JPH06503963A - 改良ヒト化免疫グロブリン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 改良ヒト化免疫グロブリン 発明の分野 本発明は一般に、新規治療薬を開発するための組換えＤＮＡ技術とモノクローナ ル抗体技術との組合せ、そしてより詳しくは、所望の抗原に対する強い親和力を 有する非免疫原性抗体の製造に関する。

発明の背景 １９７０年代中頃におけるモノクローナル抗体技術の出現は新世代の医薬品の先 駆けとなった。ここで初めて研究者及び臨床医師は、所望する抗原部位に対して 結合することができ、且つ、種々の免疫学的エフェクター機能を有する本質的に 無限な量の均一な抗体に遭遇した。「モノクローナル抗体」として知られるこれ らのタンパク質は例えば生体内における有害な細胞の除去において大いに有望で あると考えられていた。事実、モノクローナル抗体の臨床的価値はその単独での 利用に関して無限であると思われている。

残念ながら、これらのタンパク質に基づく適当な治療製品の開発はモノクローナ ル抗体の生産に固有ないくつかの欠点によってかなり妨げられている。例えば、 はとんどのモノクローナル抗体はマウスに由来しており、それ故ヒトと完全によ く適合しない。これらは更にヒトにおいて用いたときに別の重要な免疫グロブリ ン機能特性を欠いている。

おそらく最も重要には、非ヒトモノクローナル抗体はヒトの患者の中に注射され たときに免疫原となるかなりのアミノ酸配列鎖を含むであろう。数多くの研究が 示すには、外来性抗体の注射の後、患者により保持される免疫応答はかなり強く なることがあり、初期処置の後のその抗体の治療的有用性は本質的に消えてしま うものである。更に、増え続けている種々のマウス又はその他の抗原性（ヒトに 対する）モノクローナル抗体が種々の疾患の処置のために開発されることが予測 されるに従い、任意の非ヒト抗体による１又は数回の処置の後のその後の処置は 、交差反応性のため、たとえそれとは無関係の治療であったとしても、効かない 、又はそれ自体が危険ともなる。

いわゆる「キメラ抗体」　（例えば、ヒトの定常領域に連結したマウスの可変領 域）の生産はある程度有用であることが実証されているが、決定的な免疫原的な 問題が残っている。更に、ヒ）Ｂ細胞を不死化させる又は所望の抗原に対するヒ トイムノグロブリンを生産することのできるヒトハイブリドーマを作り上げる努 力は、特に重要なヒト抗原に関連して不成功に終わっている。最近、供与性マウ ス又はラット免疫グロブリン由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）と組合せたヒトフ レームワーク領域を有する免疫グロブリンを生産せしめるのに組換えＤＮＡ技術 が利用されている（例えばＥＰＯ公開０２３９４００号を参照のこと）。このよ うな新規のタンパク質は「再成形化」又は「ヒト化」免疫グロブリンと呼ばれて おり、そして供与性免疫グロブリンのＣＤＲをヒトフレームワークと組合せるこ とによってそれをヒト様免疫グロブリンへと変えるプロセスは「ヒト化」と呼ば れている。ヒト化抗体は重要であり、なぜならそれらはもとの抗体と同様に同一 の抗原に結合するが、ヒトに注射されたときのその免疫原性は低いからである。

しかしながら、ヒト化手順に関する主たる問題は抗原に対する親和性の消失であ り（ＪｏｎｅｓらＮａｔｕｒｅ、　３２１．５２２−５２５　（１９８６））　 、ある状況においては、特に抗原がタンパク質であるとき、１０倍以上相違する （Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら５ｃｉｅｎｃｅ、　２３９．１５３４−１５３６　（１ ９８８ン）、親和力の消失はむろん非常に望ましくない、少なくとも、このこと はより高い価格及びより高い有害な作用の危険性において、より多量のヒト化抗 体を患者に投与しなくてはならないことを意味するであろう。より重要には、低 い親和力を有する抗体はより劣った生物学的機能、例えば補体溶解、抗体依存細 胞性關障害又はウィルス中和を有しうる１例えば、部分的ヒト化抗体ＨｕＶ）ｉ ｃＡＭＰにおける親和力の消失は補体溶解を媒介するその能力の全ての損失の原 因となりうる（Ｒｉｅｃｈｓａｎｎら、ハ旦ｒｅ、　３２２．３２３−３２７　 （１９８９）　Ｈ表１参照）。

従って、所望する抗原と強い親和力で特異的に反応するヒト化抗体が要望されて いる。このようなヒト化免疫グロブリンはヒトにおいて実質的に非免疫原的であ り続けながら、治療裂開及びその他の用途に適する状態において簡単に、且つ、 経済的に生産されるべきである０本発明はこのような及びその他の要望を満足せ しめる。

発明の要約 本発明は、例えばＴ細胞により媒介されるヒト障害の処置において有用である新 規組成物を提供し、該組成物は、ヒ）ＩＬ−２レセプターへのヒトＩｔ−２の結 合を特異的に阻止することができそして／またはヒトＩＬ−２レセプターのＰ７ ５タンパク質に結合することができるヒト化免疫グロブリンを含有する。該免疫 グロブリンは、２対の軽鎖／重鎖複合体を有し、典型的には少なくとも１本の鎖 がヒトフレームワーク領域セグメントに機能的に連結されたマウス相補性決定領 域を含んで成る鎖を有する。例えば、追加の天然由来のマウスアミノ酸残基を有 するかまたは有しないマウス相補性決定領域を用いて、約１０’Ｍ−’よりも強 力な親和カレヘルにおいて９７５タンパク質に結合することができるヒト様抗体 を生産することができる。

これらのヒト化免疫グロブリンはｐ７５に対するＣＤＲ−供与性（ｄｏｎａｔｉ ｎｇ）マウスモノクローナル抗体の結合性をもブロックすることができる。

本発明は更に、例えばＨ５νにより媒介されるヒト障害の処置において有用であ る新規組成物を提供し、該組成物はＨ５ＶレセプターへのＨ３ｖの結合を特異的 に阻止することができそして／又はＨＳＶ特異的タンパク質に結合することがで きるヒト化免疫グロブリンを含有する。該免疫グロブリンは、２対の軽鎖／重鎖 複合体を有し、その少なくとも１本の鎖はヒトフレームワーク領域セグメントに 機能的に連結されたｌ又は複数のマウス相補性決定領域を含んで成る。例えば、 追加の天然由来のマウスアミノ酸残基を有するか又は有しないマウス相補性決定 領域をヒトフレームワーク領域の中に導入して、約１０’Ｍ−’よりも強力な親 和力レベルにおいてＨ３Ｖ表層タンパク質に結合することができるヒト様抗体を 生産することができる。これらのヒト化免疫グロブリンはＨ３Ｖに対するＣＤＩ ！−供与性マウスモノクローナル抗体の結合性をもブロックすることができる。

これらのヒト化免疫グロブリンは実質的に純粋な状態において単独で利用される か、又は抗ウィルス剤、例えばアシクロビルもしくはウィルス表層にて活性な細 胞障害剤と一緒に利用されうる。これらの化合物は全て、Ｈ５Ｖにより媒介され る障害の処置において特に有用である。

本発明は更に、例えば骨髄白血病関連ヒト障害の処置において有用である新規組 成物を提供し、該組成物はＣＤ３３抗原に特異的に結合することができるヒト化 免疫グロブリンを含有する。該免疫グロブリンは、２対の軽鎖／重鎖複合体を有 し、その少なくとも１本の鎖はヒトフレームワーク領域セグメントに機能的に連 結された１又は複数のマウス相補性決定領域を含んで成る。例えば、追加の天然 由来のマウスアミノ酸残基を有するか又は有しないマウス相補性決定領域をヒト フレームワーク領域の中に導入して、約１０’Ｍ−’よりも強力な親和カレヘル においてＣＤ３３抗原に結合することができるヒト化抗体を生産することができ る。これらのヒト化免疫グロブリンはＣＤ３３に対するＣＤＲ−供与性マウスモ ノクローナル抗体の結合性をもブロックすることができる。これらのヒト化免疫 グロブリンは実質的に純粋な状態において単独で利用されるか、又は化学治療剤 、例えば白血病細胞に対して活性であるシトシンアラビノースもしくはダウノル ビシンと一緒に、又は放射性核種、例えばヨウ素１３１と腹合されて利用されつ る。これらの化合物は全て、白血病及び骨髄細胞により媒介される障害の処！に おいて特に有用である。

本発明は更に、例えばＣＭＶにより媒介されるヒト障害の処置において有用であ る新規組成物を提供し、該組成物はＣＭＶレセプターへのＣ？Ｉνの結合を特異 的に阻止することができそして／又はＣＭＶ抗原に結合することができるヒト化 免疫グロブリンを含有する。例えば、追加の天然由来のマウスアミノ酸残基を有 するか又は有しないマウス相補性決定領域をヒトフレームワーク領域の中に導入 して、約１０’Ｍ−’よりも強力な親和力レベルにおいてＣＭＶに結合すること ができるヒト化抗体を生産することができる。これらのヒト化免疫グロブリンは ＣＭＶに対するＣＩＩＲ−供与性マウスモノクローナル抗体の結合性をもブロッ クすることができる。これらのヒト化免疫グロブリンは実質的に純粋な状態にお いて単独で利用されるか、又は化学治療剤、例えばアシクロビルもしくはＣＭＶ 感染細胞に活性なガンシクロビルと一緒に、又は細胞障害剤と組合せて利用され うる。これらの化合物は全て、ＣＭＶにより媒介される障害の処置において特に 有用である。

本発明は更に、例えばヒト自己免疫障害の処置において有用である新規組成物を 提供し、該組成物はｒ−ＩＦＮに特異的に結合することができるヒト化免疫グロ ブリンを含有する。例えば、追加の天然由来のマウスアミノ酸残基を存するか又 は有しないマウス相補性決定領域をヒトフレームワーク領域の中に導入して、約 １０’Ｍ−’よりも強力な親和カレヘルにおいてｒ−ＩＦＮに結合することがで きるヒト化抗体を生産することができる。これらのヒト化免疫グロブリンはｒ− ＩＦＮに対するＣ［］］ｌ？−供与性マウスモノクローナル抗の結合性をもブロ ックすることができる。これらのヒト化免疫グロブリンは実質的に純粋な状態に おいて単独で利用されるか、又は化学治療剤、例えば非ステロイド系、抗炎症薬 、コルチコステロイド又は免疫抑制剤と一緒に利用されうる。これらの化合物は 全て、自己免疫障害の処置において特に有用である。

図面の簡単な説明 図１゜ヒト化抗体（下行）と比べた、マウスＦｄ７９抗体（上行）の軽鎖（Ａ） 及び重鎮（Ｂ）可変領域のアミノ酸配列（１文字）〔シグナル配列を含まず〕。

各類における３つのＣ［ｌＲに下線を付した。

マウスアミノ酸により置き代えられているヒト化抗体フレームワーク又は典型的 なヒトアミノ酸の残基に二重下線を付した。各行上の第１の位置の番号を左側に 示している。

図２゜ヒト化抗体（下行）と比べた、マウスＦｄ１３８−８０抗体（上行）の軽 鎖（Ａ）及び重鎮（Ｂ）可変領域のアミノ酸配列（１文字）〔シグナル配列を含 まず〕。各類における３つのＣＤＲに下線を付した。マウスアミノ酸により置き 代えられているヒト化抗体フレームワーク又は典型的なヒトアミノ酸の残基に二 重下線を付した。各行上の第１の位置の番号を左側に示している。

図３゜ヒト化抗体（下行）と比べた、マウスＭ１９５抗体（上行）の軽鎖（Ａ） 及び重ｔＮ（Ｂ）可変領域のアミノ酸配列（１文字）〔シグナル配列を含まず］ 。各類における３つのＣＤＲに下線を付した。

マウスアミノ酸により置き代えられているヒト化抗体フレームワーク又は典型的 なヒトアミノ酸の残基に二重下線を付した。各行上の第１の位置の番号を左側に 示している。

図４゜ヒト化抗体（下行）と比べた、マウス１ｌｉｋ−β１抗体（上行）の軽鎖 （Ａ）及び重鎮（Ｂ）可変領域のアミノ酸配列（１文字）〔シグナル配列を含ま ず〕。各鎖における３つのＣＤＲに下線を付した。マウスアミノ酸により置き代 えられているヒト化抗体フレームワーク又は典型的なヒトアミノ酸の残基に二重 下線を付した。各行上の第１の位置の番号を左側に示している。

図５゜ヒト化抗体（下行）と比べた、マウスＣＭＶ５抗体（上行）の軽鎖（Ａ、 　）及び重鎮（Ｂ）可変領域のアミノ酸配列（１文字）〔シグナル配列を含まず ）。各類における３つのＣＤＨに下線を付した。

マウスアミノ酸により置き代えられているヒト化抗体フレームワーク又は典型的 なヒトアミノ酸の残基に二重下線を付した。各行上の第１の位置の番号を左側に 示している。

図６゜重及び軽鎖可変ドメインｃＤＮＡのアンカー化ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ ＣＲ’）の図解。ＲＮＡはホットフェノール抽出法を利用して約１０７個のハイ ブリドーマ細胞から調製した。簡潔すると、細胞をＲＮＡ抽出緩衝液（５０ｍＭ の酢酸ナトリウムｐＨ５，２／　１％の５Ｏ５）　１ｍｌ中に再懸濁し、次いで ポルテンクスにかけ、０．５ｍｌのフェノールｐＨ５，２により６５°Ｃで１５ 分間、続いて氷上で更に１５分間抽出した。水性相を回収し、そしてエタノール で２回沈澱を行った。逆転写酵素（ＢＩ？Ｌ。

Ｂｅｔｈｅｓｅｄａ、　ＭＯ）及びプライマーとしてオリゴ−ｄＴ＋ｚ−＋ａ（ Ｐｈａｒｎ＋ａｃｉａ。

Ｐｉｓｃａｔｗａｙ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）を用いて１０μｓの全ＲＮ＾か らｃＤＮＡを合成した。ポリ（ｄＧ）テールを末端デオキシヌクレオチドトラン スフェラーゼ（ＢＲＬ）　（Ｅ、Ｙ、Ｌｏｈら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４３．２１ ７　（１９８９））を用いてｃＤＮＡの３′末ｉに連結させ、可変ドメイン遺伝 子（Ｖ　）　ＡｍｐｌｉＴａｑ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ　）を用 い、ポリ（ｄＧ）テールにハイブリダイズするプライ７−ｍｃ０４５　（ＴＡＡ ＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ）及Ｕ　定常ＧＭ　域 遺伝子（Ｃ）にハイブリダイズするプライマーにより増幅させた。軽鎖に関して 利用したプライマーはｍｃ０４５　（ＴＡＴＡＧＡＧ（：ＴＣＡＡＧＣＴＴＧＧ ＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣ）とした。重鎮に 関し利用したプライマーはｍｃ０４７　（ＴＡＴＡＧＡＧＣＴＣＡＡＧ（：ＴＴ ＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣ（ＣＡＴ）ＧＡＴＧＧＧＧ（ＧＣ）ＴＧＴ（ＴＣ） ＧＴＴＴＴＧＧＣ）　とした。

かっこ内の配列は塩基縮重を示している。この縮重は、このプライマーがほとん どのガンマ−饋とハイブリダイズできるように導入した。増幅させたフラグメン トを次にＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄｌ［Ｉにより消化し、そしてシーケンシングのた めにｐＵｃ１８ベクターの中にクローンした。

図７゜抗体ｌ１ｉｋ−β１の軽鎖（Ａ）及び重鎮（Ｂ）可変領域のｃＤＮＡの配 列及び翻訳アミノ酸配列。ＣＤＲ配列に下線を付した。成熟軽鎖タンパク質はア ミノ酸２３Ｑより、そして成熟重鎮タンパク質はアミノ酸２０Ｑより開始し、対 応のシグナル配列が先行している。

図８．プラスミドｐＶｇｌ−ｄｈｆｒ　（Ａ　）及びｐＶＫ（Ｂ）の図解。プラ スミドｐＶｇｌ−ｄｈｆｒは以下の部分を含む：　ａｓ＋ｐ及びｄｈｆｒ遺伝子 を含む約４２００塩基対のＢａｍＨＩ　−ＥｃｏＲＩフラグメント；ヒトサイト メガロウィルスＩＥＩ遺伝子プロモーター及びエンハンサ−を含む６３０ｂＰの フラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら超旦４１．５２１　（１９８５））　Ｃその５ ′及び３′末端においてＥｃｏＲＩ及びＸｂａ　Ｉリンカ−がそれぞれフランク している〕；並びに２１５ｂｐの先行イントロン及びポリ（Ａ）シグナルを有す るヒトガンマ−１定常領域遺伝子を含む２８００ｂｐのＸｂａ　Ｉ　−ＢａｍＨ Ｔフラグメント。プラスミドｐＶＫは、ガンマ−１遺伝子を１５３０ｂｐのヒト カンバ一定常領域遺伝子に置き換え、そしてｄｈｆｒ遺伝子をｇｐｔ遺伝子に置 き換えることで同様にして作製した。これらのプラスミドは当業界Ｑこよく知ら れている方法を利用ｊ−で、表示の部分より作製した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、第 ２版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　１．ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ。

（１９８９）を参照ノコと）、例えばｐＶｇｌ−ｄｈｆｒはプラスミドｐＶｇｌ 　（１９９０年９月２８日提出の共有譲渡米国特許出願第０７１５９０．２７４ 号）より、ｈｙｇ遺伝子含有旧ｎｄＩ［Ｉ−ＢｇｌＩＩフラグメントを、ｄｈｆ ｒ遺伝子を含みそしてＢａｌｌＩ部位に至る６６０ｂｐのフラグメントに置き換 えることによって作製した（Ｓｉｍｏｎｓｅｎら、ＰｒｏＣ，Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０．２４９５（１９８３））。

回９゜アイソトープ結合化コントロール抗体（−）、ヒト化ｍ１ｋ−β１抗体（ −−一−−）、キメラｍ１ｋ−β１抗体（・・・）により染色したＹＴＪＢ細胞 のフローサイトメトリー。細胞を約５　Ｘｌ０ｈ／＋ｗｌにてＦＡＣ５緩衝液（ ＰＢＳ＋２％のＢＳＡ＋　０．１％のアザイド）の中に懸濁した。１００μｌの 細胞懸濁物をボリスチレンチューブに移し、そしてＩｎ抗体１１００ｎと氷上で ３０分間インキユヘーヒトた。この細胞をＦＡＣ５Ｉｌ衝液で洗い、次いでヤギ 抗し）Ｉｇ抗体と氷上で更に３０分間インキユヘーヒトた。次にこの細胞を洗い 、そしてＦｒＴＣラヘル化ウサギつ−ヤギＩｇ抗体と３０分間インキユヘーヒト た。この細胞を再び洗い、そして最後にＰＢＳ＋１％のバラホルムアルゲヒドの 中に再懸濁させた。細胞をＦＡＣ３Ｉｌａｔｅ　（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎ ｓｏｎ）で分析した。

図１０゜ヒト化ａ＋ｉｋ−β１抗体（下行）及びヒ）　Ｌａｙ抗体（上行）の軽 鎖（Ａ）及び重鎮（Ｂ）のアミノ酸配列（シグナル配列を含まず）。各類の３つ のＣＤＲに下線を付した。ヒト抗体におけるマウスのアミノ酸により置き換えら れているフレームワークにおけるアミノ酸又は共通のヒトアミノ酸に二重下線を 付した。

図１１゜ヒト化１ｗ１ｋ−β１重鎖（Ｂ）及び軽鎖（Ａ）の作製に用いたオリゴ ヌクレオチド。以下の対のオリゴヌクレオチドを混ぜ、ソーケナーゼで伸長し、 そしてｐブルースクリプト［ｋｓ（＋）へフタ−へのリゲーソヨン前に表示の酵 素で切断した：　ｗｐｓ５４とνｃｌｌをＸｂａ　ｌと５ａｌｌにより、ｖｃ１ ２とｗｐｓ５７をＸｂａ　Ｉと５ａｌｌにより、ｖｄ６とｖｃ１３をＸｂａ　［ とＫｐｎ　Ｉにより、ｖｃ１４とｖｃ１５をＸｂａ　ＩとＫｐｎ　（により。次 に−ｐｓ５４−ｖｃｌｌとｖｃ１２−ｗｐｓ５７のフラグメントをＸｂａ　１と ５ａｉｌで切り出し、ｐＶｇｌ　ｄｈｆｒのＸｂａ　Ｉ部位の中に一緒にリゲー トした；また、ｖｅ１６−シｃ１３フラグメントとｖｄ４−　ｖｃ１５フラグメ ントをＸｂａ　ＩとＫｐｎ　（で切り出し、そしてｐＶＫのＸｂａ　１部位の中 に一緒にリゲートした。

図１２゜ＹＴＪＢ細胞へのラベル化−４ｋ−β１トレーサーの競合結合。

約１０″のＹＴＪＢ細胞を３．０ｎＨのラジオ−ヨウ素化マウス−１ｋ−β１抗 体（６μＣ４／μｇ）とインキュベートし、次いで２００ｕ１の結合用緩衝液（ ＰＢＳ　＋　１０％の胎児牛血清＋０．１％のＮａＮ、　＋　１０　ｕ　ｇ　／ 　ｍｌのマウスモノクローナルＩｇ）中の様々な量の未標識マウスｍ１ｋ−β１ 抗体（・）又はヒト化ｍ１ｋ−β１抗体（○）のいづれかとインキュベートした 。０°Ｃで２時間インキュベーシゴンした後、この細胞をマウスＩｇを含まない 結合用緩衝液で２回洗い、そして遠心により集めた。

細胞への放射活性結合を測定し、そして結合／遊離ｃｐｓの比で表わした。

図１３゜ヒト化−１ｋ−β１＋ヒト化抗−Ｔａｃ抗体によるヒトＰ）ＩＡ芽細胞 のＩＬ−２刺激増殖の阻害、抗体なしく口）、それぞれ２μｇのヒト化ｍ１ｋ− β１及びヒト化抗−Ｔａｃ添加（■）。

図１４．フズミ及びヒト化Ｆｄ７９抗体の重鎮（Ａ）及び軽Ｍ　（Ｂ）、並びに ネズミ及びヒト化Ｆｄ１３８−８０抗体の重鎮（Ｃ）及び軽鎖（Ｄ）のアミノ酸 配列。ｃＤＮＡより推定した不ズミ抗体の配列（上行）をヒト化抗体配列（下行 ）と並べて示す。ヒト化Ｆｄ７９及びＦｄ１３Ｂ−８０フレ一ムワーク配列はＰ ｏｍ抗体及びＥｕ抗体それぞれに由来する。残基はＫａｂａ　を系に従って番号 付けした（ε、Ａ、Ｋａｂａｔら、５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ　（Ｎａｔｉｏｎａｌ 　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ。

Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＯ）（１９８７））、各類の３つのＣＤＲを枠で囲った 。ネズミ配列により置き換えられた、又は共通ヒト配列のＰｏｍ又はＥｕフレー ムワーク中の残基に下線を付した。

図１５゜プラスミドｐＶｇｌ（Ａ）及びｐＶＫ　（Ｂ　）の図解。プラスミドｐ Ｖｇｌを以下のフラグメントより作製した：　ａｍｐ及びｈｙｇ遺伝子に含むプ ラスミドｐｓＶ２ｈｐｈに由来する約４８５０塩基対のＢａ５Ｈｌ　−ＥｃｏＲ Ｉ　７ラグメント；ヒトサイトメガロウィルス■ＥＩ遺伝子プロモーター及びエ ンハンサ−を含む６３０ｂｐのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅ１ｌ　４ １゜５２１　（１９８５））　（その５′及び３′末端にてそれぞれＥｃｏＲＩ 及びＸｂａ　１びポリ（Ａ）シグナルを有するヒトガンマ−１定常頭域遺伝子を 含む２８ＱＯｂｐのＸｂａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩフラグメント、プラスミドｐＶＫ は、１５３０−ｂｐのヒトカッパ一定常領域遺伝子をガンマ−１遺伝子で置き換 え、そしてｇｐｔをｈｙｇ遺伝子で置き換えて同様に作製した。

図１６．　Ｆｄ７９　（Ａ）及びＦｄＬ３８−８０　（Ｂ　）抗体により染色し たＨ５Ｖ　−１感染化Ｖｅｒｏ細胞のサイトメトリー。アイソトープ結合化コン トロール抗体（・・）、ヒト化抗体（・・・）、キメラ抗体（−）。

Ｖｅｒｏ細胞にＨｓｖ−１（Δ３０５突然変異体（Ｆ株））を３　ｐｆｕ／細胞 にて一夜感染させた。細胞をトリプシンにより０．５ｍｇ／ｍｌにて１分処理し 、ＰＢＳでよく洗い、そしてＦＡＣ３緩衝液（ＰＳＢ＋２％のＢＳＡ＋　０．１ ％のアザイド）中で約５　ＸＩＯ’　／ｓｌで再懸濁した。１００μｌの細胞懸 濁物をポリスチレンチューブに移し、そして１１００ｎの精製抗体と氷上で３０ 分間インキュベートした。この細胞をＦＡＣ５ＩＩ衝液で洗い、そしてＦＩＴＣ ラヘル化ヤギ抗−ヒト抗体（Ｃａｐｐｅｌ）と氷上で更に３０分間インキュベー トした。この細胞を再び洗い、そして最後にＰＢＳ士１％のバラホルムアルデヒ ドの中で再＠眉した。細胞をＦＡＣ５ａ＋ａ　ｔｅ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉ ｎｓｏｎ）で分析した。

図１７゜Ｆｄ７９（Ａ）及びＦｄ１３８−８０　（Ｂ　）によるＨ５Ｖ−１１７ ）中和。いくつかの希釈率の抗体を１００ｐｆｕのウィルスと混ぜ、次いで３７ °Ｃで１時間インキュベートした。これらのウィルスを次に集密Ｖｅｒｏ＄ｉ胞 を有する６ウエルプレートに接種し、そして３７℃で１時間唆着させた。

この細胞に、培地中の１％のアガロースをかぶせ、そして４日間インキュベート した。ブラックを中性レッドで染めた。

図１８゜（Ａ）ネズミ又はヒト化Ｆｄ７９、ＣＢ）ネズミ又はヒト化Ｆｄ１３８ −８０による、組織培養物に散布したウィルスからの細胞の防御を調べるための 怒染化Ｖｓｒｏ細胞単層の免疫染色。密集Ｖｅｒｏ細胞の２４穴プレートにウィ ルスを０．１ρｆｕ／細胞で接種し、次いで培地に１０μｇ／Ｉｌ［の抗体２０ ０ｔｔｌを加える前に３７℃で２時間吸着させた。、４日目の終わりに、培養培 地を除去し、そしてプレートを３７°Ｃのインキュベーターの中に一装置いて乾 かした。ウィルス抗原を検出するため、各ウェルを２００μｌの抗−ｇＢ抗体と ０．５μｇ／ｍｌにおいて３７°Ｃで１時間インキュベートし、２回洗い、そし て２００μｌのベオキシダーゼコンジェゲヒト化ヤギ抗−マウスＩｇＧ　（Ｃａ ｐｐｅｌ、　１　：　３００希釈）と１時間、３７℃でインキュベートした。こ のプレートを洗い、次いで基質３−アミノ−９−エチル−カルバゾール（ＡＢＣ ）　（Ｓｉｇｍａ。

Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）で室温において１５分間発色させた０反応を水です すいで停止させ、次いで風乾した。

図１９．抗体門１９５の軽鎖（Ａ）及び重ＩＩ　（Ｂ）可変領域のｃＤＮＡの配 列及び翻訳アミノ酸配列。ＣＤＲ配列に下線を付した。成熟軽鎖タンパク質ばア ミノ＃２１　Ｄより、そして成熟重鎮タンパク質はアミノ酸２０Ｅより開始し、 対応のシグナル配列が先行している。

図２０．プラスミドｐＶｇｌ−ｄｈｆｒ　（Ａ）及びｐＶＫ（Ｂ）　（７１図図 ２０プラスミドＶｇｌ−ｄｈｆｒは以下の部分を含む：　ａｍｐ及びｄｈｆｒ遺 伝子を含む約４２００塩基対のＢａｍａｌ　ｌ　−ＥｃｏＲＩフラグメント；ヒ トサイトメガロウィルスＩＥＩ遺伝子プロモーター及びエンハンサ−を含む６３ ０ｂρのフラグメント（ＢｏｓｈａｒｔらＣｅ１１４１．５２１　（１９８５） ）　（その５′及び３′末端においてＥｃｏＲＩ及びＸｂａ　Ｉリンカ−がそれ ぞれフランクしている〕：並びに２１５ｂｐの先行イントロン及びポリ（Ａ）シ グナルを有するヒトガンマ−１定常領域遺伝子を含む２８００ｂｐのＸｂａ　［ Ｒａｍ）Ｉ　Ｔフラグメント。プラスミドｐｖＫは、ガンマ−１遺伝子を１５３ ０ｂｐのヒトカンバ一定常領域遺伝子に置き換え、そしてｄｈｆｒ遺伝子をｇｐ ｔ遺伝子に置き換えることで同様にして作製した。これらのプラスミドは当業界 によく知られている方法を利用して、表示の部分より作製した（Ｍａｎｉａｔｉ ｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａ ｎｕａｌｌ、第２版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ。

