JP2014523747A - ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善 - Google Patents
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
- C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
Abstract
Description
本出願は、米国特許法第119(e)項に基づいて、2011年7月22日に出願された米国仮特許出願第61/510,841号明細書に対する優先権を主張するものであり、この仮特許出願の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
本発明は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)/国立総合医科学研究所(National Institute of General Medical Sciences)からの助成金第R01 GM065400号および第R01 GM088040号、国防総省国防高等研究事業局(Defense Advanced Research Projects Agency)からの助成金第HR0011−11−2−0003号、および国立衛生研究所からの助成金第DP1 OD006862号の下で、米国政府の支援によりなされた。米国政府は本発明において特定の権利を有する。
本明細書および特許請求の範囲において使用する場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、他に明示されない限り、単数および複数への言及を含む。したがって、例えば、「薬剤(an agent)」への言及は、1つの薬剤および複数のそのような薬剤を含む。
緒言
部位特異的ヌクレアーゼは、ゲノムの標的改変のための強力なツールである。一部の部位特異的ヌクレアーゼは、理論的には、他のいかなるゲノム部位にも影響を及ぼすことなく、切断のための、ゲノム中の単一のユニーク部位を標的にすることを可能にする、標的切断部位に対する特異性レベルを達成することができる。生細胞におけるヌクレアーゼ切断は、切断され修復されたゲノム配列の改変をもたらすことが多い、例えば相同組換えを介するDNA修復機序を誘発することが報告されている。したがって、ゲノム内の特定のユニーク配列の標的切断により、多くのヒト体細胞または胚性幹細胞など、従来の遺伝子ターゲティング法により操作することが困難である細胞を含む生細胞における遺伝子ターゲティングおよび遺伝子改変のための新しい手段が開かれる。疾患関連配列、例えばHIV/AIDS患者のCCR−5対立遺伝子、または腫瘍血管新生に必要な遺伝子のヌクレアーゼ媒介の改変は、臨床的文脈において使用することが可能であり、現在、2つの部位特異的ヌクレアーゼが臨床試験中である。
本発明の一部の態様は、任意の部位特異的ヌクレアーゼにより切断された核酸標的部位を決定するための方法および試薬を提供する。一般に、そのような方法は、ヌクレアーゼが標的部位に結合し切断するのに適した条件下で所与のヌクレアーゼと標的部位のライブラリーとを接触させるステップと、ヌクレアーゼが実際に切断する標的部位を決定するステップとを含む。実際の切断に基づいた、ヌクレアーゼの標的部位プロファイルの決定は、部位特異的ヌクレアーゼの望ましくないオフターゲット作用の媒介に関連するパラメーターを測定するという、結合に基づく方法にまさる利点を有する。
本発明の一部の実施形態は、ヌクレアーゼ標的部位プロファイリングのための核酸分子ライブラリーを提供する。一部の実施形態では、そのようなライブラリーは複数の核酸分子を含み、それぞれの核酸分子は、候補ヌクレアーゼ標的部位および一定の挿入配列スペーサー配列のコンカテマーを含む。例えば、一部の実施形態では、ライブラリーの候補核酸分子は、構造R1−[(LSR)−(定常領域)]X−R2を含み、式中、R1およびR2は独立して、[(LSR)−(定常領域)]反復単位の断片を含み得る核酸配列であり、Xは2とyとの間の整数である。一部の実施形態では、yは、少なくとも101、少なくとも102、少なくとも103、少なくとも104、少なくとも105、少なくとも106、少なくとも107、少なくとも108、少なくとも109、少なくとも1010、少なくとも1011、少なくとも1012、少なくとも1013、少なくとも1014、または少なくとも1015である。一部の実施形態では、yは、102未満、103未満、104未満、105未満、106未満、107未満、108未満、109未満、1010未満、1011未満、1012未満、1013未満、1014未満、または1015未満である。定常領域は、一部の実施形態では、単一反復単位の効率的な自己連結反応を可能にする長さである。一部の実施形態では、定常領域は、2つ以上の反復単位を含む断片から単一反復単位を効率的に分離することを可能にする長さである。一部の実施形態では、その集合物は、1つのシークエンシングリードでの完全な反復単位の効率的なシークエンシングを可能にする長さを超えている。適切な長さは当業者には明らかである。例えば、一部の実施形態では、定常領域の長さは、100〜1000塩基対の間であり、例えば、約100塩基対、約200塩基対、約300塩基対、約400塩基対、約450塩基対、約500塩基対、約600塩基対、約700塩基対、約800塩基対、約900塩基対、約1000塩基対であり、一部の実施形態では、定常領域は、約100塩基対よりも短いか、または約1000塩基対よりも長い。
