JP7075183B2

JP7075183B2 - スイッチ可能ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびその使用

Info

Publication number: JP7075183B2
Application number: JP2016540409A
Authority: JP
Inventors: リウ，デービッド，アール．; フー，ジョニー，ハオ
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 2013-09-06
Filing date: 2014-09-05
Publication date: 2022-05-25
Anticipated expiration: 2034-09-05
Also published as: US9340800B2; WO2015035139A3; US20150071900A1; CA2923411C; JP7170328B2; US20150071902A1; WO2015035139A2; CA3178282A1; JP2023010712A; US20200255868A1; JP2020062024A; NZ717612A; US10597679B2; US20150071901A1; EP3693461A1; US11299755B2; US20230058176A1; CA2923411A1; JP2016533760A; AU2014315135B2

Description

関連出願
本出願は、２０１４年７月８日に出願された米国特許出願第１４／３２６，３２９号、２０１４年７月８日に出願された米国特許出願第１４／３２６，３４０号、２０１４年７月８日に出願された米国特許出願第１４／３２６，３６１号に対して、米国特許法第３６５条（ｃ）に基づく優先権の利益を主張し、また、２０１３年９月６日に出願された米国特許仮出願第６１／８７４，６８２号に対して、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張し、その全開示を参照により本明細書に組み込むものである。

部位特異的エンドヌクレアーゼは、理論上はゲノム内の単一の部位の標的操作を可能とし、標的遺伝子組換えに関して、また治療上の応用に対して有用である。哺乳動物を含む様々な有機体において、部位特異的エンドヌクレアーゼは、非相同末端結合または相同組換えのいずれかを刺激することによるゲノムエンジニアリングに使用されている。強力な研究ツールを提供することに加えて、部位特異的ヌクレアーゼは遺伝子治療剤として有望でもあり、２つの部位特異的エンドヌクレアーゼの臨床試験が最近始まった：そのうちの１つのＣＣＲ５－２２４６は、抗ＨＩＶ治療法の一環としてヒトＣＣＲ－５アレルを標的としており（ＮＣＴ００８４２６３４、ＮＣＴ０１０４４６５４、ＮＣＴ０１２５２６４１）、他の１つのＶＦ２４６８４は、抗癌治療法の一環としてヒトＶＥＧＦ－Ａプロモーターを標的としている（ＮＣＴ０１０８２９２６）。

オフターゲット活性がゼロあるいは極小で所期のヌクレアーゼ標的部位を特異的に切断することが、部位特異的エンドヌクレアーゼの臨床応用や、基礎研究応用での高効率ゲノム操作における必要条件である。例えば、操作された部位特異的結合ドメインの特異性が不完全であることが、細胞毒性および所期の標的以外のゲノム遺伝子座の望ましくない変化と関連があると考えられている。しかしながら、現在入手可能なヌクレアーゼの大部分は、有意なオフターゲット活性を示し、そのため臨床応用には適さないであろう。臨床および研究環境で使用するために注目されているヌクレアーゼプラットフォームは、Ｃａｓ９などのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである。これらのヌクレアーゼは、特異的な標的部位の切断を指示するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に結合可能であるが、オフターゲット活性が特定のＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体で依然観察されている（Pattanayak et al., "High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity." Nat Biotechnol. 2013; doi: 10.1038/nbt.2673）。従って、特異性を改善したヌクレアーゼを操作する技術が必要とされている。

本開示のいくつかの側面は、操作された部位特異的エンドヌクレアーゼの報告された毒性はオフターゲットＤＮＡ切断に拠るという認識に基づいている。更に、既存のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの活性は、一般に、例えば、ヌクレアーゼを「オフ」から「オン」状態へ切り換えるなどの分子レベルでの調節はできない。ヌクレアーゼの活性を調節することは、オフターゲット効果が起こる可能性を抑制することができるかもしれない。本開示のいくつかの側面は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼなどＲＮＡプログラム可能エンドヌクレアーゼの結合および／または切断活性を調節する方策、組成物、システム、および方法を提供する。

従って、本開示の１つの実施態様は、「スイッチ可能」ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ複合体を提供する。例えば、いくつかの実施態様では、本発明は、（ｉ）アプタマーに結合する特異的リガンドの非存在下では標的核酸にハイブリダイズしない、アプタマーを含むｇＲＮＡと；（ｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質とを含む複合体を提供する。いくつかの実施態様では、アプタマーにリガンドが結合している。いくつかの側面では、リガンドは任意の分子である。いくつかの側面では、リガンドは、小分子、代謝産物、炭水化物、ペプチド、タンパク質、または核酸である。いくつかの実施態様では、ｇＲＮＡ：リガンド：Ｃａｓ９複合体は、標的核酸に結合しその切断を仲介する。例えば、図１参照。

他の実施態様によれば、アプタマーを含むｇＲＮＡが提供される。いくつかの実施態様では、ｇＲＮＡは、アプタマーに結合したリガンドの非存在下では標的核酸にハイブリダイズしない。そのようなｇＲＮＡは、「スイッチ可能ｇＲＮＡ」と呼ぶことができる。例えば、いくつかの側面では、ｇＲＮＡは、アプタマーに結合したリガンドの非存在下ではＣａｓ９を結合しない。例えば、図１Ａおよび図１Ｂ参照。いくつかの実施態様では、ｇＲＮＡは、アプタマーにそれに特異的なリガンドが結合したときにＣａｓ９に結合する。いくつかの実施態様では、ｇＲＮＡは、アプタマーを結合したリガンドの存在下または非存在下でＣａｓ９に結合するが、アプタマーを結合したリガンドの存在下でのみ標的核酸に結合する。いくつかの側面では、リガンドは任意の分子である。いくつかの側面では、リガンドは、小分子、代謝産物、炭水化物、ペプチド、タンパク質、または核酸である。いくつかの実施態様では、アプタマーは、例えばリボスイッチに由来するＲＮＡアプタマーなどのＲＮＡアプタマーである。いくつかの実施態様では、アプタマーが由来するリボスイッチは、テオフィリンリボスイッチ、チアミンピロリン酸エステル（ＴＰＰ）リボスイッチ、アデノシンコバラミン（ＡｄｏＣｂｌ）リボスイッチ、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）リボスイッチ、ＳＡＨリボスイッチ、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）リボスイッチ、テトラヒドロ葉酸リボスイッチ、リジンリボスイッチ、グリシンリボスイッチ、プリンリボスイッチ、ＧｌｍＳリボスイッチ、またはプレケオシン１（ＰｒｅＱ１）リボスイッチから選択される。いくつかの実施態様では、アプタマーは、テオフィリンリボスイッチに由来し、配列番号３を含む。他の実施態様では、アプタマーは、天然に存在せず、またいくつかの側面では、試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）プラットフォームを用いて特異的リガンドを結合するよう操作されている。いくつかの実施態様では、ｇＲＮＡの非アプタマー部分は、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、または少なくとも１５０個のヌクレオチドを含み、アプタマーは少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、または少なくとも３００個のヌクレオチドを含む。

他の実施態様によれば、本発明のＣａｓ９変異体を用いた部位特異的ＤＮＡ切断方法が提供される。例えば、いくつかの側面では、前記方法は、（ｉ）ＤＮＡの部分に結合する配列を含む、アプタマーを含むｇＲＮＡと、（ｉｉ）ｇＲＮＡのアプタマーに結合した特異的リガンドと、（ｉｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質とを含む複合体を、Ｃａｓ９タンパク質がＤＮＡを切断する条件下で、ＤＮＡに接触させることを含む。

他の実施態様によれば、細胞において部位特異的ＤＮＡ切断を誘発する方法が提供される。例えば、いくつかの実施態様では、前記方法は、（ａ）ＤＮＡ標的配列に結合可能な配列を含む、アプタマーを含むｇＲＮＡを細胞に接触させることまたは細胞中で発現させること；（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質を細胞に接触させることまたは細胞中で発現させること；および（ｃ）ｇＲＮＡのアプタマーを結合するリガンドを細胞に接触させることにより、ＤＮＡ標的を切断するｇＲＮＡ：リガンド：Ｃａｓ９複合体を形成することを含む。いくつかの実施態様では、細胞は、例えば生理学的または病態生理学的プロセスの一環として、細胞内でリガンドを産生する。いくつかの実施態様では、前記方法は、（ａ）ＤＮＡ標的配列に結合可能な配列を含み、アプタマーを含むｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とを含む複合体を細胞に接触させること；および（ｂ）ｇＲＮＡのアプタマーに結合するリガンドを細胞に接触させることにより、ＤＮＡ標的を切断するｇＲＮＡ：リガンド：Ｃａｓ９複合体を形成することを含む。いくつかの側面では、工程（ａ）および工程（ｂ）は、同時にまたは順次に任意の順番で実施される。いくつかの実施態様では、前記方法はin vitroで実施されるが、他の実施態様では、前記方法はin vivoで実施される。

他の実施態様によれば、ｍＲＮＡをセンスするｇＲＮＡを含むＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ複合体が提供される。例えば、いくつかの実施態様では、複合体は、（ｉ）標的核酸の領域とハイブリダイズする領域と；（ｉｉ）領域（ｉ）の配列と部分的にまたは完全にハイブリダイズする他の領域と；（ｉｉｉ）転写物（ｍＲＮＡ）の領域とハイブリダイズする領域とを含むｇＲＮＡと、Ｃａｓ９タンパク質とを含む。

他の実施態様によれば、例えば、（ｉ）標的核酸の領域とハイブリダイズする領域と；（ｉｉ）領域（ｉ）の配列と部分的にまたは完全にハイブリダイズする他の領域と；（ｉｉｉ）転写物（ｍＲＮＡ）の領域とハイブリダイズする領域とを含む、ｍＲＮＡをセンスするｇＲＮＡが提供される。例えば、図２を参照。いくつかの実施態様では、領域（ｉ）、領域（ｉｉ）、および領域（ｉｉｉ）の各配列は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個のヌクレオチドを含む。いくつかの側面では、ｇＲＮＡは、ステムが領域（ｉｉ）の配列の一部または全部とハイブリダイズした領域（ｉ）の配列を含み、ループが領域（ｉｉｉ）の配列の一部または全部から形成されるステム・ループ構造を形成する。いくつかの実施態様では、領域（ｉｉ）および領域（ｉｉｉ）の両方が、領域（ｉ）に対して５’または３’側のいずれかにある。例えば、図２Ａ対図２Ｃを参照。いくつかの実施態様では、領域（ｉｉｉ）の配列とハイブリダイズする転写物の非存在下でステム・ループ構造が形成される。この例では、ｇＲＮＡは「オフ」状態であるという。例えば、図２Ａおよび図２Ｃを参照。いくつかの実施態様では、転写物が領域（ｉｉｉ）の配列へ結合することにより、領域（ｉｉ）の配列が領域（ｉ）の配列にハイブリダイズしないように、ステム・ループ構造がアンフォールディングされるかまたはステム・ループ構造の形成が阻止される。この例では、ｇＲＮＡは「オン」状態であるという。例えば、図２Ｂおよび図２Ｄを参照。いくつかの実施態様では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質を結合し、領域（ｉｉｉ）の配列が転写物を結合する（例、「センスする」）と、領域（ｉ）の配列が標的核酸とハイブリダイズする。

他の実施態様によれば、例えば、複合体がＤＮＡに結合し切断することが可能となるようにｍＲＮＡが結合する、ｍＲＮＡをセンスするｇＲＮＡと会合するＣａｓ９タンパク質を含む複合体を、ＤＮＡに接触させることを含む、部位特異的ＤＮＡ切断方法が提供される。

他の実施態様によれば、伸長ＤＮＡ認識（ｘＤＮＡをセンスする）ｇＲＮＡｓが提供される。例えば、図３を参照。いくつかの実施態様では、ｘＤＮＡをセンスするｇＲＮＡは、（ｉ）標的核酸の領域とハイブリダイズする領域と；（ｉｉ）領域（ｉ）の配列と部分的にまたは完全にハイブリダイズする他の領域と；（ｉｉｉ）標的核酸の他の領域とハイブリダイズする領域とを含む。いくつかの実施態様では、領域（ｉ）および領域（ｉｉ）の各配列は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個のヌクレオチドを含み、領域（ｉｉｉ）の配列は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、または少なくとも１００個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、ｇＲＮＡは、ステムが領域（ｉｉ）の配列の一部または全部とハイブリダイズした領域（ｉ）の配列を含み、ループが領域（ｉｉｉ）の配列の一部または全部により形成されているステム・ループ構造を形成する。いくつかの実施態様では、領域（ｉｉ）および領域（ｉｉｉ）の両方が、領域（ｉ）に対して５’または３’側のいずれかにある。例えば、図３Ａ対図３Ｃ参照。いくつかの実施態様では、ステム・ループ構造は、領域（ｉｉｉ）における配列に相補・結合する標的核酸の領域の非存在下で形成される。例えば、図３Ａおよび図３Ｃを参照。いくつかの実施態様では、標的核酸の領域の領域（ｉｉｉ）の配列へのハイブリダイゼーションにより、領域（ｉｉ）の配列が領域（ｉ）の配列にハイブリダイズしないように、ステム・ループ構造がアンフォールディングされるかまたはステム・ループ構造の形成が阻止される。例えば、図３Ｂおよび図３Ｄを参照。いくつかの実施態様では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質を結合し、領域（ｉｉｉ）における配列が標的核酸を結合すると（ｉ）中の配列が標的核酸を結合する。

