KR20180043854A - 아밀로이드 베타에 대해 인간화된 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 알츠하이머병(Alzheimer's Disease)과 같은 아밀로이드 단백질과 관련된 이상(abnormality) 및 장애 그룹인 아밀로이드증(amyloidosis)의 치료에서 치료적 및 진단적 용도를 위한 키메라 및 인간화된 항체 및 방법 및 조성물에 관한 것이다.

Description

아밀로이드 베타에 대해 인간화된 항체 {HUMANIZED ANTIBODY AGAINST AMYLOID BETA}
본 발명은 알츠하이머병(Alzheimer's Disease)과 같은 아밀로이드 단백질과 관련된 이상(abnormality) 및 장애 그룹인 아밀로이드증(amyloidosis)의 치료 및 진단을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
아밀로이드증(amyloidosis)은 단일 질환(single disease entity)이 아니라 오히려, 하나 이상의 기관 또는 신체 내에 축적되는, 아밀로이드로 불리는 밀랍상(waxy), 전분-유사 단백질의 세포외 조직 침착물(deposit)을 특징으로 하는 진행성 질환 과정의 다양한 그룹이다. 상기 아밀로이드 침착물이 축적됨에 따라, 이는 상기 기관 또는 신체의 정상 기능을 방해하기 시작한다. 적어도 15개의 상이한 유형의 아밀로이드증이 있다. 주된 형태는 공지된 선행징후(antecedent)가 없는 원발성 아밀로이드증(primary amyloidosis), 일부 다른 병태(condition)에 따르는 속발성 아밀로이드증(secondary amyloidosis), 및 유전성 아밀로이드증이다.
속발성 아밀로이드증은 결핵(tuberculosis), 가족성 지중해열(familial Mediterranean fever)로 불리는 세균 감염, 뼈 감염(골수염(osteomyelitis)), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 소장염(육아종회장염(granulomatous ileitis)), 호지킨병(Hodgkin's disease), 및 나병(leprosy)과 같은 염증 질환 또는 만성 감염 동안 발생한다.
아밀로이드 침착물은 아밀로이드 P (오각형) 성분(AP), 정상 혈청 아밀로이드 P (SAP)에 관계되는 당단백질, 및 연결 조직의 복합 탄수화물인 황산화 글리코스아미노글리칸 (sulfated glycosaminoglycan; GAG)을 포함한다. 아밀로이드 물질의 약 90%를 차지하는 아밀로이드 단백질 원섬유(fibril)는 여러 상이한 유형의 단백질 중 하나를 포함한다. 이들 단백질들은 아밀로이드 단백질의 독특한 염색 특성을 야기하는 콩고 레드(Congo red)에 대한 결합 부위를 나타내는 독특한 단백질 배열(configuration)인, 소위 "베타-플리트된(beta-pleated)" 시트 원섬유로 접힐 수 있다.
많은 노화 질환은 아밀로이드-유사 단백질에 기인하거나 이와 관련되고, 질환의 발병기전뿐만 아니라 진행에 기여하는 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 물질의 세포외 침착물의 형성을 일부 특징으로 한다. 이들 질환은, 알츠하이머병(AD), 루이 소체 치매(Lewy body dementia), 다운증후군(Down's syndrome), 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈(네덜란드형)(hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis (Dutch type)); 괌 파킨슨-치매 복합증(Guam Parkinson-Dementia complex)과 같은 신경계 장애를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 아밀로이드-유사 단백질에 기인하거나 또는 이와 관련된 다른 질환으로는 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 다발성 경화증(multiple sclerosis); 크로이츠펠트 야콥병(Creutzfeld Jacob disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), HIV-관련 치매, 근육위축가쪽경화증(ALS; amyotropic lateral sclerosis), 성인 발병형 당뇨병; 노인성 심아밀로이드증(senile cardiac amyloidosis); 내분비 종양, 및 황반 변성(macular degeneration)을 포함하는 그 밖의 질환이 있다.
비록 이들 질환의 발병기전은 다양할 수 있지만, 이들의 특징적인 침착물은 종종 많은 공통(shared) 분자적 성분을 함유한다. 이는 전염증성(pro-inflammatory) 경로의 국부적 활성화에 상당한 정도로 기여할 수 있어, 활성화된 보체 성분(complement component), 급성기 반응물질(acute phase reactant), 면역 조절물질(immune modulator), 및 다른 염증 매개체(inflammatory mediator)가 동시 침착될 수 있다(McGeer 등, 1994).
알츠하이머병(AD)은 뇌 내 단백질의 이상 침착물의 축적물인 아밀로이드 플라크에 기인하는 것으로 주로 생각되는 신경계 장애이다. 병에 걸린 개인의 뇌에서 발견되는 가장 흔한 아밀로이드의 유형은 주로 Aβ 원섬유로 구성된다. 과학적 증거는, 플라크에서의 베타-아밀로이드 단백질의 생산 및 축적의 증가가 신경 세포 사멸을 초래한다는 것을 증명하고 있는데, 신경 세포의 사멸은 AD의 발생 및 진행에 기여한다. 이어서, 중요한(strategic) 뇌 구역에서의 신경세포의 상실은 신경 전달 물질의 감소와 기억의 손상(impairment)을 유발한다. 플라크 형성에 주로 필수적인 단백질은 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 및 두 프레세닐린(presenilin)(프레세닐린 Ⅰ 및 프레세닐린 Ⅱ)을 포함한다. 효소 β 및 γ 세크레타아제(secretase)에 의한, 대부분의 세포에서 구성적으로 발현되고 이화되는(catabolized) 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 순차적 분할(cleavage)은 39 내지 43 아미노산 Aβ 펩타이드를 방출시킨다. APP의 분해는 그들의 플라크로 결집하려는 경향을 증가시키는 듯 하다. 결집물 축적 경향이 높은 것은 특히 Aβ(1-42) 절편(fragment)인데, 이는 그의 C-말단에서의 2개의 극소수성(very hydrophobic) 아미노산 잔기에 기인한다. 따라서, 상기 Aβ(1-42) 절편은 AD에서 신경 플라크(neutritic plaque) 형성의 개시에 주로 관여하고 또한 필수적이라고 여겨지며, 따라서 높은 병리적 가능성을 갖는 것으로 여겨진다. 따라서 아밀로이드 플라크 형성을 예방하기 위한 및 AD에서 존재하는 플라크를 흐트러뜨리기 위한 작용제가 필요하다.
AD의 증상은 더디게 나타나며, 제1 증상은 가벼운 건망증뿐일 것이다. 이 단계에서, 개인은 최근의 사건, 활동, 잘 아는 사람들 또는 사물들의 이름을 잊어버릴 수 있으며, 간단한 수학 문제를 풀 수 없을지도 모른다. 질환이 진행함에 따라, 증상은 보다 쉽게 인지되고 AD에 걸린 사람 또는 그의 가족 구성원이 의학적 도움을 찾을만큼 심각해진다. AD의 중간 단계의 증상은 몸치장(grooming)과 같은 간단한 일을 하는 법을 잊어버리는 것을 포함하고, 말하기, 이해하기, 읽기 또는 쓰기에서 문제점이 발생한다. 후반 단계의 AD 환자는 불안해하거나 또는 공격적이 될 수 있고, 집을 잃어버릴 수 있으며 결국 종합 간병을 필요로 한다.
현재, AD을 진단하기 위한 명확한 방법은 개체의 사망 후 부검하여 뇌 조직의 플라크 및 매듭(tangle)을 확인하는 것이 유일하다. 따라서, 사람이 아직 살아있는 동안, 의사는 "가능한(possible)" 또는 "유력한(probable)" AD의 진단만을 수행할 수 있다. 통상의 방법을 사용하여, 내과의사는 "유력한" AD을 진단하기 위한 여러 도구를 이용하여 90 퍼센트 이하의 정확도로 AD을 진단할 수 있다. 내과의사는 사람의 일반적인 건강, 과거의 의료 문제, 및 일상 활동을 수행하며 갖는 모든 어려움의 히스토리(history)에 대해 질문한다. 기억력, 문제 해결, 집중력, 계산, 및 언어의 행동 테스트는 인지 퇴행의 정보를 제공하며, 혈액, 소변, 또는 척수액의 테스트 및 뇌 스캔과 같은 의학적 테스트는 일부 추가적 정보를 제공할 수 있다.
AD의 관리는 투약-기반 및 비투약 기반 치료로 구성된다. 질환의 근원적 과정의 변화(진행의 지연 또는 역행)를 목표로 한 치료는 그동안 대부분 실패해왔다. 신경 세포의 화학적 전달자(신경전달물질), 특히 타크린(tacrine) 및 리바스티그민(rivastigmine)과 같은 콜린에스테라제 억제제(ChEI)의 결핍(결손), 또는 기능부전(malfunctioning)을 회복시키는 약은 증상의 개선을 나타내어 왔다. ChEI는 신경전달물질의 효소적 분해를 방해하여 뇌에서의 신경 신호를 전달할 수 있는 화학적 전달자의 양을 증가시킨다.
질환 초기 및 중기 단계의 일부 사람들을 위한 약물들인, 타크린 (COGNEX®, Morris Plains, NJ), 도네페질(donepezil) (ARICEPT®, Tokyo, JP), 리바스티그민 (EXELON®, East Hanover, NJ), 또는 갈란타민(galantamine) (REMINYL®, New Brunswick, NJ)은 제한된 시간 동안 일부 증상이 악화되는 것을 예방하는 것을 도울 수 있을 것이다. 다른 약물인, 메만틴(memantine) (NAMENDA®, New York, NY)은 중등도 내지 중증 AD의 치료를 위해 승인되었다. 투약은 또한 AD의 정신병적 증상(manifestation)을 다룰(address) 수 있다. 또한, 일부 약은 불면, 초조, 방랑(wandering), 불안 및 우울증과 같은 AD의 행동 증상의 제어를 도울 수 있다. 이들 증상의 치료는 종종 환자를 보다 편안하게 만들고 또한 간병인에게는 간병이 보다 수월해지도록 한다. 불행히도, 현저한 치료 진보는 이 클래스의 작용제가 위약(placebo)보다 일관적으로 나은 것으로 나타나지만, 질환은 계속 진행되고, 정신 기능의 평균 효과는 그다지 크지 않다. 예를 들어, ChEI 등 AD 약물처치에 사용되는 다수의 약물은 위장관 기능장애, 간 독성 및 체중 감소를 포함하는 부작용도 갖는다.
아밀로이드-유사 단백질의 축적물 및 침착물과 관련되거나 또는 이에 기인하는 다른 질환은 황반 변성이다.
황반 변성은 흔한 안질환으로, 망막 (감광(light-sensitive) 세포가 뇌로 시각 신호를 보내는 눈 뒤쪽의 종이처럼 얇은 조직)의 중앙 구역인 황반의 악화(deterioration)를 유발한다. 선명한, 맑은, '거짓없는(straight ahead)' 시력은 황반에 의해 처리된다. 황반에의 손상은 맹점(blind spot) 및 흐려보임 또는 난시를 야기한다. 연령-관련 황반 변성(AMD)은 미국 내의 65세가 넘은 사람들에게서 시각 손상의 주된 원인이며, 백인 중 법적 맹인의 주요 원인이다. 약 180만명의 40세 이상의 미국인들이 진행된(advanced) AMD에 걸려 있으며, 중간(intermediate) AMD에 걸린 다른 730만명의 사람들은 시력 상실에 대한 실질적 위험에 처해 있다. 정부는 2020년까지 290만명의 사람이 진행된 AMD에 걸릴 것으로 추정한다. AMD의 희생자는 종종, 이 눈을 멀게 하는 병태의 치료 및 원인에 대해 알려진 바가 매우 적다는 것을 발견하고 놀라고 좌절한다.
황반 변성은, 건성 황반 변성(dry macular degeneration) 및 습성 황반 변성(wet macular degeneration)의 두 형태가 있다. 황반의 세포가 천천히 파괴되기 시작하는 건성 형태는, 황반 변성 사례의 85 퍼센트에서 진단된다. 한쪽 눈이 시력을 상실하고, 다른쪽 눈이 걸리지 않은 상태로 잔류할 수 있지만, 통상적으로 양쪽 눈 모두 AMD에 걸린다. 망막 아래의 황색 침착물인 드루젠(drusen)은, 건성 AMD의 통상적인 초기 징후이다. 진행된 건성 AMD 또는 습성 AMD의 발전 위험은 드루젠의 크기 또는 수가 증가할수록 증가한다. 건성 AMD는 진행하여, 질환의 습성 형태로 변하지 않고 시력 상실을 유발하는 것이 가능하다; 그러나, 초기 건성 AMD가 갑자기 습성 형태로 변화하는 것 또한 가능하다.
습성 형태는, 비록 사례의 15 퍼센트만을 차지하지만, 실명의 90퍼센트를 야기하고, 진행된 AMD로 여겨진다 (습성 AMD의 초기 또는 중기는 없다). 습성 AMD는 언제나 질환의 건성 형태를 앞세운다. 건성 형태가 악화되면, 일부 사람들은 황반 뒤에 자라는 비정상적인 혈관을 갖기 시작한다. 이들 혈관들은 매우 연약하여 유체와 혈액이 샐 것이고 (따라서, '습성' 황반 변성), 황반에 대한 급속한 손상을 유발한다.
AMD의 건성 형태는 처음에 종종 약간 흐려보이는 것을 유발할 것이다. 그 후 특히 시야의 중심이 흐려지고, 질환이 진행될수록 이 영역은 더욱 커진다. 한쪽 눈만 걸렸다면 어떠한 증상도 인지하지 못할 수 있다. 습성 AMD에서는, 직선이 물결모양인 것 같이 보일 수 있고, 중심 시력 상실이 급속히 발생할 수 있다.
황반 변성의 진단은 일반적으로 확장된 눈 검사(dilated eye exam), 시력 테스트(visual acuity test), 및 AMD의 진단을 돕기 위한 안저검사(fundoscopy)로 불리는 절차를 이용하여 눈의 뒤쪽을 보는 것을 포함하고, 또한 - 만약 습성 AMD가 의심된다면 - 형광 혈관조영술(fluorescein angiography)도 수행될 수 있다. 만약 건성 AMD가 진행 단계에 도달했다면, 시력 상실을 예방할 수 있는 통용되는 치료는 존재하지 않는다. 그러나, 항산화제 및 아연의 특정 고용량 제형은, 중간 AMD의 진행된 단계로의 진행을 지연시키거나 또는 예방할 수 있다. 마큐젠(Macugen)®(페갑타닙 나트륨 주사액(pegaptanib sodium injection)), 레이저 광응고(laser photocoagulation) 및 광선역학요법(photodynamic therapy)은 황반에서의 비정상적인 혈관 성장 및 출혈을 제어할 수 있으며, 이는 습성 AMD에 걸린 일부 사람들에게 도움이 된다; 그러나, 이미 상실한 시력은 이들 기술에 의해 회복되지 않을 것이다. 시력이 이미 상실되었다면, 존재하는 저시력 보조기(low vision aid)가 삶의 질을 향상시키는데 도움될 수 있다.
연령-관련 황반 변성(AMD)의 최초의 징후 중 하나는 브루크막(Bruch's membrane; BM)과 망막색소상피(retinal pigmented epithelium; RPE)의 바닥판(basal lamina) 사이에 드루젠으로 알려진 세포외 침착물의 축적이다. Anderson 등에 의해 수행된 최근의 연구는 드루젠이 아밀로이드 베타를 함유하는 것을 확인하였다. (Experimental Eye Research 78 (2004) 243-256).
환경적, 유전적, 및 식이적(dietary) 요인들을 탐구하는 연구와 함께 지속하는 진행중인 연구는 AMD에 기여할 것이다. 각막 세포 이식, 질환의 진행을 예방할 또는 감속시킬 약물, 방사선 요법, 유전자 요법, 시력을 강화시키는 것을 도울 수 있는 망막에 삽입되는 컴퓨터 칩 및 황반 아래의 새로운 혈관의 성장을 예방할 작용제를 포함하는 새로운 치료 전략 또한 탐구될 것이다.
새로운 약물의 개발 시 고려되어야 할 중요한 인자는 표적 단백질에 대한 사용의 용이성이다. 경구 약물 전달 - 구체적으로는 정제, 캡슐 및 소프트겔 -은 환자의 편의상 소비되는 모든 투여 형태의 70%를 차지한다. 약물 개발자는 환자가 주사를 맞는 것 또는 약의 투여에서의 보다 침습적인 형태인 그 밖의 것에 비해 경구 전달을 선호하는 것에 동의한다. 낮은 투약 간격(즉, 일일 일회 또는 지속적 방출(sustained release))을 초래하는 제형 또한 바람직하다. 경구 투여 형태로 투여하는 항생제의 용이성은 치료 동안 환자 순응도를 증가시킨다.
필요한 것은, 알츠하이머병(AD), 루이 소체 치매, 다운증후군, 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈(네덜란드형); 괌 파킨슨-치매 복합증과 같은 신경계 장애; 뿐만 아니라 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증; 크로이츠펠트 야콥병, 파킨슨병, HIV-관련 치매, 근육위축가쪽경화증, 성인발병형 당뇨병; 노인성 심아밀로이드증; 내분비 종양, 및 황반 변성을 포함하는 그 밖의 질환과 같은 아밀로이드-유사 단백질과 관련되거나 또는 이에 기인하는 다른 질환을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아닌 속발성 아밀로이드증 및 연령-관련 아밀로이드증을 포함하는 아밀로이드 플라크 형성과 관련된 질환 및 장애 그룹인 아밀로이드증과 관련된 합병증을 예방 또는 처리하기 위한 효과적인 조성물 및 방법이다. 특히 필요한 것은, 아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 펩타이드의 섬유(fiber)의 결집과 관련된 플라크의 형성과 같은 질환의 생리적 표시에 반대작용할 수 있는 작용제이다.
프로인트 완전 또는 불완전 보조제와 혼합된 Aβ1 -42의 접종에 의해 유발된 항-아밀로이드 항체는 인간 알츠하이머병에 대한 트랜스제닉(transgenic) 마우스에서 아밀로이드 존재량(burden)을 감소시킬 수 있는 것으로 보고되었다 (Schenk 등, 1999). 리포좀 내에서 재구성된 테트라팔미토일화된 Aβ1 -16을 NORBA 트랜스제닉 마우스에게 복막내 접종하면 현저한 역가의 항-아밀로이드 항체를 유발하며, 이는 인 비트로 및 인 비보 상에서 아밀로이드 섬유 및 플라크를 가용화할 수 있는 것으로 보고되었다 (Nicolau 등, 2002).
아밀로이드 플라크 및 섬유의 분해가 일어나는 가능한 메카니즘은 Bard 등 (2000)에 의해 최초로 제안되었는데, 그는 항체가 플라크를 옵소닌화 하고, 이어서 이것은 미세아교세포의 포식세포에 의해 실질적으로 파괴된다고 결론지었다. De Mattos 등, (2001)은 β-아밀로이드의 중앙 도메인에 대해 지향된 mAb가 혈장 아밀로이드에 결합하여 완전히 격리시킬 수 있음을 나타내었다. 이들은, 이들 mAb의 존재는 순환 내에서의 뇌와 혈장 간의 Aβ의 평형을 시프트(shift)시켜서, 뇌 내에서의 침착 대신 주변 제거(peripheral clearing) 및 이화작용(catabolism)을 촉진한다고 주장하였다.
설치류 항체로의 연장된 인간 치료는 투여 후 약 8-12일에 검출가능하고 약 20-30일에 피크(peak)에 도달하는 항글로불린(antiglobulin) 반응을 일으킬 수 있다. 그러한 항글로불린 반응이 나타나면(encountered), 상기 치료는 약 10일 이내에 중단되어야 하고 또한 이후의 재-치료는 이차 항글로불린 반응의 빠른 개시를 야기하기 때문에 일반적으로 배제된다. 설치류 항체가 인간 항체의 서열과 서열 보존의 상당한 양을 공유하지만, 설치류 항체와 인간 항체 사이에는 설치류 항체가 인간 내에서 면역원성이 되기에 충분한 많은 서열 상이성이 존재한다.
이 문제는 인간에서 직접적으로 항체를 생성하거나 또는 "인간화된"(달리 말하면 "재형상화된(reshaped)" 항체)의 생성에 의해 극복될 수 있다. 인간화된 항체는 인간 또는 인간-유사 프레임워크 서열 내에 산재된 설치류-유래된 CDR을 포함하는 가변 영역 아미노산 서열을 가진다. 상기 인간화된 항체의 특이성이 설치류-유래된 CDR에 의해 제공되기 때문에, 그들의 잔기는 실질적으로 변화없이 사용되어야 하고, 상기 항체의 그의 표적 항원에 대한 친화도 및 특이성을 실질적으로 방해하지 않는 중요치 않은 변형만이 허용된다. 프레임워크 잔기는 임의의 영장류로부터 또는, 특히, 임의의 인간 가변 영역으로부터 유래될 수 있고 또는 이의 조합일 수 있으며 또한 결과물인 설계된 가변 영역은 재형상화된 것으로 여겨질 것이다.
재형상화된 항체 내에 친화도가 유지될 가능성을 최대화하기 위해, 프레임워크 영역을 적절히 선택하는 것이 중요하다. 프레임워크 서열은 항원과의 상호작용을 위해 그들의 정확한 공간적 배향에서 CDR을 유지하고, 또한 프레임워크 잔기는 때때로 항원 결합에서조차 관여할 수 있음이 알려져 있다. 그의 항원에 대한 항체의 친화도를 유지하기 위해 설치류 프레임워크의 서열과 가장 유사한 인간 프레임워크 서열을 선택하는 것이 유리하다. 그 후 친화도의 상실을 피하기 위해 인간 프레임워크 서열 내의 하나 이상의 아미노산을 설치류 프레임워크 내의 대응 잔기로 교체하는 것이 더 필요할 수도 있다. 이 교체는 컴퓨터 모델링에 의해 도움받을 수 있다.
McGeer 등, 1994 Nicolau 등, 2002
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 모노머, 다이머, 트라이머 등, 결집형, 섬유형, 미세섬유(filament)형 또는 플라크의 응축형의 형태인 폴리머 형태로 항체에 대해 제시될 수 있는 β-아밀로이드 항원의 범위로부터의 특정 에피토프를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖는 고도로 특이적이고 또한 고도로 효과적인 항체, 특히 이의 절편을 포함하는 키메라 항체(chimeric antibody), 보다 특히 이의 절편을 포함하는 부분적으로 또는 완전히 인간화된 항체를 포함하는 신규한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은, 모노머, 다이머, 트라이머 등, 결집형, 섬유형, 미세섬유(filament)형 또는 플라크의 응축형의 형태인 폴리머 형태로 항체에 대해 제시될 수 있는 β-아밀로이드 항원의 범위로부터의 특정 에피토프를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖는 고도로 특이적이고 또한 고도로 효과적인 항체, 특히 이의 절편을 포함하는 키메라 항체(chimeric antibody), 보다 특히 이의 절편을 포함하는 부분적으로 또는 완전히 인간화된 항체를 포함하는 신규한 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명의 가르침에 의해 가능해진 항체는, 일부 지명하자면 알츠하이머병(AD), 루이 소체 치매, 다운증후군, 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈(네덜란드형); 괌 파킨슨-치매 복합증과 같은 신경계 장애; 뿐만 아니라 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증; 크로이츠펠트 야콥병, 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈(네덜란드형), 파킨슨병, HIV-관련 치매, 근육위축가쪽경화증(ALS), 성인 발병형 당뇨병; 노인성 심아밀로이드증; 내분비 종양, 및 황반 변성을 포함하는 그 밖의 질환과 같은 아밀로이드-유사 단백질에 기인하거나 또는 이와 관련된 다른 질환을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 속발성 아밀로이드증 및 연령-관련 아밀로이드증을 포함하는 아밀로이드 플라크 형성과 관련된 질환 및 장애 그룹인 아밀로이드증의 치료에 특히 유용하다.
도 1 (실시예 2): 키메라 항체의 마우스 경쇄 가변 영역의 발현 카세트
도 2 (실시예 2): 키메라 항체의 마우스 중쇄 가변 영역의 발현 카세트
도 3 (실시예 5.2): 마우스 중쇄 가변 영역과 가장 가까운 쥐 생식 계열 서열의 비교
도 4 (실시예 8): 정제된 인간화된 C2 항체의 활성
도 5 (실시예 9): 일과성 트랜스펙션(transient transfection)에 의해 생산되고 조합된 항체인 키메라 항체 C2ChVHAF/ChVK와 비교한, C2 키메라 중쇄와 병합된 C2 변형된 CDRL2 컨스트럭트의 일과성 발현에 의해 생산된 항체의 결합 활성
도 6 (실시예 11): 키메라 항체 AF 및 인간화된 항체 H4K1으로의 면역조직화학 결합 어세이의 결과
도 7 (실시예 12): 아밀로이드 섬유 상의 mC2의 작용성
도 8 (실시예 12): ELISA에서의 인간화된 C2의 결합 친화도
도 9 (실시예 14): 상이한 클래스(class)의 아밀로이드 단백질에 대한 mC2의 배좌 특이적 결합. 본 도면에 대한 설명에서 펠렛 준비물은 Aβ1 -42 섬유를 나타내고, 상청액 준비물은 아밀로이드 모노머를 나타낸다.
도 10: 쥐 서열 및 인간 수용체 서열 DPK15 및 JK1과 비교한 인간화된 C2 VK 서열
도 11: 쥐 서열 및 인간 수용체 서열 DP54 및 JH6과 비교한 인간화된 C2 VH 서열
도 12: 인간화된 C2 항체, C2HuVK1의 경쇄 가변 영역의 완전 DNA 및 단백질 서열
도 13: 인간화된 C2 항체의 경쇄 불변 영역 (인간 C 카파)의 완전 DNA 및 단백질 서열
도 14: 인간화된 C2 항체의 중쇄 불변 영역 (인간 IgG4 ser228-pro)의 완전 DNA 및 단백질 서열
도 15a-c (실시예 15): 에피토프 매핑 실험의 결과
도 16 (실시예 13): 결집 어세이 실험의 결과
도 17 (실시예 13): 해체 어세이 실험의 결과
도 18: (실시예 16): 인간화된 항체 C2로의 신경보호 실험의 결과
일 구체예에서, 본 발명은 β-아밀로이드 단백질 상의 적어도 한 개의 독특한 결합 사이트, 특히 적어도 두 개의 독특한 결합 사이트, 또한 보다 특히 적어도 세 개의 독특한 결합 사이트를 인식하고 또한 이에 결합하는, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편에 관한 것이고 여기서 상기 하나, 상기 적어도 두 개 및 상기 적어도 세 개의 결합 사이트 각각은 상기 항체의 결합에 주로 관여하는 적어도 한 개의 또는 적어도 두 개의 연속적인 아미노산 잔기를 포함한다.
특히, 본 발명의 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편은 β-아밀로이드 단백질 상의 적어도 두 개의, 특히 적어도 세 개의 독특한 결합 사이트에 결합하고 여기서 상기 적어도 세 개 중 두 개의 독특한 결합 사이트는 상기 항체의 결합에 주로 관여하는 적어도 두 개의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하고 또한 상기 적어도 세 개 중 하나의 독특한 결합 사이트는 적어도 한 개의 아미노산 잔기를 포함한다.
상기 항체의 결합에 주로 관여하는 적어도 두 개의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 적어도 두 개의 독특한 결합 사이트는 항원 상에 상호 근접하게 위치되고, 항체 결합에 관여하지 않거나 또는 상기 적어도 두 개의 연속적인 아미노산 잔기에 비해 상당히 더 적은 정도로 관여하는 적어도 한 개의 아미노산 잔기에 의해 분리되고 및/또는 플랭크되고, 따라서 배좌적 불연속 에피토프를 형성한다.
상기 항체의 결합에 주로 관여하는, 적어도 두 개의 연속적인 아미노산 잔기 및 적어도 한 개의 아미노산 잔기를 각각 포함하는 적어도 세 개의 독특한 결합 사이트는 에피토프 상에 상호 근접하게 위치되고, 항체 결합에 관여하지 않거나 또는 항체의 결합에 주로 관여하는 아미노산 잔기에 비해 상당히 더 적은 정도로 관여하는 적어도 한 개의 아미노산 잔기에 의해 분리되고 또한/또는 플랭크되고, 따라서 배좌적 불연속 에피토프를 형성한다.
특히, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 이는 β-아밀로이드 단백질 상의 적어도 한 개의 독특한 결합 사이트, 특히 적어도 두 개의 독특한 결합 사이트, 보다 특히 적어도 세 개의 독특한 결합 사이트를 인식하고 또한 이에 결합하며 여기서 상기 적어도 한 개의 또는 상기 적어도 두 개의 독특한 결합 사이트는 항체의 결합에 주로 관여하는 적어도 두 개의 연속적인 아미노산 잔기를 각각 포함하고, 여기서 상기 제1 결합 사이트를 나타내는 적어도 두 개의 연속적인 아미노산 잔기는 하기의 코어(core) 서열(서열 식별 번호: 9) 내에 끼워진 -Phe-Phe-이다:
Figure pat00001
여기서
Xaa3은 Ala, Val, Leu, 노르류신(norleucine), Met, Phe, 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
Xaa4는 Ala, Val, Leu, Ser 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
Xaa5는 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고,
Xaa6은 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이며,
여기서 상기 아미노산 잔기 Xaa3, Xaa4, Xaa5 및 Xaa6은 항체 결합에 관여하지 않거나 또는 상기 -Phe-Phe- 결합 사이트에 비해 상당히 더 적은 정도로 관여한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 여기서
Xaa3은 Val 또는 Leu, 특히 Val이며;
Xaa4는 Ala 또는 Val, 특히 Ala이며;
Xaa5는 Glu 또는 Asp, 특히 Glu이고;
Xaa6는 Glu 또는 Asp, 특히 Asp이다.
