JP2008543346A - 腫瘍壊死因子受容体のプレリガンドアセンブリドメイン（ｐｌａｄ）を標的にすることによる炎症性関節炎の改善 - Google Patents

腫瘍壊死因子受容体のプレリガンドアセンブリドメイン（ｐｌａｄ）を標的にすることによる炎症性関節炎の改善 Download PDF

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Abstract

本発明は、TNF受容体様受容体のプレリガンドアセンブリドメイン（PLAD）の単離されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。本発明は、プレリガンドアセンブリドメイン（PLAD）の単離されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、そのPLADが、TNF-RのPLAD、p60のPLAD、p80のPLAD、Fas（CD95/APO-1）のPLAD、TRAIL受容体のPLAD、LTβRのPLAD、CD40のPLAD、CD30のPLAD、CD27のPLAD、HVEMのPLAD、OX40のPLADおよびDR4のPLADからなる群より選択されるポリペプチドも提供する。TNF-R、p60、p80、Fas、TRAIL受容体、LT/βR、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40、DR4、TROY、EDAR、XEDAR、DCR3、AITR、4-1BB、DR3、RANK、TACI、BCMA、DR6、DPG、DR5、DCR1、およびDCR2は、全てTNF受容体スーパーファミリーまたはTNF様受容体ファミリーのメンバーである。本発明は、TNF受容体スーパーファミリーの他のメンバーについてもPLADを提供する。本発明のポリペプチドは、TNF受容体スーパーファミリーメンバーのオリゴマー化を阻害するために利用することができる。これらのポリペプチドは、TNF受容体スーパーファミリーメンバーへのリガンド結合を阻害するために利用することもできる。本発明は、TNF受容体オリゴマー化の阻害剤を含む組成物も提供する。さらに本発明は、PLADを欠くTNF受容体スーパーファミリーのメンバーも提供する。

Description

本願は、米国仮特許出願第60/694,015号（2005年6月24日出願）および米国仮特許出願第60/717,589号（2005年9月16日出願）に基づく優先権を主張し、これらの仮特許出願は参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。
発明の背景
本発明は、TNF受容体（TNFR）スーパーファミリーのメンバーの細胞外領域にある保存されたドメインに、受容体オリゴマーの特異的なリガンド非依存的アセンブリの媒介にかかわる新規な機能を与える。
TNFRスーパーファミリーのメンバーは、通例、その細胞外領域にある1〜6個のシステインリッチドメイン（CRD）、1回膜貫通ドメインおよびさまざまなサイズの細胞質内ドメインを含有している。この受容体ファミリーのメンバーは、通例、構造、機能および配列の類似性によって定義されるTNFサイトカインンファミリーのリガンドに結合する。これらの受容体は、その活性リガンド結合状態では三量体を形成し、いくつかのメンバーはデスドメインと呼ばれる細胞質ドメインを含有する。
本発明によれば、これらの受容体の細胞外領域はさらに、少なくとも一つのシステインリッチドメインを含有するプレリガンド受容体アセンブリドメイン（PLAD）によって媒介される自己会合機能またはホモタイプ会合機能を特徴とする。より具体的に述べると、TRAIL受容体1、CD40、60kDa TNFRおよび80kDa TNFRなどのTNFRスーパーファミリーメンバーは、このホモタイプ会合を示す。TNFRスーパーファミリーの他のメンバー、例えばFas、LTβR、CD40、CD30、CD27、HVEM、RANK、OX40およびDR4も、このPLADを含有する。PLADはリガンド結合および受容体機能にとって必要である。このように、TNFRスーパーファミリーのメンバーは、個々の受容体サブユニットのリガンド誘発的架橋によってシグナルするのではなく、明確なプレ形成（pre-formed）複合体によってシグナルするようである。したがって、これらプレ形成複合体の形成を妨げ、その結果として受容体機能を遮断するために、PLADを医薬品の標的にすることができる。
多くの微生物が自らに向けられる免疫応答に対抗するための有効な戦略を進化させてきたことは確立されている（79）。より具体的に述べると、いくつかのウイルスおよび細菌は、サイトカインおよびケモカインなどの免疫エフェクター分子の作用を調整するか直接遮断するように設計された細胞性タンパク質のホモログを発現させる（80）。いくつかのポックスウイルスおよびヒトサイトメガロウイルスを含むいくつかの大きなDNAウイルスでは、TNF受容体様受容体のウイルスホモログ（vTNFR）が同定されている。vTNFRのPLAD媒介性自己会合もしくはTNFファミリー受容体との異種会合の存在または役割は、まだ解明されていない。
主要な関節炎に、慢性関節リウマチ（RA）と敗血症性関節炎（SA）の二つがある。RAは、慢性的な関節の炎症と進行性骨破壊を伴う一般的なヒト自己免疫疾患である（48）。RAの病因および病理発生過程はまだ完全には理解されていないが、TNF-α、IL-1、IL-6およびRANKL（recptor activator of NF-κB ligand）などのサイトカインが疾患の進行に関与する（56〜60）。核内因子カッパB（NF-κB）は、これらのサイトカインの決定的な調節因子である（56〜60）。TNF-αはRAの病理発生過程に重要な役割を果たし、そのアンタゴニスト、例えばTNFR II免疫グロブリンFc融合タンパク質であるエタネルセプト（エンブレルとも呼ばれている）、および抗TNF-αモノクローナル抗体であるインフリキシマブ（レミケードとも呼ばれている）は、RAの臨床経過を改善することができる（48）。SAは、細菌感染によって誘導される急速進行性の高度に破壊的な関節疾患であり、ここでもTNF-αは重要な役割を果たす（49）。TNF-α（59）、リポ多糖（LPS）、CpG-DNA（50、61）、およびコラーゲン（62）によって誘導される関節炎のマウス実験モデルが、新しい処置の試験に役立っている。これらの薬剤は、滑膜炎、パンヌス形成、骨破壊および軟骨破壊、ならびにヒトRAおよびSAに観察される他の特徴を誘導する。
本発明によれば、インビトロデータおよびインビボデータは、TNF-αおよび実験的炎症性疾患におけるその帰結を、TNFR PLADタンパク質が強力に阻害できるということを示している。
本発明は、TNF受容体様受容体のプレリガンドアセンブリドメイン（pre-ligand assembly domain：PLAD）の単離されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
また、プレリガンドアセンブリドメイン（PLAD）の単離されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、そのPLADが、TNF-RのPLAD、p60のPLAD、p80のPLAD、Fas（CD95/APO-1）のPLAD、TRAIL受容体のPLAD、LTβRのPLAD、CD40のPLAD、CD30のPLAD、CD27のPLAD、HVEMのPLAD、OX40のPLAD、DR4のPLAD、NGFRのPLAD、TroyのPLAD、EDARのPLAD、XEDARのPLAD、DcR3のPLAD、AITRのPLAD、4-1BBのPLAD、DR3のPLAD、RANKのPLAD、TACIのPLAD、BCMAのPLAD、DR6のPLAD、OPGのPLAD、DRSのPLAD、DcR1のPLAD、およびDcR2のPLADからなる群より選択されるものも、本発明によって提供される。TNF-R、p60 TNFR、p80 TNFR、Fas、TRAIL受容体、LTβR、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40、DR4、NGFR、Troy、EDAR、XEDAR、DcR3、AITR、4-1BB、DR3、RANK、TACI、BCMA、DR6、OPG、DRS、DcR1、およびDcR2は、全てTNF受容体スーパーファミリー（本明細書ではTNF受容体様受容体ファミリーともいう）のメンバーである。本発明は、TNF受容体スーパーファミリーの他のメンバーについてもPLADを提供し、当業者がそれを同定するための方法も提供する。
本発明のポリペプチドは、PLADの自己会合およびTNF受容体サーパーファミリーメンバーのオリゴマー化を阻害するために利用することができる。これらのポリペプチドは、TNF受容体スーパーファミリーメンバーへのリガンド結合を阻害するためにも利用することができる。
本発明は、TNF受容体オリゴマー化の阻害剤を含む組成物も提供する。さらに本発明は、PLADを欠くTNF受容体スーパーファミリーのメンバーも提供する。
図面の簡単な説明
図１Ａは、リガンド非存在下のTNFRオリゴマーを図示している。TNFαで処理したまたはTNFαで処置していないH9 T細胞リンパ腫を、DTSSPによる架橋に付した（7）。全細胞溶解物を、表示のとおり、非還元条件下（レーン1〜4、9〜12）または還元条件下（レーン5〜8、13-16）で電気泳動し、p60またはp80 TNFRについてブロッティングした。角括弧は、三量体（T）および単量体（M）の位置を示す。丸印は抗p80抗体と交差反応する非特異的タンパク質を示す。これらの結果は、3回の独立した実験を代表している。
図１Ｂは、特異的なp60 TNFR自己会合を図示している。293T細胞に、p60ΔCD-GFP-HA（レーン1〜3）またはpEGFP-N1（レーン4〜6）およびpcDNA3（レーン1、4）、p60ΔCD-HA（レーン2、5）またはHVEMΔCD-HA（レーン3、6）のいずれか一つをトランスフェクトした。抗GFP抗体（上段の2パネルでGFP IP）で免疫沈降を行い、表示のとおり抗HA抗体（HA WB）または抗GFP抗体（GFP WB）でブロッティングした。上段および中段のパネルは、沈降したp60ΔCD-GFP-HA（またはGFP）およびp60ΔCD-HAを、それぞれ示している。下段のパネルは細胞溶解物中のp60ΔCD-HAおよびHVEMΔCD-HAタンパク質を示している。これらの結果は5回の実験を代表している。
図１Ｃは、特異的なp80自己会合およびプレリガンドアセンブリドメイン（PLAD）の定義を図示している。上端に示すプラスミドを293T細胞にトランスフェクトした。完全長p80だけを認識するC末端特異的抗p80抗体（p80 IP）を使って免疫沈降を行った（上段および中段のパネル）。溶解物中のトランケート型p80またはp60タンパク質の発現を、下段のパネルに示す。ウェスタンブロットは、抗HA抗体（上段および下段のパネル）ならびにC末端特異的抗p80抗体（中段のパネル）を使って行った。白丸は糖鎖付加型および非糖鎖付加型のp80を表す。黒丸はIg重鎖を意味する。
図１Ｄは、PLADが受容体の自己会合にとって十分であることを図示している。p80ΔCD-GFP-HA（レーン1〜5）を、各レーンの上端に示すプラスミドと共に、293T細胞にトランスフェクトした。抗GFP抗体を使って免疫沈降を行い、抗HA抗体を使ってウェスタンブロットを行った。共沈したDCDタンパク質および総細胞溶解物におけるそれらの発現を、それぞれ中段および下段のパネルに示す。上段のパネルは沈降したp60ΔCD-GFP-HAタンパク質を示している。
図１Ｅは、PLADがTNFα結合にとって不可欠であることを図示している。ヒストグラムは、表示したコンストラクトをトランスフェクトした293T細胞における、トランスフェクトされた受容体の発現（抗HA染色による）と、TNFαへのそれらの結合を示している（25）。x軸は蛍光の強度を示し、y軸は細胞数を示す。表示の数字は、ベクタートランスフェクト対照と比較した陽性集団のパーセンテージである。
図２Ａは、PLADにおける残基の置換が自己会合を妨げることを図示している。293T細胞に表示のプラスミドをトランスフェクトした。図1と同様に抗GFP抗体を使って免疫沈降を行った。抗HA抗体を使ってウェスタンブロットを行った。上段および中段のパネルは、沈降したp60ΔCD-GFP-HA（白丸）およびp60ΔCD-HA突然変異型タンパク質（角括弧）を、それぞれ示している。下段のパネルは、細胞溶解物中のp60ΔCD-HA突然変異体（角括弧）およびHVEMΔCD-HA（黒丸）の発現を示している。
図２Ｂは、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）によって実証されるp60およびp80 TNFRのホモタイプ自己会合を図示している。表示のCFP（上側）およびYFP（下側）プラスミドペアをトランスフェクトした293T細胞のフローサイトメトリー分析のヒストグラム。破線はCFPだけをトランスフェクトした対照を表し、実線はTNFαなしのFRETを表し、太線はTNFαありのFRETを表す。x軸およびy軸は、それぞれ、FRET蛍光強度および細胞数を表す。全ての細胞がYFP陽性でもあるCFP陽性集団でFRETを分析した。FRETは、CFPの励起によるYFPの蛍光放射と定義される。これらの結果は独立した4回の実験を代表している。
図３Ａは、TNFRスーパーファミリーの代表的メンバーについて、CRD1（p60のCRD1（配列番号22）、p80のCRD1（配列番号23）、LTβRのCRD1（配列番号24）、CD40のCRD1（配列番号25）、HVEMのCRD1（配列番号26）およびCD30のCRD1（配列番号27））の配列アラインメントを示す（26）。この図は、ジスルフィド結合を形成し、TNFRスーパーファミリーのメンバーたる資格を与えるシステインリッチドメインを定義する、高度に保存されたシステインの位置を図示している。
図３Ｂは、他のTNFRスーパーファミリーメンバーにおける受容体自己会合を図示している。DR4ΔCD-GFP-HA（レーン1〜4）またはCD40ΔCD-GFP-HA（レーン5、6）のどちらか一方を、p80ΔCD-HA（レーン1、6）、p60ΔCD-HA（レーン2）、HVEMΔCD-HA（レーン3）、DR4ΔCD-HA（レーン4）またはCD40ΔCD-HA（レーン5）と共に、293T細胞にトランスフェクトした。免疫沈降とウェスタンブロットを、それぞれ、抗GFP抗体および抗HA抗体で行った。上段のパネルは免疫複合体中の沈降タンパク質を示し、下段のパネルは細胞溶解物中のDCDタンパク質の発現を示す。黒丸はGFP融合タンパク質を意味し、矢印は免疫複合体中のDCDタンパク質を示す。
図３Ｃは、FRETによって実証されるDR4およびCD40の特異的受容体会合のフローサイトメトリー分析を示す。表示のCFP（上側）およびYFP（下側）プラスミドペアによるトランスフェクションを、図2Bと同様に行った。破線は、CFPのみによるバックグラウンドFRETを表し、太線はCFP融合タンパク質とYFP融合タンパク質がどちらも存在する場合のFRETを表す。どの群についても、x軸はFRET強度であり、y軸は細胞数である。
図３Ｄは、プレ会合した三量体複合体に基づくTNFRシグナリングの二つのモデルを図示している。プレアセンブリ鎖再配列モデル（左側）の場合、楕円はCRD（CRDには膜遠位から膜近位に向かって順に1〜4の番号が付与される）を表し、斑点付きの四角形は細胞質ドメインを示す。受容体を形質膜に対して垂直に見ている。ローマ数字は三量体複合体中の鎖を表す。三量体クラスター化モデル（右側）の場合、灰色の記号は、細胞表面上のプレアセンブルTNFR三量体を示し、丸で囲んだ三角形は三量体型TNFαを表す。数字1〜3は、プレアセンブルした三量体複合体中の受容体の三つの鎖を表す。受容体を形質膜に向かって見下ろしている。
図４Ａは、病原性Fas突然変異が、リガンド結合の非存在下で、ドミナント干渉を引き起こすことを示している。野生型（WT）、Pt2（del 52-96）、およびPt6（A241D）Fas分子の表面発現および結合特徴。左側の列は、各受容体タンパク質のN末端に存在するAU-1エピトープタグに関する染色を使った、293T細胞へのトランスフェクションの24時間後における表面発現を示している。中央の列は、同じ細胞を10μg/mlの抗Fasアゴニスト抗体APO-1（Kamiya）で染色したものを示している。右側の列は、修飾ロイシンジッパーによって三量体化するように操作したFasLの結合（抗ロイシンジッパーmAbによる染色で可視化したもの）を示している（FasL染色）。抗体結合はフィコエリトリンコンジュゲート抗マウス抗体を使って可視化した。角括弧は、非トランスフェクト対照と比較した場合に、染色に関して強く陽性な細胞のパーセンテージを示す。各グラフにおいて、太線および細線は、それぞれ、トランスフェクト細胞調製物および非トランスフェクト細胞調製物からのシグナルを表す。ヒストグラムはいずれも、4ディケードの対数蛍光目盛（X軸）対細胞数（Y軸）にプロットした10,000イベントを表す。データは、Flowjoソフトウェア（Treestarソフトウェア）を使って、FACScaliburフローサイトメーターで収集した。
図４Ｂは、WT Fasとコトランスフェクトされた突然変異型Fas分子によるドミナント阻害を示す。10μgの表示した発現ベクターまたはpCIベクターのみを、トランスフェクト細胞をGFPでマーキングするためのpEGFP-N1（Clontech）5μgと共に、以前述べたようにヒトFasを欠くBW細胞にエレクトロポレートした（15）。24時間後に、表示した量の抗Fas mAb APO-1を、アポトーシス誘導が最大になるように、1/20体積の可溶性プロテインA（Sigma）と共に加えた。フローサイトメトリーでGFP陽性生細胞を数え上げ、細胞消失量を算出することによって、アポトーシスを定量化した（15）。
図４Ｃは、Fas分子の自己会合を図示している。C末端デスドメインが緑色蛍光タンパク質で置き換えられているHAタグ付きFas（HAFas 1-210:GFP）をコードする発現ベクターを、野生型（WT）FasおよびEC突然変異型Pt2 Fas(del 52-96)と共にコトランスフェクトした。対照細胞には、WT FasおよびGFPに融合したHAタグ付き細胞質トランケート型のTNF受容体ファミリーメンバー・ヘルペスウイルス侵入媒介因子（Herpesvirus Entry Mediator：HVEMまたはHveA）（HA HVEMΔCD:GFP）を、コトランスフェクトした。実施例で述べるように、細胞溶解物を溶解し、抗GFPで免疫沈降し、電気泳動した。GFPタグ付きタンパク質と共沈した完全長Fas分子を明らかにするために、沈降したタンパク質のブロットを、Fas C末端（C20, Santa Cruz biotechnology）に対するポリクローナル抗血清（抗Fas CT）でプローブした。また、細胞溶解物を、抗HA-HRP（Roche Molecular Biochemicals）および抗Fas C20により、ウェスタンブロット（WB）でプローブして、これらのタンパク質の総量を定量した。白丸は免疫沈降物中のIgG重鎖を示し、黒丸はWT Fasを示し、矢印はトランケート型Pt2 Fasタンパク質を示す。抗Fas C20でブロッティングした一部のレーンにおける上部のバンドは、糖鎖付加型Fasを表す。
図５Ａは、PLADまたはリガンド結合を欠くFas突然変異体の発現および機能を示す。N末端Fas突然変異体によるAPO-1およびFasLの結合。表示したHAタグ付きFas突然変異体、R86S Fas突然変異体、およびC末端トランケート型HAタグ付きTNFR2（TNFR2）による対照トランスフェクションの染色を、細胞表面上の各突然変異体の総発現量を示すために抗AU1の代りに抗HAを使用した点を除いて、図1Aと同様に行った。
図５Ｂは、Fas細胞外ドメインの相互作用が、タンパク質のN末端領域にあるドメインに依存することを示している。レーン1〜4では、293T細胞に、デスドメインを欠くAU-1タグ付きFas 1-210および表示したHAタグ付きFas突然変異体または対照TNFR2タンパク質（HA TNFR2ΔCD）を、コトランスフェクトした。溶解物を抗AU1で免疫沈降し、共沈したタンパク質を明らかにするために抗HAでプローブした。溶解物中のAU-1 Fas 1-210タンパク質の量を定量するために、FasのN末端に対する抗体による対照ブロット（WB 抗FasN）を示す。これらの結果は、3回の独立したトランスフェクションを代表している。レーン5〜7は、図1Cで用いた手法と同じ手法で、HAFas1-210:GFPによるWT FasおよびFasR86S突然変異体の共沈を示している。白丸は免疫沈降抗体のIg重鎖を示し、黒丸は免疫沈降したFasの位置を示す。
図５Ｃは、自己会合ドメインを欠くFas分子ではアポトーシスの誘導が失われることを図示している。BW5147マウス胸腺腫細胞に、表示したFas分子の発現ベクター10μgをトランスフェクトした。アポトーシスを500μg/mlの可溶性APO-1で誘導し、図1Bと同様に定量した。
図５Ｄは、非リガンド結合性R86S Fas突然変異体によるアポトーシスの誘導および阻害を図示している。BW細胞に10μgの各Fas発現ベクターおよび5μgのGFPプラスミドをトランスフェクトした。アポトーシスの誘導および定量は、白いバーで示す試料ではアポトーシスの誘導にAPO-1を使用し、黒いバーでは5％v/v FasL上清を試料に加えた点を除いて、図2Cと同様に行った。
図６Ａは、Fas分子間の蛍光共鳴エネルギー移動。表示したコトランスフェクタントにおけるCFPシグナル、YFPシグナルおよびFRETシグナル間の関係を示すドットプロット。CFP融合タンパク質およびYFP融合タンパク質を構築し、293T細胞にトランスフェクトし、FACSVantageサイトメーターで分析した。数字はFRETシグナルを持つCFPまたはYFP陽性細胞のパーセンテージである（右上の象限）。
図６Ｂは、完全長Fas受容体とN末端欠失Fas受容体とのFRETシグナルの比較。CFP蛍光についてゲーティングした細胞でFRETシグナルのヒストグラムを作成した。YFP蛍光は全てのトランスフェクタント間で同程度だった。太線はコトランスフェクト細胞からのシグナルであり、細線は各ペアのCFPコンストラクトのみからのシグナルである。
図６Ｃは、表示したCFPおよびYFPペアのFRET効率を、個々の細胞上のYFPの顕微鏡フォトブリーチングによって決定したものを示す（4〜7細胞領域を5回読み取り）。数字は各プラスミドペアについての平均E％および標準誤差を表す。
図７Ａは、内在性Fas受容体鎖のプレ会合を図示している。1×107個のH9リンパ腫細胞を架橋剤DTSSP（Pierce、10mM、4℃で30分の後、10mM Tris-Cl pH8で15分間クエンチする）で処理し、かつ/または、表示した条件下に1μgのアゴニスト抗体APO-1またはFasLで15分間刺激した。抗Fasイムノブロッティングのために、細胞溶解物をN-グリカナーゼ-F（Roche Molecular Biochemicals）で処理してから電気泳動し、抗Fas C末端mAb B10（Santa Cruz Biotechnology）および抗マウスIgG1-HRP（Southern Biotechnology）でプローブした。
図７Ｂは、表示の試薬で処理した後に細胞を溶解し、免疫沈降し、以前述べたように、FADDおよびカスパーゼ-8についてブロットした（11）。プロカスパーゼ-8の二つのアイソフォーム（p54/52）およびp11カスパーゼサブユニットのタンパク質分解後のカスパーゼ-8切断産物（p43/41）の位置を、矢印で示す。
図７Ｃは、PARP切断を示す。（A）および（B）で使用した細胞の一部を37℃でさらに4時間培養し、細胞溶解物を抗PARP mAb（Research Diagnostics Inc）でブロッティングした。上側のバンドは115kD完全長PARPであり、下側のバンドは特徴的な85kDカスパーゼ切断断片である。これらの結果は、各条件につき少なくとも3回の独立した実験を代表している。
図８Ａは、ドミナント干渉がN末端PLADに依存することを図示している。NIHで研究された家族から選ばれたALPS患者Fas突然変異のアラインメント。「×」印は点突然変異の位置を示している。共沈によって試験した野生型Fasと会合する能力（SA）およびコトランスフェクション研究におけるFas誘導アポトーシスのドミナント阻害（DI）を、記載のとおり示す。患者番号1および患者番号20の突然変異によってコードされるドミナントネガティブPLAD含有ポリペプチドをコードする配列を示す。番号付けはシグナルペプチド後の最初のアミノ酸から開始する。斜体はフレームシスト突然変異によって付加された余分なアミノ酸を表す。
図８Ｂは、PLADがないとドミナント干渉が起こらないことを図示している。Fas感受性Jurkat Tリンパ腫細胞に、10μgの表示したコンストラクトおよび2.5μgのGFPレポータープラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの18時間後に、表示した量のApo-1を6時間加え、Annexin V-PE（Pharmingen）で染色することにより、アポトーシスを定量した。パーセンテージは、Annexin Vで陽性に染色されるGFP(+)細胞のパーセントである。これらの結果は3回の独立したトランスフェクションを代表している。
図９は、p80キメラ受容体またはトランケート体の存在に関する免疫沈降物の分析を示す。表示のプラスミドを293T細胞にトランスフェクトし、収集して、抗p80 COOH末端特異的抗体を使って共免疫沈降を行った。ウェスタンブロット分析で抗HA抗体を使用することにより、免疫沈降物をp80キメラ受容体またはトランケート体の存在について分析した（上段のパネル）。下段のパネルは、全細胞溶解物におけるHAタグ付きタンパク質の発現を示している。
図１０は、組換え細菌PLADタンパク質の発現を示す。（a）PLADが受容体の三量体アセンブリおよびリガンド結合能力に寄与する方法のモデル。可溶性PLADタンパク質は、個々の受容体鎖と会合し、三量体型受容体アセンブリを妨げ、その結果として、リガンドが誘導するシグナリングを遮断するのだろう。（b）精製GST、P60 PLAD-GST（P60）、およびP80 PLAD-GST（P80）のゲル電気泳動。分子量マーカーとサイズ（単位キロダルトン）を左側に示す。（c）P60 PLAD（上段のパネル）またはP80 PLAD（下段のパネル）に対するモノクローナル抗体（MAb）を使ったウェスタンブロット分析。P60 PLAD（左側のパネル）またはP80 PLAD（右側のパネル）について、元のゲル電気泳動に使用したタンパク質の量（μg数）のタイトレーションを示す。
図１１は、TNF-α誘導細胞死におけるPLADタンパク質の作用を示す。（a）L929細胞を培地；ヒトTNF-α（hTNF）（2ng）；hTNF-α（2ng）＋P60 PLAD（P60）（40μg）で処理した後にフローサイトメトリーで評価した細胞死。挿入図は位相差顕微鏡写真を示す。右下に、ゲーティングされた生細胞のパーセントを示す。Y軸はヨウ化プロピジウム（PI）染色であり、X軸はFSC（前方散乱光プロファイル）である。死細胞は高いPI染色と低いFSCを示す。（b）マウスTNF-α（mTNF）（2ng）またはhTNF（2ng）とさまざまな用量のPLAD P60（P60）タンパク質とによって誘導される細胞消失。（c）mTNF（2ng）またはhTNF（2ng）とさまざまな用量のPLAD CD40（CD40）タンパク質とによって誘導されるL929細胞の消失。（d）TNF-αまたは抗Fas（P60 PLAD（P60）、P80 PLAD（P80）およびGSTの添加ありまたはなし）で12時間処理した後の42.3Jurkat細胞の消失。TNF-α（3ng）、P60L（低；4.5μg）、P60H（高；15μg）、P80L（低；4.5μg）、P80H（高；15μg）、GST（15μg）、抗Fas（10ng）。（e）mTNF-α（4ng）（P60 PLAD（100μg）、エタネルセプト（25μg）、インフリキシマブ（20μg）の添加ありまたはなし）で処理し、基質変換の光学密度（OD）によって測定した、L929細胞におけるカスパーゼ-8活性。
