TW202126335A - 西妥昔單抗(cetuximab)-ir700結合物組合物 - Google Patents
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Abstract
本發明提供酞菁染料IR700及EGFR-結合抗體(諸如西妥昔單抗(cetuximab)抗體)之結合物及其醫藥組合物。在一些態樣中，該等組合物含有EGFR-結合抗體，諸如西妥昔單抗抗體，其係藉由在該西妥昔單抗抗體之重鏈及/或輕鏈內之特定位置結合至IR700染料而修飾。在一些態樣中，此結合物能夠在照射該結合物之後殺死所靶向細胞。本發明亦提供相關製造方法及使用方法，及包括用於治療腫瘤及特定癌症適應症之用途。
Description
本發明係關於酞菁染料IR700及EGFR-結合抗體(諸如西妥昔單抗抗體)之結合物及其醫藥組合物。在一些態樣中，組合物含有EGFR-結合抗體，諸如西妥昔單抗抗體，其藉由在西妥昔單抗抗體之重鏈及/或輕鏈內之特定位置結合至IR700染料而修飾。在一些態樣中，此結合物能夠在照射結合物之後殺死所靶向細胞。本發明亦提供相關製造方法及使用方法，及包括用於治療腫瘤及特定癌症適應症之用途。
各種療法可用於治療疾病，諸如癌症。舉例而言，光免疫療法(PIT)為一種使用結合至抗體或其他靶向分子之光敏劑以靶向細胞表面目標分子(例如細胞表面受體)之方法，以便允許靶向殺死特定細胞。在一些情況下，PIT可選擇性地靶向諸如腫瘤細胞之疾病細胞，且藉此選擇性地殺死此類細胞而不損傷健康細胞。需要經改良的策略以改良用於PIT中之酞菁染料結合物。提供滿足此類需求之組合物及方法。
本文提供結合物，諸如抗體-酞菁染料結合物，例如西妥昔單抗-IR700結合物。在一些所提供實施例中，結合物包括至少兩個IR700分子結合至西妥昔單抗中之至少兩個離胺酸(K)位置，且其中該至少兩個離胺酸位置獨立地選自由以下組成之群：對應於該西妥昔單抗之輕鏈中之位置107之離胺酸(K107)、對應於位置145之離胺酸(K145)、對應於位置188之離胺酸(K188)、對應於位置190之離胺酸(K190)及對應於位置207之離胺酸(K207)及對應於該西妥昔單抗之重鏈中之位置5之離胺酸(K5)、對應於位置75之離胺酸(K75)、對應於位置215之離胺酸(K215)、對應於位置248之離胺酸(K248)、對應於位置292之離胺酸(K292)、對應於位置328之離胺酸(K328)、對應於位置336之離胺酸(K336)、對應於位置416之離胺酸(K416)及對應於位置449之離胺酸(K449)。
在一些實施例中，結合物包括至少三個IR700分子結合至西妥昔單抗中之至少三個離胺酸位置。在一些實施例中，至少三個離胺酸位置係獨立地選自由以下組成之群：輕鏈中之K107、K145、K188、K190及K207及重鏈中之K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416及K449。在一些實施例中，結合至IR700之離胺酸位置中之至少一者係選自由以下組成之群：輕鏈中之K145或重鏈中之K215、K416或K449。在一些實施例中，至少一個IR700分子結合至輕鏈中之離胺酸，且至少一個IR700分子結合至重鏈中之離胺酸。
在一些實施例中，結合物能夠藉由波長在690 nm ± 50 nm之間的光照射而活化且藉此在結合物結合至細胞表面上之抗原決定基時展現細胞殺死活性。
本文亦提供組合物。在一些所提供之實施例中，組合物含有本文所描述之結合物中之任一者及醫藥學上可接受之賦形劑。
本文亦提供組合物，其包括結合物之群體，其中該群體中之結合物包含IR700結合至西妥昔單抗，其中至少或至少約50%、60%、70%、80%、90%或大於或大於約90%之該等結合物包含至少兩個IR700分子結合至該西妥昔單抗中之至少兩個離胺酸(K)位置，且其中該兩個離胺酸位置獨立地選自由以下組成之群：對應於該西妥昔單抗之輕鏈中之位置107之離胺酸(K107)、對應於位置145之離胺酸(K145)、對應於位置188之離胺酸(K188)、對應於位置190之離胺酸(K190)及對應於位置207之離胺酸(K207)及對應於該西妥昔單抗之重鏈中之位置5之離胺酸(K5)、對應於位置75之離胺酸(K75)、對應於位置215之離胺酸(K215)、對應於位置248之離胺酸(K248)、對應於位置292之離胺酸(K292)、對應於位置328之離胺酸(K328)、對應於位置336之離胺酸(K336)、對應於位置416之離胺酸(K416)及對應於位置449之離胺酸(K449)。
在一些實施例中，至少或至少約50%、60%、70%、80%、90%或大於或大於約90%之結合物包含至少三個IR700分子結合至西妥昔單抗中之至少三個離胺酸位置。在一些實施例中，至少三個離胺酸位置係獨立地選自由以下組成之群：輕鏈中之K107、K145、K188、K190及K207及重鏈中之K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416及K449。
在一些實施例中，至少或至少約50%、60%、70%、80%、90%或大於或大於約90%之結合物包含至少一個IR700分子結合至輕鏈中之K145或重鏈中之K215、K416或K449。在一些實施例中，至少或至少約50%、60%、70%、80%、90%或大於或大於約90%之結合物包含IR700分子結合至輕鏈中之K145及IR700分子結合至重鏈中之K215、K416或K449中之至少一者。
在一些實施例中，IR700分子與西妥昔單抗之比率在約2:1至約4:1之間。在一些實施例中，IR700分子與西妥昔單抗之比率為約2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3.0:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1或3.4:1。在一些實施例中，IR700分子與西妥昔單抗之比率在約2.7:1至約3.2:1之間。
在一些實施例中，組合物中不超過或不超過約15%之西妥昔單抗分子未與IR700結合。在一些實施例中，組合物中小於或小於約10%之西妥昔單抗分子未與IR700結合。
在一些實施例中，游離染料在組合物中之百分比小於或小於約3%、小於或小於約2%、小於或小於約1%或小於或小於約0.5%。
本文亦提供組合物，其包括西妥昔單抗-IR700結合物之群體，其中該組合物中複數種結合物各包含IR700結合至西妥昔單抗於西妥昔單抗之輕鏈或重鏈中選自由以下組成之群之離胺酸(K)：對應於該西妥昔單抗之輕鏈中之位置107之離胺酸(K107)、對應於位置145之離胺酸(K145)、對應於位置188之離胺酸(K188)、對應於位置190之離胺酸(K190)及對應於位置207之離胺酸(K207)及對應於該西妥昔單抗之重鏈中之位置5之離胺酸(K5)、對應於位置75之離胺酸(K75)、對應於位置215之離胺酸(K215)、對應於位置248之離胺酸(K248)、對應於位置292之離胺酸(K292)、對應於位置328之離胺酸(K328)、對應於位置336之離胺酸(K336)、對應於位置416之離胺酸(K416)及對應於位置449之離胺酸(K449)，且該組合物包含以下特徵：(a)該組合物中之IR700分子與該群體中之西妥昔單抗分子之比率在約2:1與約3:5之間，(b)小於或小於約10%之西妥昔單抗分子未與IR700結合，及(c)該組合物中之游離染料在該組合物中之所有染料分子中的百分比小於或小於約3%。
在一些實施例中，複數種結合物包含西妥昔單抗在輕鏈之K145與IR700結合。在一些實施例中，複數種結合物包含西妥昔單抗在重鏈之K215、K416或K449與IR700結合。在一些實施例中，複數種結合物包含西妥昔單抗與至少三個IR700分子結合。
在一些實施例中，複數種結合物包含組合物中之至少或至少約51%、至少或至少約55%、至少或至少約60%、至少或至少約70%、至少或至少約75%或至少或至少約80%之結合物。
在一些實施例中，游離染料在組合物中之百分比小於或小於約2%、小於或小於約1%或小於或小於約0.5%。
在一些實施例中，西妥昔單抗包含SEQ ID NO: 1中所述之重鏈序列、SEQ ID NO: 2中所述之輕鏈序列或其組合。
在一些實施例中，在暗處或少光條件下儲存6個月之後，游離染料在組合物中之百分比實質上未改變。在一些實施例中，組合物包含至少或至少約95%、96%、97%或98%單體形式之結合物。在一些實施例中，組合物包含小於或小於約5%、4%或3%高分子量物種。
亦提供關於本文所提供之結合物或組合物中之任一者的方法。在一些實施例中，所提供之方法包括殺死腫瘤或癌細胞之方法。在一些所提供之實施例中，方法涉及在或接近腫瘤或癌細胞之部位投與包含本文中所描述之結合物或組合物中之任一者的醫藥組合物；及在約600 nm至約850 nm之波長以由約25 J cm−2
至約400 J cm−2
或由約25 J/cm光纖長度至約500 J/cm光纖長度之劑量照射接近腫瘤或癌細胞之區域，藉此殺死腫瘤或癌細胞。
亦提供治療個體中之疾病或病況之方法。在一些實施例中，方法涉及在或接近腫瘤或癌細胞之部位投與包含本文中所描述之結合物或組合物中之任一者的醫藥組合物；及在約600 nm至約850 nm之波長以由約25 J cm−2
至約400 J cm−2
或由約25 J/cm光纖長度至約500 J/cm光纖長度之劑量照射接近個體之病灶或腫瘤的區域，藉此治療該疾病或病況。
在一些實施例中，照射步驟係在690 ± 50 nm之波長或在或約690 ± 20 nm之波長進行。在一些實施例中，照射步驟係在約690 nm之波長進行。
在一些實施例中，疾病或病況為腫瘤或癌症。在一些實施例中，腫瘤或癌細胞或疾病或病況為腫瘤，該腫瘤為膀胱癌、胰臟癌、結腸癌、卵巢癌、肺癌、乳癌、胃癌、前列腺癌、子宮頸癌、食道癌或頭頸癌。在一些實施例中，腫瘤或癌細胞或疾病或病況為位於頭頸部、乳房、肝臟、結腸、卵巢、前列腺、胰臟、大腦、子宮頸、骨、皮膚、眼睛、膀胱、胃、食道、腹膜或肺之癌症。在一些實施例中，癌症為頭頸癌。
亦提供製造結合物(諸如本文所描述之西妥昔單抗-IR700結合物)之方法。在一些實施例中，提供製造穩定結合物之方法。在一些實施例中，方法涉及a)使西妥昔單抗與IR700在產生西妥昔單抗-IR700結合物之條件下接觸，其中該結合物包含至少兩個結合至IR700之離胺酸(K)位置，該至少兩個離胺酸(K)位置獨立地選自由以下組成之群：對應於該西妥昔單抗之輕鏈中之位置107之離胺酸(K107)、對應於位置145之離胺酸(K145)、對應於位置188之離胺酸(K188)、對應於位置190之離胺酸(K190)及對應於位置207之離胺酸(K207)及對應於該西妥昔單抗之重鏈中之位置5之離胺酸(K5)、對應於位置75之離胺酸(K75)、對應於位置215之離胺酸(K215)、對應於位置248之離胺酸(K248)、對應於位置292之離胺酸(K292)、對應於位置328之離胺酸(K328)、對應於位置336之離胺酸(K336)、對應於位置416之離胺酸(K416)及對應於位置449之離胺酸(K449)；b)使該結合物在結合期間及/或之後經受一個步驟，該步驟實質上減少與該西妥昔單抗非特異性結合之IR700；c)在醫藥學上可接受之緩衝液中調配該結合物，其中在步驟a)至c)中之每一者中，該染料及結合物曝露之唯一光具有在約400 nm至約650 nm之範圍內之波長或具有小於或小於約500勒克司(lux)之強度。
在一些實施例中，步驟b)包含在完成IR700與西妥昔單抗之間的結合反應之後，使結合物經甘胺酸淬滅反應。在一些實施例中，淬滅反應進行隔夜或大於或大於約6小時之持續時間。
亦提供穩定結合物。在一些實施例中，穩定結合物係藉由本文所描述的製造結合物之方法中之任一者製造。
本文亦提供包含複數種結合物之組合物，其中該等結合物包含IR700結合至西妥昔單抗，其中該組合物經胰蛋白酶消化產生包含以下肽之群體：a)西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置215之離胺酸(K215)；b)西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置292之離胺酸(K292)；c)西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置416之離胺酸(K416)；及d)西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置145之離胺酸(K145)。
在一些實施例中，肽之群體進一步包含：e)西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置336之離胺酸(K336)；及f)西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置449之離胺酸(K449)。
在一些實施例中，肽之群體進一步包含：g)西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置107之離胺酸(K107)；h)西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置190之離胺酸(K190)；i)西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置5之離胺酸(K5)；及j)西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置75之離胺酸(K75)。
在一些實施例中，肽之群體進一步包含以下中之一或多者：k)西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置248之離胺酸(K248)；l)西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置328之離胺酸(K328)；m)西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置188之離胺酸(K188)；及n)西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置207之離胺酸(K207)。
亦提供包括複數種結合物之組合物，其中該等結合物包含IR700結合至西妥昔單抗，其中該組合物經胰蛋白酶消化產生包含以下肽之群體：a)西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置5之離胺酸(K5)；b)西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置75之離胺酸(K75)；c)西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置215之離胺酸(K215)；d)西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置248之離胺酸(K248)；e)西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置292之離胺酸(K292)；f)西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置328之離胺酸(K328)；g)西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置336之離胺酸(K336)；h)西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置416之離胺酸(K416)；i)西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置449之離胺酸(K449)；j)西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置107之離胺酸(K107)；k)西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置145之離胺酸(K145)；l)西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置188之離胺酸(K188)；m)西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置190之離胺酸(K190)；及n)西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置207之離胺酸(K207)。
在一些實施例中，肽藉由正離子模式質譜法來偵測。在一些實施例中，當針對由正離子模式質譜法偵測之肽產生提取離子層析圖(EIC)時：對應於a)之肽之EIC峰分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於a)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的3%或約3%與5%或約5%之間；對應於b)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於b)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的3%或約3%與5%或約5%之間；對應於c)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於c)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的8%或約8%與11%或約11%之間；對應於d)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於d)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的0.5%或約0.5%與2.5%或約2.5%之間；對應於e)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於e)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的8%或約8%與12%或約12%之間；對應於f)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於f)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的0.2%或約0.2%與2.5%或約2.5%之間；對應於g)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於g)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的4.5%或約4.5%與7%或約7%之間；對應於h)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於h)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的9.5%或約9.5%與13%或約13%之間；對應於i)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於i)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的6%或約6%與10%或約10%之間；對應於j)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於j)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的2%或約2%與5%或約5%之間；對應於k)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於k)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的7%或約7%與11%或約11%之間；對應於l)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於l)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的0.5%或約0.5%與4%或約4%之間；對應於m)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於m)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的1.5%或約1.5%與5%或約5%之間；及對應於n)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於n)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的0.5%或約0.5%與4%或約4%之間。
在一些實施例中，對應於a)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於a)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約3.8±1%；對應於b)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於b)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約3.5±1%；對應於c)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於c)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約10.0±1%；對應於d)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於d)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約1.7±1%；對應於e)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於e)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約10.2±1%；對應於f)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於f)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約1.3±1%；對應於g)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於g)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約5.9±1%；對應於h)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於h)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約11.2±1%；對應於i)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於i)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約7.6±1%；對應於j)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於j)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約3.4±1%；對應於k)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於k)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約9.3±1%；對應於l)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於l)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約2.1±1%；對應於m)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於m)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約3.5±1%；及對應於n)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於n)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約2.0±1%。
在一些所提供之實施例中，a)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸1-38；b)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸72-81；c)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸213-216；d)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸225-250；e)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸291-294；f)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸325-336；g)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸329-340；h)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸412-418；i)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸442-449；j)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 2之胺基酸104-108；k)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 2之胺基酸143-149；l)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 2之胺基酸184-190；m)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 2之胺基酸189-207；及n)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 2之胺基酸191-211。
本文亦提供包括複數種結合物之組合物，其中該等結合物包含IR700結合至西妥昔單抗，且其中該組合物經胰蛋白酶消化產生肽，該等肽產生包含對應於以下之提取離子層析圖(EIC)峰之質譜：包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置215之離胺酸(K215)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約9%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置292之離胺酸(K292)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約8%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置416之離胺酸(K416)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約8%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置145之離胺酸(K145)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約8%。
在一些實施例中，組合物之胰蛋白酶消化進一步產生包含對應於以下中之一或多者之提取離子層析圖(EIC)峰的質譜：包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置449之離胺酸(K449)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約5%；及/或包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置336之離胺酸(K336)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約3.5%。在一些實施例中，組合物之胰蛋白酶消化進一步產生包含對應於以下中之一或多者之提取離子層析圖(EIC)峰的質譜：包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置5之離胺酸(K5)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約2%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置75之離胺酸(K75)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約2%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置248之離胺酸(K248)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約0.5%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置328之離胺酸(K328)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約0.5%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置107之離胺酸(K107)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約2%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置188之離胺酸(K188)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約0.5%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置190之離胺酸(K190)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約2%；及/或包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置207之離胺酸(K207)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約0.5%。
本文亦提供包括複數種結合物之組合物，其中該等結合物包含IR700結合至西妥昔單抗之，且其中該組合物經胰蛋白酶消化產生肽，該等肽產生包含對應於以下之提取離子層析圖(EIC)峰之質譜：包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置5之離胺酸(K5)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約2.5%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置75之離胺酸(K75)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約2.5%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置215之離胺酸(K215)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約9%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置248之離胺酸(K248)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約0.5%；及/或包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置292之離胺酸(K292)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約8.5%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置328之離胺酸(K328)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約0.5%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置336之離胺酸(K336)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約4.5%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置416之離胺酸(K416)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約9%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置449之離胺酸(K449)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約7%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置107之離胺酸(K107)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約2.5%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置145之離胺酸(K145)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約8.5%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置188之離胺酸(K188)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約1%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置190之離胺酸(K190)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約2.5%；及包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置207之離胺酸(K207)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約1%。
在一些實施例中，對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置5之離胺酸(K5)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約3.8±1%；對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置75之離胺酸(K75)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約3.5±1%；對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置215之離胺酸(K215)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約10.0±1%；對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置248之離胺酸(K248)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約1.7±1%；對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置292之離胺酸(K292)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約10.2±1%；對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置328之離胺酸(K328)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約1.3±1%；對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置336之離胺酸(K336)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約5.9±1%；對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置416之離胺酸(K416)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約11.2±1%；對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置449之離胺酸(K449)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約7.6±1%；對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置107之離胺酸(K107)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約3.4±1%；對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置145之離胺酸(K145)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約9.3±1%；對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置188之離胺酸(K188)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約2.1±1%；對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置190之離胺酸(K190)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約3.5±1%；及對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置207之離胺酸(K207)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約2±1%。