（１９８９）を参照のこと）。例えばｐＶｇｌ　ｄｈｆｒはプラスミドｐＶｇｌ より、ｈｙｇ遺伝子含有Ｈｉｎｄ　Ｉ［［−Ｂｇｌ　ＩＩフラグメントを、ｄｈ ｆｒ遺伝子を含みそしてＢａｌ［部位に至る６６０ｂｐのフラグメントに！き換 えることによって作製した（Ｓｒｓｉｏｎｓｅｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０．２４９５（１９８３））。

図２１．抗体なしく・・）、ヒト化Ｍ１９５抗体（・・・）、キメラＭ１９５抗 体（−−）により染色したｕ９３７細胞のフローサイトメトリー。細胞を約５Ｘ １０”／ｍｌにてＦＡＣ５Ｉｌ衝液（ＰＢＳ＋２％のＢＳＡ＋　０．１％のアザ イド）の中に懸濁した。１００ｕｌの細胞懸濁物をポリスチレンチューブに移し 、そして精製抗体５０ｎｇと氷上で３０分間インキュベートした。この細胞をＦ ＡＣ３ｉ衝液で洗い、次いでＦＩＴＣラベル化ヤギ抗ヒ目ｇ抗体と水上で更に３ ０分間インキュベートした。この細胞を再び洗い、そして最後にＰＢＳ＋−１％ のバラホルムアルデヒドの中に再懸濁させた。細胞をＦＡＣ３ｍａｔｅ　（Ｂｅ ｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。

図２２゜ヒト化Ｍ１９５抗体（下行）及びヒトＥｕ抗体（上行）の軽鎖（Ａ）及 び重鎮（Ｂ）のアミノ酸配列（シグナル配列を含まず）。

各類の３つのＣＤ１１に下線を付した。ヒト抗体におけるマウスのアミノ酸によ り置き換えられているフレームワークにおける残基に二重下線を付した。

図２３゜ヒト化Ｍ１９５重鎖（Ａ；ｍａｌ−４）及び軽鎖（Ｂ；ｍａ５−８）の 作製に用いたオリゴヌクレオチド、以下の対のオリゴヌクレオチドを混ぜ、フレ ノウポリメラーゼで伸長し、そしてｐＵｃ１８へのリゲーシゴン前に表示の酵素 で切断した：　ｍａ　１とｍａ２をＫｂａ　ＥとＫｐｎ　ｒにより、ｎ＋ａ３と ｔａａ４をχｂａｌとＫｐｎ　Ｉにより、ｅｒａ５とｔｍａ６をＸｂａ　Ｉと旧 ｎｄｌｌｌにより、ｍａｌとｍａ８をχｂａｌと旧ｎｄｌｎにより。次にｍａｌ 　−ＩＩａ２とｍａ３−＋ｗａ４のフラグメントをＸｂａ　ＩとＫｐｎ　ｌでｐ Ｕｃ１８がら切り出し、ｐＶｇｌ　ｄｈｆｒのＸｂａ　１部位の中に一緒にリゲ ヒトした；また、ｍａ５−ｍａ６フラグメントとｍａ７−ｍａ８フラグメントを Ｘｂａ　Ｉと旧ｎｄｎ［で切り出し、そしてｐＶＫのＸｂａ　Ｉ部位の中に一緒 にリゲヒトした。

図２４．　［Ｊ９３７！胞へのラベル化Ｍ１９５１−レーサーの競合結合。約４ ×１０５のＵ９３７細胞を４．５μｇのラジオ−ヨウ素化マウスＭ１９５抗体（ ６μＣｉ／μｇ）とインキュベートし、次いで２００／７１の結合用緩衝液（Ｐ ＢＳ＋２％の胎児牛血清＋０．１％のアジ化ナトリウム）中の様々な量の未標識 マウス門１９５抗体（・）又はヒト化Ｍ１９５抗体（０）のいづれかとインキュ ベートした。０°Ｃで２時間インキュベーションした後、このａ＋ｍを結合用緩 衝液で２回洗い、そして遠心により集めた。

細胞−・の放射活性結合を測定し、そして結合／遊！１ｃｐｌＩの比で表わした 。

図２５゜抗体ＣＭＶ５の軽Ｍ　（Ａ）及び重鎮（Ｂ）可変領域のｃＤＮＡの配列 及び翻訳アミノ酸配列。ＣＤＲ配列に下線を付した。成熟軽鎖タンパク質の開始 点を矢印で示し、対応のシグナル配列が先行している。

図２６゜’７”ｙ　スミｌ’ｐＶｇｌ　−ｄｈｆｒ　（Ａ）及びｐＶＫ　（Ｂ　 ）　の図解。プラスミドｐＶｇｌ　ｄｈｆｒは以下の部分を含む：　ａｍｐ及び ｄｈｆｒ遺伝子を含む約４２００塩基対のＢａｗｌ（ｌ　−ＥｃｏＲＩフラグメ ント；ヒトサイトメガロウィルスＩＥＩ遺伝子プロモーター及びエンハンサ−を 含む６３０ｂｐのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら釦旦４１．５２１　（１９８ ５））　Ｃその５′及び３′末端においてＥｃｏＲＩ及びＸｂａ　Ｉリンカ−が それぞれフランクしている〕；並びに２１５ｂｐの先行イントロン及びポリ（Ａ ）シグナルを有するヒトガンマ−１定常領域遺伝子を含む２８００ｂｐのＸｂａ 　Ｉ　−Ｂａｗｌ　Ｉフラグメント。プラスミドｐＶには、ガンマ−１遺伝子を １５３０ｂｐのヒト力。

バ一定常領域遺伝子に１き換え、そしてｄｈｆｒ遺伝子をｇｐｔ遺伝遺伝エムき 換えることで同様にして作製した。これらのプラスミドは当業界によく知られて いる方法を利用して、表示の部分より作製した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、第２ 版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｉ（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ １ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ。

（１９８９）を参照のこと）。例えばｐＶ［’　１．ａｓｅｒ　Ｊｅｔシリーズ ＩＩ　ＨＰＬＡＳＥＩＩは、ｈｙｇ遺伝子含存旧ｎｄｎｌ−８ｇｌｌｌフラグメ ントを、ｄｈｆｒ遺伝子を含みそしてＢａ１１１部に至る６６ｏｂｐのフラグメ ントに１き換えることによって作製した（Ｓｉｍｏｎｓｅｎら、Ｐｒｏｃ２ｑｔ １７Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、ＵＳＡ　８０．２４９５（１９８３））　。

図２７．ヒト化Ｃ？ｌＶ５抗体（下行）及びヒトＥｕ抗体（上行）の軽鎖（Ａ） 及び重鎮（Ｂ）のアミノ酸配列（シグナル配列を含まず）。

重鎖の３つのＣＤＲに下線を付した。ヒト抗体におけるマウスのアミノ酸により 置き換えられているフレームワークにおける残基又は共通のヒトアミノ酸に二重 下線を付した。

図２８．ヒト化ＣＭＶ５軽鎖（Ａ　；　ｊｂ１６−ｊｂ１９）及び重鎖（Ｂ；ｊ ｂ２０−ｊｂ２２）の作製に用いたオリゴヌクレオチド、以下の対のオリゴヌク レオチドを混ぜ、タレノウポリメラーゼで伸長し、そしてｐｌＪＣ１８へのリゲ ーノヨン前に表示の酵素で切断した：　ｊｂ１６とｊｂ１７をＸｂａ　ＩとＥｃ ｏＲＩにより、ｊｂ１８とｊｂ１９をＸｂａ　ＩとＥｃｏＲＩにより、ｊｂ２０ とｊｂ２１をＸｂａ　ＩとＫｐｎ　Ｉにより、ｊｂ２２とｊｂ２３をＸｂａ　Ｉ とＫｐｎ　ｌにより０次にｊｂ１６　ｊｂ１７とｊｂ１８−　ｊｂ１９のフラグ メントをＸｂａ　ＩとＭｌｕ　Ｉで切り出し、そしてｐＶＫのＸｂａ　１部位の 中に一緒にリゲヒトした；また、ｊｂ２０−ｊｂ２１フラグメントとｊｂ２２− ｊｂ２３フラグメントをＸｂａ　Ｉとにｐｎ！で切り出し、そしてｐＶｇｌ　ｄ ｈｆｒのＸｂａ　１部位の中に一緒にリゲヒトした。

図２９゜ＣＭＶ感染化細胞へのラヘル化聞ν５トレーサーの競合結合。

マウス（・）又はヒト化（０）ＣＭν５抗体の量を増やしながらトレーサーラジ オヨウ素化マウスＣＭＶ５と共にＣＭＶ−感染化ＨＥＬ細胞に加え、次いで細胞 に結合したトレーサーの量を決定した。

図３０．抗体ＡＦ２の軽１！（Ａ）及び重１１（Ｂ）可変領域のｃＤＮＡの配列 及び翻訳アミノ酸配列、ＣＤＲ配列に下線を付した。成熟軽鎖タンパク質はアミ ノ酸３ＯＮより、そして成熱重鎖タンパク質はアミノ酸３６Ｑより開始し、対応 のシグナル配列が先行している。

図３１．ブーｙスミドｐＶｇｌ　ｄｈｆｒ　（Ａ　）及びｐＶＫ（Ｂ）の図解。

プラスミドｐＶｇｌ−ｄｈｆｒは以下の部分を含む：　ａｓｐ及びｄｈｆｒ遺伝 子を含む約４２００塩基対のＢａｍＨＩ　−ＥｃｏＲＩフラグメント；ヒトサイ トメガロウィルスＩＥＩ遺伝子プロモーター及びエンハンサ−を含む６３０ｂｐ のフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔ９Ｃｅｌ！　４１．５２１　（１９８５））　 （その５′及び３′末端においてＥｃｏＲＩ及びＸｂａ　Ｉリンカ−がそれぞれ フランクしている〕：並びに２１５ｂｐの先行イントロン及びポリ（Ａ）シグナ ルををするヒトガンマ−１定常領域遺伝子を含む２８００ｂρのＸｂａ　Ｉ　− ＢａｍＨＩフラグメント。プラスミドｐＶＫは、ガンマ−１遺伝子を１５３０ｂ 、のヒトカッパ一定常領域遺伝子に置き換え、そしてｄｈｆｒ遺伝子をｇｐｔ遺 伝子に！き換えることで同様にして作製した。これらのプラスミドは当業界によ く知られている方法を＋１１用して、表示の部分より作製した（Ｍａｎｉａｔｉ ｓら、Ｍｏ１ｅｃ蛙セ−工ユ−９ｉｎ　：　Ａ　Ｌ　ｂｏｒａｙ打ＬＭａｎｕａ ↓・第２版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ＋　Ｎ、Ｙ。

（１９８９）を参照ノコト）。例えばｐＶｇｌ　ｄｈｆｒはプラスミドｐＶｇｌ 　（１９９０年９月２８日提出の共有譲渡米国特許出願第０７１５９０．２７４ 号）より、ｈｙｇ遺伝子含有旧ｎｄＤｌｌ−ＢｇｌＵフラグメントを、ｄｈｆｒ 遺伝子を含みそしてＲａｌｌＩ部位に至る６６０ｂｐのフラグメントに置き換え ることによって作製した（Ｓｉａ＋ｏｎｓｅｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　、　ｃａ 　、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０．２４９５）。

回３２゜ヒト化ＡＰ２抗体（下行）及びヒトＥｕ抗体（上行）の軽鎖（Ａ）及び 重鎮（Ｂ）のアミノ酸配列（シグナル配列を含まず）。

重鎖の３つのＣＤＲに下線を付した。ヒト抗体におけるマウスのアミノ酸により 置き換えられているフレームワークにおける残基又は共通のヒトアミノ酸に二重 下線を付した。

図３３６　ヒト化ＡＦ２軽鎖（Ａ　；　ｒｈｌＯｒｈ１３）及び重ＩＮ　（Ｂ　 ；　ｒｈ２０−２３）の作製に用いたオリゴヌクレオチド。以下の対のオリゴヌ クレオチドを混ぜ、タレノウポリメラーゼで伸長し、そしてｐｔｌＣ１８への１ １ゲーシヨン前に表示の酵素で切断した：　ｒｈｌＯとｒｈｌｌをＸｂａ　Ｉと Ｈｉｎｄ［［［により、ｒｈ１２とｒｈ１３をＸｂａ　ＩとＨ４ｎｄｎｌにより 、ｒｈ２０とｒｈ２１をＸｂａ　［とＥｅｏＲＩにより、ｒｈ２２とｒｈ２３を Ｘｂａ　ＩとＥｃｏＲＩにより。次にｒｈｌｏ−ｒｈｌｌとｒｈ１２−ｒｈ１３ のフラグメントをＸｂａ　Ｉと旧ｎｄｌＩ［で切り出し、ｐＶＫのＸｂａ　Ｉ部 位の中に一緒にリゲヒトした；また、ｒｈ２０−ｒｈ２１フラグメントとｒｈ２ ２−ｒｈ２３フラグメントをＸｂａ　ＩとＸｈｏ　Ｉで切り出し、そしてρシｇ ｌ−ｄｈｆｒのＸｂａ　［部位の中に一緒にリゲヒトした。

図３４゜γ−ＩＦＮ　と様々な濃度のマウスＡＦ２抗体と共にインキュベートし 、そして抗−ＨＬＡ−Ｄ抗体により染めたＨ５２９４Ｔ細胞の蛍光。

発明の詳細な説明 本発明に従い、強力な親和力で所望の抗原に特異的に結合できる新規なヒト化免 疫グロブリンが提供される。これらの免疫グロブリンは人体において実質的に非 免疫原性であるが、しがし少なくとも約１０”Ｍ−１、好マＬ、　＜　ハｌｏ” Ｍ−’〜１０”Ｍ−’又ハソレｉ、　＃）強い結合親和力を有する。該ヒト化免 疫グロブリンは、ヒトフレームワーク及び１又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ ）　、それに加えて抗原に特異的に反応する供与免疫グロブリンに由来する一定 の数のその他のアミノ酸を有するであろう。該免疫グロブリンは経済的に大量に 生産でき、そして例えば種々の技術によって種々のヒト障害の処置における利用 性が見い出される。

本発明をより完全に理解してもらうため、いくつかの定義を記載する０本ＨＡ細 書で用いる語「免疫グロブリン」は免疫グロブリン遺伝子により実質的にコード 化される１又は複数のポリペプチドより成るタンパク質に関する。認識されてい る免疫グロブリン遺伝子はカッパー、ラムダ、アルファ、ガンマ（ＩｇＧ＋、Ｉ ｇＧｇ＋　ＩｇＧｓ、ＩｇＧａ）、デルタ、ニブシロン及びミュ一定常領域、並 びに骨髄免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。全長免疫グロブリンの「軽 鎖」　（約２５ｋｄ又は２１４のアミノ酸）は可変領域遺伝子によりＮＯ，末端 にて（約１１０のアミノ酸）、そしてカッパー又はラムダ定常領域遺伝子はＣ０ ＯＨ末端にてコードされる。全長免疫グロブリンの「重鎮」　（約５０ｋｄ又は ４４６のアミノ酸）は可変領域遺伝子（約１１６のアミノ酸）及び上記その他の 定常領域遺伝子のうちの１つ、例えばガンマ（約３３０のアミノ酸をコードする ）により同様にコードされる。

免疫グロブリンの一形態は抗体の基本的な構造単位を構成する。

この形態は四量体であり、そして同一の２対の免疫グロブリン鎖より成り、それ ぞれの対は一本の軽鎖と一本の重鎮を有する。多対において、その軽及び重鎖の 可変領域は共に抗原に対する結合性のちととなっており、そしてその定常領域は 抗体のエフェクター機能のちととなっている。抗体に加えて、免疫グロブリンは 種々のその他の形態において存在することができ、それには例えばＦＶ＋　Ｆａ ｂ及び（Ｆａｂ”）ｔ、並びに二価バイブリド抗体（例えばＬａｎｚａｖｅｃｃ ｈ　ｉａら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉ＋ｎｕｎｏ１．１７．１０５　（１９８７））及び 一本１（例えば、Ｈｕｓ　ｔｏｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 　ｔｌｓＡ、　８５．５８７９−５８８３　（１９８８）及びＢｉｒｄら、５ｃ ｉｅｎｃｅ、　２４２．４２３−４２６　（１９８８））が含まれる。（一般に 、Ｈｏｏｄらの”Ｉｓ＋ｗｕｎｏｌｏｇｙ”　Ｂｅｎｊａｍｉｎ、　Ｎ、Ｙ、第 ２版（１９８４）　、及びＨｕｎｋａｐｉ　１１ｅｒとＨｏｏｄのハ紐皿、刀狙 、　１５−１６　（１９８６）を参照のこと）。

３つの超可変領域により干渉されている「フレームワーク」領域より成る免疫グ ロブリンの軽鎖又は重鎮可変領域はＣＤＲとも呼ばれる。フレームワーク領域及 びＣＤＲの長さは正確に決定されている（”５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏ ｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”　Ｅ、Ｋ ａｂａｔら、Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈ ｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　（１９８３）を参照のこと）。種々の軽鎖又は重 鎮のフレームワーク領域の配列が一つの種の中に関連して保存されている０本明 細書で用いる「ヒトフレームワーク領域」とは、天然由来のヒト免疫グロブリン のフレームワーク領域に実質的に同一（約８５％以上、通常は９０〜９５％又は それ以上）であるフレームワーク領域である。構成的軽鎖及び重鎮の組合せフレ ームワーク領域はＣＤＲを位置決めし、且つ、並べるために働く。ＣＤＲは抗原 のエピトープへの結合のための主因である。

キメラ抗体は、その軽鎖及び重鎮遺伝子が典型的には遺伝子工学により、異なる 種に属する免疫グロブリンの可変及び定常領域遺伝子から作製された抗体である 。例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する遺伝子の可変セグメントをヒト 定常セグメント、例えばガンマ−１及びガンマ−３に連結させることができるゆ 典型的な治療用キメラ抗体はそれ故マウス抗体に由来する可変性又は抗原結合性 ドメインとヒト抗体より成るバイブリドタンパクｉｔ（例えばＡ、Ｔ、Ｃ，Ｃ， 受託番号ＣＲＬ　９６８８は抗−Ｔａｃキメラ抗体を生産する）であるが、しか しながらその他の哺乳動物の種も利用されうる。

本明細書で用いる語「ヒト化」免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域及び 非ヒト（通常はマウス又はラッ日免疫グロブリンに由来する１又は複数のＣＤＲ を含んで成る免疫グロブリンに関する。

ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンを「供与体」と呼び、そしてフレームワ ークを提供するヒト免疫グロブリンを「受容体」と呼ぶ。

定常領域は存在している必要性はないが、しかしもしそれらがあるならば、それ らはヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、即ち、少なくとも約８５〜９ ０％、好ましくは約９５％以上同一であるべきである。従って、ヒト化免疫グロ ブリン全体は、可能としてばＣＤＲを除き、天然のヒト免疫グロブリン配列の対 応部分と実質的に同一である。ｒヒト化抗体」はヒト化軽鎖及びヒト化重鎮イム ノグロブリンを含んで成る抗体である。例えば、ヒト化抗体は例えば上記に定義 したような典型的なキメラ抗体を含まず、なぜならキメラ抗体の全可変領域は非 ヒトであるからである。供与抗体は「ヒト化」のプロセスによって「ヒト化」さ れると言われており、なぜなら得られるヒト化抗体はＣＤＲを提供する供与抗体 のそれと同じ抗原に結合することが予測されるからである。

本性により設計されたヒト化抗体は、抗原結合性又はその他の免疫グロブリン機 能に実質的に影響を及ぼさない追加の保存性アミノ酸置換を有しうる。保存性置 換とは組合せ、例えばｇｌＶ　＋　ａ　１　ａ　＋νａｌ。

ｉ１ｅ＋　Ｉｅｕ　＋ａＳｐ＋　ｇｌｕ　；ａｓｎ＋　ｇｉｎ　；　３ｅｒ＋　 ｔｈｒ　；　ｌｙｓ、　ａｒｇ　；及びｐｈｅ。

ｔｒｙを意図している。

ヒト化抗体を含むヒト化免疫グロブリンは遺伝子工学によって作製されている。

既に解明されているほとんどヒト化免疫グロブリン（Ｊｏｎｅｓら、前掲Ｈｖｅ ｒｈｏｅｙｅｎら、前掲；　Ｉ？ｉｅｃｈｗａｎｎら、前掲）は、特定の免疫グ ロブリン鎖のフレームワークと同一のフレームワーク、受容体、及び非ヒト供与 体免疫グロブリン鎖に由来する３つのＣＤＲを含んで成る。あるケースにおいて は（１？１ｅｃｈｓａｎｎら、前掲）、フレームワーク中の２個の付加アミノ酸 を別のヒトフレームワーク領域中のアミノ酸と同しになるように変えでいる。本 発明は基準を含んでおり、これに従い、ヒト化免疫グロブリン鎖を含んで成る抗 体の親和力を強めるため、ヒト化免疫グロブリン鎖のフレームワーク中の一定数 のアミノ酸が、受容体ではなく供与体におけるその位置のアミノ酸と同しである ように選ぶ。

本発明は、（例としてＣＤＲの入手源としてマウス抗体を使って）ヒト化抗体を 生産する従来方法における親和力の低下の２つの原因が、下記のためであるとい うモデルに基づく：（１）マウスＣＤＲをヒトフレームワークと結合する時、Ｃ ＤＲに密接したフレームワーク中のアミノ酸がマウスの代わりにヒトになる。

理論に結び付けようとせずに、本発明者らは、それらの変更されたアミノ酸が供 与体マウス抗体中とは異なる静電的または疎水的力を生しるため、それらがわず かにＣＤＲを歪め、そして歪められたＣＤＲは供与抗体中のＣＤＲが行うのと同 しくらい効果的な抗原との接触を行うことができないと考える； （２）また、ＣＤＲに密接しているがその一部ではない（即ちまだフレームワー クの一部である）元のマウス抗体中のアミノ酸は、親和力の原因である抗原との 接触を行うことができる。全てのフレームワークアミノ酸がヒトにされるので、 抗体がヒト化される時にそれらのアミノ酸は失われる。

（３）注射したマウス抗体はヒトの循環系の中で、正常な抗体の半減期よりもは るかに短い半減期を有することが報告されているＣＤ、５ｈａ−ら、Ｊ、ｆａｕ ｒ＋ｏ１．＋　１３８．４５３４−４５３８　（１９８７））　、注射したヒト 化抗体は天然由来のヒト抗体とより同等な半減期を有することが予測され、より 少ない量、且つ、より少ない数で投与されることが可能となる。

これらの間層を回避し、且つ、所望の抗原に対して非常に強力な親和力を有する ヒト化抗体を生産するために、本発明はヒト化免疫グロブリンを設計するための １又は複数の以下の原理を利用する。

更に、それらの基準は単独で、又は必要ならば組合せて利用することで、所望の 親和力又は他の特徴を獲得することができる。

原理は、受容体として、ヒト化すべき供与体免疫グロブリンとは通常相同性でな い特定のヒト免疫グロブリンに由来するフレームワークを利用するか、又は数多 くのヒト抗体に由来する共通フレームワークを利用することにある。例えば、デ ーターバンク（例えばナショナル　バイオメディカル　リサーチ　ファンデーシ ョン　プロティン　アイデンティフィケーション　リソース）における、ヒトの 重（又は軽）可変領域に対するマウスの重（又は軽）鎖可変領域の配列の比較が 示すには、異なるヒト領域に対する相同性の程度は典型的には約４０％から約６ ０〜７０％まで大きく変動する。受容体免疫グロブリンとして、供与体免疫グロ ブリンの重Ｍ（対応の軽ｔＫ）に最も相同であるヒト重Ｍ（対応の軽Ｍ）の１つ を選ぶことにより、供与体免疫グロブリンからヒト化免疫グロブリンとなる際に ほとんどアミノ酸が変更されないであろう。それ故、且つ、ここでも理論ニ結ヒ ツケられ金ことなく、Ｃ［ｌＲの構造を歪ませるようなＣＤＲ付近ノアミノ酸の 変化の機会は小さくなる。更に、ヒト化免疫グロブリン鎮を含んで成るヒト化抗 体の正確な全体的な形態は供与抗体の形態により近＜ｔ１４４以することができ 、これもＣＤＲの歪みの機会を下げ典型的には、少なくとも約１０〜２０種のヒ ト重鎮の代表的なコレクションにおける３〜５つの最も相同な重鎮可変領域配列 のうら１つが、重鎮フレームワーク及び同様に軽鎖の授けられる受容体として選 ばれるであろう。好ましくは、１〜３の最も相同な可変領域のうちの１つが利用 されるであろう。選ばれる受容体免疫イムノグロブリンは最も好ましくは供与体 免疫グロブリンに対してそのフレームワーク領域において少なくとも約６５％の 相同性を有するであろう。

多数のケースにおいて、ヒト化軽及び重鎮が互いに好適に接し合うことを確実に するため、受容体配列として、同一の抗体に由来する軽及び重鎖を利用すること が好ましいと考えられうる。この場合、その供与体の軽及び重鎮は、その完全な 配列が知られているヒト抗体、例えばＥｕ、　Ｌａｙ、　Ｐｏｍ、　Ｗｏｌ、　 Ｓｉｅ＋　Ｇａｌ、　Ｏｕ及び−ＥＡ抗体（Ｋａｂａｔら、前掲−通常、ヒト鎖 の最後の数個のアミノ酸は未知であり、従って別のヒト抗体との相同性によって 推定されねばならない）に由来する鎖に対してのみ比較されうる。軽及び重鎖可 変領域配列が共に、供与体の軽及び重鎖可変領域配列と全体的に最も相同性であ るヒト抗体が選ばれるであろう６選んだヒト抗体は軽及び重鎖受容体配列の両者 を提供するである・う。実際、ヒ）Ｅｕ抗体がこの機能を提供することがよく見 い出されている。

化免疫グロブリン鎖のフレームワーク中の少数のアミノ酸を選ぶことによって、 より高い親和力を獲得することができる。第２の原理は、どのアミノ酸を供与体 から選ぶかを規定する以下のカテゴリーである。好ましくは、これらのカテゴリ ーのうちの１つに属するほとんど又は全てのアミノ酸位置において、供与体アミ ノ酸は事実上選ばれるであろう。

カテゴリー１　：　ＣＤＨにおけるアミノ酸の位置はＫａｂａｔら、前掲に定義 されている。

カテゴリー２：ヒト受容体免疫グロブリンのフレームワーク中ノアミノ酸が、普 通でない〔即ち［まれである」　；本明細書中で使用されるこの用語は、代表的 なデーターバンク中のヒト重１（対応の軽鎖）ＶＳＩ域配列配列２０％以下、し かしながら通常は約１０％以下しかその位置に存在しないアミノ酸を示す］場合 、そしてその位置の供与体アミノ酸がヒト配列に典型的である［即ち「一般であ る」　；本明細書中で使用されるこの用語は、代表的なデーターバンク中の約２ ５％以上、しかしながら通常は５０％以上の配列に存在するアミノ酸を示す］場 合、受容体よりもむしろ供与体アミノ酸が選択されるだろう、この基準は、ヒト フレームワーク中の普通でないアミノ酸が抗体構造を破壊しないことを保証する のに役立つ。更に、一般でないアミノ酸をたまたまヒト抗体に典型的である供与 抗体からのアミノ酸で置換することにより、ヒト化抗体を低免疫原性にすること ができる。

全てのヒト軽鎖及び重鎮可変領域配列はそれぞれ、互いに対して特に相同性であ り、且つ、一定の基準の位置（Ｋａｂａｔら、前掲）にて同一のアミノ酸を有す る配列の「サブグループ」に分類される。ヒト受容体配列中のアミノ酸がヒト配 列の中で「まれ」又は「一般」であるかを決定するとき、受容体配列と同じサブ グループにおけるそのヒト配列のみを考慮することがしばしば好ましいであろう 。

カテゴリー３：とト化免疫グロブリン鎖中の３つのＣＤ）ｌのすぐ近くの位置に おいて、受容体アミノ酸よりもむしろ供与体アミノ酸が選択されるだろう、それ らのアミノ酸は、おそらく特にＣＤＲ中のアミノ酸と相互作用し、もし受容体か ら選択されれば供与体ＣＤＲを破壊しそして親和力を低下させるであろう。更に 、近隣のアミノ酸は抗原と直接相互作用しくＡ１（ら、と旦工旦１世、　７４７ ４５３　（１９８６）　〕、供与体からそれらのアミノ酸を選択することは元の 抗体における親和力を提供する全ての抗原接触を維持するのに望ましいかもしれ ない。