図１２は、BALB/cマウスにおけるTNF-αの関節内注射およびC3H/HeJマウスにおける細菌CpG DNAの関節内注射よって誘導された関節炎に対するP60およびP80 PLADタンパク質の作用を示す。（a）膝関節HE染色組織切片の代表的顕微鏡写真：PBS；45ng TNF-α；P60 PLAD（100μg）および45ng TNF-α；P80 PLAD（100μg）および45ng TNF-α；CpG DNA（1nmol）；CpG DNA（1nmol）およびP60 PLAD（100μg）を示す。矢印は炎症巣を示す。ラベルは、C（軟骨）、JC（関節腔）、ST（滑膜組織）、B（骨）であり、矢じりは、滑膜組織の表層（lining layer）を示す。（b、c）TNF-αのみ（TNF）またはTNF-α＋P60 PLADタンパク質（P60）またはTNF-α＋P80 PLADタンパク質（P80）で表示のとおり処置した実験群（n＝5）の滑膜炎、パンヌス、ならびに骨および軟骨のびらんの組織学的分析の定量化。（d）各実験群（n＝5）の滑膜炎、パンヌス、骨および軟骨のびらんの組織学的分析の定量化。これらの分析を少なくとも2回は繰り返した。CpG DNAのみ（CpG）、CpG DNA＋P60 PLAD（P60）。値は平均±標準偏差（s.d.）である。** 対照群に対して処置群がP＜0.01。組織病理学的検査のために関節内接種の3日後にマウスを屠殺した。これは3回の実験を代表している。
図１３は、DBA/1JマウスにおけるCIAに対するP60およびP80 PLADタンパク質の作用。盲実験（a〜f）。（a）PBSまたはP60 PLADで処置したCIAマウスの足の写真。（b）PBSまたは4週間にわたるP60 PLADタンパク質（100μgを週3回）の腹腔内注射で処置した一次免疫の75日後のCIA関節のHE染色切片。（c）PBS（n＝13匹）（四角形）、P60 PLADタンパク質（P60）（n＝12匹）（菱形）、およびP80 PLADタンパク質（P80）（n＝13匹）（楕円形）で処置したCIAマウスにおける関節炎の重症度；足厚測定；および体重。（d）PBS、P60、およびP80 PLAD処置群における関節炎の発生率。（e）表示のとおり4週間処置したCIAの関節切片における滑膜炎；パンヌス；骨および軟骨のびらんの評価。（f）血清中のIL-1およびIL-6レベル。*＝対照PBS群に対してP＜0.05。（g）PBS（n＝10匹）（四角形）、P60 PLADタンパク質（P60）（n＝10匹）（菱形）、およびエタネルセプト（n＝10匹）（楕円形）を2週間腹腔内注射したCIAマウスにおける関節炎の重症度。*＝対照PBS群に対してP＜0.05。（h）確立したCIAにおけるP60 PLADタンパク質の作用。PBS（n＝9匹）（四角形）、P60 PLADタンパク質（P60、1日おきに400μg）（n＝10匹）（菱形）を2週間腹腔内注射した、確立したCIAマウスにおける関節炎の重症度。*＝対照PBS群に対してP＜0.05。
図１４は、関節炎関節におけるTNFR発現、ならびにTNF-α結合およびNF-κB活性化のPLADタンパク質阻害を示す。（a）PBSまたはP60 PLADで処置し、75日目に屠殺した、CIAを持つDBA/1Jマウスから得た関節炎関節におけるTNFR1およびTNFR2の免疫組織化学。茶色はTNFR発現細胞を示す。（b）50ngのビオチン化ヒトTNF-α（Bt-TNF-α）およびさまざまな用量のP60 PLADタンパク質前処理で染色した後のフローサイトメトリー。曲線は、Bt-TNF-αのみ、Bt-TNF-α＋3μg P60 PLAD、Bt-TNF-α＋15μg P60 PLAD、Bt-TNF-α＋30μg P60 PLAD、ヒトTNF-α、または陰性対照を表す。（c）表示のとおりエタネルセプト（1μg）、P60（1μg）またはP80（1μg）PLADタンパク質（試験タンパク質）で免疫沈降（IP）した50ng ヒトTNF-αのゲル電気泳動。TNF-αに対する抗体（Ab）を使ったウェスタンブロット。（d）NF-κB用（左側の矢印）またはOCT1用（右側の矢印）の放射線標識オリゴヌクレオチドプローブを使って行った、P60 PLADタンパク質の存在下（+）または非存在下（-）にTNF-αで処理したA3 Jurkat細胞から調製された核抽出物の電気泳動移動度シフトアッセイ。TNFR1（e）またはTNFR2（f）ノックアウト（-/-）マウスの脾臓から単離された単核球における、これらの細胞を、mTNF-α（2ng）（P60（100μg）またはP80（100μg）PLADタンパク質の添加ありまたはなし）でインビトロ処理した後の、NF-κB p65核移行の定量。*＝対照群に対してP＜0.05；**＝対照群に対してP＜0.01。P60処置群とP80処置群の間の差は、それぞれの遺伝的背景で有意に異なる（P＜0.01）。
図１５は、P60 PLADタンパク質が破骨細胞形成ならびにRANKおよびRANKリガンド（RANKL）発現を阻害することを示す。（a）PBSまたはP60 PLADタンパク質で処置し、コラーゲンによる一次免疫の75日後に屠殺した、DBA/1Jマウスから得た関節炎関節におけるカルシトニン受容体の免疫組織化学の代表的顕微鏡写真。薄い矢印は陽性染色を示す（元のカラースライドでは褐色）。（b）インビトロでのTNF-α誘導破骨細胞形成におけるPLADタンパク質の作用。M-CSFおよびマウスTNF-α（10μg）；マウスTNF-α（10μg）＋32μg P60 PLAD；またはPBSと共に培養した骨髄マクロファージ（BMM）中のTRAP陽性破骨細胞の顕微鏡写真。薄い矢印は酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（TRAP）陽性破骨細胞を示す。表示のとおりさまざまな用量のP60 PLADタンパク質で7日間処理した後のBMM培養物の各ウェルにおけるTRAP陽性細胞を検鏡的に定量したもの。（c）コラーゲンで一次免疫した後、PBSによる処置、P60 PLADタンパク質による処置を行い、75日目に屠殺したDBA/1Jマウスから得た関節炎関節におけるRANKおよびRANKL染色の免疫組織化学の顕微鏡写真。濃い（元のカラースライドでは褐色の）染色は陽性染色細胞を示す。
図１６は、標準的一文字記号で表したヒトPLAD-GST融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。（a）太字および下線部（アミノ酸残基230〜282）はP60 PLADペプチド配列（配列番号59）である。（b）太字および下線部（アミノ酸残基230〜274）はP80 PLADペプチド配列（配列番号60）である。どちらの配列でも、GSTタンパク質配列はプレーンテキストで示されている。
図１７は、L929細胞におけるTNF-α誘導細胞死に対するP60 PLADタンパク質の作用を示す。以下の物質で19時間処理した細胞の位相差顕微鏡写真：（a）培地のみ；（b）ヒトTNF-α（2ng）；（c）P60 PLAD（3μg）＋hTNF-α（2ng）；（d）P60 PLAD（30μg）＋hTNF-α（2ng）；（e）インフリキシマブ（1μg）＋hTNF-α（2ng）；（f）エタネルセプト（1μg）＋hTNF-α（2ng）；（g）P80 PLAD（30μg）＋hTNF-α（2ng）。倍率400倍。（h）hTNF（2ng）（P60 PLAD（50μg）、エタネルセプト（1μg）およびインフリキシマブ（1μg）の添加ありまたはなし）によって誘導されるL929細胞の消失。
図１８は、炎症性関節炎に対するGSTタンパク質およびP80 PLADタンパク質の作用を示す。以下の物質で処置した実験群（n＝5）における滑膜炎、パンヌスならびに骨および軟骨のびらんの組織学的分析の定量化：（a）BALB/cマウスでTNF-α（45ng）のみ（TNF）またはTNF-α（45ng）＋GSTタンパク質（GST、100μg）；（b）C3H/HeJマウスでCpG DNA（1nmol）のみ（CpG）またはCpG DNA（1nmol）＋P80 PLADタンパク質（P80、100μg）。値は平均±s.d.。組織病理学的検査のために、関節内接種の3日後にマウスを屠殺した。これは3回の実験を代表している。（c）P80 PLADタンパク質（100μg）を4週間腹腔内注射した一次免疫75日後のCIA関節の炎症および破壊を示すHE染色切片の顕微鏡写真。倍率200倍。（d）P80 PLADタンパク質で4週間処置したDBA/1JマウスにおけるCIAでの滑膜炎、パンヌス、ならびに骨および軟骨のびらんの組織学的分析の定量化。対照群と比較してP＞0.05。
図１９は、免疫組織化学の顕微鏡写真。（a）6ヶ月で屠殺したTNF-αトランスジェニックマウスから得た関節炎関節中のTNFR1およびTNFR2。TNFR1パネル中の矢印は、受容体発現を示す濃い（元のカラースライドでは褐色の）染色を示している。TNFR2パネル中の矢印は、軟骨の深部にある軟骨細胞による高いTNFR2発現を示す。（b）6ヶ月齢で屠殺したTNF-αトランスジェニックマウスから得た関節炎関節および対照C57BL/6マウスから得た健常関節中のカルシトニン受容体。（c）6ヶ月齢で屠殺したTNF-αトランスジェニックマウスから得た関節痛関節および正常対照C57BL/6マウスから得た健常関節におけるRANKおよびRANKL染色。濃い（元のカラースライドでは褐色の）染色は、陽性組織化学反応を示す。倍率300倍。
図２０は、P60 PLADタンパク質の免疫原性および半減期を示す。（a）コラーゲンで一次免疫してから、PBS、P60またはP80 PLADタンパク質で処置し、75日後に屠殺したDBA/1マウスから得た血清中の、精製PLADタンパク質に基づく標準曲線と比較した、抗PLAD P60抗体レベル。GST+は、血清からGST抗体を除去するためにGSTを加えたことを意味する。(b）P60 PLADタンパク質の半減期。（c）P80 PLADタンパク質の半減期。
図２１は、PLADタンパク質がTNF-α誘導IkBα分解を阻害することを示す。ウェスタンブロットは、TNFR1またはTNFR2ノックアウト（-/-）マウスの脾臓から単離された単核球を、mTNF-α（2ng）により、P60（10、50、100μg）またはP80（10、50、100μg）を添加して、またはそれらを添加せずに、インビトロで5分間（b）、15分間（a）処理した後、またはGST（10、50、100μg）を添加して、またはGSTを添加せずに、インビトロで1時間（c）処理した後の、それら単核細胞におけるIkBα分解を示している。
図２２は、さまざまな量のエタネルセプトおよびP60 PLADタンパク質で免疫沈降（IP）した50ngのヒトTNF-αの電気泳動を示す。（a）表示のとおりエタネルセプト（10μg）またはP60 PLADタンパク質（100μg）（試験タンパク質）。（b）表示のとおりエタネルセプト（0.1、1、10μg）またはP60 PLADタンパク質（0.1、1、10μg）（試験タンパク質）。矢じりはゲル上のTNFタンパク質の位置を示す。ウェスタンブロッティングは、TNF-αに対する抗体（Ab）を使って行った。
図２３は、TNFR1の結晶構造（PDB ID：1NCF）の二量体化したPLAD部分を示す。濃い灰色および薄い灰色は、PLAD二量体の個々のペプチド鎖を図示している。各ペプチドからのHis-34のミラー（mirror）イミダゾール環が、円内に描かれている。これら二つのヒスチジンは鎖間ポケットに互いを閉じこめている。
図２４は、エタネルセプトと混合したP80-PLADタンパク質の免疫沈降（IP）およびウェスタンブロット（WB）を示す。
図２５は、P60-PLADタンパク質がCIAにおけるMMP発現を阻害したことを示す。左側のパネルの濃い（元のカラースライドでは褐色の）染色がMMP発現を示すことに注意されたい。
図２６は、P60-PLADタンパク質がCIAにおけるiNOS発現を阻害することを示す。左側のパネルの濃い（元のカラースライドでは褐色の）染色がiNOS発現を示すことに注意されたい。
発明の詳細な説明
本発明は、以下に述べる本発明の好ましい実施形態の詳細な説明およびそこに含まれる実施例ならびに図面および本明細書に記載するそれらの説明を参照することにより、より容易に理解されるだろう。
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、「a（ある、一つの）」は、それを使用する文脈に応じて、一つまたはそれ以上を意味することができる。したがって、例えば「a nucleic acid（ある核酸）」とは、少なくとも一つの核酸が利用されることを意味する。
ポリペプチド
本発明は、プレリガンドアセンブリドメイン（PLAD）の単離されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。本発明は、プレリガンドアセンブリドメインのアミノ酸配列からなるポリペプチドも提供する。本発明のPLADは、TNF-RのPLAD、p60のPLAD、p80のPLAD、Fas（CD95/APO-1）のPLAD、TRAILのPLAD、LTβRのPLAD、CD40のPLAD、CD30のPLAD、CD27のPLAD、HVEMのPLAD、OX40のPLAD、DR4のPLAD、またはTNFRスーパーファミリーのメンバーから得られる他の任意のPLADであることができる。PLADドメインはTNFRスーパーファミリーのメンバー間で高度に保存されているので、当業者は、PLADドメインを特徴づける保存されたモチーフについて、利用可能なデータベースを検索することにより、どのTNF受容体のPLADドメインでも同定することができるだろう。TNF受容体様受容体中のこれらの領域の同定は、本明細書に代表的なPLAD配列を記載すること、およびそれらを同ファミリーの他のメンバーの公表された配列と比較することによって、ルーチンになる（例えば図3参照）。さらにまた、当業者は、例えば実施例に記載するような機能アッセイを行うことによって、PLADを同定することもできる。ある実施形態では、機能的PLADがFas/CD59のPLADではない(83）。さらにもう一つの実施形態では、機能的PLADがFas/CD59受容体のアミノ末端の49アミノ酸ではない（83）。
ここに記載するPLADは成熟TNF受容体様受容体のN末端のわずか38アミノ酸を含むことができる。成熟TNF受容体様受容体は、シグナル配列を含まないTNF受容体様受容体である。PLADの例を配列表に開示するが、その配列表には、TNF受容体様受容体例のアミノ酸配列がそのシグナル配列を含めて記載されている。各受容体のシグナル配列の残基は、表1に列挙するこれらTNF受容体様受容体のGenBank accession番号を参照することによって見出すことができる。したがって、成熟TNF受容体様受容体の配列および対応するそれらのPLADの配列は、記載の配列中に開示されている。表3に、本明細書に開示するTNF受容体様受容体および受容体リガンドに関する追加情報を記載する。本明細書に開示する単離されたPLADおよび単離されたPLADを含有するポリペプチドの用途に関する情報も提供する。PLADは、TNFRスーパーファミリーの受容体によって媒介されるシグナル伝達系路に干渉することの意味を研究するために使用することができる。例えば、あるTNFRスーパーファミリーの受容体によるシグナリングが、ある疾患経路と関連することが知られているか、ある疾患経路と関連することが示されたとすると、本ポリペプチドによる受容体プレリガンドアセンブリの阻害を利用して、その疾患を処置または予防することができる。例えば、処置することができる疾患には、がん、心臓疾患および炎症性疾患が含まれる。PLADの修飾によって、リガンド/受容体相互作用のアフィニティを変化させることもでき、それは、リガンドおよび受容体結合、受容体シグナルの測定などといったインビトロ研究に使用することができる。蛍光タグ付きPLADタンパク質は、細胞表面における特定TNFRの相対発現量をフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡法で決定するための試薬として利用することもできる。
本発明は、単離されたPLADを含む38〜125アミノ酸のポリペプチドも提供する。例えば、ポリペプチドは、単離されたPLADを含む50〜125アミノ酸であることができる。さらにもう一つの例として、ポリペプチドは、サブ配列R1-TNF受容体様受容体PLAD-R2を含むことができる（式中、R1およびR2は随意であり、それが存在する場合には、H、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドであることができる）。R1および/またはR2は、それが存在する場合には、任意のアミノ酸であることができる。R1および/またはR2がペプチドである場合、そのペプチドはさまざまな長さを持つことができる。例えば、R1および/またはR2は、単離されたTNF様PLADを含むポリペプチド全体が125アミノ酸残基を超えず、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124または125アミノ酸長であることができる限り、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25アミノ酸以上の長さであることができる。R1およびR2は、天然TNF受容体様受容体中のTNF様PLADに通常隣接しているTNF受容体様受容体の配列であることもでき、この場合、TNF様受容体PLADを含むポリペプチドは、TNF受容体様受容体の細胞外ドメイン全体ではない。
さらに、TNF受容体様受容体のプレリガンドアセンブリドメイン（PLAD）の単離されたアミノ酸配列を含む任意のサイズを持つポリペプチドであって、そのポリペプチドがR1-TNF受容体様PLAD-R2であり、R1またはR2が、天然のTNF受容体様受容体中でTNF受容体様受容体PLADに隣接していないアミノ酸配列を含むものも、本発明によって提供される。R1またはR2（ただし両方ではない）は、天然のTNF受容体様受容体中でTNF様PLADに通常隣接しているTNF受容体様受容体の完全配列または部分配列であることができる。例えば、PLADがあるTNF受容体様受容体に由来し、かつR1またはR2は、そのポリペプチドのTNF様PLADが由来したTNF受容体様受容体中にも、他の任意のTNF受容体様受容体中にも存在しないアミノ酸配列であることができる。R1またはR2は、R1-TNF様PLAD-R2が天然の完全長TNF受容体様受容体でない限り、任意のアミノ酸配列であることができる。もう一つの例では、PLADが一つのTNF受容体様受容体に由来し、かつR1もしくはR2またはその両方が、もし存在するのであれば、もう一つのTNF受容体様受容体に由来するペプチド配列であることができる。したがって当業者は、あるTNF受容体様受容体のPLADを、別のTNF受容体様受容体に由来するR1またはR2配列と組み合わせて、このポリペプチドを得ることができる。既知のTNF受容体様受容体の配列は公開されているので、本ポリペプチドのR1およびR2の構造は非常に多いものの、それらは周知であり、本明細書に包含される。もう一つの選択肢として、R1またはR2は、どのTNF受容体様受容体配列とも無関係なペプチド配列であることもできる。ある実施形態では、単離されたPLADを含むポリペプチドが、米国特許第5,633,145号（Feldmanら）に開示された、配列番号40に示す成熟（シグナル配列を欠く）TNF1受容体の124アミノ酸配列ではない。
上記のサブ配列を含むポリペプチドの例には、以下に挙げるものが含まれる：R1-成熟p60のアミノ酸1〜38、1〜39、1〜40、1〜41、1〜42、1〜43、1〜44、1〜45、1〜46、1〜47、1〜48、1〜49、1〜50、1〜51、1〜52、1〜53、または1〜54-R2（例えば配列番号1）；R1-成熟p80のアミノ酸10〜48、10〜49、10〜50、10〜51、10〜52、10〜53、または10〜54-R2（配列番号2）；R1-成熟Fasのアミノ酸1〜38、1〜39、1〜40、1〜41、1〜42、または1〜43-R2（配列番号3）；R1-成熟Fasのアミノ酸1〜38、1〜39、1〜40、1〜41、1〜42、1〜43、1〜44、1〜45、1〜46、1〜47、1〜48、1〜49、1〜50、1〜51、1〜52、1〜53、1〜54、1〜55、1〜56、1〜57、1〜58、1〜59、1〜60、1〜61、1〜62、1〜63、1〜64、1〜65、または1〜66-R2（配列番号4）；R1-成熟LtβRのアミノ酸13〜50-R2（配列番号5）；R1-成熟CD40のアミノ酸6〜39-R2（配列番号6）；R1-成熟CD30のアミノ酸11〜49、11〜50、または11〜51-R2（配列番号7）；R1-成熟CD27のアミノ酸7〜42-R2（配列番号8）、R1-成熟HVEMのアミノ酸6〜37-R2（配列番号9）；R1-成熟OX40のアミノ酸3〜36-R2（配列番号10)、およびR1-成熟DR4のアミノ酸109〜138-R2（配列番号11）。
成熟p60（TNFR1）ポリペプチドは、配列番号12として記載する完全長p60コード配列の30番目から始まる。したがって本発明は、成熟p60タンパク質のアミノ酸1〜54（配列番号12のアミノ酸30〜83）を含むポリペプチド、成熟p60タンパク質のアミノ酸1〜53（配列番号12のアミノ酸30〜82）含むポリペプチド、成熟p60タンパク質のアミノ酸1〜52（配列番号12のアミノ酸30〜81）を含むポリペプチド、成熟p60タンパク質のアミノ酸1〜51（配列番号12のアミノ酸30〜80）を含むポリペプチド、成熟p60タンパク質のアミノ酸1〜50（配列番号12のアミノ酸30〜79）を含むポリペプチド、成熟p60タンパク質のアミノ酸1〜49（配列番号12のアミノ酸30〜78）を含むポリペプチド、成熟p60タンパク質のアミノ酸1〜48（配列番号12のアミノ酸30〜77）を含むポリペプチド、成熟p60タンパク質のアミノ酸1〜47（配列番号12のアミノ酸30〜76）を含むポリペプチド、成熟p60タンパク質のアミノ酸1〜46（配列番号12のアミノ酸30〜75）を含むポリペプチド、成熟p60タンパク質のアミノ酸1〜45（配列番号12のアミノ酸30〜74）を含むポリペプチド、成熟p60タンパク質のアミノ酸1〜44（配列番号12のアミノ酸30〜73）を含むポリペプチド、成熟p60タンパク質のアミノ酸1〜43（配列番号12のアミノ酸30〜72）を含むポリペプチド、成熟p60タンパク質のアミノ酸1〜42（配列番号12のアミノ酸30〜71）を含むポリペプチド、成熟p60タンパク質のアミノ酸1〜41（配列番号12のアミノ酸30〜70）を含むポリペプチド、成熟p60タンパク質のアミノ酸1〜40（配列番号12のアミノ酸30〜69）を含むポリペプチド、および成熟p60タンパク質のアミノ酸1〜39（配列番号12のアミノ酸30〜68）を含むポリペプチド、ならびに成熟p60タンパク質のアミノ酸1〜54の断片であってPLAD活性を保っているものを含む他のポリペプチドを提供する。
成熟p80（TNFR2）ポリペプチドは、配列番号13として記載する完全長p80コード配列の23番目から始まる。したがって本発明は、成熟p80タンパク質のアミノ酸10〜54（配列番号13のアミノ酸32〜76）を含むポリペプチド、成熟p80タンパク質のアミノ酸10〜53（配列番号13のアミノ酸32〜75）を含むポリペプチド、成熟p80タンパク質のアミノ酸10〜52（配列番号13のアミノ酸32〜74）を含むポリペプチド、成熟p80タンパク質のアミノ酸10〜51（配列番号13のアミノ酸32〜73）を含むポリペプチド、成熟p80タンパク質のアミノ酸10〜50（配列番号13のアミノ酸32〜72）を含むポリペプチド、ならびに成熟p80タンパク質のアミノ酸10〜54の断片であってPLAD活性を保っているものを含む他のポリペプチドを提供する。
成熟Fas受容体ポリペプチドは、配列番号14として記載する完全長Fasコード配列の17番目から始まる。したがって本発明は、成熟Fasタンパク質のアミノ酸1〜43（配列番号14のアミノ酸17〜59）を含むポリペプチド、成熟Fasタンパク質のアミノ酸1〜42（配列番号14のアミノ酸17〜58）を含むポリペプチド、成熟Fasタンパク質のアミノ酸1〜41（配列番号14のアミノ酸17〜57）を含むポリペプチド、成熟Fasタンパク質のアミノ酸1〜40（配列番号14のアミノ酸17〜56）を含むポリペプチド、成熟Fasタンパク質のアミノ酸1〜39（配列番号14のアミノ酸17〜55）を含むポリペプチド、ならびに成熟Fasタンパク質のアミノ酸1〜43の断片であってPLAD活性を保っているものを含む他のポリペプチドを提供する。
本発明は、成熟Fasタンパク質のアミノ酸1〜66（配列番号14のアミノ酸17〜82）を含むポリペプチド、成熟Fasタンパク質のアミノ酸1〜65（配列番号14のアミノ酸17〜81）を含むポリペプチド、成熟Fasタンパク質のアミノ酸1〜64（配列番号14のアミノ酸17〜80）を含むポリペプチド、成熟Fasタンパク質のアミノ酸1〜63（配列番号14のアミノ酸17〜79）を含むポリペプチド、成熟Fasタンパク質のアミノ酸1〜62（配列番号14のアミノ酸17〜78）を含むポリペプチド、ならびに成熟Fasタンパク質のアミノ酸1〜66の断片であってPLAD活性を保っているものを含む他のポリペプチドも提供する。
本発明は、配列番号15として記載する完全長LtβRタンパク質のアミノ酸43〜80を含むポリペプチド、ならびに配列番号15のアミノ酸43〜80の断片であってPLAD活性を保っているものを含む他のポリペプチドも提供する。
本発明は、配列番号16として記載する完全長CD40タンパク質のアミノ酸26〜59を含むポリペプチド、ならびに配列番号16のアミノ酸26〜59の断片であってPLAD活性を保っているものを含む他のポリペプチドも提供する。
成熟CD30ポリペプチドは、配列番号17として記載する完全長CD30コード配列の19番目から始まる。したがって本発明は、成熟CD30タンパク質のアミノ酸11〜51（配列番号17のアミノ酸29〜69）を含むポリペプチド、成熟CD30タンパク質のアミノ酸11〜50（配列番号17のアミノ酸29〜68）を含むポリペプチド、成熟CD30タンパク質のアミノ酸11〜49（配列番号17のアミノ酸29〜67）を含むポリペプチド、成熟CD30タンパク質のアミノ酸11〜48（配列番号17のアミノ酸29〜66）を含むポリペプチド、成熟CD30タンパク質のアミノ酸11〜47（配列番号17のアミノ酸29〜65）を含むポリペプチド、ならびに成熟CD30タンパク質のアミノ酸11〜51の断片であってPLAD活性を保っているものを含む他のポリペプチドを提供する。
本発明は、配列番号18として記載する完全長CD27タンパク質のアミノ酸27〜62を含むポリペプチド、ならびに配列番号18のアミノ酸27〜62の断片であってPLAD活性を保っているものを含む他のポリペプチドも提供する。
本発明は、配列番号19として記載する完全長HVEMタンパク質のアミノ酸42〜75を含むポリペプチド、ならびに配列番号19のアミノ酸42〜75を含むポリペプチドの断片であってPLAD活性を保っているものを含む他のポリペプチドも提供する。
成熟OX40ポリペプチドは、配列番号20として記載する完全長OX40コード配列の29番目から始まる。したがって本発明は、成熟OX40タンパク質のアミノ酸3〜36（配列番号20のアミノ酸31〜64）を含むポリペプチド、成熟OX40タンパク質のアミノ酸3〜35（配列番号20のアミノ酸31〜63）を含むポリペプチド、成熟OX40タンパク質のアミノ酸3〜34（配列番号20のアミノ酸31〜62）を含むポリペプチド、成熟OX40タンパク質のアミノ酸3〜33（配列番号20のアミノ酸31〜61）を含むポリペプチド、成熟CD30タンパク質のアミノ酸3〜32（配列番号20のアミノ酸31〜60）を含むポリペプチド、ならびに成熟OX40タンパク質のアミノ酸3〜36を含むポリペプチドの断片であってPLAD活性を保っているものを含む他のポリペプチドを提供する。
本発明は、配列番号21として記載する完全長DR4タンパク質のアミノ酸132〜170を含むポリペプチド、ならびに配列番号21のアミノ酸132〜170を含むポリペプチドの断片であってPLAD活性を保っているものを含む他のポリペプチドも提供する。
本発明のPLADを含むTNF受容体様受容体の例を、表1に記載する。これらの受容体のヌクレオチド配列およびポリペプチド配列は、表1に記載のGenBank Accession番号に見出すことができる。表1に記載のGenBank Accession番号に記載されているヌクレオチド配列、ポリペプチド配列および任意の情報（例えばシグナル配列および成熟タンパク質残基数）は、この参照をもって、そのまま本明細書に組み入れられる。例えば、p60のヌクレオチド配列、ポリペプチド配列および追加情報（例えばシグナル配列および成熟タンパク質残基数）は、GenBank Accession番号M75866に見出すことができる。GenBank Accession番号M75866に記載されているこれらのp60配列および追加情報は、この参照をもって、そのまま本明細書に組み入れられる。同様に、p80について記載されたヌクレオチド配列、ポリペプチド配列および追加情報（例えばシグナル配列および成熟タンパク質残基数）は、GenBank Accession番号M32315に見出すことができる。GenBank Accession番号M32315に記載されているこれらのp80配列および追加情報は、この参照をもって、そのまま本明細書に組み入れられる。表1に記載のGenBank Accession番号にアクセスすることにより、当業者は、そこに列挙されているさらなるGenBank Accession番号にアクセスして、シグナル配列および成熟タンパク質配列に関する追加情報を入手することができる。例えば、GenBank Accession番号M75866にアクセスすると、当業者はGenBank Accession番号AAA61201にアクセスすることができ、そこには、p60に関するシグナル配列および成熟タンパク質配列情報が記載されている。この情報は、GenBank Accession番号AAA51201（p60）、GenBank Accession番号AAA59929（p80）、GenBank Accession番号AAA63174（Fas）、GenBank Accession番号AAA36757（LTBR）、GenBank Accession番号CAA43045（CD40）、GenBank Accession番号AAA51947（CD30）、GenBank Accession番号AAA58411（CD27）、GenBank Accession番号AAB58354、GenBank Accession番号CAA53576（OX40）、GenBank Accession番号AAC51226（DR4）に直接アクセスすることによって見出すこともでき、この参照をもって本明細書に組み入れられる。