在一些實施例中，包含IR700分子結合至離胺酸之肽包含一或多個選自以下中之胺基酸序列：對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸1-38、胺基酸72-81、胺基酸213-216、胺基酸225-250、胺基酸291-294、胺基酸325-336、胺基酸329-340、胺基酸412-418及胺基酸442-449之胺基酸序列；對應於SEQ ID NO: 2之胺基酸104-108、胺基酸143-149、胺基酸184-190、胺基酸189-207及胺基酸191-211之胺基酸序列。
本文提供一種包含結合至IR700之西妥昔單抗抗體之結合物，其中至少一個IR700分子連接至西妥昔單抗抗體之輕鏈中之離胺酸(K)。在一個態樣中，至少一個IR700分子可在選自由以下組成之群之位置處連接至離胺酸：輕鏈中之K107、K145、K188、K190及K207。在所提供之實施例中之任一者中，至少一個IR700分子可連接至輕鏈中之K145。在所提供之實施例中之任一者中，西妥昔單抗抗體可在西妥昔單抗抗體之一條或兩條輕鏈中之兩個或更多個離胺酸位置處連接至IR700。在所提供之實施例中之任一者中，西妥昔單抗抗體可在西妥昔單抗抗體之一條或兩條輕鏈中之K145處連接至IR700。在所提供之實施例中之任一者中，西妥昔單抗抗體可在西妥昔單抗抗體之輕鏈中之K145處及西妥昔單抗抗體之輕鏈或重鏈中之至少一個其他離胺酸位置處連接至IR700。
本文提供一種包含結合至IR700之西妥昔單抗抗體之結合物，其中至少一個IR700分子連接至西妥昔單抗抗體之重鏈中之離胺酸(K)。在一個態樣中，至少一個IR700分子可在選自由以下組成之群之位置處連接至離胺酸：重鏈中之K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416及K449。在所提供之實施例中之任一者中，至少一個IR700分子可在選自由以下組成之群之位置處連接至離胺酸：重鏈中之K215、K292、K336、K416及K449。在所提供之實施例中之任一者中，西妥昔單抗抗體可在西妥昔單抗抗體之一條或兩條重鏈中之兩個或更多個離胺酸位置處連接至IR700。在所提供之實施例中之任一者中，西妥昔單抗抗體可在西妥昔單抗抗體之一條或兩條重鏈中之三個或更多個離胺酸位置處連接至IR700。在所提供之實施例中之任一者中，西妥昔單抗抗體可在西妥昔單抗抗體之一條或兩條重鏈中之K215、K292、K336、K416及/或K449處連接至IR700。在所提供之實施例中之任一者中，西妥昔單抗抗體可在西妥昔單抗抗體之重鏈中之K215、K292、K336、K416及/或K449處及西妥昔單抗抗體之輕鏈或重鏈中之至少一個其他離胺酸位置處連接至IR700。在所提供之實施例中之任一者中，西妥昔單抗抗體可在西妥昔單抗抗體之一條或兩條輕鏈中之K145處連接至IR700。
本文提供一種包含結合至IR700之西妥昔單抗抗體之結合物，其中至少一個IR700分子連接至西妥昔單抗抗體之輕鏈中之離胺酸(K)，且至少一個IR700分子連接至西妥昔單抗抗體之重鏈中之離胺酸(K)。在一個態樣中，輕鏈中之離胺酸可選自由以下組成之群：K107、K145、K188、K190及K207。在所提供之實施例中之任一者中，重鏈中之離胺酸可選自由以下組成之群：K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416及K449。在所提供之實施例中之任一者中，西妥昔單抗抗體可在西妥昔單抗抗體之一條或兩條輕鏈中之K145處連接至IR700。在所提供之實施例中之任一者中，西妥昔單抗抗體可在西妥昔單抗抗體之一條或兩條重鏈中之K215、K292、K336、K416及/或K449處連接至IR700。在所提供之實施例中之任一者中，西妥昔單抗抗體可在西妥昔單抗抗體之一條或兩條輕鏈中之K145處及在西妥昔單抗抗體之一條或兩條重鏈中之K215、K292、K416及K449處連接至IR700。
在所提供之實施例中之任一者中，結合物之IR700分子與西妥昔單抗抗體之比率可為1:1、2:1、3:1或4:1。在所提供之實施例中之任一者中，結合物能夠藉由波長在約600 nm與約850 nm (例如，690 nm ± 50 nm)之間的輻射而經活化且藉此獲得細胞殺死活性。
在一些實施例中，本文提供一種組合物，其包含前述實施例中之任一者之結合物及醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，本文提供一種包含西妥昔單抗抗體分子之群體的組合物，其中至少50%、60%、70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗抗體分子具有至少一個IR700分子連接至各西妥昔單抗抗體分子之輕鏈中之離胺酸(K)。在一個態樣中，至少50%、60%、70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗抗體分子可具有至少一個IR700分子連接至各西妥昔單抗抗體分子之一條或兩條輕鏈中之K107、K145、K188、K190及/或K207。在所提供之實施例中之任一者中，群體中結合至IR700之主要輕鏈離胺酸位置可為K145。在所提供之實施例中之任一者中，當西妥昔單抗抗體分子藉由改性質譜法分析時，在輕鏈K145處含有IR700結合之肽可比含有結合至其他輕鏈離胺酸位置之IR700的肽更豐富。
在一些實施例中，本文提供一種包含西妥昔單抗抗體分子之群體之組合物，其中至少50%、60%、70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗抗體分子具有至少一個IR700分子連接至各西妥昔單抗抗體分子之重鏈中之離胺酸(K)。在一個態樣中，至少50%、60%、70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗抗體分子可具有至少一個IR700分子連接至各西妥昔單抗抗體分子之一條或兩條重鏈中之K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416及/或K449。在所提供之實施例中之任一者中，群體中結合至IR700之主要重鏈離胺酸位置可為K215、K292、K336、K416及K449中之一或多者。在所提供之實施例中之任一者中，當西妥昔單抗抗體分子藉由質譜法分析時，含有在重鏈K215、K292、K336、K416或K449處結合之IR700的肽可比含有結合至其他重鏈離胺酸位置之IR700的肽更豐富。在所提供之實施例中之任一者中，至少70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗抗體分子可具有至少一個IR700分子連接至各西妥昔單抗抗體分子之一條或兩條重鏈中之兩個或更多個離胺酸。
在所提供之實施例中之任一者中，不超過約20%之西妥昔單抗抗體分子可未與IR700結合。在所提供之實施例中之任一者中，小於10%之西妥昔單抗抗體分子可未與IR700結合，且/或游離染料在組合物中之百分比可小於3%。在所提供之實施例中之任一者中，組合物中之IR700分子與群體中之西妥昔單抗抗體分子之比率可為約2:1、約2.5:1或約3:1。
在一些實施例中，本文提供一種包含西妥昔單抗抗體分子之群體之組合物，其中至少50%、60%、70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗抗體分子具有至少一個IR700分子連接至各西妥昔單抗抗體分子之輕鏈或重鏈中之離胺酸(K)。在一個態樣中，至少50%、60%、70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗抗體分子可具有至少一個IR700分子連接至一條或兩條輕鏈中之K107、K145、K188、K190及/或K207或連接至各西妥昔單抗抗體分子之一條或兩條重鏈中之K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416及/或K449。在一個態樣中，至少50%、60%、70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗抗體分子可具有至少一個IR700分子連接至一條或兩條輕鏈中之K145或連接至各西妥昔單抗抗體分子之一條或兩條重鏈中之K215、K292、K336、K416或K449。
在一些實施例中，本文提供一種包含西妥昔單抗抗體分子之群體之組合物，其中至少50%、60%、70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗抗體分子具有至少一個IR700分子連接至輕鏈中之離胺酸(K)及至少一個IR700分子連接至各西妥昔單抗抗體分子之重鏈中之離胺酸。在一個態樣中，至少50%、60%、70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗抗體分子可具有至少一個酞菁IR700分子連接至一條或兩條輕鏈中之K107、K145、K188、K190及/或K207及至少一個IR700分子連接至各西妥昔單抗抗體分子之一條或兩條重鏈中之K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416及/或K449。在一個態樣中，至少50%、60%、70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗抗體分子可具有至少一個酞菁IR700分連接至一條或兩條輕鏈中之K145及至少一個IR700分子連接至各西妥昔單抗抗體分子之一條或兩條重鏈中之K215、K292、K336、K416或K449子。
本文提供一種包含西妥昔單抗抗體分子之群體之組合物，其中不超過約20%之西妥昔單抗抗體分子在西妥昔單抗抗體分子之輕鏈或重鏈中之離胺酸(K)處未與IR700結合。在一個態樣中，小於15%之西妥昔單抗抗體分子可未與IR700結合。在一個態樣中，小於10%之西妥昔單抗抗體分子可未與IR700結合。在所提供之實施例中之任一者中，組合物中之游離染料在組合物中之所有染料分子中的百分比可小於3%、約2%、約1%或約0.5%。在所提供之實施例中之任一者中，組合物中之IR700分子與群體中之西妥昔單抗抗體分子之比率可為約2:1、約2.5:1或約3:1。
本文提供一種包含西妥昔單抗抗體分子之群體之組合物，其中一或多個西妥昔單抗抗體分子在一或多個西妥昔單抗抗體分子之輕鏈或重鏈中之離胺酸(K)處與IR700結合，組合物中之IR700分子與群體中之西妥昔單抗抗體分子之比率為約2:1、約2.5:1或約3:1，小於10%之西妥昔單抗抗體分子未與IR700結合，且組合物中之游離染料在組合物中之所有染料分子中的百分比小於約0.5%。
本文提供一種包含SEQ ID NO: 2之組合物，其中SEQ ID NO: 2之離胺酸145結合至IR700。本文提供一種包含SEQ ID NO: 1之組合物，其中SEQ ID NO: 1之離胺酸215、離胺酸292、離胺酸416及/或離胺酸449結合至IR700。
本文提供一種包含SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之組合物，其中SEQ ID NO: 2之離胺酸145結合至IR700且SEQ ID NO: 1之離胺酸215、離胺酸292、離胺酸416及/或離胺酸449結合至IR700。在一個態樣中，組合物可在相同分子中包含SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2，其中SEQ ID NO: 2之離胺酸145可結合至IR700且SEQ ID NO: 1之離胺酸215、離胺酸292、離胺酸416及/或離胺酸449可結合至IR700。在所提供之實施例中之任一者中，組合物可在不同的分子中包含SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2，其中SEQ ID NO: 2之離胺酸145可結合至IR700且SEQ ID NO: 1之離胺酸215、離胺酸292、離胺酸416及/或離胺酸449可結合至IR700。
本文提供一種包含西妥昔單抗抗體分子之群體之組合物，其中小於15%之西妥昔單抗抗體分子未與IR700結合，組合物包含小於3%游離IR700，且游離染料在組合物中之百分比在儲存約6個月之後實質上未改變。
本文提供一種包含西妥昔單抗抗體分子與IR700結合之群體的組合物，其中組合物包含小於或小於約0.6%、小於或小於約0.5%、小於或小於約0.4%，或小於或小於約0.3%游離染料。在一個態樣中，組合物可包含至少或至少約95%、96%、97%或98%單體。在一個態樣中，組合物可包含小於或小於約5%、4%或3%高分子量物種。在所提供之實施例中之任一者中，組合物可包含小於或小於約30%、20%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%或5%未結合抗體。
在所提供之實施例中之任一者中，在暗處或少光條件下儲存組合物6個月之後，游離染料之百分比實質上未改變。在所提供之實施例中之任一者中，至少70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗抗體分子可具有至少一個IR700分子結合至各西妥昔單抗抗體分子之輕鏈中之離胺酸(K)。在所提供之實施例中之任一者中，群體中結合至IR700之主要輕鏈離胺酸位置可為K145。在所提供之實施例中之任一者中，至少70%、80%、90%或大於90%之群體可具有至少一個IR700分子結合至各西妥昔單抗抗體分子之重鏈中之離胺酸(K)。在所提供之實施例中之任一者中，群體中結合至IR700之主要重鏈離胺酸位置可為K215、K292、K336、K416及K449中之一或多者。
本文提供一種包含西妥昔單抗抗體分子之群體之組合物，其中約9%與約10%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗抗體分子之總肽為在輕鏈離胺酸145 (K145)處含有IR700結合的肽。本文提供一種包含西妥昔單抗抗體分子之群體之組合物，其中約9%與約11%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗抗體分子之總肽為在重鏈離胺酸215 (K215)處含有IR700結合的肽。本文提供一種包含西妥昔單抗抗體分子之群體之組合物，其中約9%與約11%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗抗體分子之總肽為在重鏈離胺酸292 (K292)處含有IR700結合的肽。本文提供一種包含西妥昔單抗抗體分子之群體之組合物，其中約10%與約12%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗抗體分子之總肽為在重鏈離胺酸416 (K416)處含有IR700結合的肽。本文提供一種包含西妥昔單抗抗體分子之群體之組合物，其中約7%與9%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗抗體分子之總肽為在重鏈離胺酸449 (K449)處含有IR700結合的肽。本文提供一種包含西妥昔單抗抗體分子之群體之組合物，其中約5%與7%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗抗體分子之總肽為在重鏈離胺酸336 (K336)處含IR700有結合的肽。本文提供一種包含西妥昔單抗抗體分子之群體之組合物，其中約9%與11%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗抗體分子之總肽為在輕鏈離胺酸145 (K145)處含有IR700結合的肽；約9%與11%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗抗體分子之總肽為在重鏈離胺酸215 (K215)處含有IR700結合的肽；約9%與11%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗抗體分子之總肽為在重鏈離胺酸292 (K292)處含有IR700結合的肽；約10%與12%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗抗體分子之總肽為在重鏈離胺酸416 (K416)處含有IR700結合的肽；約7%與9%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗抗體分子之總肽為在重鏈離胺酸449 (K449)處含有IR700結合的肽；且/或約5%與7%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗抗體分子之總肽為在重鏈離胺酸336 (K336)處含有IR700的肽。在所提供之實施例中之任一者中，約3%與4%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗抗體分子之總肽可為在輕鏈離胺酸107 (K107)處含有IR700結合的肽；約1%與3%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗抗體分子之總肽可為在輕鏈離胺酸188 (K188)處含有IR700結合的肽；約3%與4%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗抗體分子之總肽可為在輕鏈離胺酸190 (K190)處含有IR700結合的肽；約1%與3%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗抗體分子之總肽可為在輕鏈離胺酸207 (K207)處含有IR700結合的肽；約3%與4%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗抗體分子之總肽可為在重鏈離胺酸5 (K5)處含有IR700結合的肽；約3%與4%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗抗體分子之總肽可為在重鏈離胺酸75 (K75)處含有IR700結合的肽；約1%與2%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗抗體分子之總肽可為在重鏈離胺酸248 (K248)處含有IR700結合的肽；且/或約1%與2%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗抗體分子之總肽可為在重鏈離胺酸328 (K328)處含有IR700結合的肽。
本文提供一種包含結合至IR700之西妥昔單抗抗體分子之群體的組合物，其中：在位置輕鏈中之離胺酸145 (K145)與重鏈中之離胺酸215 (K215)之間，結合至離胺酸之IR700在西妥昔單抗抗體分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；在位置輕鏈中之離胺酸145 (K145)與重鏈中之離胺酸292 (K292)之間，結合至離胺酸之IR700在西妥昔單抗抗體分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；在位置輕鏈中之離胺酸145 (K145)與重鏈中之離胺酸336 (K336)之間，結合至離胺酸之IR700在西妥昔單抗抗體分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；在位置輕鏈中之離胺酸145 (K145)與重鏈中之離胺酸416 (K416)之間，結合至離胺酸之IR700在西妥昔單抗抗體分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；及/或在位置輕鏈中之離胺酸145 (K145)與重鏈中之離胺酸449 (K449)之間，結合至離胺酸之IR700在西妥昔單抗抗體分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。本文提供一種包含結合至IR700之西妥昔單抗抗體分子之群體的組合物，其中在位置重鏈中之離胺酸215 (K215)與重鏈中之離胺酸292 (K292)之間，結合至離胺酸之IR700在西妥昔單抗抗體分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；在位置重鏈中之離胺酸215 (K215)與重鏈中之離胺酸336 (K336)之間，結合至離胺酸之IR700在西妥昔單抗抗體分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；在位置重鏈中之離胺酸215 (K215)與重鏈中之離胺酸416 (K416)之間，結合至離胺酸之IR700在西妥昔單抗抗體分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；且/或在位置重鏈中之離胺酸215 (K215)與重鏈中之離胺酸449 (K449)之間，結合至離胺酸之IR700在西妥昔單抗抗體分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。本文提供一種包含結合至IR700之西妥昔單抗抗體分子之群體的組合物，其中在位置重鏈中之離胺酸292 (K292)與重鏈中之離胺酸336 (K336)之間，結合至離胺酸之IR700在西妥昔單抗抗體分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；在位置重鏈中之離胺酸292 (K292)與重鏈中之離胺酸416 (K416)之間，結合至離胺酸之IR700在西妥昔單抗抗體分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；且/或在位置重鏈中之離胺酸292 (K292)與重鏈中之離胺酸449 (K449)之間，結合至離胺酸之IR700在西妥昔單抗抗體分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。本文提供一種包含結合至IR700之西妥昔單抗抗體分子之群體的組合物，其中在位置重鏈中之離胺酸336 (K336)與重鏈中之離胺酸416 (K416)之間，結合至離胺酸之IR700在西妥昔單抗抗體分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；且/或在位置重鏈中之離胺酸336 (K336)與重鏈中之離胺酸449 (K449)之間，結合至離胺酸之IR700在西妥昔單抗抗體分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。本文提供一種包含結合至IR700之西妥昔單抗抗體分子之群體的組合物，其中在位置重鏈中之離胺酸416 (K416)與重鏈中之離胺酸449 (K449)之間，結合至離胺酸之IR700在西妥昔單抗抗體分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。
本文提供一種包含結合至IR700之西妥昔單抗抗體分子之群體的組合物，其中在位置輕鏈中之離胺酸145 (K145)、重鏈中之離胺酸215 (K215)、重鏈中之離胺酸292 (K292)及重鏈中之離胺酸416 (K416)之間，結合至離胺酸之IR700在西妥昔單抗抗體分子之群體中的比率為約1:1:1:1。
本文提供一種包含結合至IR700之西妥昔單抗抗體分子之群體的組合物，其中在位置輕鏈中之離胺酸145 (K145)、重鏈中之離胺酸215 (K215)、重鏈中之離胺酸292 (K292)、重鏈中之離胺酸336 (K336)、重鏈中之離胺酸416 (K416)及重鏈中之離胺酸449 (K449)之間，結合至離胺酸之IR700在西妥昔單抗抗體分子之群體中的比率為約1:1:1:1:1:1。
在所提供之實施例中之任一者中，結合至離胺酸之IR700在西妥昔單抗抗體分子之群體中的比率可由質譜法量測。
本文提供一種殺死腫瘤或癌細胞之方法，其包含在或接近該腫瘤或癌細胞之部位投與包含前述實施例中之任一者之結合物或組合物的醫藥組合物；及在約600 nm至約850 nm之波長以由約25 J cm−2
至約400 J cm−2
或由約25 J/cm光纖長度至約500 J/cm光纖長度之劑量照射接近該腫瘤細胞之區域，藉此殺死該腫瘤或癌細胞。本文提供一種治療個體中之疾病或病況(例如腫瘤或癌症)之方法，其包含向個體投與包含前述實施例中之任一者之結合物或組合物的醫藥組合物；及在約600 nm至約850 nm之波長以由約25 J cm−2
至約400 J cm−2
或由約25 J/cm光纖長度至約500 J/cm光纖長度之劑量照射接近個體中之病灶(例如，由腫瘤或癌症所致之病灶)的區域，藉此治療該疾病或病況。在所提供之實施例中之任一者中，方法可進一步包含在投與步驟之前提供醫藥組合物。在所提供之實施例中之任一者中，照射步驟可在690 ± 50 nm之波長或在或約690 ± 20 nm之波長進行。在所提供之實施例中之任一者中，照射步驟可在約690 nm之波長進行。在所提供之實施例中之任一者中，腫瘤可為膀胱癌、胰臟癌、結腸癌、卵巢癌、肺癌、乳癌、胃癌、前列腺癌、子宮頸癌、食道癌或頭頸癌。在所提供之實施例中之任一者中，癌症可位於頭頸部、乳房、肝臟、結腸、卵巢、前列腺、胰臟、大腦、子宮頸、骨、皮膚、眼睛、膀胱、胃、食道、腹膜或肺。在所提供之實施例中之任一者中，癌症可為位於頭頸部之癌症。
本文提供一種製造穩定結合物之方法，其包含a)使西妥昔單抗抗體與IR700在產生結合物之條件下接觸，該結合物包含連接至一或多個選自由以下組成之群之西妥昔單抗抗體之離胺酸的IR700：K145 (輕鏈)、K215 (重鏈)、K292 (重鏈)、K336 (重鏈)、K416 (重鏈)及K449 (重鏈)；b)使該結合物在結合期間及/或之後經受一個步驟，該步驟實質上減少與該西妥昔單抗抗體非特異性結合之IR700；c)在醫藥學上可接受之緩衝液中調配該結合物，其中在步驟a)至c)中之每一者中，該染料及結合物曝露之唯一光具有在約400 nm至約650 nm之範圍內的波長或具有小於500勒克司之強度。在一個態樣中，步驟b)可包含使結合物經受淬滅反應。在所提供之實施例中之任一者中，步驟b)可包含在完成IR700與西妥昔單抗抗體之間的結合反應之後，使結合物經甘胺酸淬滅反應。在所提供之實施例中之任一者中，淬滅反應可進行隔夜或大於約6小時之持續時間。
在一些實施例中，本文提供由前述實施例中之任一者製造之穩定結合物。在所提供之實施例中之任一者中，結合物可包含結合至IR700之西妥昔單抗抗體分子之群體，其中在位置輕鏈中之離胺酸145 (K145)、重鏈中之離胺酸215 (K215)、重鏈中之離胺酸292 (K292)及重鏈中之離胺酸416 (K416)之間，結合至西妥昔單抗抗體分子之離胺酸之IR700在群體中的比率可為約1:1:1:1。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2019年8月7日申請之標題為「CETUXIMAB-IR700 CONJUGATE COMPOSITIONS」之美國臨時申請案第62/883,825號的優先權，其內容以全文引用之方式併入。
本文提供酞菁染料IR700及西妥昔單抗抗體之結合物(西妥昔單抗-IR700)及包括含有此結合物之醫藥組合物的組合物。
在一些實施例中，本文所揭示之結合物及結合物之製劑提供組合物(包括醫藥組合物)之增加的均一性、穩定性、活性及/或改良之一致性。在一些實施例中，西妥昔單抗-IR700結合物含有藉由在特定胺基酸位置或特定胺基酸殘基處(包括在特定離胺酸(K)位置或殘基處)與IR700染料結合而修飾之西妥昔單抗抗體。亦提供西妥昔單抗-IR700結合物及含有此結合物之組合物，當用諸如胰蛋白酶之內切蛋白酶消化時，其產生包含某些肽之群體及修飾(諸如IR700在特定離胺酸位置或殘基處之結合)的組合物。亦提供西妥昔單抗-IR700結合物及含有此結合物之組合物，當用諸如胰蛋白酶之內切蛋白酶消化且藉由諸如液相層析/質譜法(LC/MS)之質譜法來分析或評定時，其展現特定質譜。亦提供與所提供之結合物或組合物中之任一者相關的方法及用途，諸如治療方法或治療用途。亦提供產生所提供之西妥昔單抗-IR700結合物及/或包含西妥昔單抗-IR700結合物之組合物中之任一者的方法。
本申請案中所提及之所有公開案，包括專利文件、科學論文及資料庫，出於所有目的均以全文引用之方式併入本文中，其引用之程度如同各個別公開案以引用之方式個別地併入一般。若本文所述之定義與以引用方式併入本文中之專利、申請案、公開申請案及其他公開案中所述之定義相反或另外不一致，則以本文所述之定義為準，而非以以引用之方式併入本文中的定義為準。
本文所使用之章節標題僅出於組織目的且不應解釋為限制所描述之主題。
I. IR700酞菁染料及其結合物
本文所提供之結合物包括酞菁染料分子，諸如經由連接子基團結合至表皮生長生長因子受體(EGFR)-結合抗體(諸如西妥昔單抗)之IR700。在一個態樣中，結合物具有式I：
A-[(L)n
-D]p
(I)
其中：
A為西妥昔單抗或針對EGFR之抗體；
L為各p之獨立選擇之連接子；
n為1或2；
D為各p之獨立選擇之親水性酞菁染料；及
p獨立地為1、2、3、4、5，通常為1至3。
在一些實施例中，含有反應性基團之酞菁染料為IR700 NHS酯，諸如IRDye 700DX NHS酯(LiCor 929-70010，929-70011)。在一些實施例中，染料為具有下式之化合物：
化學式：C74
H96
N12
Na4
O27
S6
Si3
精確質量：1952.37
分子量：1954.22
IRDye 700DX NHS酯
出於本文之目的，當染料例如經由反應性基團諸如結合至抗體時，術語「IR700」 (亦稱為IRDye 700或IR700染料)包括上式。在一些實施例中，IR700染料為通常在680 nm與800 nm之間的近紅外(NIR)光譜中具有吸收及發射波長之螢光染料。
本文所描述之酞菁染料可用市售起始材料製得。藉由兩個或更多個不同的二亞胺基異吲哚啉之縮合來合成核心結構。使用不同二腈或二亞胺基異吲哚啉之合成策略可引起各種程度之酞菁取代及/或區位異構體分佈。用於產生染料之例示性合成流程描述於美國專利第7,005,518號中。用於製備及表徵染料(諸如IR700)結合物之例示性合成流程描述於WO 2017/031363中。
在一些實施例中，IR700酞菁染料經由染料分子之反應性基團結合至抗體。在一些實施例中，反應性基團為NHS酯。
在一些實施例中，本文所描述之組合物中所含有之西妥昔單抗-IR700結合物含有每一抗體分子之特定數目個染料殘基，亦即1或約1至3或約3個染料分子。在一些實施例中，每一抗體之染料分子數目可為2或約2至5或約5，諸如2或約2至4或約4，例如約3或3。在一些實施例中，西妥昔單抗-IR700結合物，每一抗體輕鏈之染料分子數目可為1或約1，或1或約1至2或約2。在一些實施例中，西妥昔單抗-IR700結合物，每一抗體重鏈之染料分子數目可為1或約1，2或約2，或3或約3，或4或約4，或1或約1至2或約2，或2或約2至3或約3，或2或約2至4或約4。
II. 表皮生長因子受體(EGFR)-結合抗體、西妥昔單抗及其結合物
本文提供抗體結合物，其具有一或多個在抗體中之特定胺基酸位置或殘基處(尤其與抗體之離胺酸位置或殘基)結合的酞菁染料分子(諸如IR700)。在一些實施例中，一或多個染料分子結合至抗體之輕鏈及/或重鏈之恆定區。此結合物保留抗體與其目標抗原結合之能力，且此外結合物提供抗體-染料結合物之目標細胞殺死活性，例如在抗體-染料結合物與表現目標抗原之細胞表面結合及用光照明或照射之後。
在本文所提供之結合物及組合物中，染料分子之位置(例如，IR700結合之抗體的一或多個鏈或域之離胺酸(K)位置或殘基)為一致及可重複的，在一些情況下係指或意謂重鏈及輕鏈上與IR700結合之位置的選擇以及位置之間的結合比例在不同批次之結合抗體中實質上恆定。結合位置之一致性及可重複性提供藥物組合物之活性及純度的均一性、可預測性及恆定性。
在一些實施例中，所提供之結合物或組合物中之抗體為靶向或結合(例如，特異性結合)表皮生長因子受體(EGFR；ErbB-1；HER1；EGF受體)之抗體，使得抗體可在細胞表面上結合EGFR。在一個實施例中，抗體為西妥昔單抗。西妥昔單抗為與EGFR之胞外域特異性結合之重組人類/小鼠嵌合單株抗體。西妥昔單抗由鼠類抗EGFR抗體之Fv區與人類IgG1重鏈及κ輕鏈恆定區構成。在一些態樣中，抗體包含重鏈，該重鏈包含SEQ ID NO: 1中所述之序列。在一些態樣中，抗體包含輕鏈，該輕鏈包含SEQ ID NO: 2中所述之序列。在一些實施例中，抗體包含重鏈及輕鏈，該重鏈及輕鏈分別包含SEQ ID NO: 1及2中所述之序列。在一些實施例中，所提供之結合物包含西妥昔單抗抗體，諸如包含重鏈及輕鏈之西妥昔單抗，該重鏈及輕鏈分別包含SEQ ID NO: 1及2中所述之序列。在一些實施例中，抗體衍生自西妥昔單抗或為西妥昔單抗之變體或衍生物，諸如抗原結合片段或其經修飾版本，或西妥昔單抗之生物類似物、可互換或生物較佳物。此類抗體亦包括西妥昔單抗之複本生物製劑及生物仿製物。
如本文所使用之「抗體」為至少包含輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區之多肽配位體，其特異性識別及結合抗原之抗原決定基，諸如腫瘤特異性蛋白。一般而言，抗體由重鏈及輕鏈構成，其中之每一者具有稱為可變重鏈(VH
)區及可變輕鏈(VL
)區之可變區。共同地，VH
區及VL
區負責結合由抗體識別之抗原。
如本文所使用之「抗體」包括完整免疫球蛋白及展現抗原結合之抗體片段，諸如Fab片段、Fab′片段、F(ab)′2
片段、單鏈Fv蛋白(「scFv」)及二硫鍵穩定之Fv蛋白(「dsFv」)。scFv蛋白為其中免疫球蛋白之輕鏈可變區(VL
)及免疫球蛋白之重鏈可變區(VH
)由連接子結合之融合蛋白質，而在dsFv中，各鏈已突變以引入二硫鍵來穩定各鏈之結合。術語亦包括經基因工程改造之形式，諸如嵌合抗體，例如人類化鼠類抗體；及異結合抗體，諸如雙特異性抗體。亦參見Pierce Catalog and Handbook
, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.)；Kuby, J.Immunology
, 第3版, W.H. Freeman & Co., New York, 1997。
通常，天然存在之免疫球蛋白具有藉由二硫鍵互連之重(H)鏈及輕(L)鏈。存在兩種輕鏈類型：lambda (λ)及kappa (k)。存在五種主要重鏈類別或同型，其決定抗體分子之功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。IgG抗體係由兩條重鏈及兩條輕鏈構成之四聚體蛋白質。IgG重鏈由自N端至C端按VH
-CH
1-CH
2-CH
3次序連接之四個免疫球蛋白域構成，分別指重鏈可變域、重鏈恆定域1、重鏈恆定域2及重鏈恆定域3 (亦稱為VH
-Cγ1-Cγ2-Cγ3，分別指IgG類之重鏈可變域、恆定γ1域、恆定γ2域及恆定γ3域)。IgG輕鏈由自N端至C端按VL
-CL
次序連接之兩個免疫球蛋白域構成，分別指輕鏈可變域及輕鏈恆定域。
各重鏈及輕鏈含有恆定區及可變區，亦稱為「域」。組合地，重鏈及輕鏈可變區通常特異性結合抗原。輕鏈及重鏈可變區可含有間雜有三個亦稱為「互補決定區」或「CDR」之高變區的「構架」區。已定義構架區及CDR之範圍(參見Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest
, U.S. Department of Health and Human Services, 1991，其特此以引用之方式併入)。Kabat資料庫現仍在線。不同輕鏈或重鏈之構架區之序列在諸如人類之物種內相對保守。抗體之構架區，亦即組成輕鏈及重鏈之組合構架區，用以在三維空間中定位且對準CDR。