특히, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 이는 β-아밀로이드 단백질 상의 적어도 한 개의 독특한 결합 사이트, 특히 적어도 두 개의 독특한 결합 사이트, 보다 특히 적어도 세 개의 독특한 결합 사이트를 인식하고 또한 이에 결합하며 여기서 상기 독특한 결합 사이트는 항체의 결합에 주로 관여하는 적어도 한 개 및 적어도 두 개의 연속적인 아미노산 잔기를 각각 포함하고, 여기서 상기 제1 결합 사이트를 나타내는 적어도 두 개의 연속적인 아미노산 잔기는 하기의 코어 서열 내에 끼워진 -Phe-Phe-이고 또한 적어도 한 개의 아미노산 잔기는 하기의 코어 서열 내에 끼워진 -His-이다:
Figure pat00002
여기서
Xaa1은 His, Asn, Gln, Lys 및 Arg으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고
Xaa3은 Asn 및 Gln으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이며
Xaa4는 His, Asn, Gln, Lys 및 Arg으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고
Xaa5는 Ala, Val, Leu, Ser 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
Xaa6은 Ala, Val, Leu, 노르류신, Met, Phe, 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고
Xaa7은 Ala, Val, Leu 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이며
Xaa8은 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고,
Xaa9는 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이며, 또한 여기서 상기 아미노산 잔기 Xaa1, Xaa3, Xaa6, Xaa7, Xaa8 및 Xaa9는 항체 결합에 관여하지 않거나 또는 상기 -His- 및 -Phe-Phe- 결합 사이트 각각에 비교하여 상당히 더 적은 정도로 관여한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 여기서
Xaa3은 Gln 또는 Asn, 특히 Gln이며;
Xaa4는 Lys이고
Xaa5는 Leu이며
Xaa6는 Val 또는 Leu, 특히 Val이고;
Xaa7는 Ala 또는 Val, 특히 Ala이며;
Xaa8는 Glu 또는 Asp, 특히 Glu이고; 또한
Xaa9는 Asp 또는 Glu, 특히 Asp이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 이는 β-아밀로이드 단백질 상의 적어도 한 개의 독특한 결합 사이트, 특히 적어도 두 개의 독특한 결합 사이트, 보다 특히 적어도 세 개의 독특한 결합 사이트를 인식하고 또한 이에 결합하며, 여기서 상기 적어도 한 개 또는 적어도 두 개의 독특한 결합 사이트는 각각 항체의 결합에 주로 관여하는 적어도 두 개의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하고, 여기서 제2 결합 사이트를 나타내는 적어도 두 개의 연속적인 아미노산 잔기는 하기의 코어 서열(서열 식별 번호: 10) 내에 끼워진 -Lys-Leu-이다:
Figure pat00003
여기서
Xaa1은 His, Asn, Gln, Lys, 및 Arg으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
Xaa2는 Asn 및 Gln으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
Xaa3은 Ala, Val, Leu, 노르류신, Met, Phe, 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산이고; 또한 여기서 상기 아미노산 잔기 Xaa2, Xaa3은 항체 결합에 관여하지 않거나 또는 상기 -Lys-Leu- 결합 사이트에 비교하여 상당히 더 적은 정도로 관여한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 이는 β-아밀로이드 단백질 상의 적어도 한 개의 독특한 결합 사이트, 특히 적어도 두 개의 독특한 결합 사이트, 보다 특히 적어도 세 개의 독특한 결합 사이트를 인식하고 또한 이에 결합하고, 여기서 상기 독특한 결합 사이트는 상기 항체의 결합에 주로 관여하는 적어도 한 개 및 적어도 두 개의 연속적인 아미노산 잔기를 각각 포함하며, 여기서 항체의 결합에 관여하지 않거나 또는 상기 항체의 결합에 주로 관여하는 아미노산 잔기에 비해 상당히 더 적은 정도로 관여하는 적어도 한 개의 아미노산 잔기에 의해 분리되는 적어도 한 개 및 적어도 두 개의 연속적인 아미노산은, 각각, 하기의 코어 서열 내에 끼워진 -His- 및 -Lys-Leu-이다:
Figure pat00004
여기서
Xaa2는 Asn 및 Gln으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
Xaa3은 Ala, Val, Leu, 노르류신, Met, Phe, 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
Xaa4는 Ala, Val, Leu, 노르류신, Met, Phe, 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
Xaa5는 Ala, Val, Leu, 노르류신, Met, Phe, 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
Xaa6은 Ala, Val, Leu, Ser 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
Xaa7은 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이며,
Xaa8은 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고
또한 여기서 상기 아미노산 잔기 Xaa2, Xaa3, Xaa6, Xaa7, Xaa8은 항체 결합에 관여하지 않거나 또는 상기 -His- 및 -Lys-Leu- 결합 사이트 각각에 비교하여 상당히 더 적은 정도로 관여한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 여기서
Xaa2는 Gln 또는 Asn, 특히 Gln이며;
Xaa3은 Val 또는 Leu, 특히 Val이고;
Xaa4는 Phe이고
Xaa5는 Phe이며
Xaa6은 Ala 또는 Val, 특히 Ala이고;
Xaa7은 Glu 또는 Asp, 특히 Glu이고; 또한
Xaa8은 Asp 또는 Glu, 특히 Asp이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 이는 β-아밀로이드 단백질 상의 적어도 두 개의 독특한 결합 사이트를 인식하고 또한 이에 결합하고 여기서 상기 적어도 두 개의 독특한 결합 사이트는 상기 항체의 결합에 주로 관여하는 적어도 두 개의 연속적인 아미노산 잔기를 각각 포함하며, 여기서 상기 적어도 두 개의 연속적인 아미노산은 항체 결합에 관여하지 않거나 또는 상기 연속적인 아미노산 잔기에 비해 상당히 더 적은 정도로 관여하는 적어도 한 개의 아미노산 잔기에 의해 분리되고, 이는 하기의 코어 서열 내에 끼워진 제1 및 제2 결합 사이트를 각각 나타내는 -Phe-Phe- 및 -Lys-Leu-이다:
Figure pat00005
여기서
Xaa1은 His, Asn, Gln, Lys, 및 Arg으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
Xaa2는 Asn 및 Gln으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
Xaa3은 Ala, Val, Leu, 노르류신, Met, Phe, 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
Xaa4는 Ala, Val, Leu, Ser 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
Xaa5는 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고,
Xaa6은 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이며 또한 여기서 상기 아미노산 잔기 Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5 및 Xaa6은 항체 결합에 관여하지 않거나 또는 -Lys-Leu- 및 -Phe-Phe- 결합 사이트 각각에 비교하여 상당히 더 적은 정도로 관여한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 이는 β-아밀로이드 단백질 상의 적어도 한 개의 독특한 결합 사이트, 특히 적어도 두 개의 독특한 결합 사이트, 보다 특히 적어도 세 개의 독특한 결합 사이트를 인식하고 또한 이에 결합하며 여기서 상기 독특한 결합 사이트는 상기 항체의 결합에 주로 관여하는 적어도 한 개 및 적어도 두 개의 연속적인 아미노산 잔기를 각각 포함하고, 여기서 적어도 한 개 및 적어도 두 개의 연속적인 아미노산은 항체 결합에 관여하지 않거나 또는 상기 항체의 결합에 주로 관여하는 아미노산 잔기에 비해 상당히 더 적은 정도로 관여하는 적어도 한 개의 아미노산 잔기에 의해 분리되고, 또한 여기서 상기 아미노산 잔기는 각각 하기의 코어 서열 내에 끼워진 -His- 및 -Phe-Phe- 및 -Lys-Leu-이다:
Figure pat00006
여기서
Xaa2는 Asn 및 Gln으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
Xaa3은 Ala, Val, Leu, 노르류신, Met, Phe, 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
Xaa4는 Ala, Val, Leu, Ser 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
Xaa5는 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이며,
Xaa6은 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고, 또한 여기서 상기 아미노산 잔기 Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6은 항체 결합에 관여하지 않거나 또는 -His-, -Lys-Leu- 및 -Phe-Phe- 결합 사이트 각각에 비교하여 상당히 더 적은 정도로 관여한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 여기서
Xaa2는 Gln 또는 Asn, 특히 Gln이며;
Xaa3은 Val 또는 Leu, 특히 Val이고;
Xaa4는 Ala 또는 Val, 특히 Ala이며;
Xaa5는 Glu 또는 Asp, 특히 Glu이고; 또한
Xaa6은 Asp 또는 Glu, 특히 Asp이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 이는 β-아밀로이드 단백질 상의 적어도 두 개의 독특한 결합 사이트를 인식하고 또한 이에 결합하며 여기서 상기 적어도 두 개의 독특한 결합 사이트는 상기 항체의 결합에 주로 관여하는 적어도 두 개의 연속적인 아미노산 잔기를 각각 포함하고, 여기서 상기 적어도 두 개의 연속적인 아미노산은 항체 결합에 관여하지 않거나 또는 상기 연속적인 아미노산 잔기에 비해 상당히 더 적은 정도로 관여하는 적어도 한 개의 아미노산 잔기에 의해 분리되고, 이는 각각 하기의 코어 서열 내에 끼워진 제1 및 제2 결합 사이트를 나타내는 -Phe-Phe- 및 -Lys-Leu-이다:
Figure pat00007
여기서
Xaa1은 His, Asn, Gln, Lys 및 Arg으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
Xaa2는 Asn 및 Gln으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
Xaa3은 Val, Ala, Leu, Met, Phe, 노르류신 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
Xaa4는 Ala, Val, Leu 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
Xaa5는 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고,
Xaa6은 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이며, 또한 여기서 상기 아미노산 잔기 Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6은 항체 결합에 관여하지 않거나 또는 -Lys-Leu- 및 -Phe-Phe 결합 사이트 각각에 비교하여 상당히 더 적은 정도로 관여한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 여기서
Xaa1은 His 또는 Arg, 특히 His이며;
Xaa2는 Gln 또는 Asn, 특히 Gln이고;
Xaa3은 Val 또는 Leu, 특히 Val이며;
Xaa4는 Ala 또는 Val, 특히 Ala이고;
Xaa5는 Glu 또는 Asp, 특히 Glu이며; 또한
Xaa6은 Asp 또는 Glu, 특히 Asp이다.
본 발명의 일 구체예에서, β-아밀로이드 단백질 상의 적어도 두 개의 독특한 결합 사이트를 인식하고 또한 이에 결합하는, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 여기서 상기 적어도 두 개의 독특한 결합 사이트는 상기 항체의 결합에 주로 관여하는 적어도 두 개의 연속적인 아미노산 잔기를 각각 포함하며, 이는 - Phe - Phe - Ala - Glu -, 특히 - Phe - Phe - Ala -, 특히 - Phe - Phe - 및 - Lys - Leu - 각각이고, 또한 여기서 상기 적어도 두 개의 독특한 결합 사이트는 각각 서열 식별 번호: 7에 나타낸 아미노산 서열 - Val - Phe - Phe - Ala - Glu - Asp - 및 서열 식별 번호: 8에 나타낸 아미노산 서열 His - Gln - Lys - Leu - Val -을 나타낸다.
본 발명의 일 구체예에서, β-아밀로이드 단백질 상의 적어도 한 개의 독특한 결합 사이트, 특히 적어도 두 개의 독특한 결합 사이트, 보다 특히 적어도 세 개의 독특한 결합 사이트를 인식하고 또한 이에 결합하는, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 여기서 상기 적어도 한 개 또는 상기 적어도 두 개의 독특한 결합 사이트는 상기 항체의 결합에 주로 관여하는 적어도 한 개 및 적어도 두 개의 연속적인 아미노산 잔기를 각각 포함하며, 이는 - Phe - Phe- 및 - Lys - Leu -, 및 -His- 각각이고, 여기서 상기 독특한 결합 사이트는 아미노산 서열 - Val - Phe - Phe - Ala - Glu-, 및 아미노산 서열 - His - Gln - Lys - Leu - Val - 각각으로 끼워넣어진다.
본 발명의 다른 구체예에서, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편은 β-아밀로이드 단백질 상의 적어도 두 개의 독특한 결합 사이트를 인식하고 또한 이에 결합하는 항원 인식 및 결합 사이트를 포함하고 여기서 상기 둘 이상의 독특한 결합 사이트는 각각, 서열 식별 번호: 7 및 8로 각각 주어진 아미노산 서열 내에 적어도 두 개의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하고, 여기서 상기 연속적인 아미노산 잔기, 특히 -Phe-Phe- 및 -Lys-Leu-는 β-아밀로이드 단백질의 결합에 주로 관여한다.
본 발명의 추가의 특정 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 이는 β-아밀로이드 단백질 상의 4 독특한 결합 사이트에 결합하고 여기서 상기 4 독특한 결합 사이트는 하나의 아미노산 잔기를 각각 포함하는 2 결합 사이트 및 두 개의 연속적인 아미노산 잔기를 각각 포함하는 2 결합 사이트를 포함하며, 상기 잔기는 상기 항체의 결합에 주로 관여하고, 여기서 상기 4 독특한 결합 사이트는 β-아밀로이드 단백질 상에 상호 근접하게 위치되고, 또한 여기서 상기 4 결합 사이트는 항체 결합에 관여하지 않거나 또는 결합에 관여하지만 상기 4 독특한 결합 사이트의 상기 두 개의 연속적인 아미노산 잔기 및 상기 하나의 아미노산 잔기에 비해 상당히 더 적은 정도로 관여하는 적어도 한 개의 아미노산 잔기에 의해 분리되고, 따라서 배좌적 불연속 에피토프를 형성한다.
특히, 하기의 코어 서열 내에 끼워진 상기 항체의 결합에 주로 관여하는 상기 두 개의 연속적인 아미노산 잔기의 첫번째는 -Lys-Leu-이고, 또한 상기 적어도 두 개의 연속적인 아미노산 잔기의 두번째는 -Phe-Phe-이며, 단일 아미노산 잔기의 첫번째는 -His-이고 또한 단일 아미노산 잔기의 두번째는 -Asp-이다:
Figure pat00008
여기서
Xaa1은 His, Asn, Gln, Lys 및 Arg으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 His이고;
Xaa2는 Asn 및 Gln으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Gln이고;
Xaa3은 Ala, Val, Leu, 노르류신, Met, Phe, 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Val이고;
Xaa4는 Ala, Val, Leu, Ser 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Ala이고;
Xaa5는 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Glu이고;
Xaa6은 Ala, Val, Leu, 노르류신, Met, Phe, 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Val이고; 또한 여기서 상기 아미노산 잔기 Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6은 항체 결합에 관여하지 않거나 또는 -His-, - Asp-, -Lys-Leu, 및 -Phe-Phe- 결합 사이트에 비교하여 상당히 더 적은 정도로 관여한다.
일 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 절편에 관한 것으로, 이는 β-아밀로이드 단백질 상의 4 독특한 결합 사이트에 결합하고, 여기서 상기 4 독특한 결합 사이트는 각각 하나의 아미노산 잔기를 포함하는 2 결합 사이트 및 각각 두 개의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 2 결합 사이트를 포함하며, 여기서 하기의 코어 서열 내에 끼워진, 상기 항체의 결합에 주로 관여하는 상기 두 개의 연속적인 아미노산 잔기 중 첫번째는 -Lys-Leu-이고, 또한 적어도 두 개의 연속적인 아미노산 잔기 중 두번째는 -Phe-Phe-이며, 상기 단일 아미노산 잔기 중 첫번째는 -His-이고 또한 상기 단일 아미노산 잔기 중 두번째는 -Asp-이다:
Figure pat00009
여기서
Xaa1은 His, Asn, Gln, Lys 및 Arg으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 His이고;
Xaa2는 Asn 및 Gln으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Gln이고;
Xaa3은 Ala, Val, Leu, 노르류신, Met, Phe, 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Val이고;
Xaa4는 Ala, Val, Leu, Ser 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Ala이고;
Xaa5는 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Glu이고;
Xaa6은 Ala, Val, Leu, 노르류신, Met, Phe, 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Val이고; 또한 여기서 상기 아미노산 잔기 Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6은 항체 결합에 관여하지 않거나 또는 -His-, - Asp-, -Lys-Leu, 및 -Phe-Phe- 결합 사이트에 비교하여 상당히 더 적은 정도로 관여한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 본원에서 전술된 바와 같은 배좌적 불연속 에피토프를 형성하는 인식 및 결합 사이트는 아미노산 잔기 12 내지 24 사이, 특히 잔기 14 내지 23 사이, 보다 특히 아미노산 잔기 14 내지 20 사이의 β-아밀로이드 단백질의 영역 내에 위치되고, 여기서 적어도 2 개의 아미노산 잔기를 포함하는 적어도 두 개의 독특한 인식 및 결합 사이트 각각은 위치 16 및 17 및 위치 19 및 20에 각각 위치되고, 또한 여기서 적어도 1개의 아미노산 잔기를 포함하는 적어도 한 개의 독특한 인식 및 결합 사이트는 위치 14에 위치되고, 상기 잔기는 β-아밀로이드 단백질의 결합에 주로 관여하며 또한 여기서 상기 독특한 인식 및 결합 사이트는 적어도 일측 상에서 아미노산 잔기, 특히 잔기 21 및 22에 의해 플랭크되고, 또한 위치 15 및 18에 위치된 하나의 아미노산 잔기에 의해 분리되고, 상기 아미노산 잔기는 항원의 결합에 직접적으로 관여하지 않거나 또는, 적어도, 실질적으로 더 적은 정도로 관여한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 적어도 세 개의 독특한 인식 및 결합 사이트는 아미노산 잔기, 특히 잔기 12 및 13, 및 잔기 21 및 22에 의해 양쪽 모두에 플랭크 되고 또한 위치 15 및 18에 위치된 하나의 아미노산 잔기에 의해 분리되고, 상기 아미노산 잔기는 항원의 결합에 직접적으로 관여하지 않거나 또는, 적어도, 실질적으로 더 적은 정도로 관여한다.
특정 구체예에서, β-아밀로이드 단백질의 결합에 주로 관여하는 상기 연속적인 아미노산 잔기, 특히 위치 16 및 17의 -Lys-Leu- 및 위치 19 및 20의 -Phe- Phe-는 하기의 코어 영역 내에 끼워진다:
Figure pat00010
다른 특정 구체예에서, β-아밀로이드 단백질의 결합에 주로 관여하는 상기 아미노산 잔기, 특히 위치 16 및 17의 -Lys-Leu- 및 위치 19 및 20의 -Phe- Phe-, 및 위치 14의 -His-는 하기의 코어 영역 내에 끼워진다:
Figure pat00011
본 발명의 다른 구체예에서, 경쇄(light chain) 및 중쇄(heavy chain) 가변 영역(variable region) 각각 내에 하나 이상의 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내에 끼워진 비인간 기원의 적어도 한 개의 CDR, 특히 비인간 기원의 두 개의 CDR, 보다 특히 비인간 기원의 세 개의 CDR 및, 선택적으로, 인간 또는 영장류 근원 항체로부터 유래된 불변 영역을 포함하는 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 상기 인간화된 항체 또는 이의 절편은 β-아밀로이드 단백질, 특히 β-아밀로이드 모노머성 펩타이드, 보다 특히 β-아밀로이드 폴리머성 펩타이드, 보다 더 특히 β-아밀로이드 플라크의 일부로서 또는 단리된 β-아밀로이드 섬유, 원섬유 또는 미세섬유에, 이하의 아미노산 서열(서열 식별 번호: 11)을 포함하는 에피토프에서 특이적으로 인식하고 또한 결합할 수 있다:
Figure pat00012
여기서
Xaa1은 His, Asn, Gln으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 His이고;
Xaa2는 Asn 및 Gln으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Gln이며; 또한
Xaa3은 Val, Leu, 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Val이고;
Xaa4는 Ala 및 Val으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Ala이며;
Xaa5는 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Glu이고;
Xaa6은 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Asp이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서는, 경쇄 및 중쇄 가변 영역 각각 내에 하나 이상의 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내에 끼워진 비인간 기원의 적어도 한 개의 CDR, 특히 비인간 기원의 두 개의 CDR, 보다 특히 비인간 기원의 세 개의 CDR 및, 선택적으로, 인간 또는 영장류 근원 항체로부터 유래된 불변 영역을 포함하는 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 상기 인간화된 항체 또는 이의 절편은 β-아밀로이드 단백질, 특히 β-아밀로이드 모노머성 펩타이드, 보다 특히 β-아밀로이드 폴리머성 펩타이드, 보다 특히 β-아밀로이드 플라크의 일부로서의 또는 단리된 β-아밀로이드 섬유, 원섬유 또는 미세섬유에, 이하의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에서 인식하고 또한 결합할 수 있다:
Figure pat00013
여기서
Xaa2는 Asn 및 Gln으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Gln이고; 또한
Xaa3은 Val, Leu, 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Val이며;
Xaa4는 Ala 및 Val으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Ala이고;
Xaa5는 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Glu이며;
Xaa6은 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Glu이고; 또한 여기서 상기 아미노산 잔기 Xaa2, Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6은 항체 결합에 관여하지 않거나 또는 -His- 및 -Lys-Leu- 및 -Phe-Phe- 결합 사이트에 비교하여 더 적은 정도로 관여한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 비인간 기원의 CDR은 상기 독특한 결합 사이트를 함유하지 않는 항원 절편에 대해 생성된 도너(donor) 항체로부터, 특히 쥐(murine) 도너 항체로부터 수득된다. 상기 에피토프 영역 내의 이 시프트는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)와 같은 친수성 모이어티로 변형된, β-아밀로이드 펩타이드, 특히 β-아밀로이드 펩타이드 Aβ1 -16의 아미노산 서열에 대응하는 항원성 펩타이드를 포함하는 초분자 항원성 구조체의 사용에 의해 적어도 부분적으로 야기될 수 있고, 여기서 상기 친수성 모이어티는 면역화 공정에서 본원의 이하에서 기술된 바와 같이 예를 들어, 라이신, 글루타민산 및 시스테인 또는 상기 친수성 모이어티를 상기 펩타이드 절편에 커플링하기 위한 연결 장치로서 작용할 수 있는 임의의 다른 적합한 아미노산 또는 아미노산 유사체와 같은, 적어도 하나, 특히 1 또는 2개의 아미노산을 통해 상기 항원성 펩타이드의 각 말단에 공유 결합한다. PEG가 친수성 모이어티로 사용될 때, 자유 PEG 말단은, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 리포좀 이중층 내에 항원성 구조체를 파묻기(embed) 위해, 포스파티딜에탄올아민 또는 앵커링 요소로서 작용하기에 적합한 임의의 다른 화합물에 공유 결합한다.
특히, (부다페스트 조약의 규정 하에, 브라운슈바이그 38124, 마쉐로데르 베그 1 비, 브라운슈바이그(Braunschweig, Mascheroder Weg 1 B, 38124 Braunschweig) 소재 "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)"에 2005년 12월 1일 기탁된 접근 번호 DSM ACC2750 하의 (본 출원 전체에서 "mC2"로도 명명된) ACI-01-Ab7C2의 특질을 나타내는 비인간 기원의 CDR이 쥐 도너 항체로부터 수득된다.
본 발명의 일 구체예에서, 비인간 기원의 CDR은 (부다페스트 조약의 규정 하에, 브라운슈바이그 38124, 마쉐로데르 베그 1 비, 브라운슈바이그 소재 "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)"에 2005년 12월 1일 기탁된 접근 번호 DSM ACC2750 하의 (본 출원 전체에서 "mC2"로도 명명된) 쥐 도너 항체 ACI-01-Ab7C2로부터 수득된다.
또한 면역화 프로토콜의 일부로서 지질 A의 사용은 에피토프 영역 내에서의 시프트에 이바지할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은, 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내에 통합된(integrated), 중쇄 가변 영역(HCVR)의 CDR2를 나타내는 서열 식별 번호: 2 및 CDR3를 나타내는 서열 식별 번호: 3 및 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 4로 이루어지는 서열 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 펩타이드를 포함하는 인간화된 항체 또는 이의 절편에 관한 것이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 인간화된 항체 또는 이의 절편에 관한 것이고, 여기서 상기 인간화된 항체는, 인간- 또는 영장류-유래된 중쇄 프레임워크 영역 내에 통합된, 중쇄 가변 영역(HCVR)의 CDR2를 나타내는 서열 식별 번호: 2 및 CDR3을 나타내는 서열 식별 번호: 3으로 이루어지는 서열 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 인간화된 항체 또는 이의 절편에 관한 것이고, 여기서 상기 인간화된 항체는, 인간- 또는 영장류-유래된 중쇄 프레임워크 영역 내에 통합된, 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함한다.
특히, 본 발명은, 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내에 통합된, 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 펩타이드를 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)에 관한 것이다.
다른 특정 구체예에서, 본 발명은 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내에 통합된, 중쇄 가변 영역(HCVR)의 CDR2을 나타내는 서열 식별 번호: 2 및 CDR3을 나타내는 서열 식별 번호: 3으로 이루어지는 서열 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 인간화된 항체 또는 이의 절편에 관한 것이고, 이는 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내에 통합된 적어도 두 개의 펩타이드를 포함하며, 이 펩타이드는 상이하고 또한 중쇄 가변 영역(HCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 1, CDR2를 나타내는 서열 식별 번호: 2 및 CDR3을 나타내는 서열 식별 번호: 3 및 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 4, CDR2를 나타내는 서열 식별 번호: 5 및 CDR3을 나타내는 서열 식별 번호: 6으로 이루어지는 서열 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 나타내며 여기서 동일한 CDR은 상기 항체 내에 두 번 존재하지 않는다. 특히, 존재하는 적어도 두 개의 CDR이 모두 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR이라면, 상기 CDR 중 적어도 하나는 서열 식별 번호: 4로 나타내어지는 CDR1이어야 한다.
본 발명은 인간- 또는 영장류-유래된 중쇄 프레임워크 영역 내에 통합된, 중쇄 가변 영역(HCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 1, CDR2를 나타내는 서열 식별 번호: 2 및 CDR3을 나타내는 서열 식별 번호: 3으로 이루어지는 서열 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 적어도 두 개의 펩타이드를 포함하는 인간화된 항체 또는 이의 절편, 특히 상기 항체 내에 동일한 CDR이 두 번 존재하지 않는 인간화된 항체 또는 이의 절편 또한 포함한다.
특히, 본 발명은 인간- 또는 영장류-유래된 중쇄 프레임워크 영역 내에 통합된, 중쇄 가변 영역(HCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 1, CDR2를 나타내는 서열 식별 번호: 2 및 CDR3을 나타내는 서열 식별 번호: 3으로 이루어지는 서열 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 적어도 두 개의 펩타이드를 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)에 관한 것이다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 인간- 또는 영장류-유래된 경쇄 프레임워크 영역 내에 통합된, 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 4, CDR2를 나타내는 서열 식별 번호: 5 및 CDR3을 나타내는 서열 식별 번호: 6으로 이루어지는 서열 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 적어도 두 개의 펩타이드를 포함하는 인간화된 항체 또는 이의 절편에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 인간- 또는 영장류-유래된 경쇄 프레임워크 영역 내에 통합된, 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 4, CDR2를 나타내는 서열 식별 번호: 5 및 CDR3을 나타내는 서열 식별 번호: 6으로 이루어지는 서열 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 적어도 두 개의 펩타이드를 가지는 경쇄 가변 영역(LCVR)에 관한 것이고, 여기서 동일한 CDR은 상기 항체 내에 두 번 존재할 수 없고 또한, 특히, 상기 CDR 중 하나 이상은 서열 식별 번호: 4로 나타내어지는 CDR1이어야 한다.
본 발명은 또한 인간- 또는 영장류-유래된 중쇄 프레임워크 영역 내에 통합된, 중쇄 가변 영역(HCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 1, CDR2를 나타내는 서열 식별 번호: 2 및 CDR3을 나타내는 서열 식별 번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는, 특히 상기에 표시된 순서로 포함하는 인간화된 항체 또는 이의 절편에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 인간- 또는 영장류-유래된 중쇄 프레임워크 영역 내에 통합된, 중쇄 가변 영역(HCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 1, CDR2를 나타내는 서열 식별 번호: 2 및 CDR3을 나타내는 서열 식별 번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는, 특히 상기에 표시된 순서로 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)에 관한 것이다.
또한 본 발명은 인간- 또는 영장류-유래된 경쇄 프레임워크 영역 내에 통합된, 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 4, CDR2를 나타내는 서열 식별 번호: 5 및 CDR3을 나타내는 서열 식별 번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를, 특히 상기에 표시된 순서로 포함하는 인간화된 항체 또는 이의 절편을 포함한다.
특히, 본 발명은 인간- 또는 영장류-유래된 경쇄 프레임워크 영역 내에 통합된, 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 4, CDR2를 나타내는 서열 식별 번호: 5 및 CDR3을 나타내는 서열 식별 번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를, 특히 상기에 표시된 순서로 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내에 통합된, 중쇄 가변 영역(HCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 1, CDR2를 나타내는 서열 식별 번호: 2 및 CDR3을 나타내는 서열 식별 번호: 3 및 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 4, CDR2를 나타내는 서열 식별 번호: 5 및 CDR3을 나타내는 서열 식별 번호: 6으로 이루어지는 서열 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 적어도 세 개의 펩타이드를 포함하는 인간화된 항체 또는 이의 절편, 특히 상기 항체 내에 동일한 CDR이 두번 존재하지 않는 인간화된 항체 또는 이의 절편에 관한 것이다.
다른 구체예에서 본 발명은 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내에 통합된, 중쇄 가변 영역(HCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 1, CDR2를 나타내는 서열 식별 번호: 2 및 CDR3을 나타내는 서열 식별 번호: 3 및 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 4, CDR2를 나타내는 서열 식별 번호: 5 및 CDR3을 나타내는 서열 식별 번호: 6으로 이루어지는 서열 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 적어도 네 개의 펩타이드를 포함하는 인간화된 항체 또는 이의 절편, 특히 상기 항체 내에 동일한 CDR이 두번 존재하지 않는 인간화된 항체 또는 이의 절편에 관한 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내에 통합된, 중쇄 가변 영역(HCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 1, CDR2를 나타내는 서열 식별 번호: 2 및 CDR3을 나타내는 서열 식별 번호: 3 및 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 4, CDR2를 나타내는 서열 식별 번호: 5 및 CDR3을 나타내는 서열 식별 번호: 6으로 이루어지는 서열 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 적어도 다섯 개의 펩타이드를 포함하는 인간화된 항체 또는 이의 절편, 특히 상기 항체 내에 동일한 CDR이 두번 존재하지 않는 인간화된 항체 또는 이의 절편에 관한 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내에 통합된, 중쇄 가변 영역(HCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 1, CDR2를 나타내는 서열 식별 번호: 2 및 CDR3을 나타내는 서열 식별 번호: 3 및 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 4, CDR2를 나타내는 서열 식별 번호: 5 및 CDR3을 나타내는 서열 식별 번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 인간화된 항체 또는 이의 절편에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 인간화된 항체, 중쇄 가변 영역 (HCVR), 또는, 이의 절편에 관한 것으로, 여기서 상기 인간화된 항체, 중쇄 가변 영역 (HCVR) 또는 이의 절편은 인간- 또는 영장류-유래된 중쇄 프레임워크 영역 내에 통합된, 중쇄 가변 영역(HCVR)의 CDR2를 나타내는 서열 식별 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 펩타이드를 포함한다.
다른 특정 구체예에서, 본 발명은 인간화된 항체, 중쇄 가변 영역 (HCVR) 또는 이의 절편에 관한 것으로, 여기서 상기 인간화된 항체, 중쇄 가변 영역 (HCVR) 또는 이의 절편은 인간- 또는 영장류-유래된 중쇄 프레임워크 영역 내에 통합된, 중쇄 가변 영역(HCVR)의 CDR3를 나타내는 서열 식별 번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 펩타이드를 포함한다.
다른 특정 구체예에서, 본 발명은 인간화된 항체, 중쇄 가변 영역 (HCVR) 또는 이의 절편에 관한 것으로, 상기 항체, 중쇄 가변 영역 (HCVR), 또는 이의 절편은 인간- 또는 영장류-유래된 중쇄 프레임워크 영역 내에 통합된, 중쇄 가변 영역(HCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 1 및 CDR2를 나타내는 서열 식별 번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 적어도 두 개의 펩타이드를 포함한다.
다른 특정 구체예에서, 본 발명은 인간화된 항체, 중쇄 가변 영역 (HCVR) 또는 이의 절편에 관한 것으로, 상기 항체, 중쇄 가변 영역 (HCVR) 또는 이의 절편은 인간- 또는 영장류-유래된 중쇄 프레임워크 영역 내에 통합된, 중쇄 가변 영역(HCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 1 및 CDR3을 나타내는 서열 식별 번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 적어도 두 개의 펩타이드를 포함한다.
다른 특정 구체예에서, 본 발명은 인간화된 항체, 중쇄 가변 영역 (HCVR) 또는 이의 절편에 관한 것으로, 상기 항체, 중쇄 가변 영역 (HCVR) 또는 이의 절편은 인간- 또는 영장류-유래된 중쇄 프레임워크 영역 내에 통합된, 중쇄 가변 영역(HCVR)의 CDR2를 나타내는 서열 식별 번호: 2 및 CDR3을 나타내는 서열 식별 번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 적어도 두 개의 펩타이드를 포함한다.
다른 특정 구체예에서, 본 발명은 인간화된 항체, 경쇄 가변 영역 (LCVR) 또는 이의 절편에 관한 것으로, 상기 항체, 경쇄 가변 영역 (LCVR) 또는 이의 절편은 인간- 또는 영장류-유래된 중쇄 프레임워크 영역 내에 통합된, 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 4 및 CDR2를 나타내는 서열 식별 번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 적어도 두 개의 펩타이드를 포함한다.
다른 특정 구체예에서, 본 발명은 인간화된 항체, 경쇄 가변 영역 (LCVR) 또는 이의 절편에 관한 것으로, 상기 항체, 경쇄 가변 영역 (LCVR) 또는 이의 절편은 인간- 또는 영장류-유래된 중쇄 프레임워크 영역 내에 통합된, 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR1을 나타내는 서열 식별 번호: 4 및 CDR3을 나타내는 서열 식별 번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 적어도 두 개의 펩타이드를 포함한다.