他の実施態様によれば、任意に標的核酸を含み、ｘＤＮＡをセンスするｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とを含む複合体が提供される。いくつかの実施態様では、複合体の形成により、標的核酸が切断される。

他の実施態様によれば、ｘＤＮＡをセンスするｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とを含む複合体をＤＮＡに接触させることを含む、部位特異的ＤＮＡ切断方法が提供される。

本明細書で提供される方法はいずれも、例えば、in vitroまたはin vivoの細胞などの細胞中のＤＮＡに対して実施することが可能である。いくつかの実施態様では、本明細書で提供される方法はいずれも、真核細胞中のＤＮＡに対して実施される。いくつかの実施態様では、真核細胞は、例えばヒトなどの個体中にある。

他の実施態様によれば、例えば本明細書に記載のｇＲＮＡ、複合体、またはタンパク質（例、Ｃａｓ９タンパク質）のいずれかをコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のｇＲＮＡ、複合体、またはタンパク質（例、Ｃａｓ９タンパク質）のいずれかの組換え発現用ベクターが提供される。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のｇＲＮＡ、複合体、またはタンパク質（例、Ｃａｓ９タンパク質）のいずれかを発現する遺伝子構築物を含む細胞が提供される。

いくつかの実施態様では、キットが提供される。例えば、本明細書に記載のｇＲＮＡ、複合体、またはタンパク質（例、Ｃａｓ９タンパク質）のいずれかを含むキットが提供される。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含むキットが提供される。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のｇＲＮＡ、複合体、またはタンパク質（例、Ｃａｓ９タンパク質）のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現用ベクターを含むキットが提供される。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のｇＲＮＡ、複合体、またはタンパク質（例、Ｃａｓ９タンパク質）のいずれかを発現する遺伝子構築物を含む細胞を含むキットが提供される。

本発明のその他の利点、特徴、および使用は、本発明のいつくかの実施態様の詳細な説明、模式的であり正確な縮尺ではない図面、および請求の範囲から明らかとなるであろう。

図１Ａ～図１Ｄは、アプタマーにリンクしたｇＲＮＡに関する本発明のいくつかの実施態様を示す。（Ａ）本図では、アプタマーを含むスイッチ可能ｇＲＮＡを模式的に図示する。アプタマーを結合する特異的リガンド（本図では代謝産物）の非存在下で、標的核酸に結合すべき配列は、アプタマーの部分（「スイッチング配列」と示された一番左の部分参照）とハイブリダイズしている。代謝産物の結合に際して、アプタマーは、標的核酸に結合すべき配列がもはやアプタマー配列とハイブリダイズしないような立体構造変化を受けて、標的にハイブリダイズすることを可能とする。（Ｂ）「オン」状態へのスイッチングに際して、Ｃａｓ９と結合すると、ｇＲＮＡは、ハイブリダイズしている標的部位へとヌクレアーゼを配向させ、Ｃａｓ９が標的核酸の各鎖を切断することを可能とする。（ＣおよびＤ）本図では、ｇＲＮＡにリンクしたアプタマーは、テオフィリンリボスイッチに由来する。テオフィリンの非存在下で（Ｃ）、アプタマーの部分（「テオフィリン・リボスイッチ」と示す）は、標的核酸（パネルの上部の二本鎖配列により示す）に結合すべき配列（「標的切断ガイド」と示す）の部分を結合して、ｇＲＮＡが標的核酸にハイブリダイズすることを阻止する。図１Ｃにおいて、配列は、上から下へ、配列番号４～６に対応する。アプタマーにテオフィリン（アプタマー配列に結合している中実の小分子として示す）が結合すると（Ｄ）、立体構造変化を受けて、「ガイド」配列が標的核酸に自由にハイブリダイズすることになる。図１Ｄにおいて、配列は、上から下へ、配列番号４、５、および１１に対応する。

図２Ａ～図２Ｄは、ｍＲＮＡをセンスするｇＲＮＡに関する本発明のいくつかの実施態様を示す。（ＡおよびＢ）本図は、５’転写物センサー／ガイドブロックモチーフを含むｇＲＮＡを示す。特定のｍＲＮＡの非存在下では（Ａ）、転写物センサーの部分が結合されないままであり、標的核酸（パネル上部の二本鎖配列により示す）を結合すべき配列の特定の部分（「標的切断ガイド」と示す）をブロックするステム・ループ構造を形成し、その結果ｇＲＮＡが標的核酸にハイブリダイズすることを阻止する。図２Ａにおいて、配列は、上から下へ、配列番号４、５、および７に対応する。転写物センサーがハイブリダイズするｍＲＮＡの存在下で（Ｂ）、ｇＲＮＡは立体構造変化を受けて、「ガイド」配列が標的核酸に自由にハイブリダイズする。配列は、上から下へ、配列番号４、５、７、および１２に対応する。（ＣおよびＤ）同様に、ｍＲＮＡの非存在下で（Ｃ）、ｇＲＮＡが「オフ」状態であり（配列は、上から下へ、配列番号４、５、および８に対応する）、ｍＲＮＡの存在下で（Ｄ）、ｇＲＮＡが「オン」状態（配列は、上から下へ、配列番号４、５、および１２に対応する）であるように、この方策を、３’転写物センサー／ガイドブロックを含むｇＲＮＡに応用できる。

図３Ａ～図３Ｄは、伸長ＤＮＡ（ｘＤＮＡ）認識方策に関する本発明のいくつかの実施態様を示す。（ＡおよびＢ）本実施態様では、５’ｘＤＮＡセンサー／ガイドブロックモチーフを含むｇＲＮＡを示す。ｘＤＮＡセンサーモチーフは、標的核酸の他の部分（例えば、「標的切断ガイド」配列に追加して）に相補・ハイブリダイズする。（Ａ）適正な標的配列（例、「ガイド」配列の標的とｘＤＮＡセンサー配列の標的の両方を含む）の非存在下では、ｘＤＮＡセンサーの部分は結合しないままでおり、その結果、標的核酸（パネルの上部に二本鎖配列で示す）に結合すべき配列の特定の部分（「標的切断ガイド」として示す）をブロックするステム・ループ構造を形成し、ｇＲＮＡが標的核酸にハイブリダイズすることを阻止する。配列は、上から下へ、配列番号４、５、および９に対応する。ｘＤＮＡセンサーの部位がハイブリダイズする適正な標的核酸の存在下では（Ｂ）、ｇＲＮＡは立体構造変化を受けて、「ガイド」配列が自由に標的核酸にハイブリダイズする。配列は、上から下へ、１３、１４、および９に対応する。このように、適正な標的核酸の存在下でのみ、ｇＲＮＡ（および関連するＣａｓ９タンパク質）の結合は起こる。これは、例えばＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体により認識される標的ヌクレオチドの数を効果的に増加させ（すなわち、延長させ）、特異性を高めることになる。（ＣおよびＤ）同様に、この方策は、標的核酸の非存在下では（Ｃ）、ｇＲＮＡは「オフ」状態（配列は、上から下へ、配列番号４、５、および１０）であり、標的核酸の存在下では（Ｄ）ｇＲＮＡは「オン」状態であるよう、３’ｘＤＮＡセンサー／ガイドブロックを含むｇＲＮＡに応用できる。配列は上から下へかつ左から右へ配列番号４、１５、５、１６、および１０に対応する。

定義
本明細書および請求の範囲で使用される、単数型の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈から明らかに判別されない限り、単数型および複数型を含むものである。従って、例えば、「薬剤」という場合には、単一の薬剤および複数の薬剤を含む。

「アプタマー」という用語は、例えば特異的リガンドなどの特異的な標的分子に結合する核酸またはペプチド分子を意味する。いくつかの実施態様では、リガンドのアプタマーへの結合が、アプタマーと、例えばアプタマーへ接合またはリンクした他の分子とにおける立体構造変化を誘導する。いくつかの実施態様では、核酸（例、ＤＮＡまたはＲＮＡ）アプタマーは、例えば、小分子、大分子、代謝産物、タンパク質、タンパク質、炭水化物、金属、核酸、細胞、組織および有機体などの様々な分子標的に結合するように、in vitroの選択または同等のＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）を繰り返し行うことにより操作されている。小分子を結合するようにアプタマーを操作する方法は、当分野で公知であり、例えば、全内容を参照により本明細書に取り込む、米国特許第５，５８０，７３７号および第８，４９２，０８２号；Ellington and Szostak, "In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands." Nature. 1990; 346:818-822; Tuerk and Gold, "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase." Science. 1990; 249:505-510; Burke and Gold, "RNA aptamers to the adenosine moiety of S-adenosyl methionine: structural inferences from variations on a theme and the reproducibility of SELEX." Nucleic Acids Res. 1997; 25(10):2020-4; Ulrich et al., "DNA and RNA aptamers: from tools for basic research towards therapeutic applications." Comb Chem High Throughput Screen. 2006; 9(8):619-32; Svobodova et al., "Comparison of different methods for generation of single-stranded DNA for SELEX processes. Anal Bioanal Chem. 2012; 404:835-842に記載のものが含まれる。核酸アプタマーは、例えば、リボスイッチの一部を形成するものなど天然にも存在している。「リボスイッチ」は、例えば代謝産物などの小分子を結合するｍＲＮＡ分子の制御セグメントであり、ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質（例、リボスイッチに結合する代謝産物の産生に関与するタンパク質）の産生に変化をもたらす。リボスイッチは、しばしば概念的に、アプタマーと発現プラットフォーム（例、ｍＲＮＡ）との２つの部分に分けられる。アプタマーは、小分子（例、代謝産物）を直接結合し、アプタマーの変化に応じてｍＲＮＡは構造変化を起こす。通常、ｍＲＮＡの構造変化により、タンパク質発現の減少または阻害が起こる。アプタマーは、当分野の常法により、リボスイッチからクローン（例、分離）し、それにリンクした他の分子（例、ＲＮＡ、ＤＮＡ）の活性を調節するために使用可能である。更に、天然に存在するアプタマーを、公知の方法により、合成の非天然小分子リガンドに結合するように再操作して、それにリンクした他の分子の活性を調節することが可能である。例えば、Dixon et al., "Reengineering orthogonally selective riboswitches." PNAS 2010; 107 (7): 2830-2835を参照、その全開示を参照により本明細書に組み込むものである。以下は、アプタマーを含むリボスイッチのリストであるが、これに限定するものではない。

コバラミンリボスイッチ（Ｂ１２エレメントとも呼ぶ）は、アデノシルコバラミン（ビタミンＢ１２の補酵素型）を結合してコバラミン生合成およびコバラミンおよび同様の代謝産物の輸送、および他の遺伝子を制御する。例えば、Nahvi et al., "Coenzyme B12 riboswitches are widespread genetic control elements in prokaryotes." Nucleic Acids Res. 2004; 32: 143-150; Vitreschak et al., "Regulation of the vitamin B12 metabolism and transport in bacteria by a conserved RNA structural element." RNA. 2003; 9:1084-1097を参照、それらの全内容を参照により本明細書に取り込むものである。

サイクリックジＧＭＰリボスイッチは、シグナル伝達分子サイクリックジＧＭＰに調節される様々な遺伝子を制御するために、この２番目のメッセンジャーを結合する。サイクリックジＧＭＰ－ＩリボスイッチおよびサイクリックジＧＭＰ－ＩＩリボスイッチの少なくとも２つのクラスのサイクリックジＧＭＰリボスイッチが公知である。例えば、Sudarsan et al., "Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP." Science. 2008; 321 (5887): 411-3; Lee et al., "An allosteric self-splicing ribozyme triggered by a bacterial second messenger." Science. 2010; 329 (5993): 845-8を参照、それらの全内容を参照により本明細書に取り込むものである。

ＦＭＮリボスイッチ（ＲＦＮエレメントとも呼ばれる）は、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を結合して、リボフラビンの生合成および輸送を制御する。例えば、Winkler et al., "An mRNA structure that controls gene expression by binding FMN." Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99 (25): 15908-15913; Serganov et al., "Coenzyme recognition and gene regulation by a flavin mononucleotide riboswitch." Nature. 2009; 458 (7235): 233-7を参照、それらの全内容を参照により本明細書に取り込むものである。

