PT2109623E - Tratamento de cancro com anticorpos anti-il-1 - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "TRATAMENTO DE CANCRO COM ANTICORPOS ANTI-IL-1"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O cancro geralmente mata pela invasão de estruturas de tecidos adjacentes, causando a disrupção da fisiologia de órgãos críticos. Descobriu-se que o processo de metástase é concomitante com desdiferenciação de lesões de tumor primário. Um corolário da desdiferenciação de tumor é a heterogeneidade do tumor. A tríade de desdiferenciação, heterogeneidade e metástase contribui para uma combinação mortal. Após o cancro se ter tornado metastático e heterogéneo, a possibilidade de tratamento anti-tumor completo é remota. A antiga esperança tem sido identificar algum elemento comum de tumores metastáticos, uma caracteristica crucial que seja retida durante o crescimento de e desdiferenciação mesmo nos tumores mais heterogéneos, uma característica que seja tão intrínseca ao processo de metástase que esteja presente em praticamente todas as células tumorais independente de origem ou tropismo. Com a identificação de tais elementos cruciais, a noção de tratar a doença avançada, disseminada pode ter uma base na realidade.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Gráficos que mostram respostas de tumor em ratinhos nude com xenotransplantes de tumor humano após tratamento com anticorpos anti-IL-Ια. Os ratinhos são tratados com anticorpo monoclonal anti-IL-Ια anti-humano de ratinho (mahIL-la) ou anticorpo monoclonal anti-IL-1 anti-ratinho de hamster (hamIL-loO ou ambos (mahIL-la + hamIL-la) . Os ratinhos são administrados com doses de 5 mg/kg de cada anticorpo duas vezes por semana começando no dia de xenotransplante (Dia 1 Tumor) ou após o estabelecimento da 2 doença metastásica (Tumor estabelecido). Os ratinhos são sacrificados quando apresentam considerável carga de tumor e em desconforto óbvio. Figura la, tumor de próstata, dia 1; Figura 1B, tumor de mama, dia 1; Figura 1C, tumor de próstata estabelecido; Figura 1D, tumor de mama estabelecido.

Figura 2. Formação de autoanticorpo anti-IL-loc no dia 56 em ratinhos C57BL/6 após três injecções subcutâneas com conjugado de IL-la-PPD em alume (♦) . Ratinhos de controlo imunizados com PPD em alume somente () .

Figura 3. Destruição mediada por complemento dependente de anticorpo de células EL-4. As células EL-4 foram incubadas com diluições em série de anti-soro policlonal de ratinho anti-IL-loc de ratinho. A razão de células destruídas para células viáveis é proporcional à concentração no soro. Um ser anticorpo monoclonal de humano anti-IL-Ια de ratinho foi utilizado como um controlo positivo. Incubação com soro murino naive ou com meio de cultura sozinho serviu como os dois controlos negativos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Direccionar um anticorpo contra IL-Ια pode ser uma abordagem utilizada como um tratamento de cancro. Em particular, anticorpo anti-IL-Ια pode inibir o potencial metastático de tumores através de interrupção do papel fisiológico que IL-Ια derivada de tumor desempenha em metástase de tumor. Além disso, por a IL-loc ser expressa por tumores, um anticorpo que tem como alvo IL-loc pode causar citotoxicidade tumoral directa através de citotoxicidade celular direccionada por anticorpo (comummente referida como ADCC). É altamente inesperado que interleucina-1 alfa (IL-loc) poderia ser um alvo para terapêutica de cancro. Para entender isso é necessária uma breve revisão da história do denominado sistema de interleucina-1. 0 sistema de IL-1 3 inclui IL-Ια, interleucina- 1 beta (IL-1 β), antagonista de receptor de interleucina-1 (IL-lra), e receptor 1 de interleucina-1 (IL-1R1). Após quase três décadas desde a descoberta de IL-Ια e IL-1 β, pouco progresso foi feito na distinção de papéis biológicos separados para os dois produtos génicos. A incapacidade para elucidar as funções biológicas independentes destas duas citocinas é evidenciado pela referência comum na literatura cientifica simplesmente a interleucina-1, que durante décadas tem sido a nomenclatura que colectivamente se refere- a IL-Ια e/ou IL-1β. Esta falha em distinguir estas duas citocinas é tão única como é peculiar, considerando as claras diferenças entre IL-Ια e IL-1 β: não compartem significativa homologia de sequência de proteína; estão sob diferente regulação transcricional, que resulta em separação temporal e espacial da expressão; são reguladas de maneira independente através de maquinaria de processamento pós-traducional separado e individualmente; são submetidos a modificações pós-tradução únicas e separadas; e têm diferente distribuição em tecido e são reguladas positivamente em resposta a diferentes estímulos. Além disso, IL-loc é ancorada em membrana via um cauda de lípido e tem actividade de ligação similar a lecitina, enquanto que IL-1 β é um proteína secretada.

Considerando as diferenças entre estas citocinas, é válido entender porque IL-Ια e IL-1 β deveriam ter sido colectivamente denominadas como interleucina-1. Em primeiro lugar, a presunção antecipada foi que os dois produtos génicos representavam somente uma única actividade biológica, ou para talvez colocar mais uma particularidade a isto, que IL-Ια tem pouco função biológica notável. Esta desconsideração de IL-loc resultou do facto de que não existia mecanismo secretor conhecido para citocina, nenhuma sequência transmembrana que permitisse a integração na membrana, e nenhuma sequência de sinal codificado para 4 translocação para vesículas secretoras. Pensou-se que IL-la estava contida no citoplasma, e um papel como uma molécula de sinalização intracelular sugeriu pouca relevância como uma citocina verdadeira. Por outro lado, um processamento pós-traducional e via secretora foi rapidamente estabelecida para IL-1 β. De facto, a única relevância de IL-Ια no denominado sistema de interleucina-1, parece ser que foi mostrado que induz a sinalização através do receptor 1 de IL-1, que foi encontrado que induzia sinalização em resposta a IL-Ια e IL-Ιβ. Porque não existia mecanismo para secreção, foi postulado que IL-Ια poderia somente efectuar um papel fisiológico quando era libertada desde o citoplasma de células mortas. Mas o fracasso de encontrar níveis significativos de IL-Ια em soros ou tecidos sob quase quaisquer circunstâncias parecia minimizar a possível importância de IL-la. É assim bastante inesperado que tratamento de animais com um anticorpo anti-IL-Ια possa proteger os animais das formas agressivas de cancro. De maneira similar, a imunização de animais para induzir titulação de anticorpo anti-IL-Ια pode proteger os animais de tumores. 0 mecanismo de acção não é ainda claro e pode envolve uma ou mais combinações de uma neutralização de produção de IL-Ια pró-tumor de hospedeiro, neutralização de produção de IL-la tumor ou citotoxicidade directa de tumor via celular dirigida a anticorpo (ADCC) ou destruição mediada por complemento (ADCK).