본 발명은 또한 인간화된 항체 또는 이의 절편을 포함하고, 여기서 마우스 C2 항체의 중쇄 가변 영역(HCVR) 및 경쇄 가변 영역(LCVR) 모두는 상기 인간화된 항체의 그의 CDR 영역의 적어도 하나 내지 CDR 영역의 적어도 둘에 각각 기여한다.
따라서 결과적인 인간화된 항체 또는 이의 절편은
- 적어도 CDRl (LCVR)을 나타내는 서열 식별 번호: 4의 아미노산 서열과 조합된 CDRl (HCVR)을 나타내는 서열 식별 번호: 1의 아미노산 서열;
- 적어도 CDRl (LCVR)을 나타내는 서열 식별 번호: 4의 아미노산 서열과 조합된 CDR2 (HCVR)을 나타내는 서열 식별 번호: 2의 아미노산 서열;
- 적어도 CDRl (LCVR)을 나타내는 서열 식별 번호: 4의 아미노산 서열과 조합된 CDR3 (HCVR)을 나타내는 서열 식별 번호: 3의 아미노산 서열;
- 적어도 CDR2 (LCVR)를 나타내는 서열 식별 번호: 5의 아미노산 서열과 조합된 CDRl (HCVR)을 나타내는 서열 식별 번호: 1의 아미노산 서열;
- 적어도 CDR2 (LCVR)를 나타내는 서열 식별 번호: 5의 아미노산 서열과 조합된 CDR2 (HCVR)을 나타내는 서열 식별 번호: 2의 아미노산 서열;
- 적어도 CDR3 (LCVR)을 나타내는 서열 식별 번호: 6의 아미노산 서열과 조합된 CDR2 (HCVR)를 나타내는 서열 식별 번호: 2의 아미노산 서열;
- 적어도 CDR3 (LCVR)을 나타내는 서열 식별 번호: 6의 아미노산 서열과 조합된 CDR1 (HCVR)를 나타내는 서열 식별 번호: 1의 아미노산 서열;
- 적어도 CDR2 (LCVR)를 나타내는 서열 식별 번호: 5의 아미노산 서열과 조합된 CDR3 (HCVR)을 나타내는 서열 식별 번호: 3의 아미노산 서열;
- 적어도 CDR3 (LCVR)를 나타내는 서열 식별 번호: 6의 아미노산 서열과 조합된 CDR3 (HCVR)를 나타내는 서열 식별 번호: 3의 아미노산 서열
을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본원에서 전술된 바와 같은 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편에 관한 것이고, 상기 항체는 인간 또는 영장류 기원의 경쇄 및/또는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편에 관한 것이고, 여기서 서열 식별 번호: 1-6에 주어진 바와 같은 경쇄 및/또는 중쇄 CDR 영역의 아미노산 대표의 하나 이상, 특히 하나 이상 5 이하, 보다 특히 하나 이상 4 이하, 보다 더 특히 하나 이상 3 이하, 특히 하나 이상 2 이하는 상기 항체가 그의 완전한 작용성(full functionality)을 유지하는 보존적 치환을 통해 바뀐다.
특히, 본 발명은 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편에 관한 것이고, 여기서 서열 식별 번호: 5로 주어진 바와 같은 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR2에서 Kabat 위치 50의 Lys는 Arg, Gln 및 Glu로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Arg으로 교체된다.
특히, 본 발명은 경쇄 가변 영역(LCVR)에 관한 것이고 여기서 서열 식별 번호: 5로 주어진 바와 같은 CDR2에서 Kabat 위치 50의 Lys는 Arg, Gln 및 Glu로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Arg으로 교체된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편에 관한 것이고, 여기서 서열 식별 번호: 5로 주어진 바와 같은 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR2에서 Kabat 위치 53의 Ser은 Asn 또는 Thr로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Asn으로 교체된다.
특히, 본 발명은 경쇄 가변 영역(LCVR)에 관한 것이고 여기서 서열 식별 번호: 5로 주어진 바와 같은 CDR2에서 Kabat 위치 53의 Ser은 Asn 또는 Thr로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Asn으로 교체된다.
본 발명의 일 구체예에서, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 여기서 중쇄 가변 영역(HCVR)은 서열 식별 번호: 15 및 16으로 주어진 각각의 서열과 90%, 특히 95%, 보다 특히 98% 동일한 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 다른 구체예에서, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 여기서 경쇄 가변 영역(LCVR)은 서열 식별 번호: 12 및 13으로 주어진 각각의 서열과 90%, 특히 95%, 보다 특히 98% 동일한 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 여기서 중쇄 가변 영역(HCVR)의 CDR 영역의 적어도 둘, 특히 셋은 서열 식별 번호: 1-3으로 주어진 바와 같은 대응 CDR 영역과 90%, 특히 95%, 보다 특히 98% 동일한 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 여기서 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR 영역의 적어도 둘, 특히 셋은 서열 식별 번호: 4-6으로 주어진 바와 같은 대응 CDR 영역과 90%, 특히 95%, 보다 특히 98% 동일한 아미노산 서열을 가진다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본원에서 전술한 바와 같은 본 발명의 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편에 관한 것이고 여기서 중쇄 가변 영역(HCVR)은 서열 식별 번호: 15 및 16 각각으로 주어진 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본원에서 전술한 바와 같은 본 발명의 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편에 관한 것이고 여기서 경쇄 가변 영역(LCVR)은 서열 식별 번호: 12 및 13 각각으로 주어진 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본원에서 전술한 바와 같은 본 발명의 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편에 관한 것이고, 여기서 중쇄 가변 영역(HCVR)의 CDR 영역의 적어도 하나, 특히 적어도 둘, 특히 셋은 서열 식별 번호: 1 - 3에 주어진 바와 같은 대응 CDR 영역에 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본원에서 전술한 바와 같은 본 발명의 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편에 관한 것이고, 여기서 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR 영역의 적어도 하나, 특히 적어도 둘, 특히 셋은 서열 식별 번호: 4 - 6에 주어진 바와 같은 대응 CDR 영역에 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본원에서 전술한 바와 같은 본 발명의 인간화된 항체에 관한 것이고, 여기서 인간 생식계열(germline) VH 및 VK 서열 각각으로부터 수득된 수용체 프레임워크 서열의 하나 이상의 아미노산 대표는 쥐 항체 ACI-01-Ab7C2의 대응 영역으로부터의 아미노산으로의 치환 또는 이의 보존적 치환을 통해 바뀐다.
특히, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 이 중쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체 각각에 관한 것이고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역의 KABAT 서브그룹 VHIII의 인간 생식계열 VH 서열로부터 수득된 수용체 프레임워크 서열 내 Kabat 위치 47의 Trp는 Leu, 노르류신, Ile, Val, Met, Ala, 및 Phe, 특히 Leu 및 Ile로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산, 특히 서열 식별 번호: 15에 나타낸 바와 같이 Leu으로 교체된다.
또한 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 이 중쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체 각각에 관한 것이고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역의 KABAT 서브그룹 VHIII의 인간 생식계열 VH 서열로부터 수득된 수용체 프레임워크 서열 내 Kabat 위치 94의 Arg은 Ser 및 Thr으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산, 특히 서열 식별 번호: 15에 나타낸 바와 같이 Ser으로 교체된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 이 중쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체 각각에 관한 것이고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역의 KABAT 서브그룹 VHIII의 인간 생식계열 VH 서열로부터 수득된 수용체 프레임워크 서열 내 Kabat 위치 47의 Trp는 Leu, 노르류신, Ile, Val, Met, Ala, 및 Phe, 특히 Leu 및 Ile로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산, 특히 Leu으로 교체되고 또한 Kabat 위치 94의 Arg은 Ser 및 Thr으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산, 특히 서열 식별 번호: 15에 나타낸 바와 같이 Ser으로 교체된다.
본 발명은 또한 경쇄 가변 영역 및 이 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체 각각에 관한 것이고, 여기서 상기 경쇄 가변 영역의 KABAT 서브그룹 VKII의 인간 생식계열 VK 서열로부터 수득된 수용체 프레임워크 서열 내 Kabat 위치 45의 Gln은 Lys, Arg, Gln, 및 Asn, 특히 Lys 및 Arg으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산, 특히 Lys으로 교체된다.
본 발명은 또한 경쇄 가변 영역 및 이 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체 각각에 관한 것이고, 여기서 상기 경쇄 가변 영역의 KABAT 서브그룹 VKII의 인간 생식계열 VK 서열로부터 수득된 수용체 프레임워크 서열 내 Kabat 위치 87의 Tyr은 Phe, Leu, Val, Ile, 및 Ala, 특히 Leu 및 Phe으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산, 특히 Phe으로 교체된다.
본 발명은 또한 경쇄 가변 영역 및 이 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체 각각에 관한 것이고, 여기서 마우스 단일클론성 항체, 특히 쥐 항체 ACI-01-Ab7C2로부터 수득된, 서열 식별 번호: 12에 나타낸 바와 같은 CDR2 영역 내 Kabat 위치 50의 Lys는 Arg, Gln, His, 및 Asn으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산, 특히 Arg으로 교체된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 경쇄 가변 영역 및 이 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체 각각에 관한 것이고, 여기서 마우스 단일클론성 항체, 특히 쥐 항체 ACI-01-Ab7C2로부터 수득된, 서열 식별 번호: 12에 나타낸 바와 같은 CDR2 영역 내 Kabat 위치 53의 Asn은 Ala, Val, Leu, Ser 및 Ile로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산, 특히 Ser으로 교체된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 인간화된 항체에 관한 것이고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역의 KABAT 서브그룹 VHIII의 인간 생식계열 VH 서열로부터 수득된 수용체 프레임워크 서열 내 Kabat 위치 47의 Trp는 Leu, 노르류신, Ile, Val, Met, Ala, 및 Phe, 특히 Leu 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산, 특히 Leu으로 교체되고 또한 상기 중쇄 가변 영역의 KABAT 서브그룹 VHIII의 인간 생식계열 VH 서열로부터 수득된 수용체 프레임워크 서열 내 Kabat 위치 94의 Arg은 Ser 및 Thr으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산, 특히 서열 식별 번호: 15에 나타낸 바와 같이 Ser으로 교체되고, 또한 상기 경쇄 가변 영역의 KABAT 서브그룹 VKII의 인간 생식계열 VK 서열로부터 수득된 수용체 프레임워크 서열 내 Kabat 위치 87의 Tyr은 Phe, Leu, Val, Ile, 및 Ala, 특히 Leu 및 Phe으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산, 특히 Phe으로 교체된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 이 중쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체 각각에 관한 것이고, 여기서 서열 식별 번호: 15에 나타낸 바와 같은 상기 중쇄 가변 영역의 KABAT 서브그룹 VHIII의 인간 생식계열 VH 서열로부터 수득된 수용체 프레임워크 서열 내 Kabat 위치 47의 Trp는 Leu으로 교체된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 이 중쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체 각각에 관한 것이고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역의 KABAT 서브그룹 VHIII의 인간 생식계열 VH 서열로부터 수득된 수용체 프레임워크 서열 내 Kabat 위치 94의 Arg은 서열 식별 번호: 15에 나타낸 바와 같이 Ser으로 교체된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 이 중쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체 각각에 관한 것이고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역의 KABAT 서브그룹 VHIII의 인간 생식계열 VH 서열로부터 수득된 수용체 프레임워크 서열 내 Kabat 위치 47의 Trp는 Leu 및 Ile, 특히 Leu으로 교체되고 또한 상기 중쇄 가변 영역의 KABAT 서브그룹 VHIII의 인간 생식계열 VH 서열로부터 수득된 수용체 프레임워크 서열 내 Kabat 위치 94의 Arg은 서열 식별 번호: 15에 나타낸 바와 같이 Ser으로 교체된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 경쇄 가변 영역 및 이 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체 각각에 관한 것이고, 여기서 상기 경쇄 가변 영역의 KABAT 서브그룹 VKII의 인간 생식계열 VK 서열로부터 수득된 수용체 프레임워크 서열 내 Kabat 위치 87의 Tyr은 Phe으로 교체된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 이 중쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체 각각에 관한 것이고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역의 KABAT 서브그룹 VHIII의 인간 생식계열 VH 서열로부터 수득된 수용체 프레임워크 서열 내 Kabat 위치 47의 Trp는 Leu 및 Ile, 특히 Leu으로 교체되고 또한 중쇄 가변 영역의 KABAT 서브그룹 VHIII의 인간 생식계열 VH 서열로부터 수득된 수용체 프레임워크 서열 내 Kabat 위치 94의 Arg는 서열 식별 번호: 15에 나타낸 바와 같이 Ser으로 교체되고 또한 경쇄 가변 영역의 KABAT 서브그룹 VKII의 인간 생식계열 VK 서열로부터 수득된 수용체 프레임워크 서열 내 Kabat 위치 87의 Tyr은 Phe으로 교체된다.
일 구체예에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 이 중쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체 각각에 관한 것이고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역의 KABAT 서브그룹 VHIII의 인간 생식계열 VH 서열로부터 수득된 수용체 프레임워크 서열 내 Kabat 위치 47의 Trp는 Leu, 노르류신, Ile, Val, Met, Ala, 및 Phe, 특히 Leu 및 Ile로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산, 특히 Leu로 교체되고 또한 Kabat 위치 94의 Arg는 Ser 및 Thr으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산, 특히 서열 식별 번호: 15에 나타낸 바와 같이 Ser으로 교체되고 또한 여기서 마우스 단일클론성 항체, 특히 쥐 항체 ACI-O1-Ab7C2로부터 수득된 CDR2 영역 내 Kabat 위치 50의 Lys은 Arg, Gln, His 및 Asn으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산, 특히 Arg으로 교체된다.
일 구체예에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 이 중쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체 각각에 관한 것이고, 여기서 상기 중쇄 가변 영역의 KABAT 서브그룹 VHIII의 인간 생식계열 VH 서열로부터 수득된 수용체 프레임워크 서열 내 Kabat 위치 47의 Trp는 Leu, 노르류신, Ile, Val, Met, Ala, 및 Phe, 특히 Leu 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산, 특히 Leu로 교체되고 또한 Kabat 위치 94의 Arg는 Ser 및 Thr으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산, 특히 서열 식별 번호: 15에 나타낸 바와 같이 Ser으로 교체되고 또한 여기서 마우스 단일클론성 항체, 특히 쥐 항체 ACI-O1-Ab7C2로부터 수득된 CDR2 영역 내 Kabat 위치 53의 Asn은 Ala, Val, Leu, Ser 및 Ile로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산, 특히 Ser으로 교체된다.
특정 구체예에서, 본 발명은 서열 식별 번호: 12의 경쇄 가변 영역에 관한 것이다.
본 발명의 다른 특정 구체예에서, 인간화된 항체가 제공되고, 이는 서열 식별 번호: 12의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 서열 식별 번호: 13에 나타낸 바와 같은 신호 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역에 관한 것이다.
본 발명의 다른 특정 구체예에서, 인간화된 항체가 제공되고, 이는 서열 식별 번호: 13에 나타낸 바와 같은 신호 서열을 포함하는 완전 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 다른 특정 구체예에서, 인간화된 항체가 제공되고, 이는 서열 식별 번호: 12의 경쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호: 14의 경쇄 불변 영역을 포함한다.
본 발명의 다른 특정 구체예에서, 인간화된 항체가 제공되고, 이는 서열 식별 번호: 13의 완전 경쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호: 14의 경쇄 불변 영역을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 서열 식별 번호: 15의 중쇄 가변 영역에 관한 것이다.
본 발명의 다른 특정 구체예에서, 인간화된 항체가 제공되고, 이는 서열 식별 번호: 15의 중쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 서열 식별 번호: 16에 나타낸 바와 같은 신호 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 관한 것이다.
본 발명의 다른 특정 구체예에서, 인간화된 항체가 제공되고, 이는 서열 식별 번호: 16에 나타낸 바와 같은 신호 서열을 포함하는 완전 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 다른 특정 구체예에서, 인간화된 항체가 제공되고, 이는 서열 식별 번호: 15의 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호: 17의 중쇄 불변 영역을 포함한다.
본 발명의 다른 특정 구체예에서, 인간화된 항체가 제공되고, 이는 서열 식별 번호: 16의 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호: 17의 중쇄 불변 영역을 포함한다.
일 구체예에서 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 인간화된 항체는 30 이상, 특히 35 이상, 보다 특히 38 이상, 보다 더 특히 40 이상의 아미노산 잔기를 갖는 Aβ 모노머성 펩타이드 및/또는 복수의 상기 Aβ 모노머 단위를 포함하는 Aβ 폴리머성 가용성 아밀로이드 펩타이드, 특히 Aβ1 -42 모노머성 및/또는 복수의 상기 Aβ1-42 모노머 단위를 포함하는 Aβ 폴리머성 가용성 아밀로이드 펩타이드와, 특히 항체 대 Aβ1-42의 몰농도비가 1:1000 이하, 특히 1:500 이하, 보다 특히 1:300 이하, 보다 더 특히 1:200 이하, 특히 1:10 내지 1:100의 몰농도비에서 공동-인큐베이션(co-incubation)하면 상기 Aβ 모노머가 고분자 폴리머성 원섬유(high molecular polymeric fibril)로 결집하는 것을 억제한다.
특히, 아밀로이드 모노머성 및/또는 폴리머성 가용성 아밀로이드 펩타이드와 본 발명의 항체의 공동-인큐베이션은 28℃ 내지 40℃, 특히 32℃ 내지 38℃, 보다 특히 37℃ 온도에서 24시간 내지 60시간 동안, 특히 30시간 내지 50시간 동안, 보다 특히 48시간 동안, 특히 24시간 동안 수행된다.
본 발명의 특정 구체예에서, 아밀로이드 모노머성 및/또는 폴리머성 가용성 아밀로이드 펩타이드와의 공동-인큐베이션은 37℃의 온도에서 24시간 동안 이루어진다.
특히, 작용적으로 균등한 모든 항체 또는 이의 작용부(functional part)를 포함하는 본 발명의 항체, 특히 인간화된 항체는 Aβ1 -42 모노머성 펩타이드 및/또는 복수의 상기 Aβ1 -42 모노머성 단위를 포함하는 Aβ 폴리머성 가용성 아밀로이드 펩타이드에 결합하고 또한 Aβ1 -42 모노머성 펩타이드 및/또는 복수의 상기 Aβ1 -42 모노머성 단위를 포함하는 Aβ 폴리머성 가용성 아밀로이드 펩타이드와 공동-인큐베이션하면, 상기 Aβ 모노머 및/또는 폴리머가 고분자 폴리머성 원섬유로 결집되는 것을 억제한다.
일 구체예에서, 작용적으로 균등한 모든 항체 또는 이의 작용부를 포함하는 항체, 특히 본 발명의 인간화된 항체는 Aβ 모노머 및/또는 복수의 상기 Aβ 모노머 단위를 포함하는 Aβ 가용성 폴리머의 고분자 폴리머성 원섬유로의 결집을, 항체 대 Aβ1-42의 몰농도비 1:1000 이하에서, 특히 몰농도비 1:10 내지 1:100에서, 특히 몰농도비 1:10에서, 완충액(대조군) 내에서 인큐베이트된 각각의 아밀로이드 펩타이드 모노머에 비하여 적어도 50%, 특히 적어도 60%, 특히 적어도 65%, 보다 특히 적어도 75%, 보다 더 특히 적어도 80%, 특히 적어도 85%-90% 이상 억제한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 작용적으로 균등한 모든 항체 또는 이의 작용부를 포함하는 항체, 특히 본 발명의 인간화된 항체는 Aβ 모노머 및/또는 복수의 상기 Aβ 모노머 단위를 포함하는 Aβ 가용성 폴리머의 고분자 폴리머성 원섬유로의 결집을, 항체 대 Aβ1-42의 몰농도비 1:100에서 적어도 30% 억제한다.
본 발명의 다른 특정 구체예에서, 작용적으로 균등한 모든 항체 또는 이의 작용부를 포함하는 항체, 특히 본 발명의 인간화된 항체는 Aβ 모노머 및/또는 복수의 상기 Aβ 모노머 단위를 포함하는 Aβ 가용성 폴리머의 고분자 폴리머성 원섬유로의 결집을, 항체 대 Aβ1-42의 몰농도비 1:10에서 적어도 80% 억제한다.
아밀로이드 형성 모노머성 및/또는 폴리머성 펩타이드, 특히 아밀로이드 형태 (1-42)에 대한 본원에서 기술된 바와 같은 본 발명의 항체의 결합은 모노머성 및/또는 폴리머성 아밀로이드 형성 펩타이드의 고분자 원섬유 또는 미세섬유로의 결집을 억제시킨다. 아밀로이드 형성 모노머성 및/또는 폴리머성 펩타이드의 결집의 억제를 통해 본 발명의 항체는 아밀로이드 플라크, 특히 이차 배좌의 변화에 의해 불용성이 되고 또한 질환에 걸린 동물 또는 인간의 뇌 내의 아밀로이드 플라크의 대부분이 되는 것으로 알려진 아밀로이드 형태 (1-42)의 형성을 방지하거나 감속시킬 수 있다.
본 발명의 항체의 결집 억제 잠재성은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법, 특히 농도-구배 초원심분리에 따르는 미리형성된 구배 상에서의 SDS-PAGE 침강 분석 및/또는 티오플라빈 T(Th-T) 형광 어세이에 의해 측정될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 항체, 특히 작용적으로 균등한 모든 항체 또는 이의 작용부를 포함하는 본원에 기술된 바와 같은 인간화된 항체에 관한 것이고, 상기 항체는, 30개 이상, 특히 35개 이상, 보다 특히 38개 이상, 보다 더 특히 40개 이상의 아미노산 잔기를 갖는 Aβ 모노머성 펩타이드, 특히 Aβ1 -42 모노머성 펩타이드의 결집에 의해 형성된, 미리형성된 고분자 폴리머성 아밀로이드 원섬유 또는 미세섬유와, 특히 몰농도비 1:5 내지 1:1000로, 특히 1:10 내지 1:500로, 보다 특히 1:10 내지 1:300로, 보다 더 특히 1:10 내지 1:100의 비율로 공동-인큐베이션하면, 상기 미리형성된 폴리머성 원섬유 또는 미세섬유를 적어도 20%, 특히 적어도 30%, 보다 특히 적어도 35%, 보다 더 특히 적어도 40%, 특히 적어도 50% 이상 해체시킬 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 상기 항체의 결집 억제 및 해체 잠재성 각각은 농도-구배 초원심분리에 따르는 미리형성된 구배 상에서의 SDS-PAGE 침강 분석에 의해 측정된다.
본 발명의 다른 특정 구체예에서, 상기 항체의 결집 억제 및 해체 잠재성은 티오플라빈 T(Th-T) 형광 어세이에 의해 각각 측정된다.
다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 아밀로이드 미리형성된 고분자 폴리머성 아밀로이드 원섬유 또는 미세섬유와 28℃ 내지 40℃, 특히 32℃ 내지 38℃, 보다 특히 37℃의 온도에서 12시간 내지 36시간, 특히 18시간 내지 30시간, 보다 특히 24시간 동안 공동-인큐베이션된다.
특히, 미리형성된 고분자 폴리머성 아밀로이드 원섬유 또는 미세섬유와의 공동-인큐베이션은 37℃의 온도에서 24시간 동안 수행된다.
본 발명의 특정 구체예에서, 작용적으로 균등한 모든 항체 또는 이의 작용부를 포함하는 항체, 특히 본 발명의 인간화된 항체는 미리형성된 폴리머성 원섬유 또는 미세섬유를 항체 대 Aβl-42의 몰농도비 1:100에서 적어도 24% 해체시킬 수 있다.
본 발명의 다른 특정 구체예에서, 작용적으로 균등한 모든 항체 또는 이의 작용부를 포함하는 항체, 특히 본 발명의 인간화된 항체는 미리형성된 폴리머성 원섬유 또는 미세섬유를 항체 대 Aβl-42의 몰농도비 1:10에서 적어도 32% 해체시킬 수 있다.
본 발명의 항체는, 아밀로이드 형성 폴리머성 원섬유 또는 미세섬유의 해체를 통해 아밀로이드 플라크의 형성을 예방 또는 감속시킬 수 있으며, 이는 상기 질환과 관련된 증상을 완화시키고, 그의 진행을 지연 또는 되돌린다.
따라서, 본 발명의 추가 구체예는 본원에서 기재된 바와 같은 작용적으로 균등한 모든 항체 또는 이의 작용부를 포함하는 항체, 특히 인간화된 항체를 제공하고, 상기 항체는, 뇌 내 Aβ의 농도를 증가시키는 질환 또는 병태에 걸린 동물, 특히 포유류, 특히 인간의 뇌 내 Aβ의 총량을 감소시킬 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 본원에서 전술된 바와 같은 본 발명의 인간화된 항체에 관한 것으로, 특히 고도의 배좌적 민감도와 짝지어져서, 결집 억제 특성뿐만 아니라 해체 특성 모두를 나타내는 점에서 이중-효과성(bi-effective)이다.
특히, 본 발명은 본원에서 전술된 바와 같은 본 발명의 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편에 관한 것으로, 상기 항체는 아밀로이드 모노머성 및/또는 폴리머성 가용성 아밀로이드 펩타이드, 특히 예를 들어, Aβ 모노머성 펩타이드 1-39; 1-40, 1-41 또는 1-42와 같은 β-아밀로이드 모노머성 펩타이드, 및/또는 복수의 상기 Aβ 모노머 단위를 포함하는 폴리머성 가용성 β-아밀로이드 펩타이드, 특히 Aβ1 -42 모노머성 및/또는 복수의 상기 Aβ1 -42 모노머 단위를 포함하는 Aβ 폴리머성 가용성 아밀로이드 펩타이드와 공동-인큐베이션하면, Aβ 모노머의 고분자 폴리머성 원섬유 또는 미세섬유로의 결집을 억제하고 또한, 추가로, 아밀로이드 모노머성 펩타이드, 특히 예를 들어, Aβ 모노머성 펩타이드 1-39; 1-40, 1-41 또는 1-42와 같은 β-아밀로이드 모노머성 펩타이드와, 특히 Aβ1 -42 모노머성 펩타이드의 결집에 의해 형성된 미리형성된 고분자 폴리머성 아밀로이드 원섬유 또는 미세섬유와 공동-인큐베이션하면, 상기 미리형성된 원섬유 또는 미세섬유를 해체시킬 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 본원에서 전술된 바와 같은 본 발명의 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편에 관한 것으로, 상기 항체는 β-시트 배좌의 α-나선 및/또는 랜덤 코일 배좌, 특히 랜덤 코일 배좌, 보다 특히 분자 내 주어진 위치에서, 특히 Aβ 단백질의 Tyr 10 및 Val 12의 환경에서 랜덤 코일 배좌로의 전이를 유도할 수 있고, 이는 상기 β-시트 배좌를 손실시켜 랜덤 코일 배좌를 증가시키고 또한 상기 미리형성된 고분자 폴리머성 아밀로이드 원섬유 또는 미세섬유의 개선된 가용화를 이끈다. 특히 상기 β-시트 배좌의 감소는 완충액(대조군) 내에서 인큐베이트된 각각의 미리형성된 아밀로이드 폴리머성 원섬유 또는 미세섬유에 비교하여 적어도 30%, 특히 적어도 35%, 또한 보다 특히 적어도 40%에 달한다.
상기 항체의 이차 구조에서의 전이를 유도시키는 잠재성은 고체 13C NMR 분광학(solid state 13C NMR spectroscopy)에 의해, 특히 Aβ1 -42 펩타이드 내 Tyr 10 및 Val 12 Cβ의 배좌의 적분 강도(integral intensity)를 측정함으로써 측정된다.
본 발명의 추가의 구체예에서는, 적어도 하나의 경쇄 또는 이의 절편 또는 적어도 하나의 중쇄 또는 이의 절편을 포함하는 본원에서 전술한 바와 같은 본 발명의 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 여기서 상기 항체 또는 절편은 적어도 약 1 x 10-7 M 내지 적어도 약 1 x 10-12 M, 특히 적어도 약 1 x 10-8 M 내지 적어도 약 1 x 10-11 M, 보다 특히 적어도 약 1 x 10-9 M 내지 적어도 약 1 x 10-10 M, 보다 더 특히 적어도 약 1 x 10-8 M 내지 적어도 약 2 x 10-8 M 범위의 KD를 갖는 높은 결합 친화도로 Aβ 모노머에 결합하지만, 바람직하게는, 아밀로이드 전구체 단백질(APP)과 어떠한 유의한 교차반응성을 나타내지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서는, 적어도 하나의 경쇄 또는 이의 절편 또는 적어도 하나의 중쇄 또는 이의 절편을 포함하는 본원에서 전술한 바와 같은 본 발명의 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 여기서 상기 항체 또는 절편은 적어도 약 1 x 10-7 M 내지 적어도 약 1 x 10-12 M, 특히 적어도 약 1 x 10-8 M 내지 적어도 약 1 x 10-11 M, 보다 특히 적어도 약 1 x 10-9 M 내지 적어도 약 1 x 10-10 M, 보다 더 특히 적어도 약 2 x 10-9 M 내지 적어도 약 5 x 10-9 M 범위의 KD를 갖는 높은 결합 친화도로 Aβ 섬유, 원섬유 또는 미세섬유에 결합하지만, 바람직하게는, 아밀로이드 전구체 단백질(APP)과 어떠한 유의한 교차반응성을 나타내지 않는다.
다른 구체예에서, 본원에서 전술한 바와 같은 본 발명의 항체 또는 이의 절편은 Aβ 섬유, 원섬유 또는 미세섬유에 대해, Aβ 모노머에 대한 결합친화도보다 적어도 2배, 특히 적어도 4배, 특히 적어도 10배, 특히 적어도 15배, 보다 특히 적어도 20배, 특히 적어도 25배 더 높은 결합 친화도를 나타낸다.
또 다른 구체예에서, 본원에 전술된 바와 같은 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되며, 상기 항체는 포유류, 특히 인간 뇌 내에서, Aβ 플라크를 포함하는 결집된 Aβ에 실질적으로 결합하지만, 바람직하게는, 아밀로이드 전구체 단백질(APP)과 어떠한 유의한 교차반응성을 나타내지 않는다.
본 발명의 다른 양상에서, 본원에서 전술된 바와 같은 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되며, 상기 항체는 포유류, 특히 인간 뇌 내에서, Aβ 모노머를 포함하는 가용성 폴리머성 아밀로이드, 특히 아밀로이드 β(Aβ)에 실질적으로 결합하지만, 바람직하게는, 아밀로이드 전구체 단백질(APP)과 어떠한 유의한 교차반응성을 나타내지 않는다.
본원에서 전술된 바와 같은 본 발명의 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편이 추가로 제공되며, 상기 항체는 포유류, 특히 인간 뇌 내에서 Aβ 플라크 존재량을 실질적으로 감소시킨다. 이는 조직 및/또는 체액, 특히 뇌 내에서, 플라크에 대한 항체의 결합에 의해서나, 또는 배좌의 시프트의 유도에 의해 섬유를 가용성 폴리머 및 모노머 형태로 해체시킴으로써, 아밀로이드, 특히 아밀로이드 β(Aβ) 사이의 평형을 그의 불용성 및 결집된 상태에서 그의 가용성 형태로 시프트시키고, 또한 상기 해체된 및 가용화된 아밀로이드 형태, 특히 아밀로이드 β(Aβ) 형태에 결합 및 안정화에 의해 달성될 수 있다. 본 발명의 항체의 활성을 통해 조직 및/또는 체액, 특히 뇌 내에서 침착 대신 주변 제거 및 이화작용이 선호된다. 따라서 본 발명의 항체의 유익한 효과는 상기 항체의 플라크에의 결합없이 얻어질 수 있다.
이 안정화 활성을 통해, 본 발명의 항체는, 조직 및/또는 체액 내 폴리머성 및 덜 결집된 가용성 아밀로이드 단백질, 특히 아밀로이드 β(Aβ) 단백질의 독성 효과를 중화할 수 있다. 따라서 본 발명의 특정 구체예에서 본 발명의 항체는 뇌 내에서 결집된 아밀로이드 베타에 반드시 결합하지 않고 그의 유익한 효과를 달성할 수 있다.
