TW202108177A - 抗體藥物結合物 - Google Patents

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李弘明
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Abstract

本揭示案提供包含STING調節劑之抗體藥物結合物。亦提供包含該等抗體藥物結合物之組合物。該等化合物及組合物可用於刺激有需要之個體之免疫反應。

Description

抗體藥物結合物
本揭示案提供包含STING調節劑之抗體藥物結合物。亦提供包含抗體藥物結合物之組合物。該等化合物及組合物可用於刺激有需要之個體之免疫反應。
抗體藥物結合物(ADC)係一類快速發展之靶向治療劑，代表了有望提高藥物之選擇性及細胞毒性活性之新方法。該等治療劑包含抗體(或抗體片段)，該抗體可連接至酬載藥物以形成免疫結合物。抗體使ADC定向以與靶向細胞結合。然後ADC可內化並釋放其酬載，從而為細胞提供治療。當ADC定向至其靶向細胞時，結合藥物之副作用可能低於全身性投與同一劑時遇到之副作用。
已顯示銜接蛋白STING (干擾素基因之刺激劑)在先天免疫系統中發揮作用。STING路徑之活化觸發免疫反應，使得產生特異性殺傷T細胞，該等特異性殺傷T細胞使腫瘤縮小並可提供長效免疫，從而使腫瘤不再復發。活化之STING路徑亦藉由產生抗病毒及促發炎細胞介素來促進抗病毒反應，該等抗病毒及促發炎細胞介素對抗病毒並動員先天及適應性免疫系統，最終產生針對致病病毒之長效免疫。增強先天及適應性免疫反應之潛在治療益處使STING成為藥物發現之有吸引力之靶。環狀二核苷酸可能起STING促效劑之作用且正在臨床試驗中進行測試。然而，其陰離子性質使其膜滲透性變差，此可能限制其在細胞內接合STING之能力，經常導致該等化合物在血流中不希望之分佈。
仍然需要新的STING促效劑以及改進的將其遞送至靶向細胞之方法。
在第一態樣中，本揭示案提供式(I)化合物：
Figure 02_image001
(I)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： a係1至20之整數； b係1至20之整數； m係0、1、2、3或4； n係0或1； D-NH-係胺基取代之化合物之一部分，其中胺基取代之化合物具有式D-NH2 ； 每一R1 係獨立地選自C1 -C4 烷基、O-C1 -C4 烷基及鹵素； R2 係選自C1 -C4 烷基及-(CH2 CH2 O)s -CH3 ；其中s係1至10之整數； R3 及R3’ 係各自獨立地選自氫及C1 -C3 烷基； L係可裂解連接體；且 Ab係抗體、抗體片段或抗原結合片段。
在第一態樣之第一實施例中，a係1至4之整數；b係1至10之整數；且m係0。
在第一態樣之第二實施例中，a係1至4之整數；m係0；n係0；且R3 及R3’ 各自係氫。
在第一態樣之第三實施例中，L係
Figure 02_image003
； 其中：
Figure 02_image005
係與氮原子之連接點；
Figure 02_image007
係與Ab之連接點； t係1及10之整數； W係不存在或自消性基團； Z係不存在或2至5個胺基酸之肽； U及U’獨立地係不存在或間隔體；且 Q係異雙官能團； 條件係W及Z並非同時不存在。
在第一態樣之第四實施例中，W係選自以下之自消性基團：
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
、
Figure 02_image015
、
Figure 02_image017
、
Figure 02_image019
、
Figure 02_image021
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
及
Figure 02_image027
； 其中：
Figure 02_image005
係與羰基之連接點；且
Figure 02_image029
係與Z之連接點。
在第一態樣之第五實施例中，W係選自
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
及
Figure 02_image013
。
在第一態樣之第六實施例中，W係
Figure 02_image009
。
在第一態樣之第七實施例中，Z係能夠經酶促裂解之肽。在第八實施例中，Z係細胞自溶酶可裂解的。在第九實施例中，Z係選自Val-Cit、Cit-Val、Val-Ala、Ala-Val、Phe-Lys及Lys-Phe之二胺基酸肽。在第一態樣之第十實施例中，Z係Val-Ala或Ala-Val。
在第一態樣之第十一實施例中，U及U’獨立地係不存在或係選自
Figure 02_image035
、
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
Figure 02_image043
、
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
、
Figure 02_image051
及
Figure 02_image053
； 其中：
Figure 02_image005
係與Z之連接點；
Figure 02_image007
係與Q之連接點； p係1至6之整數； q係1至20之整數； X係O或-CH2 -；且 每一r獨立地係0或1。 在第一態樣之第十二實施例中，U’係不存在且U係
Figure 02_image045
。
在第一態樣之第十三實施例中，Q係能夠經由化學或酶介導之結合連接至Ab之異雙官能團。在第十四實施例中，Q係選自
Figure 02_image056
、
Figure 02_image058
、
Figure 02_image060
、
Figure 02_image062
、
Figure 02_image064
、
Figure 02_image066
、
Figure 02_image068
、
Figure 02_image070
、
Figure 02_image072
、
Figure 02_image074
Figure 02_image076
及
Figure 02_image078
； 其中
Figure 02_image005
係與U之連接點，或當U不存在時係與Z之連接點；且
Figure 02_image007
係與U’之連接點，或當U’不存在時係與Ab之連接點。
在第一態樣之第十五實施例中，本揭示案提供式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L係：
Figure 02_image003
且其中t係1；W係不存在或自消性基團；且Z係不存在或二胺基酸肽。
在第一態樣之第十六實施例中，本揭示案提供式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R2 係-CH3 或-(CH2 CH2 O)s -CH3 且s係1至10之整數。
在第一態樣之第十七實施例中，本揭示案提供式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中D-NH2 係調節STING活性之胺基取代之化合物。在第一態樣之第十八實施例中，調節STING活性之胺基取代之化合物包含鳥嘌呤或腺嘌呤衍生物。
在第十九實施例中，調節STING活性之胺基取代之化合物係式(II)化合物：
Figure 02_image080
(II)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： X10 係SH或OH； X20 係SH或OH； Ya 係O、S或CH2 ； Yb 係O、S、NH或NRa ，其中Ra 係C1 -C4 烷基； R10 係氫、氟、OH、NH2 、ORb 或NHRb ； R20 係氫或氟； R30 係氫；R40 係氫、氟、OH、NH2 、ORb 或NHRb ；或R30 及R40 一起形成CH2 O； R50 係氫或氟； Rb 係C1 -C6 烷基、鹵代(C1 -C6 )烷基或C3 -C6 環烷基； 環A10 係視情況經取代之含有1-4個選自N、O或S之雜原子之5員或6員單環雜芳基環，或視情況經取代之含有1-5個選自N、O或S之雜原子之9員或10員雙環雜芳基環；其中環A10 在環中包含至少一個N原子，且其中Yb 連接至環A10 之碳原子；且 環B10 係視情況經取代之含有2至5個選自N、O或S之雜原子之9員或10員雙環雜芳基環；其中環B10 在環中包含至少兩個N原子； 條件係環A10 或環B10 經由-NH-基團連接至式(I)之羰基。
在第二十實施例中，調節STING活性之胺基取代之化合物係
Figure 02_image082
； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中
Figure 02_image005
係與式(I)之羰基之連接點。
在第一態樣之第二十一實施例中，調節STING活性之胺基取代之化合物係式(III)化合物：
Figure 02_image084
(III)； 或其醫藥學上可接受之鹽；其中 X10 係SH或OH； X20 係SH或OH； Yc 係O、S或CH2 ； Yd 係O、S或CH2 ； B100 係由式(B1 -A )或式(B1 -B )表示之基團：
Figure 02_image086
R13 、R14 、R15 、R16 及R17 各自獨立地係氫原子或取代基； R1000 係氫或連接至式(I)之羰基的鍵； Y11 、Y12 、Y13 、Y14 、Y15 及Y16 各自獨立地係N或CR1a ，其中R1a 係氫或取代基； Z11 、Z12 、Z13 、Z14 、Z15 及Z16 各自獨立地係N或C； R105 係氫原子或取代基； B200 係由式(B2 -A )或式(B2 -B )表示之基團：
Figure 02_image087
R23 、R24 、R25 、R26 及R27 各自獨立地係氫原子或取代基； R100’ 係氫或連接至式(I)之羰基的鍵； Y21 、Y22 、Y23 、Y24 、Y25 及Y26 各自獨立地係N或CR2a ，其中R2a 係氫或取代基； Z21 、Z22 、Z23 、Z24 、Z25 及Z26 各自獨立地係N或C；且 R205 係氫原子或取代基；其中R105 及R205 各自獨立地連接至其分別連接之5員環之2位或3位； 條件係： B100 或B200 中之一者經由-NH-基團連接至式(I)之羰基。
在第一態樣之第二十二實施例中，調節STING活性之胺基取代之化合物係式(IIIa)化合物，
Figure 02_image088
(IIIa)； 或其醫藥學上可接受之鹽；其中 B100 係由式(B1 -A )或式(B1 -B )表示之基團：
Figure 02_image090
R13 、R14 、R15 、R16 及R17 各自獨立地係氫原子或取代基； R1000 係氫或連接至式(I)之羰基的鍵； Y11 、Y12 、Y13 、Y14 、Y15 及Y16 各自獨立地係N或CR1a ，其中R1a 係氫或取代基； Z11 、Z12 、Z13 、Z14 、Z15 及Z16 各自獨立地係N或C； R105 係氫原子或取代基； B200 係由式(B2 -A )或式(B2 -B )表示之基團：
Figure 02_image091
R23 、R24 、R25 、R26 及R27 各自獨立地係氫原子或取代基； R100’ 係氫或連接至式(I)之羰基的鍵； Y21 、Y22 、Y23 、Y24 、Y25 及Y26 各自獨立地係N或CR2a ，其中R2a 係氫或取代基； Z21 、Z22 、Z23 、Z24 、Z25 及Z26 各自獨立地係N或C；且 R205 係氫原子或取代基；其中R105 及R205 各自獨立地連接至其分別連接之5員環之2位或3位； 條件係： B100 或B200 中之一者係：
Figure 02_image092
； 其中： R18 係氫或C1-6 烷基；且 R19 係鹵素原子； 且另一者經由-NH-基團連接至式(I)之羰基。
在第一態樣之第二十三實施例中，調節STING活性之胺基取代之化合物係：
Figure 02_image094
； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中
Figure 02_image005
係與式(I)之羰基之連接點。
在第二態樣中，本揭示案提供式(IV)化合物：
Figure 02_image096
(IV)； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： a係1至20之整數； b係1至20之整數； k係0、1、2或3； m係0、1、2、3或4； D-NH-係胺基取代之化合物之一部分，其中胺基取代之化合物具有式D-NH2 ； R2 係選自H、C1 -C4 烷基及-(CH2 CH2 O)s -CH3 ；其中s係1及10之整數； R4 係選自氫及任何天然胺基酸側鏈； R5 係選自C1 -C4 烷基及O-C1 -C4 烷基； L係可裂解連接體；且 Ab係抗體、抗體片段或抗原結合片段。
在第二態樣之第一實施例中，L係
Figure 02_image098
， 其中：
Figure 02_image005
係與羰基之連接點；
Figure 02_image007
係與Ab之連接點； W係自消性基團； Z係不存在或2至5個胺基酸之肽；且 U及U’獨立地係不存在或間隔體；且 Q係異雙官能團。
在第三態樣中，本揭示案提供式(V)化合物：
Figure 02_image100
(V)； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： D-NH-係
Figure 02_image102
或
Figure 02_image104
； X係O或CH2 ； f係1至10之整數； g係1至20之整數； U及U’獨立地係不存在或間隔體； Q係異雙官能團；且 Ab係抗體，Ab係抗體、抗體片段或抗原結合片段。
在第三態樣之第一實施例中，X係O。
在第四態樣中，本揭示案提供式(VI)化合物：
Figure 02_image106
(VI)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： a係1至20之整數； m係0、1、2、3或4； n係0或1； D-NH-係胺基取代之化合物之一部分，其中胺基取代之化合物具有式D-NH2 ； 每一R1 係獨立地選自C1 -C4 烷基、O-C1 -C4 烷基及鹵素； R2 係選自C1 -C4 烷基及-(CH2 CH2 O)s -CH3 ；其中s係1至10之整數； R3 及R3’ 係各自獨立地選自氫及C1 -C3 烷基； L係可裂解連接體；且 LP係脂質。
在第四態樣之第一實施例中，脂質係膽固醇或磷脂。在第四態樣之第二實施例中，脂質係磷脂。在第四態樣之第三實施例中，磷脂係選自磷脂醯膽鹼、磷脂醯甘油、磷脂酸、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、鞘磷脂、大豆磷脂及蛋黃磷脂。在第四態樣之第五實施例中，磷脂係磷脂醯乙醇胺，其中磷脂醯乙醇胺係1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺。
在第四態樣之第六實施例中，本揭示案提供脂質複合物，其包含式(VI)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在第七實施例中，脂質複合物呈脂質體形式。
在第四態樣之第八實施例中，脂質複合物進一步包含一或多種磷脂。在第九實施例中，一或多種磷脂係選自磷脂醯膽鹼、磷脂醯甘油、磷脂酸、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、鞘磷脂、大豆磷脂及蛋黃磷脂。在第十實施例中，磷脂係磷脂醯膽鹼，其中磷脂醯膽鹼係1,2-二硬脂醯基-sn -甘油-3-磷酸膽鹼。
在第四態樣之第十一實施例中，脂質複合物進一步包含脂肪醇及/或膽固醇。
在第四態樣之第十二實施例中，脂質複合物進一步包含至少一種聚乙二醇化脂質。在第十三實施例中，聚乙二醇化脂質係選自聚乙二醇化磷脂及聚乙二醇化二醯基甘油。在第十四實施例中，聚乙二醇化脂質係N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂醯基-sn -甘油-3-磷酸乙醇胺。
在第五態樣中，本揭示案提供醫藥組合物，其包含本文所述之化合物或複合物或其醫藥學上可接受之鹽及一或多種醫藥學上可接受之載劑。
在第六態樣中，本揭示案提供治療有需要之個體之癌症之方法，該方法包括向個體投與醫藥學上可接受量之本文所述之化合物或複合物。
在第七態樣中，本揭示案提供刺激有需要之個體之免疫反應之方法，該方法包括向個體投與醫藥學上可接受量之本文所述之化合物或複合物。
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除非用諸如術語「任一」、「除非」、「替代地」及具有類似效果之詞語明確表示，否則如本文所用之術語「或」係邏輯析取(即及/或)並且不指示排他析取。
如本文所用之術語「約」係指± 10%。 抗體藥物結合物
在一些實施例中，本揭示案提供式(I)化合物，
Figure 02_image001
(I)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： a係1至20之整數； b係1至20之整數； m係0、1、2、3或4； n係0或1； D-NH-係胺基取代之化合物之一部分，其中胺基取代之化合物具有式D-NH2 ； 每一R1 係獨立地選自C1 -C4 烷基、O-C1 -C4 烷基及鹵素； R2 係選自C1 -C4 烷基及-(CH2 CH2 O)s -CH3 ；其中s係1至10之整數； R3 及R3’ 係各自獨立地選自氫及C1 -C3 烷基； L係可裂解連接體；且 Ab係抗體、抗體片段或抗原結合片段。
在一些實施例中，本揭示案提供式(IV)化合物，
Figure 02_image096
(IV)； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： a係1至20之整數； b係1至20之整數； k係0、1、2或3； m係0、1、2、3或4； D-NH-係胺基取代之化合物之一部分，其中胺基取代之化合物具有式D-NH2 ； R2 係選自H、C1 -C4 烷基及-(CH2 CH2 O)s -CH3 ；其中s係1及10之整數； R4 係選自氫及任何天然胺基酸側鏈； R5 係選自C1 -C4 烷基及O-C1 -C4 烷基； L係可裂解連接體；且 Ab係抗體、抗體片段或抗原結合片段。
在一些實施例中，本揭示案提供式(V)化合物：
Figure 02_image100
(V)； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： D-NH係
Figure 02_image102
或
Figure 02_image104
； X係O或CH2 ； f係1至10之整數； g係1至20之整數； U及U’獨立地係不存在或間隔體； Q係異雙官能團；且 Ab係抗體、抗體片段或抗原結合片段。
在式(I)及(IV)之化合物中，胺基取代之化合物D-NH2 可為任何含胺基藥物。在某些實施例中，D-NH2 係免疫調節劑。如本文所用之術語「免疫調節劑」係指在有需要之個體中產生免疫反應之化合物。免疫調節劑之實例包括(但不限於) IDO抑制劑、MEK抑制劑、STING調節劑、CCR4拮抗劑、PD-1/PD-L1抑制劑、TLR7/8促效劑及諸如此類。在一些實施例中，D-NH2 係STING調節劑。在一些實施例中，D-NH2 包含鳥嘌呤或腺嘌呤衍生物。在一些實施例中，STING調節劑係下式之環狀二核苷酸或環狀二核苷酸樣化合物(各自為CDN)：
Figure 02_image112
其中A’及A’’各自獨立地係核苷或其合成類似物；且Q、Q’、Q2 及Q2’ 中之每一者獨立地係氧或硫。在一些實施例中，Q’ 及Q2’ 係硫。在本揭示案之範圍內之CDN (包括環狀二核苷酸及環狀二核苷酸樣化合物)之實例包括(但不限於) US 9,724,408、US 10,106,574、US 9,549,944、US 9,695,212、US 9,718,848、US 9,994,607、US 10,047,115、US20180230178、US20180064745、US2018028132、US20180002369、US20180186828、US20190016750、US20180162899、US20180369268、US2018273578、US20180092937、WO2017/027646及WO2018/100558內揭示之CDN；以及諸如c-二-GMP、2’3’-cGAMP及SB 11285 (Spring Bank Pharmaceuticals)之化合物。
在某些實施例中，STING調節劑係式(II)化合物：
Figure 02_image114
(II)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： X10 係-SH或-OH； X20 係-SH或-OH； Ya 係-O-、-S-或-CH2 -； Yb 係-O-、-S­、-NH-或-NRa -，其中Ra 係C1 -C4 烷基； R10 係氫、氟、-OH、-NH2 、-ORb 或-NHRb ； R20 係氫或氟； R30 係氫；R40 係氫、氟、-OH、-NH2 、-ORb 或-NHRb ；或R30 及R40 一起形成-CH2 O-； R50 係氫或氟； Rb 係C1 -C6 烷基、鹵代(C1 -C6 )烷基或C3 -C6 環烷基； 環A10 係視情況經取代之含有1-4個選自N、O或S之雜原子之5員或6員單環雜芳基環，或視情況經取代之含有1-5個選自N、O或S之雜原子之9員或10員雙環雜芳基環；其中環A10 在環中包含至少一個N原子，且其中Yb 連接至環A10 之碳原子；且 環B10 係視情況經取代之含有2-5個選自N、O或S之雜原子之9員或10員雙環雜芳基環；其中環B10 在環中包含至少兩個N原子。
如本文所述，環A10 及環B10 可含有一或多個取代基且因此可視情況經取代。雜芳基之不飽和碳原子上之合適之取代基包括且通常選自-鹵基、-NO2 、-CN、-R+ 、-C(R+ )=C(R+ )2 、-C≡C-R+ 、-OR+ 、-SRº、-S(O)Rº、-SO2 Rº、-SO3 R+ 、-SO2 N(R+ )2 、-N(R+ )2 、-NR+ C(O)R+ 、-NR+ C(S)R+ 、-NR+ C(O)N(R+ )2 、-NR+ C(S)N(R+ )2 、-N(R+ )C(=NR+ )­N(R+ )2 、-N(R+ )C(=NR+ )­Rº、-NR+ CO2 R+ 、-NR+ SO2 Rº、-NR+ SO2 N(R+ )2 、-O-C(O)R+ 、-O-CO2 R+ 、-OC(O)N(R+ )2 、-C(O)R+ 、-C(S)Rº、-CO2 R+ 、-C(O)-C(O)R+ 、-C(O)N(R+ )2 、-C(S)N(R+ )2 、-C(O)N(R+ )-OR+ 、-C(O)N(R+ )C(=NR+ )-N(R+ )2 、-N(R+ )C(=NR+ )-N(R+ )-C(O)R+ 、-C(=NR+ )-N(R+ )2 、-C(=NR+ )-OR+ 、-N(R+ )-N(R+ )2 、-C(=NR+ )-N(R+ )-OR+ 、-C(Rº)=N-OR+ 、-P(O)(R+ )2 、-P(O)(OR+ )2 、-O-P(O)-OR+ 及-P(O)(NR+ )-N(R+ )2 ，其中R+ 獨立地係氫或視情況經取代之脂族基團、芳基、雜芳基、環脂族基團或雜環基，或兩個獨立出現之R+ 與其中間原子一起形成視情況經取代之5-7員芳基、雜芳基、環脂族基團或雜環基。在一些實施例中，R+ 獨立地係氫、C1-6 脂族基團或C3-6 環脂族基團。每一Rº獨立地係視情況經取代之脂族基團、芳基、雜芳基、環脂族基團或雜環基。
如上文所詳述，在一些實施例中，兩個獨立出現之R+ (或本文說明書及申請專利範圍中類似定義之任何其他變量)與其中間原子一起形成選自以下之單環或雙環：3-13員環脂族基團、具有1-5個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子之3-12員雜環基、6-10員芳基或具有1-5個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子之5-10員雜芳基。
在一些實施例中，STING調節劑係式(IIA)化合物：
Figure 02_image116
(IIA)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中R10 及R40 各自獨立地係氫、氟、-OH或-OCH2 CF3 且環A10 及B10 係如針對式(II)化合物所定義，條件係環A10 或環B10 經由-NH-基團連接至化合物(I)、(IV)或(V)母體分子部分之羰基。
在一些實施例中，環A10 係視情況經取代之含有1個、2個或3個氮原子之6員單環雜芳基環。
在一些實施例中，環B10 係：
Figure 02_image118
其中： Z10 、Z20 、Z30 及Z40 各自獨立地係N或CR200 ； R210 係氫或C1 -C6 烷基、鹵代(C1 -C6 )烷基或C3 -C6 環烷基； R230 係氫或-NH2 ；且 R200 、R220 及R240 各自獨立地係氫、鹵素、-OH、-NH2 、-CN、C1 -C6 烷基、鹵代(C1 -C6 )烷基或C3 -C6 環烷基。
在一些實施例中，STING調節劑係：
Figure 02_image119
； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中
Figure 02_image005
係與母體分子部分之羰基之連接點。
在某些實施例中，STING調節劑係式(X)之環狀二核苷酸：
Figure 02_image121
(X)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： 由式(A-1 )表示之部分結構：
Figure 02_image123
(A-1 ) 係由式(Z-A )或式(Z-B )表示之部分結構：
Figure 02_image125
02
Figure 02_image127
； R105 及R205 各自獨立地係羥基或鹵素原子； B100 係由式(B1 -A )或式(B1 -B )表示之基團：
Figure 02_image129
R13 、R14 、R15 、R16 及R17 各自獨立地係氫原子或取代基； Y11 、Y12 、Y13 、Y14 、Y15 及Y16 各自獨立地係N或CR1a ； Z11 、Z12 、Z13 、Z14 、Z15 及Z16 各自獨立地係N或C； R1a 係氫原子或取代基； B200 係由式(B2 -A )或式(B2 -B )表示之基團：
Figure 02_image131
R23 、R24 、R25 、R26 及R27 各自獨立地係氫原子或取代基； Y21 、Y22 、Y23 、Y24 、Y25 及Y26 各自獨立地係N或CR2a ； Z21 、Z22 、Z23 、Z24 、Z25 及Z26 各自獨立地係N或C； R2a 係氫原子或取代基； X1 及X2 各自獨立地係氧原子或硫原子；且 Q1a 、Q2a 、Q3a 及Q4a 各自獨立地係氧原子或硫原子；且 B100 或B200 中之一者經由-NH-基團連接至母體結構之5員環。
在另一實施例中，B100 或B200 中之一者係：
Figure 02_image092
； 其中： R18 係氫或C1-6 烷基；且另一者經由-NH-基團連接至母體結構之5員環。 R19 係鹵素原子；且另一者經由-NH-基團連接至式(I)之羰基。
在另一態樣中，本揭示案提供如本文所述之抗體藥物結合物。
如本文所述，某些R基團係選自氫及取代基。取代基之實例包括鹵素原子、氰基、硝基、視情況經取代之烴基、視情況經取代之雜環基、醯基、視情況經取代之胺基、視情況經取代之胺甲醯基、視情況經取代之硫代胺甲醯基、視情況經取代之胺磺醯基、視情況經取代之羥基、視情況經取代之氫硫基(SH)及視情況經取代之矽基。
如本文所用，在本說明書中，「烴基」 (包括「視情況經取代之烴基」之「烴基」)之實例包括C1-6 烷基、C2-6 烯基、C2-6 炔基、C3-10 環烷基、C3-10 環烯基、C6-14 芳基及C7-16 芳烷基。
在本說明書中，「視情況經取代之烴基」之實例包括視情況具有選自以下取代基群A之取代基之烴基，該取代基群A包括： (1) 鹵素原子， (2) 硝基， (3) 氰基， (4) 側氧基， (5) 羥基， (6) 視情況鹵化之C1-6 烷氧基， (7) C6-14 芳氧基(例如苯氧基、萘氧基)， (8) C7-16 芳烷基氧基(例如苄基氧基)， (9) 5至14員芳族雜環基氧基(例如吡啶基氧基)， (10) 3至14員非芳族雜環基氧基(例如嗎啉基氧基、六氫吡啶基氧基)， (11) C1-6 烷基-羰基氧基(例如乙醯氧基、丙醯基氧基)， (12) C6-14 芳基-羰基氧基(例如苯甲醯基氧基、1-萘甲醯基氧基、2-萘甲醯基氧基)， (13) C1-6 烷氧基-羰基氧基(例如甲氧基羰基氧基、乙氧基羰基氧基、丙氧基羰基氧基、丁氧基羰基氧基)， (14) 單-或二-C1-6 烷基-胺甲醯基氧基(例如甲基胺甲醯基氧基、乙基胺甲醯基氧基、二甲基胺甲醯基氧基、二乙基胺甲醯基氧基)， (15) C6-14 芳基-胺甲醯基氧基(例如苯基胺甲醯基氧基、萘基胺甲醯基氧基)， (16) 5至14員芳族雜環基羰基氧基(例如菸鹼醯基氧基)， (17) 3至14員非芳族雜環基羰基氧基(例如嗎啉基羰基氧基、六氫吡啶基羰基氧基)， (18) 視情況鹵化之C1-6 烷基磺醯基氧基(例如甲基磺醯基氧基、三氟甲基磺醯基氧基)， (19) 視情況經C1-6 烷基取代之C6-14 芳基磺醯基氧基(例如苯基磺醯基氧基、甲苯磺醯基氧基)， (20) 視情況鹵化之C1-6 烷基硫基， (21) 5至14員芳族雜環基， (22) 3至14員非芳族雜環基， (23) 甲醯基， (24) 羧基， (25) 視情況鹵化之C1-6 烷基-羰基， (26) C6-14 芳基-羰基， (27) 5至14員芳族雜環基羰基， (28) 3至14員非芳族雜環基羰基， (29) C1-6 烷氧基-羰基， (30) C6-14 芳氧基-羰基(例如苯基氧基羰基、1-萘基氧基羰基、2-萘基氧基羰基)， (31) C7-16 芳烷基氧基-羰基(例如苄基氧基羰基、苯乙基氧基羰基)， (32) 胺甲醯基， (33) 硫代胺甲醯基， (34) 單-或二-C1-6 烷基-胺甲醯基， (35) C6-14 芳基-胺甲醯基(例如苯基胺甲醯基)， (36) 5至14員芳族雜環基胺甲醯基(例如吡啶基胺甲醯基、噻吩基胺甲醯基)， (37) 3至14員非芳族雜環基胺甲醯基(例如嗎啉基胺甲醯基、六氫吡啶基胺甲醯基)， (38) 視情況鹵化之C1-6 烷基磺醯基， (39) C6-14 芳基磺醯基， (40) 5至14員芳族雜環基磺醯基(例如吡啶基磺醯基、噻吩基磺醯基)， (41) 視情況鹵化之C1-6 烷基亞磺醯基， (42) C6-14 芳基亞磺醯基(例如苯基亞磺醯基、1-萘基亞磺醯基、2-萘基亞磺醯基)， (43) 5至14員芳族雜環基亞磺醯基(例如吡啶基亞磺醯基、噻吩基亞磺醯基)， (44) 胺基， (45)   單-或二-C1-6 烷基胺基(例如甲基胺基、乙基胺基、丙基胺基、異丙基胺基、丁基胺基、二甲基胺基、二乙基胺基、二丙基胺基、二丁基胺基、N-乙基-N-甲基胺基)， (46) 單-或二-C6-14 芳基胺基(例如苯基胺基)， (47) 5至14員芳族雜環基胺基(例如吡啶基胺基)， (48) C7-16 芳烷基胺基(例如苄基胺基)， (49) 甲醯基胺基， (50) C1-6 烷基-羰基胺基(例如乙醯基胺基、丙醯基胺基、丁醯基胺基)， (51) (C1-6 烷基)(C1-6 烷基-羰基)胺基(例如N-乙醯基-N-甲基胺基)， (52) C6-14 芳基-羰基胺基(例如苯基羰基胺基、萘基羰基胺基)， (53) C1-6 烷氧基-羰基胺基(例如甲氧基羰基胺基、乙氧基羰基胺基、丙氧基羰基胺基、丁氧基羰基胺基、第三丁氧基羰基胺基)， (54) C7-16 芳烷基氧基-羰基胺基(例如苄基氧基羰基胺基)， (55) C1-6 烷基磺醯基胺基(例如甲基磺醯基胺基、乙基磺醯基胺基)， (56) 視情況經C1-6 烷基取代之C6-14 芳基磺醯基胺基(例如苯基磺醯基胺基、甲苯磺醯基胺基)， (57) 視情況鹵化之C1-6 烷基， (58) C2-6 烯基， (59) C2-6 炔基， (60) C3-10 環烷基， (61) C3-10 環烯基，及 (62) C6-14 芳基。
在「視情況經取代之烴基」中上文所提及取代基之數量為例如1至5，通常為1至3。當取代基之數量為2或更大時，各別取代基可相同或不同。
在本說明書中，「雜環基」 (包括「視情況經取代之雜環基」之「雜環基」)之實例包括(i)芳族雜環基，(ii)非芳族雜環基及(iii) 7至10員橋接雜環基，其各自含有1至4個選自氮原子、硫原子及氧原子之雜原子作為除碳原子外構成環之原子。
在本說明書中，「芳族雜環基」 (包括「5至14員芳族雜環基」)之實例包括5至14員(通常5至10員)芳族雜環基，其含有1至4個選自氮原子、硫原子及氧原子之雜原子作為除碳原子外構成環之原子。
「芳族雜環基」之合適之實例包括5員或6員單環芳族雜環基，例如噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、異噻唑基、㗁唑基、異㗁唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基、1,2,4-㗁二唑基、1,3,4-㗁二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基及諸如此類；及
8至14員稠合多環(通常二環或三環)芳族雜環基，例如苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并㗁唑基、苯并異㗁唑基、苯并噻唑基、苯并異噻唑基、苯并三唑基、咪唑并吡啶基、噻吩并吡啶基、呋喃并吡啶基、吡咯并吡啶基、吡唑并吡啶基、㗁唑并吡啶基、噻唑并吡啶基、咪唑并吡嗪基、咪唑并嘧啶基、噻吩并嘧啶基、呋喃并嘧啶基、吡咯并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、㗁唑并嘧啶基、噻唑并嘧啶基、吡唑并三嗪基、萘并[2,3-b]噻吩基、啡㗁噻基、吲哚基、異吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、異喹啉基、喹啉基、呔嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、啡嗪基、啡噻嗪基、啡㗁嗪基及諸如此類。
在本說明書中，「非芳族雜環基」 (包括「3至14員非芳族雜環基」)之實例包括3至14員(通常4至10員)非芳族雜環基，其含有1至4個選自氮原子、硫原子及氧原子之雜原子作為除碳原子外構成環之原子。
「非芳族雜環基」之合適之實例包括3至8員單環非芳族雜環基，例如氮丙啶基、環氧乙烷基、環硫乙烷基、氮雜環丁基、氧雜環丁基、硫雜環丁基、四氫噻吩基、四氫呋喃基、吡咯啉基、吡咯啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、㗁唑啉基、㗁唑啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、噻唑啉基、噻唑啶基、四氫異噻唑基、四氫㗁唑基、四氫異㗁唑基、六氫吡啶基、六氫吡嗪基、四氫吡啶基、二氫吡啶基、二氫硫吡喃基、四氫嘧啶基、四氫噠嗪基、二氫吡喃基、四氫吡喃基、四氫硫吡喃基、嗎啉基、硫嗎啉基、氮雜環庚基、二氮雜環庚基、氮呯基、氧雜環庚基、氮雜環辛基、二氮雜環辛基及諸如此類；及
9至14員稠合多環(通常二環或三環)非芳族雜環基，例如二氫苯并呋喃基、二氫苯并咪唑基、二氫苯并㗁唑基、二氫苯并噻唑基、二氫苯并異噻唑基、二氫萘并[2,3-b]噻吩基、四氫異喹啉基、四氫喹啉基、4H-喹嗪基、吲哚啉基、異吲哚啉基、四氫噻吩并[2,3-c]吡啶基、四氫苯并氮呯基、四氫喹喔啉基、四氫菲啶基、六氫啡噻嗪基、六氫啡㗁嗪基、四氫呔嗪基、四氫萘啶基、四氫喹唑啉基、四氫噌啉基、四氫咔唑基、四氫-β-咔啉基、四氫吖啶基、四氫啡嗪基、四氫硫代呫噸基、八氫異喹啉基及諸如此類。
在本說明書中，「7至10員橋接雜環基」之合適之實例包括奎寧環基及7-氮雜二環[2.2.1]庚基。
在本說明書中，「含氮雜環基」之實例包括含有至少一個氮原子作為構成環之原子之「雜環基」。
在本說明書中，「視情況經取代之雜環基」之實例包括視情況具有選自上文所提及取代基群A之取代基之雜環基。
在「視情況經取代之雜環基」中取代基之數量為例如1至3。當取代基之數量為2或更大時，各別取代基可相同或不同。
在本說明書中，「醯基」之實例包括甲醯基、羧基、胺甲醯基、硫代胺甲醯基、亞磺醯基、磺基、胺磺醯基及膦醯基，其各自視情況具有1或2個選自C1-6 烷基、C2-6 烯基、C3-10 環烷基、C3-10 環烯基、C6-14 芳基、C7-16 芳烷基、5至14員芳族雜環基及3至14員非芳族雜環基之取代基，該等取代基各自視情況具有1至3個選自鹵素原子、視情況鹵化之C1-6 烷氧基、羥基、硝基、氰基、胺基及胺甲醯基之取代基。
「醯基」之實例亦包括烴-磺醯基、雜環基磺醯基、烴-亞磺醯基及雜環基亞磺醯基。
在此處，烴-磺醯基意指烴基鍵結之磺醯基，雜環基磺醯基意指雜環基鍵結之磺醯基，烴-亞磺醯基意指烴基鍵結之亞磺醯基，且雜環基亞磺醯基意指雜環基鍵結之亞磺醯基。
「醯基」之合適之實例包括甲醯基、羧基、C1-6 烷基-羰基、C2-6 烯基-羰基(例如巴豆醯基)、C3-10 環烷基-羰基(例如環丁烷羰基、環戊烷羰基、環己烷羰基、環庚烷羰基)、C3-10 環烯基-羰基(例如2-環己烯羰基)、C6-14 芳基-羰基、C7-16 芳烷基-羰基、5至14員芳族雜環基羰基、3至14員非芳族雜環基羰基、C1-6 烷氧基-羰基、C6-14 芳氧基-羰基(例如苯基氧基羰基、萘基氧基羰基)、C7-16 芳烷基氧基-羰基(例如苄基氧基羰基、苯乙基氧基羰基)、胺甲醯基、單-或二-C1-6 烷基-胺甲醯基、單-或二-C2-6 烯基-胺甲醯基(例如二烯丙基胺甲醯基)、單-或二-C3-10 環烷基-胺甲醯基(例如環丙基胺甲醯基)、單-或二-C6-14 芳基-胺甲醯基(例如苯基胺甲醯基)、單-或二-C7-16 芳烷基-胺甲醯基、5至14員芳族雜環基胺甲醯基(例如吡啶基胺甲醯基)、硫代胺甲醯基、單-或二-C1-6 烷基-硫代胺甲醯基(例如甲基硫代胺甲醯基、N-乙基-N-甲基硫代胺甲醯基)、單-或二-C2-6 烯基-硫代胺甲醯基(例如二烯丙基硫代胺甲醯基)、單-或二-C3-10 環烷基-硫代胺甲醯基(例如環丙基硫代胺甲醯基、環己基硫代胺甲醯基)、單-或二-C6-14 芳基-硫代胺甲醯基(例如苯基硫代胺甲醯基)、單-或二-C7-16 芳烷基-硫代胺甲醯基(例如苄基硫代胺甲醯基、苯乙基硫代胺甲醯基)、5至14員芳族雜環基硫代胺甲醯基(例如吡啶基硫代胺甲醯基)、亞磺醯基、C1-6 烷基亞磺醯基(例如甲基亞磺醯基、乙基亞磺醯基)、磺基、C1-6 烷基磺醯基、C6-14 芳基磺醯基、膦醯基及單-或二-C1-6 烷基膦醯基(例如二甲基膦醯基、二乙基膦醯基、二異丙基膦醯基、二丁基膦醯基)。
在本說明書中，「視情況經取代之胺基」之實例包括視情況具有1或2個選自C1-6 烷基、C2-6 烯基、C3-10 環烷基、C6-14 芳基、C7-16 芳烷基、C1-6 烷基-羰基、C6-14 芳基-羰基、C7-16 芳烷基-羰基、5至14員芳族雜環基羰基、3至14員非芳族雜環基羰基、C1-6 烷氧基-羰基、5至14員芳族雜環基、胺甲醯基、單-或二-C1-6 烷基-胺甲醯基、單-或二-C7-16 芳烷基-胺甲醯基、C1-6 烷基磺醯基及C6-14 芳基磺醯基之取代基之胺基，該等取代基各自視情況具有1至3個選自取代基群A之取代基。
視情況經取代之胺基之合適之實例包括胺基、單-或二-(視情況鹵化之C1-6 烷基)胺基(例如甲基胺基、三氟甲基胺基、二甲基胺基、乙基胺基、二乙基胺基、丙基胺基、二丁基胺基)、單-或二-C2-6 烯基胺基(例如二烯丙基胺基)、單-或二-C3-10 環烷基胺基(例如環丙基胺基、環己基胺基)、單-或二-C6-14 芳基胺基(例如苯基胺基)、單-或二-C7-16 芳烷基胺基(例如苄基胺基、二苄基胺基)、單-或二-(視情況鹵化之C1-6 烷基)-羰基胺基(例如乙醯基胺基、丙醯基胺基)、單-或二-C6-14 芳基-羰基胺基(例如苯甲醯基胺基)、單-或二-C7-16 芳烷基-羰基胺基(例如苄基羰基胺基)、單-或二-5至14員芳族雜環基羰基胺基(例如菸鹼醯基胺基、異菸鹼醯基胺基)、單-或二-3至14員非芳族雜環基羰基胺基(例如六氫吡啶基羰基胺基)、單-或二-C1-6 烷氧基-羰基胺基(例如第三丁氧基羰基胺基)、5至14員芳族雜環基胺基(例如吡啶基胺基)、胺甲醯基胺基、(單-或二-C1-6 烷基-胺甲醯基)胺基(例如甲基胺甲醯基胺基)、(單-或二-C7-16 芳烷基-胺甲醯基)胺基(例如苄基胺甲醯基胺基)、C1-6 烷基磺醯基胺基(例如甲基磺醯基胺基、乙基磺醯基胺基)、C6-14 芳基磺醯基胺基(例如苯基磺醯基胺基)、(C1-6 烷基)(C1-6 烷基-羰基)胺基(例如N-乙醯基-N-甲基胺基)及(C1-6 烷基)(C6-14 芳基-羰基)胺基(例如N-苯甲醯基-N-甲基胺基)。
在本說明書中，「視情況經取代之胺甲醯基」之實例包括視情況具有1或2個選自C1-6 烷基、C2-6 烯基、C3-10 環烷基、C6-14 芳基、C7-16 芳烷基、C1-6 烷基-羰基、C6-14 芳基-羰基、C7-16 芳烷基-羰基、5至14員芳族雜環基羰基、3至14員非芳族雜環基羰基、C1-6 烷氧基-羰基、5至14員芳族雜環基、胺甲醯基、單-或二-C1-6 烷基-胺甲醯基及單-或二-C7-16 芳烷基-胺甲醯基之取代基之胺甲醯基，該等取代基各自視情況具有1至3個選自取代基群A之取代基。
視情況經取代之胺甲醯基之合適之實例包括胺甲醯基、單-或二-C1-6 烷基-胺甲醯基、單-或二-C2-6 烯基-胺甲醯基(例如二烯丙基胺甲醯基)、單-或二-C3-10 環烷基-胺甲醯基(例如環丙基胺甲醯基、環己基胺甲醯基)、單-或二-C6-14 芳基-胺甲醯基(例如苯基胺甲醯基)、單-或二-C7-16 芳烷基-胺甲醯基、單-或二-C1-6 烷基-羰基-胺甲醯基(例如乙醯基胺甲醯基、丙醯基胺甲醯基)、單-或二-C6-14 芳基-羰基-胺甲醯基(例如苯甲醯基胺甲醯基)及5至14員芳族雜環基胺甲醯基(例如吡啶基胺甲醯基)。
在本說明書中，「視情況經取代之硫代胺甲醯基」之實例包括視情況具有1或2個選自C1-6 烷基、C2-6 烯基、C3-10 環烷基、C6-14 芳基、C7-16 芳烷基、C1-6 烷基-羰基、C6-14 芳基-羰基、C7-16 芳烷基-羰基、5至14員芳族雜環基羰基、3至14員非芳族雜環基羰基、C1-6 烷氧基-羰基、5至14員芳族雜環基、胺甲醯基、單-或二-C1-6 烷基-胺甲醯基及單-或二-C7-16 芳烷基-胺甲醯基之取代基之硫代胺甲醯基，該等取代基各自視情況具有1至3個選自取代基群A之取代基。
視情況經取代之硫代胺甲醯基之合適之實例包括硫代胺甲醯基、單-或二-C1-6 烷基-硫代胺甲醯基(例如甲基硫代胺甲醯基、乙基硫代胺甲醯基、二甲基硫代胺甲醯基、二乙基硫代胺甲醯基、N-乙基-N-甲基硫代胺甲醯基)、單-或二-C2-6 烯基-硫代胺甲醯基(例如二烯丙基硫代胺甲醯基)、單-或二-C3-10 環烷基-硫代胺甲醯基(例如環丙基硫代胺甲醯基、環己基硫代胺甲醯基)、單-或二-C6-14 芳基-硫代胺甲醯基(例如苯基硫代胺甲醯基)、單-或二-C7-16 芳烷基-硫代胺甲醯基(例如苄基硫代胺甲醯基、苯乙基硫代胺甲醯基)、單-或二-C1-6 烷基-羰基-硫代胺甲醯基(例如乙醯基硫代胺甲醯基、丙醯基硫代胺甲醯基)、單-或二-C6-14 芳基-羰基-硫代胺甲醯基(例如苯甲醯基硫代胺甲醯基)及5至14員芳族雜環基硫代胺甲醯基(例如吡啶基硫代胺甲醯基)。
在本說明書中，「視情況經取代之胺磺醯基」之實例包括視情況具有1或2個選自C1-6 烷基、C2-6 烯基、C3-10 環烷基、C6-14 芳基、C7-16 芳烷基、C1-6 烷基-羰基、C6-14 芳基-羰基、C7-16 芳烷基-羰基、5至14員芳族雜環基羰基、3至14員非芳族雜環基羰基、C1-6 烷氧基-羰基、5至14員芳族雜環基、胺甲醯基、單-或二-C1-6 烷基-胺甲醯基及單-或二-C7-16 芳烷基-胺甲醯基之取代基之胺磺醯基，該等取代基各自視情況具有1至3個選自取代基群A之取代基。
視情況經取代之胺磺醯基之合適之實例包括胺磺醯基、單-或二-C1-6 烷基-胺磺醯基(例如甲基胺磺醯基、乙基胺磺醯基、二甲基胺磺醯基、二乙基胺磺醯基、N-乙基-N-甲基胺磺醯基)、單-或二-C2-6 烯基-胺磺醯基(例如二烯丙基胺磺醯基)、單-或二-C3-10 環烷基-胺磺醯基(例如環丙基胺磺醯基、環己基胺磺醯基)、單-或二-C6-14 芳基-胺磺醯基(例如苯基胺磺醯基)、單-或二-C7-16 芳烷基-胺磺醯基(例如苄基胺磺醯基、苯乙基胺磺醯基)、單-或二-C1-6 烷基-羰基-胺磺醯基(例如乙醯基胺磺醯基、丙醯基胺磺醯基)、單-或二-C6-14 芳基-羰基-胺磺醯基(例如苯甲醯基胺磺醯基)及5至14員芳族雜環基胺磺醯基(例如吡啶基胺磺醯基)。
在本說明書中，「視情況經取代之羥基」之實例包括視情況具有選自C1-6 烷基、C2-6 烯基、C3-10 環烷基、C6-14 芳基、C7-16 芳烷基、C1-6 烷基-羰基、C6-14 芳基-羰基、C7-16 芳烷基-羰基、5至14員芳族雜環基羰基、3至14員非芳族雜環基羰基、C1-6 烷氧基-羰基、5至14員芳族雜環基、胺甲醯基、單-或二-C1-6 烷基-胺甲醯基、單-或二-C7-16 芳烷基-胺甲醯基、C1-6 烷基磺醯基及C6-14 芳基磺醯基之取代基之羥基，該等取代基各自視情況具有1至3個選自取代基群A之取代基。
視情況經取代之羥基之合適之實例包括羥基、C1-6 烷氧基、C2-6 烯基氧基(例如烯丙基氧基、2-丁烯基氧基、2-戊烯基氧基、3-己烯基氧基)、C3-10 環烷基氧基(例如環己基氧基)、C6-14 芳氧基(例如苯氧基、萘基氧基)、C7-16 芳烷基氧基(例如苄基氧基、苯乙基氧基)、C1-6 烷基-羰基氧基(例如乙醯基氧基、丙醯基氧基、丁醯基氧基、異丁醯基氧基、戊醯基氧基)、C6-14 芳基-羰基氧基(例如苯甲醯基氧基)、C7-16 芳烷基-羰基氧基(例如苄基羰基氧基)、5至14員芳族雜環基羰基氧基(例如菸鹼醯基氧基)、3至14員非芳族雜環基羰基氧基(例如六氫吡啶基羰基氧基)、C1-6 烷氧基-羰基氧基(例如第三丁氧基羰基氧基)、5至14員芳族雜環基氧基(例如吡啶基氧基)、胺甲醯基氧基、C1-6 烷基-胺甲醯基氧基(例如甲基胺甲醯基氧基)、C7-16 芳烷基-胺甲醯基氧基(例如苄基胺甲醯基氧基)、C1-6 烷基磺醯基氧基(例如甲基磺醯基氧基、乙基磺醯基氧基)及C6-14 芳基磺醯基氧基(例如苯基磺醯基氧基)。
在本說明書中，「視情況經取代之氫硫基」之實例包括視情況具有選自C1-6 烷基、C2-6 烯基、C3-10 環烷基、C6-14 芳基、C7-16 芳烷基、C1-6 烷基-羰基、C6-14 芳基-羰基及5至14員芳族雜環基之取代基之氫硫基，該等取代基各自視情況具有1至3個選自取代基群A之取代基，及鹵化氫硫基。
視情況經取代之氫硫基之合適之實例包括氫硫基(-SH)、C1-6 烷基硫基、C2-6 烯基硫基(例如烯丙基硫基、2-丁烯基硫基、2-戊烯基硫基、3-己烯基硫基)、C3-10 環烷基硫基(例如環己基硫基)、C6-14 芳基硫基(例如苯基硫基、萘基硫基)、C7-16 芳烷基硫基(例如苄基硫基、苯乙基硫基)、C1-6 烷基-羰基硫基(例如乙醯基硫基、丙醯基硫基、丁醯基硫基、異丁醯基硫基、戊醯基硫基)、C6-14 芳基-羰基硫基(例如苯甲醯基硫基)、5至14員芳族雜環基硫基(例如吡啶基硫基)及鹵化硫基(例如五氟硫基)。
在本說明書中，「視情況經取代之矽基」之實例包括視情況具有1至3個選自C1-6 烷基、C2-6 烯基、C3-10 環烷基、C6-14 芳基及C7-16 芳烷基之取代基之矽基，該等取代基各自視情況具有1至3個選自取代基群A之取代基。視情況經取代之矽基之實例包括三-C1-6 烷基矽基(例如三甲基矽基、第三丁基(二甲基)矽基)。
在一些實施例中，STING調節劑係式(III)化合物：
Figure 02_image088
(III)； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： R105 及R205 各自獨立地係羥基或鹵素原子； B1 00 係由式(B1 -A )或式(B1 -B )表示之基團：
Figure 02_image133
R13 、R14 、R15 、R16 及R17 各自獨立地係氫原子或取代基； R1000 係氫或連接至式(I)之羰基的鍵； Y11 、Y12 、Y13 、Y14 、Y15 及Y16 各自獨立地係N或CR1a ； Z11 、Z12 、Z13 、Z14 、Z15 及Z16 各自獨立地係N或C； R105 及R205 各自獨立地係羥基或鹵素原子； R1a 係氫原子或取代基； B2 00 係由式(B2 -A )或式(B2 -B )表示之基團：
Figure 02_image135
R23 、R24 、R25 、R26 及R27 各自獨立地係氫原子或取代基； R100’ 係氫或連接至式(I)之羰基的鍵； Y21 、Y22 、Y23 、Y24 、Y25 及Y26 各自獨立地係N或CR2a ； Z21 、Z22 、Z23 、Z24 、Z25 及Z26 各自獨立地係N或C； R2a 係氫原子或取代基； X1 及X2 各自獨立地係氧原子或硫原子；且 Q1 、Q2 、Q3及Q4 各自獨立地係氧原子或硫原子。
條件係： B100 或B200 中之一者係：
Figure 02_image092
； 其中： R18 係氫或C1-6 烷基；且 R19 係鹵素原子，且B100 或B200 中之另一者經由-NH-基團連接至母體結構之5員環。
在一些實施例中，STING調節劑係式(III)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R205 係F且B100 係
Figure 02_image137
。
在一些實施例中，環狀二核苷酸係：
Figure 02_image139
； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中
Figure 02_image005
係與母體分子部分之羰基之連接點。
基團「L」係可裂解連接體。如本文所用之術語「連接體」係指能夠將抗體、抗體片段或抗原結合片段(Ab)連接至式(I)及(IV)化合物內之含藥物部分之任何化學部分。連接體可為具支鏈的，且可經1至20個含藥物部分取代。在一些實施例中，連接體可經1至10個含藥物部分取代。在一些實施例中，連接體可經1至5個含藥物部分取代。在一些實施例中，連接體可經一個或兩個含藥物部分取代。在一些實施例中，連接體可經一個含藥物部分取代。