Pacientes que podem ser tratados de acordo com a invenção incluem tanto seres humanos como mamíferos não humanos, tal como animais de companhia, animais laboratório, modelos animais, etc. (por exemplo, gatos, cães, ovelha, porcos, cabras). "Anticorpos" como é utilizado no presente documento inclui moléculas de imunoglobulina policlonais ou monoclonais intactas; fragmentos de imunoglobulina, tal 5 como Fab, F(ab')2/· scFv, e Fv monoméricos e diméricos; e moléculas que não ocorrem naturalmente tal como diacorpos, minicorpos, corpos Kappa, Janusins, e similares. Anticorpos úteis em métodos terapêuticos da invenção compreendem um lugar de ligação a IL-Ια e especificamente ligam-se a IL-la. "lugares de ligação a IL-Ια" como é utilizado no presente documento incluem lugares de ligação a IL-Ια que ocorrem naturalmente em a porção variável de anticorpos. Os lugares de ligação a IL-Ια também incluem lugares de ligação que diferem dos lugares de ligação IL-Ια de ocorrência natural por entre 1 e 15 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15) substituições de aminoácido conservativas e que especificamente se ligam a IL-Ια. Tipicamente, um anticorpo que especificamente se liga a IL-Ια proporciona um sinal de detecção pelo menos 10, 20, ou 100 vezes maior que um sinal de detecção proporcionado com um antigénio não IL- la quando é utilizado num ensaio imunoquimico. Preferentemente, anticorpos que especificamente se ligam a IL-Ια não detectam outras proteínas em ensaios imunoquimicos e podem imunoprecipitar IL-Ια da solução.

Anticorpos policlonais podem ser obtidos por meio de imunização de um hospedeiro apropriado com IL-Ια utilizando métodos bem conhecidos. No entanto, anticorpos monoclonais são preferidos. Anticorpos monoclonais (por exemplo, comprimento completo, scFv, Fv) podem ser preparados utilizando qualquer técnica que proporciona a produção de moléculas de anticorpo by linhas de células continuas em cultura. Estas técnicas incluem, mas não são limitadas a, a técnica de hibridoma, a ser técnica de hibridoma de célula B humana, e a técnica de hibridoma de EBV. Veja-se Roberge et ai., Science 269, 202-204, 1995; Kohler et al. , Nature 256, 495-497, 1985; Kozbor et ai., J. Imunol. Methods 81, 31-42, 1985; Cote et al., Proc. Natl. Acad Sei. 80, 2026-2030, 1983; e Shimamoto et ai., Biologicals, Set de 2005; 6 33(3):169-74. Anticorpos de cadeia simples podem ser gerados por meio de embaralhamento de cadeia de bibliotecas combinatórias randômicas. Takeda et ai., Nature 314, 452-454, 1985.

Anticorpos de cadeia simples também pode ser construído utilizando um Método de amplificação de ADN, tal como PCR, utilizando ADNc de hibridoma como um molde. Os anticorpos de cadeia simples podem ser mono- ou biespecíficos, e podem ser bivalentes ou tetravalentes A construção de anticorpos de cadeia simples tetravalentes, biespecíficos é bem conhecida no estado da técnica. Uma sequência de nucleótido que codifica um anticorpo de cadeia simples pode ser construído utilizando síntese de nucleótido manual ou automática, clonada numa construção de expressão utilizando métodos de ADN recombinante padrão, e introduzida numa célula para expressar a sequência codificante. Alternativamente, anticorpos de cadeia simples pode ser produzidos directamente utilizando, por exemplo, tecnologia d efago filamentoso. Burton et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. 88, 11120-23, 1991; Verhaar et al., Int. J. Cancro 61, 497-501, 1995. anticorpos contra IL-Ια úteis na invenção podem ser purificados a partir de qualquer célula que expresse os anticorpos, incluindo células hospedeiras que foram transfectadas com moléculas de ácido nucleico que codificam anticorpo. As células hospedeiras são cultivadas sob condições adequadas para a expressão dos anticorpos. As células hospedeiras apropriadas e condições de cultura podem ser seleccionadas da ampla variedade conhecida no estado da técnica.

Anticorpos Purificados são separados dos outros compostos que normalmente se associam com o anticorpo na célula, tal como certas proteínas, hidratos de carbono, ou lípidos. Os métodos de purificação incluem, mas não são limitados a, cromatografia de exclusão de tamanho, 7 fraccionamento de sulfato de amónio, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de afinidade, e electroforese em gel preparativa. Uma preparação de anticorpos purificados é pelo menos 80 % pura; preferentemente, as preparações são 90 %, 95 %, ou 99 % pura. A pureza das preparações pode ser avaliada por meio de quaisquer meios conhecidos no estado da técnica, tal como electroforese em gel de SDS-poliacrilamida. Uma preparação de anticorpos purificados da invenção pode conter mais de um tipo de anticorpo que especificamente liga-se a IL-la.