カテゴリー４：典型的には元の供与抗体の３次元モデルは、ＣＤＨの外側の幾つ かのアミノ酸がＣＩ）ｌ？に密接しておりそして水素結合、ファンデルワールス 力、疎水的相互作用等によりＣＤＲ中のアミノ酸と相互作用する相当な確率を存 することを示す、それらのアミノ酸位置では、受容体免疫グロブリンアミノ酸よ りもむしろ供与体アミノ酸が選択され得る。この基１！に従ったアミノ酸は、通 常はＣＤＲ中の成る部位の約３入車位内にＩＩＩ原子を有し、そして確立された 化学的力、例えば上記に列挙した力に従ってＣＤＲ原子と相互作用することがで きる原子を含まなければならない。

水素結合を形成しうる原子の場合、この３人はその原子核の間で測定されるが、 しかしながら結合を形成しない原子に関しては、この３人はそれらのファンデル ワールス表層間で測定される。従って、後者の場合、相互作用が可能と考えられ る原子に関して、その原子核は約６人以内（３＋フアンデルワールス半径の合計 ）であろう。

はとんどの場合、原子核は４又は５〜６人離れている。アミノ酸がＣＤＲと相互 作用できるかの決定のうえで、重ＩＩｃＤＲ２の最後の８個のアミノ酸をＣＤＨ の一部と考えないことが好ましく、なぜなら構造上の見地より、これらの８個の アミノ酸はフレームワークの一部としてよりふるまうからである。

ＣＤＲ中のアミノ酸と相互作用でき、そしてそれ故カテゴリー４に属するフレー ムワーク中のアミノ酸は別の方法で区別できうる。各フレームワークのアミノ酸 の溶剤の接近可能な表面積は２つの方法、即ち、（１）完全抗体において、及び （２）そのＣＤＲの除去された抗体より成る理論分子、において計算される。こ れらの値の間での杓１０平方人又はそれより大きい有意差は、フレームワークの アミノ酸の溶剤への接近がＣＤＨにより少なくともある程度ブロックされ、そし てそれ故このアミノ酸がＣＩ）ｌ？と接触していることを示す、アミノ酸の溶剤 接近可能表面積は、当業界において既知の計算法を利用して、抗体の３次元モデ ルに基づいて計算されうる（例えばＣｏｎｎｏＩ　ＩｙのＪ、Ａｐｐｌ、Ｃｒ　 ｓｔ、　１６．５４８　（１９８３）及びＬｅｅとＲ４ｃｈａｒｄｓのＪ　、　 Ｍｏ　Ｉ　、　Ｂ　ｉｏ　Ｉ　。

５５、３７９　（１９７１））　、フレームワークのアミノ酸は、ＣＤＲと接触 する別のフレームワークアミノ酸のコンホメーションに影響を及ぼすことによっ てＣＤＲ間接的に相互作用することも時折ある。

フレームワーク中のいくつかの位置でのアミノ酸、特に軽鎖の位！２．４８．６ ４及び７１、並びに重鎮の２６−３０．７１及び９４（番号付けはＫａｂａｔら 、前掲に従う）のそれは数多くの抗体（ＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ、　Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１９６．９０１　（１９８７））と相互作用することがで きることが知られており、それ故これらのアミノ酸は一般にカテゴリー４に属す るであろう、典型的には、本発明のヒト化免疫グロブリンはこれらに加えてカテ ゴリー４に属する（異なる）供与体アミノ酸を含むであろう。軽鎖における位置 ３５、並びに重鎖における９３及び１０３でのアミノ酸もＣＤＲと相互作用する ようである。これらの番号の位置の全てでは、ヒト化免疫グロブリンとなるよう に受容体アミノ酸よりもむしろ供与体アミノ酸（それらが異なるとき）の選択が 好ましい、他方、カテゴリー４に属しつる一定の位置、例えば軽鎖の最初の５個 のアミノ酸が、ヒト化免疫グロブリンにおける親和力を失わせずに受容体免疫グ ロブリンから時折り選ばれうる。

ＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ　（前掲）はＫａｂａｔら（前掲）とは異なるＣＤＲ を決定している。特に、ＣＤＲＩは２６〜３２の残基数を含むと決定されている 。

従って、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（前掲）はこれらのアミノ酸を供与体免疫グロブ リンから選んでいる。

タンパク質、例えば抗体のモデルを作るためのコンピュータープログラムは一般 に入手でき、そして当業者によく知られている（Ｌｅｒｙら、Ｂｉｏｃｈｅｓｉ ｓ±ｒ１２８．７１６８−７１７５　（１９Ｂ９）　；　Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３３５．５６４−５６８　（１９８８）　ＨＣｈｏｔｈｉ ａら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３３．７５５−７５８　（１９８６）を参照のこと ）、これらは本発明の一部を構成していない、事実、全ての抗体は類似の構造を 有するため、ブルックヘーブン　プロティン　データー　バンクより入手できる 既知の抗体の構造が、他の抗体の大まかなモデルとして必要ならば利用されうる 。

市販のコンピュータープログラムは原子間の距離を計算するため、及び異なるア ミノ酸が相互作用する傾向を評価するため、これらのモデルをコンピューターモ ニターに表示するのに利用できる（Ｆｅｒｒｉｎら、ム顕し紅肚吋■、６．１３ −２７　（１９８８）を参照のこと）。

ヒト化免疫グロブリンにおけるアミノ酸を供与体から取る場合を記載した上記の カテゴリーに加えて、ヒト化免疫グロブリンにおける一定のアミノ酸は、もしそ れらが下記に属するなら、供与体又は受容体以外から取ることができる： カテゴリー５：供与体免疫グロブリン中の一定の位置のアミノ酸が前記で定義し たようにヒト配列にとって「まれ」であり、且つ、受容体免疫グロブリン中のそ の位置でもそのアミノ酸が「まれ」であるなら、ヒト化免疫グロブリン中のその 位置でのアミノ酸はヒト配列の「典型的」ないくつかのアミノ酸となるよう選ば れうる。好ましい選択は受容体配列と同しサブグループに属する既知のヒト配列 において知られているその位置にてよく存在しているアミノ酸である。

ヒト化抗体は一般に、ヒトの治療における利用に関して、マウスよりも、又はあ る場合においてはキメラ抗体よりも少なくとも３つの有用な利点を有している： １）エフェクター領域がヒトであるため、これはヒト免疫系の他の部分によく相 互作用しうる（例えば、相補−依存性細胞障害性（ＣＤＣ）又は抗体−依存性細 胞障害性（ＡＤＣＣ）によって標的細胞をより効率的に破壊する）。

２）ヒト免疫系は異物のようにヒト化抗体のフレームワーク又は定常領域を認識 せず、従って注射した抗体に対する抗体応答は、全体的に外来性であるマウス抗 体又は部分的に外来性であるキメラ抗体に対するそれより低いであろう。

ある観点において本発明は、受容体ヒトフレームワーク領域をコードするＤＮＡ セグメントに連結された、所望の抗原、例えばヒトＩＬ−２受容体に結合するこ とのできる供与体免疫グロブリンに由来する重鎖及び軽鎖ＣＤＲをコードする組 換えＤＮＡセグメントを発現せしめることによって生産されるヒト化免疫グロブ リンの設計に関する。

本発明に従って設計された例示的なりＮＡ配列は、図１〜４に示す重鎖及び軽１ ！ｉ　ＣＤＲと実質的なヒトフレームワーク領域を含んで成るポリペプチド鎖を コードする。コドン縮重及び重要でないアミノ酸置換に基づき、下記に詳細のと おり、その他のＤＮＡ配列がこれらの配列に容易にとって代わることができる。

一般に、本発明の基準は実質的に任意のヒト化免疫グロブリンを設計するのに有 用である。

前記［ＩＮＡセグメントは、典型的には、ヒト化免疫グロブリンのコード配列に 作用可能に連結した発現調節ＤＮＡ配列、例えば天然由来のまたは異種のプロモ ーター領域、を更に含むだろう、好ましくは発現調節配列は、真植生物宿主細胞 を形質転換またはトランスフェクションせしめることができるベクター中の真核 生物プロモーター系であろうが、原核生物宿主用の調節配列を用いることができ る。

ヘクターが適当な宿主中に組み込まれれば、宿主はヌクレオナト配列の高レベル 発現に適当な条件下で維持され、そして所望する時、軽鎖、重鎖、軽鎖／重鎖二 盪体もしくは完全な抗体、結合性断片または他の免疫グロブリン形態の収得およ び精製を行うことができる（Ｓ　、　ＢｅｙｃｈｏｃｋのＣｅ１ｌｓ　ｏｆ　Ｉ ｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　５ｙｎｔｅｓｉｓ、　ＡｃａｄｅＩｌｉｃ　Ｐｒ ｅｓｓB Ｎ、Ｙ、、　（１９７９）を参照のこと）。

ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、周知の方法に従って、種々のヒト細胞から、好まし くは不死化されたＢ細胞から単離することができる（Ｋａｂａｔ、前掲および− Ｐ　８７１０２６７１を参照のこと）。本発明の免疫グロブリンを作製するため のＣＤＲは、所望の抗原（例えばヒトＩＬ−２レセプター）に結合することがで きるモノクローナル抗体から同様にして誘導され、そしてマウス、ラット、ウサ ギまたは抗体を生産することができる他のを推動物を含む任意の便利な哺乳動物 起源において生産されるだろう、定常領域及びフレームワークＤＮＡ配列の適当 な起源細胞並びに免疫グロブリンの発現および分泌のための宿主細胞は、多数の 入手源、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手するこ とができるビＣａｔａｌｏｇｕｅ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌＬｉｎｅｓ　ａｎｄ　Ｈｙｂ ｒｉｄｏｍａｓ″、第５版（１９８５）　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａ ｎｄ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、　］。

本明細書中に特定的に記載のヒト化免疫グロブリンに加えて、他の「実質的に相 同の」改良免疫グロブリンを容易に設計することができ、そして当業者に周知の 様々な岨換えＤＮＡ技術を使って製造することができる。例えば、フレームワー ク領域は幾つかのアミノ酸置換、末端および中間の付加および削除等により一次 構造レベルで図１〜図４の配列と異なることができる。更に、本発明のヒト化免 疫グロブリンを基準として、種々の異なるヒトフレームワーク領域を単独でまた は組合せて用いることができる。一般に、遺伝子の修飾は種々の周知の技術、例 えば部位特異的突然変異誘発（ＧｉｌｌｍａｎおよびＳｍ１ｔｈ、　Ｇｅｎｅ　 ８　：　８１−９７　（１９７９）並びにＲｏｂｅｒｔｓら、Ｎａ　ｔｕｒｅ３ ２８　：　７３１−７３４　（１９８７）を参照のこと〕により容易に達成する ことができる。実質的に相同の免疫グロブリン配列は対照の免疫グロブリンタン パク質と少なくとも約８５％の相同性、通常は少なくとも９０％、そして好まし くは少なくとも約９５％の相同性を示すものである。

あるいは、−次抗体構造の一部分のみを含んで成るポリペプチド断片を製造する ことができ、この断片は１または複数の免疫プロプリン活性（例えば補体結合活 性）を存する。これらのポリペプチド断片は当業界に周知の方法による完全抗体 のタンパク質分解により製造するか、又は部位特異的突然変異誘発を利用して停 止コドンを所望の位置、例えばｃＨｉの後に挿入してＦａｂ断片を作るか、もし くはヒンジ領域の後に挿入して（Ｆａｂ’　ｈ断片を作ることができる。−末鎖 抗体はＶＬ及びＶＨをＤＮＡリンカ−につなげることによって製造できる（Ｈｕ ｓｔｏｎら、前掲及びＢｉｒｄら、前掲を参照のこと）。また多数の遺伝子と同 様、免疫グロブリン関連遺伝子は、各々が１または複数の別個の生物活性を有す る別々の機能性領域を含むため、該遺伝子を別の遺伝子からの機能性領域（例え ば酵素；　１９８７年１２月１５日提出の一般譲渡された［１．Ｓ、Ｓ、Ｎ、　 １３２．３８７を参照のこと）と融合させ、新規性質を有する融合タンパク質（ 例えば免疫毒素）を製造することができる。最終的に所望のヒト化抗体を発現す ることができる本発明の核酸配列は、様々な異なるポリヌクレオチド（ゲノムま たはｃＤＮＡ、　ＲＮＡ、合成オリゴヌクレオチド等）および成分（例えば■。

、Ｊ、ＤおよびＣ３Ｊｉ域）から、そして様々な異なる技術により、形成せしめ ることができる。適当な合成及びゲノム配列を連結することが現在量も一般的な 製造方法であるが、ｃＤＮＡ配列を使用してもよい［ヨーロッパ特許公報ｋ　０ ２３９４００およびり、Ｒｅ１ｃｈｎａｎ、ら、ＮａｔｕｒｅＪ倣：　３２３− ３２７　（１９８７）を参照のこと〕。

前に述べたように、該ＤＮ＾配列を発現調節配列に作用可能に連結した（即ち、 機能を保証するように配宜さ廿た）後で該配列が宿主中で発現されるだろう。そ れらの発現ベクターは、典型的にはエピソームとしてまたは宿主染色体ＤＮＡの 組込み部分として宿主中で復製可能である。−船に、発現ベクターは、所望のＤ ＮＡ配列により形質転換された細胞の検出を可能にするために選択マーカー、例 えばテトラサイタリンまたはネオマイシンのそれを含むだろう（例えば、米国特 許第４　、７０４　、３６２号を参照のこと）。

大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｊ）は本発明のＤＮＡ配列をクローニングするのに特に有 用な原核生物宿主である。使用に適当な他の微生物宿主としては、バシラス菌、 例えばハシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌ順）、並びに他の 腸内細菌、例えばサルモネラ薗（鎖膓並吋ハ）、セラチア菌（錘■旦ｕ）および 種々のシュードモナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種が挙げられる。それらの 原核生物宿主では、典型的には宿主細胞と適合性である発現調節配列（例えば複 製開始点）を含むであろう発現ベクターを作製することもできる。加えて、任意 の数の種々の周知のプロモーター、例えばラクトースプロモーター系、トリプト ファン（ｔｒｐ　）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、または λファージからのプロモーター系が存在するだろう、プロモーターは、典型的に は所望によりオペレーター配列と共に発現を調節し、そして転写および翻訳を開 始および終了させるためのリポソーム結合部位算を有するだろう。

他の微生物、例えば酵母を発現に用いることもできる。サツカロミセス（Ｓａｃ ｃｈ＋駈１匹竺）は好ましい宿主であり、発現調節配列、例えば３−ホスホグリ セレートキナーゼ又は他の解糖酵素プロモーターを包含するプロモーター、並び に所望により複製開始点、終結配列等を有する適当なベクターを有している。

微生物に加えて、哺乳動物組繊細胞培養物を用いて本発明のポリペプチドを発現 および生産せしめることもできる（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ。

”Ｆｒｏｍ　Ｇｅｎｅｓ　ｔｏ　Ｃ１ｏｎｅｓ”、ＶＣＨＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ 、Ｎ、Ｙ、＋　Ｎ、Ｙ、（１９８７）　を参照のこと〕。完全な免疫グロブリン を分泌することができる多数の適当な宿主細胞系が技術の現状において開発され ているため実際は真核細胞が好ましい。そのような真核細胞としては、ＣＯＯ細 胞系、種々のＣＯ８細胞系、ＨｅＬａ細胞、好ましくはミエローマ細胞系等及び 形質転換されたＢ細胞またはハイブリドーマが挙げられる。それらの細胞のため の発現ベクターは、発現調節配列、例えば複製開始点、プロモーター、エンハン サ−（Ｑｕｅｅｎ＋　Ｃ，ら、Ｉｓ＋＋＊ｕｎｏ１．Ｒｅｖ、　８９　：４９− ６８　（１９８６）　Ｅ　、および必要なプロセシング情報部位、例えばリポソ ーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、およ）　び転写タ ーミネータ−配列を含むことができる。好ましい発現調節配列は、免疫グロブリ ン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウィルス、サイトメガロウィルス、ウシ乳ｗｉ腫ウ ィルス等に由来するプロモーターである。

着目のＩ）ＮＡ上セグメントＮえば、重鎖および軽鎖コード配列並びに発現調節 配列）を含むベクターは、細胞宿主のタイプに依存して異なる周知の方法により 、宿主細胞中に移すことができる０例えば、原核細胞には塩化カルシウムトラン スフェクション法が常用され、一方他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理また はエレクトロポレーションが使用され得る〔一般には、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒＣＩｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ＋ 　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８２）を参照の こと〕。

一度発現されれば、本発明の完全抗体、それらの二量体、個々の軽鎖および重鎮 、または他の免疫グロブリン形態を当業界の標準法、例えば硫酸アンモニウム沈 澱、アフィニティーカラム、カラムクロマ１−グラフィー、ゲル電気泳動等に従 って精製することができる〔一般的には、５ｃｏｐｅｓ、　Ｒ，、Ｐｒｏｔｅｉ ｎ　Ｐｕｒｉｆ’ｃａｔｉｏｎ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎ、Ｙ 、　（１９８２）を参照のこと〕。少なくとも約９０〜９５％均質の実質的に純 粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％またはそれ以上の均質が医薬用途 に好ましい。部分的にまたは所望の時には均質まで精製されれば、療法的に（体 外的を含む）またはアッセイ方法、免疫蛍光染色法等を開発しそして実施する際 に該ポリペプチドを使用することができる〔一般的には、−堕二児１０１（す士 」」コ鼠ゆ以坊、第１および５巻、Ｌｅｆｋｏｖｉｔ、ｓおよびＰｅｒｎｉｓ［ 、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ’１０ｒｋ、　Ｎ、Ｙ、（１９７９ および１９８１）を参照のこと〕。

本発明の好ましい医薬組成物は、免疫毒素における１又は複数の当該抗体の使用 を含んで成る。免疫毒素は２つの成分により特徴づけられ、そして試験管内また は生体内において選択細胞を殺すのに特に有用である。第一成分は、付着または 吸収すると細胞に対して通常は致命的である細胞毒性物質である。「デリバリ− 賦形剤」として知られる第二成分は、毒性物質を特定の細胞タイプ、例えばガン を含む細胞に供給するだめの手段を提供する。この２成分は通常は様々な周知の 化学的方法のいずれかによって一緒に化学的に結合される。例えば、細胞毒性物 質がタンパク質でありそして第二成分が完全な免疫グロブリンである時、結合は 異種二価性架橋剤、例えば５ＰＤＰ、カルボジイミド、グルタルアルデヒド等に よることができる。種々の免疫毒素の製造が当業界で周知であり、例えば“Ｍｏ ｎｏｃｌｏｎａｉＡｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　：　 Ａｉｍｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍａｇｉｃ　Ｂｕｌｌｅｔ’、Ｔｈｏｒｐｅら、Ｍｏｎ ｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｃ１１ｔｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃ ｉｎｅ、　Ａｃａｄｅ＋ｓｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

１６８−１９０　（１９８２）中に見′つけることができる。咳成分は遺伝子的 に結合させることもできる（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、ハ且ｒｅ　３３９．３９４ 　（１９８９）参照）。

様々な細胞毒性物質が免疫毒素における使用に適当である。細胞毒性物質として は、放射性核種、例えばヨウ素−１，３１、イツトリウム−９０、レニウム−１ ８８およびビスマス−２１２又はその他のアルファー線放射物；多数の化学療法 剤、例えばビンデシン、メトトレキセート、アドリアマイシンおよびシスプラチ ン；並びに細胞毒性タンパク質、例えば、リポソーム阻害タンパク質捧アメリカ ヤマゴボウ抗つィルスタンパク質、シュードモナス外毒素Ａ、リジン、ジフテリ ア毒素、リジン重鎖等；または細胞表面で活性な物質、例えばホスホリパーゼ酵 素（例えばホスホリパーゼＣ）を挙げることができる。（１９９０年７月２６日 に提出された−０９０１０７８６１　；　”ＣｈｉｓｅｒｉｃＴｏｘｉｎｓ’、 　０１ｓｎｅｓおよびＰｈ１ｌ、　Ｐｈａｒｍａｃ、Ｔｈｅｒ、、　２５　：　 ３５５−３８０１９８２）　；並びに”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄ ｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ ”。

ＢａｌｄｗｉｎおよびＢｙｅｒｓ編、１５９−１７９．２２４−２６６頁、Ａｃ ａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照のこと。〕 免疫毒素のデリバリ−成分は、本発明のヒト化免疫グロブリンを含むだろう。好 ましくは完全な免疫グロブリンまたはそれらの結合性断片、例えばＦａｂが使用 される。典型的には、免疫毒素中の抗体はヒト　Ｉｇ？ｌまたはＩｇＧイソタイ プのものであるだろう。しかし所望の時には他の哺乳動物定常領域を用いること もできる。

ヒト化抗体およびそれの医薬組成物は、特に非経口、即ち皮下、筋肉内または静 脈内投与に有用である。非経口投与用組成物は、通常、許容される担体、好まし くは水性担体中に溶解された免疫グロブリンの溶液または混合物を含んで成るだ ろう。様々な水性担体、例えば水、緩衝化された水、０．４％食塩水、０．３％ グリシン等を使用することができる。それらの溶液は無菌であり、通常は粒状物 質を含まない。それらの組成物は、常用される周知の滅菌技術により滅菌するこ とができる。該組成物は、適切な生理的条件に必要である時は医薬上許容される 補助物質、例えばｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤等、例えば酢酸ナトリウ ム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、ヒトア ルブミン等を含有することができる。それらの組成物中の抗体の濃度は広範囲に 渡り異なることができ、即ち、少なくとも約０．５％未満から、通常は少なくと も約１％から、１５〜２０重量％はどまでに及ぶことができ、そして液体の体積 、粘度等に主として基づいて、選択された特定の投与形式に従って選択されるだ ろう。

従って、注射用の典型的医薬組成物は、１ｍｌの無菌緩衝液と１〜１０ｍｇの免 疫グロブリンを含むように調製することができる。静脈点滴注入用の典型的医薬 組成物は、２５０ｍ１の無菌リンガ−液と１５ｋｇの抗体を含むように調製する ことができる。非経口投与可能な組成物の実際の調製方法は当業者に既知である かまたは明白であり、そして例えば如煎邦ぶＥ土ヱ■」赳朋遁且山ｊ江竺聾、第 １５版、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｅａｓｔｏｎ＋　 Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ　（１９８０）中に詳細に記載されており、これは参 考として本明細書中に組み込まれる。

本発明の抗体は貯蔵のために凍結乾燥することができ、そして使用前に適当な担 体中で再構成することができる。この技術は従来の免疫グロブリンに関して効果 的であることが示されており、当業界で既知の凍結乾燥および再構成技術を用い ることができる。凍結乾燥と再構成は様々な程度の抗体活性の低下をもたらし得 ること（例えば従来の免疫グロブリンでは、Ｉｇ？ｌ抗体はＩｇＧ抗体よりも大 きな活性低下を有する傾向がある）、そして使用レベルを調整して埋め合わせな ければならないことがあることは、当業者により明白であろう。

本発明のヒト化抗体またはそれの混合物を含有する組成物は、予防および／また は治療処置のために投与することができる。治療用途においては、組成物は、既 に病気にかかっている患者に、病気を治癒するかまたは少なくとも部分的に緩和 するのに十分な量で投与される。これを達成するのに適切な量は「治療的有効量 」と定義される。この用途に有効な量は、感染の重度および患者自身の免疫系の 一般状態に依存するであろう。しかし通常は、用量あたり約１〜約２００ｍｇの 抗体、より好ましくは患者あたり５〜２５ｍｇの用量が使用されるだろう０本発 明の材料は通常は深刻な病気状態、即ち命にかかわるかまたはもしかすると命に かかわる状況において使用されるだろうことを念頭に置かなければならない。そ のような場合、本発明のヒト化抗体により達成される外来性物質の最小化および 「外来物質」拒絶の低確率の点からみて、実質的過剰量の抗体を投与することが 可能でありそして治療医により望ましいと感じられるかもしれない。

予防用途においては、本免疫グロブリンまたはそれの混合物を含有する組成物は 、患者の抵抗性を高めるためにまだ病気状態でない患者に投与される。そのよう な量は「予防的有効量」として定義される。この用途の場合、正確な量は患者の 健康状態および免疫の一般レベルに依存するが、通常は用量あたり０．１〜２５ 園ｇであろう。

１回又は数回の本組成物の投与は処置する医師により選択される用量レベル及び パターンに従って実施されうる。あらゆる状況において、該医薬製剤は患者を有 効に処置せしめるのに十分な量の本発明の抗体を提供すべきである。

診断目的に、抗体を標識してもよくまたは未標識であってもよい。

未標識抗体は、ヒト化抗体と反応性である別の標識抗体（二次抗体）、例えばヒ ト免疫グロブリン定常領域に特異的な抗体と組合せて使用することができる。あ るいは抗体を直接標識してもよい、様々な標識、例えば放射性核種、蛍光団、酵 素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害側、リガンド（特にハプテン）、等を使用 することができる。

多数の型式のイムノアッセイが利用可能であり、そして当業者に周知である。

以下の実施例を限定でない例示の目的のために提供する。

５つの特定のヒト化抗体の製造を以下に説明する。これらの抗体は、ヘルペス単 純ウィルスのｇＢ及びｇＤ塘タンパク質（Ｍｅｔｃａｌｆら、むぷニコエ国■υ 、　３９　（１９８８））にそれぞれ結合するＦｄ７９及びＦｄ１３８−８０、 ＣＤ３３抗原に結合するＭ１９５　（Ｔａｎｉｍｏｔｏら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ　 ３　、３３９（１９８９）　、ＩＬ−２レセプターのｐ７５鎖に結合するｍ１ｋ −β１　（Ｔｕｓｄ。

ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉ、υＳＡ　８６．１９８２　（１９ ８９）　、並びにサイトメガロウィルスのｇＨ糖タンパク質に結合するＣＭ７５ である。

基本的には、各抗体の重鎮及び軽鎖可変ドメイン遺伝子に関するｃＤＮＡは、ア ンカー化ポリメラーゼ連鎖反応（Ｌｏｈら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４３＋２１９　 （１９８９））により、定常領域にハイブリダイズし、且つ、旧ｎｄｌｎ部位を 含んでいる３′プライマーと、ｄＧデテールハイブリダイズし、且つ、ＥｃｏＲ Ｔ部位を含んでいる５′プライマーを利用してクローンした（図６において手法 を示す）。シーケンシングのため、このＰＣＲ増幅化断片をＥｃｏＲ［及び旧ｎ ｄｎＩによって消化し、次いでｐＵｃ１８ベクターの中にクローンした。各抗体 に関して、少なくとも２本の重鎮及び２つのカッパークローンをシーケンス化し 、そして同一の配列を有していることが認められた。成熟の軽及び重鎖可変領域 の推定アミノ酸配列を図１〜５の上行に示す。

ヒト化抗体の高い結合親和力を維持するため、抗体を設計するときに前記の原理 及びカテゴリーを採用した。高い配列相同性に基づき、マウス抗体に受容体の軽 及び重鎮ヒトフレームワークの両方を提供するのに以下のヒト抗体を選択した： 　Ｆｄ７９のためにヒトＰｏｍ。

Ｆｄ１３８−８０のためにヒトＥｕ、　Ｍ１９５のためにヒトＥｕ＋　ｍ１ｋ− β１のためにヒトＬａｙ、そしてＣＭ７５のためにヒト−ｏ１゜各マウス抗体の 可変領域のモデルを作製するためにコンピュータープログラムＡＢＭＯＤ及びＥ ＮＣＡＤ　（ＬｅｖｉｔｔのＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ＋、、　１６８．５９５（１９ ８３）及びＺｉｂｌｅｒら、虹匹抑コ互江Ｌ２９．１００３２　（１９９０）） を用いた。このモデルは、ＣＤＨに十分に密接していてそれらと有効に相互作用 する各フレームワーク中のアミノ酸を決定するために利用した。

各抗体に関して、前記のカテゴリー（１）〜（５）に属することが認められた位 置を、図１〜５の番号付けに従い、表１に示す。

表　１ 朋註 カテゴリー　！１１　ｊ！−員 １　２４−３８．５４−５０．９３−１００　３１−３５．５０−６６、９９− １１１２　９．４５，４６．８３　８２，１１２晟１３８−別五体 カテゴリー　ＬＪＬ　里−亘 １　２４−３４．５０−５６．８９−９７　３１−３５．５０−６６、９９−１ １０２　４８．６３　９３，９８，１１１，１１２，１１３゜３　３０、６７、 ９８．１１１ ４　３６．４８，８７　２７，３０，３７，４８，６７．６８゜表　１　（続き ） 坦旦脣【化 ダテー美史二　″　軽〜−−−鎖　１−１１　２４−３８．５４−６０．９３− １０１　３１−３５．５０−６６．９５−１０５２　ｔｏ、５２，６７．１１０ 　９３，９５，９８，１０６，１０７゜ｉｏｓ、ｉｉ。