連接體「L」為可裂解的。在某些實施例中，在藥物及/或抗體可保持活性之條件下，連接體可能易於發生酸誘導之裂解、光誘導之裂解、酶促裂解或諸如此類。在一些實施例中，可裂解連接體可經酶促裂解。在一些實施例中，可裂解連接體可由蛋白酶、肽酶、酯酶、糖苷酶、磷酸二酯酶、磷酸酶或脂肪酶裂解。在一些實施例中，可裂解連接體可由蛋白酶裂解。蛋白酶之實例包括(但不限於)細胞自溶酶B、VAGP四肽及諸如此類。在某些實施例中，連接體可為PCT公開案WO 2018/200812、WO 2018/100558中所揭示之彼等連接體中之任一者，該等PCT公開案之全文皆以引用方式併入本文中。
在某些實施例中，「L」具有下式：
Figure 02_image141
； 其中：
Figure 02_image005
係與氮原子之連接點；且
Figure 02_image007
係與Ab之連接點。
在一些實施例中，「L」具有下式：
Figure 02_image143
， 其中：
Figure 02_image005
係與氮原子之連接點；
Figure 02_image007
係與抗體之連接點；
基團「W」係不存在或自消性基團。如本文所用之術語「自消性」係指基團經受電子級聯從而釋放其所連接之基團。在一些實施例中，自消性基團包括一或多個可經受1,4-消去、1,6-消去、1,8-消去、1,6-環化消去、1,5-環化消去、1,3-環化消去、分子內5-環外-trig環化及/或6-環外-trig環化之基團。在某些實施例中，自消性基團可為PCT公開案WO 2018/200812、WO 2018/100558中所揭示之彼等自消性基團中之任一者，該等PCT公開案之全文皆以引用方式併入本文中。
基團「Z」係不存在或2至5個胺基酸之肽。在某些實施例中，肽係連接體之裂解位點，由此在暴露於細胞內蛋白酶(例如溶酶體酶)時促進藥物釋放(Doronina等人(2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784)。具有兩個胺基酸之肽之實例包括(但不限於)丙胺酸-丙胺酸(ala-ala)、纈胺酸-瓜胺酸(vc或val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(af或ala-phe)；苯丙胺酸-離胺酸(fk或phe-lys)；苯丙胺酸-高離胺酸(phe-homolys)；及N-甲基-纈胺酸-瓜胺酸(Me-val-cit)。具有三個胺基酸之肽之實例包括(但不限於)甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(gly-val-cit)及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸(gly-gly-gly)。上述胺基酸組合亦可以相反順序存在(即cit-val)。
本揭示案之肽可包含天然及/或非天然胺基酸殘基。術語「天然胺基酸」係指Ala、Asp、Cys、Glu、Phe、Gly、His、He、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp及Tyr。作為非限制性實例，「非天然胺基酸」(即胺基酸並非天然存在)包括高絲胺酸、高精胺酸、瓜胺酸、苯甘胺酸、牛磺酸、碘代酪胺酸、硒代-半胱胺酸、正白胺酸(「Nle」)、正纈胺酸(「Nva」)、β-丙胺酸、L-或D-萘丙胺酸、鳥胺酸(「Orn」)及諸如此類。肽可經設計及優化以藉由特定酶(例如腫瘤相關蛋白酶、細胞自溶酶B、C及D或胞漿素蛋白酶)進行酶促裂解。
胺基酸亦包括天然及非天然胺基酸之D-形式。「D-」表示具有與天然(「L-」)胺基酸之構形不同之「D」 (右旋)構形之胺基酸。天然及非天然胺基酸可在市面上購得(Sigma Chemical Co., Advanced Chemtech)或使用本領域已知之方法合成。
基團「U」及「U′」獨立地係不存在或間隔體。如本文所用之術語「間隔體」係指用作連接物之化學部分。在本揭示案中，間隔體可將抗體、抗體片段或抗原片段連接至異雙官能團及/或將異雙官能團連接至肽「Z」，或當「Z」不存在時連接至基團「W」。非限制性例示性間隔體包括-NH-、-S-、-O-、-NHC(=O)CH2 CH2 -、-S(=O)2 -CH2 CH2 -、-C(=O)NHNH-、-C(=O)O-、-C(=O)NH-、-CH2 -、-CH2 CH2 -、-CH2 CH2 CH2 -、-CH2 =CH2 -、-C≡C-、-CH=N-O-、聚乙二醇(PEG)、
Figure 02_image145
在本揭示案之化合物中，當「U」存在時，其可為經1至10個「-C(O)-W-Z-」基團取代之具支鏈基團。在一些實施例中，「U」經1至5個「-C(O)-W-Z-」基團取代。在一些實施例中，「U」經1或2個「-C(O)-W-Z-」基團取代。在一些實施例中，「U」經1個「-C(O)-W-Z-」基團取代。在某些實施例中，間隔體可為PCT公開案WO 2018/200812、WO 2018/100558中所揭示之彼等間隔體中之任一者，該等PCT公開案之全文皆以引用方式併入本文中。
基團「Q」係異雙官能團。在本揭示案中，術語「異雙官能團」係指將其作為一部分之連接體連接至抗體、抗體片段或抗原結合片段之化學部分。參見例如WO2017/191579。異雙官能團的特徵為在化學部分之任一端具有不同之反應基團。異雙官能團可直接連接至「Ab」，或替代地可經由連接體「U′」連接。連接至「Ab」可經由化學或酶促結合或二者之組合實現。化學結合涉及抗體表面上之可及胺基酸殘基與「Q」或「U′」上之反應柄(reaction handle)之受控反應。化學結合之實例包括(但不限於)離胺酸醯胺偶合、半胱胺酸偶合及經由藉由遺傳改造納入之非天然胺基酸偶合，其中具有期望反應柄之非天然胺基酸殘基安裝至「Ab」上。在酶促結合中，酶介導連接體與抗體、抗體片段或抗原結合片段上之可及胺基殘基之偶合。酶促結合之實例包括(但不限於)使用分選酶之轉肽、使用微生物轉麩醯胺酸酶之轉肽及N-聚糖改造。化學結合及酶促結合亦可依序使用。例如，酶促結合亦可用於將獨特的反應柄安裝於欲用於後續化學結合之「Ab」上。在某些實施例中，異雙官能團可為PCT公開案WO 2018/200812、WO 2018/100558中所揭示之彼等異雙官能團中之任一者，該等PCT公開案之全文皆以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，「Q」係選自
Figure 02_image056
、
Figure 02_image058
、
Figure 02_image060
、
Figure 02_image062
、
Figure 02_image064
、
Figure 02_image066
、
Figure 02_image068
、
Figure 02_image070
、
Figure 02_image072
、
Figure 02_image074
Figure 02_image076
及
Figure 02_image078
； 其中
Figure 02_image005
係與U之連接點，或當U不存在時係與Z之連接點；且
Figure 02_image007
係與U’之連接點，或當U’不存在時係與Ab之連接點。
在某些實施例中，本揭示案提供式(XX)化合物：
Figure 02_image147
(XX)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中n、m、a、t、D-NH-、R1 、R2 、R3 、R3’ 、W、Z及U係如本文所述且其中Q*係能夠結合至抗體、抗體片段或抗原結合片段之反應性官能團。合適之Q*基團之實例包括(但不限於)活化羧酸基團，例如醯氯-C(O)-Cl及酸酐、鹵代乙醯胺、馬來醯亞胺、炔烴、環炔烴(例如環辛炔)、氧雜降莰二烯、降莰烯、疊氮化物、二芳基四嗪、單芳基四嗪、醛、酮、羥胺、乙烯基砜及氮丙啶。在某些實施例中，反應性官能團可為PCT公開案WO 2018/200812、WO 2018/100558中所揭示之彼等反應性官能團中之任一者，該等PCT公開案之全文皆以引用方式併入本文中。
基團「Ab」係抗體、抗體片段或抗原結合片段。抗體係由免疫系統產生之能夠識別並結合至特定抗原之蛋白質。靶抗原通常具有由多種抗體上之CDR識別之多個結合位點，亦稱為表位。特異性結合至不同表位之每種抗體具有不同之結構。因此，一種抗原可具有一種以上之相應抗體。術語「抗體」在本文中以最廣泛含義使用且具體涵蓋單株抗體、單結構域抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現期望生物活性即可。抗體可為鼠類、人類、人類化、嵌合或衍生自其他物種。(Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology，第5版，Garland Publishing, New York)。
如本文所用之術語「抗體」亦指全長免疫球蛋白分子或全長免疫球蛋白分子之免疫活性部分，即含有免疫特異性結合相關靶之抗原或其一部分之抗原結合位點之分子，該等靶包括(但不限於)癌細胞或產生與自體免疫疾病相關之自體免疫抗體之細胞。本文所揭示之免疫球蛋白可為免疫球蛋白分子之任一類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD及IgA)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類。免疫球蛋白可衍生自任何物種。然而，在一個態樣中，免疫球蛋白為人類源、鼠類源或兔源的。
術語「單結構域抗體」 (亦稱為奈米抗體)係由分子量為約12 kDa至約15 kDa之單個單體可變抗體結構域組成之抗體片段。單體抗體可基於重鏈可變結構域或輕鏈。單結構域抗體之實例包括(但不限於) VH H片段及VNAR 片段。參見例如Harmsen M. M.等人，Applied Microbiology and Biotechnology 77 (1): 13-22。
「抗體片段」包含完整抗體之一部分，通常抗原結合區域或其可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2 及Fv片段；雙價抗體；線性抗體；由Fab表現文庫產生之片段、抗個體基因型(抗Id)抗體、CDR (互補決定區)及上述任一者之免疫特異性結合至癌細胞抗原、病毒抗原或微生物抗原之表位結合片段、單鏈抗體分子；及自抗體片段形成之多特異性抗體。
「完整抗體」係包含抗原結合可變區以及輕鏈恆定結構域(CL)及重鏈恆定結構域CH1、CH2及CH3之抗體。恆定結構域可為天然序列恆定結構域(例如人類天然序列恆定結構域)或其胺基酸序列變異體。
如本文所用之術語「單株抗體」係指自實質上同源之抗體群體獲得之抗體，即構成該群體之個別抗體除可能的天然突變以外係一致的，該等天然突變可以小量存在。單株抗體係高度特異性的，針對單一抗原位點。此外，與包括針對不同決定簇(表位)之不同抗體之多株抗體製劑不同，每種單株抗體針對抗原上之單一決定簇。除其特異性之外，單株抗體之優勢在於其可不受其他抗體污染地合成。修飾詞「單株」指示抗體之特徵為自實質上同源之抗體群體獲得且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，欲根據本揭示案使用之單株抗體可藉由首先由Kohler等人(1975) Nature 256:495闡述之雜交瘤方法製得，或可藉由重組DNA方法(參見美國專利第4,816,567號)製得。例如，「單株抗體」亦可使用Clackson等人(1991) Nature, 352:624-628；Marks等人(1991) J. Mol. Biol., 222:581-597中所述之技術自噬菌體抗體文庫分離。
單株抗體在本文中具體包括其中重鏈及/或輕鏈之一部分與衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中之相應序列一致或同源，而鏈之剩餘部分與衍生自另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中之相應序列一致或同源的「嵌合」抗體，以及該等抗體之片段，只要其展現期望生物活性即可(美國專利第4,816,567號；及Morrison等人(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855)。相關嵌合抗體在本文中包括「靈長化」抗體，其包含衍生自非人類靈長類動物(例如舊大陸猴、人猿等)之可變結構域抗原結合序列及人類恆定區序列。
已採用多種方法來產生單株抗體(MAb)。雜交瘤技術係指產生單一類型之抗體之經選殖細胞系，其使用不同物種之細胞，包括小鼠(鼠類)、倉鼠、大鼠及人類。製備MAb之另一方法使用遺傳改造，包括重組DNA技術。自該等技術製得之單株抗體尤其包括嵌合抗體及人類化抗體。嵌合抗體組合一種以上類型之物種之DNA編碼區。例如，嵌合抗體可自小鼠獲得可變區且自人類獲得恆定區。人類化抗體主要來自人類，即使其含有非人類部分。與嵌合抗體一樣，人類化抗體可含有完整人類恆定區。但與嵌合抗體不同，可變區可部分衍生自人類。人類化抗體之非人類合成部分通常來自鼠類抗體中之CDR。無論如何，該等區域對使抗體識別並結合至特定抗原至關重要。儘管可用於診斷學及短期療法，鼠類抗體在不增加有害免疫原性反應之風險的情況下無法長期投與人。此反應稱為人類抗小鼠抗體(HAMA)，發生在人類免疫系統將鼠類抗體識別為外源且對其進行攻擊時。HAMA反應可引起毒性休克或甚至死亡。
嵌合及人類化抗體藉由最小化所投與抗體之非人類部分來降低HAMA反應之可能性。此外，嵌合及人類化抗體可具有活化二級人類免疫反應(例如抗體依賴性細胞毒性)之額外益處。
完整抗體可具有一或多種「效應功能」，該等效應功能係指歸因於抗體之Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變異體Fc區)之彼等生物活性。抗體效應功能之實例包括C1q結合；補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)下調等。
端視完整抗體之重鏈之恆定結構域之胺基酸序列，完整抗體可指配給不同之「類別」。存在五大類完整抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等抗體中之若干可進一步分成「子類」 (同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及IgA2。對應於不同類別之抗體之重鏈恆定結構域分別稱為.α.、.δ.、.ε.、.γ.及.μ.。不同類別之免疫球蛋白之亞單位結構及三維構形為眾所周知。
有用的非免疫反應蛋白、多肽或肽抗體包括(但不限於)轉鐵蛋白、表皮生長因子(「EGF」)、鈴蟾素、胃泌素、胃泌素釋放肽、血小板源性生長因子、IL-2、IL-6、轉型生長因子(「TGF」) (例如TGF-.α.及TGF-.β.)、痘瘡生長因子(「VGF」)、胰島素及胰島素樣生長因子I及II、凝集素及來自低密度脂蛋白之缺輔基蛋白。
有用的多株抗體係衍生自經免疫動物血清之抗體分子之異質群體。可使用本領域眾所周知之各種程序來產生針對相關抗原之多株抗體。例如，為了產生多株抗體，可藉由注射相關抗原或其衍生物來免疫各種宿主動物，包括(但不限於)兔、小鼠、大鼠及豚鼠。端視宿主物種，可使用各種佐劑來增加免疫反應，包括(但不限於)弗氏佐劑(Freund's adjuvant) (完全及不完全)、礦物凝膠(例如氫氧化鋁)、表面活性物質(例如溶血卵磷脂)、普魯蘭尼克多元醇(pluronic polyol)、聚陰離子、肽、油性乳液、匙孔血藍蛋白、二硝基酚及潛在有用的人類佐劑(例如BCG (卡介苗))及細小棒狀桿菌。該等佐劑在本領域亦係眾所周知的。
有用的單株抗體係針對特定抗原決定簇(例如癌細胞抗原、病毒抗原、微生物抗原、蛋白質、肽、碳水化合物、化學品、核酸或其片段)之抗體之同質群體。針對相關抗原之單株抗體(mAb)可藉由使用本領域已知之任何技術來製備，該技術藉由培養物中之連續細胞系提供抗體分子之產生。該等技術包括(但不限於)最初由Kohler及Milstein闡述之雜交瘤技術(1975, Nature 256, 495-497)、人類B細胞雜交瘤技術(Kozbor等人，1983, Immunology Today 4:72)及EBV雜交瘤技術(Cole等人，1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.，第77-96頁)。該等抗體可具有任一免疫球蛋白類別，包括IgG、IgM、IgE、IgA及IgD及其任一子類。產生本揭示案中使用之mAb之雜交瘤可在活體外或活體內培養。
有用的單株抗體包括(但不限於)人類單株抗體、人類化單株抗體、抗體片段或嵌合人類-小鼠(或其他物種)單株抗體。人類單株抗體可藉由本領域已知之多種技術中之任一者(例如Teng等人，1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 7308-7312；Kozbor等人，1983, Immunology Today 4, 72-79；及Olsson等人，1982, Meth. Enzymol. 92, 3-16)製得。
抗體亦可為雙特異性抗體。用於製備雙特異性抗體之方法為本領域已知。全長雙特異性抗體之傳統產生係基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之共表現，其中兩條鏈具有不同的特異性(Milstein等人，1983, Nature 305:537-539)。由於免疫球蛋白重鏈及輕鏈之隨機分組，該等雜交瘤(四源雜交瘤)產生10種不同抗體分子之潛在混合物，其中僅一種具有正確的雙特異性結構。通常使用親和層析步驟來純化正確之分子，此相當麻煩，並且產物產率低。類似程序揭示於WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J. 10:3655-3659 (1991)中。
根據不同之方法，具有期望結合特異性(抗體-抗原組合位點)之抗體可變結構域融合至免疫球蛋白恆定結構域序列。融合可使用免疫球蛋白重鏈恆定結構域，包含鉸鏈區、CH2 區及CH3 區之至少一部分。第一重鏈恆定區(CH1 )可含有輕鏈結合所需之位點，存在於至少一種融合物中。將具有編碼免疫球蛋白重鏈融合物及(若需要)免疫球蛋白輕鏈之序列之核酸插入單獨表現載體中，且共轉染至合適之宿主生物體中。在實施例中，當用於構建之不相等比率之三條多肽鏈提供最佳產量時，此在調節三個多肽片段之相互比例方面提供很大之靈活性。然而，當至少兩條多肽鏈以相等之比率表現產生高產量時，或當該等比率不特別重要時，可在一個表現載體中插入兩條或所有三條多肽鏈之編碼序列。
雙特異性抗體可在一個臂中具有帶有第一結合特異性之雜合免疫球蛋白重鏈且在另一臂中具有雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)。此不對稱結構有助於自不期望之免疫球蛋白鏈組合分離期望之雙特異性化合物，此乃因在僅一半之雙特異性分子中存在免疫球蛋白輕鏈提供便捷的分離方式(WO 94/04690；Suresh等人，Methods in Enzymology, 1986, 121:210；Rodrigues等人，1993, J. of Immunology 151:6954-6961；Carter等人，1992, Bio/Technology 10:163-167；Carter等人，1995, J. of Hematotherapy 4:463-470；Merchant等人，1998, Nature Biotechnology 16:677-681)。使用該等技術，可製備雙特異性抗體以結合為ADC來治療或預防如本文所定義之疾病。
雜合或雙功能抗體可以生物(即藉由細胞融合技術)或化學(尤其用交聯劑或二硫橋形成試劑)方式衍生而來，並且可包含完整抗體或其片段(EP 105360；WO 83/03679；EP 217577)。
抗體可為免疫特異性結合至癌細胞抗原、病毒抗原或微生物抗原之抗體或結合至腫瘤細胞或基質之其他抗體之功能活性片段、衍生物或類似物。就此而言，「功能活性」意指片段、衍生物或類似物能夠引發抗抗個體基因型抗體，該等抗體所識別之抗原與衍生出片段、衍生物或類似物之抗體所識別之抗原相同。具體而言，在例示性實施例中，免疫球蛋白分子之個體基因型之抗原性可藉由缺失框架及CDR序列來增強，該等框架及CDR序列係特異性識別抗原之CDR序列之C末端。為了確定結合抗原之CDR序列，含有CDR序列之合成肽可藉由本領域已知之任何結合分析方法(例如BIA core分析)用於與抗原之結合分析(參見例如Kabat等人，1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，National Institute of Health, Bethesda, Md.；Kabat E等人，1980,J. of Immunology 125 (3):961-969)。
其他有用的抗體包括抗體片段，例如(但不限於) F(ab')2片段，其含有可變區、輕鏈恒定區及重鏈之CH1結構域(可藉由抗體分子之胃蛋白酶消化產生)，以及Fab片段，其可藉由還原F(ab')2片段之二硫橋產生。其他有用的抗體係抗體之重鏈及輕鏈二聚體，或其任何最小片段，例如Fv或單鏈抗體(SCA) (例如如美國專利第4,946,778號；Bird, 1988, Science 242:423-42；Huston等人，1988,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；及Ward等人，(1989)Nature 334:544-54中所述)或具有與抗體相同之特異性之任何其他分子。
此外，重組抗體(例如嵌合及人類化單株抗體，包含人類及非人類部分，可使用標準重組DNA技術製備)係有用的抗體。嵌合抗體係其中不同部分衍生自不同動物物種之分子，例如具有衍生自鼠類單株之可變區及人類免疫球蛋白恒定區之彼等分子。(參見例如Cabilly等人，美國專利第4,816,567號；及Boss等人，美國專利第4,816,397號)。人類化抗體係來自非人類物種之抗體分子，其具有來自非人類物種之一或多個互補決定區(CDR)及來自人類免疫球蛋白分子之框架區。(參見例如Queen，美國專利第5,585,089號)。該等嵌合及人類化單株抗體可藉由本領域已知之重組DNA技術，例如使用以下文獻中所述之方法產生：WO 87/02671；EP 184,187；EP 171496；EP 173494；WO 86/01533；美國專利第4,816,567號；EP 12023；Berter等人，1988, Science 240:1041-1043；Liu等人，1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443；Liu等人，1987, J. Immunol. 139:3521-3526；Sun等人，1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218；Nishimura等人，1987, Cancer. Res. 47:999-1005；Wood等人，1985, Nature 314:446-449；及Shaw等人，1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559；Morrison, 1985, Science 229:1202-1207；Oi等人，1986, BioTechniques 4: 214；美國專利第5,225,539號；Jones等人，1986, Nature 321 :552-525；Verhoeyan等人(1988) Science 239:1534；及Beidler等人，1988, J. Immunol. 141:4053-4060。
使用不能表現內源性免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因、但可表現人類重鏈及輕鏈基因之轉基因小鼠，可產生完整人類抗體。用所選抗原(例如本揭示案之多肽之全部或一部分)以正常方式免疫轉基因小鼠。可使用習用雜交瘤技術獲得針對抗原之單株抗體。轉基因小鼠攜帶之人類免疫球蛋白轉基因在B細胞分化期間重排，並隨後經受類別轉換及體細胞突變。因此，使用該技術，可產生治療上有用之IgG、IgA、IgM及IgE抗體。關於此產生人類抗體之技術之綜述參見Lonberg及Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93)。關於此產生人類抗體及人類單株抗體之技術及產生該等抗體之方案之詳細討論參見例如美國專利第5,625,126號；第5,633,425號；第5,569,825號；第5,661,016號；第5,545,806號。其他人類抗體可在市面上自例如Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.)及Genpharm (San Jose, Calif.)獲得。
可使用稱為「指導選擇」之技術來產生識別所選表位之完整人類抗體。在此方法中，使用所選非人類單株抗體(例如小鼠抗體)來指導識別相同表位之完整人類抗體之選擇。(Jespers等人(1994) Biotechnology 12:899-903)。人類抗體亦可使用本領域已知之多種技術(包括噬菌體展示文庫)產生(Hoogenboom及Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等人，J. Mol. Biol., 222:581 (1991))。
抗體可為抗體之融合蛋白或其功能活性片段，例如其中抗體經由共價鍵(例如肽鍵)在N末端或C末端與不為抗體之另一種蛋白質(或其部分，例如蛋白質之至少10個、20個或50個胺基酸部分)之胺基酸序列融合。抗體或其片段可在恒定結構域之N末端共價連接至另一種蛋白質。
抗體包括經修飾之類似物及衍生物，即藉由任何類型分子之共價連接，只要該共價連接允許抗體保持其抗原結合免疫特異性即可。例如(但不作為限制)，抗體之衍生物及類似物包括已經進一步修飾、例如藉由糖基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、藉由已知之保護/封阻基團衍生化、蛋白水解裂解、與細胞抗體單元或其他蛋白質之連接等修飾之彼等衍生物及類似物。許多化學修飾中之任一者皆可藉由已知技術進行，包括(但不限於)特定化學裂解、乙醯化、甲醯化、衣黴素(tunicamycin)存在下之代謝合成等。此外，類似物或衍生物可含有一或多種非天然胺基酸。
抗體藥物結合物中之抗體包括在與Fc受體相互作用之胺基酸殘基中具有修飾(例如取代、缺失或添加)之抗體。特定而言，抗體包括在鑒定為參與抗Fc結構域與FcRn受體之間之相互作用之胺基酸殘基中具有修飾之抗體(參見例如WO 97/34631)。對癌細胞抗原具有免疫特異性之抗體可在市面上例如自Genentech (San Francisco, Calif.)獲得或藉由熟習此項技術者已知之任何方法(例如化學合成或重組表現技術)產生。編碼對癌細胞抗原具有免疫特異性之抗體之核苷酸序列可例如自GenBank數據庫或類似數據庫、文獻出版物或藉由常規選殖及測序獲得。
ADC之抗體可為單株抗體，例如鼠類單株抗體、嵌合抗體或人類化抗體。抗體可為抗體片段，例如Fab片段。
已知用於治療或預防癌症之抗體可結合為ADC。對癌細胞抗原具有免疫特異性之抗體可在市面上獲得或藉由熟習此項技術者已知之任何方法(例如重組表現技術)產生。編碼對癌細胞抗原具有免疫特異性之抗體之核苷酸序列可例如自GenBank數據庫或類似數據庫、文獻出版物或藉由常規選殖及測序獲得。可用於治療癌症之抗體之實例包括(但不限於)人類化抗HER2單株抗體，用於治療轉移性乳癌患者；RITUXAN.RTM. (利妥昔單抗(rituximab); Genentech)，其係用於治療非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)患者之嵌合抗CD20單株抗體；OvaRex (AltaRex Corporation, MA)，其係用於治療卵巢癌之鼠類抗體；Panorex (Glaxo Wellcome, NC)，其係用於治療結腸直腸癌之鼠類IgG2a 抗體；西妥昔單抗(Cetuximab) Erbitux (Imclone Systems Inc., NY)，其係用於治療表皮生長因子陽性癌症(例如頭頸癌)之抗EGFR IgG嵌合抗體；Vitaxin (MedImmune, Inc., MD)，其係用於治療肉瘤之人類化抗體；Campath I/H (Leukosite, MA)，其係用於治療慢性淋巴球性白血病(CLL)之人類化IgG1 抗體；Smart MI95 (Protein Design Labs, Inc., CA)，其係用於治療急性骨髓性白血病(AML)之人類化抗CD33 IgG抗體；LymphoCide (Immunomedics, Inc., NJ)，其係用於治療非霍奇金氏淋巴瘤之人類化抗CD22 IgG抗體；Smart ID10 (Protein Design Labs, Inc., CA)，其係用於治療非霍奇金氏淋巴瘤之人類化抗HLA-DR抗體；Oncolym (Techniclone, Inc., CA)，其係用於治療非霍奇金氏淋巴瘤之放射性標記之鼠類抗HLA-Dr10抗體；Allomune (BioTransplant, CA)，其係用於治療霍奇金氏病或非霍奇金氏淋巴瘤之人類化抗CD2 mAb；Avastin (Genentech , Inc., CA)，其係用於治療肺癌及結腸直腸癌之抗VEGF人類化抗體；埃皮托珠單抗(Epratuzamab) (Immunomedics, Inc., NJ及Amgen, CA)，其係用於治療非霍奇金氏淋巴瘤之抗CD22抗體；及CEAcide (Immunomedics, NJ)，其係用於治療結腸直腸癌之人類化抗CEA抗體。
可用於治療癌症之其他抗體包括(但不限於)針對以下抗原之抗體：CA125 (卵巢癌)、CA15-3 (癌瘤)、CA19-9 (癌瘤)、L6 (癌瘤)、Lewis Y (癌瘤)、Lewis X (癌瘤)、甲胎蛋白(癌瘤)、CA 242 (結腸直腸癌)、胎盤鹼性磷酸酶(癌瘤)、前列腺特異性抗原(前列腺癌)、前列腺酸性磷酸酶(前列腺癌)、表皮生長因子(癌瘤)、MAGE-1 (癌瘤)、MAGE-2 (癌瘤)、MAGE-3 (癌瘤)、MAGE-4 (癌瘤)、抗轉鐵蛋白受體(癌瘤)、p97 (黑色素瘤)、MUC1-KLH (乳癌)、CEA (結腸直腸癌)、gp100 (黑色素瘤)、MART1 (黑色素瘤)、PSA (前列腺癌)、IL-2受體(T細胞白血病及淋巴瘤)、CD20 (非霍奇金氏淋巴瘤)、CD52 (白血病)、CD33 (白血病)、CD22 (淋巴瘤)、人類絨毛膜促性腺激素(癌瘤)、CD38 (多發性骨髓瘤)、CD40 (淋巴瘤)、黏蛋白(癌瘤)、P21 (癌瘤)、MPG (黑色素瘤)及Neu致癌基因產物(癌瘤)。一些有用的特異性抗體包括(但不限於) BR96 mAb (Trail, P. A.等人，Science (1993) 261, 212-215)、BR64 (Trail, P A等人，Cancer Research (1997) 57, 100-105)、針對CD40抗原之mAb (例如S2C6 mAb) (Francisco, J. A.等人，Cancer Res. (2000) 60:3225-3231)、針對CD70抗原之mAb (例如1F6 mAb)及針對CD30抗原之mAb (例如AC10) (Bowen, M. A.等人(1993) J. Immunol., 151:5896-5906；Wahl等人，2002 Cancer Res. 62 (13):3736-42)。可使用且已綜述結合至腫瘤相關抗原之許多其他內化抗體(Franke, A. E.等人，Cancer Biother Radiopharm. (2000) 15:459-76；Murray, J. L., (2000) Semin Oncol., 27:64-70；Breitling, F.及Dubel, S., Recombinant Antibodies, John Wiley, and Sons, New York, 1998)。
結合至與抗原呈遞細胞相關之抗原(例如CD40、OX40L、內皮因子、DEC-205、4-1BBL、CD36、CD36、CD204、MARCO、DC-SIGN、CLEC9A、CLEC5A、Dectin 2、CLEC10A、CD206、CD64、CD32A、CD1A、HVEM、CD32B、PD-L1、BDCA-2、XCR-1及CCR2)之抗體亦可結合為ADC。
已知用於治療或預防自體免疫病症之抗體可結合為ADC。自體免疫病症包括全身性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關節炎、休格倫氏症候群(Sjogren's syndrome)、免疫性血小板減少症及多發性硬化。對負責產生自體免疫抗體之細胞之抗原具有免疫特異性之抗體可藉由熟習此項技術者已知之任何方法(例如化學合成或重組表現技術)獲得。SLE係由過表現干擾素-α (IFN-.α.)細胞介素基因標記(Bennett等人(2003) Jour. Exp. Med. 197:711-723)。1型干擾素(IFN-.α./.β.)在狼瘡之發病機制中起重要作用(Santiago-Raber (2003) Jour. Exp. Med. 197:777-788)。基因敲除小鼠(-IFN-.α./.β.)顯示顯著減少之抗紅血球自體抗體、紅血球母細胞增多症、溶血性貧血、抗DNA自體、腎病及死亡率。該等結果表明，1型IFN介導鼠類狼瘡，且降低其在人類對應部分中之活性可能係有益的。結合至雙1,8萘二甲醯亞胺藥物部分之抗IFN Ab可為針對SLE及其他自體免疫病症之有效治療劑。
在另一實施例中，對治療自體免疫疾病具有免疫特異性之可用於ADC之抗體包括(但不限於)抗核抗體；抗ds DNA；抗ss DNA、抗心磷脂抗體IgM、IgG；抗磷脂抗體IgM、IgG；抗SM抗體；抗粒線體抗體；甲狀腺抗體；微粒體抗體；甲狀腺球蛋白抗體；抗SCL-70；抗Jo；抗U1 RNP；抗La/SSB；抗SSA；抗SSB；抗壁細胞抗體；抗組織蛋白；抗RNP；C-ANCA；P-ANCA；抗著絲粒；抗核仁纖維及抗GBM抗體。
ADC之抗體可結合至在活化淋巴球上表現之受體或受體複合物二者。受體或受體複合物可包括免疫球蛋白基因超家族成員、TNF受體超家族成員、整合素、細胞介素受體、趨化介素受體、主要組織相容性蛋白、凝集素或補體控制蛋白。合適之免疫球蛋白超家族成員之非限制性實例係CD2、CD3、CD4、CD8、CD 19、CD22、CD28、CD79、CD90、CD 152/CTLA-4、PD-1及ICOS。合適之TNF受體超家族成員之非限制性實例係CD27、CD40、CD95/Fas、CD134/OX40、CD137/4-1BB、TNF-R1、TNFR-2、RANK、TACI、BCMA、骨保護素、Apo2/TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4及APO-3。合適之整合素之非限制性實例係CD11a、CD11b、CD11c、CD18、CD29、CD41、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD 103及CD 104。合適之凝集素之非限制性實例係C型、S型及I型凝集素。
如本文所用之術語「病毒抗原」包括(但不限於)能夠引發免疫反應之任何病毒肽、多肽蛋白(例如HIV gp120、HIV nef、RSV F糖蛋白、流感病毒神經胺酸糖苷酶、流感病毒血球凝集素、HTLV tax、單純皰疹病毒糖蛋白(例如Gb、Gc、Gd及Ge)及B型肝炎表面抗原)。如本文所用之術語「微生物抗原」包括(但不限於)能夠引發免疫反應之任何微生物肽、多肽、蛋白質、糖、多糖或脂質分子(例如細菌、真菌、致病性原生動物或酵母多肽，包括例如LPS及莢膜多糖5/8)。
對病毒或微生物抗原具有免疫特異性之抗體可在市面上例如自BD Biosciences (San Francisco, Calif.)、Chemicon International, Inc. (Temecula, Calif.)或Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, Calif.)獲得或藉由熟習此項技術者已知之任何方法(例如化學合成或重組表現技術)產生。編碼對病毒或微生物抗原具有免疫特異性之抗體之核苷酸序列可例如自GenBank數據庫或類似數據庫、文獻出版物或藉由常規選殖及測序獲得。
在一些實施例中，可用於本ADC中之抗體係根據本文所揭示之方法治療或預防病毒或微生物感染之彼等抗體。可用於治療病毒感染或微生物感染之抗體之實例包括(但不限於) SYNAGIS (MedImmune, Inc., MD)，其係可用於治療RSV感染患者之人類化抗呼吸道融合病毒(RSV)單株抗體；PRO542 (Progenics)，其係可用於治療HIV感染之CD4融合抗體；OSTAVIR (Protein Design Labs, Inc., CA)，其係可用於治療B型肝炎病毒之人類抗體；PROTOVIR (Protein Design Labs, Inc., CA)，其係可用於治療巨細胞病毒(CMV)之人類化IgG抗體；及抗LPS抗體。
可用於ADC中來治療傳染病之其他抗體包括(但不限於)針對來自以下菌株之抗原之抗體：致病性細菌(釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrheae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、破傷風梭菌(Clostridium tetani)、流感嗜血桿菌(Hemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、歐氏克雷伯氏菌(Klebsiella ozaenas)、鼻硬結克雷伯氏菌(Klebsiella rhinoscleromotis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、霍亂弧菌(Vibrio colerae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、胎兒彎曲桿菌(弧菌) (Campylobacter (Vibrio) fetus)、嗜水產氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、蠟狀桿菌(Bacillus cereus)、緩慢愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)、小腸結腸炎耶氏桿菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶氏桿菌(Yersinia pestis)、假性結核病耶氏桿菌(Yersinia pseudotuberculosis)、痢疾志賀桿菌(Shigella dysenteriae)、副痢疾桿菌(Shigella flexneri)、宋內氏桿菌(Shigella sonnei)、鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhimurium)、梅毒螺旋體(Treponema pallidum)、細弱螺旋體(Treponema pertenue)、斑點病密螺旋體(Treponema carateneum)、包柔疏螺旋體(Borrelia vincentii)、博氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、出血性黃疸鉤端螺旋體(Leptospira icterohemorrhagiae)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、土倫病法蘭西斯氏菌(Francisella tularensis)、流產布氏桿菌(Brucella abortus)、豬布氏桿菌(Brucella suis)、地中海熱布氏桿菌(Brucella melitensis)、支原體屬(Mycoplasma spp.)、斑疹傷寒立克次體(Rickettsia prowazeki)、恙蟲熱立克次氏體(Rickettsia tsutsugumushi)、衣原體屬(Chlamydia spp.))；致病性真菌(粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、薰煙色麴菌(Aspergillus fumigatus)、白色念珠菌(Candida albicans)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、莢膜組織漿菌(Histoplasma capsulatum))；原生動物(溶組織內阿米巴(Entomoeba histolytica)、弓蟲(Toxoplasma gondii)、口腔毛滴蟲(Trichomonas tenas)、腸滴蟲(Trichomonas hominis)、陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)、甘比亞錐蟲(Tryoanosoma gambiense)、羅德西亞錐蟲(Trypanosoma rhodesiense)、庫氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、黑熱病利什曼原蟲(Leishmania donovani)、熱帶利什曼原蟲(Leishmania tropica)、巴西利什曼原蟲(Leishmania braziliensis)、肺胞囊蟲肺炎(Pneumocystis pneumonia)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、三日瘧原蟲(Plasmodium malaria))；或蠕蟲(Helminiths) (蠕形住腸蟯蟲(Enterobius vermicularis)、鞭形鞭蟲(Trichuris trichiura)、人蛔蟲(Ascaris lumbricoides)、旋毛線蟲(Trichinella spiralis)、糞類圓線蟲(Strongyloides stercoralis)、日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)、曼森血吸蟲(Schistosoma mansoni)、埃及血吸蟲(Schistosoma haematobium)及鉤蟲(hookworms))。
可用於ADC中來治療病毒性疾病之其他抗體包括(但不限於)針對致病性病毒之抗原之抗體，該等致病性病毒包括例如(但不限於)：痘病毒科(Poxviridae)、皰疹病毒科(Herpesviridae)、單純皰疹病毒1、單純皰疹病毒2、腺病毒科(Adenoviridae)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、腸病毒科(Enteroviridae)、小核醣核酸病毒屬(Picornaviridae)、細小病毒科(Parvoviridae)、呼腸病毒科(Reoviridae)、逆轉錄病毒科(Retroviridae)、流感病毒、副流感病毒、流行性腮腺炎、麻疹、呼吸道融合病毒、風疹、蟲媒病毒科(Arboviridae)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、E型肝炎病毒、非A型/非B型肝炎病毒、鼻病毒科(Rhinoviridae)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、輪狀病毒科(Rotoviridae)及人類免疫缺陷病毒。
術語「胺基酸序列變異體」係指胺基酸序列在某種程度上不同于天然序列多肽之多肽。通常，胺基酸序列變異體將具有與天然抗體之至少一個受體結合結構域或天然受體之至少一個配位體結合結構域至少約70%之序列一致性，且通常，其將與該等受體或配位體結合結構域之序列至少約80%、更通常至少約90%同源。胺基酸序列變異體在天然胺基酸序列之胺基酸序列內之某些位置具有取代、缺失及/或插入。胺基酸由習用名稱、一字母及三字母代碼來指定。
「序列一致性」定義為在比對序列並引入缺口(若需要)以達成最大序列一致性百分比後，在胺基酸序列變異體中相同殘基之百分比。用於比對之方法及電腦程式在本領域中係眾所周知的。一個該電腦程式係由Genentech , Inc.設計之「Align 2」，其於1991年12月10日在United States Copyright Office, Washington, D.C. 20559中提交了用戶文檔。
術語「Fc受體」或「FcR」用於闡述結合至抗體Fc區之受體。例示性FcR係天然序列人類FcR。此外，FcR可為結合IgG抗體之受體(γ受體)，並且包括Fc.γ.RI、Fc.γ.RII及Fc.γ.RIII子類受體，包括該等受體之對偶基因變異體及選擇性剪接形式。Fc.γ.RII受體包括Fc.γ.RIIA (「活化受體」)及Fc.γ.RIIB (「抑制受體」)，其具有相似之胺基酸序列，主要區別在於其胞質結構域。活化受體Fc.γ.RIIA在其胞質結構域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化基序(ITAM)。抑制受體Fc.γ.RIIB在其胞質結構域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基序(ITIM)。(參見綜述M. Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997))。FcR綜述於Ravetch及Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)；Capel等人，Immunomethods, 4:25-34 (1994)；及de Haas等人，J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995)。其他FcR (包括待將來鑒定之彼等FcR)涵蓋於本文之術語「FcR」。該術語亦包括新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人，J. Immunol., 117:587 (1976)及Kim等人，J. Immunol., 24:249 (1994))。
「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指分子在補體存在下溶解靶之能力。補體活化路徑係藉由使補體系統之第一組分(C1q)結合至與同源抗原複合之分子(例如抗體)來起始。為評價補體活化，可進行例如如Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)中所述之CDC分析。
「天然抗體」通常係約150,000道爾頓之異四聚糖蛋白，由兩條相同之輕(L)鏈及兩條相同之重(H)鏈組成。每條輕鏈藉由一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型之重鏈之間二硫鍵之數量不同。每條重鏈及輕鏈亦具有規則間隔之鏈內二硫橋。每條重鏈在一端具有可變結構域(VH)，其後係許多恒定結構域。每條輕鏈在一端具有可變結構域(VL)且在其另一端具有恒定結構域。輕鏈之恒定結構域與重鏈之第一恒定結構域對齊，且輕鏈可變結構域與重鏈之可變結構域對齊。認為特定之胺基酸殘基形成輕鏈與重鏈可變結構域之間之界面。
術語「可變」係指可變結構域之某些部分在抗體之間之序列上有很大不同並且用於每種特定抗體對其特定抗原之結合及特異性的事實。然而，可變性並不均勻地分佈在抗體之可變結構域中。其集中在輕鏈及重鏈可變結構域之稱為超變區之三個區段中。可變結構域中更高度保守之部分稱為框架區(FR)。天然重鏈及輕鏈之可變結構域各自包含四個FR，主要採用β-片構形，由三個超變區連接，該等超變區形成連接β-片結構且在一些情況下形成β-片結構之一部分的環。每條鏈中之超變區由FR緊密連接在一起，並且與另一條鏈中之超變區一起，有助於形成抗體之抗原結合位點(參見Kabat等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md.)。恒定結構域不直接參與抗體與抗原之結合，但展現各種效應功能，例如抗體參與抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
術語「超變區」在用於本文中時係指抗體中負責抗原結合之胺基酸殘基。超變區通常包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基(例如輕鏈可變結構域中之殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)及89-97 (L3)及重鏈可變結構域中之31-35 (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3)；Kabat等人，見上文)及/或來自「超變環」之彼等殘基(例如輕鏈可變結構域中之殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)及91-96 (L3)及重鏈可變結構域中之26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)；Chothia及Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196:901-917)。「框架區」或「FR」殘基係除如本文所定義之超變區殘基外之彼等可變結構域殘基。
抗體之木瓜蛋白酶消化產生兩個相同之抗原結合片段，稱為「Fab」片段，每個片段具有單個抗原結合位點；及殘餘「Fc」片段，其名稱反映了其容易結晶之能力。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原結合位點並且仍能夠交聯抗原之F(ab')2片段。
「Fv」係含有完全抗原識別及抗原結合位點之最小抗體片段。此區域由緊密、非共價締合之一個重鏈可變結構域及一個輕鏈可變結構域之二聚體組成。在此構形中，每個可變結構域之三個超變區相互作用以將抗原結合位點限定於VH-VL二聚體之表面上。該六個超變區共同賦予抗體抗原結合特異性。然而，即使單個可變結構域(或僅包含三個抗原特異性超變區之Fv之一半)亦具有識別及結合抗原之能力，但其親和力低於整個結合位點。
Fab片段亦含有輕鏈之恆定結構域及重鏈之第一恆定結構域(CH1)。Fab'片段與Fab片段之不同之處在於，在重鏈CH1結構域之羧基末端添加了少量殘基，包括來自抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸。Fab'-SH在本文中係Fab'之名稱，其中恒定結構域之半胱胺酸殘基帶有至少一個游離巰基。F(ab')2抗體片段最初係以成對Fab'片段之形式產生，該等成對Fab'片段之間具有鉸鏈半胱胺酸。抗體片段之其他化學偶合亦係已知的。