CDR通常負責結合至抗原之抗原決定基。自N端開始依序編號的各鏈之CDR通常稱為CDR1、CDR2及CDR3，且通常亦藉由其中定位有特定CDR之鏈鑑別。因此，VH
CDR3位於發現其之抗體之重鏈可變域中，而VL
CDR1為來自發現其之抗體之輕鏈可變域的CDR1。具有不同特異性(諸如不同抗原之不同組合位點)之抗體具有不同CDR。儘管CDR在抗體與抗體之間不同，但CDR內僅有限數目之胺基酸位置直接參與抗原結合。CDR內之此等位置稱為特異性決定殘基(SDR)。
「VH
」或「VH」之參考係指免疫球蛋白重鏈之可變區(亦即，重鏈可變區)，包括Fv、scFv、dsFv或Fab之可變區。「VL
」或「VL」之參考係指免疫球蛋白輕鏈之可變區(亦即，輕鏈可變區)，包括Fv、scFv、dsFv或Fab之可變區。
「CH
」或「CH」之參考係指免疫球蛋白重鏈之恆定區。「CL
」或「CL」之參考係指免疫球蛋白輕鏈之恆定區。恆定區如此命名，因為其胺基酸序列在同一同型或重鏈類之抗體之間相對相似或相同。舉例而言，IgG抗體之恆定區可高度同源，甚至跨物種。例示性IgG同型包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4且可進一步劃分成諸如IgG2a及IgG2b之亞類。舉例而言，人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之恆定區在胺基酸序列中展示超過90%之同源性，其中差異並非隨機分佈的。在鉸鏈區及N端CH2域中發現許多差異，而在其他域中發現較少胺基酸差異。
「抗體片段」係指除完整抗體之外的分子，其包含完整抗體中結合完整抗體所結合之抗原的部分。抗體片段之實例包括(但不限於) Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2
；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如，scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。其他抗體片段或由抗體片段形成之多特異性抗體包括多價scFv、雙特異性scFv或scFv-CH
3二聚體。抗體片段可藉由各種技術製得，包括(但不限於)完整抗體之蛋白分解消化以及藉由重組宿主細胞產生。
「單株抗體」為藉由B淋巴球之單一純系或藉由其中已轉染單一抗體之輕鏈及重鏈基因之細胞產生的抗體。單株抗體藉由熟習此項技術者已知之方法產生，例如藉由自骨髓瘤細胞與免疫脾細胞之融合物製造雜交抗體形成細胞。單株抗體包括人類化單株抗體。
「嵌合抗體」具有來自一個物種(諸如人類)之構架殘基，及來自另一物種(諸如特異性結合間皮素之鼠類抗體)的通常賦予抗原結合之CDR。
「人類化」免疫球蛋白為包括人類構架區及一或多個來自非人類(例如小鼠、大鼠或合成)免疫球蛋白之CDR的免疫球蛋白。提供CDR之非人類免疫球蛋白稱為「供體」且提供構架之人類免疫球蛋白稱為「受體」。在一些實施例中，CDR來自人類化免疫球蛋白中之供體免疫球蛋白。恆定區不必存在，但若其存在，則其可與人類免疫球蛋白恆定區實質上一致，諸如至少約85-90%，諸如約95%或更高一致。因此，除可能CDR外，人類化免疫球蛋白之部分與天然人類免疫球蛋白序列之對應部分實質上一致。「人類化抗體」為包含人類化輕鏈及人類化重鏈免疫球蛋白之抗體。人類化抗體與提供CDR之供體抗體結合至相同抗原。人類化免疫球蛋白或抗體之受體構架可具有有限數目個藉由取自供體構架之胺基酸的取代。人類化或其他單株抗體可具有對抗原結合或其他免疫球蛋白功能實質上無影響之額外保守性胺基酸取代。人類化免疫球蛋白可藉助於基因工程改造構築(參見例如美國專利第5,585,089號)。
「人類」抗體(亦稱為「完全人類」抗體)為包括人類構架區及來自人類免疫球蛋白之CDR的抗體。在一些實施例中，構架及CDR來自同一起源人類重鏈及/或輕鏈胺基酸序列。然而，來自一種人類抗體之構架可經工程改造以包括來自不同人類抗體之CDR。人類免疫球蛋白之部分可與天然人類免疫球蛋白序列之對應部分實質上一致。
本文提供結合至諸如IR700之酞菁染料之抗體，特定言之結合EGFR之抗體。在一些實施例中，結合物之抗體為西妥昔單抗。在一些實施例中，西妥昔單抗結合至IR700染料。在一些實施例中，結合至IR700之西妥昔單抗具有包含SEQ ID NO: 1之重鏈。在一些實施例中，結合至IR700之西妥昔單抗具有包含SEQ ID NO: 2之輕鏈。在一些實施例中，西妥昔單抗具有分別包含SEQ ID NO: 1及2之重鏈及輕鏈。
如本文所使用，兩個多肽序列之間的「序列一致性」指示序列之間一致的胺基酸百分比。「序列相似性」指示一致的或表示保守性胺基酸取代之胺基酸百分比。
在一些實施例中，本文所揭示之西妥昔單抗在CDR區中與闡述於SEQ ID NO: 1中之重鏈序列中的CDR區中之一或多者具有至少60%，更佳地至少70%或80%，仍更佳至少90%且最佳至少95%之序列一致性。在一些實施例中，本文所揭示之西妥昔單抗在CDR區中與闡述於SEQ ID NO: 2中之輕鏈序列中的CDR區中之一或多者具有至少60%，更佳地至少70%或80%，仍更佳至少90%且最佳至少95%之序列一致性。在一些實施例中，本文所揭示之西妥昔單抗在CDR區中與闡述於SEQ ID NO: 1中之重鏈序列及闡述於SEQ ID NO: 2中之輕鏈序列中的CDR區中之一或多者具有至少60%，更佳地至少70%或80%，仍更佳至少90%且最佳至少95%之序列一致性。
在一些實施例中，本文所揭示之西妥昔單抗在CDR區中與闡述於SEQ ID NO: 1中之重鏈序列中的CDR區中之一或多者具有至少80%，更佳90%且最佳95%之序列相似性。在一些實施例中，本文所揭示之西妥昔單抗在CDR區中與闡述於SEQ ID NO: 2中之輕鏈序列中的CDR區中之一或多者具有至少80%，更佳90%且最佳95%之序列相似性。在一些實施例中，本文所揭示之西妥昔單抗在CDR區中與闡述於SEQ ID NO: 1中之重鏈序列及闡述於SEQ ID NO: 2中之輕鏈序列中的CDR區中之一或多者具有至少80%，更佳90%且最佳95%之序列相似性。
在一些實施例中，抗體為西妥昔單抗(例如，包含闡述於SEQ ID NO:1中之重鏈序列及/或闡述於SEQ ID NO:2中之輕鏈序列)之變體或衍生物。舉例而言，抗體具有西妥昔單抗之可變區(VH及VL)，且CH及CL區為不同的，諸如來自不同IgG同型之CH及CL或與西妥昔單抗之CH及CL區具有一或多個胺基酸差異。在一些實施例中，西妥昔單抗之變體或衍生物為具有與西妥昔單抗相同的CDR且具有與西妥昔單抗之CH區至少90%、92%、95%、98%或99%一致之CH區的變體或衍生物。在一些實施例中，西妥昔單抗之變體或衍生物為具有與西妥昔單抗相同的CDR且具有與西妥昔單抗之CL區至少90%、92%、95%、98%或99%一致之CL區的變體或衍生物。在一些實施例中，西妥昔單抗之變體或衍生物為具有與西妥昔單抗相同的CDR且具有與CH至少90%、92%、95%、98%或99%一致之CH區及與西妥昔單抗之CL區至少90%、92%、95%、98%或99%一致之CL區的變體或衍生物。在一些實施例中，與西妥昔單抗之CH及CL區至少90%、92%、95%、98%或99%一致性包括CH及/或CL區中之一或多個離胺酸殘基或經暴露離胺酸殘基之位置。
在一些實施例中，西妥昔單抗之變體或衍生物為具有與西妥昔單抗相同的CDR且具有與西妥昔單抗(例如，包含闡述於SEQ ID NO:1中之重鏈序列及/或闡述於SEQ ID NO:2中之輕鏈序列)之CH區相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或多於20個胺基酸取代之CH區的變體或衍生物。在一些實施例中，西妥昔單抗之變體或衍生物為具有與西妥昔單抗相同的CDR且具有與西妥昔單抗之CL區相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多於10個胺基酸取代之CL區的變體或衍生物。在一些實施例中，西妥昔單抗之變體或衍生物為具有與西妥昔單抗相同的CDR且具有與西妥昔單抗之CH區相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸取代之CH區及與西妥昔單抗之CL區相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代之CL區的變體或衍生物。在所提供之實施例中之任一者中，一或多個胺基酸取代可在除CH及/或CL區中之離胺酸殘基外的位置處。在所提供之實施例中之任一者中，一或多個胺基酸取代可在除CH及/或CL區中之經暴露離胺酸殘基外的位置處。在一些實施例中，一或多個胺基酸取代可包括揭示於US 6,737,056、US 7,183,387、US 7,632,497、US 7,741,072、US 7,960,512、US 8,217,147、US 8,388,955、US 8,445,645、US 8,652,466、US 8,697,071、US 8,735,547、US 8,753,628及US 8,937,158中之彼等，其皆以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，抗體為具有變體Fc區之西妥昔單抗之變體或衍生物。在一些實施例中，與西妥昔單抗(例如，包含闡述於SEQ ID NO:1中之重鏈序列及/或闡述於SEQ ID NO:2中之輕鏈序列)之Fc區相比，變體Fc區包含變型，例如，胺基酸殘基取代。在一些實施例中，變型包括揭示於US 6,737,056、US 7,183,387、US 7,632,497、US 7,741,072、US 7,960,512、US 8,217,147、US 8,388,955、US 8,445,645、US 8,652,466、US 8,697,071、US 8,735,547、US 8,753,628及US 8,937,158中之彼等，其皆出於所有目的以引用之方式併入本文中。
在本文實施例中，諸如IR700之酞菁染料經由抗體上之個別反應性位點結合至抗體。在一些實施例中，反應性位點為抗體輕鏈上之一或多個離胺酸殘基。在一些實施例中，反應性位點為抗體重鏈上之一或多個離胺酸殘基。在一些實施例中，反應性位點為抗體輕鏈上之一或多個離胺酸殘基且為抗體重鏈上之一或多個離胺酸殘基。
在一些實施例中，至少一個IR700染料結合至抗體輕鏈中之至少一個離胺酸。在一些實施例中，至少一個IR700染料結合至抗體輕鏈中之至少一個離胺酸及恆定區中之離胺酸處的結合位置殘基。在一些實施例中，僅一個IR700染料結合至抗體輕鏈中之離胺酸及恆定區中之離胺酸處的結合位置殘基。在一些實施例中，西妥昔單抗-IR700結合物在西妥昔單抗之輕鏈中在結合至IR700染料分子之位置145 (K145)處具有至少一個離胺酸(例如，參見闡述於SEQ ID NO:2中之輕鏈序列中之位置編號)。
在一些實施例中，至少一個IR700染料結合至抗體重鏈中之離胺酸。在一些實施例中，至少一個IR700染料結合至抗體重鏈中之離胺酸及恆定區中之離胺酸處的結合位置殘基。在一些實施例中，西妥昔單抗-IR700結合物在西妥昔單抗之重鏈內之一或多個特定位置處經修飾。在一些實施例中，西妥昔單抗-IR700結合物在西妥昔單抗之重鏈中在結合至IR700染料分子之K215、K292、K336、K416及K449中的一或多個位置處具有至少一個離胺酸(例如，參見闡述於SEQ ID NO:1中之重鏈序列中之位置編號)。在一些實施例中，西妥昔單抗-IR700結合物在西妥昔單抗之重鏈內之兩個或更多個特定位置處經修飾且在重鏈中在結合至IR700染料分子之K215、K292、K336、K416及K449的位置處具有至少一個離胺酸。在一些實施例中，西妥昔單抗-IR700結合物在西妥昔單抗之重鏈內之兩個或更多個特定位置處經修飾且在重鏈中在結合至IR700染料分子之K215、K292、K336、K416及K449的位置處具有至少兩個離胺酸。在一些實施例中，西妥昔單抗-IR700結合物在西妥昔單抗之重鏈內之三個或更多個特定位置處經修飾且具有結合至IR700染料分子之位置K215、K292、K336、K416及K449中的1、2或3個。
III. 結合物之組合物
提供含有所提供結合物(例如西妥昔單抗-IR700結合物)中之一或多者之組合物(諸如醫藥組合物)。在一些實施例中，組合物包含結合物群體或複數種結合物，諸如西妥昔單抗-IR700結合物群體或複數種西妥昔單抗-IR700結合物。亦提供含有西妥昔單抗-IR700結合物之組合物，當用諸如胰蛋白酶之內切蛋白酶消化時，其產生某些肽及修飾(諸如IR700結合在特定離胺酸位置或殘基)之群體，及/或當藉由諸如液相層析/質譜(LC/MS)之質譜法來分析或評估時，其展現特定質譜(例如指示某些肽及修飾之存在)。亦提供諸如分析組合物之組合物，其含有由內切蛋白酶(例如胰蛋白酶)消化包含西妥昔單抗-IR700結合物之組合物產生之肽及經修飾肽(例如含有與IR700結合之胺基酸殘基的肽)。在一些態樣中，可藉由諸如LC/MS之質譜法來分析或評估此分析組合物。
在一些實施例中，群體中抗體的每一抗體之染料分子平均數目可為2或約2至5或約5，諸如2或約2至4或約4，例如約3或3或約2.5或2.5。在一些實施例中，群體中每一抗體輕鏈之染料分子平均數目為或約0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5或約1，或0.2或約0.2至1.0或約1.0，0.2或約0.2至0.6或約0.6，或0.4或約0.4至0.5或約0.5，或0.5或約0.5至1.0或約1.0。在一些實施例中，群體中每一抗體重鏈之染料分子平均數目為或約1、約2或約3或約4，或1或約1至2或約2，或2或約2至3或約3，或2或約2至4或約4，或約2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4或3.5。
在一些本文所提供之實施例中，經IR700修飾或與其結合之離胺酸(K)殘基或位置參見西妥昔單抗中之胺基酸位置編號。在一些本文所提供之實施例中，經IR700修飾或與其結合之重鏈離胺酸(K)殘基或位置參見述於SEQ ID NO:1中之重鏈序列中的胺基酸位置編號。舉例而言，重鏈之K215、K292、K336、K416或K449可指述於SEQ ID NO:1中之重鏈序列之位置215、292、336、416或449的離胺酸。在一些本文所提供之實施例中，經IR700修飾或與其結合之輕鏈離胺酸(K)殘基或位置參見述於SEQ ID NO:2中之輕鏈序列中的胺基酸位置編號。舉例而言，輕鏈之K145可指述於SEQ ID NO:2中之輕鏈序列之位置145的離胺酸。
在一些實施例中，群體包含西妥昔單抗-IR700結合物，由此相當大百分比之結合物具有至少一個結合至IR700染料之輕鏈離胺酸殘基。在一些實施例中，群體中至少或至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或多於50%之抗體具有至少一個結合至IR700染料之輕鏈離胺酸(K)殘基。
在一些實施例中，群體包含西妥昔單抗-IR700結合物，由此相當大百分比之結合物具有至少結合至IR700染料之輕鏈位置K145。在一些實施例中，群體中至少或至少約10%之所有西妥昔單抗在輕鏈之位置K145處結合至IR700。在一些實施例中，群體中至少或至少約10%、15%、20%、30%、35%、40%、45%、50%或多於50%之所有結合抗體在輕鏈之位置K145處具有IR700(例如，參見闡述於SEQ ID NO:2中之輕鏈序列中之位置編號)。
在一些實施例中，群體包含西妥昔單抗，由此相當大百分比之IR700結合西妥昔單抗在結合至IR700染料分子之重鏈中具有至少位置K215、K292、K336、K416或K449 (例如，參見闡述於SEQ ID NO:1中之重鏈序列中之位置編號)。在一些實施例中，群體中至少或至少約10%、15%、20%、30%、35%、40%、45%、50%或多於50%之所有西妥昔單抗在重鏈中之位置K215、K292、K336、K416或K449中之至少一者處結合至IR700。在一些實施例中，群體中至少55%、60%、65%或70%之所有西妥昔單抗結合物在重鏈中之位置K215、K292、K336、K416或K449中之一或多者處具有IR700。在一些實施例中，群體中至少或至少約10%、15%、20%、30%、35%、40%、45%、50%或多於50%之所有西妥昔單抗具有至少兩個IR700染料分子結合至重鏈，其中結合位置中之一或兩者為K215、K292、K336、K416或K449。
在一些實施例中，組合物包含可藉由諸如胰蛋白酶之內切蛋白酶消化之西妥昔單抗-IR700結合物的群體，其中經消化之組合物可隨後藉由液相層析/質譜法(LC/MS)來分析。在一些實施例中，本文所提供之組合物經胰蛋白酶消化產生複數個肽，包括具有如表 1
中所述之胺基酸(AA)、未結合肽及IR700結合肽之單同位素質量([MH]+
)
的肽：
| 表1. | |||
| 西妥昔單抗輕鏈 | |||
| AA (SEQ ID NO: 2) | [MH]+ (Da) | 結合之 離胺酸 | |
| 未結合肽 | 肽+IR700 | ||
| 46 - 61 | 1733.98 | 2503.18 | K49 |
| 104 - 108 | 658.42 | 1427.62 | K107 |
| 109 - 142 | 3724.9 | 4494.1 | K126 |
| 143 - 149 | 888.49 | 1657.69 | K145 |
| 146 - 169 | 2677.27 | 3446.47 | K149 |
| 184 - 190 | 890.44 | 1659.64 | K188 |
| 189 - 207 | 2141.08 | 2910.28 | K190 |
| 191 - 211 | 2380.17 | 3149.37 | K207 |
| 西妥昔單抗重鏈 | |||
| AA (SEQ ID NO:1) | [MH]+ (Da) | 結合之 離胺酸 | |
| 未結合肽 | 肽+IR700 | ||
| 1 - 38 | 4142.14 | 4911.34 | K5 |
| 39 - 66 | 3067.49 | 3836.69 | K43 |
| 72 - 81 | 1199.61 | 1968.81 | K75 |
| 76 - 97 | 4735.98 | 5505.18 | K81 |
| 124 - 149 | 2489.31 | 3258.51 | K135 |
| 213 - 216 | 517.31 | 1286.51 | K215 |
| 225 - 250 | 2844.46 | 3613.66 | K248 |
| 225 - 257 | 3660.87 | 4430.07 | K250 |
| 258 - 290 | 3797.81 | 4567.01 | K276 |
| 277 - 292 | 1906.94 | 2676.14 | K290 |
| 291 - 294 | 501.31 | 1270.51 | K292 |
| 304 - 322 | 2228.21 | 2997.41 | K319 |
| 325 - 336 | 1266.74 | 2035.94 | K328 |
| 329 - 340 | 1267.76 | 2036.96 | K336 |
| 358 - 372 | 1779.9 | 2549.1 | K362 |
| 373 - 411 | 4399.04 | 5168.24 | K394 |
| 412 - 418 | 818.47 | 1587.67 | K416 |
| 442 - 449 | 788.45 | 1557.65 | K449 |
在一些實施例中，本文提供包含西妥昔單抗-IR700結合物群體或複數種西妥昔單抗-IR700結合物之組合物，其中組合物經胰蛋白酶消化產生包含肽之混合物的肽，其中一些結合至一或多個IR700分子且其他肽不結合至IR700分子(未結合或未經修飾肽)。在一些實施例中，所提供組合物之胰蛋白酶消化含有西妥昔單抗之重鏈的肽，該等肽含有結合至位置5 (K5)、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416及/或K449 (例如，參見闡述於SEQ ID NO:1中之重鏈序列中之位置編號)處之離胺酸中之一或多者之IR700分子。在一些實施例中，所提供組合物之胰蛋白酶消化含有西妥昔單抗之輕鏈的肽，該等肽含有結合至位置107 (K107)、K145、K188、K190及/或K207 (例如，參見闡述於SEQ ID NO:2中之輕鏈序列中之位置編號)處之離胺酸中之一或多者之IR700分子。
在一些實施例中，藉由質譜法(例如，以正離子模式)來偵測結合至IR700分子之肽。在一些實施例中，所提供組合物之胰蛋白酶消化產生藉由質譜法偵測之經修飾及未經修飾肽。
遵循液相層析/質譜法(LC/MS)程序，提取離子層析圖(EIC)可藉由繪製在所選質荷比(m/z)值或隨滯留時間記錄之系列質譜中之系列所選m/z值下觀察到之信號強度來創建。對於所選值，藉由積分確定之EIC之曲線下面積可用於計算所選組分之含量。為確定所選肽(具有所選質荷比(m/z)值)之結合百分比，對應於所選肽之曲線下面積除以結合肽序列及對應於與結合肽相同殘基之未結合肽(未經修飾)的曲線下面積之總和，乘以100 [結合百分比=結合肽之面積/(結合肽面積+未經修飾肽之面積)×100]。所選肽可為單電荷肽或多電荷肽，諸如具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個電荷(z)之肽。
在一些實施例中，對應於西妥昔單抗重鏈之肽(包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置5之離胺酸(K5))之提取離子層析圖(EIC)峰之積分面積(結合肽百分比)係在對應未經修飾肽之EIC峰及對應於位置K5處修飾之肽之EIC峰的積分面積總和的2%或約2%與5%或約5%之間或約3%與5%或約5%之間，諸如約3%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、3.6%、3.7%、3.8%、3.9%、4.0%、4.1%、4.2%、4.3%、4.4%、4.5%、4.6%、4.7%、4.8%、4.9%或約5%。在一些實施例中，位置K5處之結合肽百分比為約3.8±1%。在一些實施例中，用於計算結合肽百分比的在位置K5處結合至IR700之肽及未經修飾肽對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸1-38。在一些實施例中，在西妥昔單抗重鏈之位置K5處結合至IR700之肽為約m/z 1243.09之[MH4
]4+
肽。
在一些實施例中，對應於西妥昔單抗重鏈之肽(包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置75之離胺酸(K75))之提取離子層析圖(EIC)峰之積分面積(結合肽百分比)係在對應未經修飾肽之EIC峰及對應於位置K75處修飾之肽之EIC峰的積分面積總和的2%或約2%與5%或約5%之間或3%或約3%與5%或約5%之間，諸如約3%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、3.6%、3.7%、3.8%、3.9%、4.0%、4.1%、4.2%、4.3%、4.4%、4.5%、4.6%、4.7%、4.8%、4.9%或約5%。在一些實施例中，位置K75處之結合肽百分比為約3.5±1%。在一些實施例中，用於計算結合肽百分比的在位置K75處結合至IR700之肽及未經修飾肽對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸72-81。在一些實施例中，在西妥昔單抗重鏈之位置K75處結合至IR700之肽為約m/z 984.91之[MH2
]2+
肽。
在一些實施例中，對應於西妥昔單抗重鏈之肽(包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置215之離胺酸(K215))之提取離子層析圖(EIC)峰之積分面積(結合肽百分比)係在對應未經修飾肽之EIC峰及對應於位置K215處修飾之肽之EIC峰的積分面積總和的8%或約8%與11%或約11%之間或9%或約9%與11%或約11%之間，諸如約9%、9.1%、9.2%、9.3%、9.4%、9.5%、9.6%、9.7%、9.8%、9.9%、10.0%、10.1%、10.2%、10.3%、10.4%、10.5%、10.6%、10.7%、10.8%、10.9%或約11%。在一些實施例中，位置K215處之結合肽百分比為約10.0±1%。在一些實施例中，用於計算結合肽百分比的在位置K215處結合至IR700之肽及未經修飾肽對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸213-216。在一些實施例中，在西妥昔單抗重鏈之位置K215處結合至IR700之肽為約m/z 643.76之[MH2
]2+
肽。
在一些實施例中，對應於西妥昔單抗重鏈之肽(包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置248之離胺酸(K248))之提取離子層析圖(EIC)峰之積分面積(結合肽百分比)係在對應未經修飾肽之EIC峰及對應於位置K248處修飾之肽之EIC峰的積分面積總和的0.5%或約0.5%與2.5%或約2.5%之間，諸如約0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%或約2.5%。在一些實施例中，位置K248處之結合肽百分比為約1.7±1%。在一些實施例中，用於計算結合肽百分比的在位置K248處結合至IR700之肽及未經修飾肽對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸225-250。在一些實施例中，在西妥昔單抗重鏈之位置K248處結合至IR700之肽為約m/z 1205.22之[MH3
]3+
肽。
在一些實施例中，對應於西妥昔單抗重鏈之肽(包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置292之離胺酸(K292))之提取離子層析圖(EIC)峰之積分面積(結合肽百分比)係在對應未經修飾肽之EIC峰及對應於位置K292處修飾之肽之EIC峰的積分面積總和的8%或約8%與12%或約12%之間，諸如約8.0%、8.1%、8.2%、8.3%、8.4%、8.5%、8.6%、8.7%、8.8%、8.9%、9.0%、9.1%、9.2%、9.3%、9.4%、9.5%、9.6%、9.7%、9.8%、9.9%、10.0%、10.1%、10.2%、10.3%、10.4%、10.5%、10.6%、10.7%、10.8%、10.9%、11.0%、11.1%、11.2%、11.3%、11.4%、11.5%、11.6%、11.7%、11.8%、11.9%或約12%。在一些實施例中，位置K292處之結合肽百分比為約10.2±1%。在一些實施例中，用於計算結合肽百分比的在位置K292處結合至IR700之肽及未經修飾肽對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸291-294。在一些實施例中，在西妥昔單抗重鏈之位置K292處結合至IR700之肽為約m/z 424.16之[MH3
]3+
肽。
在一些實施例中，對應於西妥昔單抗重鏈之肽(包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置328之離胺酸(K328))之提取離子層析圖(EIC)峰之積分面積(結合肽百分比)係在對應未經修飾肽之EIC峰及對應於位置K328處修飾之肽之EIC峰的積分面積總和的0.2%或約0.2%與2.5%或約2.5%之間，諸如約0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%或約2.5%。在一些實施例中，位置K328處之結合肽百分比為約1.3±1%。在一些實施例中，用於計算結合肽百分比的在位置K328處結合至IR700之肽及未經修飾肽對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸325-336。在一些實施例中，在西妥昔單抗重鏈之位置K328處結合至IR700之肽為約m/z 1018.47之[MH2
]2+
肽。
在一些實施例中，對應於西妥昔單抗重鏈之肽(包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置336之離胺酸(K336))之提取離子層析圖(EIC)峰之積分面積(結合肽百分比)係在對應未經修飾肽之EIC峰及對應於位置K336處修飾之肽之EIC峰的積分面積總和的4.5%或約4.5%與7%或約7%之間，諸如約4.5%、4.6%、4.7%、4.8%、4.9%、5.0%、5.1%、5.2%、5.3%、5.4%、5.5%、5.6%、5.7%、5.8%、5.9%、6.0%、6.1%、6.2%、6.3%、6.4%、6.5%、6.6%、6.7%、6.8%、6.9%或約7.0%。在一些實施例中，位置K336處之結合肽百分比為約5.9±1%。在一些實施例中，用於計算結合肽百分比的在位置K336處結合至IR700之肽及未經修飾肽對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸329-340。在一些實施例中，在西妥昔單抗重鏈之位置K336處結合至IR700之肽為約m/z 1018.98之[MH2
]2+
肽。
在一些實施例中，對應於西妥昔單抗重鏈之肽(包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置416之離胺酸(K416))之提取離子層析圖(EIC)峰之積分面積(結合肽百分比)係在對應未經修飾肽之EIC峰及對應於位置K416處修飾之肽之EIC峰的積分面積總和的9.5%或約9.5%與13%或約13%之間，諸如約9.5%、9.6%、9.7%、9.8%、9.9%、10.0%、10.1%、10.2%、10.3%、10.4%、10.5%、10.6%、10.7%、10.8%、10.9%、11.0%、11.1%、11.2%、11.3%、11.4%、11.5%、11.6%、11.7%、11.8%、11.9%、12.0%、12.1%、12.2%、12.3%、12.4%、12.5%、12.6%、12.7%、12.8%、12.9%或約13.0%。在一些實施例中，位置K416處之結合肽百分比為約11.2±1%。在一些實施例中，用於計算結合肽百分比的在位置K416處結合至IR700之肽及未經修飾肽對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸412-418。在一些實施例中，在西妥昔單抗重鏈之位置K416處結合至IR700之肽為約m/z 529.89之[MH3
]3+
肽。
在一些實施例中，對應於西妥昔單抗重鏈之肽(包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置449之離胺酸(K449))之提取離子層析圖(EIC)峰之積分面積(結合肽百分比)係在對應未經修飾肽之EIC峰及對應於位置K449處修飾之肽之EIC峰的積分面積總和的6%或約6%與10%或約10%之間，諸如約6.0%、6.1%、6.2%、6.3%、6.4%、6.5%、6.6%、6.7%、6.8%、6.9%、7.0%、7.1%、7.2%、7.3%、7.4%、7.5%、7.6%、7.7%、7.8%、7.9%、8.0%、8.1%、8.2%、8.3%、8.4%、8.5%、8.6%、8.7%、8.8%、8.9%、9.0%、9.1%、9.2%、9.3%、9.4%、9.5%、9.6%、9.7%、9.8%、9.9%或約10.0%。在一些實施例中，位置K449處之結合肽百分比為約7.6±1%。在一些實施例中，用於計算結合肽百分比的在位置K449處結合至IR700之肽及未經修飾肽對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸442-449。在一些實施例中，在西妥昔單抗重鏈之位置K449處結合至IR700之肽為約m/z 779.33之[MH2
]2+
肽。
在一些實施例中，對應於西妥昔單抗輕鏈之肽(包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置107之離胺酸(K107))之提取離子層析圖(EIC)峰之積分面積(結合肽百分比)係在對應未經修飾肽之EIC峰及對應於位置K107處修飾之肽之EIC峰的積分面積總和的2%或約2%與5%或約5%之間，諸如約2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3.0%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、3.6%、3.7%、3.8%、3.9%、4.0%、4.1%、4.2%、4.3%、4.4%、4.5%、4.6%、4.7%、4.8%、4.9%或約5.0%。在一些實施例中，位置K107處之結合肽百分比為約3.4±1%。在一些實施例中，用於計算結合肽百分比的在位置K107處結合至IR700之肽及未經修飾肽對應於SEQ ID NO: 2之胺基酸104-108。在一些實施例中，在西妥昔單抗輕鏈之位置K107處結合至IR700之肽為約m/z 714.34之[MH2
]2+
肽。
在一些實施例中，對應於西妥昔單抗輕鏈之肽(包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置145之離胺酸(K145))之提取離子層析圖(EIC)峰之積分面積(結合肽百分比)係在對應未經修飾肽之EIC峰及對應於位置K145處修飾之肽之EIC峰的積分面積總和的7%或約7%與11%或約11%之間，諸如約7.0%、7.1%、7.2%、7.3%、7.4%、7.5%、7.6%、7.7%、7.8%、7.9%、8.0%、8.1%、8.2%、8.3%、8.4%、8.5%、8.6%、8.7%、8.8%、8.9%、9.0%、9.1%、9.2%、9.3%、9.4%、9.5%、9.6%、9.7%、9.8%、9.9%、10.0%、10.1%、10.2%、10.3%、10.4%、10.5%、10.6%、10.7%、10.8%、10.9%或約11.0%。在一些實施例中，位置K145處之結合肽百分比為約9.3±1%。在一些實施例中，用於計算結合肽百分比的在位置K145處結合至IR700之肽及未經修飾肽對應於SEQ ID NO: 2之胺基酸143-149。在一些實施例中，在西妥昔單抗輕鏈之位置K145處結合至IR700之肽為約m/z 829.36之[MH2
]2+
肽。
在一些實施例中，對應於西妥昔單抗輕鏈之肽(包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置188之離胺酸(K188))之提取離子層析圖(EIC)峰之積分面積(結合肽百分比)係在對應未經修飾肽之EIC峰及對應於位置K188處修飾之肽之EIC峰的積分面積總和的0.5%或約0.5%與4%或約4%之間，諸如約0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3.0%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、3.6%、3.7%、3.8%、3.9%或約4.0%。在一些實施例中，位置K188處之結合肽百分比為約2.1±1%。在一些實施例中，用於計算結合肽百分比的在位置K188處結合至IR700之肽及未經修飾肽對應於SEQ ID NO: 2之胺基酸184-190。在一些實施例中，在西妥昔單抗輕鏈之位置K188處結合至IR700之肽為約m/z 415.67之[MH4
]4+
肽。
在一些實施例中，對應於西妥昔單抗輕鏈之肽(包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置190之離胺酸(K190))之提取離子層析圖(EIC)峰之積分面積(結合肽百分比)係在對應未經修飾肽之EIC峰及對應於位置K190處修飾之肽之EIC峰的積分面積總和的1.5%或約1.5%與5%或約5%之間，諸如約1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3.0%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、3.6%、3.7%、3.8%、3.9%、4.0%、4.1%、4.2%、4.3%、4.4%、4.5%、4.6%、4.7%、4.8%、4.9%或約5.0%。在一些實施例中，位置K190處之結合肽百分比為約3.5±1%。在一些實施例中，用於計算結合肽百分比的在位置K190處結合至IR700之肽及未經修飾肽對應於SEQ ID NO: 2之胺基酸189-207。在一些實施例中，在西妥昔單抗輕鏈之位置K190處結合至IR700之肽為約m/z 970.76之[MH3
]3+
肽。
在一些實施例中，對應於西妥昔單抗輕鏈之肽(包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置207之離胺酸(K207))之提取離子層析圖(EIC)峰之積分面積(結合肽百分比)係在對應未經修飾肽之EIC峰及對應於位置K207處修飾之肽之EIC峰的積分面積總和的0.5%或約0.5%與4%或約4%之間，諸如約0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3.0%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、3.6%、3.7%、3.8%、3.9%或約4.0%。在一些實施例中，位置K207處之結合肽百分比為約2.0±1%。在一些實施例中，用於計算結合肽百分比的在位置K207處結合至IR700之肽及未經修飾肽對應於SEQ ID NO: 2之胺基酸191-211。在一些實施例中，在西妥昔單抗輕鏈之位置K207處結合至IR700之肽為約m/z 1050.48之[MH3