本発明の一部の態様は、複雑なゲノムの文脈において、単一のユニークな部位の標的切断が可能である部位特異的ヌクレアーゼの選択および設計のための方法および戦略を提供する。一部の実施形態では、同じコンセンサス配列を切断するように設計されたかまたは切断することが公知である複数の候補ヌクレアーゼを準備するステップと、各候補ヌクレアーゼにより実際に切断された標的部位をプロファイリングし、それによりあらゆる切断されたオフターゲット部位(コンセンサス標的配列とは異なる標的部位)を検出するステップと、そのように同定された1つまたは複数のオフターゲット部位に基づいて候補ヌクレアーゼを選択するステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、一群の候補ヌクレアーゼ、例えば、コンセンサス標的部位を最高の特異性で切断するヌクレアーゼ、切断するオフターゲット部位の数が最少であるヌクレアーゼ、標的ゲノムの文脈において、切断するオフターゲット部位の数が最少であるヌクレアーゼ、またはコンセンサス標的部位以外の標的部位をまったく切断しないヌクレアーゼ、から最も特異的なヌクレアーゼを選択するために使用される。一部の実施形態では、この方法は、被験体のゲノムの文脈において、ヌクレアーゼの治療有効濃度以上の濃度で、いかなるオフターゲット部位も切断しないヌクレアーゼを選択するために使用される。
本発明の一部の実施形態は、ゲノム内のヌクレアーゼ標的部位を選択するための方法を提供する。本明細書の他の箇所で詳細に記載するように、驚くべきことに、所与のヌクレアーゼにより切断されたオフターゲット部位が、通例、コンセンサス標的部位に高度に類似している、例えば、コンセンサス標的部位と、1ヌクレオチド残基のみ、2ヌクレオチド残基のみ、3ヌクレオチド残基のみ、4ヌクレオチド残基のみ、または5ヌクレオチド残基のみ異なることが発見された。この発見に基づいて、ゲノム内のヌクレアーゼ標的部位を選択して、この部位を標的とし、ゲノム内のいかなるオフターゲット標的部位も切断しないヌクレアーゼの可能性を増大させることができる。例えば、一部の実施形態では、候補ヌクレアーゼ標的部位を同定するステップと、候補ヌクレアーゼ標的部位をゲノム内の他の配列と比較するステップとを含む方法を提供する。候補ヌクレアーゼ標的部位をゲノム内の他の配列と比較するための方法は、当業者に周知であり、例えば、汎用コンピューター上でBLASTなどの配列アラインメントソフトウェアまたはアルゴリズムを使用する、配列アラインメント法などが挙げられる。次いで、配列比較の結果に基づいて、適切なユニークなヌクレアーゼ標的部位を選択することができる。一部の実施形態では、候補ヌクレアーゼ標的部位が、ゲノム内の他のいかなる配列とも、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、または少なくとも10ヌクレオチド異なる場合、そのヌクレアーゼ標的部位は、ゲノム内のユニークな部位として選択され、一方、その部位がこの基準を満たさない場合、その部位は廃棄することができる。一部の実施形態では、上記に概説するように、配列比較に基づいていったん部位が選択されると、その選択部位を標的とする部位特異的ヌクレアーゼが設計される。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、標的部位に結合するジンクフィンガーアレイを構築し、そのジンクフィンガーアレイにDNA切断ドメインをコンジュゲートすることにより、任意の選択された標的部位を標的とするように設計することができる。DNA切断ドメインがDNAを切断するために二量体形成する必要がある実施形態では、それぞれがヌクレアーゼのハーフサイトに結合し、それぞれが切断ドメインにコンジュゲートするジンクフィンガーアレイが設計される。一部の実施形態では、ヌクレアーゼの設計および/または作製は、組換え技術により行われる。適切な組換え技術は当業者に周知であり、本発明はこの点において限定されない。