Os anticorpos policlonais ou monoclonais de comprimento completo, no entanto preparados, pode ser clivados com técnicas padrão para obter fragmentos de anticorpo funcionais tal como Fab ou F(ab')2. Veja-se Cheung et al ., Protein Expr. Purif. 32, 135-40, 2003. Proteínas de ligação que são derivadas de imunoglobulinas e que são multivalentes e multiespecificas, tal como os "diacorpos" descritos no documento WO 94/13804 e Holliger et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 90, 6444-48, 1993; os "minicorpos" descritos em Martin et ai., EMBO J. 13, 5303-09, 1994; "Kappa corpos" described em 111 et ai., Protein Eng. 10, 949-57, 1997; e "Janusins" (moléculas de cadeia simples biespecíficas) descritos em Traunecker et ai., EMBO J. 10, 3655 3659, 1991, e Traunecker et ai., Int. J. Câncer Suppl. 7, 51-52, 1992, pode ser preparados.

Qualquer anticorpo IL-Ια útil na invenção também pode ser produzidos utilizando métodos químicos para sintetizar sua sequência de aminoácidos, tal como por meio de síntese directa de péptidos utilizando técnicas de fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-54, 1963; Roberge et ai., Science 269, 202-04, 1995). A síntese de proteína pode ser realizada utilizando técnicas manuais ou por meio de automação. A síntese automatizada pode ser conseguida, por exemplo, utilizando Applied Biosystems 431a Peptide Synthesizer (Perkin Elmer). Opcionalmente, fragmentos de 8 anticorpos pode ser sintetizados por separado e combinados utilizando métodos químicos para produzir uma molécula de comprimento completo. As moléculas recentemente sintetizadas podem ser substancialmente purificadas por meio de cromatografia líquida de alta eficiência preparativa (por exemplo, Creighton, PROTEINS: STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman e Co. , Nova Iorque, N.Y., 1983). A composição de um polipéptido sintético pode ser confirmada por meio de análise de aminoácidos ou sequenciamento (por exemplo, utilizando degradação de Edman).

Aqueles peritos na especialidade podem utilizar soluções estéreis fisiologicamente aceitáveis injectáveis conhecidas para preparar composições farmacêuticas adequadas que compreendem anticorpos da invenção. Soluções isotónicas aquosas, tal como solução salina ou soluções de proteína plasmática correspondentes, são facilmente disponíveis e pode ser utilizadas para preparar soluções prontas para utilização para injecção parentérica ou infusão. As composições farmacêuticas podem ser armazenadas como liofilisatos ou preparações secas, que podem ser reconstituídos com uma solução injectável conhecida antes de utilização. Uma composição farmacêutica pode ser complementada com substâncias portadoras conhecidas ou/e aditivos (por exemplo, soro albumina, dextrose, bissulfito de sódio, EDTA, etc.). As composições farmacêuticas da invenção tipicamente compreendem um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como um diluente inerte.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas por diferentes vias conhecidas por aqueles peritos na especialidade. Para aplicação sistémica, as vias intravenosa, intravascular, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, oral, intranodal, ou intratecal podem ser utilizadas. Aplicação mais localizada pode ser efectuada por via subcutânea, intracutânea, intracardíaca, 9 intralobal, intramedular, intrapulmonar, ou directamente em ou próximo ao tecido a ser tratado. Dependendo da duração desejada e eficácia do tratamento, as composições pode ser administradas uma vez ou várias vezes, por exemplo, numa um base diária durante vários dias, semanas ou meses, e em diferentes dosagens. A dosagem dependerá da idade, condição, sexo e extensão da doença no paciente e pode varias desde 0,25 mg/kg até aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal do paciente. Cancros que podem ser tratados incluem, mas não são limitadas a, cancros no sangue (por exemplo, leucemias, linfomas) e cancros de tecidos sólidos (por exemplo, bexiga, osso, cérebro, mama, colo do útero, cólon, esófago, rim, fígado, pulmão, pâncreas, próstata, estômago). ADJUVANTE EXEMPLO Sal inorgânico hidróxido de alumínio, fosfatode cálcio, hidróxido de berílio sistemas de distribuição adjuvante incompleto de Freund Produtos bacterianos adjuvante completo de Freund, BCG, plasmídeo ADN motivos CpG Complexos imunomoduladores (ISCOMS) Mistura de Quil A que contém proteínas virai

Numa forma de realização, o paciente é imunizado contra IL-la para induzir anticorpos contra IL-la. Quaisquer métodos de imunização conhecidos no estado da técnica podem ser utilizados para alcançar a resposta de anticorpo desejada (veja-se a seguir). Em geral, IL-la recombinante pode ser utilizado numa fórmula que contém um adjuvante para conseguir imunização; uma sequência de ácido nucleico que codifica IL- la pode ser utilizado para preparar um vírus recombinante ou organismo que pode ser utilizado para imunizar; ou IL-la recombinante pode ser quimicamente ligado a partículas similares de vírus, que actuam como complexos imunomoduladores._ 10

Citocinas GM-CSF, IL-12, IL-1, IL-2 Vírus Recombinante Influenza conjugado de partícula similar a vírus rotavírus bovino que contém VLP 2/6 VP2 e rotavírus humano VP6 Bactérias recombinantes Salmonella typhimurium atenuada A descrição anterior geralmente descreve a presente invenção. Um entendimento mais completo pode ser obtido por meio de referência aos seguintes específicos exemplos, que são proporcionados para fins de ilustração somente e não são destinados a limitar o âmbito da invenção. EXEMPLO 1

Animais e células tumorais

Os dados são gerados utilizando ratinhos atímicos nu/nu (8-10 de semanas de vida, NCI, Frederick, MD) . Os ratinhos são injectados subcutaneamente no flanco com 5 xlO6 células tumorais suspensas em 200 μΐ de DMEM. Uma vez que se esperava que IL-la poderia proporcionar um mecanismo geral para a viabilidade célula tumoral, testaram-se diversas linhas de células tumorais para a inibição com anti-IL-Ια, injectando os animais com células tumorais derivadas de mama (MDA-MB-436 ou MDA-MB-231, Nozaki et al. Biochem Biophy Res Comm 275, 60-62 (2000)) ou linhagens de próstata (PC-3, Chung et al. The Prostate 38:199-207 (1999); Singer CF et al. Clin Câncer Res. 15 de Outubro de 2003; 9 (13):4877-83), que demonstraram anteriormente expressar IL-la.