來自任何脊椎動物物種之抗體之「輕鏈」基於其恒定結構域之胺基酸序列可指配給兩種明顯不同之類型中之一者，稱為κ及λ。
「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體之VH及VL結構域，其中該等結構域存在於單個多肽鏈中。Fv多肽可進一步包含VH與VL結構域之間之多肽連接體，該多肽連接體使得scFv能夠形成抗原結合之期望結構。關於scFv之綜述參見Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編輯，Springer-Verlag, New York，第269-315頁(1994)。抗ErbB2抗體scFv片段闡述於WO 93/16185；美國專利第5,571,894號；及第5,587,458號中。
術語「雙價抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段在同一多肽鏈(VH-VL)中包含相互連接之可變重鏈結構域(VH)及可變輕鏈結構域(VL)。藉由使用太短而不能在同一條鏈上之兩個結構域之間配對之連接體，結構域被迫與另一條鏈之互補結構域配對並產生兩個抗原結合位點。雙價抗體更全面闡述於例如EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448中。
非人類(例如囓齒類動物)抗體之「人類化」形式係嵌合抗體，其含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列。人類化係將鼠類抗原結合資訊轉移至非免疫原性人類抗體受體之方法，並產生了許多治療上有用的藥物。人類化方法通常始於將所有六個鼠類互補決定區(CDR)轉移至人類抗體框架上(Jones等人，(1986) Nature 321:522-525)。該等CDR移植之抗體通常不能保持其對抗原結合之原有親和力，且事實上，親和力通常受到嚴重損害。除了CDR，亦必須納入選擇之非人類抗體框架殘基，以維持正確之CDR構形(Chothia等人(1989) Nature 342:877)。已顯示，將關鍵之小鼠框架殘基轉移至人類受體以支持移植CDR之結構構形會恢復抗原結合及親和力(Riechmann等人，(1992) J. Mol. Biol. 224, 487-499；Foote及Winter, (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499；Presta等人，(1993) J. Immunol. 151, 2623-2632；Werther等人，(1996) J. Immunol. Methods 157:4986-4995；及Presta等人(2001) Thromb. Haemost. 85:379-389)。在大多數情況下，人類化抗體係具有期望特異性、親和力及能力之人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者之超變區之殘基由來自非人類物種(供體抗體) (例如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)之超變區之殘基替代。在一些情況下，人類免疫球蛋白之框架區(FR)殘基由相應之非人類殘基替代。此外，人類化抗體可包含接受者抗體或供體抗體中未發現之殘基。進行該等修飾以進一步細化抗體性能。一般而言，人類化抗體將包含實質上所有之至少一個且通常兩個可變結構域，其中所有或實質上所有之超變環對應於非人類免疫球蛋白之超變環，並且所有或實質上所有之FR係人類免疫球蛋白序列之FR。人類化抗體亦視情況包含免疫球蛋白恒定區(Fc)之至少一部分，通常係人類免疫球蛋白之恒定區。關於更多細節參見美國專利第6,407,213號；Jones等人(1986) Nature, 321:522-525；Riechmann等人(1988) Nature 332:323-329；及Presta, (1992) Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596。
「親代抗體」係包含其中一或多個胺基酸殘基由一或多個半胱胺酸殘基替代之胺基酸序列之抗體。親代抗體可包含天然或野生型序列。相對于抗體之其他天然、野生型或修飾形式，親代抗體可具有預先存在之胺基酸序列修飾(例如添加、缺失及/或取代)。親代抗體係針對相關靶抗原。亦涵蓋針對非多肽抗原(例如腫瘤相關糖脂抗原；參見美國專利第5,091,178號)之抗體。
「分離之」抗體係已經自其天然環境之組分中鑒定並分離及/或回收之抗體。其天然環境之污染物組分係會干擾抗體之診斷或治療用途之物質，且可能包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在某些實施例中，將抗體純化(1)至大於95重量%之抗體(如藉由Lowry方法測定)，或大於99重量%，(2)至足以藉由使用氣相蛋白質測序儀獲得至少15個N末端或內部胺基酸序列殘基之程度，或(3)在使用考馬斯藍(Coomassie blue)或銀染色之還原或非還原條件下，藉由SDS-PAGE達到同質性。分離之抗體包括重組細胞內之原位抗體，此乃因抗體之天然環境之至少一種組分不存在。然而，通常，分離之抗體將藉由至少一個純化步驟來製備。
「結合」相關分子靶或抗原之抗體係能夠以足夠之親和力結合該抗原之抗體，使得該抗體可用于靶向表現該抗原之細胞。
術語「治療(treat)」或「治療(treatment)」係指治療性治療及防護性或預防性措施，其中目標係預防或減緩(減輕)不期望之生理變化或病症，例如癌症之發展或擴散。出於本揭示案之目的，有益或期望之臨床結果包括(但不限於)症狀之緩和、疾病程度之減輕、疾病狀態之穩定(即不惡化)、疾病進展之延遲或減緩、疾病狀態之改善或緩解以及減退(無論係部分抑或全部)，無論係可偵測到的抑或不可偵測到的。「治療」亦可意指與未接受治療情況下之預期存活期相比，延長存活期。需要治療之人包括已經患有疾患或病症之人，以及易患疾患或病症之人，或需要預防疾患或病症之人。
「噬菌體展示」係一種技術，藉由該技術，變異體多肽以與外殼蛋白之融合蛋白之形式展示在噬菌體(例如絲狀噬菌體)顆粒表面上。噬菌體展示之一個用途在於以下事實：針對以高親和力結合至靶分子之彼等序列，可快速有效地對隨機化蛋白質變異體之大文庫進行分選。在噬菌體上展示肽及蛋白質文庫已用於篩選數百萬種多肽，以尋找具有特異性結合性質之多肽。多價噬菌體展示方法已經用於展示小隨機肽及小蛋白質，通常經由融合至絲狀噬菌體之PIII或PVIII。Wells及Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol., 3:355-362 (1992)及其中引用之參考文獻。在單價噬菌體展示中，蛋白質或肽文庫融合至噬菌體外殼蛋白或其一部分，並在野生型蛋白存在下以低水準表現。相對於多價噬菌體，親合力效應降低，以使得分選係基於固有之配位體親和力，並且使用噬菌粒載體，此簡化了DNA操作。Lowman及Wells, Methods: A companion to Methods in Enzymology, 3:205-0216 (1991)。噬菌體展示包括產生抗體樣分子之技術(Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology，第5版，Garland Publishing, New York，第627-628頁)。
「噬菌粒」係質體載體，其具有細菌複製起點(例如Co1E1)以及噬細菌體之基因間區域之拷貝。噬菌粒可用於任何已知之噬細菌體，包括絲狀噬細菌體及人字形噬細菌體。質體通常亦含有抗生素抗性之選擇性標記物。選殖至該等載體中之DNA區段可隨著質體繁殖。當攜帶該等載體之細胞提供有產生噬菌體顆粒所必需之所有基因時，質體之複製模式變為滾環複製，以產生質體DNA之一條鏈之拷貝並包裝噬菌體顆粒。噬菌粒可形成感染性或非感染性噬菌體顆粒。此術語包括含有噬菌體外殼蛋白基因或其片段之噬菌粒，該噬菌體外殼蛋白基因或其片段作為基因融合物連接至異源多肽基因，使得異源多肽展示在噬菌體顆粒之表面上。本文所述之化合物可呈醫藥學上或醫藥學上可接受之鹽形式。在一些實施例中，該等鹽衍生自無機或有機酸或鹼。關於合適之鹽之綜述參見例如Berge等人，J. Pharm. Sci .,1977 ,66 , 1-19及Remington: The Science and Practice of Pharmacy ，第20版，A. Gennaro (編輯), Lippincott Williams & Wilkins (2000)。
在本揭示案中，基團「Ab」 (即抗體、抗體片段及/或抗原片段)可結合至一個以上之含藥物部分。在一些實施例中，「Ab」可結合至1至20個含藥物部分。在一些實施例中，「Ab」可結合至1至10個含藥物部分。在一些實施例中，「Ab」可結合至1至5個含藥物部分。在一些實施例中，「Ab」可結合至1或2個含藥物部分。在一些實施例中，「Ab」可結合至一個含藥物部分。
本文所述之化合物可呈醫藥學上或醫藥學上可接受之鹽形式。在一些實施例中，該等鹽衍生自無機或有機酸或鹼。關於合適之鹽之綜述參見例如Berge等人，J. Pharm. Sci .,1977 ,66 , 1-19及Remington: The Science and Practice of Pharmacy ，第20版，A. Gennaro (編輯), Lippincott Williams & Wilkins (2000)。
合適之酸加成鹽之實例包括乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、葡糖庚酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酯酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基-丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽及十一烷酸鹽。
合適之鹼加成鹽之實例包括銨鹽；鹼金屬鹽，例如鈉鹽及鉀鹽；鹼土金屬鹽，例如鈣鹽及鎂鹽；有機鹼鹽，例如二環己胺鹽、N -甲基-D-葡萄糖胺；及胺基酸鹽，例如精胺酸鹽、離胺酸鹽及諸如此類。
例如，Berge列示出下列經FDA批准之市售鹽：陰離子乙酸鹽、苯磺酸鹽(besylate、benzenesulfonate)、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、酒石酸氫鹽、溴化物、依地酸鈣(乙二胺四乙酸鹽)、樟腦磺酸鹽(camsylate、camphorsulfonate)、碳酸鹽、氯化物、檸檬酸鹽、二鹽酸鹽、依地酸鹽(乙二胺四乙酸鹽)、乙二磺酸鹽(1,2-乙二磺酸鹽)、依託酸鹽(月桂基硫酸鹽)、乙磺酸鹽(esylate、ethanesulfonate)、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽(gluceptate、glucoheptonate)、葡萄糖酸鹽、麩胺酸鹽、對羥乙醯胺基苯胂酸鹽(glycollylarsanilate、glycollamidophenylarsonate)、己基間苯二酚鹽、哈胺(N,N' -二(去氫樅酸基)乙二胺)、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、羥基萘酸鹽、碘化物、羥乙磺酸鹽(2-羥基乙磺酸鹽)、乳酸鹽、乳糖酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、杏仁酸鹽、甲磺酸鹽(mesylate、methanesulfonate)、甲基溴化物、甲基硝酸鹽、甲基硫酸鹽、黏酸鹽、萘磺酸鹽(2-萘磺酸鹽)、硝酸鹽、雙羥萘酸鹽(pamoate、embonate)、泛酸鹽、磷酸鹽/二磷酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、柳酸鹽、硬脂酸鹽、次乙酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、鞣酸鹽、酒石酸鹽、茶氯酸鹽(8-氯茶鹼)及三乙基碘化物；有機陽離子苄星鹽(N,N′ -二苄基乙二胺)、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N -甲基葡糖胺)及普魯卡因；及金屬陽離子鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉及鋅。
Berge另外列示出下列非FDA批准之市售(在美國以外)鹽：陰離子己二酸鹽、藻酸鹽、胺基柳酸鹽、無水亞甲基檸檬酸鹽、檳榔鹼、天冬胺酸鹽、硫酸氫鹽、丁基溴化物、樟腦酸鹽、二葡萄糖酸鹽、二氫溴化物、二琥珀酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、氫氟酸鹽、氫碘酸鹽、亞甲基雙(柳酸鹽)、萘二磺酸鹽(1,5-萘二磺酸鹽)、草酸鹽、果膠酯酸鹽、過硫酸鹽、苯基乙基巴比妥酸鹽、苦味酸鹽、丙酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽及十一烷酸鹽；有機陽離子苯乙苄胺(N -苄基苯乙胺)、克立咪唑(clemizole)(1-對-氯苄基-2-吡咯啶-1'-基甲基苯并咪唑)、二乙胺、六氫吡嗪及胺丁三醇(叁(羥基甲基)胺基甲烷)；及金屬陽離子鋇及鉍。
本文所述之化合物亦可包含合適之載劑、賦形劑及助劑，其可端視投與模式而不同。
在一些實施例中，醫藥組合物可配製成合適之非經腸劑型。該等製劑可藉由本領域已知之各種方法製備。醫藥組合物可直接投與至血流中、肌肉中或直接投與至器官中。適於非經腸投與之方式包括靜脈內、動脈內、腹膜內、鞘內、腦室內、尿道內、胸骨內、顱內、肌內及皮下。適於非經腸投與之裝置包括針式注射器、無針注射器及輸注技術。
非經腸組合物通常係水溶液，其可含有賦形劑，例如鹽、碳水化合物及緩沖劑。然而，該組合物亦可配製成無菌非水溶液或乾燥形式，與合適之媒劑(例如無菌無熱原水)結合使用。
使用熟習此項技術者熟知之標準技術，可容易地在無菌條件下、例如藉由凍乾來製備非經腸組合物。
非經腸投與之組合物可配製成立即釋放及/或改質釋放。改質釋放製劑包括延遲釋放、持續釋放、脈衝釋放、控制釋放、靶向釋放及程式釋放。因此，該等組合物可配製成固體、半固體或觸變液體，作為植入之貯庫投與，從而提供活性劑之改質釋放。
非經腸製劑可與非經腸劑型中使用之其他合適之醫藥學上可接受之賦形劑混合，例如(但不限於)防腐劑。
在另一實施例中，醫藥組合物可配製成合適之口服劑型，例如錠劑、膠囊、粉劑、丸劑、混懸劑、溶液、乳液及諸如此類。可存在其他合適之載劑，例如崩解劑、稀釋劑、螯合劑、黏合劑、助流劑、潤滑劑、填充劑、增積劑、抗黏劑及諸如此類。
口服劑量製劑亦可含有其他合適之醫藥賦形劑，例如甜味劑、媒劑/潤濕劑、著色劑、矯味劑、防腐劑、增黏劑/增稠劑及諸如此類。
本揭示案之醫藥組合物之劑量可針對個別患者進行調整。 脂質結合物
在某些實施例中，本揭示案提供式(VI)化合物，
Figure 02_image106
(VI)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： a係1至20之整數； m係0、1、2、3或4； n係0或1； D-NH-係胺基取代之化合物之一部分，其中胺基取代之化合物具有式D-NH2 ； 每一R1 係獨立地選自C1 -C4 烷基、O-C1 -C4 烷基及鹵素； R2 係選自C1 -C4 烷基及-(CH2 CH2 O)s -CH3 ；其中s係1至10之整數； R3 及R3’ 係各自獨立地選自氫及C1 -C3 烷基； L係可裂解連接體；且 LP係脂質。
在一些實施例中，D-NH2 係STING調節劑。在一些實施例中，D-NH2係環狀二核苷酸(CDN)或CDN樣化合物。在一些實施例中，D-NH2 係本文所述式中之一者。
在某些實施例中，本揭示案提供式(VI)化合物，其中L具有下式
Figure 02_image003
； 其中W、Z、t、U、Q及U’係如本文所述。
在一些實施例中，式(VI)化合物與脂質複合物締合。術語「脂質複合物」係醫藥化合物製備中公認之術語。脂質複合物之特徵在於脂質與式(VI)化合物之間之非共價鍵合。不受特定理論之約束，式(VI)化合物可經由靜電相互作用、親水相互作用、疏水相互作用或其任一組合與脂質複合物締合。
在一些實施例中，本文所述之脂質複合物採取脂質顆粒之形式。在一個實施例中，複合物呈脂質奈米顆粒之形式。在一個實施例中，複合物呈脂質體之形式。在一些實施例中，本揭示案之脂質體包括脂質單層或脂質多層。在一些實施例中，脂質體包括脂質雙層及水性核心。在一些實施例中，脂質體之平均粒徑為約5 nm至約1 µm。在一些實施例中，脂質奈米顆粒或脂質體之平均粒徑為約5 nm至約500 nm、約10 nm至約150 nm及約30 nm至約100 nm。在一些實施例中，式(V)化合物駐留於水性核心、脂質雙層或其組合中。
在某些實施例中，LP可為膽固醇或磷脂。在一些實施例中，LP係磷脂。在一些實施例中，磷脂係選自磷脂醯膽鹼、磷脂醯甘油、磷脂酸、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、大豆磷脂及蛋黃磷脂。在一些實施例中，磷脂係磷脂醯乙醇胺。在一些實施例中，磷脂係1,2-二硬脂醯基-sn -甘油-3-磷酸乙醇胺。
在一些實施例中，在一些實施例中，本揭示案提供包含式(VI)化合物之脂質複合物。在一些實施例中，脂質複合物可為脂質體。
在一些實施例中，脂質複合物包含約0.5莫耳%至約40莫耳%之式(VI)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，脂質複合物包含約1莫耳%至約35莫耳%之式(VI)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，脂質複合物包含約1莫耳%至約30莫耳%之式(VI)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，脂質複合物包含約1莫耳%至約20莫耳%之式(VI)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，脂質複合物包含約1莫耳%至約15莫耳%之式(VI)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，脂質複合物進一步包含一或多種額外磷脂。在一些實施例中，磷脂係選自磷脂醯膽鹼、磷脂醯甘油、磷脂酸、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、鞘磷脂、大豆磷脂及蛋黃磷脂。
在一些實施例中，脂質複合物包含約30莫耳%至約90莫耳%之一或多種磷脂。在一些實施例中，脂質複合物包含約40莫耳%至約85莫耳%之一或多種磷脂。在一些實施例中，脂質複合物包含約50莫耳%至約80莫耳%之一或多種磷脂。
在一些實施例中，脂質複合物進一步包含脂肪醇或膽固醇。在一些實施例中，脂質複合物包含約5莫耳%至約35莫耳%之膽固醇。在一些實施例中，脂質複合物包含約5莫耳%至約30莫耳%之膽固醇。在一些實施例中，脂質複合物包含約5莫耳%至約25莫耳%之膽固醇。
在一些實施例中，脂質複合物進一步包含至少一種聚乙二醇化磷脂。在一些實施例中，至少一種聚乙二醇化脂質係聚乙二醇化磷脂。在一些實施例中，聚乙二醇化磷脂係選自N-(羰基-甲氧基聚乙二醇5000)-1,2-二硬脂醯基-sn -甘油-3-磷酸乙醇胺、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂醯基-sn -甘油-3-磷酸乙醇胺、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二棕櫚醯基-sn -甘油-3-磷酸乙醇胺、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇5000)-1,2-二棕櫚醯基-sn -甘油-3-磷酸乙醇胺、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二肉豆蔻醯基-sn -甘油-3-磷酸乙醇胺、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇5000)-1,2-二肉豆蔻醯基-sn -甘油-3-磷酸乙醇胺、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-二硬脂醯基-rac -甘油及N-(羰基-甲氧基聚乙二醇5000)-二硬脂醯基-rac -甘油、其醫藥學上可接受之鹽或其混合物。在一些實施例中，聚乙二醇化磷脂係N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂醯基-sn -甘油-3-磷酸乙醇胺。
在一些實施例中，脂質複合物包含約0至約6莫耳%之一或多種聚乙二醇化磷脂。在一些實施例中，脂質複合物包含約0.5莫耳%及5莫耳%之一或多種聚乙二醇化磷脂。在一些實施例中，脂質複合物包含約1莫耳%及5莫耳%之一或多種聚乙二醇化磷脂。在一些實施例中，脂質複合物包含約3莫耳%之一或多種聚乙二醇化磷脂。在一些實施例中，脂質複合物包含約4莫耳%之一或多種聚乙二醇化磷脂。在一些實施例中，脂質複合物包含約5莫耳%之一或多種聚乙二醇化磷脂。 化合物及組合物之使用方法
本文所述之某些化合物係STING促效劑且因此可用於刺激其個體中之免疫反應。組合物可用於治療病毒。
本揭示案之化合物顯示STING調節/促效活性。本揭示案之某些化合物在功效表現、藥代動力學(例如吸收、分佈、代謝、排泄)、溶解性(例如水溶性)、與其他藥物之相互作用(例如藥物代謝酶抑制作用)、安全性(例如急性毒性、慢性毒性、遺傳毒性、生殖毒性、心臟毒性、致癌性、中樞毒性)及/或穩定性(例如化學穩定性、對酶之穩定性)方面可為優異的，並且可用作藥物。
本揭示案之化合物可用於增加哺乳動物(例如小鼠、大鼠、倉鼠、兔、貓、狗、牛、綿羊、猴、人類)中之STING活性。
本揭示案之化合物可用作藥物，例如用於防護或治療可受STING影響之疾病(在本說明書中，有時縮寫為「STING相關疾病」)之劑，該等疾病係例如癌症，例如結腸直腸癌(例如結腸直腸癌、直腸癌、肛門癌、家族性結腸直腸癌、遺傳性非息肉性結腸直腸癌、胃腸間質瘤)、肺癌(例如非小細胞肺癌、小細胞肺癌、惡性間皮瘤)、間皮瘤、胰髒癌(例如胰髒導管癌、胰髒內分泌腫瘤)、咽癌、喉癌、食道癌、胃癌(例如乳頭狀腺癌、黏液腺癌、腺鱗狀癌)、十二指腸癌、小腸癌、乳癌(例如浸潤性導管癌、非浸潤性導管癌、發炎性乳癌)、卵巢癌(例如卵巢上皮癌、性腺外生殖細胞瘤、卵巢生殖細胞瘤、卵巢低惡性潛能腫瘤)、睪丸腫瘤、前列腺癌(例如激素依賴性前列腺癌、非激素依賴性前列腺癌、去勢抗性前列腺癌)、肝癌(例如肝細胞癌、原發性肝癌、肝外膽管癌)、甲狀腺癌(例如甲狀腺髓質癌)、腎癌(例如腎細胞癌(例如透明細胞腎細胞癌)、腎盂及輸尿管之移行細胞癌)、子宮癌(例如子宮頸癌、子宮體癌、子宮肉瘤)、妊娠絨毛膜癌、腦腫瘤(例如髓母細胞瘤、神經膠質瘤、松果體星形細胞瘤、毛細胞星形細胞瘤、瀰漫性星形細胞瘤、間變性星形細胞瘤、垂體腺瘤)、視網膜母細胞瘤、皮膚癌(例如基底細胞瘤、惡性黑色素瘤)、肉瘤(例如橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、軟組織肉瘤、梭形細胞肉瘤)、惡性骨腫瘤、膀胱癌、血癌(例如多發性骨髓瘤、白血病(例如急性骨髓性白血病)、惡性淋巴瘤、霍奇金氏病、慢性骨髓增生性疾病)、不明原發性癌症；癌症生長抑制劑；癌症轉移抑制劑；細胞凋亡促進劑；用於治療癌前病灶(例如骨髓增生異常症候群)之劑；及諸如此類。
在某些實施例中，本揭示案之化合物可用作結腸直腸癌、乳癌、皮膚癌、惡性淋巴瘤或肺癌之藥物。
此外，本揭示案之化合物或本揭示案之組合劑可與非藥物療法同時使用。確切而言，本揭示案之化合物或本揭示案之組合劑可與諸如以下之非藥物療法組合：(1)手術，(2)使用血管緊張素II等之高血壓化學療法，(3)基因療法，(4)熱療，(5)冷凍療法，(6)雷射燒灼及(7)放射療法。
例如，藉由在上文所提及手術及諸如此類之前或之後，或在其中兩種或三種之組合治療之前或之後使用本揭示案之化合物，可提供諸如預防抗性出現、延長無疾病存活期、抑制癌症轉移或復發、延長壽命及諸如此類之效果。
此外，可將用本揭示案之化合物或本揭示案之組合劑進行之治療與支持療法組合：(i)針對各種傳染病之併發症投與抗生素(例如β-內醯胺型，例如泛孢菌素(pansporin)及諸如此類；大環內酯型，例如克拉黴素(clarithromycin)及諸如此類)，(ii)投與高熱量輸液、胺基酸製劑或一般維生素製劑以改善營養不良，(iii)投與嗎啡以減輕疼痛，(iv)投與用於改善副作用(例如惡心、嘔吐、厭食、腹瀉、白細胞減少、血小板減少、血紅蛋白濃度降低、脫髮、肝病、腎病、DIC、發熱及諸如此類)之醫藥劑，及(v)投與用於抑制癌症及諸如此類之多重抗藥性之醫藥劑。 實例 一般合成方法及中間體
本揭示案之化合物可由熟習此項技術者根據本揭示案及本領域之知識，及/或藉由參考下文所示之方案及合成實例來製備。例示性合成途徑闡述於下文方案及實例中。應理解，在下文方案及實例中出現之變量(例如「R」基團)應獨立於在本申請之其他地方出現之變量來閱讀。熟習此項技術者將容易理解下文所示之方案及實例說明本文所述化合物之製備之方式。 方案1：將羧酸轉化成相應醯氯或(異丁基碳酸)丙酸酐之一般途徑
Figure 02_image149
方案1顯示將羧酸i 活化成相應醯氯或(異丁基碳酸)丙酸酐(例如ii )之一般途徑，其中Yc係烷基或芳族鏈，R6 係甲基或含聚醚之烷基鏈。ii (其中E係OCO2 CH2 CH(CH3 )2 )之製備可藉由在鹼存在下用氯甲酸異丁基酯處理i 來達成。當E係Cl時，ii 之形成藉由用草醯氯或用Ghosez試劑處理i 來達成(參見α-Chloro enamines, reactive intermediates for synthesis: 1-Chloro-N,N,2-trimethylpropenylamine. Haveaux B.等人，Org. Synth. 1980,59 , 26。) 方案2：使用逐步方法將間隔體連接至藥物部分中之胺基之一般途徑
Figure 02_image150
方案2顯示將間隔體(例如ii )連接至藥物部分(例如iii )中之胺基之一般方法。在化合物iii 藉由用三甲基氯矽烷及吡啶處理經歷全矽基保護後，使其與活化間隔體ii 反應。用NEt3 -3HF去除矽基獲得iv 。藉由用酸(例如TFA或HCl)處理來完成iv 之胺之去保護，且用活化二肽碳酸酯v 處理所得胺鹽以提供vi 。 方案3：使用逐步方法將間隔體連接至藥物部分中之胺基之一般途徑
Figure 02_image152
方案3顯示將間隔體(例如ii )連接至藥物部分(例如iii-a )中之胺基之一般方法，其中X1 及X2 係氧、硫或CH2 ，X3 係氮或CH，R3 係氫或氟，R4 係羥基、氫、氟或與R3 一起形成OCH2 ，Rc 係OH或SH，Rd 係甲基或(CH2 )3 NHC(O)NH2 。在化合物iii-a 藉由用三甲基氯矽烷及吡啶處理經歷全矽基保護後，使其與活化間隔體ii 反應。用NEt3 -3HF去除矽基獲得iv-a 。藉由用酸(例如TFA或HCl)處理來完成iv-a 之胺之去保護，且用活化二肽碳酸酯v 處理所得胺鹽以提供vi-a 。 方案4：使用逐步方法將間隔體連接至藥物部分中之胺基之一般途徑
Figure 02_image154
方案4顯示遵循方案3中所述之一般方法將間隔體基團(例如ii )連接至藥物部分(例如iii-b )中之胺基之一般方法。 方案5：產生間隔體肽醯氯之一般途徑
Figure 02_image156
方案5顯示製備醯氯viii 之一般方法。使用酸(例如TFA或HCl)對Boc-胺i 去保護後，用活化碳酸酯v 處理以獲得羧酸vii 。可藉由用草醯氯或磺醯氯處理將vii 轉化成醯氯viii 。 方案6：將間隔體連接至藥物部分中之胺基之替代性一般途徑
Figure 02_image158
方案6顯示將酬載iii 直接轉化成化合物ix 之替代性一般方法。在用三甲基氯矽烷進行全矽基保護後，用醯氯viii 處理iii 。去除矽基獲得ix 。 方案7：將間隔體連接至藥物部分中之胺基之替代性一般途徑
Figure 02_image160
方案7顯示遵循方案6中所述之一般方法將酬載iii-a 直接轉化成化合物ix-a 之替代性一般方法。 方案8：將間隔體連接至藥物部分中之胺基之替代性一般途徑
Figure 02_image162
方案8顯示遵循方案6中所述之一般方法將間隔體連接至藥物部分(例如iii-b )中之胺基之替代性一般方法。 方案9：製備連接體-酬載之一般途徑
Figure 02_image164
方案9顯示自vi 製備連接體-酬載xi 之一般方法，其中Yd係直鏈或具支鏈烷基鏈或聚醚鏈，且Z係諸如馬來醯亞胺、BCN或DBCO之結合柄。用酸(例如TFA或HCl)對vi 之胺去保護後與活化酯x 反應以獲得連接體-酬載xi 。 方案10：製備連接體-酬載之一般途徑
Figure 02_image166
方案10顯示遵循方案9中所述之一般方法自vi-a 製備連接體-酬載xi-a 之一般方法。 方案11：製備連接體-酬載之一般途徑
Figure 02_image168
方案11顯示遵循方案9中所述之一般方法將結合柄連接至化合物(例如vi-b )之一般方法。 方案12：製備連接體-酬載之一般途徑
Figure 02_image170
方案12顯示自iv 製備連接體-酬載xi 之替代性方法。用酸(例如TFA或HCl)對iv 之胺去保護後與xii 反應以提供xi 。 方案13：製備連接體-酬載之一般途徑
Figure 02_image172
方案13顯示遵循方案12中所述之一般方法自iv-a 製備連接體-酬載xi-a 之替代性方法。 方案14：製備連接體-酬載之一般途徑
Figure 02_image174
方案14顯示製備含葡糖醛酸酯之連接體酬載xvi 之一般方法。用酸(例如TFA或HCl)對iv 之胺去保護後與活化碳酸酯xiii 反應以獲得xiv 。用鹼(例如氫氧化鋰)進行全乙酸酯水解並去除xiv 中之FMOC基團獲得xv 。用活化結合柄x 處理xv 提供含葡糖醛酸酯之連接體酬載xvi 。 方案15：製備連接體-酬載之一般途徑
Figure 02_image176
方案15顯示遵循方案14中所述之一般方法製備含葡糖醛酸酯之連接體酬載xvi-a 之一般方法。 方案16：製備連接體-酬載之一般途徑
Figure 02_image178
方案16顯示製備含末端胺之連接體酬載xviii 之一般方法，其中Ye係直鏈烷基鏈或含聚醚之烷基鏈。用酸(例如TFA或HCl)對vi 之胺去保護後與活化結合柄xvii 反應。用酸(例如TFA)去除末端保護基團提供含末端胺之連接體酬載xviii 。 方案17：製備連接體-酬載之一般途徑
Figure 02_image180
方案17顯示遵循方案16中所述之一般方法製備含末端胺之連接體酬載xviii-a 之一般方法。 方案18：製備連接體-酬載之一般途徑
Figure 02_image182
方案18顯示製備納入二肽間隔體之連接體酬載(例如xxii )之一般方法，其中R7 係氫、烷基或芳族部分。藉由用三甲基氯矽烷及吡啶處理對化合物iii 全保護，然後用Boc-脯胺酸琥珀醯亞胺酯處理。用氟化物源(例如NEt3 -3HF)去除矽基獲得xix 。用酸(例如TFA或HCl)對xix 之胺去保護後與琥珀醯亞胺酯活化胺基酸xx 反應以獲得xxi 。用酸(例如TFA或HCl)對xxi 之胺去保護後安裝馬來醯亞胺柄以提供連接體酬載xxii 。 方案19：製備連接體-酬載之一般途徑
Figure 02_image184
方案19顯示遵循方案18中所述之一般方法製備連接體酬載(例如xxii-a )之一般方法。 實例 例示性ADC及中間體之製備 定義
AA    使用乙酸銨之LCMS方法
Ac    乙酸鹽
ACN    乙腈
atm    大氣壓
aq    水性
BCN    二環[6.1.0]壬炔
BLQ    低於定量限值
Bn    苄基
Boc    第三丁氧基羰基
t Bu    第三丁基
Bz    苯甲醯基
C    攝氏度
calcd    計算值
Cbz    苄基氧基羰基
DAR    藥物抗體比
DBCO    二苯并環辛炔
DCC    N,N- 二環己基碳化二亞胺
DCM    二氯甲烷
DIPEA    N,N- 二異丙基乙胺
DMAP    4-二甲基胺基吡啶
DMA    N,N -二甲基乙醯胺
DMB    2,4-二甲氧基苄基
DMF    N,N -二甲基甲醯胺
DMSO    二甲基亞砜
DTT    二硫蘇糖醇
ε    消光係數
E 0.1%    0.1%溶液消光係數
EDC    1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺
EDTA    乙二胺四乙酸
Et    乙基
EtOH    乙醇
EtOAc    乙酸乙酯
FA    使用甲酸之LCMS方法
Fmoc    茀基甲基氧基羰基
h    小時
HATU    1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-1H -1,2,3-三唑并[4,5-b ]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸鹽
HIC    疏水相互作用層析
HOAt    1-羥基-7-氮雜苯并三唑
HPLC    高壓液相層析
HRMS    高解析度質譜
IC50    50%抑制濃度
LC    液相層析
LCMS    液相層析質譜
m/z 質荷比
MHz    兆赫茲
Me    甲基
MeOH    甲醇
μM    微米
min    分鐘
mL    毫升
MS    質譜
MWCO    分子量截止值
NMR    核磁共振
PBS    磷酸鹽緩衝鹽水
PE    石油醚
Ph    苯基
psi    磅/平方英吋
psig    磅/平方英吋表壓
Pyr    吡啶
QTOF    四極飛行時間
rt    室溫
SEC    粒徑排阻層析
SFC    超臨界流體層析
TBS    第三丁基二甲基矽基
TCEP    (叁(2-羧乙基)膦)
TEA    三乙胺
TFA    三氟乙酸
THF    四氫呋喃
TIPS    三異丙基矽基
TMS    三甲基矽基
Tris    叁(羥基甲基)胺基甲烷
UPLC    超高效液相層析
分析方法 NMR條件：
除非另有說明，否則1 H NMR譜係在400 MHz Bruker譜儀上獲取。除非另有說明，否則31 P NMR譜係在400 MHz Bruker譜儀上在162 MHz下記錄且用1 H去偶合獲取。除非另有說明，否則19 F NMR譜係在400 MHz Bruker譜儀上在376 MHz下記錄。 HRMS條件：
HRMS譜係使用Agilent 1260 Infinity II生物惰性多取樣器、生物惰性管柱隔室、生物惰性四級幫浦、DAD多波長偵測器及Agilent 6545 LC-QTOF質譜儀，使用Osaka Soda Capcell PAK C1 UG120 (5 µm, 2.0 mm ID × 35 mm長度)反相管柱來獲取。LC之溶劑系統係由水中之0.1%甲酸用於流動相A及乙腈中之0.1%甲酸用於流動相B或等效溶劑系統組成。通常，LC溶析以95%/5%流動相A/B比率開始。在等梯度流動間隔(通常0.5 min)後，將流動相經1.5 min線性梯度更換為100%B。流量為0.7 mL/min，運行5 min。
通常，將2 uL之於DMSO中之1 mM溶液注射至質譜儀中。QTOF設定：氣體溫度35℃，乾燥氣體流量= 10 L/min，噴霧器壓力55 psig，護套氣體溫度及流量分別為35℃及12 L/min。應用以下電壓設定：毛細管電壓4500V，噴嘴電壓2000V，破碎器電壓75V。
藉由使用Agilent Mass Hunter定性分析軟體8.07.00 SP2版分析數據。質量誤差[ppm]表示為精確質量與觀察質量之間之差除以精確質量乘以1×106 。 LCMS條件：
LCMS譜記錄於使用反相C18管柱之連接至Micromass質譜儀之Hewlett-Packard HP1100或Agilent 1100 Series LC系統上。選擇多個梯度及運行時間以最好地表徵化合物。流動相係基於ACN/水或MeOH/水梯度且含有0.1%甲酸(方法指示為FA)或10 mM乙酸銨(方法指示為AA)。使用之溶劑梯度之一個實例係100%流動相A (流動相A = 99%水+ 1% ACN + 0.1%甲酸)至100%流動相B (流動相B = 95% ACN + 5%水+ 0.1%甲酸)，流量為1 mL/min，運行16.5 min。
在一些情況下，LCMS譜記錄於連接至Agilent 6130質譜儀之Agilent 1290 Infinity UPLC系統、連接至Waters Acquity SQ質譜儀之Waters Acquity UPLC系統、或使用反相C18管柱之連接至Waters Micromass ZQ質譜儀之Agilent 1100 Series HPLC系統上。選擇多個梯度及運行時間以最好地表徵化合物。流動相係基於ACN/水或MeOH/水梯度且含有0.1%甲酸(方法指示為FA)或10 mM乙酸銨(方法指示為AA)。使用之溶劑梯度之一個實例係95%流動相A (流動相A = 99%水+ 1% ACN + 0.1%甲酸)至100%流動相B (流動相B = 95% ACN + 5%水+ 0.1%甲酸)，流量為0.5 mL/min，運行5 min。 製備型HPLC：
使用18×150 mm Sunfire C-18管柱進行製備型HPLC分離，使用由322个幫浦操作之Gilson儀器用水-ACN梯度溶析，且UV/可見光155偵測器觸發之流分收集設定在200 nm與400 nm之間。在Agilent 1100 LC/MSD儀器上進行質量門控流分收集。
熟習此項技術者將認識到，梯度、管柱長度及流量之改變係可能的，並且一些條件可能比其他條件更適合化合物表徵，此端視所分析之化學物質而定。 製備型SFC：
使用10、20或30 mm × 250 mm ChiralPak管柱(通常為IA、IB、IC、ID、IE及IF)、10或20 mm × 250 mm Phenomenex Lux Cellulose-4或2-乙基吡啶管柱進行製備型SFC，用適當百分比之含有0.3%二乙胺、0.3% TEA、0.3%甲酸或不含任何酸或鹼添加劑之超臨界二氧化碳及醇溶析。典型之等梯度條件係流量在10-100 mL/min範圍內且管柱溫度為40℃。在Jasco SFC製備型純化系統上進行製備型SFC，UV/可見光觸發之流分收集設定在200 nm與400 nm之間且背壓調節設定為10 MPa。
熟習此項技術者將認識到，梯度、管柱長度及流量之改變係可能的，並且一些條件可能比其他條件更適合化合物表徵，此端視所分析之化學物質而定。 分析型SEC條件：
SEC譜係在280 nm處記錄於具有二極體陣列偵測器使用SEC管柱(通常為Tosoh Biosep TSK Gel, G3000SWxl；P/N 8541；250A；5um；7.8mm × 300mm)之Hewlett­Packard HP1100或Agilent 1100 Series LC系統上。流動相為100 mM磷酸鈉、300 mM氯化鈉，pH 6.8，10%乙腈(v/v)或1×PBS。典型運行係以1 mL/min之流量等梯度運行20 min。 分析型HIC條件：
HIC譜係在280 nm處記錄於具有二極體陣列偵測器使用HIC管柱(通常為Tosoh丁基-NPR, 4.6 × 35 mm, 2.5 um, P/N: 14947)之Hewlett­Packard HP1100或Agilent 1100 Series LC系統上。流動相A為25 mM磷酸鈉、1.5 M硫酸銨，pH 7，且流動相B為75% 25 mM磷酸鈉，pH 7，25%異丙醇。對於典型20 min運行，將在等梯度流之初始與最終間隔之間使用95%/5% A/B至100%B之12 min線性梯度。 LC-QTOF條件：
LCMS譜記錄於使用加熱至80℃之反相管柱(通常為Agilent, PLRP-S, 5 µm, 1000 Å, 2.1 mm × 50 mm)之連接至Agilent 6545 QTOF質譜儀之Agilent 1260 Bioinert Series LC系統上。選擇多個梯度及運行時間以最好地表徵化合物。流動相係基於ACN/水梯度且含有0.1%甲酸。使用之溶劑梯度之一個實例係95%流動相A (流動相A = 99%水+ 1% ACN + 0.1%甲酸)至100%流動相B (流動相B = 95% ACN + 5%水+ 0.1%甲酸)，且條件顯示於表1中。 表1
時間(min) 流量(mL/min) A% B%
0 0.35 82 18
1 0.35 82 18
2 0.35 70 30
19 0.5 50 50
19.5 0.5 10 90
21 0.5 10 90
21.1 0.5 82 18
22 0.5 82 18
樣品係完整或還原的(20 uL之1~5 mg/mL ADC溶液，用4 uL之0.5M DTT溶液在37℃下處理30 min)。使用Agilent BioConfirm軟體在適當之質量範圍內對原始數據進行解卷積以獲得蛋白質分子量，並使用Agilent DAR計算器計算DAR。 LC/MS/MS條件：
使用Shimadzu UFLC LC-20AD XR二元幫浦及SIL-30AC MP自動取樣器系統及AB SCIEX三重四極桿4500 ESI質譜進行LC/MS/MS分析。
通常，將5 uL樣品等份在通過Waters Xselect C18 CSH 3.5u 2.1 mm ID × 30 mm管柱後注射至LC/MS/MS中。流動相A含有水中之0.1%甲酸，且流動相B含有5%水及95%乙腈中之0.1%甲酸。總運行時間為3 min，流量為1.5 mL/min，經1.5 min線性梯度從100% A至100% B。最初，儀器在100%水性流動相溶劑下運行0.5 min，然後其在下一個1.5 min內增加至100%有機溶劑。 製備型SEC：
在具有UV偵測器使用SEC管柱(通常為GE Superdex 200 Increase 10/300 GL)之Gilson製備型HPLC系統上進行製備型SEC純化。流動相為1×PBS (pH 7.4)。典型運行係以1 mL/min之流量等梯度運行30 min。基於UV臨限值(在214 nm及280 nm處)觸發流分收集。 ADC濃度：
ADC濃度係根據藉由NanoDrop (2000c; Fisher Scientific)係數量測之280 nm UV吸光度減去相應連接體-酬載構築體之UV吸光度來計算。 實例1 N-[(2-氯羰基苯基)甲基]-N-甲基-胺基甲酸第三丁基酯(中間體1)
Figure 02_image186
步驟1：2-(((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)甲基)苯甲酸
向2-[(甲基胺基)甲基]苯甲酸(7.50 g, 44 mmol)於1,4-二㗁烷(136 mL)及水中之1N氫氧化鈉(182 mL)中之溶液中添加二碳酸二-第三丁基酯(19.2 g, 88 mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌2 h。然後將反應混合物濃縮以去除有機溶劑且使用1N HCl將pH調節至pH 3。用EtOAc (3×)萃取粗產物。用鹽水洗滌合併之有機相，乾燥(Na2 SO4 )，過濾並蒸發。藉由矽膠層析(0­50% EtOAc/DCM)純化粗化合物以提供2-(((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)甲基)苯甲酸(8.88 g, 75%)。LCMS (AA):m/z = 264.1 (M-H)。 步驟2：N-[(2-氯羰基苯基)甲基]-N-甲基-胺基甲酸第三丁基酯，中間體1
在0℃下，將1-氯-N,N ,2-三甲基丙烯基胺(0.52 mL, 4.0 mmol)緩慢添加至2-(((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)甲基)苯甲酸(525 mg, 2.0 mmol)於DCM (16 mL)中之溶液中。然後將反應混合物升溫至室溫並攪拌1 h。然後將反應混合物濃縮至乾燥以提供粗N-[(2-氯羰基苯基)甲基]-N-甲基-胺基甲酸第三丁基酯(中間體1, 562 mg, 100%)。 實例2 N-[[2-(2-氯-2-側氧基-乙基)苯基]甲基]-N-甲基-胺基甲酸第三丁基酯(中間體2)
Figure 02_image188
步驟1：2-[2-[[第三丁氧基羰基(甲基)胺基]甲基]苯基]乙酸
在室溫下，向2-(2-(((第三丁氧基羰基)胺基)甲基)苯基)乙酸(1.50 g, 5.7 mmol)於THF (20 mL)中之溶液中添加碘甲烷(2.8 mL, 45.2 mmol)。將反應混合物冷卻至0℃且分3份添加氫化鈉(60%分散液於礦物油中，905 mg, 22.6 mmol)。然後將反應混合物在室溫下攪拌16 h。用水淬滅反應混合物且藉由濃縮去除有機溶劑。使用1N HCl將水相酸化至pH 3且用Et2 O (2×)萃取粗產物。用鹽水洗滌合併之有機相，乾燥(Na2 SO4 )，過濾並蒸發以提供2-[2-[[第三丁氧基羰基(甲基)胺基]甲基]苯基]乙酸(1.36 g, 86%)。LCMS (AA):m/z = 280.2 (M+H)。 步驟2：N-[[2-(2-氯-2-側氧基-乙基)苯基]甲基]-N-甲基-胺基甲酸第三丁基酯，中間體2
標題化合物係遵循實例1之步驟2中所述之程序、用2-[2-[[第三丁氧基羰基(甲基)胺基]甲基]苯基]乙酸(650 mg, 2.33 mmol)開始製備以提供粗中間體2 (693 mg, 100%)。 實例3 4-[第三丁氧基羰基(甲基)胺基]丁酸異丁氧基羰基酯(中間體3)
Figure 02_image190
步驟1：4-((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)丁酸
標題化合物係遵循實例2之步驟1中所述之程序、使用4-(第三丁氧基羰基胺基)丁酸(2.92 g, 14.4 mmol)替代2-(2-(((第三丁氧基羰基)胺基)甲基)苯基)乙酸製備以提供4-((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)丁酸(2.89 g, 93%)。LCMS (AA):m/z = 216.1 (M-H)。 步驟2：4-[第三丁氧基羰基(甲基)胺基]丁酸異丁氧基羰基酯，中間體3
向4-((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)丁酸(360 mg, 1.57 mmol)及三乙胺(0.24 mL, 1.73 mmol)溶解於DCM (7 mL)中且冷卻至0℃之溶液中逐滴添加氯甲酸異丁基酯(0.22 mL, 1.73 mmol)。完成添加後，將反應混合物在室溫下攪拌2 h。然後將混合物濃縮至乾燥以提供粗4-[第三丁氧基羰基(甲基)胺基]丁酸異丁氧基羰基酯(中間體3, 499 mg, 100%)。 實例4
下文所列示之化合物係如實例3中所述，用表2中所示之起始材料替代4-(第三丁氧基羰基胺基)丁酸來製備。 表2
起始材料 產物 注釋
Figure 02_image192
Figure 02_image194
Int-4		   
Figure 02_image196
Figure 02_image198
Int-5		 跳過步驟1
實例5 N-{9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}-2-[(甲基胺基)甲基]苯甲醯胺(中間體6)
Figure 02_image200
步驟1：[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸第三丁基酯
將呈N,N -二乙基乙胺鹽形式之2-胺基-9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-1,9-二氫-6H-嘌呤-6-酮(化合物I-5c，參見PCT/IB2018/058846, 160 mg, 0.19 mmol)溶解於無水吡啶中且濃縮至乾燥(3 × 2mL)，然後置於真空下15 min。在氬氣氛下將殘餘物溶解於吡啶(3 mL)中且添加氯三甲基矽烷(0.15 mL, 1.13 mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌30 min。然後經由注射器添加溶解於吡啶(3 mL)中之中間體1 (800 mg, 2.82 mmol)。將反應混合物在室溫下在氬氣氛下攪拌16 h。然後將反應混合物濃縮至乾燥並添加MeOH (10 mL)及氫氧化銨(28-30%水溶液，10 mL)且攪拌30 min。將反應混合物濃縮至乾燥且將殘餘物溶解於MeOH (15 mL)中。添加三乙胺三氫氟酸鹽(0.12 mL, 0.75 mmol)且將反應混合物在室溫下攪拌30 min。將反應混合物濃縮至乾燥且將粗殘餘物吸附至矽藻土上，並藉由反相急速管柱層析(0-50% ACN/三乙基乙酸銨水溶液(10 mM))純化以提供呈N,N -二乙基乙胺鹽形式之[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸第三丁基酯(120 mg, 58%)。LCMS (AA):m/z = 897.3 (M+H)。1 H NMR (400 MHz, CD3 OD) δ 8.70 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 8.41 (d,J = 6.0 Hz, 1H), 7.70 (d,J = 7.5 Hz, 1H), 7.58 - 7.52 (m, 1H), 7.44 - 7.39 (m, 1H), 7.33 (d,J = 7.8 Hz, 1H), 6.85 (d,J = 6.0 Hz, 1H), 6.17 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 5.64 - 5.58 (m, 1H), 5.49 - 5.44 (m, 1H), 5.08 - 5.02 (m, 1H), 4.88 - 4.78 (m, 1H), 4.76 - 4.67 (m, 2H), 4.37 - 4.21 (m, 3H), 4.06 - 4.00 (m, 1H), 3.83 - 3.74 (m, 1H), 2.82 (s, 3H), 2.60 - 2.32 (m, 4H), 1.54 - 1.46 (m, 1H), 1.42 (s, 9H)。31 P NMR (162 MHz, CD3 OD) δ 55.19 (s, 1P), 53.20 (s, 1P)。 步驟2：N-{9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}-2-[(甲基胺基)甲基]苯甲醯胺，中間體6