表1には、TNF様受容体に関するLocus Link Accession番号も記載する。Locus Link Accession番号は、現在では、Entrez Gene Identification Number（Gene ID番号）に等しく、これには米国国立医学図書館の国立バイオテクノロジー情報センターでアクセスすることができる。例えば当業者は、Entrez GeneデータベースでLocus Link番号7132（現在はEntrez GeneのGene ID 7132）にアクセスすることにより、p60に関する追加情報（ヌクレオチド配列およびタンパク質配列を含む）を入手することができる。同様に当業者は、Entrez GeneデータベースでLocus Link番号7133（現在はEntrez GeneのGene ID 7133）にアクセスすることにより、p80に関する追加情報（ヌクレオチド配列およびタンパク質配列を含む）を入手することができる。このように当業者は、表1に記載されている任意のTNF様受容体に関する情報を、Entrez Geneで各々のLocus Link（Gene ID）番号にアクセスすることにより、容易に入手することができる。表1に記載のLocus Link（Gene ID）番号で提供される情報は全て、参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。
vTNFRタンパク質のPLADドメインの単離されたアミノ酸配列（配列番号28〜39）を含むポリペプチドが提供される。他のvTNFR PLADは、TNFR1およびTNFR2 PLAD配列についてホモログのタンパク質-タンパク質BLASTデータベース検索を行うことにより、同定することができる。各vTNFRおよびその修飾タンパク質の完全長アミノ酸配列も包含される（配列番号44〜55）。当業者がさらなるvTNFR PLADポリペプチドを同定し、製造し、機能試験するための方法論も提供する。
vTNFR PLADドメインは、宿主TNFRの自己会合および/または後続のリガンド結合を妨害することにより、抗ウイルス免疫を鈍らせ、かつ/または感染細胞をTNFによる細胞死から保護することができる。粘液腫ウイルスがコードするTNF受容体様タンパク質M-T2タンパク質は、その細胞外TNF結合能力とは無関係に、粘液腫感染T細胞をTNF誘導細胞死から保護することができる（82）。vTNFR PLAD配列は、宿主TNFR PLADドメインへの高いアフィニティ結合が進化論的に選択された結果として、P60またはP80 PLADそのものよりも強力なTNF誘導作用の阻害剤として機能することができる。この点で、単離されたウイルスPLADタンパク質は、慢性関節リウマチおよび他の自己免疫疾患に関連するTNF関連病理発生過程の遮断に臨床使用するための改善された薬剤になる。
本明細書に記載するような技法を使って、本明細書に記載する他のTNF受容体様受容体（例えばFas）に見出されるPLADドメインにホモロジーを持つ、さらなる微生物タンパク質を同定できることは言うまでもない。例えば、Fas PLADドメインに相同な配列を含有する微生物ポリペプチドの例を三つ開示する（配列番号41〜43、56〜58）。
本明細書にいう「PLADの単離されたアミノ酸配列」とは、自然界において通常そのアミノ酸配列に付随している天然物質を実質的に含まない配列を意味する。本発明のポリペプチドは、PLADドメインの全アミノ酸配列またはPLAD活性を持つその断片を含むことができる。本発明のポリペプチドまたはその断片は、そのポリペプチドを天然に産生する細胞からそれらを単離し精製することによって取得するか、PLADをコードする外来核酸を発現させることによって取得することができる。PLADの断片は、ペプチドの化学合成、PLADまたはPLADを含むポリペプチドのタンパク質分解切断、および関心部分をコードする核酸からの合成によって取得することができる。PLADは、天然のアミノ酸が類似する性質を持つもので置き換えられる保存的置換を含むことができる。そのような保存的置換はポリペプチドの機能を変化させない。さまざまなアミノ酸置換を作り出し、それらを、本明細書に記述する結合アッセイで、当業者が利用することのできる技法を使って試験することにより、結合および有効性を強化する突然変異を見つけることができる。
したがって、所望であれば、本発明のポリペプチドをコードする核酸および/または本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に修飾および改変を加えることができ、それでもなお、類似する特徴、あるいは望ましい特徴を持つポリペプチドが得られることは言うまでもない。そのような改変は、天然の単離物に見出される場合もあるし、部位特異的突然変異誘発法を使って合成的に導入することもでき、その手法（例えばミスマッチポリメラーゼ連鎖反応（PCR））は当技術分野では周知である。
例えば、一定のアミノ酸は、機能的活性をほとんど失うことなく、ポリペプチド中の他のアミノ酸の代りに使用することができる。したがって、PLADのアミノ酸配列（またはその基礎をなす核酸配列）には、生物学的有用性または活性をほとんど失うことなく、場合によってはそのような有用性または活性の増加を伴って、さまざまな改変を加えることができると考えられる。例えば、p60 TNFRの天然配列におけるQ24A突然変異、D49R突然変異およびK19E突然変異は、PLAD自己会合を損なわない。
これらのポリペプチドは、当技術分野で周知のいくつかの手法のいずれによっても、取得することができる。ポリペプチドを製造する方法の一つは、二つのペプチドまたはポリペプチドを、タンパク質化学技法によって一つに連結することである。例えばペプチドまたはポリペプチドは、現在利用することができる実験設備を使用し、Fmoc（9-フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはBoc（tert-ブチルオキシカルボニル）ケミストリーのどちらかを使って、化学的に合成することができる（Applied Biosystems, Inc.、カリフォルニア州フォスターシティ）。特定のタンパク質に対応するペプチドまたはポリペプチドを標準的な化学反応によって合成できることは、当業者には容易に理解できるだろう。例えば、ペプチドまたはポリペプチドを合成し、その合成用レジンから切り離さずにおき、その一方で、ハイブリッドペプチドの他方のフラグメントを合成した後、それをレジンから切り離すことにより、他方のフラグメント上で機能的にブロックされている末端基を露出させることができる。ペプチド縮合反応により、これら二つの断片を、それらのそれぞれカルボキシ末端およびアミノ末端で、ペプチド結合を介して共有結合させることによって、より大きなポリペプチドを形成させることができる（Grant「Synthetic Peptides: A User Guide」W.H.Freeman and Co.、ニューヨーク（1992）ならびにBodanskyおよびTrost編「Principles of Peptide Synthesis」Springer-Verlag Inc.、ニューヨーク (1993)）。もう一つの選択肢として、ペプチドまたはポリペプチドを、上述のようにインビボで別々に合成させることもできる。単離し終えたら、同様のペプチド縮合反応で、それら別々のペプチドまたはポリペプチドを連結して、より大きなタンパク質を形成させることができる。
例えば、クローニングしたペプチドセグメントまたは合成ペプチドセグメントの酵素的ライゲーションにより、比較的短いペプチド断片を接合して、より大きなペプチド断片、ポリペプチドまたはタンパク質ドメイン全体を作製することができる（Abrahmsenら, Biochemistry, 30:4151 (1991)）。もう一つの選択肢として、合成ペプチドのネイティブケミカルライゲーションを利用して、短いペプチド断片から大きなペプチドまたはポリペプチドを合成的に構築することもできる。この方法は二段階の化学反応からなる（Dawsonら, "A Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation", Science, 266:776-779 (1994)）。第1段階では、無保護合成ペプチド-％-チオエステルと、アミノ末端Cys残基を含有するもう一つの無保護ペプチドセグメントとの官能基選択的反応により、チオエステル連結中間体が初期共有結合生成物として得られる。反応条件を変えなくても、この中間体は自発的に迅速な分子内反応を起こして、ライゲーション部位にネイティブペプチド結合を形成する。タンパク質分子の全合成にこのネイティブケミカルライゲーション法を応用した例が、ヒトインターロイキン8（IL-8）の製造である（Clark-Lewisら, FEBS Lett., 307:97 (1987)、Clark-Lewisら., J.Biol.Chem., 269:16075 (1994)、Clark-Lewisら, Biochemistry, 30:3128 (1991)、およびRajarathnamら, Biochemistry, 29:1689 (1994)）。
あるいは、化学的ライゲーションの結果としてペプチドセグメント間に形成される結合が非天然（非ペプチド）結合になるように、無保護ペプチドセグメントを化学的に連結することもできる（Schnolzerら, Science, 256:221 (1992)）。この技法を使って、タンパク質ドメインのアナログならびに完全な生物学的活性を持つ大量の比較的純粋なタンパク質が合成されている（deLisle Miltonら「Techniques in Protein Chemistry IV」Academic Press、ニューヨーク、pp.257-267 (1992)）。
本発明はここに開示するポリペプチドのペプチドミメティックも提供する。「ペプチドミメティック」の定義には、タンパク質の結合領域に基づく構造またはタンパク質の結合領域に由来する構造を持つ、化学化合物または有機分子または他の任意のペプチドミメティックが包含される。例えば、PLADなどの結合領域の構造を模倣するように予想化学構造をモデリングすることができる。そのようなモデリングは標準的な方法を使って行うことができる。もう一つの選択肢として、コンビナトリアル化合物ライブラリーから、ペプチドとほとんど同じ方法で、ペプチドミメティックを選択することもできる（Ostresh, J.Mら., Proc Natl Acad Sci USA 1994 Nov 8;91(23):11138-42；Dorner, B.ら, Bioorg Med Chem 1996 May;4(5):709-15；Eichler, J.ら, Med Res Rev 1995 Nov;15(6):481-96；Blondelle, S.E.ら, Biochem J 1996 Jan 1;313(Pt 1):141-7；Perez-Paya, E.ら, J Biol Chem 1996 Feb 23;271(8):4120-6）。ペプチドミメティックの選択には機能アッセイを利用することもできる。
本発明のポリペプチドは、核酸、タンパク質、ペプチド、リガンド、糖質部分、ウイルスタンパク質、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはリポソームなどといったもう一つの部分に連結することができる。さらにまた、二つ以上のPLAD含有ポリペプチドを互いに連結することもできる。例えば、二つ以上のTNF受容体様受容体の活性を調整する能力を持つポリペプチドが得られるように、二つ以上の異なるPLADを含有する二官能性または多官能性ポリペプチドを作製することができる。特定のTNF受容体様受容体に対するそのポリペプチドのアビディティを増加させるために、ポリペプチドが、同じTNF受容体様受容体に由来するPLADを二つ以上含有することもできる。
PLAD含有融合コンストラクト
本明細書には、PLADを含有する融合タンパク質およびそれらをコードする核酸を開示する。融合タンパク質は、融合タグに連結された、本明細書に開示するTNF受容体様受容体のPLADを含むことができる。機能分子は、抗体またはそのターゲティング部分または他の融合タグであることができる。PLADは細胞表面上にあるので、PLAD含有融合タンパク質は、PLAD発現細胞の細胞表面にPLADをターゲティングする成分を含むことができる。例えば、意図する標的細胞の表面にある非TNF受容体様マーカーに対するリガンドのマーカー結合部分タグを、PLADに融合することができる。PLADは、さまざまな担体タンパク質、例えば免疫グロブリン、あるいは他の血清、可溶性、かつ/または安定タンパク質などに融合することができる。融合タグは、GST、または融合タンパク質の精製を容易にする他の分子であることができる。PLAD含有融合タンパク質は、組換え発現されたPLADの分泌を容易にするために、シグナル配列を含むことができる。
PLADを含むまたはPLADからなるポリペプチドをコードする核酸を、イムノアドヘシンをコードする他の核酸に機能的に連結することもできる。本発明において「イムノアドヘシン」という用語は、非免疫グロブリン分子（例えばPLAD）をコードする核酸の少なくとも一部が免疫グロブリン重鎖ポリペプチド（例えばIgG）をコードする核酸の少なくとも一部にカップリングされている核酸によってコードされる、任意のポリペプチドを包含すると定義される。IgG2、IgG3、IgM、IgA、IgEのFc領域を利用してイムノアドヘシンを構築することもできる。ある具体例では、融合タンパク質が（特にIgガンマ4の）Ig Fc部分に融合されたPLADを含む。カップリングは、その核酸セグメントとそこから生じるメッセージとがそれぞれ機能的に転写および翻訳されうるような方法で達成することができる。
PLADポリペプチド融合タンパク質は、さまざまな哺乳類宿主細胞の一過性または安定トランスフェクションによって発現させることができ、バキュロウイルス感染細胞で発現させることもできる。発現された融合タンパク質は、標準的な方法に従って精製することができる。抗体と同様に、IgGイムノアドヘシンは、それらが分泌された培養培地から、一段階プロテインAまたはプロテインGアフィニティクロマトグラフィーによって精製することができる。
導入遺伝子
PLADをコードする導入遺伝子が提供される。「導入遺伝子」とは、細胞内に人工的に挿入されて、その細胞およびその子孫のゲノムの一部になる核酸配列を意味する。そのような導入遺伝子は、その細胞にとって、部分的にまたは完全に異種である（例えば異なる種に由来する）ことができる（ただし必ずしもそうであるとは限らない）。「導入遺伝子」という用語は、動物のゲノムに導入される任意の核酸を広く指し、そのゲノム中にはおそらく通常は存在しないであろう配列を持つ遺伝子もしくはDNA、与えられたゲノム中に存在するが、通常は転写および翻訳（「発現」）されない遺伝子、またはそのゲノム中に導入することが望まれる他の任意の遺伝子もしくはDNAを包含する。これは、非トランスジェニックゲノム中に通常に存在しうるが、その発現を変化させたいと望む遺伝子、または改変型または変異型として導入したいと望む遺伝子を包含することができる。導入遺伝子は、一つ以上の転写調節配列、および選択した核酸の最適な発現に必要とされうる他の任意の核酸、例えばイントロンを含むことができる。導入遺伝子は、わずか数ヌクレオチド長であってもよいが、好ましくは少なくとも約50、100、150、200、250、300、350、400、もしくは500ヌクレオチド長またはそれ以上の長さである。導入遺伝子は、コード配列もしくは非コード配列、またはそれらの組み合わせであることができる。導入遺伝子は通常、適当な条件下で一つ以上の導入遺伝子の発現を駆動する能力を持つ調節要素を含む。
抗体
TNF受容体様受容体のPLADに特異的に結合する抗体も、本発明によって提供される。例えば本発明の抗体は、TNF受容体のPLADに特異的に結合する抗体、FASのPLADに特異的に結合する抗体、DR4のPLADに特異的に結合する抗体などであることができる。本明細書に記載するポリペプチドおよび本明細書で考慮されるポリペプチド（天然ポリペプチド、組換えポリペプチドとも）ならびにその免疫原性断片のいずれに対してでも、抗体（ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）を生じさせることができる。抗体は、診断薬、処置、またはワクチン接種などの技法または手法に使用することができる。抗イディオタイプ抗体およびアフィニティマチュアード（affinity matured）抗体も考慮される。
抗体は数ある周知の方法によって作製することができる（例えばHarlowおよびLane「Antibodies; A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Laboratory、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク (1988)を参照されたい）。簡単に述べると、免疫応答を誘発するのに十分な量および間隔で、精製抗原を動物に注射することができる。抗体を直接精製することもできるし、その動物から脾細胞を得ることもできる。その場合は細胞を不死化細胞株と融合し、抗体分泌についてスクリーニングすることができる。抗体は、抗原を分泌する細胞を求めて核酸クローンライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。次に、陽性クローンを配列決定することができる（例えばKellyら, Bio/Technology, 10:163-167 (1992)；Bebbingtonら, Bio/Technology, 10:169-175 (1992)を参照されたい）。本発明ではヒト化抗体およびキメラ抗体も考えられる。異種抗体は周知の方法によって作製することができる（例えば米国特許第5545806号、同第5569825号、同第5625126号、同第5633425号、同第5661016号、同第5770429号、同第5789650号、および同第5814318号を参照されたい）。
ポリペプチドと「特異的に結合」という表現は、タンパク質および他の生物学的物質の雑多な集団において、そのタンパク質の存在を決定づける結合反応を指す。したがって、指定したイムノアッセイ条件下で、ある特定タンパク質に結合する指定の抗体は、その試料中に存在する他のタンパク質に、有意な量では結合しない。そのような条件下で抗体への選択的結合を起こすには、特定タンパク質に対するその特異性ゆえに選択される抗体が必要になりうる。特定タンパク質と選択的に結合する抗体を選択するには、さまざまなイムノアッセイフォーマットを使用することができる。例えば、あるタンパク質と選択的に免疫反応する抗体を選択するために、固相ELISAイムノアッセイは日常的に使用されている。選択的結合を決定するために使用することができるイムノアッセイフォーマットおよび条件の説明については、HarlowおよびLane「Antibodies, A Laboratory Manual」（Cold Spring Harbor Publications、ニューヨーク (1988)）を参照されたい。
核酸
本発明は、TNF受容体様受容体のPLADを含む125アミノ酸までのポリペプチドをコードする核酸、ならびにTNF受容体様受容体PLADからなるポリペプチドをコードする核酸も提供する。
本発明は、単離されたPLADを含む125アミノ酸までのポリペプチドをコードする核酸であって、そのポリペプチドがサブ配列R1-PLAD-R2（式中、R1およびR2は随意であり、それが存在する場合には、H、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドであることができる）を含むものも提供する。
さらに本発明は、TNF受容体様受容体のプレリガンドアセンブリドメイン（PLAD）の単離されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸であって、そのポリペプチドがR1-TNF受容体様受容体PLAD-R2（式中、R1またはR2は、天然のTNF受容体様受容体においてTNF受容体様受容体PLADに隣接していないアミノ酸配列を含む）であるものを提供する。
本明細書で使用する用語「核酸」は、DNAもしくはRNAまたはその任意の組み合わせであることができる一本鎖分子または多本鎖分子を指し、それらの核酸に対する修飾も包含する。核酸は、コード鎖もしくはその相補鎖またはそれらの任意の組み合わせを表しうる。核酸は、本明細書で議論する任意の新規遺伝子について天然に存在する配列と配列が同じであってもよいし、天然の配列中に見出されるアミノ酸と同じアミノ酸をコードする代替コドンを含むこともできる。これらの核酸はその典型的構造から修飾することもできる。そのような修飾には、例えばメチル化核酸、リン酸エステル残基上の非架橋酸素の硫黄（ホスホロチオエートデオキシヌクレオチドが得られる）、セレン（ホスホロセレノエートデオキシヌクレオチドが得られる）、またはメチル基（メチルホスホネートデオキシヌクレオチドが得られる）による置換などがあるが、これらに限るわけではない。
PLADをコードする核酸分子は、それが通常に見出される生物から単離することができる。例えば、ゲノムDNAライブラリーまたはcDNAライブラリーを構築し、関心対象の核酸の存在についてスクリーニングすることができる。そのようなライブラリーを構築しスクリーニングする方法は当技術分野では周知であり、構築ステップおよびスクリーニングステップを実行するためのキットは市販されている（例えばStratagene Cloning Systems、カリフォルニア州ラホーヤ）。核酸が単離されたら、それを適当なベクターにそのままクローニングするか、必要であれば、以降のクローニングステップが容易になるように修飾することができる。そのような修飾ステップは日常的作業であり、その一例として、制限部位を含有するオリゴヌクレオチドリンカーを核酸の末端に付加することが挙げられる。一般的方法は、Sambrookら「Molecular Cloning, a Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されている。本発明では、リガンド結合部位を含有しないPLADをコードする核酸も考えられる。
所望するPLADの核酸配列が得られたら、当技術分野で周知の技法により、任意の特定アミノ酸位置で、その特定アミノ酸をコードする配列を修飾または改変することができる。例えば、その一つまたは複数のアミノ酸位置をまたぎ、任意のアミノ酸で別のアミノ酸を置き換えることができるPCRプライマーを、設計することができる。次に、PLADの任意の位置にあるアミノ酸の考えうるいくつかの組合わせのいずれかを入手するために、核酸を増幅し、野生型PLADコード配列に挿入することができる。もう一つの選択肢として、当業者は、点突然変異誘発の技法を使って、特定核酸配列中の任意の位置に特異的突然変異を導入することもできる。一般的方法は、Smith, M., "In vitro mutagenesis" Ann. Rev. Gen., 19:423-462 (1985)およびZoller, M.J. "New molecular biology methods for protein engineering" Curr. Opin. Struct. Biol., 1:605-610 (1991)に記述されている。このような技法を使って、コードされるアミノ酸配列を変化させずにコード配列を変化させることができる。
PLADをコードするDNA分子を取得する方法のもう一つの例は、PLADをコードする組換えDNA分子を合成することである。例えば、オリゴヌクレオチド合成手法は当技術分野では日常的作業であり、特定のタンパク質領域をコードするオリゴヌクレオチドは、自動DNA合成によって容易に取得することができる。二本鎖分子の一方の鎖の核酸を合成し、その相補鎖とハイブリダイズさせることができる。これらのオリゴヌクレオチドは、結果として生じる二本鎖分子が、適当なベクターへのクローニングに備えて、内部制限部位を持つか、末端に適当な5'もしくは3'オーバーハングを持つように設計することができる。比較的大きなタンパク質をコードする二本鎖分子は、まず、そのタンパク質の特定領域をコードする数個の異なる二本鎖分子を構築し、次にそれらのDNA分子を一つに連結することによって、容易に合成することができる。例えば、Cunninghamら, "Receptor and Antibody Epitopes in Human Growth Hormone Identified by Homolog-Scanning Mutagenesis" Science, 243:1330-1336 (1989)は、まず、オーバーラップする相補的な合成オリゴヌクレオチドを構築し、それらの断片を一つに連結することによって、ヒト成長ホルモン遺伝子をコードする合成遺伝子を構築した。合成オリゴヌクレオチドからの1057塩基対合成牛ロドプシン遺伝子の合成が開示されているFerrettiら., Proc. Nat. Acad. Sci. 82:599-603 (1986)も参照されたい。この方法でPLADを構築することにより、当業者は、PLAD内の任意の特定位置（一つまたは複数）に所望のアミノ酸を持つ任意の特定PLADを、容易に取得することができる。合成遺伝子を製造する酵素テンプレート反応法が記述されている米国特許第5,503,995号も参照されたい。このような技法は当技術分野では日常的作業であり、文献に十分な裏付けがある。次に、PLADをコードするこれらの核酸または核酸の断片を、以下に論じるように、インビボまたはインビトロで発現させることができる。
本発明は、核酸を発現させるのに適したベクター中のPLADをコードする単離された核酸も提供する。関心対象の特定PLADをコードする核酸またはその核酸の一領域を構築し、修飾し、または単離したら、次に、その野生型および/または修飾PLADのインビボまたはインビトロ合成を指示することができる適当なベクターに、その核酸をクローニングすることができる。ベクターは、挿入された遺伝子または核酸の転写を指示し調節する、必要な機能要素を持つと考えられる。これらの機能要素には、プロモーター、プロモーターの上流または下流にある領域、例えばプロモーターの転写活性を調節しうるエンハンサー、複製起点、インサートをプロモータの隣に容易にクローニングできるようにするための適当な制限部位、そのベクターを含有する細胞またはインサートを含有するベクターを選択するのに役立ちうる抗生物質耐性遺伝子または他のマーカー、RNAスプライス接合部、転写終結領域、または挿入した遺伝子もしくはハイブリッド遺伝子の発現を容易にするのに役立ちうる他の任意の領域などがあるが、これらに限るわけではない（概要についてはSambrookらを参照されたい）。
核酸インサートの発現に有用な大腸菌（Escherichia coli）発現ベクターは、当業者に数多く知られている。使用に適した他の微生物宿主には、枯草菌（Bacillus subtilis）などのバチルス、および他の腸内細菌、例えばサルモネラ（Salmonella）、セラチア（Serratia）、およびさまざまなシュードモナス（Pseudomonas）属の種などがある。これらの原核宿主では、発現ベクターを作製することもでき、それらの発現ベクターは、通例、その宿主細胞に適合する発現制御配列（例えば複製起点）を含有するだろう。さらにまた、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（Trp）プロモーター系、β-ラクタマーゼプロモーター系、またはファージλ由来のプロモーター系など、数多くのさまざまな周知のプロモーターも存在するだろう。プロモーターは、通例、場合によってはオペレーター配列と共に、発現を制御し、例えば転写および翻訳を開始し完了させるために、リボソーム結合部位配列を持つだろう。必要であれば、下流の核酸インサートの5'にMetコドンをインフレームに挿入することにより、アミノ末端メチオニンを用意することができる。また、核酸インサートのカルボキシ末端伸長部分を、標準的なオリゴヌクレオチド突然変異誘発手法を使って除去することもできる。