Os ratinhos são injectados com anticorpos anti- IL-la humana de ratinho para antagonizar a produção de IL-la tumoral. Os ratinhos recebem 5 mg/kg de anticorpo monoclonal de IgGl (clone 364-3B3-14, BioLegend) ou 5 mg/kg de anticorpo monoclonal de IgG2a (Clone 1F3B3, ProMab), administrados intraperitonealmente duas vezes por semana, começando no dia de implantação do tumor ou após evidência de uma lesão tumoral primária de pelo menos aproximadamente 3 mm3. Dois outros grupos de ratinhos recebem o anticorpo 11 monoclonal de IgGl ou anticorpo monoclonal de IgG2a bem como 5 mg/kg de um anticorpo monoclonal anti-IL-Ια anti-ratinho (IL-Ια anti-ratinho de Hamster é comprado de BD PharMingen (San Diego, Calif)), com a finalidade de neutralizar produção de IL-Ια endógena.

Os animais são mantidos vivos durante 56 dias a não ser que sacrificados antes por razões humanitárias, devido a carga tumoral excessiva. Regista-se o peso corporal do animal a cada semana e mede-se o volume do tumor observável. Os animais são sacrificados quando existe morbidade evidente relacionada com tumor (perda de peso, letargia). Os ratinhos são sacrificados utilizando um câmara de CO2. As metástases são colhidas e armazenadas separadamente após examinação cuidadosa das cavidades abdominal e peritoneal e órgãos maiores, incluindo figado, gânglios linfáticos, baço e pulmões. Massa tumoral agregada é calculada. Os resultados de sobrevivência e carga tumoral são expressos como média +1- SE. EXEMPLO 2 Imunohistoquimica

Os espécimes de tumor metastático ressectados com tecido circunvizinho são tomados de alguns animais para a análise histológica. As preparações de tumor fixas em formalina, embebidas em parafina são geradas no momento do sacrifício. A análise histológica é realizada utilizando ambos os anticorpos IL-Ια anti-murina e anti-humana, bem como coloração anti-VEGF, anti-ICAM-1, anti-E-Selectina e anti-VCAM é realizada.

EXEMPLO 3 PCR 0 ARN é extraído de cada uma das linhas de células tumorais e de biópsias tumorais tomadas de ratinhos com tumores transplantados subcutaneamente estabelecidos. As células são analisadas utilizando RT-PCR para transcritos de IL-Ioí. Iniciadores são desenhados para identificar 12 especif icamente IL-1oí humana, de modo que não existe confusão em amostras de biópsia de tumor se ou não os transcritos de IL-loc fossem derivados das células tumorais ou da produção endógena. Adicionalmente, iniciadores específicos de IL-Ια de ratinho são desenhados para identificar IL-Ια endógena que poderia ter sido produzida a partir de infiltração leucocitária ou do tecido circunvizinho do microambiente tumoral. Uma vez que IL-la da fonte pode ser importante em criar um microambiente tumoral favorável. ARN total é isolado de amostras tumorais com Trizol (Gibco/BRL Life Technologies, Rockville, MD, USA) como é indicado pelo fabricante. 0 ADN contaminante é removido com DNAse livre de RNase. Um pg de ARN total tratado com DNAse (ou água como um controlo negativo) é incubado com 1 pg de iniciador oligo dT a 95°C durante 3 min e então 68°C durante 10 min. Oito pl de 5x tampão, 4 pl DTT (0,1 M) , 2 pl de dNTP (10 mM) , 1 pl inibidor de RNase, e 1 pl de transcriptase reversa superscript são adicionados a cada reacção de acordo com o método de Lee et ai. (Journal of Orthopaedic Research, 21(2003) 62-72). EXEMPLO 4

Anticorpo aIL-Ια Reduz Incidência Metastático

Os ratinhos nu/nu que portam tumores metastáticos estabelecidos são tratados duas vezes por semana com injecções intraperitoneal de PBS, 5 mg/kg de mahIL-loc b, ou 5 mg/kg de hamIL-l0£ b juntamente com 5 mg/kg de hamIL-lcx b. Dois grupos de ratinhos que portam tumor são utilizados, aqueles injectados subcutaneamente com 5xl06 células tumorais MDA-MB-436 ou PC-3. O anticorpo é administrado duas vezes por semana, começando no dia da injecção subcutânea de células tumorais ou após crescimento tumoral de 3 mm3. Veja-se Quadro 1. 13

Quadro 1. Descrição de Desenho Experimental e Números dos

Animais PBS mahIL_1“+hamIL_1“ mahIL_la hamIL~la D1MDA-MB436 6 6 6 6 D1PC-3 6 6 6 6 EstMDA-MB436 6 6 6 6 EstPC-3 6 6 6 6

Colónias tumorais visíveis são contadas nos órgãos no momento do sacrifício. 0 número de metástases de fígado superficial é determinado pela inspecção do tecido para visualizar os focos tumorais. 0 número de focos metastáticos no diafragma, intestino e parede peritoneal e gânglios linfáticos é determinado de uma maneira similar.

Nos modelos de tumor de mama metástases visíveis em gânglios linfáticos, pulmão e fígado são reduzidas pelo tratamento com nahIL-la ou pelo tratamento de combinação com mahIL-la b + hamIL-la b. 100 % dos ratinhos tratados com controlo desenvolveram ascite ao contrário da formação de ascite em somente 10 % de ratinhos tratados com anti-IL-la. Observações similares são feitas com o modelo de tumor de próstata, onde ratinhos que recebem mahIL-la ou mahIL-la: b + hamIL-la b têm carga metastática reduzida. Em ambos modelos de tumor de mama e de tumor de próstata, os ratinhos administrados com namIL-la b não mostraram redução aparente em metástase no momento do sacrifício. Veja-se Quadro 2.