본 발명의 추가적 양상에서는, 마우스 도너 항체로부터, 특히 2005년 12월 1일, 브라운슈바이그 38124, 마쉐로데르 베그 1 비, 브라운슈바이그 소재 "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)"에 기탁되어 접근 번호 DSM ACC2750을 부여받은 (본 출원 전체에서, "mC2"로 또한 인간화된 C2 항체에 대해서는 hC2로 명명된) 마우스 항체 ACI-01-Ab7C2로부터 수득된 적어도 하나, 특히 둘 또한, 특히 세 개의 CDR 영역을 삽입하는 적어도 하나의 경쇄 또는 이의 절편 또는 적어도 하나의 중쇄 또는 이의 절편을 포함하는 본원에서 전술된 바와 같은 본 발명의 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 여기서 상기 항체 또는 이의 절편은, Aβ 항원에 대해, 마우스 도너 항체의 친화도보다 적어도 5배, 특히 적어도 8배, 보다 특히 적어도 10배, 특히 적어도 15배 더 높은 친화도를 가진다.
일 구체예에서, 본 발명의 항체는 임의의 이소타입 및 서브타입(예컨대, IgM, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA1 및 IgA2)의 (예컨대, 두 전체 길이 경쇄 및 두 전체 길이 중쇄를 갖는) 전체(whole) 항체; 특히 IgG4 이소타입의 항체일 수 있고, 대신, 다른 구체예에서, 전체 항체의 항원-결합 절편(예컨대, Fab, F(ab')2, 및 Fv)일 수 있다.
따라서 본 발명은 또한 본원에서 기술된 항체의 항원-결합 절편에 관한 것이다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 절편은 Fab 면역글로불린 발현 라이브러리의 산물을 포함하는 Fab 절편, Fab' 절편, F(ab)2 절편, 및 FV 절편 및 상기에 언급된 모든 항체 및 절편의 에피토프-결합 절편으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 절편은 폴리에틸렌 글리콜에 컨쥬게이트된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체의 불변 영역은 변형되어, 변형되지 않은 항체에 비해 적어도 하나의 불변 영역-매개된 생물학적 이펙터 작용이 감소된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 절편은 변경된 이펙터 작용을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에서 전술된 바와 같은 본 발명의 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 각각 서열 식별 번호: 2 및 3으로 주어진 인접하는(contiguous) 아미노산 분자의 스트레치를 인코드하는 뉴클레오티드 서열, 또는 중쇄 가변 영역(HCVR)의 상보성 결정 영역(CDR) 2 및 3을 나타내는 상보적 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자에 관한 것이다.
보다 특히, 본 발명은 서열 식별 번호: 4로 주어진 바와 같은 인접하는 아미노산 분자의 스트레치를 인코드하는 뉴클레오티드 서열, 또는 경쇄 가변 영역(LCVR)의 상보성 결정 영역(CDR) 1을 나타내는 상보적 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구체예에서 서열 식별 번호: 18 및 서열 식별 번호: 19로 주어진 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 중쇄 가변 영역(HCVR)의 CDR 2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 인코드하는 상보적 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자가 제공된다.
본 발명의 다른 구체예에서 서열 식별 번호: 20으로 주어진 바와 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR 1의 뉴클레오티드 서열을 인코드하는 상보적 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자가 제공된다.
본 발명의 다른 구체예에서 서열 식별 번호: 21의 뉴클레오티드 서열, 또는 경쇄 가변 영역을 인코드하는 상보적 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자가 제공된다.
본 발명의 다른 구체예에서 서열 식별 번호: 22의 뉴클레오티드 서열, 또는 신호 서열을 포함하는 완전 경쇄 가변 영역을 인코드하는 상보적 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자가 제공된다.
본 발명의 다른 구체예에서 서열 식별 번호: 22의 경쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호: 23의 경쇄 불변 영역을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자가 제공된다. 본 발명은 또한 상기 뉴클레오티드 분자의 상보적 스트랜드를 포함한다.
본 발명의 다른 구체예에서 중쇄 가변 영역을 인코드하는 서열 식별 번호: 24의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자가 제공된다. 본 발명은 또한 상기 뉴클레오티드 분자의 상보적 스트랜드를 포함한다.
본 발명의 다른 구체예에서 신호 서열을 포함하는 완전 중쇄 가변 영역을 인코드하는 서열 식별 번호: 25의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자가 제공된다. 본 발명은 또한 상기 뉴클레오티드 분자의 상보적 스트랜드를 포함한다.
본 발명의 다른 구체예에서 서열 식별 번호: 25의 중쇄 가변 영역 및 서열 식별 번호: 26의 중쇄 불변 영역을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자가 제공된다. 본 발명은 또한 상기 뉴클레오티드 분자의 상보적 스트랜드를 포함한다.
본 발명은 또한 보다 큰 뉴클레오티드 분자의 일부로서의 또는 단리된, 본 발명의 상술된 항체-인코딩 뉴클레오티드 서열 중 하나, 특히 이의 상보적 스트랜드에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특히, 본 발명은 통상적인 혼성화 조건 하, 특히 엄격한 혼성화 조건 하에서 서열 식별 번호: 18-26 및 29-32로 주어진 뉴클레오티드 서열 중 어느 것에, 특히 이의 상보적 스트랜드에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구체예에서 본원에서 전술된 바와 같은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터가 제공된다.
본 발명의 다른 구체예에서 본원에서 전술된 바와 같은 본 발명의 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 세포가 제공된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 치료적 유효량의, 작용적으로 균등한 모든 항체 또는 이의 모든 유도체 또는 이의 작용부를 포함하는 본 발명의 항체, 특히 본원에서 전술된 바와 같은 본 발명의 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편을 포함하는 조성물, 특히 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물인 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 조성물은 치료적 유효량의 항체를 포함한다.
본 발명은, 치료적 유효량의, 작용적으로 균등한 모든 항체 또는 이의 유도체 또는 이의 작용부를 포함하는 항체, 특히 본 발명의 단일클론성 항체, 특히 본원에서 전술된 바와 같은 본 발명의 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편 및, 선택적으로, 추가적 생물학적 활성 물질 및/또는 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 혼합물을 추가로 포함한다.
특히, 본 발명은 혼합물에 관한 것이고, 여기서 상기 추가적 생물학적 활성 물질은 알츠하이머병에 관여하는 Aβ 단백질과 같은 아밀로이드-유사 단백질 또는 아밀로이드와 관련된 질환 또는 장애 그룹인 아밀로이드증의 투약(medication)에 사용되는 화합물이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 다른 생물학적 활성 물질 또는 화합물은 또한 아밀로이드 β 에 기인하는 아밀로이드증의 치료에 사용될 수 있거나 또는 다른 신경계 장애의 투약에 사용될 수 있는 치료제가 될 수 있다.
상기 다른 생물학적 활성 물질 또는 화합물은 본 발명의 항체와 동일한 또는 유사한 메카니즘에 의해 또는 언급되지 않은 작용 메카니즘에 의해 또는 언급된 및/또는 언급되지 않은 작용 메카니즘의 다양성(multiplicity)에 의해 그의 생물학적 효과를 발휘할 수 있다.
일반적으로, 상기 다른 생물학적 활성 화합물은 중성자-전달 증강제(neutron-transmission enhancer), 정신치료제(psychotherapeutic drug), 아세틸콜린 에스테라아제 억제제, 칼슘-채널 차단제(blocker), 생원성(biogenic) 아민, 벤조디아제핀 진정제(tranquillizer), 아세틸콜린 합성, 저장 또는 방출 증강제, 아세틸콜린 시냅스 후부의 수용체 작용제, 모노아민 옥시다아제-A 또는 -B 억제제, N-메틸-D-아스파르테이트 글루타메이트 수용체 길항제, 비스테로이드성 항염증제, 항산화제, 및 세로토닌 수용체(serotonergic receptor) 길항제를 포함할 수 있다.
보다 특히, 본 발명은 산화적 스트레스에 효과적인 화합물, 항-자가사멸 화합물, 금속 킬레이터(chelator), 피렌제핀(pirenzepin) 및 대사물과 같은 DNA 수복 억제제, 3-아미노-1-프로판술폰산(3APS), 1,3-프로판디술포네이트(1,3PDS), α-세크레타아제 활성제(α-secretase activator), β- 및 γ-세크레타아제 억제제, 타우 단백질(tau protein), 신경전달물질(neurotransmitter), β-시트 파괴제(sheet breaker), 아밀로이드 베타 제거(clearing)/고갈(depleting) 세포 성분에 대한 유인물질(attractant), 피로글루타메이트화(pyroglutamated) 아밀로이드 베타 3-42를 포함하는 N-말단 잘린 아밀로이드 베타의 억제제, 항-염증 분자, 또는 타크린(tacrine), 리바스티그민(rivastigmine), 도네페질(donepezil), 및/또는 갈란타민(galantamine)과 같은 콜린에스테라아제 억제제(ChEIs), M1 작용제 및 임의의 아밀로이드 또는 타우 변형 약물 및 영양 보조제, 및 영양 보조제를 포함하는 다른 약물로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 화합물과, 본 발명의 항체 및, 선택적으로, 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제를 함께 포함하는 혼합물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 화합물이 콜린에스테라아제 억제제(ChEI)인 혼합물, 특히 상기 화합물이 타크린, 리바스티그민, 도네페질, 갈란타민, 니아신 및 메만틴으로 이루어지는 그루브로부터 선택된 하나인 혼합물에 관한 것이다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 혼합물은 본 발명의 항체와 함께 니아신(niacin) 또는 메만틴(memantine) 및, 선택적으로, 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서 제공되는 혼합물은, 환각(hallucination), 망상(delusion), (두드러진 사고산란(marked incoherence), 탈선(derailment), 사고이탈(tangentiality)로 표시되는) 사고 장애(thought disorder), 및 기묘한 또는 혼란된 행동, 뿐만 아니라 무쾌감증(anhedonia), 정서둔마(flattened affect), 무감동(apathy), 및 사회적 위축(social withdrawal)을 포함하는 양성 및 음성 정신병 증상의 치료를 위해, 예를 들어, 클로자핀(clozapine), 지프라시돈(ziprasidone), 리스페리돈(risperidone), 아리피프라졸(aripiprazole) 또는 올란자핀(olanzapine)과 같은 "비전형적 항정신병약(atypical antipsychotics)"을, 항체, 본 발명의 단일클론성 항체, 특히 특히 본원에서 전술된 바와 같은 본 발명의 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편 및, 선택적으로, 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제와 함께 포함한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 본원에서 전술된 바와 같은 본 발명의 조성물 및 혼합물은 치료적 유효량의 상기 항체 및 생물학적 활성 물질을 각각 포함한다.
본 발명의 항원과 조합되어 혼합물에 적절하게 사용될 수 있는 다른 화합물은, 치료 약물 표적(36-39페이지), 알칸술폰산 및 알칸올황산(39-51페이지), 콜린에스테라아제 억제제(51-56페이지), NMDA 수용체 길항제(56-58페이지), 에스트로겐(58-59페이지), 비스테로이드성 항-염증제(60-61페이지), 항산화제(61-62페이지), 퍼옥시좀 증식체-활성화된 수용체(peroxisome proliferators-activated receptor; PPAR) 작용제(63-67페이지), 콜레스테롤-저하 작용제(68-75페이지); 아밀로이드 억제제(75-77페이지), 아밀로이드 형성 억제제(77-78페이지), 금속 킬레이터(78-79페이지), 항-정신병약 및 항-우울제(80-82페이지), 영양 보충제(83-89페이지) 및 뇌 내 생물학적 활성 물질의 유용성을 증가시키는 화합물(89-93페이지 참조) 및 전구약물(prodrug)(93 및 94페이지)을 포함하는, 본원에 참조로서 삽입된 문서인 WO 2004/058258 (특히 16 및 17페이지 참조)에 설명된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 치료적 유효량의 생물학적 활성 물질 및/또는 항체, 특히 본 발명의 단일클론성 항체, 특히 본원에 전술된 바와 같은 본 발명의 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편을 포함하는 혼합물에 관한 것이다.
본 발명은 알츠하이머병(AD), 루이 소체 치매, 다운증후군, 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈(네덜란드형); 괌 파킨슨-치매 복합증과 같은 신경계 장애; 뿐만 아니라 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증; 크로이츠펠트 야콥병, 파킨슨병, HIV-관련 치매, 근육위축가쪽경화증, 성인 발병형 당뇨병; 노인성 심아밀로이드증; 내분비 종양, 및 황반 변성을 포함하는 그 밖의 질환과 같은 아밀로이드-유사 단백질에 기인하거나 또는 이와 관련된 다른 질환을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 질환과 같은 속발성 아밀로이드증 및 연령-관련 아밀로이드증을 포함하는 아밀로이드 플라크 형성과 관련된 질환 및 장애 그룹인 아밀로이드증의 영향을 완화 또는 치료하기 위한 약제의 조제를 위한 항체, 특히 본 발명의 단일클론성 항체, 특히 본원에서 전술된 바와 같은 본 발명의 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편 및/또는 이의 작용부 및/또는 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물, 또는 혼합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 항체, 특히 본 발명의 단일클론성 항체, 특히 본 발명의 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편을 약제학적으로 허용가능한 형태로 제형화하는 것을 포함하고, 알츠하이머병(AD), 루이 소체 치매, 다운증후군, 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈(네덜란드형); 괌 파킨슨-치매 복합증과 같은 신경계 장애; 뿐만 아니라 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증; 크로이츠펠트 야콥병, 파킨슨병, HIV-관련 치매, 근육위축가쪽경화증, 성인 발병형 당뇨병; 노인성 심아밀로이드증; 내분비 종양, 및 황반 변성을 포함하는 그 밖의 질환과 같은 아밀로이드-유사 단백질에 기인하거나 또는 이와 관련된 다른 질환을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 질환과 같은 속발성 아밀로이드증 및 연령-관련 아밀로이드증을 포함하는 아밀로이드 플라크 형성과 관련된 질환 및 장애 그룹인 아밀로이드증의 영향을 예방, 치료 또는 완화시키는 방법에서의 사용을 위한, 항체, 특히 본 발명의 단일클론성 항체, 특히 본원에서 전술된 바와 같은 본 발명의 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편 및/또는 이의 작용부 및/또는 상기 항체 및/또는 이의 작용부를 포함하는 약제학적 조성물, 또는 혼합물, 특히 치료적 유효량의 항체, 특히 본 발명의 단일클론성 항체, 특히 본원에서 전술된 바와 같은 본 발명의 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편 및/또는 이의 작용부 및/또는 상기 항체 및/또는 이의 작용부를 포함하는 약제학적 조성물, 또는 혼합물의 조제 방법을 포함한다.
본 발명은, 치료적 유효량의 항체를 투여하는 것을 포함하고, 알츠하이머병(AD), 루이 소체 치매, 다운증후군, 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈(네덜란드형); 괌 파킨슨-치매 복합증과 같은 신경계 장애; 뿐만 아니라 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증; 크로이츠펠트 야콥병, 파킨슨병, HIV-관련 치매, 근육위축가쪽경화증, 성인 발병형 당뇨병; 노인성 심아밀로이드증; 내분비 종양, 및 황반 변성을 포함하는 그 밖의 질환과 같은 아밀로이드-유사 단백질에 기인하거나 또는 이와 관련된 다른 질환을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 질환과 같은 속발성 아밀로이드증 및 연령-관련 아밀로이드증을 포함하는 아밀로이드 플라크 형성과 관련된 질환 및 장애 그룹인 아밀로이드증의 영향을, 항체 및/또는 이의 작용부, 특히 인간화된 항체 및/또는 이의 작용부, 또는 상기 항체 및/또는 이의 작용부를 포함하는 조성물 또는 혼합물을 상기 장애에 걸린 동물 또는 인간에게 투여함에 의해 예방, 치료 또는 완화시키기 위한 방법을 추가로 포함한다.
동물, 특히 포유류 또는 인간에게, 항체, 특히 본원에 전술된 바와 같은 본 발명의 약제학적 조성물을 투여함에 의한, 알츠하이머병(AD)과 같은 신경계 장애를 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 속발성 아밀로이드증 및 연령-관련 아밀로이드증을 포함하는 아밀로이드 플라크 형성과 관련된 질환 및 장애 그룹인 아밀로이드증, 특히 인지 기억 능력의 상실을 특징으로 하는 질환 또는 병태의 치료 방법을 제공하는 것 또한 본 발명의 목적이다.
특정 구체예에서 본 발명은 동물, 특히 포유류 또는 인간에게 항체, 특히 본원에서 기술된 바와 같은 본 발명의 약제학적 조성물을 투여함으로써 기억 손상에 걸린 동물, 특히 포유류 또는 인간의 인지 기억 능력을 유지시키거나 또는 증가시키는, 특히, 인지 기억 능력을 회복시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 목적은, 본원에 전술된 바와 같은 본 발명의 항체를 사용하는, 알츠하이머병(AD)과 같은 신경계 장애를 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 속발성 아밀로이드증 및 연령-관련 아밀로이드증을 포함하는 아밀로이드 플라크 형성과 관련된 질환 및 장애 그룹인 아밀로이드증, 특히 인지 기억 능력의 상실을 특징으로 하는 질환 또는 병태의 치료 조성물 및 그러한 조성물을 생산하는 방법뿐만 아니라 치료를 위한 방법을 제공하는 것이다.
특히, 본 발명은 인지 기억 능력을 보유(retention)시키는, 인지 기억 능력의 상실을 특징으로 하는 아밀로이드-관련 병태에 걸린 동물, 특히 포유류 또는 인간의 치료에 관한 것이다.
본 발명은 또한
(a) 아밀로이드 단백질을 함유하는 것으로 추측되는 샘플 또는 특정 신체 부분 또는 신체 구역을 항체, 특히 본 발명의 단일클론성 항체, 특히 본원에서 전술된 바와 같은 본 발명의 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편, 및/또는 이의 작용부와 접촉시키는 단계로서, 상기 항체는 상기 아밀로이드 단백질의 에피토프에 결합하는 것인 단계;
(b) 상기 항체 및/또는 이의 작용부가 상기 아밀로이드 단백질에 결합하여 면역복합체를 형성하도록 하는 단계;
(c) 상기 면역복합체의 형성을 검출하는 단계; 및
(d) 상기 면역복합체의 존재 또는 부재를, 상기 샘플 또는 특정 신체 부분 또는 구역 내의 아밀로이드 단백질의 존재 또는 부재와 서로 관련시키는 단계
를 포함하는, 샘플 내 또는 인 시투(in situ) 아밀로이드 단백질의 에피토프에 대한 항체 또는 이의 활성 절편의 면역특이적 결합을 검출하는 것을 포함하는 환자에서 아밀로이드-관련 질환 또는 병태의 진단 방법에 관한 것이다.
(a) 조사 중인 조직 및/또는 체액의 샘플 표본을 수득하는 것;
(b) 항체, 특히 본 발명의 단일클론성 항체, 특히 본원에서 전술된 바와 같은 본 발명의 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편, 및/또는 이의 작용부로 아밀로이드 단백질의 존재에 대해 상기 샘플을 테스트하는 것;
(c) 상기 단백질에 결합된 항체의 양을 측정하는 것; 및
(d) 상기 조직 및/또는 체액 내의 플라크 존재량(burden)을 계산하는 것
을 포함하는 조직 및/또는 체액 내 아밀로이드 형성 플라크 존재량의 정도를 측정하는 방법도 포함한다.
특히, 본 발명은 조직 및/또는 체액 내 아밀로이드 형성 플라크 존재량의 정도를 측정하는 방법에 관한 것으로, 여기서 단계 c)의 면역복합체의 형성은 아밀로이드 단백질의 존재 또는 부재와 서로 관련되는 상기 면역복합체의 존재 또는 부재로 측정된다.
본 발명의 다른 구체예에서, 항체, 특히 본 발명의 단일클론성 항체, 특히 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편, 및/또는 이의 작용부를 포함하는 아밀로이드-관련 질환 및 병태의 검출 및 진단을 위한 테스트 키트가 제공된다.
특히, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 항체 및/또는 이의 작용부를 담는 용기(container), 및 아밀로이드 단백질에 대해 결합시켜 면역복합체를 형성하고 상기 면역복합체의 형성을 검출하여, 상기 면역복합체의 존재 또는 부재를 아밀로이드 단백질의 존재 또는 부재와 서로 관련시키는 것을 목적으로 하는 상기 항체의 사용을 위한 설명서를 포함하는 아밀로이드-관련 질환 및 병태의 검출 및 진단을 위한 테스트 키트에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은 서열 식별 번호: 27에 기술된 바와 같은 가변 영역, 또는 이의 변이체(variant)를 포함하는 항체를 제공한다. 일 구체예에서, 세포주는 상기 항체를 발현한다.
다른 양상에서, 본 발명은 서열 식별 번호: 29에 기술된 바와 같은 가변 영역, 또는 이의 변이체를 포함하는 항체 유전자를 제공한다. 일 구체예에서, 세포주는 상기 항체를 발현한다.
다른 양상에서, 본 발명은 hC2 항체를 미리형성된 베타-아밀로이드 섬유와 상호작용시키는 것을 포함하는 미리형성된 베타-아밀로이드 섬유를 해체시키는 방법을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 선행된 청구항 중 어느 하나에 따른 인간화된 항체 또는 이의 절편을 제공하고, 여기서 상기 항체 또는 이의 절편은 뉴런을 A베타-유도된 분해로부터 보호한다.
다른 양상에서, 본 발명은 뉴런에 본원 명세서의 인간화된 항체 또는 이의 절편의 유효량을 처리하는 것을 포함하는 A베타-유도된 뉴런 분해를 방지하는 방법을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 A베타 올리고머에 노출된 뉴런의 분해를 방지하기 위한 약제의 조제를 위한 본원 명세서에 따른 인간화된 항체 또는 이의 절편의 용도를 제공한다.
본 발명의 이들 및 다른 목적, 특성 및 이점은 이하에 개시된 구체예의 상세한 설명 및 첨부된 청구항의 검토 후 명백해질 것이다.
서열 식별 번호: 1 C2 HuVH AF 4 인간화된 중쇄 가변 영역 (CDRl)의 아미노산 서열
서열 식별 번호: 2 C2 HuVH AF 4 인간화된 중쇄 가변 영역 (CDR2)의 아미노산 서열
서열 식별 번호: 3 C2 HuVH AF 4 인간화된 중쇄 가변 영역 (CDR3)의 아미노산 서열
서열 식별 번호: 4 C2 HuVK 1 인간화된 경쇄 가변 영역 (CDR1)의 아미노산 서열
서열 식별 번호: 5 C2 HuVK 1 인간화된 경쇄 가변 영역 (CDR2)의 아미노산 서열
서열 식별 번호: 6 C2 HuVK 1 인간화된 경쇄 가변 영역 (CDR3)의 아미노산 서열
서열 식별 번호: 7 Aβ 에피토프 영역 2의 아미노산 서열
서열 식별 번호: 8 Aβ 에피토프 영역 1의 아미노산 서열
서열 식별 번호: 9 Aβ 에피토프 영역 2의 아미노산 서열 (변형)
서열 식별 번호: 10 Aβ 에피토프 영역 1의 아미노산 서열 (변형)
서열 식별 번호: 11 에피토프 영역의 아미노산 서열 (변형, 완전)
서열 식별 번호: 12 C2 HuVK 1 인간화된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열 식별 번호: 13 C2 인간화된 경쇄의 아미노산 서열
서열 식별 번호: 14 인간화된 C2 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열
서열 식별 번호: 15 C2 HuVH AF 4 인간화된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열 식별 번호: 16 C2 인간화된 중쇄의 아미노산 서열
서열 식별 번호: 17: IG 감마-4 사슬 C-영역의 아미노산 서열 - 변형
서열 식별 번호: 18: C2 HuVH AF 4 인간화된 중쇄 가변 영역의 CDR2의 뉴클레오티드 서열
서열 식별 번호: 19: C2 HuVH AF 4 인간화된 중쇄 가변 영역의 CDR3의 뉴클레오티드 서열
서열 식별 번호: 20: C2 HuVK 1 인간화된 경쇄 가변 영역의 CDR1의 뉴클레오티드 서열
서열 식별 번호: 21: C2 HuVK 1 인간화된 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열
서열 식별 번호: 22: C2 인간화된 경쇄의 뉴클레오티드 서열
서열 식별 번호: 23: C2 인간화된 경쇄 불변 영역의 뉴클레오티드 서열
서열 식별 번호: 24: C2 HuVH AF 4 인간화된 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열
서열 식별 번호: 25: C2 인간화된 중쇄의 뉴클레오티드 서열
서열 식별 번호: 26: C2 인간화된 중쇄 불변 영역의 뉴클레오티드 서열
서열 식별 번호: 27: 마우스 C2 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열 식별 번호: 28: 마우스 C2 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열 식별 번호: 29: 마우스 C2 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열
서열 식별 번호: 30: 마우스 C2 경쇄의 뉴클레오티드 서열
서열 식별 번호: 31: 마우스 C2 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열
서열 식별 번호: 32: 마우스 C2 중쇄의 뉴클레오티드 서열
정의
본원에서 사용된 용어 "폴리펩타이드", "펩타이드", 및 "단백질"은 교차사용할 수 있으며 또한 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산으로 구성된 생체분자를 의미하는 것으로 정의된다.
본원에서 사용된 용어 "a", "an" 및 "the"는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 정의되며, 문맥에 부적절하지 않으면 복수를 포함한다.
용어 "아밀로이드 또는 아밀로이드-유사 단백질에 기인하거나 또는 이와 관련된 질환 및 장애"는 모노머성, 원섬유, 또는 폴리머성 상태, 또는 상기 세 가지의 임의의 조합인 아밀로이드-유사 단백질의 존재 또는 활성에 기인하는 질환 및 장애를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 그러한 질환 및 장애는 아밀로이드증, 내분비 종양, 및 황반 변성을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "아밀로이드증"은 알츠하이머병(AD)과 같은 신경계 장애, 예를 들면, 경증 인지 손상(mild cognitive impairment, MCI), 루이 소체 치매, 다운증후군, 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈(네덜란드형); 괌 파킨슨-치매 복합증과 같은 인지 기억 능력의 상실을 특징으로 하는 질환 또는 병태; 뿐만 아니라 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증; 크로이츠펠트 야콥병, 파킨슨병, HIV-관련 치매, 근육위축가쪽경화증(ALS), 봉입체 근염(inclusion-body myositis, IBM), 성인발병형 당뇨병, 및 노인성 심아밀로이드증; 및 황반 변성, 드루젠-관련 시각 신경병증(drusen-related optic neuropathy), 및 베타-아밀로이드 침착에 의한 백내장(cataract)을 포함하는 다양한 안질환(eye disease)과 같은 아밀로이드-유사 단백질에 기인하거나 또는 이와 관련되는 다른 질환을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 질환과 같은 속발성 아밀로이드증 및 연령-관련 아밀로이드증을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 아밀로이드 플라크 형성과 관련된 질환 및 장애 그룹을 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "검출하는(detecting)" 또는 "검출된(detected)"은, 면역화학적 또는 조직학적(histological) 방법과 같은 생물학적 분자의 검출을 위한 공지의 기술을 사용하는 것을 의미하고, 또한 조사중인 생체분자의 존재 또는 농도를 정성적으로 또는 정량적으로 측정하는 것을 나타낸다.
"폴리머성 가용성 아밀로이드"는 포유류 또는 인체 내, 보다 특히 뇌 내에서 가용성인 올리고머성 또는 폴리머성 구조를 형성하는, 아밀로이드 펩타이드의, 또는 아밀로이드-유사 펩타이드의, 또는 변형된 또는 잘린(truncated) 아밀로이드 펩타이드의 또는 아밀로이드 펩타이드의 다른 유도체의 다수의 결집된 모노머, 특히 아밀로이드 β(Aβ)의 또는 변형된 또는 잘린 아밀로이드 β(Aβ) 펩타이드의 또는 이의 유도체의 다수의 결집된 모노머를 나타내며, 이는 포유류 또는 인체 내, 보다 특히 뇌 내에서 가용성이다.
"아밀로이드 β, Aβ 또는 β-아밀로이드"는 기술 공인 용어이며, 아밀로이드 β 단백질 및 펩타이드, 아밀로이드 β 전구체 단백질(APP), 뿐만 아니라 변형물, 절편 및 이의 모든 작용적 균등물을 나타낸다. 특히, 본원에서 사용된 아밀로이드 β는 APP의 단백질 분해적 분할에 의해 생산된 모든 절편, 특히 Aβ1 -38, Aβ1 -39, Aβ1 -40, Aβ1 -41, Aβ1 -42 및 Aβ1 -43을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 아밀로이드 병리에 관여하거나 이와 관련되는 이들 절편을 의미한다.
상기에 언급된 아밀로이드 β 펩타이드의 구조 및 서열은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 상기 펩타이드를 생산하는 방법 또는 뇌 및 다른 조직으로부터 상기 펩타이드를 추출하는 방법은 예를 들어, Glenner 및 Wong, Biochem Biophys Res Comm 129, 885-890 (1984) 내에 기술되어 있다. 게다가, 다양한 형태의 아밀로이드 β 펩타이드는 상업적으로도 입수 가능하다.
"단리된(isolated)"은 자연적으로 발생했을 때 가졌던 성분의 적어도 일부가 없는 생물학적 분자를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "항체" 또는 "항체들"은 기술 공인 용어이고, 공지된 항원에 결합하는 분자 또는 분자의 활성 절편, 특히 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역적으로 활성인 부분, 즉 항원에 특이적으로 결합하는 결합 사이트를 포함하는 분자를 나타내는 것으로 이해된다. 면역글로불린은 실질적으로 면역글로불린 카파(kappa) 및 람다(lambda), 알파(alpha), 감마(gamma), 델타(delta), 입실론(epsilon) 및 뮤(mu) 불변 영역 유전자, 뿐만 아니라 무수한(myriad) 면역글로불린 가변 영역 유전자로 인코드된 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 단백질이다. 경쇄는 카파 또는 람다 중 어느 하나로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 입실론으로 분류되며, 이는 각각 차례로 면역글로불린 클래스, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 정의된다. 또한 상기 중쇄의 서브클래스는 알려져있다. 예를 들어, 인간에서 IgG 중쇄는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서브클래스 중 어느 것일 수 있다. 본 발명의 면역글로불린은 임의의 클래스(IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 및 IgY) 또는 면역글로불린 분자의 서브클래스(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은, 항체에 관해 "특이적으로 결합하는"은 상기 항체가 그의 표적 항원에, 구조적으로 상이한 항원(들)에 대한 친화도 보다 큰 친화도로 결합하는 것을 의미한다.
전형적인 면역글로불린 구조적 단위는 테트라머(tetramer)를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각 테트라머는 동일한 폴리펩타이드 쇄(chain) 두 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 하나의 "경"쇄 (약 25kD) 및 하나의 "중"쇄 (약 50-70 kD)를 갖는다. 각 쇄의 N-말단은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 110 이상의 아미노산의 가변 영역으로 정의한다. 용어 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)는 이들 경쇄 및 중쇄를 각각 나타낸다.
항체는 전체 길이 무손상 항체(full length intact antibody)로서 또는 다양한 펩티다아제(peptidase) 또는 화학물질로의 소화(digestion)에 의해 생산된 다수의 적절히-특징부여된(well-characterized) 절편으로서 존재한다. 따라서, 예를 들어, 펩신(pepsin)은 항체 하측의 힌지 영역(hinge region) 내의 디설파이드 결합(disulfide linkage) 아래에서 항체를 소화하여, 그 자체가 디설파이드 결합에 의해 VH-CH1에 연결된 경쇄인 Fab의 다이머인 F(ab')2를 생산한다. F(ab')2는 온화한 조건 하에 감소되어 힌지 영역 내의 디설파이드 결합이 끊기고 이에 의해 F(ab')2 다이머가 Fab' 모노머로 전환될 수 있다. 상기 Fab' 모노머는 실질적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab 절편이다 (다른 항체 절편의 보다 상세한 설명을 위해서는 Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993) 참조). 다양한 항체 절편이 무손상 항체의 소화로 정의되는 한편, 당업자는 모든 여러 가지 항체 절편이 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법론을 이용함으로써 처음부터(de novo) 합성될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 항체는 전체 항체의 변형에 의해 생산된 또는 처음부터 합성된 항체 절편 또는 재조합 DNA 방법론을 사용함으로써 얻어진 항체 및 절편도 포함한다.