將呈N,N -二乙基乙胺鹽形式之[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸第三丁基酯(50 mg, 0.045 mmol)添加至圓底燒瓶中且冷卻至0℃。然後經由注射器添加三氟乙酸(0.24 mL, 3.2 mmol)及DCM (0.58 mL)之溶液，且將反應混合物在0℃下攪拌30 min。然後將反應混合物濃縮至乾燥並置於真空下2 h以提供呈2,2,2-三氟乙酸鹽形式之中間體6 (41 mg, 100%)。LCMS (AA):m/z = 797.1 (M+H)。 實例6 [2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S )-2-{[(2S )-2-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}苄基酯，化合物1 (C-1)
Figure 02_image202
步驟1：[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S )-2-({(2S )-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基酯，中間體7
在室溫下，向第三丁基氧基羰基-纈胺醯基-丙胺醯基-(4-胺基苄基)-(4-硝基苯基)碳酸酯(58 mg, 0.10 mmol)及4-二甲基胺基吡啶(12 mg, 0.10 mmol)於DMF (0.38 mL)及三乙胺(0.055 mL, 0.40 mmol)中之溶液中添加中間體6 (45 mg, 0.05 mmol)於DMF (1.5 mL)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌15 min。添加矽藻土且將混合物濃縮至乾燥。藉由反相急速管柱層析(0-40% ACN/三乙基乙酸銨水溶液(10 mM))純化吸附至矽藻土上之粗殘餘物以提供呈N,N -二乙基乙胺鹽形式之[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S )-2-({(2S )-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基酯(中間體7, 10 mg, 16%)。LCMS (AA):m/z = 1216.3 (M+H)。1 H NMR (400 MHz, CD3 OD) δ 8.70 (s, 1H), 8.43 (brs, 1H), 8.40 (d,J = 5.9 Hz, 1H), 7.70 (d,J = 7.5 Hz, 1H), 7.56 - 7.46 (m, 3H), 7.42 - 7.38 (m, 1H), 7.32 - 7.19 (m, 3H), 6.84 (d,J = 5.5 Hz, 1H), 6.15 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 5.62 - 5.56 (m, 1H), 5.54 - 5.48 (m, 1H), 5.08 - 5.02 (m, 1H), 5.04 (s, 2H), 4.88 - 4.83 (m, 1H), 4.81 - 4.76 (m, 2H), 4.53 - 4.47 (m, 1H), 4.37 - 4.22 (m, 3H), 4.08 - 4.03 (m, 1H), 3.92 - 3.89 (m, 1H), 3.82 - 3.74 (m, 1H), 2.88 (s, 3H), 2.58 - 2.30 (m, 4H), 2.10 - 2.03 (m, 1H), 1.54 - 1.47 (m, 1H), 1.46 - 1.44 (m, 3H), 1.44 (s, 9H), 0.98 (d,J = 6.8 Hz, 3H), 0.93 (d,J = 6.8 Hz, 3H)。31 P NMR (162 MHz, CD3 OD) δ 55.01 (s, 1P), 53.03 (s, 1P)。 步驟2：[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S )-2-{[(2S )-2-胺基-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}苄基酯，中間體8
標題化合物係遵循實例5之步驟2中所述之程序、使用中間體7 (10 mg, 0.008 mmol)替代[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸第三丁基酯並在室溫下攪拌10 min來製備，以提供呈2,2,2-三氟乙酸鹽形式之[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S )-2-{[(2S )-2-胺基-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}苄基酯(中間體8, 9 mg, 100%)。LCMS (AA):m/z = 1116.3 (M+H)。 步驟3：[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S )-2-{[(2S )-2-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}苄基酯，化合物C-1
向中間體8 (8 mg, 0.007 mmol)及6-馬來醯亞胺基己酸N -琥珀醯亞胺基酯(3.1 mg, 0.010 mmol)於THF (0.20 mL)及DMF (0.10 mL)中之溶液中逐滴添加N,N -二異丙基乙胺(2.5 uL, 0.014 mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌1 h。然後將反應混合物濃縮至乾燥，並藉由反相急速管柱層析(0-100% ACN/乙酸銨水溶液(10 mM))純化粗殘餘物以提供呈銨鹽形式之[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S )-2-{[(2S )-2-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}苄基酯(C-1, 4.2 mg, 45%)。LCMS (AA):m/z = 1309.4 (M+H)。HRMS (m/z ): C55 H66 N12 O18 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1309.3607；實驗值1309.3639。 實例7 氯甲酸2-[第三丁氧基羰基(甲基)胺基]乙基酯(中間體9)
Figure 02_image204
步驟1：氯甲酸2-[第三丁氧基羰基(甲基)胺基]乙基酯，中間體9
向N-(2-羥基乙基)-N-甲基胺基甲酸第三丁基酯(296 mg, 1.69 mmol)於冷卻至0℃之THF (4.2 mL)及N,N -二異丙基乙胺(1 mL, 5.9 mmol)中之溶液中緩慢添加三光氣(752 mg, 2.53 mmol)。將反應混合物升溫至室溫並攪拌1 h。將反應混合物過濾，用THF洗滌固體，並將濾液濃縮至乾燥以提供粗氯甲酸2-[第三丁氧基羰基(甲基)胺基]乙基酯(中間體9, 402 mg, 100%)。 實例8 N-[(2-氯羰基苯基)甲基]-N-甲基-胺基甲酸[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲酯(中間體10)
Figure 02_image206
步驟1：2-[[[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲氧基羰基-甲基-胺基]甲基]苯甲酸
標題化合物係遵循實例6之步驟1中所述之程序，用2-[(甲基胺基)甲基]苯甲酸HCl (150 mg, 0.72 mmol)替代中間體6開始來製備。在藉由矽膠層析(0-25% MeOH/DCM)純化後獲得2-[[[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲氧基羰基-甲基-胺基]甲基]苯甲酸(306 mg, 67%)。LCMS (AA):m/z = 583.4 (M-H)。 步驟2：N-[(2-氯羰基苯基)甲基]-N-甲基-胺基甲酸[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲酯，中間體10
向2-[[[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲氧基羰基-甲基-胺基]甲基]苯甲酸(295 mg, 0.50 mmol)於冷卻至0℃之THF (1.5 mL)中之溶液中添加草醯氯(2.0 M溶液於DCM中，0.25 mL, 0.50 mmol)，然後添加3滴DMF。將反應混合物在0℃下攪拌45 min。然後將混合物濃縮至乾燥以提供粗中間體10 (304 mg, 100%)。 實例8A (4-氯-4-側氧基丁基)甲基胺基甲酸4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基酯(中間體34)
Figure 02_image208
步驟1：4-[{[(4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基)氧基]羰基}(甲基)胺基]丁酸甲酯
標題化合物係遵循實例6之步驟1中所述之程序，用4-(甲基胺基)丁酸甲酯HCl (1.44 g, 8.16 mmol)替代中間體6開始來製備。在藉由矽膠層析(0-70% EtOAc/DCM)純化後獲得4-[{[(4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基)氧基]羰基}(甲基)胺基]丁酸甲酯(3.45 g, 92%)。LCMS (AA):m/z = 549.3 (M-H)。 步驟2：4-[{[(4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基)氧基]羰基}(甲基)胺基]丁酸
在0℃下，向4-[{[(4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基)氧基]羰基}(甲基)胺基]丁酸甲酯(3.45 g, 6.27 mmol)於THF (40.7 mL)及水(20.3 mL)中之溶液中添加氫氧化鋰單水合物(657 mg, 15.7 mmol)。然後將均質混合物升溫至室溫並攪拌2 h。將此反應混合物冷卻至0℃且鹽酸(1.0 mol/L水溶液，1.83 mL)。藉由添加額外1N HCl將此混合物調節至pH＜ 4。將此溶液升溫至室溫並用EtOAc及水稀釋。用EtOAc進一步萃取水相。用鹽水洗滌合併之有機相且經硫酸鎂乾燥。過濾並去除溶劑後，藉由矽膠層析(0-10% MeOH/EtOAc)純化殘餘物。去除溶劑提供白色固體狀4-[{[(4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基)氧基]羰基}(甲基)胺基]丁酸(3.17 g, 94%)。LCMS (AA):m/z = 535.3 (M-H)。 步驟3：(4-氯-4-側氧基丁基)甲基胺基甲酸4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基酯
標題化合物係遵循實例8之步驟2中所述之程序，用4-[{[(4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基)氧基]羰基}(甲基)胺基]丁酸(387 mg, 0.721 mmol)替代2-[[[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲氧基羰基-甲基-胺基]甲基]苯甲酸開始來製備，以在濃縮反應混合物後提供粗中間體34 (400 mg, 100%)。 實例9 [2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S )-2-({(2S )-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基酯(中間體7)
Figure 02_image210
[2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基酯，中間體7
標題化合物係遵循實例5之步驟1中所述之程序，用中間體10替代N-[(2-氯羰基苯基)甲基]-N-甲基-胺基甲酸第三丁基酯(中間體1)來製備。藉由反相急速管柱層析(0-50% ACN/碳酸氫銨水溶液(5 mM))純化粗產物以提供呈銨鹽形式之中間體7。然後將此材料溶解於MeOH (2 mL)中並添加三乙胺(5 mL)。將混合物搖晃1 min，去除溶劑並凍乾過夜以提供呈N,N -二乙基乙胺鹽形式之[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S )-2-({(2S )-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基酯(147 mg, 48%)。LCMS (AA):m/z = 1216.3 (M+H)。1 H NMR與實例6之步驟1一致。 實例10 [2-(氯羰基)苄基]2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基胺基甲酸4-{[(2S )-2-({(2S )-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基酯(中間體11)
Figure 02_image212
步驟1：2-(2,5,8,11-四氧雜-14-氮雜十五烷-15-基)苯甲酸
向2-羧基苯甲醛(1.10 g, 7.3 mmol)溶解於MeOH (15 mL)中之溶液中添加2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-胺(1.82 g, 8.8 mmol)且將反應混合物在室溫下攪拌1 h。然後逐份緩慢添加硼氫化鈉(139 mg, 3.7 mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌1 h。藉由添加丙酮(0.65 mL)淬滅反應混合物且然後濃縮至乾燥。藉由矽膠層析(0-25% MeOH/DCM)純化粗殘餘物以提供2-(2,5,8,11-四氧雜-14-氮雜十五烷-15-基)苯甲酸(2.25 g, 87%)。LCMS (AA):m/z = 342.3 (M+H)。 步驟2：2-(14-{[(4-{[(2S )-2-({(2S )-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基)氧基]羰基}-2,5,8,11-四氧雜-14-氮雜十五烷-15-基)苯甲酸
標題化合物係遵循實例6之步驟1中所述之程序，用2-(2,5,8,11-四氧雜-14-氮雜十五烷-15-基)苯甲酸(764 mg, 2.24 mmol)替代中間體6開始，使用DCM作為溶劑並攪拌16 h來製備。在藉由矽膠層析(0-25% MeOH/DCM)純化後獲得2-(14-{[(4-{[(2S )-2-({(2S )-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基)氧基]羰基}-2,5,8,11-四氧雜-14-氮雜十五烷-15-基)苯甲酸(855 mg, 47%)。LCMS (AA):m/z = 759.4 (M-H)。 步驟3：[2-(氯羰基)苄基]2,5,8,11-四氧雜十三烷-13-基胺基甲酸4-{[(2S )-2-({(2S )-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基酯，中間體11
標題化合物係遵循實例8之步驟2中所述之程序，用2-(14-{[(4-{[(2S )-2-({(2S )-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基)氧基]羰基}-2,5,8,11-四氧雜-14-氮雜十五烷-15-基)苯甲酸(591 mg, 0.777 mmol)替代2-[[[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲氧基羰基-甲基-胺基]甲基]苯甲酸開始來製備，以在濃縮反應混合物後提供粗中間體11 (605 mg, 100%)。 實例11
下表3中所列示之化合物係如實例5中所述，用表中所示之起始材料替代N-[(2-氯羰基苯基)甲基]-N-甲基-胺基甲酸第三丁基酯(中間體1)來製備。 表3
起始材料 產物 分析數據
Figure 02_image214
Int-2 在步驟1中使用10當量
Figure 02_image216
Int-12		 LCMS (AA):m/z = 811.2 (M+H)
Figure 02_image218
Int-3 在步驟1中使用6當量
Figure 02_image220
Int-13		 LCMS (AA):m/z = 749.2 (M+H)
Figure 02_image222
Int-4 在步驟1中使用6當量
Figure 02_image224
Int-14		 LCMS (AA):m/z = 777.2 (M+H)
Figure 02_image226
Int-5* 在步驟1中使用8當量
Figure 02_image228
Int-15		 LCMS (AA):m/z = 747.0 (M+H)
Figure 02_image230
Int-24 在步驟1中使用6當量
Figure 02_image232
Int-16		 LCMS (AA):m/z = 854.1 (M+H)
*在步驟2中，將甲醇作為溶劑之於1,4-二㗁烷中之4M HCl用於去保護步驟。 實例12 N-{9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15R ,15aR ,16R )-15-氟-7-(5-氟-4-側氧基-3,4-二氫-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-16-羥基-2,10-二氧橋-2,10-二氫硫基八氫-12H-5,8-亞甲基呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-14-基]-9H-嘌呤-6-基}-4-(甲基胺基)丁醯胺(中間體17)
Figure 02_image234
步驟1：[4-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15R ,15aR ,16R )-15-氟-7-(5-氟-4-側氧基-3,4-二氫-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-16-羥基-2,10-二氧橋-2,10-二氫硫基八氫-12H-5,8-亞甲基呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-14-基]-9H-嘌呤-6-基}胺基)-4-側氧基丁基]甲基胺基甲酸第三丁基酯
標題化合物係遵循實例5之步驟1中所述之程序，分別使用呈鈉鹽形式之7-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15R ,15aR ,16R )-14-(6-胺基-9H-嘌呤-9-基)-15-氟-16-羥基-2,10-二氧橋-2,10-二氫硫基八氫-12H-5,8-亞甲基呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-5-氟-3,7-二氫-4H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-酮(化合物編號14，參見WO2018100558A2, 200 mg, 0.265 mmol)及中間體3 (503 mg, 1.59 mmol)替代2-胺基-9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-1,9-二氫-6H-嘌呤-6-酮及中間體1來製備。藉由反相急速管柱層析(0-50% ACN/碳酸氫銨水溶液(5 mM))純化獲得呈銨鹽形式之[4-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15R ,15aR ,16R )-15-氟-7-(5-氟-4-側氧基-3,4-二氫-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-16-羥基-2,10-二氧橋-2,10-二氫硫基八氫-12H-5,8-亞甲基呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-14-基]-9H-嘌呤-6-基}胺基)-4-側氧基丁基]甲基胺基甲酸第三丁基酯(148 mg, 59%)。LCMS (AA):m/z = 910.5 (M+H)。1 H NMR (400 MHz, D2 O) δ 8.70 (s, 1H), 8.34 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.28 (s, 1H), 6.56 (d,J = 16.1 Hz, 1H), 6.43 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 5.67 (dd, J = 51.0, 3.9 Hz, 1H), 5.18 - 4.99 (m, 2H), 4.82 - 4.77 (m, 1H), 4.63 - 4.58 (m, 1H), 4.49 - 4.38 (m, 3H), 4.31 - 4.25 (m, 1H), 4.12 - 4.06 (m, 1H), 3.43 - 3.36 (m, 2H), 2.88 (s, 3H), 2.73 - 2.68 (m, 2H), 2.04 - 1.97 (m, 2H), 1.34 (s, 9H)。31 P NMR (162 MHz, D2 O) δ 55.47 (s, 1P), 52.07 (s, 1P)。19 F NMR (376 MHz, CD3 OD) δ -165.50 (m, 1F), -203.45 (m, 1F)。 步驟2：N-{9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15R ,15aR ,16R )-15-氟-7-(5-氟-4-側氧基-3,4-二氫-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-16-羥基-2,10-二氧橋-2,10-二氫硫基八氫-12H-5,8-亞甲基呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-14-基]-9H-嘌呤-6-基}-4-(甲基胺基)丁醯胺，中間體17
標題化合物係遵循實例5之步驟2中所述之程序，使用呈銨鹽形式之[4-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15R ,15aR ,16R )-15-氟-7-(5-氟-4-側氧基-3,4-二氫-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-16-羥基-2,10-二氧橋-2,10-二氫硫基八氫-12H-5,8-亞甲基呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-14-基]-9H-嘌呤-6-基}胺基)-4-側氧基丁基]甲基胺基甲酸第三丁基酯(42 mg, 0.045 mmol)替代[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸第三丁基酯並在室溫下攪拌30 min來製備。獲得呈2,2,2-三氟乙酸鹽形式之N-{9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15R ,15aR ,16R )-15-氟-7-(5-氟-4-側氧基-3,4-二氫-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-16-羥基-2,10-二氧橋-2,10-二氫硫基八氫-12H-5,8-亞甲基呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-14-基]-9H-嘌呤-6-基}-4-(甲基胺基)丁醯胺(中間體17, 41 mg, 100%)。LCMS (AA):m/z = 810.2 (M+H)。 實例13
下表5中所列示之化合物係如實例12中所述，用表4中所示之起始材料替代4-[第三丁氧基羰基(甲基)胺基]丁酸異丁氧基羰基酯(中間體3)來製備。 表4
起始材料 產物 分析數據
Figure 02_image236
Int-9* 在步驟1中使用15當量		 Int-18 LCMS (AA):m/z = 812.1 (M+H)
Figure 02_image238
Int-10 在步驟1中使用6當量		 Int-31 LCMS (AA):m/z = 1177.1 (M+H)
Figure 02_image240
Int-34 在步驟1中使用6當量		 Int-35 LCMS (AA):m/z = 1129.2 (M+H)
*在步驟2中，將1,4-二㗁烷中之4M HCl用於去保護步驟。 表5
產物 結構
Int-18   
Figure 02_image242
Int-31
Figure 02_image244
Int-35
Figure 02_image246
實例14
表7中所列示之化合物係如實例6中所述，用表6中所示之起始材料替代中間體6來製備。 表6
起始材料 產物 分析數據
Figure 02_image248
Int-12		 C-2 LCMS (AA):m/z = 1323.4 (M+H); HRMS (m/z ): C56 H68 N12 O18 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1323.3764；實驗值1323.3790。
Figure 02_image220
Int-13*		 C-3 LCMS (AA):m/z = 1261.4 (M+H); HRMS (m/z ): C51 H66 N12 O18 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1261.3607；實驗值1261.3630。
Figure 02_image251
Int-18		 C-4 LCMS (AA):m/z = 1324.1 (M+H); HRMS (m/z ): C51 H61 F2 N13 O19 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1324.3164；實驗值1324.3186。
*在步驟2中，以2:1之比率(對甲酚:TFA)將對甲酚添加至反應混合物中。 表7
產物 結構
C-2
Figure 02_image253
C-3
Figure 02_image255
C-4
Figure 02_image257
實例15
表8中所列示之化合物(中間體19)係如實例6之步驟1中所述，用表中所示之起始材料替代第三丁基氧基羰基-纈胺醯基-丙胺醯基-(4-胺基苄基)-(4-硝基苯基)碳酸酯來製備。 表8
起始材料 產物 分析數據
Figure 02_image259
Figure 02_image261
Int-19		 LCMS (AA):m/z = 1302.4 (M+H)
實例16
表10中所列示之化合物係如實例6之步驟2及3中所述，用表9中所示之起始材料替代中間體7來製備。 表9
起始材料 產物 分析數據
Figure 02_image263
Int-19		 C-5 LCMS (AA):m/z = 1395.2 (M+H); HRMS (m/z ): C58 H72 N14 O19 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1395.4088；實驗值1395.4125。
表10
產物 結構
C-5
Figure 02_image265
實例17
表12中所列示之化合物係如實例6之步驟3中所述，用表11中所示之起始材料替代6-馬來醯亞胺基己酸N -琥珀醯亞胺基酯來製備。 表11
起始材料 產物 分析數據
Figure 02_image267
 C-6 LCMS (AA):m/z = 1431.2 (M+H); HRMS (m/z ): C66 H72 N12 O17 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1431.4128；實驗值1431.4153。
Figure 02_image269
 C-7 LCMS (AA):m/z = 726.3  (M/2+H); HRMS (m/z ): C63 H80 N12 O20 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1451.4601；實驗值1451.4608。
Figure 02_image271
 C-8 LCMS (AA):m/z = 1487.2 (M+H); HRMS (m/z ): C62 H80 N12 O23 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1487.4449；實驗值1487.4474。
Figure 02_image273
 C-9 LCMS (AA):m/z = 913.9 (M/2+H)
Figure 02_image275
Int-20		 C-10 LCMS (AA):m/z = 1586.0 (M+H); HRMS (m/z ): C67 H89 N13 O24 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1586.5133；實驗值1586.5150。
Figure 02_image277
 C-11* LCMS (AA):m/z = 1715.8 (M+H)
Figure 02_image279
 C-12 LCMS (AA):m/z = 1253.3 (M+H)
Figure 02_image281
Int-27		 C-13 LCMS (AA):m/z = 920.9 (M/2+H); HRMS (m/z ): C83 H104 N14 O26 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1839.6236；實驗值1839.6307。
Figure 02_image283
Int-36		 C-35 LCMS (AA):m/z = 1726.3 (M-H); HRMS (m/z ): C75 H103 N13 O26 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1728.6127；實驗值1728.6148。
Figure 02_image285
Int-40		 C-39 LCMS (AA):m/z = 1775.8 (M+H); HRMS (m/z ): C75 H104 N14 O28 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1775.6134；實驗值1775.6138。
*使用三乙胺作為鹼替代N,N -二異丙基乙胺。 表12
產物 結構
C-6
Figure 02_image287
C-7
Figure 02_image289
C-8
Figure 02_image291
C-9
Figure 02_image293
C-10
Figure 02_image295
C-11*
Figure 02_image297
C-12
Figure 02_image299
C-13
Figure 02_image301
C-35
Figure 02_image303
C-39
Figure 02_image305
實例18
表14中所列示之化合物係如實例6之步驟2及3中所述，用表13中所示之起始材料分別替代中間體7及6-馬來醯亞胺基己酸N -琥珀醯亞胺基酯來製備。 表13
步驟2中之起始材料 步驟3中之起始材料 產物 分析數據
Int-19
Figure 02_image267
 C-14 LCMS (AA):m/z = 759.5 (M/2+H); HRMS (m/z ): C69 H78 N14 O18 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1517.4608；實驗值1517.4635。
Int-19
Figure 02_image269
 C-15 LCMS (AA):m/z = 769.8 (M/2+H); HRMS (m/z ): C66 H86 N14 O21 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1537.5081；實驗值1537.5120。
Int-21
Figure 02_image309
 C-16 LCMS (AA):m/z = 1485.3 (M+H); HRMS (m/z ): C63 H82 N12 O22 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1485.4656；實驗值1485.4680。
Int-21
Figure 02_image269
 C-17 LCMS (AA):m/z = 1627.2 (M+H)
Int-28*
Figure 02_image312
 C-18 LCMS (AA):m/z = 1718.3 (M+H); HRMS (m/z ): C73 H101 N13 O27 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1718.5919；實驗值1718.5936。
Int-29
Figure 02_image309
 C-19 LCMS (AA):m/z = 1789.0 (M+H); HRMS (m/z ): C76 H106 N14 O28 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1789.6290；實驗值1789.6286。
Int-31**
Figure 02_image271
 C-32 LCMS (AA):m/z = 1547.9 (M+H); HRMS (m/z ): C63 H77 F2 N13 O23 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1548.4213；實驗值1548.4236。
Int-33
Figure 02_image271
 C-33 LCMS (AA):m/z = 1498.3 (M+H); HRMS (m/z ): C62 H77 FN15 O22 PS2 之[M+H]+ 計算值1498.4603；實驗值1498.4604。
Int-38
Figure 02_image309
 C-36 LCMS (AA):m/z = 1659.1 (M-H); HRMS (m/z ): C71 H98 N12 O26 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1661.5705；實驗值1661.5759。
Int-31**
Figure 02_image318
Int-39		 C-38 LCMS (AA):m/z = 1777.6 (M-H); HRMS (m/z ): C74 H98 F2 N14 O27 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1779.5683；實驗值1779.5716。   
Int-29
Figure 02_image279
 C-40 LCMS (AA):m/z = 1731.4 (M-H); HRMS (m/z ): [M+H]+ 計算值?；實驗值?。
Int-38
Figure 02_image279
 C-41 LCMS (AA):m/z = 1605.4 (M+H); HRMS (m/z ): C67 H90 N12 O26 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1605.5079；實驗值1605.5148。
Int-41
Figure 02_image279
 C-42 LCMS (AA):m/z = 1542.1 (M-H); HRMS (m/z ): C64 H83 N13 O24 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1544.4663；實驗值1544.4722。
Int-31**
Figure 02_image320
Int-44		 C-45 LCMS (AA):m/z = 1777.5 (M-H)。
*使用三乙胺作為鹼替代N,N -二異丙基乙胺。 **跳過實例6中之步驟2。 表14
產物 結構
C-14
Figure 02_image322
C-15
Figure 02_image324
C-16
Figure 02_image326
C-17
Figure 02_image328
C-18
Figure 02_image330
1 H NMR (400 MHz，甲醇-d 4 ) δ ppm 0.97 (t,J =7.15 Hz, 6 H) 1.24 - 1.40 (m, 2 H) 1.45 (d,J =7.09 Hz, 3 H) 1.55 - 1.88 (m, 5 H) 2.13 (m, 1 H) 2.25 - 2.40 (m, 1 H) 2.44 - 2.62 (m, 5 H) 2.89 (s, 3 H) 3.35 (s, 3 H) 3.46 (t,J =7.03 Hz, 2 H) 3.50 - 3.57 (m, 2 H) 3.62 (m, 28 H) 3.67 - 3.83 (m, 3 H) 3.98 - 4.08 (m, 1 H) 4.18 (d,J =6.97 Hz, 1 H) 4.22 - 4.40 (m, 4 H) 4.48 (d,J =7.09 Hz, 1 H) 4.78 (m, 2 H) 5.04 (s, 2 H) 5.45 - 5.64 (m, 2 H) 6.08 - 6.21 (m, 1 H) 6.78 (s, 2 H) 6.83 (d,J =6.11 Hz, 1 H) 7.12 - 7.35 (m, 3 H) 7.35 - 7.44 (m, 1 H) 7.45 - 7.61 (m, 3 H) 7.70 (br d,J =7.58 Hz, 1 H) 8.40 (d,J =5.99 Hz, 2 H) 8.70 (s, 1 H)。31 P NMR (162 MHz，甲醇-d 4 ) δ ppm 52.93 (s, 1 P) 54.97 (s, 1 P)。
C-19
Figure 02_image332
C-32
Figure 02_image334
C-33
Figure 02_image336
C-36
Figure 02_image338
C-38
Figure 02_image340
31 P NMR (162 MHz，甲醇-d 4 ) δ ppm 52.26 (s, 1 P) 56.88 (s, 1 P)1 H NMR (400 MHz，甲醇-d 4 ) δ ppm 0.97 (m, 6 H) 1.34 (m, 2 H) 1.47 (d,J =7.09 Hz, 3 H) 1.52 - 1.61 (m, 2 H) 1.63 - 1.75 (m, 1 H) 1.77 - 1.88 (m, 1 H) 2.11 - 2.24 (m, 1 H) 2.44 - 2.59 (m, 2 H) 2.94 (br s, 3 H) 3.35 (s, 3 H) 3.45 (m, 2 H) 3.49 - 3.56 (m, 2 H) 3.58 - 3.66 (m, 28 H) 3.73 (t,J =6.05 Hz, 2 H) 4.01 (dd,J =11.25, 3.42 Hz, 1 H) 4.20 (d,J =6.85 Hz, 1 H) 4.29 (s, 1 H) 4.33 - 4.59 (m, 5 H) 4.86 (m, 2 H) 4.96 - 5.08 (m, 3 H) 5.15 - 5.30 (m, 1 H) 5.72 (d,J =52.0 Hz, 1 H) 6.35 - 6.53 (m, 2 H) 6.77 (s, 2 H) 7.09 - 7.24 (m, 2 H) 7.26 - 7.35 (m, 1 H) 7.38 (s, 1 H) 7.43 - 7.59 (m, 4 H) 7.76 (s, 1 H) 7.80 (br d,J =7.46 Hz, 1 H) 8.42 (s, 1 H) 8.62 - 8.69 (s, 1 H)
C-40
Figure 02_image342
C-41
Figure 02_image344
C-42
Figure 02_image346
C-45
Figure 02_image348
1 H NMR (400 MHz，甲醇-d 4 ) δ ppm 0.98 (dd,J =12.90, 6.91 Hz, 6 H) 1.23 - 1.40 (m, 2 H) 1.47 (d,J =7.21 Hz, 3 H) 1.58 (m, 2 H) 1.73 (m, 2 H) 2.17 - 2.30 (m, 2 H) 2.35 (m, 1 H) 2.91 (s, 3 H) 3.31 (s, 3 H) 3.40 (m, 2 H) 3.46 - 3.60 (m, 30 H) 3.97 (dd,J =11.55, 3.36 Hz, 1 H) 4.12 (d,J =5.62 Hz, 1 H) 4.19 - 4.28 (m, 2 H) 4.30 - 4.54 (m, 6 H) 4.83 (m, 2 H) 4.93 - 5.07 (m, 3 H) 5.10 - 5.25 (m, 1 H) 5.72 (d,J =52.0 Hz, 1 H) 6.36 - 6.48 (m, 2 H) 6.76 (s, 2 H) 7.05 - 7.32 (m, 3 H) 7.35 (s, 1 H) 7.38 - 7.68 (m, 4 H) 7.75 (s, 1 H) 7.76 - 7.83 (m, 1 H) 8.41 (s, 1 H) 8.61 - 8.68 (s, 1 H)31 P NMR (162 MHz，甲醇-d 4 ) δ ppm 52.35 (s, 1 P) 56.91 (s, 1 P)
實例19 [4-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺基)-2,2-二甲基-4-側氧基丁基]甲基胺基甲酸4-{[(2S )-2-{[(2S )-2-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}苄基酯，化合物20 (C-20)
Figure 02_image350
步驟1：[4-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺基)-2,2-二甲基-4-側氧基丁基]甲基胺基甲酸4-{[(2S )-2-{[(2S )-2-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}苄基酯，化合物20
在室溫下，向碳酸[4-[[(2S )-2-[[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯基胺基]-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲酯(4-硝基苯基)酯(47.9 mg, 0.037 mmol)及1-羥基-7-氮雜苯并三唑(4.08 mg, 0.03 mmol)於DMF (0.60 mL)及N,N -二異丙基乙胺(26 uL, 0.15 mmol)中之溶液中添加呈2,2,2-三氟乙酸鹽形式之N-{9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}-3,3-二甲基-4-(甲基胺基)丁醯胺(中間體14, 20 mg, 0.02 mmol)於DMF (0.54 mL)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌16 h。添加矽藻土且將混合物濃縮至乾燥。藉由反相急速管柱層析(0-100% ACN/乙酸銨水溶液(10 mM))純化吸附至矽藻土上之粗殘餘物以提供呈銨鹽形式之[4-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺基)-2,2-二甲基-4-側氧基丁基]甲基胺基甲酸4-{[(2S )-2-{[(2S )-2-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}苄基酯(C-20, 4 mg, 17%)。LCMS (AA):m/z = 1287.4 (M-H)。 實例20
表16中所列示之化合物係如實例19中所述，用表15中所示之起始材料A及B分別替代中間體14及碳酸[4-[[(2S )-2-[[(2S)-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯基胺基]-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲酯(4-硝基苯基)酯來製備。 表15
起始材料A 起始材料B 產物 分析數據
Int-17*
Figure 02_image352
 C-21 LCMS (AA):m/z = 1322.3 (M+H); HRMS (m/z ): C52 H63 F2 N13 O18 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1322.3371；實驗值1322.3394。
Int-17**
Figure 02_image354
Int-25		 C-22 LCMS (AA):m/z = 1444.8 (M+H)
Int-17**
Figure 02_image356
Int-26		 C-23 LCMS (AA):m/z = 1416.8 (M+H)
Int-18**
Figure 02_image352
 C-44 LCMS (AA):m/z = 1304.4 (M+H); HRMS (m/z ): C50 H63 N15 O19 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1304.3414；實驗值1304.3465。
*在反應中使用1-羥基苯并三唑及三乙胺替代1-羥基-7-氮雜苯并三唑及N,N -二異丙基乙胺。 **在反應中使用4-二甲基胺基吡啶及三乙胺替代1-羥基-7-氮雜苯并三唑及N,N -二異丙基乙胺。 表16
產物 結構
C-21
Figure 02_image358
C-22
Figure 02_image360
C-23
Figure 02_image362
C-44
Figure 02_image364
實例21 N-{(2S )-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-1-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-1-側氧基己-2-基}-2,5,8,11,14-五氧雜十七烷-17-醯胺(中間體20)
Figure 02_image366
步驟1：(19S )-19-[4-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丁基]-17-側氧基-2,5,8,11,14-五氧雜-18-氮雜二十烷-20-酸
向1-[(17-側氧基-2,5,8,11,14-五氧雜十七烷-17-基)氧基]吡咯啶-2,5-二酮(4.0 g, 10.5 mmol)於無水DCM (10 mL)中之溶液中添加溶解於DMF (40 mL)中之(S )-2-胺基-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸鹽酸鹽(3.4 g, 12.9 mmol)，然後添加N,N -二異丙基乙胺(6.9 mL, 42 mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌18 h。將反應混合物過濾且濃縮至乾燥。藉由製備型HPLC純化粗殘餘物以提供(19S )-19-[4-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丁基]-17-側氧基-2,5,8,11,14-五氧雜-18-氮雜二十烷-20-酸(1.26 g, 24%)。LCMS (AA):m/z = 489.3 (M+H)。 步驟2：N-{(2S )-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-1-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-1-側氧基己-2-基}-2,5,8,11,14-五氧雜十七烷-17-醯胺，中間體20
在室溫下，向(19S )-19-[4-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丁基]-17-側氧基-2,5,8,11,14-五氧雜-18-氮雜二十烷-20-酸(65 mg, 0.133 mmol)及N,N’ -二環己基碳化二亞胺(30 mg, 0.145 mmol)於1,4-二㗁烷(0.68 mL)中之溶液中添加N -羥基琥珀醯亞胺(15.3 mg, 0.133 mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌16 h。添加矽藻土並將混合物過濾，用1,4-二㗁烷沖洗且濃縮至乾燥。藉由矽膠層析(0-10% MeOH/DCM)純化吸附至矽藻土上之粗殘餘物以提供中間體20 (14.6 mg, 19%)。LCMS (AA):m/z = 586.3 (M+H)。 實例22
表17中所列示之化合物係如實例9中所述，用表中所示之起始材料替代中間體10來製備。 表17
起始材料 產物 分析數據
Figure 02_image368
Int-11 使用6當量
Figure 02_image370