さらにまた、酵母発現も使用することができる。酵母発現系には利点がいくつかある。第一に、酵母分泌系で産生されたタンパク質は、正しいジスルフィドペアリングを示す。第二、翻訳後糖鎖付加が酵母分泌系では効率よく行われる。サッカロミセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）プレプロアルファ因子リーダー領域（MF"-1遺伝子によってコードされているもの）は、酵母からのタンパク質分泌を指示するために、日常的に使用されている（Brakeら, "Alpha-Factor-Directed Synthesis and Secretion of Mature Foreign Proteins in Saccharomyces cerevisiae" Proc. Nat. Acad. Sci., 81:4642-4646 (1984)）。プレプロアルファ因子のリーダー領域は、シグナルペプチドと、KEX2遺伝子によってコードされる酵母プロテアーゼ（この酵素は前駆体タンパク質をLys-Argジペプチド切断シグナル配列のカルボキシル側で切断する）の認識部位を含むプロセグメントとを含有する。核酸コード配列を、プレプロアルファ因子リーダー領域に、インフレームに融合することができる。次に、このコンストラクトを、強力な転写プロモーター、例えばアルコールデヒドロゲナーゼIプロモーターまたは解糖系プロモーターの制御下に置く。核酸コード配列の後ろに翻訳停止コドンを置き、その後ろに転写終結シグナルを置く。もう一つの選択肢として、核酸コード配列を、アフィニティクロマトグラフィーによる融合タンパク質の精製を容易にするために用いられる第2のタンパク質コード配列、例えばSj26またはβ-ガラクトシダーゼなどに融合することもできる。融合タンパク質の構成要素を分離するためのプロテアーゼ切断部位の挿入を、酵母における発現に用いるコンストラクトに応用することができる。組換えタンパク質の効率の良い翻訳後糖鎖付加および発現は、バキュロウイルス系でも達成することができる。
哺乳動物細胞では、例えばフォールディングおよびシステインペアリング、複雑な糖質構造の付加、および活性タンパク質の分泌などといった重要な翻訳後修飾に有利な環境で、タンパク質を発現させることができる。哺乳動物細胞における活性タンパク質の発現に有用なベクターは、強力なウイルスプロモーターとポリアデニル化シグナルとの間にタンパク質コード配列が挿入されることを特徴とする。ベクターは、ハイグロマイシン耐性、ジェネティシンもしくはG418耐性、または選択可能マーカーとして使用するのに適した他の遺伝子もしくは表現型を付与する遺伝子、または遺伝子増幅用のメトトレキサート耐性を付与する遺伝子を含有することができる。キメラタンパク質コード配列は、メトトレキサート耐性コードベクターを使って、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株に導入するか、適当な選択マーカーを使って他の細胞株に導入することができる。形質転換細胞中のベクターDNAの存在は、サザンブロット分析によって確認することができる。インサートコード配列に対応するRNAの産生は、ノーザンブロット分析によって確認することができる。完全なヒトタンパク質を分泌させる能力を持つ適切な宿主細胞株は、当技術分野では、他にもいくつか開発されており、例えばCHO細胞株、HeLa細胞、メラノーマ細胞株、Juarkat細胞などがある。これらの細胞用の発現ベクターは、発現制御配列、例えば複製起点、プロモーター、エンハンサー、および必要な情報プロセシング部位、例えばリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列などを含むことができる。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターである。関心対象の核酸セグメントを含有するベクターは、周知の方法によって宿主細胞中に導入することができ、その方法は細胞宿主のタイプに応じて変る。例えば塩化カルシウム形質転換が原核細胞によく利用されるのに対して、他の真核細胞宿主には、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン、もしくはリポフェクチンによるトランスフェクション、またはエレクトロポレーションを使用することができる。
哺乳動物細胞中で遺伝子または核酸を発現させるための代替ベクター、ヒトγ-インターフェロン、組織プラスミノゲン活性化因子、第VIII凝固因子、B型肝炎ウイルス表面抗原、プロテアーゼネキシン1、および好酸球主要塩基性タンパク質を発現させるために開発されたものと同様のベクターを使用することができる。さらにベクターは、哺乳動物細胞（例えばCOS-7）における挿入核酸の発現に利用することができるCMVプロモーター配列およびポリアデニル化シグナルを含むことができる。
昆虫細胞でも哺乳類タンパク質を発現させることができる。バキュロウイルスベクターを使って昆虫細胞中で産生させた組換えタンパク質は、野生型タンパク質と同様の翻訳後修飾を受ける。簡単に述べると、昆虫細胞のおける活性タンパク質の発現に役立つバキュロウイルスベクターは、主要封入タンパク質であるポリヘドリンをコードする遺伝子のオートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多核体病ウイルス（AcNPV）プロモーターの下流に、タンパク質コード配列が挿入されることを特徴とする。ツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）細胞株などの培養昆虫細胞に、ウイルスDNAとプラスミドDNAの混合物をトランスフェクトし、ウイルス子孫を播種する。ポリヘドリン遺伝子の欠失または挿入非働化が、野生型封入陽性ウイルスとは明確に異なるプラークを形成する封入陰性ウイルスの産生をもたらす。これらの示差的なプラークの形態は、AcNPV遺伝子が選択したハイブリッド遺伝子で置き換えられている組換えウイルスの視覚的スクリーニングを可能にする。
本発明は、核酸を発現させるのに適した宿主に入っている、本願の核酸を含有するベクターも提供する。関心対象の核酸セグメントを含有するベクターは、周知の方法によって宿主細胞中に導入することができ、その方法は細胞宿主のタイプに応じて変る。例えば原核細胞には、塩化カリウム形質転換、形質導入、およびエレクトロポレーションがよく利用されるが、他の細胞宿主には、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン、もしくはリポフェクチンによるトランスフェクション、またはエレクトロポレーションを使用することができる。
もう一つの選択肢として、本発明の核酸を、挿入された核酸の転写を指示し調節する機能要素の一つ以上に作動可能に連結し、その核酸を発現させることもできる。例えば、核酸を細菌またはファージプロモーターに作動可能に連結し、その核酸のインビトロでの転写を指示するために使用することができる。さらにもう一つの例には、本明細書に記載する核酸を、共役転写翻訳系で使用することが含まれる。この共役転写翻訳系では、核酸が転写を指示し、その結果生成したRNAを翻訳のテンプレートとして使用することにより、ポリペプチドが産生される。これらの反応の産物を、例えば標識RNAをプローブとして使用することや、ポリペプチドを使って抗体を産生させること、または細胞もしくは対象にポリペプチドを投与することが含まれる手法にポリペプチドを使用することなど、数多くの用途に使用できることは、当業者には理解されるだろう。
ベクターと組み合わされた核酸の発現は、インビボでもインビトロでも行うことができる。インビボ合成には、そのベクターの宿主として機能することができる原核細胞または真核細胞を形質転換することが含まれる。もう一つの選択として、核酸の発現をインビトロ発現系で行うこともできる。例えばインビトロ転写系は市販されており、それらは、比較的大量のmRNAを合成するために、日常的に使用されている。そのようなインビトロ転写系では、PLADをコードする核酸が、転写プロモーターに隣接して、発現ベクターにクローニングされるだろう。例えば、Bluescript IIクローニングおよび発現ベクターは、マルチクローニングサイトを含有し、それが強力な原核転写プロモーターに隣接している（Stratagene Cloning Systems、カリフォルニア州ラホーヤ）。DNAテンプレートからRNAをインビトロ合成するために必要なBluescriptベクターなどの試薬類が全て含まれているキットを入手することができる（Stratagene Cloning Systems、カリフォルニア州ラホーヤ）。そのような系を使ってインビトロで産生されたRNAを、次にインビトロで翻訳することにより、所望のPLADポリペプチドを産生させることができる（Stratagene Cloning Systems、カリフォルニア州ラホーヤ）。
遺伝子治療法
遺伝子治療法を使って、PLADを含むポリペプチドまたはPLADからなるポリペプチドをコードする核酸を投与することができる。本発明のポリペプチドをコードする核酸をベクターに入れて、標準的な方法により、インビボまたはエクスビボで、対象の細胞に送達することができる。
本発明のポリペプチドをコードする核酸は、そのポリペプチドの分泌を指定することができる特定のリーダー配列に、機能的に結合させることができる。例えば、ポリペプチドはシグナル配列、例えばマウスIg-κシグナル配列（Blezingerら, Nat. Biotechnol. 17: 343-8, 1999）、ラットインスリンリーダー配列（Fakhralら, J. Immunother. 20: 437-8, 1997）、FGF-4シグナル配列（Uenoら, Aterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 17: 2453-2460, 1997）、ヒト成長ホルモンシグナルペプチド（Radeら, Gene Ther. 6: 385-92, 1999）、βラクタマーゼシグナル配列（Hughesら, Hum. Gene Ther. 5: 1445-55, 1994）、ウシプロラクチンシグナル配列（Gormanら, Bran Res. Mol. Brain Res. 44:143-146, 1997）、その他類似のシグナル配列などを持つことができる。
インビボ投与の場合、細胞は対象内にあることができ、核酸は薬学的に許容できる担体に入れて投与することができる。対象は、ある細胞中である核酸を選択的に発現させることが望まれる任意の動物であることができる。好ましい実施形態において本発明の動物はヒトである。また、本発明の方法によって処置することができるヒト以外の動物には、例えばネコ、イヌ、トリ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ハムスター、アレチネズミおよびウサギ（ただしこれらに限るわけではない）、ならびに本明細書に記載する方法に従ってある細胞内である核酸を選択的に発現させることができる他の任意の動物が含まれる。
対象の細胞への外来DNAの導入（すなわち遺伝子導入またはトランスフェクション）を含む上述の方法において、本発明の核酸は裸のDNAの形をとるか、核酸を細胞に送達してその細胞内で核酸を発現させるためのベクターに組み込まれた形をとることができる。ベクターは、アデノウイルスベクター（Quantum Biotechnologies, Inc.、カナダ・ケベック州ラバル）などの市販の製剤であることができる。細胞への核酸またはベクターの送達はさまざまな機序で行うことができる。一例として、送達はリポソームにより、例えばLipofectin（登録商標）、Lipofectamine（登録商標）（GIBCO-BRL, Inc.、メリーランド州ゲイサーズバーグ）、Superfect（登録商標）(Qiagen, Inc.、ドイツ・ヒルデン）およびTransfectam（登録商標）（Promega Biotec, Inc.、ウィスコンシン州マディソン）などの市販リポソーム製剤、ならびに当技術分野で広く用いられている手法に従って開発された他のリポソームを使って行うことができる。さらにまた、エレクトロポレーション（そのための技術はGenetronics, Inc.（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手することができる）によって、ならびにソノポレーション装置（ImaRx Pharmaceutical Corp.、アリゾナ州トゥーソン）を利用して、本発明の核酸またはベクターをインビボ送達することもできる。
一例として、ベクター送達は、例えば組換えレトロウイルスゲノムをパッケージングすることができるレトロウイルスベクター系などのウイルス系を使って行うことができる。次に、その組換えレトロウイルスを使って感染させることにより、核酸を感染細胞に送達することができる。哺乳動物細胞中に核酸を導入するための具体的な方法は、もちろん、レトロウイルスベクターの使用に限定されるわけではない。この手法には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レンチウイルスベクター、偽型レトロウイルスベクター、およびポックスウイルスベクター、例えばワクシニアウイルスベクターの使用など、他の技法も広く利用することができる。リポソーム送達ならびに受容体仲介エンドサイトーシス機序および他のエンドサイトーシス機序などといった物理的な形質導入技法も使用することができる。本発明は、これらの遺伝子導入方法または他の一般に使用されている遺伝子導入方法のいずれとも一緒に使用することができる。
本発明の核酸および核酸送達ビヒクル（例えばウイルス、リポソーム、プラスミド、ベクター）は、対象へのインビボ投与のために、薬学的に許容できる担体に入れることができる。「薬学的に許容できる」とは、生物学的にもその他の面でも望ましくない点がない材料を意味する。すなわち、その材料は、核酸またはビヒクルと一緒に対象に投与しても、望ましくない生物学的作用を何も引き起こさず、それを含有する医薬組成物の他の構成要素のいずれとも有害な形では相互作用しない。当然ながら担体は、当業者には周知であるだろうように、活性成分の分解が最小限に抑えられるように、また対象における有害副作用が最小限に抑えられるように選択されるだろう。
核酸またはビヒクルは経口投与、非経口投与（例えば静脈内投与）、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮投与、体外投与、局所外用などの方法によって投与することができる。核酸またはベクターの具体的な所要量は、対象の種、年齢、体重および全般的状態、処置される障害の重症度または機序、使用するその核酸またはビヒクル、その投与様式などに依存して、対象ごとに異なるだろう。
PLAD自己会合の阻害剤
本発明はさらに、PLAD自己会合またはTNF様受容体オリゴマー化の阻害剤を含む組成物を提供する。「阻害剤」とは、PLADを結合する化合物、またはPLADの標的を結合してPLADの活性を防止する化合物（抗体を含む）と定義される。この阻害剤は、PLADに結合すると、PLAD自己会合を妨害または防止し、その結果としてTNF受容体様受容体のオリゴマー化を阻害する。TNF様受容体オリゴマー化の阻害剤は、PLADに特異的結合する抗体（ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体）、PLADに結合するリガンド、PLADに結合するポリペプチド、PLADに結合する化合物、またはPLADに基づくペプチドミメティックであることができる。例えば、PLADを含むポリペプチドまたはPLADからなるポリペプチドは、天然TNF受容体様受容体のPLADと会合することにより、そのTNF受容体様受容体が他の天然TNF受容体様受容体と自己会合することを防止または阻害することができる。PLADを含むポリペプチドまたはPLADからなるポリペプチドは、可溶性PLADであることができる。抗イディオタイプ抗体およびアフィニティマチュアード抗体も考えられる。他の阻害剤として、PLAD自己会合を遮断するように設計された分子または化合物が挙げられるが、これらに限るわけではない。阻害剤は、PLAD自己会合を阻害することによってTNF受容体様受容体のオリゴマー化を防止するタンパク質全体であってもよいし、その断片であってもよい。阻害剤は、本明細書に記載する方法に従って同定される有機分子であることができる。PLAD自己会合を妨害することのできる分子を設計するために、TNF受容体およびそれらのオリゴマー型複合体の結晶構造を利用することができる。PLADを模倣し、PLAD自己会合を妨害する分子を設計するために、結晶構造を解析することもできる。
このように、小分子阻害剤を作製する方法と、その方法によって作製される阻害剤とが提供される。TNFRアセンブリおよびTNF結合に干渉する小分子（SM）およびPLADペプチド誘導体が提供される。二量体化したTNFR1タンパク質の結晶構造に基づいて、PLAD会合の結合表面を検索した。これを、保存的ホモロジー検索および本明細書に記載するPLAD突然変異誘発に関するデータと組み合わせることにより、潜在的鎖間会合部位をいくつか同定することができる。例えば、二量体化したPLAD構造（図23）に示されるとおり、各ペプチド鎖の34番目にある二つのヒスチジン環は、鎖間ポケット内で互いをミラーロック（mirror lock）するようである。ヒスチジン残基のイミダゾールはPLAD自己会合の妨害にとって良い候補であるため、イミダゾールおよびイミダゾール誘導体は、強力な受容体特異的遮断剤になり、TNFが媒介する疾患の処置に使用することができる。
本明細書には、TNFRアセンブリおよびTNF結合に干渉することができる化合物を開示する。一般に適切な阻害剤は、PLAD二量体化構造の鎖間ポケットに侵入して、34番目にある二つのヒスチジン環の間で起こる相互作用に干渉することができる化合物である。この意味で、鎖間ポケットへの侵入を邪魔するまたは34番目にある二つのヒスチジン残基の間で起こる相互作用の妨害を妨げる嵩高い置換基を含有する阻害剤は、好ましくない。逆に、鎖間ポケットへの容易な侵入を許し、挿入と、その結果として起こる34番目の二つのヒスチジン残基の間の相互作用の妨害とを容易にするような置換基を含有する阻害剤は、好ましい。さらに、鎖間ポケット中の他の残基に対して増加したアフィニティを持ち、それゆえにPLAD二量体化構造における阻害剤の結合を容易にしかつ/または強化する置換基を含有する阻害剤は、より一層好ましい。一定の置換基がPLAD二量体化構造への結合を強化するか、それとも邪魔するかを評価するために行われる推定上の阻害剤の解析を、当業者は、インシリコで行うことができる。
本明細書で使用する「置換（された）」という用語は、有機化合物の許容される置換基を全て包含すると考えられる。広義にみて、許容される置換基には、有機化合物の非環式および環式、分岐および非分岐、炭素環式および複素環式、ならびに芳香族および非芳香族置換基が包含される。置換基の実例には、例えば後述するものが含まれる。許容される置換基は、適当な有機化合物について、一つ以上であることができ、同じであっても、異なってもよい。本明細書においては、窒素などのヘテロ原子は、そのヘテロ原子の原子価を満たす水素置換基および/または本明細書に記載する任意の許容される有機化合物の置換基を持つことができる。この開示が、有機化合物の許容される置換基によって限定されることは、決してないつもりである。また、「置換」または「〜で置換された」という用語には、そのような置換が置換される原子および置換基の許容された原子価に従い、その置換が安定な化合物（例えば転位、環化、脱離などの変換を自発的には起こさない化合物）をもたらすという、暗黙の前提が含まれる。
本明細書では、「A1」「A2」「A3」および「A4」を、さまざまな具体的置換基を表すための一般記号として使用する。これらの記号は、本明細書に開示する置換基に限らず、任意の置換基であることができ、ある場合にそれらが一定の置換基であると定義されたとしても、別の場合にはそれらは何か別の置換基であると定義されうる。
本明細書で使用する用語「アルキル」は、炭素原子数1〜24の分岐または非分岐飽和炭化水素基、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、t-ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなどである。アルキル基は置換されていても、無置換であってもよい。アルキル基は、後述するように、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ-オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールなど（ただしこれらに限るわけではない）を含む一つ以上の基で、置換することができる。
本明細書の全体を通して、「アルキル」は、無置換アルキル基および置換アルキル基の両方を指すために広く使用されるが、本明細書ではアルキル基上の具体的置換基を特定することにより、限定的に、置換アルキル基に言及する場合もある。例えば用語「ハロゲン化アルキル」は、一つ以上のハライド、例えばフッ素、塩素、臭素、またはヨウ素で置換されたアルキル基を限定的に指す。用語「アルコキシアルキル」は、後述するように、一つ以上のアルコキシ基で置換されたアルキル基を限定的に指す。用語「アルキルアミノ」は、後述するように、一つ以上のアミノ基で置換されたアルキル基を限定的に指す。ある例では「アルキル」を使用し、別の例では「アルキルアルコール」などの具体的用語を使用したとしても、それは、「アルキル」という用語が例えば「アルキルアルコール」などの具体的用語をも指すということがないことを、含意するものではない。
この慣例は本明細書で使用する他の基にも用いられる。すなわち、「シクロアルキル」などの用語は無置換シクロアルキル部分と置換シクロアルキル部分の両方を指すが、それに加えて、本明細書では置換部分を具体的に特定する場合もあり、例えば特定の置換シクロアルキルを例えば「アルキルシクロアルキル」などと呼ぶ場合がある。同様に、置換アルコキシは、限定的に、例えば「ハロゲン化アルコキシ」と呼ぶ場合があり、特定の置換アルケニルは、例えば「アルケニルアルコール」などである場合もある。ここでも、「シクロアルキル」などの一般用語と「アルキルシクロアルキル」などの具体的用語の使用に関する慣例は、一般用語が具体的用語をも包含するということがないことを、含意するわけではない。
本明細書で使用する用語「アルコキシ」は、単一の末端エーテル結合によって結合されたアルキル基である。すなわち「アルコキシ」基は-OA1（式中、A1は上に定義したアルキルである）と定義することができる。
本明細書で使用する用語アルコキシルアルキルは、アルコキシ置換基を含有するアルキル基であり、-A1-O-A2（式中、A1およびA2はアルキル基である）と定義することができる。
本明細書で使用する用語「アルケニル」は、少なくとも一つの炭素-炭素二重結合を含有する構造式を持つ炭素原子数2〜24の炭化水素基である。(A1A2)C＝C(A3A4)などの非対称構造は、E異性体およびZ異性体の両方を包含するものとする。非対称アルケンが存在する本明細書記載の構造式では、これが推定されるか、あるいは結合記号C＝Cによって明示的に示されうる。アルケニル基は、後述するように、例えばアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ-オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールなど（ただしこれらに限るわけではない）を含む一つ以上の基で、置換することができる。
本明細書で使用する用語「アルキニル」は、少なくとも一つの炭素-炭素三重結合を含有する構造式を持つ炭素原子数2〜24の炭化水素基である。アルキニル基は、後述するように、例えばアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ-オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールなど（ただしこれらに限るわけではない）を含む一つ以上の基で、置換することができる。
本明細書で使用する用語「アリール」は、任意の炭素系芳香族基を含有する基であり、例えばベンゼン、ナフタレン、フェニル、ビフェニル、フェノキシベンゼンなどを包含するが、これらに限るわけではない。用語「アリール」は、少なくとも一つのヘテロ原子が芳香族基の環内に組み込まれている芳香族基を含有する基と定義される「ヘテロアリール」も包含する。ヘテロ原子の例には、窒素、酸素、硫黄、およびリンが含まれるが、これらに限るわけではない。また、同様に用語「アリール」に包含される用語「非ヘテロアリール」は、ヘテロ原子を含有しない芳香族基を含有する基を示す。アリール基は置換されていてもよいし、無置換でもよい。アリール基は、本明細書で述べるように、例えばアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ-オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールなど（ただしこれらに限るわけではない）を含む一つ以上の基で置換することができる。用語「ビアリール」は、特殊なタイプのアリール基であり、アリールの定義に包含される。ビアリールとは、ナフタレンのように縮合環構造によって結合されている二つのアリール基、またはビフェニルのように一つ以上の炭素-炭素結合によって結合されている二つのアリール基を指す。
本明細書で使用する用語「シクロアルキル」は、少なくとも三つの炭素原子から構成される非芳香族炭素系環である。シクロアルキル基の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどがあるが、これらに限るわけではない。用語「ヘテロシクロアルキル」は、環の炭素原子の少なくとも一つがヘテロ原子（例えば、限定するわけではないが、窒素、酸素、硫黄、またはリン）で置換されている、上に定義したシクロアルキルである。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は置換されていてもよいし、無置換であってもよい。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は、本明細書で述べるように、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ-オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールなど（ただしこれらに限るわけではない）を含む一つ以上の基で置換することができる。
本明細書で使用する用語「シクロアルケニル」は、少なくとも三つの炭素原子から構成され、かつ少なくとも一つの二重結合（すなわちC＝C）を含有する、非芳香族炭素系環である。シクロアルケニル基の例には、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニルなどがあるが、これらに限るわけではない。用語「ヘテロシクロアルケニル」は、上に定義したシクロアルケニル基の一タイプであって、用語「シクロアルケニル」の意味に包含され、この場合は、環の炭素原子の少なくとも一つがヘテロ原子（例えば、限定するわけではないが、窒素、酸素、硫黄、またはリン）で置換されている。シクロアルケニル基およびヘテロシクロアルケニル基は置換されていてもよいし、無置換であってもよい。シクロアルケニル基およびヘテロシクロアルケニル基は、本明細書で述べるように、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ-オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールなど（ただしこれらに限るわけではない）を含む一つ以上の基で置換することができる。
用語「環式基」は、本明細書では、アリール基、もしくは非アリール基（すなわちシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニル基）、またはその両方を指すために使用される。環式基は、置換されていても無置換でもよい一つ以上の環系を持つ。環式基は、一つ以上のアリール基、一つ以上の非アリール基、または一つ以上のアリール基および一つ以上の非アリール基を含有することができる。