ＧｌｍＳリボスイッチは、グルコサミン－６－リン酸が結合したとき自分自身を切断するリボザイムである。例えば、Winkler et al., "Control of gene expression by a natural metabolite-responsive ribozyme." Nature. 2004; 428: 281-286; Jansen et al., "Backbone and nucleobase contacts to glucosamine-6-phosphate in the glmS ribozyme." Nat Struct Mol Biol. 2006; 13: 517-523; Hampel and Tinsley, "Evidence for preorganization of the glmS ribozyme ligand binding pocket." Biochemistry. 2006; 45: 7861-7871を参照、それらの全内容を参照により本明細書に取り込むものである。

グリシンリボスイッチは、グリシンを結合して、エネルギー源としてのグリシンの使用などのグリシン代謝遺伝子を制御する。例えば、"A glycine-dependent riboswitch that uses cooperative binding to control gene expression." Science. 2004; 306 (5694): 275-279; Kwon and Strobel, "Chemical basis of glycine riboswitch cooperativity." RNA. 2008; 14 (1): 25-34を参照、それらの全内容を参照により本明細書に取り込むものである。

リジンリボスイッチ（Ｌ－ｂｏｘとも呼ばれる）は、リジンを結合して、リジンの生合成、異化および輸送を制御する。例えば、Sudarsan et al., "An mRNA structure in bacteria that controls gene expression by binding lysine." Genes Dev. 2003;17:2688-2697; Grundy et al., "The L box regulon: Lysine sensing by leader RNAs of bacterial lysine biosynthesis genes." Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100:12057-12062を参照、それらの全内容を参照により本明細書に取り込むものである。

ＰｒｅＱ１リボスイッチは、プレケオシン１を結合し、この前駆体のケエオシンへの合成または輸送に関与する遺伝子を制御する。ＰｒｅＱ１－ＩリボスイッチおよびＰｒｅＱ１－ＩＩリボスイッチの少なくとも２つの異なるクラスのＰｒｅＱ１リボスイッチが公知である。例えば、Roth et al., "A riboswitch selective for the queuosine precursor preQ1 contains an unusually small aptamer domain," Nat Struct Mol Biol. 2007; 14 (4): 308-317; Klein et al., "Cocrystal structure of a class I preQ1 riboswitch reveals a pseudoknot recognizing an essential hypermodified nucleobase," Nat. Struct. Mol. Biol. 2009; 16 (3): 343-344; Kang et al., "Structural Insights into riboswitch control of the biosynthesis of queuosine, a modified nucleotide found in the anticodon of tRNA." Mol. Cell 33 2009; (6): 784-90; Meyer et al., "Confirmation of a second natural preQ1 aptamer class in Streptococcaceae bacteria." RNA 2008; 14 (4): 685を参照、それらの全内容を参照により本明細書に取り込むものである。

プリンリボスイッチは、プリンを結合して、プリンの代謝および輸送を制御する。異なる形態のプリンリボスイッチは、グアニン（元々Ｇ－ｂｏｘとして知られていた形態）またはアデニンを結合する。グアニンまたはアデニンのどちらかへの特異性は、例えばＹ７４などの特定の位置でのリボスイッチにおける単一のピリミジンとのワトソン・クリック型相互作用に完全に依存する。グアニンリボスイッチでは、この残基は通常シトシン（例、Ｃ７４）であり、アデニンリボスイッチでは通常ウラシル（例、Ｕ７４）である。プリンリボスイッチの相同型は、デオキシグアノシンを結合するが、一塩基変異以上の重要な相違がある。例えば、Serganov et al., "Structural basis for discriminative regulation of gene expression by adenine- and guanine-sensing mRNAs." Chem Biol. 2004; 11 (12): 1729-41; Batey et al., "Structure of a natural guanine-responsive riboswitch complexed with the metabolite hypoxanthine." Nature. 2004; 432 (7015): 411-415; Mandal and Breaker, "Adenine riboswitches and gene activation by disruption of a transcription terminator." Nat Struct Mol Biol. 2004; 11 (1): 29-35を参照、それらの全内容を参照により本明細書に取り込むものである。

ＳＡＨリボスイッチは、Ｓ－アデノシルホモシステインを結合し、Ｓ－アデノシルメチオニンがメチレーション反応で使用されるときに産生されるこの代謝産物の再利用に関与する遺伝子を制御する。例えば、Wang et al., "Riboswitches that Sense S-adenosylhomocysteine and Activate Genes Involved in Coenzyme Recycling." Mol. Cell 2008; 29 (6): 691-702; Edwards et al., "Structural basis for recognition of S-adenosylhomocysteine by riboswitches." RNA 2010; 16 (11): 2144-2155を参照、それらの全内容を参照により本明細書に取り込むものである。

ＳＡＭリボスイッチは、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を結合して、メチオニンおよびＳＡＭの生合成および輸送を制御する。ＳＡＭ－Ｉ（元々Ｓ－ｂｏｘと呼ばれる）、ＳＡＭ－ＩＩ、ＳＭＫボックスリボスイッチおよびＳａｍ－ＩＶの、少なくとも４つのＳＡＭリボスイッチが知られている。ＳＡＭ－Ｉは、バクテリアにおいてよくみられるが、ＳＡＭ－ＩＩはプロテオバクテリアαおよびプロテオバクテリアβそして数種のプロテオバクテリアγにだけ存在する。ＳＭＫボックスリボスイッチは、ラクトバチルス目にだけ存在すると考えられている。ＳＡＭ－ＩＶリボスイッチは、ＳＡＭ－Ｉリボスイッチと類似のリガンド結合コアを有するが、異なるスカフォールドと関連している。例えば、Montange et al., "Structure of the S-adenosyl methionine riboswitch regulatory mRNA element." Nature. 2006; 441:1172 -1175; Winkler et al., "An mRNA structure that controls gene expression by binding Sadenosylmethionine." Nat Struct Biol. 2003; 10: 701 -707; Zasha et al., "The aptamer core of SAM-IV riboswitches mimics the ligand-binding site of SAM-I riboswitches." RNA. 2008; 14(5): 822-828を参照、それらの全内容を参照により本明細書に取り込むものである。

テトラヒドロ葉酸リボスイッチは、テトラヒドロ葉酸を結合して合成および輸送遺伝子を制御する。例えば、Ames et al., "A eubacterial riboswitch class that senses the coenzyme tetrahydrofolate." Chem. Biol. 2010; 17 (7): 681-5; Huang et al., "Long-range pseudoknot interactions dictate the regulatory response in the tetrahydrofolate riboswitch." Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2011; 108 (36): 14801-6; Trausch et al., "The structure of a tetrahydrofolate-sensing riboswitch reveals two ligand binding sites in a single aptamer." Structure. 2011; 19 (10): 1413-23を参照、それらの全内容を参照により本明細書に取り込むものである。

テオフィリンリボスイッチは、ＳＥＬＥＸにより同定されたものであり、選択的に小分子テオフィリンを結合する。アプタマーは、テオフィリン結合に必要な１５ヌクレオチドコアモチーフを含む。例えば、Jenison et al., "High-resolution molecular discrimination by RNA." Science. 1994; 263:1425-1429; Zimmerman et al., "Molecular interactions and metal binding in the theophylline-binding core of an RNA aptamer." RNA. 2000; 6(5):659-67; Suess et al., "A theophylline responsive riboswitch based on helix slipping controls gene expression in vivo." Nucleic Acids Res. 2004; 32(4): 1610-1614を参照、それらの全内容を参照により本明細書に取り込むものである。例えば、図１Ｃおよび図１Ｄ。

ＴＰＰリボスイッチ（ＴＨＩ－ボックスとも呼ぶ）は、チアミンピロリン酸エステル（ＴＰＰ）を結合して、チアミン生合成および輸送と同様の代謝産物の輸送を制御する。それは、真核生物で今までに見つかった唯一のリボスイッチと考えられている。例えば、Edwards et al., "Crystal structures of the thi-box riboswitch bound to thiamine pyrophosphate analogs reveal adaptive RNA-small molecule recognition." Structure 2006; 14 (9): 1459-68; Winkler et al., "Thiamine derivatives bind messenger RNAs directly to regulate bacterial gene expression." Nature. 2002; 419 (6910): 952-956; Serganov et al., "Structural basis for gene regulation by a thiamine pyrophosphate-sensing riboswitch." Nature. 2006; 441 (7097): 1167-1171を参照、それらの全内容を参照により本明細書に取り込むものである。

「Ｃａｓ９」または「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」という用語は、Ｃａｓ９タンパク質またはその断片を含むＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを意味する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ｃａｓｎ１ヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ（集まって規則的に間を空けて配置された短い回文配列の繰り返し）関連ヌクレアーゼとも呼ばれることがある。ＣＲＩＳＰＲは、可動遺伝要素（例、ウィルス、転移因子および接合プラスミド）からの防御を提供する獲得免疫システムである。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、スペーサー、先行可動エレメントに相補的な配列、および標的侵入核酸を含む。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）へ転写・プロセシングされる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムでは、ｃｒＲＮＡ前駆体の適正なプロセシングは、トランスコード化スモールＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、内因性リボヌクレアーゼ３（ｒｎｃ）およびＣａｓ９タンパク質を必要とする。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ前駆体のリボヌクレアーゼ３支援プロセシング用ガイドとして機能する。その後、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡは、スペーサーに相補的な直鎖または環状ｄｓＤＮＡ標的を核酸内部で切断する。ｃｒＲＮＡに相補的でない標的鎖は、まず核酸内部で切断され、その後３’－５’で末端から切断される。自然界では、ＤＮＡの結合および切断は、通常タンパク質と両種類のＲＮＡを必要とする。しかしながら、単一ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」、または単に「ｇＲＮＡ」）を操作して、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方の部分を単一のＲＮＡ分子に組み込むことが可能である。例えば、Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)を参照、その全開示を参照により本明細書に組み込むものである。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ反復配列（ＰＡＭすなわちプロトスペーサー隣接モチーフ）中の短いモチーフを認識し、自己と非自己の区別を助ける。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの配列および構造は当業者には公知である（例えば、"Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L. expand/collapse author list McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011); and "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)を参照、その全開示を参照により本明細書に組み込むものである）。Ｃａｓ９相同分子種は、様々な種類が記載されており、限定するものではないが、Ｓ．ピオゲネスおよびＳ．サーモフィルスが挙げられる。その他の好適なＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列は、当業者には本開示に基づいて明らかであろう。そのようなＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列には、全開示を参照により本明細書に組み込むChylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737に開示された有機体および遺伝子座由来のＣａｓ９配列も含まれる。いくつかの実施態様では、Ｃａｓ９を含むタンパク質またはその断片タンパク質は、「Ｃａｓ９変異体」と呼ばれている。Ｃａｓ９変異体は、Ｃａｓ９またはその断片に対して相同である。例えば、Ｃａｓ９変異体は、野生型Ｃａｓ９と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。いくつかの実施態様では、Ｃａｓ９変異体は、野生型Ｃａｓ９の対応する断片と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一であるＣａｓ９の断片（例、ｇＲＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ切断ドメイン）を含む。いくつかの実施態様では、野生型Ｃａｓ９は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＮＣ＿０１７０５３．１、配列番号１（ヌクレオチド）；配列番号２（アミノ酸））由来のＣａｓ９に対応する。

「接合している」、「接合した」、および「接合」という用語は、例えば、２つのタンパク質などの２つの分子、２つのドメイン（例、結合ドメインおよび切断ドメイン）、またはタンパク質および薬剤、例えばタンパク質結合ドメインおよび小分子などの２つの実体の会合を意味する。いくつかの側面では、会合は、タンパク質（例、ＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼ）と核酸（例、ガイドＲＮＡ）の間でおこる。会合は、例えば直接的または間接的（例、リンカーを介する）な共有結合を介してもよい。いくつかの実施態様では、会合は共有結合による。いくつかの実施態様では、２つの分子は、両分子を結合するリンカーを介して接合している。例えば、アプタマー（すなわち核酸をセンスするドメイン）およびｇＲＮＡなどのＲＮＡの２つの部分が相互に接合している実施態様では、２つのＲＮＡは、例えば１つのＲＮＡの３’末端を他のＲＮＡの５’末端に結合するヌクレオチド配列などのポリヌクレオチドリンカーを介して接合することができる。いくつかの実施態様では、リンカーは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または少なくとも３０個のヌクレオチドを含む。

核酸配列と関連して本明細書で使用される「コンセンサス配列」という用語は、複数の類似の配列の各位置において最も頻繁に見られるヌクレオチド残基を表す計算された配列を意味する。通常、コンセンサス配列は、類似の配列を相互に比較し類似の配列モチーフを計算する配列アライメントにより決定される。

本明細書で使用される「有効量」という用語は、所望の生物学的応答を誘発するのに十分な生理活性薬剤の量を意味する。例えば、いくつかの実施態様では、ヌクレアーゼの有効量は、好ましくはオフターゲット切断が最小または存在せずに、ヌクレアーゼが特異的に結合・切断する所望の標的部位の切断を誘導するのに十分なヌクレアーゼの量を意味することができる。当業者には理解されるであろうように、例えば、ヌクレアーゼ、ハイブリッドタンパク質、融合タンパク質、タンパク質ダイマー、タンパク質（またはタンパク質ダイマー）とポリヌクレオチドの複合体、またはポリヌクレオチドなどの薬剤の有効量は、例えば、所望の生物学的応答、標的となる特異的なアレル、ゲノム、標的部位、細胞、または組織、および使用される薬剤などの様々な因子により変化するであろう。