Int-21		 LCMS (AA):m/z = 1392.2 (M+H)
Figure 02_image372
Int-37 使用6當量
Figure 02_image374
Int-38		 LCMS (AA):m/z = 785.3 (M/2+H)
Figure 02_image376
Int-42 使用6當量
Figure 02_image378
Int-43		 LCMS (AA):m/z = 1923.2 (M+H)
實例23 (2S ,3S ,4S ,5R ,6S )-6-{2-[(3-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}丙醯基)胺基]-4-[({[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基](甲基)胺甲醯基}氧基)甲基]苯氧基}-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-甲酸，化合物24 (C-24)
Figure 02_image380
步驟1：(2S ,3S ,4S ,5R ,6S )-3,4,5-三乙醯氧基-6-{2-[(3-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}丙醯基)胺基]-4-[({[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基](甲基)胺甲醯基}氧基)甲基]苯氧基}四氫-2H-吡喃-2-甲酸甲酯
標題化合物係遵循實例6之步驟1中所述之程序，用中間體6 (104 mg, 0.094 mmol)及(2S ,3S ,4S ,5R ,6S )-3,4,5-三乙醯氧基-6-[2-[3-(9H -茀-9-基甲氧基羰基胺基)丙醯基胺基]-4-[(4-硝基苯氧基)羰基氧基甲基]苯氧基]四氫吡喃-2-甲酸甲酯(150 mg, 0.16 mmol) (關於合成參見Jeffrey, S.C.等人，Bioconjugate Chem . 2006,17 , 831-840)開始，使用N,N -二異丙基乙胺作為鹼來製備，以提供呈銨鹽形式之(2S ,3S ,4S ,5R ,6S )-3,4,5-三乙醯氧基-6-{2-[(3-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}丙醯基)胺基]-4-[({[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基](甲基)胺甲醯基}氧基)甲基]苯氧基}四氫-2H-吡喃-2-甲酸甲酯(71 mg, 48%)。LCMS (AA):m/z = 1570.9 (M+H)。 步驟2：(2S ,3S ,4S ,5R ,6S )-6-{2-[(3-胺基丙醯基)胺基]-4-[({[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基](甲基)胺甲醯基}氧基)甲基]苯氧基}-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-甲酸，中間體22
在室溫下，向呈銨鹽形式之(2S ,3S ,4S ,5R ,6S )-3,4,5-三乙醯氧基-6-{2-[(3-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}丙醯基)胺基]-4-[({[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基](甲基)胺甲醯基}氧基)甲基]苯氧基}四氫-2H-吡喃-2-甲酸甲酯(66 mg, 0.042 mmol)溶解於THF (13 mL)中之溶液中添加LiOH (0.5M水溶液，1.25 mL, 0.625 mmol)且將反應混合物攪拌2.5 h。用1M HCl將反應混合物中和至pH 7且將混合物濃縮至乾燥。藉由反相急速管柱層析(0-30% ACN/碳酸氫銨水溶液(5 mM))純化粗殘餘物以提供呈銨鹽形式之中間體22 (26 mg, 50%)。然後將此材料溶解於MeOH (5 mL)中並添加三乙胺(1 mL)。將混合物搖晃1 min。去除溶劑且將所得殘餘物凍乾過夜以提供呈N,N -二乙基乙胺鹽形式之(2S ,3S ,4S ,5R ,6S )-6-{2-[(3-胺基丙醯基)胺基]-4-[({[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基](甲基)胺甲醯基}氧基)甲基]苯氧基}-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-甲酸(中間體22, 30 mg, 100%)。LCMS (AA):m/z = 1209.0 (M+H)。 步驟3：(2S ,3S ,4S ,5R ,6S )-6-{2-[(3-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}丙醯基)胺基]-4-[({[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基](甲基)胺甲醯基}氧基)甲基]苯氧基}-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-甲酸，化合物24
標題化合物係遵循實例6之步驟3中所述之程序，使用中間體22 (24 mg, 0.02 mmol)替代中間體8來製備，以提供呈銨鹽形式之(2S ,3S ,4S ,5R ,6S )-6-{2-[(3-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}丙醯基)胺基]-4-[({[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基](甲基)胺甲醯基}氧基)甲基]苯氧基}-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-甲酸(C-24, 17 mg, 71%)。LCMS (AA):m/z = 1402.4 (M+H)。HRMS (m/z ): C56 H65 N11 O24 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1402.3193；實驗值1402.3232。 實例24
表18中所列示之化合物(化合物25)係如實例23之步驟3中所述，用表中所示之起始材料分別替代6-馬來醯亞胺基己酸N -琥珀醯亞胺基酯來製備。 表18
起始材料 產物 分析數據
Figure 02_image269
 C-25 LCMS (AA):m/z = 1544.8 (M+H); HRMS (m/z ): C64 H79 N11 O26 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1544.4187；實驗值1544.4232。
C-25結構：
Figure 02_image383
實例25 {2-[(2R )-2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)吡咯啶-1-基]-2-側氧基乙基}胺基甲酸4-{[(2S )-2-{[(2S )-2-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}苄基酯，化合物26 (C-26)
Figure 02_image385
步驟1：2-[[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯基胺基]-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲氧基羰基胺基]乙酸
在室溫下，向甘胺酸(24 mg, 0.32 mmol)於三乙胺(0.10 mL, 0.72 mmol)、DMF (0.50 mL)及DMSO (0.50 mL)中之溶液中添加碳酸[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯基胺基]-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲酯(4-硝基苯基)酯(220 mg, 0.34 mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌4 h。然後將反應混合物冷卻至0℃。添加水(1 mL)並藉由添加甲酸將溶液酸化至pH 4。將混合物濃縮至乾燥，並藉由反相急速管柱層析(0-100% ACN/甲酸水溶液(0.1%))純化粗殘餘物以提供2-[[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯基胺基]-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲氧基羰基胺基]乙酸(87 mg, 44%)。LCMS (AA):m/z = 586.3 (M-H)。 步驟2：{2-[(2R )-2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)吡咯啶-1-基]-2-側氧基乙基}胺基甲酸4-{[(2S )-2-{[(2S )-2-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}苄基酯，化合物26
在室溫下，向2-[[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯基胺基]-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲氧基羰基胺基]乙酸(40 mg, 0.068 mmol)及三乙胺(35 uL, 0.25 mmol)於DMF (1 mL)中之溶液中添加1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-1H -1,2,3-三唑并[4,5-b ]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸鹽(46 mg, 0.12 mmol)，且將反應混合物攪拌10 min。然後在室溫下向此溶液中逐滴添加呈2,2,2-三氟乙酸鹽形式之(2R )-N-{9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}吡咯啶-2-甲醯胺(中間體15, 50 mg, 0.047 mmol)於DMF (0.60 mL)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌30 min。然後將混合物冷卻至0℃，添加水(1 mL)，並藉由添加甲酸將溶液酸化至pH 4。將混合物濃縮至乾燥，並藉由反相急速管柱層析(0-100% ACN/甲酸水溶液(0.1%))純化粗殘餘物以提供{2-[(2R )-2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)吡咯啶-1-基]-2-側氧基乙基}胺基甲酸4-{[(2S )-2-{[(2S )-2-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}苄基酯(C-26, 32 mg, 50%)。LCMS (AA):m/z = 1316.4 (M+H)。HRMS (m/z ): C53 H67 N13 O19 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1316.3666；實驗值1316.3705。 實例26 (2R )-1-({[(2S )-2-{[(2S )-2-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}乙醯基)-N-{9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}吡咯啶-2-甲醯胺，化合物27 (C-27)
Figure 02_image387
步驟1：{2-[(2R )-2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)吡咯啶-1-基]-2-側氧基乙基}胺基甲酸第三丁基酯
向中間體15 (60 mg, 0.05 mmol)及(第三丁氧基羰基)甘胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(19 mg, 0.07 mmol)於DMF (1.6 mL)中之混合物中添加三乙胺(50 uL, 0.355 mmol)，且將反應混合物在室溫下攪拌1 h。用水淬滅反應混合物，添加矽藻土並將反應混合物濃縮至乾燥。藉由反相管柱層析(0-100% ACN/碳酸氫銨水溶液(5 mM))純化吸附至矽藻土上之粗殘餘物。將三乙胺(14 uL, 0.1 mmol)添加至產物之水溶液中。凍乾過夜提供呈N,N -二乙基乙胺鹽形式之{2-[(2R )-2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)吡咯啶-1-基]-2-側氧基乙基}胺基甲酸第三丁基酯(49 mg, 87%)。LCMS (AA):m/z = 904.4 (M+H)。 步驟2：(2R )-1-(胺基乙醯基)-N-{9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}吡咯啶-2-甲醯胺
向呈N,N -二乙基乙胺鹽形式之{2-[(2R )-2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)吡咯啶-1-基]-2-側氧基乙基}胺基甲酸第三丁基酯(37 mg, 0.033 mmol)於MeOH (1 mL)中之溶液中添加鹽酸(4M溶液於二㗁烷中，1 mL, 4 mmol)，且將反應混合物在室溫下攪拌1 h。然後將反應混合物濃縮至乾燥並置於真空下2 h以提供呈鹽酸鹽形式之(2R )-1-(胺基乙醯基)-N-{9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}吡咯啶-2-甲醯胺(37 mg, 100%)。LCMS (AA):m/z = 804.2 (M+H)。 步驟3：(2R )-1-({[(2S )-2-{[(2S )-2-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}乙醯基)-N-{9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞乙基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}吡咯啶-2-甲醯胺，化合物27
標題化合物係遵循實例26之步驟1中所述之程序，用呈鹽酸鹽形式之(2R )-1-(胺基乙醯基)-N-{9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}吡咯啶-2-甲醯胺(30 mg, 0.027 mmol)及(2S )-2-[[(2S )-2-[6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己醯基胺基]-3-甲基-丁醯基]胺基]丙酸(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)酯(24 mg, 0.04 mmol)(關於合成參見US20180015176A1)開始來製備。藉由反相急速管柱層析(0-100% ACN/甲酸水溶液(0.1%))純化獲得(2R )-1-({[(2S )-2-{[(2S )-2-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}乙醯基)-N-{9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}吡咯啶-2-甲醯胺(C-27, 20 mg, 64%)。LCMS (AA):m/z = 1167.1 (M+H)。HRMS (m/z ): C45 H60 N12 O17 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1167.3189；實驗值1167.3206。 實例27 [2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S )-2-({(2S )-2-[(胺基乙醯基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基酯，化合物28 (C-28)
Figure 02_image389
步驟1：(2-{[(2S )-1-{[(2S )-1-({4-[({[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基](甲基)胺甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基)-1-側氧基丙-2-基]胺基}-3-甲基-1-側氧基丁-2-基]胺基}-2-側氧基乙基)胺基甲酸第三丁基酯
標題化合物係遵循實例6之步驟3中所述之程序，用中間體8 (23 mg, 0.016 mmol)及(第三丁氧基羰基)甘胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(11 mg, 0.039 mmol)替代6-馬來醯亞胺基己酸N -琥珀醯亞胺基酯開始來製備。將反應混合物在室溫下攪拌30 min。藉由反相急速管柱層析(0-100% ACN/三乙基乙酸銨水溶液(10 mM))純化獲得呈N,N -二乙基乙胺鹽形式之(2-{[(2S )-1-{[(2S )-1-({4-[({[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基](甲基)胺甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基)-1-側氧基丙-2-基]胺基}-3-甲基-1-側氧基丁-2-基]胺基}-2-側氧基乙基)胺基甲酸第三丁基酯(13 mg, 57%)。LCMS (AA):m/z = 1273.1 (M+H)。 步驟2：[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S )-2-({(2S )-2-[(胺基乙醯基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基酯，化合物28
標題化合物係遵循實例5之步驟2中所述之程序，用呈N,N -二乙基乙胺鹽形式之(2-{[(2S )-1-{[(2S )-1-({4-[({[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基](甲基)胺甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺基)-1-側氧基丙-2-基]胺基}-3-甲基-1-側氧基丁-2-基]胺基}-2-側氧基乙基)胺基甲酸第三丁基酯(6.6 mg, 0.005 mmol)替代[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸第三丁基酯開始來製備。將反應混合物在室溫下攪拌5 min以提供呈2,2,2-三氟乙酸鹽形式之[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S )-2-({(2S )-2-[(胺基乙醯基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基酯(C-28, 5.6 mg, 91%)。LCMS (AA):m/z = 1173.3 (M+H)。 實例28
表20中所列示之化合物係如實例27中所述，用表19中所示之起始材料替代(第三丁氧基羰基)甘胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯來製備。 表19
起始材料 產物 分析數據
Figure 02_image391
如美國專利第6022966號中所述製備		 C-29 LCMS (AA):m/z = 1287.2 (M+H)
Figure 02_image393
Int-23		 C-30 LCMS (AA):m/z = 1349.3 (M+H)
表20
產物 結構
C-29
Figure 02_image395
C-30
Figure 02_image397
實例29 {14-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-14-側氧基-3,6,9,12-四氧雜十四烷-1-基}胺基甲酸第三丁基酯(中間體23)
Figure 02_image399
步驟1：{14-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-14-側氧基-3,6,9,12-四氧雜十四烷-1-基}胺基甲酸第三丁基酯，中間體23
在室溫下，向2,2-二甲基-4-側氧基-3,8,11,14,17-五氧雜-5-氮雜十九烷-19-酸(120 mg, 0.32 mmol)及1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺(78 mg, 0.49 mmol)溶解於DCM (6.4 mL)中之溶液中添加N -羥基琥珀醯亞胺(46 mg, 0.39 mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌2.5 h。用水淬滅反應混合物且用DCM (3×)萃取。用鹽水洗滌合併之有機相，乾燥(Na2 SO4 )，過濾並蒸發以提供粗{14-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-14-側氧基-3,6,9,12-四氧雜十四烷-1-基}胺基甲酸第三丁基酯(中間體23, 146 mg, 100%)。LCMS (AA):m/z = 447.2 (M-H)。 實例30 N-[(1S )-2-[(2-氯羰基苯基)甲基-[(2,4-二甲氧基苯基)甲基]胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]胺基甲酸第三丁基酯(中間體24)
Figure 02_image401
步驟1：2-[[(2,4-二甲氧基苯基)甲基胺基]甲基]苯甲酸
標題化合物係遵循實例10之步驟1中所述之程序，用2-羧基苯甲醛(6.0 g, 40 mmol)及2,4-二甲氧基苄基胺(12 mL, 80 mmol)開始來製備，以提供2-[[(2,4-二甲氧基苯基)甲基胺基]甲基]苯甲酸(7.6 g, 61%)。LCMS (AA):m/z = 302.2 (M+H)。 步驟2：2-[[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)丙醯基]-[(2,4-二甲氧基苯基)甲基]胺基]甲基]苯甲酸
向2-[[(2,4-二甲氧基苯基)甲基胺基]甲基]苯甲酸(380 mg, 1.26 mmol)及三乙胺(0.5 mL, 3.55 mmol)於DMF (6 mL)中之溶液中添加(第三丁氧基羰基)-L -丙胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(640 mg, 2.2 mmol)。添加水(2 mL)以幫助溶解反應混合物，將其在室溫下攪拌1 d。然後將反應混合物濃縮至乾燥，並藉由反相急速管柱層析(0-100% ACN/甲酸水溶液(0.1%))純化粗殘餘物以提供2-[[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)丙醯基]-[(2,4-二甲氧基苯基)甲基]胺基]甲基]苯甲酸(322 mg, 51%)。LCMS (AA):m/z = 473.3 (M+H)。 步驟3：N-[(1S )-2-[(2-氯羰基苯基)甲基-[(2,4-二甲氧基苯基)甲基]胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]胺基甲酸第三丁基酯，中間體24
標題化合物係遵循實例1之步驟2中所述之程序，用2-[[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)丙醯基]-[(2,4-二甲氧基苯基)甲基]胺基]甲基]苯甲酸(270 mg, 0.57 mmol)替代2-(((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)甲基)苯甲酸開始來製備，以提供粗中間體24 (280 mg, 100%)。 實例31 2-({[(2S )-2-{[(2S )-2-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}甲基)-N-{9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}苯甲醯胺，化合物31 (C-31)
Figure 02_image403
步驟1：[(2S )-1-{[(2S )-1-{[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]胺基}-1-側氧基丙-2-基]胺基}-3-甲基-1-側氧基丁-2-基]胺基甲酸第三丁基酯
標題化合物係遵循實例26之步驟1中所述之程序，用中間體16 (45 mg, 0.53 mmol)及(第三丁氧基羰基)-L -纈胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(100 mg, 0.32 mmol)分別替代中間體15及(第三丁氧基羰基)甘胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯開始來製備。藉由反相急速管柱層析(0-100% ACN/乙酸銨水溶液(10 mM))純化獲得呈銨鹽形式之[(2S )-1-{[(2S )-1-{[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]胺基}-1-側氧基丙-2-基]胺基}-3-甲基-1-側氧基丁-2-基]胺基甲酸第三丁基酯(24 mg, 44%)。LCMS (AA):m/z = 1053.0 (M+H)。 步驟2：2-({[(2S )-2-{[(2S )-2-胺基-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}甲基)-N-{9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}苯甲醯胺
標題化合物係遵循實例5之步驟2中所述之程序，用呈銨鹽形式之[(2S )-1-{[(2S )-1-{[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]胺基}-1-側氧基丙-2-基]胺基}-3-甲基-1-側氧基丁-2-基]胺基甲酸第三丁基酯(24 mg, 0.023 mmol)替代[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸第三丁基酯開始來製備，以提供呈2,2,2-三氟乙酸鹽形式之2-({[(2S )-2-{[(2S )-2-胺基-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}甲基)-N-{9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}苯甲醯胺(24 mg, 97%)。LCMS (AA):m/z = 953.1 (M+H)。 步驟3：2-({[(2S )-2-{[(2S )-2-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}甲基)-N-{9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}苯甲醯胺，化合物31
標題化合物係遵循實例6之步驟3中所述之程序，用呈2,2,2-三氟乙酸鹽形式之2-({[(2S )-2-{[(2S )-2-胺基-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}甲基)-N-{9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}苯甲醯胺(24 mg, 0.022 mmol)替代中間體8開始來製備，以提供呈銨鹽形式之2-({[(2S )-2-{[(2S )-2-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}甲基)-N-{9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}苯甲醯胺(C-31, 6.2 mg, 23%)。LCMS (AA):m/z = 1146.1 (M+H)。HRMS (m/z ): C46 H57 N11 O16 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1146.2974；實驗值1146.2998。 實例32 碳酸4-{[(2S )-2-{[(2S )-2-{[6-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖㖕-5(6H)-基)-6-側氧基己醯基]胺基}-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}苄基酯4-硝基苯基酯(中間體25)
Figure 02_image405
步驟1：6-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖㖕-5(6H)-基)-N-[(2S )-1-{[(2S )-1-{[4-(羥基甲基)苯基]胺基}-1-側氧基丙-2-基]胺基}-3-甲基-1-側氧基丁-2-基]-6-側氧基己醯胺
向(2S )-2-胺基-N-[(1S )-2-[4-(羥基甲基)苯胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]-3-甲基-丁醯胺(240 mg, 0.82 mmol)溶解於DMF (2 mL)及THF (5.5 mL)中之溶液中添加N,N -二異丙基乙胺(0.39 mL, 2.24 mmol)。將反應混合物冷卻至0℃且添加1-{[6-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖㖕-5(6H)-基)-6-側氧基己醯基]氧基}吡咯啶-2,5-二酮(320 mg, 0.75 mmol)。將反應混合物升溫至室溫且攪拌30 min。用水稀釋反應混合物且用EtOAc (3×)萃取。用飽和碳酸氫鈉水溶液及鹽水洗滌合併之有機相，乾燥(Na2 SO4 )，過濾並蒸發至乾燥。藉由矽膠層析(50-100% EtOAc/DCM)純化粗殘餘物以提供6-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖㖕-5(6H)-基)-N-[(2S )-1-{[(2S )-1-{[4-(羥基甲基)苯基]胺基}-1-側氧基丙-2-基]胺基}-3-甲基-1-側氧基丁-2-基]-6-側氧基己醯胺(347 mg, 76%)。LCMS (AA):m/z = 609.4 (M+H)。 步驟2：碳酸4-{[(2S )-2-{[(2S )-2-{[6-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖㖕-5(6H)-基)-6-側氧基己醯基]胺基}-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}苄基酯4-硝基苯基酯，中間體25
向6-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖㖕-5(6H)-基)-N-[(2S )-1-{[(2S )-1-{[4-(羥基甲基)苯基]胺基}-1-側氧基丙-2-基]胺基}-3-甲基-1-側氧基丁-2-基]-6-側氧基己醯胺(257 mg, 0.42 mmol)於冷卻至0℃之THF (4.2 mL)及N,N -二異丙基乙胺(0.37 mL, 2.1 mmol)中之溶液中一次性添加氯甲酸4-硝基苯基酯(362 mg, 1.69 mmol)。將反應混合物升溫至室溫並攪拌3 h。用水稀釋反應混合物且用DCM (3×)萃取。用飽和碳酸氫鈉水溶液及鹽水洗滌合併之有機相，乾燥(Na2 SO4 )，過濾並蒸發至乾燥。藉由矽膠層析(0-100% EtOAc/DCM)純化粗殘餘物以提供碳酸4-{[(2S )-2-{[(2S )-2-{[6-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖㖕-5(6H)-基)-6-側氧基己醯基]胺基}-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}苄基酯4-硝基苯基酯(中間體25, 137 mg, 42%)。LCMS (AA):m/z = 774.4 (M+H)。 實例33
表21中所列示之化合物(中間體26)係如實例32中所述，用表中所示之起始材料替代1-{[6-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖㖕-5(6H)-基)-6-側氧基己醯基]氧基}吡咯啶-2,5-二酮來製備。 表21
起始材料 產物 分析數據
Figure 02_image407
Figure 02_image409
Int-26		 LCMS (AA):m/z = 746.3 (M+H)
實例34 (2S )-2-{[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖㖕-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]胺基}-4-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-N-(2,5,8,11,14,17,20-七氧雜二十二烷-22-基)-4-側氧基丁醯胺(中間體27)及(25S )-25-{[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖㖕-5(6H )-基)-4-側氧基丁醯基]胺基}-24-側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-27-酸(中間體27A)
Figure 02_image411
步驟1：(25S )-25-{[(苄基氧基)羰基]胺基}-24-側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-27-酸第三丁基酯
標題化合物係遵循實例26之步驟1中所述之程序，用(3S )-3-{[(苄基氧基)羰基]胺基}-4-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-4-側氧基丁酸第三丁基酯(2.2 g, 5.3 mmol)及2,5,8,11,14,17,20-七氧雜二十二烷-22-胺(2.0 g, 5.9 mmol)分別替代中間體15及(第三丁氧基羰基)甘胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯開始來製備。藉由矽膠層析(0-10% MeOH/DCM)純化獲得(25S )-25-{[(苄基氧基)羰基]胺基}-24-側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-27-酸第三丁基酯(3.8 g, 100%)。 步驟2：(25S )-25-胺基-24-側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-27-酸第三丁基酯
將(25S )-25-{[(苄基氧基)羰基]胺基}-24-側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-27-酸第三丁基酯(3.8 g, 5.9 mmol)溶解於乙醇(100 mL)中。添加鈀(10%於碳上，1.38 g, 1.17 mmol)且將混合物在氫(15 psi)下攪拌3 h。將反應混合物過濾，用甲醇洗滌且將濾液蒸發至乾燥以提供(25S )-25-胺基-24-側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-27-酸第三丁基酯(2.56 g, 85%)。 步驟3：(25S )-25-{[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖㖕-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]胺基}-24-側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-27-酸第三丁基酯
在0℃下，向(25S )-25-胺基-24-側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-27-酸第三丁基酯(3.32 g, 6.5 mmol)、4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖㖕-5(6H)-基)-4-側氧基丁酸(1.5 g, 4.91 mmol)及1-羥基-7-氮雜苯并三唑(884 mg, 6.57 mmol)於DCM (50 mL)中之溶液中添加1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺(1.25 g, 6.56 mmol)及三乙胺(1.26 mL, 9.1 mmol)。將反應混合物升溫至室溫並攪拌16 h。用EtOAc稀釋反應物且添加碳酸鉀(20 mL，4.0 M於水中)。將混合物攪拌15 min並將有機相分離，用飽和碳酸氫鈉水溶液、鹽水洗滌，乾燥(Na2 SO4 )，過濾並蒸發至乾燥。藉由矽膠層析(0-10% MeOH/DCM)純化粗殘餘物以提供(25S )-25-{[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖㖕-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]胺基}-24-側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-27-酸第三丁基酯(2.27 g, 44%)。 步驟4：(25S )-25-{[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖㖕-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]胺基}-24-側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-27-酸
標題化合物係遵循實例5之步驟2中所述之程序，用(25S )-25-{[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖㖕-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]胺基}-24-側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-27-酸第三丁基酯(278 mg, 0.35 mmol)替代[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸第三丁基酯開始來製備。藉由矽膠層析(0-20% MeOH/DCM)純化獲得(25S )-25-{[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖㖕-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]胺基}-24-側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-27-酸(中間體27A, 180 mg, 70%)。LCMS (AA):m/z = 742.4 (M+H)。 步驟5：(2S )-2-{[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖㖕-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]胺基}-4-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-N-(2,5,8,11,14,17,20-七氧雜二十二烷-22-基)-4-側氧基丁醯胺，中間體27
標題化合物係遵循實例29中所述之程序，用(25S )-25-{[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖㖕-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]胺基}-24-側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-27-酸(60 mg, 0.08 mmol)替代2,2-二甲基-4-側氧基-3,8,11,14,17-五氧雜-5-氮雜十九烷-19-酸開始來製備。將反應混合物在室溫下攪拌30 min以提供(2S )-2-{[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖㖕-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]胺基}-4-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-N-(2,5,8,11,14,17,20-七氧雜二十二烷-22-基)-4-側氧基丁醯胺(中間體27, 68 mg, 100%)。LCMS (AA):m/z = 839.4 (M+H)。 實例35
表23中所列示之化合物係如實例6之步驟3中所述，用表22中所示之起始材料替代6-馬來醯亞胺基己酸N -琥珀醯亞胺基酯來製備。 表22
起始材料 產物 分析數據
Figure 02_image413
 Int-28* LCMS (AA):m/z = 1424.0 (M+H)
Figure 02_image415
Int-30		 Int-29 LCMS (AA):m/z = 1696.0 (M+H)
Figure 02_image417
 Int-41 LCMS (AA):m/z = 1504.7 (M-H)
*使用三乙胺作為鹼替代N,N -二異丙基乙胺。 表23
產物 結構
Int-28*
Figure 02_image419
  
Int-29
Figure 02_image421
Int-41
Figure 02_image423
實例36 {(29S )-30-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-26,30-二側氧基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜-27-氮雜三十烷-29-基}胺基甲酸第三丁基酯(中間體30)
Figure 02_image425
步驟1：(29S )-29-[(第三丁氧基羰基)胺基]-26-側氧基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜-27-氮雜三十烷-30-酸
標題化合物係遵循實例21之步驟1中所述之程序，用(S )-3-胺基-2-((第三丁氧基羰基)胺基)丙酸(238 mg, 1.17 mmol)及1-[(26-側氧基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜二十六烷-26-基)氧基]吡咯啶-2,5-二酮(300 mg, 0.58 mmol)替代(S )-2-胺基-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸鹽酸鹽及1-[(17-側氧基-2,5,8,11,14-五氧雜十七烷-17-基)氧基]吡咯啶-2,5-二酮開始，使用DMF作為溶劑並在室溫下攪拌2 h來製備。藉由反相急速管柱層析(0-100% ACN/三乙基乙酸銨水溶液(10 mM))純化獲得(29S )-29-[(第三丁氧基羰基)胺基]-26-側氧基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜-27-氮雜三十烷-30-酸(344 mg, 99%)。LCMS (AA):m/z = 599.4 (M+H)。 步驟2：{(29S )-30-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-26,30-二側氧基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜-27-氮雜三十烷-29-基}胺基甲酸第三丁基酯，中間體30
標題化合物係遵循實例21之步驟2中所述之程序，用(29S )-29-[(第三丁氧基羰基)胺基]-26-側氧基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜-27-氮雜三十烷-30-酸(100 mg, 0.166 mmol)替代(19S )-19-[4-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丁基]-17-側氧基-2,5,8,11,14-五氧雜-18-氮雜二十烷-20-酸開始，使用DCM作為溶劑並在室溫下攪拌1 h來製備。將反應混合物過濾且濃縮以提供粗{(29S )-30-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-26,30-二側氧基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜-27-氮雜三十烷-29-基}胺基甲酸第三丁基酯(中間體30, 116 mg, 100%)。 實例37 N-[[2-[[9-[(2R ,3R ,5S )-5-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3-羥基-四氫呋喃-2-基]-6-側氧基-1H-嘌呤-2-基]胺甲醯基]苯基]甲基]-N-甲基-胺基甲酸[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲酯(中間體32)
Figure 02_image427
步驟1：N-[[2-[[9-[(2R ,3R ,5S )-3-[第三丁基(二甲基)矽基]氧基-5-[[第三丁基(二甲基)矽基]氧基甲基]四氫呋喃-2-基]-6-側氧基-1H-嘌呤-2-基]胺甲醯基]苯基]甲基]-N-甲基-胺基甲酸[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲酯
將2-胺基-9-[(2R ,3R ,5S )-3-[第三丁基(二甲基)矽基]氧基-5-[[第三丁基(二甲基)矽基]氧基甲基]四氫呋喃-2-基]-1H-嘌呤-6-酮(1.62 g, 3.27 mmol) (關於合成參見Prakash, T.P.J. Med. Chem. 2005,48 , 1199-1210)溶解於無水吡啶中且濃縮至乾燥(3 × 3mL)，然後置於真空下15 min。將殘餘物在氬氣氛下溶解於吡啶(43 mL)中且添加中間體10 (5.91 g, 9.80 mmol)於吡啶(32 mL)中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌16 h。添加MeOH (20 mL)並將反應混合物濃縮至乾燥。添加MeOH (100 mL)及氫氧化銨(28-30%水溶液，50 mL)並將所得混合物攪拌60 min。將反應混合物濃縮至乾燥且將粗殘餘物吸附至矽藻土上，並藉由矽膠層析(0-100% EtOAc/己烷)純化以提供N-[[2-[[9-[(2R ,3R ,5S )-3-[第三丁基(二甲基)矽基]氧基-5-[[第三丁基(二甲基)矽基]氧基甲基]四氫呋喃-2-基]-6-側氧基-1H-嘌呤-2-基]胺甲醯基]苯基]甲基]-N-甲基-胺基甲酸[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲酯(2.17 g, 63%)。LCMS (AA):m/z = 1062.0 (M+H)。 步驟2：N-[[2-[[9-[(2R ,3R ,5S )-3-羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基]-6-側氧基-1H-嘌呤-2-基]胺甲醯基]苯基]甲基]-N-甲基-胺基甲酸[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲酯
向聚丙烯管中添加溶解於THF (27 mL)中之N-[[2-[[9-[(2R ,3R ,5S )-3-[第三丁基(二甲基)矽基]氧基-5-[[第三丁基(二甲基)矽基]氧基甲基]四氫呋喃-2-基]-6-側氧基-1H-嘌呤-2-基]胺甲醯基]苯基]甲基]-N-甲基-胺基甲酸[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲酯(2.17 g, 2.04 mmol)。添加三乙胺(2.26 mL, 16.1 mmol)，然後添加三乙胺三氫氟酸鹽(1.19 mL, 7.33 mmol)且將反應混合物在室溫下攪拌16 h。藉由添加飽和碳酸氫鈉水溶液緩慢淬滅反應混合物且然後用EtOAc稀釋。分離有機相並用鹽水洗滌，乾燥(Na2 SO4 )，過濾並蒸發至乾燥。藉由矽膠層析(0-20% MeOH/DCM)純化粗殘餘物以提供N-[[2-[[9-[(2R ,3R ,5S )-3-羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基]-6-側氧基-1H-嘌呤-2-基]胺甲醯基]苯基]甲基]-N-甲基-胺基甲酸[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲酯(1.18 g, 69%)。LCMS (AA):m/z = 834.4 (M+H)。 步驟3：N-[[2-[[9-[(2R ,3R ,5S )-5-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3-羥基-四氫呋喃-2-基]-6-側氧基-1H-嘌呤-2-基]胺甲醯基]苯基]甲基]-N-甲基-胺基甲酸[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲酯，中間體32