本発明の一部の態様は、本明細書に記載の方法および戦略を使用して設計される、特異性が向上した単離の部位特異的ヌクレアーゼを提供する。本発明の一部の実施形態は、そのようなヌクレアーゼをコードする核酸を提供する。本発明の一部の実施形態は、そのようなコード核酸を含む発現構築物を提供する。例えば、一部の実施形態では、ゲノム内の所望の標的部位を切断するように操作され、本明細書に提供する方法に従って、ヌクレアーゼがその目的の標的部位を切断するのに有効な濃度で、1未満、2未満、3未満、4未満、5未満、6未満、7未満、8未満、9未満、または10未満のオフターゲット部位を切断すると評価された単離ヌクレアーゼを提供する。一部の実施形態では、ゲノム内の他のいかなる部位とも、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、または少なくとも10ヌクレオチド残基、異なるように選択された所望のユニークな標的部位を切断するように操作された単離ヌクレアーゼを提供する。一部の実施形態では、単離ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)もしくは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、ホーミングエンドヌクレアーゼであるか、あるいは有機化合物ヌクレアーゼ、エンジイン、抗生物質ヌクレアーゼ、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、ブレオマイシン、もしくはそれらの誘導体であるかまたはそれらを含む。一部の実施形態では、単離ヌクレアーゼは、疾患または障害に関連する対立遺伝子内のコンセンサス標的部位を切断する。一部の実施形態では、単離ヌクレアーゼは、その切断が疾患または障害の治療または予防をもたらすコンセンサス標的部位を切断する。一部の実施形態では、この疾患はHIV/AIDSまたは増殖性疾患である。一部の実施形態では、対立遺伝子は、CCR5(HIV/AIDSの治療用)またはVEGFA対立遺伝子(増殖性疾患の治療用)である。
実施例
緒言
ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)は、所望の標的DNA配列を認識し切断するように操作された酵素である。ZFN単量体は、非特異的なFokI制限エンドヌクレアーゼ切断ドメイン1と融合したジンクフィンガーDNA結合ドメインからなる。FokIヌクレアーゼドメインは、DNAを切断するためには、二量体を形成して、2つのDNAハーフサイトを架橋しなければならないため2、ZFNは、二量体としてDNAに結合する場合にのみ、可変長のスペーサー配列を挟む2つのユニークな配列を認識し、切断するように設計される。ZFNは、非相同末端結合または相同組換えのいずれかを促進することにより、哺乳動物を含む種々の生物におけるゲノム工学のために使用されてきた3−9。強力な研究ツールの提供に加えて、ZFNには、遺伝子治療剤としての能力もある。実際、2つのZFNが最近臨床試験に入った:一つは、抗HIV治療のアプローチ(NCT00842634、NCT01044654、NCT01252641)の一部としてであり、もう一つは、抗癌治療(NCT01082926)として使用される細胞を改変するためのものである。
ZFN媒介のDNA切断に対するin vitro選択
潜在的な切断部位のライブラリーを、合成プライマーおよびPCRを使用して二本鎖DNAとして調製した(図5)。プライマー中の部分的に無作為化された位置はそれぞれ、79%の野生型ホスホラミダイトと、他の3つのホスホラミダイトすべての等量混合物との混合物を組み込むことにより合成した。したがって、ライブラリーの配列は、二項分布的に、平均して21%が、正規のZFN切断部位と異なった。平滑連結反応の戦略を使用して、1012メンバーの小環状ライブラリーを作製した。ローリングサークル増幅を使用して、このライブラリーの1011超のメンバーを増幅すると共に、連結して高分子量(12kb超)DNA分子にした。理論上、このライブラリーは、野生型標的配列から7つ以下の突然変異があるDNA配列をすべて、少なくとも10倍過剰量で包含する。
活性ZFNのDNA切断特異性を包括的に特徴づけるために、ノイズを増幅しバイアスを導入する可能性のある反復濃縮ステップを必要とすることなく、1ステップでDNA切断に対して選択することができる、潜在的なDNA基質の大規模なライブラリーを最初に作製した。ライブラリー中の各分子が1011超の潜在的な基質配列のうちの1つのコンカテマーであるように、基質ライブラリーを設計した(図5)。ZFNとのインキュベーションにより、切断されない分子、1回切断された分子、および少なくとも2回切断された分子が得られる。少なくとも2回切断された分子には、切断されたDNA配列の各半分からなる末端がある(図1)。切断されたライブラリーメンバーは、3つの方法で、切断されないライブラリーメンバーに対して濃縮される(図1)。第1に、2回切断された配列には、2つの相補的5’オーバーハングがあり、これらは、本物の切断産物のホールマークとして、DNAシークエンシング後に計算的に同定することができる。