３　３０、　６７、　９８．　１０６ ４　４０．５２，７４　２７，３０，４８，６８．９８α生皿盗 一々テ−チ−ワ−二　督」　ｌ−浜 １　２４−３３．　４９−５５．　８８−９６　３１−３５．　５０−６５．　 ９８−１０８２　１３　８４．８９．９０ ３　３０、　４９ ４　７０　２９．３０．７２．７３ ｃ！Ｕ男寸【本 主命　ｉ−一浜　ｌ−浜 １　２４−．３４．５０−５６．８９ｉ７　３１−３５．５０−６６．９９−１ ０８４　４９　２４．２７，２８，３０．９７各ヒト化抗体を設計するうえで、 その位ｉが、マカス供与体配列に由来するアミノ酸を用いる場合であるカテゴリ ー（１）−（４）に属しない限り、又はその位置においてヒト配列にとって典型 的なアミノ酸を利用する場合であるカテゴリー（５）に属しない限り、ヒト受容 体配列のアミノ酸と同しになるそれを各位置にて選択した。

ヒト化抗体についての遺伝子の作製のため、ヒト比重及び軽鎖のタンパク質配列 をコードし、マウス抗体に典型的に由来するシグナルペプチドを含み、マウス配 列において見い出せるコドンを一般に利用するヌクレオチド配列を選択した。制 限部位を作るため、又は所望されないものを除去するため、複数の縮重コドンを 変化させた。

このヌクレオチド配列は更に免疫グロブリン遺伝子にとって典型的なスプライス ドナーシグナル及び各端にてχｂａ１部位を含む。各可変ドメイン遺伝子に関し て、交互の鎖の上の２対の重複オリゴヌクレオチドであって、コード化配列全体 並びにシグナルペプチド及びスプライスドナーシグナルを包括するものを合成し た。このオリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０ Ｂ　ＤＮＡ合成装置で合成した。

各オリゴは約１１０−１４０塩基の長さであり、１５〜２ｏ塩基の重複を有する 。二本鎖ＤＮＡ断片は、多対のオリゴヌクレオチドから、フレノウもしくはＴａ ｑポリメラーゼ、又はシーケンス化により合成し、制限酵素により消化し、ｐｔ ＋ｃｘａベクターの中にリゲヒトし、そしてシーケンス化した。それぞれ正確な 半配列を有する２本の断片を次にｐＶｇｌ　（Ｆｄ７９及びＦｄ１３８−８０（ ７）重１１Ｆ）又はｐＶｇｌ−ｄｈｆｒ（Ｍ１９５．　ｍｉｋ　１３１゜ＣＨ３ Ｓの重Ｍ）又はｐＶＫ　（全ての軽Ｍ）の発現ベクターのＸｂａ　１部位へ、完 全な重及び軽鎖遺伝子を作るのに適切な方向においてリゲヒトさせた。反応は当 業界に周知の条件のもとで実施した（Ｍａｎｒａｔｉｓら、前掲）。

重鎮及び軽鎖プラスミドをエレクトロボレーシランによりＳρ２１０マウスミエ ロマー細胞へとトランスフェクトし、そしてｇｐｔ発現に関する細胞を選別した 。　ＥＬＩＳ＾によって培養上清液中のヒト抗体生産をアンセイすることによっ てクローンをスクリーンし、次いで最良の生産性クローンから抗体を精製した。

組織培養上清液をスタフィロコンカスプロテインＡセファひ−スＣＬ−４Ｂ　（ ファルマシア）のカラＪ・に通ずことに、よって抗体を精製した。結合した抗体 を０．２Ｍのグリシンー〇ＣＩ　、、　ｐＨ３，０で溶離させ、そしてＩＭのト リス、ｐＨ８，０で中和した。ＰＤＩＯカラム（′２アルマシア）に通すことに よって緩衝液をＰＢＳに交換した７ ヒト化抗体の、対応の抗原を発甲するタイプの細胞への結合性を試験した：　Ｆ ｄ７９及びＦｄ１３８−８０ニ対するＨ３Ｖ　−％染化細胞、門１９５ニ対する ｕ９３７細胞、＋＋１ｉｋ−８１に対するＹＴＪ８細胞及びｌ’：ｌ′１７５１ こ対するＣＭシー感染化細胞。蛍光比色法により、ヒト化抗体は元のマウス抗体 及び関連のキメラ抗体とほぼ同程度に結合した。甲乙こ、ヒト化抗体は細胞に対 する結合に関して、関連のマウス抗体とほぼ同程度に放射性標識化マウス抗体に 対して競合し、従ってこのヒト化抗体はマウス抗体とほぼ同し結合親和力、典型 的には約２倍以内又はそれより優れた親和力ををする（例えば表２を参照のこと ）。

表２ ネズミ及びヒト化抗体の結合親和力 Ｆｄ７９　（抗−ｇＢ）　１．１ｘｌＯ”　５．３ｘｌＯ’以上より、本発明の ヒト化免疫グロブリンは他の抗体よりも数多くの利点を提供することが認められ る。他のモノクローナル抗体と比−パ、本ヒト化免疫グロブリンはより経済的に 生産でき、そして実實的に少ない列来性アミノ酸残基を含みうる。ヒト患者に注 射された後のこの低められた抗原性の傾向は有意な治療改善を示す。

各ヒト化免疫グロブリンの詳細な説明を続ける。

例　Ｉ ｐ７５に対するヒト化免疫グロブリン 哺乳動物において、免疫応答は外来物質、即ち、抗原に特異的に相互作用する２ タイプの細胞により媒介される。これらの細胞タイプのうちの１つ、Ｂ−細胞は 、抗体の生産のちととなる。第２の細胞のクラス、Ｔ細胞は、両Ｂ細胞の生体内 機能を調節する広範囲にわたる細胞サブセット及びＴａ１ｌ胞を含んでいる他の 広範囲にわたる造血細胞を含む（一般に、Ｐａｕｌ、　Ｗ、Ｅ、ｉｉ、、Ｆｕｎ ｄａｍｅｎｔａｌ　ｒｍｍｕｎｏｌｏＪｌｙ−第２編、Ｉ？ａｖｅｎ　Ｐｒｅｓ ｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９）を参照のこと）。

Ｔ細胞がこの調節を及ぼす一経路は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）として 知られ、もとはＴ−細胞成長因子と呼ばれていたリンホカインの生産を介する。

ＩＬ−２の主機能はＴ細胞の刺激及び維持にあるようである。事実、数人の免疫 学者はＩＬ−２が全免疫応答の中心にあると信じている（Ｆａｒｒａｒ、　Ｊ、 ら、Ｉｖｗｕｎｏｌ、Ｒｅｖ、　６３．１２９−１６６　（１９８２））　。

その生物学作用を及ぼすため、ＩＬ−２は特定の高親和力膜レセプターに相互作 用する（Ｇｒｅｅｎｅ、　Ｗ、ら、Ｐｒｏ　ｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｈｅｍａｔｏｌｏ 　ＬＪＩＬＨ，Ｂｒｏｗｎ編、Ｇｒｕｎｅ　ａｎｄ　５ｔａｔｔｏｎ、　Ｎｅｗ 　Ｙｏｒｋ　（１９８６）、頁２８３Ｎ、及び−ａｌｄｍａｎｎ、Ａｎｎ、Ｒｅ ｖ、Ｂｉｏｃ　ｅｓ、５８．　８７５　（１９８９））　＠　ヒトＩＬ−２レセ プターは複雑な多重［１！タンパク質であり、その−鎖は、Ｔａｃペプチド又は アルファー鎖として知られ、約５５ｋＤのサイズである（Ｌｅｏｎａｒｄ−ら、 Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋＊、　２６０．１８７２　（１９８５）を参照のこと） 。

この第２鎖はｐ７５又はベーター饋として知られている（Ｔｓｕｄｏら、て低又 は中親和力でＩＬ−２と結合し、一方両鏡のＩＬ−２レセプター複合体は高親和 力でＩＬ−２と結合する。ヒトＩＬ−２レセプターのｐ７５ｔｉ［はしばしば本 明細書中でｐ７５タンパク譬と簡単に呼ばれている。

ヒ１−ＩＬ−２レセプターの構造及び機能の説明のほとんどは特異的な反応性の モノクローナル抗体の開発に基づく。特に、抗−Ｔａｃとして知られているある マウスモノクローナル抗体（Ｕｃｈｉｙａ■ａら、ＬＩｓｓｕｎｏｌ、　１２６ ．１３９３　（１９８１））は、ＩＬ−２レセプターがＴ細胞上だけでなく、単 球マクロファージ科の細胞、肝臓のクツバー細胞、皮膚のランゲルハンス細胞、 そしてむろん活性化Ｔ−細胞上でも検出されうることを示すために利用されてい る。重要なこととして、休止Ｔ−細胞、Ｂ−細胞又は循環マクロファージは典型 的にはＩＬ−２レセプターを示さない（Ｈｅｒｒｍａｎら、Ｌ旺り肚虹耳ｉ２． １１１１　（１９８５））。

他の抗体、ｍ１ｋ−βｌはｐ７５鎖に結合する（Ｔｓｕｄｏら、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６．１９８２　（１９８９））。

抗−Ｔａｃモノクローナル抗体もＩＬ−２相互作用を必要とするリンパ球機能を 決定するために利用されており、そして細胞培養物中に細胞障害性及び抑制Ｔリ ンパ球を発生せしめることを含む様々なＴ−細胞機能を阻害することが示されて いる。更に、抗−Ｔａｃ及びその他の抗体による試験に基づき、様々な疾患、特 に成人子細胞白血病が、Ｔ細胞による不適切なＩＬ−２レセプター発現に現状関 連している。

より最近になり、ＩＬ−２レセプターはＴ細胞により媒介される障害への新規の 治療手法に関する真の標的であることが示された。　ＩＬ−２レセプター特異的 抗体、例えば抗−Ｔａｃモノクローナル抗体又はｍ１ｋ−β１は、ＩＬ−２レセ プターを抱える細胞を効率的に除去するために単独で、又は免疫コンジュゲート （例えばリシンＡ、アイソトープ等との）として利用されうることか提唱されて いる。これらの因子は病気状態に関与する例えばＩＬ〜２レセプター−発現性白 血病細胞、一定のＢ−細胞、又は活性化Ｔ−細胞を理論的に消失させ、且つ、必 要とされる正常なＴ−細胞免疫応答を高めることができることを確実にするため に成熟正常Ｔ−細胞及びその前駆体の維持を可能とすることができる。一般に、 はとんどのその他のＴ−細胞特異的因子は本質的に全ての末梢Ｔ−細胞を破壊し てしまうことができ、これはこの因子の治療効果を制限する。全体的に、ＩＬ− ２レセプターに対して特異的な適当なモノクローナル抗体の利用は活性化Ｔ−細 胞による自己免疫障害、器官移植及び任意の望ましくない応答において治療的用 途を有しうる。事実、例えば抗−Ｔａｃ抗体を利用する臨床試験が開始されてい る（Ｋｉｒｋｓａｎら、７よＰｒｏｃ、　２１２．１７６６　（１９８９）及び −ａｌｄｍａｎｎら、Ｂｌｏｏｄ　７２．１８０５（１９８８））。

残念ながら、抗−Ｔａｃ＋　ｓ＋ｉｋ−β１及びその他の非ヒトモノクローナル 抗体の利用は、特に以下に説明するような反復治療処決において一定の欠点を有 している。例えばマウスモノクローナル抗体は一般にヒト補体を完全に固定しな く、そしてヒトに利用する際のその他の重要な免疫グロブリン機能特性を欠く。

おそらくより重要には、抗−Ｔａｃ、　＋＊ｉｋ−β１及びその他の非ヒトモノ クローナル抗体は、ヒト患者に注射されたときに免疫原となりうる大きなアミノ 酸の鎖を含まない。

本発明に従い、ヒ）ＩＬ−２レセプターのｐ　１５Ｍに特異的に反応性なヒト様 免疫グロブリンを提供する。少なくとも１０７〜１０”　Ｍ−’、そして好まし くは１０’　Ｍ　−１〜１０１０１Ｏ’又はそれより強力な結合親和力を有する 免疫グロブリンは例えばＩＬ−２のヒトＩＬ−２レセプターへの結合を阻害する ことができる。該ヒト一様免疫グロブリンはヒト様フレームワークを有し、そし て免疫グロブリン、典型的にはｐ７５タンパク質上のエピトープに特異的に反応 性なマウス免疫グロブリンに由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有することが できる。大量に経済的に生産できる本発明の免疫グロブリンは例えば様々な技術 によるヒト愚者におけるＴ細胞媒介障害の処置において利用できる。

一観点において、本発明はヒ）ＩＬ−２レセプター上の所望のエピトープに結合 可能な免疫グロブリン、例えばｍ１ｋ−βＩモノクローナル抗体に由来するｌ及 び／又は軽鎖ＣＤＲをコードする組換えＤＮＡセグメントに関する。これらの領 域をコードするＤＮＡセグメントは典型的には適当なヒト様フレームワーク領域 をコードするＤＮＡセグメントに連結されているであろう。発現により一１ｋ− ３１の重及び軽ｊｉｃＤＲを含んで成るポリペプチド鎖をコードする典型的なり ＮＡ配列を図７に含ませている。コドン縮重及び重要でないアミノ酸置換に基づ き、前記した通りその他のＤＮＡ配列が容易にそれらの配列にとって代わること ができる。

これらの抗体は典型的には各別にＴ細胞媒介障害症状の処置において利用される であろう。一般に、障害に関連する細胞がＩＬ−２レセプターを抱えていること が同定されたとき、ＩＬ−２のヒトＩＬ−２レセプターへの結合を阻害できるヒ ト様抗体が適切となる（Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ。

０８５、７０７、題名＋Ｔｒｅａｔｉｎｇ　Ｈｕｍａｎ　Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉ ｅｓ　ａｎｄ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ”を参照のこと）。例えば、処置に適する典 型的な障害症状には、例えば心臓、肺、腎臓、肝臓等の器官移植を受けた患者に おける移植対宿主障害及び移植拒絶が含まれる。その他の疾患には、自己免疫障 害、例えばＩ型糖尿病、多発性硬化症、リウマチ型関節炎、全身性エリテマトー デス及び重症筋無力症が含まれる。

本発明のヒト様抗体は別の抗体と、特に灰色のもととなる細胞上の別のマーカー に反応性なヒトモノクローナル抗体と組合せて利用することもできる。例えば、 適当なＴ−細胞マーカーにはファースト　インターナショナル　リューコサイト 　ディファレンチェーンヨン　ワークンｆｆ　’７ブのＬｅｕｋｏｃ　ｔｅ　Ｔ 　１ｎ　、　Ｂｅｒｎａｒｄら纏、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−νｅｒｌａｇ、　Ｎ、Ｙ 、　（１９８４）により命名された通称「クラスターの分類」に分類されたもの が含まれる。好ましい利用はｐ５５に結合するヒト様抗体とＩＬ−２レセプター のｐ７５に結合するヒト様抗体、即ち、ヒト化抗Ｔａｃ＋ヒト化ｍ１ｋ−β１に よる患者の同時処置である。

本発明のヒ）Ｉ抗体は試験管試験において広範囲にわたる用途が更に見い出せう る。例えば、該抗体はＴ細胞の分類、特定の［Ｌ−２レセプター保有細胞もしく はレセプターの断片の単離、ワクチンの製造等のために利用できる。

実験 重鎮及び軽鎖。ＤＮＡのクローニング 重鎮及び軽鎖可変ドメイン遺伝子に関するｃＤＮＡをアンカー化ポリメラーゼ連 鎖反応により（Ｅ、ｆｌ、Ｌｏｈら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４３．２１７　（１９ ８９））、定常領域にハイブリダイズされ、且つ、Ｈｉｎｄｌ［１部位を含む３ ′プライマーと、ｄＧテールにハイブリダイズされ、且つ、ＥｃｏＲ１部位を含 む５′プライマーを用いてクローンする（図６において手法を示す）。

このＰＣＲ増幅化断片をシーケンシングのためにＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄ［ｎによ り消化し、次いでｐ［Ｉｃ１９ベクターの中にクローンした。ｍｉｋ　−β１に 関しては、２種類のガンマ−２ａ特異性及び２種類のカッパー特異性クローンを シーケンス化した。この２つのガンマ−２８クローン及び２つのカッパークロー ンはそれぞれ配列において同一である。ｃＤＮＡ可変ドメイン配列及びその推定 アミノ酸配列を図７に示す。

キメラ抗体の作製及び発現 キメラ抗体遺伝子の作製及び発現のために２種類のプラスミドベクターを調製し た。プラスミドｐＶｇｌ　ｄｈｆｒ　（図８Ａ）はヒトサイトメガロウィルスＩ ＥＩプロモーター及びエンハンサ−（Ｍ、Ｂｏｓｈａｒｔら、リー１ユ４ｊ、　 ５２１　（１，９８５１Ｎ　、前方のイントロンの一部を含むヒトゲノムＣｒｌ セグメント、並びに選別のためのノヒドロフォレートリダクターゼ（ｄｈｆｒ） 遺伝子（Ｓｉｍｏｎｓｅｎら、Ｉ’ｒｏｃ、Ｎａｔｊ−通ｃａ＜ｊ、ｓｃｉ、１ ＩｓＡ８０、、２４９５　（１９８３１１＞を含む。ブ５スミドｐνＫ（図８Ｂ ）はｐＶｇＬ　ｄｈｆｒと類似するが、しかしながらヒＩ・ゲノムＣにセグメン ト及びｇｐｔ遺伝子を含む。１に一β１の重及び軽鎖可変領域の誘導体をポリメ ラーゼ連鎖反応によりｃＤＮＡから調製した。５′プライマーはＡＴＧコド゛／ において出発する■領域にハイブリダイズしており、そしてＸｂａ　１部位を含 み；３′プライマーは、Ｊ　ＧＷ域の最後の１５個のヌクレオチドとハイブリダ イズしており、そしてスプライスドナーシグナル及びＸｂａ　１部位を含む（Ｃ ，Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、ＵＳＡ　８６．１０ ０２９（１９８９）を参照のこと）、改質■領域を関連のプラミドヘクターのＣ ＭＶプロモーターど定常領域の部分イントロンとの間のにｂａ１部位の中にクロ ーンした。

キメラ抗体の発現のため、重鎖及びカッパー鎖プラスミドをエレクトロボＬ、・ −ジョンによって５Ｐ２１０マウスミエローマ細胞にトランスフェクトし、そし てｇｐｔ発現のために細胞を選別した。最大量の完全抗体を分泌す−るクローン をＥＬＩＳＡにより検定した。精製したキメラ−１ｋ−β１抗体は、フローサイ トメトリーにより、ｐ７５抗原を発現するＹＴＪＢ細胞に結合することが示され た（図９）。

ヒト化抗体のコンピューターモデル化 重１へ化抗体において高結合親和力を維持せしめるため、Ｑｕｅｅｎらの一般手 順に従、った（Ｃ，Ｑｕｅｅｎら、ヒ匹ユ狂山Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６ ．１００２９（１９８９））。ヒＩ・抗体が元のネズミ抗体とより相同性である に従い、不ズミＣＤＲをヒトフレームワークに組合せることによる、親和力を低 めうる、ＣＤＲへの歪みの導入の傾向が下がるである・う。通常、同一のヒ１− 抗体に由来する重鎮及び軽鎖をフレームワーク配列を提供するために選び、これ によりこの２本の鎖を集成するうえでの非適合性の可能性は低まる。配列データ ーヘース（門１ｃｒｏ　Ｇｅｎ１ｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｏ ｆｔｗａｒｅ　（Ｂｅｃｋｗａｎ）により実施）に基づき、抗体Ｌａｙを、ｍ１ ｋ−β１のヒト化のためのフレームワーク配列を担うために選んだ。

ｍ１ｋ−βｌ可変領域のモデルを作製するためにコンピュータープログラムＥＮ ＣＡＤ　（Ｍ、１．ｅｖｉｔｔ、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１６８．５９５　 （１９８３））を用いた。このモデルは、ＣＤＲに十分に密接していてそれらと 有効な相互作用する一１ｋ−βｌフレームワークにおけるアミノ酸を決定するた めに用いた（以下のカテゴリー４）。ヒト化重及び重鎖ｍｊｋ−β１可変領域を 設計するには、次の５つのカテゴリーのうちの１つ又は複数に属しない限り、各 位置においてＬａｙ抗体と同一のアミノ酸を選択した： （１）その位置がＣＤＲに属した、 （２）その位置では、Ｌａｙアミノ酸がヒト抗体にまれであり、一方、その位１ では、５ｉｋ−β１アミノ酸がヒト抗体に典型的であった。

（３）その位置がＣＤＨのすぐ近くであった、（４）上記したモデルが、そのア ミノ酸が抗原結合性領域（ＣＤＲ）に物理的に近いことを示唆した。

これらのカテゴリーのうちのいくつかの位置に関しては、（マウス）麟ｉｋ−β １抗体由来のアミノ酸を用いた。更に、もし位置が下記のとおりであるなら、第 ５カテゴリーに属する（５）その位置ではＬａｙアミノ酸がヒト抗体に非常にま れであり、そしてｍ１ｋ−β１アミノ酸が異なり、しかもまれである、この場合 、その位置ではヒト抗体に典型的であるアミノ酸を用いてよい。

各カテゴリーにおけるアミノ酸を表３に示す、いくつかのアミノ酸は複数のカテ ゴリー乙こ属Ｌ５う乙。ヒトｍｉｋ　−βｌの軽及び重鎖可変１゛メインの最終 配列を図１０に示し、Ｌａｙ配列と比較する。

＆　３ カテゴリー　軽　鎖　重　鎖 １　２４−３３．４９−５５．８８−９６　３１−５５．５０−６５．９８−１ ０８１３　８４、８９．９０ ３　３０、４９ ４　７０　２９、３０．７２．７３ ヒト化抗体のだめの遺伝子の作製のため、一般にマウス配列において見い出セる コＩ゛ンを利用して、マウスのｍ１ｋ−β１鎖中と同一の、・グノールベブチド （図７）を含むヒト比重及び軽鎖のタンパク質配列を］−）−するヌクレオチド 配列を選別した。複数の縮重コドンを変えて、制限部位を作る又は所望されない ものを除去した。このスフ１／オ千ド配列はキメラ遺伝子において利用されてい るものと同しスプライスドナーシグナル及び各端でのＸｂａ　Ｉ部位も含んでい た。

各遺伝子を４つの重複合成オリゴヌクレオチドから作製した。各可変ドメイン遺 伝子のため、交互鏡上の２対の重複オリゴヌクレオチドを合成し１、これは全コ ード配列並びにシグナルペプチド及びスプライスドナーシグナル（図１１）を含 んでいた。このメリゴヌクレオナドはアブぞ・イドバイオシスブーム３８０Ｂ　 ＤＮＡ合成装置で合成した。各すリボ；よ約１１０−１４０の塩基の長さであり 、その約２０塩基は重複していたゆ各号のオリゴヌクレオチドから二本鎖ＤＮ＾ 断片をシーケンス化により伶成し、制限酵素で消化し、ブルースクリプトＩＩ　 ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ヘクターにυケ゛−トし、次いでシーケン ス化しな。

対応の適切な半配列を有するこの２種の断片を次にｐＶｇｌ−ｄｈｆｒ又はρｖ Ｋ発現ヘクターのＸｂａ　１部位にリゲヒトした。試験内突然変異誘発を利用し 、ヒト化重鎮の位置ｌにて（図１０Ｂ）ヌクレオチドｃＴをＡＧに変えることに より、オリゴヌクレオチドｗｐｓ５４により本来コード化されるＡｌａのアミノ 酸をＧｌｕ（Ｅ）に変えた。反応は当業界によく知られる条件のもとで行った（ Ｍａｎｉａｔｉｓら、前掲）。

重鎮及び軽鎖プラスミドをエレクトロポレーションによって５ｐ２１０マウスミ エローマ細胞にトランスフェクトし、そしてｇｐｔ発現のために細胞を選別した 。ＥＬＩＳＡによって培養土清液中のヒト抗体生産をアッセイすることによりク ローンをスクリーンし、そして最良生産クローンから抗体を精製した。抗体は組 織培養上清液をスターフィロコツカスプロティンＡ−セファローズＣＬ−４８（ ファルマシア）のカラムに通すことによって精製した。結合抗体を０．２Ｍのグ リノ：／　−ＨＣｌ　、ｐｌ（３，ｏニより溶離させ、次いでＩＭのトリス、ｐ Ｈ８，０で中和した。この緩衝液をＰＤＩＯカラム（ファルマシア）に通してＰ Ｂｓに交換した。

ヒト化抗体の性質 ヒト化鍾ｉｋ−βＩ抗体をネズミ及びキメラ抗体と比較して特性化した。該ヒト 化抗体は、ｐ７５鎖を高レベルで発現するＹＴＪＢ細胞に、フルオロサイトメリ ー分析においてキメラ抗体と同様に結合しく図９）、これが同じｐ７５タンパク 質を認識することが示唆された。

ｉニド化抗体の親和力は放射性ヨウ素化マウスｍ１ｋ−β１抗体との競合によっ て決定した（図１２）、結合親和力はＢｅｒｚｏｆｓｋｙの方法に従って計算し た（Ｊ、Ａ、ＢｅｒｚｏｆｓｋｙとＩ、　Ｊ　、　Ｂｅｒｋｏｗｅｒの、Ｆｕｎ ｄａ明旦υ」工！二竺ユ９−Ｌ９呈ｌ　（Ｗ、Ｅ、Ｐａｕｌｍ）、Ｒａｖｅｎ　 Ｐｒｅｓ　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、５９５　（１９８４））　。

ヒト化ｍ１ｋ−β１抗体の結合親和力はマウスのｍ１ｋ−β１抗体の親和力の約 ２倍以内にあった。

ヒトリンパ球のＩＬ−２刺激化増殖を阻害する、ヒト化＋ｍ１ｋ−β１士ヒト化 抗−Ｔａｃ抗体の能力（１９９０年６月２６日公開の−０９０１０７８６１を参 照のこと）を調べた。フィコール−パーク（ファルマシア）による遠心によりヒ ト血液から集めたヒト単球細胞を、ＲＰＭＩ培地モ１０％の胎児牛血清（Ｆｅ２ ）の中に２Ｘ１０”細胞／＋＊ｌに希釈した。ｌ　／２００容量のフィトヘマグ ルチニンＰ（ジフコ）を加え、次いでこの細胞を４日間インキュベートした。こ の細胞をＲＰＭＩ　＋　１０％のＦｅ２　＋　ｔｏμ／■１の！Ｌ−２の中で更 に４日インキスヘヒトした。　１０’のこのＰＨＡ活性芽細胞を次に９６穴プレ ートのウェルにおいて１５０μｌのＲＰＭＩ＋１０％のＦｅ２Ｏ中で１時間、ヒ ト化ｍ１ｋ−βｌ及びヒト化抗−Ｔａｃそれぞれ２μｇを伴って、又は伴わない で、これに５０μｌの培地中の種々の希釈率のＩＬ　−２（Ａ＋ｓｇｅｎ）を加 えてインキュベートした。この細胞を４８ｈｒインキエヘートし、０．５μＣｉ のメチル−３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ＋　８２Ｃｉ／ｍ＋ｗｏｌ）を加 え、そしてこの細胞を２４時間インキユヘーヒトた。この細胞を細胞ハーベスタ −で集め、そして放射活性を測定した。抗体の組合せはＩＬ−２に応答する細胞 の増殖を大いに阻止しく図１３）、抗体の組合せが強い免疫抑制特性を有するこ とが示唆された。ヒト化ｍ１ｋ−βｌとヒト化抗−Ｔａｃを合わせることは、い づれの抗体単独よりも強力に増殖を阻害した。

例■ Ｈ５Ｖ抗原に対するヒト化免疫グロブリンＩ型及び■型ヘルペスウィルス（ＨＳ Ｖ−１及び）ＩｓＶ　−２）は現在、世界中での性的伝染障害の２番目に多い原 因と考えられている。完璧に正確なデーターは入手していないが、怒染人は米国 の人口の約２０〜４０％に範囲すると見込まれる。無症候性から生命を脅やかす 数多くの障害にＨ５Ｖ感染が関係している。特定の臨床的感心の中で、ＨＳＶ− １感染症由来の脳炎及び妊婦からその胎児への）ＩｓＶ−２伝染がしばしば致命 的である。免疫抑制、＠者もこのウィルスに感染したときに重症な合併症にかか る。

Ｈ５Ｖ感染細胞において５０種以上のＨ３Ｖポリペプチドが同定されており、そ れには少なくとも７種の主要細胞表層塘タンパク質が含まれる（Ｖｉｒｏｌｏｇ ｙ　Ｆｉｅｌｄら編、第２版、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ、、　Ｎ、Ｙ 。