본 발명의 범위 내의 "항체들"은 단일클론성 항체, 다클론성 항체, 키메라, 단쇄(single chain), 이중특이성, 유인원화된(simianized), 인간 및 인간화된 항체뿐만 아니라 이들의 활성 절편을 포함하는 것을 의도한다. 공지된 항원에 결합하는 분자의 활성 절편의 예는, Fab 면역글로불린 발현 라이브러리의 산물 및 모든 항체의 에피토프-결합 절편 및 상기 언급된 절편들을 포함하는, 분리된 경쇄 및 중쇄, Fab, Fab/c, Fv, Fab', 및 F(ab')2 절편을 포함한다.
이들 활성 절편은 다수의 기술에 의해 본 발명의 항체로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 단일클론성 항체는 펩신과 같은 효소로 절단될 수 있고, 또한 HPLC 겔 여과될 수 있다. 그 후 Fab 절편을 함유하는 적절한 분획이 수합되어 막 여과 등에 의해 농축될 수 있다. 항체의 활성 절편의 단리를 위한 일반적 기술의 추가적 설명은 예를 들어, Khaw, B. A. 등 J. Nucl. Med. 23:1011-1019 (1982); Rousseaux 등 Methods Enzymology, 121 :663-69, Academic Press, 1986를 참조한다.
재조합적으로 제조된 항체는 통상적인 전체 길이 항체, 단백질 가수분해 소화로부터 알려진 활성 항체 절편, Fv 또는 단쇄 Fv(scFv)와 같은 독특한 활성 항체 절편, 도메인 결실된 항체 등일 수 있다. Fv 항체는 약 50Kd의 크기이고 경쇄 및 중쇄의 가변 영역을 포함한다. 단쇄 Fv("scFv") 폴리펩타이드는 직접 연결되거나 또는 펩타이드-인코딩 링커에 의해 연결된 VH- 및 VL- 인코딩 서열을 포함하는 핵산으로부터 발현될 수 있는 공유결합된 VH::VL 헤테로다이머이다. Huston 등 (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883을 참조한다. 자연적으로 결집된, 그러나 항체 V 영역으로부터 화학적으로 분리된 경쇄 및 중쇄 폴리펩타이드(light and heavy polypeptide chain)를 scFv 분자로 전환시키기 위한 다수의 구조는 실질적으로 항원-결합 사이트의 구조와 유사한 3차원 구조로 접힐 것이다. 예컨대, 미국 특허 제5,091,513호, 제5,132,405호 및 제4,956,778호를 참조한다.
결합 사이트(combining site)는 항원 결합에 관여하는 항체 분자의 일부를 나타낸다. 상기 항원 결합 사이트는 중("H")쇄 및 경("L")쇄의 N-말단 가변("V") 영역의 아미노산 잔기로 형성된다. 상기 항체 가변 영역은 "프레임워크 영역(framwork region, FR)"으로 알려진 보다 보존된 플랭킹 스트레치(flanking stretch)들 사이에 끼워진 "과가변 영역(hypervariable region)" 또는 "상보성 결정 영역"(CDR)으로 언급된 세 개의 고도로 분기하는(highly divergent) 스트레치를 포함한다. 항체 분자 내에서, 상기 세 개의 경쇄의 과가변 영역(LCDRl, LCDR2, 및 LCDR3) 및 세 개의 중쇄의 과가변 영역(HCDRl, HCDR2 및 HCDR3)은 3차원 공간 내에서 서로에 대해 배치되어 항원 결합 표면 또는 포켓(pocket)을 형성한다. 따라서 상기 항원 결합 사이트는 항원의 CDR을 구성하는 아미노산 및 결합 사이트 포켓을 구성하는 모든 프레임워크 잔기를 나타낸다.
조합 사이트를 이루는 특정 항체 내 아미노산 잔기의 동일성은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 항체 CDR은 Kabat 등에 의해 최초로 정의된 과가변 영역으로서 확인될 수 있다 ("Sequences of Proteins of Immunological Interest," E. Kabat 등, U.S. Department of Health and Human Services; Johnson, G 및 Wu, TT (2001) Kabat Database and its applications: future directions. Nucleic Acids Research, 29: 205-206; http://immuno.bme.nwa.edu 참조). CDR의 위치는 또한 Chothia 및 다른 이들에 의해 최초로 밝혀진 구조적 루프 구조로서 확인될 수 있다 (Chothia 및 Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901 (1987), Chothia 등, Nature 342, 877 (1989), 및 Tramontano 등, J. Mol. Biol. 215, 175 (1990) 참조). 다른 방법은 Kabat과 Chothia 사이의 절충이고 또한 옥스포드 몰레큘러 사(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어 (현재 Accelrys)를 사용하여 얻어지는 "AbM 정의(AbM definition)" 또는 Macallum 등 ("Antibody-antigen interactions: contact analysis and binding site topography," J Mol Biol. 1996 Oct 1 1;262(5):732-45)에 의한 CDR의 "접촉 정의(contact definition)"를 포함한다. 이하의 표는 여러가지 공지된 정의를 기초로 하여 CDR을 확인한다.
Figure pat00014
서열만으로 항체 내의 CDR을 확인할 수 있는 일반적인 지침은 이하와 같다:
LCDR1:
시작 - 대략 잔기 24.
앞서는 잔기는 항상 Cys이다.
뒤따르는 잔기는 항상 Trp이다. 일반적으로 TRP는 TYR-GLN가 뒤따르나, LEU-GLN, PHE-GLN, 또는 TYR-LEU가 뒤따를 수도 있다.
길이는 10 내지 17 잔기이다.
LCDR2:
시작 - L1의 끝 이후 16 잔기
앞서는 서열은 일반적으로 ILE-TYR이지만, VAL-TYR, ILE-LYS, 또는 ILE-PHE일 수도 있다.
길이는 일반적으로 7 잔기이다.
LCDR3:
시작 - 일반적으로 L2의 끝 이후 33 잔기.
앞서는 잔기는 Cys이다.
뒤따르는 서열은 PHE-GLY-X-GLY이다.
길이는 7 내지 11 잔기이다.
HCDR1 :
시작 - 대략 잔기 26 (CYS 이후 4 잔기) [Chothia / AbM 정의] Kabat 정의는 5 잔기 이후 시작한다.
앞서는 서열은 CYS-X-X-X이다.
뒤따르는 잔기는 TRP이고, 일반적으로 VAL이 뒤따르지만, ILE 또는 ALA가 뒤따를 수도 있다.
Chothia 정의는 마지막 4 잔기를 제외한 반면 AbM 정의 하에서의 길이는 10 내지 12 잔기이다.
HCDR2:
시작 - CDR-H1의 Kabat /AbM 정의의 끝 이후 15 잔기
앞서는 서열은 일반적으로 LEU-GLU-TRP-ILE-GLY(서열 식별 번호. 1)이지만, 다수의 변형(variation)이 가능하다.
뒤따르는 서열은 LYS/ARG-LEU/ILE/VAL/PHE/THR/ALA-THR/SER/ILE/ALA이다.
길이는 Kabat 정의 하에서 16 내지 19 잔기이다 (AbM 정의는 7 잔기 먼저 끝난다).
HCDR3:
시작 - CDR-H2의 끝 이후 33잔기 (CYS 이후 2 잔기).
앞서는 서열은 CYS-X-X이다 (일반적으로 CYS-ALA-ARG).
뒤따르는 서열은 TRP-GLY-X-GLY이다.
길이는 3 내지 25 잔기이다.
특정 항체 내 아미노산 잔기가 CDR의 외측(outside)이지만, 그럼에도 불구하고 결합 사이트의 라이닝(lining)의 일부인 측쇄를 가짐으로써 결합 사이트의 일부를 구성하는 것(즉, 상기 결합 사이트를 통해 연결시킬 수 있다)의 확인은 분자 모델링 및 X-선 결정학과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예컨대, Riechmann 등, (1988) Nature, 332:;323-327 참조한다.
키메라 항체는 상기 항체의 하나 이상의 영역이 한 종의 동물로부터의 것이고 또한 상기 항체의 하나 이상의 영역이 다른 종의 동물로부터의 것인 항체이다. 바람직한 키메라 항체는 영장류 면역글로불린으로부터의 영역을 포함하는 것이다. 인간 임상 용도를 위한 키메라 항체는 일반적으로 인간으로부터의 불변 영역과 비인간 동물, 예컨대 설치류로부터의 가변 영역을 갖는 것으로 이해된다. 반대로, 인간화된 항체는 인간 면역글로불린으로부터의 불변 영역 전부 및 가변 프레임워크 영역의 대부분 또는 전부와 비인간 항체로부터의 CDR을 사용한다. 인간 키메라 항체는 일반적으로 설치류로부터의 가변 영역을 가지는 것으로 이해된다. 일반적인 인간 키메라 항체는 설치류 항체 유래의 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 영역과 인간 중쇄 불변 영역 및 인간 경쇄 불변 영역을 가진다. 키메라 항체는 인간 불변 영역의 본래의(native) 아미노산 서열 및 본래의 설치류 가변 영역 서열에 대해 일부 변화를 포함할 수 있다. 키메라 및 인간화된 항체는 CDR 이식(grafting) 방법(예를 들어, 미국 특허 제 5,843,708호; 제 6,180,370호; 제 5,693,762호; 제 5,585,089호; 제 5,530,101호 참조), 쇄 셔플링(chain shuffling) 방법(예를 들어, 미국 특허 제 5,565,332호; Rader 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95:8910-8915 참조), 분자 모델링 방법(미국 특허 제 5,639,641호) 등을 포함하는 당업계에 공지된 방법에 의해 준비될 수 있다.
두 쇄(two chain) 항체의 경우에서 본원에서 사용된 바와 같은 "인간화된 항체"는 적어도 하나의 쇄가 인간화된 것이다. 인간화된 항체 쇄는 하나 이상의 프레임워크 영역이 인간인 가변 영역을 가진다. 단일쇄인 인간화된 항체는 상기 쇄가 하나 이상의 프레임워크 영역이 인간인 가변 영역을 가지는 것이다. 인간화된 항체 쇄 또는 이의 절편의 가변 영역의 비인간 부분은 비인간 근원(non-human source), 특히 비인간 항체, 일반적으로 설치류 기원으로부터 유래한다. 인간화된 항체에의 비인간 기여(contribution)는 일반적으로 하나 (이상의) 인간 면역글로불린(들)으로부터 유래된 프레임워크 영역 중에 산재된(interspersed) 적어도 하나의 CDR 영역의 형태로 제공된다. 추가로, 프레임워크 지지 잔기(framework support residue)는 결합 친화도를 보존하기 위해 변경될 수 있다.
인간화된 항체는 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다 (예컨대, 경쇄의 경우 적어도 하나의 불변 영역 또는 이의 부분, 및 중쇄의 경우 바람직하게는 세 개의 불변 영역). 인간화된 항체의 불변 영역이 존재한다면 일반적으로 인간이다.
"인간화된 항체"를 수득하는 방법은 당업자들에게 공지되어 있다 (예를 들어, Queen 등, Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson 등, Bio/Technology, 9:421 (1991) 참조).
"인간화된 항체"는 예를 들어, 토끼 및 마우스와 같은 큰 동물에서 친화도-성숙된(affinitiy-matured) 인간유사 다클론성 항체를 생산할 수 있는 신규한 유전공학 수단에 의해서도 수득될 수 있다. 미국 특허 제 6,632,976호 참조.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 불변 영역(CR)은 면역글로불린의 불변 영역 유전자를 나타낸다. 상기 불변 영역 유전자는 이펙터 작용(effector function)을 부여하는 항체 분자의 부분을 인코드한다. 키메라 인간 항체 및 인간화된 항체에 있어서, 일반적으로 비인간 (예컨대, 쥐), 불변 영역은 인간 불변 영역에 의해 치환된다. 대상 키메라 또는 인간화된 항체의 불변 영역은 일반적으로 인간 면역글로불린에서 유래된다. 중쇄 불변 영역은 다섯가지 이소타입 중 어느 것으로 선택될 수 있다: 알파, 델타, 입실론, 감마 또는 뮤. 또한, (중쇄의 IgG 서브클래스와 같은) 여러가지 서브클래스의 중쇄는 상이한 이펙터 작용을 야기하므로, 원하는 중쇄 불변 영역을 선택함으로써, 원하는 이펙터 작용을 갖는 항체를 생산할 수 있다. 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있는 불변 영역은 감마 1(IgG1), 특히 감마 1(IgG1) 이소타입, 감마 3(IgG3) 및 특히 감마 4(IgG4)의 Fc 영역이다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 유형, 바람직하게는 카파 유형의 것일 수 있다. 일 구체예에서 경쇄 불변 영역은 인간 카파 불변 쇄이고 (Heiter 등 (1980) Cell 22:197-207) 또한 중쇄 불변 영역은 인간 IgG4 불변 쇄이다.
용어 "단일클론성 항체"는 또한 당업계에서 잘 인지될 수 있으며, 또한 단일 클론된 항체 생산 세포의 산물인 항체를 나타낸다. 단일클론성 항체는 일반적으로, 정상적으로 단명하는, 항체-생산 B 세포를 (때때로 "무한증식(immortal)" 세포로 나타내어지는) 암세포와 같은 빨리-성장하는 세포와 융합하여 제조된다. 결과물인, 항체를 생산(create)하는 클론(clone)을 생성하는 하이브리드(hybrid) 세포, 또는 하이브리도마는 빠르게 증식한다.
본 발명의 목적을 위해, "단일클론성 항체"는 완전한 단일클론성(full monoclonality)에 미처 도달하지 않은 모 클론(mother clone)에 의해 생산되는 항체를 포함하는 것으로도 이해된다.
"작용적으로 균등한 항체"는, β-아밀로이드 단백질, 특히 Aβ1 -42 단백질, 또한 보다 특히 Aβ1 -42 단백질의 16-21 에피토프 영역에 대한 결합 특이성, 인 비트로 면역반응성, Aβ1 -42 모노머의 고분자 폴리머성 원섬유로의 결집의 억제 및/또는 미리형성된 Aβ1 -42 폴리머성 원섬유의 해체, 및/또는 β-시트 파괴 특성 및 예방적으로 또는 치료적으로 투여될 때, 예를 들면, 알츠하이머병(AD), 루이 소체 치매, 다운증후군, 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈(네덜란드형); 괌 파킨슨-치매 복합증과 같은 신경계 질환; 뿐만 아니라 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증; 크로이츠펠트 야콥병, 파킨슨병, HIV-관련 치매, 근육위축가쪽경화증(ALS), 성인발병형 당뇨병; 노인성 심아밀로이드증; 내분비 종양, 및 황반 변성을 포함하는 그 밖의 질환과 같은 아밀로이드-유사 단백질에 기인하거나 또는 이와 관련되는 다른 질환을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 질환과 같은 속발성 아밀로이드증 및 연령-관련 아밀로이드증을 포함하는 아밀로이드 플라크 형성과 관련된 질환 및 장애 그룹인 아밀로이드증의 영향을 완화시키는 것을 포함하는 본원에 기재된 및 상기에 언급된 항체와 적어도 하나의 주요 작용 특성을 실질적으로 공유하는 항체를 나타내는 것으로 본 발명의 범위 내에서 이해된다. 상기 항체는 IgG, IgM,또는 IgA 등과 같은 임의의 클래스 또는 IgG1, IgG2a등과 같은 임의의 서브클래스 및 당업계에 알려지거나 또는 본원의 상기에 언급된 다른 서브클래스일 수 있으며, 특히 IgG4 클래스의 항체일 수 있다. 또한, 상기 항체는 파아지 디스플레이(phage display)와 같은 임의의 방법에 의해 생산될 수 있거나, 또는 인간화된 항체와 같은, 원하는 특색을 갖는 항체를 생산하는 세균의, 곤충의, 포유류의 또는 다른 유형의 세포 또는 세포주를 포함하는 임의의 유기체 또는 세포주에서 생산된다. 상기 항체는 상이한 종으로부터의 Fab 부분 및 Fc 영역을 조합함으로써 형성될 수도 있다.
사용된 용어 "혼성화하다(hybridize)"는 통상적인 혼성화 조건, 바람직하게는 5xSSPE, 1% SDS, 1x 덴하르트 용액이 용액으로서 사용되는 혼성화 조건 및/또는 혼성화 온도가 35℃ 내지 70℃, 바람직하게는 65℃인 혼성화 조건을 나타낸다. 혼성화 후, 세척은 바람직하게는 35℃ 내지 70℃, 바람직하게는 65℃의 온도에서 처음에는 2xSSC, 1% SDS로, 그리고 이어서 0.2xSSC로 수행된다 (SSPE, SSC 및 덴하르트 용액의 정의에 대해 Sambrook 등 인용된 곳에서 참조). 예를 들면 앞의 Sambrook 등에 기술된 바와 같은 엄격한 혼성화 조건이 특히 바람직하다. 특히 바람직한 엄격한 혼성화 조건은 예를 들어 상술하여 나타낸 바와 같이 혼성화 및 세척이 65℃에서 일어나는 것이다. 예를 들어 혼성화 및 세척이 45℃에서 수행되는 엄격하지 않은 혼성화 조건은, 보다 덜 바람직하며, 35℃에서 수행되는 혼성화 조건은 바람직하지 않다.
두 서열간의 "상동성(homology)"은 서열 동일성에 의해 결정된다. 만약 상호 길이 면에서 상이한 두 서열이 비교된다면, 서열 동일성은 바람직하게는 더 긴 서열의 뉴클레오티드 잔기와 동일한 더 짧은 서열의 뉴클레오티드 잔기의 백분율과 관련된다. 서열 동일성은 통상적으로 Bestfit 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Unix용 Version 8, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, WI 53711)과 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. Bestfit은, 두 서열간 가장 높은 서열 동일성을 갖는 세그먼트를 찾기 위해, Smith 및 Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489의 로컬 상동성 알고리즘을 사용한다. 예를 들어 특정 서열이 본 발명의 참조 서열과 95% 동일성을 가지는지를 측정하기 위해 Bestfit 또는 다른 서열 정렬 프로그램을 사용할 때, 파라미터는 바람직하게는 동일성의 백분율이 참조 서열의 전체 길이로 나누어 계산되도록, 또한 참조 서열 내 뉴클레오티드의 총 수의 5%이하의 상동성 갭(gap)으로 보정된다. Bestfit을 사용할 때, 소위 선택가능한(optional) 파라미터는 바람직하게는 그들의 미리세트된 ("디폴트") 값을 버린다. 본 발명의 상기 서열과 주어진 서열 사이의 비교에서 나타나는 편차는 예를 들어 첨가, 결실, 치환, 삽입 또는 재조합에 기인할 수 있다. 상기 서열 비교는 바람직하게는 프로그램 "fasta20u66"로도 수행될 수 있다 (version 2.0u66, William R. Pearson 및 버지니아 대학에 의해 1998년 9월; W. R. Pearson (1990), Methods in Enzymology 183, 63-98, 첨부된 실시예 및 http://workbench.sdsc.edu/ 또한 참조). 이 목적을 위해, 상기 "디폴트" 파라미터 세팅이 사용될 것이다.
본 발명의 항체는 (다가(multivalent)라면) 이의 동일한 결합 사이트를 각각 가지는 것으로 이해되는 면역글로불린 또는 항체일 수 있고 또는, 선택적으로, "이중특이성(bispecific)" 또는 "이작용성(bifunctional) 항체"일 수 있다.
용어 "이중특이성" 또는 "이작용성 항체"는 두 개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 두 개의 상이한 결합 사이트를 가지는 인공적 하이브리드 항체이다. 이중특이성 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 절편의 연결을 포함하는 여러 가지 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, Songsivilai & Lachmann, Clin . Exp . Immunol . 79:315-321 (1990); Kostelny 등, J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992) 참조.
용어 "절편"은 무손상 또는 완전(complete) 항체 또는 항체 쇄보다 더 적은 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 쇄의 일부 또는 부분을 나타낸다. 절편은 무손상 또는 완전 항체 또는 항체 쇄의 화학적 또는 효소 처리를 통해 수득될 수 있다. 절편은 또한 재조합 수단에 의해 수득될 수 있다. 대표적 절편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fabc 및/또는 Fv 절편을 포함한다. 용어 "항원-결합 절편"은 항원에 결합하거나 또는 항원 결합(즉, 특이적 결합)을 위해 무손상 항체와(즉, 그들이 유래된 무손상 항체와) 경쟁하는 면역글로불린 또는 항체의 폴리펩타이드 절편을 나타낸다.
결합 절편은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 무손상 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 분할에 의해 생산된다. 결합 절편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, 단일쇄, 및 단일-쇄 항체를 포함한다.
"절편"은 또한 다른 폴리펩타이드 아미노산 서열의 적어도 5개의 인접하는 아미노산 잔기, 적어도 10개의 인접하는 아미노산 잔기, 적어도 15개의 인접하는 아미노산 잔기, 적어도 20개의 인접하는 아미노산 잔기, 적어도 25개의 인접하는 아미노산 잔기, 적어도 40개의 인접하는 아미노산 잔기, 적어도 50개의 인접하는 아미노산 잔기, 적어도 60개의 인접하는 아미노산 잔기, 적어도 70개의 인접하는 아미노산 잔기, 적어도 80개의 인접하는 아미노산 잔기, 적어도 90개의 인접하는 아미노산 잔기, 적어도 100개의 인접하는 아미노산 잔기, 적어도 125개의 인접하는 아미노산 잔기, 적어도 150개의 인접하는 아미노산 잔기, 적어도 175개의 인접하는 아미노산 잔기, 적어도 200개의 인접하는 아미노산 잔기, 또는 적어도 250개의 인접하는 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 나타낸다. 특정 구체예에서, 폴리펩타이드의 절편은 상기 폴리펩타이드의 적어도 하나의 작용을 유지한다.
용어 "항원"은 항체에 결합할 수 있는 존재(entity) 또는 이의 절편을 나타낸다. 면역원은 유기체, 특히 동물, 보다 특히 인간을 포함하는 포유류 내에서 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 나타낸다. 용어 항원은 항원성(antigenicity) 또는 항원 결정기의 원인인 항원 내에 존재하는 접촉(contact reside)을 돕는데 유의한 역할을 하거나 또는 접촉되는) 항원의 부분을 나타내는 항원 결정기 또는 에피토프로 알려진 영역을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "가용성"은 수용액에 부분적으로 또는 완전히 용해되는 것을 의미한다.
또한 본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역원성"은 면역원의 항원에 대해 지향되는 항체, T-세포 및 다른 반응성 면역 세포의 생산을 이끌어내는 물질을 나타낸다.
면역 반응은 치료될 장애를 절제시키거나 또는 완화시키기 위해, 투여된 본 발명의 면역원성 조성물에 대해, 개체가 충분한 항체, T-세포 및 다른 반응성 면역 세포를 생산할 때 일어난다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 면역원성은 수령자(recipient)에 투여될 때 (체액성 또는 세포성) 면역 반응을 유발하는 항원의 능력의 정도를 나타낸다. 본 발명은 대상 인간 키메라 또는 인간화된 항체의 면역원성을 감소시키는 수단에 관한 것이다.
감소된 면역원성의 인간화된 항체는 부모 항체(parent antibody), 예컨대 쥐 항체에 대해 감소된 면역원성을 나타내는 인간화된 항체를 나타낸다.
실질적으로 부모 항체의 결합 특성을 유지하는 인간화된 항체는 그러한 인간화된 항체를 생산하기 위해 사용된 부모 항체에 의해 인식되는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 인간화된 항체를 나타낸다. 바람직하게는 상기 인간화된 항체는 부모 항체와 동일한 또는 실질적으로 동일한 항원-결합 친화도 또는 결합력(avidity)을 나타낼 것이다. 이상적으로, 상기 항체의 친화도는 부모 항체 친화도의 10% 미만은 아닐 것이고, 보다 바람직하게는 약 30% 미만은 아니며, 또한 가장 바람직하게는 부모 항체의 50% 미만은 아닐 것이다. 항원-결합 친화도를 어세이하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있고 또한 반-최대(half-maximal) 결합 어세이, 경쟁 어세이, 및 스캐쳐드(Scatchard) 분석을 포함한다. 적합한 항원 결합 어세이는 본 출원에 기술된다.
"복귀 돌연변이(back mutation)"는 인간화된 항체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열 내에 도입된 돌연변이로서, 상기 돌연변이는 부모 항체(예컨대, 도너 항체, 예를 들면, 쥐 항체) 내 아미노산에 대응하는 아미노산을 유발한다. 부모 항체로부터의 어떤 프레임워크 잔기는, 부모 항체의 결합 특성을 실질적으로 유지하기 위해 본 발명의 항체의 인간화 동안 유지될 수 있는데 이때 동시에 결과물인 항체의 잠재적 면역원성을 최소화하도록 한다. 본 발명의 일 구체예에서, 부모 항체는 마우스 유래의 것이다. 예를 들어, 복귀 돌연변이는 인간 프레임워크 잔기를 부모 쥐 잔기로 바꾼다. 복귀 돌연변이될 수 있는 프레임워크 잔기의 예는 CDR H3에 가까운 (CDR 외에 플랫폼을 형성하는) "베르니에 존(Vernier Zone)" 내의 잔기(Foote & Winter, 1992, J. Mol. Biol. 224, 487-499), 결합 사이트에 가까운 보기드문 부모 잔기, 인터페이스 팩킹 잔기(interface packing residue), 캐노니컬 잔기(canonical residue)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용된 바와 같은 "보존적 변화(conservative change)"는 본래의 단백질과 비교하여, 각각, 돌연변이 폴리펩타이드의 항원 결정기 내에 최소의 변화를 생성하는, 또는 돌연변이 폴리펩타이드의 3차 구조 내에 최소 변화를 생성하는, 실직적으로 배좌적으로 또는 항원적으로 중성인 변경(alteration)을 나타낸다. 본 발명의 항체 및 항체 절편을 언급할 때, 보존적 변화는 대상 수용체에 대한 결합이 불가능한 항체를 표현하지 않는 아미노산 치환을 의미한다. 당업자는 아미노산 치환이 배좌적으로 및 항원적으로 중성이 되는 높은 가능성을 유지하면서 제조될 수 있음을 예상할 수 있다. 그러한 안내는 예를 들어 Berzofsky, (1985) Science 229:932-940 및 Bowie 등 (1990) Science 247:1306-1310에서 제공된다.
배좌적 및 항원적 중성의 유지의 가능성에 영향을 미치는 것으로 여겨지는 요인은 하기를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다:
(a) 소수성 아미노산의 치환은 항원성에 영향을 미칠 가능성이 적은데, 소수성 잔기가 단백질의 내부에 보다 위치되려고 하기 때문이다;
(b) 물리화학적으로 유사한 아미노산의 치환은 배좌에 영향을 미칠 가능성이 적은데, 상기 치환된 아미노산이 구조적으로 본래의 아미노산의 모방(mimic)이기 때문이다; 또한
(c) 진화적으로 보존된 서열의 변경은 배좌에 불리하게 영향을 미칠 가능성이 있고 그러한 보존은 아미노산 서열이 작용적 중요성을 가질 수 있음을 제안한다.
당업자는 마이크로컴플리먼트 고정 방법(microcomplement fixation method)(Wasserman 등 (1961) J. Immunol. 87:290-295; Levine 등 (1967) Meth. Enzymol. 11:928-936) 등에 제한되지 않는 잘 알려진 어세이의 사용 및 배좌-의존적 단일클론성 항체를 사용하는 결합 연구(Lewis 등 (1983) Biochem. 22:948-954)를 통해 단백질 배좌의 변경을 평가할 수 있다.
또한, 용어 "치료적 유효량"은 인간 또는 동물에게 투여될 때, 상기 인간 또는 동물에서 치료적 효과를 유발하기에 충분한 항체의 양을 나타낸다. 유효량은 관례적 과정을 따라 당업자에 의해 미리 결정된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "치료하다", "예방하다", "예방하는" 및 "예방"은 예방제 또는 치료제의 투여로 야기되는, 대상에서 장애의 하나 이상의 증상의 재발 또는 발병의 예방을 나타낸다.
인간화된 항체의 구축
본 발명은 본원에 포함된 이하의 특정 구체예의 상세한 설명에 대한 참조로서 보다 쉽게 이해될 것이다. 비록 본 발명은 어떤 구체예의 특정 상세한 설명에 대한 참조로서 기술되었지만, 이에 대해, 상기 상세한 설명은 본 발명의 범위에 대한 제한으로서 간주되어야 하는 것으로 의도하는 것은 아니다.
본 발명은 β-아밀로이드 항원의 범위로부터의 특정 에피토프를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖는 고도로 특이적이고 또한 고도로 효과적인 항체를 포함하는 신규한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 가르침에 의해 가능해진 항체는, 특히 일부 지명하자면 알츠하이머병(AD), 루이 소체 치매, 다운증후군, 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈(네덜란드형); 괌 파킨슨-치매 복합증과 같은 신경계 장애; 뿐만 아니라 진행성 핵상 마비, 다발성 경화증; 크로이츠펠트 야콥병, 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈(네덜란드형), 파킨슨병, HIV-관련 치매, 근육위축가쪽경화증(ALS), 성인 발병형 당뇨병; 노인성 심아밀로이드증; 내분비 종양, 및 황반 변성을 포함하는 그 밖의 질환과 같은 아밀로이드-유사 단백질에 기인하거나 또는 이와 관련되는 다른 질환을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 속발성 아밀로이드증 및 연령-관련 아밀로이드증을 포함하는 아밀로이드 플라크 형성과 관련된 질환 및 장애 그룹인 아밀로이드증의 치료에 유용하다.
본 발명에 따라 완전히 인간화된 또는 재형상화된 가변 영역은 인간-유래 프레임워크 서열 내에 끼워진 비인간, 특히 설치류-유래 CDR, 특히 쥐 항체 ACI-O1-Ab7C2(본 출원 전체에 "mC2"로 명명되고 또한 부다페스트 조약의 규정 하에, 2005년 12월 1일, 브라운슈바이그 38124, 마쉐로데르 베그 1 비, 브라운슈바이그(Braunschweig, Mascheroder Weg 1 B, 38124 Braunschweig) 소재 "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)"에 기탁되어 접근 번호 DSM ACC2750을 부여받음)로부터 유래된 CDR을 함유하는 가변 영역 아미노산 서열을 우선 설계함으로써 본 발명의 범위 내에서 생성될 수 있다. 본 발명의 항체로부터 수득될 수 있는 비인간, 특히 설치류-유래 CDR은 원하는 특이성을 제공한다. 따라서, 이들 잔기는 본질적으로 변화되지 않은 재형상화된 가변 영역의 설계에 포함된다. 따라서 임의의 변형은 항체의 특이성 및 친화도의 변화에 있어 최소로 제한되어야 하며 또한 엄중히 주시되어야 되어야 한다. 한편, 이론 상의 프레임워크 잔기는 모든 인간 가변 영역으로부터 유래될 수 있다.
용인할 수 있는 또는 한층 개선된 친화도를 나타내는 재형상화된 항체를 생성하기 위해, 재형상화된 가변 영역을 생성하기에 및 항원 친화도를 유지하기에 균등하게 적합한 인간 프레임워크 서열이 선택되어야 한다.