第2に、ZFN媒介の切断により、プレ選択ライブラリー中に存在しない5’リン酸が現れるので、切断を受けたDNAのみにシークエンシングアダプター連結反応が可能である。第3に、シークエンシングアダプターに相補的なプライマーを使用するPCRの後に、ゲル精製ステップにより、配列決定される材料すべてが、2つの隣接した部位で切断されたライブラリーメンバーと一致する長さであることが保証される。このゲル精製材料は、イルミナ法を使用するハイスループットDNAシークエンシングに供される(Bentley,D.R.et al.Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.Nature 456,53−9(2008))。理想的には、ZFN切断選択に使用されるライブラリーは、ZFNにより認識される長さのあらゆる可能なDNA配列からなるであろう。しかしながら、そのようなライブラリーの105メンバーごとに1つのメンバーのみが、24塩基対の認識配列のうち突然変異が7つ以内である配列を含有するであろう。オフターゲット認識配列は標的認識部位に類似している可能性が極めて高いため、その代わりとして、野生型認識配列と最大7つの突然変異だけ異なるハーフサイト配列をすべて10倍超で含有するバイアスのかかったライブラリーを使用した。ライブラリーメンバーは、認識部位の5’末端に隣接した完全に無作為化された塩基対、4−、5−、6−、または7−bpの完全に無作為化されたスペーサーを挟む2つの部分的に無作為化されたハーフサイト、および認識部位の3’末端に隣接した、別の完全に無作為化された塩基対からなる。完全に無作為化された5塩基対タグが、各ライブラリーメンバーに続く。このタグは、無作為化された隣接塩基対および無作為化されたスペーサー配列と共に、各ライブラリーメンバーに対するユニークな識別子「キー」として使用した。このユニークなキーが同一のライブラリーメンバーを含有する2つ以上の配列リードと関連する場合、これらの重複したシークエンシングリードは、PCR増幅の間に生じたと考えられ、したがって、1つのデータポイントとして処理される。
配列対の各メンバーは、スペーサーの断片、全ハーフサイト、隣接したヌクレオチド、および一定配列から構成された。スペーサーの一方の末端は、通例、一方の配列に見出され、他方の末端は、その対応する対配列に見出されるが、アダプターの連結前に伸長によってオーバーハングが平滑化されるので、オーバーハング配列は両方の対配列のリードの中に存在する。スペーサー配列は、共有のオーバーハング配列を最初に同定し、次いで、オーバーハング配列とハーフサイト配列との間に存在するすべてのヌクレオチドを同定することにより再構築した。曖昧さのないヌクレオチドおよび少なくとも4ヌクレオチドのオーバーハングを含有する配列のみを分析した。全体として、同一のライブラリーメンバー上の2つの切断事象に由来するユニーク配列に対する計算スクリーニングから、切断されたライブラリーメンバーのリードを合計200万取得した(表2)。0.5nM、1nM、および2nMのCCR5−224およびVF2468の選択について分析された配列は、上記のユニークな識別子キーの使用により同定されたが、数多くの配列反復のために、4nMの選択と比較してはるかに少ない。反復配列が除去される前における、0.5nM、1nM、および2nMの選択における、大量の反復配列の存在は、それらの選択で得られたシークエンシングリードの数が、すべての実験的選択ステップで残存した個々のDNA配列の数よりも大きいことを示す。すべての対のリードにおける一定ヌクレオチドの分析によって、シークエンシングのエラー率をヌクレオチド当たり0.086%と推定した。このエラー率を使用して、ポスト選択のZFN標的部位配列の98%はエラーを含有しないと推定した。
予想されるように、ライブラリーメンバーのサブセットのみが各酵素により切断された。CCR5−224およびVF2468に対するプレ選択ライブラリーはそれぞれ、完全な標的部位(2つのハーフサイト)当たり平均4.56および3.45の突然変異を含有したが、使用した最高濃度のZFN(4nMのCCR5−224および4nMのVF2468)に曝露されたポスト選択ライブラリーはそれぞれ、標的部位当たり平均2.79および1.53の突然変異を有した(図8)。ZFN濃度が低下するにつれて、両方のZFNのオフターゲット配列に対する許容性が低下した。最低濃度(0.5nMのCCR5−224および0.5nMのVF2468)において、切断された部位はそれぞれ、平均1.84および1.10の突然変異を含有した。新しいDNAの文脈において、同定された部位の小規模なサブセットを設けて、2nMのCCR5−224または1nMのVF2468と、37℃で4時間、in vitroでインキュベートした(図9)。試験した部位すべてについて切断が観察され、よりストリンジェントな(低いZFN濃度)選択から得られた部位は、低ストリンジェントな選択に由来する部位よりも効率的に切断された。試験した配列はすべて、幾つかの突然変異を含有するが、配列の中には、設計された標的よりも効率的にin vitroで切断されるものがあったことに留意されたい。