]3+
肽。
在一些實施例中，所提供組合物之胰蛋白酶消化產生如藉由質譜法(例如，以正離子模式)偵測之複數個IR700結合肽的計算分數模式(結合肽%)，進而產生組合物之肽質量指紋。
在一些實施例中，經胰蛋白酶消化、LC/MS分析之組合物含有肽之群體，其中組合物中第一組偵測之經IR700修飾之肽的豐度(或其偵測之頻率)大於其他經修飾肽之豐度或偵測頻率，且第一組包括以下中之一或多者：西妥昔單抗重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置215之離胺酸(K215)；西妥昔單抗重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置292之離胺酸(K292)；西妥昔單抗重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置416之離胺酸(K416)；及西妥昔單抗輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置145之離胺酸(K145)。在一些此類實施例中，IR700結合之EIC峰之面積百分比係對應經修飾及未經修飾肽之EIC峰總面積的至少約7.5%，諸如對應經修飾及未經修飾肽之EIC峰總面積的約至少8%、8.5%或至少9%。在一些實施例中，IR700結合之EIC峰之面積百分比係在對應經修飾及未經修飾肽之EIC峰總面積的約7.5%與20%之間，諸如對應經修飾及未經修飾肽之EIC峰總面積的約7.5%、8%、8.5%、9.0%、9.1%、9.2%、9.3%、9.4%、9.5%、9.6%、9.7%、9.8%、9.9%、10.0%、10.1%、10.2%、10.3%、10.4%、10.5%、10.6%、10.7%、10.8%、10.9%、11.0%、12%、12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%、15%、15.5%、16%、16.5%、17%、18%、19%或至少20%。
在一些實施例中，組合物中第二組偵測之經IR700修飾之肽的豐度(或其偵測之頻率)大於其他經修飾肽之豐度或偵測頻率(但豐度或偵測頻率低於第一組)，且該第二組包括以下中之一或多者：西妥昔單抗重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置336之離胺酸(K336)；及西妥昔單抗重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置449之離胺酸(K449)。在一些此類實施例中，IR700結合之EIC峰之面積百分比係對應經修飾及未經修飾肽之EIC峰總面積的至少約4%，諸如對應經修飾及未經修飾肽之EIC峰總面積的約至少4%、4.5%或至少5%，但豐度或頻率小於第一組經修飾肽。在一些實施例中，IR700結合之EIC峰之面積百分比係在對應經修飾及未經修飾肽之EIC峰總面積的約4%與9%之間，諸如對應經修飾及未經修飾肽之EIC峰總面積的約4%、4.5%、5%、5.1%、5.2%、5.3%、5.4%、5.5%、5.6%、5.7%、5.8%、5.9%、6.0%、6.1%、6.2%、6.3%、6.4%、6.5%、6.6%、6.7%、6.8%、6.9%、7.0%、7.1%、7.2%、7.3%、7.4%、7.5%、7.6%、7.7%、7.8%、7.9%、8.0%、8.5%或9%。
在一些實施例中，組合物中第三組偵測之經IR700修飾之肽的豐度(或其偵測之頻率)大於其他經修飾肽之豐度或偵測頻率(但豐度或偵測頻率低於第一組及第二組)，且該第三組包括以下中之一或多者：西妥昔單抗輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置107之離胺酸(K107)；西妥昔單抗輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置190之離胺酸(K190)；西妥昔單抗重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置5之離胺酸(K5)；及西妥昔單抗重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置75之離胺酸(K75)。在一些此類實施例中，IR700結合之EIC峰之面積百分比係對應經修飾及未經修飾肽之EIC峰總面積的至少約2%，諸如對應經修飾及未經修飾肽之EIC峰總面積的約至少2.5%、2.7%或至少3%，但豐度或頻率低於第一組及第二組經修飾肽。在一些實施例中，IR700結合之EIC峰之面積百分比係在對應經修飾及未經修飾肽之EIC峰總面積的約2.5%與5.5%之間，諸如對應經修飾及未經修飾肽之EIC峰總面積的約2.5%、2.7%、3%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、3.6%、3.7%、3.8%、3.9%、4.0%、4.1%、4.2%、4.3%、4.4%、4.5%、4.6%、4.7%、4.8%、4.9%、5.0%或5.5%。
在一些實施例中，組合物中第四組偵測之經IR700修飾之肽的豐度(或其偵測之頻率)大於其他經修飾肽之豐度或偵測頻率(但豐度或偵測頻率低於第一組、第二組及第三組)，且該第四組包括以下中之一或多者：西妥昔單抗重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置248之離胺酸(K248)；西妥昔單抗重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置328之離胺酸(K328)；西妥昔單抗輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置188之離胺酸(K188)；及西妥昔單抗輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置207之離胺酸(K207)。在一些此類實施例中，IR700結合之EIC峰之面積百分比係對應經修飾及未經修飾肽之EIC峰總面積的至少約0.5%，諸如對應經修飾及未經修飾肽之EIC峰總面積的約至少1%、1.1%或至少1.2%，但豐度或頻率低於第一組、第二組及第三組經修飾肽。在一些實施例中，IR700結合之EIC峰之面積百分比係在對應經修飾及未經修飾肽之EIC峰總面積的約0.5%與3%之間，諸如對應經修飾及未經修飾肽之EIC峰總面積的約0.5%、1%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%或3%。
在一些實施例中，本文所提供之經胰蛋白酶消化、LC/MS分析之組合物含有以下：具有結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置5之離胺酸(K5)的IR700之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應經修飾及未經修飾肽之EIC峰總面積的至少約2.5%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置75之離胺酸(K75)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應經修飾及未經修飾多肽之EIC峰總面積的至少約2.5%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置215之離胺酸(K215)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應經修飾及未經修飾多肽之EIC峰總面積的至少約9%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置248之離胺酸(K248)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應經修飾及未經修飾多肽之EIC峰總面積的至少約0.5%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置292之離胺酸(K292)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比為約對應經修飾及未經修飾多肽之EIC峰總面積的至少約8.5%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置328之離胺酸(K328)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應經修飾及未經修飾多肽之EIC峰總面積的至少約0.5%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置336之離胺酸(K336)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應經修飾及未經修飾多肽之EIC峰總面積的至少約4.5%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置416之離胺酸(K416)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應經修飾及未經修飾多肽之EIC峰總面積的至少約9%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置449之離胺酸(K449)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應經修飾及未經修飾多肽之EIC峰總面積的至少約7%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置107之離胺酸(K107)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應經修飾及未經修飾多肽之EIC峰總面積的至少約2.5%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置145之離胺酸(K145)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應經修飾及未經修飾多肽之EIC峰總面積的至少約8.5%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置188之離胺酸(K188)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應經修飾及未經修飾多肽之EIC峰總面積的至少約1%；包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置190之離胺酸(K190)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應經修飾及未經修飾多肽之EIC峰總面積的至少約2.5%；及包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置207之離胺酸(K207)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應經修飾及未經修飾多肽之EIC峰總面積的至少約1%。
在一些實施例中，對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置5之離胺酸(K5)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約3.8±1%；對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置75之離胺酸(K75)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約3.5±1%；對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置215之離胺酸(K215)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約10.0±1%；對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置248之離胺酸(K248)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約1.7±1%；對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置292之離胺酸(K292)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約10.2±1%；對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置328之離胺酸(K328)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約1.3±1%；對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置336之離胺酸(K336)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約5.9±1%；對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置416之離胺酸(K416)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約11.2±1%；對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置449之離胺酸(K449)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約7.6±1%；對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置107之離胺酸(K107)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約3.4±1%；對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置145之離胺酸(K145)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約9.3±1%；對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置188之離胺酸(K188)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約2.1±1%；對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置190之離胺酸(K190)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約3.5±1%；及對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置207之離胺酸(K207)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約2±1%。
在一些實施例中，使用具有對應於以下之胺基序列之肽計算面積百分比：對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸1-38、胺基酸72-81、胺基酸213-216、胺基酸225-250、胺基酸291-294、胺基酸325-336、胺基酸329-340、胺基酸412-418及胺基酸442-449的胺基酸序列；及對應於SEQ ID NO: 2之胺基酸104-108、胺基酸143-149、胺基酸184-190、胺基酸189-207及胺基酸191-211的胺基酸序列。
在一些實施例中，本文提供包含結合至IR700分子之西妥昔單抗分子之群體的組合物，其中當藉由質譜法分析組合物時：在輕鏈離胺酸145 (K145)處含有IR700染料結合之肽與在重鏈離胺酸215 (K215)處含有IR700染料結合之肽之間的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；在輕鏈離胺酸145 (K145)處含有IR700染料結合之肽與在重鏈離胺酸292 (K292)處含有IR700染料結合之肽之間的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；在輕鏈離胺酸145 (K145)處含有IR700染料結合之肽與在重鏈離胺酸336 (K336)處含有IR700染料結合之肽之間的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；在輕鏈離胺酸145 (K145)處含有IR700染料結合之肽與在重鏈離胺酸416 (K416)處含有IR700染料結合之肽之間的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；及/或在輕鏈離胺酸145 (K145)處含有IR700染料結合之肽與在重鏈離胺酸449 (K449)處含有IR700染料結合之肽之間的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。
在一些實施例中，本文提供包含西妥昔單抗分子之群體的組合物，其中當藉由質譜法分析組合物時：在重鏈離胺酸215 (K215)處含有IR700染料結合之肽與在重鏈離胺酸292 (K292)處含有IR700染料結合之肽之間的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；在重鏈離胺酸215 (K215)處含有IR700染料結合之肽與在重鏈離胺酸336 (K336)處含有IR700染料結合之肽之間的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；在重鏈離胺酸215 (K215)處含有IR700染料結合之肽與在重鏈離胺酸416 (K416)處含有IR700染料結合之肽之間的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；及/或在重鏈離胺酸215 (K215)處含有IR700染料結合之肽與在重鏈離胺酸449 (K449)處含有IR700染料結合之肽之間的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。
在一些實施例中，本文提供包含西妥昔單抗分子之群體的組合物，其中當藉由質譜法分析組合物時：在重鏈離胺酸292 (K292)處含有IR700染料結合之肽與在重鏈離胺酸336 (K336)處含有IR700染料結合之肽之間的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；在重鏈離胺酸292 (K292)處含有IR700染料結合之肽與在重鏈離胺酸416 (K416)處含有IR700染料結合之肽之間的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；及/或在重鏈離胺酸292 (K292)處含有IR700染料結合之肽與在重鏈離胺酸449 (K449)處含有IR700染料結合之肽之間的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。
在一些實施例中，本文提供包含西妥昔單抗分子之群體的組合物，其中當藉由質譜法分析組合物時：在重鏈離胺酸336 (K336)處含有IR700染料結合之肽與在重鏈離胺酸416 (K416)處含有IR700染料結合之肽之間的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；及/或在重鏈離胺酸336 (K336)處含有IR700染料結合之肽與在重鏈離胺酸449 (K449)處含有IR700染料結合之肽之間的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。
在一些實施例中，本文提供包含西妥昔單抗分子之群體的組合物，其中當藉由質譜法分析組合物時，在重鏈離胺酸416 (K416)處含有IR700染料結合之肽與在重鏈離胺酸449 (K449)處含有IR700染料結合之肽之間的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。
在一些實施例中，本文提供包含西妥昔單抗分子之群體的組合物，其中當藉由質譜法分析組合物時，在輕鏈離胺酸145 (K145)處含有IR700染料結合之肽、在重鏈離胺酸215 (K215)處含有IR700染料結合之肽、在重鏈離胺酸292 (K292)處含有IR700染料結合之肽及在重鏈離胺酸416 (K416)處含有IR700染料結合之肽之間的比率為約1:1:1:1。
在一些實施例中，本文提供包含SEQ ID NO: 2之組合物，其中離胺酸145結合至IR700染料。在一些態樣中，組合物進一步包含SEQ ID NO: 1，其中SEQ ID NO: 1之離胺酸215、離胺酸292及離胺酸416及視情況SEQ ID NO: 1之離胺酸449各自結合至IR700染料。
在一些實施例中，本文提供包含結合至IR700染料之西妥昔單抗的結合物，其中至少一個IR700染料結合至抗體輕鏈中之離胺酸。在一些態樣中，IR700染料結合在西妥昔單抗之輕鏈之位置145處的離胺酸。
在一些實施例中，本文提供包含結合至IR700染料之西妥昔單抗的結合物，其中至少一個IR700染料結合至抗體重鏈中之離胺酸。在一些態樣中，IR700染料分子在選自K215、K292、K416及K449組成之群的重鏈中之離胺酸殘基處結合。
在所提供之實施例中之任一者中，西妥昔單抗可包含在重鏈中之2個或更多個離胺酸殘基處結合之IR700染料。在一些態樣中，西妥昔單抗包含在重鏈中之3個離胺酸殘基處結合之IR700染料。
在所提供之實施例中之任一者中，西妥昔單抗可具有在離胺酸殘基145處結合至西妥昔單抗之輕鏈的IR700染料。
在所提供之實施例中之任一者中，可藉由具有約600 nm與850 nm之間的波長之照射活化結合物且藉此獲得細胞殺死活性。在一些態樣中，波長為690 nm ± 50 nm。
在一些實施例中，本文提供包含結合至IR700染料之西妥昔單抗之群體的組合物，其中至少70%、80%、90%或大於90%之群體具有至少一個IR700染料結合至西妥昔單抗輕鏈上之離胺酸。在一些態樣中，輕鏈中結合之主要離胺酸殘基為K145。
在一些實施例中，本文提供包含結合至IR700染料之西妥昔單抗之群體的組合物，其中至少70%、80%、90%或大於90%之群體具有至少一個IR700染料結合至西妥昔單抗重鏈上之離胺酸。在一些態樣中，重鏈中結合之主要離胺酸殘基為K215、K292、K416及K449中之一或多者。
在所提供之實施例中之任一者中，至少70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗分子之群體可具有結合至西妥昔單抗重鏈上之兩個或多於兩個離胺酸的IR700染料。
在一些實施例中，本文提供包含結合至IR700染料之西妥昔單抗之群體的組合物，其中不超過約20%之群體為未結合抗體。在一些態樣中，小於10%之群體為未結合抗體。在一些態樣中，小於約10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之群體為未結合抗體。
在所提供之實施例中之任一者中，群體中染料與西妥昔單抗之比率可為約2:1、約2.5:1或約3:1。
在一些實施例中，本文提供包含結合至IR700染料之西妥昔單抗的組合物，其中組合物包含小於或小於約0.6%、0.5%、0.4%或0.3%的游離染料(例如，未結合IR700染料)。在一些態樣中，組合物包含至少或至少約95%、96%、97%或98%之單體。在一些態樣中，組合物包含小於或小於約5%、4%或3%之高分子量物種。在一些態樣中，組合物包含小於或小於約30%、20%、25%、20%、15%或10%之未結合抗體。在一些態樣中，組合物在暗處或少光條件下儲存6個月之後，游離染料(例如，未結合IR700染料)之百分比實質上未改變。
在所提供之實施例中之任一者中，至少70%、80%、90%或大於90%之群體可具有至少一個IR700染料結合至抗體輕鏈上之離胺酸。在一些態樣中，輕鏈中結合之主要離胺酸殘基為K145。
在所提供之實施例中之任一者中，至少70%、80%、90%或大於90%之群體可具有至少一個IR700染料結合至抗體重鏈上之離胺酸。在一些態樣中，重鏈中結合之主要離胺酸殘基為K215、K292、K416及K449中之一或多者。
IV. 製造西妥昔單抗-IR700結合物之方法
本文亦提供製備、製造或產生本文所提供之結合物及/或組合物之方法，該等結合物及組合物包括在輕鏈及/或重鏈上之一或多個特定離胺酸殘基或位置處具有IR700染料的西妥昔單抗-IR700結合物及西妥昔單抗-IR700結合物之群體。在一些實施例中，方法包括提供使得達成特定染料與抗體之比率之條件。在一些實施例中，方法包括提供以下條件：使得在消化及分析包含結合物之組合物之後，達成肽及經修飾肽之特定類型及/或相對比例及/或質譜(例如，如藉由LC/MS評定)。在一些實施例中，方法包括提供以下條件：使得與除離胺酸位置之外的位置處之西妥昔單抗結合之染料的量實質上減少，使得組合物中相當大部分之IR700染料分子在西妥昔單抗內之離胺酸處共價結合。
在一些實施例中，提供西妥昔單抗-IR700結合物及包含穩定且一致的西妥昔單抗-IR700結合物之群體之組合物。關於結合物，術語「一致」係指結合物或結合物之群體的組合物，其中在結合過程之後，結合物之DAR (染料與抗體之比率)及組合物中游離染料的量隨時間推移保持實質上相同。在一些過程中，IR700染料可變成在除離胺酸處之外的位置處(諸如經由硫醇酯及酪胺酸酯)與抗體結合。此等非離胺酸結合位置係不穩定的，使得隨時間推移，IR700染料分離且釋放至組合物中，使得組合物隨時間推移不一致。
本文提供製造一致的西妥昔單抗-IR700結合物及一致的西妥昔單抗-IR700結合物群體之方法。在本文所描述之製造步驟中之一些或全部中，反應組分及反應步驟在避光條件下進行，使得染料及/或結合物不曝露於任何環境光或不曝露於強度大於700勒克司、大於600勒克司、大於500勒克司、大於400勒克司、大於300勒克司、大於200勒克司或大於100勒克司之光。在製造之一些實施例中，染料及結合物不曝露於強度大於700勒克司之光超過10分鐘或超過5分鐘。在製造之一些實施例中，染料及結合物不曝露於強度大於200勒克司之光超過10分鐘或超過5分鐘。參見例如如WO2017/031363公開之PCT/US2016/047636。
在一些實施例中，製造結合物之方法包括製備或生產結合物之步驟。在一些實施例中，此類方法包括提供酞菁染料。在一些實施例中，以諸如水溶液之水性形式提供酞菁染料。在一些實施例中，將染料以諸如凍乾粉之凍乾形式提供且復水或溶解於溶劑中以形成水溶液。舉例而言，在一些實施例中，將含有反應性基團之酞菁染料(例如，IR700 NHS酯)溶解於溶劑中。在一些實施例中，方法包括將酞菁染料溶解於溶劑中之步驟，諸如在染料與抗體結合之前。在一些實施例中，溶劑為有機溶劑，諸如二甲亞碸(DMSO)或DMF。在一些實例中，溶劑為基於水之溶劑。在一些實施例中，將染料溶解於濃度介於0.1 mg/mL或約0.1 mg/mL至100 mg/ml或約100 mg/ml、l mg/mL或約l mg/mL至50 mg/mL或約50 mg/mL、1 mg/mL或約1 mg/mL至15 mg/mL或約15 mg/mL之範圍內的溶劑中，或溶解於濃度為或約10 mg/mL之溶劑中。在一些實施例中，在製備用於本方法之染料之步驟期間，保護諸如IR700 NHS酯之酞菁染料免於曝露於白光。
在一些實施例中，製備或生產結合物之步驟包括提供諸如西妥昔單抗之抗體，用於與諸如IR700之酞菁染料結合。在一些實施例中，在與酞菁染料結合之前製備抗體。在一些實施例中，製備抗體包括在結合反應之前將抗體濃縮或稀釋至特定量或濃度。在一些實施例中，製備抗體包括將抗體交換至緩衝液(諸如與結合反應相容或適合於結合反應之緩衝液)中。在一些實施例中，製備抗體包括將pH調節至適用於結合反應之pH。舉例而言，抗體在介於或介於約6與10之間，諸如介於或介於約8與9之間，諸如約8.5，諸如8.46之pH下製備。
在一些實施例中，諸如使用超過濾/透濾作用，諸如使用切向流過濾(TFF)，將抗體緩衝交換至緩衝液中。在一些實施例中，TFF包含再生膜，諸如再生纖維素膜。在一些實施例中，抗體經交換至其中之緩衝液為磷酸鈉緩衝液，諸如100 mM磷酸鈉，諸如pH為8.5或pH 8.65。在一些實施例中，進行切向流過濾直至濾液達至所需pH。在一些實施例中，所需pH在6與10之間或在約6與10之間，諸如在8與9之間或在約8與9之間，諸如約8.5，諸如8.46。
在一些實施例中，以在0.01 g或約0.01 g與100 g或約100 g之間、在1 g或約1 g與50 g或約50 g之間、在1 g或約1 g與25 g或約25 g之間、在5 g或約5 g與15 g或約15 g之間或12 g或約12 g之量提供抗體。在一些實施例中，抗體製劑之體積係在0.01 L或約0.01 L與100 L或約100 L之間、在1 L或約1 L與50 L或約50 L之間、在約1 L與15 L或約15 L之間或為6 L或約6 L。在一些實施例中，抗體之濃度小於或小於約0.01 mg/mL，或在0.1 mg/mL或約0.1 mg/mL與100.0 mg/mL或約100.0 mg/mL之間、在0.1 mg/mL或約0.1 mg/mL與50 mg/mL或約50 mg/mL之間、在0.1 mg/mL或約0.1 mg/mL與10 mg/mL或約10 mg/mL之間，或在1 mg/mL或約1 mg/mL與5 mg/mL或約5 mg/mL之間，或為5 mg/mL或約5 mg/mL或為4.5 mg/mL或約4.5 mg/mL，或為2 mg/mL或約2 mg/mL、為10 mg/mL或約10 mg/mL。在一些實施例中，將抗體稀釋以使濃度在0.1 mg/mL或約0.1 mg/mL與100.0 mg/mL或約100.0 mg/mL之間、在0.1 mg/mL或約0.1 mg/mL與50 mg/mL或約50 mg/mL之間、在0.1 mg/mL或約0.1 mg/mL與10 mg/mL或約10 mg/mL之間、在1 mg/mL或約1 mg/mL與5 mg/mL或約5 mg/mL之間或在1.8 mg/mL或約1.8 mg/mL與2.4 mg/mL或約2.4 mg/mL之間，或稀釋至為或約2 mg/mL、約5 mg/mL或約10 mg/mL之濃度。
在一些實施例中，抗體經由諸如0.2 μm過濾器或0.22 μm過濾器之無菌過濾器過濾。在一些實施例中，諸如在低於30℃，諸如通常低於26℃、20℃、15℃、10℃，諸如通常在2℃或約2℃與8℃或約8℃之間的溫度下儲存製備之抗體。在一些實施例中，測定抗體之重量。
在一些實施例中，製造結合物之方法包括使抗體與諸如IR700之酞菁染料接觸之步驟。在一些實施例中，將酞菁染料及抗體在諸如反應容器之容器中混合在一起。在一些實施例中，在諸如反應容器之容器(container/vessel)中進行接觸步驟。在一些實施例中，容器為試管、瓶或酸瓶(carboy)。在一些實施例中，容器具有約或至少1 L、2 L、5 L、10 L、15 L、20 L、30 L、40 L、50 L或100 L之最大體積。在一些實施例中，容器為40 L酸瓶。在一些實施例中，容器具有約或至少100 μL、500 μL、1 mL、1.5 mL、5 mL、15 mL、50 mL、250 mL或500 mL之最大體積。在一些實施例中，容器(container/vessel)為半透明或不透明的，為綠色或琥珀色的，及/或以諸如鋁之不透明箔封蓋(諸如包覆)。
在一些實施例中，基於容器(container/vessel)中存在之抗體重量計算用於接觸抗體之染料的量。舉例而言，在一些實施例中，添加一定量的染料使得染料與抗體或約抗體之最終莫耳比為1:1或約1:1至1000:1或約1000:1、1:1或約1:1至100:1或約100:1、1:1或約1:1至10:1或約10:1、1:1或約1:1至4:1或約4:1或約4:1或4:1。
在一些實施例中，選擇染料與抗體之比率使得每一抗體併入所需數目個染料殘基。在一些實施例中，每一抗體之所需染料殘基數目為1至5或約1至5、2至5或約2至5、2至3或約2至3或為約3或3。
在一些實施例中，將染料及抗體在控制溫度下接觸，或在具有控制溫度之單元(諸如培育箱或冷凍機)中接觸。在一些實施例中，方法包括使酞菁染料(例如IR700)及抗體在介於4℃或約4℃至37℃或約37℃，諸如10℃或約10℃至30℃或約30℃、20℃或約20℃至30℃或約30℃、或23℃或約23℃至27℃或約27℃、或亦即約25℃ + 2.0℃、25℃ + 1.0℃或25℃ + 0.3℃，諸如亦即25℃或約25℃之範圍內的溫度下接觸。在一些實施例中，在室溫下，諸如在21℃與25℃之間，諸如約23℃進行接觸步驟。
在一些實施例中，接觸步驟包括培育，諸如使染料及抗體反應。在一些實施例中，接觸可在反應容器中進行。在一些實施例中，接觸包括針對至少一部分之接觸將合併之染料及抗體組合物混合(例如藉由攪拌)。在一些實施例中，諸如在攪拌盤上攪拌內容物。在一些實施例中，將內容物攪拌約或至少5至30分鐘，諸如約5至20分鐘，諸如約10至15分鐘。
在一些實施例中，接觸步驟進行至少5分鐘、至少15分鐘、至少30分鐘、至少60分鐘、至少90分鐘、至少120分鐘、至少240分鐘、至少360分鐘、至少24小時、至少72小時或至少120小時。在一些實施例中，接觸步驟進行5分鐘至150小時、5分鐘至100小時、5分鐘至48小時、5分鐘至24小時、5分鐘至6小時、5分鐘至2小時、5分鐘至90分鐘、5分鐘至60分鐘、5分鐘至30分鐘、30分鐘至150小時、30分鐘至100小時、30分鐘至48小時、30分鐘至24小時、30分鐘至6小時、30分鐘至2小時、30分鐘至90分鐘、30分鐘至60分鐘、60分鐘至150小時、60分鐘至100小時、60分鐘至48小時、60分鐘至24小時、60分鐘至6小時、60分鐘至2小時、60分鐘至90分鐘、90分鐘至150小時、90分鐘至100小時、90分鐘至48小時、90分鐘至24小時、90分鐘至6小時、90分鐘至2小時、2小時至150小時、2小時至100小時、2小時至48小時、2小時至24小時、2小時至6小時、6小時至150小時、6小時至100小時、6小時至48小時、6小時至24小時、24小時至150小時、24小時至100小時、24小時至48小時、48小時至150小時、48小時至100小時或100小時至150小時。在一些實施例中，接觸進行5分鐘至6小時(諸如5分鐘至4小時、5分鐘至2小時)、5分鐘至60分鐘、5分鐘至30分鐘(諸如約5分鐘至20分鐘，諸如約10分鐘至15分鐘)之一段時間。在一些實施例中，方法包括諸如藉由酞菁染料(例如IR700)及抗體(例如抗體)之培育來接觸至少或至少約15分鐘、至少或至少約30分鐘、至少或至少約60分鐘、至少或至少約90分鐘、至少或至少約120分鐘或至少或至少約150分鐘。在一些實施例中，方法包括諸如使染料及抗體反應來接觸介於或介於約90與150分鐘之間，諸如120分鐘。
在一些實施例中，將染料及抗體在可包括諸如DMSO或DMF之有機溶劑之水性緩衝液中混合。在一些實施例中，溶劑為基於水之溶劑。在一些實施例中，緩衝液之pH在6與10之間或在約6與10之間，諸如在7與10之間或在約7與10之間，在8與10之間或在約8與10之間，或在8與9之間或在約8與9之間。
在一些實施例中，在接觸步驟之後，諸如藉由添加諸如甘胺酸之淬滅劑來淬滅反應物。術語「淬滅」係指使未反應之反應性基團與過量非特異性淬滅劑(quenching agent/quencher)反應，諸如停止染料與抗體之間的反應之過程。使用之特定試劑或淬滅劑視與染料結合之特定反應性基團而定。舉例而言，NHS酯交聯反應可在含有胺之緩衝液，諸如含有Tris或甘胺酸之緩衝液存在下淬滅。
在一些實施例中，淬滅步驟移除任何未反應之染料。在一些實施例中，淬滅步驟移除已與抗體上之非離胺酸位置反應之任何染料，以便形成硫醇酯或酪胺酸酯。在一些實施例中，進行淬滅步驟使得實質上所有與抗體反應之染料處於抗體上之一或多個離胺酸位置。
在一些實施例中，添加之淬滅劑的量為至少或至少約200 mM、至少或至少約500 mM、至少或至少約1 M、至少或至少約2 M、至少或至少約5 M或至少或至少約10 M。在一些實施例中，淬滅反應包括添加1 M甘胺酸。在一些實施例中，在將淬滅劑添加至結合反應之後，其最終濃度為至少或至少約1 mM、至少或至少約2 mM、至少或至少約3 mM、至少或至少約4 mM、至少或至少約5 mM或至少或至少約10 mM。在一些實施例中，諸如甘胺酸之淬滅試劑之最終濃度為4.2 nM或約4.2 nM。在一些實施例中，淬滅步驟之pH在6與10之間或在約6與10之間，諸如在7與10之間或在約7與10之間，在8與10之間或在約8與10之間或在8與9之間或在約8與9之間。在一些實施例中，淬滅步驟之pH為或約8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0。