본 목적을 달성하기 위해, 최적-적합 방법(best-fit strategy)이 개발되었다. 프레임워크 서열이 항원과의 상호작용에 대한 그들의 올바른 공간적 배향 내에 CDR을 유지하고, 또한 프레임워크 잔기는 때때로 항원 결합에 보다 관여하는 것으로 알려져 있는 바와 같이, 이 방법은 비인간, 특히 설치류-유래된 가변 영역에 가장 상동적인 또는 유사한 인간 가변 영역으로부터 항체 재형상화를 위해 사용된 인간 프레임워크 서열을 유도함으로써 항체의 3차원 구조에 부정적 영향을 줄 수 있는 변화를 최소화하는 것을 목표로 한다. 이는 또한 상기 재형상화된 항체 내에서 친화도가 유지될 가능성을 최대화할 것이다.
그의 가장 간단한 수준에서, "최적-적합" 방법은 모든 알려진 인간 V-영역 아미노산 서열과 도너 설치류 V-영역을 비교, 및 그 후 가장 상동성이 높은 것의 선택에 관여하여 인간화 과제를 위한 수용체 프레임 영역을 제공한다. 실제로 여러 다른 요소가 고려되어야 하며, 이는 수용체 프레임워크 영역의 최종 선택에 영향을 미칠 수 있다. 이점에서 분자 모델링 예측(Molecular modelling prediction)은 결과물인 재형상화된 항체의 친화도를 최대화하기 위한 시도에서의 모든 실험에 선행되어 사용될 수 있다. 본질적으로, 상기 모델링의 목표는 가장 상동성이 높은 인간 프레임워크의 (만약 있다면) 기본 잔기(key residue)가 설치류 내에 잔류해야하는지 예측하여 상기 재형상화된 항체 내의 최적의 친화도를 수득하는 것이다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 CDR은 마우스 단일클론성 항체로부터, 특히 2005년 12월 12일 출원되어 동시계류 중인 출원 EP 05 02 7092.5에 기술된 (본 출원 전체에 "mC2"로 명명된) 마우스 단일클론성 항체 ACI-O1-Ab7C2로부터 수득가능하고, 이의 개시는 본원에 참조로서 삽입된다.
동시계류 출원 EP05027092.5의 마우스 단일클론성 항체 ACI-O1-Ab7C2 (본 출원 전체에서 "mC2"로 명명되고 또한 인간화된 C2 항체에 대해서는 hC2로 명명됨)를 생산하는 하이브리도마 세포 FP-12H3-C2는 부다페스트 조약의 규정 하에, 2005년 12월 1일, 브라운슈바이그 38124, 마쉐로데르 베그 1 비, 브라운슈바이그 소재 "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)"에 기탁되어 접근 번호 DSM ACC2750을 부여받았다.
예를 들어, 팔미트산과 같은 소수성 모이어티 또는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 친수성 모이어티 또는 이들 둘의 조합으로 변형된 β-아밀로이드 펩타이드, 특히 β-아밀로이드 펩타이드 Aβ1 -15, Aβ1 -16 및 Aβ1 -16( Δ14 )의 아미노산 서열에 대응하는 항원성 펩타이드를 포함하는 마우스 항체는 초분자 항원성 구조체에 대해 생성될 수 있고, 여기서 상기 소수성 및 친수성 모이어티 각각은 상기 소수성 및 친수성 모이어티를 펩타이드 절편에 커플링시키기 위한 연결 장치로서 작용할 수 있는 예를 들어, 라이신, 글루타민산 및 시스테인 또는 임의의 적합한 아미노산 또는 아미노산 유사체와 같은, 적어도 하나, 특히 하나 또는 두 개의 아미노산을 통해 항원성 펩타이드의 말단 각각에 공유 결합된다. PEG가 상기 친수성 모이어티로 사용될 때, 자유 PEG 말단은 포스파티딜에탄올아민 또는 예를 들어, 리포좀 이중층 내에 항원성 구조체를 끼워넣기 위한 앵커링 요소로서 작용하기에 적합한 임의의 다른 화합물에 공유 결합된다.
특히, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 친수성 모이어티와 같은 친수성 모이어티로 변형된 β-아밀로이드 펩타이드 Aβ1 -16의 아미노산 서열에 대응하는 항원성 펩타이드를 포함하는 초분자 항원성 구조체에 대해 생성될 수 있는 마우스 항체는 상기 소수성 및 친수성 모이어티를 펩타이드 절편에 커플링시키기 위한 연결 장치로서 작용할 수 있는 예를 들어, 라이신, 글루타민산 및 시스테인 또는 임의의 적합한 아미노산 또는 아미노산 유사체와 같은, 적어도 하나, 특히 하나 또는 두 개의 아미노산을 통해 상기 항원성 펩타이드의 말단 각각에 공유 결합된다. PEG가 상기 친수성 모이어티로 사용될 때, 자유 PEG 말단은 포스파티딜에탄올아민 또는 예를 들어, 리포좀 이중층 내에 항원성 구조체를 끼워넣기 위한 앵커링 요소로서 작용하기에 적합한 임의의 다른 화합물에 공유 결합된다.
본 발명의 구체예에서, 가변 영역 내에 하나 이상의 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내에 끼워진 비인간 기원의 적어도 하나의 CDR을 포함하고 또한 인간 또는 영장류 근원 항체로부터 유래된 불변 영역과 조합된 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편이 제공되고, 상기 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편은 β-아밀로이드 모노머성 펩타이드의 특이적인 인식 및 결합을 가능하게 한다.
상기 CDR은 항원에 결합할 가능성이 가장 높고 또한 상기 재형상화된 항체 내에 유지되어야 하는 잔기를 포함한다. CDR은 Kabat 등, Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, The United States Department of Health and Human Services, The United States Government Printing Office, 1991에 따르는 서열에 의해 한정된다. CDR은 기본 잔기가 CDR 루프의 구조적 배좌의 대부분을 결정하는 캐노니컬 클래스(Chothia 등, 1989 Nature, 342, 877-883)에 해당한다. 이들 잔기는 대부분 언제나 상기 재형상화된 항체 내에 유지된다.
본 발명의 인간화된 항체를 준비하기 위한 공정에서, C2 중쇄 및 경쇄 가변 영역(VH 및 VK)의 아미노산 서열은 NCBI 및 Kabat 데이터베이스의 설치류 항체 VH 및 VK 서열과 비교된다.
C2 VK에 대해 가장 가까운 매치(match) 마우스 생식계열 유전자는 bb1, 로커스(Locus) MMU231201이다 (Schable 등, 1999). 비교는 이 생식 계열 서열과 모두 CDRL1 내에 위치된 두 아미노산이 상이함을 나타낸다. 유사한, 그러나 동일하지 않은 서열을 가지는 성숙한 쥐 항체가 발견될 수 있다. 몇몇은 동일한 CDRL2 및 동일한 CDRL3를 가질 것이나, C2의 CDRL1은 독특한 것으로 보인다. 인간 생식 계열 VK 서열과이 비교는 서브그룹 VKII로부터의 유전자가 C2 VK에 최적의 매치임을 나타낸다 (Cox 등, 1994). 따라서 C2 VK는 Kabat 서브그룹 MUVKII.서열로 지정될 수 있다.
인간화된 VK에 대한 수용체 프레임워크 서열을 제공하기 위해 인간 J 영역 HuJK1과 함께 DPK15가 선택될 수 있다.
가변 경쇄 및 중쇄 사이의 경계에서의 잔기는 한정되어 있다 (Chothia 등, 1985 J. Mol . Biol, 186, 651-663). 이들은 보통 재형상화된 항체 내에 유지된다. 상기 경계에서 마우스 C2 VK의 위치 87의 Phe는 드문 반면, Tyr은 VKII 서브그룹 내에서 보다 일반적이며, 이는 이 프레임워크 잔기가 항체 활성에 중요할 수 있음을 지시한다. Tyr 87은 인간 생식계열 및 인간화된 C2VK에 존재한다.
따라서 인간화된 VK 서열은, C2HuVK1가 인간 JK1 및 DPK 15로부터의 프레임워크를 갖는 마우스 C2 VK CDR로 이루어도록 설계될 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, 쥐 잔기는 위치 45, 및/또는 87에서 인간 프레임워크 영역에서 치환될 수 있다. 마우스 단일클론성 항체, 특히 쥐 항체 ACI-O1-Ab7C2로부터 수득가능한 CDR2 영역에서, 아미노산 치환은 Kabat 위치 50 및/또는 53에서 이루어질 수 있다. 잔기 45는 CDR의 배좌를 지지하는 것에 관여할 수 있다. 잔기 87은 VH 및 VK 도메인의 경계에 위치된다. 따라서 이들 잔기는 항체 결합의 유지에 결정적일 수 있다.
C2 VH AF에 가장 가까운 매치 마우스 생식 계열 유전자는 VH7183, 로커스 AF 120466이다 (Langdon 등, 2000). 인간 생식 계열 VH 서열과의 비교는 서브그룹 VHIII로부터의 유전자가 C2 VH에 대한 최적의 매치인 것을 나타낸다. C2 VH AF는 Kabat 서브그룹 MuVHIIID로 지정될 수 있다. 인간화된 VH를 위한 수용체 프레임워크 서열을 제공하기 위해 인간 J 영역 HuJH6과 함께 서열 DP54가 선택될 수 있다.
상기 비교는 상기 C2 VH와 인간 수용체 생식 계열 서열 DP54 및 JH6 사이에 9개 아미노산 상이성이 있으며, 대부분이 CDRH2에 위치하고 있음을 나타낸다. 동일한 또는 유사한 (하나의 잔기가 상이) CDRH1을 갖는 또는 유사한 CDRH2 (하나의 잔기가 상이)를 갖는 성숙한 쥐 항체가 발견되었으나, 모든 세 CDR 중 어떤 것도 C2 VH AF와 동일하지 않다. 단지 세 개의 잔기로 이루어지는 C2 항체의 CDRH3은 매우 짧다. 그러나, 이 길이의 CDRH3를 갖는 다른 항체가 데이터베이스에서 발견된다. C2 VH의 잔기 47은 보다 일반적인 Trp보다 Leu이고, 또한 잔기 94는 보통의 Arg보다는 Ser이며, 이는 이들 프레임워크 잔기가 항체 활성에 중요할 수 있음을 나타낸다.
다양한 인간화된 VH 서열이 설계될 수 있다. C2HuVH1은 DP54 및 HUJH6로부터의 프레임워크를 갖는 C2 VH AF CDR로 이루어진다. 본 발명의 특정 구체예에서, 쥐 잔기는 인간 프레임워크 영역 내 위치 47 또는 94 또는 모두에서 치환될 수 있다. 프레임워크 2 내 잔기 47은 상기 CDR 및 상기 VK 도메인 모두와 접촉을 이룬다. 잔기 94는 CDR의 배좌의 지지에 관여할 수 있다. 따라서 이들 잔기는 항체 결합의 유지에 있어 결정적일 수 있다.
설계될 수 있는 상이한 HCVR 및 LCVR은 본래의 또는 변형된 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내에 끼워진 도너 항체, 예를 들어, 쥐 항체로부터 수득가능한 비인간 CDR을 포함한다. 이 변형은 특히, 각각의 서브그룹 내 이 위치에서 보다 일반적으로 발견되는 비인간 잔기, 특히 쥐 잔기에 의한 또는 각각의 서브그룹 내 이 위치에서 보다 일반적으로 발견되는 것에 유사한 특성을 가지는 잔기에 의한 프레임워크 영역 내부의 하나 이상의 아미노산 잔기의 교환에 관여할 수 있다.
프레임워크 영역의 변형 프레임워크 서열은 항원과의 상호작용을 위해 그들의 정확한 공간적 배향에서 CDR을 유지하고, 또한 프레임워크 잔기는 때때로 항원 결합에 보다 관여할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서 재형상화된 항체에서 친화도가 유지될 가능성을 최대화하기 위해, 선택된 인간 프레임워크 서열을 설치류 프레임워크의 서열에 가장 유사하게 하도록 추가로 개조하기 위한 조치가 취해진다.
따라서, 인간 프레임워크 영역 내의 쥐 잔기는 치환될 수 있다. 특히, 중쇄 가변(HCVR) 영역의 인간 프레임워크 영역 내 위치 47 또는 94 또는 모두의 쥐 잔기 및 경쇄 가변(LCVR) 영역의 인간 프레임워크 영역 내 위치 45 및/또는 87의 쥐 잔기가 치환될 수 있다. 마우스 단일클론성 항체, 특히 쥐 항체 ACI-O1-Ab7C2로부터 수득가능한 CDR2 영역에서, 아미노산 치환은 Kabat 위치 50 및/또는 53에서 이루어질 수 있다.
인간 프레임워크 영역 내의 상기 지시된 위치에서 발견된 잔기는 각각의 서브그룹 내의 이 위치에서 보다 일반적으로 발견되는 쥐 잔기로 교환될 수 있다. 특히, 서열 식별 번호: 15에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역의 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내 Kabat 위치 47의 Trp는 Leu에 의해 또는 유사한 특성을 갖는 아미노산 잔기에 의해 교체될 수 있고 또한 상기 치환은 돌연변이체(mutant) 폴리펩타이드의 3차 구조에서 최소 변화를 생성하는, 또는 항원성 결정기에서의 최소 변화를 생성하는, 실질적으로 배좌적으로 또는 항원적으로 중성인 변경을 야기한다. 특히, 서열 식별 번호: 15에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역의 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내 Kabat 위치 47의 Trp는 노르류신, Ile, Val, Met, Ala, 및 Phe으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산, 특히 Ile에 의해 추가로 교체될 수 있다. 배좌적으로 및 항원적으로 중성인 선택적 보존적 치환이 예상될 수 있다.
서열 식별 번호: 15에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역의 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내 Kabat 위치 94의 Arg은 Ser에 의해 또는 유사한 특성을 갖는 아미노산 잔기에 의해 교체될 수 있고 또한 상기 치환은 돌연변이체 폴리펩타이드의 3차 구조에서 최소 변화를 생성하는, 또는 항원성 결정기에서의 최소 변화를 생성하는, 실질적으로 배좌적으로 또는 항원적으로 중성인 변경을 야기한다. 특히, 서열 식별 번호: 15에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역의 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내 Kabat 위치 94의 Arg은 Thr에 의해 선택적으로 교체될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 인간화된 항체 내의 두 잔기는 모두 교체될 수 있다.
서열 식별 번호: 12에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역의 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내 Kabat 위치 45의 Gln은 Lys에 의해 또는 유사한 특성을 갖는 아미노산 잔기에 의해 교체될 수 있고 또한 상기 치환은 돌연변이체 폴리펩타이드의 3차 구조에서 최소 변화를 생성하는, 또는 항원성 결정기에서의 최소 변화를 생성하는, 실질적으로 배좌적으로 또는 항원적으로 중성인 변경을 야기한다. 특히, 서열 식별 번호: 12에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역의 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내 Kabat 위치 45의 Gln은 Arg, Gln, 및 Asn으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산, 특히 Arg에 의해 교체될 수 있다.
서열 식별 번호: 12에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역의 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내 Kabat 위치 50의 Leu은 Lys에 의해 또는 유사한 특성을 갖는 아미노산 잔기에 의해 교체될 수 있고 또한 상기 치환은 돌연변이체 폴리펩타이드의 3차 구조에서 최소 변화를 생성하는, 또는 항원성 결정기에서의 최소 변화를 생성하는, 실질적으로 배좌적으로 또는 항원적으로 중성인 변경을 야기한다. 특히, 서열 식별 번호: 12에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역의 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내 Kabat 위치 50의 Leu은 Arg, Gln, 및 Asn으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산, 특히 Arg에 의해 교체될 수 있다.
서열 식별 번호: 12에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역의 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내 Kabat 위치 53의 Asn은 His 및 Gln에 의해 또는 유사한 특성을 갖는 아미노산 잔기에 의해 교체될 수 있고 또한 상기 치환은 돌연변이체 폴리펩타이드의 3차 구조에서 최소 변화를 생성하는, 또는 항원성 결정기에서의 최소 변화를 생성하는, 실질적으로 배좌적으로 또는 항원적으로 중성인 변경을 야기한다. 특히, 서열 식별 번호: 12에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역의 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내 Kabat 위치 53의 Asn은 Gln, His, Lys 및 Arg으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산에 의해 교체될 수 있다.
서열 식별 번호: 12에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역의 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내 Kabat 위치 87의 Tyr은 Phe에 의해 또는 유사한 특성을 갖는 아미노산 잔기에 의해 교체될 수 있고 또한 상기 치환은 돌연변이체 폴리펩타이드의 3차 구조에서 최소 변화를 생성하는, 또는 항원성 결정기에서의 최소 변화를 생성하는, 실질적으로 배좌적으로 또는 항원적으로 중성인 변경을 야기한다. 특히, 서열 식별 번호: 12에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역의 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내 Kabat 위치 87의 Tyr은 Leu, Val, Ile, 및 Ala으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산, 특히 Leu에 의해 교체될 수 있다.
하나 이상의 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 내에 끼워진 비인간 기원의 적어도 하나의 CDR을 포함하는, 이렇게 수득된 가변 영역은 그 후 인간 또는 영장류 근원 항체로부터 유래된 불변 영역, 특히 인간 IgG4 또는 κ 불변 영역 각각과 조합될 수 있다. 상기 IgG4 불변 영역은 예를 들어, 힌지 영역 내 위치 228의 세린을 프롤린으로 바꿈으로써 변형될 수 있다 (HuIgG4 Ser-Pro). 이 돌연변이는 사슬간(interchain) 디설파이드 결합을 안정화시키고 또한 본래의 인간 IgG4 제조에서 발생할 수 있는 하프 분자(half molecule)의 형성을 막는다. IgG4 불변 영역은 서열 식별 번호: 16에 나타낸 바와 같이 위치 439의 말단 Lys의 결실에 의해 추가로 변형될 수 있다.
상기 변형된 가변 영역은 예를 들어, 오버래핑(overlapping) PCR 재조합과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 키메라 항체를 위한 발현 카세트, C2 ChVH AF 및 C2 ChVK는 요구되는 서열에 대해 프레임워크 영역의 돌연변이생성(mutagenesis)을 위한 주형으로 사용될 수 있다. 돌연변이생성 프라이머 쌍의 세트는 변경되어야 할 영역을 포함하여 합성된다. 생산된 인간화된 VH 및 VK 발현 카세트는 당업계에 공지된 적절한 클로닝 벡터, 예를 들어, pUC19 등에 클로닝될 수 있다. 상기 전체 DNA 서열이 각 VH 및 VK에 대해 정확한지를 확인한 후, 변형된 중쇄 및 경쇄 V-영역 유전자를 발현 카세트로서 클로닝 벡터로부터 잘라내었다. 이들은 그 후 인간 IgG4 Ser-Pro 또는 κ 불변 영역을 각각 포함하는 pSVgpt 및 pSVhyg와 같은 적절한 발현 벡터로 옮겨질 수 있다.
발현 벡터
발현 벡터 pSVgpt는 pSV2 gpt (Mulligan 및 Berg, 1980)를 기반으로 하고 또한 세균 세포의 선택을 위한 암피실린 저항성 유전자, 포유류 세포의 선택을 위한 gpt 유전자, 쥐 중쇄 면역글로불린 인핸서 영역, 불변 영역 유전자를 인코드하는 게놈 서열 및 SV40 폴리 A 서열을 포함한다. 발현을 위한 중쇄 가변 영역은 HindⅢ 내지 BamHI 절편으로서 삽입된다.
발현 벡터 pSVhyg는 세균 세포의 선택을 위한 암피실린 저항성 유전자, 포유류 세포의 선택을 위한 hyg 유전자, 쥐 중쇄 면역글로불린 인핸서 영역, 카파 영역 유전자를 인코드하고 또한 카파 인핸서를 포함하는 게놈 서열 및 SV40 폴리 A 서열을 포함한다. 발현을 위한 경쇄 가변 영역은 HindⅢ 내지 BamHI 절편으로서 삽입된다.
그 후 발현 벡터 내의 인간화된 VH 및 VK를 위한 DNA 서열이 정확한지 여부가 확인된다.
항체 생산을 위해 인간화된 중쇄 및 경쇄 발현 벡터는 예를 들어, NS0 세포와 같이 당업계에 알려진 적절한 생산 세포주 내에 도입될 수 있다. 발현 벡터의 도입은 전기천공(electroporation)을 통한 공동-트랜스펙션(co-transfection) 또는 당업계에서 가능한 임의의 다른 적합한 형질전환 기술에 의해 달성될 수 있다. 그 후 항체 생산 세포주가 선택되고, 증대되고, 또한 인간화된 항체가 정제될 수 있다. 상기 정제된 항체는 그 후 SDS-PAGE와 같은 표준 기술에 의해 분석될 수 있다.
개선된 친화도, 특이성, 안정성을 갖는 항체
마우스 C2 항체의 CDRL2 서열("KVSNRFS")은 항체 활성에 유해하게 영향을 미치지 않으면서 약간 변형될 수 있다. 보존적 치환은 위치 50의 K에 대해 R로 또한 위치 53의 N에 대해 S로의 교환을 통해 이루어질 수 있다. 따라서 두 선택적 CDRL2 서열은 각각 "RVSNRFS" 및 "KVSSRFS"이다. 이들은 각각 C2 VK-R 및 C2 VK-S로서 어떠한 변화 없이 쥐 VK 서열 내부로 삽입된다.
본원에서 전술된 바와 같은 본 발명의 항체 또는 이의 절편의 친화도, 특이성 및 안정성은 그의 당화(glycosylation) 프로파일 또는 패턴의 변화에 의해 변형되어 개선된 치료적 능력을 야기할 수 있다.
이 당화 패턴 내 변화를 달성하기 위해, 숙주 세포는 이분(bisecting) GlcNAc를 운반하는 복합체 N-링크된 올리고당을 증가시키는 바람직한 범위의 당단백-변형 글리코실 트랜스퍼라아제(glycoprotein-modifying glycosyl transferase) 활성을 발현할 수 있도록 조작될 수 있다. 또한, 당단백의 변형된 당형태(glycoform), 예를 들어 전체 항체 분자를 포함하는 항체, 항체 절편, 또는 향상된 Fc-매개된 세포적 세포독성을 갖는, 면역글로불린의 Fc 영역에 균등한 영역을 포함하는 융합 단백질이 수득될 수 있다.
변형된 당화 패턴을 갖는 항체의 수득 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, EP 1071700, US2005272128, Ferrara 등 (2006) J Biol Chem 281(8), 5032-5036); Ferrara 등 (2006) Biotechnology and Bioengineering 93(5), 851-861에 기술되어 있다.
약제학적 제제 및 투여
본 발명의 항체, 특히 본 발명의 단일클론성 항체는 생리학적으로 허용가능한 제형으로 조제될 수 있고, 공지된 기술을 사용하여 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 작용적으로 균등한 모든 항체 또는 이의 작용부를 포함하는 본원에서 전술된 바와 같은 본 발명의 항체, 특히, 작용적으로 균등한 모든 항체 또는 이의 작용부를 포함하는 단일클론성 항체는 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 조합되어 치료적 조성물을 형성한다. 적절한 약제학적 담체, 희석제 및/또는 부형제는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 인산염 완충 염수 용액, 물, 유/수 에멀션과 같은 에멀션, 다양한 형태의 습윤제, 멸균 용액 등을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물의 제형화는 당업자에게 공지된 규격 방법론에 따라 달성될 수 있다.
본 발명의 조성물은 적절한, 약제학적 유효량의 고체, 액체 또는 에어로졸의 형태로 대상에게 투여될 수 있다. 고체 조성물의 예는 환제, 크림 및 삽입가능한 투여량 유닛(implantable dosage unit)을 포함한다. 환제는 경구로 투여될 수 있다. 치료 크림은 국소적으로 투여될 수 있다. 삽입가능한 투여량 단위는 국부적으로(locally), 예를 들어, 종양 사이트에 투여될 수 있고, 또는 상기 치료 조성물의 전신 방출을 위해, 예를 들어, 피하적으로 삽입될 수 있다. 액체 조성물의 예는 근육내, 피하, 정맥내, 동맥내 주입을 위해 적응(adapt)된 제형, 및 국소 및 안내(intraocular) 투여를 위한 제형을 포함한다. 에어로졸 제형의 예는 폐에 대한 투여를 위한 흡입기 제형을 포함한다.
상기 조성물은 표준 투여 루트(route)에 의해 투여될 수 있다. 일반적으로, 상기 조성물은 국소, 경구, 직장, 비강, 진피내(interdermal), 복막내, 또는 비경구적(예를 들어, 정맥내, 피하, 또는 근육내) 루트로 투여될 수 있다. 추가로, 상기 조성물은 생분해성 폴리머와 같은 서방성(sustained release) 매트릭스 내로 함침될 수 있고, 상기 폴리머는 전달이 희망되는 곳의, 예를 들어, 종양 사이트 부근에 삽입(implant)될 수 있다. 상기 방법은 단일 용량의 투여, 미리결정된 시간 간격에서의 반복 용량의 투여, 및 미리결정된 시기에 대한 지속 투여(sustained administration)를 포함한다.
본원에서 사용된 서방성 매트릭스는 재료, 일반적으로 효소적 또는 산/염기 가수분해 또는 용해(dissolution)에 의해 분해가능한 폴리머로 제조된 매트릭스이다. 체내에 삽입되면, 상기 매트릭스는 효소 및 체액에 의해 작용한다. 상기 서방성 매트릭스는 리포좀, 폴리락티드(폴리락티드산), 폴리글리콜리드(글리콜산의 폴리머), 폴리락티드 코-글리콜리드 (락트산과 글리콜산의 코폴리머), 폴리안히드라이드(polyanhydride), 폴리(오르토)에스테르, 폴리펩타이드, 히알루론산, 콜라겐, 황산콘드로이틴, 카르복실산, 지방산, 인지질, 다당류, 핵산, 폴리아미노산, 페닐알라닌, 타이로신, 이소류신과 같은 아미노산, 폴리뉴클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘과 같은 생체적합한 재료에 의해 바람직하게 선택된다. 바람직한 생분해성 매트릭스는 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 또는 폴리락티드 코-글리콜리드 (락트산 및 글리콜산의 코폴리머)의 어느 하나인 매트릭스이다.
상기 조성물의 투여량이 예를 들어, 처리될 병태, 사용되는 특정 조성물, 및 환자의 체중, 키, 성별 및 일반적 건강 상태와 같은 다른 임상적 요소, 체표면적, 투여될 특정 화합물 또는 조성물, 동시에 투여될 다른 약물, 및 투여 경로와 같은 여러 요소에 의존적일 것임은 당업자에게 잘 알려져 있다.
상기 조성물은 생물학적 활성 물질 또는 화합물, 특히 산화적 스트레스에 대한 화합물, 항-자가사멸 화합물, 금속 킬레이터, 피렌제핀 및 대사물과 같은 DNA 수복 억제제, 3-아미노-1-프로판술폰산(3APS), 1,3-프로판디술포네이트(1,3PDS), α-세크레타아제 활성제, β- 및 γ-세크레타아제 억제제, 타우 단백질, 신경전달물질, β-시트 파괴제, 아밀로이드 베타 제거/고갈 세포 성분에 대한 유인물질, 피루글루타메이트화 아밀로이드 베타 3-42를 포함하는 N-말단 잘린 아밀로이드 베타의 억제제, 항-염증 분자, 예를 들어, 클로자핀, 지프라시돈, 리스페리돈, 아리피프라졸 또는 올란자핀과 같은 "비전형적 항정신병약" 또는 타크린, 리바스티그민, 도네페질, 및/또는 갈란타민과 같은 콜린에스테라아제 억제제(ChEI), M1 작용제 및 임의의 아밀로이드 또는 타우 변형 약물 및 예를 들어, 비타민 B12, 시스테인, 아세틸콜린의 전구체, 레시틴, 콜린, 은행(Ginkgo biloba), 아세틸-L-카르니틴, 이데베논(idebenone), 프로펜토필린(propentofylline) 또는 크산틴 유도체와 같은 영양 보조제를 포함하는 다른 약물로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 다른 조성물은 본 발명의 항체 및, 선택적으로, 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 부형제 및 질환의 치료를 위한 과정을 조합하여 투여될 수 있다.
단백질성(Proteinaceous) 약제학적 활성 물질은 용량당 1 ng 내지 10 ㎎의 양으로 존재할 수 있다. 일반적으로, 투여의 투약 계획(regime)은 본 발명의 항체의 0.1㎍ 내지 10㎎의 범위 내, 특히 1.0㎍ 내지 1.0㎎ 내에, 보다 특히 1.0㎍ 내지 100㎍ 내에 있어야 하며, 모든 개별적 수는 본 발명의 일부가 되는 범위 내에 있어야 한다. 만약 투약이 지속 주입을 통해 일어난다면, 보다 바람직한 투여량은 시간당 킬로그램 체중당 0.01㎍ 내지 10 mg 유닛의 범위 내에 있을 수 있으며, 이들 범위에 해당되는 모든 개별적 수는 본 발명의 일부가 되는 범위 내에 있을 수 있다.
투여는 일반적으로 비경구적으로 예를 들어, 정맥내로일 것이다. 비경구적 투여를 위한 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀션을 포함한다. 비수성 용매는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸 올리에이트(ethyl oleate)와 같은 주사가능한 유기 에스테르를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 수성 용매는 염수 및 완충 매체를 포함하는 물, 알코올/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액으로 이루어지는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 비경구적 비히클(vehicle)은 염화나트륨 용액, 링거의 덱스트로오스(Ringer's dextrose), 덱스트로오스 및 염화나트륨, 락테이트가 첨가된 링거(lactated Ringer's), 또는 고정유(fixed oil)를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충제(nutrient replenisher), (링거의 덱스트로오스를 기반으로 하는 것들과 같은) 전해질 보충제 및 그 외를 포함한다. 예를 들어, 항균제(antimicrobial), 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스(inert gas) 등과 같은 방부제도 존재할 수 있다.
약제학적 조성물은 예를 들어, 혈청 알부민 또는 면역글로불린, 특히 인간 기원의 혈청 알부민 또는 면역글로불린과 같은 단백질성 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물 내에는 의도된 용도에 따라 추가의 생물학적 활성제가 존재할 수 있다.
결합 타겟이 뇌 내에 위치될 때, 본 발명의 어떤 구체예는 상기 항체 또는 이의 활성 절편을 제공하여 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier)을 가로지른다. 어떤 신경퇴행성 질환은 혈액-뇌 장벽의 투과성의 증가와 관련되어, 항체 또는 이의 활성 절편이 뇌 내에 쉽게 도입될 수 있다. 혈액-뇌 장벽이 손상없이 존재할 때, 이를 가로질러 분자를 수송하기 위한 물리적 방법, 지질-기반 방법, 및 수용체 및 채널-기반 방법을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 여러 기존에 알려져 있는 수단이 존재한다.