本明細書で使用される「操作されている」という用語は、人工的に設計、産生、調製、合成および／または製造された核酸分子、タンパク質分子、複合体、物質、または実体を意味する。従って、操作された産物は、天然に存在しない産物である。

本明細書で使用される「リンカー」という用語は、例えばアプタマー（すなわち核酸をセンスするドメイン）とｇＲＮＡなどの２つの隣接分子または部分を連結する化学基または分子を意味する。通常、リンカーは、２つの基、分子、または他の部分の間に位置するかまたはそれらに隣接し、共有結合によりそれぞれに結合することで、それら２つのものを結合する。いくつかの実施態様では、リンカーは、ヌクレオチドリンカーである。いくつかの実施態様では、ヌクレオチドリンカーは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または少なくとも３０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、リンカーは、アミノ酸または複数のアミノ酸（例、ペプチドまたはタンパク質）である。いくつかの実施態様では、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学部分である。

本明細書で使用される「変異」という用語は、例えば核酸またはアミノ酸配列などの配列内の残基を、他の残基と置換すること、配列内の１つ以上の残基を欠失または挿入することを意味する。本明細書にでは、変異は、通常、元の残基を特定すること、その後配列内に残基を配置すること、および新たに置換した残基の特定により表される。本明細書で提供されるアミノ酸置換（変異）方法は、当分野で公知であり、例えば、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012)により提供される。

本明細書で使用される「ヌクレアーゼ」という用語は、核酸分子中のヌクレオチド残基を連結するリン酸ジエステル結合を切断することが可能な、例えばタンパク質または小分子などの薬剤を意味する。いくつかの実施態様では、ヌクレアーゼは、例えば核酸分子を結合し、核酸分子内のヌクレオチド残基を連結するリン酸ジエステル結合を切断可能な酵素などのタンパク質である。ヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のリン酸ジエステル結合を切断するエンドヌクレアーゼ、あるいはポリヌクレオチド鎖の末端リン酸ジエステル結合を切断するエキソヌクレアーゼであってもよい。いくつかの実施態様では、ヌクレアーゼは、本明細書では「認識配列」、「ヌクレアーゼ標的部位」、または「標的部位」とも呼ばれる特異的なヌクレオチド配列内の特異的なリン酸ジエステル結合を連結および／または切断する部位特異的ヌクレアーゼである。いくつかの実施態様では、ヌクレアーゼは、標的部位に相補する配列を有するＲＮＡ（例、ガイドＲＮＡ、「ｇＲＮＡ」）と複合体を形成する（例えばそれと結合する）ことでヌクレアーゼの配列特異性を提供するＲＮＡ誘導型（すなわち、ＲＮＡプログラム可能）ヌクレアーゼである。いくつかの実施態様では、ヌクレアーゼは、一本鎖標的部位を認識する。他の実施態様では、ヌクレアーゼは、例えば二本鎖ＤＮＡ標的部位などの二本鎖標的部位を認識する。例えば多くの天然に存在するＤＮＡ制限ヌクレアーゼなどの多くの天然に存在するヌクレアーゼ標的部位は、当業者には公知である。多くのケースでは、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、またはＢａｍＨＩなどのＤＮＡヌクレアーゼは、長さが４～１０個の塩基対のパリンドロームである二本鎖ＤＮＡ標的部位を認識し、標的部位内の特異的な位置で二本のＤＮＡ鎖の各鎖を切断する。いくつかのエンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸標的部位を対称的に、すなわち本明細書では平滑末端とも呼ぶ末端が塩基対をなすヌクレオチドからなるように両鎖を同じ位置で切断する。他のエンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸標的部位を非対称的に、すなわち末端が対をなさないヌクレオチドからなるように両鎖を異なる位置で切断する。二本鎖ＤＮＡ分子の末端の不対のヌクレオチドは、不対のヌクレオチドがそれぞれのＤＮＡ鎖の５’または３’末端を形成するかにより、例えば「５’突出」または「３’突出」のように「突出」とも呼ばれる。末端が不対のヌクレオチドである二本鎖ＤＮＡ分子の末端は、相補的不対ヌクレオチドを含む他の二本鎖ＤＮＡ分子末端に「粘着」可能なので、粘着末端とも呼ばれる。ヌクレアーゼタンパク質は、通常タンパク質と核酸基質との相互作用を仲介し、更にいくつかのケースでは、特異的に標的部位に結合する「結合ドメイン」と、核酸主鎖内のリン酸ジエステル結合の切断を触媒する「切断ドメイン」とを含む。いくつかの実施態様では、ヌクレアーゼタンパク質は、単量体の形態で核酸分子を結合・切断可能であるが、他の実施態様では、ヌクレアーゼタンパク質は、標的核酸分子を切断するために二量体化または多量体化する必要がある。天然に存在するヌクレアーゼの結合ドメインおよび切断ドメインと、融合して特異的な標的部位に結合するヌクレアーゼを作成可能なモジュールの結合ドメインおよび切断ドメインは、当業者には公知である。例えば、ＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼ（例、Ｃａｓ９）の結合ドメイン、すなわち不活性ＤＮＡ切断ドメインを有するＣａｓ９タンパク質を、所望の標的部位を特異的に結合する結合ドメイン（例、ｇＲＮＡに結合して標的部位への結合を指示する）として使用し、例えばＦｏｋＩの切断ドメインなどの切断ドメインと融合または接合し標的部位を切断するよう操作されたヌクレアーゼを作成することが可能である。

本明細書で使用される「核酸」および「核酸分子」という用語は、例えばヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオチドの多量体などの核酸塩基および酸性部分を含む化合物を意味する。通常、例えば３つ以上のヌクレオチドを含む核酸分子などの核酸多量体は、隣接するヌクレオチドがリン酸ジエステル結合により相互に連結された直鎖分子である。いくつかの実施態様では、「核酸」は、個々の核酸残基を意味する（例、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）。いくつかの実施態様では、「核酸」は３つ以上の個々のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を意味する。本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は、互換可能に使用でき、ヌクレオチドの多量体（例、少なくとも３つのヌクレオチドがつながったもの）を意味する。いくつかの実施態様では、「核酸」は、一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡと同様に、ＲＮＡも含む。核酸は、例えばゲノム、転写物、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、プラスミド、コスミド、染色体、染色分体、または他の天然に存在する核酸分子などとして、天然に存在するものでもよい。他方、核酸分子は、例えば組換えＤＮＡまたはＲＮＡ、人工染色体、操作されたゲノムまたはその断片、または合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、または天然に存在しないヌクレオチドまたはヌクレオシドを含むものなどの、天然に存在しない分子でもよい。更に、「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」という用語および／または類似の用語には、核酸類似体、すなわちリン酸ジエステル主鎖以外を有する類似体が含まれる。核酸は、天然の原料から精製する、組換え発現システムを使用して産生し任意に精製する、化学的に合成するなどが可能である。必要に応じて、例えば化学的に合成された分子の場合には、核酸は、化学修飾した塩基または糖および主鎖修飾を有する類似体などのヌクレオシド類似体を含むことが可能である。核酸配列は、特に記載がない限り、５’から３’の方向に記述される。いくつかの実施態様では、核酸は、天然のヌクレオシド（例、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシド類似体（例、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニルウリジン、Ｃ５－プロピニルシチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、および２－チオシチジン）；化学修飾した塩基；生物学的に修飾した塩基（例、メチル化塩基）；挿入塩基；修飾糖（例、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾したリン酸基（例、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホラミダイト連鎖）であるか、それらを含む。

本明細書で使用される「医薬組成物」という用語は、疾患または障害の処置と関連して対象に投与可能な組成物を意味する。いくつかの実施態様では、医薬組成物は、例えばヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードする核酸などの活性成分と医薬的に許容される賦形剤とを含む。

本明細書で使用される「増殖性疾患」という用語は、細胞または細胞集団が異常に高い増殖速度を示すように細胞または組織恒常性が障害された疾患を意味する。増殖性疾患には、前腫瘍過形成状態および腫瘍性疾患などの過剰増殖性疾患が含まれる。腫瘍性疾患は、細胞の異常増殖により特徴付けられ、良性および悪性新生物の両方が含まれる。悪性新生物は、癌とも呼ばれる。

「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ペプチド（アミド）結合により連結したアミノ酸残基の多量体を意味する。それらの用語は、任意のサイズ、構造、機能のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを意味する。通常、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸長を有するであろう。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、個々のタンパク質またはタンパク質の集まりを意味することができる。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸は、例えば、接合、官能基化、または他の修飾用リンカー、炭水化物基、ヒドロキシ基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基などの化学成分の付加などにより修飾されていてもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、単一の分子でも、多分子複合体であることもできる。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在するタンパク質またはペプチドの断片であってもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然、組換え、または合成されたもの、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。本明細書で使用される「融合タンパク質」という用語は、少なくとも２つの異なるタンパク質由来のタンパク質ドメインを含むハイブリッドポリペプチドを意味する。１つのタンパク質を、融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）部分またはカルボキシ末端（Ｃ末端）タンパク質に配置して、それぞれ「アミノ末端融合タンパク質」または「カルボキシ末端融合タンパク質」を形成してもよい。タンパク質は、例えば、核酸結合ドメイン（例、タンパク質の標的部位への結合を指令するＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメイン）および核酸切断ドメインなどの異なるドメインを含むことができる。いくつかの実施態様では、タンパク質は、例えば核酸結合ドメインを構成するアミノ酸配列などのタンパク質性部分と、例えば核酸切断剤として作用可能な化合物などの有機化合物とを含む。いくつかの実施態様では、タンパク質は、核酸、例えばＲＮＡとの複合体であるか、会合している。本明細書で提供されるタンパク質のいずれも、当分野で公知の任意の方法により産生できる。例えば、本明細書で提供されるタンパク質は、組換えタンパク質の発現・精製により産生でき、これはペプチドリンカーを含む融合タンパク質に特に好適である。組換えタンパク質の発現・精製の方法は公知であり、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))に記載されるの方法が挙げられ、その全開示を参照により本明細書に組み込むものである。

「ＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼ」および「ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、切断の標的ではない１つ以上のＲＮＡと複合体を形成（例えば、結合または会合）するヌクレアーゼを意味する。いくつかの実施態様では、ＲＮＡとの複合体であるとき、ＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体と呼ばれる。通常、結合したＲＮＡは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と呼ばれる。ｇＲＮＡは、２つ以上のＲＮＡの複合体または単一のＲＮＡ分子として存在可能である。「ｇＲＮＡ」は単一の分子または２つ以上の分子の複合体のいずれかとして存在するガイドＲＮＡを意味するよう互換的に使用されるが、単一のＲＮＡ分子として存在するｇＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と呼ぶことができる。通常、単一のＲＮＡ種として存在するｇＲＮＡは、少なくとも２つのドメイン：（１）標的核酸との相同性を共有するドメイン（例、Ｃａｓ９複合体の標的への結合を指令する）；および（２）Ｃａｓ９タンパク質を結合するドメインを有する。いくつかの実施態様では、ドメイン（２）は、「図１～図４のいずれかに示す「ｓｇＲＮＡ主鎖」である。いくつかの実施態様では、ドメイン（２）は、ｔｒａｃｒＲＮＡとして知られる配列に対応し、ステム・ループ構造を含む。例えば、いくつかの実施態様では、ドメイン（２）は、全開示を参照により本明細書に組み込むJinek et al., Science 337:816-821(2012)の図１Ｅに示すｔｒａｃｒＲＮＡに相同である。いくつかの実施態様では、ドメイン２は、図１～図４のいずれかの「ｓｇＲＮＡ主鎖」と、またはJinek et al., Science 337:816-821(2012)に記載のｔｒａｃｒＲＮＡと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの実施態様では、ｇＲＮＡは、２つ以上のドメイン（１）および（２）を含み、「伸長ｇＲＮＡ」と呼ぶことができる。例えば、伸長ｇＲＮＡは、２つ以上のＣａｓ９タンパク質を結合し、２つ以上の異なる領域で標的核酸を結合する。ｇＲＮＡは、ヌクレアーゼ／ＲＮＡ複合体の標的部位への結合を仲介する、標的部位に相補するヌクレオチド配列を含み、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体の配列特異性を提供する。標的核酸を結合するｇＲＮＡの配列は、標的の領域に相補し、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体が結合するのに好適な配列を含むことが可能である。いくつかの実施態様では、ＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼは、（ＣＲＩＳＰＲ関連システム）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、例えば、ストレプトコッカスピオゲネス由来のＣａｓ９（Ｃｓｎ１）である（例えば、"Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L. expand/collapse author list McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011); and "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)を参照、その全開示を参照により本明細書に組み込むものである）。

ＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼ（例、Ｃａｓ９）は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションを使用して標的ＤＮＡ切断部位を決定し、これらのタンパク質は原理的にはガイドＲＮＡに特定された任意の配列を切断可能である。部位特異的切断のため（例、ゲノムを修飾するため）に、Ｃａｓ９などのＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼを使用する方法は、当分野で公知である（例、Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013); Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013); Hwang, W.Y. et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229 (2013); Jinek, M. et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013); Dicarlo, J.E. et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research (2013); Jiang, W. et al. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239 (2013)を参照、その全開示を参照により本明細書に組み込むものである）。

「小分子」および「有機化合物」という用語は、本明細書では互換的に使用され、比較的小さい分子量を有する天然または人工的に作成された（例、化学合成により）分子を意味する。通常、有機化合物は炭素を含む。有機化合物は、複数の炭素‐炭素結合、立体中心、および他の官能基（例、アミン類、ヒドロキシ、カルボニル類、またはヘテロサイクリック環類）を含むことができる。いくつかの実施態様では、有機化合物は単量体であり、約１５００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有する。ある実施態様では、小分子の分子量は、約１０００ｇ／ｍｏｌ未満または約５００ｇ／ｍｏｌ未満である。ある実施態様では、小分子は、例えばヒトまたは動物における使用で適切な、政府機関または規制団体により既に安全および効果的であるとみなされた薬物などの薬物である。ある実施態様では、小分子は、アプタマーを結合することが知られている。いくつかの実施態様では、有機化合物は、例えば、ジネマイシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラミシン、ブレオマイシン、またはそれらの誘導体などの抗がん抗生物質などの抗生物質である。

本明細書で使用される「対象」という用語は、例えば個々の哺乳動物などの個々の有機体を意味する。いくつかの実施態様では、対象はヒトである。いくつかの実施態様では、対象は、ヒト以外の哺乳動物である。いくつかの実施態様では、対象は、ヒト以外の霊長類である。いくつかの実施態様では、対象はげっ歯動物である。いくつかの実施態様では、対象は、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコまたはイヌである。いくつかの実施態様では、対象は、脊椎動物、両生類、爬虫類、魚類、昆虫、ハエ、または線虫である。いくつかの実施態様では、対象は、研究動物である。いくつかの実施態様では、対象は、遺伝操作されており、例えば遺伝操作されているヒト以外の対象である。対象は、どちらの性別でも、発達のどの段階でもよい。

ヌクレアーゼと関連して本明細書で使用される「標的核酸」および「標的ゲノム」という用語は、それぞれ、所与のヌクレアーゼが標的とする少なくとも1つの標的部位を含む核酸分子またはゲノムを意味する。

本明細書では「ヌクレアーゼ標的部位」という用語と互換的に使用される「標的部位」という用語は、ヌクレアーゼが結合して切断する核酸分子内の配列を意味する。標的部位は、一本鎖でも二本鎖であってもよい。ＲＮＡ誘導型（例、ＲＮＡプログラム可能）ヌクレアーゼ（例、Ｃａｓ９ｇＲＮＡ結合ドメインおよび活性Ｃａｓ９ＤＮＡ切断ドメインを含むタンパク質ダイマー）と関連して、標的部位は、通常、ＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼのｇＲＮＡと相補的なヌクレオチド配列と、ｇＲＮＡ相補配列に隣接する３’末端にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）とを含む。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼＣａｓ９では、いくつかの実施態様では、標的部位は、２０塩基対プラス３塩基対ＰＡＭ（例、ＮＮＮ、Ｎは任意のヌクレオチドを示す）であってもよい。通常、ＰＡＭの１番目のヌクレオチドは、任意のヌクレオチドであり得るが、下流の２個のヌクレオチドは、特定のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼに依存して特定される。Ｃａｓ９などのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの標的部位の例は、当業者には公知であり、限定することなく、ＮＮＧ、ＮＧＮ、ＮＡＧ、およびＮＧＧが含まれ、Ｎは任意のヌクレオチドである。更に、異なる種由来のＣａｓ９ヌクレアーゼ（例、Ｓ．ピオゲネスの代わりにＳ．サーモフィルス）は、配列：ＮＧＧＮＧを含むＰＡＭを認識する。その他のＰＡＭ配列は公知であり、限定するものではないが、ＮＮＡＧＡＡＷおよびＮＡＡＲ（例えば、Esvelt and Wang, Molecular Systems Biology, 9:641 (2013)を参照、その全開示を参照により本明細書に組み込むものである）が挙げられる。例えばＣａｓ９などのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの標的部位は、〔Ｎ_Ｚ〕－〔ＰＡＭ〕構造を含んでもよく、各Ｎは独立して任意のヌクレオチドであり、Ｚは１～５０の整数である。いくつかの実施態様では、Ｚは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、または少なくとも５０である。いくつかの実施態様では、Ｚは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０である。いくつかの実施態様では、Ｚは２０である。いくつかの実施態様では、「標的部位」は、ヌクレアーゼが結合するが切断しない核酸分子内の配列を意味することもできる。

「処置」、「処置する」、および「処置している」という用語は、本明細書で記載されるような疾患または障害またはその１つ以上の症状を逆行、軽減、発症の遅延または進行の阻止を目的とする臨床介入を意味する。本明細書で使用される「処置」、「処置する」、および「処置している」という用語は、本明細書で記載されるような疾患または障害またはその１つ以上の症状を逆行、軽減、発症の遅延または進行の阻止を目的とする臨床介入を意味する。いくつかの実施態様では、処置は、１つ以上の症状が起こった後および／または疾患が診断された後に施してもよい。他の実施態様では、処置は、症状の非存在下で施されてもよく、例えば症状の発症を防止または遅延するまたは疾患の発症または進行を阻止する。例えば、処置は、症状の発症前に感受性の高い個体に施すことができる（例、症状の病歴および／または遺伝的または他の感受性因子に照らして）。処置は、症状がなくなった後にも、例えば再発を防止または遅延するために継続することもできる。

「ベクター」という用語は、例えば本明細書で提供されるｇＲＮＡおよび／またはＣａｓ９タンパク質をコードするものなどの、本発明の１つ以上の組換えポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。ベクターには、限定するものではないが、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、人工染色体、およびファージミドが含まれる。ベクターは、宿主細胞中で複製可能であり、ベクターが切断され得る１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位で更に特徴付けられ、その中へ所望の核酸配列を挿入できるものである。ベクターは、ベクターで形質転換またはゲノム修飾した細胞の同定および／または選択の使用に好適である１つ以上のマーカー配列を含むことができる。マーカーの例としては、抗生物質（例、カナマイシン、アンピシリン）または他の化合物への抵抗性または感受性のどちらかを増加または減少させるタンパク質をコードする遺伝子、当分野で公知の通常の試験法により検出される活性をもつ酵素（例、β－ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたはルシフェラーゼ）をコードする遺伝子、および形質転換または形質移入された細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に可視的に影響を与える遺伝子が挙げられる。本発明に含まれる宿主細胞（例、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞、昆虫細胞など）の形質転換に好適な任意のベクターの例としては、ｐＵＣ系、ｐＧＥＭ系、ｐＥＴ系、ｐＢＡＤ系、ｐＴＥＴ系、またはｐＧＥＸ系に属するベクターが挙げられる。いくつかの実施態様では、ベクターは、組換えタンパク質産生用に宿主細胞を形質転換するのに好適である。ｇＲＮＡおよび／またはタンパク質（例、本明細書で提供されるもの）を発現するベクターおよび宿主細胞を選択・操作し、細胞を形質転換し、組換えタンパク質を発現・精製する方法は、当分野で公知であり、例えば、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012) により提供される）。

本発明の実施態様の詳細な説明
部位特異的ヌクレアーゼは、in vitroおよびin vivoでの標的ゲノム修飾のための強力なツールである。いくつかの部位特異的ヌクレアーゼは、理論的には、他のゲノムの部位に影響を与えずに、ゲノム中の単一の特有な部位を切断の標的とすることを可能とするレベルの標的切断部位特異性を達成することが可能である。生細胞中でのヌクレアーゼ切断が、例えば相同組換えまたは非相同末端結合により切断・修復されたゲノム配列の修飾を頻繁にもたらすＤＮＡ修復機構を誘発することが報告されている。従って、ゲノム内のある特定の配列の標的切断は、多くのヒト体細胞または胚性幹細胞など、従来の標的遺伝子組換え法での操作が困難である細胞などの生細胞中での標的遺伝子組換えおよび遺伝子修飾のための新しい道を開くものである。例えばＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者におけるＣＣＲ－５アレルなどの疾患関連配列または腫瘍血管新生に必要な遺伝子のヌクレアーゼ仲介修飾は臨床の環境においても使用可能であり、２つの部位特異的ヌクレアーゼが現在臨床試験中である（Perez, E.E. et al., "Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases." Nature Biotechnology. 26, 808-816 (2008); ClinicalTrials.gov identifiers: NCT00842634, NCT01044654, NCT01252641, NCT01082926）。部位特異的ヌクレアーゼを使用して処置可能な他の疾患としては、例えば、トリプレット病と関連する疾患（例、ハンチントン病、筋緊張性ジストロフィー、脊髄小脳失調症など）、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ遺伝子を標的とすることによる）、がん、自己免疫疾患、およびウイルス感染症が挙げられる。

部位特異的ヌクレアーゼ－が仲介する修飾に関する重要な問題のひとつは、例えば、所期の標的配列と１つ以上のヌクレオチドが異なるゲノム配列の切断などオフターゲットヌクレアーゼ効果である。オフターゲット切断の望ましくない副作用には、標的遺伝子組換え中の不所望の遺伝子座への挿入から、臨床場面での重度の合併症までに及ぶ。対象に投与されたエンドヌクレアーゼによる腫瘍抑制遺伝子または重要な遺伝子機能をコードする配列のオフターゲット切断は、対象の疾患または死に至ることもあり得る。従って、オフターゲット効果を最小とする可能性が最も高いヌクレアーゼを設計する新たな方策を用いることが望ましい。

本開示の方法および組成物は、いくつかの側面では、一時的な活性の調節および／またはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの特異性の増加の手段を提供することによる既存の方法および組成物の改良である。例えば、当分野で公知の天然に存在するものおよび操作されているものの両方のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、通常、標的に相補するＲＮＡ（例、ｇＲＮＡ）と複合体を形成してＤＮＡに結合・これを切断する。本発明の側面は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体の標的への結合のタイミングを一時的に調節することが、複合体が標的に結合しこれを切断できる時間の長さを最小とするまたは調節することによりオフターゲット効果の可能性を小さくするという認識に関する。更に、例えば標的の非存在下で結合をブロックする伸長標的認識ドメインを有するｇＲＮＡを使用して切断すべき標的部位にだけ結合するようにｇＲＮＡを操作することは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの特異性を向上させ、オフターゲット効果の可能性を低減する。

本明細書で提供される方策、方法、組成物、キット、およびシステムは、任意のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例、Ｃａｓ９）の活性を調節および／または特異性を向上させるために使用可能である。本明細書で記載される修飾したｇＲＮＡに使用される好適なヌクレアーゼは、当業者には本開示に基づいて明らかであろう。

ある実施態様では、本明細書で提供される方策、方法、組成物、キット、およびシステムは、ＲＮＡ誘導型（例、ＲＮＡプログラム可能）ヌクレアーゼ活性のタイミングを調節するために利用される。典型的なＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼはヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体を形成した際に標的配列を認識・切断する一方、本明細書で提供される修飾したｇＲＮＡは標的結合および切断の調節を可能とする。他の側面は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの特異性を向上するように、所期の標的部位が存在するときのみ標的部位を結合するように操作されているｇＲＮＡを提供する。Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ複合体は、細胞（Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013); Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013); Jinek, M. et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013)）および有機体（Hwang, W.Y. et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31, 227-229 (2013)）の両方を修飾するために効果的に使用されているが、ゼブラフィッシュ胚を修飾するためにＣａｓ９：ガイドＲＮＡ複合体を使用する研究は、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ（Hwang, W.Y. et al. Nature Biotechnology. 31, 227-229 (2013)）と同様の割合で毒性（例、オフターゲット効果）を観察した。従って、本開示の側面は、標的結合および切断のタイミングを調節および／またはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの特異性を向上する新規のｇＲＮＡプラットフォームを使用して、Ｃａｓ９オフターゲット効果の可能性を低減することを目的とする。

ＤＮＡおよびＣａｓ９などのＤＮＡ切断ヌクレアーゼに特に関連して、本明細書で提供される本発明の概念、方法、組成物、方策、キット、およびシステムはこの点に関して限定されるものではないが、標的核酸への結合を指令するＲＮＡなどの核酸テンプレートを利用した任意の核酸：ヌクレアーゼシステムへ応用可能である。