在一些實施例中，在淬滅步驟期間，將反應容器之內容物諸如在攪拌盤上混合(諸如攪拌)。在一些實施例中，將反應容器之內容物在100 rpm與1000 rpm之間或在約100 rpm與1000 rpm之間、在200 rpm與500 rpm之間或在約200 rpm與500 rpm之間下攪拌，或在300 + 50 rpm下或在300 rpm下攪拌。在一些實施例中，淬滅反應混合至少或至少約5分鐘、至少或至少約10分鐘或至少或至少約15分鐘。在一些實施例中，淬滅反應混合約10至12分鐘。
在一些實施例中，在混合淬滅反應之後，將諸如反應容器之容器諸如在培育箱中返回至控制溫度。在一些實施例中，諸如自21℃或約21℃至30℃或約30℃，諸如自23℃或約23℃至27℃或約27℃，諸如25℃或約25℃培育容器之內容物。在一些實施例中，淬滅步驟之培育(諸如在將淬滅劑與反應容器之內容物混合之後的額外培育)進行至少或至少約30分鐘、60分鐘、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、12-15小時、12-16小時、15-20小時、12-24小時、約20小時或約24小時。在一些實施例中，培育進行12或約12小時或隔夜。
在一些實施例中，本文提供一種製造穩定結合物之方法，其包含：a)使西妥昔單抗與IR700染料在產生結合物之條件下接觸，該結合物包含在一或多個選自由以下組成之群之西妥昔單抗之離胺酸處結合的IR700染料：K145 (輕鏈)、K215 (重鏈)、K292 (重鏈)、K416 (重鏈)及K449 (重鏈)；b)使結合物在結合期間及/或之後經受一個步驟，該步驟實質上減少與西妥昔單抗非特異性結合之IR700染料；c)在醫藥學上可接受之緩衝液中調配結合物，其中在步驟a)至c)中之每一者中，染料及結合物曝露之唯一光具有在約400 nm至約650 nm範圍內的波長或具有小於500勒克司之強度。在一些態樣中，步驟b)包含在約8.4之pH下進行IR700染料與西妥昔單抗之間的結合反應。在一些態樣中，步驟b)包含在完成IR700染料與西妥昔單抗之間的結合反應之後，使結合物在約8.4之pH下經甘胺酸淬滅反應。在一些態樣中，淬滅反應進行隔夜或大於約6小時之持續時間。
在一些實施例中，本文所提供之製造方法包括其中調配、純化或分離結合物以產生原料藥之一或多個步驟。在一些實施例中，將結合物調配至濃度在0.1 mg/mL或約0.1 mg/mL至1000 mg/mL或約1000 mg/mL、0.1 mg/mL至約500 mg/mL、0.1 mg/mL至約200 mg/mL、0.1 mg/mL至約100 mg/mL、0.1 mg/mL至約50 mg/mL、0.1 mg/mL至約10 mg/mL、0.5 mg/mL至約10 mg/mL或0.5 mg/mL至約5 mg/mL之範圍內。
在一些實施例中，調配結合物之方法可包括濃縮或稀釋結合物，將結合物交換至醫藥學上可接受之緩衝液中或無菌處理。
在一些實施例中，調配步驟包括濃縮結合物。在一些實施例中，濃縮步驟包括減小結合物之體積。在一些實施例中，使用超過濾/滲濾系統實現體積減小。在一些實施例中，將結合物之體積自或自約10 L、15 L、20 L、25 L、30 L、40 L或50 L減小至或至約5 L、8 L、9 L、10 L、12 L或15 L。在一些實施例中，濃縮之後的最終體積在8 L與10 L之間或在約8 L與10 L之間。在一些實施例中，將結合物濃縮至濃度介於或介於約0.1 mg/mL至約1000 mg/mL、0.1 mg/mL至約500 mg/mL、0.1 mg/mL至約200 mg/mL、0.1 mg/mL至約100 mg/mL、0.1 mg/mL至約50 mg/mL、0.1 mg/mL至約10 mg/mL、0.5 mg/mL至約10 mg/mL、0.5 mg/mL至約5 mg/mL或1.8 mg/mL至約2.1 mg/mL之範圍內。在一些實施例中，將結合物濃縮至或至約2.0 mg/mL、約5.0 mg/mL或約10 mg/mL。
在一些實施例中，調配步驟包括稀釋結合物。在一些實施例中，結合物之稀釋包括將包含結合物之緩衝液的體積諸如自或自約5 L、10 L、15 L、20 L、30 L、40 L或50 L增加至或至約20 L、30 L、40 L、50 L或75 L。在一些實施例中，將結合物稀釋至濃度介於或介於約0.1 mg/mL至約1000 mg/mL、0.1 mg/mL至約500 mg/mL、0.1 mg/mL至約200 mg/mL、0.1 mg/mL至約100 mg/mL、0.1 mg/mL至約50 mg/mL、0.1 mg/mL至約10 mg/mL、0.5 mg/mL至約10 mg/mL或0.5 mg/mL至約5 mg/mL之範圍內。
在一些實施例中，調配步驟包括純化結合物。在一些實施例中，藉由凝膠滲透層析使用諸如SEPHADEX G-50管柱之設備或藉由滲析來純化結合物以移除未結合染料。在一些實施例中，諸如藉由使用切向流過濾(TFF)來超過濾或透濾結合物。在一些實施例中，在暗處或避光條件下進行超過濾/透濾作用以避免結合物曝露於環境光。
在一些實施例中，調配步驟包括將酞菁染料-抗體結合物(諸如IR700-抗體結合物)自反應緩衝液交換至醫藥學上可接受之緩衝液。在一些實施例中，可藉由超過濾/透濾作用進行緩衝液交換。
在一些實施例中，在諸如含有醫藥學上可接受之載劑或媒劑的醫藥學上可接受之緩衝液中調配結合物。一般而言，醫藥學上可接受之載劑或媒劑，諸如存在於醫藥學上可接受之緩衝液中之彼等，可為任何此項技術中已知的。E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 第19版(1995)之Remington's Pharmaceutical Sciences描述適用於醫藥上遞送一或多種治療性化合物之組合物及調配物。含有結合物之組合物可調配成適合之醫藥製劑(諸如溶液、懸浮液、錠劑、可分散錠劑、丸劑、膠囊、散劑、持續釋放調配物或酏劑)以供經口投與，以及調配成經皮貼片製劑及乾粉吸入劑。通常，使用此項技術中熟知之技術及程序將含有化合物之組合物調配成醫藥組合物(參見例如，Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 第四版, 1985, 126)。一般而言，調配模式隨投藥途徑而變化。可例如以WO2019/035053公開之PCT/US2019/035053中所描述調配包含酞菁染料-抗體結合物之醫藥組合物。
在一些實施例中，組合物之pH在6與10之間或在約6與10之間，諸如在6與8之間或在約6與8之間，在6.9與7.3之間或在約6.9與7.3之間，諸如約pH 7.1。在一些實施例中，醫藥學上可接受之緩衝液之pH為至少或至少約5、至少或至少約6、至少或至少約7、至少或至少約8、至少或至少約9、或至少或至少約10或為7.1。
在一些實施例中，提供一種穩定之染料結合物，諸如西妥昔單抗-IR700結合物。在一些實施例中，藉由實踐所提供之方法，結合物之純度、雜質、完整性、組合物及效能之變化不大於製造目的之可接受規格以支援臨床或商業用途。在實施例中，結合物為穩定的且展現最小聚集且保留效能及活性，諸如在染料之加工、製造或儲存之後。在一些實施例中，染料結合物穩定超過三個月、四個月、五個月，諸如通常超過6個月、超過7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月或更長。在一些實施例中，當在低於30℃之溫度下，諸如通常在2至8℃之溫度下儲存一段時間時，仍存在此類穩定性。
關於染料結合物，諸如西妥昔單抗-IR700結合物，術語「穩定」係指以下結合物，其中與儲存必要時間(例如，t=0)之前的結合物相比，在儲存超過必要時間(諸如超過三個月，例如超過或超過約6個月、12個月或24個月)之後，大於或大於約90%之結合物作為主要單體成分以樣品中存在之結合物之總分子量的百分比存在，不超過10.0%之結合物作為高分子量組分以樣品中存在之結合物之總分子量的百分比存在或結合物保留至少20%及至多100%之完整性，諸如其物理及功能品質，包括其純度(例如，單體含量相對於聚集體之百分比，諸如較高分子量組分之含量)、一致性(例如，化學組成，諸如結構特徵)、效能(例如，產生藥理反應所需要之濃度或量)或活性(例如，PIT殺死)中之一或多者。在一些實施例中，保留至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之純度、一致性、效能或活性。
本文亦提供藉由如前述實施例中任一者之方法製造之結合物之穩定組合物。在一些實施例中，結合物之穩定組合物包含結合至IR700染料之西妥昔單抗分子之群體，其中當藉由質譜法分析穩定結合物時，在輕鏈離胺酸145 (K145)處含有IR700染料結合之肽、在重鏈離胺酸215 (K215)處含有IR700染料結合之肽、在重鏈離胺酸292 (K292)處含有IR700染料結合之肽及在重鏈離胺酸416 (K416)處含有IR700染料結合之肽之間的比率為約1:1:1:1 (例如，參見闡述於SEQ ID NO: 1中之重鏈序列及/或闡述於SEQ ID NO: 2中之輕鏈序列中的位置編號)。
在一些實施例中，在結合物之穩定組合物中，在位置輕鏈中之離胺酸145 (K145)與重鏈中之離胺酸215 (K215)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。在一些實施例中，在結合物之穩定組合物中，在位置輕鏈中之離胺酸145 (K145)與重鏈中之離胺酸292 (K292)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。在一些實施例中，在結合物之穩定組合物中，在位置輕鏈中之離胺酸145 (K145)與重鏈中之離胺酸336 (K336)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。在一些實施例中，在結合物之穩定組合物中，在位置輕鏈中之離胺酸145 (K145)與重鏈中之離胺酸416 (K416)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。在一些實施例中，在結合物之穩定組合物中，在位置輕鏈中之離胺酸145 (K145)與重鏈中之離胺酸449 (K449)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。
在一些實施例中，在結合物之穩定組合物中，在位置重鏈中之離胺酸215 (K215)與重鏈中之離胺酸292 (K292)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。在一些實施例中，在結合物之穩定組合物中，在位置重鏈中之離胺酸215 (K215)與重鏈中之離胺酸336 (K336)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。在一些實施例中，在結合物之穩定組合物中，在位置重鏈中之離胺酸215 (K215)與重鏈中之離胺酸416 (K416)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。在一些實施例中，在結合物之穩定組合物中，在位置重鏈中之離胺酸215 (K215)與重鏈中之離胺酸449 (K449)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。
在一些實施例中，在結合物之穩定組合物中，在位置重鏈中之離胺酸292 (K292)與重鏈中之離胺酸336 (K336)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。在一些實施例中，在結合物之穩定組合物中，在位置重鏈中之離胺酸292 (K292)與重鏈中之離胺酸416 (K416)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。在一些實施例中，在結合物之穩定組合物中，及/或在位置重鏈中之離胺酸292 (K292)與重鏈中之離胺酸449 (K449)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。
在一些實施例中，在結合物之穩定組合物中，在位置重鏈中之離胺酸336 (K336)與重鏈中之離胺酸416 (K416)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。在一些實施例中，在結合物之穩定組合物中，在位置重鏈中之離胺酸336 (K336)與重鏈中之離胺酸449 (K449)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。
在一些實施例中，在結合物之穩定組合物中，在位置重鏈中之離胺酸416 (K416)與重鏈中之離胺酸449 (K449)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。
在一些實施例中，提供一種一致之染料結合物組合物。關於染料結合物組合物，術語「一致」係指在淬滅步驟之後，組合物中具有低含量或實質上無游離染料且隨時間推移在組合物中實質上無游離染料釋放之組合物。舉例而言，在淬滅步驟之後組合物中存在小於約5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%之游離染料且組合物中游離染料之量不在組合物儲存期間增加，包括儲存約1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月或至少1年、2年或超過2年。
關於製造結合物之組合物之術語「一致」係指在不同製造批次之間輕鏈及/或重鏈上與此類IR700之酞菁染料結合的特定位置之大致均一性。舉例而言，在製造西妥昔單抗-IR700結合物之本文所描述之組合物中，與染料結合之主要離胺酸位置及各離胺酸位置處之結合之間的比例在製造批次之間相對恆定。
V. 治療方法
所提供之組合物，諸如含有酞菁染料-抗體結合物之醫藥組合物，諸如本文所描述之IR700-西妥昔單抗結合物，可用於治療方法或治療方案(諸如光免疫療法(PIT)方法)中。光免疫療法為利用目標特異性光敏劑之分子靶向療法，該目標特異性光敏劑係基於IR700酞菁染料，結合至靶向分子(例如，西妥昔單抗)，靶向腫瘤細胞上細胞表面蛋白上之表皮生長因子受體(EGFR；ErbB-1；HER1；EGF受體)。所提供之結合物及組合物(諸如醫藥組合物)之方法及用途包括例如涉及向患有疾病、病況或病症之個體投與分子，隨後照射至PIT，藉此引起此類細胞或病原體之光解以實現疾病或病症之治療的治療方法及用途。在一些實施例中，方法可用於治療腫瘤或癌症，由此將投與之酞菁染料西妥昔單抗結合物(諸如IR700-西妥昔單抗結合物)靶向至與腫瘤相關之細胞，藉此引起此類細胞之光解，且在一些情況下，導致腫瘤之治療。用途包括組合物在此類方法及治療(諸如治療方案(therapeutic regimens/treatment regimens))中之用途，及此類組合物在製備藥劑以進行此類治療方法中之用途。在一些實施例中，方法及用途藉此治療個體中之疾病或病況或病症，諸如腫瘤或癌症。
本文提供用西妥昔單抗-IR700結合物進行PIT之方法。西妥昔單抗靶向腫瘤特異性細胞之表面上的EGFR。藉由用吸收光照射活化染料結合物激發光敏劑且引起腫瘤細胞之細胞殺死。一般而言，靶向光毒性似乎主要取決於染料結合物經由特異性靶向分子(例如，抗體)與細胞膜之結合。舉例而言，使用例示性抗體-IR700分子之研究指示結合物必須結合至細胞膜以具有活性，且有效細胞殺死不需要細胞內定位(參見例如，美國專利第8,524,239號及美國公開申請案第US20140120119號)。結合物結合細胞之光活化引起快速細胞死亡及壞死。
通常，PIT主要引起在細胞經照射之後酞菁染料結合物(諸如抗體-IR700結合物)所結合之彼等細胞之細胞死亡，而不表現識別抗體之細胞表面蛋白的細胞未大量殺死。因此，因為療法特異性地靶向疾病細胞，諸如腫瘤細胞，所以與健康組織或細胞相比，其作用對疾病組織具有高度選擇性。
本文提供組合物，其包括用於靶向表皮生長因子受體(EGFR；ErbB-1；HER1；EGF受體) (諸如癌細胞上之EGFR)之醫藥組合物。舉例而言，EGF受體HER1通常發現於腺癌中，腺癌可見於許多器官，諸如胰臟、乳房、前列腺及結腸中。
在一些實施例中，方法包括用EGFR抗體-酞菁結合物(諸如具有在癌症抗體之輕鏈及/或重鏈上之特定離胺酸殘基或離胺酸位置結合之IR700染料的西妥昔單抗-IR700結合物)治療癌前病變或癌症，其中癌症表現表皮生長因子受體(EGFR或HER1)抗原。此類癌症可包括(但不限於)頭頸癌、癌前異常增生、神經膠母細胞瘤、食道癌、喉癌、甲狀腺髓樣癌、非黑素瘤皮膚SCC、乳癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、胃癌、結腸直腸癌、腎癌、膀胱癌、胰臟癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、外陰癌、前列腺癌、陰莖癌、睪丸癌及肛門癌。
在一些實施例中，方法包括用西妥昔單抗-IR700結合物或含有本文所描述之西妥昔單抗-IR700結合物之群體的組合物治療頭頸癌。在一些實施例中，治療個體中來自頭頸癌之非所要細胞之方法包括：(a)向個體投與包含西妥昔單抗-IR700結合物或具有結合至如本文所描述之染料之特定位置的西妥昔單抗-IR700結合物之群體的組合物，及(b)以至少1 J cm−2
或1 J/cm光纖長度之劑量在660至740 nm之波長下照射非所要細胞，藉此移除或殺死個體中之非所要細胞。在一些實施例中，方法包括自本文所提供之避光裝置中之任一者投與西妥昔單抗-IR700結合物及/或其中在投藥步驟之前及期間，組合物不曝露於強度大於500勒克司之環境光。在一些實施例中，在690 nm下或在690 nm ± 50 nm下進行照射。在一些實施例中，結合物以為或約160 mg/m2
、320 mg/m2
、640 mg/m2
或1280 mg/m2
之量投與。
在一些實施例中，治療個體中之頭頸癌之方法包括：(a)向患有頭頸癌之個體靜脈內投與作為經調配組合物之包含西妥昔單抗-IR700結合物或具有結合至如本文所描述之染料之特定位置的西妥昔單抗-IR700結合物之群體的組合物，其中結合物以為或約640 mg/m2
之量投與；及b)在投與結合物之後，以至少或至少約至少或至少約50 J cm-2
或100 J/cm光纖長度之劑量在690 ± 20 nm之波長下輻射病變，藉此治療個體中之癌症。在方法之一些實施例中，在投與西妥昔單抗-IR700之後20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32小時或約該等時間投與或在投與西妥昔單抗-IR700後約24小時± 4小時投與光照射以用於照射病變。
在一些實施例中，本文提供一種殺死腫瘤細胞之方法，其包含：在或接近腫瘤細胞之部位投與包含本文所揭示之結合物的醫藥組合物；以約25 J cm−2
至約400 J cm−2
或約25 J/cm光纖長度至約500 J/cm光纖長度之劑量在600 nm至850 nm之波長下照射接近腫瘤細胞之區域，藉此殺死腫瘤細胞。
在一些實施例中，本文提供一種殺死腫瘤細胞之方法，其包含：在或接近腫瘤細胞之部位投與包含本文所揭示之組合物的醫藥組合物；以約25 J cm−2
至約400 J cm−2
或約25 J/cm光纖長度至約500 J/cm光纖長度之劑量在600 nm至850 nm之波長下照射接近腫瘤細胞之區域，藉此殺死腫瘤細胞。
在一些實施例中，本文提供一種治療疾病或病況之方法，其包含：向個體投與包含本文所揭示之結合物的醫藥組合物；以約25 J cm−2
至約400 J cm−2
或約25 J/cm光纖長度至約500 J/cm光纖長度之劑量在600 nm至850 nm之波長下照射個體中接近腫瘤或病變之區域，藉此治療疾病或病況。
在一些實施例中，本文提供一種治療疾病或病況之方法，其包含：向個體投與包含本文所揭示之組合物的醫藥組合物；以約25 J cm−2
至約400 J cm−2
或約25 J/cm光纖長度至約500 J/cm光纖長度之劑量在600 nm至850 nm之波長下照射個體中接近腫瘤或病變之區域，藉此治療疾病或病況。
在方法之一些實施例中，將待投與之西妥昔單抗-IR700結合物調配於包含非離子界面活性劑及/或保護劑之組合物中。在一些實施例中，將西妥昔單抗-IR700結合物調配於包含非離子界面活性劑(諸如聚山梨醇酯、聚乙二醇、Triton X-100、CHAPS或普洛尼克酸(Pluronic acid) (F-68))及視情況保護劑(諸如海藻糖、山梨醇、木糖醇、甘露醇或蔗糖)之組合物中。在一些實施例中，將西妥昔單抗-IR700結合物調配於包含聚山梨醇酯及海藻糖之組合物中。在一些實施例中，將西妥昔單抗-IR700結合物調配於包含聚山梨醇酯-80及海藻糖之組合物中。在一些實施例中，將西妥昔單抗-IR700結合物調配於pH 7.1下包含10 mM磷酸鈉、0.02% (w/v)聚山梨醇酯-80及9% (w/v)海藻糖之組合物中。
在一些實施例中，個體為人類或非人類哺乳動物。在一些實施例中，個體為人類或獸醫學個體，諸如小鼠。在一些實施例中，個體為患有癌症或正針對癌症進行治療之哺乳動物，諸如人類。在一些實施例中，所揭示之組合物用於治療患有腫瘤(諸如本文所描述之腫瘤)之個體。在一些實施例中，腫瘤先前已進行治療，諸如以手術方式或以化學方式移除，且所揭示之組合物隨後用於殺死可保留於個體中之任何剩餘非所需腫瘤細胞。
所提供之含有結合物(諸如如本文所描述之西妥昔單抗-IR700結合物)之組合物可用於治療患有腫瘤(諸如癌症)或先前已進行此類移除或治療之任何哺乳動物個體，諸如人類。需要所揭示療法之個體可包括患有癌症之人類個體，其中癌細胞在其表面上表現腫瘤特異性蛋白質，該腫瘤特異性蛋白質可特異性結合至酞菁染料-抗體結合物。舉例而言，所揭示之組合物可單獨或與放射或其他化學療法組合用作癌症之初始治療。所揭示之組合物亦可用於先前放射或化學療法已失敗之患者中。因此，在一些實施例中，個體為已接受其他療法之個體，但彼等其他療法尚未提供所需治療反應。所揭示之組合物亦可用於患有局部及/或轉移癌之患者中。
A. 用額外治療劑之組合治療
在一些實施例中，本文所揭示之結合物或組合物與用於治療病變、疾病或病況之第二療法(例如，額外治療劑或抗癌治療)之添加一起投與且本文之方法與該第二療法之添加一起進行。在一些實施例中，用於治療之額外治療劑或第二治療劑為免疫調節劑、抗癌劑或其他藥劑，其可增加治療腫瘤之功效，在一些情況下，其可增加治療結果或經治療個體之存活期。在一些實施例中，額外治療劑或第二治療劑為免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，額外治療劑或第二治療劑為下文描述之任一種。
在投與含有酞菁染料-抗體結合物(例如，西妥昔單抗-IR700結合物)之組合物之前、期間或之後，個體可接受一或多種其他療法。在一個實例中，在投與結合物之前，個體接受一或多種治療以移除或減少腫瘤。在一些實施例中，在投與含有酞菁染料-抗體結合物之組合物之前、期間或之後，個體接受免疫調節劑。在一些實施例中，免疫調節劑為免疫檢查點抑制劑。
在本文之方法及組合物之一些實施例中，以與另一治療劑(諸如免疫調節劑或抗癌劑中之一者或兩者)組合提供酞菁染料-抗體結合物，諸如西妥昔單抗-IR700。在一些實施例中，酞菁染料-抗體結合物及其他治療劑可以單獨組合物形式封裝為製品用於一起、依序或間歇地投藥。組合可以套組形式封裝。在一些實施例中，將治療劑及酞菁染料-抗體結合物一起調配於同一組合物中。在一些實施例中，治療劑及酞菁染料-抗體結合物經調配為單獨的組合物。
在一些實施例中，投與之一或多種其他或額外藥劑或組合療法中之額外藥劑為未結合抗體。在一些實施例中，未結合抗體與結合物之抗體相同或實質上相同。舉例而言，在一些實施例中，在投與含有結合物之組合物之前，向個體投與靶向蛋白質或抗原之未結合抗體。在一些實施例中，在投與結合物之前至多96小時投與抗體。在一些實施例中，以介於或介於約10 mg/m2
至約500 mg/m2
範圍內之劑量投與抗體。舉例而言，抗體為西妥昔單抗，且在投與含有結合物之組合物之前至多96小時向個體投與西妥昔單抗。
在一些實施例中，投與之一或多種其他或額外藥劑或組合療法中之額外藥劑為免疫調節劑或抗癌劑。在一些實施例中，免疫調節劑、抗癌劑及/或酞菁染料-抗體結合物(例如，西妥昔單抗-IR700結合物)經調配為單獨的組合物。在一些實施例中，免疫調節劑作為與酞菁染料-抗體結合物之單獨組合物提供，且分別投與兩種組合物。在一些實施例中，抗癌劑作為與酞菁染料-抗體結合物之單獨組合物提供，且分別投與兩種組合物。在一些實施例中，用一或多種穩定劑調配酞菁染料-抗體結合物(例如，西妥昔單抗-IR700結合物)，其中穩定劑為非離子界面活性劑及/或保護劑，且以單獨及不同調配物投與免疫調節劑或抗癌劑。
在一些實施例中，將免疫調節劑及/或抗癌劑及酞菁染料-抗體結合物調配於同一組合物中。組合物可調配用於非經腸遞送(亦即，用於全身遞送)。舉例而言，組合物或組合物之組合經調配用於皮下遞送或用於靜脈內遞送。諸如酞菁染料-抗體結合物、免疫調節劑及/或抗癌劑之藥劑可藉由不同投藥途徑投與。
可與所揭示之抗體-IR700結合物組合用於治療癌症或腫瘤的額外療法(其可增強腫瘤對額外治療劑之可及性)之實例包括(但不限於)用於移除或減少腫瘤之手術治療，諸如手術切除、超低溫療法或化學藥物栓塞治療，以及抗腫瘤醫藥治療，其可包括放射性治療劑、抗贅生性化學治療劑、抗生素、烷基化劑及抗氧化劑、激酶抑制劑及其他藥劑。在一些實例中，額外治療劑結合至奈米顆粒。可使用之額外治療劑之特定實例包括微管結合劑、DNA嵌入劑或交聯劑、DNA合成抑制劑、DNA及/或RNA轉錄抑制劑、抗體、酶、酶抑制劑及基因調節劑。以治療有效量投與之此等藥劑及治療可單獨或呈組合形式使用。此類藥劑之方法及治療劑量為熟習此項技術者已知的且可藉由熟練的臨床醫師確定。
在一些實施例中，在投與所揭示之療法(諸如投與酞菁染料-抗體結合物)之前，以手術方式(例如經由超低溫療法、照射、化學治療(例如經由化學藥物栓塞治療)或其組合)移除至少一部分腫瘤(諸如轉移性腫瘤)。舉例而言，患有轉移性腫瘤之個體可在投與所揭示之療法之前已以手術方式切除全部或部分腫瘤。在一些實施例中，在用結合物及照射治療之後，投與一或多種化學治療劑。在一些實施例中，個體患有轉移性腫瘤且在投與所揭示之療法的同時投與放射療法、化學藥物栓塞治療療法或兩者。
在一些實施例中，免疫調節劑為或包含抗體或其抗原結合片段、小分子或多肽。在一些實施例中，免疫調節劑為或包含特異性結合選自以下中之分子的免疫調節劑：CD25、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、4-1BB、GITR、CD40、CD40L、OX40、OX40L、CXCR2、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、CD28、VISTA、ICOS、ICOS-L、CD27、CD30、STING、CCR4及A2A腺苷受體。在一些實施例中，免疫調節劑係選自以下：西米單抗(cemiplimab)、納武單抗(nivolumab)、帕博利珠單抗(pembrolizumab)、皮立珠單抗(pidilizumab)、MK-3475、BMS-936559、MPDL3280A、伊匹單抗(ipilimumab)、曲美單抗(tremelimumab)、IMP31、BMS-986016、烏瑞魯單抗(urelumab)、TRX518、達西珠單抗(dacetuzumab)、魯卡木單抗(lucatumumab)、SEQ-CD40、CP-870、CP-893、MED16469、MED14736、MOXR0916、AMP-224及MSB001078C，或為其抗原結合片段。在一些實施例中，在用結合物及照射治療之前，諸如在結合物投藥之前1週、2週、3週或4週或約1週、2週、3週或4週投與免疫調節劑。在一些實施例中，在用結合物及照射治療之後，諸如在結合物投藥之後1週、2週、3週或4週或約1週、2週、3週或4週投與免疫調節劑。在一些實施例中，在用結合物及照射治療之前及之後，諸如以每1週、2週、3週或4週之週期投與免疫調節劑。
在一些實施例中，抗癌劑為烷基化劑、鉑藥物、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、拓樸異構酶抑制劑、有絲分裂抑制劑、皮質類固醇、蛋白酶體抑制劑、激酶抑制劑、組蛋白-去乙醯酶抑制劑、抗腫瘤劑或其組合。在一些實施例中，抗癌劑為抗體或其抗原結合片段、小分子或多肽。
在一些實施例中，抗癌劑係選自以下中之一或多者：5-氟尿嘧啶/甲醯四氫葉酸(leukovorin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、伊立替康(irinotecan)、瑞戈非尼(regorafenib)、茲弗-阿柏西普(ziv-afibercept)、卡培他濱(capecitabine)、順鉑、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、拓朴替康(toptecan)、卡鉑、吉西他濱(gemcitabine)、多烯紫杉醇(docetaxel)、5-FU、異環磷醯胺、絲裂黴素、培美曲塞(pemetrexed)、長春瑞濱(vinorelbine)、卡莫司汀藥片(carmustine wager)、替莫唑胺(temozolomide)、甲胺喋呤、卡培他濱、拉帕替尼(lapatinib)、依託泊苷(etoposide)、達拉非尼(dabrafenib)、維羅非尼(vemurafenib)、脂質體阿糖胞苷、阿糖胞苷、干擾素α、埃羅替尼(erlotinib)、長春新鹼(vincristine)、環磷醯胺、洛莫司汀(lomusine)、丙卡巴肼(procarbazine)、舒尼替尼(sunitinib)、生長抑素(somastostatin)、小紅莓(doxorubicin)、聚乙二醇化脂質體囊封小紅莓、表柔比星(epirubicin)、艾日布林(eribulin)、白蛋白結合太平洋紫杉醇、伊沙匹隆(ixabepilone)、可曲噁唑(cotrimoxazole)、紫杉烷(taxane)、長春鹼(vinblastine)、坦羅莫司(temsirolimus)、替莫唑胺、苯達莫司汀(bendamustine)、口服依託泊苷、依維莫司(everolimus)、奧曲肽(octreotide)、蘭瑞肽(lanredtide)、達卡巴嗪(dacarbazine)、美司鈉(mesna)、帕佐泮尼(pazopanib)、艾日布林、伊馬替尼(imatinib)、瑞戈非尼、索拉非尼(sorafenib)、尼羅替尼(nilotinib)、達沙替尼(dasantinib)、塞內昔布(celecoxib)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、更生黴素(dactinomycin)、西羅莫司(sirolimus)、克唑替尼(crizotinib)、賽爾替尼(certinib)、恩雜魯胺(enzalutamide)、乙酸阿比特龍(abiraterone acetate)、米托蒽醌、卡巴他賽(cabazitaxel)、氟嘧啶(fluoropyrimidine)、奧沙利鉑、甲醯四氫葉酸、阿法替尼(afatinib)、色瑞替尼(ceritinib)、吉非替尼(gefitinib)、卡博替尼(cabozantinib)、奧沙利鉑(oxoliplatin)及奧洛拉嘧啶(auroropyrimidine)。在一些實施例中，抗癌劑係選自以下中之一或多者：貝伐單抗(bevacizumab)、西妥昔單抗、帕尼單抗(panitumumab)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、伊匹單抗、利妥昔單抗(rituximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、曲妥珠單抗-美坦新偶聯物、帕妥珠單抗(pertuzumab)、納武單抗或其抗原結合片段。在一些實施例中，抗癌劑係選自以下中之一或多者：拉帕替尼、達拉非尼、維羅非尼、埃羅替尼、舒尼替尼、帕佐泮尼、伊馬替尼、瑞戈非尼、索拉非尼、尼羅替尼、達沙替尼、塞內昔布、克唑替尼、賽爾替尼、阿法替尼、阿西替尼(axitinib)、貝伐單抗、博舒替尼(bosutinib)、卡博替尼、阿法替尼、吉非替尼、坦羅莫司、依維莫司、西羅莫司、依魯替尼(ibrutinib)、伊馬替尼、樂伐替尼(lenvatinib)、奧拉帕尼(olaparib)、帕博西尼(palbociclib)、魯索替尼(ruxolitinib)、曲美替尼(trametinib)、凡德他尼(vandetanib)或維莫德吉(vismodegib)。
VI. 定義
除非另有定義，否則本文所使用之所有技術術語、標記法及其他技術及科學名詞或術語意欲具有與一般熟習所主張主題所屬技術者通常所理解相同的含義。在一些情況下，為了清楚起見及/或便於參考，本文中定義具有通常所理解含義的術語，且本文中包括此等定義不應必然解釋為表示與此項技術中通常所理解之實質性差異。
除非本文另外明確規定，否則如本文所使用，單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個指示物。舉例而言，「一(a/an)」意謂「至少一個/種」或「一或多個/種」。應理解，本文所描述之態樣及變體包括「由態樣及變體組成」及/或「基本上由態樣及變體組成」。
在整個本發明中，所主張之主題的各種態樣以範圍形式呈現。應理解，範圍形式中之描述僅為了方便及簡潔起見且不應視為對所主張主題之範疇的無彈性限制。因此，範圍之描述應視為具有特定揭示之所有可能子範圍以及該範圍內的個別數值。舉例而言，在提供值範圍之情況下，應理解該範圍之上限與下限之間的各中間值及所述範圍內的任何其他陳述值或中間值均考慮於所主張之主題內。此等較小範圍之上限及下限可獨立地包括於較小範圍內且亦考慮於所主張之主題內，在所述範圍內受到任何特定排除限制。在所陳述之範圍包括限制中之一或兩者的情況下，排除所包括限制中之一者或兩者之範圍亦包括於所主張之主題中。不管範圍之寬度，此均適用。
如本文所使用，術語「約」係指此技術領域之技術人員易於知曉之各別值的常見誤差範圍。本文中對「約」一個值或參數之參考包括(且描述)針對該值或參數本身之實施例。舉例而言，關於「約X」之描述包括「X」之描述。在一些實施例中，「約一值」為或係指該值的±25%、±10%、±5%、±1%、±0.1%、±0.01%。
如本文所使用，「結合物」係指直接或間接地連接至一或多個其他分子之多肽，諸如多肽或化學部分。此結合物包括融合蛋白，藉由化學結合物產生之彼等結合物及藉由任何其他方法產生之彼等結合物。舉例而言，結合物可指直接或間接地連接至一或多個其他分子(諸如抗體)之酞菁染料，諸如IR700分子。
如本文所使用，組合物係指兩種或更多種產物、物質或化合物(包括細胞)之任何混合物。其可為溶液、懸浮液、液體、粉末、糊狀物、水溶液、非水溶液或其任何組合。
如本文所使用，「醫藥組合物」或「醫藥調配物」係指所呈形式准許其中所含活性成分之生物活性有效，且不含對調配物將投與之個體具有不可接受毒性之額外組分的製劑。
如本文所使用，「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分以外之對個體無毒的成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝液、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文所使用，「未經修飾之肽」係指在肽內不具有IR700分子結合至離胺酸之肽。此類肽不會排除以其他方式經修飾之肽，諸如藉由氧化、磷酸化、乙醯化、烷基化、糖基化、失水或不包括IR700分子之其他修飾。
如本文所使用，套組為封裝組合，其視情況包括其他要素，諸如額外試劑及組合或其要素之使用說明書。
術語「藥品說明書」用以指通常包括於治療性產品之商業包裝中的說明書，其含有關於與使用此類治療性產品有關之適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、禁忌及/或警告的資訊。
如本文所使用，「製品(article of manufacture)」為製得之產物，且在一些情況下，其可出售。在一些實施例中，術語可指包含於封裝製品中(諸如容器中)之組合物。
如本文所使用，「疾病或病症」係指生物體中由包括(但不限於)感染、獲得性病況、基因病況之病因或病況引起且特徵為可鑑別之症狀的病理性病況。本文所關注之疾病及病症為可由免疫球蛋白治療之彼等疾病及病症。
如本文所使用，「治療」患有疾病或病況之個體意謂在治療之後個體之症狀部分或完全緩解或保持靜態。因此，治療涵蓋預防、療法及/或治癒。預防係指預防潛在疾病及/或預防症狀惡化或疾病進展。
如本文所使用，「治療」意謂改善或以其他方式有益地改變病況、病症或疾病或其他適應症之症狀的任何方式。
如本文所使用，「治療效果」意謂由治療個體產生之改變、通常改良或改善疾病或病況之症狀或治癒疾病或病況之作用。
如本文所使用，「治療有效量」或「治療有效劑量」係指含有至少足以產生治療效果之化合物之藥劑、化合物、材料或組合物的數量。因此，其為預防、治癒、改善、遏制或部分遏制疾病或病症之症狀所需的數量。
如本文所使用，藉由治療，諸如藉由投與醫藥組合物或其他治療劑來改善特定疾病或病症之症狀係指可歸因於組合物或治療劑之投與或與其相關的任何症狀減輕，不論永久性還是暫時性、持續或短暫的。
如本文所使用，術語「個體」係指動物，包括哺乳動物，諸如人類。
如本文所使用，「視情況選用之」或「視情況」意謂隨後描述之事件或情形可能發生或不發生，且描述包括其中該事件或情形發生之情況及其中該事件或情形未發生之情況。舉例而言，視情況經取代之基團意謂該基團未經取代或經取代。
如本文所使用，術語「實質上」係指高程度之相似性。在一些實施例中，實質上可指幾乎全部或完全，諸如至少85%、90%、95%、99%、99.9%或99.99%完全。舉例而言，在一些實施例中，若藥劑稱為實質上處於狀態，則至少85%、90%、95%、99%、99.9%或99.99%之藥劑處於該狀態。