（１９９０）の−ｔ＋＋Ｈｅｙ＋　Ｒ−の第６６章及びＲｏｉｚｗａｎと５ｅａ ｒｓの第６５章、を参照のこと）。これらの糖タンパク質の特異的な生物学的機 能はあまりよく解明されていないが、しかしながらｇＢ及びｇＤは細胞融合活性 に関係することが示されている（匈、Ｃａｉら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、餞、　２５ ９６（１９８８）及びＦｕｌｌｅｒと５ｐｅａｒ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、［ＩＳＡ　８Ｃ５４５４（１９８７）　’）。ｇＢ及びｇｏは種 特異的及び種共通の抗原決定基の両者を発現する。　０ａｋｅｓとＬａｕｓｈは ｇＢ及びｇＥに対するモノクローナル抗体が、三叉神経節における）ＩＳＶ−１ の複製を抑制することを実証した（ＯａｋｅｓとＬａｕｓｈ、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ 、　５１．６５６　（１９８４））　、Ｄｉｘらは抗−ｇＣ及びｇΩ抗体が２、 性ウィルス誘発性神経障害からマウスを守ることを示した（Ｄｉｘら、Ｉｎｆｅ ｃｔ、ｌ５ｓｕｎ、　３４．１９２　（１９８１））。Ｗｈｉｔｌｅｙとその仲 間はＨＳＶ−１対するネズミモノクローナル抗体のパネルを作製し、そしていく つかの抗体がウィルスによる目の感染による脳炎及び死からマウスを守ることを 示している（Ｋｏｇａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１！シ、＋　３８５　（１９８６ ）　ｉＭｅｔｃａｌｆら、Ｃｕｒ、Ｅｙｅ　Ｒｅｓ、６．１７３　（１９８７） 及びＭｅｔｃａｌｆらＩｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇ）Ｉ　２９．３９　（１９８９ ）を参照のこと）。クローンＦｄ７９（抗−ｇＢ）はたとえ免疫化が感染して４ ８時間まで遅れても脳炎を防いだ。

Ｆｄ７９及びＦｄ１３８−８０　（抗−ｄＧ）は上皮角膜炎の重症度を有意に引 き下げ、そして異形交配マウスモデル中の持続性ウィルス感染の頻度を低めた。

本発明に従い、Ｈ３Ｖ関連エピトープと、このウィルス上に直接的に又は感染化 細胞に特異的に反応性なヒト化免疫グロブリンを提供する。少なくともｌｏ’Ｍ −’、そして好ましくは１０’Ｍ〜１〜１０１０ｌ０’又はそれより強力なＨ５ Ｖ特異的抗原に対する結合親和力を有するこれらの免疫グロブリンは例えばｌｌ ５Ｖ伝染から細胞を守ることができる。該ヒト化免疫グロブリンはヒトフレーム ワークを有しており、そして典型的にはマウス免疫グロブリン、詳しくはｇＢ及 びｇＤタンパク質のようなＨ３Ｖタンパク質と反応性な免疫グロブリンに由来す る２又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するであろう。大量に経済的に製 造される本発明の免疫グロブリンは例えば種々の技術によるヒト患者におけるＨ ３ν媒介障害の処理において有用である。

ＨＳＶは全てのウィルスのうちで最もよく研究されているものであり、そしてＨ ５Ｖピリオン構造は約３３種のタンパク質を含むことが示されている。これらの タンパク質、特に８種の表層糖タンパク質（例えばｇＢ、　ｇＣ，ｇＤ、　ｇＥ 、　ｇＧ、　ｇＨ及びｇ［）に反応性のモノクローナル抗体に由来するＣＤＲを 利用するヒト化免疫グロブリンは本発明の好ましい態様を示す（Ｓｐｅａｒ、　 Ｐ、Ｇ、、乃Ｌ±」ヱ症辻匹、第３巻、頁３１５−３５６　（１９８４）（Ｒｏ ｉｚ＋ｍａｎ、Ｂ、、り　、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、、Ｎ、Ｙ、 。

及び５ｐｅａｒ、　Ｐ、Ｇ、　Ｉ＋ｉｍｕｎｏｃｈｅｍ’ｓｔｒ　ｏｆ　Ｖｉｒ ｕｓｅｓ　Ｔｈｅ　Ｂａ５ｉｓ　ｆｏｒＳｅ仔坦ｊｙＡｉｓ　ａｎｄ　Ｖａｃｃ ｉｎｅｓ、頁４２５−４４６　（１９８５）　（Ｎｅｕｒａｔｈ、　Ａ、Ｒ，＆ Ｗ）、（Ｉｌｗｓｔｅｒｄａｍ　：　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）を参照のこと）６ある 観点において、本発明はＨ３Ｖタンパク質の所望のエピトープに結合することの できる免疫グロブリン、例えばＨＳＶのｇＢ及びｇＤ塘タンパク質に反応性のモ ノクローナル抗体に由来する重鎮及び／又は軽鎖をコードする岨換えＤＮＡセグ メントに関連する。このような領域をコードするＤＮＡセグメントは一般に適当 なヒト化フレームワーク領域をコードするＤＮＡセグメントに連結されているで あろう。

モノクローナル抗体ｐｄ７９及びＦｄ１３ｇ−８０に由来する重及び軽鎖超可変 領域（ヒトフレームワーク領域を伴う）を含んで成るポリペプチド鎖をコードす る典型的な［ｌＮＡ配列を図１４に示す。コドン縮重及び重要でないアミノ酸置 換に基づき、以下に詳しく述べ３通り、その他のＩ）ＩＩＡ配列がこれらの配列 に容易ムことって代わることができる。

本発明の任意のヒト化免疫グロブリンはその他の抗体、特に種々のＨ５ν抗原に 反応性のヒト化抗体と組合せて利用することもできうる。例えば、ヒト化免疫グ ロブリンの混合物が反応しうる適当なＨ５Ｖ抗原にはｇＣ，ｇＥ、　ｇＰ、　ｇ Ｇ及びｇＨが含まれる（Ｒｅｃｔｏｒ、　Ｊ、ら、Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、　３８．１６８　（１９８２）及びＦｕｌｌｅｒら、Ｊ、Ｖｉｒｏ ｌ、　６３．３４３５　（１９８９）を参照のこと）。

これらの抗体はアシロクロビル又はその他の抗ウィルス剤と一緒に付与される独 立投与型組成物としても利用されうる。典型的にはこの試薬にはイドクスウリジ ン又はトリフルオロチミジンが含まれうるが、しかしながらＨ５ν処１について の業界の当業者によく知られている真人な数の添加剤（例えばビダラビン）も利 用されうる（Ｃｏｒｅｖ＋　Ｌ、前掲を参照のこと）。本発明の好ましい薬品製 剤はＨＳＶにより感染された細胞を殺す免疫毒性の対象の免疫グロブリンの利用 を含んで成る。

これらのヒト化抗体は試験管内における広範囲にわたる様々な用途に有用性が見 い出せうる。例えば、これらの抗体はＨ３Ｖ抗原の検査、特定の）ＩＳＶ感染化 細胞又はウィルスの断片の単離、ワクチンの調製等に利用できる。

実験 重鎖及び軽ｆＪｉｃＤＮＡのクローニング重鎮及び軽鎖可変ドメイン遺伝子に間 するｃＤＮＡをアンカー化ポリメラーゼ連鎖反応により（Ｅ、Ｈ，Ｌｏｈら、５ ｃｉｅｎｃｅ　２４３．２１７　（１９８９））、定常領域にハイブリダイズさ れ、且つ、）ｌｉｎｄｌｌＩ部位を含む３′プライマーと、ｄＧデテールハイブ リダイズされ、且つ、ＥｃｏＲＩ部位を含む５′プライマーを用いてクローンす る０図６において手法を示ず几この方法は、可変ドメイン配列にアニールさせる ように設計した混合プライマーを用いるその他の方法（Ｊｕｌ、１．ａｒｒｉｃ ｋら、ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏ１ｏｇｙ７．９３４　（１９８９）及びＳｌ、Ｉ４ ．Ｃｈｉａｎｇら、ＢｉｏＴｅｃｈ、λ−，３６０（１９８９））　と比べて、 真性可変ドメイン配列を有するクローンをもたらｔｏこのＰＣＲ増幅化断片を１ ．／−ケンソングのためにＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄｌｌＮにより消化し、次いでｐ Ｕｃ１８ヘクターの中にクローンした。Ｆｄ７９に関しては、２つのガンマ−１ 特異性及び５つのカッパー特異性クローンをシーケンス化し、た。この２つのガ ンマ−１特異性りｉボーンは配列において同一゛であった。この重鎮ＣＤ　ＪＪ 　Ａ断片は１９個のアミノ酸のシグナルベグ（−）゛、マ・ブス重Ｍ号ブグルー プＩＩ［Ｂにおける■領域、Ｄセグメン］、及びゲ／ムＪエ　１配列と比較して ４箇所の変異を有するＪイ　１セグメントをコ一　ドする。推定のアミ、ノ酸配 列を図１４Ａに示す。

５つのカッパー特霞性クローンは２つのグループに属した。２つのりしトウは同 一であり、そし７て２３番目の保存性アミ、ノ酸ンステインがチロノンにより置 換され、おそらくは非生産性アレルを示すカッパー鎮をコードする。他の３つの クローンは２０個のアミノ酸のシグナルペプチド配列、マウスカンバー鎖サブグ ループ■における■９］域、及びゲノ、！、Ｊｗ２配列と比べて１箇所の変異を 有するＪＫ２セグメントをコードする同一の配列を有する（図１４Ｂ）。重鎖及 びカッパー鎮配列の有効性は以下に述べるキメラ抗体の作製及び発現ら二より１ 認した。

Ｆｄ１３８．．８０の重鎖及び力／バー鎖は偵たようにクローンした。重鎮及び カッパー鎮の３つのクローン壱ソーケンス化した。全ての３つの重鎖クローンは １９個のアミノ酸のシグナルペプチド配列、マウス重鎮サブグループＨにおける ｖ領域、Ｄセグメント及び、Ｊ、３セグメントをコードする同一の配列を有する （図１４０）。この３つのカッパークローンは配列においても同一であった。軽 鎖フラグメントは２０個のアミノ酸のシグナルペプチド、マウスカッパー鎖サブ グルＶ　−プＶに８けるｖｇＨ域遺伝子、及びＪＫ５セグメントをコードする（ 図１４Ｄ）。コード配列において両方の鎖は異常を示さなかった；それらの有効 性を次にキメラ抗体の作製及び発現により確認した。

キメラ抗体の作製及び発現 キメラ抗体遺伝子の作製及び発現のために２種類のプラスミドベクターを調製し た。プラスミドｐｖｇｉ　（図１５Ａ）はヒトサイトメガロウィルス■Ｅ１プロ モーター及びエンハンサ−（Ｍ、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅ１Ｉｎ、５２１　（１ ９８５））、前方のイントロンの一部を含むヒトゲノムＣｌｌセグメント、並び に選別のためのヒグロマイシン遺伝子（Ｂｌｏｃｈｌｉｎｇｅｒら、Ｍｏ１．Ｃ ｅ１１．Ｂｉｏｌ、　４　、２９２９　（１９８４））を含む、プラスミドｐＶ Ｋ　（図１５Ｂ）はｐＶｇｌと１（１２するが、しかしながらヒトゲノムＣにセ グメント及びｇｐｔ遺伝子を含む、　Ｆｄ７９及びＦａｘ３８−８０の重及び軽 鎖可変領域の誘導体をポリメラーゼ連鎖反応によりｃＤＮ＾から調製した。５′ プライマーはＡＴＧコドンにおいて出発するＶ８！＠にハイブリダイズしており 、そしてＸｂａ　１部位を含み；３′プライマーはＪ領域の最後の１５個のヌク レオチドとハイブリダイズしており、そしてスプライスドナーシグナル及びχｈ ａ１部位を含む（Ｃ，Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

匙ａｄ、旦牡」］」坦、　１００２９　（１９８９）を参照のこと）、改質■領 域を関連のブラミドベクターのＣＭＶプロモーターと定常領域の部分イントロン との間のＸｂａ　１部位の中にクローンした。

キメラ抗体の発現のため、重鎮及びカッパー鎖プラスミドをエレクトロポレーシ ヨンによって５ｐ２１０マウスミエローマ細胞にトランスフェクトし、そしてｇ ｐｔ発現について細胞を選別した。最大量の完全抗体を分泌するクローンをＥＬ ＩＳＡにより検定した。ｗ＃製したキメラＦｄ７９及びＦｄ１３８−８０抗体は 、フローサイトメトリーにより、ｌｌ５ｖ−ｉ感染化ｖｅｒｏ細胞に結合するこ とが示された。ウィルス中和アッセイは、キメラ抗体がネズミ抗体の中和活性を 保持していることち示した（デ′−ターは示さず、！−かしながら以下のヒト抗 体の類似の結果を参照のこと）６ ヒＭｌ、抗体のコンビエータ−モデル化ヒト化抗体において高結合親和力を維持 せしめるため、Ｑｕｅｅｎらの一般千Ｉｌｌ？こ従った（Ｃ，Ｑｕｅｅｎら、Ｐ ｒｏｃ、Ｎ４ｔ１．Ｉｊｃａす、Ｓｅｉ、ｌｌ５ｑ　８６．１００２９（１９８ ９））。ヒト抗体が元のネズミ抗体とより相同性であるに従い、不ズミＣＤＲを ヒトフレームワークに組合せることによる、親和力を低めろる、ＣＤＲへの歪み の導入の傾向が下がるであろう。通常、同一のヒト抗体に由来する重鎮及び軽鎖 をフレームワーク配列を提供するために選び、これによりこの２木の鎖を集成す るうえでの非適合性の可能性は低まる。Ｎ８１？Ｆタンパク質配列データーヘー スに対する配列相同性探索（Ｍｉｃｒｏ　Ｇｅｎ１ｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎ ａｌｙｓｉｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（３ｒ４ｃｋｍａｎ）により実施）に基づき、 抗体Ｐｏｓを、Ｆｄ７９のヒト化のたメツフレームワーク配列を担うために選ん だ。

Ｆｄ７９可変領域のモデルを作製するためにコンピュータープログラムＦＮＣＡ Ｄ　（Ｌｅｖｉｔｔ、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１６８．５９５　（１９８３ ））を利用した。

不ズミＦｄ７９の精空なモデルの調査は、ＣＤＲ残苓に有意に接触するのＬ二七 分に近いフレームワーク中の２個のアミノ酸残基を示した（表４）。軽鎖のＮＲ Ｉ？Ｆ位２４９におけるＬｙｙ、は、軽鎖のＣｌ１Ｒ２における３つのアミノ酸 （Ｌ５０のＴｒｙ、Ｌ　５３のＡｓｎ、　Ｌ　５５のｃｉｕ）及び重鎮における ＣＤＲ３の２個のアミノ酸（Ｒ９９のＡ！＋ｐ、　ＨｌｏｏのＴｙｒ　）に接し ている。重鎮の位置９３におけるＬｅｕは重鎮のＣＤＲ２における２個のアミ− ’　酸（Ｈ３５のＳｓｒ、Ｈ３７のＶａｌン及び重を貞のＣＤＲ３におけるアミ ノ酸（ＨｌｏｏＣのＰｈｅ　）との相互作用も示す９それ故、Ｌ４９の１、ｙｓ 及びＲ９３の１、ｅｕはヒト化Ｆｄ７９の作製において維持し、なぜならそれら のヒトＰＯＩｌフレー１４ワーク残基による置換はＣＤＲに歪みを導入しがちで あろうからである。更に、　Ｐｏｔｌフレームワークにおける７個の他の残基（ 軽鎖のうちの５個及び重鎮における２個）を共通しト残基で置換しく不ズミＦｄ ７９配列と６通りの選択において同一）、その理由はそれらは、他のヒト抗体に おいてまれであるからである。フレームワークにおｔｊる普通でないアミノ酸の 削除は免疫原性を更に低める。

このネズミＦｄ７９配列及び関連のヒト化配列を図１４Ａ、Ｂに示す。Ｐｏｍフ レームワーク中の置換された残基に下線を付しである。

表４ 超可麦類域中の残基と接しているフレームワーク配列中の残基ｄ７９ Ｌ４９　Ｌｙｓ　Ｌ５０Ｙ、　Ｌ５３Ｎ、　Ｌ５５Ｅ、　Ｒ９９Ｄ、　Ｈｌｏｏ ＹＨ９３Ｌｅｕ　Ｈ３５Ｓ、　）＋３７Ｌ　）ＩｌｏｏｃＦＦ、＋１３８−８０ Ｌ３６　Ｈｉｓ　Ｌ３４Ｖ、　Ｌ８９ＱＨ２７Ｔｙｒ　Ｈ３２Ｈ，Ｈ３４Ｉ Ｈ３０Ｔｙｒ　１（３２）１．　Ｈ５３ＲＨ４８Ｐｈｅ　８６３Ｆ Ｈ６６Ｌｙｓ　）１６３Ｆ １、アミノ酸残基はＫａｂａｔ系に従って番号付けした（Ｅ、Ａ、Ｋａｂａｔら 、５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｆｍｕｎｏｌｇｉｅａ ｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆ　Ｈｅａｌ ｔｈ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＤ　（１９８７））　：第１文字（Ｈ又はＩ、 ）は重鎮又は軽鎖を意味する。続く番号は残基番号である。最後の文字はアミノ 酸の１文字コードであるや２、超可変領域はＫａｂａｔに従って決定した：軽鎖 ＣＤＲＩ　：残基２４−３４　；　ＣＤＲ２：　５０−５６　；　ＣＤＲ３：　 ８９−９７重鎖ＣＤＲＩ　：　３１−３５　；ＣＤＲ２：５ｏ−ｓｓ　；ＣＤＲ ３：　９５−１０２同様にして、Ｆｄ１３８−８０の７ズミ重鎖及び軽鎖配列を ＮＢＲＦタンパク質配列データーヘースに対する配列相同性探索にかけた。ヒト 化Ｆｄ１３８−８０のためのフレームワーク配列を担うのにヒト抗体Ｅｕの配列 を選んだ、　Ｆｄ１３８−８０のコンピューター作製モデルの調査は、このフレ ームワーク中の６個のアミノ酸残基がＣＤＲ残基との重要な接触のために十分に 近くにあることを示した。これらの残基及びその接触対応物を表４に記載する； これらの不ズミ残基はヒト化Ｆｄ１３８−８０の構造の中で維持させた。２個の 他の残基（Ｌ８７のＰｈｅ及びＲ３７のＭｅ　ｔ）はＬ９８　Ｐｈｅとの存意な 接触性を示し、これらはＣＤＲ３のすぐ隣りにあり、従ってこれら２個のマウス 残基も残した。Ｅｕフレームワーク中の８個のアミノ酸（軽鎖のうちの２個及び 重鎮のうちの６個）をネズミ残基で１換しくこれらもヒト共通残基を構成する） 、なぜならそれらはその他のヒト抗体においてまれであるからである。ネズミＦ ｄ１３８−８０配列及び対応のヒト化配列を図１４Ｃに示す。Ｅｕフレームワー ク中の置換された残基に下線を付した。

ヒト化抗体のための遺伝子の作製のため、一般にマウス配列において見い出せる コドンを利用して、シグナルペプチドを含むヒト比重及び軽鎖のタンパク譬配列 をコードするヌクレオチド配列を選別した。複数の縮重コドンを変えて、制限部 位を作る又は所望されないものを除去した。このヌクレオチド配列はキメラ遺伝 子において利用されているものと同しスプライスドナーシグナル、及び各端での Ｘｂａ　Ｉ部位も含んでいた。各遺伝子を４つの重複合成オリゴヌクレオチドか ら作製した。各可変ドメイン遺伝子のため、交互鎖上の２対の重複オリゴヌクレ オチドを合成し、これは全コード配列並びにシグナルペプチド及びスプライスド ナーシグナルを含んでいた。このオリゴヌクレオチドはアプライドバイオシステ ム３８０Ｂ　ＤＮＡ合成装置で合成した。各オリゴは約１１０−１４０の塩基の 長さであり、その１５塩基は重複していた。二本鎖ＤＮ＾断片をクレノウポ１１ メラーゼにより合成し、制限酵素で消化し、ｐＵｃ１８ヘクターにリゲヒトし、 次いでシーケンス化した。適切な配列を有するこの２種の断片を次にｐＶｇｌ　 ｄｈｆｒ又はｐＶに発現ヘククーのＸｂａ　１部位にリゲヒトした。

合成遺伝子をｐＶｇｌ及びｐＶＫ発現発現ダクターにクローンさせた。

作製した各ヒト化抗体に関して、重鎮及び軽鎖プラスミドをエレクトロポレーシ ョンによって５ｐ２１０マウスミエローマ細胞にトランスフェクトし、そしてｇ ｐｔ発現について細胞を選別した。　ＥＬＩＳＡによって培養上清液中のヒト抗 体生産をアッセイすることによりクローンをスクリーンし、そして最良生産クロ ーンから抗体を精製した。

抗体は組織培養上滑液をスタフィロコッカスプロティンＡ−セファローズＣＬ− ４Ｂ　（ファルマシア）のカラムに通すことによって精製した。結合抗体を０． ２Ｍのグリシン−ＨＣｌ　、ｐＨ３，０により溶離させ、次いでＩＭのトリス、 ｐＨｓ、ｏで中和した。この緩衝液をＰＤＩＯカラム（ファルマシア）に通して ＰＢＳに交換した。

ヒト化抗体の性質 ヒト化Ｆｄ７９及びＦｄ１３８−Ｒ０抗体をネズミ及びキメラ抗体と比較して特 性化した。両方のヒト化抗体は、ＨＳＶ−１により感染されたνｅｒ。

細胞に、フルオロサイトメトリー分析においてキメラ抗体と同様に結合しく図１ ６）、これらが対応のウィルス抗原を認識することが示唆された。この結合活性 をより定量的に評価するため、放射性ヨウ素化ネズミ抗体をウィルス感染化細胞 に結合させ、そしてスキャノチャード分析を実施した。

ヒト化抗体の親和力をヨウ素化抗体との競合によって決定した。

ＨＳＶ−１により感染された細胞をｇＢ及びｇｏ抗原の起源として利用した。競 合抗体（マウス又はヒト化）の量を増やしながら１．５ｏｇの放射性ヨウ素化ト レーサーマウス抗体（２μＣｉ／μｇ）に加え、そして０．２ｍｌの結合用緩衝 液（ＰＢＳ−＋１％のＦＣＳ＋　０．１％のアザイド）の中で４Ｘ１０’の感染 化νｅｒｏ細胞と４°Ｃで１時間インキエヘヒトした。

細胞を洗い、次いでベレット化し、そしてその放射活性を測定した。

結合及び遊離のトＬノーサー抗体の濃度を計算した。結合親和力はＢｅｒｚｏｆ ｓｋｙの方法に従って計算した（Ｊ、Ａ、ＢｅｒｚｏｆｓｋｙとＩｊ、Ｂｅｒｗ ｏｒｋｅｒのＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｉｍａ＋ｕｎｏｌｏｇｙ　（Ｗ、Ｅ、Ｐ ａｕ１編）　、　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。

５９５　（１９８４））。

この測定値が示すには、ヒト抗体において結合親和力の有意な損失はなかった（ 表５）。詳しくは、ヒト化Ｆｄ７９における親和力はネズミＦｄ７９と比べて１ ／２に下った（５．３Ｘ１０’　Ｍ−’対１．ｌＸ１０”　Ｍ−’のに、）。ヒ ト化Ｆｄ１３８−８０の親和力は享ズミ抗体のそれに匹敵した（４．８ｘｌＯ’ 　Ｍ−’対５．２ｘｌＯ’　Ｍ−’のに、）。

表５ ネズミ及びヒト化抗体の結合親和力 Ｆｄ７９　（抗＝ｇＢ）　１．１ｘｌＯ”　５．３Ｘ１０’ネズミＦｄ７９及び Ｆｄ１３８−８０は補体なしで試験管内でＨＳＶ−１を中和することが示されて おり（Ｊ、Ｋｏｇａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ■ｉＬ　３８５　（１９８６））、従 ってヒト化抗体の中和活性をこれらのマウス抗体と比較した。

Ｖｅｒｏ細胞への接種の前に、同量のネズミとヒト化抗体の希釈系列をウィルス とインキュへ一１’　シた。４日後、細胞を中性レッドで染めてブラックを識別 化させた。これらのブラック削減アッセイに由来する結果は、この両方のヒト化 Ｆｄ７９及びＦｄ１３８−８０がその不ズミ対応物と同等にウィルスを中和せし めることを示唆した（図１７Ａ及びＢ）。

ヒト化及び不ズミのＦｄ７９の両者は１０ｎＭ（１，５μｇ／ｌ）の抗体濃度で ブラックの９０％を削減させた。同様に、ヒト化及びネズミＦｄ１３８−８０は 同じレベルにて９０％のブラックを削減を起こさせることができる。

これらの抗体は、組織培養物に分散されたウィルスから細胞を守るその能力につ いても調べられた。Ｖｅｒｏ細胞にウィルスをＯ，１ｐｆｕ／細胞で接種させ、 次いで１０μｇ／ｍｌの抗体を加える前に３７°Ｃで２時間吸着させた。４日後 、感染化細胞上のウィルス抗原の検定のために細胞を抗−ｇＢ抗体で染めた。結 果が示すには、ネズミ及びヒト化Ｆｄ７９の両者は１０μｇ／ｍｌで培養細胞を 感染から守った（図３８Ａ）。

しかしながら、ネズミもヒト化Ｆｄ１３８−８０も、接種前のそのウィルスを中 和する能力にもかかわらず、ウィルスの分散に対して細胞を守ることはできなか った（図１８Ｂ）。ｇＢ及びｇＤの両者は細胞融合及びウィルスｑＤに関連する と考えられている（Ｗ、Ｃａｉら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　６２＋２５９６　（１９ ８８）及びＡ、０．ＦｕｌｌｅｒとＰ、Ｇ、５ｐｅａｒ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８４、５４５４　（１９８７））。しかしながら、 ＦｄはｇＢの感染及び細胞融合機能の両方をプロ、りすることが可能であり、他 方Ｆｄ１３８−８０はｇＤの感染機能のみをブロックするため、ウィルスは細胞 から細胞へと移ることができ続ける。

結合、中和及び防御結果の全ては、ヒト化Ｆｄ７９及びＦｄ１３８−Ｒ０抗体が ネズミモノクローナル抗体の結合活性及び生物学的性質を保持していることを示 唆する。とりわけ）ＩＳＶのｇＢ及びｇｏに対する特異性を存するヒト化抗体の 能力は、ウィルス障害の処置におけるヒト化抗体の生体内能力及び免疫原性の研 究の機会を提供する。ｇＢ及びｇＤの共通のタイプのエピトープのＦｄ７９及び Ｆｄ１３８−８０による認ｔｘ　ＣＪ、Ｋｏｇａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１５１． ３８５　（１９８６））はヘルペス単純ウィルス２型及び１型に対して有効な治 療を広げる。

生体内におけるヘルペス感染症に対するヒト化抗体の薬効を調べるため、致死量 のＨ５Ｖ−２の接種の前後でマウスにヒト化抗体を注射し、そして死亡率をモニ ターした。動物のグループを０．９．０．３又は０．１ｍｇのヒト化Ｆｄ７９又 はＦｄ１３８−８０のそれぞれにより、ウィルス接種の２４ｈｒ前又は２４ｈｒ 後にて腹腔内処宣した。１０匹のマウスのグループに致死量のＨ５Ｖ−２を鼻腔 内的に付与した。マウスを３週間にわたりモニターした。死亡率を以下の表に示 す。

この結果が示すには、マウスのＨ５Ｖ−２感染に対して有意な防御がヒト化Ｆｄ ７９及びヒト化Ｆｄ１３８−８０により獲得された。

表一旦 ＨＳシー２を鼻口内接種させたマウスの死亡率に及ぼすＨ５Ｖ抗体前処置（−２ ４ｈ）の効果コントロール　１３／１５　８７ 偽薬　１３／１５　８７　ＮＳ ネネズＦｄ１３８ ０、ｈｇ　３／　１０　３０　＜　０．００１Ｑ、３ｍｇ　５／１０　５０　０ ．０１０．１−ｇ　５／１０　５０　０．０８ヒト化Ｆｄ１３８ ０．９ｍｇ　１／　１０　１０　＜０．００１０．３ｍｇ　８／　１０　８０　 ＮＳ Ｏ，ｂ＋ｇ　７／１０　７０　ＮＳ ネネズＦｄ７９ ０．９ｍｇ　Ｏ／　１０　０　＜０．００１０．３ｍｇ　２／　１０　２０　＜ ０．０１０、　ＩＢ　４／　１０　４０　＜　０．０５ヒト化Ｆｄ７９ ０．９ｍｇ　１／１０　１０　＜０．０１０．３ａｇ　３／　１０　３０　０． ０８０．１ｍｇ　５／１０　５０　０．０８支−１ Ｈ５Ｖ−２を鼻口内接種させたマウスの死亡率に及ぼすｌｌ５Ｖ抗体後処置（＋ ２４ｈ）の効果コントロール　１２／１５　８０ 偽薬　１５／１５　１００　ＮＳ ネネズＦｄ１３８ ０．９ｓｇ　２／１０　２０　＜０．００１０．３ｍｇ　４／　１０　４０　０ ．００１０、１ｍｇ　５／　１０　５０　＜０．０１ヒト化Ｆｄ１３８ ０．９雌ｇ　３／１０　３０　＜０．００１０．３ｍｇ　３／　１０　３０　＜ ０．００１０．１膳ｇ９／１０９ＯＮＳ ネズミＦｄ７９ ０．９ｓｇ　５／　１０　５０　＜　０．０１０．３ｍｇ　３／　１０　３０　 ＜０．００１０．１−ｇ　６／１０　６０　＜０．０５ヒト化Ｆｄ７９ ０４９霧ｇ　３／　１０　３０　＜　０．００１０．３ｍｇ　３／１０　３０　 ＜０．００１０、１ｍｇ　９／　１０　９０　ＮＳ 治療における２種以上のヒト化抗体の組合せの利用は抗体耐性株の発生を低める ために重要である。ヒト化抗体と別の抗ウィルス剤、例えばアシクロビルとの組 合せ治療は、化学治療剤単独では有効でないときに障害に打ぢ勝つ更なる機会を 提供する。Ｆｄ７９及びＦｄ１３８−８０は不ズミの目のモデルにおけるウィル スの持続性の率を下げるため（Ｊ、Ｆ、Ｍｅｔｃａｌｆら、Ｃｕｒ、Ｅｙｅ　Ｒ ｅｓ、、６　、１７３　（１９８７））　、ヒト化抗体は典型的にはその他の抗 ウィルス剤と一緒になって、再発性生殖怒染症の状況〔その箇所は従来抗ウィル ス剤は有効でないとされていた（Ｌ、Ｃｏｒｅｙら、Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ 、　３０６．１３１３　（１９８２）　）を抑えることができる。ヒト定常ドメ インの一体化はエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞性細胞毒性を高めるこ ともでき、これはヒト患者におけるより多大な治療的効果をもたらす。