本明細書で使用する用語「アルデヒド」は、式-C(O)Hによって表される。本明細書の全体を通して「C(O)」はC＝Oを短縮表記である。
本明細書で使用する用語「アミン」または「アミノ」は、式NA1A2A3（式中、A1、A2、およびA3は、独立して、水素、上述のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であることができる）で表される。
本明細書で使用する用語「カルボン酸」は、式-C(O)OHで表される。本明細書にいう「カルボキシレート」は、式-C(O)O-で表される。
本明細書で使用する用語「エステル」は、式-OC(O)A1または-C(O)OA1（式中、A1は、上述のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であることができる）で表される。
本明細書で使用する用語「エーテル」は、式A1OA2（式中、A1およびA2は、独立して、上述のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であることができる）で表される。
本明細書で使用する用語「ケトン」は、式A1C(O)A2（式中、A1およびA2は、独立して、上述のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であることができる）で表される。
本明細書で使用する用語「ハライド」は、ハロゲンであるフッ素、塩素、臭素、およびヨウ素を指す。
本明細書で使用する用語「ヒドロキシル」は、式-OHで表される。
本明細書で使用する用語「ニトロ」は、式-NO2で表される。
本明細書で使用する用語「シリル」は、式-SiA1A2A3（式中、A1、A2、およびA3は、独立して、水素、上述のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であることができる）で表される。
本明細書で使用する用語「スルホ-オキソ」は、式-S(O)A1、-S(O)2A1、-OS(O)2A1、または-OS(O)2OA1（式中、A1は、水素、上述のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であることができる）で表される。本明細書の全体を通して、「S(O)」はS＝Oの短縮表記である。
用語「スルホニル」は、本明細書では、式-S(O)2A1（式中、A1は、水素、上述のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であることができる）で表されるスルホ-オキソ基を指すために用いられる。
本明細書で使用する用語「スルホニルアミノ」または「スルホンアミド」は、式-S(O)2NH-で表される。
本明細書で使用する用語「スルホン」は、式A1S(O)2A2（式中、A1およびA2は、独立して、上述のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であることができる）で表される。
本明細書で使用する用語「スルホキシド」は、式A1S(O)A2（式中、A1およびA2は、独立して、上述のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であることができる）で表される。
本明細書で使用する用語「チオール」は、式-SHで表される。
本明細書で使用する「R1」「R2」「R3」「Rn」（式中、nは整数である）は、独立して、上に列挙した基の一つ以上を持つことができる。例えば、R1が直鎖アルキル基であるとすると、そのアルキル基の水素原子の一つを、場合によっては、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキル基、ハライドなどで置換することができる。選択した基に応じて、第1の基を第2の基内に組み込むか、あるいは第1の基を第2の基にぶら下げる（すなわち結合する）ことができる。例えば「アミノ基を含むアルキル基」という表現では、アミノ基をアルキル基の主鎖に組み込むことができる。もう一つの選択肢として、アミノ基をアルキル基の主鎖に結合することもできる。第1の基が第2の基に埋め込まれるか、結合されるかは、選択した基の性質によって決まるだろう。
反対の表示がない限り、楔形や破線としてではなく実線だけで示された化学結合を持つ式では、考えうる各異性体、例えば各エナンチオマーおよびジアステレオマー、ならびに異性体の混合物、例えばラセミ混合物または非ラセミ（scalemic）混合物などが考えられる。
有効量のイミダゾールまたはイミダゾール誘導体を投与することにより、TNF受容体様受容体へのリガンド結合を阻害する方法が提供される。
本明細書で考えられる阻害剤の例は、一般に、さまざまな置換基で官能化された5員窒素含有複素環である。そのような阻害剤の例を以下に示し、基本となる無置換複素環構造（すなわちRnがHであるもの）の名前によって総称する。
Figure 2008543346
上に示した構造を持つ阻害剤の多くの例において、R1、R2、R3、R4、およびR5が存在する場合、それらは独立して、H、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルホ-オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールである。具体的な例では、R1〜5が、独立して、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシアルキル基、またはC1-C6アルコキシ基である。代表的なC1-C6アルキル基およびC1-C4アルキル基として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec-ブチル、イソブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、2-エチルブチル、2-メチルペンチルなどが挙げられる。対応するC1-C6アルコキシ基は、酸素原子に結合された上記のC1-C6アルキル基を含有し、その酸素原子はカチオン環にも結合される。アルコキシアルキル基はアルキル基に結合されたエーテル基を含有し、ここでは合計6個までの炭素原子を含有する。1,2,3-トリアゾール類には二つの異性体が存在することに注意すべきである。
本発明では、TNF受容体様受容体の他の領域を、その領域を結合した時に受容体中のPLADのコンフォメーションが乱され、その結果、そのPLADともう一つのPLADとの会合が妨げられるような形で、標的にすることも考えられる。例えば当業者は、p60 TNFRのCRD3領域を結合したときに、この受容体のコンフォメーションが変化し、その結果、p60 TNFRのPLADともう一つのPLADとの会合が妨げられるような形で、p60 TNFRのCRD3を標的にすることができるだろう。
このように、有効量のTNF受容体様受容体オリゴマー化阻害剤を投与することによって細胞におけるTNF受容体様受容体のオリゴマー化を阻害する方法も、本発明によって提供される。
本発明では、TNF受容体様受容体の作用を強化するために、PLAD自己会合を強化することも考えられる。例えば、TNFRシグナリングを強化することが望まれるであろう状況がある。そのような場合は、PLAD自己会合のアゴニスト、例えばPLADに結合しPLAD自己会合を強化するという特別な性質を持つ一定の抗体または分子を利用して、PLAD相互作用が弱いせいでTNFR作用に対して抵抗性を示す細胞を、TNFR作用に応答する細胞に変換することができる。そのような強化されたPLAD自己会合は、リガンド結合およびシグナリングを増加させることができる。そのような強化されたPLAD相互作用が望ましいであろう疾患状態の例には、自己免疫性リンパ球増殖症候群（ALPS）および高IgM症候群などがあるが、これらに限るわけではない。
本発明は、生物学的薬剤を細胞に送達するためのターゲティング部分としてPLADを利用することも可能にする。例えば、毒素に連結されたPLADを細胞に送達することにより、それがTNF-R上の天然PLADに結合した時に、オリゴマー化が阻害されるように、また天然TNF-Rの内部移行時には、毒素に連結されたPLADも同様に内部移行して、毒素が細胞内に送達されるようにすることができる。
本明細書の全体を通して使用する「TNF受容体様受容体」とは、TNF受容体スーパーファミリーの任意のメンバーを指し、これには、例えばTNF-R、p60（p55およびTNFR1とも呼ばれている）、p80（p75、TNFR2とも呼ばれている）、Fas（CD95/APO-1）、TRAIL受容体、LTβR、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40、DR4、TROY、EDAR、XEDAR、DCR3、AITR、4-1BB、DR3、RANK、TACI、BCMA、DR6、DPG、DR5、DCR1およびDCR2が含まれるが、これらに限るわけではない（表1参照）。表1に記載のGenBank Accession番号に記載されているヌクレオチド配列、ポリペプチド配列および任意の情報（例えばシグナル配列および成熟タンパク質残基数）は、この参照をもって、そのまま本明細書に組み入れられる。
上述のように、TNF受容体様受容体オリゴマー化の阻害剤には、抗体、リガンド、ペプチドミメティック、PLADに特異的に結合する化合物およびポリペプチドが含まれる。これらのポリペプチドには、単離された（例えば可溶性）PLADを含むまたはそのようなPLADからなるポリペプチドが含まれる。
本発明は、有効量のTNF受容体様受容体オリゴマー化阻害剤を投与することによってTNF受容体様受容体へのリガンド結合を阻害する方法も提供する。例えば、TNFR-PLADを含むまたはTNFR-PLADからなるポリペプチドなどの阻害剤を投与することにより、TNF受容体オリゴマー化が阻害され、その結果、TNF受容体へのTNF-αの結合が防止されて、TNF-αの有害な作用が軽減されるだろう。同様に、CD40受容体-PLAD（CD40R-PLAD）を含むポリペプチドを投与すると、CD40Rオリゴマー化が阻害され、その結果、CD40RへのCD40リガンドの結合が防止されて、同種移植拒絶、慢性関節リウマチおよび全身性エリテマトーデスなどの疾患状態におけるCD40の有害な作用が軽減されるだろう。TNF受容体様受容体へのリガンド結合の阻害は、TNF受容体様受容体によるシグナル伝達の阻害をもたらすので、TNF受容体様受容体によるシグナリングを調整する方法になる。さらにまた本発明は、TNF受容体様受容体が、ホモタイプ会合によってリガンドを結合しシグナルすることを確認した。すなわち、例えばTNFR-PLADはTNFR-PLADと相互作用し、Fas-PLADはFas-PLADと相互作用し、CD40-PLADはCD40-PLADと相互作用する。したがって、PLAD自己会合を妨害するペプチドおよびペプチドミメティックを使った治療により、受容体特異的な治療が保証されるだろう。なぜなら、各受容体はPLADによってそれ自身とのみ会合することを、本発明が示しているからである。例えば、TNF-R2に影響を及ぼさずにTNF-R1機能を妨害することは、現在の非選択的治療薬に比して大きな利点を持つ。同様に、他のTNF受容体様受容体機能に影響を及ぼさない特定TNF受容体様受容体機能の特異的妨害は非常に望ましく、本明細書の教示するところによってもたらされる。
タンパク質治療方法
本発明は、有効量のPLAD自己会合阻害剤を投与することによって、対象における炎症を処置する方法も提供する。本発明は、有効量のPLAD自己会合阻害剤を投与することによって、対象における自己免疫疾患に関連する炎症を処置する方法も提供する。そのような疾患には、例えば周期熱症候群、敗血症症候群、および成人呼吸窮迫症候群が含まれるが、これらに限るわけではない。例えば、炎症が敗血症性関節炎に関連し、阻害剤がTNF受容体様受容体の可溶性PLADである方法が提供される。
本発明において、対象は任意の哺乳動物、好ましくはヒトであることができ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、サル、ウマおよびチンパンジーを包含しうるが、これらに限るわけではない。
本明細書にいう「処置（する）」とは、患者の臨床状態の改善を表す。改善は、炎症応答の軽減から、炎症性疾患の完全な改善にまで及びうる。
本明細書にいう「自己免疫疾患」とは、対象の身体が、対象自身の身体構成要素に対して、有害な作用を持つ機能不全的免疫応答を生じる疾患状態または症候群を表す。これには、全ての抗原、アレルゲンまたは主要組織適合（MHC）抗原に対して特異性を持つ抗体を産生するB細胞の産生が含まれることや、自己構成要素を認識する受容体を持ち、炎症を引き起こすサイトカインを産生するT細胞の産生が含まれることがある。自己免疫疾患の例には、潰瘍性大腸炎、クローン病、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、敗血症性関節炎、真性糖尿病、悪性貧血、自己免疫性胃炎、乾癬、ベーチェット病、ウェゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性卵巣炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、多染性内分泌障害、スティル病、ランバート・イートン筋無力症候群、重症筋無力症、グッドパスチャー症候群、自己免疫性睾丸炎、自己免疫性ぶどう膜炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群および強直性脊柱炎などがあるが、これらに限るわけではない。
HVEAなど、一部のTNFR受容体はウイルス受容体であり、これらの受容体はオリゴマー化に依存しうるので、本発明では、PLADアセンブリを防止することによってウイルス侵入を遮断することも考えられる。
使用される最適な投薬量は処置される個体および使用する阻害剤に依存して変化するだろう。阻害剤の量は、年齢、サイズ、体重、状態などに基づいて、個体間でも変動するだろう。投薬量が担当医によって最善に最適化されることと、用量およびレジメンを決定し剤形を製造する方法が、例えば「Remington's Pharmaceutical Sciences」などに記載されていることは、当業者には理解されるだろう。例えば、適切な用量および投薬レジメンは、炎症または自己免疫障害の処置または予防に現在使用されている薬剤との比較によって決定することができる。
典型的には、本発明の阻害剤は、得られるべき臨床応答に依存して、0.1〜100mg/kg-体重の量で、経口投与または非経口投与することができる。例えば、阻害剤が可溶性PLADまたはPLAD含有化合物である場合、阻害剤を0.5〜100mg/kg（例えば5mg/kg）の量で投与することができる。さらなる一例として、阻害剤が可溶性（単離された）p60 PLADであり、疾患が関節炎（例えば敗血症性関節炎）である場合は、PLADを1関節あたり0.5〜100mgの投薬量で投与することができる。例えば、敗血症性関節炎の処置には、関節内投与の場合で4mg/kg、または非経口投与の場合で16m/kgというp60 PLADの用量が有効である。阻害剤の投与は、長期間にわたる寛解または疾患の徴候および症状の安定化後に完全に停止することができ、疾患の徴候もしくは症状の悪化後、またはこの分野の臨床医には周知のルーチン追跡免疫検査によって決定される免疫状態の有意な変化後に、再投与することができる。
本明細書に記述する炎症または自己免疫障害の処置における特定用量の阻害剤の投与の効力は、処置される特定障害の病態生理学的活動度を評価するのに有用であることが証明されている病歴、徴候、症状および客観的臨床検査の特定の側面を評価することによって、決定することができる。この分野の臨床医には周知であるだろうように、これらの徴候、症状および客観的臨床検査は、処置される特定の障害に依存して変化するだろう。例えば、適当な対照群との比較および一般集団または特定個体におけるその障害の通常の進行に関する知見に基づいて、1）対象の再発頻度または再発の重症度が改善されることが示されるか、2）疾患または障害の進行が安定化されることが示されるか、または3）他の免疫抑制薬物治療を使用する必要性が減少するのであれば、その特定処置は、有効であるとみなすことができる。
疾患活動度がある阻害剤によって有意に改善または安定化されることが確認されたら、処置スケジュールを縮小または中断して、特定の徴候、症状および臨床検査を評価することができる。本明細書に記載する特定の徴候、症状および客観的臨床検査の標準的な評価方法に基づいて、疾患活動度が再発する場合には、処置を再開することができる。
さらにまた、自己免疫障害を持つことは知られていないが自己免疫障害を発症するリスクがあることがわかっている対象における自己免疫障害の予防に、特定用量のペプチドリガンドの投与が持つ効力は、当業者に知られている標準的な徴候、症状および客観的臨床検査を経時的に評価することによって決定することができる。この時間間隔は長くてもよい（すなわち年単位/十年単位）。自己免疫障害を発症するリスクがある人の決定は、この分野の臨床医および研究者によく知られている特定障害の既知のリスク因子（例えばある障害のとりわけ強力な家族歴、または自己免疫疾患の発症につながりそうな因子もしくは条件へのばく露もしくはその獲得など）に関する最新の知見に基づいて行われるだろう。
「薬学的に許容できる」とは、生物学的にもその他の面でも望ましくない点がない材料を意味する。すなわち、その材料は、選択した化合物と一緒に対象に投与しても、望ましくない生物学的作用を何も引き起こさず、それを含有する医薬組成物の他の構成要素のいずれとも有害な形では相互作用しない。選択される担体は、投与の方法とその患者に依存する。投与方法は経口投与、舌下投与、粘膜投与、吸入投与、吸収投与、または注射による投与であることができる。本明細書に記載するTNF受容体様受容体オリゴマー化の阻害剤を投与する方法の全てが、薬学的に許容できる担体を必要とするわけではないことにも注意されたい。
本発明では、PLAD自己会合またはTNF様オリゴマー化の阻害剤を、ヒト対象にとって薬学的に許容できる担体に入れて、経口投与または非経口投与することができる。経口投与または吸入投与に適した担体は、ヒト対象にとって薬学的に許容できる担体の一つ以上を含むことができる。経口投与に適した担体は、着香剤、潤滑剤、懸濁化剤、または保護剤としても作用しうる一つ以上の物質を含む。適切な固形担体として、例えばリン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、糖、デンプン、ゼラチン、セルロース、カルボキシポリメチレン、またはシクロデキストランが挙げられる。適切な液状担体として、例えば水、パイロジェンフリー食塩水、薬学的に許容できる油、またはこれらのいずれかの混合物が挙げられる。液体は、他の適切な医薬添加物、例えば緩衝剤、保存剤、着香剤、粘性もしくは浸透圧調節剤、安定剤または懸濁化剤などを含有することもできる。適切な液状担体の例として、さまざまな添加剤（例えばph調節ゲルとしてのカルボキシポリメチレンなど）を含むまたは含まない水が挙げられる。阻害剤は、胃での破壊を避けるためにポリペプチドを腸に放出する腸溶性カプセル剤に含めることもできる。アンタゴニストを非経口投与するために、オレイン酸エチルまたはミリスチン酸イソプロピルなどの添加剤を含有しうる食塩水中に、滅菌溶液または滅菌懸濁液を調製し、静脈内に注射する他、例えば皮下または筋肉内組織に注射することができる。
スクリーニング方法
PLAD会合の阻害剤をスクリーニングする方法であって、a）単離されたPLADをコードする核酸配列を含む核酸を含有するプラスミドと、第2の単離されたPLADをコードする核酸配列を含むプラスミドとを、細胞にトランスフェクトすること、b）その細胞を推定上の阻害剤と接触させること、およびc）PLAD自己会合を測定することを含み、推定上の阻害剤と接触させなかった細胞におけるPLAD会合と比較したステップb）の細胞におけるPLAD会合の減少が、PLAD会合の阻害剤の存在を示す方法。
このスクリーニング方法の一例は、PLAD会合の阻害剤をスクリーニングする方法であって、a）蛍光ドナーに機能的に連結された単離されたPLADをコードする核酸配列を含む核酸を含有するプラスミドと、蛍光アクセプターに機能的に連結された単離されたPLADをコードする核酸配列を含むプラスミドとを、細胞にトランスフェクトすること、b）その細胞を阻害剤と接触させること、およびc）FRETを測定することを含み、阻害剤と接触させなかった細胞におけるFRET測定と比較したFRETの減少が、PLAD会合の阻害剤の存在を示す方法である。
PLAD会合のアゴニストをスクリーニングする方法であって、a）単離されたPLADをコードする核酸配列を含む核酸を含有するプラスミドと、第2の単離されたPLADをコードする核酸配列を含むプラスミドとを、細胞にトランスフェクトすること、b）その細胞を推定上のアゴニストと接触させること、およびc）PLAD自己会合を測定することを含み、推定上のアゴニストと接触させなかった細胞におけるPLAD会合と比較したステップb）の細胞におけるPLAD会合の増加が、PLAD会合のアゴニストの存在を示す方法も、本発明によって提供される。
以下の実施例ではFRETを使ったPLAD会合の測定を例示する。さらにまた、上述のスクリーニング方法を実施するにあたって、単一のプラスミドを利用して、PLADをコードする二つ以上の核酸を送達することもできる。FRET分析を伴う方法では、単一のプラスミドを使って、蛍光ドナーまたは蛍光アクセプターに機能的に連結されたPLADをコードする二つ以上の核酸を送達することができる。
当業者は、酵母ツーハイブリッドスクリーニング法を利用して、PLAD会合の阻害剤またはアゴニストをスクリーニングすることもできるだろう。PLAD会合の阻害剤またはアゴニストは、細胞アッセイ（例えばアポトーシス誘導、NF-KB誘導、リンパ球成熟またはリンパ球活性化、および壊死誘導を挙げることができるが、これらに限るわけではない）を利用して同定することもできる（3、4、8、15、29、33、42、45）。
以下の実施例では本発明をより具体的に説明するが、その変更および変形は当業者には数多く明白になるだろうから、以下の実施例は例示を目的とするに過ぎない。
H9リンパ腫細胞を洗浄し、PBSに再懸濁した。次に細胞を、100ng/mlのヒト組換えTNFα（R&D Systems）と共に、回転させながら4℃で1時間、インキュベートした。次に細胞を2mMの架橋剤DTSSP（Pierce）で30分間処理し、反応を、20mM Tris-Cl［pH7.5］により、氷上で15分間でクエンチした。細胞を、プロテアーゼ阻害剤（Boehringer Mannheim）を加えた150mM NaCl、20mM Tris-Cl［pH7.5］、1mM EDTA、30mM NaF、2mM b-グリセロリン酸および1mMオルトバナジウム酸ナトリウム中で溶解した。等量の溶解物を、非還元条件下（β-メルカプトエタノールなし）または還元条件下（280mMβ-メルカプトエタノール添加）で電気泳動し、p60およびp80複合体について、特異的抗体で分析した（19）。Kodak Image Station 440を使ってデンシトメトリーを行った。
p80では、ユニットサイズの約3倍の分子サイズを示す複合体が見つかった。これは糖鎖付加型および非糖鎖付加型三量体に合致する（図1A）。驚いたことに、p80複合体は、TNFαの存在下または非存在下で、効率よく捕捉された（デンシトメトリーでは鎖の65〜70％、図1Aレーン3および4）。大半のp60がゴルジ装置中に存在し、架橋剤には接近し難いという事実にもかかわらず（7）、15〜20％ものp60鎖が、TNFαを添加したかどうかとは無関係に、見かけ上三量体および不連続な高次複合体として架橋された（図1Aレーン11および12）。対照実験では検出可能な内在性TNFαは認められず、p60複合体に架橋したp80などの他のタンパク質を示す証拠も認められなかった。ウェスタンブロット分析により、溶解物にはTNFαが存在しないことが確認された。抗p60抗体による架橋複合体の免疫沈降では、ウェスタンブロット中のp60複合体中に、検出可能なレベルのp80は認められなかった。
β-メルカプトエタノールで架橋剤を切断することにより、複合体は単量体に分割された（図1Aレーン7、8、15および16）。したがってこれらの結果は、リガンド結合前のp60およびp80鎖自己会合を示唆している。
リガンド非依存的な自己アセンブリの可能性を確認するために、この現象を媒介するTNFR中のドメインを同定した。p60の細胞質デスドメインが、過剰に発現された場合に自己会合してアポトーシスを惹起できることは、確立されている（8）。しかし、観察されたプレアセンブル複合体は非シグナリング性であると思われるので、アセンブリドメインは細胞質領域の外に存在するという仮説を立てた。p60およびp80のECDのN末端領域は酵母ツーハイブリッド相互作用アッセイで特異的に自己会合しうることが見出された（9）。
p60、p80、HVEM、DR4およびCD40のさまざまなトランケート体および突然変異体をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって作製し、配列決定した。簡単に述べると、受容体のN末端にHAタグを作り出すために、p80のリーダー配列および最初の10アミノ酸残基を、HAエピトープタグがその3'末端に含まれるように増幅した。PCR産物をBamHIおよびEcoRIで消化し、pcDNA3にクローニングした。次に、受容体断片を含有するPCR断片を、EcoRIおよびXhoI部位を使って、このプラスミドに導入した。GFP/CFP/YFPキメラの場合、断片をPCRによって増幅し、p60ΔCD-HAのXhoIおよびXbaI部位にインフレームに導入した。Fugene 6（Boehringer Mannheim）により、製造者のプロトコールに従って、293T細胞のトランスフェクションを行った。細胞を、150mM NaCl、20mM Tris-Cl［pH7.5］、1mM EDTA、30mM NaF、2mMβ-グリセロリン酸、1mMオルトバナジウム酸ナトリウム、5mMヨードアセトアミド、2mMジチオスレイトール（DTT）、1％ TRITON X-100およびプロテアーゼ阻害剤（Boehringer Mannheim）中で溶解した。プロテインGアガロースビーズ（Boehringer Mannheim）および正常マウスIgGによる予備浄化後に、2mgの抗GFPおよびプロテインGアガロースビーズを使って、タンパク質を溶解物から免疫沈降した。0.5M NaClを含有する溶解バッファーで免疫複合体を2回洗浄した後、通常の溶解バッファーで3回洗浄した。免疫複合体をTris/グリシンゲル（Novex）上で分割した。Jurkat細胞におけるトランスフェクションも同様の結果を示した。哺乳動物細胞において、細胞質ドメインを緑色蛍光タンパク質（GFP）で置き換えたキメラp60受容体は、テールレス（tailless）p60（p60ΔCD-HA）と強く相互作用するが、TNFR様受容体ヘルペスウイルス侵入媒介因子（HVEMΔCD-HA）とは強く相互作用しないことがわかった（図1Bレーン2とレーン3を比較されたい）。
GFP単独ではp60ΔCD-HAと会合することはできなかった（図1Bレーン5）。細胞外部分の類似するホモタイプ相互作用が、完全長p80とテールレスp80との間にも観察された（図1Cレーン6）。
そのうえ、CRD1と部分的に一致するp80のアミノ酸（a.a.）10〜54を除去しただけで、完全なp80とのリガンド非依存的会合は、完全に妨げられた（図1Cレーン7）。自己会合は、p60における同様の欠失（a.a.1〜54）でも消失した（下記参照）。
p80のN末端部分（a.a.10〜54）の重要性は、それをp60受容体に付加したところ、そのp60受容体が完全長p80と相互作用したことによって、さらに例証される（図1Dレーン3をレーン4およびレーン5と比較、図９）。このように、このドメインは、異種受容体の特異的会合を媒介するのに十分であった。この会合はリガンド非依存的である。なぜなら、キメラp8010-546055-211(R1)では、EcoRI制限部位によってコードされる二つのアミノ酸が、p80配列とp60配列の接合部に挿入されており、それがTNFα結合を打ち消したからである（図1Eパネルkおよびl）。このように、TNFR-ECDのリガンド結合ポケットとは異なる新規機能ドメインが、リガンド非存在下での自己会合を媒介している。以後、このドメインをプレリガンドアセンブリドメイン（Pre-Ligand Assembly Domain：PLAD）と呼ぶ。