Quadro 2. Controlo de tumores xenotransplantados pelo tratamento com anticorpo aIL-la. DIMDA- MB436 PBS mahIL_la + hamIL-la mahlL- la hamIL-la Ascite 6(100) 0(0) 1(17) 4(66) Gânglio linfático 6(100) 1(17) 2(33) 6(100) Peritónio 6(100) 0(0) 1(17) 6(100) Fígado 6(100) 1(17) 3(50) 6(100) 14

EstMDA- MB436 PBS mahIL_la+hamIL~1 um mahlL- Icí hamIL-la Ascite 6 (100) 0(0) 0(0) 4(66) Gânglio linfático 6(100) 4(66) 5(83) 6 (100) Peritónio 6(100) 3(50) 5(83) 6(100) Fígado 6 (100) 3(50) 5(83) 6(100) DIPC-3 PBS mahIL-1“ + hamIL~la mahlL- la hamIL-la Ascite 6 (100) 0(0) 0(0) 3(50) Gânglio linfático 6(100) 0(0) 3(33) 5(83) Peritoncal 6 (100) 1 (17) 2(33) 6(100) Fígado 6(100) 0(0) 1(17) 6(100) EstPC3 PBS mahIL_la+hamIL_1 um mahlL- lOÍ hamIL-la Ascite 6(100) 0 - 0 5(83) Gânglio linfático 6(100) 3(50) 3(50) 6(100) Peritónio 6(100) 4(66) 2(33) 6(100) Fígado 6(100) 3(50) 2(33) 6(100)

Todos os ratinhos tratados com PBS são sacrificados no Dia 50, ao passo que nenhum ratinho tratado com alL-la-sucumbe a tumores de mama ou próstata xenotransplantados após 60 dias. O tratamento com aIL-Ια que tem como alvo IL-la expressa ou IL-Ια endógena (principalmente leucócito) derivada de tumor reduz a carga metastática em ratinhos que portam cancro de mama ou próstata xenotransplantado. 0 tratamento com aIL-Ια que tem como alvo IL-Ια expressa por tumor tem um efeito antitumoral estatisticamente mais potente, ao passo que o tratamento com anticorpo alL-la antitumoral e anti-endógena combinado proporciona um 15 bloqueio quase completo do crescimento tumoral metastático em ratinhos nu/nu que portam tumores de mama ou próstata. Veja-se a Figura 1.

Os animais que recebem mahIL-lo( ou hamIL-lo( ou combinação dos dois anticorpos têm gravidade reduzida do curso clinico da doença. Todos os animais de controlo eventualmente aparecem moribundos e requerem o sacrifício antes do fim do estudo. Em contraste, os animais que recebem mahIL-la + h^mlL-la são excepcionais em aparência, são bem cuidados, activos, não mostram sinais de angústia, exibem crescimento e ganho de peso normais, e todos sobrevivem ao longo da duração da experiência. Os ratinhos que recebem a combinação de anticorpo de facto, no entanto, revelam lesões metastáticas observáveis após exame pós-morte minucioso dos órgãos. Isto é particularmente evidente em animais que têm tumores metastáticos estabelecidos antes de começar o tratamento. Parece que os ratinhos que recebem o tratamento somente após o desenvolvimento de lesões metastáticas estabelecidas são incapazes de subsequentemente limpar todas as lesões estabelecidas. No entanto, lesões metastáticas nestes ratinhos tratados são aparentemente parados.

Este efeito pode ser analisado após inocular ratinhos com tumor de mama ou próstata e sacrificar os animais no momento da doença metastásica detectável, que é o mesmo curso da doença onde os animais receberam tratamento. A abundância e tamanho das lesões metastáticas é claramente maior nestes ratinhos que o que é observado pós-morte em animais que recebem a combinação mahIL-la + hamIL-la. Parece que o tratamento com anticorpo tem como resultado a regressão da doença metastásica estabelecida.

Os ratinhos tratados com mahIL-la + hamIL-la que recebem injecção de anticorpo começando no Dia 1 após a inoculação do tumor são quase completamente prevenidos de desenvolver metástase. Somente um único animal (17%) em 16 cada um dos grupos de tumor de mama ou próstata desenvolve uma lesão metastática.

Tumores xenotransplantados humanos são utilizados num modelo de ratinho nude de metástase de tumor. A utilização de tumores humanos, que expressam IL-Ια humana, permite tentar tratar os ratinhos tendo como alvo: IL-Ια humana expressa em tumores; IL-Ια murina expressa em leucócitos (que para a simplicidade se denomina como produção de IL-la endógena); ou pela administração de dois anticorpos diferentes, tendo simultaneamente como alvo ambas as IL-la endógena e derivada de tumor. Isto permite começar a desenovelar, de algum modo, o papel em metástase de IL-la derivada de tumor dessa de IL-Ιαproduzida endogenamente (expressa de infiltrado leucocitário ou de tecidos do microambiente tumoral).