혈액-뇌 장벽을 가로질러 항체 또는 이의 활성 절편을 수송하기 위한 물리적 방법은, 혈액-뇌 장벽을 전체적으로 우회(circumventing)하거나 또는 혈액-뇌 장벽에 개구(opening)를 생성하는 것을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 우회 방법은 뇌 내에 직접 주사하는 것 (예를 들어 Papanastassiou 등, Gene Therapy 9: 398-406 (2002) 참조) 및 뇌 내에 전달 장치를 삽입하는 것 (예를 들어, Gill 등, Nature Med. 9: 589-595 (2003); 및 Gliadel Wafers™, Guildford Pharmaceutical 참조)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 장벽 내에 개구를 생성하는 방법은 초음파 (예를 들어, 미국 특허 공개 제 2002/0038086호 참조), 삼투압 (예를 들어, 고장(hypertonic) 만니톨의 투여에 의해 (Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989))), 예를 들어 브래디키닌(bradykinin) 또는 투과제(permeabilizer) A-7에 의한 투과화(permeabilization) (예를 들어, 미국 특허 제 5,112,596호, 제 5,268,164호, 제 5,506,206호, 및 제 5,686,416호 참조), 및 항체 또는 항원-결합 절편을 인코드하는 유전자를 함유하는 벡터와 혈액-뇌 장벽을 걸치는 뉴런의 트랜스펙션 (예를 들어, 미국 특허 공개 제 2003/0083299호 참조)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
혈액-뇌 장벽을 가로질러 항체 또는 이의 활성 절편을 수송하는 지질-기반 방법은 혈액-뇌 장벽의 혈관 내피 상 수용체에 결합하는 항체 결합 절편에 커플되는 항체 또는 이의 활성 절편을 리포좀 내에 캡슐화하는(encapsulating) 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제 20020025313호 참조), 및 저밀도 지단백 입자 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제 20040204354호 참조) 또는 아포지단백 E (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제 20040131692호 참조)로 항체 또는 이의 활성 절편을 코팅하는 것을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
혈액-뇌 장벽을 가로질러 항체 또는 이의 활성 절편을 수송하는 수용체 및 채널-기반 방법은 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키기 위해 글루코코르티코이드 차단제를 사용하는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제 2002/0065259호, 제 2003/0162695호, 및 제 2005/0124533호 참조); 칼륨 채널을 활성화하는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제 2005/0089473호 참조), ABC 약물 수송자(transporter)를 억제하는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제 2003/0073713호 참조); 항체를 트랜스페린으로 코팅하여 하나 이상의 트랜스페린 수용체의 활성을 조절(modulate)하는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제 2003/0129186호 참조), 및 항체를 양이온화하는 것 (예를 들어, 미국 특허 제 5,004,697호 참조)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
검출/진단
추가의 구체예에서 본 발명은, 아밀로이드-관련 질환 또는 병태의 검출 및 진단을 위한 방법 및 키트를 제공한다. 이들 방법은 생물학적 샘플 내에서 또는 인 시투 조건에서 물질을 검출 또는 정량하기 위해 일반적으로 사용되는 공지의 면역학적 방법을 포함한다.
환자에서의 아밀로이드-관련 질환 또는 병태의 진단은 샘플 내 또는 인 시투의 아밀로이드 단백질의 에피토프에의 단일클론성 항체 또는 이의 활성 절편의 면역특이적 결합을 검출함으로써 달성될 수 있으며, 이는 아밀로이드 단백질을 함유하는 것으로 추측되는 샘플 또는 특정 신체 부분 또는 신체 구역을 아밀로이드 단백질의 에피토프에 결합하는 항체와 접촉시키는 것, 상기 항체가 상기 아밀로이드 단백질에 결합하여 면역복합체를 형성하도록 하는 것, 상기 면역복합체의 형성을 검출하는 것, 및 상기 면역복합체의 존재 또는 부재를 상기 샘플 또는 특정 신체 부분 또는 구역 내의 아밀로이드 단백질의 존재 또는 부재와 서로 관련시키는 것을 포함한다.
아밀로이드-관련 질환 또는 병태의 진단에 사용될 수 있는 생물학적 샘플은 예를 들어, 혈청, 혈장, 타액, 소화분비물, 점액, 척수액, 림프액 등과 같은 유체, 또는 신경, 뇌, 심장 또는 혈관 조직과 같은 유기체로부터 수득한 조직 또는 세포 샘플이다. 샘플 내의 아밀로이드 단백질의 존재 또는 부재를 측정하기 위해, 예를 들어, 검출을 위한 이차 시약을 사용하는 간접적 검출 방법을 사용하는 어세이, ELISA's 및 면역침강 및 응집(agglutination) 어세이와 같은 당업계의 보통의 기술자에게 알려진 임의의 면역어세이 (Harlow 및 Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988 555-612) 참조)가 사용될 수 있다. 이들 어세이의 상세한 설명은 예를 들어, Maertens 및 Stuyver의 WO96/13590, Zrein 등 (1998), 및 WO96/29605에 주어진다.
인 시투 진단을 위해, 항체 또는 이의 모든 활성부 및 작용부는 예를 들어, 정맥내, 비강내, 복막내, 뇌내, 동맥내 주사와 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 진단될 생명체에 투여될 수 있으며, 이로서 본 발명의 항체와 아밀로이드 단백질의 에피토프 영역 사이의 특이적 결합이 발생할 수 있다. 항체/항원 복합체는 상기 항체 또는 이의 작용적 절편에 부착된 표지(label)를 통해 검출될 수 있다.
진단적 적용에 사용되는 면역어세이는 일반적으로 검출을 위해 표지된 항원, 항체, 또는 이차 시약에 의존한다. 이들 단백질 또는 시약은 효소, 방사능동위원소, 및 형광물질, 발광물질 및 콜로이드 금 및 라텍스 비드와 같은 착색 입자를 포함하는 발색성(chromogenic) 물질을 포함하는 일반적으로 당업자에게 알려진 화합물로 표지될 수 있다. 이들 중, 방사능 표지는 대부분의 모든 유형의 어세이를 위해 또한 대부분의 변형물과 함께 사용될 수 있다. 효소-컨쥬게이트된 표지는 방사능활성이 회피되어야할 때 또는 빠른 결과가 필요할 때 특히 유용하다. 형광 색소(fluorochrome)는, 그들의 사용에 값비싼 장비가 요구됨에도 불구하고, 매우 민감한 검출 방법을 제공한다. 이들 어세이에 유용한 항체는 단일클론성 항체, 다클론성 항체, 및 친화도 정제된 다클론성 항체를 포함한다.
또는, 상기 항체는 단백질 A 또는 G와 같은 면역글로불린 또는 이차 항체에 대한 친화도를 갖는 표지된 물질과의 작용에 의해 간접적으로 표지될 수 있다. 상기 항체는 이차 물질과 컨쥬게이트될 수 있고, 상기 항체에 컨쥬게이트된 상기 이차 물질에 대한 친화도를 갖는 표지된 삼차 물질(third substance)로 검출될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 비오틴에 컨쥬게이트될 수 있고, 상기 항체-비오틴 컨쥬게이트는 표지된 아비딘 또는 스트렙트아비딘을 사용하여 검출될 수 있다. 유사하게, 상기 항체는 합텐에 컨쥬게이트 될 수 있고, 상기 항체-합텐 컨쥬게이트는 표지된 항-합텐 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
당업자는 이들 및 다른 적절한 표지가 본 발명에 따라 사용될 수 있음을 알 것이다. 항체 또는 이의 절편에의 이들 표지의 결합은 당업자에게 일반적으로 알려진 표준 기술을 이용하여 달성될 수 있다. 일반적인 기술은 Kennedy, J. H., 등, 1976 (Clin. Chim. Acta 70:1-31), 및 Schurs, A. H. W. M., 등 1977 (Clin. Chim Acta 81:1-40)에 의해 기재되었다. 후자(latter)에 언급된 커플링 기술은 글루타르알데하이드 방법, 과요오드산염(periodate) 방법, 디말레이미드 방법, 및 그 외이고, 이들 모두는 본원에 참조로서 삽입되었다.
여기서, 통용되는 면역어세이는 분석물의 존재를 검출하기 위해 이중 항체 방법을 사용한다. 상기 항체는 검출가능한 표지로 표지된 이차 항체와의 반응성에 의해 간접적으로 표지된다. 상기 이차 항체는 바람직하게는 단일클론성 항체가 유래된 동물의 항체에 결합하는 것이다. 바꿔 말하면, 만약 상기 단일클론성 항체가 마우스 항체라면, 표지된 이차 항체는 항-마우스 항체이다. 이하에 기재된 어세이에서 사용되는 단일클론성 항체에 대해, 이 표지는 바람직하게는 항체-코팅된 비드, 특히 자성 비드이다. 본원에 기재된 면역어세이에서 사용되는 다클론성 항체에 대해, 상기 표지는 바람직하게는 방사성(radioactive), 형광 또는 전기화학발광 물질과 같은 검출가능한 분자이다.
분석물의 존재의 빠른 측정에 대해 유연하게 변경되는 것에서 종종 빠른 포맷 시스템으로 언급되는, 선택적인 이중 항체 시스템(alternative double antibody system)은 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있다. 상기 시스템은 항체와 분석물 간에 높은 친화도를 요구한다. 본 발명의 일 구체예에 따라, 아밀로이드 단백질의 존재는 각각 아밀로이드 단백질에 특이적인 한쌍의 항체를 사용하여 측정된다. 상기 한쌍의 항체 중 하나는 "검출자 항체(detector antibody)"로서 본원에서 언급되고, 상기 한쌍의 항체 중 다른 하나는 "포획 항체(capture antibody)"로서 본원에서 언급된다. 본 발명의 단일클론성 항체는 포획 항체 또는 검출자 항체 중 어느 것으로든 사용될 수 있다. 본 발명의 단일클론성 항체는 단일 어세이에서 함께, 포획 및 검출자 항체 모두로서도 사용될 수 있다. 따라서 본 발명의 일 구체예는 생물학적 유체인 샘플 내에서 아밀로이드 단백질을 검출하기 위해 이중 항체 샌드위치 방법을 사용한다. 이 방법에서, 상기 분석물(아밀로이드 단백질)은 검출자 항체와 포획 항체 사이에 샌드위치되고, 상기 포획 항체는 고체 지지체 상에 불가역적으로 고정된다. 상기 검출자 항체는 항체-분석물 샌드위치의 존재를 확인하여 상기 분석물의 존재를 확인하기 위해 검출가능한 표지를 함유한다.
폴리스티렌의 마이크로타이터(microtiter) 플레이터, 테스트 튜브, 자성, 플라스틱 또는 유리 비드 및 슬라이드를 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 대표적인 고체상 물질(solid phase substance)은 방사면역어세이(radioimmunoassay) 및 효소 면역어세이 분야에 공지되어 있다. 항체를 고체상에 커플링시키기 위한 방법 또한 당업자에게 공지되어 있다. 보다 최근에, 나일론, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 유리섬유 및 다른 다공성 폴리머와 같은 몇 가지의 다공성 물질이 고체 지지체로서 사용되어왔다.
본 발명은 또한 상기에 정의된 바와 같은 조성물을 포함하는, 생물학적 샘플 내의 아밀로이드 단백질을 검출하기 위한 진단 키트에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 상기에 정의된 바와 같은 조성물에 추가로, 상기에 정의된 바와 같은 검출 시약도 포함하는 후자(latter)의 진단 키트에 관한 것이다. 용어 "진단 키트"는 일반적으로 당업계에 공지된 모든 진단 키트를 나타낸다. 보다 특히, 후자의 용어는 Zrein 등 (1998)에 기술된 바와 같은 진단 키트를 나타낸다.
본 발명의 또 다른 목적은 아밀로이드-관련 질환 및 병태의 검출 및 진단을 위한 본 발명의 항체를 포함하는 신규한 면역프로브(immunoprobe) 및 테스트 키트를 제공하는 것이다. 면역프로브를 위해, 상기 항체는 직접적으로 또는 간접적으로 적절한 리포터 분자, 예를 들어 효소 또는 방사성 핵종(radionuclide)에 부착된다. 상기 테스트 키트는, 본 발명의 하나 이상의 항체를 담는 용기, 및 아밀로이드 단백질에 결합하여 면역복합체를 형성하기 위해 상기 항체를 사용하기 위한 및 상기 면역복합체의 존재 또는 부재(absence)가 아밀로이드 단백질의 존재 또는 부재와 서로 관련이 있으므로 상기 면역복합체의 형성을 검출하기 위한 설명서를 포함한다.
실시예
재료
마우스 단일클론성 항체 ACI-O1-Ab7C2(본 출원 전체적으로 "mC2"로 명명되었으며 또한 인간화된 C2 항체에 대해 hC2로 명명됨)의 개발 및 제조는 2005년 12월 12일에 출원된 동시계류중인 출원 EP 05 02 7092.5 내에 기재되며, 이의 개시는 본원에 참조로서 삽입된다.
동시계류중인 출원 제 EP05027092.5호의 마우스 단일클론성 항체 ACI-O1-Ab7C2(본 출원 전체적으로 "mC2"로 명명되었으며 또한 인간화된 C2 항체에 대해 hC2로 명명됨)를 생산하는 하이브리도마 세포 FP-12H3-C2는, 부다페스트 조약의 규정 하에, 브라운슈바이그 38124, 마쉐로데르 베그 1 비, 브라운슈바이그 소재 "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)"에 2005년 12월 1일 기탁되어 접근 번호 DSM ACC2750을 부여받았다.
하이브리도마 세포는 10% 우태아혈청 및 항생제(페니실린/스트렙토마이신)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle Medium)에서 배양하였다. 생산된 항체의 이소타입을 체크하였으며 기대한 바와 같이 마우스 IgG2b/카파로 밝혀졌다.
어세이(Assay)
아밀로이드 베타에 대한 결합을 위한 ELISA는 C2 항체의 역가(potency)의 믿을만한 수치를 제공하였다. 양성 대조군 항체는 쥐 FP-12H3-C2 항체(Genovac 제품번호: AK379/01), 및 표준 케미콘(Chemicon) 항체 1560(제품번호: 0508008791).
인간 불변 영역의 선정
면역계 동원(recruitment)은 임상적 항체 후보로서 바람직하지 않으므로, 중쇄를 위해 선택된 인간 불변 영역은 힌지 영역 내 위치 228의 세린이 프롤린으로 바뀌도록 변형된 인간 IgG4이다(HuIgG4 Ser-Pro). 이 돌연변이는 사슬간 디설파이드 결합을 안정화시키고 또한 본래의 인간 IgG4 제조에서 발생할 수 있는 하프 분자의 형성을 막을 것이다. 생산 세포주로부터 발현된 항체는 또한 말단 라이신이 제거되어 있을 것이다. 인간 불변 영역 HuIgG4 Ser-Pro 및 인간 카파의 서열은 서열 식별 번호: 17 및 서열 식별 번호: 14에 각각 주어진다.
실시예 1 항체 가변 영역의 클로닝 및 시퀀싱(Sequencing)
3 x 106 하이브리도마 세포 (하나의 T175 플라스크)로부터의 총 RNA는 키아겐 알엔이지 미니 키트(Qiagen RNeasy mini kit, 카탈로그 번호: 74104)를 사용하여 준비하였다. RNA는 50μL 물로 용리하였고 1.2% 아가로스 겔 상에서 체크하였다. 세포로부터의 조건 배지(conditioned medium)는 보존하였으며, 항체 활성 어세이에서 테스팅을 위한 샘플로서 사용하였다.
VH 및 VK cDNA는 마우스 IgG 및 κ 불변 영역 프라이머와 역전사효소(reverse transcriptase)를 사용하여 준비하였다. 제1 스트랜드 cDNA는 다수의 신호 서열 프라이머 세트를 사용하는 PCR에 의해 증폭시켰다. 상기 증폭된 DNA는 겔-정제하였으며 또한 벡터 pGem® T Easy (Promega)내에 클로닝하였다. 수득된 VH 및 VK 클론은 PCR에 의해 원하는 크기의 인서트(insert)에 대해 스크리닝하였으며, 선택된 클론의 DNA 서열은 자동화된 DNA 시퀀싱에 의해 측정하였다. 서열 내 상보성 결정 영역(CDR)의 위치는 다른 항체 서열을 참조하여 측정하였다 (Kabat EA 등, 1991). 항체 가변 영역에 대한 Kabat의 계수 규정(numbering convention)은 본 출원 전체에서 사용된다; 따라서 잔기 수는 완전한 직선상 수(strict linear number)와 상이할 수 있다.
mC2 VK에 대한 DNA 서열 및 유추되는(deduced) 아미노산 서열은 서열 식별 번호: 29 및 27 각각에 나타낸다. 네 개의 클론이 이 동일한 생산성 서열을 나타내었다. 하이브리도마 융합 파트너로부터 기인하는 비생산성 이상형(aberrant) VK 서열 또한 다수의 클론에서 발견되었다.
mC2 VH를 위해, 두 상이한 생산성 서열이 단리(isolate)되었다. mC2 VH AF 서열(서열 식별 번호: 30 참조)은 총 29개의 클론에서 발견되는데, 각각의 클론에서 14 단일 염기쌍 변화가 있었다. mC2 VH B 서열은 총 8개의 클론에서 발견되었다. 이들 중 다섯은 다수(major)의 서열을 나타내고, 다른 3 클론은 이의 이형이다. 이들 유사한 VH B 서열은 PCR 증폭의 인공산물(artifact)로서 발생되었을 수 있다. 비생산성 이상형 VH는 C2 하이브리도마로부터 또한 수득되었고, 불완전 V-D-J 결합(defective V-D-J joining)에 기인한 것으로 생각된다.
정확한 활성 mC2 VH를 측정하기 위해, 정확한 항체 활성이 테스트되어야 하는 mC2 VK와 조합된 두 상이한 서열 AF 및 B를 갖는 두 키메라 항체를 준비했다.
실시예 2 키메라 항체 유전자의 구축
가장 일반적인 형태인 인간 키메라 항체는 쥐 (또는 다른 비인간) 가변 영역에 연결된 인간 불변 영역으로 이루어진다. 키메라 항체는, 첫째로 정확한 가변 영역이 식별되었는지 확인하기 위한, 둘째로 항원 결합 어세이에서 동일한 이펙터 작용을 갖는 대조군 항체로서 사용하기 위한 인간화된 또는 조작된 항체와 동일한 이차 검출 시약을 사용하는 매우 유용한 수단을 제공하고, 또한 항체에 대한 특정 타겟을 참조하여 인간 불변 영역의 약동학 및 기타 특성을 조사하기 위해 사용될 수도 있다.
발현 벡터 pSVgpt 내 HuIgG4(Ser-Pro) 불변 영역에 연결된 mC2 VH AF 또는 mC2 VH B 가변 영역으로 이루어지는 두 키메라 중쇄 발현 벡터를 구축하였다. 이는 pSV2 gpt (Mulligan 및 Berg, 1980)를 기반으로 하며, 또한 세균 세포 내 선택을 위한 암피실린 저항 유전자, 포유류 세포 내 선택을 위한 gpt 유전자, 쥐 중쇄 면역글로불린 인핸서 영역, 불변 영역 유전자를 인코드하는 게놈 서열 및 SV40 폴리 A 서열을 포함한다. 발현을 위한 중쇄 가변 영역은 Hind Ⅲ 내지 BamHI 절편으로서 삽입된다.
발현 벡터 pSVhyg 내 인간 C 카파 불변 영역에 연결된 C2 VK로 이루어지는 키메라 경쇄 벡터를 구축하였다 (Hieter PA 등, 1980). pSVhyg는 세균 세포 중에서 선택을 위한 암피실린 저항 유전자, 포유류 세포 중에서 선택을 위한 hyg 유전자, 쥐 중쇄 면역글로불린 인핸서 영역, 카파 불변 영역 유전자를 인코드하고 또한 카파 인핸서를 포함하는 게놈 서열 및 SV40 폴리 A 서열을 포함한다. 발현을 위한 경쇄 가변 영역은 HindⅢ 내지 BamHI 절편으로서 삽입된다.
쥐 C2 VH 및 VK 서열을 위한 발현 카세트는, 주형으로서 벡터 VH-PCR1 및 VK-PCR1를 사용하여, 리더 신호 펩타이드(leader signal peptide), 리더 인트론 및 쥐 면역글로불린 프로모터를 포함하는 5' 플랭킹 서열, 및 스플라이스(splice) 사이트 및 인트론 서열을 포함하는 3' 플랭킹 서열을 첨가함으로써 구축하였다 (Riechmann 등, 1988). 키메라 발현 벡터 내의 VH 및 VK를 위한 DNA 서열이 정확한가 여부를 확인하였다. 상기 발현 카세트 내 VH 및 VK 유전자의 DNA 및 아미노산 서열을 도 1 및 2에 나타낸다.
실시예 3 키메라 항체의 발현
3.1 지속적(stable) 세포주에서의 발현
항체 발현을 위한 숙주 세포주인 면역글로불린을 생산하지 않는 마우스 골수종(myeloma)인 NS0은 European Collection of Animal Cell Cultures(Porton UK)로부터 수득하였다 (ECACC No 85110503). 중쇄 및 경쇄 발현 벡터는 전기천공법에 의해 NS0 세포 내에 동시-트랜스펙트(co-transfect)하였다. gpt 유전자를 발현하는 콜로니는 10% 우태아 혈청(FBS), 0.8 ㎍/㎖ 마이코페놀산(mycophenolic acid) 및 250 ㎍/㎖ 잔틴(xanthine)이 첨가된 DMEM 내에서 선택하였다. 트랜스펙트된 세포 클론은 인간 IgG에 대한 ELISA에 의해 인간 항체의 생산에 대해 스크린하였다. 항체를 분비하는 세포주를 증대시키고 최고의 생산 세포주를 선택하여 액체 질소 내에서 동결하였다. 각 항체에 대한 최고의 생산 세포주를 5% FBS만을 갖는 상기 배지에서 증대시켰다. 키메라 항체를 Prosep®-A (Bioprocessing Ltd)를 사용하여 정제하였다. 농도는 인간 IgGκ 항체에 대한 ELISA에 의해 측정하였다. 상기 항체는 또한 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
3.2 키메라 항체의 일과성(transient) 발현
상이한 키메라 항체의 테스팅을 신속하게 처리하기 위해, 테스팅을 위한 재조합 항체를 함유하는 작은 양의 세포 상청액을 재빨리 생산하기 위한 일과성 발현을 사용하였다. 일과성 발현을 위해, mC2 VH 및 VK 발현 카세트를 pcDNA3.1 (Invitrogen)를 기반으로 한 벡터에 옮겼다. 중쇄 벡터는 인간 IgG 불변 영역을 포함하였다. 경쇄 벡터는 인간 카파 불변 영역을 포함하였다. mC2 VH AF 및 mC2 VH B 둘 모두는 mC2 VK와 함께, 제조사에 의해 공급된 프로토콜에 따라 리포펙타민 2000 시약 (Lipofectamine 2000 reagent, Invitrogen 카탈로그 번호: 11668)으로 인간 배아 신장(HEK 298) 세포 내에 트랜스펙트시켰다. 트랜스펙션 3일 후 세포로부터 조건 배지를 수합하였다. 생산된 항체의 양을 인간 IgGκ 항체에 대한 ELISA에 의해 측정하였다.
실시예 4 키메라 C2 항체의 활성
4.1 일과성 트랜스펙션에 의해 생산된 키메라 C2 항체의 활성
두 상이한 키메라 항체에 대한 일과성 트랜스펙션으로부터의 조건 배지의 샘플을 아밀로이드 베타에의 결합에 대해 ELISA로 테스트하였다. 결과는 C2 VH AF가 정확한 서열인 것을 명확하게 나타내었다. C2 VH AF/C2 VK 키메라 항체는 어세이에서 잘 결합하였으나, C2 VH B/C2 VK는 어떠한 결합도 전혀 나타내지 않았다. 케미콘 1560 쥐 대조군 항체는 양호한 결합을 나타내었으나, 공급된 정제된 쥐 C2 항체에 의한 결합은 낮았다. 인간 불변 영역을 갖는 키메라 항체에 비하여 마우스 불변 영역을 갖는 쥐 항체에 대해 상이한 이차 항체가 사용되어 결과가 직접적으로 비교가능하지 않음을 유념해야한다. C2 하이브리도마로부터의 조건 배지가 어세이에서 좋은 결과를 나타내는 것을 이후에 발견하였다.
4.2 정제된 키메라 C2 항체의 활성
기술된 바와 같이 지속적 NS0 세포주로부터 두 상이한 C2 키메라 항체를 정제하고 아밀로이드 베타 ELISA를 사용하여 테스트하였다. 수득된 결과는 일과성으로 발현된 항체로 수득된 결과와 일치하였다. C2 ChVH AF/ChVK 항체는 ELISA에서 잘 결합하였으며, C2 ChVH B/ChVK 항체는 전혀 결합하지 않았다.
실시예 5 인간화된 C2 항체 유전자의 설계
mC2 VH 및 VK 아미노산 서열을 NCBI 및 Kabat 데이터베이스의 설치류 항체 VH 및 VK 서열과 비교하였다.
5.1 경쇄 가변 영역
mC2 VK에 가장 가까운 매치 마우스 생식 계열 유전자는 bb1, 로커스 MMU231201이다 (Schable 등, 1999). 모두 CDRL1 내에 위치된 두 아미노산만이 이 생식 계열 서열과 상이하다. 유사하지만 동일하지 않은 서열을 가지는 성숙한 쥐 항체가 발견된다. 몇몇은 동일한 CDRL2 및 동일한 CDRL3을 가지지만, mC2의 CDRL1은 독특하게 보인다. mC2 VK는 Kabat 서브그룹 MuVKII로 지정할 수 있다. mC2 VK의 위치 87은 서브그룹 내에 보다 일반적인 Y 라기보다 F이고, 이는 이 프레임워크 잔기가 항체 활성에 대해 중요할 것이라는 것을 나타낸다. 인간 생식 계열 VK 서열과의 비교는 서브그룹 VKII으로부터의 유전자가 mC2 VK에 대한 최고의 매치임을 나타낸다 (Cox 등, 1994). 인간화된 VK를 위한 수용체 프레임워크 서열을 제공하기 위해 인간 J 영역 HuJK1과 함께 서열 DPK15를 선택하였다.
네 개의 인간화된 VK 서열을 설계하였다. C2HuVK1은 인간 JK1 및 DPK 15로부터의 프레임워크를 갖는 mC2 VK CDR로 이루어진다. 버젼 2, 3 및 4에서 프레임워크 내 위치 45 또는 87 또는 둘 모두의 쥐 잔기는 치환되어 있다. 잔기 45는 CDR의 배좌를 지지하는 것에 관여할 수 있다. 잔기 87은 VH 및 VK 도메인의 경계에 위치된다. 따라서 이들 잔기는 항체 결합의 유지에 결정적일 수 있다. 경쇄 프레임워크 영역 내에 만들어진 변화 및 위치를 표 6에 나타낸다. 인간화된 서열과 mC2 VK 서열과의, 또한 DPK15와 인간 JK1과의 비교
5.2 중쇄 가변 영역
mC2 VH AF에 가장 가까운 매치 마우스 생식 계열 유전자는 VH7183, 로커스 AF120466이다 (Langdon 등, 2000). 비교는 도 3에 나타낸다. 9개의 아미노산이 이 생식 계열 서열과 상이하고, 대부분 CDR2 내에 위치된다. 동일한 또는 유사한 (하나의 잔기가 상이한) CDR1을 갖는 또는 유사한 (하나의 잔기가 상이한) CDR2를 갖는 성숙한 쥐 항체가 발견되었으나, 어떠한 것도 모든 세 CDR이 mC2 VH AF에 동일하지는 않았다. mC2 항체의 CDR3는 유별나게 짧은데, 단지 세 개의 잔기로 이루어진다. 그러나, 이 길이의 CDR3을 갖는 다른 항체가 데이터베이스에서 발견된다. mC2 VH AF는 Kabat 서브그룹 MuVHIIID로 지정할 수 있다. mC2 VH의 잔기 47은 보다 일반적인 W 라기보다 L이고, 또한 잔기 94는 보통의 R이라기보다 S이며, 이는 이 프레임워크 잔기가 항체 활성에 대해 중요할 것이라는 것을 나타낸다. 인간 생식 계열 VH 서열과의 비교는 서브그룹 VHIII로부터의 유전자가 mC2 VH에 대한 최고의 매치임을 나타낸다. 인간화된 VH를 위한 수용체 프레임워크 서열을 제공하기 위해 인간 J 영역 HuJH6과 함께 서열 DP54를 선택하였다.
네 개의 인간화된 VH 서열을 설계하였다. C2HuVH1은 HuJH6 및 DP54로부터의 프레임워크를 갖는 mC2 VH AF CDR로 이루어진다. 버젼 2, 3 및 4에서 프레임워크 내 위치 47 또는 94 또는 둘 모두의 쥐 잔기는 치환되어 있다. 프레임워크 2 내 잔기 47은 CDR과 및 VH 도메인과 모두 접촉하도록 한다. 잔기 94는 CDR의 배좌를 지지하는데 관여할 수 있다. 따라서 이들 잔기는 항체 결합의 유지에 결정적일 수 있다.
중쇄 프레임워크 영역 내에 만들어진 변화 및 위치를 표 7에 나타낸다.
실시예 6 인간화된 항체 유전자의 구축
오버래핑 PCR 재조합 방법에 의해 변형된 가변 영역을 구축하였다. 키메라 항체에 대한 발현 카세트인 C2 ChVH AF 및 C2 ChVK를 프레임워크 영역의 요구되는 서열로의 돌연변이생성을 위한 주형으로서 사용하였다. 변경될 영역을 포함하는 돌연변이생성 프라이머 쌍의 세트를 합성하였다. 생성된 인간화된 VH 및 VK 발현 카세트를 pUC19 내에 클로닝하고 전체 DNA 서열이 각 VH 및 VK에 대해 정확한지를 확인하였다. 변형된 중쇄 및 경쇄 V-영역 유전자를 HindIII 내지 BamHI 발현 카세트로서 pUC19로부터 잘라내었다. 키메라 항체 벡터에 대하여, 이들을 인간 IgG4 Ser-pro 또는 κ 불변 영역 각각을 포함하는 발현 벡터 pSVgpt 및 pSVhyg에 옮겼다. 발현 벡터 내의 인간화된 VH 및 VK에 대한 DNA 서열이 정확한지 확인하였다.
실시예 7 인간화된 항체의 발현
7.1 지속적 세포주에서의 발현
키메라 항체의 발현에 대해서와 같이, 인간화된 중쇄 및 경쇄 발현 벡터를 전기천공법에 의해 NS0 세포 내에 동시-트랜스펙트하였다. 항체 생산 세포주를 선택하여 증대시키고 인간화된 항체를 정제하는데, 키메라 항체에 대한 정제에서와 동일하게 수행하였다. 상기 정제된 항체는 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
7.2 인간화된 항체의 일과성 발현
상이한 인간화된 VH 및 VK 컨스트럭트의 테스팅을 신속하게 처리하기 위해, 섹션 7.2에 기재된 일과성 발현을 위한 벡터에 C2 인간화된 VH 및 VK 발현 카세트를 또한 옮겼다. 네 개의 인간화된 C2 VK 컨스트럭트를 키메라 C2 VH 컨스트럭트와 함께 HEK293 세포 내에 동시-트랜스펙션하였다. 유사하게, 네 개의 인간화된 C2 VH 컨스트럭트를 키메라 C2 VK 컨스트럭트와 함께 HEK293 세포 내에 동시-트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 3일 후 세포로부터 조건 배지를 수합하였다. 생산된 항체의 양을 인간 IgGκ 항체에 대한 ELISA에 의해 측정하였다.
실시예 8 인간화된 C2 항체의 활성
8.1 일과성 트랜스펙션에 의해 생산된 인간화된 C2 항체의 활성
일과성 트랜스펙션으로부터의 조건 배지의 샘플을 아밀로이드 베타 ELISA에서 테스트하였다. 수득된 결과는 인간화된 VH 컨스트럭트 C2 HuVH AF 버젼 2 및 4가 키메라 C2 카파 쇄와 조합될 때 작용적이고, 또한 어세이에서 키메라 C2 항체에 필적함을 명확하게 지시한다. 반대로, 키메라 C2 카파 쇄와 조합된 C2 HuVH AF 버젼 1 및 3을 함유하는 항체는 어세이에서 어떠한 결합도 나타내지 않는다. 이는 위치 94에서의 쥐 잔기의 치환이 항체 활성에 필수적임을 나타낸다. 네 개의 인간화된 C2 카파 쇄와 조합된 키메라 C2 중쇄를 함유하는 항체는 ELISA에서 모두 키메라 항체에 필적하는 좋은 결합을 나타냈다.
8.2 정제된 인간화된 C2 항체의 활성
두 개의 인간화된 중쇄 및 네 개의 인간화된 경쇄의 모든 조합을 포함하는 여덟 개의 상이한 인간화된 C2 항체를 기술된 바와 같이 지속적인 NS0 세포주로부터 정제하였으며 아밀로이드 베타 ELISA를 사용하여 테스트하였다 (도 4).