修飾したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
本開示のいくつかの側面は、「オン」および「オフ」状態の両方を有するように操作されているｇＲＮＡを提供する。そして、いくつかの側面では、これらのｇＲＮＡは、「スイッチ可能ｇＲＮＡ」と総称できる。例えば、スイッチ可能ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの標的核酸への結合を阻止する構造状態にあるとき「オフ」状態であると言われる。いくつかの側面では、「オフ」状態のｇＲＮＡは、それと同種のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例、Ｃａｓ９）に結合可能であるが、ヌクレアーゼ：ｇＲＮＡ複合体（ｇＲＮＡが「オフ」状態にあるとき）は、標的核酸を結合して切断を仲介することはできない。他の側面では、「オフ」状態のｇＲＮＡは、標的配列またはＣａｓ９などのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼに結合できない。逆に、スイッチ可能ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡが、（例、Ｃａｓ９などのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとの複合体として）ｇＲＮＡの標的核酸への結合を可能とする構造状態であるとき「オン」状態であると言われる。本開示のいくつかの実施態様では、Ｃａｓ９などのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと関連する本発明のｇＲＮＡを含む複合体、およびそれらの使用方法が提供される。本開示のいくつかの実施態様は、そのようなｇＲＮＡおよび／またはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例、Ｃａｓ９）をコードする核酸を提供する。本開示のいくつかの実施態様は、そのようなコードする核酸を含む発現構築物を提供する。

アプタマーに基づいたｇＲＮＡ
１つの実施態様では、アプタマーを含むｇＲＮＡが提供される。例えば、図１を参照。例えば、いくつかの実施態様では、ｇＲＮＡは、本明細書で記載されるように、ヌクレオチドリンカーを介してアプタマーに連結している。アプタマーは、通常、例えば抗体抗原相互作用に競合する親和性で特異的リガンドを結合するＲＮＡまたはペプチドに基づいた分子である。いくつかの実施態様では、アプタマーは、約１ｎＭ～１０μＭ、約１ｎＭ～１μＭ、約１ｎＭ～５００ｎＭ、または約１ｎＭ～１００ｎＭのＫ_ｄでリガンドを結合する。ＲＮＡに基づいたアプタマー、例えば、ｍＲＮＡのリボスイッチ中にあるものに関しては、リガンドのアプタマードメインへの結合により、ｍＲＮＡの発現（例、翻訳）を調節する立体構造的変化をもたらす。ＲＮＡアプタマーは、例えば遺伝子発現を調節するために他の分子にクローン化・適応されていたり、またはＳＥＬＥＸを使用して特定のリガンドに対して操作・選択されている（例えば、Dixon et al., "Reengineering orthogonally selective riboswitches." PNAS 2010; 107 (7): 2830-2835; Suess et al., "A theophylline responsive riboswitch based on helix slipping controls gene expression in vivo." Nucleic Acids Res. 2004; 32(4): 1610-1614; Ellington and Szostak, "In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands." Nature. 1990; 346:818-822; Tuerk and Gold, "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase." Science. 1990; 249:505-510; Burke and Gold, "RNA aptamers to the adenosine moiety of S-adenosyl methionine: structural inferences from variations on a theme and the reproducibility of SELEX." Nucleic Acids Res. 1997; 25(10):2020-4; Ulrich et al., "DNA and RNA aptamers: from tools for basic research towards therapeutic applications." Comb Chem High Throughput Screen. 2006; 9(8):619-32; Svobodova et al., "Comparison of different methods for generation of single-stranded DNA for SELEX processes. Anal Bioanal Chem. 2012; 404:835-842を参照、それらの全内容を参照により本明細書に取り込むものである）。アプタマーを結合するリガンドとしては、限定されるものではないが、小分子、代謝産物、炭水化物、タンパク質、ペプチド、または核酸が挙げられる。図１に示されるように、アプタマーに連結したｇＲＮＡは、アプタマーを結合する特異的リガンドの非存在下で「オフ」状態で存在する。通常、「オフ」状態は、標的核酸とハイブリダイズするｇＲＮＡの配列の全部または一部が標的核酸に自由にハイブリダイズするのを阻止する構造的特徴により仲介される。例えば、いくつかの側面では、アプタマーを含むｇＲＮＡは、アプタマー配列の一部が、標的とハイブリダイズするｇＲＮＡの配列の一部または全部とハイブリダイズするように設計されている。標的を結合するｇＲＮＡの配列（例、図１Ｃおよび図１Ｄに「標的切断ガイド」として示す、本明細書では「ガイド」配列と呼ぶ）は、任意の所望の核酸標的を標的とする配列を含むように、当分野で公知の方法を使用して操作可能であり、従って、図に示す配列は例示の目的であって限定するものではない。同様に、任意の好適なアプタマーは、ｇＲＮＡ配列に５’または３’側で連結することが可能であり、当分野の常法を使用してｇＲＮＡ中の特定のガイド配列にハイブリダイズするであろうヌクレオチドを含むように修飾することが可能である。いくつかの実施態様では、本明細書で提供される任意のｇＲＮＡに連結するアプタマーは、本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマーである。いくつかの実施態様では、ＲＮＡアプタマーは、リボスイッチに由来する（例えばそれからクローンされる）。任意のリボスイッチをＲＮＡアプタマーに使用することができる。リボスイッチの例としては、限定されるものではないが、テオフィリンリボスイッチ、チアミンピロリン酸エステル（ＴＰＰ）リボスイッチ、アデノシンコバラミン（ＡｄｏＣｂｌ）リボスイッチ、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）リボスイッチ、ＳＡＨリボスイッチ、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）リボスイッチ、テトラヒドロ葉酸リボスイッチ、リジンリボスイッチ、グリシンリボスイッチ、プリンリボスイッチ、ＧｌｍＳリボスイッチ、およびプレケオシン１（ＰｒｅＱ１）リボスイッチが挙げられる。いくつかの実施態様では、ＲＮＡアプタマーは、テオフィリンリボスイッチに由来する。いくつかの実施態様では、テオフィリンリボスイッチに由来するアプタマーは、配列番号３を含む。いくつかの実施態様では、配列番号３の太字の下線部分を、そこにある任意のヌクレオチドを他の任意のヌクレオチドで置換するように修飾可能であり、および／または１つ以上のヌクレオチドを付加または欠失することにより修飾可能である。例えば、太字の下線部分は、標的核酸とハイブリダイズするｇＲＮＡの配列の一部または全部とハイブリダイズする配列を含むように修飾可能である。例えば、図１Ｃを参照。いくつかの実施態様では、ＲＮＡアプタマーは、配列番号３と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。
５’－ＧＧＵＧＡＵＡＣＣＡＧＣＡＵＣＧＵＣＵＵＧＡＵＧＣＣＣＵＵＧＧＣＡＧＣＡＣＣ－３’（配列番号３）

いくつかの実施態様では、アプタマーは天然に存在しない（例えば、自然界に見つからない）。例えば、いくつかの実施態様では、アプタマーは、操作されているか、またはＳＥＬＥＸを使用してライブラリーから選択される。いくつかの実施態様では、アプタマーは少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、または少なくとも３００個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、アプタマーは２０～２００、２０～１５０、２０～１００、または２０～８０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、提供されるＲＮＡ（例、アプタマーに連結するｇＲＮＡを含むＲＮＡ）のｇＲＮＡ部分は、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１７５、または少なくとも２００個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、ｇＲＮＡ部分は６０～１５０、６０～１００、または６０～８０個のヌクレオチドを含む。

ｍＲＮＡをセンスするｇＲＮＡ
他の実施態様によれば、ある条件下で（例、代謝産物、小分子、核酸などの存在下で）標的核酸を結合するｇＲＮＡが提供される。いくつかの実施態様では、ｇＲＮＡは、他の分子がｇＲＮＡに結合（例、ハイブリダイズ）して、「オン」状態に対応する構造再構成をもたらさない限り、構造的に、標的と結合する（例、ハイブリダイズする）ことから阻止されている（例えば、「オフ」状態にある）。いくつかの実施態様では、特定の転写物（例、ｍＲＮＡ）のｇＲＮＡへの結合は、ｇＲＮＡを「オフ」状態から「オン」状態へ移行させる。例えば、図２を参照。そのようなｇＲＮＡは、「ｍＲＮＡをセンスする」ｇＲＮＡと呼ばれる。例えば、いくつかの側面では、（ｉ）標的核酸の領域とハイブリダイズする領域（例、「ガイド」配列）と；（ｉｉ）領域（ｉ）の配列と部分的にまたは完全にハイブリダイズする他の領域（例、「ガイドブロック」配列）と；（ｉｉｉ）転写物（ｍＲＮＡ）の領域とハイブリダイズする領域（例、「転写物センサー」）とを含むｇＲＮＡが提供される。いくつかの実施態様では、各領域（例、ｉ～ｉｉｉ）は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、ｇＲＮＡは、ステム・ループ構造を形成する。いくつかの実施態様では、ステムが、領域（ｉｉ）の配列の一部または全部とハイブリダイズした領域（ｉ）の配列を含み、ループが領域（ｉｉｉ）の配列の一部または全部からなる。いくつかの実施態様では、領域（ｉｉ）および領域（ｉｉｉ）の両方が、領域（ｉ）に対して５’または３’側のいずれかにある。例えば、図２Ａ対図２Ｃを参照。標的を結合するｇＲＮＡの配列（例、「ガイド」配列）は、当分野で公知の方法を使用して、任意の所望の核酸標的を標的とする任意の配列を含むよう操作することが可能であり、従って、例として図に示す配列に限定されるものではない。同様に、領域（ｉｉｉ）（例、転写物センサー）は、当分野の常法を使用して、目的のｍＲＮＡとハイブリダイズする任意の配列を含むよう操作することが可能である。同様に、領域（ｉｉ）は、当分野の常法を使用して、「ガイド」配列の一部または全部とハイブリダイズする配列を含むよう操作可能である。例えば、いくつかの側面では、ｍＲＮＡは、細胞中で発現されるとき、標的核酸（例、遺伝子）のゲノム修飾が望まれるものである。このように、ｍＲＮＡの非存在下で、細胞へ送達される（または、発現される）と、ｇＲＮＡは「オフ」状態のままである。ｍＲＮＡが存在する（例、発現される）と、それはｇＲＮＡの転写物センサーを結合して、「ガイド」配列の標的核酸へのハイブリダイゼーションを阻止していたステム・ループ構造のアンフォールディングをもたらし、それによってｇＲＮＡを「オン」とする。例えば、図２Ｂおよび２Ｄを参照。提供された「オン」状態のｇＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例、Ｃａｓ９タンパク質）と会合して、標的核酸の結合をガイドすることができる。

伸長ＤＮＡをセンスする（ｘＤＮＡをセンスする）ｇＲＮＡ
他の実施態様によれば、ｇＲＮＡが少なくとも２つの異なる領域で標的核酸とハイブリダイズしない限り「オフ」状態のままでいる修飾したｇＲＮＡが提供される。例えば、図３を参照。そのようなｇＲＮＡは、特定のｇＲＮＡ／標的相互作用の認識配列を効果的に延長するので、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例、Ｃａｓ９）への特異性が改善されている。そのようなｇＲＮＡは、「ｘＤＮＡをセンスする」ｇＲＮＡ（「ｘ」は、「伸長」ＤＮＡ認識の略語である）と呼ばれる。例えば、（ｉ）標的核酸の領域とハイブリダイズする領域（例、「ガイド」配列）と；（ｉｉ）領域（ｉ）の配列と部分的にまたは完全にハイブリダイズする他の領域（例、「ガイドブロック」）と；（ｉｉｉ）標的核酸の他の領域とハイブリダイズする領域（例、「ｘＤＮＡセンサー」）とを含むｇＲＮＡが提供される。いくつかの実施態様では、ｘＤＮＡセンサーは、ガイド配列が標的に結合できる前に、まず標的核酸を結合しなくてはならない。いくつかの実施態様では、ｘＤＮＡセンサーは、ガイド配列を結合する標的の同一の鎖を結合する。いくつかの実施態様では、ｘＤＮＡセンサーおよびガイド配列は、標的核酸の異なる鎖を結合する。いくつかの実施態様では、領域（ｉ）および領域（ｉｉ）の配列が、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、領域（ｉｉｉ）の配列は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、または少なくとも１００個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、ｇＲＮＡは、ステム・ループ構造を形成する。例えば、いくつかの実施態様では、ステムが領域（ｉｉ）の配列の一部または全部とハイブリダイズした領域（ｉ）の配列を含み、ループが領域（ｉｉｉ）の配列の一部または全部からなる。いくつかの実施態様では、領域（ｉ）および領域（ｉｉｉ）は、ｇＲＮＡ中で隣接する配列を含む。いくつかの実施態様では、領域（ｉｉ）および領域（ｉｉｉ）の両方が、領域（ｉ）に対して５’または３’側のいずれかにある。例えば、図３Ａ対図３Ｃを参照。いくつかの実施態様では、領域（ｉｉ）は、領域（ｉ）と領域（ｉｉｉ）の間に配置されている。標的を結合するｇＲＮＡの配列（例、「ガイド」配列）は、当分野で公知の方法を使用して任意の所望の核酸標的を標的とする任意の配列を含むように操作可能であり、従って図に例として示す配列に限定するものではない。同様に、領域（ｉｉｉ）（例、ｘＤＮＡセンサー）は、当分野の常法を使用して、標的核酸の他の領域（例、「ガイド」配列により標的とされる領域と異なる領域）とハイブリダイズする任意の配列を含むように操作可能である。同様に、領域（ｉｉ）は、当分野の常法を使用して、「ガイド」配列の一部または全部とハイブリダイズする配列を含むように操作してもよい。従って、適正な標的核酸（例、ｇＲＮＡがハイブリダイズするよう設計された両方の領域を含む標的）の非存在下では、ｇＲＮＡは、細胞へ送達される（またはそこで発現される）と、「オフ」状態のままである。特定の理論に束縛されるものではないが、ｇＲＮＡが（例、Ｃａｓ９と会合して）標的核酸と接触すると、ｘＤＮＡセンサーが標的とハイブリダイズし、それは次に「ガイド」配列をブロックするステム・ループ構造をほどき、ｇＲＮＡを「オン」にすると考えられる。それが適正な標的核酸であれば、ガイド配列は標的にハイブリダイズし、複合体は任意に標的核酸を切断するであろう。例えば、図３Ｂおよび図３Ｄを参照。