Os resultados sugerem que ambas IL-Ια endógena e derivada de tumor desempenham um papel em metástase de tumor, por causa do anticorpo direccionado contra a fonte de IL-Ια cada um melhora a sobrevivência em ratinhos. 0 anticorpo direccionado contra IL-Ια endógena é, no entanto, consideravelmente menos eficaz em proporcionar benefício de sobrevivência a longo prazo e não protege os ratinhos de metástase em comparação com anticorpo que tem como alvo IL-la derivada de tumor. Evidentemente, a expressão de IL-la dos tumores pelos próprios é suficiente para promover a metástase nestes modelos. 0 anticorpo direccionado contra IL-Ια expressa pelo tumor tem efeitos antitumorais potentes. Os efeitos antitumorais profundos em animais que recebem anticorpo IL-la antitumoral parecem envolver um bloqueio fisiológico de IL-Ια em metástase de tumor, mas podem também envolver acção tumoricida directa do anticorpo. Espera-se que direccionar como alvo a IL- la expressa por tumor utilizando um anticorpo IgGl, uma subclasse de anticorpo que induz eficientemente a fixação do complemento e 17 citotoxicidade celular direccionada por anticorpo (ADCC), pode representar uma acção tumoricida considerável contra os tumores que expressam IL-loc no modelo de ratinho nude. No entanto, se o efeito antitumoral de anticorpo direccionado contra IL-loc derivada de tumor actua exclusivamente via um ADCC ou outro mecanismo citotóxico, não haveria uma expectativa de efeito sinergistico com os dois anticorpos. Nem que seria esperado que a anticorpo direccionado contra IL-loc endógena impactaria na sobrevivência; ao passo que, existe um beneficio de sobrevivência consistente, embora modesta, visto em animais tratados com anticorpo direccionado contra IL-loc endógena. É possível o benefício de sobrevivência visto a partir do direccionament o como alvo IL-loc ant i-endógena com o anticorpo hamIL-lcc é um resultado da reactividade cruzada hamIL-lcc com humana IL-loc, direccionando deste modo como alvo o tumor directamente. Examinou-se a reactividade cruzada para o anticorpo anti- murina IL-loc, para avaliar se o benefício de sobrevivência é um resultado directo de reactividade cruzada do anticorpo com IL-loc expressa por tumor, induzindo ADCC do tumor, bloqueio de IL-loc fisiológico da produção de IL-loc de tumor, ou ambos. Não existe reactividade cruzada aparente com o anticorpo. Além disso, o anticorpo hamIL-loc não liga-se eficientemente a receptores Fc murinos e provavelmente não induz uma resposta ADCC eficaz. A partir dos resultados de direccionamento diferencial como alvo de IL-loc endógena e expressa por tumor num modelo de xenotransplante em ratinhos nude conclui-se que bloqueio fisiológico de IL-loc pode reduzir a letalidade de tumores. 0 efeito sinergistico de benefício de sobrevivência para a combinação de anticorpo anti-IL-loc, direccionado a ambas IL-loc endógena e derivada de tumor, proporciona compelir a evidência de que ambas as fontes de IL-loc de tumor e endógena são importantes em metástase de tumor neste 18 modelo. Estes resultados também emitiram luz favorável em outros relatos que sugerem que IL-Ια desempenha um papel fisiológico na interacção dinâmica entre tumor e hospedeiro; e que a expressão IL-Ια pode melhorar o potencial metastático de tumores.

Ter como alvo a produção de IL-Ια pelas células tumorais utilizando um anticorpo monoclonal é um meio eficaz de prolongar a sobrevivência e reduzir a carga metastática. 0 anticorpo que tem como alvo os tumores que expressam IL-Ια seriam de valor terapêutico potencial na configuração da doença em humanos e pode representar um alvo terapêutico eficaz para numerosas formas de cancro em estágios precoce ou avançado da doença.

Relatou-se em outra parte que no máximo 20 % de pessoas analisadas têm auto-anticorpo que neutraliza IL-la no seu soro. Além disso, estas pessoas são relatadas como saudáveis durante períodos de observação do volume. De maneira similar, ratinhos IL- la suprimidos estão sem um fenótipo aparente (Horai et al. J. Exp. Med. 1998 187:1463-1475). Finalmente, relatou-se em outra parte (Svenson et al.) que os animais podem ser imunizados simplesmente e eficientemente com IL-Ια para induzir respostas de anticorpo potentes e neutralizantes contra a citocina. Estes achados sugerem que uma imunoterapêutica activa, tal como uma imunização com IL-Ια para induzir auto-anticorpo de neutralização, poderia também ser um meio eficaz de tratar cancro humano que expressa IL-la. EXEMPLO 5

Materiais e Métodos

Medição de titulações de anticorpo anti-IL-Ια por meio de ELISA IL-la humano ou murino, respectivamente, são incubados em placas de ELISA de 96 poços durante a noite, utilizando 0,5 pg/ml com um volume de 100 μΐ por poço. As placas são então lavadas 4 vezes com solução salina tamponada com 19 fosfato (PBS) + 0,05 % de Tween 20, então saturada com um solução de bloqueio que contém 1 % de albumina de soro bovino (BSA) em PBS + 0,05 % de Tween 20 . 200 μΐ deste tampão de bloqueio são utilizados por poço durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Em seguida as placas são lavadas de novo 4 vezes com PBS + 0,05 % de Tween 20 (PBST) . 100 ml de amostras de soro diluídas em série (diluições 1:2 em PBST + 1 % de BSA) são adicionados em seguida e incubadas durante um hora a temperatura ambiente ou a 4 °C durante a noite. Em seguida as placas são lavadas de novo 4 vezes com PBST. Em seguida anticorpo anti-Fc acoplado com peroxidase de rábano (HRP) é adicionado como um anticorpo secundário (diluto 1:2000 em PBST com 1 % de BSA em, 100 μΐ por poço, 1 hora, temperatura ambiente). Ser humano: 0,2 μΐ de IgG anti humano de cabra-HRP em 400 μΐ de PBST + 1 % de BSA. Ratinho: 0,5 μΐ IgG anti ratinho de cabra HRP (H+L). Em seguida as placas são lavadas de novo 4 vezes com PBST. A reacção de coloração é feita com tampão ABTS (ácido 3-etilbenztiazolino-6-sulfónico, Sigma N° de Cat A-1888, 150 mg, 0,1 M de ácido cítrico, Fisher anidro, N° de Cat A-940, 500 ml, ajuste de pH a 4,35 com pelotas de NaOH, alíquota a 11 ml por frasco e armazenamento a -20 °C, 40 % de SDS (80 g de SDS em 200 ml de dd H20) , adicionar 200 ml de DMF (Ν,Ν-dimetil formamida) ) . 100 μΐ do tampão ABTS são adicionados a cada poço. A reacção é parada pela adição de 100 μΐ de 2 % de solução de ácido oxálico quando bom contraste é visível. Em seguida a densidade óptica é medida com um leitor de ELISA a um comprimento de onda de 405 nm.