수득된 결과는 C2 HuVH4 항체가 C2 HuVH2 항체에 비해 어세이에서 보다 잘 작용함을 명확하게 지시한다. C2 HuVH2 항체 중, C2 HuVH2/HuVK3은 가장 좋은 결합 활성을 나타내지만, 이는 키메라 대조군 항체 C2 ChVHAF/ChVK에 비교하여 약 2배 감소된 것이다. C2 HuVH2/HuVK2 활성은 대조군에 비교하여 4 내지 5배 감소된 것이다. 네 개의 상이한 인간화된 경쇄를 갖는 C2HuVH4를 포함하는 항체의 활성은 유사하다. 가장 높은 활성은 C2HuVH4/HuVK1에서 관찰되었고, 네 항체 모두가 어세이에서 대조군 키메라 항체에 근접한다.
실시예 9 CDRL2에 대한 변형
9.1 변형된 CDR 2를 갖는 경쇄 설계
상기에 기재된 바와 같이, 많은 항체는 C2 항체와 같이 동일한 CDRL2 서열("KVSNRFS")을 공유한다. CDRL2가 항체 활성에 유해한 영향을 끼치지 않으면서 약간 변형될 수 있는지를 테스트하기로 했다. 두 보존적 치환을 선택하였다: 위치 50의 K에 대해 R 및 위치 53의 N에 대해 S. 따라서 두 대체적 CDRL2 서열은 "RVSNRFS" 및 "KVSSRFS"이다. 이들은 각각 mC2 VK-R 및 mC2 VK-S로서 다른 변화 없이 쥐 VK 서열 내부로 삽입되었다.
9.2 변형된 CDRL2 항체의 일과성 발현
섹션 11.2.1에 기재된 변형된 CDRL2를 갖는 두 C2 경쇄 컨스트럭트를 일과성 발현을 위한 경쇄 벡터 내에 클로닝하였다. 각각을 키메라 C2 VH 벡터와 함께 HEK293 세포 내부에 공동-트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 3일 후 세포로부터 조건 배지를 수합하였다. 생산된 항체의 양을 인간 IgGκ 항체에 대한 ELISA에 의해 측정하였다.
9.3 변형된 CDRL2를 갖는 C2 항체의 활성
mC2 VH와 조합된 변형된 CDRL2를 갖는 mC2 VKs의 일과성 트랜스펙션으로부터의 조건 배지의 샘플을 아밀로이드 베타 ELISA에서 테스트하였다 (도 5). VK-R 및 VK-S 항체 모두 키메라 C2 항체에 필적하고, 이는 어세이에서 선택된 CDRL2에 대한 개별적 변형은 항체의 활성에 현저하게 영향을 끼치지 않음을 나타낸다.
실시예 10 친화도 측정
마우스 (ACI-O1-Ab-7-C2) 키메라 (AF) 및 인간화된 항체(H4K1; H4K4)의 결합 특이성 및 친화도를 평가하기 위해, CM5 칩 상에 고정된 항원으로서 아밀로이드 베타 1-42 모노머 및 섬유를 사용하는 BIACORE.RTM. 분석을 수행하였다. BIACORE.RTM. 기술은 표면층 상에 고정된 항원에의 항체의 결합에 따른 상기 표면층에서 굴절률의 변화를 이용한다. 결합은 상기 표면으로부터의 레이저 광 굴절의 표면 플라즈몬 공명 (surface plasmon resonance, SPR)에 의해 검출된다. 신호 동역학(kinetics) 회합 속도(on rate) 및 해리 속도(off rate)의 분석은 비특이적 및 특이적 상호작용 사이의 식별을 가능하게 한다. 사용된 항체의 농도는 0.05μM 내지 1.0μM의 범위였다.
표 1: 아밀로이드 베타 1-42 모노머 및 섬유에 대한 마우스 (ACI-O1-Ab-7-C2) 키메라 (AF) 및 인간화된 항체(H4K1; H4K4)의 결합 특이성 및 친화도
Figure pat00015
실시예 11 면역조직화학적 결합 어세이
11.1 인간 뇌 섹션(section)
건강하고, 치매가 아닌 예비-AD(pre-AD) 및 AD 환자로부터의 뇌를 윤리적 승인 후 본(Bonn)의 유니버시타트스클리닉(Universitatsklinik)으로부터 받았다. 뇌는 포름알데히드에서 고정하였으며 해마(hippocampus) 영역은 탈수하고 파라핀에 묻어 마이크로톰(microtome)으로 5 ㎛ 섹션으로 절단하였다. 파라핀 섹션은 사용하기 전까지 실온(RT)에서 저장하였다. 신선한 재료를 위해, 냉동미세절단기(cryostat)로 5 ㎛ 냉동섹션(cryosection)을 절단하였으며, 섹션을 사용하기 전까지 -80℃에 보관하였다.
11.2 면역조직화학
파라핀 섹션은 파라핀을 제거하고, 슬라이드를 자일렌, 그 후 100% 에탄올, 90% 에탄올 및 70% 에탄올에 담금(bathing)으로써 재수화(rehydrate)하였다. 배경(background)은 10% H202, 10% 메탄올 수용액 내에서 30분간 인큐베이션함으로써 감소되었다. 상기 슬라이드를 100% 포름산에서 3분간 인큐베이팅함으로써 항원 복구(retrieval)를 수득하였다. TBS(Tris buffered saline, pH 7.5)에서 3번 세척 후, TBS에 녹인 10% BSA, 0.25% 트리톤 X-100 내에서 슬라이드의 인큐베이션을 2시간 행함으로써 비특이적 표지를 블로킹시켰다. 세척 (TBS에서 3번 세척) 후 비표지된 항-인간 IgG (Biomeda)를 첨가하고 슬라이드를 RT의 습한 챔버 내에서 하룻밤 인큐베이트함으로써 내재적 항체의 블로킹을 수행하였다. 또 다시 3회 세척 후, 슬라이드에 일차 인간 항 아밀로이드 항체를 첨가하고 RT에서 또 다시 24시간 동안 인큐베이트하였다. 세척 후, 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase) 표지된 이차 항 인간 IgG (Sigma)를 상기 슬라이드에 첨가하고 RT에서 2시간동안 인큐베이트하였다. 세척 후, 슬라이드를 리퀴드 퍼머넌트 레드(Liquid permanent Red, Dakocytomation)로 현상하고, 물로 세척하고 퍼머넌트 마운팅 매체(permanent mounting media, corbitbalsam)로 마운팅하기 전에 공기건조시켰다.
냉동섹션은 -80℃의 메탄올에서 30분간 고정하였으며, 배경은 차가운 메탄올에 H2O2를 첨가하여 최종 농도 10%로 하여 RT에서 30분간 인큐베이팅함으로써 감소되었다. 상기한 바와 같이 TBS(pH 7.5)에서 3번 세척 후, TBS에 녹인 10% BSA, 0.25% 트리톤 X-100 내에서 상기 슬라이드의 인큐베이션을 2시간 행함으로써 비특이적 표지를 블로킹시키고 상기한 바와 동일한 염색 과정을 수행하였다.
섹션은 라이카(Leica) DMLB 현미경으로 검사하였으며 라이카 DC500 카메라 및 라이카 FireCam1.2.0 소프트웨어를 사용하여 사진촬영하였다.
인간 항체 A 및 C 둘 모두 AD 질환 환자로부터의 뇌의 플라크를 표지하였다 (도 6). 광범위(diffuse) 및 중심성(cored) 플라크 모두 표지되었다. 게다가, 치매가 아닌 예비-AD 환자에서의 광범위 플라크 또한 상기 A 및 C 항체에 의해 검출될 수 있었다. 대뇌 아밀로이드 맥관병증(cerebral amyloid angiopathy, CAA)에서 아밀로이드는 두 항체 모두로 표지되었으며 세포내 아밀로이드에 대응할 수 있는 뉴런의 일부 염색 또한 검출되었다. 건강한 환자로부터의 대조군 뇌에서는 어떠한 표지도 볼 수 없었다. 포름산으로 전처리된 파라핀 섹션 상의 플라크는 검출될 수 있었으나, 포름산 전처리 하지 않은 파라핀 섹션 상 및 메탄올로 고정된 냉동섹션 상에서는 어떠한 플라크도 표지되지 않았다. 인간 항체 B는 파라핀 섹션 상의 플라크를 검출하지 않았으며 마우스 항체는 인간 뇌의 파라핀 또는 냉동섹션 어느 것도 염색하지 않았다.
약어(Abbreviation):
A = 결합 키메라 항체 AF (IgG4) (mC2ChVHAF)
B = 비결합 키메라 항체 B (IgG4) (mC2VHB)
C = 결합 인간화된 항체 H4K1 (IgG4) (HuVH4/HuVKl)
마우스 = ACI-01-Ab-C2 마우스 항체 (IgG2b)
실시예 12 아밀로이드 섬유 상에서의 mC2의 작용성
12.1 Aβ1-42 섬유의 배좌의 변형 및 mC2 항체의 결합 후 해체의 개시
항체가 미리형성된 베타-아밀로이드(Aβ1 -42) 섬유를 해체시킬 수 있는 메카니즘을 평가하기위해, 이차 배좌를 분석하는 U-13C 타이로신10(TyrosinelO) 및 발린12(Valine12)-표지된 Aβ1-42 펩타이드의 고체(solid-state) 핵 자기 공명(Nuclear Magnetic Resonance; NMR) 및 해체를 측정하는 티오플라빈-T(Th-T) 형광 어세이의 헤드-투-헤드 비교(head-to-head comparison)가 수행되었다 (도 7A). 상기 mC2 항체는 미리형성된 Aβ1-42 섬유의 35.4 %를 가용화시켰으며, 동시에 베타 시트로부터 랜덤 코일로의 이차 배좌의 이동을 유도하였다. 랜덤 코일에 대한 베타 시트 배좌의 개체의 감소는 약 35%이고, 따라서 형광 Th-T 어세이를 이용하여 측정된 값과 매우 유사하다 (도 7B). 이들 데이터는, 상기 mC2 항체의 결합이, 신장된(elongated) 섬유의 보다 작은 절편으로의 쪼개짐에 영향을 미치는 베타 시트의 평행(parallel) 분자내 배열의 불안정화를 잠재적으로 야기하는 이차 구조의 전이를 개시함을 나타낸다.
12.2 mC2 항체의 배좌-의존적 결합 친화도
항체-항원 결합 에너지의 일부가 항원의 배좌의 에너지-의존적 변형을 위해 사용될 수 있음이 과학적 문헌에서 잘 알려져 있기 때문에(Blond 및 Goldberg, 1987), 전체 Aβ1 -42 단백질 및 더 작은, 아홉개의 아미노산 길이의, 항체의 에피토프를 포함하는 펩타이드에 대한 C2 항체의 결합 친화도의 비교 실험을 수행하였다 (도 8). 이 비교를 위해, 상기 인간화된 항체 C2의 친화도는 C2의 에피토프의 완전 아미노산 서열을 커버하는 비오틴화된 펩타이드 (Mimotopes에 의해 생산되고 ANAWA Trading SA로부터 구입) 및 비오틴화된 완전 Aβ1 -42 펩타이드(Bachem)를 사용하는 ELISA에 의해 분석하였다. 이 분석은 제조사(Mimotopes)의 설명서에 따라 수행하였다. 도 8 및 표 2에서 증명된 바와 같이, 상기 항체는 완전한 Aβ1 -42 단백질에 대한 것보다 그의 특이적 에피토프를 포함하는 펩타이드(Aβ1-42서열의 아미노산 13-21)에 36.0% 더 높은 친화도로 결합한다. 따라서 이는 결합 친화도 에너지에서의 차이가 항체 상호작용을 위해 보다 접근가능한 위치에 항원을 제시하기 위해 아밀로이드 단백질의 이차 배좌의 에너지-소비 전이를 위해 사용되었음을 제시한다. 이는 왜 단리된 서브유닛에 대한 항체의 친화도에 비해 본래의 것 (전체 아밀로이드 단백질)에 대한 항체의 친화도가 더 낮은가에 대해 설명한다.
표 2
Figure pat00016
실시예 13 아밀로이드 베타 1-42 펩타이드의 결집에 대한 항-아밀로이드 hC2의 효과
인간화된 항-인간 아밀로이드 베타 단일클론성 항체 hC2의 아밀로이드 베타(Aβ)의 항-결집 및 해체 효과를 매개하는 능력을 평가하기 위해 티오플라빈 T 분광형광 어세이(thioflavin T spectrofluorescence assay)를 완수하였다.
13.1 결집의 억제 어세이
Aβ1-42 동결건조된 분말을 헥사플루오로이소프로판올(hexafluoroisopropanol, HFIP)로 1mM이 되도록 액상화하였다(reconstitute). 상기 펩타이드 용액을 실온에서 15분간 소니케이트하고, 하룻밤동안 교반하고, 실리콘화 되지 않은 마이크로원심분리기 튜브에 분취하였다. 그 후 아르곤의 스트림 하에 HFIP를 증발시켰다. 결과물인 펩타이드 필름을 10분간 진공건조시키고 사용하기 전까지 -80℃에 보관하였다.
Aβ1-42 결집의 항체-매개된 억제에 대해 어세이하기 위해 hC2 항체를 PBS에 미리희석하고 이하의 성분을 함유한 어세이 용액을 실리콘화 되지 않은 인큐베이션 튜브에 조제하였다: 3.3 또는 0.33 μM 미리희석한 항체, 10 μM 티오플라빈 T, 33 μM Aβ1-42, 및 8.2% DMSO. 따라서 항체의 Aβ1-42에 대한 최종 몰비는 1:10 내지 1:100이다. 적절한 대조군 용액을 조제하였다. 그 후 용액을 37℃에서 24시간 동안 인큐베이트하였으며, 분광형광 (relative fluorescence units; RFU)은 Perkin-Elmer FluoroCount 분광형광계 상에서 검은 384-웰 플레이트(Perkin-Elmer) 내 여섯개의 복제물(replicate)에서 읽었다. 그 후 분광형광을 측정하고 이하에 기재된 바와 같이 해체%를 계산하였다.
13.2 해체 어세이
미리-결집된 Aβ1-42의 항체-매개 해체를 어세이하기 위해, 상기와 같이 준비된 저분자량 Aβ1-42를 27% DMSO 및 1x PBS에서 110 μM로서 제조하였다. 그 후 3.3 또는 0.33 μM 미리희석한 항체, 및 10 μM 티오플라빈 T를 첨가한 후 이 용액이 37℃에서 24시간 동안 결집하도록 하였다. 항체 대 Aβ1-42의 몰비는 1:10 및 1:100이 되었다. 그 후 이 용액을 37℃에서 추가적 24시간 동안 인큐베이트하였다. 그 후 분광형광을 측정하고 이하에 기재된 바와 같이 해체%를 계산하였다.
13.3 계산
결집의 억제 또는 분해는 이하의 방정식에 따라 각각 평균 억제 또는 분해 % ± 평균값의 표준 오차 (SEM) 로서 표현된다:
Figure pat00017
13.4 결과
13.4.1 Aβ1-42 결집의 억제
hC2 항체를 이용한 Aβ1-42 결집의 억제를 표 3 및 도 16에 나타낸다. 항체 대 Aβ1-42의 몰비 1:100에서 억제는 평균 30%이었지만 (2 독립적 실험), 반면 몰비 1:10에서 억제율은 80%였다 (2 독립적 실험; 표 3 참조).
표 3. 항체 대 Aβ1-42의 몰비 1:100 및 1:10에서 Aβ1-42 결집의 hC2-매개된 억제
Figure pat00018
13.4.2 미리-결집된 Aβ1-42의 해체
hC2 항체를 이용한 미리결집된 Aβ1-42의 해체를 표 4 및 도 17에 나타낸다. 항체 대 Aβ1-42의 몰비 1:100에서 해체는 평균 24%이었지만, 반면 몰비 1:10에서 해체는 32%였다 (3 독립적 실험; 표 4 참조).
표 4. 항체 대 Aβ1-42의 몰비 1:100 및 1:10에서 미리결집된 Aβ1-42의 hC2-매개된 해체
Figure pat00019
티오플라빈 T 어세이를 사용하여, 항-Aβ 인간화된 항체 hC2의 이작용적 특성, 즉 Aβ1-42가 병원성 원시섬유성(protofibrillar) 배좌로의 결집을 억제하는 특성 및 또한 미리형성된 Aβ1-42 원시섬유를 해체하는 특성이 증명될 수 있다. hC2는 항체 대 Aβ1-42의 몰비 1:10에서 Aβ1-42 결집을 80% 억제하였다. 미리결집된 Aβ1-42의 원시섬유(protofibril)를 해체시키는 hC2의 능력은 1:10 몰비에서 32%인 것으로 나타났다.
실시예 14: 상이한 클래스의 아밀로이드 단백질에 대한 mC2의 배좌 -특이적 결합
상이한 단계의, 폴리머화된 아밀로이드 단백질, 모노머성, 폴리머성 가용성, 및 원섬유성 아밀로이드에 대한 mC2의 특이성을 평가하기 위해, 이들 상이한 단계의 폴리머성 베타-아밀로이드로 코팅된 ELISA를 수행하였다 (도 9). 모노머는 (Klein, 2002)에 공개된 변형된 방법에 따라 준비되었으며, 가용성 폴리머성 아밀로이드 베타는 (Barghorn 등, 2005)에 따라 준비되었으며, 반면 섬유는 Tris/HCl (pH 7.4)에 최종 농도 1 ㎍/㎕로 녹인 아밀로이드(Bachem, Switzerland)를 37℃에서 5일간 인큐베이션한 후 이어지는 원심분리 단계(5분간 10,000 rpm)로 수행되었다. 그 후 아밀로이드 폴리머를 55 ㎍/ml의 최종 농도로 ELISA 플레이트 상에 코팅하였으며, 알칼리 포스파타아제가 표지된 항-마우스 IgG 단일클론성 항체(Jackson)를 사용하는 결합 친화도 ELISA를 수행하였다. 표 5에서 증명된 바와 같이 mC2 항체는 섬유에 대해서 보다 더 높은 친화도로 가용성 폴리머 아밀로이드 베타에 결합하고, 모노머에 대해서는 가장 낮은 결합 친화도로 결합한다. 이들 데이터는, 상기 항체의 결합은 아밀로이드 에피토프에 의해서 뿐만 아니라 상이한 아밀로이드 결집체의 배좌에 의해 영향받음을 나타낸다.
표 5 아밀로이드 모노머, 올리고머 및 섬유에 대한 mC2의 배좌-특이적 결합
Figure pat00020
실시예 15: 에이씨 이뮨(AC Immune)의 단일클론성 항체 hC2의 에피토프 매핑
인간화된 단일클론성 항체 hC2의 에피토프 매핑은 3개의 상이한 펩타이드 라이브러리를 사용하는 ELISA에 의해 수행하였다. 한 라이브러리는 Aβ1-42의 완전 아미노산(aa) 서열을 커버하는 총 33개의 비오틴화된 펩타이드(Mimotopes에 의해 생산 및 ANAWA Trading SA로부터 구입)를 포함하고, 두번째 라이브러리는 상기 첫번째 펩타이드 라이브러리로부터 펩타이드 12 (Aβ의 aa12-20)를 사용하고 또한 서열 내 각 aa을 알라닌으로 치환하는 비오틴화된 펩타이드를 함유하며 (이하의 표 8 참조), 또한 세번째 라이브러리는 각각의 경우에서 마지막 아미노산을 알라닌으로 또는 이미 알라닌인 aa21에 있어서는 글리신으로 치환하는, 비오틴화된 펩타이드 13, 14, 또는 15 (Aβ의 aa13-21, 14-22 또는 15-23)를 함유한다 (이하의 표 9 참조). 비오틴화된 완전 Aβ1-42 펩타이드는 양성 대조군으로 사용되었다 (Bachem). 에피토프 매핑은 제조사의(Mimotopes) 설명서에 따라 수행되었다. 간단히 말해, 스트렙트아비딘 코팅된 플레이트 (NUNC)는 4℃에서 PBS에 녹인 0.1% BSA로 밤새 블로킹하였다. PBS-0.05% 트윈(Tween) 20으로 세척한 후, 플레이트는 PBS에 녹인 0.1% BSA, 0.1% 소듐 아자이드(Sodium Azide)에 최종 농도 10 μM로 희석된 상기 라이브러리로부터의 상이한 펩타이드로 RT에서 1시간 동안 코팅하였다. 세척 후, 플레이트는 PBS에 녹인 2% BSA, 0.1% 소듐 아자이드에 200 ng/ml로 희석된 hC2 항체 또는 Aβ 비결합 키메라 IgG4 항체와 RT에서 1시간 동안 인큐베이트하였다. 플레이트는 다시 세척하였으며, 알칼리 포스파타아제 컨쥬게이트된 염소 항 인간 IgG와 RT에서 1시간 동안 인큐베이트하였다. 최종 세척 후, 플레이트는 포스파타아제 기질 (pNPP)과 인큐베이트하고, ELISA 플레이트 리더를 사용하여 405 nm에서 리드(read)하였다.
상기 인간화된 단일클론성 항체 hC2는 첫번째 펩타이드 라이브러리의 펩타이드 12, 13, 14, 15 및 16에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다. 이들 펩타이드는 Aβ1-42의 aa 12-20, 13-21, 14-22, 15-23 및 16-24를 각각 포함하며, 에피토프가 Aβ의 영역 12-24 내에 놓이는 것을 제시한다. 알라닌 치환을 갖는 두번째 라이브러리는 Aβ12-20 (VHHQKLVFF)에의 결합에 대해 결정적인 aa를 측정하기 위해 사용하였다. hC2 항체의 결합은 아미노산 16, 17, 19 또는 20이 알라닌으로 치환되었을 때 완전히 상실되었으며, 이들 aa가 Aβ에의 항체의 결합에 절대적으로 결정적임을 지시한다. hC2 항체의 결합은 aa 15 및 18가 치환되었을 때 부분적으로 상실된다.
상기 결합은 또한 aa 14가 알라닌으로 치환되었을 때 거의 완전히 상실되었고, aa 14 또한 결합에 매우 중요한 것임을 지시한다.
마지막으로, 세번째 라이브러리는 aa 21, 22 또는 23이 에피토프에의 결합에 결정적인지 측정하기 위해 사용하였다. aa 15-23에의 항체의 결합은 aa 23이 알라닌으로 치환되었을 때 감소하였으며, aa 23이 결합에 또한 중요함을 지시한다. 상기 결합은 aa 21이 글리신으로 치환되었을 때 부분적으로 상실되었으며, aa 22가 알라닌으로 치환되었을 때 약간 상실되었다.
Example 16: hC2 항체에 의한 신경보호
항체 hC2의 A베타 올리고머-유도된 분해(degeneration)로부터 뉴런을 보호하는 능력을 인 비트로 어세이로 평가하였다. 배아 일수 16.5-17.5(Embryonic day 16.5-17.5)의 마우스 겉질(cortical) 뉴런을 단리하고, 분리하여, N3-F12 배지에서 인 비트로 배양하였다. 세포를 총 9일간 배양하였으며, 3일째 및 A베타 올리고머, 또는 A베타 올리고머 플러스 항-A베타 항체 hC2를 첨가한 날에 영양 공급되었다. 5일 ("4일간의 A베타") 또는 6일 ("3일간의 A베타")째, 어떤 세포의 웰(well)은 2μM A베타 올리고머를 단독으로, 또는 2 μM A베타 올리고머 및 50 ㎍/mL 항-A베타 항체 hC2의 조합으로 처리하였다.
A베타 올리고머는 HFIP에 A베타 1-42 (r펩타이드)를 용해시킴으로써 준비하였으며, 여기서 A베타 펩타이드는 1 mg/ml의 lO ㎕ 분취물로 분주하고 그 후 흄 후드(fume hood) 내에서 30분간 증발시키고 펩타이드 필름은 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다. 사용할 때, 상기 펩타이드 필름을 lO㎕의 DMSO에 용해시킨 후, 78.6㎕의 HAMS F12에 용해시키고, A베타 펩타이드 용액을 4C에서 24-48 시간동안 인큐베이트하였다 (A베타의 최종 농도 25μM).
대조군 세포에 있어서, 5일째에 A베타-DMSO와 동일한 부피의 DMSO-F12를 단독으로 첨가하고, 세포를 어떠한 추가적 처리 없이 4일간 더 배양하였다. 9일째에, 모든 배양 조건으로부터의 뉴런을 고정하고 Tuj1(항-베타-튜뷸린 항체)로 염색한 후, FITC로 표지된 이차 항체로 염색하여 미소관(microtubule)을 가시화시켰고, 따라서 대개의 신경 돌기를 가시화하였다. 결과를 도 18에 나타낸다.
비처리된 마우스 배아 겉질 뉴런은 배양 9일 후 정상적인 형태(morphology)를 나타낸다 (도 13, 가장 왼쪽 패널). 3일간 세포의 A베타 올리고머로의 처리는 축삭(axon) 퇴행을 유발하고 축삭의 총 수의 감소를 야기하며 (도 13,아래쪽 중간 패널), 이 효과는 4일간 처리에서 훨씬 더 두드러졌다(도 13, 위쪽 중간 패널). 반대로, A베타 올리고머와 항-A베타 항체 hC2의 조합으로 처리된 세포는 대조군 세포와 유사하게 보였다 (도 13, 위쪽 및 아래쪽 오른쪽 패널). 이 결과는 항-A베타 항체 hC2가 A베타 올리고머-유도된 분해로부터 배아 마우스 겉질 뉴런을 보호할 수 있음을 나타낸다.
표 6: 인간화된 C2 경쇄 프레임워크 영역 내에 마련된 변화 및 위치
Figure pat00021
표 7: 인간화된 C2 중쇄 프레임워크 영역 내에 마련된 변화 및 위치
Figure pat00022
인간화된 C2HuVK1, C2HuVK2, C2HuVK3, C2HuVK4의 경쇄 및 C2HuVHAF4 및 C2HuVHAF2의 중쇄를 갖는 총 8개의 상이한 항체가 구축되었다.
표 8. 두번째 라이브러리에 사용된 펩타이드의 요약. 결합에 중요한 aa는 이탤릭체 및 밑줄로 마크되며, 결합에 절대적으로 결정적인 aa는 이탤릭체 및 볼드체로 마크된다.
Figure pat00023
표 9. 세번째 라이브러리에 사용된 펩타이드의 요약. 결합에 중요한 aa는 이탤릭체 및 밑줄로 마크되며, 결합에 절대적으로 결정적인 aa는 이탤릭체 및 볼드체로 마크된다.
Figure pat00024
참조문헌 목록
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데에스엠제-도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하 DSMACC2750 20051201
<110> AC Immune <120> Humanized Antibody <130> M1967 EP S3 <160> 32 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> C2 HuVH AF 4 humanised heavy chain variable region (CDR1) <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> C2 HuVH AF 4 humanised heavy chain variable region (CDR2) <400> 2 Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> C2 HuVH AF 4 humanised heavy chain variable region (CDR3) <400> 3 Gly Asp Tyr 1 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> C2 HuVK 1 humanised light chain variable region (CDR1) <400> 4 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> C2 HuVK 1 humanised light chain variable region (CDR2) <400> 5 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus 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aaggctccac tctcacagtc tcctca 336 <210> 32 <211> 408 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 32 atgrasttsg ggytcagmtt grttttcctt gcccttattt taaaaggtgt ccaatgtgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc tatggcatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gacaagaggc tggaattggt cgcaagcatc aatagtaatg gtggtagcac ctattatcca 240 gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300 caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatgtatt actgtgcaag tggtgactac 360 tggggccaag gctccactct cacagtctcc tcagccaaaa caacaccc 408

Claims (7)

  1. β-아밀로이드 단백질 상의 하나 이상의 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편으로서, 여기서 상기 에피토프는 상기 항체의 결합에 주로 관여하는 둘 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하고, 여기서 상기 둘 이상의 연속적인 아미노산 잔기는 하기의 코어 서열(서열 식별 번호: 10) 내에 끼워진 -Lys-Leu-인, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편:
    Figure pat00025
    여기서
    Xaa1은 His, Asn, Gln Lys, 및 Arg으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산이고,
    Xaa2는 Asn 및 Gln으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산이며,
    Xaa3은 Ala, Val, Leu, 노르류신(norleucine), Met, Phe, 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산이다.
  2. β-아밀로이드 단백질 상의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편으로서 여기서 상기 에피토프는 상기 항체의 결합에 주로 관여하는 둘 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하고, 여기서 상기 둘 이상의 연속적인 아미노산 잔기는 하기의 코어 서열(서열 식별 번호: 9) 내에 끼워진 -Phe-Phe-인, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편:
    Figure pat00026
    여기서
    Xaa3은 Ala, Val, Leu, 노르류신, Met, Phe, 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고;
    Xaa4는 Ala, Val, Leu, Ser 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이며;
    Xaa5는 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이고, 또한
    Xaa6은 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기이다.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, β-아밀로이드 단백질 상의 둘 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편으로서 여기서 상기 둘 이상의 에피토프는 상기 항체의 결합에 주로 관여하는 둘 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 각각 포함하며, 여기서 상기 둘 이상의 연속적인 아미노산은 항체 결합에 관여하지 않거나 또는 상기 연속적인 아미노산 잔기에 비해 상당히 더 적은 정도로 관여하는 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 분리되고, 이는, 각각, 하기의 코어 서열 내에 끼워진 -Phe-Phe- 및 -Lys-Leu-인, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편:
    Figure pat00027
    여기서
    Xaa1은 His, Asn, Gln, Lys, 및 Arg으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산이고;
    Xaa2는 Asn 및 Gln으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산이며;
    Xaa3은 Ala, Val, Leu, 노르류신, Met, Phe, 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산이고;
    Xaa4는 Ala, Val, Leu, Ser 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산이며;
    Xaa5는 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산이고, 또한
    Xaa6은 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산이다.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기
    Xaa1은 His 및 Arg으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산이고;
    Xaa2는 Asn 및 Gln으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산이며;
    Xaa3은 Val 및 Leu으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산이고,
    Xaa4는 Ala 및 Val으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산이며;
    Xaa5는 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산이고, 또한
    Xaa6은 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산인,
    키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기
    Xaa1은 His이고;
    Xaa2는 Gln이며;
    Xaa3은 Val이고;
    Xaa4는 Ala이며;
    Xaa5는 Glu이고; 또한
    Xaa6은 Asp인,
    키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, β-아밀로이드 단백질 상의 둘 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편으로서 여기서 상기 둘 이상의 에피토프는 상기 항체의 결합에 주로 관여하는 둘 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 각각 포함하며, 이는 각각 -Phe-Phe- 및 -Lys-Leu-이고, 또한 여기서 상기 둘 이상의 독특한 결합 사이트는 각각 서열 식별 번호: 7에 나타낸 아미노산 서열 -Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp- 및 서열 식별 번호: 8에 나타낸 아미노산 서열 His-Gln-Lys-Leu-Val-을 나타내는, 키메라 항체 또는 이의 절편, 또는 인간화된 항체 또는 이의 절편.
  7. 가변 영역(variable region) 내에 비인간 기원의 하나 이상의 CDR 및 하나 이상의 인간- 또는 영장류-유래된 프레임워크 영역 및, 선택적으로, 인간 또는 영장류 근원 항체로부터 유래된 불변 영역을 포함하는 인간화된 항체 또는 이의 절편으로서, β-아밀로이드 단백질, β-아밀로이드 모노머성 펩타이드, 복수의 β-아밀로이드 모노머 단위를 포함하는 폴리머성 가용성 아밀로이드 펩타이드, β-아밀로이드 섬유, 원섬유(fibril) 또는 미세섬유(filament), 및 β-아밀로이드 플라크의 일부로서 또는 단리된 β-아밀로이드 폴리머성 펩타이드에, 하기의 아미노산 서열(서열 식별 번호: 11)을 포함하는 에피토프에서, 특이적으로 결합할 수 있는 인간화된 항체 또는 이의 절편:
    Figure pat00028
    여기서
    Xaa1은 His, Asn, Gln으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 His이고;
    Xaa2는 Asn 및 Gln으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Gln이며; 또한
    Xaa3은 Val, Leu, 및 Ile으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Val이고;
    Xaa4는 Ala 및 Val으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Ala이며;
    Xaa5는 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Glu이고; 또한
    Xaa6은 Glu 및 Asp로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 아미노산 잔기, 특히 Asp이다.
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