複合体
いくつかの実施態様では、本明細書で記載される任意のＲＮＡ／ｇＲＮＡ（例、アプタマーに連結したｇＲＮＡ、ｍＲＮＡをセンスするｇＲＮＡ、またはｘＤＮＡセンサーを含むｇＲＮＡを含むＲＮＡ）を含む複合体が提供される。いくつかの側面では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと会合する、提供されたＲＮＡ／ｇＲＮＡを含む複合体が提供される。いくつかの実施態様では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、例えば本明細書で記載されるＣａｓ９、Ｃａｓ９の変異体、またはＣａｓ９の断片である。いくつかの実施態様では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、全内容を参照により本明細書に取り込む、２０１３年９月６日に出願された米国特許仮出願第６１／８７４，６０９号名称「Ｃａｓ９変異体およびその使用」、および２０１４年９月６日に出願された米国特許仮出願第６１／８７４，７４６号名称「機能性ヌクレアーゼの送達システム」に提供されるＣａｓ９タンパク質の任意の形態である。

いくつかの実施態様では、複合体は、例えば本明細書で記載されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと会合したＲＮＡのアプタマーを結合するリガンドなどのリガンドを更に含む。いくつかの実施態様では、複合体（例、提供されたＲＮＡ（ｇＲＮＡ）：リガンド：Ｃａｓ９タンパク質を含む）は、標的核酸に結合し、任意に切断する。いくつかの側面では、「センスする」ｇＲＮＡ（例、ｍＲＮＡまたはｘＤＮＡ）およびＣａｓ９を含む複合体は、標的核酸に結合し、任意に切断する。

医薬組成物
いくつかの実施態様では、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡが、医薬組成物の一部として提供される。いくつかの実施態様では、医薬組成物は、本発明のｇＲＮＡと複合体を形成するＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例、Ｃａｓ９）を更に含む。例えば、いくつかの実施態様は、本明細書で提供されるｇＲＮＡおよびＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、またはそのようなｇＲＮＡおよび／またはヌクレアーゼをコードする核酸と、医薬的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、更に治療的に活性のある物質を１つ以上任意に含むことができる。

いくつかの実施態様では、本明細書で提供される組成物は、対象において標的とするゲノム修飾を実施するために、対象、例えばヒト対象に投与される。いくつかの実施態様では、細胞を対象から入手し、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと会合する提供されたｇＲＮＡまたはそれをコードする核酸を、生体外で接触させる。いくつかの実施態様では、対象から除去し、本発明のｇＲＮＡ：ヌクレアーゼ複合体と生体外で接触させた細胞を、任意に所望のゲノム修飾が実施または細胞中で検出された後に、対象に再導入される。ヌクレアーゼを含む医薬組成物を送達する方法は公知であり、例えば、その全開示を参照により本明細書に組み込む米国特許第６，４５３，２４２号；第６，５０３，７１７号；第６，５３４，２６１号；第６，５９９，６９２号；第６，６０７，８８２号；第６，６８９，５５８号；第６，８２４，９７８号；第６，９３３，１１３号；第６，９７９，５３９号；第７，０１３，２１９号；および第７，１６３，８２４号に記載されている。本明細書で提供される医薬組成物の記載は、主にヒトへの投与に好適な医薬組成物に対してのものであるが、そのような組成物が一般にすべての種類の動物または有機体への投与に好適であることは当業者には理解されるであろう。ヒトへの投与に好適な医薬組成物を、種々の動物への投与に好適な組成物とするための修飾は、良く理解されており、通常の熟練獣医薬理学者は、もし必要なら単に通常の実験によりそのような修飾を設計および／または実施可能である。医薬組成物の投与が意図される対象としては、限定されるものではないが、ヒトおよび／または他の霊長類；哺乳動物、家畜、ペット、およびウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウスおよび／またはラットなどの商業的に重要な哺乳動物；および／または、チキン、ダック、グースおよび／またはターキーなどの商業的に重要な鳥類などの鳥類が挙げられる。

本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で公知のまたは今後開発される任意の方法により調製できる。一般に、そのような調製方法には、活性成分を賦形剤および／または１つ以上の他の副成分と会合させ、その後必要および／または所望なら、生成物を所望の単一用量または複数用量ユニットに成形および／または包装する工程が含まれる。

医薬製剤は、本明細書で使用されるように、所望の特定の剤形に適する任意のおよびすべての溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体媒体、分散または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、固形結合剤、潤滑剤などの医薬的に許容される賦形剤を更に含むことができる。Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro （Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006、その全開示を参照により本明細書に組み込む）には、医薬組成物の処方に使用される種々の賦形剤およびその調製のための公知の技術が記載されている。また、全開示を参照により本明細書に組み込む、国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５５１３１号（公開番号第ＷＯ２０１１０５３９８２Ａ８号、２０１０年１１月２日出願）を、ヌクレアーゼを含む医薬組成物の製造のための他の好適な方法、試薬、賦形剤および溶媒に関して参照できる。望ましくない生物学的効果をもたらしたり、あるいは医薬組成物の他の成分と有害な仕方で相互作用して、従来の任意の賦形媒体が物質またはその誘導体と適合しない場合を除いて、その使用は、本開示の範囲内であるとみなされる。

いくつかの実施態様では、本発明による組成物は、任意の様々な疾患、障害および／または病状の処置に使用することができ、その例としては、限定するものではないが、以下の１つ以上が挙げられる：自己免疫疾患（例、糖尿病、ループス、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ）；炎症性疾患（例、関節炎、骨盤内炎症性疾患）；感染症（例、ウイルス感染症（例、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＲＳＶ）、細菌感染症、真菌感染症、敗血症）；神経疾患（例、アルツハイマー病、ハンチントン病；自閉症；デュシェンヌ型筋ジストロフィー）；心血管障害（例、粥状動脈硬化、高コレステロール血症、血栓症、凝固障害、黄斑変性症などの血管新生障害）；増殖性障害（例、がん、良性腫瘍）；呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患）；消化障害（例、炎症性腸疾患、潰瘍）；筋骨格系疾患（例、線維筋痛症、関節炎）；内分泌、代謝、および栄養障害（例、糖尿病、骨粗鬆症）；泌尿器障害（例、腎疾患）；心理的疾患（例、うつ病、統合失調症）；皮膚障害（例、創傷、湿疹）；血液およびリンパ管疾患（例、貧血症、血友病）；など。

部位特異的核酸切断方法
本開示の他の実施態様では、部位特異的核酸（例、ＤＮＡ）切断方法が提供される。いくつかの実施態様では、この方法は、ＤＮＡを本明細書に記載の任意のＣａｓ９：ＲＮＡ複合体に接触させることを含む。例えば、いくつかの実施態様では、この方法は、（ｉ）ＤＮＡの部分に結合する配列を含み、本明細書で記載されるアプタマーに連結したｇＲＮＡと；（ｉｉ）ｇＲＮＡのアプタマーに結合したリガンドと；（ｉｉｉ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例、Ｃａｓ９タンパク質）とを含む複合体に、Ｃａｓ９ヌクレアーゼがＤＮＡを切断するのに好適な条件下でＤＮＡを接触させることを含む。

いくつかの実施態様では、細胞中での部位特異的ＤＮＡ切断を誘発する方法が提供される。いくつかの実施態様では、この方法は、（ａ）ＤＮＡ標的配列に結合可能な配列を含み、本明細書で記載されるアプタマーを含むｇＲＮＡを、細胞に接触させることまたは細胞中で発現させること；（ｂ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例、Ｃａｓ９タンパク質）を細胞に接触させることまたは細胞中で発現させること；および（ｃ）ｇＲＮＡのアプタマーを結合する特異的リガンドを細胞に接触させて、ＤＮＡ標的を切断するｇＲＮＡ：リガンド：Ｃａｓ９複合体を形成することを含む。いくつかの実施態様では、この方法は、（ａ）ＤＮＡ標的配列に結合可能な配列を含み、本明細書で記載されるアプタマーを含むｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質を含む複合体を細胞に接触させること；および（ｂ）ｇＲＮＡのアプタマーを結合する特異的リガンドを細胞に接触させて、ＤＮＡ標的を切断するｇＲＮＡ：リガンド：Ｃａｓ９複合体を形成することを含む。いくつかの実施態様では、工程（ａ）および工程（ｂ）は同時に実施される。いくつかの実施態様では、工程（ａ）および工程（ｂ）は順次実施される。従って、細胞に複合体を接触した後にリガンドを接触させるいくつかの実施態様では、切断はリガンドが細胞へ送達された後にだけ起こるので、切断の調節が達成される。これらの方法のいくつかの実施態様では、リガンドは細胞へ送達されないが、例えば生理学的または病態生理学的プロセスの一部として、細胞により内部で産生される。

いくつかの実施態様では、本明細書で記載されるｍＲＮＡをセンスするｇＲＮＡを利用する部位特異的ＤＮＡ切断方法が提供される。例えば、いくつかの実施態様では、この方法はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例、Ｃａｓ９タンパク質）と、（ｉ）標的核酸の領域とハイブリダイズする領域；（ｉｉ）領域（ｉ）の配列と部分的にまたは完全にハイブリダイズする他の領域；および（ｉｉｉ）転写物（ｍＲＮＡ）の領域とハイブリダイズする領域を含むｍＲＮＡをセンスするｇＲＮＡとを含む複合体をＤＮＡに接触させることを含む。いくつかの実施態様では、領域（ｉｉｉ）における配列がｍＲＮＡとハイブリダイズした後に、切断が起こる。

他の実施態様では、本明細書で記載されるｘＤＮＡをセンスするｇＲＮＡを利用する部位特異的ＤＮＡ切断方法が提供される。例えば、いくつかの実施態様では、この方法はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例、Ｃａｓ９タンパク質）と、（ｉ）標的核酸の領域とハイブリダイズする領域；（ｉｉ）領域（ｉ）の配列と部分的にまたは完全にハイブリダイズする他の領域；および（ｉｉｉ）標的核酸の他の領域とハイブリダイズする領域を含むｘＤＮＡをセンスするｇＲＮＡとを含む複合体をＤＮＡに接触させることを含む。いくつかの実施態様では、領域（ｉｉｉ）における配列が「ガイド」配列が標的としない標的核酸の領域とハイブリダイズした後に、切断が起こる。

いくつかの実施態様では、本明細書で提供される任意の方法が、細胞中のＤＮＡに対して実施可能である。例えば、いくつかの実施態様では、本明細書で提供される任意のＲＮＡ／ｇＲＮＡ含有複合体が接触したＤＮＡは、真核細胞中にある。いくつかの実施態様では、真核細胞は、個体中にある。いくつかの実施態様では、個体はヒトである。いくつかの実施態様では、本明細書で提供される任意の方法は、in vitroで実施される。いくつかの実施態様では、本明細書で提供される任意の方法は、in vivoで実施される。

ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、キット
本開示の他の実施態様では、本明細書に記載のいずれかのｇＲＮＡ（および任意にいずれかのＣａｓ９タンパク質）をコードするポリヌクレオチドが提供される。例えば、本明細書に記載のいずれかのｇＲＮＡおよび／またはＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のｇＲＮＡ、またはそれを含む複合体、例えば本発明のｇＲＮＡおよびＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例、Ｃａｓ９タンパク質）を含む複合体などの組換え発現および精製のために提供される。いくつかの実施態様では、提供されるポリヌクレオチドは、ｇＲＮＡをコードする１つ以上の配列を、単独で、または本明細書に記載のいずれかのＣａｓ９タンパク質をコードする配列との組み合わせで含む。