將N-[[2-[[9-[(2R ,3R ,5S )-3-羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基]-6-側氧基-1H-嘌呤-2-基]胺甲醯基]苯基]甲基]-N-甲基-胺基甲酸[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲酯(1.13 g, 1.36 mmol)溶解於無水吡啶中且濃縮至乾燥(3 × 15 mL)。將殘餘物溶解於吡啶(13.3 mL)中且添加4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(650 mg, 1.9 mmol)，然後添加4-二甲基胺基吡啶(8 mg, 0.068 mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌2 h。將反應混合物濃縮至乾燥且吸附至矽藻土上，並藉由矽膠層析(0-5% MeOH/DCM，含0.5% NEt3 )純化以提供N-[[2-[[9-[(2R ,3R ,5S )-5-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3-羥基-四氫呋喃-2-基]-6-側氧基-1H-嘌呤-2-基]胺甲醯基]苯基]甲基]-N-甲基-胺基甲酸[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲酯(中間體32, 1.12 g, 73%)。LCMS (AA):m/z = 1136.5 (M+H)。 實例38 [2-({9-[(2S ,5S ,7R ,8R ,12aR ,14R ,15R ,15aR )-15-氟-2,10,10-三氧橋-14-(9H-嘌呤-9-基)-2-氫硫基十氫-5,8-亞甲基呋喃并[2,3-m][1,3,6,9,10,11,2]四氧雜硫氮雜磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S )-2-({(2S )-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基酯或[2-({9-[(2R ,5S ,7R ,8R ,12aR ,14R ,15R ,15aR )-15-氟-2,10,10-三氧橋-14-(9H-嘌呤-9-基)-2-氫硫基十氫-5,8-亞甲基呋喃并[2,3-m][1,3,6,9,10,11,2]四氧雜硫氮雜磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S )-2-({(2S )-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基酯(中間體33)
Figure 02_image429
步驟1：N-[[2-[[9-[(2R ,3R ,5S )-5-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3-[[(2R ,3R ,4R ,5R )-3-[第三丁基(二甲基)矽基]氧基-4-氟-5-嘌呤-9-基-四氫呋喃-2-基]甲基胺磺醯基氧基]四氫呋喃-2-基]-6-側氧基-1H-嘌呤-2-基]胺甲醯基]苯基]甲基]-N-甲基-胺基甲酸[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲酯
將N-[[2-[[9-[(2R ,3R ,5S )-5-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3-羥基-四氫呋喃-2-基]-6-側氧基-1H-嘌呤-2-基]胺甲醯基]苯基]甲基]-N-甲基-胺基甲酸[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲酯(中間體32, 1.1 g, 0.97 mmol)、N-[[(2R ,3R ,4R ,5R )-3-[第三丁基(二甲基)矽基]氧基-4-氟-5-嘌呤-9-基-四氫呋喃-2-基]甲基]胺基磺酸(4-硝基苯基)酯(667 mg, 1.17 mmol)(關於合成參見PCT公開案第PCT/IB2019/052364號)、4-二甲基胺基吡啶(122 mg, 0.97 mmol)及4Å分子篩(1.74 g)於無水DCM (13.6 mL)中之混合物在室溫下在氬下攪拌10 min。然後添加三乙胺(0.60 mL, 4.3 mmol)且將反應混合物在40℃下攪拌16 h。將反應混合物過濾且濃縮，並藉由反相管柱層析(10-100% ACN/碳酸氫銨水溶液(5 mM))純化所得殘餘物以提供N-[[2-[[9-[(2R ,3R ,5S )-5-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3-[[(2R ,3R ,4R ,5R )-3-[第三丁基(二甲基)矽基]氧基-4-氟-5-嘌呤-9-基-四氫呋喃-2-基]甲基胺磺醯基氧基]四氫呋喃-2-基]-6-側氧基-1H-嘌呤-2-基]胺甲醯基]苯基]甲基]-N-甲基-胺基甲酸[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲酯(0.94 g, 62%)。LCMS (AA):m/z = 1565.0 (M+H)。 步驟2：N-[[2-[[9-[(2R ,3R ,5S )-5-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3-[[(2R ,3R ,4R ,5R )-4-氟-3-羥基-5-嘌呤-9-基-四氫呋喃-2-基]甲基胺磺醯基氧基]四氫呋喃-2-基]-6-側氧基-1H-嘌呤-2-基]胺甲醯基]苯基]甲基]-N-甲基-胺基甲酸[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲酯
向N-[[2-[[9-[(2R ,3R ,5S )-5-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3-[[(2R ,3R ,4R ,5R )-3-[第三丁基(二甲基)矽基]氧基-4-氟-5-嘌呤-9-基-四氫呋喃-2-基]甲基胺磺醯基氧基]四氫呋喃-2-基]-6-側氧基-1H-嘌呤-2-基]胺甲醯基]苯基]甲基]-N-甲基-胺基甲酸[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲酯(939 mg, 0.60 mmol)於聚丙烯管中之THF (12 mL)中之溶液中添加三乙胺三氫氟酸鹽(0.52 mL, 3.17 mmol)及三乙胺(0.98 mL, 6.95 mmol)。將反應溶液在室溫下攪拌過夜，然後用二氯甲烷稀釋，並相繼用飽和NaHCO3 水溶液及鹽水洗滌。經無水MgSO4 乾燥有機相，過濾且濃縮。藉由反相管柱層析(10-100% ACN/碳酸氫銨水溶液(5 mM))純化獲得之殘餘物以提供N-[[2-[[9-[(2R ,3R ,5S )-5-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3-[[(2R ,3R ,4R ,5R )-4-氟-3-羥基-5-嘌呤-9-基-四氫呋喃-2-基]甲基胺磺醯基氧基]四氫呋喃-2-基]-6-側氧基-1H-嘌呤-2-基]胺甲醯基]苯基]甲基]-N-甲基-胺基甲酸[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲酯(795 mg, 89%)。LCMS (AA):m/z = 1452.2 (M+H)。 步驟3：[(2R ,3R ,4R ,5R )-2-[[[(2R ,3R ,5S )-2-[2-[[2-[[[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲氧基羰基-甲基-胺基]甲基]苯甲醯基]胺基]-6-側氧基-1H-嘌呤-9-基]-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3-基]氧基磺醯基胺基]甲基]-4-氟-5-嘌呤-9-基-四氫呋喃-3-基]氧基膦酸
將亞磷酸二苯基酯(0.225 mL, 1.17 mmol)添加至N-[[2-[[9-[(2R ,3R ,5S )-5-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-3-[[(2R ,3R ,4R ,5R )-4-氟-3-羥基-5-嘌呤-9-基-四氫呋喃-2-基]甲基胺磺醯基氧基]四氫呋喃-2-基]-6-側氧基-1H-嘌呤-2-基]胺甲醯基]苯基]甲基]-N-甲基-胺基甲酸[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲酯(792 mg, 0.55 mmol)於吡啶(2 mL)中之0℃溶液中。完成添加後，將反應混合物在室溫下攪拌1 h。然後添加三乙胺(0.62 mL, 4.37 mmol)及水(0.51 mL, 28.3 mmol)，且將反應混合物在室溫下再攪拌60分鐘，然後濃縮至乾燥。然後將殘餘物溶解於乙酸(1.25 mL, 21.8 mmol)及水(0.33 mL, 18.6 mmol)中並在室溫下攪拌1 h。藉由添加三乙基矽烷(4.3 mL, 26.2 mmol)淬滅反應混合物並在室溫下攪拌1 h。然後將反應混合物濃縮至乾燥，且藉由反相管柱層析(10-100% ACN/碳酸氫銨水溶液(5 mM))純化殘餘物以提供呈銨鹽形式之[(2R ,3R ,4R ,5R )-2-[[[(2R ,3R ,5S )-2-[2-[[2-[[[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲氧基羰基-甲基-胺基]甲基]苯甲醯基]胺基]-6-側氧基-1H-嘌呤-9-基]-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3-基]氧基磺醯基胺基]甲基]-4-氟-5-嘌呤-9-基-四氫呋喃-3-基]氧基膦酸(396 mg, 59%)。LCMS (AA):m/z = 1213.4 (M+H)。 步驟4：[2-({9-[(2S ,5S ,7R ,8R ,12aR ,14R ,15R ,15aR )-15-氟-2,10,10-三氧橋-14-(9H-嘌呤-9-基)-2-氫硫基十氫-5,8-亞甲基呋喃并[2,3-m][1,3,6,9,10,11,2]四氧雜硫氮雜磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S )-2-({(2S )-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基酯或[2-({9-[(2R ,5S ,7R ,8R ,12aR ,14R ,15R ,15aR )-15-氟-2,10,10-三氧橋-14-(9H-嘌呤-9-基)-2-氫硫基十氫-5,8-亞甲基呋喃并[2,3-m][1,3,6,9,10,11,2]四氧雜硫氮雜磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S )-2-({(2S )-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基酯，中間體33
將氯磷酸二苯基酯(0.055 mL, 0.26 mmol)添加至吡啶(1.6 mL)中並將此溶液冷卻至-35℃。呈銨鹽形式之[(2R ,3R ,4R ,5R )-2-[[[(2R ,3R ,5S )-2-[2-[[2-[[[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲氧基羰基-甲基-胺基]甲基]苯甲醯基]胺基]-6-側氧基-1H-嘌呤-9-基]-5-(羥基甲基)四氫呋喃-3-基]氧基磺醯基胺基]甲基]-4-氟-5-嘌呤-9-基-四氫呋喃-3-基]氧基膦酸(80 mg, 0.065 mmol)於DCM (2.5 mL)及吡啶(3.2 mL)中之溶液經15 min逐滴添加至冷卻的反應混合物中。將所得溶液在-35℃下攪拌30 min。將固體3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮(25 mg, 0.15 mmol)及水(0.056 mL)分別添加至冷卻的反應混合物中，將其在室溫下再攪拌1 h。然後將反應溶液在冰浴中冷卻至0℃並藉由添加硫代硫酸鈉水溶液(0.2M水溶液，0.14 mL, 0.70 mmol)淬滅。將混合物在室溫下攪拌5 min且在減壓下濃縮。藉由反相管柱層析(0-50% ACN/三乙基乙酸銨水溶液(10 mM))純化所得殘餘物以提供呈N,N -二乙基乙胺鹽形式之[2-({9-[(2S ,5S ,7R ,8R ,12aR ,14R ,15R ,15aR )-15-氟-2,10,10-三氧橋-14-(9H-嘌呤-9-基)-2-氫硫基十氫-5,8-亞甲基呋喃并[2,3-m][1,3,6,9,10,11,2]四氧雜硫氮雜磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S )-2-({(2S )-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基酯或[2-({9-[(2R ,5S ,7R ,8R ,12aR ,14R ,15R ,15aR )-15-氟-2,10,10-三氧橋-14-(9H-嘌呤-9-基)-2-氫硫基十氫-5,8-亞甲基呋喃并[2,3-m][1,3,6,9,10,11,2]四氧雜硫氮雜磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S )-2-({(2S )-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基酯(中間體33, 27 mg, 31%)。LCMS (AA):m/z = 1227.9 (M+H)。1 H NMR (400 MHz, CD3 OD) δ 9.14 (s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.30 (s, 1H), 7.53 - 7.36 (m, 5H), 7.34 - 7.17 (m, 3H), 6.47 (d,J = 19.3 Hz, 1H), 6.16 (d,J = 5.1 Hz, 1H), 5.87 - 5.82 (m, 1H), 5.76 - 5.55 (m, 1H), 5.50 - 5.40 (m, 1H), 5.00 (s, 2H), 4.79 - 4.75 (m, 2H), 4.68 - 4.61 (m, 1H), 4.58 - 4.47 (m, 2H), 4.44 - 4.39 (m, 1H), 4.09 - 4.02 (m, 1H), 3.92 - 3.89 (m, 1H), 3.67 - 3.62 (m, 1H), 3.57 - 3.53 (m, 1H), 3.01 - 2.94 (m, 1H), 2.87 (s, 3H), 2.74 - 2.68 (m, 1H), 2.11 - 2.03 (m, 1H), 1.45 - 1.43 (m, 3H), 1.44 (s, 9H), 0.98 (d,J = 6.7 Hz, 3H), 0.93 (d,J = 6.7 Hz, 3H)。31 P NMR (162 MHz, CD3 OD) δ 57.35 (s, 1P)。 實例38A [4-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15R ,15aR ,16R )-15-氟-7-(5-氟-4-側氧基-3,4-二氫-7H -吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-16-羥基-2,10-二氧橋-2,10-二氫硫基八氫-12H -5,8-亞甲基呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-14-基]-9H -嘌呤-6-基}胺基)-4-側氧基丁基]甲基胺基甲酸4-{[(25S ,29S ,32S )-25-{[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖㖕-5(6H )-基)-4-側氧基丁醯基]胺基}-29-異丙基-32-甲基-24,27,30,33-四側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23,28,31-三氮雜三十三烷-33-基]胺基}苄基酯(C-34)
Figure 02_image431
向[4-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15R ,15aR ,16R )-15-氟-7-(5-氟-4-側氧基-3,4-二氫-7H -吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-16-羥基-2,10-二氧橋-2,10-二氫硫基八氫-12H -5,8-亞甲基呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-14-基]-9H -嘌呤-6-基}胺基)-4-側氧基丁基]甲基胺基甲酸4-{[(2S )-2-{[(2S )-2-胺基-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}苄基酯(Int-35, 17.4 mg, 0.0154 mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(3.49 mg, 0.0182 mmol)及(25S )-25-{[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖㖕-5(6H )-基)-4-側氧基丁醯基]胺基}-24-側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-27-酸(Int-27A) (10.4 mg, 0.0140 mmol)之懸浮液中添加DCM (0.37 mL)中之三乙胺(0.004 mL, 0.0266 mmol)。將混合物在室溫下攪拌20 min，然後添加DMF (0.15 mL, 2.23 mmol)。將此混合物在室溫下攪拌2 h後，濃縮溶劑。藉由反相急速管柱層析(0-50% ACN/三乙基乙酸銨水溶液(10 mM))純化粗殘餘物以提供呈N,N -二乙基乙胺鹽形式之[4-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15R ,15aR ,16R )-15-氟-7-(5-氟-4-側氧基-3,4-二氫-7H -吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-16-羥基-2,10-二氧橋-2,10-二氫硫基八氫-12H -5,8-亞甲基呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-14-基]-9H -嘌呤-6-基}胺基)-4-側氧基丁基]甲基胺基甲酸4-{[(25S ,29S,32S )-25-{[4-(11,12-二去氫二苯并[b,f]吖㖕-5(6H )-基)-4-側氧基丁醯基]胺基}-29-異丙基-32-甲基-24,27,30,33-四側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23,28,31-三氮雜三十三烷-33-基]胺基}苄基酯(C-34) (2.0 mg, 6.9%)。LCMS (AA):m/z = 926.9 (M/2+H)。HRMS (m/z ): C80 H101 F2 N15 O26 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1852.6000；實驗值1852.6006。 實例38B {(25S )-27-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-24,27-二側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-25-基}胺基甲酸(1R ,8S ,9s)-二環[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲酯(中間體36)
Figure 02_image433
步驟1：(25S )-25-{[(苄基氧基)羰基]胺基}-24-側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-27-酸第三丁基酯
標題化合物係遵循實例26之步驟1中所述之程序，用(3S )-3-{[(苄基氧基)羰基]胺基}-4-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-4-側氧基丁酸第三丁基酯(2.2 g, 5.3 mmol)及2,5,8,11,14,17,20-七氧雜二十二烷-22-胺(2.0 g, 5.9 mmol)分別替代中間體15及(第三丁氧基羰基)甘胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯開始來製備。藉由矽膠層析(0-10% MeOH/DCM)純化獲得(25S )-25-{[(苄基氧基)羰基]胺基}-24-側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-27-酸第三丁基酯(3.8 g, 100%)。 步驟2：(25S )-25-胺基-24-側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-27-酸第三丁基酯
將(25S )-25-{[(苄基氧基)羰基]胺基}-24-側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-27-酸第三丁基酯(3.8 g, 5.9 mmol)溶解於乙醇(100 mL)中。添加鈀(10%於碳上，1.38 g, 1.17 mmol)且將混合物在氫(15 psi)下攪拌3 h。將反應混合物過濾，用甲醇洗滌且將濾液蒸發至乾燥以提供(25S )-25-胺基-24-側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-27-酸第三丁基酯(2.56 g, 85%)。 步驟3：(25S )-25-({[(1R ,8S ,9s)-二環[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基]羰基}胺基)-24-側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-27-酸
向(25S )-25-胺基-24-側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-27-酸酯(587 mg, 1.15 mmol)於DCM (11.3 mL)中之溶液中添加TFA (11.3 mL)。將混合物在室溫下攪拌1h。將反應物濃縮並與甲苯共沸，且進一步在高真空上乾燥以獲得油狀粗中間體。在室溫下向粗油中間體中添加1-({[(1R ,8S ,9s)-二環[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮(279 mg, 0.959 mmol)及DCM (9.8 mL)、三乙胺(1.34 mL, 9.59 mmol)。將混合物在室溫下攪拌2 h。用EtOAc (50 mL)及碳酸鉀溶液(10 mL, 4.0 M於水中)稀釋反應混合物。用鹽水洗滌分離之有機層，經Na2 SO4 乾燥，過濾，且濃縮。藉由反相管柱層析(0-100% ACN/碳酸氫銨水溶液(5 mM))純化殘餘物。在真空中濃縮期望流分以獲得(25S )-25-({[(1R ,8S ,9s)-二環[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基]羰基}胺基)-24-側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-27-酸(19 mg, 3.1%產率)。LCMS (AA):m/z = 629.2 (M-H); 1H NMR (400 MHz，甲醇-d4) δ = 4.46 (dd,J = 5.7, 7.4 Hz, 1 H), 4.25 - 4.12 (m, 2 H), 3.68 - 3.51 (m, 28 H), 3.41 - 3.34 (m, 5 H), 2.80 - 2.60 (m, 2 H), 2.33 - 2.12 (m, 4 H), 1.69 - 1.54 (m, 2 H), 1.40 (quin,J = 8.7 Hz, 1 H), 1.02 - 0.89 (m, 2 H)。 步驟4：{(25S )-27-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-24,27-二側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-25-基}胺基甲酸(1R ,8S ,9s)-二環[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲酯(中間體36)
標題化合物係遵循實例29中所述之程序，用(25S)-25-({[(1R ,8S ,9s)-二環[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基]羰基}胺基)-24-側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-27-酸替代2,2-二甲基-4-側氧基-3,8,11,14,17-五氧雜-5-氮雜十九烷-19-酸開始來製備。將反應混合物在室溫下攪拌30 min以提供{(25S )-27-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-24,27-二側氧基-2,5,8,11,14,17,20-七氧雜-23-氮雜二十七烷-25-基}胺基甲酸(1R ,8S ,9s)-二環[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲酯(中間體36, 22 mg, 100%)。LCMS (AA):m/z = 728.4 (M+H)。 實例38C
表22A中所列示之化合物(中間體37及中間體42)係如實例10中所述，用步驟1及步驟2中所示之起始材料替代2,5,8,11,14,17,20-七氧雜二十二烷-22-胺(中間體37及中間體42)及(2S ,3S ,4S ,5R ,6S )-3,4,5-三乙醯氧基-6-{2-[(3-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}丙醯基)胺基]-4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯氧基}四氫-2H -吡喃-2-甲酸甲酯(中間體42)來製備。 表22A
起始材料 (步驟1) 起始材料 (步驟2) 產物 步驟2苯甲酸中間體之分析數據
Figure 02_image435
Figure 02_image437
Figure 02_image439
Int-37		 LCMS (AA):m/z = 935.6 (M-H);
Figure 02_image441
Figure 02_image442
*
Figure 02_image444
Int-42		 LCMS (AA):m/z = 1290.2 (M-H);
* 在步驟2中不使用DMAP 實例38D [2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H -嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S,5S)-57-胺基-5-異丙基-2-甲基-4,7-二側氧基-10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55-十六氧雜-3,6-二氮雜五十七烷)-1-醯基]胺基}苄基酯(C-37)
Figure 02_image446
步驟1：[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H -嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(53S ,56S )-1-疊氮基-53-異丙基-56-甲基-51,54,57-三側氧基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48-十六氧雜-52,55-二氮雜五十七烷-57-基]胺基}苄基酯
向中間體8 (18.68 mg, 0.01674 mmol)、1-[(1-疊氮基-51-側氧基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48-十六氧雜五十一烷-51-基)氧基]吡咯啶-2,5-二酮(32.3 mg, 0.03348 mmol)、THF (0.6 mL)及DMF (0.2 mL)之溶液中添加DIEA (0.044 mL, 0.2511 mmol)。將混合物在室溫下攪拌3 h，然後用MeOH (5 mL)淬滅。蒸發大部分溶劑後，藉由反相管柱層析(0-50% ACN/碳酸氫銨水溶液(5 mM))純化殘餘物。將期望流分濃縮並凍乾以獲得白色粉末狀標題化合物(17.8 mg, 55%)。LCMS (AA):m/z = 1915 (M-H)。 步驟2：[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H -嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S ,5S )-57-胺基-5-異丙基-2-甲基-4,7-二側氧基-10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55-十六氧雜-3,6-二氮雜五十七烷-1-醯基]胺基}苄基酯(C-37)
向50-mL圓底燒瓶中添加[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H -嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(53S ,56S )-1-疊氮基-53-異丙基-56-甲基-51,54,57-三側氧基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48-十六氧雜-52,55-二氮雜五十七烷-57-基]胺基}苄基酯(17.7 mg, 0.00923 mmol)、THF (1.0 mL)及三苯基膦(24.2 mg, 0.0923 mmol)。將此混合物在室溫下攪拌過夜。向反應混合物中添加氫氧化鈉(0.0554 mL, 1.0 mol/L水溶液)。將混合物在室溫下攪拌1 h後，將其濃縮。藉由反相管柱層析(0-50% ACN/碳酸氫銨水溶液(5 mM))純化殘餘物。將期望流分收集並凍乾以獲得白色鬆散粉末狀[2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H -嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S ,5S )-57-胺基-5-異丙基-2-甲基-4,7-二側氧基-10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55-十六氧雜-3,6-二氮雜五十七烷-1-醯基]胺基}苄基酯(C-37) (5.7 mg, 32%)。LCMS (AA):m/z = 1889 (M-H)。HRMS (m/z ): C80 H124 N12 O32 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1891.7434；實驗值1891.7433。 實例38EN -{(2S )-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H -吡咯-1-基)-1-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-1-側氧基己-2-基}-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜二十六烷-26-醯胺(中間體39)
Figure 02_image448
步驟1：(28S )-28-[4-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H -吡咯-1-基)丁基]-26-側氧基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜-27-氮雜二十九烷-29-酸
向(2S )-2-胺基-6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己酸鹽酸鹽(1.05 g, 4.00 mmol)及1-[(26-側氧基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜二十六烷-26-基)氧基]吡咯啶-2,5-二酮(2.08 g, 4.04 mmol)於吡啶(21.0 mL)中之混合物中添加DIEA (1.43 mL, 8.20 mmol)且將混合物在室溫下攪拌30 min，然後冷卻至0℃並攪拌過夜。去除揮發性溶劑，並將殘餘物與甲苯(3×20 mL)及乙腈(10 mL)共沸以獲得無色油狀(28S )-28-[4-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H -吡咯-1-基)丁基]-26-側氧基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜-27-氮雜二十九烷-29-酸(4.00 g, 100%產率)。LCMS (AA):m/z = 619.3 (M-H)。 步驟2：N -{(2S )-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H -吡咯-1-基)-1-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-1-側氧基己-2-基}-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜二十六烷-26-醯胺(中間體39)
將N -羥基琥珀醯亞胺(469 mg, 4.08 mmol)、N,N' -二環己基碳化二亞胺(824 mg, 4.00 mmol)及步驟1之粗(28S)-28-[4-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H -吡咯-1-基)丁基]-26-側氧基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜-27-氮雜二十九烷-29-酸(4.00 g, 4.00mmol)於DCM (76.7 mL, 1200 mmol)中之混合物在室溫下攪拌16 h。過濾自此反應析出之固體並將濾液濃縮以獲得粗油狀物。藉由矽膠層析(0-20% IPA/DCM)純化獲得無色油狀N -{(2S )-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H -吡咯-1-基)-1-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-1-側氧基己-2-基}-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜二十六烷-26-醯胺(中間體39) (1.70g, 52%)。1 H NMR (400 MHz，甲醇-d 4 ) δ ppm 1.42 - 1.55 (m, 2 H) 1.64 (m, 2 H) 1.81 - 1.93 (m, 1 H) 1.94 - 2.01 (m, 1 H) 2.52 (m, 2 H) 2.81 - 2.86 (m, 4 H) 3.36 (s, 3 H) 3.51 - 3.57 (m, 4 H) 3.60 - 3.66 (m, 26 H) 3.68 - 3.76 (m, 2 H) 4.03 - 4.17 (m, 2 H) 4.74 - 4.80 (m, 1 H) 6.74 - 6.86 (s, 2 H)。 實例38FN -{(2S )-6-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H -吡咯-1-基)乙醯基]胺基}-1-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-1-側氧基己-2-基}-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜二十六烷-26-醯胺(中間體40)
Figure 02_image450
步驟1：(28S )-28-{4-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁基}-26-側氧基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜-27-氮雜二十九烷-29-酸
標題化合物係遵循實例38E之步驟1中所述之程序，用N 6-(第三丁氧基羰基)-L -離胺酸(0.49 g, 1.99 mmol)替代(2S )-2-胺基-6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己酸鹽酸鹽開始來製備。藉由反相管柱層析(0-60% ACN/甲酸水溶液(0.1%))純化提供無色油狀(28S )-28-{4-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁基}-26-側氧基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜-27-氮雜二十九烷-29-酸(1.14 g, 90%)。LCMS (AA):m/z = 639.4 (M-H)。 步驟2：(28S )-28-(4-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H -吡咯-1-基)乙醯基]胺基}丁基)-26-側氧基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜-27-氮雜二十九烷-29-酸
在室溫下，向(28S )-28-{4-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁基}-26-側氧基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜-27-氮雜二十九烷-29-酸(148 mg, 0.2310 mmol)於DCM (2.0 mL)中之溶液中添加TFA (2.0 mL)。將混合物在室溫下攪拌15 min，蒸發，然後與甲苯(×3)共蒸發以獲得粗TFA鹽。將此粗產物在高真空下再乾燥2 h後，添加DCM (2650 mg, 2.00 mL, 31.2 mmol)中之馬來醯亞胺基乙酸NHS酯(69.89 mg, 0.2772 mmol)及DIEA (0.121 mL, 0.6929 mmol)，且將此反應物在室溫下攪拌16 h。蒸發反應混合物。藉由反相管柱層析(10-30% ACN/乙酸銨水溶液(10 mM))純化提供油狀(28S )-28-(4-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H -吡咯-1-基)乙醯基]胺基}丁基)-26-側氧基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜-27-氮雜二十九烷-29-酸(120 mg, 38%)。LCMS (AA):m/z = 676.3 (M-H)。 步驟3：N -{(2S )-6-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H -吡咯-1-基)乙醯基]胺基}-1-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-1-側氧基己-2-基}-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜二十六烷-26-醯胺(中間體40)
向含有(28S )-28-(4-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H -吡咯-1-基)乙醯基]胺基}丁基)-26-側氧基-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜-27-氮雜二十九烷-29-酸(311 mg, 0.459mmol)及DCM (2.94 mL)之燒瓶中添加N,N' -二環己基碳化二亞胺(94.7 mg, 0.459 mmol)及N -羥基琥珀醯亞胺(53.9 mg, 0.459 mmol)。將懸浮液在室溫下在氬氣氛下攪拌1 hr。然後將反應混合物冷卻至0℃，經由矽藻土過濾並用MeCN沖洗。蒸發濾液。將殘餘物再溶解於DCM中，用水(×2)洗滌，用MgSO4乾燥，且濃縮以獲得黏性油狀N -{(2S )-6-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H -吡咯-1-基)乙醯基]胺基}-1-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-1-側氧基己-2-基}-2,5,8,11,14,17,20,23-八氧雜二十六烷-26-醯胺(中間體40) (300 mg, 84.4%)。LCMS (AA):m/z = 773.2 (M-H)。 實例38G
表22C中所列示之化合物(C-43)係如實例23之步驟2及步驟3中所述，用表中所示之起始材料替代(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三乙醯氧基-6-{2-[(3-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}丙醯基)胺基]-4-[({[2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H -嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基](甲基)胺甲醯基}氧基)甲基]苯氧基}四氫-2H -吡喃-2-甲酸甲酯來製備。 表22B
起始材料 產物 分析數據
Figure 02_image452
Int-43		 C-43 LCMS (AA):m/z = 1755 (M+H); HRMS (m/z ): C72 H97 N11 O32 P2 S2 之[M+H]+ 計算值1754.5291；實驗值1754.5321。
表22C
產物 結構
C-43
Figure 02_image454
實例38H
表22D中所列出之化合物中間體-44係如實例38E中所述，用表22D中所示之起始材料(2R )-2-胺基-6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己酸鹽酸鹽替代步驟1中之(2S )-2-胺基-6-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)己酸鹽酸鹽來製備。  表22D
起始材料 產物 分析數據
Figure 02_image456
Figure 02_image458
Int-44		 LCMS (AA):m/z = 718.3 (M+H)
實例39 經由隨機半胱胺酸結合製備Ab-STING促效劑結合物之程序(繪示於圖1中)
向抗GCC抗體(純系5F9，參見PCT公開案第WO 2011/050242號，60 mg/mL)於50 mM組胺酸、100 mM精胺酸，pH 6.0緩衝液中之溶液中添加0.5M Tris/25 mM EDTA pH 8.0緩衝液，直至溶液之pH為7.5-8.0。向上述溶液中添加TCEP (10 mM溶液於H2 O中，3-5當量)。用氬吹掃反應混合物且在室溫或37℃下在溫和搖晃下培育2h。然後將期望連接體-酬載構築體(10 mM溶液於DMA中，5-9當量)緩慢添加至上述混合物中。用氬吹掃反應物且在37℃下在溫和搖晃下再培育1.5-2 h。遵循本文所述之製備型SEC方法純化反應混合物以獲得ADC。如分析方法中所述，藉由UV吸光度、分析型SEC及LC-QTOF分別測定ADC濃度、聚集百分比及DAR。
以上程序可用於製備其他抗體結合物。 實例40
表24中所列示之抗體藥物結合物係如實例39中所述，使用顯示為起始材料之起始連接體-酬載構築體來製備。 表24
起始材料 ADC產物 酬載 DAR 聚集% 產率%
C-21 ADC-1 化合物編號14 4.5 3.09 100
C-27 ADC-2 化合物I-5c 3.7 2.08 56
C-3 ADC-3 化合物I-5c 2.9 BLQ 57
C-16 ADC-4 化合物I-5c 3.5 2.13 69
C-8 ADC-5 化合物I-5c 3.6 1.54 50
C-24 ADC-6 化合物I-5c 2.5 2.58 56
C-26 ADC-7 化合物I-5c 4.1 BLQ 42
C-18 ADC-8 化合物I-5c 3.9 0.59 83
C-1 ADC-9 化合物I-5c 4.3 BLQ 29
C-4 ADC-15 化合物編號14 3.1 BLQ 63
C-38 ADC-16 化合物編號14 3.7 BLQ 60
實例41 經由轉麩醯胺酸酶結合製備Ab-STING促效劑結合物之程序(繪示於圖2中)
去糖基化：用等體積之pH 7.2 PBS稀釋抗GCC抗體(純系5F9，參見PCT公開案第WO 2011/050242號，60 mg/mL)於50 mM組胺酸、100 mM精胺酸，pH 6.0緩衝液中之溶液。向溶液中添加N-糖苷酶F (New England Biolabs, P0704S, 500,000單位/mL, 300單位/1mg抗體)，且在溫和混合下將反應混合物加熱至37℃過夜。將所得去糖基化5F9與PBS pH 7.2進行緩衝液交換。
轉麩醯胺酸酶結合：向上文製備之PBS中之去糖基化5F9溶液(10~20 mg/mL)中添加29-疊氮基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜二十九烷-1-胺(疊氮基-PEG9-胺, BroadPharm, BP-23556, 40當量)之0.1M DMSO溶液，然後添加轉麩醯胺酸酶(ACTIVATM , Ajinomoto, 5~10 mg/1 mg抗體)。在溫和混合下將反應混合物加熱至37℃過夜。遵循本文所述之製備型SEC方法純化產物以獲得5F9-NH-PEG-疊氮化物。
應變促進之疊氮化物-炔烴環加成：向上文製備之5F9-NH-PEG-疊氮化物結合物之溶液(2~15mg/mL於PBS中)中添加含有應變炔烴之連接體-酬載構築體之4~10 mM DMSO溶液(3-5當量，其中DMSO ＜總溶劑體積之10%)。將所得溶液在室溫下溫和攪拌過夜。遵循本文所述之製備型SEC方法純化產物以獲得ADC。如分析方法中所述，藉由UV吸光度、分析型SEC及LC-QTOF分別測定ADC濃度、聚集百分比及DAR。
以上程序可用於製備其他抗體結合物。 實例42
表25中所列示之抗體藥物結合物係如實例41中所述，使用在表中顯示為起始材料之起始連接體-酬載構築體來製備。 表25
起始材料 ADC產物 酬載 DAR 聚集% 產率%
C-15 ADC-10 化合物I-5c 1.8 BLQ 40
C-13 ADC-11 化合物I-5c 2 BLQ 81
實例43 經由轉麩醯胺酸酶結合製備Ab-STING促效劑結合物(繪示於圖3中)
向PBS中之去糖基化5F9溶液(10~20 mg/mL，遵循實例41中所述之去糖基化程序製備)中添加1M Tris、5M NaCl，pH 8.0緩衝液(總體積之10~20%)以將pH調節至8.0。向溶液中添加含一級胺之連接體-酬載構築體(20當量)之10mM DMSO溶液，然後添加轉麩醯胺酸酶(ACTIVATM , Ajinomoto, 100-150 mg/1 mg抗體)。在溫和混合下將反應混合物加熱至37℃過夜。使用HiTrap蛋白A HP管柱(GE Healthcare, 17-0402-01)，藉由首先用20mM磷酸鹽pH 7.0洗滌，然後用0.1M檸檬酸pH 4.0溶析ADC來純化產物。
以上程序可用於製備其他抗體結合物。 實例44
表26中所列示之抗體藥物結合物係如實例43中所述，使用在表中顯示為起始材料之起始連接體-酬載構築體來製備。 表26
起始材料 ADC產物 酬載 DAR 聚集% 產率%
C-30 ADC-17 化合物I-5c 1.6 BLQ 72
C-37 ADC-18 化合物I-5c 1.2 BLQ 72
實例45 2-胺基-N-(2-((2-(2-疊氮基乙醯胺基)乙基)胺基)-2-側氧基乙基)乙醯胺
Figure 02_image460
步驟1：(2,2-二甲基-4,7,10-三側氧基-3-氧雜-5,8,11-三氮雜十三烷-13-基)胺基甲酸苄基酯