p60またはp80のどちらか一方からPLADを欠失させると、リガンド結合は完全に妨げられた（表2ならびに図1Eパネルd、f、およびhを比較されたい）。しかし、p80のPLADを付加することにより、PLAD欠失p60は、TNFαを結合することが可能になったが、上記のとおり、これは、EcoRI部位がコードする二つのアミノ酸挿入によって打ち消された（図1Eパネルjおよびl）。したがって、TNFRによる効率のよいTNFα結合は、受容体自己会合に依存するのかもしれない。あるいは、PLADの除去が全体的なECD構造を乱したのかもしれない。CRD1の除去がp60 ECDの適正なフォールディングを乱さないことは、以前の結果によって示されているので（13）、後者の可能性はなさそうである。しかし、これらの可能性を決定的に識別するために、p60ΔCD-HAのCRD1〜3にアミノ酸置換を導入し、それらがp60ΔCD-GFP-HAとの相互作用に及ぼす影響を決定した。突然変異誘発は、Quikchange法（Stratagene）を使用し、製造者の指示に従って行った。突然変異はDNA配列決定によって確認した。置換したアミノ酸はK19を除いて全てp60とp80の間で保存されている。p80中の対応する残基はE22である。直接リガンド接触を乱さないと予想されるPLAD中の二つの置換、KY19/20AAおよびK32A（5）が、自己会合を妨げ（図2Aレーン3およびレーン5をレーン2と比較されたい）、TNFα結合を消失させた（表2）。PLAD内のもう一つの残基の置換、Q24Aは、自己会合にもTNFα結合にも影響を及ぼさなかった（図2Aレーン4および表2）。表2で言及する残基番号は、p60の成熟配列に基づいている。CRD2リガンド結合ポケット内でPLAD外にある他の二つの置換、E57AおよびN66Fは、TNFα結合を妨害したが、受容体自己会合にはほとんど影響しなかった（表2ならびに図2Aレーン6および7）。細胞質テールを欠く突然変異型受容体と野生型ECDとの会合が、p60誘導アポトーシスにドミナントに干渉するというその能力と相関することもわかった。これは、突然変異型受容体がPLADを介して内在性の機能的なp60受容体複合体の一部になることを示している（表2）。これらの結果は、PLADはリガンド接触ドメインとは物理的に異なるが、それでもなお、効率のよいTNFα結合および受容体機能にとって不可欠であることを示している。
単量体型の受容体鎖とは異なり、プレアセンブルした受容体複合体内の受容体鎖の細胞質部分は、互いに近接していると予想されうる。次に、TNFα結合が、細胞質ドメインのより強固な会合を引き起こして、それがシグナリングタンパク質の動員につながるのかもしれない。この仮説を評価するために、実施例2に記載する新しいフローサイトメトリーによるアプローチ（11）を使って、GFPの二つのスペクトル変異体、すなわち蛍光ドナーとしてのシアン蛍光タンパク質（CFP）と蛍光アクセプターとしての黄色蛍光タンパク質（YFP）の間の蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を分析した（12）。FRETは、生細胞内の分子間相互作用を測定するための強力なアプローチである。エネルギー移動は蛍光体間の距離が増加するにつれて急速に減衰するので、GFP変異体間のFRETにより、100Å以内の分子相互作用を検出することが可能になる。
p60およびp80の細胞質領域がCFPまたはYFPのどちらか一方で置き換えられたキメラタンパク質を作製し、さまざまな受容体ペア間でエネルギー移動が起こるかどうかを決定するための試験を行った。FRETは、514nmでYFPタンパク質を励起してから413nmでCFPタンパク質を励起するデュアルレーザーFACSvantage装置を使って行った。次に、CFPからYFPへのエネルギー移動を、546nmでの放射として検出した。CFPタンパク質と比較して大過剰のYFPタンパク質を細胞にトランスフェクトした。次に、プログラムFlowjo（Treestar Inc.）を使って、CFP陽性集団でのFRETを分析した。
p60ΔCD-CFPとp60ΔCD-YFPの間に、TNFαの添加後に実質的に増加するエネルギー移動が観察された（図2Bパネルa）。このFRETは、PLADの欠失、またはPLAD会合を妨げるK32A突然変異によって、打ち消された(図2Bパネルbおよびc）。p80ΔCD-CFP：p80ΔCD-YFPペアの同様の分析では、やはりTNFαの添加によって増加する強いFRETシグナルが認められた（図2Bパネルd）。ドナーとしてのp80ΔCD-CFPまたはCFP-p80ΔCD（細胞外ドメインのN末端に融合されたCFP）に対してp60ΔCD-YFPをアクセプターとして用いる対照実験は、FRETを示さなかった（図2Bパネルeおよびf）。これらのデータは、全体として、p60鎖およびp80鎖が自分自身の近傍にあること、および細胞質内でCFP部分とYFP部分とがより強固に会合することになるような複合体の変化を、リガンドが誘導することを、生細胞で実証している。
p60およびp80のPLADをTNFRファミリーに属するいくつかの受容体の第1CRDと比較すると、ドメインのジスルフィド結合スキャフォールドを形成するシステインの他にも保存が見出される（図3A、p80のY23、P36、G37およびT50）。DR4およびFasを含む他のTNFR様受容体の一部はCRD1中に示す保存が少なく、これらの受容体中にPLAD様ドメインが存在するかどうかという疑問が生じる。リガンド非依存的会合がTNFRスーパーファミリーの他のメンバーでも起こるかどうかを調べた。
目立った特徴として、TRAIL受容体1（DR4）およびCD40のECDはどちらも自己会合するが、他のTNFR様受容体のECDとは有意に相互作用しない（図3B）。これらのキメラはホモ特異的FRETも示した（図3C）。実施例2で述べるように、Fas（CD95/APO-1）も自分自身と特異的に会合する（11）。このように、PLADによる自己アセンブリは、TNFRスーパーファミリーの保存された特徴である。
本発明は、p60およびp80 TNFRが、PLADと呼ばれる新規N末端ドメインにより、リガンドの非存在下で、機能的複合体にプレアセンブルすることを明らかにする。これは、CRD1がp60およびp80のリガンド結合および受容体シグナリングに決定的な役割を果たす方法を明らかにする（10）。今まで、TNFRスーパーファミリーのメンバーによるシグナリングに関する基本的概念は、リガンドが単量体型受容体鎖を適当な三部分複合体にし、それが細胞質シグナル伝達タンパク質の動員につながるというものだった（1、3、5、6）。このモデルは、主として、リガンドと複合体を形成したp60の結晶構造に基づくものであり、その結晶構造は、三本の受容体鎖がそのサブユニット間溝に三量体型リガンドを包囲し、少なくとも40Åは離れた状態を保つことを示していた。リガンドが伸長したCRD2およびCRD3ドメインと接触するのに対して、CRD1ドメインはリガンドとは相互作用せず、互いに相互作用することもない（5）。DR5/TRAIL複合体の構造に関する最近の記述も、同様の受容体-リガンド相互作用を明らかにしている（13）。しかし、リガンドが結合した構造は、リガンド結合前の受容体構造を反映していないと思われる。p60およびp80は細胞表面上で自己会合し、PLADを欠失させた場合には単量体としてのみ見出されることが、現在では、明らかになっている。内在性p60およびp80受容体の架橋により、三量体は有利なコンフォメーションであるものの、他のオリゴマー型複合体も生じうることが示唆される。
リガンドがプレ会合した受容体複合体と相互作用する方法は極めて興味深い。というのも、プレ会合がTNFα結合にとって必要であることは、現在では、明白だからである。TNFRシグナリングは、大きく分けて二種類のモデル、すなわち1）鎖回転および再配列モデルと、2）スーパークラスター形成モデルの、どちらか一方によって説明できるかもしれない（図3D）。鎖回転および再配列モデルでは、リガンドがプレ形成された受容体三量体に入り込み、PLAD接触の妨害を引き起こすと共に、もっぱらリガンド三量体との接触によって安定化される三量体への鎖の回転および再編成を引き起こす。あるいは、リガンド結合が、PLAD接触が完全には妨害されないプレアセンブルTNFR三量体のクラスター化を誘発するのかもしれない。PALDが媒介するプレアセンブルTNFR三量体の存在は、その多くがリンパ球の機能およびホメオスタシスにとって極めて重要であることが知られているこの大きな受容体ファミリーによるシグナリングの重要な側面に、新しい光明を投じる（2）。特異的なホモタイプECD接触およびPLADにおける重要残基の保存は、デスドメインを介してシグナルする受容体（p60、DR4およびFas）も、そうでない受容体（p80およびCD40）も含めて、TNFRスーパーファミリーメンバーの特徴である。細胞表面上のホモタイプ複合体への鎖のプレソーティングは、受容体の効率および特異性を増進しうる。例えばp80鎖（デスドメインを欠く）がTNFαによってp60との複合体に動員され、アポトーシスのドミナント阻害を引き起こすというような「受容体干渉」が、回避されるだろう。p80が実際には非依存的アポトーシス促進シグナルによってp60誘導アポトーシスを増進するという事実は、この概念を裏付けている（15）。複合体を「構築」するために受容体鎖を逐次動員する必要も、従来のモデルでは要求されたかもしれないが、プレ形成された三量体ではその必要性を回避することができるので、TNFR様受容体によって達成される迅速なシグナリングを説明することができる（3）。
異なるポリペプチドのヘテロマーから構成される他の受容体ファミリー、特にIL-1およびIL-2については、プレアセンブリが記述されている（16）。とりわけ興味深いのは、リガンドを収容するために「鋏型（scissors-type）」の動きを起こすらしいエリスロポエチン受容体二量体のプレ会合に関する最近の記述である（17）。この場合は、受容体鎖の自己会合が、リガンド結合にとって重要なアミノ酸接触と同じアミノ酸接触によって起こる（17）。これに対し、TNFRスーパーファミリーは、CRD2/3リガンド接触領域とは異なる専用の自己会合ドメインを利用する。PLADの同定は、TNFR様受容体のプレリガンドアセンブリを特異的に阻害することによってシグナリングを防止する治療薬の使用による、TNFαまたは関連リガンドが引き起こす疾患の新しい処置を可能にする。
異常型のFas（CD95/APO-1）をコードするヘテロ接合型突然変異は、ヒト自己免疫性リンパ球増殖症候群（ALPS）において、Fas誘導リンパ球アポトーシスに、ドミナントに干渉する。本発明は、これが、リガンドが誘導する受容体オリゴマー化に依存するのではなく、細胞外ドメインによる野生型Fas受容体と突然変異型Fas受容体とのプレ会合に起因することを実証する。プレ会合したFas受容体複合体は、シグナル伝達にとって不可欠であることを見出すと共に、それを、緑色蛍光タンパク質（GFP）の変異体間で起こるFRETの新しい応用を使って、生細胞において実証した。これらの結果は、Fasシグナリングおよびヒト疾患におけるドミナント干渉に、新しい分子機序を与える。
Fas（APO-1/CD95）は、免疫ホメオスタシスおよび寛容にとって不可欠なアポトーシスシグナルを伝達する細胞表面受容体である（19〜21）。Fasは、腫瘍壊死因子受容体（TNFR）スーパーファミリーに特有の3つの細胞外システインリッチドメイン（CRD）を持つ317アミノ酸の1型膜糖タンパク質である。
ヒトにおいて、ヘテロ接合型Fas突然変異を保有する1A型ALPS患者のリンパ球は、Fas誘導アポトーシスが減少しており、突然変異型アレルのトランスフェクションは、Fasによって誘導されるアポトーシスへのドミナント干渉を引き起こす（29〜34）。これは、野生型Fas鎖と欠陥Fas鎖のリガンド媒介架橋により、下流シグナリング分子を動員することができない混成三量体複合体が生じるためであると考えられていた。しかし、RNAスプライシングの変化によってCRD2の大半を細胞外ドメイン（ECD）欠失させるドミナント干渉性突然変異（Pt2、欠失a.a.52〜96）が研究された。この突然変異体をFas陰性293T細胞で発現させても、アゴニスト抗体への結合を示さない（図4A）（33、35）。この突然変異体は、三量体化したFasLに結合することもできなかったが、細胞質デスドメイン中のALPS突然変異、例えばPt6、A241Dは、FasL結合またはAPO-1結合に影響を及ぼさなかった（図4A）。アゴニスト抗体またはFasLを結合しなくても、Pt2突然変異体は、Pt6デスドメイン突然変異体とほとんど同じ程度に効率よく、Fas誘導アポトーシスにドミナントに干渉した（図4B）。コトランスフェクト細胞の表面染色は、WT Fasだけをトランスフェクトした細胞と比較して、Fas発現量の減少を示さなかったことから、突然変異型Fas分子が正常アレルの発現を阻害した可能性は排除された（36）。このように、ドミナント干渉は、受容体単量体のFasL誘導架橋によるシグナリングという従来のモデルでは説明することができない。なぜなら、このスキームでは、Pt2突然変異型Fas分子は混成受容体複合体の一部にはならないだろうからである。そこで、デスドメインによる偽性相互作用（24、37）を避けるために野生型Fasの細胞質ドメインを緑色蛍光タンパク質（GFP）で置き換えた構築物（HA-Fas 1-210:GFP）を使って、Pt2 Fasと野生型Fasの間のリガンド非依存的相互作用を試験した。完全長Fas受容体とPt2 Fas受容体はどちらも、FasLの非存在下で、Fas 1-210:GFPと共沈した（図4C）。この相互作用は特異的だった。というのも、GFPに融合したTNFRファミリーのもう一つのメンバー・ヘルペスウイルス侵入媒介因子（HVEMΔCD:GFP）は、Fasを免疫沈降させなかったからである。
これらの免疫沈降研究を実行するために、Fugene 6（Boehringer Mannheim）を使用し、製造者の指示に従って、293T細胞のトランスフェクションを行った。細胞を、150mM NaCl、20mM Tris-Cl［pH7.5］、1mM EDTA、5mMヨードアセトアミド、2mMジチオスレイトール（DTT）、10％グリセロール、1％ TRITON X-100およびプロテアーゼ阻害剤（Boehringer Mannheim）中で溶解した。プロテインGアガロースビーズ（Boehringer Mannheim）および正常マウスIgGによる予備浄化後に、1mgの抗GFP（Roche Molecular Biochemicals）およびプロテインGアガロースビーズを使って、タンパク質を免疫沈降した。免疫複合体を溶解バッファーで3回洗浄した。AU1を2μlの抗AU1（Covance）およびプロテインAビーズで免疫沈降した。タンパク質をTris/グリシンゲル（Novex）上で電気泳動し、ニトロセルロースメンブレンに転写し、表示の抗体でブロットした。バンドをSuperSignal WestDura（Pierce）で可視化した。1D画像解析ソフトウェア（Kodak）を使ってデンシトメトリーを行った。
実施例1には、TNFRスーパーファミリーの他のメンバーの特異的自己会合を媒介する「プレリガンドアセンブリドメイン」（PLAD）と呼ばれる保存されたN末端ドメインが記述されている。しかし、FasのN末端は、他のTNFRファミリー受容体に保存されているいくつかの重要なアミノ酸を欠いており、Fasが機能的なPLADを含有するかどうかという問題が生じる。
第1CRDをトランケートまたは除去したN末端Fas突然変異体を構築し、リガンド結合、Fas-Fas会合、およびアポトーシス機能について試験した（図5）。適当なプライマーおよびPwo高忠実度ポリメラーゼ（Roche Molecular Biochemicals）を用いるPCR突然変異誘発法によって、Fasトランケーション突然変異体を作製した。AU-1タグ付き受容体の場合は、Fas CRD1の上流にあたる領域にAU-1タグが前もって挿入されているテンプレートを使用した。HAタグを付加するには、p80のリーダー配列を含有しその後ろにHAタグ配列が続いている修飾pcDNA3ベクターのEcoRI/XhoI部位に、突然変異をクローニングした。点突然変異は、Pfuポリメラーゼの代りにPwoポリメラーゼを使用して、Quickchange技法（Stratagene）で作出した。突然変異を制限酵素マッピングおよび自動配列決定によって確認した。
これらの研究は、第1CRDサブドメイン（39）を構成する成熟Fasタンパク質の最初の43アミノ酸（a.a.）を欠失させると、リガンド結合は実質的に減少するが、APO-1アゴニスト抗体の結合は妨げられないことを示した。CRD1全体をコードする最初の66a.a.を欠失させると、FasLおよびAPO-1の結合がどちらも妨げられた（図5A）。これらの欠失はどちらも、APO-1抗体によって開始されるアポトーシスに、対応する欠陥を示すと共に(図5C）、トランケート鎖と、完全なECDを含有する弁別的にタグ付けされたFas 1-210タンパク質との共沈の消失も示した(図5Bレーン1〜4）。このように、部分的なFasL結合および正常なAPO-1結合にも関わらず、FasのN末端からのわずか43a.a.の除去はアポトーシス誘導を妨げ、これらのトランケート型受容体と野生型Fasとの会合の消失に相関した。66a.a.欠失（CRD1を含む）によるFasL結合の消失は、予想されるFasLとの接触の大半がCRD2およびCRD3中に見出される（22、23）という事実に照らすと、意外だった。これらの結果を、実施例1においてp60およびp80 TNFRで得られた結果と比較して、効率のよいFasL結合および受容体シグナリングを可能にするには、Fas受容体複合体のリガンド非依存的なプレアセンブリが非常に重要であるかもしれないという仮説を立てた。受容体自己会合におけるリガンド結合の必要性をさらに調べるために、FasLにとって決定的なCRD2接触残基を除去するFas点突然変異R86Sを調べた（23）。これは、細胞表面に発現させた場合には、FasLを結合しない（図5A、最下段のパネル）。全体的な受容体構造は、二つの異なるアゴニスト抗Fas抗体による染色が示すとおり、保存され（図5Aおよび（18））、完全なFasとの自己会合は、同時免疫沈降が示すとおり、依然として起こった（図5Bレーン5〜7）。よりいっそう重要なことに、野生型（WT）受容体と同時発現させると、この突然変異体は、FasL誘導アポトーシスに、それ自身はFasLを結合することなく、ドミナントに干渉した（図5D、黒いバー）。同じ細胞においてAPO-1抗体によって誘導されるアポトーシスは、どのトランスフェクションでも損なわれなかったことから、どちらの受容体も細胞表面に機能的に発現されることが示された（図5D、白いバー）。このようにドミナント干渉は、天然および操作Fas突然変異体のどちらによるリガンド結合にも、依存しない。そうではなくて、Fas機能は、自己会合能力と相関する。
生細胞におけるFas受容体自己会合を定量するために、GFPのスペクトル的に異なる突然変異体、シアン蛍光タンパク質（CFP）と黄色蛍光タンパク質（YFP）の間の蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）に基づくフローサイトメトリーおよび顕微鏡アッセイを開発した。CFPおよびYFPは、CFPの放射極大がYFPの吸収極大に近いので、FRETにとって好都合なスペクトル特性を持っている（40）。これらのタンパク質の間で起こるFRETは50Å〜100Åを超える距離では急速に減衰するので、CFP融合タンパク質とYFP融合タンパク質の間にFRETが存在するということは、それらの蛍光タンパク質ドメインが近接していることを示す。CFPおよびYFPに（デスドメインの代りに210番目の位置で）C末端インフレーム融合したFas受容体を、293T HEK細胞にコトランスフェクトしたところ、それらは細胞表面に適切に発現された（36）。
Fasおよび他のTNFファミリー受容体のインフレームCFPおよびYFP融合物を標準的なPCRクローニング技法によって作製し、正しいタンパク質発現をウェスタンブロッティングおよび蛍光顕微鏡法によって確認した。293T細胞に、表示のYFP融合タンパク質コンストラクト1μgと、表示のCFPコンストラクト2μgとをトランスフェクトした。24〜36時間後に、細胞をPBS中に収集し、CFP用に413nmに調整したクリプトンレーザー（Spectrophysics）と、YFP用に514nmに調整したILT空冷レーザーとを使って、FACSvantageサイトメーターで分析した。CFPは470nm/20nm帯域フィルタで検出した。YFPおよびFRETは、それぞれ514nmレーザーおよび413nmレーザーからのシグナルを、546nm/10nm帯域フィルタで検出した。各細胞からの三つのシグナルを全て検出することができるように、細胞を514nmレーザーおよび413nmレーザーで逐次照射した。CFPまたはYFPのみをトランスフェクトした細胞からは目に見えるFRETシグナルがないように、補償を適用した。各試料から50,000イベントを収集し、データをFlowJoソフトウェアパッケージ（Treestar）によって分析した。FRET効率測定の場合は、505〜545nm帯域フィルタを通した5分間の照射によるYFPのブリーチングの前後に、コトランスフェクト細胞からのCFP放射強度を蛍光顕微鏡で測定した。対照実験では、この大強度によってYFPは本質的に完全にブリーチングされ、CFPの直接的ブリーチングはほとんど起こらないことが示された。そのような直接的ブリーチングについて補正した。FRET効率は、式：
E％＝[1−(YFPブリーチ前のCFP放射/YFPブリーチ後のCFP放射)]×100％
を使って算出した。
フローサイトメトリーによって調べた場合、CFPおよびYFP Fas融合タンパク質をコトランスフェクトした細胞のCFP励起は、FRETに起因すると考えられるYFP波長の強い蛍光放射を誘発し（図6A、Fas 1-210:CFP/Fas 1-210:YFP）、YFP発現レベルが高い場合は特にそうであった。陽性対照として、CFPが9a.a.ペプチドリンカーを介してYFPに共有結合されているコンストラクト（CFP-YFP）を利用した（41）。これらの細胞でも、発現レベルと共に直線的に増加する強力なFRETシグナルが検出された。FRETは、デスドメインを持つまたはデスドメインを持たないFas融合タンパク質間に検出されたが、FasとTNFファミリーメンバーTNFR1またはHVEMとの間には検出されなかった（図6AおよびB）。PLADをトランケートまたは除去するN末端トランケート型のFasは、Fas 1-210と同時発現させた場合、FRETシグナルを減少させた（図6B）。これら異なる受容体突然変異体間のFRET効率を定量するために、FRETのもう一つの特徴である、YFPアクセプター分子を選択的にフォトブリーチングした後のCFP脱消光（dequenching）（40、24）を、顕微鏡に基づいて測定した（図6C）。デスドメインを欠くFasはそれ自身と会合してFRETをもたらし、観測されたその効率は16％だった。両分子上にデスドメインがあると、FRET効率は27％に上昇し、デスドメインのオリゴマー化特性を示した（42）。Pt2 Fasは、Fas 1-210に匹敵するFRET効率を与え、ほぼ正常な自己会合を示したが、Fas 43-210ではシグナルが減少し、Fas 67-210では有意なFRET効率は見られなかった。これらの結果は、Fas分子が細胞表面上で特異的に自己会合することと、この性質がPLADに依存することを示唆している。
非トランスフェクトTリンパ球の表面上でネイティブFas受容体が自己会合するかどうかを調べるために、化学架橋研究（図7）を行った。細胞不透過性のチオール切断可能な架橋剤3,3'-ジチオビス[スルホスクシンイミジルプロピオネート]（DTSSP）の添加により、脱糖鎖細胞溶解物中のFasの見掛けの分子量は、Fas三量体の形成に対応して45kDから140kDにシフトした（図7Aレーン2）。デンシトメトリーで単量体バンドと比較したところ、Fas鎖の60％が三量体として架橋されることが示唆された。ジチオスレイトール（DTT）で架橋剤を切断すると、これらの三量体型複合体の大半が、ユニット状態に戻った（図7Aレーン5〜8）。DTSSPが誘導する複合体は、化学的架橋を行わずにAPO-1アゴニスト抗体またはFasLで刺激した後に見出されるものと似ていた（図7Aレーン3〜4）（25）。アゴニストが誘導する複合体は、DTTを使った還元によって示される分子間ジスルフィド結合で連結された（図7Aレーン7〜8）。これらの細胞から得られる免疫沈降Fasシグナリング複合体を調べたところ、抗体またはリガンド刺激が、FADDおよびカスパーゼ-8の動員を誘発し、カスパーゼ-8のタンパク質分解によるその41kD型および43kD型への加工（図4B）ならびにポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ（PARP）のカスパーゼ依存的切断（図7C）につながることが示された。しかし、DTSSPで処理した細胞中のシグナリング複合体は中等度のFADD会合を示したものの、カスパーゼ-8結合またはカスパーゼ-8プロセシングや、PARP切断は示さなかったことから、プレ会合した受容体複合体の化学的架橋はアポトーシスシグナリングを誘発するのに十分でないことが示された。興味深いことに、DTSSPによる前処理は、その後のAPO-1処理に呼応する活性シグナリング複合体の形成を妨げた（図7B）。これらの結果は、Fas受容体の非共有結合的プレ会合が過剰発現に依存しないことを示している。リガンド結合は、分子間ジスルフィド結合形成および細胞内シグナリングに関連する受容体複合体の構造変化を誘発する。Fas受容体の化学的架橋は、プレ会合した複合体を非シグナリング状態で捕捉するようである。
適切なFas受容体機能には、保存されたN末端PLADが必要だったので、これは、ALPSにおけるドミナント干渉に重要な役割を果たしているかもしれない。米国国立衛生研究所で研究された多数のALPS患者の構造、ドミナント干渉（DI）およびFas-Fas自己会合（SA）を比較することにより（29、33〜35）（図8）、Fasの細胞外部分または細胞内部分に影響する突然変異を含めて、疾患に関連するドミナント干渉性突然変異の全ての例で、PLADは保存されていることがわかった。Pt1およびPt20では、突然変異が、成熟Fasタンパク質の最初の57a.a.および62a.a.しかコードしていない中途終止ポリペプチドを生成させることから、ドミナント干渉にはPLADそれ自体で十分であることが示唆された（図8A）。デスドメインの全部または一部を除去するか（Pt5、30または33）、そのFADD結合機能を点突然変異によって妨げると（Pt3、6、26、29、または31）、強力なドミナント干渉性Fas分子が生成する（29）。そこで、デスドメインを取り除くFasの人工終止突然変異体（Fas 1-210）によるドミナント干渉に、PLADが必要かどうかを調べた。結果は、どちらのN末端トランケーションも、Fas 1-210によるドミナント干渉を打ち消すことを示した（図8B）。ALPS患者由来のFasデスドメイン点突然変異体（ALPS Pt26、D244V）におけるPLADのトランケーション（a.a.42までの欠失）により、この天然突然変異体のドミナント阻害作用は排除された（図8B）。
これらの知見は、全体として、ALPSにおけるFas突然変異が正常なFas機能にドミナントに干渉する機序を再定義する。ドミナント干渉性Fas突然変異がN末端PLADを保持することは、現在では明白である。なぜなら、このドメインが、野生型Fas分子と突然変異型Fas分子の間で起こる複合体形成の原因だからである。遺伝的ドミナント干渉の中心をなす分子原理は、突然変異型タンパク質が特異的な機能的複合体中で野生型タンパク質と物理的に相互作用しなければならないということである（43）。かねてより、ヒト疾患と関連するドミナントネガティブ受容体突然変異は、リガンドを隔離すること、または細胞内シグナリングを遮断すること、または細胞表面へのWT鎖の輸送を妨げることによって、正常な受容体シグナリングに干渉することが示されていた（44）。Fasの場合、ドミナント干渉は、PLADが媒介する野生型受容体と突然変異型受容体の間の会合がリガンド結合に先だって起こる新しい機序に起因することを、データは示している。これらの知見は、ALPS Pt2における異常Fasタンパク質および他のFas ECD突然変異体が、FasLに結合できないにもかかわらず、疾患を引き起こすのに十分なドミナント干渉を発揮できる理由を説明している。PLADが媒介する相互作用は、Fasのデスドメインに影響を及ぼす突然変異を保有する数多くのALPS患者におけるドミナント干渉性相互作用の説明にもなる。というのも、デスドメインが欠失または突然変異しているFas分子のドミナントネガティブ機能は、PLADを除去することによって妨げられたからである。PLAD相互作用は、いずれもこのドメインを含む可溶性選択的スプライス型のFasによるFas誘導アポトーシスの下方調整にも関与しそうである（45）。機能的なPLADをコードしない天然の受容体突然変異体は、ドミナント干渉性ではないと予想される。PLADが媒介するドミナント干渉は、デコイ受容体によるシグナリングの調整（20）、およびTNFRファミリーの他のメンバーにおけるヘテロ接合型遺伝子異常による疾患の病理発生過程にも、役割を果たしうる。