いくつかの実施態様では、本明細書に記載のいずれかのｇＲＮＡ（および随意、任意のＣａｓ９タンパク質）をコードするベクターは、例えば本発明のｇＲＮＡ、または本発明のｇＲＮＡおよびＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例、Ｃａｓ９タンパク質）を含む複合体の組換え発現および精製のために提供される。いくつかの実施態様では、ベクターは、例えば本明細書に記載のものなどのポリヌクレオチドを含むか、あるいは含むように操作されている。いくつかの実施態様では、ベクターはｇＲＮＡおよび／または任意のＣａｓ９タンパク質（例、本明細書で記載されるもの）をコードする１つ以上の配列を含む。通常、ベクターは、ｇＲＮＡが宿主細胞で発現されるようにプロモーターに作動可能に連結した本発明のｇＲＮＡをコードする配列を含む。

いくつかの実施態様では、本明細書に記載の任意のｇＲＮＡ（および随意に任意のＣａｓ９タンパク質）の組換え発現および精製用の細胞が提供される。細胞としては、組換えＲＮＡ発現および任意にタンパク質発現に好適な任意の細胞、例えば本発明のｇＲＮＡを発現しているまたは発現可能な遺伝子構築物を含む細胞（例、本明細書に記載の１つ以上のベクターで形質転換した細胞、または細胞のゲノムに組み入れられたアレルから本発明のｇＲＮＡおよび随意に本明細書で提供される任意のＣａｓ９タンパク質を発現するゲノム修飾を有する細胞）が挙げられる。細胞を形質転換する、細胞を遺伝子組み換えする、およびそのような細胞中で遺伝子およびタンパク質を発現する方法は、当分野で公知であり、例えば、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012)) およびFriedman and Rossi, Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA, A Laboratory Manual (1st ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2006))により提供されるものが挙げられる。

本開示のいくつかの側面は、本明細書で提供されるいずれかの本発明のｇＲＮＡまたは複合体および随意に本明細書に記載の任意のＣａｓ９タンパク質を含むキットを提供する。いくつかの実施態様では、キットは、提供されるｇＲＮＡ、および随意に任意のＣａｓ９タンパク質をコードするいずれかのポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、キットは、任意の本発明のｇＲＮＡおよび随意に任意のＣａｓ９タンパク質の組換え発現用ベクターを含む。いくつかの実施態様では、キットは、いずれかの本発明のｇＲＮＡ、複合体、および随意に本明細書で提供される任意のＣａｓ９タンパク質を発現する遺伝子構築物を含む細胞を含む。いくつかの実施態様では、キットは、賦形剤と、例えば本発明のｇＲＮＡおよびＣａｓ９などのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの複合体などを核酸に接触させるのに好適な組成物を生成するために、賦形剤を任意の本発明の組成物に接触させるための説明書とを含む。いくつかの実施態様では、組成物は、ゲノム内の核酸に接触させるのに好適である。いくつかの実施態様では、組成物は、本発明の組成物（例、ｇＲＮＡ、ｇＲＮＡとＣａｓ９との複合体）を細胞へ送達するのに好適である。いくつかの実施態様では、組成物は、本発明の組成物（例、ｇＲＮＡ、ｇＲＮＡとＣａｓ９との複合体）を対象へ送達するのに好適である。いくつかの実施態様では、賦形剤は、医薬的に許容される賦形剤である。

等価物および範囲
当業者は、本明細書に記載の本発明の具体的な実施態様の多くの等価物を認識可能であるか、または単に通常の実験により確認可能であろう。本発明の範囲は、上記の記述に限定されることを意図するものではなく、添付の請求の範囲に記載されるものである。

請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、特に他の記載がない限りまたは文脈から明らかでない限り、１つ以上を意味するものである。グループの１つ以上のメンバーの間で「または」を含む請求の範囲または説明の記載は、特に他の記載がない限りまたは文脈から明らかでない限り、グループのメンバーの１つ、２つ以上、またはすべてが、所与の産物またはプロセスに存在する、用いられる、または他の方法で関与する場合に満足するとみなされる。本発明は、グループの１つのメンバーだけが、所与の産物またはプロセスに存在する、用いられる、または他の方法で関与する実施態様を含むものである。また、本発明は、２つ以上またはすべてが、所与の産物またはプロセスに存在する、用いられる、または他の方法で関与する実施態様も含むものである。

更に、本発明は、１つ以上の請求項または記載の関連部分からの１つ以上の限定、要素、節、記述用語などが他の請求項に組み入れられたすべての変形、組み合わせ、および置換を含むと理解すべきである。例えば、他の請求項に従属した任意の請求項は、同じ元の請求項に従属する任意の他の請求項にある１つ以上の限定を含むよう変更可能である。更に、請求項が組成物に言及する場合、特に他の記載がない限りまたは矛盾や不一致が起こることが当業者に明らかではない限り、本明細書に記載の任意の目的のための組成物の使用方法が含まれ、本明細書に記載の任意の作成方法または当分野で公知の他の方法による組成物の作成方法が含まれると理解すべきである。

例えばマーカッシュ・クレーム形式などの要素がリストとして提示される場合、要素の各サブグループも開示されるものであり、グループから任意の要素を除去可能であると理解すべきである。また、「含む」という用語は、オープンであり、追加の要素または工程を含むことが可能であることを意図することに留意すべきである。一般に、本発明、すなわち本発明の側面は、特定の要素、特徴、工程などを含むとして言及される場合、本発明のある実施態様または本発明の側面は、それらの要素、特徴、工程などからなる、または本質的にそれらからなると理解すべきである。簡潔とするため、これらの実施態様は、本明細書では、これらの言葉で具体的に記載されていない。従って、１つ以上の要素、特徴、工程などを含む本発明の各実施態様に対しては、本発明は、それらの要素、特徴、工程などからなる、または本質的にそれらからなる実施態様も提供する。

範囲が与えられる場合は、端点も含まれるものである。更に、特に他の記載がない限りまたは文脈および／または当業者の理解から明らかでない限り、範囲で表す値は、本発明の異なる実施態様では表記された範囲中で、文脈から明らかに他を示していない限り、範囲の最小値の単位の１０分の１までの任意の特異的な値を想定できることを理解すべきである。特に他の記載がない限りまたは文脈および／または当業者の理解から明らかでない限り、範囲で表す値は、所与の範囲内で任意の部分的な範囲を想定できることも理解すべきであり、ここで部分的な範囲の端点は、範囲の最小値の単位の１０分の１と同じ程度の正確さで記載される。

更に、本発明の任意の特定の実施態様は、任意の１つ以上の請求項から明示的に除外できることを理解すべきである。範囲が与えられる場合、範囲内の任意の値は、任意の１つ以上の請求項から明示的に除外できる。本発明の組成物および／または方法の任意の実施態様、要素、特徴、応用、または側面は、任意の１つ以上の請求項から除去可能である。簡潔とするため、１つ以上の要素、特徴、目的または側面が除去される実施態様のすべてを本明細書で明示的に記載しているわけではない。

本明細書に記載のすべての刊行物、特許および配列データベース登録項目は、上記に挙げたものも含めて、それぞれの刊行物または特許が、参照により取り込むと具体的におよび個別に表示したかのように、参照により本明細書に取り込むものである。矛盾する場合は、本明細書の定義も含めて、本出願が支配するであろう。

Claims

（ｉ）アプタマーを含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であって、アプタマーがリボスイッチに由来し、さらにｓｇＲＮＡが、アプタマーに結合した特異的リガンドの非存在下では標的核酸にハイブリダイズしない、前記ｓｇＲＮＡと；（ｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質とを含む複合体であって；ｓｇＲＮＡは、標的核酸との相同性を共有するドメインを含み、および、ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質を結合するドメインをさらに含み、Ｃａｓ９結合ドメインは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む、前記複合体。
リガンドが、小分子、代謝産物、ペプチド、または核酸である、請求項１に記載の複合体。
ｓｇＲＮＡ：リガンド：Ｃａｓ９複合体が標的核酸を結合する、請求項２に記載の複合体。
アプタマーを含むｓｇＲＮＡであって、アプタマーがリボスイッチに由来し、さらに、ｓｇＲＮＡはアプタマーに結合した特異的リガンドの非存在下では標的核酸にハイブリダイズせず；ｓｇＲＮＡは、標的核酸との相同性を共有するドメインを含み、および、ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質を結合するドメインをさらに含み、Ｃａｓ９結合ドメインは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む、前記ｓｇＲＮＡ。
ｓｇＲＮＡが、アプタマーに結合した特異的リガンドの非存在下ではＣａｓ９タンパク質を結合しない、請求項４に記載のｓｇＲＮＡ。
アプタマーが、アプタマーに特異的なリガンドにより結合されているとき、ｓｇＲＮＡがＣａｓ９タンパク質に結合する、請求項４または５に記載のｓｇＲＮＡ。
アプタマーに結合する特異的リガンドの存在下または非存在下でＣａｓ９タンパク質を結合するが、アプタマーに結合した特異的リガンドの存在下でのみ標的核酸に結合する、請求項４に記載のｓｇＲＮＡ。
リガンドが、小分子、代謝産物、ペプチド、または核酸である、請求項４～７のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡ。
リボスイッチが、テオフィリンリボスイッチ、チアミンピロリン酸エステル（ＴＰＰ）リボスイッチ、アデノシンコバラミン（ＡｄｏＣｂｌ）リボスイッチ、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）リボスイッチ、ＳＡＨリボスイッチ、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）リボスイッチ、テトラヒドロ葉酸リボスイッチ、リジンリボスイッチ、グリシンリボスイッチ、プリンリボスイッチ、ＧｌｍＳリボスイッチ、またはプレケオシン１（ＰｒｅＱ１）リボスイッチである、請求項４～８のいずれか一項に記載のsｇＲＮＡ。
アプタマーが、テオフィリンリボスイッチに由来し、配列番号３を含む、請求項９に記載のｓｇＲＮＡ。
アプタマーが、試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）プラットフォームを使用して特異的リガンドを結合するよう操作されている、請求項４～１０のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡ。
非アプタマー部分が、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、または少なくとも１５０個のヌクレオチドを含み、アプタマーが、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、または少なくとも３００個のヌクレオチドを含む、請求項４～１１のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡ。
（ｉ）請求項４～１２のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡと、（ｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質とを含む複合体。
ＤＮＡを、（ｉ）ＤＮＡの部分を結合する配列を含む請求項４～１２のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡと、（ｉｉ）ｓｇＲＮＡのアプタマーに結合した特異的リガンドと、（ｉｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質とを含む複合体に、Ｃａｓ９タンパク質がＤＮＡを切断する条件下で接触させることを含む、in vitroの部位特異的ＤＮＡ切断方法。
ＤＮＡが細胞中にある、請求項１４に記載の方法。
細胞が真核細胞である、請求項１５に記載の方法。
細胞において部位特異的ＤＮＡ切断を誘発するin vitroの方法であって、（ａ）ＤＮＡ標的配列に結合可能な配列を含む、請求項４～１２のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡを、細胞に接触させるかまたは細胞内で発現させること；（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質を、細胞に接触させるかまたは細胞内で発現させること；および（ｃ）ｓｇＲＮＡのアプタマーを結合する特異的リガンドを細胞に接触させ、ＤＮＡ標的を切断するｓｇＲＮＡ：リガンド：Ｃａｓ９複合体を形成させることを含む、前記方法。
細胞において部位特異的ＤＮＡ切断を誘発するin vitroの方法であって、（ａ）Ｃａｓ９タンパク質と、ＤＮＡ標的配列に結合可能な配列を含む、請求項４～１２のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡとを含む複合体を、細胞に接触させること、および（ｂ）ｓｇＲＮＡのアプタマーを結合する特異的リガンドを細胞に接触させ、ＤＮＡ標的を切断するｓｇＲＮＡ：リガンド：Ｃａｓ９複合体を形成させることを含む、前記方法。
工程（ａ）および（ｂ）を、同時に実行する、請求項１８に記載の方法。
工程（ａ）および（ｂ）を、任意の順番で順次実行する、請求項１８に記載の方法。
請求項４～１２のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡをコードする単離したポリヌクレオチド。
請求項２１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
請求項４～１２のいずれか一項に記載ｓｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現用ベクター。
さらにＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項２２または２３に記載のベクター。
請求項４～１２のいずれか一項に記載のｓｇＲＮＡを発現する遺伝子構築物を含む細胞。
Ｃａｓ９タンパク質を発現する遺伝子構築物をさらに含む、請求項２５に記載の細胞。
ＤＮＡを請求項１～３または１３のいずれか一項に記載の複合体に接触させることを含む、in vitroの部位特異的ＤＮＡ切断方法。
ＤＮＡが細胞中にある、請求項２７に方法。
細胞が真核生物である、請求項２８に記載の方法。