例■ ＣＤ３３抗原に対するヒト化免疫グロブリン米国において年間約１０，０００〜 １５，０００の新しい骨髄性（非リンパ球性又は顆粒球性とも呼ばれている）白 血病のケースがある（ＣａｎｃｅｒＦａｃｔｓ　＆　Ｆｉｇｕｒｅｓ、　Ａｍｅ ｒｉｃａｎ　Ｃａｎｃｅｒ　５ｏｃｉｅｔｙ、　１９８７）　ａ骨髄白血病には ２つの主たる形！！：急性骨髄性白血病（Ａ？ＩＬ）及び慢性骨髄性白血病（Ｃ ＭＬ）がある、化学治療による処置にもかかわらず、ＡＭＬに患う患者の長期生 存は１０〜２０％以下であり（Ｃ１ａｒｋｓｏｎら、ＣＲＣＣｒｉｔｉｃａｌＲ ｅｗｉｅｗ　ｉｎ　Ｏｎｃｏ１ｏｇｙ／Ｉ’ｌｅｍａｔｏｌｏｇｙ土、　２２１ 　（１９８６））　、そしてＣＩ’ｌＬ並びに関連の障害、例えば慢性骨髄性単 球白血病（ＣＭＭＬ）　、慢性単球性白血病（ＣＭＭＯＬ）及び骨髄形成異常症 （ＭＤＳ）に患う者の生存率は更に低い。

ＣＤ３３に結合するその他の抗体はＭ１９５である（Ｔａｎｉｓｏｔｏら、Ｌｅ ｕｋｅｍｉａ３、３３９　（１９８９）及び５ｃｈｅ　ｉｎｂｅｒｇらＬｅｕｋ ｅｍｉａ　３　、４４０　（１９８９））　、　Ｍ１９５の広範囲にわたる様々 な細胞及び組織との反応性を試験した。正常な細胞のうちで、ｈ１９５は一定の 単球及び骨髄先祖細胞にのみ結合することが報告されている。その探索は、これ がその他の造血細胞又は非造血細胞に結合しないことも報告している。Ｍ１９５ はＡ札のほとんどのケース及び骨髄芽球期におけるＣＭＬの全てのケースの細胞 に結合する。

Ａ肚におけるＭ２Ｏ３の第１段階臨床試験が実施されている（Ｓｃｈｅｉｎｂｅ ｒｇら、Ｐｒｏｃ、ＡＳＣＯ９、２０？　（１９９０））　、ヨウ素１３１によ り放射ラヘル化されたＭ２Ｏ３は血液及び骨髄の両方における白血病細胞を迅速 に、且つ、特異的に標的にすることが見い出されている。

本発明により、ＣＤ３３関連エピトープに特異的に反応するヒト化免疫グロブリ ンが提供された。少なくとも約１０’Ｍ−’、そして好ましくは１０”Ｍ−’〜 １０１０１Ｏ’又はそれより強いＣＤ３３への結合親和力を有するこれらの免疫 グロブリンは白血病細胞を破壊することができる。

該ヒト化免疫グロブリンはヒトフレームワークを有しており、そして典型的には マウス免疫グロブリン、詳しくはＣＤ３３抗原に反応性な免疫グロブリンに由来 する１又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するであろう、好ましい態様に おいては、１又は複数のＣＤＲはＭ１９５抗体に由来するであろう。Ｈ１９５は 究極造血幹細胞と結合しなく、従って治療において利用されるＭ２Ｏ３がそれら の細胞に相互作用してそれらを破壊することが最少限であることが重要であり、 これは全ての血液細胞の発生にとって重要である。従って、大量に経済的に製造 できる本発明のＣＤ３３特異性免疫グロブリンは例えば様々な技術によりヒト患 者における骨髄細胞媒介障害の処置において利用されうる。

ある観点において、本発明はＣＤ３３抗原の所望のエピトープに結合することの できる免疫グロブリン、例えばモノクローナル抗体Ｍ１９５゜Ｌ４Ｂ３．　ＬＩ Ｂ２又は？ｌＹ９に由来する重鎮及び／又は軽鎖をコードする組換えＤＮＡセグ メントに関する。このような領域をコードするＤＮＡセグメントは一般に適当な ヒト化フレームワーク領域をコードするＤＮＡセグメントに連結されているであ ろう。発現に基づいてモノクローナル抗体旧９５の重及び軽鎖のＣＤＲに由来す るポリペプチド鎖をコードする典型的なりＮＡ配列を図１９に含ませた。コドン 縮重及び重要でないアミノ酸置換に基づき、以下の詳１−．　（述ハ；る通り、 その他のＤＮＡ配列がこれらの配列に容易にとって代わることができる。

本発明の抗体は血液学悪性疾患においてそれぞれ典型的に利用されるであろう。

例えば、処置に適する典型的な障害症状には八Ｍ１．。

Ｃ？Ｉ１．、　ＣＭ？ＩＬ、　ＣＭＭＯｌ、及び−〇Ｓが含まれる（一般に、Ｈ ｏｆｆｂｒａｎｄ　＆　Ｐｅｔｔｉｔ。

Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ　Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉ ｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ。

０ｘｆｏｒｄ　（１９８０）を参照のこと）。この抗体は骨髄移植前の骨髄切除 のためにも利用されうる。

本発明の任意のヒト化免疫グロブリンはその他の抗体、特に種々の骨髄抗原に反 応性のヒト化抗体と組合せて利用することもできうる。例えば、ヒト化免疫グロ ブリンの混合物が反応しうる適当な抗体には、ＣＩ）１３．　ＣＤ１４．　ＣＤ １５．　ＣＤ１６及びＣＤ３４が含まれる（Ｌｅｕｋｏｃｙ　ｔ。

Ｔｙｐｉｎｇ　ｍ、前掲、頁５７６−７３２を参照のこと）。

これらの抗体は化学治療剤と一緒に付与される独立投与型組成物としても利用さ れうる。典型的には、この試薬にはシトシンアラビノシド及びダウノルビシンが 含まれうるが、しかしながら白血病処置についての業界の当業者によく知られて いる真人な数の添加剤（例えば６−チオグアニン）も利用されうる（Ｈｏｆｆｂ ｒｕｎｄ　＆　Ｐｅｔｔｉｔ、前掲）。本発明の好ましい薬品製剤は白血病細胞 を殺す免疫毒性の対象の免疫グロブリンの利用を含んで成る。

本発明のヒト化抗体は試験管内における広範囲にわたる様々な用途に有用性が見 い出せうる。例えば、これらの抗体はＣＤ３３抗原の検査、特定の骨髄細胞の単 離等に利用できる。

この実験は１１９５抗体に固執したが、ＣＤ３３抗原に対して高１１結合親和力 を有するヒト化抗体の製造は、Ｌ４Ｂ３．　ＬＩＢ２．　ＭＹ９又はその他のＣ Ｄ３３エピトープに結合するモノクローナル抗体由来のＣＤＲを用しすることも 考えられる。

実験 重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡのクローニング 重鎮及び軽鎖可変ドメイン遺伝子に関するｃＤＮＡをアンカー化ポリメラーゼ連 鎖反応により（Ｅ、ｆｌ、Ｌｏｈら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４３．２１７　（１９ ８９））、イマーと、ｄＧデテールハイブリダイズされ、且つ、ＥｃｏＲ１部位 を含む５′プライマーを用いてクローンする（図６において手法を示す）６二〇 ＰＣＲ増幅化断片をシーケンシングのためにＥｃｏＲＴ及び旧ｎｄＩ［により消 化し、次いでｐＨｃ１９ヘクターの中にクローンした。Ｍ２Ｏ３に関しては、２ つのガンマ−２ａ特異性及び２つの力・ツバー特異性クローンをシーケンス化し た。この２つのガンマ−２ａクローン及び２つのカンバークローンはそれぞれ配 列において同一である。ｃＤＮＡ可変ドメイン配列及びその推定アミノ酸配列を 図１９に示す。

キメラ抗体の作製及び発現 キメラ抗体遺伝子の作製及び発現のために２種類のプラスミドベクターを調製し た。プラスミドｐＶｇｌ−ｄｈｆｒ　（図２ＯＡ）はヒトサイトメガロウィルス ＩＥＩプロモーター及びエンノーンサ−（Ｍ、Ｂｏｓｈａｒｔ　ラ、釦旦４１． ５２１　（１９８５））　、前方のイントロンの一部を含むヒトゲノム（、ｒｌ セグメント、並びに選別のためのジヒドロフオレートリダクターゼ（ｄｈｆｒ） 遺伝子（Ｓｉｍｏｎｓｅｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳ Ａ８０、２４９５　（１９８３））を含む。プラスミドｐｖＫ（図２０Ｂ）はｐ Ｖｇｌ−ｄｈｆｒと類似するが、しかしながらヒトゲノムＣにセグメント及びｇ ｐｔ遺伝子を含む、　！′１１９５の重及び軽鎖可変領域の誘導体をポリメラー ゼ連鎖反応によりｃＤＮＡから調製した。５′プライマーはＡＴＧコドンにおい て出発する■領域にハイブリダイズしており、そしてＸｂａ　１部位を含み；３ ′プライマーはＪＧＩ域の最後の１５個のヌクレオチドとハイブリダイズしてお り、そしてスブライスドナーノグナル及び、Ｘｂａ１部位を含む（Ｃ，Ｑｕｅｅ ｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６．１００２９　（ １９８９）を参照のこと）、、改質■領域を関連のプラミドヘクターのＣＭジブ ロモ−ターと定常領域の部分イントロンとの間のＸｂａ　１部位の中にクローン した。

キメラ抗体の発現のため、重鎮及びカッパー鎖プラスミドをエレクトロポレーシ ョンによって５ｐ２１０マウスミエローマ細胞にトランスフェクトし、そしてｇ ｐｔ発現について細胞を選別した。最大量の完全抗体を分泌するクローンをＥＬ ［ＳＡにより検定した。精製したキメラＭ１９５抗体は、フローサイトメトリー により、ＣＤ３３抗原を発現するＵ９３７細胞に結合することが示された（図２ １）。

ヒト化抗体のコンピューターモデル化 ヒト化抗体において高結合親和力を維持せしめるため、Ｑｕｅｅｎらの一船手１ ＠に従った（Ｃ，Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ　８６．１００２９（１９８９））、ヒト抗体が元のネズミ抗体とより相同性 であるに従い、ネズミＣＤＲをヒトフレームワークに組合せることによる、親和 力を低めうる、ＣＤＲへの歪みの導入の傾向が下がるであろう。通常、同一のヒ ト抗体に由来する重鎮及び軽鎖をフレームワーク配列を提供するために選び、こ れによりこの２本の鎖を集成するうえでの非適合性の可能性は低まる。ＮＢＦＩ ？タンパク質配列データーヘースに対する配列相同性探索（Ｍｉｃｒｏ　Ｇｅｎ １ｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｋｍａ ｎ）により実施）に基づき、抗体Ｅｕを、Ｍ２Ｏ３のヒト化のためのフレームワ ーク配列を担うために選んだ。

Ｍ１９５可変領域のモデルを作製するためにコンピュータープログラムＥＮＣＡ Ｄ　Ｏ’ｌ几ｅｖｉｔｔ、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１６８．５９５　（１９ ８３））を用いた。

このモデルは、ＣＤＲに十分に密接していてそれらと存効な相互作用するＭ１９ ５フレームワークにおけるアミノ酸を決定するために用いた（以下のカテゴリー ４）。ヒト化重及び重１ｊＭ１９５可変領域を設計するには、次の４つのカテゴ リーのうちの１つ又は複数に属しない限り、各位ＩにおいてＥｕ抗体と同一のア ミノ酸を選択した：（１）その位置がＣＤＲに属した、 （２）その位１では、Ｅｕアミノ酸がヒト抗体にまれであり、一方、その位置で は、Ｍ１９５アミノ酸がヒト抗体に典型的であった。

（３）その位置がＣＤＲのすぐ近くであった、（４）上記したモデルが、そのア ミノ酸が抗原結合性領域（ＣＤＲ）に物理的に近いことを示唆した。

カテゴリー（２）において、「まれ」とは、Ｅｕの軽及び重鎮と同一のサブグル ープにおいてヒト配列の約２０％以下で見し）出せるアミノ酸を含むものと解釈 され（Ｋａｂａｔら、前掲に定義）、そして「典型的」とは、そのサブグループ においてヒト配列の約２５％以上、しかしながら一般には５０％以上で見い出せ るアミノ酸を含むものと解釈される。これらのカテゴリーにおける位置に関して 、マウスＭ１９５抗体に由来するアミノ酸を用いた：各カテゴリーにおけるアミ ノ酸を表８に示す。いくつかのアミノ酸は複数のカテゴリーに属する。ヒト化Ｍ １９５の軽及び重鎖可変ドメインの最終配列を図２２に示し、Ｅｕ配列と比較す る。

１　２４−３８．５４−６０．９３−１０１　３１−３５．５０−６６、９９− １０５２　１０．５２，６７．１１０　９３．９５，９８，１０６，１０７゜１ ０８、１１０ ３　３０、６７、９８．１０６ ４　４０．５２．７４　２７，３０．４８．．６８．９８ヒト化抗体のための遺 伝子の作製のため、一般にマウス配列において見い出せるコドンを利用して、マ ウスのＭ１９５１１中と同一のシグナルペプチド（図１９）を含むヒト比重及び 軽鎖のタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列を選別した。複数の縮重コ ドンを変えて、制限部位を作る又は所望されないものを除去した。このヌクレオ チド配列はキメラ遺伝子において利用されているものと同じスプライスドナーシ グナル及び各端でのＸｂａ　１部位も含んでいた。各遺伝子を４つの重複合成オ リゴヌクレオチドから作製した。各可変ドメイン遺伝子のため、交互鎖上の２対 の重複オリゴヌクレオチドを合成し、これは全コード配列並びにシグナルペプチ ド及びスプライスドナーシグナル（図２３）を含んでいた。このオリゴヌクレオ チドはアプライドバイオシステム３８０Ｂ　ＤＮＡ合成装置で合成した。各オリ ゴは約１１０−１４０の塩基の長さであり、その約１５塩基は重複していた。多 対のオリゴヌクレオチドから二本鎖ＤＮＡ断片をタレノウポリメラーゼにより合 成し、制限酵素で消化し、ｐ［Ｉｃ１８ベクターにリゲヒトシ、次いでシーケン ス化した。対応の適切な半配列を有するこの２種の断片を次にρＶｇｌ−ｄｈｆ ｒ又はｐＶＫ発現ベクターのＸｂａ　１部位に、完全な重及び軽鎖遺伝子を精製 せしめる正しい方向でリゲヒトした０反応は当業界によく知られる条件のもとで 行った（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前掲）。

重鎖及び軽鎖プラスミドをエレクトロポレーションによって５ｐ２１０マウスミ エローマ細胞にトランスフェクトし、そしてｇｐｔ発現について細胞を選別した 。ＥＬＩＳＡによって培養上清液中のヒト抗体生産をアッセイすることによりク ローンをスクリーンし、そして最良生産クローンから抗体を精製した。抗体は組 織培養上清液をメタフィロコンカスプロティンＡ−セファローズＣＬ−４８（） ７）レマシア）のカラムに通すことによって精製した。結合抗体を０．２Ｍのグ リシン−ＨＣｌ　、ｐＨ３，０により溶離させ、次いでＩＭのトリス、ｐＨｓ、 ｏで中和した。この緩衝液をＰ１１１０カラム（ファルマンア）に通してＰＢＳ に交換した。

ヒト化抗体の性質 ヒト化重９５抗体を不ズミ及びキメラ抗体と比較して特性化した。

該ヒト化抗体は、ｕ９３７細胞に、フルオロサイトメリー分析においてキメラ抗 体と同様に結合しく図２１）、これが同しＣＤ３３抗原を認識することが示唆さ れた。

ヒト化抗体の親和力は放射性ヨウ素化マウスＭ１９５抗体との競合によって決定 した（図２４）。結合親和力はＢｅｒｚｏｆｓｋｙの方法に従って計算した（Ｊ 、Ａ、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙと１．Ｊ、Ｂｅｒｋｏｗｅｒの、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔ ａｌ　〕四肌蛸旦ｕ（Ｗ、Ｅ、Ｐａｕ１編）、　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓ　（Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋ）、　５９５　（１９８４））　、マウス１９５は公開の値（Ｔａ ｈｍｏｔｏら、前掲）に匹敵する親和力を存し、そしてヒト化？１１９５抗体は 実験誤差の範囲内でマウスｊ１９５と同程度の親和力を有していた。

ヒト北門１９５は、ヒトエフェクター細胞及びヒトＣＤ３３−発現性細胞を用い るとき、抗体依存性細胞性細胞毒性を媒介するのに有用である。これは例えばＪ ｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５０．１４９５　（１９ ９０）により報告されているその他のヒト化抗体と類似している。

残念ながら、非ヒトモノクローナル抗体、例えばＭ２Ｂ５の利用はヒトの処置、 特に繰り返し７治療法において一定の欠点を有する。

例■ ＣＭＶ抗原に対するヒト化免疫グロブリンサイトメガロウィルスは免疫無防備状 態の個体、特に骨髄移植受答者、器官移植受容者及びＡＩＤＳ患者の主たる病因 となる（一般に、Ｆｉｅｌｄら編、νｉｒｏｌｏｇｙ　第２版、Ｒａｖｅｎ　Ｐ ｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ頁１９８１−２０１０　（１９９０）を参照のこ と）。骨髄移植患者の約１５％はＣＩ’ｌＶ肺炎を発症し、８５％の死亡率にあ る（Ｍｅｙｅｒｓ、　Ｒｅｖ、Ｉｎｆ、Ｄｉｓ、　１１　（付７）。

５Ｉ６９１　（１９８９））　、　ＡＩＤＳ患者の約１０％は重度なＣＭＶ障害 ；及び特異的な後天性ＣＭＶを、高い罹病率及び死亡率を伴って発症し、新生児 の１％に影響が及ぼされている（Ｆｉｅｌｄｓ前掲）。

薬剤ガンシクロビルは（ＪＶ感染症の一定の状態、特に脈絡網膜炎及び胃腸炎に 対して有効であるが、しかしながらＣ？ｌＶ肺炎に対してはあまり有効でなく、 そしてかなりの毒性を有している。プールしたヒト免疫グロブリン調製物の利用 は骨髄移植患者におけるＣ門Ｖの予防に関していくつかの利点効果が示されてお り（Ｍｅｙｅｒ前掲）、そして高用量の免疫グロブリンとガンシクロビルの組合 せはＣ！ＩＶ肺炎に対して有効であることが報告されている（ＥＨｎｕｅｌら、 Ｔｒａｎｓ。

Ｐｒｏｃ、　ＸＩＸ（付７）　１３２　（１９８７））　、しかしながら、市販 の免疫グロブリンの限界的な有効性、様々な潜伏能力及び高い価値は重大な問題 を残している。従って、ＣＭＶに対してを効な新規の薬剤の強い要望がある。

Ｃ？ＩＶはウィルスのヘルペスウィルス科の構成員であり、従って大きな二本鎖 ＤＮＡコア、タンパク質カスビド、及び表層上にウィルス塘タンパク質を有する 外部脂質エンベロープを有している。少なくとも８種類のタンパク譬がＣＭＶの エンベロープ上で検出されており（Ｂｒｉｔｔら、Ｊ、ν１ｒｏ１．６２．３３ ０９　（１９８８））、そしてＣＭＶのＤＮＡ配列に基づいて他も存在している ことが推定されている（Ｃｈｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ影μ、　７４４　（１９９０ ）。２種類の特に有意義なＣ１′Ｉｖｗタンパク質、即ち、ｇＢ　（ｐ１３０１ ５５又はｇｐ５５−１１６とも呼ばれる）及びｇＨ（ｐ８６とも呼ばれている） に対するネズミモノクローナル抗体が製造されており（Ｒａｓｕｍｕｓｓｅｎら 、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ耳ｉ３．３０８　（１９８８）及びＢｒ１ｔｔら、前掲）、 そしてウィルスの感染性を中和することが示されている。ｇＨに対する３種類の その他の中和抗体が（ＪＶ５．　ＣＭＶ１０９及びＣ？１Ｖ１１５と命名されて いる。ＣＭＶに対するヒトモノクローナル抗体も製造されている（Ｅｈｒｉｃｈ ら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　６　、　１５１　（１９８７））。

動物モデルにおいて、ネズミモノクローナル抗体がヘルペスウィルス科の構成員 を含む様々なウィルスにより生ずる感染症の処置において有効であることが示さ れている（例えばＭｅｔｃａｌｆら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏ１２９、３９　（１９ ８８）を参照のこと）。従って、かかる抗体はＣＭν怒染症の処置において有用 でありうる。残念ながら、非ヒトモノクローナル抗体、例えばＣＭν５及びＣＭ Ｖ１１５は以下に説明する通り、ヒ）・の処置、特に繰り返し治療法において一 定の欠点を有している。

従って、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、しかも治療製剤及びその他の 用途にとって適切な状態において簡単に、且つ、経済的に製造されるＣ１１ν抗 原に対して特異的なヒト化免疫グロブリンの改良形態が要望されている。本発明 はこれら及びその他の要望を満足せしめる。

本発明に従い、Ｃ？ＩＶ及びＣＭＶ怒染化細胞に特異的に反応性なヒト化免疫グ ロブリンを提供する。少なくとも約１０’Ｍ−’、そして好ましくは１０”Ｍ− ’〜１０”Ｍ−’又はそれより強力なＣ？ｌＶ特異的抗原に対する結合親和力を 有するこれらの免疫グロブリンは例えば細胞のＣＭＶ感染をブロックすることが できる。該ヒト化免疫グロブリンはヒトフレームワークを有しており、そして典 型的にはマウス免疫グロブリン、詳しくはけり抗原に反応性な免疫グロブリンに 由来するｌヌは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するであろう。好ましい態 様において、ｌ又ｉ”？ｊｆ数ノＣＤｌ？ハｃ１５、又はｃｑｖｘｏ９、又はＣ ？ＩＶ１１５抗体に由来するであろう。大量に経済的に製造されうる本発明の免 疫グロブリンは例えば種々の技術によるヒト愚者におけるＣＩ’ｌＶ媒介障害の 処置において有用である。

ある観点において、本発明はＣＭＶ抗原の所望のエピトープに結合することので きる免疫グロブリン、例えばモノクローナル抗体ＣＭＶ５又はＣ＋ＩＶ１１５に 由来する重鎖及び／又；よ軽鎖のＣＤＲをコートする組換えＤＮＡセグメントに 関連する。このような領域をコードするＤＮＡセグメントは御所に適当なヒトフ レームワーク領域をコードするＩ３Ｎ＾セグメントに連結されているであろう。

モノクローナル抗体側ν５の重及び軽鎖のＣＤＲを含んで成るポリペプチド鎖を 発現に基づいてコードする典型的なりＮＡ配列を図２５に含ませている。コドン 縮重及び重要でないアミノ酸置換に基づき、以下に述べる通り、その他のＤＮＡ 配列がこれらの配列に容易にとって代わることができる。

断片が１又は複数の免疫グロブリン活性（例えば補体固定活性）を有する、−次 抗体構造の一部のみを含んで成るポリペプチド断片を製造することができる。こ れらのポリペプチド断片は、当業界によく知られている方法による完全抗体のタ ンパク質分解によって、又は部位特異的突然変異誘発を利用し、ヘクターｐＶＫ 及びＰＶｇｌ−ｄｈｆｒ（図２６）における所望の位置に停止コドンを挿入する （例えばＣ１（１の後ろに挿入してＦａｂ断片を作る、又はヒンジ領域の後ろに 挿入して（Ｆａｂ’　ｈ断片を作る）ことによって製造されうる。−末鎖抗体は ＶＬとＶ）ＩをＤＮＡリンカ−で連結することによって製造されうる（Ｈｕｓ　 ｔｏｎら、前掲、及びＢｉｒｄら前掲を参照のこと）。

本発明の抗体は典型的にはＣＭν関連障害の処置において各別に用途が見い出せ る。例えば、処置に適する典型的な疾患症状にはＣＨＩν肺炎、新生見聞ν感染 症、ＣＭＶ単核細胞症、並びにＣＭＶ関連脈絡網膜炎及び胃腸炎が含まれる１本 発明の任意のヒト化免疫グロブリンはその他の抗体、特に欅々なＣＭＶ抗原に反 応性なヒト化抗体と組合せて利用することもできる。例えは、ヒト化免疫グロブ リンの混合物が反応しうる適切な抗原にはｇＢ及びｇＨタンパク質が含まれる。

この抗体は化学治療剤と一緒に付与される独立投与型組成物としても利用されう る。典型的には、この試薬にはアシクロビル又はガンシクロヒルが含まれうるが 、しかしながらＣＭν処置についての当業者によく知られている真人な数の他の 試薬も含まれうる。本発明の好ましい薬品製剤はＣＭＶ惑染感染胞を殺す免疫毒 性の対象の免疫グロブリンの利用を含んで成る。

本発明のＣ門Ｖ特異的ヒト化抗体は試験管内ζこおける広範囲にわたる様々な用 途に有用性が見い出せる。例えば、これらの抗体はＣＭＶ抗原の検査、特定のＣ ＭＶ感染化細胞の単離等に利用できる。

特に、本明細書でヒト化ＣＭＶ５を製造したのと同し方法を、ヒト化ＣＭＶ１０ ９．　ｆｌｆＶ１１５又はその他の抗ＣＭＶ抗体を製造するために利用できうる 。

実験 重鎮及び軽鎖ｃＤＮＡのクローニング 重鎮及び軽鎖可変ドメイン遺伝子に関するｃＤＮＡをアンカー化ポリメラーゼ連 鎖反応により（Ｅ、Ｙ、ｌ、Ｏｈら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４３．２１７　（１９ ８９））、定常領域にハイブリダイズされ、且つ、ＨｉｎｄＩ［［部位を含む３ ′プライマーと、ｄＧデテールハイブリダイズされ、且つ、ＥｃｏＲ１部位を含 む５′プライマーを用いてクローンする（図６において手法を示す）。

この１）ＣＲ増幅化断片をシーケンシングのためにＥｃｏＲＩ及びＨ４ｎｄＩｎ により消化し、次いでｐ　ＩＪ　Ｃ１８ヘクターの中にクローンした。　Ｃ１ｌ ν５に関しては、２つのガンマ−２ａ持異性及び２つのカンバー特異性クローン をシーケンス化した。この２つのガンマ−２ａクローン及び２つのカッパークロ ーンはそれぞれ配列において同一である。ＣＤＮＡ可変トメ１′ン配列及びその 推定アミノ酸配列を図２５Ａ及び２５Ｂに示す。

同様に、当業界によく知られている技術を利用して、ＣＭν１０９及びＣ？Ｉν １１５抗体に関するｃＤＮＡを獲得してその配列を決定することができうる。

キメラ抗体の作製及び発現 キメラ抗体遺伝子の作製及び発現のために２種類のプラスミドヘクターをｇＲ製 した。プラスミドｐＶｇｌ−ｄｈｆｒ　（図２６Ａ）はヒトサイトメガロウィル スＩＥＩプロモーター及びエンハンサ−（Ｍ、［１ｏｓｈａｒｔら、釦旦４１． ５２１　（１９８５））　、前方のイントロンの一部を含むヒトゲノムＣγ１セ グメント、並びに選別のためのジヒドロフオレートリダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺 伝子（Ｓｉｍｏｎｓｅｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、ＵＳＡ８ ０、２４９５　（１９８３））を含む、プラスミドｐＶＫ　（図２６Ｂ）はｐＶ ｇｌ　ｄｈｆｒと類似するが、しかしながらヒトゲノムＣにセグメント及びｇｐ ｔ遺伝子を含む。ＣＭＶ５の重及び軽鎖可変領域の誘導体をポリメラーゼ連鎖反 応によりｃＤＮＡから調製した。５′プライマーはＡＴＧコドンにおいて出発す るＶ領域にハイブリダイズしており、そしてＸｂａ　Ｉ部位を含み；３′プライ マーはＪＳｉ域の最後の１５個のヌクＩ／オチドとハイブリダイズしており、そ してスプライスドナーシグナル及びＸｂａ　Ｉ部位を含む（Ｃ，Ｑｕｅｅｎら、 Ｐｒｏｃ、Ｎｌ貼旦）山ＵＳＡ　８６．１００２９　（１９８９）を参照のこと ）、改質Ｖｉｆｆ域を関連のブラミドベクターのＣＭＶプロモーターと定常領域 の部分イントロンとの間のＸｂａ　１部位の中にクローンした。