これらの結果は、Fasによる膜貫通シグナリングを理解するための新しいモデルであって、リガンドが誘導する個々の受容体鎖のオリゴマー化ではなく、プレ会合した三量体の、リガンドによるシグナリング状態への変換を伴うモデルも示唆している。FRET研究により、リガンドの非存在下における細胞表面でのCFPおよびYFPタグ付きFas分子間の距離を推定することができる。ランダムに配向したCFPおよびYFPの場合、フェルスター半径R0は50Åである（23）。Fasに融合されたCFPとYFPが等しく発現され、互いに対してランダムに配向し、かつ等辺三量体中にランダムに取り合わされると仮定すると、観測されたFRET効率（図3C）は、CFP発色団とYFP発色団の間の距離について、完全長Fas分子に融合されている場合で57Å、Fas 1-210に融合されている場合で65Åという上限を示唆している。これらの距離は、細胞表面上にランダムに分布した分子で観測されるであろう距離よりもはるかに近く、特異的であった。というのも、Fasと他のTNFRファミリー受容体との間にFRETは観察されなかったからである。FRETがある閾レベルのYFP発現を必要としたという事実（図3A、FAS1-210:CFP/FAS1-210:YFP）は、CFP標識FasとYFP標識Fasの混合の統計を反映しているのかもしれないし、あるいはプレ会合に関する受容体密度への実際の依存性を反映しているのかもしれない。プレ会合はFasシグナリングを強化するので、Fas発現の変化または他の手段による受容体プレ会合量の調節は、アポトーシスシグナリングを調整するための新しい機序である。
受容体複合体再配列によるシグナリングは、リガンドに対する迅速かつ特異的な細胞応答を確保するために広く用いられている機序であるかもしれない。しかしこのシグナリング機序は、天然の受容体変異体またはALPSにおける病原性ヘテロ接合型突然変異によるドミナント干渉への感受性も付与する。
方法
マウスおよび試薬．BALB/c、C57BL/6、DBA/1J、C3H/HeJ、C3H/HeN、TNFR1およびTNFR2ノックアウトマウスはJackson Laboratoryから購入した。TNF-αトランスジェニックマウスはTaconicから購入した。6〜8週齢の雄マウスを全ての実験に使用し、NIAID（NIH）の免疫学研究室（Laboratory of Immunology）の動物施設で飼育した。CpG DNAはCBERによって合成された。CpG DNA 1668配列は、5'-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3'（配列番号61）である（50）。P60 PLAD（1H11）またはP80 PLAD（3H11）に対するマウスモノクローナル抗体（MAb）は、P60 PLADおよびP80 PLADを使って作製した。
PLAD-GST融合タンパク質の精製．PLAD-GST融合タンパク質のクローニングと精製は、確立された手法に従って行った（78）。精製PLAD-GST融合タンパク質を、4-20％Tris-グリシンゲルおよび質量分析法で確認し、-80℃で保存した。Detoxi-Gel AffinityPakカラム（Pierce）を使ってLPSを除去した。
P60およびP80 PLADタンパク質のインビトロ試験．L929細胞をトリプシン処理後に収集した。細胞を異なる用量のPLADタンパク質で30分間前処理してから、TNF-α（2ng）を加えた。42.3細胞をPLADタンパク質またはGSTで同様に前処理した。30分間の前処理後に、TNF-α（3ng）、Fasに対する抗体（11）（10ng）、およびプロテインA（20ng）を加え、37℃でインキュベートした。表示の時点で、血球計またはフローサイトメトリーにより、細胞死の定量を行った。TNF-α結合は、製造者のプロトコール（R&D systems）に従って測定した。
PLADタンパク質の免疫原性および半減期．ELISAを使って、PLADタンパク質のインビボでの免疫原性と半減期を調べた。どちらのPLADタンパク質も抗体応答を誘発することができ、そのうちの少なくとも半分は、GST部分に向けられた（追補（Supplementary）図5a）。P60またはP80 PLADタンパク質の生体内半減期を、さまざまな時点で採取した血液でのELISAによって測定したところ、約5時間だった（追補図5b、c）。
TNF-α、CpG DNAが誘発する関節炎の発症とPLADタンパク質処置．TNF-α、CpG DNAまたはLPSを、100μgのPLADタンパク質と共に、またはPLADタンパク質なしで、マウスの膝関節に関節内注射した。注射の3日後にマウスを屠殺し、組織病理学的検査のために関節を摘出した。
CIAの誘導とPLADタンパク質による処置．等体積の完全フロイントアジュバント（Sigma）で乳化したニワトリII型コラーゲン（Sigma）を、II型コラーゲン100μgを含有するエマルション0.1mlを使って、雄DBA/1Jマウスの尾の基部に皮内注射した。21日目に、等体積の不完全フロイントアジュバント（Sigma）で乳化したII型コラーゲン100μgで、マウスを追加免疫した。PLADタンパク質またはPBSによる予防的処置を、一次免疫の22日後に開始し、52日目まで週3回、盲検的に腹腔内投与した。P60 PLADタンパク質またはPBSによる治療的処置は、マウスが関節炎を既に発症してしまってから3日の後に開始した。P60 PLADタンパク質（400μgを一日おきに投与）を2週間にわたって腹腔内投与してから、処置を群間で交換した。この「盲」検では、処置を知らない二人の独立した実験者が三日ごとにマウスを分析し、関節炎の程度、すなわち足の腫脹および臨床スコアを評価した。関節腫脹はキャリパーで足の厚さを測定することによって決定した。臨床的関節炎は以下の尺度を使って評価した：グレード0、腫脹なし；グレード1、わずかな腫脹および紅斑；グレード2、顕著な腫脹；グレード3、関節硬直。各肢を0〜3のスコアに分類したので、各動物がとりうる最大スコアは12である。
関節の組織病理学的検査．ルーチンの固定、組織の脱灰およびパラフィン包埋を行った後、関節切片を切断し、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。全てのスライドを符号化し、それらを研究者が盲検的に評価した。滑膜炎、パンヌス形成、または骨/軟骨破壊の程度を、グレード0（炎症の徴候なし）、グレード1（滑膜表層の過形成を伴う軽度の炎症）からグレード2および4（炎症性細胞浸または軟骨および骨破壊の度合いの増加）までの尺度で判定した。
インビトロ破骨細胞形成アッセイ．BALB/cマウスの脛骨から骨髄細胞を抽出し、M-CSFの存在下、α-MEM培地中で培養した。3日後に、PLADタンパク質の存在下または非存在下に、TNF-α（20ng/ml）およびM-CSF（50ng/ml）を使って、4日間にわたり、骨髄マクロファージをさらに誘導させた。次に細胞を固定し、破骨細胞マーカーTRAPに関して、製造者の手法（Sigma）に従って染色した。
免疫蛍光（66）．TNFR1またはTNFR2ノックアウトマウスの脾臓から単離された単核球を、インビトロで、TNFα（P60およびP80 PLADタンパク質の添加ありまたはなし）で処理した。固定し透過処理した細胞を、NF-κB p65に対するウサギ抗体（C-20、Santa Cruz）で染色した。次に細胞を洗浄し、FITCコンジュゲートロバ抗ウサギ抗体と共にインキュベートした。共焦点顕微鏡で、盲検的に、核NF-κBを分析し、採点した。
統計解析．郡内の発生率と重症度の相違を、それぞれフィッシャー検定およびマン・ホイットニーのU検定で解析した。P≦0.05を有意とみなした。
結果
組換えPLAD-GST融合タンパク質
ヒトP60またはP80 TNFRのPLADドメインを含有する可溶性タンパク質を得るために、グルタチオン-S-トランスフェクラーゼ（GST）融合タンパク質を作製した。アフィニティ精製により、完全長分子量がそれぞれ34kDおよび33kD（すなわちアミノ酸配列に基づく予想サイズ）であるP60およびP80 PLAD-GST融合タンパク質を得た（図1bおよび追補図1）。ウェスタンブロットと、質量分析法によるタンパク質配列決定とを行って、ゲル中の両バンドがP60またはP80 PLADタンパク質であることを確認した（図1c）。
PLADタンパク質はTNF-α誘導細胞死を阻害する
この実験は、L929細胞に対するTNF-αの細胞変性作用を精製PLADタンパク質が阻害するかどうかを決定するために行った（63）。精製P60 PLADタンパク質は、明らかに、マウスおよびヒトTNF-α誘導細胞死を用量依存的に阻害した（図2a、b）。その保護はインフリキシマブおよびエタネルセプトに匹敵した（追補図2）。これに対し、対照CD40 PLADタンパク質は効果がなかった(図2c）。TNF-αによって誘導される細胞死を起こすにはP60とP80の両方からのシグナルを必要とするヒト42.3細胞（15）も試験した。P60またはP80 PLADタンパク質はどちらもTNF-α誘導細胞死を阻害したが、抗Fas誘導細胞死は阻害しないことがわかった（図2d）。GST単独のタンパク質は、TNF-α誘導細胞死も抗Fas誘導細胞死も阻害しない。また、P60 PLADタンパク質は、L929細胞におけるTNF-α誘導カスパーゼ-8活性化も、エタネルセプトまたはインフリキシマブと同じぐらい効果的に阻害した（図2e）。このように、精製ヒトP60またはP80 PLADタンパク質は、ヒトまたはマウスTNF-αを効率よく遮断した。
P60 PLADはTNF-αまたはCpG DNAが誘導する関節炎を阻害する
PLADタンパク質がTNF-α誘導関節炎をインビボで阻害できるかどうかも調べた。マウスTNF-α（45ng）（PLADタンパク質100μgの添加ありまたはなし）の関節内注射によって関節炎を誘導した。P60 PLADタンパク質は、滑膜炎、パンヌス、および骨びらんを含むTNF-α誘導関節炎の特徴を、強力に阻害した（図3a、b）。これに対し、P80 PLADまたはGSTタンパク質のみは、疾患に有意な影響を及ぼさなかった（図3a、c）（追補図3a）。
TNF-αはSAの病理発生に重要な役割を果たす（49、50、61）。CpG含有細菌DNAおよびLPSは、関節炎を誘発しうる単球およびマクロファージからのTNF-α放出を強く誘導する細菌構成要素である（49、61）。P60 PLADタンパク質100μgの同時注射は、CpG DNA誘導関節炎におけるパンヌスおよび骨破壊を有意に減少させることができたが（P＜0.05）（図3a、d）、100μgのP80 PLADはそうではなかった（追補図3b）。P60 PLADタンパク質はLPS誘導関節炎を有意に減少させることができたが、P80 PLADタンパク質はできなかった。
P60 PLADはコラーゲン誘導関節炎（CIA）におけるMMP発現を阻害する
マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）は、関節炎中に起こる軟骨および骨の破壊の重要な媒介因子であり、MMP発現はTNFαによって誘導されうる。そこで、この実験では、P60-PLADタンパク質がCIAにおけるMMP発現を阻害するかどうかを検討した。結果は、P60 PLADがCIAにおけるMMP発現を有意に阻害することを示した（図25）。左側パネルにおける濃い（元のカラースライドでは茶色の）染色はMMP発現を示すことに注意されたい。
P60 PLADはコラーゲン誘導関節炎（CIA）におけるiNOS発現を阻害する
一酸化窒素（NO）は、短寿命のフリーラジカルガスである。過剰な一酸化窒素は有毒であり、慢性の炎症を引き起こす。重要なことに、TNFαは、誘導性一酸化窒素シンターゼ（iNOS）を活性化することにより、マクロファージ/単球を刺激して一酸化窒素を産生させ、NOレベルを増加させることにより、局所的な関節損傷を引き起こしうることが示されている。そこで、P60-PLADタンパク質がCIAにおけるiNOS発現を阻害するかどうかを決定した。結果は、P60-PLADタンパク質が、CIAの患部関節におけるiNOS発現を、著しく阻害することを示した（図26）。左側のパネルにおける濃い（元のカラースライドでは茶色の）染色はiNOS発現を示すことに注意されたい。これらの結果は、P60 PLADが、TNFRアセンブリに干渉することによって、CIAにおけるTNFα誘導組織損傷を遮断するという本明細書の教示内容を、裏付けている。
結論
これらの結果は、TNFR1中のPLADが重要な治療標的であることを実証している。CD95 PLADはドミナント干渉を媒介することによってALPSの病理発生に関与することが見出された（11）。P60およびP80 PLADタンパク質は、TNF-αに直接結合するのではなく、TNFR1へのTNF-αの結合を遮断する。最も重要なことに、P60 PLADは、全身投与および関節内投与による関節炎のいくつかのマウスモデルにおいて、顕著な改善作用を示した。さらにまた、関節の炎症性細胞浸潤も、P60 PLAD処置によって著しく減少した。先の例では、P60およびP80のPLADは、ホモタイプ結合に関して選択的であり、互いにまたはCD95 PLADとは交差結合しないことが見出された（11、53）。これらの実験により、P60およびP80 PLADは、完全に特異的というわけではないかもしれないが、対応する受容体に対して優先的な作用を持つことが実証された（図5e、f）。さらにまた、P60 PLADは、関節炎のいくつかのマウスモデルにおいて、疾患過程の重要な側面を阻止することができる。本発明者らのデータは、全体として、PLADが関節炎の重要な薬物標的であることを示している。
P60 PLADタンパク質は、TNF-αによるNF-κB誘導を、強力に阻止した。P60およびP80 PLADタンパク質は、TNF-αが誘導するNF-κBのトランスロケーションを、受容体優先的に阻害することができる。さらにまた、RNAKLが誘導する破骨細胞形成には、NF-κBが必要である（71）。破骨細胞が媒介する骨および軟骨びらんは、関節炎における永続的損傷の大半を引き起こす（67、68、69）。これらの結果は、TNF-αトランスジェニックマウスにおけるパンヌスおよび骨破壊の部位で起こる破骨細胞活性化を示している。また、TNF-αトランスジェニックマウスおよびコラーゲン誘導関節炎の関節炎関節では、RANKおよびRANKLが豊富に発現していた（69）。P60 PLAD処置は、表層およびパンヌス中のRANKおよびRANKLを劇的に減少させた。
インフリキシマブおよびエタネルセプトはどちらも、TNF-αに直接結合してその作用を遮断することができ、現在、これらは、RAおよび他の疾患の処置に広く使用されている（48）。しかし、狼蒼様疾患、放線菌感染症、およびリンパ腫の発生率の増加などの副作用が観察されている（72〜75）。どちらの薬物も、両TNFRへのTNF-α結合を直接遮断する。したがってこれらは、TNFR1の病原作用を阻止すると同時に、TNFR2によって媒介される潜在的に有益な作用を阻害しうる。P60 PLADは、TNFR1を優先的に標的としうる小さなタンパク質ドメインである。本発明者らのモデルでは、約4mg/kg（関節内）または16mg/kg（非経口）の用量のP60 PLADタンパク質が、関節炎の改善に臨床的に用いられてきたインフリキシマブ（10mg/kg）（76）およびエタネルセプト（0.4mg/kg）33の用量と、類似する作用を持っていた。P60 PLADタンパク質は、RAに有用な、TNF-αの病原作用を阻害するための新しいアプローチを提供する。
PLADタンパク質はTNF受容体に直接結合する
PLADタンパク質がTNFRに直接結合するかどうかを決定するために、P80-PLADタンパク質をエタネルセプト（TNFR2の細胞外ドメイン全体を含有するTNFR2融合タンパク質）と混合し、P80 PLADタンパク質と混合することによって試験した。免疫沈降（IP）およびウェスタンブロット（WB）の結果は、P80-PLAD-GSTタンパク質はエタネルセプトと会合できるが、GST単独のタンパク質はエタネルセプトと会合できないことを示す。これは、PLADタンパク質がTNFRに直接結合し、それゆえにTNFα活性を阻害することを示している（図24）。
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 *p60特異的モノクローナル抗体クローンMAB225（R&D Systems）の染色。値は、MAB225陽性細胞のパーセンテージをHA陽性細胞のパーセンテージで割ることにより、HAエピトープタグの染色に対して標準化した。†p60特異的モノクローナル抗体クローン4.12（Zymed）による染色をHA染色に対して標準化した。‡ビオチン化型のTNFαを使ってTNFα結合を決定し、HA染色に対して標準化した（25）。§記述されているように293T一過性トランスフェクションでの免疫沈降アッセイによって自己会合を決定した（12）。NT、未検。||ドミナント干渉を記述されているように決定した（26）。p60ΔCD-HA突然変異体によるドミナント阻害はp60ΔCD野生型の少なくとも50％だった（+）。p6055-211、KY19/20AAおよびK32Aは、どの実験でも、TNFが誘導する死からの保護を付与しなかった（＜5％）（-）。p60ΔCDへの抗体およびTNFα結合を、恣意的に1とする。結果は3回の実験を代表している。
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本願の全体にわたってさままざまな刊行物に言及するが、それら刊行物の開示は、本発明が属する技術分野の状況をより完全に説明するために、参照によりそのまま本願に組み入れられる。
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リガンド非存在下のTNFRオリゴマーを図示している。TNFαで処理したまたはTNFαで処置していないH9 T細胞リンパ腫を、DTSSPによる架橋に付した（7）。全細胞溶解物を、表示のとおり、非還元条件下（レーン1〜4、9〜12）または還元条件下（レーン5〜8、13-16）で電気泳動し、p60またはp80 TNFRについてブロッティングした。角括弧は、三量体（T）および単量体（M）の位置を示す。丸印は抗p80抗体と交差反応する非特異的タンパク質を示す。これらの結果は、3回の独立した実験を代表している。 特異的なp60 TNFR自己会合を図示している。293T細胞に、p60ΔCD-GFP-HA（レーン1〜3）またはpEGFP-N1（レーン4〜6）およびpcDNA3（レーン1、4）、p60ΔCD-HA（レーン2、5）またはHVEMΔCD-HA（レーン3、6）のいずれか一つをトランスフェクトした。抗GFP抗体（上段の2パネルでGFP IP）で免疫沈降を行い、表示のとおり抗HA抗体（HA WB）または抗GFP抗体（GFP WB）でブロッティングした。上段および中段のパネルは、沈降したp60ΔCD-GFP-HA（またはGFP）およびp60ΔCD-HAを、それぞれ示している。下段のパネルは細胞溶解物中のp60ΔCD-HAおよびHVEMΔCD-HAタンパク質を示している。これらの結果は5回の実験を代表している。 特異的なp80自己会合およびプレリガンドアセンブリドメイン（PLAD）の定義を図示している。上端に示すプラスミドを293T細胞にトランスフェクトした。完全長p80だけを認識するC末端特異的抗p80抗体（p80 IP）を使って免疫沈降を行った（上段および中段のパネル）。溶解物中のトランケート型p80またはp60タンパク質の発現を、下段のパネルに示す。ウェスタンブロットは、抗HA抗体（上段および下段のパネル）ならびにC末端特異的抗p80抗体（中段のパネル）を使って行った。白丸は糖鎖付加型および非糖鎖付加型のp80を表す。黒丸はIg重鎖を意味する。 PLADが受容体の自己会合にとって十分であることを図示している。p80ΔCD-GFP-HA（レーン1〜5）を、各レーンの上端に示すプラスミドと共に、293T細胞にトランスフェクトした。抗GFP抗体を使って免疫沈降を行い、抗HA抗体を使ってウェスタンブロットを行った。共沈したDCDタンパク質および総細胞溶解物におけるそれらの発現を、それぞれ中段および下段のパネルに示す。上段のパネルは沈降したp60ΔCD-GFP-HAタンパク質を示している。 PLADがTNFα結合にとって不可欠であることを図示している。ヒストグラムは、表示したコンストラクトをトランスフェクトした293T細胞における、トランスフェクトされた受容体の発現（抗HA染色による）と、TNFαへのそれらの結合を示している（25）。x軸は蛍光の強度を示し、y軸は細胞数を示す。表示の数字は、ベクタートランスフェクト対照と比較した陽性集団のパーセンテージである。
PLADにおける残基の置換が自己会合を妨げることを図示している。293T細胞に表示のプラスミドをトランスフェクトした。図1と同様に抗GFP抗体を使って免疫沈降を行った。抗HA抗体を使ってウェスタンブロットを行った。上段および中段のパネルは、沈降したp60ΔCD-GFP-HA（白丸）およびp60ΔCD-HA突然変異型タンパク質（角括弧）を、それぞれ示している。下段のパネルは、細胞溶解物中のp60ΔCD-HA突然変異体（角括弧）およびHVEMΔCD-HA（黒丸）の発現を示している。 蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）によって実証されるp60およびp80 TNFRのホモタイプ自己会合を図示している。表示のCFP（上側）およびYFP（下側）プラスミドペアをトランスフェクトした293T細胞のフローサイトメトリー分析のヒストグラム。破線はCFPだけをトランスフェクトした対照を表し、実線はTNFαなしのFRETを表し、太線はTNFαありのFRETを表す。x軸およびy軸は、それぞれ、FRET蛍光強度および細胞数を表す。全ての細胞がYFP陽性でもあるCFP陽性集団でFRETを分析した。FRETは、CFPの励起によるYFPの蛍光放射と定義される。これらの結果は独立した4回の実験を代表している。
TNFRスーパーファミリーの代表的メンバーについて、CRD1（p60のCRD1（配列番号22）、p80のCRD1（配列番号23）、LTβRのCRD1（配列番号24）、CD40のCRD1（配列番号25）、HVEMのCRD1（配列番号26）およびCD30のCRD1（配列番号27））の配列アラインメントを示す（26）。この図は、ジスルフィド結合を形成し、TNFRスーパーファミリーのメンバーたる資格を与えるシステインリッチドメインを定義する、高度に保存されたシステインの位置を図示している。 他のTNFRスーパーファミリーメンバーにおける受容体自己会合を図示している。DR4ΔCD-GFP-HA（レーン1〜4）またはCD40ΔCD-GFP-HA（レーン5、6）のどちらか一方を、p80ΔCD-HA（レーン1、6）、p60ΔCD-HA（レーン2）、HVEMΔCD-HA（レーン3）、DR4ΔCD-HA（レーン4）またはCD40ΔCD-HA（レーン5）と共に、293T細胞にトランスフェクトした。免疫沈降とウェスタンブロットを、それぞれ、抗GFP抗体および抗HA抗体で行った。上段のパネルは免疫複合体中の沈降タンパク質を示し、下段のパネルは細胞溶解物中のDCDタンパク質の発現を示す。黒丸はGFP融合タンパク質を意味し、矢印は免疫複合体中のDCDタンパク質を示す。 FRETによって実証されるDR4およびCD40の特異的受容体会合のフローサイトメトリー分析を示す。表示のCFP（上側）およびYFP（下側）プラスミドペアによるトランスフェクションを、図2Bと同様に行った。破線は、CFPのみによるバックグラウンドFRETを表し、太線はCFP融合タンパク質とYFP融合タンパク質がどちらも存在する場合のFRETを表す。どの群についても、x軸はFRET強度であり、y軸は細胞数である。 プレ会合した三量体複合体に基づくTNFRシグナリングの二つのモデルを図示している。プレアセンブリ鎖再配列モデル（左側）の場合、楕円はCRD（CRDには膜遠位から膜近位に向かって順に1〜4の番号が付与される）を表し、斑点付きの四角形は細胞質ドメインを示す。受容体を形質膜に対して垂直に見ている。ローマ数字は三量体複合体中の鎖を表す。三量体クラスター化モデル（右側）の場合、灰色の記号は、細胞表面上のプレアセンブルTNFR三量体を示し、丸で囲んだ三角形は三量体型TNFαを表す。数字1〜3は、プレアセンブルした三量体複合体中の受容体の三つの鎖を表す。受容体を形質膜に向かって見下ろしている。
病原性Fas突然変異が、リガンド結合の非存在下で、ドミナント干渉を引き起こすことを示している。野生型（WT）、Pt2（del 52-96）、およびPt6（A241D）Fas分子の表面発現および結合特徴。左側の列は、各受容体タンパク質のN末端に存在するAU-1エピトープタグに関する染色を使った、293T細胞へのトランスフェクションの24時間後における表面発現を示している。中央の列は、同じ細胞を10μg/mlの抗Fasアゴニスト抗体APO-1（Kamiya）で染色したものを示している。右側の列は、修飾ロイシンジッパーによって三量体化するように操作したFasLの結合（抗ロイシンジッパーmAbによる染色で可視化したもの）を示している（FasL染色）。抗体結合はフィコエリトリンコンジュゲート抗マウス抗体を使って可視化した。角括弧は、非トランスフェクト対照と比較した場合に、染色に関して強く陽性な細胞のパーセンテージを示す。各グラフにおいて、太線および細線は、それぞれ、トランスフェクト細胞調製物および非トランスフェクト細胞調製物からのシグナルを表す。ヒストグラムはいずれも、4ディケードの対数蛍光目盛（X軸）対細胞数（Y軸）にプロットした10,000イベントを表す。データは、Flowjoソフトウェア（Treestarソフトウェア）を使って、FACScaliburフローサイトメーターで収集した。 WT Fasとコトランスフェクトされた突然変異型Fas分子によるドミナント阻害を示す。10μgの表示した発現ベクターまたはpCIベクターのみを、トランスフェクト細胞をGFPでマーキングするためのpEGFP-N1（Clontech）5μgと共に、以前述べたようにヒトFasを欠くBW細胞にエレクトロポレートした（15）。24時間後に、表示した量の抗Fas mAb APO-1を、アポトーシス誘導が最大になるように、1/20体積の可溶性プロテインA（Sigma）と共に加えた。フローサイトメトリーでGFP陽性生細胞を数え上げ、細胞消失量を算出することによって、アポトーシスを定量化した（15）。 Fas分子の自己会合を図示している。C末端デスドメインが緑色蛍光タンパク質で置き換えられているHAタグ付きFas（HAFas 1-210:GFP）をコードする発現ベクターを、野生型（WT）FasおよびEC突然変異型Pt2 Fas(del 52-96)と共にコトランスフェクトした。対照細胞には、WT FasおよびGFPに融合したHAタグ付き細胞質トランケート型のTNF受容体ファミリーメンバー・ヘルペスウイルス侵入媒介因子（Herpesvirus Entry Mediator：HVEMまたはHveA）（HA HVEMΔCD:GFP）を、コトランスフェクトした。実施例で述べるように、細胞溶解物を溶解し、抗GFPで免疫沈降し、電気泳動した。GFPタグ付きタンパク質と共沈した完全長Fas分子を明らかにするために、沈降したタンパク質のブロットを、Fas C末端（C20, Santa Cruz biotechnology）に対するポリクローナル抗血清（抗Fas CT）でプローブした。また、細胞溶解物を、抗HA-HRP（Roche Molecular Biochemicals）および抗Fas C20により、ウェスタンブロット（WB）でプローブして、これらのタンパク質の総量を定量した。白丸は免疫沈降物中のIgG重鎖を示し、黒丸はWT Fasを示し、矢印はトランケート型Pt2 Fasタンパク質を示す。抗Fas C20でブロッティングした一部のレーンにおける上部のバンドは、糖鎖付加型Fasを表す。
