处理后的DNA模板（120ng）。但由于引物的不同，退火温度不一致。PCR条件为95℃变性15分钟，再经过35个扩增循环（94℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸30秒），最后再在72℃下延伸5分钟。
反应结束后，将反应液加到含有400μl超纯水的pore膜中，1,2000rmp离心6分钟，将离心下来的液体吸去后再加入300μl超纯水，1,2000rmp离心6分钟；以此除去未反应的Fluoresein-dGTP。最后用200μl超纯水溶液溶解纯化后的DNA，以波长492nm激发扫光谱。
SEQUENCELISTING
<110>武汉大学
<120>一种检测DNA中的5-甲基胞嘧啶的方法
<130>
<160>5
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>76
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
cctcaccatctcaaccaatattatattacgcgtataacgcgtattgcgcgctataatatt60
gagggagaagtggtga76
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Claims (3)
1.一种非疾病诊断目的检测DNA中的5-甲基胞嘧啶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)设计待测DNA的引物，引物不包含CpG岛；
2)将DNA进行亚硫酸氢钠处理，将不含甲基的胞嘧啶转化成为尿嘧啶；
3)进行不对称PCR，限制性引物和非限制性引物的比例为1:100，四种dNTP的终浓度为100μM，Fluorescein-dGTP占总dGTP的75％；
4)定性检测：将PCR产物用pore除盐柱除去未反应的Fluorescein-dGTP，用超纯水溶解纯化后的PCR产物，以492nm波长激发，扫荧光光谱，若发现荧光，则目标DNA中含有5甲基胞嘧啶；
定量检测：将PCR产物进行12％中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据相应电泳条带的荧光强度来定量分析5甲基胞嘧啶的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对于基因组DNA，先用提取试剂盒提取细胞内的基因组DNA，再进行亚硫酸氢钠处理。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述待测DNA为SEQIDNo1，进行不对称PCR的上游引物为SEQIDNo2，下游引物为SEQIDNo3。
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