キメラ抗体の発現のため、重鎖及びカンバー鎖プラスミドをエレクトロボレーシ 巧ンによって５ｐ２１０マウスミエローマ細胞にトランスフェクトし、そしてｇ ｐｔ発現について細胞を選別した。最大量の完全抗体を分泌するクローンをＥＬ ＩＳＡにより検定した。精製したキメラＣＭＶ５抗体は、けり感染化ヒト胎芽肺 繊維芽細胞の染色により、ｇＨ抗原を発現するＣＭＶ惑染感染胞に結合すること が示された。

ヒト化抗体のコンピューターモデル化 ヒト化抗体において高結合親和力を維持せしめるため、Ｑｕｅｅｎらの一般手順 に従った（Ｃ，Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ 　８６．１００２９（１９８９））。ヒト抗体が元のネズミ抗体とより相同性で あるに従い、不ズミＣＤＩＩをヒトフレームワークに組合せることによる、親和 力を低めうる、ＣＤＲへの歪みの導入の傾向が下がるであろう０通常、同一のヒ ト抗体に由来する重鎮及び軽鎖をフレームワーク配列を提供するために選び、こ れによりこの２本の鎖を集成するうえでの非適合性の可能性は低まる。ＮＢＲＦ タンパク質配列データーベースに対する配列相同性の探索（Ｍｉｃｒｏ　Ｇｅｎ １ｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｋｍａ ｎ）により実施）に基づき、抗体１ＩｌＯ１を、ＣＭＶ５のヒト化のためのフレ ームワーク配列を担うために選んだ。

ＣＭＶ５可変領域のモデルを作製するためにコンピュータープログラムＥＮＣＡ Ｄ　（Ｍ、Ｌｅｖｉｔｔ、　Ｊ、Ｍｏ！、Ｂｉｏｌ、　１６８．５９５　（１９ ８３））を用いた。

このモデルは、ＣＤＲに十分に密接していてそれらと有効に相互作用するＣ？Ｉ ＶＳフレームワークにおけるアミノ酸を決定するために用いた（以下のカテゴリ ー４）、ヒト化重及び重鎖ＣＭＶ５可変領域を設計するには、次の４つのカテゴ リーのうちの１つ又は複数に属しない限り、各位置においてＭｏｌ抗体と同一の アミノ酸を選択した：（１）その位置がＣＤＲに属した、 （２）その位置では、Ｍｏｌアミノ酸がヒト抗体にまれであり、一方、その位置 では、ＣＭＶ５アミノ酸がヒト抗体に典型的であった。

（３）その位置がＣＤＲのすぐ近くであった。

（４）上記したモデルが、そのアミノ酸が抗原結合性領域（ＣＤＲ）に物理的に 近いことを示唆した。

カテゴリー（２）において、「まれ」とは、−０１の軽及び重鎮と同一のサブグ ループにおいてヒト配列の約２０％以下で見い出せるアミノ酸を含むものと解釈 され（Ｋａｂａｔら、前掲に定義）、そして「典型的」とは、そのサブグループ においてヒト配列の約２５％以上、しかしながら一般には５０％以上で見い出せ るアミノ酸を含むものと解釈される。これらのカテゴリーにおける位置に関して 、マウスＣＭＶ５抗体に由来するアミノ酸を用いた。更に、もし位置が下記のと おりであるなら、その位置は第５カテゴリーに属する。即ち、その位置では勧１ アミノ酸がヒト抗体に非常にまれであり、そしてＣＭＶ５アミノ酸が異なり、し かもまれであるとき、この場合、この位置ではヒト抗体に典型的であるアミノ酸 を用いてよい。

各カテゴリーにおけるアミノ酸を表１に示している。いくつかのアミノ酸は複数 のカテゴリーに属しうる。ヒト化ＣＭＶ５の軽及び重鎖可変ドメインの最終配列 を図２７Ａ−Ｂに示し、Ｗｏｌ配列と比較する。

１　２４−３４．５０−５６．８９−９７　３１−３５．５０−６６、９９−１ ０８６９．８０ ２　６９、８０ ４　２４、２７．２８．３０．９７ ヒト化抗体のための遺伝子の作製のため、一般にマウス配列において見い出せる コドンを利用して、マウスのＣＭＶ５ｆｌ［中と同一のシグナルペプチド（図２ ５）を含むヒト比重及び軽鎖のタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列を 選別した。複数の縮重コドンを変えて、制限部位を作る又は所望されないものを 除去した。このヌクレオチド配列はキメラ遺伝子において利用されているものと 同じスプライスドナーシグナル及び各端でのＸｂａ　Ｉ部位も含んでいた。各遺 伝子を４つの重複合成オリゴヌクレオチドから作製した。各可変ドメイン遺伝子 のため、交互鎖上の２対の重複オリゴヌクレオチドを合成し、これは全コード配 列並びにシグナルペプチド及びスプライスドナーシグナル（図２８）を含んでい た。このオリゴヌクレオチドはアプライドバイオシステム３８０Ｂ　ＤＮＡ合成 装置で合成した。各オリゴは約１１０−１４０の塩基の長さであり、その約１５ 塩基は重複していた。多対のオリゴヌクレオチドから二本鎖ＤＮＡ断片をフレノ ウポリメラーゼにより合成し、制限酵素で消化し、ｐ［Ｉｃ１８ヘクターにリゲ ヒトし、次いでシーケンス化した。対応の適切な半配列を有するこの２種の断片 を次にｐＶｇｌ　ｄｈｆｒ又はｐＶＫ発現発現ダクターｂａ　１部位に完全な重 及び軽鎖遺伝子を生産するのに適切な方向でリゲヒトした０反応は当業界によく 知られる条件のもとで行った（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前掲）。

重鎮及び軽鎖プラスミドをエレクトロポレーションによって５ｐ２１０マウスミ エローマ細胞にトランスフェクトし、そしてｇｐｔ発現のために細胞を選別した 。ＥＬＩＳＡによって培養上清液中のヒト抗体生産をアンセイすることによりク ローンをスクリーンし、そして最良生産クローンから抗体を精製した。抗体は組 織培養土清液をスタフィロコッカスプロティンＡ−セファローズＣＬ−４８（フ ァルマシア）のカラムに通すことによって精製した。結合抗体を０．２Ｍのグリ シン−ＭＣＩ　、ｐ）ｌ　３．０により溶離させ、次いでＩＭのトリス、ｐＨ８ ，０で中和した。この緩衝液をＰＤＩＯカラム（ファルマシア）に通してＰＢＳ に交換した。

一過性トランスフェクションによってもヒト化抗体を製造した。

重鎮及び軽鎖プラスミドを叶ＡＥ−デキストラン法（Ｑｕｅｅｎら、Ｍｏｌ。

Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、４　、１０４３　（１９８４））により５１９４細胞にト ランスフェクト（７、そして前記の通りに培地からヒト化ＣＭＶ５抗体を精製し た。抗体をヒトＩｇに関するＥＬＩＳＡアッセイによって定量した。

ヒト化抗体の性質 ヒト化（ＪＶ５抗体を不ズミ及びキメラ抗体と比較して特性化した。

該ヒト化ＣＭν５抗体は、ＣＭＶ感染化ヒ化重芽肺（ＨＥＬ）細胞（ＡＴＣＣＣ ＣＬ１３７）の免疫染色により、側ν抗原に対するマウス及びキメラ抗体とほぼ 同程度に結合することが示された。９６穴プレート中のＨＥＬ細胞単層にＣＭＶ を０−０１ｐｆｕ／細胞で怒染させ、４日間インキエヘヒトし、３７°Ｃで乾か し、そしてラップして４℃で保存した。１００μｌのプロット（ＰＢＳ、　ＰＨ ７，４中の５％のカーネーションインスタントミルク）を各ウェルに加え、次い で３７°Ｃで３０分インキュベートした。このプロットを注ぎ出し、そして７５ μＩの２倍希釈系列のマウス、キメラ及びヒト化ＣＭＶ５抗体をこれらのウェル に加えた。このプレートを３７°Ｃでｌｈｒインキュベートし、次いでブロンド で２回洗った（各洗浄は１０分間放置した）。７５μＩの希釈ペルオキシダーゼ （ＨＲＰ）コンジュゲート化ヤギ抗マウス又は抗ヒトＩｇＧ　（Ｔａｇｏ）を各 ウェルに加え、そして３７℃で１時間インキュベートした。このプレートをＰＢ Ｓで２回洗い、次いで１５０μｌのＨＲＰ基質溶液を各ウェルに加えた。

室温で発色させた。このプレートを水で洗い、次いで風乾した。これらのウェル を顕微鏡で、ＣＭν感染化細胞上に着色沈漬を生成せしめる最大希釈率の抗体を 決定するために調べた。３種類の抗体に関して、検出可能な沈漬を生成せしめる 最低量の抗体は６３ｎｇ／ｍｌであり、ヒト化ＣＭν５抗体がマウス及びキメラ 抗体とほぼ同程度に結合することを示唆した。

マウス及びヒト化Ｃ？ｌＶ５の親和力を別の方法において比較するため、競合実 験を行った。前記のＣＭν感染化ＨＥＬ細胞のプレートをプロットと３７゛Ｃで ３０分間インキュベートした。このプロットを注ぎ出し、そして７５μｍのＰＢ Ｓ中のマウス又はヒト化ＣＭＶ５の希釈品を各ウェルに加えた。次にＰＢＳ中の １２５μｌの放射性ヨウ素化マウスＣＭν５（１μＣｉ／　ｕ　ｇ　）　（２８ ，０ＯＯｃｐａを含む）を各ウェルに加え、次いで３７°Ｃで２．５時間インキ ュベートした。このプレートをＰＢＳで５回洗い、そして各ウェルの内容物を２ ％のＳＯ５２００μｌで可溶化し、そしてカウントした。上昇する濃度のマウス 及びヒト化ＣＭＶ５はほぼ同程度に放射性ラヘル化ＣＭＶ５の結合を阻害しく図 ２９）、従ってヒト化ＣＭＶ５はマウス側Ｖ５とほぼ同し結合親和力を有する。

異常な抗体はこのアンセイにおいて競合しなかった。

けりを中和するヒト化Ｃ１’ｌＶ５の能力をマウスＣＭＶ５のそれと比べた。

マウス及びヒト化ＣＭＶ５を９６穴プレートのつニルの中で、１００μｌのＤＭ Ｅ培地→・２％のＦｅ２の中に２倍に順々に希釈した。１００の５０％−組織培 養物感染用量（ＴＣＩｎｓ。）単位を含むように希釈したＣＭＶ　１００μｍを 各ウェルに加え、そして３７゛Ｃで６０分間インキュベートした。

抗体−ウィルス混合物の各ウェルを９６穴プレート中の半集密ＨＥＬ細胞のウェ ルに加え、これより培地を除去した。細胞を５日間インキーエヘヒトし、そして 顕微鏡で各ウェル中の細胞障害効果（ＣＰＥ）を調べた。９０％でＣＰＥを阻害 する最も高い希釈率の抗体が、抗体の中和能力の測定のための尺度である。この ヒト化ＣＭＶ５抗体はマウスＣＭＶ５抗体とほぼ同程度にＣＭＶ抗体を中和した 。

例Ｖ 哺乳動物において、免疫応答は外来物質、皿ち抗原に特異的に相互作用するいく つかの細胞のタイプにより媒介される。このような細胞タイプのうちの１つであ るＢ細胞は、抗体の生産のもとである。

その他の細胞のタイプ、Ｔ細胞は、ウィルスにより感染された細胞を破壊する、 又はＢ細胞及びその他の造血細胞（Ｔ細胞を含む）の両者の生体内機能をコント ロールする広範囲にわたる様々な細胞のナブセノトを含む。第３の細胞タイプ、 マクロファージは、主要組織適合性複合体（？ＩＨＣ）タンパク質に関連する抗 原を処理及びＴ細胞に提供する。これらの細胞タイプ間の連絡はリンホカイン、 例えばインターロイキン１〜６及び７１ＦＮにより複雑な方法で媒介される（一 般に、Ｐａｕｌ、　Ｗ、Ｅ、ｍ、、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｉｗｓｕｎｏｌｇ ｙ、第２版、ＲａｖｅｙｌＰｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　ｙｏｒｋ　（１９８９）を参 照のこと）。

一つの重要なリンホカインはγ−ＩＦＮであり、これは一定のＴ細胞により分泌 される。その抗ウィルス活性に加えて、Ｔ−ＩＦＮはナチェラルキラー（ＮＫ） 細胞を刺激し、マクロファージを活性化し、そして細胞の表層上のＭＭＣ分子の 発現を刺激する（Ｐａｕｌ前掲、頁６２２−６２４）。従って、ｒ−ＩＦＮは一 般に免疫機能の数多くの態様を増強するのに働き、そしてかかる増強が所望され る、例えば癌の処Ｉのような場合において、治療薬の理論的な候補となる。他方 、免疫系が過剰活性である疾を症状、例えば自己免疫疾患及び器官移植拒絶にお い゛乙ｒ−ＩＦＮの拮抗剤がγ−ＩＦＮの刺激作用を中和することによりこの疾 患を処置するために用いられうる。

１つの種類のＴ−ＩＦＮの有効な拮抗薬は、それに結合し、そして中和するモノ クローナル抗体である（例えばＶａｎ　ｄｅｒ　Ｍｅｉｃｌｅら、Ｊ。

Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、　６Ｚ、　１０５９　（１９８６）を参照のこと）。移植 の試験管内及び生体内マウスモデルにおいて、抗−７−ＩＦＮ抗体が拒絶を遅ら せる又は防ぐことが示されている（Ｌａｎｄｏｌｆｏら、５ｃｉｅｎｃｅ　３２ ９．１７６（１９８６）及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇらＪ、Ｉｓｕｗｕｎｏｌ、　１ ４４．４６４８　（１９９０））。ｒ　−ＩＦＮに対するモノクローナル抗体に よる、全身系エリテマトーデス（ＳＬＥ）様症状の発症に対するマウスブローン の処置は、この疾患の発症を有意に遅らせた（Ｊａｃｏｂら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅ ｄ、　１６６、７９８　（１９８７））　。

一定の条件のもとで、抗−ｒ−ＩＦＮ抗体はラットにおけるアジュバント関節炎 を緩和しくＪａｃｏｂら、Ｊ、Ｉｗｓｕｎｏｌ、　１４２．１５００　（１９８ ９））、この抗−ｒ−ＩＦＮがヒト患者における一定のケースのリウマチ性関節 炎に有効でありうることを示唆している。患者における多発性硬る。従って、抗 −ｒ−ＩＦＮ抗体はこれら及びその他の自己免疫疾患の処置において有効であり うる。

ヒト患者の処置のため、ヒト、−ＩＦＮに結合してそれを中和するネズミモノク ローナルが利用されうる（例えばＹａｍａｍｏｔｏら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｉｗｓｕｎｏｌ、　３２．３３９　（１９８８）を参照のこと）、ＡＦ２と命名 され、ヒトγ−ＩＦＮを中和し、そしてγ−ＩＦＮの細胞レセプターへのその結 合・と阻害する別の不ズミモノクローナル抗体を本明細書に開示している。残念 ながら、非ヒトモノクローナル抗体は、例えばＡＰ２の利用はヒＩ・の処置、特 に繰り返し治療法において一定の欠点を有している。

本発明に従い１．−−ＩＦＮエピトープに特異的に反応性なヒト化免疫グロブリ ンを提供する。少なくとも約１０’Ｍ−’、そして好ましくは１０”Ｍ−１〜ｔ 　Ｑ　Ｉ　ＯＭ　−１又はそれより強力な、γ−ＩＰ１１に対する結合親和力を 有するこれらの免疫グロブリンは例えばヒＩ”ｒ−ｒｐＮを中和することができ る。、該ヒト化免疫グロブリンはヒトフレームワークを有しており、そして典型 的にはマウス免疫グロブリン、詳しくはγ−ＩＦＮに反応性な免疫グロブリンに 由来する１又は複数の相補性決定領域（ＣＩ）Ｒ）を有するであろう。好ましい ａ様において、１又は複数のＣＤＩ？はＡＦ２抗体に由来するであろう。大量に 経済的に製造され・）る本発明の免疫グロブリンは例えば種々の技術によるヒト 患者における自己免疫障害の処置において有用である。

ある観点において、本発明はＴ−ＩＦＩｌの所望のエピトープに結合することの できる免疫グロブリン、例えばモノクローナル抗体ＡＦ２に由来する重鎖及び／ 又は軽鎖のＣＤＲをコードする組換えＤＮＡセグメントに関連する。このような 領域をコードするＤＮＡセグメントは一般に適当なヒトフレームワーク領域をコ ードするＤＮＡセグメントに連結されているであろう。モアツクローナル抗体Ａ Ｆ２の重及び軽鎖のＣＤＲを含んで成るポリペプチド鎖を発現に基づいてコード する典型的なりＮＡ配列を図３０に含ませている。コドン縮重及び重要でないア ミノ酸置換に基づき、以下に述べる通り、その他のＤＮＡ配列がこれらの配列に 容易にとって代わることができる。

他方、断片が１又は複数の免疫グロブリン活性（例えば補体固定活性）を有する 、−次抗体構造の一部のみを含んで成るポリペプチド断片を製造することができ る。これらのポリペプチド断片は１．当業界によく知られている方法による完全 抗体のタンパク質分解によって、又は部位特異的突然変異誘発を利用し、ヘクタ ーｐｖに及びｐＶｇｌ　ｄｈｆｒ　（図３１）における所望の位置に停止コドン を挿入する（例えばＣＨＩの後ろに挿入してＦａｂ断片を作る、又はヒンジ領域 の後ろに挿入して（Ｆａｂ’　Ｌ断片を作る）ことによって製造されうる。

−末鎖抗体はＶＬとＶＨをＤＮＡリンカ−で連結することによって製造されうる （Ｈｕｓｔｏｎら、前掲、及びＢｉｒｄら前掲を参照のこと）６本発明の抗体は 典型的には自己免疫症状の処置において各別に用途が見い出せるであろう０例え ば、処置に適する典型的な疾患症状は移植対宿主灰色及び器官、例えば心臓、肺 、腎臓、肝臓、他の移植を受けた、患者における移植拒絶が含まれる。その他の 疾患には自己免疫疾患、例えば■型糖尿病、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、 全身系エリテマトーデス及び重症筋無力症が含まれる。

本発明のヒト化免疫グロブリンはその他の抗体、特にその他のリンホカイン又は リンホカインレセプターに反応性なヒト化抗体と聞合せて利用することもできう る０例えは、ヒト化免疫グロブリンの混合物が反応しうる適当な抗原にはインタ ーロイキン１〜１０、並びにＩＬ−２レセプターのｐ５５及びＰ７５鎖が含まれ る（Ｗａｌｄｍａｎｎ、　Ａｎｎｕ。

Ｒｅｖ、Ｂｉ’ｏｃｈｅｍ、　５８．８７５　（１９８９）及、びＱｕｅｅｎら Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ　Ｉ　、　Ａｃａｄ　、　Ｓｃ　ｉ　B ＵＳＡ斯、　１００２９　（１９８９）を参照のこと）、その他の抗原には、疾 、曇のもととなる細胞上のそれ、例えば、いわゆる「認識分類」じＣ１ｕｓｔｅ ｒｓｏｆ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｒｉ’）抗原が含まれる（Ｌｅｕｃｏ ｃｙｔｅ　Ｔｙｐｉｎｇ　’；Ｌ　Ａ、Ｊ。

ＭｃＭｉｃｈａｅ１５．０ｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ　（ １９８７））　＊これらの抗体は化学治療剤と一緒に付与される独立投与型組成 物としても利用されうる。典型的には、この試薬には非ステロイド系抗炎症剤（ 例えばアスピリン、イブプロフェン）、ステロイド（例えばプレドニソン）及び 免疫抑制剤（例えばシクロスポリンＡ１シトキサン）が含まれうるが、しかしな がら当業者によく知られる真人な数の更なる試薬の利用も含んで成る０本発明の 好ましい薬品製剤はγ−ＪＰＮ分泌細胞を殺す免疫毒性の対象の免疫グロブリン の利用を含んで成る。

本発明のヒト化抗体は試験管内における広範囲にわたる様々な用途に有用性が見 い出せる０例えば、これらの抗体は７−ＩＦＮ抗原の検査等に利用できる。

実験 重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡのクローニング 重鎖及び軽鎖可変ドメイン遺伝子に関するｃＤＮＡをアンカー化ポリメラーゼ連 鎖反応により（Ｅ、Ｙ、Ｌｏｈら、５ｃｔｅｎｃｅ　２４３．２１？　（１９８ ９））、定常領域にハイブリダイズされ、且つ、Ｈｉｎｄｌ［［部位を含む３′ プライマーと、ｄＧテールにハイブリダイズされ、且つ、ＥｃｏＲＩ部位を含む ５′プライマーを用いてクローンする（図６において手法を示す）。

このＰＣＲ増幅化断片をシーケンシングのためにＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄｌｌｌに より消化し、次いでｐＵｃ１８ベクターの中にクローンした。ＡＰ２に関しては 、２つのガンマ−２３特異性及び２つのカッパー特異性クローンをシーケンス化 した。この２つのガンマ−２８クローン及ヒ２つのカンバークローンはそれぞれ 配列において同一である。ｃＤＮＡ可変ドメイン配列及びその推定アミノ酸配列 を図３０に示す。

キメラ抗体の作製及び発現 キメラ抗体遺伝子の作製及び発現のために２種類のプラスミドベクターを調製し た。プラスミドｐＶｇｌ−ｄｈｆｒ　（図３１Ａ）はヒトサイトメガロウィルス ＩＥＩプロモーター及びエンハンサ−（Ｍ、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅ１ｌ　４１ ．５２１　（１９８５））　、前方のイントロンの一部を含むヒトゲノムＣｒ１ セグメント、並びに選別のためのジヒドロフすレートリダクターゼ（ｄｈｆｒ） 遺伝子（Ｓｉｍｏｎｓｅｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ８０、２４９５　（１９８３））を含む、プラスミドｐＶＫ　（図３１Ｂ）はｐ Ｖｇｌ−ｄｈｆｒと類似するが、しかしながらヒトゲノムＣにセグメント及びｇ ｐｔ遺伝子を含む。ＡＦ２の重及び軽鎖可変領域の誘導体をポリメラーゼ連鎖反 応によりｃＤＮＡから調製した。５′プライマーはＡＴＧコドンにおいて出発す るＶｌ域にハイブリダイズしており、そしてＸｂａ　１部位を含み２３′プライ マーはＪ　９Ｍ域の最後の１５個のヌクレオチドとハイブリダイズしており、そ してスプライスドナーシグナル及びＸｂａ■部位を含む（Ｃ，Ｑｕｅｅｎら、Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６．１００２９（１９８９） を参照のこと）、改質Ｖ６！域を関連のプラミドベクターのＣＭＶプロモーター と定常領域の部分イントロンとの間のＸｂａ　１部位の中にクローンした。

キメラ抗体の発現のため、重鎮及びカッパー鎖プラスミドをエレクトロポレーシ ヨンによって５ｐ２１０マウスミエローマ細胞にトランスフェクトし、そしてｇ ｐｔ発現について細胞を選別した。最大量の完全抗体を分泌するクローンをＥＬ ＩＳＡにより検定した。キメラＡＦ２抗体は、ＥＬＩＳＡにより、γ−ＩＦＮに 結合することが示された。

ヒト化抗体のコンピューターモデル化 ヒト化抗体において高結合親和力を維持せしめるため、Ｑｕｅｅｎらの一般手順 に従った（Ｃ，Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ 　８６．１００２９（１９８９））、ヒト抗体が元のネズミ抗体とより相同性で あるに従い、不ズミＣＤＲをヒトフレームワークに組合せることによる、親和力 を低めうる、ＣＤＲへの歪みの導入の傾向が下がるであろう。通常、同一のヒト 抗体に由来する重鎮及び軽鎖をフレームワーク配列を提供するために選び、これ によりこの２本の鎖を集成するうえでの非適合性の可能性は低まる。ＮＢＲＦタ ンパク質配列データーヘースに対する配列相同性（Ｍｉｃｒｏ　Ｇｅｎ１ｅ　５ ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　（Ｂｅｃｋ＋ｗａｎ） により実施）に基づき、抗体Ｅｕを、ＡＦ２のヒト化のためのフレームワーク配 列を担うために選んだ。

ＡＰ２可変領域のモデルを作製するためにコンピュータープログラムＥＮＣＡＤ 　（Ｍ、Ｌｅｖｉｔｔ、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１６８．５９５　（１９８ ３））を用いた。

このモデルは、ＣＤＲに十分に密接していてそれらと有効に相互作用するＡＦ２ フレームワークにおけるアミノ酸を決定するために用いた（以下のカテゴリー４ ）。ヒト比重及び重鎖ＡＦ２可変領域を設計するには、次の４つのカテゴリーの うちの１つ又は複数に属しない限り、各位置においてＥｕ抗体と同一のアミノ酸 を選択した：（１）その位置がＣｒＪＨに属した、 （２）その位置では、Ｅｕアミノ酸がヒト抗体にまれであり、一方、その位置で は、ＡＰ２アミノ酸がヒト抗体に典型的であった。

（３）その位置がＣＤＲのすぐ近くであった。

（４）上記したモデルが、そのアミノ酸が抗原結合性領域（ＣＤＩ＋）に物理的 に近いことを示唆した。

カテゴリー（２）において、「まれ」とは、Ｅｕの軽及び重鎖と同一のサブグル ープにおいてヒト配列の約２０％以下で見い出せるアミノ酸を含むものと解釈さ れ（Ｋａｂａｔら、前掲に定義）、そして「典型的」とは、そのサブグループに おいてヒト配列の約２５％以上、しかしながら一般には５０％以上で見い出せる アミノ酸を含むものと解釈される。これらのカテゴリーにおける位置に関して、 マウスＡＦ２抗体に由来するアミノ酸を用いた。更に、もし位置が下記のとおり であるなら、その位置は第５カテゴリーに属する。即ち、その位置ではＥｕアミ ノ酸がヒト抗体に非常にまれであり、そしてＡＦ２アミノ酸が異なり、しかもま れであるとき。この場合、この位置ではヒト抗体に典型的であるアミノ酸を用い てよい。

各カテゴリーにおけるアミノ酸を表１０に示している。いくつかのアミノ酸は複 数のカテゴリーに属しうる。ヒト化ＡＰ２の軽及び重鎖可変ドメインの最終配列 を図３２に示し、Ｅｕ配列と比較する。

１　２４−３４．５０−５６．８９−９７　３１−３５．５０−６６、９９−１ ０６２　４８　９３．９５，９８，１０７，１０８゜１０９、１１１ ３　３０、９８．１０７ ４　４８．７０　２７，２８，３０，９８．１０７ヒト化抗体のための遺伝子の 作製のため、一般にマウス配列において見い出せるコドンを利用して、典型的な 免疫グロブリンシグナル配列と共に重及び軽鎖のタンパク質配列をコードするヌ クレオチド配列を選別した。複数の縮重コドンを変えて、制限部位を作る又は所 望されないものを除去した。このヌクレオチド配列はキメラ遺伝子において利用 されているものと同じスプライスドナーソゲナル及び各端でのＸｂａ　１部位も 含んでいた。各遺伝子を４つの重複合成オリゴヌクレオチドから作製した。各可 変ドメイン遺伝子のため、交互鏡上の２対の重複オリゴヌクレオチドを合成し、 これは全コード配列並びにシグナルペプチド及びスプライスドナーシグナル（図 ３３）を含んでいた。このオリゴヌクレオチドはアブライドバイオンステム３８ ０Ｂ　ｒｌＮＡ合成装置で合成した。各オリゴは約１１０−１４０の塩基の畏さ であり、その約１５塩基は重複していた。多対のオリゴヌクレオチドから二本ｉ ｌｌ　ＤＮＡ断片をクレノウボリメラーゼにより合成し、制限酵素で消化し、ｐ Ｈｃ１８ベクターにリゲヒトし、次いでシーケンス化した。対応の適切な半配列 を有するこの２種の断片を次にｐＶｇ１−ｄｈｆｒ又はｐＶに発現ベクターのＸ ｂａ　１部位に完全な重及び軽鎖遺伝子を生産するのに適切な方向でリゲヒトし た。反応は当業界によく知られる条件のもとで行った（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前 掲）。