本申請案中所提及之所有公開案(包括專利文獻、科學論文及資料庫)出於所有目的均以全文引用之方式併入本文中，其引用之程度如同各個別公開案以引用之方式個別地併入一般。若本文所述之定義與以引用方式併入本文中之專利、申請案、公開申請案及其他公開案中所述之定義相反或另外不一致，則以本文所述之定義為準，而非以以引用之方式併入本文中的定義為準。
VII. 例示性實施例
在實施例中，本文提供：
1. 一種結合物，其包含結合至IR700染料之西妥昔單抗，其中至少一個IR700染料分子連接至西妥昔單抗之輕鏈中之離胺酸(K)。
2. 如實施例1之結合物，其中至少一個IR700染料分子在選自由以下組成之群之位置處連接至離胺酸：輕鏈中之K107、K145、K188、K190及K207。
3. 如實施例1或實施例2之結合物，其中至少一個IR700染料分子連接至輕鏈中之K145。
4. 如實施例1至3中任一項之結合物，其中西妥昔單抗在西妥昔單抗之一條或兩條輕鏈中之兩個或更多個離胺酸位置處連接至IR700染料。
5. 如實施例1至4中任一項之結合物，其中西妥昔單抗在西妥昔單抗之一條或兩條輕鏈中之K145處連接至IR700染料。
6. 如實施例1至5中任一項之結合物，其中西妥昔單抗在西妥昔單抗之輕鏈中之K145處及西妥昔單抗之輕鏈或重鏈中之至少一個其他離胺酸位置處連接至IR700染料。
7. 一種結合物，其包含結合至IR700染料之西妥昔單抗，其中至少一個IR700染料分子連接至西妥昔單抗之重鏈中之離胺酸(K)。
8. 如實施例7之結合物，其中至少一個IR700染料分子在選自由以下組成之群之位置處連接至離胺酸：重鏈中之K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416及K449。
9. 如實施例7或實施例8之結合物，其中至少一個IR700染料分子在選自由以下組成之群之位置處連接至離胺酸：重鏈中之K215、K292、K336、K416及K449。
10. 如實施例7至9中任一項之結合物，其中西妥昔單抗在西妥昔單抗之一條或兩條重鏈中之兩個或更多個離胺酸位置處連接至IR700染料。
11. 如實施例7至10中任一項之結合物，其中西妥昔單抗在西妥昔單抗之一條或兩條重鏈中之三個或更多個離胺酸位置處連接至IR700染料。
12. 如實施例7至11中任一項之結合物，其中西妥昔單抗在西妥昔單抗之一條或兩條重鏈中之K215、K292、K336、K416及/或K449處連接至IR700染料。
13. 如實施例7至12中任一項之結合物，其中西妥昔單抗在西妥昔單抗之重鏈中之K215、K292、K336、K416及/或K449處及西妥昔單抗之輕鏈或重鏈中之至少一個其他離胺酸位置處連接至IR700染料。
14. 如實施例7至13中任一項之結合物，其中西妥昔單抗在西妥昔單抗之一條或兩條輕鏈中之K145處連接至IR700染料。
15. 一種結合物，其包含結合至IR700染料之西妥昔單抗，其中至少一個IR700染料分子連接至西妥昔單抗之輕鏈中之離胺酸(K)，且至少一個IR700染料分子連接至西妥昔單抗之重鏈中之離胺酸(K)。
16. 如實施例15之結合物，其中輕鏈中之離胺酸係選自由以下組成之群：K107、K145、K188、K190及K207。
17. 如實施例15或實施例16之結合物，其中重鏈中之離胺酸係選自由以下組成之群：K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416及K449。
18. 如實施例15至17中任一項之結合物，其中西妥昔單抗在西妥昔單抗之一條或兩條輕鏈中之K145處連接至IR700染料。
19. 如實施例15至18中任一項之結合物，其中西妥昔單抗在西妥昔單抗之一條或兩條重鏈中之K215、K292、K336、K416及/或K449處連接至IR700染料。
20. 如實施例15至19中任一項之結合物，其中西妥昔單抗在西妥昔單抗之一條或兩條輕鏈中之K145處及在西妥昔單抗之一條或兩條重鏈中之K215、K292、K416及K449處連接至IR700染料。
21. 如實施例1至20中任一項之結合物，其中IR700染料分子與西妥昔單抗之比率為1:1、2:1、3:1或4:1。
22. 如實施例1至21中任一項之結合物，其中結合物能夠藉由波長在約600 nm與約850 nm (例如，690 nm ± 50 nm)之間的照射而經活化且藉此獲取細胞殺死活性。
23. 一種組合物，其包含如實施例1至22中任一項之結合物及醫藥學上可接受之賦形劑。
24. 一種組合物，其包含西妥昔單抗分子之群體，其中至少50%、60%、70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗分子具有至少一個連接至各西妥昔單抗分子之輕鏈中之離胺酸(K)的IR700染料分子。
25. 如實施例24之組合物，其中至少50%、60%、70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗分子具有至少一個連接至各西妥昔單抗分子之一條或兩條輕鏈中之K107、K145、K188、K190及/或K207的IR700染料分子。
26. 如實施例24或實施例25之組合物，其中在群體中，結合至IR700染料之主要輕鏈離胺酸位置為K145。
27. 如實施例24至26中任一項之組合物，其中當西妥昔單抗分子藉由改性質譜法分析時，在輕鏈K145處含有IR700染料結合之肽可比含有結合至其他輕鏈離胺酸位置之IR700染料的肽更豐富。
28. 一種組合物，其包含西妥昔單抗分子之群體，其中至少50%、60%、70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗分子具有至少一個連接至各西妥昔單抗分子之重鏈中之離胺酸(K)的IR700染料分子。
29. 如實施例28之組合物，其中至少50%、60%、70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗分子具有至少一個連接至各西妥昔單抗分子之一條或兩條重鏈中之K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416及/或K449的IR700染料分子。
30. 如實施例28或實施例29之組合物，其中在群體中，結合至IR700染料之主要重鏈離胺酸位置為K215、K292、K336、K416及K449中之一或多者。
31. 如實施例28至30中任一項之組合物，其中當西妥昔單抗分子藉由質譜法分析時，在重鏈K215、K292、K336、K416或K449處含有IR700染料結合之肽比含有結合至其他重鏈離胺酸位置之IR700染料的肽更豐富。
32. 如實施例28至31中任一項之組合物，其中至少70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗分子具有至少一個連接至各西妥昔單抗分子之一條或兩條重鏈中之兩個或更多個離胺酸的IR700染料分子。
33. 如實施例24至32中任一項之組合物，其中不超過約20%之西妥昔單抗分子與IR700染料未結合。
34. 如實施例33之組合物，其中小於10%之西妥昔單抗分子與IR700染料未結合，且/或游離染料在組合物中之百分比小於3%。
35. 如實施例24至34中任一項之組合物，其中組合物中之IR700染料分子與群體中之西妥昔單抗分子的比率為約2:1、約2.5:1或約3:1。
36. 一種組合物，其包含西妥昔單抗分子之群體，其中至少50%、60%、70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗分子具有至少一個連接至各西妥昔單抗分子之輕鏈或重鏈中之離胺酸(K)的IR700染料分子。
37. 如實施例36之組合物，其中至少50%、60%、70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗分子具有至少一個連接至一條或兩條輕鏈中之K107、K145、K188、K190及/或K207或連接至各西妥昔單抗分子之一條或兩條重鏈中之K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416及/或K449的IR700染料分子。
38. 如實施例37之組合物，其中至少50%、60%、70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗分子具有至少一個連接至一條或兩條輕鏈中之K145或連接至各西妥昔單抗分子之一條或兩條重鏈中之K215、K292、K336、K416或K449的IR700染料分子。
39. 一種組合物，其包含西妥昔單抗分子之群體，其中至少50%、60%、70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗分子具有至少一個連接至輕鏈中之離胺酸(K)的IR700染料分子及至少一個連接至各西妥昔單抗分子之重鏈中之離胺酸的IR700染料分子。
40. 如實施例39之組合物，其中至少50%、60%、70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗分子具有至少一個連接至一條或兩條輕鏈中之K107、K145、K188、K190及/或K207的酞菁IR700染料分子及至少一個連接至各西妥昔單抗分子之一條或兩條重鏈中之K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416及/或K449的IR700染料分子。
41. 如實施例40之組合物，其中至少50%、60%、70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗分子具有至少一個連接至一條或兩條輕鏈中之K145的酞菁IR700染料分子及至少一個連接至各西妥昔單抗分子之一條或兩條重鏈中之K215、K292、K336、K416或K449的IR700染料分子。
42. 一種組合物，其包含西妥昔單抗分子之群體，其中不超過約20%之西妥昔單抗分子在西妥昔單抗分子之輕鏈或重鏈中之離胺酸(K)處與IR700染料未結合。
43. 如實施例42之組合物，其中小於15%之西妥昔單抗分子與IR700染料未結合。
44. 如實施例43之組合物，其中小於10%之西妥昔單抗分子與IR700染料未結合。
45. 如實施例42至44中任一項之組合物，其中組合物中之游離染料在組合物中之所有染料分子中的百分比小於約3%、小於約2%、小於約1%或小於約0.5%。
46. 如實施例42至45中任一項之組合物，其中組合物中之IR700染料分子與群體中之西妥昔單抗分子的比率為約2:1、約2.5:1或約3:1。
47. 一種組合物，其包含西妥昔單抗分子之群體，其中一或多個西妥昔單抗分子在一或多個西妥昔單抗分子之輕鏈或重鏈中之離胺酸(K)處與IR700染料結合，組合物中之IR700染料分子與群體中之西妥昔單抗分子的比率為約2:1、約2.5:1或約3:1，小於10%之西妥昔單抗分子與IR700染料未結合，且組合物中之游離染料在組合物中之所有染料分子中的百分比小於約0.5%。
48. 一種組合物，其包含SEQ ID NO: 2，其中SEQ ID NO: 2之離胺酸145結合至IR700染料。
49. 一種組合物，其包含SEQ ID NO: 1，其中SEQ ID NO: 1之離胺酸215、離胺酸292、離胺酸416及/或離胺酸449結合至IR700染料。
50. 一種組合物，其包含SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2，其中SEQ ID NO: 2之離胺酸145結合至IR700染料且SEQ ID NO: 1之離胺酸215、離胺酸292、離胺酸416及/或離胺酸449結合至IR700染料。
51. 如實施例50之組合物，其在相同分子中包含SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2，其中SEQ ID NO: 2之離胺酸145結合至IR700染料且SEQ ID NO: 1之離胺酸215、離胺酸292、離胺酸416及/或離胺酸449結合至IR700染料。
52. 如實施例50或實施例51之組合物，其在不同分子中包含SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2，其中SEQ ID NO: 2之離胺酸145結合至IR700染料且SEQ ID NO: 1之離胺酸215、離胺酸292、離胺酸416及/或離胺酸449結合至IR700染料。
53. 一種組合物，其包含西妥昔單抗分子之群體，其中小於15%之西妥昔單抗分子與IR700染料未結合，組合物包含小於3%游離IR700染料，且游離染料在組合物中之百分比在儲存約6個月之後實質上未改變。
54. 一種組合物，其包含與IR700染料結合之西妥昔單抗分子之群體，其中組合物包含小於或小於約0.6%、小於或小於約0.5%、小於或小於約0.4%，或小於或小於約0.3%游離染料。
55. 如實施例54之組合物，其中組合物包含至少或至少約95%、96%、97%或98%單體。
56. 如實施例55之組合物，其中組合物包含小於或小於約5%、4%或3%高分子量物種。
57. 如實施例54至56中任一項之組合物，其中組合物包含小於或小於約30%、20%、25%、20%、15%或10%未結合抗體。
58. 如實施例54至57中任一項之組合物，其中在暗處或少光條件下儲存組合物6個月之後，游離染料之百分比實質上未改變。
59. 如實施例53至58中任一項之組合物，其中至少70%、80%、90%或大於90%之西妥昔單抗分子具有至少一個IR700染料分子結合至各西妥昔單抗分子之輕鏈中之離胺酸(K)。
60. 如實施例59之組合物，其中在群體中，結合至IR700染料之主要輕鏈離胺酸位置為K145。
61. 如實施例53至60中任一項之組合物，其中至少70%、80%、90%或大於90%之群體具有至少一個IR700染料分子結合至各西妥昔單抗分子之重鏈中之離胺酸(K)。
62. 如實施例61之組合物，其中在群體中，結合至IR700染料之主要重鏈離胺酸位置為K215、K292、K336、K416及K449中之一或多者。
63. 一種組合物，其包含西妥昔單抗分子之群體，其中約9%與約10%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗分子之總肽為在輕鏈離胺酸145 (K145)處含有IR700染料結合的肽。
64. 一種組合物，其包含西妥昔單抗分子之群體，其中約9%與約11%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗分子之總肽為在重鏈離胺酸215 (K215)處含有IR700染料結合的肽。
65. 一種組合物，其包含西妥昔單抗分子之群體，其中約9%與約11%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗分子之總肽為在重鏈離胺酸292 (K292)處含有IR700染料結合的肽。
66. 一種組合物，其包含西妥昔單抗分子之群體，其中約10%與約12%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗分子之總肽為在重鏈離胺酸416 (K416)處含有IR700染料結合的肽。
67. 一種組合物，其包含西妥昔單抗分子之群體，其中約7%與約9%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗分子之總肽為在重鏈離胺酸449 (K449)處含有IR700染料結合的肽。
68. 一種組合物，其包含西妥昔單抗分子之群體，其中：約9%與約10%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗分子之總肽為在輕鏈離胺酸145 (K145)處含有IR700染料結合的肽；約9%與約11%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗分子之總肽為在重鏈離胺酸215 (K215)處含有IR700染料結合的肽；約9%與約11%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗分子之總肽為在重鏈離胺酸292 (K292)處含有IR700染料結合的肽；約10%與約12%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗分子之總肽為在重鏈離胺酸416 (K416)處含有IR700染料結合的肽；約7%與約9%之間的藉由質譜法分析西妥昔單抗分子之總肽為在重鏈離胺酸449 (K449)處含有IR700染料結合的肽；且/或約5%與約7%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗分子之總肽為在重鏈離胺酸336 (K336)處含有IR700染料結合的肽。
69. 如實施例63至68中任一項之組合物，其中：約3%與4%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗分子之總肽為在輕鏈離胺酸107 (K107)處含有IR700染料結合的肽；約1%與3%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗分子之總肽為在輕鏈離胺酸188 (K188)處含有IR700染料結合的肽；約3%與4%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗分子之總肽為在輕鏈離胺酸190 (K190)處含有IR700染料結合的肽；約1%與3%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗分子之總肽為在輕鏈離胺酸207 (K207)處含有IR700染料結合的肽；約3%與4%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗分子之總肽為在重鏈離胺酸5 (K5)處含有IR700染料結合的肽；約3%與4%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗分子之總肽為在重鏈離胺酸75 (K75)處含有IR700染料結合的肽；約1%與2%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗分子之總肽為在重鏈離胺酸248 (K248)處含有IR700染料結合的肽；且/或約1%與2%之間的藉由質譜法分析之西妥昔單抗分子之總肽為在重鏈離胺酸328 (K328)處含有IR700染料結合的肽。
70. 一種組合物，其包含結合至IR700染料之西妥昔單抗分子之群體，其中：在位置輕鏈中之離胺酸145 (K145)與重鏈中之離胺酸215 (K215)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；在位置輕鏈中之離胺酸145 (K145)與重鏈中之離胺酸292 (K292)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；在位置輕鏈中之離胺酸145 (K145)與重鏈中之離胺酸336 (K336)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；在位置輕鏈中之離胺酸145 (K145)與重鏈中之離胺酸416 (K416)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；及/或在位置輕鏈中之離胺酸145 (K145)與重鏈中之離胺酸449 (K449)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。
71. 一種組合物，其包含結合至IR700染料之西妥昔單抗分子之群體，其中：在位置重鏈中之離胺酸215 (K215)與重鏈中之離胺酸292 (K292)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；在位置重鏈中之離胺酸215 (K215)與重鏈中之離胺酸336 (K336)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；在位置重鏈中之離胺酸215 (K215)與重鏈中之離胺酸416 (K416)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；且/或在位置重鏈中之離胺酸215 (K215)與重鏈中之離胺酸449 (K449)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。
72. 一種組合物，其包含結合至IR700染料之西妥昔單抗分子之群體，其中：在位置重鏈中之離胺酸292 (K292)與重鏈中之離胺酸336 (K336)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；在位置重鏈中之離胺酸292 (K292)與重鏈中之離胺酸416 (K416)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；及/或在位置重鏈中之離胺酸292 (K292)與重鏈中之離胺酸449 (K449)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。
73. 一種組合物，其包含結合至IR700染料之西妥昔單抗分子之群體，其中：在位置重鏈中之離胺酸336 (K336)與重鏈中之離胺酸416 (K416)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1；且/或在位置重鏈中之離胺酸336 (K336)與重鏈中之離胺酸449 (K449)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。
74. 一種組合物，其包含結合至IR700染料之西妥昔單抗分子之群體，其中在位置重鏈中之離胺酸416 (K416)與重鏈中之離胺酸449 (K449)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約2:1至約1:2，視情況約1:1。
75. 一種組合物，其包含結合至IR700染料之西妥昔單抗分子之群體，其中在位置輕鏈中之離胺酸145 (K145)、重鏈中之離胺酸215 (K215)、重鏈中之離胺酸292 (K292)及重鏈中之離胺酸416 (K416)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約1:1:1:1。
76. 一種組合物，其包含結合至IR700染料之西妥昔單抗分子之群體，其中在位置輕鏈中之離胺酸145 (K145)、重鏈中之離胺酸215 (K215)、重鏈中之離胺酸292 (K292)、重鏈中之離胺酸336 (K336)、重鏈中之離胺酸416 (K416)及重鏈中之離胺酸449 (K449)之間，結合至離胺酸之IR700染料在西妥昔單抗分子之群體中的比率為約1:1:1:1:1:1。
77. 如實施例71至76中任一項之組合物，其中比率藉由質譜法量測。
78. 一種殺死腫瘤或癌細胞之方法，其包含：在或接近腫瘤或癌細胞之部位投與包含如實施例1至77中任一項之結合物或組合物的醫藥組合物；及在約600 nm至約850 nm之波長以由約25 J cm−2
至約400 J cm−2
或由約25 J/cm光纖長度至約500 J/cm光纖長度之劑量照射接近腫瘤細胞之區域，藉此殺死腫瘤或癌細胞。
79. 一種治療個體中之疾病或病況(例如腫瘤或癌症)之方法，其包含：向個體投與包含如實施例1至78中任一項之結合物或組合物的醫藥組合物；及在約600 nm至約850 nm之波長以由約25 J cm−2
至約400 J cm−2
或由約25 J/cm光纖長度至約500 J/cm光纖長度之劑量照射接近個體中之病灶(例如，由腫瘤或癌症所導致之病灶)的區域，藉此治療疾病或病況。
80. 如實施例78或實施例79之方法，其進一步包含在投與步驟之前提供醫藥組合物。
81. 如實施例78至80中任一項之方法，其中照射步驟係在690 ± 50 nm之波長或在或約690 ± 20 nm之波長進行。
82. 如實施例78至81中任一項之方法，其中照射步驟係在約690 nm之波長進行。
83. 如實施例78至82中任一項之方法，其中腫瘤為膀胱癌、胰臟癌、結腸癌、卵巢癌、肺癌、乳癌、胃癌、前列腺癌、子宮頸癌、食道癌或頭頸癌。
84. 如實施例78至83中任一項之方法，其中癌症位於頭頸部、乳房、肝臟、結腸、卵巢、前列腺、胰臟、大腦、子宮頸、骨、皮膚、眼睛、膀胱、胃、食道、腹膜或肺。
85. 如實施例78至84中任一項之方法，其中癌症為位於頭頸部之癌症。
86. 一種製造穩定結合物之方法，其包含：a)使西妥昔單抗與IR700染料在產生結合物之條件下接觸，該結合物包含連接至一或多個選自由以下組成之群的西妥昔單抗之離胺酸的IR700染料：K145 (輕鏈)、K215 (重鏈)、K292 (重鏈)、K336 (重鏈)、K416 (重鏈)及K449 (重鏈)；b)使結合物在結合期間及/或之後經受一個步驟，該步驟實質上減少與西妥昔單抗非特異性結合之IR700染料；c)在醫藥學上可接受之緩衝液中調配結合物，其中在步驟a)至c)中之每一者中，染料及結合物曝露之唯一光具有在約400 nm至約650 nm範圍內之波長或具有小於500勒克司之強度。
87. 如實施例86之方法，其中步驟b)包含使結合物經受淬滅反應。
88. 如實施例86或實施例87之方法，其中步驟b)包含在完成IR700染料與西妥昔單抗之間的結合反應之後，使結合物經甘胺酸淬滅反應。
89. 如實施例88之方法，其中淬滅反應進行隔夜或大於約6小時之持續時間。
90. 一種穩定結合物，其由如實施例86至89中之任一者之方法製造。
91. 如實施例90之穩定結合物，其包含結合至IR700染料之西妥昔單抗分子之群體，其中在位置輕鏈中之離胺酸145 (K145)、重鏈中之離胺酸215 (K215)、重鏈中之離胺酸292 (K292)及重鏈中之離胺酸416 (K416)之間，結合至西妥昔單抗分子之離胺酸之IR700染料在群體中的比率為約1:1:1:1。
92. 一種結合物，其包含至少兩個IR700分子結合至西妥昔單抗中之至少兩個離胺酸(K)位置，且其中至少兩個離胺酸位置獨立地選自由以下組成之群：對應於西妥昔單抗之輕鏈中之位置107之離胺酸(K107)、對應於位置145之離胺酸(K145)、對應於位置188之離胺酸(K188)、對應於位置190之離胺酸(K190)及對應於位置207之離胺酸(K207)及對應於西妥昔單抗之重鏈中之位置5之離胺酸(K5)、對應於位置75之離胺酸(K75)、對應於位置215之離胺酸(K215)、對應於位置248之離胺酸(K248)、對應於位置292之離胺酸(K292)、對應於位置328之離胺酸(K328)、對應於位置336之離胺酸(K336)、對應於位置416之離胺酸(K416)及對應於位置449之離胺酸(K449)。
93. 如實施例92之結合物，其包含至少三個IR700分子結合至西妥昔單抗中之至少三個離胺酸位置。
94. 如實施例93之結合物，其中至少三個離胺酸位置獨立地選自由以下組成之群：輕鏈中之K107、K145、K188、K190及K207及重鏈中之K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416及K449。
95. 如實施例92至94中任一項之結合物，其中結合至IR700之離胺酸位置中之至少一者係選自由以下組成之群：輕鏈中之K145或重鏈中之K215、K416或K449。
96. 如實施例92至95中任一項之結合物，其中至少一個IR700分子結合至輕鏈中之離胺酸，且至少一個IR700分子結合至重鏈中之離胺酸。
97. 如實施例92至96中任一項之結合物，其中結合物能夠藉由波長在690 nm ± 50 nm之間的光照射而經活化且藉此在結合物結合至細胞表面上之抗原決定基時展現細胞殺死活性。
98. 一種組合物，其包含如實施例92至97中任一項之結合物及醫藥學上可接受之賦形劑。
99. 一種組合物，其包含結合物之群體，其中群體中之結合物包含結合IR700至西妥昔單抗，其中至少或至少約50%、60%、70%、80%、90%或大於或大於約90%之結合物包含至少兩個IR700分子結合至西妥昔單抗中之至少兩個離胺酸(K)位置，且其中兩個離胺酸位置獨立地選自由以下組成之群：對應於西妥昔單抗之輕鏈中之位置107之離胺酸(K107)、對應於位置145之離胺酸(K145)、對應於位置188之離胺酸(K188)、對應於位置190之離胺酸(K190)及對應於位置207之離胺酸(K207)及對應於西妥昔單抗之重鏈中之位置5之離胺酸(K5)、對應於位置75之離胺酸(K75)、對應於位置215之離胺酸(K215)、對應於位置248之離胺酸(K248)、對應於位置292之離胺酸(K292)、對應於位置328之離胺酸(K328)、對應於位置336之離胺酸(K336)、對應於位置416之離胺酸(K416)及對應於位置449之離胺酸(K449)。
100. 如實施例98或99之組合物，其中至少或至少約50%、60%、70%、80%、90%或大於或大於約90%之結合物包含至少三個IR700分子結合至西妥昔單抗中之至少三個離胺酸位置。
101. 如實施例100之組合物，其中至少三個離胺酸位置獨立地選自由以下組成之群：輕鏈中之K107、K145、K188、K190及K207及重鏈中之K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416及K449。
102. 如實施例98至101中任一項之組合物，其中至少或至少約50%、60%、70%、80%、90%或大於或大於約90%之結合物包含至少一個IR700分子結合至輕鏈中之K145或重鏈中之K215、K416或K449。
103. 如實施例98至102中任一項之組合物，其中至少或至少約50%、60%、70%、80%、90%或大於或大於約90%之結合物包含IR700分子結合至輕鏈中之K145之IR700分子及結合至重鏈中之K215、K416或K449中之至少一者。
104. 如實施例98至103中任一項之組合物，其中IR700分子與西妥昔單抗之比率在約2:1至約4:1之間。
105. 如實施例98至104中任一項之組合物，其中IR700分子與西妥昔單抗之比率為約2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3.0:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1或3.4:1。
106. 如實施例98至104中任一項之組合物，其中IR700分子與西妥昔單抗之比率在約2.7:1至約3.2:1之間。
107. 如實施例98至106中任一項之組合物，其中組合物中不超過或不超過約15%之西妥昔單抗分子未與IR700結合。
108. 如實施例98至107中任一項之組合物，其中組合物中小於或小於約10%之西妥昔單抗分子與未IR700結合。
109. 如實施例98至108中任一項之組合物，其中游離染料在組合物中之百分比小於或小於約3%、小於或小於約2%、小於或小於約1%或小於或小於約0.5%。
110. 一種組合物，其包含西妥昔單抗-IR700結合物之群體，其中組合物中複數種結合物各包含IR700結合至西妥昔單抗於西妥昔單抗之輕鏈或重鏈中選自由以下組成之群之離胺酸(K)：對應於西妥昔單抗之輕鏈中之位置107之離胺酸(K107)、對應於位置145之離胺酸(K145)、對應於位置188之離胺酸(K188)、對應於位置190之離胺酸(K190)及對應於位置207之離胺酸(K207)及對應於西妥昔單抗之重鏈中之位置5之離胺酸(K5)、對應於位置75之離胺酸(K75)、對應於位置215之離胺酸(K215)、對應於位置248之離胺酸(K248)、對應於位置292之離胺酸(K292)、對應於位置328之離胺酸(K328)、對應於位置336之離胺酸(K336)、對應於位置416之離胺酸(K416)及對應於位置449之離胺酸(K449)，且組合物包含以下特徵：
(a) 組合物中之IR700分子與群體中之西妥昔單抗分子之比率在約2:1與約3:5之間，
(b) 小於或小於約10%之西妥昔單抗分子未與IR700結合，及
(c) 組合物中之游離染料在組合物中之所有染料分子中的百分比小於或小於約3%。
111. 如實施例110之組合物，其中複數種結合物包含西妥昔單抗在輕鏈之K145與IR700結合。
112. 如實施例110或111之組合物，其中複數種結合物包含西妥昔單抗在重鏈之K215、K416或K449與IR700結合。
113. 如實施例110至112中任一項之組合物，其中複數種結合物包含西妥昔單抗與至少三個IR700分子結合。
114. 如實施例110至113中任一項之組合物，其中複數種結合物包含組合物中之至少或至少約51%、至少或至少約55%、至少或至少約60%、至少或至少約70%、至少或至少約75%或至少或至少約80%之結合物。
115. 如實施例110至114中任一項之組合物，其中游離染料在組合物中之百分比小於或小於約2%、小於或小於約1%或小於或小於約0.5%。
116. 如實施例98至115中任一項之組合物，其中西妥昔單抗包含SEQ ID NO: 1中所述之重鏈序列、SEQ ID NO: 2中所述之輕鏈序列或其組合。
117. 如實施例98至116中任一項之組合物，其中在暗處或少光條件下儲存6個月之後，游離染料在組合物中之百分比實質上未改變。
118. 如實施例98至117中任一項之組合物，其中組合物包含至少或至少約95%、96%、97%或98%單體形式之結合物。
119. 如實施例98至118中任一項之組合物，其中組合物包含小於或小於約5%、4%或3%高分子量物種。
120. 一種殺死腫瘤或癌細胞之方法，方法包含：
在或接近腫瘤或癌細胞之部位投與包含如實施例92至119中任一項之結合物或組合物的醫藥組合物；及
在約600 nm至約850 nm之波長以由約25 J cm−2
至約400 J cm−2
或由約25 J/cm光纖長度至約500 J/cm光纖長度之劑量照射接近腫瘤或癌細胞之區域，藉此殺死腫瘤或癌細胞。
121. 一種治療個體中之疾病或病況之方法，方法包含：
在或接近腫瘤或癌細胞之部位投與包含如實施例92至119中任一項之結合物或組合物的醫藥組合物；及
在約600 nm至約850 nm之波長以由約25 J cm−2
至約400 J cm−2
或由約25 J/cm光纖長度至約500 J/cm光纖長度之劑量照射接近個體之病灶或腫瘤的區域，藉此治療疾病或病況。
122. 如實施例120或121之方法，其中照射步驟係在690 ± 50 nm之波長或或約690 ± 20 nm之波長進行。
123. 如實施例122之方法，其中照射步驟係在約690 nm之波長進行。
124. 如實施例121至123中任一項之方法，其中疾病或病況為腫瘤或癌症。
125. 如實施例120至124中任一項之方法，其中腫瘤或癌細胞包含或疾病或病況為以下腫瘤：膀胱癌、胰臟癌、結腸癌、卵巢癌、肺癌、乳癌、胃癌、前列腺癌、子宮頸癌、食道癌或頭頸癌。
126. 如實施例120至124中任一項之方法，其中腫瘤或癌細胞包含或疾病或病況為位於以下之癌症：頭頸部、乳房、肝臟、結腸、卵巢、前列腺、胰臟、大腦、子宮頸、骨、皮膚、眼睛、膀胱、胃、食道、腹膜或肺。
127. 如實施例126之方法，其中癌症為頭頸癌。
128. 一種製造穩定結合物之方法，方法包含：
a) 使西妥昔單抗與IR700在產生西妥昔單抗-IR700結合物之條件下接觸，其中結合物包含至少兩個結合至IR700之離胺酸(K)位置，該至少兩個離胺酸(K)位置獨立地選自由以下組成之群：對應於西妥昔單抗之輕鏈中之位置107之離胺酸(K107)、對應於位置145之離胺酸(K145)、對應於位置188之離胺酸(K188)、對應於位置190之離胺酸(K190)及對應於位置207之離胺酸(K207)及對應於西妥昔單抗之重鏈中之位置5之離胺酸(K5)、對應於位置75之離胺酸(K75)、對應於位置215之離胺酸(K215)、對應於位置248之離胺酸(K248)、對應於位置292之離胺酸(K292)、對應於位置328之離胺酸(K328)、對應於位置336之離胺酸(K336)、對應於位置416之離胺酸(K416)及對應於位置449之離胺酸(K449)；
b) 使結合物在結合期間及/或之後經受一個步驟，該步驟實質上減少與西妥昔單抗非特異性結合之IR700；及
c) 在醫藥學上可接受之緩衝液中調配結合物，
其中在步驟a)至c)中之每一者中，染料及結合物曝露之唯一光具有在約400 nm至約650 nm範圍內之波長或具有小於或小於約500勒克司之強度。
129. 如實施例128之方法，其中步驟b)包含在完成IR700與西妥昔單抗之間的結合反應之後，使結合物經甘胺酸淬滅反應。
130. 如實施例129之方法，其中淬滅反應進行隔夜或大於或大於約6小時之持續時間。
131. 一種穩定結合物，其由如實施例128至130中任一項之方法製造。
132. 一種組合物，其包含複數種結合物，其中結合物包含IR700結合至西妥昔單抗，其中組合物經胰蛋白酶消化產生包含以下肽之群體：
a) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置215之離胺酸(K215)；
b) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置292之離胺酸(K292)；
c) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置416之離胺酸(K416)；及
d) 西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置145之離胺酸(K145)。
133. 如實施例132之組合物，其中肽之群體進一步包含：
e) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置336之離胺酸(K336)；及
f) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置449之離胺酸(K449)。
134. 如實施例132或133之組合物，其中肽之群體進一步包含：
g) 西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置107之離胺酸(K107)；
h) 西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置190之離胺酸(K190)；
i) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置5之離胺酸(K5)；及
j) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置75之離胺酸(K75)。
135. 如實施例132至134中任一項之組合物，其中肽之群體進一步包含以下中之一或多者：
k) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置248之離胺酸(K248)；
l) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置328之離胺酸(K328)；
m) 西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置188之離胺酸(K188)；及
n) 西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置207之離胺酸(K207)。
136. 一種組合物，其包含複數種結合物，其中結合物包含IR700結合至西妥昔單抗，其中組合物經胰蛋白酶消化產生包含以下肽之群體：
a) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置5之離胺酸(K5)；
b) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置75之離胺酸(K75)；
c) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置215之離胺酸(K215)；
d) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置248之離胺酸(K248)；
e) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置292之離胺酸(K292)；
f) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置328之離胺酸(K328)；
g) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置336之離胺酸(K336)；
h) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置416之離胺酸(K416)；
i) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置449之離胺酸(K449)；
j) 西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置107之離胺酸(K107)；
k) 西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置145之離胺酸(K145)；
l) 西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置188之離胺酸(K188)；
m) 西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置190之離胺酸(K190)；及
n) 西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置207之離胺酸(K207)。
137. 如實施例132至136中任一項之組合物，其中肽藉由正離子模式質譜法來偵測。
138. 如實施例137之組合物，其中當針對由正離子模式質譜法偵測之肽產生提取離子層析圖(EIC)時：
對應於a)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於a)之肽之EIC峰積分面積之總和的3%或約3%與5%或約5%之間；
對應於b)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於b)之肽之EIC峰積分面積之總和的3%或約3%與5%或約5%之間；
對應於c)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於c)之肽之EIC峰積分面積之總和的8%或約8%與11%或約11%之間；
對應於d)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於d)之肽之EIC峰積分面積之總和的0.5%或約0.5%與2.5%或約2.5%之間；
對應於e)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於e)之肽之EIC峰積分面積之總和的8%或約8%與12%或約12%之間；
對應於f)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於f)之肽之EIC峰積分面積之總和的0.2%或約0.2%與2.5%或約2.5%之間；
對應於g)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於g)之肽之EIC峰積分面積之總和的4.5%或約4.5%與7%或約7%之間；
對應於h)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於h)之肽之EIC峰積分面積之總和的9.5%或約9.5%與13%或約13%之間；
對應於i)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於i)之肽之EIC峰積分面積之總和的6%或約6%與10%或約10%之間；
對應於j)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於j)之肽之EIC峰積分面積之總和的2%或約2%與5%或約5%之間；
對應於k)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於k)之肽之EIC峰積分面積之總和的7%或約7%與11%或約11%之間；
對應於l)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於l)之肽之EIC峰積分面積之總和的0.5%或約0.5%與4%或約4%之間；
對應於m)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於m)之肽之EIC峰積分面積之總和的1.5%或約1.5%與5%或約5%之間；及
對應於n)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於n)之肽之EIC峰積分面積之總和的0.5%或約0.5%與4%或約4%之間。
139. 如實施例138之組合物，其中：
對應於a)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於a)之肽之EIC峰積分面積之總和的約3.8±1%；
對應於b)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於b)之肽之EIC峰積分面積之總和的約3.5±1%；
對應於c)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於c)之肽之EIC峰積分面積之總和的約10.0±1%；
對應於d)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於d)之肽之EIC峰積分面積之總和的約1.7±1%；
對應於e)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於e)之肽之EIC峰積分面積之總和的約10.2±1%；
對應於f)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於f)之肽之EIC峰積分面積之總和的約1.3±1%；
對應於g)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於g)之肽之EIC峰積分面積之總和的約5.9±1%；
對應於h)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於h)之肽之EIC峰積分面積之總和的約11.2±1%；
對應於i)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於i)之肽之EIC峰積分面積之總和的約7.6±1%；
對應於j)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於j)之肽之EIC峰積分面積之總和的約3.4±1%；
對應於k)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於k)之肽之EIC峰積分面積之總和的約9.3±1%；
對應於l)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於l)之肽之EIC峰積分面積之總和的約2.1±1%；
對應於m)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於m)之肽之EIC峰積分面積之總和的約3.5±1%；及
對應於n)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於n)之肽之EIC峰積分面積之總和的約2.0±1%。
140. 如實施例132至139中任一項之組合物，其中：
a)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸1-38；
b)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸72-81；
c)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸213-216；
d)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸225-250；
e)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸291-294；
f)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸325-336；
g)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸329-340；
h)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸412-418；
i)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸442-449；
j)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 2之胺基酸104-108；
k)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 2之胺基酸143-149；
l)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 2之胺基酸184-190；
m)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 2之胺基酸189-207；及
n)之肽之胺基酸序列對應於SEQ ID NO: 2之胺基酸191-211。
141. 一種組合物，其包含複數種結合物，其中結合物包含IR700結合至西妥昔單抗，且其中組合物之胰蛋白酶消化產生肽，該等肽產生包含對應於以下之提取離子層析圖(EIC)峰之質譜：
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置215之離胺酸(K215)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約9%；
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置292之離胺酸(K292)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約8%；
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置416之離胺酸(K416)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約8%；
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置145之離胺酸(K145)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約8%。
142. 如實施例141之組合物，其中組合物之胰蛋白酶消化進一步產生包含對應於以下中之一或多者之提取離子層析圖(EIC)峰的質譜：
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置449之離胺酸(K449)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約5%；及/或
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置336之離胺酸(K336)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約3.5%。
143. 如實施例141或142之組合物，其中組合物之胰蛋白酶消化進一步產生包含對應於以下中之一或多者之提取離子層析圖(EIC)峰的質譜：
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置5之離胺酸(K5)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約2%；
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置75之離胺酸(K75)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約2%；
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置248之離胺酸(K248)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約0.5%；
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置328之離胺酸(K328)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約0.5%；
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置107之離胺酸(K107)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約2%；
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置188之離胺酸(K188)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約0.5%；
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置190之離胺酸(K190)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約2%；及/或
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置207之離胺酸(K207)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約0.5%。
144. 一種組合物，其包含複數種結合物，其中結合物包含IR700結合至西妥昔單抗，且其中組合物之胰蛋白酶消化產生肽，該等肽產生包含對應於以下之提取離子層析圖(EIC)峰之質譜：
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置5之離胺酸(K5)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約2.5%；
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置75之離胺酸(K75)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約2.5%；
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置215之離胺酸(K215)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約9%；
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置248之離胺酸(K248)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約0.5%；及/或
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置292之離胺酸(K292)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約8.5%；
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置328之離胺酸(K328)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約0.5%；
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置336之離胺酸(K336)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約4.5%；
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置416之離胺酸(K416)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約9%；
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置449之離胺酸(K449)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約7%；
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置107之離胺酸(K107)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約2.5%；
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置145之離胺酸(K145)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約8.5%；
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置188之離胺酸(K188)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約1%；
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置190之離胺酸(K190)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約2.5%；及
包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置207之離胺酸(K207)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約1%。
145. 如實施例141至144中任一項之組合物，其中：
對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置5之離胺酸(K5)之肽，EIC峰之面積百分比為約3.8±1%；
對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置75之離胺酸(K75)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約3.5±1%；
對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置215之離胺酸(K215)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約10.0±1%；
對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置248之離胺酸(K248)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約1.7±1%；
對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置292之離胺酸(K292)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約10.2±1%；
對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置328之離胺酸(K328)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約1.3±1%；
對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置336之離胺酸(K336)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約5.9±1%；
對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置416之離胺酸(K416)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約11.2±1%；
對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置449之離胺酸(K449)之肽，結合的EIC峰之面積百分比為約7.6±1%；
對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置107之離胺酸(K107)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約3.4±1%；
對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置145之離胺酸(K145)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約9.3±1%；
對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置188之離胺酸(K188)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約2.1±1%；
對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置190之離胺酸(K190)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約3.5±1%；及
對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置207之離胺酸(K207)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約2±1%。
146. 如實施例141至145中任一項之組合物，其中包含IR700分子結合至離胺酸之肽包含一或多個選自以下中之胺基酸序列：
對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸1-38、胺基酸72-81、胺基酸213-216、胺基酸225-250、胺基酸291-294、胺基酸325-336、胺基酸329-340、胺基酸412-418及胺基酸442-449之胺基酸序列，
對應於SEQ ID NO: 2之胺基酸104-108、胺基酸143-149、胺基酸184-190、胺基酸189-207及胺基酸191-211之胺基酸序列。
VIII. 實例
以下實施例僅出於說明目的而包括在內，且並不意欲限制本發明之範疇。
實例1：產生西妥昔單抗-IR700結合物
在此實例中，西妥昔單抗-IR700結合物使用限制染料及結合物曝露於光之方法來產生，此係由於染料之光敏性，包括在製造設備中使用波長為425至575 nm且強度小於200勒克司之低水準的綠光。以下緩衝液用於結合：結合緩衝液(100 mM磷酸鈉，pH 8.65)、淬滅緩衝液(1.0 M甘胺酸，pH 9)及最終磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)調配物緩衝液：(5.60 mM Na2
HPO4
，1.058 mM KH2
PO4
，154 mM NaCl，pH 7.1)。
A. 製備染料及西妥昔單抗 1. 製備西妥昔單抗
在結合之前，將西妥昔單抗經由0.5/0.2 µm PES Millipore SHC過濾器過濾，彙集且儲存在2-8℃下。
接著藉由超過濾/透濾(UF/DF)進行濃縮及緩衝液交換步驟。UF/DF裝置經清潔且用100 mM磷酸鈉，pH 8.65緩衝液平衡。在UF/DF操作之前，藉由在25℃下將其置放於培育箱中120至150 min來升溫經彙集過濾之西妥昔單抗。首先將材料濃縮至17至20 g/L之目標濃度且接著透濾至PBS pH 7.1 ± 0.2緩衝液中。測定經透濾西妥昔單抗產物濃度且接著將其調節至30至38 g/L之目標濃度。將所得溶液經由0.5/0.2 µm PES Millipore SHC過濾器過濾，最終濃度為20至40 g/L。在結合之前，將抗體溶液在100 mM磷酸鈉pH 8.65 ± 0.15緩衝液中調節至10 g/L之濃度，最終目標pH為8.0至8.6。
2. 製備染料
在結合之前，IRDye 700DX NHS酯(染料；目錄號929-70011；Li-COR，Lincoln，NE)藉由在無水DMSO中將其溶解至10 mg/mL的濃度來製備。步驟在綠光(例如，波長為425至575 nm且強度小於200勒克司)下執行以保護染料免受由染料強烈吸收之光波長的影響。
B. 結合
結合及淬滅步驟在含有經透濾西妥昔單抗之容器或槽中進行，包覆在鋁箔或類似材料中用於避光。步驟在室溫下在綠光(例如，波長為425至575 nm且強度小於200勒克司)下進行以保護結合物免於光降解。
在DMSO中，以4:1 (IRDye 700DX NHS酯:西妥昔單抗)之最終莫耳比與IRDye 700DX NHS酯進行結合反應，以實現每一西妥昔單抗分子結合約2至3個染料殘基。將IRDye 700DX NHS酯添加至含有西妥昔單抗之酸瓶中且在攪拌盤上混合10至15 min。接著藉由將容器置放於25℃培育箱(範圍23至27℃)中來進行結合反應60至90 min。
藉由與1.0 M甘胺酸pH 9.0 ± 0.2混合至20 mM甘胺酸之最終目標濃度來淬滅結合反應物。將容器在25℃ (範圍23至27℃)下再培育16至24小時。
進行最終UF/DF步驟以將結合產物交換至最終PBS調配物緩衝液中。將經淬滅結合物轉移至UF/DF系統且首先濃縮至9至11g/L，隨後用8至12透濾體積(diavolume)之10 mM磷酸鈉pH 7.1 ± 0.2進行透濾。測定蛋白濃度且若需要，進一步進行緩衝液稀釋以達至9至11g/L之最終目標產物濃度。
經由0.5/0.2 µm PES Millipore SHC過濾器進行過濾且西妥昔單抗-IR700結合物在2至8℃下在黑暗中儲存於覆蓋有鋁箔之容器中以保護內容物免受光照。在室溫下在綠光下執行該等步驟以保護西妥昔單抗-IR700結合物。將結合物在10 mM磷酸鈉Ph 7.1 ± 0.2中稀釋至6.7 g/L之濃度。接著在4倍濃縮賦形劑緩衝液：10 mM磷酸鈉、36%海藻糖、0.06% PS-80 pH 7.1 ± 0.2 (w/v)、0.5至0.8 mg/mL聚山梨醇酯-80中將此結合物溶液稀釋至5 g/L之濃度。使用0.2 μm PVDF Millipore Durapore過濾器執行最終過濾步驟且所得結合物在10 mM磷酸鈉、9%海藻糖、0.02%聚山梨醇酯-80，pH 7.1 ± 0.2中調配為5 g/L。
將所得結合物提供用於SEC-HPLC分析以測定濃度、染料與抗體比(DAR)、一致性及純度且測定外觀、pH、生物負荷及內毒素含量。
實例2：西妥昔單抗-IR700結合物之結合位置之圖譜繪製(Mapping) A. 藉由肽譜(Peptide Mapping)分析IR700位點佔用
在變性緩衝液(6M 胍-HCl，0.1M tris pH 8.0)中使用DTT來還原西妥昔單抗-IR700結合物，隨後用碘乙醯胺烷基化。將經還原及烷基化之樣本去鹽至胰蛋白酶消化緩衝液(25 mM tris，10mM氯化鈣pH 7.5)中且用蛋白酶以1:20 (蛋白酶:蛋白質)之比率處理且在37℃下培育隔夜。為判定IR700結合之位點，將經胰蛋白酶消化之樣本用1% TFA處理且在37℃下再加熱兩小時。在表E1中所概述之條件下，經TFA處理之樣本藉由在C18管柱(Waters)上用220 nm及690 nm偵測及MS偵測進行RP-HPLC分析來分析。
表E1：
| 方法參數 | 條件/要求 | |
| HPLC設置 | 行動相 | 行動相A: 0.05% TFA/水 行動相B: 0.04% TFA/乙腈 |
| 流速 | 0.3 mL/min | |
| 管柱 | XSelect CSH C18, 3.5µm, 2.1 × 150 mm | |
| 偵測器波長 | 220 nm, 690 nm | |
| 溶離模式 | 梯度 | |
| 管柱溫度 | 50℃ | |
| 質譜法設置 | 離子極性 | 正 |
| 氣體溫度 | 325℃ | |
| 乾燥氣體 | 9 L/min | |
| 噴霧器 | 25 psig | |
| VCap電壓 | 3500 V | |
| 碎裂電壓 | 175 V | |
| 碰撞能量 | 斜率- 3.4 偏移- 2.7 |
在690 nm下分析IR700結合且藉由質譜法以正離子模式確認。IR700結合之定量藉由整合與結合肽及未經修飾肽相關的提取離子層析圖峰來測定，使用下式以測定結合量：
在三個單獨生產之結合物批次中定位IR700染料在西妥昔單抗之輕鏈及重鏈上之結合位置，且所選擇之結合肽及對應的未經修飾之肽之結果、滯留時間(RT)及質量(m/z)如表E2 (輕鏈)及表E3 (重鏈)所顯示。表 E2 ：
表 E3 ：
B. 強陰離子交換(SAX) HPLC之未結合抗體
| 結合位點 | RT (min) | 結合肽(m/z) | 未經修飾之肽(m/z) | 結合% | |||
| 第1 批 | 第2 批 | 第3 批 | 平均 | ||||
| K49 | 58.5 | 1243.09 | 486.36, 633.82 | 0.5% | 0.4% | 0.5% | 0.5% |
| K107 | 54 | 714.34 | 502.32 | 3.7% | 3.0% | 3.4% | 3.4% |
| K126 | 50.2 | 1119.78 | 899.45, 973.52 | 0.4% | 0.5% | 0.4% | 0.4% |
| K145 | 53.5 | 829.36 | 347.19, 560.32 | 9.7% | 9.1% | 9.2% | 9.3% |
| K149 | 54.5 | 862.37 | 560.32, 1068.49 | 0.1% | 0.1% | 0.1% | 0.1% |
| K188 | 46 | 415.17 | 313.15, 625.28 | 1.7% | 2.3% | 2.3% | 2.1% |
| K190 | 43 | 970.76 | 938.47 | 3.5% | 3.2% | 3.7% | 3.5% |
| K207 | 50 | 1050.48 | 938.47, 523.26 | 2.0% | 1.9% | 2.1% | 2.0% |
| 結合位點 | RT | 結合肽(m/z) | 天然肽(m/z) | 結合% | |||
| 第1 批 | 第2 批 | 第3 批 | 平均 | ||||
| K5 | 62 | 1224.84 | 598.38, 1188.26 | 3.7% | 3.8% | 3.9% | 3.8% |
| K43 | 65.8 | 1273.9 | 516.28, 1285.62 | 0.8% | 0.8% | 0.8% | 0.8% |
| K75 | 58.5 | 984.91 | 378.21, 462.21 | 3.3% | 3.7% | 3.5% | 3.5% |
| K81 | 64.5 | 1373.31 | 1333.85, 378.21 | 0.2% | 0.3% | 0.2% | 0.2% |
| K135 | 59 | 1086.84 | 593.83, 661.34 | 0.1% | 0.1% | 0.1% | 0.1% |
| K215 | 51 | 643.76 | 361.21, 1679.34 | 9.8% | 9.6% | 10.6% | 10.0% |
| K248 | 60 | 1205.22 | 711.87 | 1.7% | 1.7% | 1.6% | 1.7% |
| K250 | 57.5 | 1108.26 | 418.22, 711.87 | 0.2% | 0.2% | 0.1% | 0.2% |
| K276 | 60 | 914.2 | 839.4, 1070.02 | 0.4% | 0.4% | 0.4% | 0.4% |
| K290 | 52.5 | 892.71 | 839.4 | 0.4% | 0.7% | 0.6% | 0.6% |
| K292 | 49.5 | 424.16 | 501.31, 720.7 | 9.2% | 11.0% | 10.3% | 10.2% |
| K319 | 60 | 999.8 | 904.51 | 0.6% | 0.7% | 0.6% | 0.6% |
| K328 | 54 | 1018.47 | 419.76, 447.26 | 1.3% | 1.3% | 1.2% | 1.3% |
| K336 | 56 | 1018.98 | 419.76 | 5.9% | 6.1% | 5.8% | 5.9% |
| K362 | 57 | 850.37 | 319.15, 581.32 | 0.5% | 0.5% | 0.5% | 0.5% |
| K394 | 62 | 1288.31 | 937.46, 1272.57 | 0.2% | 0.4% | 0.3% | 0.3% |
| K416 | 52.5 | 529.89 | 575.34 | 10.2% | 12.3% | 11.1% | 11.2% |
| K449 | 61.5 | 779.33 | 394.73 | 7.4% | 8.1% | 7.2% | 7.6% |
強陰離子交換(SAX) HPLC用於基於電荷分離樣本中之組分。西妥昔單抗與IRDye 700 DX (IR700)之間的結合改變抗體之電荷，使得結合及未結合之抗體組分具有不同的電荷分佈。出於此原因，SAX管柱用於將此等兩個組分彼此分離且量測原料藥物質(bulk drug substance)及藥品中未結合抗體之含量。含量報導為相對於總峰面積之面積百分比。藉由280 nm處之吸光度進行偵測，以690 nm之吸光度進行校正。此例示性方法用於釋放及穩定性測試。
在表E4中所顯示之條件下，將樣本用低導電性緩衝液稀釋且施加至SAX HPLC管柱上。IR700染料之顯著電荷貢獻藉由SAX-HPLC提供未結合西妥昔單抗抗體與IR700-結合物之分解。如表E5中所展示，在不同批次中，未結合抗體之百分比介於4.6%至7.1%之間。表 E4 ：
表 E5 ：
實例3：評定西妥昔單抗-IR700結合物
| 方法參數 | 條件/要求 |
| 行動相 | 平衡：低電導性，高pH 梯度：氯化鈉濃度增加及pH降低 |
| 流速 | 0.5 mL/min |
| 管柱 | Thermo ProPac SAX10, bioLC Analytical 4 mm × 250 mm |