PLADまたはリガンド結合を欠くFas突然変異体の発現および機能を示す。N末端Fas突然変異体によるAPO-1およびFasLの結合。表示したHAタグ付きFas突然変異体、R86S Fas突然変異体、およびC末端トランケート型HAタグ付きTNFR2（TNFR2）による対照トランスフェクションの染色を、細胞表面上の各突然変異体の総発現量を示すために抗AU1の代りに抗HAを使用した点を除いて、図1Aと同様に行った。 Fas細胞外ドメインの相互作用が、タンパク質のN末端領域にあるドメインに依存することを示している。レーン1〜4では、293T細胞に、デスドメインを欠くAU-1タグ付きFas 1-210および表示したHAタグ付きFas突然変異体または対照TNFR2タンパク質（HA TNFR2ΔCD）を、コトランスフェクトした。溶解物を抗AU1で免疫沈降し、共沈したタンパク質を明らかにするために抗HAでプローブした。溶解物中のAU-1 Fas 1-210タンパク質の量を定量するために、FasのN末端に対する抗体による対照ブロット（WB 抗FasN）を示す。これらの結果は、3回の独立したトランスフェクションを代表している。レーン5〜7は、図1Cで用いた手法と同じ手法で、HAFas1-210:GFPによるWT FasおよびFasR86S突然変異体の共沈を示している。白丸は免疫沈降抗体のIg重鎖を示し、黒丸は免疫沈降したFasの位置を示す。 自己会合ドメインを欠くFas分子ではアポトーシスの誘導が失われることを図示している。BW5147マウス胸腺腫細胞に、表示したFas分子の発現ベクター10μgをトランスフェクトした。アポトーシスを500μg/mlの可溶性APO-1で誘導し、図1Bと同様に定量した。 非リガンド結合性R86S Fas突然変異体によるアポトーシスの誘導および阻害を図示している。BW細胞に10μgの各Fas発現ベクターおよび5μgのGFPプラスミドをトランスフェクトした。アポトーシスの誘導および定量は、白いバーで示す試料ではアポトーシスの誘導にAPO-1を使用し、黒いバーでは5％v/v FasL上清を試料に加えた点を除いて、図2Cと同様に行った。
Fas分子間の蛍光共鳴エネルギー移動。表示したコトランスフェクタントにおけるCFPシグナル、YFPシグナルおよびFRETシグナル間の関係を示すドットプロット。CFP融合タンパク質およびYFP融合タンパク質を構築し、293T細胞にトランスフェクトし、FACSVantageサイトメーターで分析した。数字はFRETシグナルを持つCFPまたはYFP陽性細胞のパーセンテージである（右上の象限）。 完全長Fas受容体とN末端欠失Fas受容体とのFRETシグナルの比較。CFP蛍光についてゲーティングした細胞でFRETシグナルのヒストグラムを作成した。YFP蛍光は全てのトランスフェクタント間で同程度だった。太線はコトランスフェクト細胞からのシグナルであり、細線は各ペアのCFPコンストラクトのみからのシグナルである。 表示したCFPおよびYFPペアのFRET効率を、個々の細胞上のYFPの顕微鏡フォトブリーチングによって決定したものを示す（4〜7細胞領域を5回読み取り）。数字は各プラスミドペアについての平均E％および標準誤差を表す。
内在性Fas受容体鎖のプレ会合を図示している。1×107個のH9リンパ腫細胞を架橋剤DTSSP（Pierce、10mM、4℃で30分の後、10mM Tris-Cl pH8で15分間クエンチする）で処理し、かつ/または、表示した条件下に1μgのアゴニスト抗体APO-1またはFasLで15分間刺激した。抗Fasイムノブロッティングのために、細胞溶解物をN-グリカナーゼ-F（Roche Molecular Biochemicals）で処理してから電気泳動し、抗Fas C末端mAb B10（Santa Cruz Biotechnology）および抗マウスIgG1-HRP（Southern Biotechnology）でプローブした。 表示の試薬で処理した後に細胞を溶解し、免疫沈降し、以前述べたように、FADDおよびカスパーゼ-8についてブロットした（11）。プロカスパーゼ-8の二つのアイソフォーム（p54/52）およびp11カスパーゼサブユニットのタンパク質分解後のカスパーゼ-8切断産物（p43/41）の位置を、矢印で示す。 PARP切断を示す。（A）および（B）で使用した細胞の一部を37℃でさらに4時間培養し、細胞溶解物を抗PARP mAb（Research Diagnostics Inc）でブロッティングした。上側のバンドは115kD完全長PARPであり、下側のバンドは特徴的な85kDカスパーゼ切断断片である。これらの結果は、各条件につき少なくとも3回の独立した実験を代表している。
ドミナント干渉がN末端PLADに依存することを図示している。NIHで研究された家族から選ばれたALPS患者Fas突然変異のアラインメント。「×」印は点突然変異の位置を示している。共沈によって試験した野生型Fasと会合する能力（SA）およびコトランスフェクション研究におけるFas誘導アポトーシスのドミナント阻害（DI）を、記載のとおり示す。患者番号1および患者番号20の突然変異によってコードされるドミナントネガティブPLAD含有ポリペプチドをコードする配列を示す。番号付けはシグナルペプチド後の最初のアミノ酸から開始する。斜体はフレームシスト突然変異によって付加された余分なアミノ酸を表す。 PLADがないとドミナント干渉が起こらないことを図示している。Fas感受性Jurkat Tリンパ腫細胞に、10μgの表示したコンストラクトおよび2.5μgのGFPレポータープラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの18時間後に、表示した量のApo-1を6時間加え、Annexin V-PE（Pharmingen）で染色することにより、アポトーシスを定量した。パーセンテージは、Annexin Vで陽性に染色されるGFP(+)細胞のパーセントである。これらの結果は3回の独立したトランスフェクションを代表している。
p80キメラ受容体またはトランケート体の存在に関する免疫沈降物の分析を示す。表示のプラスミドを293T細胞にトランスフェクトし、収集して、抗p80 COOH末端特異的抗体を使って共免疫沈降を行った。ウェスタンブロット分析で抗HA抗体を使用することにより、免疫沈降物をp80キメラ受容体またはトランケート体の存在について分析した（上段のパネル）。下段のパネルは、全細胞溶解物におけるHAタグ付きタンパク質の発現を示している。 組換え細菌PLADタンパク質の発現を示す。（a）PLADが受容体の三量体アセンブリおよびリガンド結合能力に寄与する方法のモデル。可溶性PLADタンパク質は、個々の受容体鎖と会合し、三量体型受容体アセンブリを妨げ、その結果として、リガンドが誘導するシグナリングを遮断するのだろう。（b）精製GST、P60 PLAD-GST（P60）、およびP80 PLAD-GST（P80）のゲル電気泳動。分子量マーカーとサイズ（単位キロダルトン）を左側に示す。（c）P60 PLAD（上段のパネル）またはP80 PLAD（下段のパネル）に対するモノクローナル抗体（MAb）を使ったウェスタンブロット分析。P60 PLAD（左側のパネル）またはP80 PLAD（右側のパネル）について、元のゲル電気泳動に使用したタンパク質の量（μg数）のタイトレーションを示す。
TNF-α誘導細胞死におけるPLADタンパク質の作用を示す。（a）L929細胞を培地；ヒトTNF-α（hTNF）（2ng）；hTNF-α（2ng）＋P60 PLAD（P60）（40μg）で処理した後にフローサイトメトリーで評価した細胞死。挿入図は位相差顕微鏡写真を示す。右下に、ゲーティングされた生細胞のパーセントを示す。Y軸はヨウ化プロピジウム（PI）染色であり、X軸はFSC（前方散乱光プロファイル）である。死細胞は高いPI染色と低いFSCを示す。（b）マウスTNF-α（mTNF）（2ng）またはhTNF（2ng）とさまざまな用量のPLAD P60（P60）タンパク質とによって誘導される細胞消失。（c）mTNF（2ng）またはhTNF（2ng）とさまざまな用量のPLAD CD40（CD40）タンパク質とによって誘導されるL929細胞の消失。（d）TNF-αまたは抗Fas（P60 PLAD（P60）、P80 PLAD（P80）およびGSTの添加ありまたはなし）で12時間処理した後の42.3Jurkat細胞の消失。TNF-α（3ng）、P60L（低；4.5μg）、P60H（高；15μg）、P80L（低；4.5μg）、P80H（高；15μg）、GST（15μg）、抗Fas（10ng）。（e）mTNF-α（4ng）（P60 PLAD（100μg）、エタネルセプト（25μg）、インフリキシマブ（20μg）の添加ありまたはなし）で処理し、基質変換の光学密度（OD）によって測定した、L929細胞におけるカスパーゼ-8活性。
BALB/cマウスにおけるTNF-αの関節内注射およびC3H/HeJマウスにおける細菌CpG DNAの関節内注射よって誘導された関節炎に対するP60およびP80 PLADタンパク質の作用を示す。（a）膝関節HE染色組織切片の代表的顕微鏡写真：PBS；45ng TNF-α；P60 PLAD（100μg）および45ng TNF-α；P80 PLAD（100μg）および45ng TNF-α；CpG DNA（1nmol）；CpG DNA（1nmol）およびP60 PLAD（100μg）を示す。矢印は炎症巣を示す。ラベルは、C（軟骨）、JC（関節腔）、ST（滑膜組織）、B（骨）であり、矢じりは、滑膜組織の表層（lining layer）を示す。（b、c）TNF-αのみ（TNF）またはTNF-α＋P60 PLADタンパク質（P60）またはTNF-α＋P80 PLADタンパク質（P80）で表示のとおり処置した実験群（n＝5）の滑膜炎、パンヌス、ならびに骨および軟骨のびらんの組織学的分析の定量化。（d）各実験群（n＝5）の滑膜炎、パンヌス、骨および軟骨のびらんの組織学的分析の定量化。これらの分析を少なくとも2回は繰り返した。CpG DNAのみ（CpG）、CpG DNA＋P60 PLAD（P60）。値は平均±標準偏差（s.d.）である。** 対照群に対して処置群がP＜0.01。組織病理学的検査のために関節内接種の3日後にマウスを屠殺した。これは3回の実験を代表している。
DBA/1JマウスにおけるCIAに対するP60およびP80 PLADタンパク質の作用。盲実験（a〜f）。（a）PBSまたはP60 PLADで処置したCIAマウスの足の写真。（b）PBSまたは4週間にわたるP60 PLADタンパク質（100μgを週3回）の腹腔内注射で処置した一次免疫の75日後のCIA関節のHE染色切片。（c）PBS（n＝13匹）（四角形）、P60 PLADタンパク質（P60）（n＝12匹）（菱形）、およびP80 PLADタンパク質（P80）（n＝13匹）（楕円形）で処置したCIAマウスにおける関節炎の重症度；足厚測定；および体重。（d）PBS、P60、およびP80 PLAD処置群における関節炎の発生率。（e）表示のとおり4週間処置したCIAの関節切片における滑膜炎；パンヌス；骨および軟骨のびらんの評価。（f）血清中のIL-1およびIL-6レベル。*＝対照PBS群に対してP＜0.05。（g）PBS（n＝10匹）（四角形）、P60 PLADタンパク質（P60）（n＝10匹）（菱形）、およびエタネルセプト（n＝10匹）（楕円形）を2週間腹腔内注射したCIAマウスにおける関節炎の重症度。*＝対照PBS群に対してP＜0.05。（h）確立したCIAにおけるP60 PLADタンパク質の作用。PBS（n＝9匹）（四角形）、P60 PLADタンパク質（P60、1日おきに400μg）（n＝10匹）（菱形）を2週間腹腔内注射した、確立したCIAマウスにおける関節炎の重症度。*＝対照PBS群に対してP＜0.05。
関節炎関節におけるTNFR発現、ならびにTNF-α結合およびNF-κB活性化のPLADタンパク質阻害を示す。（a）PBSまたはP60 PLADで処置し、75日目に屠殺した、CIAを持つDBA/1Jマウスから得た関節炎関節におけるTNFR1およびTNFR2の免疫組織化学。茶色はTNFR発現細胞を示す。（b）50ngのビオチン化ヒトTNF-α（Bt-TNF-α）およびさまざまな用量のP60 PLADタンパク質前処理で染色した後のフローサイトメトリー。曲線は、Bt-TNF-αのみ、Bt-TNF-α＋3μg P60 PLAD、Bt-TNF-α＋15μg P60 PLAD、Bt-TNF-α＋30μg P60 PLAD、ヒトTNF-α、または陰性対照を表す。（c）表示のとおりエタネルセプト（1μg）、P60（1μg）またはP80（1μg）PLADタンパク質（試験タンパク質）で免疫沈降（IP）した50ng ヒトTNF-αのゲル電気泳動。TNF-αに対する抗体（Ab）を使ったウェスタンブロット。（d）NF-κB用（左側の矢印）またはOCT1用（右側の矢印）の放射線標識オリゴヌクレオチドプローブを使って行った、P60 PLADタンパク質の存在下（+）または非存在下（-）にTNF-αで処理したA3 Jurkat細胞から調製された核抽出物の電気泳動移動度シフトアッセイ。TNFR1（e）またはTNFR2（f）ノックアウト（-/-）マウスの脾臓から単離された単核球における、これらの細胞を、mTNF-α（2ng）（P60（100μg）またはP80（100μg）PLADタンパク質の添加ありまたはなし）でインビトロ処理した後の、NF-κB p65核移行の定量。*＝対照群に対してP＜0.05；**＝対照群に対してP＜0.01。P60処置群とP80処置群の間の差は、それぞれの遺伝的背景で有意に異なる（P＜0.01）。
P60 PLADタンパク質が破骨細胞形成ならびにRANKおよびRANKリガンド（RANKL）発現を阻害することを示す。（a）PBSまたはP60 PLADタンパク質で処置し、コラーゲンによる一次免疫の75日後に屠殺した、DBA/1Jマウスから得た関節炎関節におけるカルシトニン受容体の免疫組織化学の代表的顕微鏡写真。薄い矢印は陽性染色を示す（元のカラースライドでは褐色）。（b）インビトロでのTNF-α誘導破骨細胞形成におけるPLADタンパク質の作用。M-CSFおよびマウスTNF-α（10μg）；マウスTNF-α（10μg）＋32μg P60 PLAD；またはPBSと共に培養した骨髄マクロファージ（BMM）中のTRAP陽性破骨細胞の顕微鏡写真。薄い矢印は酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（TRAP）陽性破骨細胞を示す。表示のとおりさまざまな用量のP60 PLADタンパク質で7日間処理した後のBMM培養物の各ウェルにおけるTRAP陽性細胞を検鏡的に定量したもの。（c）コラーゲンで一次免疫した後、PBSによる処置、P60 PLADタンパク質による処置を行い、75日目に屠殺したDBA/1Jマウスから得た関節炎関節におけるRANKおよびRANKL染色の免疫組織化学の顕微鏡写真。濃い（元のカラースライドでは褐色の）染色は陽性染色細胞を示す。
標準的一文字記号で表したヒトPLAD-GST融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。（a）太字および下線部（アミノ酸残基230〜282）はP60 PLADペプチド配列（配列番号59）である。（b）太字および下線部（アミノ酸残基230〜274）はP80 PLADペプチド配列（配列番号60）である。どちらの配列でも、GSTタンパク質配列はプレーンテキストで示されている。 L929細胞におけるTNF-α誘導細胞死に対するP60 PLADタンパク質の作用を示す。以下の物質で19時間処理した細胞の位相差顕微鏡写真：（a）培地のみ；（b）ヒトTNF-α（2ng）；（c）P60 PLAD（3μg）＋hTNF-α（2ng）；（d）P60 PLAD（30μg）＋hTNF-α（2ng）；（e）インフリキシマブ（1μg）＋hTNF-α（2ng）；（f）エタネルセプト（1μg）＋hTNF-α（2ng）；（g）P80 PLAD（30μg）＋hTNF-α（2ng）。倍率400倍。（h）hTNF（2ng）（P60 PLAD（50μg）、エタネルセプト（1μg）およびインフリキシマブ（1μg）の添加ありまたはなし）によって誘導されるL929細胞の消失。
炎症性関節炎に対するGSTタンパク質およびP80 PLADタンパク質の作用を示す。以下の物質で処置した実験群（n＝5）における滑膜炎、パンヌスならびに骨および軟骨のびらんの組織学的分析の定量化：（a）BALB/cマウスでTNF-α（45ng）のみ（TNF）またはTNF-α（45ng）＋GSTタンパク質（GST、100μg）；（b）C3H/HeJマウスでCpG DNA（1nmol）のみ（CpG）またはCpG DNA（1nmol）＋P80 PLADタンパク質（P80、100μg）。値は平均±s.d.。組織病理学的検査のために、関節内接種の3日後にマウスを屠殺した。これは3回の実験を代表している。（c）P80 PLADタンパク質（100μg）を4週間腹腔内注射した一次免疫75日後のCIA関節の炎症および破壊を示すHE染色切片の顕微鏡写真。倍率200倍。（d）P80 PLADタンパク質で4週間処置したDBA/1JマウスにおけるCIAでの滑膜炎、パンヌス、ならびに骨および軟骨のびらんの組織学的分析の定量化。対照群と比較してP＞0.05。
免疫組織化学の顕微鏡写真。（a）6ヶ月で屠殺したTNF-αトランスジェニックマウスから得た関節炎関節中のTNFR1およびTNFR2。TNFR1パネル中の矢印は、受容体発現を示す濃い（元のカラースライドでは褐色の）染色を示している。TNFR2パネル中の矢印は、軟骨の深部にある軟骨細胞による高いTNFR2発現を示す。（b）6ヶ月齢で屠殺したTNF-αトランスジェニックマウスから得た関節炎関節および対照C57BL/6マウスから得た健常関節中のカルシトニン受容体。（c）6ヶ月齢で屠殺したTNF-αトランスジェニックマウスから得た関節痛関節および正常対照C57BL/6マウスから得た健常関節におけるRANKおよびRANKL染色。濃い（元のカラースライドでは褐色の）染色は、陽性組織化学反応を示す。倍率300倍。
P60 PLADタンパク質の免疫原性および半減期を示す。（a）コラーゲンで一次免疫してから、PBS、P60またはP80 PLADタンパク質で処置し、75日後に屠殺したDBA/1マウスから得た血清中の、精製PLADタンパク質に基づく標準曲線と比較した、抗PLAD P60抗体レベル。GST+は、血清からGST抗体を除去するためにGSTを加えたことを意味する。(b）P60 PLADタンパク質の半減期。（c）P80 PLADタンパク質の半減期。 PLADタンパク質がTNF-α誘導IkBα分解を阻害することを示す。ウェスタンブロットは、TNFR1またはTNFR2ノックアウト（-/-）マウスの脾臓から単離された単核球を、mTNF-α（2ng）により、P60（10、50、100μg）またはP80（10、50、100μg）を添加して、またはそれらを添加せずに、インビトロで5分間（b）、15分間（a）処理した後、またはGST（10、50、100μg）を添加して、またはGSTを添加せずに、インビトロで1時間（c）処理した後の、それら単核細胞におけるIkBα分解を示している。
さまざまな量のエタネルセプトおよびP60 PLADタンパク質で免疫沈降（IP）した50ngのヒトTNF-αの電気泳動を示す。（a）表示のとおりエタネルセプト（10μg）またはP60 PLADタンパク質（100μg）（試験タンパク質）。（b）表示のとおりエタネルセプト（0.1、1、10μg）またはP60 PLADタンパク質（0.1、1、10μg）（試験タンパク質）。矢じりはゲル上のTNFタンパク質の位置を示す。ウェスタンブロッティングは、TNF-αに対する抗体（Ab）を使って行った。 TNFR1の結晶構造（PDB ID：1NCF）の二量体化したPLAD部分を示す。濃い灰色および薄い灰色は、PLAD二量体の個々のペプチド鎖を図示している。各ペプチドからのHis-34のミラー（mirror）イミダゾール環が、円内に描かれている。これら二つのヒスチジンは鎖間ポケットに互いを閉じこめている。
エタネルセプトと混合したP80-PLADタンパク質の免疫沈降（IP）およびウェスタンブロット（WB）を示す。 P60-PLADタンパク質がCIAにおけるMMP発現を阻害したことを示す。左側のパネルの濃い（元のカラースライドでは褐色の）染色がMMP発現を示すことに注意されたい。 P60-PLADタンパク質がCIAにおけるiNOS発現を阻害することを示す。左側のパネルの濃い（元のカラースライドでは褐色の）染色がiNOS発現を示すことに注意されたい。

Claims (33)

  1. TNF受容体様受容体のプレリガンドアセンブリドメイン（PLAD）の単離されたアミノ酸配列を含む38〜125アミノ酸のポリペプチド。
  2. PLADが、TNF-RのPLAD、p60のPLAD、p80のPLAD、Fas（CD95/APO-1）のPLAD、TRAILのPLAD、LTβRのPLAD、CD40のPLAD、CD30のPLAD、CD27のPLAD、HVEMのPLAD、OX40のPLAD、DR4のPLAD、NGFRのPLAD、TroyのPLAD、EDARのPLAD、XEDARのPLAD、DcR3のPLAD、AITRのPLAD、4-1BBのPLAD、DR3のPLAD、RANKのPLAD、TACIのPLAD、BCMAのPLAD、DR6のPLAD、OPGのPLAD、DRSのPLAD、DcR1のPLAD、およびDcR2のPLADからなる群より選択される、請求項1のポリペプチド。
  3. TNF受容体様受容体のプレリガンドアセンブリドメインのアミノ酸配列からなるポリペプチド。
  4. R1-TNF受容体様受容体PLAD-R2（式中、R1またはR2は、天然のTNF受容体様受容体においてTNF受容体様受容体PLADに隣接していないアミノ酸配列を含む）である、TNF受容体様受容体のプレリガンドアセンブリドメイン（PLAD）の単離されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  5. R1-TNF受容体様受容体PLAD-R2（式中、R1はH、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドであり、R2はH、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドである）である、請求項1のポリペプチド。
  6. R1-p60のアミノ酸1〜54-R2（配列番号1）（式中、R1はH、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドであり、R2はH、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドである）である、請求項1のポリペプチド。
  7. R1-p80のアミノ酸10〜54-R2（配列番号2）（式中、R1はH、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドであり、R2はH、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドである）である、請求項1のポリペプチド。
  8. R1-Fasのアミノ酸1〜43-R2（配列番号3）（式中、R1はH、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドであり、R2はH、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドである）である、請求項1のペプチド。
  9. R1-Fasのアミノ酸1〜66-R2（配列番号4）（式中、R1はH、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドであり、R2はH、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドである）である、請求項1のポリペプチド。
  10. R1-LtβRのアミノ酸13〜50-R2（配列番号5）（式中、R1はH、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドであり、R2はH、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドである）である、請求項1のポリペプチド。
  11. R1-CD40のアミノ酸6〜39-R2（配列番号6）（式中、R1はH、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドであり、R2はH、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドである）である、請求項1のポリペプチド。
  12. R1-CD30のアミノ酸11〜51-R2（配列番号7）（式中、R1はH、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドであり、R2はH、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドである）である、請求項1のポリペプチド。
  13. R1-CD27のアミノ酸7〜42-R2（配列番号8）（式中、R1はH、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドであり、R2はH、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドである）である、請求項1のポリペプチド。
  14. R1-HVEMのアミノ酸6〜37-R2（配列番号9）（式中、R1はH、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドであり、R2はH、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドである）である、請求項1のポリペプチド。
  15. R1-OX40のアミノ酸3〜36-R2（配列番号10）（式中、R1はH、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドであり、R2はH、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドである）である、請求項1のポリペプチド。
  16. R1-DR4のアミノ酸109〜138-R2（配列番号11）（式中、R1はH、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドであり、R2はH、アシル、NH2、アミノ酸またはペプチドである）である、請求項1のポリペプチド。
  17. PLADが、TNF-RのPLAD、Fas（CD95/APO-1）のPLADおよびTRAILのPLADからなる群より選択される、請求項3のポリペプチド。
  18. 請求項1のポリペプチドをコードする単離された核酸。
  19. ベクター中の請求項18の単離された核酸。
  20. 前記核酸を発現させるのに適した宿主中の請求項19のベクター。
  21. 有効量の請求項1または3のポリペプチドを投与することによって細胞におけるTNF受容体オリゴマー化を阻害する方法。
  22. 有効量の請求項1または3のポリペプチドを投与することによって細胞におけるFasオリゴマー化を阻害する方法。
  23. 有効量の請求項1または3のポリペプチドを投与することによってTNF受容体様受容体へのリガンド結合を阻害する方法。
  24. 有効量の請求項1または3のポリペプチドを投与することによってFasへのリガンド結合を阻害する方法。
  25. 有効量の請求項1または3のポリペプチドを投与することによって対象における炎症を処置する方法。
  26. 炎症が自己免疫障害に関連する、請求項25の方法。
  27. 炎症が慢性関節リウマチ、変形性関節症または敗血症性関節炎に関連する、請求項25の方法。
  28. PLAD会合の阻害剤を含む組成物。
  29. 阻害剤がTNF受容体様受容体のPLADに特異的に結合する抗体である、請求項25の方法。
  30. 阻害剤がTNF受容体様受容体のPLADである、請求項25の方法。
  31. 可溶性PLADがp60のPLADである、請求項30の方法。
  32. PLAD会合の阻害剤をスクリーニングする方法であって、
    a）蛍光ドナーに機能的に連結された単離されたPLADをコードする核酸配列を含む核酸を含有するプラスミドと、蛍光アクセプターに機能的に連結された単離されたPLADをコードする核酸配列を含むプラスミドとを、細胞にトランスフェクトすること；
    b）その細胞を推定上の阻害剤と接触させること；および
    c）FRETを測定すること
    を含み、推定上の阻害剤と接触させなかった細胞におけるFRET測定と比較したFRETの減少が、PLAD会合の阻害剤の存在を示す方法。
  33. PLAD会合の阻害剤をスクリーニングする方法であって、
    a）単離されたPLADをコードする核酸配列を含む核酸を含有するプラスミドと、第2の単離されたPLADをコードする核酸配列を含むプラスミドとを、細胞にトランスフェクトすること、
    b）その細胞を推定上の阻害剤と接触させること、および
    c）PLAD自己会合を測定すること
    を含み、推定上の阻害剤と接触させなかった細胞におけるPLAD会合と比較したステップb）の細胞におけるPLAD会合の減少が、PLAD会合の阻害剤の存在を示す方法。
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