重鎮及び軽鎖プラスミドをエレクトロボレーシランによって５ｐ２１０マウスミ エローマ細胞にトランスフェクトし、そしてｇｐｔ発現のために細胞を選別した 。　Ｅｌ、ＩＳＡによって培養上清液中のヒト抗体生産をアッセイすることによ りクローンをスクリーンし、そして最良生産クローンから抗体を精製した。抗体 は組織培養上清液をスタフィロコッカスプロティンＡ−セファローズＣＬ−４Ｂ 　（ファルマシア）の力うムに通すことによって精製した。結合抗体を０．２Ｍ のグリシン−〇ＣＩ　、　ｐＨ３，０により溶離させ、次いでＩＭのトリス、ｐ ［ｌ　８．０で中和した。この緩衝液をＰＤＩＯカラム（ファルマシア）に通し てＰＢＳに交換した。

ヒト化抗体の性質 ヒト化ＡＦ２抗体をネズミ及びキメラ抗体と比較して特性化した。

このヒト化抗体はＥＬＩＳＡアッセイにおいて、マウス及びキメラ抗体と類似の 状態でｒ−ＩＦＮに結合し、これがγ−ＩＦＮを認識することが示唆された。

マウスＡＰ２抗体とヒト化ＡＰ２抗体の結合親和力を比較するため、競合Ｅｌ、 ＩＳＡアッセイを行った。ＥＬＩＳＡプレートに、各ウェルの中にＰＢＳ中のｒ −ＩＦＮの５００ｎｇ／＋ｓｌのｆｉｔ液１００μ＋を加え、そして４°Ｃで一 夜インキュベートすることによってヒト組換えγ−ＩＦＮでコートした。その後 の工程は室温で行った。γ−ＩＦＮ　溶液を除去し、そして各ウェルに２００μ ｌのＥＬＩＳＡ緩衝液２００μｌ　（ＰＢＳ中の０．１％のツイーン２０．１％ の生血清アルブミン）を加え、そしてｌｈｒインキュベートヒト。溶液を除去し た後、ＰＢＳ中の様々な量の競合抗体（マウスＡＦ２又はヒト化ＡＦ２）　１０ ０μｌを各ウェルに、優れたＦＬＩＳＡ応答を示すように予め決定しておいた一 定量のビオチニル化ＡＰ２と共に加えた。このプレートを１時間インキユヘヒト し、次いでＥＬＩＳＡ緩衝液で３回洗った。１００μｌのＰＢＳ中の、過剰とな るように予め決定しておいた一定量の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）− コンジュゲート化ストレプトアビジンを各ウェルに加え、そして３０分インキユ ヘーヒトた。このプレートをＥＬＩＳＡｉｌ衝液で３回洗い、そしてＨＲＰのた めの基！溶液１００μＩを各ウェルに加えた。このプレートを１０−３０分イン キュベートし、そして各ウェルの光学密度をＥＬＩＳＡリーダー（ＢｉｏＲａｄ ）により決定した。競合抗体マウスＡＰ２及びヒト化ＡＰ２の上昇する濃度に伴 う光学密度の減少をプロントした。マウス八Ｆ２及びヒト化ＡＦ２は同様に競合 し合い、それらのＴ−ＩＦＮに対する結合親和力がほぼ同じであることが示され た。この手順は当業界によく知られている（例えば、Ｈａｒｌｏ−とＬａ　ｎ　 ｅ　％前掲）。

γ−ＩＦＮの重要な生物活性は細胞上のクラスＩＩ　ＨＬＡ抗原の発現の誘発に ある。この活性中和するマウス及びヒト化ＡＦ２の能力を決定するため、１．０ ｍｌの［１ＭＨＭ培地＋１０％のＦｅ２中の約５Ｘ１０’のｌｌ５２９４Ｔ細胞 （Ｂａｓｈａ−ら、Ｊ、Ｉｍｓ＋ｕｎｏ１．１３０．１４９２　（１９８３）） を２４穴プレートの各ウェルの中に分注した。−夜のインキエベーシジン後、０ ．１ｎＨのインターフェロン及び様々な量のマウス又はヒト化ＡＦ２をこの細胞 に加え、そしてこのプレートを７２時間インキュベートした。この細胞を０．０ ５ＭのＥＤＴＡでこのプレートから取り出し、ＩＩＬＡ−Ｄ抗原に対するアメリ カン　タイプ　カルチャー　コレクション（ＡＴＣＣ）由来のモノクローナル抗 体Ｌ２４３で染め、洗い、ＦＩＴＣコンジュゲート化ヒト抗マウスＩｇで染め、 そしてＦＡＣ５ｃａｎ　（Ｒｅｃｔｏｒ−ロ１ｃｋｉｓｏｎ）で分析した。

丑昇する濃度のマウスＡＦ２は細胞の蛍光を低め（図３４）、この抗体がγ−Ｉ ＦＮによるＨＬＡ−Ｄの誘発を妨げることが示唆された。このヒト化ＡＰ２はこ のアッセイにおいてマウスＡＦ２と同じように（肋き、これが７’−ＩＦＮの生 物活性を中和することが示された。

以上より、本発明のヒト化免疫グロブリンは他のγ−ＩＦＮ特異的抗体に勝る倍 大なる利点を授けることが期待されるであろう。マウスモノクローナル抗体と比 べ、本ヒト化免疫グロブリンはより経済的に製造でき、そして外来のアミノ酸配 列を実質的に少なく含む。

ヒト患者に注射された後のこの抗原性の低められた傾向は有意義な治療的改善を 示す。

本明細書に挙げた全ての文献及び特許明細書は本明細書の中に参考として組入れ られる０本発明を例示及び理解を促すための実施例によっである程度詳しく説明 してきたが、一定の変更及び改良は添付の請求の範囲に属するであろう。

６１　Ｇ　Ｘ　Ｐ　Ａ　ＲＦ　Ｓ　Ｇ　Ｓ　Ｇ　Ｓ　Ｇ　Ｔ　Ｅ　Ｆ　Ｔ　Ｌ　 Ｔ　Ｉ　５８１ＰＶＥＥＥＤＴＶＴＹＹＣＱＨ３ＷＥＸＰＹ８１　ＲＬ　Ｅ　Ｓ 　Ｅ　Ｄ　Ｆ　Ａ　Ｖ　Ｙ　Ｙ　ＣＨＳ　Ｗ　Ｅ　工　Ｐ　Ｙｌｏｌ　Ｔ　Ｆ　 Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ｋ　Ｌ　Ｅ　工　Ｋ１０１　Ｔ　Ｆ　Ｇ　Ｑ　Ｇ　Ｔ　ＲＶ　 Ｅ　Ｉ　ＫＦＩＧ、　７Ａ Ｉ　ＥＭ　工　ＬＶＥ　Ｓ　ＧＧＧＬＶＫＰＧＡＳＬＫＬＩ　ＥＶＱＬＬＥＳＧ ＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ４１　Ｓ　Ｄ　ＲＲＬ　Ｅ　Ｗ　Ｖ　Ａ　Ｓ　工　Ｓ 　ＲＧ　Ｇ　Ｇ　ＲＸ　Ｙ　Ｓ４１　Ｐ　Ｇ　Ｋ　Ｇ　Ｌ　Ｅ　Ｗ　Ｖ　Ａ　Ｔ 二り一二６１　Ｐ　Ｄ　Ｎ　Ｌ　Ｋ　Ｇ　ＲＦ　Ｔ　工　Ｓ　ＲＥ　Ｄ　Ａ　Ｋ 　Ｎ　Ｔ　Ｌ　Ｙ６１　Ｄ　Ｎ　Ｋ　ＲＦ　Ｔ　Ｉ　Ｓ　ＲＮ　Ｄ　Ｓ　Ｋ　Ｎ 　Ｔ　Ｌ　Ｙｌｏｌ　Ｘ　Ｙ　Ｙ　Ａ　Ｄ　Ｙ　Ｇ　Ｆ　Ｆ　Ｄ　Ｖ　Ｗ　Ｇ　 Ｔ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　Ｖ　工　ＶＦＩＧ、　ＩＢ １０１　Ｇ　Ｔ　Ｋ　Ｖ　Ｅ　Ｖ　Ｋ ＦＩＧ、　２Ａ ６１　ＧＶＥ’５ＲＦｌｌＬＧＳＧＳＧＴ、ＬＦＴＬＮ　工　５１０１　Ｔ　Ｆ 　Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ｋ　Ｌ　Ｅ　Ｉ　Ｋ１０１　ＴＦＧＱＧＴＫＶＥ４Ｋ ＦＩＧ、　３Ａ ４１　ＨＧ　Ｋ　Ｓ　Ｌ　Ｅ　Ｗ　Ｉ　Ｇ　Ｙ　工　Ｙ　Ｐ　Ｙ　Ｎ　Ｇ　Ｇ　 Ｔ　Ｇ　ＹＢ２　Ｍ　Ｄ　Ｖ　ＲＳ　Ｌ　Ｔ　Ｓ　Ｅ　Ｄ　Ｓ　Ａ　Ｖ　Ｙ　Ｙ 　ＣＡ　ＲＧ　Ｒ８１Ｍ　Ｅ　Ｌ　Ｓ　Ｓ　Ｌ　ＲＳ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　ＡコニＹ二 ＣＡ＝Ｒニー且１０１　Ｔ　Ｋ　Ｌ　Ｅ　Ｌ　Ｋ １０１　Ｔ　Ｋ　Ｖ　Ｅ　Ｖ　Ｋ ＦＩＧ、　４Ａ ＦＩＧ、　４Ｂ １０１　Ｇ　Ｔ　Ｋ　Ｖ　Ｅ　Ｉ　Ｋ ＦＩＧ、　５Ａ ＦＩＧ、　５Ｂ ＦＩＧ、　８Ａ ＦＩＧ、　８Ｂ ＦＩＧ、　９ １０１　Ｇ　Ｔ　Ｋ　Ｖ　Ｅ　Ｖ　Ｋ １００　Ｇ　Ｔ　Ｋ　Ｖ　Ｅ　Ｖ　Ｋ ＦＩＧ、　１０Ａ ６０　ＲＦ　Ｔ　Ｉ　Ｓ　Ｒ二、二５ＫＮＴＬＹｃ１３ ＣＧＧＴＣＡＣＣＣＡ　ＣＴＧＡＧＧＣＡＣＴ　ｆｆｉゴＡＧＡＴ　ＧＧＡＧＡ ＣＴＧＧＧ　ＴＣＡＴＴｒＧｃ１４ ＣＴｒＴＡＣＡＡＴＣＴＣＴＴＣＡ ｃ１５ ＧＡＴＴＧＴＡＡＡＧ　ＧＴＧＴＭＴ ｃ１６ ｃｌ１ ＣＴＣＡＧＡＧλＴＣＣＴＣＣＴα℃ ｃ１２ ＴＡＴＴＧ ＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣ ＦＩＧ、　１１Ｂ ＦＩＧ、　７２ ＩＬ−２ａ度（ｐＭ） ＦＩＧ、　７３ ＦＩＧ、　７４Ａ １１３５ＦＩＧ、　１４Ｃ ＦＩＧ、　１４Ｄ ＦＩＧ、　１５Ａ ＦＩＧ、　１５Ｂ ＦＩＧ、　１６Ａ 、１　１　１０　１００　１０００ 抗体濃度（ｎＭ） ＦＩＧ、　７７Ａ 、１　１　１０　１００　１０００ 抗体濃度（ｎＭ） ＦＩＧ、　１７Ｂ ＦＩＧ、　１８Ａ ＦＩＧ、　１８Ｂ ＦＩＧ、　１９Ａ ＦＩＧ、１９Ｂ ＦＩＧ、　２０Ａ ＦＩＧ、　２０Ｂ ＦＩＧ、２１ ５＝　ｃ　ｖ　ｐ　Ｓ　ＲＦ　工　ｃ　ｓ　ｃ　ｓ　ｃ　Ｔ　Ｅ　Ｆ　Ｔ　Ｌ　 Ｔ　工　Ｓ６：ｔ　Ｇ　Ｖ　Ｐ　Ｓ　ＲＦ　Ｓ　Ｇ　Ｓ　Ｇ　Ｓ　Ｇ　Ｔ　Ｄ　 Ｆ　Ｔ　Ｌ　Ｔ　工５ＦＩＧ、　２２Ａ ＦＩＧ、　２２Ｂ ＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧ　ＴＴ ａ２ ＣＣＴＴＣＡＣＴＣＡ　ＧＣＴ ａ３ ａ４ ａ５ ＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡ　ＣＡＧＧＴＣＡＣＡＴ　ＴＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴ ＣテＣＣＣＡαゴＣＴＣＴＧＴＣＣまスＴユＧＴＡＧ ａ６ ＡＡＴＴＧＴＣＣＡＣＡＣＴＴＴＣＧＣＴＧ　ＧＣＴＣＴＧＣＡＴＧ　ＴＧＡＴ ＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴ　ＡＣＴＧＡＴＧＣＧＧＣ ｒｌａ７ ａ８ ０１　．１　１　１０　１００　１０００Ａ１０００ＡＮＴＩＢＯＤＹＣＯＮＣ ＥＮＴＲＡＴＩＯＮ（ｎ、　２４ ＦＩＧ、　２５Ａ ＦＩＧ、　２５Ｂ ＦＩＧ、　２６Ａ ＦＩＧ、　２６Ｂ ＦＩＧ、　２７Ａ ＦＩＧ、　２７Ｂ 〕ｂ１６ ］ｂ１７ フｂｌＢ ＦＩＧ、２ＢＡ ｂ２０ ＴＣＡＧＴＭＧＡＧ　ＴＴＴＣ ＭＣＴＣＴＴＡＣＴ　ＧＡＡＣ フｂ２３ ＦＩＧ、　２８Ｂ ００１　．０１　．１　１　１０ ００ＭＰＥＴＩＴＯＲＡＮＴＩＢＯＤＹＣＯＮＣＥＮＴＲＡＴＩＯＮ（ｎ１０Ｃ ０６０ ＤＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ ＡＴＧＣＡＴＣＡＧＡＣＣＡＧＣＡＴＧＧＧＣＡＴＣＡＡＧＡＴＧＧＡＡＴＣＡ ＣＡＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＴＴＣＡＴＡＴＣＣＡＴＡＭＨＱＴＳＭＧ　工　ＫＭ ＥＳＱＴＬＶＦ　工　Ｓ：ＣＴＧＣＴＣＴＧＧＴＴＡＴＡＴＧＧＴＧＣτＣＡＴ ＧＧＧＡＡＣＡＴＴＧＴＴＡＴＧＡＣＣＣＡＡＴＣＴＣＣＣＡＡＡＴＣＣＡＴＧ ＬＬＷＬＹＧＡＤＧＮＩＶＭＴＱＳＰＫＳＭＴＡＣＧＴＧＴＣＡＡＴＡＧＧＡＧ ＡＧＡＧＧＧＴＣＡＣＣＴＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＡＡＴＧ ＴＧＧＡＴＡＣτＹＶＳＩＧＥＲＶＴＬＳＣＫＡＳＥＮＶＤ　ＴＴＡＴＧＴＡＴ ＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧ　ＡＡＡＣＣＡＧＡＧＣＡＧＴＣＴＣＣＴＡＡＡ ＣＴＧＣＴＧＡＴＡＴＡＴＧＧＧＧＣＡＹＶＳＷＹＱＱＫＰＥＱＳＰＫＬＬＩＹ 　≦辷−ンＴＣＣＡＡＣＣＧＧＴＡＣＡＣＴＧＧＧＧＴＣＣＡＣＧＡＴＣＧＣＴ ＴＣＡＣＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＣＡＡＣＡＧＡＴＴＴＣ５ＮＲＹＴＧＶ ＨＤＲＦＴＧＳＧＳＡＴＤＦＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧ”、ＧＴＧＣ ＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＴＧＣＡＧＡＴＴＡＴＣＡＣＴＧＴＧＧＡＣＡＧＡ ＧＴＴ　Ｌ　Ｔ　工Ｓ　Ｓ　Ｖ　Ｑ　Ａ　Ｅ　Ｄ　Ｌ　Ａ　Ｄ　Ｙ　ＨＣ」Ｌニ ド−１ＴＡＣＡＡＣＴＡＴＣＣＡＴＴＣＡＣＧ−、ＴＣＧＧＣＴＣＧＧＧＧＡＣ ＡＡＡＧＴＴＧＧ入ＡＡＴ入入入ＧＹＮＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥ　工　ＫＦＩ Ｇ、　３０Ｂ ＦＩＧ、３１Ａ ＦＩＧ、３１Ｂ ４１　Ｇ　Ｋ　Ａ　Ｐ　Ｋ　Ｌ　Ｌ　Ｍ　Ｙ　Ｋ　Ａ　Ｓ　Ｓ　Ｌ　Ｅ　Ｓ　Ｇ 　Ｖ　？　Ｓ４１　Ｇ　Ｋ　Ａ　Ｐ　Ｋ　Ｌ　Ｌ二ＹＧＡＳＮＲＹτに　ｙ　ｐ 　５１００　ＱＧＴＫＶＥＶＫ ＦＩＧ、３２Ａ ごｈｌ。

ごｈｌ２ ｈ２２ こｈ＝こτＧこτ０　ＡＧτで ＦＩＧ、　３３Ｂ ＦＩＧ、　３４ 国際調査報告 １１Ｉｌｌｌ１ＭｆＩ＠−＾帥ｈａｍＢａ内Ｎ・ＰＣＴＭｌ＠＊ｌ　Ｍｆｆ　Ｉ Ｉフロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３５／７４　Ｚ 　７４３１−４Ｃ３９／３９５　Ｕ　９２８４−４Ｃ ＡＢＡ　Ｄ　９２８４−４Ｃ ＡＤＹ　Ｙ　９２８４−４Ｃ ３９２８４−４Ｃ ＣＯ７Ｋ　１５／１４　８５１７−４Ｈ／／　Ｃ１２Ｎ　１５／１３ （Ｃ１２Ｐ　２１１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、Ｊ　Ｐ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＳＤ、ＳＥ、５Ｏ （７２）発明者　コー、マン　スン アメリカ合衆国、カリフォルニア　９５０１４゜キュパティーノ、ヨシノ　ブレ イス ＦＩ （７２）発明者　シュナイダー、ウィリアム　ピー。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４０４１゜マウンテン　ビュー、ロレット 　ストリート　４８４ （７２）発明者　ランドルフィ、ニコラス　エフ。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９５０３５゜ミルピタス、シーサイド　ドラ イブ　２４６（７２）発明者　コーリン、カサリン　エル。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４１１４゜サンフランシスコ、ドーラーズ 　アベニュ

Claims (60)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトＩＬ−２レセプターのｐ７５鎖に特異的に反応性な実質的に純粋な免疫 グロブリンを含んで成る組成物。
2. ２．前記免疫グロブリンが約１０７Ｍ−１又はそれより強力なヒトＩＬ−２レセ プターに対する結合親和力を示す、請求項１に記載の組成物。
3. ３．前記免疫グロブリンが、ヒトｐ７５タンパク質に反応性な免疫グロブリンに 由来するＣＤＲに実質的に相同な１又は複数の外来性ＣＤＲを含んで成る、請求 項１に記載の組成物。
4. ４．前記免疫グロブリンがヒトＩＬ−２レセプターのｐ７５鎖へのインターロイ キン−２（ＩＬ−２）の結合を阻止することができる、請求項１に記載の組成物 。
5. ５．前記ヒト化免疫グロブリンが少なくとも２種類の免疫グロブリンに由来する アミノ酸配列を有するヒトフレームワーク領域を含んで成る、請求項１に記載の 組成物。
6. ６．ヒトインターロイキン−２レセプターに結合することのできるヒト化免疫グ ロブリンであって、前記免疫グロブリンがヒトフレームワークにおいてｍｉｋ− β１抗体に由来する１又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んで成る免疫グ ロブリン。
7. ７．前記ヒトフレームワークがＬａｙ免疫グロブリンフレームワークに実質的に 相同である、請求項６に記載のヒト化免疫グロブリン。
8. ８．ヒトＴ細胞上のインターロイキン−２レセプターへのＩＬ−２の結合を阻止 することのできる、請求項６に記載のヒト化免疫グロブリン。
9. ９．ヒト患者におけるＴ−細胞媒介障害を処置する方法であって、前記患者に治 療的に有効な用量の請求項６に記載の免疫グロブリンを投与することを含んで成 る方法。
10. １０．細胞障害剤と組合せた、請求項６に記載のヒト化免疫グロブリン。
11. １１．ヘルペス単純ウイルス特異的エピトープに特異的に反応性な実質的に純粋 なヒト化免疫グロブリンを含んで成る組成物。
12. １２．前記エピトープがウイルスの表層糖タンパク質上にある、請求項１１に記 載の組成物。
13. １３．前記糖タンパク質がｇＢ又はｇＤである、請求項１２に記載の組成物。
14. １４．ヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）タンパク質の、該タンパク質に特異的に 反応性なマウスモノクローナル抗体への結合を阻止することのできる実質的に純 粋なヒト化免疫グロブリンを含んで成る組成物であって、ここでこのヒト化免疫 グロブリンがマウスモノクローナル抗体に由来する少なくとも１つの相補性決定 領域（ＣＤＲ）を含んで成る、組成物。
15. １５．前記ヒト化免疫グロブリンが約１０７Ｍ−１又はそれより強力な結合親和 力を示す、請求項１４に記載の組成物。
16. １６．前記免疫グロブリンが１型又は２型のヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）に 結合することができる、請求項１４に記載の組成物。
17. １７．前記免疫グロブリンがｇＢ，ｇＤ，ｇＧ又はｇＨのＨＳＶ糖タンパク質に 反応性な免疫グロブリンに由来するＣＤＲに実質的に相同である１又は複数のＣ ＤＲを含んで成る、請求項１４に記載の組成物。
18. １８．前記免疫グロブリンがＩｇＧ、免疫グロブリンアイソタイプである、請求 項１４に記載の組成物。
19. １９．ヘルペス単純ウイルスに結合することができ、ヒトフレームワークにおい てマウスモノクローナル抗体に由来する１又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ） を含んで成り、ここでこのマウス抗体がＦｄ７９又はＦｄ１３８−８０である、 ヒト化免疫グロブリン。
20. ２０．前記ヒトフレームワークがＥｕ又はＰｏｍ免疫グロブリンフレームワーク に実質的に相同である、請求項１９に記載のヒト化免疫グロブリン。
21. ２１．ＨＳＶを中和することのできる請求項１９に記載のヒト化免疫グロブリン 。
22. ２２．ヒト患者におけるヘルペス単純ウイルス媒介障害を処置する方法であって 、前記患者に治療的に有効な用量の請求項１４に記載の免疫グロブリンを投与す ることを含んで成る方法。
23. ２３．ＣＤ３３抗原エピトープに特異的に反応性な実質的に純粋なヒト化免疫グ ロブリンを含んで成る組成物。
24. ２４．前記免疫グロブリンの少なくとも−本の鎖の可変領域がヒトフレームワー クにおいて、非ヒト抗体に由来する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んで成 る、請求項２３に記載の組成物。
25. ２５．前記鎖が重鎖である、請求項２４に記載の組成物。
26. ２６．前記非ヒト抗体がＭ１９５である、請求項２４に記載の組成物。
27. ２７．ＣＤ３３抗原の、該抗原に特異的に反応性なマウスモノクローナル抗体へ の結合を阻害することのできる実質的に純粋な免疫グロブリンを含んで成り、こ こでこのヒト化免疫グロブリンがマウスモノクローナル抗体に由来する少なくと も１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んで成る、組成物。
28. ２８．前記ヒト化免疫グロブリンが約１０７Ｍ−１又はそれより強力な結合親和 力を示す、請求項２７に記載の組成物。
29. ２９．マウスＭ１９５抗体のヒト細胞への結合を阻止することのできる、請求項 ２７に記載の組成物。
30. ３０．前記ヒト化免疫グロブリンがＥｕ免疫グロブリンフレームワークに実質的 に相同であるヒトフレームワークを含んで成る、請求項２７に記載の組成物。
31. ３１．ヒト標的細胞及びエフェクター細胞の存在下において抗体依存性細胞障害 を媒介することのできる、請求項２７に記載のヒト化免疫グロブリン。
32. ３２．ヒト患者における骨髄細胞媒介障害を処置する方法であって、前記患者に 治療的に有効な用量の請求項２７に記載の組成物を投与することを含んで成る方 法。
33. ３３．前記免疫グロブリンが細胞障害剤にコンジュゲートされている、請求項２ ７に記載の組成物。
34. ３４．ヒトサイトメガロウイルスー特異的エピトープに特異的に反応性な実質的 に純粋なヒト化免疫グロブリンを含んで成る組成物。
35. ３５．少なくとも−鎖の可変領域が、ヒトフレームワークにおいて、非ヒト免疫 グロブリン鎖に由来する３つの相補性決定領域を含んで成る、請求項３４に記載 の組成物。
36. ３６．前記エピトープがウイルス表層糖タンパク質上にある、請求項３４に記載 の組成物。
37. ３７．前記糖タンパク質がｇＢ又はｇＨである、請求項３６に記載の組成物。
38. ３８．サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）タンパク質の、該タンパク質に特異的に 反応性なマウスモノクローナル抗体への結合を阻害することのできる実質的に純 粋なヒト化免疫グロブリンを含んで成り、ここでこのヒト化免疫グロブリンがマ ウスモノクローナル抗体に由来する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ） を含んで成る、組成物。
39. ３９．前記ヒト化免疫グロブリンが約１０７Ｍ−１又はそれより強力な結合親和 力を示す、請求項３８に記載の組成物。
40. ４０．ヒトフレームワーク、及びこのフレームワークに天然には連結していない １又は複数の外来性相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んで成る組換え免疫グロブリ ン組成物であって、ここで該免疫グロブリンがＣＭＶに結合することのできる、 組換え免疫グロブリン組成物。
41. ４１．前記外来性ＣＯＲの全てが免疫グロブリンの重鎖の上に位置している、請 求項４０に記載の組成物。
42. ４２．前記免疫グロブリンがＩｇＧ１免疫グロブリンアイソタイプである、請求 項４０に記載の組成物。
43. ４３．前記免疫グロブリンがＣＭＶのヒト細胞への結合を阻止することのできる 、請求項４０に記載の組成物。
44. ４４．前記フレームワーク領域が少なくとも２種類のヒト免疫グロブリンに由来 するアミノ酸配列を含んで成る、請求項４０に記載の免疫グロブリン。
45. ４５．サイトメガロウイルスに結合することができ、ヒトフレームワークにおい てマウスモノクローナル抗体に由来する１又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ） を含んで成り、ここでこのマウス抗体がＣＭＶ５，ＣＭＶ１０９又はＣＭＶ１１ ５である、ヒト化免疫グロブリン。
46. ４６．前記ヒトフレームワークがＥｕ又はＷｏ１免疫グロブリンフレームワーク に実質的に相同である、請求項４５に記載のヒト化免疫グロブリン。
47. ４７．ＣＭＶを中和することのできる、請求項４５に記載のヒト化免疫グロブリ ン。
48. ４８．ヒト患者におけるサイトメガロウイルス媒介障害を処置する方法であって 、前記患者に治療的に有効な用量の請求項４５に記載の免疫グロブリンを投与す ることを含んで成る方法。
49. ４９．ヒト患者におけるサイトメガロウイルス媒介障害を処置する方法であって 、前記患者に治療的に有効な量の２種以上の請求項４５に記載の免疫グロブリン の組合せを投与することを含んで成る方法。
50. ５０．ヒトΥ−ＩＦＮに特異的に反応性な実質的に純粋なヒト化免疫グロブリン を含んで成る組成物。
51. ５１．少なくとも−鎖の可変領域が、ヒトフレームワークにおいて、非ヒト抗体 に由来する３つの相補性決定領域を含んで成る、請求項５０に記載の組成物。
52. ５２．前記非ヒト抗体がＡＦ２である、請求項５１に記載の組成物。
53. ５３．ヒトΥ−ＩＦＮのヒトΥ−ＩＦＮレセプターへの結合を阻害することので きる、請求項５０に記載の組成物。
54. ５４．ヒトフレームワーク、及びこのフレームワークに天然には連結していない １又は複数の外来性相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んで成る組換え免疫グロブリ ン組成物であって、ここで該免疫グロブリンがヒトΥ−ＩＦＨのヒトΥ−ＩＦＮ レセプターへの結合を特異的に阻害することのできる、組換え免疫グロブリン組 成物。
55. ５５．１又は複数の前記外来性ＣＤＲがＡＦ２抗体に由来するＣＤＲに実質的に 相同である、請求項５４に記載の組成物。
56. ５６．前記免疫グロブリンがＩｇＧ１免疫グロブリンアイソタイプである、請求 項５４に記載の組成物。
57. ５７．前記免疫グロブリンが、ヒトΥ−ＩＦＮ抗体のヒト細胞への結合を阻止す ることのできる、請求項５４に記載の組成物。
58. ５８．ヒト患者における自己免疫障害を処置する方法であって、前記患者に治療 的に有効な用量の請求項５４に記載の組成物を投与することを含んで成る方法。
59. ５９．前記免疫グロブリンが細胞障害剤にコンジュゲートされている、請求項１ １に記載の組成物。
60. ６０．前記免疫グロブリンが細胞障害剤にコンジュゲートされている、請求項４ ０に記載の組成物。