| 偵測器波長 | 280 nma |
| 溶離模式 | 梯度 |
| 管柱溫度 | 30℃ |
| 西妥昔單抗-IR700結合物樣本 | 未結合抗體% |
| 第1批, 350 g規模 | 6.9% |
| 第2批, 350 g規模 | 7.1% |
| 第3批, 2 kg規模 | 4.6% |
與參考標準相比，測試西妥昔單抗-IR700結合物批次之EGFR結合及光免疫療法(PIT)活性。
A. EGFR結合
針對上文實例2中所描述之三個批次之結合物中之每一者，藉由ELISA量測相對於參考標準，西妥昔單抗-IR700結合物與人類表皮生長因子受體(EGFR)之結合。與參考標準相比，結合物分別展現103%、97%及101%的相對EGFR結合。
B. PIT
將BxPC3細胞接種於微量滴定盤中，使一些孔無細胞(對照物)。使細胞黏附至微量滴定盤，在37℃，5% CO2
下隔夜培育。將西妥昔單抗-IR700結合物之參考材料及樣本連續稀釋且施加於盤之孔中之細胞。將完整的細胞培養基添加至無細胞孔中。在37℃，5% CO2
下培育一小時之後，以150 mW/cm2
之功率密度用690 nm光照射微量滴定盤，改變曝露時間以獲得所需光通量(J/cm2
)。在曝光後，將含有經光處理之細胞的微量滴定盤在37℃，5% CO2
下培育22 +/-2小時。在隔夜培育後，藉由添加螢光細胞存活率試劑(CellTiter-Glo 2.0)來測定細胞存活率。不同批次之基於細胞之光免疫療法(PIT)分析的結果展示於圖 1
中，且批次中之每一者的相對效能展示於下表E6中。收集原始螢光單位且繪製為4參數邏輯曲線，表明樣本相對於參考標準之細胞殺死活性。
表E6：
實例4：藉由西妥昔單抗-IR700結合物之尺寸排阻(SEC) HPLC來量測殘餘游離IR700
| 西妥昔單抗-IR700結合物樣本 | 相對效能% |
| 第1批, 350 g規模 | 95% |
| 第2批, 350 g規模 | 88% |
| 第3批, 2 kg規模 | 91% |
SEC-HPLC用以基於分子量及流體動力比來分級分離樣本。在等度條件下進行該方法。藉由在690 nm (A690)及280 (A280)nm處的吸光度進行染料之偵測，且含量報導為相對於總峰面積之面積百分比。兩種波長之使用允許評定一致性(在A690下)、產物濃度(在A280下，具有背景校正)、純度及雜質含量(在A690及A280下)、游離IR700含量(在A690下)及染料與抗體比(DAR；A690及A280)。此與表明穩定性之量測相關，此係因為曝露於光之樣本中發生高分子量物種之增加及主峰定量的減少。此方法用於在表E7中所展示之條件下評定3批結合物(第1批至第3批)，且結果展示於圖 2
中，其中藍色跡線指示批號1之西妥昔單抗-IR700結合物，紅色跡線指示批號2之西妥昔單抗-IR700結合物且綠色跡線指示批號3之西妥昔單抗-IR700結合物。此方法可用於原料藥物質及藥品之釋放及穩定性測試。表 E7 ：
| 方法參數 | 條件/要求 |
| 行動相 | 磷酸鹽緩衝鹽水, pH 7.1 |
| 流速 | 0.5 mL/min |
| 管柱 | Shodex Protein KW-803 |
| 標稱管柱負荷 | 100 µg |
| 偵測器波長 | 280 nm及690 nm |
| 運行時間 | 20 min |
| 溶離模式 | 等度 |
| 溫度 | 25 ± 2℃ |
| 自動取樣器溫度 | 4 ± 2℃ |
如下表E8中所展示，所有3個批次之西妥昔單抗-IR700結合物展現至少97%單體、小於3%高分子量物種(HMW)及小於或等於0.3%游離IR700染料(例如，未結合染料)。表 E8 ：
| 偵測波長 | 西妥昔單抗-IR700結合物樣本 | 單體% | % HMW | % LMW | 游離IR700 % | DAR |
| 280 nm | 第1批, 350 g規模 | 98.4% | 1.6% | ND | NA | NA |
| 第2批, 350 g規模 | 98.3% | 1.7% | ND | NA | NA | |
| 第3批, 2 kg規模 | 97.8% | 2.2% | ND | NA | NA | |
| 690 nm | 第1批, 350 g規模 | 98.0% | 2.0% | ND | 0.3% | 2.8 |
| 第2批, 350 g規模 | 97.9% | 2.1% | ND | 0.3% | 2.8 | |
| 第3批, 2 kg規模 | 97.0% | 3.0% | ND | 0.2% | 3.0 |
本發明並不意欲限制於所揭示之特定實施例的範疇內，該等實施例經提供例如以說明本發明之各種態樣。對組合物及方法之各種修改將自本文中之描述及教示變得顯而易見。此類變化形式可在不背離本發明之真正範疇及精神的情況下實踐且意欲屬於本發明之範疇內。
圖 1
展示光免疫療法(PIT)分析之結果，其相對於參考標準比較三個批次西妥昔單抗-IR700結合物之BxPC3細胞-殺死活性。
圖 2
展示三個批次西妥昔單抗-IR700結合物之尺寸排阻HPLC (SEC-HPLC)之結果，其顯示所有三個批次展現至少97%單體，小於3%高分子量物種(high molecular weight species；HMW)及小於或等於0.3%游離IR700染料(例如，未結合染料)。
Claims (50)
- 一種結合物，其包含至少兩個IR700分子結合至西妥昔單抗(cetuximab)中之至少兩個離胺酸(K)位置，且其中該至少兩個離胺酸位置獨立地選自由以下組成之群：對應於該西妥昔單抗之輕鏈中之位置107之離胺酸(K107)、對應於位置145之離胺酸(K145)、對應於位置188之離胺酸(K188)、對應於位置190之離胺酸(K190)及對應於位置207之離胺酸(K207)及對應於該西妥昔單抗之重鏈中之位置5之離胺酸(K5)、對應於位置75之離胺酸(K75)、對應於位置215之離胺酸(K215)、對應於位置248之離胺酸(K248)、對應於位置292之離胺酸(K292)、對應於位置328之離胺酸(K328)、對應於位置336之離胺酸(K336)、對應於位置416之離胺酸(K416)及對應於位置449之離胺酸(K449)。
- 如請求項1之結合物，其包含至少三個IR700分子結合至該西妥昔單抗中之至少三個離胺酸位置。
- 如請求項2之結合物，其中該至少三個離胺酸位置獨立地選自由以下組成之群：輕鏈中之K107、K145、K188、K190及K207及重鏈中之K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416及K449。
- 如請求項1至3中任一項之結合物，其中結合至IR700之該等離胺酸位置中之至少一者係選自由以下組成之群：輕鏈中之K145或重鏈中之K215、K416或K449。
- 如請求項1至4中任一項之結合物，其中至少一個IR700分子結合至輕鏈中之離胺酸，且至少一個IR700分子結合至重鏈中之離胺酸。
- 如請求項1至5中任一項之結合物，其中該結合物能夠藉由波長在690 nm ± 50 nm之間的光照射而活化且藉此在該結合物結合至細胞表面上之抗原決定基時展現細胞殺死活性。
- 一種組合物，其包含如請求項1至6中任一項之結合物及醫藥學上可接受之賦形劑。
- 一種組合物，其包含結合物之群體，其中該群體中之結合物包含IR700結合至西妥昔單抗，其中至少或至少約50%、60%、70%、80%、90%或大於或大於約90%之該等結合物包含至少兩個IR700分子結合至該西妥昔單抗中之至少兩個離胺酸(K)位置，且其中該兩個離胺酸位置獨立地選自由以下組成之群：對應於該西妥昔單抗之輕鏈中之位置107之離胺酸(K107)、對應於位置145之離胺酸(K145)、對應於位置188之離胺酸(K188)、對應於位置190之離胺酸(K190)及對應於位置207之離胺酸(K207)及對應於該西妥昔單抗之重鏈中之位置5之離胺酸(K5)、對應於位置75之離胺酸(K75)、對應於位置215之離胺酸(K215)、對應於位置248之離胺酸(K248)、對應於位置292之離胺酸(K292)、對應於位置328之離胺酸(K328)、對應於位置336之離胺酸(K336)、對應於位置416之離胺酸(K416)及對應於位置449之離胺酸(K449)。
- 如請求項7或8之組合物，其中至少或至少約50%、60%、70%、80%、90%或大於或大於約90%之該等結合物包含至少三個IR700分子結合至該西妥昔單抗中之至少三個離胺酸位置。
- 如請求項9之組合物，其中該至少三個離胺酸位置獨立地選自由以下組成之群：輕鏈中之K107、K145、K188、K190及K207及重鏈中之K5、K75、K215、K248、K292、K328、K336、K416及K449。
- 如請求項7至10中任一項之組合物，其中至少或至少約50%、60%、70%、80%、90%或大於或大於約90%之該等結合物包含至少一個IR700分子結合至輕鏈中之K145或重鏈中之K215、K416或K449。
- 如請求項7至11中任一項之組合物，其中至少或至少約50%、60%、70%、80%、90%或大於或大於約90%之該等結合物包含IR700分子結合至輕鏈中之K145及IR700分子結合至重鏈中之K215、K416或K449中之至少一者。
- 如請求項7至12中任一項之組合物，其中IR700分子與該西妥昔單抗之比率在約2:1至約4:1之間。
- 如請求項7至13中任一項之組合物，其中IR700分子與該西妥昔單抗之比率為約2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3.0:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1或3.4:1。
- 如請求項7至13中任一項之組合物，其中IR700分子與該西妥昔單抗之比率在約2.7:1至約3.2:1之間。
- 如請求項7至15中任一項之組合物，其中該組合物中不超過或不超過約15%之西妥昔單抗分子未與IR700結合。
- 如請求項7至16中任一項之組合物，其中該組合物中小於或小於約10%之西妥昔單抗分子未與IR700結合。
- 如請求項7至17中任一項之組合物，其中游離染料在該組合物中之百分比小於或小於約3%、小於或小於約2%、小於或小於約1%，或小於或小於約0.5%。
- 一種組合物，其包含西妥昔單抗-IR700結合物之群體，其中該組合物中複數種結合物各包含IR700結合至西妥昔單抗於西妥昔單抗之輕鏈或重鏈中選自由以下組成之群之離胺酸(K)：對應於該西妥昔單抗之輕鏈中之位置107之離胺酸(K107)、對應於位置145之離胺酸(K145)、對應於位置188之離胺酸(K188)、對應於位置190之離胺酸(K190)及對應於位置207之離胺酸(K207)及對應於該西妥昔單抗之重鏈中之位置5之離胺酸(K5)、對應於位置75之離胺酸(K75)、對應於位置215之離胺酸(K215)、對應於位置248之離胺酸(K248)、對應於位置292之離胺酸(K292)、對應於位置328之離胺酸(K328)、對應於位置336之離胺酸(K336)、對應於位置416之離胺酸(K416)及對應於位置449之離胺酸(K449)，且該組合物包含以下特徵： (a) 該組合物中之IR700分子與該群體中西妥昔單抗分子之比率在約2:1與約3:5之間， (b) 小於或小於約10%之西妥昔單抗分子未與IR700結合，及 (c) 該組合物中之游離染料在該組合物中之所有染料分子中的百分比小於或小於約3%。
- 如請求項19之組合物，其中複數種結合物包含西妥昔單抗在輕鏈之K145與IR700結合。
- 如請求項19或20之組合物，其中複數種結合物包含西妥昔單抗在重鏈之K215、K416或K449與IR700結合。
- 如請求項19至21中任一項之組合物，其中複數種結合物包含西妥昔單抗與至少三個IR700分子結合。
- 如請求項19至22中任一項之組合物，其中該複數種結合物包含該組合物中之至少或至少約51%、至少或至少約55%、至少或至少約60%、至少或至少約70%、至少或至少約75%或至少或至少約80%之結合物。
- 如請求項19至23中任一項之組合物，其中游離染料在該組合物中之百分比小於或小於約2%、小於或小於約1%或小於或小於約0.5%。
- 如請求項7至24中任一項之組合物，其中該西妥昔單抗包含SEQ ID NO: 1中所述之重鏈序列、SEQ ID NO: 2中所述之輕鏈序列，或其組合。
- 如請求項7至25中任一項之組合物，其中在暗處或少光條件下儲存6個月之後，游離染料在該組合物中之百分比實質上未改變。
- 如請求項7至26中任一項之組合物，其中該組合物包含至少或至少約95%、96%、97%或98%單體形式之該結合物。
- 如請求項7至27中任一項之組合物，其中該組合物包含小於或小於約5%、4%或3%高分子量物種。
- 一種殺死腫瘤或癌細胞之方法，該方法包含： 在或接近該腫瘤或該癌細胞之部位投與包含如請求項1至28中任一項之結合物或組合物的醫藥組合物；及 在約600 nm至約850 nm之波長以由約25 J cm−2 至約400 J cm−2 或由約25 J/cm光纖長度至約500 J/cm光纖長度之劑量照射接近該腫瘤或該癌細胞之區域，藉此殺死該腫瘤或該癌細胞。
- 一種治療個體之疾病或病況之方法，該方法包含： 在或接近該腫瘤或該癌細胞之部位投與包含如請求項1至28中任一項之結合物或組合物的醫藥組合物；及 在約600 nm至約850 nm之波長以由約25 J cm−2 至約400 J cm−2 或由約25 J/cm光纖長度至約500 J/cm光纖長度之劑量照射接近個體之病灶或腫瘤的區域，藉此治療該疾病或病況。
- 如請求項29或30之方法，其中該照射步驟係在690 ± 50 nm之波長或在或約690 ± 20 nm之波長進行。
- 如請求項31之方法，其中該照射步驟係在約690 nm之波長進行。
- 如請求項30至32中任一項之方法，其中該疾病或病況為腫瘤或癌症。
- 如請求項29至33中任一項之方法，其中該腫瘤或該癌細胞包含以下腫瘤或該疾病或病況為以下腫瘤：膀胱癌、胰臟癌、結腸癌、卵巢癌、肺癌、乳癌、胃癌、前列腺癌、子宮頸癌、食道癌或頭頸癌。
- 如請求項29至33中任一項之方法，其中該腫瘤或該癌細胞包含以下癌症或該疾病或病況為以下癌症：位於頭頸部、乳房、肝臟、結腸、卵巢、前列腺、胰臟、腦、子宮頸、骨、皮膚、眼睛、膀胱、胃、食道、腹膜或肺之癌症。
- 如請求項35之方法，其中該癌症為頭頸癌。
- 一種製造穩定結合物之方法，該方法包含： a) 使西妥昔單抗與IR700在產生西妥昔單抗-IR700結合物之條件下接觸，其中該結合物包含至少兩個結合至IR700之離胺酸(K)位置獨立地選自由以下組成之群：對應於該西妥昔單抗之輕鏈中之位置107之離胺酸(K107)、對應於位置145之離胺酸(K145)、對應於位置188之離胺酸(K188)、對應於位置190之離胺酸(K190)及對應於位置207之離胺酸(K207)及對應於該西妥昔單抗之重鏈中之位置5之離胺酸(K5)、對應於位置75之離胺酸(K75)、對應於位置215之離胺酸(K215)、對應於位置248之離胺酸(K248)、對應於位置292之離胺酸(K292)、對應於位置328之離胺酸(K328)、對應於位置336之離胺酸(K336)、對應於位置416之離胺酸(K416)及對應於位置449之離胺酸(K449)； b) 使該結合物在結合期間及/或之後經受一個步驟，該步驟實質上減少與該西妥昔單抗非特異性結合之IR700；及 c) 在醫藥學上可接受之緩衝液中調配該結合物， 其中在步驟a)至c)中之每一者中，該染料及結合物曝露之唯一光具有在約400 nm至約650 nm範圍內之波長或具有小於或小於約500勒克司(lux)之強度。
- 如請求項37之方法，其中步驟b)包含在完成IR700與該西妥昔單抗之間的結合反應之後，使該結合物經甘胺酸淬滅反應。
- 如請求項38之方法，其中該淬滅反應進行隔夜或大於或大於約6小時之持續時間。
- 一種穩定結合物，其係藉由如請求項37至39中任一項之方法製造。
- 一種組合物，其包含複數種結合物，其中該等結合物包含IR700結合至西妥昔單抗，其中該組合物經胰蛋白酶消化產生包含以下肽之群體： a) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置215之離胺酸(K215)； b) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置292之離胺酸(K292)； c) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置416之離胺酸(K416)；及 d) 西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置145之離胺酸(K145)。
- 如請求項41之組合物，其中該肽之群體進一步包含： e) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置336之離胺酸(K336)；及 f) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置449之離胺酸(K449)。
- 如請求項41或42之組合物，其中該肽之群體進一步包含： g) 西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置107之離胺酸(K107)； h) 西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置190之離胺酸(K190)； i) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置5之離胺酸(K5)；及 j) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置75之離胺酸(K75)。
- 如請求項41至43中任一項之組合物，其中該肽之群體進一步包含以下中之一或多者： k) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置248之離胺酸(K248)； l) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置328之離胺酸(K328)； m)西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置188之離胺酸(K188)；及 n) 西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置207之離胺酸(K207)。
- 一種組合物，其包含複數種結合物，其中該等結合物包含IR700結合至西妥昔單抗，其中該組合物經胰蛋白酶消化產生包含以下肽之群體： a) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置5之離胺酸(K5)； b) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置75之離胺酸(K75)； c) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置215之離胺酸(K215)； d) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置248之離胺酸(K248)； e) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置292之離胺酸(K292)； f) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置328之離胺酸(K328)； g) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置336之離胺酸(K336)； h) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置416之離胺酸(K416)； i) 西妥昔單抗之重鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置449之離胺酸(K449)； j) 西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置107之離胺酸(K107)； k) 西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置145之離胺酸(K145)； l) 西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置188之離胺酸(K188)； m)西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置190之離胺酸(K190)；及 n) 西妥昔單抗之輕鏈之肽，其包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置207之離胺酸(K207)。
- 如請求項41至45中任一項之組合物，其中該等肽係藉由正離子模式質譜法偵測。
- 如請求項46之組合物，其中當針對由正離子模式質譜法偵測之肽產生提取離子層析圖(EIC)時： 對應於a)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於a)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的3%或約3%與5%或約5%之間； 對應於b)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於b)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的3%或約3%與5%或約5%之間； 對應於c)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於c)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的8%或約8%與11%或約11%之間； 對應於d)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於d)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的0.5%或約0.5%與2.5%或約2.5%之間； 對應於e)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於e)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的8%或約8%與12%或約12%之間； 對應於f)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於f)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的0.2%或約0.2%與2.5%或約2.5%之間； 對應於g)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於g)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的4.5%或約4.5%與7%或約7%之間； 對應於h)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於h)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的9.5%或約9.5%與13%或約13%之間； 對應於i)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於i)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的6%或約6%與10%或約10%之間； 對應於j)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於j)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的2%或約2%與5%或約5%之間； 對應於k)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於k)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的7%或約7%與11%或約11%之間； 對應於l)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於l)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的0.5%或約0.5%與4%或約4%之間； 對應於m)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於m)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的1.5%或約1.5%與5%或約5%之間；及 對應於n)之肽之EIC峰積分面積係在對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於n)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的0.5%或約0.5%與4%或約4%之間。
- 如請求項47之組合物，其中： 對應於a)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於a)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約3.8±1%； 對應於b)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於b)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約3.5±1%； 對應於c)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於c)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約10.0±1%； 對應於d)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於d)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約1.7±1%； 對應於e)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於e)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約10.2±1%； 對應於f)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於f)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約1.3±1%； 對應於g)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於g)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約5.9±1%； 對應於h)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於h)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約11.2±1%； 對應於i)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於i)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約7.6±1%； 對應於j)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於j)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約3.4±1%； 對應於k)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於k)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約9.3±1%； 對應於l)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於l)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約2.1±1%； 對應於m)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於m)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約3.5±1%；及 對應於n)之肽之EIC峰積分面積係對應的未經修飾肽之EIC峰積分面積及對應於n)之該等肽之EIC峰積分面積之總和的約2.0±1%。
- 一種組合物，其包含複數種結合物，其中該等結合物包含IR700結合至西妥昔單抗，且其中該組合物經胰蛋白酶消化產生肽，該等肽產生包含對應於以下之提取離子層析圖(EIC)峰之質譜： 包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置5之離胺酸(K5)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約2.5%； 包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置75之離胺酸(K75)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約2.5%； 包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置215之離胺酸(K215)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約9%； 包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置248之離胺酸(K248)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約0.5%；及/或 包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置292之離胺酸(K292)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約8.5%； 包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置328之離胺酸(K328)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約0.5%； 包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置336之離胺酸(K336)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約4.5%； 包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置416之離胺酸(K416)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約9%； 包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置449之離胺酸(K449)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約7%； 包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置107之離胺酸(K107)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約2.5%； 包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置145之離胺酸(K145)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約8.5%； 包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置188之離胺酸(K188)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約1%； 包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置190之離胺酸(K190)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約2.5%；及 包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置207之離胺酸(K207)之肽，其中結合EIC峰之面積百分比係對應的經修飾及未經修飾之多肽之EIC峰總面積的至少或至少約1%。
- 如請求項49之組合物，其中： 對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置5之離胺酸(K5)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約3.8±1%； 對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置75之離胺酸(K75)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約3.5±1%； 對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置215之離胺酸(K215)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約10.0±1%； 對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置248之離胺酸(K248)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約1.7±1%； 對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置292之離胺酸(K292)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約10.2±1%； 對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置328之離胺酸(K328)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約1.3±1%； 對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置336之離胺酸(K336)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約5.9±1%； 對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置416之離胺酸(K416)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約11.2±1%； 對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 1之位置449之離胺酸(K449)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約7.6±1%； 對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置107之離胺酸(K107)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約3.4±1%； 對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置145之離胺酸(K145)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約9.3±1%； 對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置188之離胺酸(K188)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約2.1±1%； 對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置190之離胺酸(K190)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約3.5±1%；及 對於包含IR700分子結合至對應於SEQ ID NO: 2之位置207之離胺酸(K207)之肽，結合EIC峰之面積百分比為約2±1%。
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