在0℃下，向Boc-Gly-Gly-OH (550 mg, 2.32 mmol)、EDC·HCl (437 mg, 2.28 mmol)及HOAt (317 mg, 2.33 mmol)於DMF (8.0 mL)中之溶液中添加三乙胺(0.340 mL, 2.44 mmol)。將所得黃色異質混合物攪拌15min。緩慢添加(2-胺基乙基)胺基甲酸苄基酯(500 mg, 2.44 mmol)於DMF (6.0 mL)中之溶液。在10min內，將混合物升溫至室溫且攪拌3天以上。將反應混合物分配於水(100mL)及EtOAc (50mL)中。用EtOAc (50mL)萃取分離之水層。用50mL水、然後用鹽水洗滌合併之有機層，經Na2 SO4 乾燥且濃縮。藉由矽膠層析(0-6% MeOH/CH2 Cl2 )純化粗產物以提供白色固體狀N-[2-[[2-[2-(苄基氧基羰基胺基)乙基胺基]-2-側氧基-乙基]胺基]-2-側氧基-乙基]胺基甲酸第三丁基酯(617 mg, 1.51 mmol, 65%產率)。LCMS (FA): m/z = 431.2 (M+Na)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 ) δ 7.97-7.97 (m, 1H), 7.86-7.84 (m, 1H), 7.39-7.29 (m, 5H), 7.27-7.24 (m, 1H), 7.01-6.98 (m, 1H), 5.02 (s, 2H), 3.67 (d,J =5.62 Hz, 2H), 3.58 (d,J =5.87 Hz, 2H), 3.03-3.18 (m, 4H), 1.39 (s, 9H)。 步驟2：(2-((2-((2-胺基乙基)胺基)-2-側氧基乙基)胺基)-2-側氧基乙基)胺基甲酸第三丁基酯
向N-[2-[[2-[2-(苄基氧基羰基胺基)乙基胺基]-2-側氧基-乙基]胺基]-2-側氧基-乙基]胺基甲酸第三丁基酯(615 mg, 1.51 mmol)於乙醇(20.0 mL)中之溶液中添加10% Pd/C (62.0 mg, 0.0583 mmol)。用H2 (1atm)吹掃混合物且在室溫下攪拌3h。將矽藻土添加至反應混合物中且經矽藻土短床過濾漿液。濃縮濾液並藉由與甲苯共蒸發、然後高真空乾燥殘餘物以獲得灰白色固體狀N-[2-[[2-(2-胺基乙基胺基)-2-側氧基-乙基]胺基]-2-側氧基-乙基]胺基甲酸第三丁基酯(407 mg, 1.48 mmol, 98.5%產率)。LCMS (FA): m/z = 275.2 (M+H)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 ) δ 8.05-7.89 (m, 1H), 7.80-7.63 (m, 1H), 7.08-6.96 (m, 1H), 3.67 (d,J =5.75 Hz, 2H), 3.56 (d,J =5.87 Hz, 2H), 3.06 (q,J =6.24 Hz, 2H), 2.59-2.53 (m, 2H), 1.87-1.61 (m, 2H), 1.39 (s, 9H)。 步驟3：N-[2-[[2-[2-[(2-疊氮基乙醯基)胺基]乙基胺基]-2-側氧基-乙基]胺基]-2-側氧基-乙基]胺基甲酸第三丁基酯
將EDC·HCl (57.6 mg, 0.300 mmol)、HOAt (43.6 mg, 0.320 mmol)及2-疊氮基乙酸(27.0 μL, 0.315 mmol)於二氯甲烷(2.70 mL)中之混合物攪拌10分鐘。在冰浴中冷卻混合物，然後添加N-[2-[[2-(2-胺基乙基胺基)-2-側氧基-乙基]胺基]-2-側氧基-乙基]胺基甲酸第三丁基酯(75.0 mg, 0.273 mmol)，然後在幾分鐘內添加N,N-二異丙基乙胺(55.8 μL, 0.320 mmol)。將混合物在0℃下攪拌5min，然後在室溫下攪拌過夜。添加水(2mL)及EtOAc (5mL)，並將混合物劇烈攪拌20min。用EtOAc (25mL)稀釋混合物，然後用50%鹽水/水(20mL)及鹽水洗滌。經Na2 SO4 乾燥分離之有機層且濃縮。藉由矽膠層析(0-8% MeOH/CH2 Cl2 )純化提供玻璃固體狀N-[2-[[2-[2-[(2-疊氮基乙醯基)胺基]乙基胺基]-2-側氧基-乙基]胺基]-2-側氧基-乙基]胺基甲酸第三丁基酯(88.0 mg, 0.246 mmol, 90.1%產率)。LCMS (FA): m/z = 356.2 (M-H)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 ) δ 8.16-8.08 (m, 1H), 8.04-7.92 (m, 1H), 7.92-7.81 (m, 1H), 7.05-6.94 (m, 1H), 3.82 (s, 2H), 3.67 (d,J =5.62 Hz, 2H), 3.58 (d,J =5.87 Hz, 2H), 3.10-3.19 (m, 4H), 1.39 (s, 9H)。 步驟4：2-胺基-N-[2-[2-[(2-疊氮基乙醯基)胺基]乙基胺基]-2-側氧基-乙基]乙醯胺(中間體34)
向N-[2-[[2-[2-[(2-疊氮基乙醯基)胺基]乙基胺基]-2-側氧基-乙基]胺基]-2-側氧基-乙基]胺基甲酸第三丁基酯(86.0 mg, 0.241 mmol)於二氯甲烷(4.0 mL)中之溶液中添加三氟乙酸(1.00 mL, 8.77 mmol)。將混合物在室溫下攪拌30 min。用5mL甲苯稀釋混合物且濃縮。將殘餘物吸收於5mL水中並凍乾以提供無色糖漿狀2-胺基-N-[2-[2-[(2-疊氮基乙醯基)胺基]乙基胺基]-2-側氧基-乙基]乙醯胺2,2,2-三氟乙酸鹽(102 mg, 0.275 mmol，定量)。LCMS (FA): m/z = 258.1 (M+H)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 ) δ 8.55-8.62 (m, 1H), 8.12-8.20 (m, 1H), 8.02-8.09 (m, 1H), 7.90-8.02 (m, 3H), 3.74-3.82 (s, 2H), 3.80 (m, 2H), 3.55-3.68 (m, 2H), 3.11-3.19 (m, 4H)。 實例46 5F9-LPETGG-His6之產生及純化
使用來自Thermo Fisher目錄號A14635之瞬時Expi293F哺乳動物蛋白質表現系統套組來產生5F9-LPETGG-His6蛋白，該瞬時Expi293F哺乳動物蛋白質表現系統套組包括Expi293FTM細胞、Expi293TM表現生長培養基及Expifectamine 293TM轉染套組。用混合有5.4mL Expifectamine 293TM轉染試劑之0.666mg輕鏈DNA加0.334mg重鏈DNA轉染在5L開孔搖瓶中密度為2.8×106 個細胞/mL之1.8升Expi293FTM細胞，且在37℃、8% CO2 培育器中及100rpm搖晃下培育過夜。第二天，將來自套組之10mL增強劑1及100mL增強劑2添加至燒瓶中。將燒瓶在上述條件下培育且在轉染後第5天收穫。將細胞在4℃下在9000rpm下旋轉沉降10分鐘，然後經由0.22µM過濾單元無菌過濾，並儲存在4℃下，直至經剛剛填充之30mL MabSelect SuRe LX蛋白質A管柱(GE Healthcare，目錄號17-5474-03)純化。在使用蠕動幫浦將上清液裝載於管柱上後，將樹脂用60mL [2管柱體積(CV])之低鹽緩衝液(25 mM檸檬酸三鈉pH 7.6, 125 mM NaCl)洗滌，然後用60mL (2CV)之高鹽緩衝液(25 mM檸檬酸三鈉pH 7.6, 2M NaCl)洗滌，然後再用60mL (2CV)低鹽緩衝液洗滌。藉由用25mM檸檬酸、125mM NaCl pH8至pH2.2進行pH梯度溶析來溶析蛋白質，且收集峰流分。用1M檸檬酸三鈉pH8.2中和每一流分，至70mM，約pH 6。匯集主峰(2A5-2C5)中之流分。將匯集之流分濃縮，並使用分子量截止值為50kDa之Sartorius VIVAFLOW200柱緩衝液交換至25 mM檸檬酸鈉pH 5.5、125 mM NaCl緩衝液中。然後經由0.22 μM注射器過濾單元過濾樣品，等分並儲存在-80℃下。最終產量為623 mg純化之5F9-LPETGG-His6抗體，純度＞95%，內毒素為0.64 EU/mL。 重鏈序列：MGWSCIILFLVATATGVHS QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVFGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHRGNTNDNPSLKSRVTISVDTSKNQFALKLSSVTAADTAVYYCARERGYTYGNFDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAGGGSLPETGGHHHHHH (加下劃線處為信號序列) (SEQ ID NO. 1) 輕鏈序列：MGWSCIILFLVATATGVHS EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSRNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTIGSLQSEDFAVYYCQQYKTWPRTFGQGTNVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (加下劃線處為信號序列) (SEQ ID NO. 2) 實例47 經由分選酶結合製備Ab-STING促效劑結合物之程序(繪示於圖4中)
分選酶結合：根據實例46中所述之程序產生在重鏈之C末端含有LPETGG-His6之5F9抗體。用50 mM HEPES、150 mM NaCl, pH 7.45緩衝液稀釋在重鏈之C末端含有LPETG-His6標籤之5F9 (5F9-LPETGG-His6)於25 mM檸檬酸鹽、125 mM NaCl, pH 5.5緩衝液中之溶液，以使得蛋白質之濃度為48 µM。向溶液中添加CaCl2 (4 mM水溶液，80~100當量)及2-胺基-N-[2-[2-[(2-疊氮基乙醯基)胺基]乙基胺基]-2-側氧基-乙基]乙醯胺(中間體34, 800 µM溶液於含有0.1% DMSO之50 mM HEPES、150 mM NaCl, pH 7.45緩衝液中，20當量)，然後添加分選酶A Q60-K206-P94S-D160N-D165A-K196 His6 (如Antos, J. M., Ingram, J., Fang, T., Pishesha, N., Truttmann, M. C., Ploegh, H. L. (2017). Site-specific protein labeling via sortase-mediated transpeptidation. Current Protocols in Protein Science, 89, 15.3.1-15.3.19中所述表現，2.0 µM溶液於50 mM HEPES、150 mM NaCl, pH 7.45緩衝液中，0.03當量)。將反應混合物在室溫下攪拌4 h。藉由Capturem鎳管柱(來自Takara，用PBS洗滌)、然後透析或遵循本文所述之製備型SEC方法純化產物以獲得5F9-LPETG-疊氮化物。
應變促進之疊氮化物-炔烴環加成：向上文製備之5F9-LPETGG-NH(CH2 )2 NHCOCH2 -疊氮化物結合物(2~15mg/mL於PBS中)之溶液中添加含應變炔烴之連接體-酬載構築體之4~10 mM DMSO溶液(3~5當量，其中DMSO ＜總溶劑體積之10%)。將所得溶液在室溫下溫和攪拌過夜。遵循本文所述之製備型SEC方法純化產物以獲得ADC。如分析方法中所述，藉由UV吸光度、分析型SEC及LC-QTOF分別測定ADC濃度、聚集百分比及DAR。
以上程序可用於製備其他抗體結合物。 實例48
表27中所列示之抗體藥物結合物係如實例47中所述，使用在表中顯示為起始材料之起始連接體-酬載構築體來製備。 表27
起始材料 ADC產物 酬載 DAR 聚集% 產率%
C-15 ADC-12 化合物I-5c 1.4 3.67 60
C-9 ADC-13 化合物I-5c 1.8 BLQ 66
C-13 ADC-14 化合物I-5c 1.4 3.7 84
實例49 生物方案及STING細胞數據 去污溶酶體分析條件
將測試化合物(DMSO中之121 uM連接體-酬載構築體溶液或PBS中之ADC溶液，4.65 uL)摻入125 uL大鼠肝臟去污溶酶體(購自XenoTech)及433 uL緩衝劑水溶液(54.7 mg/mL磷酸鹽、1.7 mg/mL EDTA, pH 6.0)之混合物中，且將溶液在37℃下培育。在10 min及30 min、1 h、3 h、5 h及24 h取出40 uL樣品，並於96孔板上用160 uL之0.1%甲酸於甲醇中之溶液處理，然後儲存在-80℃下。收集最末時間點後，將每一樣品冷凍且用200 uL含有150 nM磺胺丁脲(內標)之0.1%甲酸於甲醇中之溶液處理。將樣品在4000g下離心10 min，且遵循本文所述之LC/MS/MS方法進行分析。使用Excel-Fit程式計算t1/2 。計算之t1/2 報告於表28中。如表28中所示，在24h內在此去污溶酶體分析中未觀察到來自ADC-3之游離酬載釋放，而具有相同酬載之ADC-9成功地釋放酬載且t1/2 為7小時，此指示與ADC-3相比，ADC-9之連接體在替代細胞釋放條件下可顯著改良酬載解離之速率。 表28
ADC 酬載 t1/2 (小時)
ADC-1 化合物編號14 2.4
ADC-3 化合物I-5c -*
ADC-9 化合物I-5c 7.0
ADC-15 化合物編號14 2.9
ADC-16 化合物編號14 3.7
*在24 h內未觀察到游離酬載釋放
表28中ADC-1、ADC-3及ADC-9之隨時間之酬載釋放的圖形表示顯示於圖5、圖6及圖7中。 血漿穩定性分析條件
將測試化合物以10 µg/mL之濃度摻入1 mL血漿中，然後將5等體積等份分配至2 mL Eppendorf微量離心管(標記為0小時、24小時、48小時、72小時及96小時)中。將時間0樣品管立即儲存在-80℃下，且將剩餘管在37℃適度搖晃下培育。在其相應時間點自培育器取出等份並儲存在-80℃下。收集所有樣品後，將其在室溫下解凍並置於濕冰上。將50 µL每個樣品一式三份分配至96孔微量滴定板中。用200 µL含有50 nM內標之冰冷甲醇淬滅樣品。將樣品渦旋2 min，然後以3000 rpm離心10 min。將185 μL上清液轉移至乾淨之注射板上，然後在40℃下在N2 氣下乾燥。用100 μL LCMS級水重構乾燥之樣品提取物，然後渦旋1 min，為LC-MS/MS分析做準備。
在40℃下，藉由反相HPLC，使用Synergi 2.5µ極性-RP 100A C18管柱(2.0 mm × 30 mm) (Phenomenex®)，使用由水中之0.1%甲酸(溶劑A)及乙腈中之0.1%甲酸(溶劑B)組成之梯度分離每一樣品。使用SCIEX API 4500 QTRAP儀器藉由陽離子噴霧以多反應監測(MRM)模式偵測分析物。不同時間點之人類、靈長類動物及小鼠血漿中之酬載損失百分比報告於表29中。 表29
ADC 人類血漿中之酬載損失(%) 食蟹猴血漿中之酬載損失(%) 小鼠血漿中之酬載損失(%)
1d 2d 3d 4d 1d 2d 3d 4d 1d 2d 3d 4d
ADC-9 0.1 0.7 1.1 1.7 0.3 0.3 1.0 1.2 1.4 2.1 3.0 3.4
ADC-2 5.7 11.1 13.2 20.8 7.3 14.2 20.9 25.8 5.8 9.4 14.1 18.8
ADC-4 0.1 0.8 1.6 1.8 0 0.7 1.3 1.6 0.4 0.8 1.0 5.6
ADC-3 1.3 3.7 5.4 7.3 1.4 3.2 5.5 7.6 0.7 1.5 1.0 1.3
ADC-1 11.5 21.6 32.1 40.9 NA NA NA NA 9.2 16.0 23.3 30.4
ADC-10 0 0 1.2 1.7 0 0 1.1 1.5 2 1.8 1.9 2.6
ADC-5 0 0.9 1.6 2.1 0.5 0.7 1.3 1.8 2.2 1.5 2.2 6.3
ADC-6 0 0 1.7 2.4 0.6 1.1 1.5 2.3 0.3 0.7 1.0 0.9
ADC-7 6.3 12.0 15.5 23.4 6.0 11.6 16.3 20.5 4.0 6.0 3.6 19.9
ADC-8 0.2 0.6 0.9 1.2 0.3 0.5 0.7 1.0 0.5 0.7 1.3 1.3
ADC-12 0 0 0.3 1.7 0 0.4 1.1 1.3 21.2 25.6 27.2 28.8
ADC-14 0 0.7 2.2 2.6 0.5 1.0 1.6 2.4 16.5 15.0 17.6 17.8
ADC-15 0.9 2.0 3.0 4.1 0 1.6 2.2 3.1 3.6 3.7 6.6 8.0
ADC-16 1.0 2.0 2.5 3.6 0.9 1.1 1.7 2.6 2.5 8.6 8.4 11.7
THP1雙重Lucia報告基因分析條件
藉由內源人類HAQ STING基因之穩定二對偶基因敲除及人類STING之R232變異體之基因敲入自人類THP-1單核球細胞系衍生出THP1-Dual™ KI-hSTING-R232細胞(InvivoGen編號thpd-r232)。在ISG54 (干擾素刺激基因)最小啟動子結合五個IFN刺激之反應元件(ISRE)之控制下，該等細胞亦穩定表現誘導型分泌之Lucia螢光素酶報告基因。報告基因之表現允許藉由評價Lucia螢光素酶之活性來研究IFN調控因子(IRF)路徑。除人類STING及螢光素酶外，該等細胞經改造以穩定表現人類鳥苷酸環化酶C (GCC)以允許研究靶介導之IRF路徑活化。使用非GCC表現載體細胞作為對照。
在實驗當天，將細胞以15,000個細胞/25 µL/孔之密度平鋪於白色384孔板(Corning 356661)上之生長培養基(RPMI 1640、2 mM L-麩醯胺酸、25 mM HEPES、10%熱不活化胎牛血清、100 μg/mL Normocin™、100 U/mL-100 μg/mL Pen-Strep、10 μg/mL殺稻瘟菌素(blasticidin)、100 μg/mL吉歐黴素(Zeocin)及1 μg/mL嘌羅黴素(Puromycin))中。向細胞板投用5 μL之GCC靶向ADC樣品，然後在37℃下培育20小時。在培育結束時，添加10 µL/孔之QUANTI-Luc™ (InvivoGen編號rep-qlc1)，且立即使用LeadSeeker量測發光。
對於上述分析方法，相對於未經處理及對照處理之樣品，計算不同濃度下每種測試ADC之發光信號誘導百分比。擬合化合物濃度對信號誘導百分比曲線以產生EC50 值。熟習此項技術者將會理解，作為EC50 值產生之值受實驗變化之影響。觀測到之EC50 及Emax報告於表30中。如下表30中所展示，ADC-16在載體THP1細胞中比ADC-15強效約21倍，此可能歸因於自ADC-16之細胞內酬載釋放比ADC-15更快速。 表30
ADC 表現hGCC之THP1 載體THP1
EC50 nM Emax EC50 nM Emax
ADC-1 0.068 123 3.9 82.3
ADC-9 0.10 91.6 ＞280 39.6
ADC-2 0.28 80.7 ＞370 17.0
ADC-10 0.10 81.3 ＞180 3.8
ADC-3 ＞290 0.9 ＞290 0.4
ADC-4 0.047 96.6 3.92 67.6
ADC-5 0.089 82.5 11.0 49.8
ADC-11 0.12 86.9 ＞200 12.6
ADC-6 0.11 90.8 ＞250 28.3
ADC-7 0.57 90.1 ＞380 15.1
ADC-8 0.17 102.2 ＞430 40.2
ADC-12 0.10 94.8 ＞140 22.4
ADC-13 0.060 95 NA NA
ADC-14 0.074 86.9 ＞140 15.4
ADC-15 0.067 108 242 54.9
ADC-16 0.040 97.7 11.2 83.0
ADC-17 0.032 105 ＞500 3.46
ADC-18 ＜0.025 100 ＞500 1.18
實例50 小鼠中之藥代動力學評估
為在帶有表現GCC之CT26結腸癌小鼠腫瘤之Balb/C小鼠中進行ADC之活體內評估，使用6-8週齡之雌性Balb/C小鼠(購自Jackson Laboratory)。CT26.WT親代細胞係自ATCC目錄號CRL-2638獲得。表現GCC之CT26細胞係在Takeda藉由用含有人類GCC基因之慢病毒載體pLenti6.3轉導CT26.WT來構築以獲得CT26 pLenti6.3 GCC純系A5。使CT26 pLenti6.3 GCC純系A5細胞於無菌條件下於37℃培育器及5% CO2 下生長12-14天。使細胞生長於含10%胎牛血清之RPMI-1640培養基中。使用0.05%胰蛋白酶/EDTA使細胞每3-4天傳代以分離細胞。在植入當天，將細胞抽出並以0.5 × 106 個細胞/100 μL之濃度重懸浮於RPM-1640無血清培養基中。藉由使用27號針皮下注射至小鼠下側腹中來植入CT26 pLenti6.3 GCC純系A5細胞(0.5 × 106 個細胞/100 μI注射體積/小鼠)。細胞植入後，藉由卡尺量測腫瘤且一旦可觸知腫瘤，便立即對小鼠進行每週兩次稱重。在兩個維度上量測腫瘤。使用(L × W2 )/2計算卡尺量測值。根據實驗動物之護理及使用指南(Guide for Care and Use of Laboratory Animals)以及制度性動物護理及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)之規定對小鼠飼餵正常飲食並圈養於SPF動物設施中。使動物保持在18-26℃之溫度、50 ± 20%之相對濕度以及12小時之間歇性光照及黑暗週期下且隨意獲得食物及水。
當平均腫瘤體積(MTV)達到500-800 mm3 時，將ADC注射至帶有CT26-GCC腫瘤之Balb/C小鼠(n=3/治療組)中後，研究ADC之藥代動力學。在多個時間點採集血清樣品並冷凍儲存用於分析。
在與Sciex 6500 QTRAP質譜儀介接之Shimadzu UHPLC系統上藉由基於2合1免疫捕獲之LC/MS分析量測總抗體及結合酬載之小鼠血漿水準。簡言之，將小鼠血漿樣品與抗人類IgG包被之磁珠在室溫下一起培育45 min，然後藉由連續用PBST (PBS緩衝液，pH 7.4，含有0.05% tween 20)及PBS緩衝液洗滌磁珠去除非特異性結合之蛋白質。此後，將裸抗體(DAR=0)及ADC (DAR≥1)二者自磁珠溶析至0.1%三氟乙酸中。在中和溶析劑且摻入穩定同位素標記之內標中後，移出一等份樣品並用木瓜酶在37℃下消化1小時，然後用於結合酬載之LC/MS分析。使剩餘樣品經受在70℃下胰蛋白酶/lys-C消化1小時，然後用於總抗體之LC/MS分析。
亦在實施血漿蛋白沈澱後藉由LC/MS量測循環中之游離酬載。簡言之，將小鼠血漿與8體積之含有穩定同位素標記之內標之甲醇混合，然後將上清液在40℃下在溫和氮流下蒸發至乾燥。最後，將殘餘物於LC/MS級水中復原，然後進行LC/MS分析。ADC-1、ADC-8及ADC-9之PK特徵匯總於表31中。血漿PK之圖形表示顯示於圖12、圖13及圖14中。如表24中所示，ADC-1、ADC-8及ADC-9之DAR值分別為4.5、3.9及4.3，此使得在時間0獲得之結合之CDN之莫耳濃度高於圖8-圖10中之每一者中所示之總Ab之莫耳濃度。然而，如圖8中所示，ADC-1之結合之CDN之莫耳濃度下降快於總Ab之莫耳濃度且兩種濃度在第7天合併(導致DAR在該天為約1)，此指示ADC-1之DAR因其連接體之穩定性降低而隨時間減小。相反，如圖9及圖10中所示，在整個實驗進程中，ADC-8及ADC-9之結合之CDN之莫耳濃度一直高於其各別總Ab之莫耳濃度。另外，如表31中所展示，ADC-8及ADC-9之結合酬載/CDN之半衰期長於ADC-1，此可能係ADC-8及ADC-9中之連接體穩定性增強之結果。總之，此實驗指示，相對於ADC-1之連接體，ADC-8及ADC-9之連接體在小鼠血漿中具有改良之穩定性。  表31
ADC (酬載劑量) 半衰期(h) AUC (最終) (h*nM)
ADC-1 (0.1 mg/kg) 結合酬載 33 51432
抗體 45 23280
ADC-9 (0.05 mg/kg) 結合酬載 50 46262
抗體 62 13313
ADC-8 (0.055 mg/kg) 結合酬載 60 37315
抗體 65 12540
實例51 小鼠中之抗腫瘤活性評估
如實例50中所述生成帶有表現GCC之CT26結腸癌小鼠腫瘤之Balb/C小鼠。
當平均腫瘤體積(MTV)達到約75 mm3 時，將動物隨機化至若干治療組(n=8/組)中，且藉由靜脈內途徑投用一次不同劑量之ADC。繼續每週兩次量測腫瘤。藉由量測腫瘤體積並與媒劑治療之腫瘤比較來評估ADC治療對腫瘤生長之效應。
當腫瘤大小達到動物體重之10%體積或在任一方向上達到2 cm時，達成功效研究之終點。注射後，亦密切監測小鼠之臨床衰退體徵。若出於任何原因小鼠顯示任何發病體徵，包括呼吸窘迫、姿勢彎曲、活動性降低、後腿癱瘓、呼吸急促作為胸膜滲出液之體徵、體重損失接近20%或15%加其他體徵，或若其進行正常活動(進食、運動性)之能力受損，則對小鼠實施安樂死。  觀測到之ADC-1、ADC-5、ADC-8及ADC-9之抗腫瘤活性之圖形表示分別顯示於圖7、圖8、圖9及圖10中。 脂質結合物： 縮寫：
AA 使用乙酸銨之LCMS方法
Ac 乙酸鹽
ACN 乙腈
atm 大氣壓
aq 水性
BBN 硼雜雙環(3.3.1)壬烷
Bn 苄基
Boc 第三丁氧基羰基
(Bpin)2 雙(頻哪醇)二硼
t Bu 第三丁基
Bz 苯甲醯基
C 攝氏度
CAD 帶電氣溶膠偵測
cGAMP 環單磷酸鳥苷-單磷酸腺苷
DBAD 偶氮二甲酸二-第三丁酯
DBU DCA DCE 1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯二氯乙酸 二氯乙酸 二氯乙烷
DCM 二氯甲烷
DEAD 偶氮二甲酸二乙酯
DIAD 偶氮二甲酸二異丙酯
DIPEA N,N - 二異丙基乙胺
DMAP 4-二甲基胺基吡啶
DMF N,N -二甲基甲醯胺
DMSO 二甲基亞砜
DMTr 4,4′-二甲氧基三苯甲基
DOTMA 1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基銨丙烷
DPPC 1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼
DSPC 1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼
Et 乙基
EtOH 乙醇
EtOAc 乙酸乙酯
FA 使用甲酸之LCMS方法
h 小時
Int 中間體
HPLC HRMS 高壓液相層析 高解析度質譜
IC50 IPA 50%抑制濃度 異丙醇
IPC 二異松蒎基
LCMS  LC/MS/MS 液相層析質譜 液相層析/串聯質譜
LDA 二異丙基胺基鋰
LHMDS 雙(三甲基矽基)胺基鋰
m/z 質荷比
MHz 兆赫
Me 甲基
MeOH 甲醇
min 分鐘
mL 毫升
MMP 甲基嗎啉
MS 質譜
nBu 正丁烷
NMP 1-甲基-2-吡咯啶酮
NMR 核磁共振
PE 石油醚
Ph 苯基
psi 磅/平方英吋
pyr 吡啶
rt SFC 室溫 超臨界流體層析
T3P    TDA-1 2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧雜三磷雜環己烷-2,4,6-三氧化物 叁[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]胺
TBAF 四丁基氟化銨
TBS 第三丁基二甲基矽基
TBTU O -(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N' -四甲基脲鎓四氟硼酸鹽
TEA 三乙胺
TFA 三氟乙酸
TIDPSi 1,1,3,3-四異丙基二矽氧烷
TIPS 三異丙基矽基
THF 四氫呋喃
UPLC 超高效液相層析
Xantphos 4,5-雙(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫噸
分析方法： NMR條件：
除非另有說明，否則NMR譜係在Bruker Avance III 400譜儀400 MHz1 H頻率上記錄。在同一譜儀上分別在162 MHz及376 MHz下運行31 P NMR及19 F NMR譜。除非另有說明，否則所有異核實驗係使用1 H去偶獲取。  LCMS條件：
在使用反相C18管柱之連接至Micromass質譜儀之Hewlett­Packard HP1100或Agilent 1100 Series LC系統上記錄LCMS譜。選擇多個梯度及運行時間以最佳地表徵化合物。流動相係基於ACN/水或MeOH/水梯度且含有0.1%甲酸(方法指示為FA)或10 mM乙酸銨(方法指示為AA)。所用溶劑梯度之一個實例係100%流動相A (流動相A = 99%水+ 1% ACN + 0.1%甲酸)至100%流動相B (流動相B = 95% ACN + 5%水+ 0.1%甲酸)，以1 mL/min之流量運行16.5 min。
在一些情形下，在連接至Agilent 6130質譜儀之Agilent 1290 Infinity UPLC系統、連接至Waters Acquity SQ質譜儀之Waters Acquity UPLC系統或使用反相C18管柱之連接至Waters Micromass ZQ質譜儀之Agilent 1100 Series HPLC系統上記錄LCMS譜。選擇多個梯度及運行時間以最佳地表徵化合物。流動相係基於ACN/水或MeOH/水梯度且含有0.1%甲酸(方法指示為FA)或10 mM乙酸銨(方法指示為AA)。所用溶劑梯度之一個實例係95%流動相A (流動相A = 99%水+ 1% ACN + 0.1%甲酸)至100%流動相B (流動相B = 95% ACN + 5%水+ 0.1%甲酸)，以0.5 mL/min之流量運行5 min。  製備型HPLC：
使用用溶劑A (99% 10mM乙酸銨/1%乙腈) /溶劑B (5% 10mM乙酸銨/ 95%乙腈)梯度溶析之Phenomenex 5微米C5 21.2×250 mm使用由322個幫浦操作之Gilson儀器實施製備型HPLC，其中UV/可見光155偵測器觸發之流分收集設定為200 nm至400 nm。在Agilent 1100 LC/MSD儀器上實施質量門控流分收集。
熟習此項技術者將意識到，可改變梯度、管柱長度及流量且一些條件可比其他條件更適用於化合物表徵，此端視所分析之化學物質而定。  製備型SFC：
使用10mm、20mm或30mm × 250mm ChiralPak管柱(通常為IA、IB、IC、ID、IE及IF)、10 mm或20 mm × 250 mm Phenomenex Lux Cellulose­4或2­乙基吡啶管柱實施製備型SFC，用適當百分比之含有0.3%二乙胺或0.3% TEA或0.3%甲酸或不含任何酸或鹼添加劑之超臨界二氧化碳及醇溶析。典型的等梯度條件係10­100 mL/min範圍內之流量及40℃之管柱溫度。在A Jasco SFC製備型純化系統上實施製備型SFC，其中UV/可見光觸發之流分收集設定為200 nm至400 nm且背壓調節設定為10 MPa。
熟習此項技術者將意識到，可改變梯度、管柱長度及流量且一些條件可比其他條件更適用於化合物表徵，此端視所分析之化學物質而定。 實例B之HPLC條件：
使用具有SHISEIDO 3微米C18 4.6×75 mm之SHIMADZU LC-2010C實施HPLC分析，用溶劑A (80%水/ 10% 50mM乙酸銨/ 10%乙腈) /溶劑B (10% 50mM乙酸銨/ 90%乙腈)梯度溶析，流量為1 mL/min，管柱溫度為40℃且UV偵測在254 nm。  實例B之LC/MS/MS條件：
使用與AB SCIEX 4500或AB SCIEX 5500 Triple Quad質譜連接之Shimadzu UltraFast液相層析及自動取樣器或等效系統實施LC/MS/MS分析。
為分析14號化合物及化合物I-5c，將99%水及1%乙腈中之10 mM乙酸銨或水中之0.1%甲酸製備為流動相A溶劑，且使用5%水及95%乙腈中之10 mM乙酸銨或5%水及95%乙腈中之0.1%甲酸作為流動相B溶劑。以1.5 mL/min將液相層析梯度運行3分鐘。HPLC管柱為具有2.1 mm ID × 30 mm長度之Waters Xselect C18 CSH 3.5微米管柱，且管柱溫度為室溫。
為分析化合物CP-1，將99%水及1%乙腈中之10 mM乙酸銨製備為流動相A溶劑，且將5%水及95%乙腈中之10 mM乙酸銨用於流動相B溶劑。以1.5 ml/min將液相層析梯度運行3.5分鐘。HPCL管柱為Osaka Soda Capcell PAK C1 UG120 5微米，2.0 mm I.D. × 35 mm長度，且管柱溫度為室溫。
使用Analyst軟體1.7分析MS/MS峰面積且計算樣品之濃度。  UPLC-CAD條件：
使用Thermo Scientific™ Dionex™ Corona™ Veo™ RS (快速分離)帶電氣溶膠偵測器及具有ACE Excel C4 2微米2.1×100 mm或相似管柱之Waters ACQUITY UPLC系統實施UPLC-CAD分析，用使用溶劑A (水中之10mM乙酸銨、4L中之2.6mL氫氧化銨) /溶劑B (甲醇中之10mM乙酸銨、4L中之2.6mL 95%氫氧化銨)之梯度方法使用0.8 mL/min之流量及35℃之管柱溫度溶析。高達±20%變化可源自UPLC-CAD分析。  實例A1 [4-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-氟-7-(5-氟-4-側氧基-3,4-二氫-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-16-羥基-2,10-二氧橋-2,10-二氫硫基八氫-12H-5,8-亞甲基呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環(cyclotetradecin)-14-基]-9H-嘌呤-6-基}胺基)-4-側氧基丁基]甲基胺基甲酸第三丁基酯TEA鹽，中間體-1
Figure 02_image462
將14號化合物(300 mg, 0.40 mmol)溶解於無水吡啶中且濃縮至乾燥(5 mL × 3次)。在氬氣氛下將殘餘物溶解於吡啶(6.41 mL)中且用冰水浴冷卻之氯三甲基矽烷(0.30 mL, 2.38 mmol)處理。使反應物升溫至rt並攪拌2h以產生TMS保護之14號化合物。單獨地(在rt下將上述反應物攪拌約30 min後)，向4-((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)丁酸(520.0 mg, 2.27 mmol)於四氫呋喃(10.7 mL)中之冰水浴冷卻溶液添加4-甲基嗎啉(0.28 mL, 2.50 mmol)，然後緩慢添加THF中之氯甲酸異丁基酯(0.29 mL, 2.27 mmol)。將渾濁懸浮液升溫至rt並攪拌1h，然後經由注射器緩慢添加至上述TMS保護之中間體。將反應混合物在rt下攪拌過夜。將MeOH (10 mL)添加至上述反應混合物中且將反應混合物濃縮。將殘餘物再溶解於MeOH (3.8 mL)中。將三氫氟酸三乙胺(0.26 mL, 1.59 mmol)添加至冰水浴冷卻之反應混合物中且升溫至rt並攪拌30min。將反應混合物吸附於矽藻土(Celite® ) (1 g)上且藉由反相急速管柱層析(0­50% ACN於三乙基乙酸銨水溶液(10 mM)中)純化以提供呈TEA鹽形式之中間體-1 (214.0 mg, 48.5%)。LCMS (AA):m/z = 910.2 (M+H)。1 H NMR (D2 O) δ 8.55 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.14 (d, ,J = 4.0 Hz, 1H), 6.42 (d,J = 16.0 Hz, 1H), 6.29 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 5.5d (dd,J = 4.0, 52.0 Hz, 1H), 5.04-4.93 (m, 1H), 4.91-4.86 (m, 1H), 4.66 (d,J = 4.0 Hz, 1H), 4.46 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 4.33-4.25 (m, 3H), 4.14 (dd,J = 4.0, 12.0 Hz, 1H), 3.94 (dd,J = 4.0, 8.0 Hz, 1H), 3.25 (br, m, 2H), 3.05 (q,J = 8.0 Hz, 15H), 2.73 (s, 3H), 2.59-2.54 (m, 1H), 1.90-1.82 (m, 1H), 1.20 (s, 9H), 1.13 (t,J = 8.0 Hz, 22H)。31 P NMR (D2 O) δ 55.46 (s, 1P), 52.06 (s, 1P)。19 F NMR (D2 O) δ -164.19 (s, br, 1F), -200.75至-200.99 (m, 1F)。  實例A2 十八烷酸[(2R )-3-[羥基-[2-[[5-[[(1S )-1-[[(1S )-2-[4-(羥基甲基)苯胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]胺甲醯基]-2-甲基-丙基]胺基]-5-側氧基-戊醯氧基]胺基]乙氧基]磷醯基]氧基-2-十八醯基氧基-丙基]酯，中間體-2
Figure 02_image464
將(2S )-2-胺基-N-[(1S )-2-[4-(羥基甲基)苯胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]-3-甲基-丁醯胺(112.1 mg, 0.38 mmol)懸浮於瓶中之甲苯中且蒸發至乾燥(1mL × 3)。將殘餘物溶解於DMF (1.5 mL)中並用DIPEA (88.9 uL, 0.51 mmol)處理。然後將DMF溶液添加至DCM (15 mL)中之磷酸[(2R )-2,3-二(十八醯基氧基)丙基]酯2-[[5-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基-5-側氧基-戊醯氧基]胺基]乙酯鈉(250.0 mg, 0.25 mmol)。將反應混合物在rt下攪拌4h。蒸發大部分溶劑(DCM)且將殘餘溶液(DMF)傾倒至冰冷HCl水溶液(0.1 N, 5mL))中。藉由過濾收集固體且用水(3 mL × 3)及DCM (3 mL × 3)洗滌並在真空下乾燥以獲得中間體-2 (247.0 mg, 85.2%)。LCMS (AA):m/z = 1137.8 (M+H)。1 H NMR (MeOD/CDCl3 ) δ  7.55 (隱藏於CDCl3 峰內，2H), 7.29 (d, ,J = 8.0 Hz, 1H), 5.25-5.22 (m, 1H), 4.53-4.49 (隱藏於MeOD殘餘水峰內，3H), 4.40 (dd,J = 4.0, 12.0 Hz, 1H), 4.19-4.00 (m, 6 H), 3.49-3.39 (m, 2H), 2.35-2.30 (m, 6H), 2.22 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 2.17-2.09 (m, 1H), 1.97-1.89 (m, 2H), 1.65-1.58 (m, 4H), 1.45 (d,J = 8.0 Hz, 3H), 1.35-1.28 (br, m, 56H), 0.99-0.97 (m, 6H), 0.89-0.86 (6H)。31 P NMR (MeOD/CDCl3 ) δ 0.77 (s, 1P)。  實例A3 十八烷酸[(2R )-3-[羥基-[2-[[5-[[(1S )-2-甲基-1-[[(1S )-1-甲基-2-[4-[(4-硝基苯氧基)羰基氧基甲基]苯胺基]-2-側氧基-乙基]胺甲醯基]丙基]胺基]-5-側氧基-戊醯氧基]胺基]乙氧基]磷醯基]氧基-2-十八醯基氧基-丙基]酯，中間體-3
Figure 02_image465
向瓶中添加中間體-2 (247.0 mg, 0.22 mmol)、THF (4.0 mL)及DIPEA (83.3 µL, 0.48 mmol)。在N2 氣氛下用冰水浴冷卻溶液且然後一次性添加碳酸雙(4-硝基苯基)酯(97%, 74.9 mg, 0.24 mmol)。將淡黃色溶液在50℃下攪拌1h。再添加碳酸雙(4-硝基苯基)酯(97%, 145.3 mg, 0.48 mmol)並在50℃下攪拌1h且然後rt過夜。將反應混合物傾倒至冰冷HCl水溶液(0.05 N, 30 mL)中。藉由過濾收集固體且用水(10 mL × 3)及EtOAc (8 mL × 6)洗滌以獲得固體中間體-3 (282.8 mg, 79.5%)。LCMS (FA):m/z = 1302.8 (M+H)。1 H NMR (MeOD/CDCl3 ) δ  8.28 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.65 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.42-7.38 (m, 4H), 5.25-5.22 (m, 3H), 4.53-4.49 (隱藏於MeOD殘餘水峰內，1H), 4.38 (dd,J = 4.0, 12.0 Hz, 1H), 4.19-4.02 (m, 6 H), 3.61-3.387 (m, 2H), 2.35-2.29 (m, 6H), 2.22-2.20 (m, 2H), 2.17-2.08 (m, 1H), 1.98-1.90 (m, 2H), 1.64-1.56 (m, 4H), 1.46 (d,J = 8.0 Hz, 3H), 1.35-1.28 (br, m, 56H), 0.99-0.97 (m, 6H), 0.89-0.85 (6H)。31 P NMR (MeOD/CDCl3 ) δ 0.74 (s, 1P)。  實例A4 十八烷酸(2S,5S,19R)-2-({4-[({[4-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-氟-7-(5-氟-4-側氧基-3,4-二氫-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-16-羥基-2,10-二氧橋-2,10-二氫硫基八氫-12H-5,8-亞甲基呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-14-基]-9H-嘌呤-6-基}胺基)-4-側氧基丁基](甲基)胺甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺甲醯基)-16-羥基-5-異丙基-16-氧橋-4,7,11-三側氧基-19-(硬脂醯基氧基)-15,17-二氧雜-3,6,12-三氮雜-16λ~5~-磷雜二十烷-20-基酯，CP-1
Figure 02_image466
將中間體-1 (15.0 mg, 0.013 mmol)溶解於1,4-二㗁烷(0.29 mL)中且用1,4-二㗁烷中之4M HCl (0.15 ml, 0.6 mml)在rt下處理1h。去除揮發物並在真空下乾燥1h以獲得4-A，其以粗產物形式直接用於下一步驟。單獨地，向瓶中裝填中間體-3 (17.6 mg, 0.013 mmol)、DMAP (3.3 mg, 0.027 mmol)、TEA (0.015 ml, 0.11 mmol)及DCM (0.35 mL)。向此混合物緩慢添加4-A於DMF (0.42 mL)中之溶液。將反應物在rt下攪拌15min且濃縮至小體積(約0.5 mL)。藉由製備型HPLC (Phenomenex 5微米C5 21.2×250 mm，用溶劑A [99% 10mM乙酸銨/1%乙腈] /溶劑B [5% 10mM乙酸銨/ 95%乙腈]自60% B至100% B在16 min內以20 mL / min之流量溶析)純化粗化合物以提供呈銨鹽形式之CP-1 (11.0 mg, 40.3%)。LCMS (AA):m/z = 1972.8 (M+H)。1 H NMR (MeOD) δ 8.55 (br, s, 1H), 8.28 (br, s, 1H), 7.75 (br, s, 1H) 7.52-7.42 (m, 2H), 7.24-7.17 (m, 3H), 6.43-6.36 (m, 2H), 5.60 (dd,J = 4.0及52.0 Hz, 1H), 5.17-5.12 (m, 1H), 5.10-5.00 (m, 1H), 4.99 (s, 2H), 4.95-4.89 (m, 1H), 4.78-4.76 (隱藏於MeOD殘餘水峰內，1H), 4.48-4.28 (m, 6H), 4.23 (m, 1H), 4.13-4.09 (m, 2H), 3.96-3.82 (m, 5H), 3.42-3.33 (m, 4H), 2.91 (s, 3H), 2.73-2.64 (m, 2H), 2.31-2.16 (m, 8H), 2.11-2.03 (m, 1H), 1.99-1.92 (m, 2H), 1.89-1.82 (m, 2H), 1.57-1.47 (m,4H), 1.49 (d,J = 8.0 Hz, 3H), 1.27-1.28 (br, 56H), 0.93-0.91 (m, 6H), 0.85-0.81 (m, 6H)。31 P NMR (MeOD) δ 57.00 (s, 1P), 52.26 (s, 1P), -0.20 (s, 1P)。19 F NMR (MeOD) δ -165.24至-165.46 (s, br, 1F), -202.98至-203.24 (m, 1F)。HRMS (C88 H138 F2 N13 O25 P3 S2 )預期值：1972.8622；觀察值：1972.8674  實例A5 {9-[(1R,3R,6R,8R,9R,10R,12R,15R,17R,18R)-9-氟-17-(5-氟-4-側氧基-3,4-二氫-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-18-羥基-3,12-二氧橋-3,12-二氫硫基-2,4,7,11,13,16-六氧雜-3,12-二磷雜三環[13.2.1.0~6,10~]十八烷-8-基]-9H-嘌呤-6-基}胺基甲酸2-[(第三丁氧基羰基)(甲基)胺基]乙酯，中間體-4
Figure 02_image467
步驟1：氯甲酸2-[第三丁氧基羰基(甲基)胺基]乙酯(5-A)
在-78℃下將含有吡啶(1.26 mL)之DCM (100 ml)中之(2-羥基乙基)(甲基)胺基甲酸第三丁基酯(1.40 g, 7.99 mmol)緩慢添加至甲苯中之15%光氣溶液(16 ml, 22.4 mmol)。然後將反應混合物升溫至rt並攪拌1.5 h。然後將溶劑濃縮至乾燥以提供粗5-A (1.90 g, 100%)。  步驟2：{9-[(1R,3R,6R,8R,9R,10R,12R,15R,17R,18R)-9-氟-17-(5-氟-4-側氧基-3,4-二氫-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-18-羥基-3,12-二氧橋-3,12-二氫硫基-2,4,7,11,13,16-六氧雜-3,12-二磷雜三環[13.2.1.0~6,10~]十八烷-8-基]-9H-嘌呤-6-基}胺基甲酸2-[(第三丁氧基羰基)(甲基)胺基]乙酯，中間體-4
將14號化合物(313 mg, 0.40 mmol)溶解於無水吡啶中且濃縮至乾燥(3 × 5 mL)。在氬氣氛下將殘餘物溶解於吡啶(6.70 mL)中並用冰水浴冷卻之氯三甲基矽烷(0.378 mL, 2.97 mmol)處理。使反應物升溫至rt並攪拌20 min以產生呈溶液形式之TMS保護之14號化合物。將5-A (1.90 g, 7.52 mmol)溶解於DCM (12.5mL)中，然後經由注射器添加至上文所提及溶液。將反應混合物在rt下在氬氣氛下攪拌16 h。然後將反應混合物濃縮至乾燥。將MeOH (10 mL)及氫氧化銨(水中之28-30%溶液，10 mL)添加至殘餘物且攪拌30 min。將反應混合物濃縮至乾燥並將殘餘物溶解於MeOH (15 mL)中。添加三氫氟酸三乙胺(0.12 mL, 0.75 mmol)且將反應混合物在rt下攪拌30 min。將反應混合物濃縮至乾燥並使粗殘餘物吸附至Celite上且藉由反相急速管柱層析(0-50% ACN於三乙基乙酸銨水溶液(10 mM)中)純化以提供呈TEA鹽形式之中間體-4 (181 mg, 39.3%)。LCMS (AA):m/z = 912.3 (M+H)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.06(br, s, 1H), 10.56 (br, s, 1H), 9.16 (br, 2H), 8.62 (s, 1H), 8.52 (s, 1H), 7.89(d,J = 4.0 Hz, 1H), 7.63 (s, 1H), 6.35 (dd,J = 4.0及12.0 Hz, 1H), 6.26 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 5.80 (d,J = 52.0 Hz, 1H), 5.19-5.14 (m, 1H), 4.95-4.93 (m, 1H), 4.79-4.78 (m, 1H), 4.56 (br, s, 1H), 4.33 (br, s, 1H), 4.21-4.12 (m, 5H), 4.00-3.90 (m, 1H), 3.72-3.69 (m, 1H), 3.45-3.43 (m, 2H), 3.05 (br, 12H), 2.86-2.83 (m, 3H), 1.34 (br, 9H), .115-1.11(m, 18H)。31 P NMR (DMSO-d6) δ 54.04 (s, 1P), 47.46 (s, 1P)。19 F NMR (DMSO-d6) δ -165.06 (s, br, 1F), -207.23至-207.54 (m, 1F) 實例A6 十八烷酸(2S,5S,19R)-2-{[4-({[{2-[({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-氟-7-(5-氟-4-側氧基-3,4-二氫-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-16-羥基-2,10-二氧橋-2,10-二氫硫基八氫-12H-5,8-亞甲基呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-14-基]-9H-嘌呤-6-基}胺甲醯基)氧基]乙基}(甲基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]胺甲醯基}-16-羥基-5-異丙基-16-氧橋-4,7,11-三側氧基-19-(硬脂醯基氧基)-15,17-二氧雜-3,6,12-三氮雜-16λ~5~-磷雜二十烷-20-基酯，CP-2