Monitorização de animais durante desafio com tumor A saúde do animal foi registada pela monitorização da aparência, ingestão de alimentos e água, comportamento natural bem como comportamento provocado utilizando o seguintes sistema de pontuação: Pontuação 0: sem desvio do normal; Pontuação 1: desvio suave do normal; Pontuação 2: 20 desvio moderado do normal; Pontuação 3: desvio substancial do normal. Se 3 é pontuado mais de uma vez, um extra 1 é dado a cada, tornando uma pontuação máxima de 15. Pontuação 0-3: Normal. Pontuação 4-7: Monitorizar cuidadosamente. Pontuação 8-15: o animal está sofrendo. 0 animal é sacrificado. Os animais foram também sacrificados quando tinham uma perda de peso corporal de mais de 15 % ou a temperatura corporal caia mais de 3,0 °C.

Linhas de células tumorais células EL-4 foram obtidas da Colecção Americana de

Culturas Celulares (ATCC, Manassas VA, USA). EL-4 foi estabelecida a partir um linfoma induzido num ratinho C57BL/6 por 9,10-dimetil-l,2-benzantraceno. As células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco com 4 mM de L-glutamina ajustado para conter 1,5 g/L de bicarbonato de sódio e 4,5 g/L de glucose, 90 %, soro fetal de vitelo, 10 %. Células PC-3 foram obtidas da Colecção Americana de

Culturas Celulares (ATCC, Manassas VA, USA) . A linha de células PC-3 foi iniciada a partir de um metástase óssea de um adenocarcinoma prostático de grau IV a partir de um macho caucásico de 62 anos de idade. A linha de células foi crescida utilizando meio F12K de Ham com 2 mM de L- glutamina ajustada para conter 1,5 g/L de bicarbonato de sódio, 90 %; soro fetal bovino, 10 %.

Imunização de ratinhos com IL-Ια e IL-Ιβ conjugado com PPD IL-loc e IL-Ιβ foram obtidos de eBioscience (San Diego, CA). PPD foi obtido de Statens Serum Institute (Copenhagen, Dinamarca). O método para conjugação foi adaptado de Svenson et al. (Svenson M. 2000). IL-Ια ou IL-1 β foram incubadas durante 48 h a 4 °C com PPD a uma razão de 0,41 (p/p) e na presença de 0,1 % de glutaraldeido (IL-l/PPD = 0,41) . Como um controlo PPD foi tratado em paralelo, mas sem IL-1 oí ou IL-1 β. Em seguida o conjugado foi então adsorvida a Al(OH)3 (Rehydragel; Reheis Chemical, Dublin, 21

Irlanda) de modo que havia 1,5 % de A1(0H)3 no volume final. Incubação com Alume foi durante 90 min a temperatura ambiente. As partículas foram então lavadas com 0,9 % de NaCl e resuspensas em 0,9 % de NaCl a 11 pg de suspensão de IL-Ioí/100 μΐ, supondo uma adsorção de 70 % de IL-Ια para AI (OH)3 (encontrado em estudos pilotos utilizando 125I-IL-la) . 0 IL-1 β conjugado foi preparado do mesmo modo. Suspensões de controlo foram diluídos de maneira idêntica para igualar a quantidade de PPD no conjugado de IL-la-PPD. Os conjugados foram armazenados a 4 °C até utilização. EXEMPLO 6

Geração de uma resposta de anticorpo anti-IL-Ια em ratinhos C5 7BL/6

Como o sistema imune é tolerante contra auto-proteínas tal como citocinas, no entanto, tal vacinação activa tem que quebrar auto-tolerância. Em caso da maioria da tolerância imune de auto proteínas é causado pela falta de células T específicas como um consequência de selecção negativa no timo. Ao contrário, self-reactive células B potencialmente auto reactivas são usualmente presentes. Quando se injecta a IL-Ια similar a auto-proteína sozinha, estas B células do não respondes, devido à falta de célula T auxiliar. O acoplamento de uma proteína estranha tal como PPD ao auto antigénio IL-Ια, T célula auxiliar para a estimulação de célula B é proporcionada, porque as células T reconhecem PPD que resulta em produção de anticorpo de células B estimuladas contra IL-loc e PPD. Portanto, os inventores vacinaram ratinhos com um conjugado de IL-la-PPD em alume para assegurar a célula T auxiliar eficazpara as células B específicas de IL-1 β. As titulações de anticorpo foram determinadas por meio de ELISA. Grupos de 5 ratinhos receberam imunizações subcutâneas com 15 pg de conjugado de IL-Ια recombinante a 10 pg-PPD utilizando uma etapa de incubação com glutaraldeído. Em seguida o conjugado de IL-la-PPD é absorvido a alume. Os ratinhos receberam três tais 22 imunizações subcutâneas com intervalo de tempo de 2 semanas.

Os ratinhos imunizados produziram altas titulações de anticorpos anti-IL-Ια, ao passo que os ratinhos de controlo imunizados com PPD em alume falharam em induzir titulações de anticorpo detectáveis (Fig. 2). A indução de anticorpos anti-IL-Ια requereu pelo menos 2 injecções. Após somente uma injecção de conjugado de IL-la-PPD recombinante em alume nenhuma resposta de anticorpo foi detectada nos soros, mas após uma terceira injecção de conjugado de IL-la-PPD recombinante em alume todos os ratinhos vacinados produziram anticorpos anti-IL-la. EXEMPLO 7

Imunização activa contra IL- la protege ratinhos contra desafio com tumor com EL-4

Os ratinhos C57BL/6 foram activamente imunizados por meio de três injecções de 15 pg de conjugado de IL-la murino com 10 pg de PPD em alume nos dias 0, 14 e 28 por meio de administração subcutânea na região do pescoço. O volume de injecção foi de 100 μΐ, e a quantidade de hidróxido de alumínio foi aproximadamente 1 mg. Ratinhos de controlo foram tratados de maneira similar, mas com uma preparação que continha a mesma quantidade de PPD e hidróxido de alumínio, mas que não continha IL-Ια. Foram colhidas amostra de sangue da veia da cauda nos dias 0, 28, 42, e 56 com a finalidade de confirmar a formação de respostas de anticorpo anti-ILla por meio de ELISA. No dia 56 após a primeira imunização, todos os ratinhos receberam um inoculo de 1.000 células de linfoma EL-4. Subsequentemente, os ratinhos foram observados diariamente durante as seguintes quatro semanas. No primeiro surgimento dos sinais de doenças, ratinhos foram sacrificados para quantificação macroscópica e histológica de crescimento tumoral e metástase. 23