Figure 02_image468
標題化合物係使用與實例A4中所示相似之程序使用中間體-4 (77.0 mg, 0.069 mmol)替代中間體-1製備以獲得呈銨鹽形式之CP-2 (42.0 mg, 30.0%)。LCMS (AA): m/z = 1974.6 (M+H)。1H NMR (MeOD) δ  8.52 (br, d, J = 12.0 Hz, 1H), 8.33 (br, d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.50 (br, d,J = 8.0 Hz 1H), 7.40 (br, d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.28 (br, 1H), 7.24 (br, d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.14 (br, d,J = 8.0 Hz, 1H), 6.43-6.34 (m, 2H), 5.56 (d,J = 52.0 Hz, 1H), 5.17-5.06 (m, 2H), 5.01-4.93 (m, 3H), 4.78-4.76 (隱藏於MeOD殘餘水峰內，1H), 4.47-4.29 (m, 8H), 4.21 (m, 1H), 4.13-4.09 (dd,J = 8.0及12.0 Hz, 2H), 3.95-3.82 (m, 5H), 3.63-3.58 (m, 2H), 3.33 (br, d,J = 8.0 Hz, 2H), 2.99 (s, 3H), 2.30-2.22 (m, 6H), 2.17 (t, d,J = 8.0 Hz, 2H), 2.10-2.04 (m, 1H), 1.88-1.81 (m, 2H), 1.56-1.48 (m,4H), 1.49 (br, d,J = 8.0 Hz, 3H), 1.27-1.21 (br, m, 56H), 0.93-0.90 (m, 6H), 0.84-0.81 (m, 6H)。31 P NMR (DMSO-d6) δ 53.64 (s, 1P), 46.87 (s, 1P), -0.45 (s, 1P)。19 F NMR (MeOD) δ -165.49至-165.66 (m, 1F), -203.23至-203.70 (m, 1F)。HR-MS (C87 H136 F2 N13 O26 P3 S2 )預期值：1974.8415；觀察值：1974.8455。  實例A7 4-(胺基甲基)苯甲酸[4-(羥基甲基)苯基]酯，中間體-5
Figure 02_image470
步驟1：4-[(第三丁氧基羰基胺基)甲基]苯甲酸[4-(羥基甲基)苯基]酯
向100 mL圓底燒瓶中裝填4-(Boc-胺基甲基)苯甲酸(503.0 mg, 1.98 mmol)、4-羥基苄基醇(97%, 304.3 mg, 2.38 mmol)。然後將混合物懸浮於DCM (15 mL)中且用1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺(97%, 634.3 mg, 3.96 mmol)處理。將反應在rt下維持2h且用冰冷HCl (0.1N, 10mL)洗滌，然後用水(10 mL)及飽和NaHCO3 (10 mL)洗滌並乾燥且藉由矽膠層析(0­100% EtOAc/己烷)純化以獲得7-A (385.0 mg, 54.4%)。LCMS (AA):m/z = 356.00 (M-H)。1 H NMR (DMSO-d6 ) δ  8.09 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.53 (t,J = 4.0 Hz, 1H), 7.47-7.39 (m, 4H), 7.22 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 5.25 (t,J = 8.0 Hz, 1H), 4.53 (d,J = 8.0 Hz, 2H) , 4.24 (br, d,J = 4.0 Hz, 2H), 1.41 (s, 9 H)。  步驟2：4-(胺基甲基)苯甲酸[4-(羥基甲基)苯基]酯，中間體-5
將4-[(第三丁氧基羰基胺基)甲基]苯甲酸[4-(羥基甲基)苯基]酯7-A (100.0 mg, 0.28 mmol)溶解於DCM (2 mL)中且用TFA (0.8 mL, 10 mmol)在rt下處理30min。藉由旋轉蒸發去除揮發物且將殘餘物再溶解於MeOH (2 mL)中並在37℃下保持90 min。完全去除揮發物後，將殘餘物與MeOH (2 mL × 2)及DCM (4 mL × 2)共蒸發以獲得呈TFA鹽形式之中間體-5 (110.0 mg，定量產率)。LCMS (AA):m/z = 258.20 (M+H)。1 H NMR (DMSO-d6 ) δ 8.37 (br, 3H), 8.19 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 7.68 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 7.42 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 7.24 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 4.54 (s, 2H), 4.20 (br, s, 2H)。  實例A8 二硬脂酸(2R)-3-((羥基(2-(5-((4-((4-(羥基甲基)苯氧基)羰基)苄基)胺基)-5-側氧基戊醯胺基)乙氧基)磷醯基)氧基)丙烷-1,2-二基酯，中間體-6
Figure 02_image471
將4-(胺基甲基)苯甲酸[4-(羥基甲基)苯基]酯三氟乙酸鹽(64.1 mg, 0.17 mmol)溶解於DMF (0.8 mL)中。將溶液添加至磷酸[(2R )-2,3-二(十八醯基氧基)丙基]酯2-[[5-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基-5-側氧基-戊醯氧基]胺基]乙酯鈉(113.0 mg, 0.115 mmol)於DCM (3.2 mL)中之另一溶液中。然後將DIPEA (0.04 mL, 0.23 mmol)添加至上述混合物中且在rt下攪拌3.5 h。將大部分溶劑(DCM)蒸發且將殘餘溶液(DMF)傾倒至冰冷HCl溶液(0.1 N, 5mL)中。藉由過濾收集固體並用冰冷HCl溶液(0.1 N, 4mL × 6)及水(3 mL × 6)洗滌且在真空下乾燥以獲得中間體-6 (106.0 mg, 83.6%)。LCMS (AA)：弱信號。1 H NMR (MeOD/CDCl3 ) δ 8.03 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 7.31 (d,J = 8.0 Hz, 4H), 7.06 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 5.13-5.10 (m, 1H), 4.55 (s, 2H), 4.37 (s, 2H), 4.07-4.05 (m, 1H), 4.07-3.93 (m, 5H), 3.37-3.34 (br, 2H), 2.24-2.13 (m, 8H), 1.86-1.82 (m, 2H), 1.49 (br, 4H), 1.14 (br, 56H), 0.78 (m, 6H)。31 P NMR (MeOD/CDCl3 ) δ 3.06 (s, 1P)。  實例A9 二硬脂酸(2R)-3-((羥基(2-(5-((4-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯氧基)羰基)苄基)胺基)-5-側氧基戊醯胺基)乙氧基)磷醯基)氧基)丙烷-1,2-二基酯，中間體-7
Figure 02_image472
將中間體-6 (106 mg, 0.096 mmol)溶解於THF (2 mL)中且用DIPEA (0.037 mL, 0.21 mmol)處理。向此溶液添加碳酸雙(4-硝基苯基)酯(64.4 mg, 0.21 mmol)。將反應混合物在rt下保持1 h且然後再添加碳酸雙(4-硝基苯基)酯(64.4 mg, 0.21 mmol)及DIPEA (0.037 mL, 0.21 mmol)。將反應物在50℃下再加熱1h。將反應混合物添加至冰冷HCl溶液(0.05 N, 100 mL)中。藉由過濾收集沈澱且用水(2 mL ×4)洗滌。將固體懸浮於EtOAc (3 mL)中且超音波處理5 sec.並過濾。用EtOAc (2 mL × 3)洗滌固體以獲得固體中間體-7 (121.9 mg, 57.4%)。LCMS (AA)：弱信號。1 H NMR (MeOD/CDCl3 ) δ 8.26 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 8.12  (d,J = 8.0 Hz, 2H), 7.50 (d,J = 8.0 Hz, 4H), 7.40 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 7.37 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 7.23 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 5.29 (s, 2H), 5.21-5.18 (m, 1H), 4.48 (s, 2H), 4.31 (dd,J = 4.0及12.0 Hz,1H), 4.14-4.01 (m, 5H), 3.45 (br, t,J = 4.0 Hz, 2H), 2.32-2.23 (m, 8H), 1.96-1.92 (m, 2H), 1.57 (br, 4H), 1.22 (br, 56H), 0.84 (m, 6H)。  實例A10 4-[(15R)-12-羥基-12-氧橋-3,7,18-三側氧基-15-(硬脂醯基氧基)-11,13,17-三氧雜-2,8-二氮雜-12λ~5~-磷雜三十五烷-1-基]苯甲酸4-({[{2-[({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-氟-7-(5-氟-4-側氧基-3,4-二氫-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-16-羥基-2,10-二氧橋-2,10-二氫硫基八氫-12H-5,8-亞甲基呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-14-基]-9H-嘌呤-6-基}胺甲醯基)氧基]乙基}(甲基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基酯，CP-3
Figure 02_image473
標題化合物係使用與實例A4中所示相似之程序使用中間體-7 (8.0 mg, 0.0072 mmol)替代中間體-3及使用中間體-4 (9.1 mg, 0.0072 mmol)替代中間體-1製備以獲得呈銨鹽形式之CP-3 (4.2 mg, 29.0%)。LCMS (AA):m/z = 1939.1 (M+H)。1 H NMR (MeOD) δ 8.65-8.59 (m, 1H), 8.42 (br, d,J = 16.0 Hz, 1H), 8.14 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 7.85 (s, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.51 (d,J = 8.0 Hz, 2H), 7.48-7.39 (m, 3H), 7.20 (br, d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.11 br, d,J = 8.0 Hz, 1H), 6.50 (dd,J = 1.2及8.0 Hz, 1H), 6.42 (br, d,J = 8.0 Hz, 1H), 5.80-5.61 (m, 1H), 5.27-5.10 (m, 4H), 5.08-5.0 (m, 1H), 4.82 (m, 1H), 4.55-4.32 (m, 9H), 4.30 (br, 1H), 4.04-3.98 (m, 3H), 3.96-3.91 (m, 2H), 3.83-3.65 (m, 2H), 3.44 (t,J = 4.0 Hz, 2H), 3.10 (br, d,J = 12.0 Hz, 3H), 2.38-2.28 (m, 8H), 2.02-1.94 (m, 2H), 1.65-1.57 (m, 4H), 1.30 (br, 56H), 0.93-0.90 (m, 6H)。31 P NMR (MeOD) δ 57.08 (s, 1P), 52.51 (s, 1P), 0.36 (s, 1P)。19 F NMR (MeOD) δ -165.58至-165.67 (m, 1F), -203.66至-203.99 (m, 1F) HR-MS (C87 H128 F2 N11 O26 P3 S2 )預期值：1938.7727；觀察值：1938.7713 實例A11 [2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-氟-7-(5-氟-4-側氧基-3,4-二氫-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-16-羥基-2,10-二氧橋-2,10-二氫硫基八氫-12H-5,8-亞甲基呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-14-基]-9H-嘌呤-6-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基酯，中間體-8
Figure 02_image475
步驟1：2-[[[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲氧基羰基-甲基-胺基]甲基]苯甲酸，11-A
標題化合物係遵循實例A4之步驟2中所述之程序，用2-[(甲基胺基)甲基]苯甲酸HCl (150 mg, 0.72 mmol)替代de-Boc中間體-1開始來製備。在藉由矽膠層析(0-25% MeOH/DCM)純化後獲得11-A (306 mg, 67%)。LCMS (AA):m/z = 583.4 (M-H)。 步驟2：N-[(2-氯羰基苯基)甲基]-N-甲基-胺基甲酸[4-[[(2S )-2-[[(2S )-2-(第三丁氧基羰基胺基)-3-甲基-丁醯基]胺基]丙醯基]胺基]苯基]甲酯，中間體-8
向11-A (295 mg, 0.50 mmol)於冷卻至0℃之THF (1.5 mL)中之溶液中添加草醯氯(2.0 M溶液於DCM中，0.25 mL, 0.50 mmol)，然後添加3滴DMF。將反應混合物在0℃下攪拌45 min。然後將混合物濃縮至乾燥以提供粗中間體-8，將其直接用於下一步驟(304 mg, 100%)。 實例A12 [2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-氟-7-(5-氟-4-側氧基-3,4-二氫-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-16-羥基-2,10-二氧橋-2,10-二氫硫基八氫-12H-5,8-亞甲基呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-14-基]-9H-嘌呤-6-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S)-2-({(2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基酯，中間體-9
Figure 02_image477
將化合物編號14 (107 mg, 0.117 mmol)添加至圓底燒瓶(50mL)中且與無水吡啶(2 mL × 3次)共蒸發。然後將殘餘物再溶解於無水吡啶(4.26 mL, 52.7 mmol)中，且用氯三甲基矽烷(0.121 mL, 0.934 mmol)處理，並在室溫下攪拌30min。向上述溶液中添加吡啶(1.89 mL, 23.4 mmol)中之中間體-8 (423 mg, 0.70 mmol)，且在室溫下攪拌過夜。用10 ml MeOH淬滅反應混合物並攪拌30 min，去除所有溶劑，且添加氫氧化銨(28-30%水溶液，10 mL)並攪拌30 min。將反應混合物濃縮以獲得粗深色固體。將固體再溶解於MeOH (1.42 mL)中，並在0℃下用三乙胺三氫氟酸鹽(0.12 mL, 0.75 mmol)處理，且升溫至室溫並保持30 min。將混合物蒸發，並藉由反相急速管柱層析(0-50% ACN於碳酸氫銨水溶液(5 mM)中)純化，且進一步藉由製備型HPLC (Phenomenex 5微米C5 21.2×250 mm，用溶劑A (99% 10mM乙酸銨/1%乙腈) /溶劑B (5% 10mM乙酸銨/ 95%乙腈)自60% B至100% B在16 min內以20 mL / min之流量溶析)純化以提供呈銨鹽形式之中間體-9。LCMS (AA):m/z = 1277.8 (M+H)。1 H NMR (MeOD) δ 8.68 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 7.82 (br, d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.52-7.39 (m, 4H), 7.39 (s, 1H), 7.23-7.26 (m, 3H), 6.50-6.43 (m, 2H), 5.74 (dd,J = 4.0及52.0 Hz, 1H), 5.25-5.15 (m, 1H), 5.07-5.04 (m, 3H), 4.93-4.89 (m, 2H), 4.56-4.49 (m, 2H), 4.46-4.39(m, 3H), 4.30 (br, 1H), 4.03 (dd,J = 4.0及12.0 Hz, 1H), 3.95 (d,J = 4.0 Hz, 1H), 2.95 (br, 3H), 2.13-2.11 (m, 1H), 1.48 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 1.45 (s, 9H), 1.00 (d,J = 4.0 Hz, 3H), 0.94 (J = 4.0 Hz, 3H),31 P NMR (MeOD) δ 56.91 (s, 1P), 52.36 (s, 1P)。19 F NMR (MeOD) δ -165.65 (s, 1F), -203.16至-203.35 (m, 1F)。 實例A13 十八烷酸(2S,5S,19S)-2-({4-[({[2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-氟-7-(5-氟-4-側氧基-3,4-二氫-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-16-羥基-2,10-二氧橋-2,10-二氫硫基八氫-12H-5,8-亞甲基呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-14-基]-9H-嘌呤-6-基}胺甲醯基)苄基](甲基)胺甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺甲醯基)-16-羥基-5-異丙基-16-氧橋-4,7,11-三側氧基-19-(硬脂醯基氧基)-15,17-二氧雜-3,6,12-三氮雜-16λ~5~-磷雜二十烷-20-基酯(CP-4)
Figure 02_image479
步驟1：[2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-氟-7-(5-氟-4-側氧基-3,4-二氫-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-16-羥基-2,10-二氧橋-2,10-二氫硫基八氫-12H-5,8-亞甲基呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-14-基]-9H-嘌呤-6-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}苄基酯(13-A)
將中間體-9 (56 mg, 0.045 mmol)添加至圓底燒瓶中且冷卻至0℃。然後經由注射器添加TFA (0.24 mL, 3.2 mmol)及DCM (0.58 mL)之溶液，且將反應物在0℃下攪拌30 min。然後將反應混合物濃縮至乾燥並置於真空下2 h以提供呈TFA鹽形式之13-A (56 mg, 100%)。LCMS (AA):m/z = 1177.0 (M+H)。 步驟2：十八烷酸(2S,5S,19S)-2-({4-[({[2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15R,15aR,16R)-15-氟-7-(5-氟-4-側氧基-3,4-二氫-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-16-羥基-2,10-二氧橋-2,10-二氫硫基八氫-12H-5,8-亞甲基呋喃并[3,2-l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-14-基]-9H-嘌呤-6-基}胺甲醯基)苄基](甲基)胺甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺甲醯基)-16-羥基-5-異丙基-16-氧橋-4,7,11-三側氧基-19-(硬脂醯基氧基)-15,17-二氧雜-3,6,12-三氮雜-16λ~5~-磷雜二十烷-20-基酯，CP-4
向13-A (56 mg, 0.037 mmol)及13-B (40.0 mg, 0.041 mmol)於THF (1.4 mL)及DMF (0.7 mL)中之溶液中逐滴添加N,N -二異丙基乙胺(65 uL, 0.37 mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌16 h。然後將反應混合物濃縮至乾燥，並藉由製備型HPLC (Phenomenex 5微米C5 21.2×250 mm，用溶劑A (99% 10mM乙酸銨/1%乙腈) /溶劑B (5% 10mM乙酸銨/ 95%乙腈)自60% B至100% B在16 min內以20 mL / min之流量溶析)純化粗殘餘物以提供呈銨鹽形式之CP-4 (32.8 mg, 42%)。LCMS (AA): ½m/z = 1011.1 (M+H)。1 H NMR (MeOD) δ 8.78 (s, 1H), 8.74 (s, 1H), 7.90-7.88 (m, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.64-7.46 (m, 4H), 7.36 (s, 1H), 7.33-7.13 (m, 3H), 6.54-6.48 (m, 2H), 5.79 (dd,J = 4.0及52.0 Hz, 1H), 5.26-5.13 (m, 2H), 5.05-4.99 (m, 3H), 4.84 (m, 2H，隱藏於水峰中), 4.78-4.77 (m, 1H), 4.59-4.36 (m, 6H), 4.30-4.29 (m, 1H), 4.22-4.17 (m, 2H), 4.03-3.92 (m, 5H),  3.43 (t,J = 4.0 Hz, 2H), 2.96 (s, 3H), 2.89-2.24 (m, 8H), 2.20-2.12 (m, 1H), 1.98-1.90 (m, 2H), 1.67-1.56 (m, br, 4H), 1.48 (d,J = 8.0 Hz, 3H), 1.30 (br, 56H), 1.02-0.99 (m, 6H), 0.93-0.90 (m, 6H)。31 P NMR (MeOD) δ 57.47 (s, 1P), 52.87 (s, 1P), 0.12 (s, 1P)。19 F NMR (MeOD) δ -165.91至-166.08 (m, 1F), -203.70至-203.94 (m, 1F)。HR-MS (C92 H138 F2 N13 O25 P3 S2 )預期值：2020.8622，觀察值：2020.8601。 實例A14 [2-({9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基]甲基胺基甲酸4-{[(2S )-2-({(2S )-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-3-甲基丁醯基}胺基)丙醯基]胺基}苄基酯，中間體-10
Figure 02_image481
標題化合物係遵循實例A12中所述之程序，用呈TEA鹽形式之2-胺基-9-[(2R ,5R ,7R ,8R ,10R ,12aR ,14R ,15aS ,16R )-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-1,9-二氫-6H-嘌呤-6-酮(化合物I-5c) (關於合成參見PCT/IB2018/058846)替代化合物I-5c來製備。藉由反相急速管柱層析(0-50% ACN於碳酸氫銨水溶液(5 mM)中)純化粗產物以提供呈銨鹽形式之中間體-10。為轉化鹽，然後將此材料溶解於MeOH (2 mL)中並添加三乙胺(5 mL)。將混合物搖晃1 min.，去除溶劑並凍乾過夜以提供呈TEA鹽形式之中間體-10 (147 mg, 48%)。LCMS (AA):m/z = 1216.3 (M+H)。1 H NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.70 (s, 1H), 8.43 (brs, 1H), 8.40 (d,J = 5.9 Hz, 1H), 7.70 (d,J = 7.5 Hz, 1H), 7.56 - 7.46 (m, 3H), 7.42 - 7.38 (m, 1H), 7.32 - 7.19 (m, 3H), 6.84 (d,J = 5.5 Hz, 1H), 6.15 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 5.62 - 5.56 (m, 1H), 5.54 - 5.48 (m, 1H), 5.08 - 5.02 (m, 1H), 5.04 (s, 2H), 4.88 - 4.83 (m, 1H), 4.81 - 4.76 (m, 2H), 4.53 - 4.47 (m, 1H), 4.37 - 4.22 (m, 3H), 4.08 - 4.03 (m, 1H), 3.92 - 3.89 (m, 1H), 3.82 - 3.74 (m, 1H), 2.88 (s, 3H), 2.58 - 2.30 (m, 4H), 2.10 - 2.03 (m, 1H), 1.54 - 1.47 (m, 1H), 1.46 - 1.44 (m, 3H), 1.44 (s, 9H), 0.98 (d,J = 6.8 Hz, 3H), 0.93 (d,J = 6.8 Hz, 3H)。31 P NMR (162 MHz, MeOD) δ 55.01 (s, 1P), 53.03 (s, 1P)。 實例A15 十八烷酸(2S,5S,19R)-16-羥基-2-({4-[({[2-({9-[(2R,5R,7R,8R,10R,12aR,14R,15aS,16R)-16-羥基-2,10-二氧橋-14-(嘧啶-4-基氧基)-2,10-二氫硫基十氫-5,8-亞甲基環戊[l][1,3,6,9,11,2,10]五氧雜二磷雜十四熳環-7-基]-6-側氧基-6,9-二氫-1H-嘌呤-2-基}胺甲醯基)苄基](甲基)胺甲醯基}氧基)甲基]苯基}胺甲醯基)-5-異丙基-16-氧橋-4,7,11-三側氧基-19-(硬脂醯基氧基)-15,17-二氧雜-3,6,12-三氮雜-16λ~5~-磷雜二十烷-20-基酯，CP-5
Figure 02_image483
標題化合物係使用類似於實例A13所示之程序，用中間體-10替代中間體-9開始來製備，以獲得CP-5 (96.0 mg, 48.8% 2步)。LCMS (AA):m/z = 1959.8 (M+H)。1 H NMR (MeOD) δ  8.58 (s, 1H), 8.33 (s, 1H), 8.28 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.58 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 7.45-7.36 (m, 3H), 7.29 (t,J = 8.0 Hz, 1H), 7.14 (br, 3H), 6.72 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 6.04 (d,J = 8.0 Hz, 1H), 5.48 (br, 1H), 5.38-5.33 (m, 1H), 5.13-5.08 (m, 1H), 4.94-4.89 (m, 3H), 4.71 (隱藏於MeOD殘餘水峰內，1H), 4.67 (m, 2H), 4.42-4.38 (m, 1H), 4.34-4.30 (m, 1H), 4.25-4.04 (m, 5H), 3.95-3.91 (m, 1H), 3.87 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 3.82-3.78 (m, 2H), 3.69-3.62 (m, 1H), 3.29 (t,J = 4.0 Hz, 2H), 2.77 (s, 3H), 2.47-2.17 (m, 10H), 2.13 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 2.05-1.97 (m, 1H), 1.82-1.77 (m, 2H), 1.53-1.43 (br, m, 4H), 1.41-1.38 (m, 1H), 1.34 (d,J = 8.0 Hz, 3H), 1.17 (br, 56H), 0.89-0.86 (m, 6H), 0.80-0.76 (m, 6H)。31 P NMR (DMSO-d6) δ 55.29 (s, 1P), 53.05 (s, 1P), 0.29 (s, 1P)。HR-MS (C91 H141 N12 O25 P3 S2 )預期值：1959.8858，觀察值：1959.8886。
應該理解，[實施方式]部分而非[發明內容]及[摘要]部分意欲用於解釋申請專利範圍。[發明內容]及[摘要]部分可闡述如發明人所設想之本揭示案之一或多個而非所有例示性實施例，且因此不欲以任何方式限制本揭示案及所附申請專利範圍。
上文已藉助說明指定功能之實現及其關係之功能構建塊闡述了本揭示案。為了描述之方便，本文已經任意定義了該等功能構建塊之邊界。只要適當地執行指定之功能及其關係，即可定義替代邊界。
特定實施例之前述描述將如此充分地揭露本揭示案之一般性質，使得其他人可藉由應用本領域技術內之知識，在不脫離本揭示案之一般概念之情況下，容易地修改及/或適應該等特定實施例之各種應用，而無需過度之實驗。因此，基於本文呈現之教導及指導，該等適應及修改意欲處於所揭示實施例之等效物之含義及範圍內。應當理解，本文之措辭或術語係出於描述之目的而非為了限制，使得本說明書之術語或措辭將由熟習此項技術者根據教導及指導來解釋。
本揭示案之廣度及範圍不應受上述例示性實施例中之任一者之限制，而應僅根據所附申請專利範圍及其等效物來定義。
圖1繪示經由隨機半胱胺酸結合製備Ab-STING促效劑結合物。
圖2繪示經由轉麩醯胺酸酶結合製備Ab-STING促效劑結合物。
圖3繪示經由轉麩醯胺酸酶結合製備Ab-STING促效劑結合物。
圖4繪示經由分選酶結合製備Ab-STING促效劑結合物。(SEQ ID3及SEQ ID 4)
圖5繪示在去污溶酶體分析中ADC-1之酬載釋放。
圖6繪示在去污溶酶體分析中ADC-3之酬載釋放。
圖7繪示在去污溶酶體分析中ADC-9之酬載釋放。
圖8繪示在帶有表現GCC之CT26之Balb/C小鼠中ADC-1之血漿PK (0.1 mg/kg酬載劑量)。
圖9繪示在帶有表現GCC之CT26之Balb/C小鼠中ADC-8之血漿PK (0.055 mg/kg酬載劑量，釋放CDN BLQ)。
圖10繪示在帶有表現GCC之CT26之Balb/C小鼠中ADC-9之血漿PK (0.05 mg/kg酬載劑量，釋放CDN BLQ)。
圖11繪示ADC-1在帶有表現GCC之CT26之Balb/C小鼠中之功效(顯示酬載劑量)。
圖12繪示ADC-5在帶有表現GCC之CT26之Balb/C小鼠中之功效(顯示酬載劑量)。
圖13繪示ADC-8在帶有表現GCC之CT26之Balb/C小鼠中之功效(顯示酬載劑量)。
圖14繪示ADC-9在帶有表現GCC之CT26之Balb/C小鼠中之功效(顯示酬載劑量)。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 109115437-A0101-11-0001-1

Claims (43)

  1. 一種式(I)化合物，
    Figure 03_image001
    (I)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： a係1至20之整數； b係1至20之整數； m係0、1、2、3或4； n係0或1； D-NH-係胺基取代之化合物之一部分，其中該胺基取代之化合物具有式D-NH2 ； 每一R1 係獨立地選自C1 -C4 烷基、O-C1 -C4 烷基及鹵素； R2 係選自C1 -C4 烷基及-(CH2 CH2 O)s -CH3 ；其中s係1至10之整數； R3 及R3’ 係各自獨立地選自氫及C1 -C3 烷基； L係可裂解連接體；且 Ab係抗體、抗體片段或抗原結合片段。
  2. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中： a係1至4之整數； b係1至10之整數；且 m係0。
  3. 如請求項1或2之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中： m係0； n係0；且 R3 及R3’ 各自係氫。
  4. 如請求項1至3中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L係
    Figure 03_image003
    ； 其中：
    Figure 03_image005
    係與氮原子之連接點；
    Figure 03_image007
    係與Ab之連接點； t係1及10之整數； W係不存在或自消性基團； Z係不存在或2至5個胺基酸之肽； U及U’獨立地係不存在或間隔體；且 Q係異雙官能團； 條件係W及Z並非同時不存在。
  5. 如請求項4之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中W係選自以下之自消性基團：
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    、
    Figure 03_image015
    、
    Figure 03_image017
    、
    Figure 03_image019
    、
    Figure 03_image021
    Figure 03_image023
    、
    Figure 03_image025
    及
    Figure 03_image027
    ； 其中：
    Figure 03_image005
    係與羰基之連接點；且
    Figure 03_image029
    係與Z之連接點。
  6. 如請求項5之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中W係選自
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    及
    Figure 03_image013
    。
  7. 如請求項4至6中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中Z係能夠經酶促裂解之肽。
  8. 如請求項7之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中Z係細胞自溶酶可裂解的。
  9. 如請求項4至8中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中Z係選自Val-Cit、Cit-Val、Val-Ala、Ala-Val、Phe-Lys及Lys-Phe之二胺基酸肽。
  10. 如請求項4至9中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中U及U’係獨立地選自
    Figure 03_image035
    、
    Figure 03_image037
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    Figure 03_image043
    、
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    Figure 03_image051
    及
    Figure 03_image053
    ； 其中：
    Figure 03_image005
    係與Z之連接點；
    Figure 03_image007
    係與Q之連接點； p係1至6之整數； q係1至20之整數； X係O或-CH2 -；且 每一r獨立地係0或1。
  11. 如請求項4至10中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中Q係經由化學或酶介導之結合連接至Ab之異雙官能團。
  12. 如請求項11之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中Q係選自
    Figure 03_image056
    、
    Figure 03_image058
    、
    Figure 03_image060
    、
    Figure 03_image062
    、
    Figure 03_image064
    、
    Figure 03_image066
    、
    Figure 03_image068
    、
    Figure 03_image070
    、
    Figure 03_image072
    、
    Figure 03_image074
    Figure 03_image076
    及
    Figure 03_image078
    ； 其中
    Figure 03_image005
    係與U之連接點，或當U不存在時係與Z之連接點；且
    Figure 03_image007
    與U’之連接點，或當U’不存在時係與Ab之連接點。
  13. 如請求項4之化合物，其中 t係1； W係不存在或自消性基團；且 Z係不存在或二胺基酸肽。
  14. 如請求項1至13中任一項之化合物，其中R2 係-CH3 或-(CH2 CH2 O)s -CH3 且s係1至10之整數。
  15. 如請求項1至14中任一項之化合物，其中D-NH2 係調節STING活性之胺基取代之化合物。
  16. 如請求項15之化合物，其中該調節STING活性之胺基取代之化合物包含鳥嘌呤或腺嘌呤衍生物。
  17. 如請求項15之化合物，其中該調節STING活性之胺基取代之化合物係式(II)化合物：
    Figure 03_image080
    (II)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： X10 係SH或OH； X20 係SH或OH； Ya 係O、S或CH2 ； Yb 係O、S、NH或NRa ，其中Ra 係C1 -C4 烷基； R10 係氫、氟、OH、NH2 、ORb 或NHRb ； R20 係氫或氟； R30 係氫；R40 係氫、氟、OH、NH2 、ORb 或NHRb ；或R30 及R40 一起形成CH2 O； R50 係氫或氟； Rb 係C1 -C6 烷基、鹵代(C1 -C6 )烷基或C3 -C6 環烷基； 環A10 係視情況經取代之含有1-4個選自N、O或S之雜原子之5員或6員單環雜芳基環，或視情況經取代之含有1-5個選自N、O或S之雜原子之9員或10員雙環雜芳基環；其中環A10 在該環中包含至少一個N原子，且其中Yb 連接至環A10 之碳原子；且 環B10 係視情況經取代之含有2至5個選自N、O或S之雜原子之9員或10員雙環雜芳基環；其中環B10 在該環中包含至少兩個N原子； 條件係環A10 或環B10 經由-NH-基團連接至式(I)之羰基。
  18. 如請求項15至17中任一項之化合物，其中該調節STING活性之胺基取代之化合物係
    Figure 03_image082
    ； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中
    Figure 03_image005
    係與式(I)之羰基之連接點。
  19. 如請求項15之化合物，其中該調節STING活性之胺基取代之化合物係式(III)化合物：
    Figure 03_image084
    (III)； 或其醫藥學上可接受之鹽；其中 X10 係SH或OH； X20 係SH或OH； Yc 係O、S或CH2 ； Yd 係O、S或CH2 ； B100 係由式(B1 -A )或式(B1 -B )表示之基團：
    Figure 03_image490
    ； R13 、R14 、R15 、R16 及R17 各自獨立地係氫原子或取代基； R1000 係氫或連接至式(I)之羰基的鍵； Y11 、Y12 、Y13 、Y14 、Y15 及Y16 各自獨立地係N或CR1a ，其中R1a 係氫或取代基； Z11 、Z12 、Z13 、Z14 、Z15 及Z16 各自獨立地係N或C； R105 係氫原子或取代基； B200 係由式(B2 -A )或式(B2 -B )表示之基團：
    Figure 03_image492
    ； R23 、R24 、R25 、R26 及R27 各自獨立地係氫原子或取代基； R100’ 係氫或連接至式(I)之羰基的鍵； Y21 、Y22 、Y23 、Y24 、Y25 及Y26 各自獨立地係N或CR2a ，其中R2a 係氫或取代基； Z21 、Z22 、Z23 、Z24 、Z25 及Z26 各自獨立地係N或C；且 R205 係氫原子或取代基；其中R105 及R205 各自獨立地連接至其分別連接之5員環之2位或3位； 條件係： B100 或B200 中之一者經由-NH-基團連接至式(I)之羰基。
  20. 如請求項19之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其具有式(IIIa)：
    Figure 03_image088
    (IIIa)； 或其醫藥學上可接受之鹽；其中 B100 係由式(B1 -A )或式(B1 -B )表示之基團：
    Figure 03_image493
    ； R13 、R14 、R15 、R16 及R17 各自獨立地係氫原子或取代基； R1000 係氫或連接至式(I)之羰基的鍵； Y11 、Y12 、Y13 、Y14 、Y15 及Y16 各自獨立地係N或CR1a ，其中R1a 係氫或取代基； Z11 、Z12 、Z13 、Z14 、Z15 及Z16 各自獨立地係N或C； R105 係氫原子或取代基； B200 係由式(B2 -A )或式(B2 -B )表示之基團：
    Figure 03_image495
    ； R23 、R24 、R25 、R26 及R27 各自獨立地係氫原子或取代基； R100’ 係氫或連接至式(I)之羰基的鍵； Y21 、Y22 、Y23 、Y24 、Y25 及Y26 各自獨立地係N或CR2a ，其中R2a 係氫或取代基； Z21 、Z22 、Z23 、Z24 、Z25 及Z26 各自獨立地係N或C；且 R205 係氫原子或取代基；其中R105 及R205 各自獨立地連接至其分別連接之5員環之2位或3位； 條件係： B100 或B200 中之一者係：
    Figure 03_image092
    ； 其中： R18 係氫或C1-6 烷基；且 R19 係鹵素原子； 且另一者經由-NH-基團連接至式(I)之羰基。
  21. 如請求項19或20之化合物，其中該調節STING活性之胺基取代之化合物係：
    Figure 03_image094
    ； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中
    Figure 03_image005
    係與式(I)之羰基之連接點。
  22. 一種式(IV)化合物，
    Figure 03_image096
    (IV)； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： a係1至20之整數； b係1至20之整數； k係0、1、2或3； m係0、1、2、3或4； D-NH-係胺基取代之化合物之一部分，其中該胺基取代之化合物具有式D-NH2 ； R2 係選自H、C1 -C4 烷基及-(CH2 CH2 O)s -CH3 ；其中s係1至10之整數； R4 係選自氫及任何天然胺基酸側鏈； R5 係選自C1 -C4 烷基及O-C1 -C4 烷基； L係可裂解連接體；且 Ab係抗體、抗體片段或抗原結合片段。
  23. 如請求項22之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中L係
    Figure 03_image098
    ， 其中：
    Figure 03_image005
    係與羰基之連接點；
    Figure 03_image007
    係與Ab之連接點； W係自消性基團； Z係不存在或2至5個胺基酸之肽；且 U及U’獨立地係不存在或間隔體；且 Q係異雙官能團。
  24. 一種式(V)化合物，
    Figure 03_image100
    (V)； 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： D-NH-係
    Figure 03_image102
    或
    Figure 03_image104
    ； X係O或CH2 ； f係1至10之整數； g係1至20之整數； U及U’獨立地係不存在或間隔體； Q係異雙官能團；且 Ab係抗體、抗體片段或抗原結合片段。
  25. 如請求項24之化合物，其中X係O。
  26. 一種式(VI)化合物，
    Figure 03_image106
    (VI)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： a係1至20之整數； m係0、1、2、3或4； n係0或1； D-NH-係胺基取代之化合物之一部分，其中該胺基取代之化合物具有式D-NH2 ； 每一R1 係獨立地選自C1 -C4 烷基、O-C1 -C4 烷基及鹵素； R2 係選自C1 -C4 烷基及-(CH2 CH2 O)s -CH3 ；其中s係1至10之整數； R3 及R3’ 係各自獨立地選自氫及C1 -C3 烷基； L係可裂解連接體；且 LP係脂質。
  27. 如請求項26之化合物，其中該脂質係膽固醇或磷脂。
  28. 如請求項27之化合物，其中該脂質係磷脂。
  29. 如請求項28之化合物，其中該磷脂係選自磷脂醯膽鹼、磷脂醯甘油、磷脂酸、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、鞘磷脂、大豆磷脂及蛋黃磷脂。
  30. 如請求項28之化合物，其中該磷脂係磷脂醯乙醇胺，其中該磷脂醯乙醇胺係1,2-二硬脂醯基-sn -甘油-3-磷酸乙醇胺。
  31. 一種脂質複合物，其包含如請求項26至30中任一項之化合物。
  32. 如請求項31之脂質複合物，其中該脂質複合物呈脂質體形式。
  33. 如請求項31或32之脂質複合物，其進一步包含一或多種磷脂。
  34. 如請求項33之脂質複合物，其中該一或多種磷脂係選自磷脂醯膽鹼、磷脂醯甘油、磷脂酸、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、鞘磷脂、大豆磷脂及蛋黃磷脂。
  35. 如請求項34之脂質複合物，其中該磷脂係磷脂醯膽鹼，其中該磷脂醯膽鹼係1,2-二硬脂醯基-sn -甘油-3-磷酸膽鹼。
  36. 如請求項31至35中任一項之脂質複合物，其進一步包含脂肪醇。
  37. 如請求項31至36中任一項之脂質複合物，其進一步包含膽固醇。
  38. 如請求項31至37中任一項之脂質複合物，其進一步包含至少一種聚乙二醇化脂質。
  39. 如請求項38之脂質複合物，其中該聚乙二醇化脂質係選自聚乙二醇化磷脂及聚乙二醇化二醯基甘油。
  40. 如請求項39之脂質體，其中該聚乙二醇化脂質係N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂醯基-sn -甘油-3-磷酸乙醇胺。
  41. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至40中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽及一或多種醫藥學上可接受之載劑。
  42. 一種治療有需要之個體之癌症之方法，該方法包括向該個體投與醫藥學上可接受量之如請求項1至40中任一項之化合物。
  43. 一種刺激有需要之個體之免疫反應之方法，該方法包括向該個體投與醫藥學上可接受量之如請求項1至41中任一項之化合物、脂質複合物或組合物。
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