Dentro 30 dias após o desafio com tumor, os ratinhos de controlo mostraram sinais de doenças devido a progressão do tumor, como foi evidenciado por metástase disseminada macroscopicamente visível em órgãos viscerais. Ao contrário, nenhum dos ratinhos activamente imunizados contra IL-loc mostraram sinais clínicos de doença. EXEMPLO 8

Imunização passiva contra IL-loc protege contra EL-4 linfoma de ratinho

Os ratinhos C57BL/6 foram activamente imunizados contra IL-loc com 3 injecções subcutâneas de conjugado de IL-loc-PPD em alume. Após 56 dias seus soros foi colhidos e a geração de titulações autoanticorpo anti-IL-Ια foi confirmada por meio de ELISA. 200 μΐ de tais soros foi passivamente transferidos a ratinhos de 6 semanas de idade C57BL/6. Estas transferências de soro passivas foram repetidas a cada semana. Ratinhos de controlo C57BL/6 receberam 200 μΐ de soro de ratinhos naive C57BL/6 com intervalos semanais. Juntamente com a primeira transferência de soro todos os ratinhos receberam um inoculo de 1.000 células de linfoma EL-4. Subsequentemente, ratinhos foram observados diariamente durante as seguintes quatro semanas. No primeiro surgimento de sinais de doenças, os ratinhos foram sacrificados para quantificação macroscópica e histológica de crescimento tumoral e metástase.

Dentro de 30 dias, os ratinhos de controlo sucumbiram ao tumor, como foi evidenciado por metástase disseminada macroscopicamente visível em órgãos viscerais. Ao contrário, nenhum dos ratinhos que receberam a transferência de soro passiva com antisoro anti-IL- la policlonal mostraram sinais clínicos de doença. EXEMPLO 9

Imunização passiva contra IL-loc protege ratinhos SCID contra tumor de xenoenxerto de PC-3

Os ratinhos C57BL/6 foram activamente imunizados contra IL-loc com 3 injecções subcutâneas de conjugado de IL-la-PPD em alume. Após 56 dias seus soros foram colhidos e a geração de titulações de autoanticorpo anti-IL-loí foram confirmadas por meio de ELISA. 200 μΐ de tal soro foi passivamente transferido a SCID ratinhos fêmeas de 6 semanas de idade. Estas transferências de soro passivas foram repetidas a cada semana. Os ratinhos SCID de controlo receberam 200 μΐ de soro de ratinhos naive C57BL/6 com intervalos semanais. Juntamente com a primeira transferência de soro todos os ratinhos receberam um inoculo subcutâneo de 107 células PC-3 nas costelas. Os ratinhos com tumores palpáveis foram identificados a cada semana.

Dentro de 30 dias, ratinhos de controlo tinham desenvolvido tumores palpáveis no local de inoculação, ao passo que nenhum dos ratinhos que receberam a transferência de soro passiva com antisoro anti-IL-loc policlonal desenvolveram um tumor palpável. EXEMPLO 10

Destruição mediada por complemento dependente de Anticorpo

e ADCK

Os ratinhos C57BL/6 foram activamente imunizados contra IL-loc com 3 injecções subcutâneas de conjugado de IL-la-PPD em alume. Após 56 dias seus soror foram colhidos e a geração de titulações de autoanticorpo anti-IL-loc foram confirmadas por meio de ELISA. Os soros foram inactivados por calor. 50 μΐ de um suspensão de célula EL-4 foram inoculadas em placa em placas 96 de poço. A cada um destes poços 15 μΐ de diluições em sériel:2 do soro inactivado por calor foi adicionado. Em seguida as placas foram incubadas durante 20 minutos a 37 °C. Então 25 ml de soro murino foram adicionados a cada poço. Após outras 5 h de incubação a 37 °C os poços são fotografados e então as 25 células contadas numa câmara de contagem utilizando azul de tripano para distinguir as células vivas das mortas. 0 antisoro policlonal de ratinho anti- IL-lcí de ratinho mediou destruição dependente de complemento de células tumorais EL-4 numa maneira dependente da concentração. Veja-se a figura 3. 26

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor da presente solicitação de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 9413804 A [0015]

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Claims (10)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpos anti-IL-Ια para utilização no tratamento de cancro num paciente mamífero.

2. Os anticorpos anti-IL-Ια de acordo com a reivindicação 1 em que o paciente é um ser humano.

3. Os anticorpos anti-IL-Ια de acordo com a reivindicação 1 em que o paciente é seleccionado do grupo que consiste em um ratinho, um porco, uma cabra, um cão, um gato, e uma ovelha.

4. Os anticorpos anti-IL-Ια de acordo com a reivindicação 1 em que o cancro é metastático.

5. Os anticorpos anti-IL-Ια de acordo com a reivindicação 1 em que o cancro é cancro de mama ou de próstata.

6. Os anticorpos anti-IL-Ια de acordo com a reivindicação 1 em que os anticorpos são policlonais.

7. Os anticorpos anti-IL-Ια de acordo com a reivindicação 1 em que os anticorpos são monoclonais.

8. Os anticorpos anti-IL-Ια de acordo com a reivindicação 1 em que os anticorpos são seleccionados do grupo que consiste em Fab, F(ab')2, scFv, Fv, diacorpos, minicorpos, Kappa corpos, e Janusins.

9. IL-Ια para utilização no tratamento de cancro, pelo qual o paciente gera autoanticorpos contra IL-la.

10. A IL-la de acordo com a reivindicação 9 em que o paciente é um ser humano.