本発明者らの結果は、一方のハーフサイト中に突然変異を含むZFN基質は、プレ選択ライブラリーに比較して、同じハーフサイト中の近傍の位置にさらなる突然変異を有する可能性が高く、他方のハーフサイト中にさらなる突然変異を有する可能性が低いことを示す。この効果は、最も強力に認識される塩基対が変異した場合に最大であることが見出されたが(図11)、CCR5およびVEGFターゲティングZFNの両方に対する指定のハーフサイト位置すべてについてこの補償現象が観察された(図3および図12)。VF2468標的部位位置(+)G1、(−)G1、(−)A2、および(−)C3などの切断部位の少数派となるヌクレオチドの場合は、変異により、他方のハーフサイト中の塩基対における突然変異許容性が低下し、また、同じハーフサイトにおける突然変異許容性も、増大ではなくわずかに低下した。これらの突然変異のうちの2つ、(+)G1および(−)G1が同時に実行された場合は、他のすべての位置での突然変異許容性が低下した(図13)。まとめると、これらの結果から、一方のハーフサイトの突然変異許容性が他方のハーフサイトにおけるDNA認識によって影響を受けることがわかる。
ポスト選択ライブラリー中の各配列の出現頻度をプレ選択ライブラリー中のその出現頻度で割ることにより、3つ以下の突然変異を含有する配列すべてについて濃縮係数を算出した。切断により濃縮された配列(濃縮係数>1)の中で、CCR5−224は、すべてのユニークな単一突然変異配列、すべてのユニークな二重突然変異配列の93%、およびすべての可能な三重突然変異配列の半分を、使用した最高酵素濃度で切断することができた(図4aおよび表3a)。VF2468は、すべてのユニークな単一突然変異配列の98%、すべてのユニークな二重突然変異配列の半分、およびすべての三重突然変異配列の17%を切断することができた(図4bおよび表3b)。
K562細胞においてCCR5−224を発現させることにより、そしてZFN誘導の突然変異を証明するために、PCRおよびハイスループットDNAシークエンシングを使用して、ヒトゲノム内の34個の潜在的な標的部位を調べることにより、ヒト細胞において、選択により同定された部位でCCR5−224が切断することができるか否かを試験した。空ベクターを含有する対照細胞と比較して、活性なCCR5−224を発現する細胞において有意(P<0.05)に濃縮された、非相同末端結合(NHEJ)修復に特徴的な挿入または欠失突然変異(インデル)を有する部位を(表6)、ZFN媒介の切断の証拠となる部位と定義した。分析する各部位について、約100,000配列以上を取得し、これによって、10,000中に約1の頻度で有意に改変された部位の検出が可能になった。分析により、10のそのような部位が同定された、すなわち、CCR5における目的の標的配列、CCR2において以前に同定された配列、および8つのオフターゲット配列(表1、4、および6)、そのうちの1つはBTBD10遺伝子のプロモーター内に位置する。8つの新たに同定されたオフターゲット部位は、1/300〜1/5,300の頻度で改変されている。さらに、培養K562細胞においてVF2468を発現させ、in vitro選択により同定された、90の最も高度に切断された部位について上記の分析を実施した。分析された90のVF2468部位のうち32が、K562細胞において、ZFN媒介ターゲティングと一致するインデルを示した(表7)。3つのCCR5−224部位および7つのVF2468部位について、部位特異的PCR増幅を得ることができなかったため、それらの遺伝子座でのNHEJの発生を分析することができなかった。まとめると、これらの観察から、in vitro選択法により同定されたオフターゲット配列には、ヒト細胞において、ZFNにより切断され得る多くのDNA配列が含まれることがわかる。
ここに提示した方法により、ヒト細胞のゲノム中に存在し、かつ切断され得る多くの配列を含めて、2つの活性な二量体ZFNにより切断され得る数十万の配列が同定された。CCR5−224 ZFNについて新たに同定された切断部位の1つは、BTBD10遺伝子のプロモーター内にある。ダウンレギュレートされると、BTBD10は、悪性腫瘍21および膵臓β細胞のアポトーシス22と関連した。アップレギュレートされると、BTBD10は、Aktファミリータンパク質22、23のリン酸化を介して、神経細胞の増殖23および膵臓β細胞の増殖を促進することが示された。この潜在的に重要なオフターゲット切断部位および本発明者らが細胞において観察した7つの他の部位は、in vitro単量体結合データを使用して、潜在的なCCR5−224基質を予測する最近の研究6では同定されなかった。
オリゴヌクレオチドおよび配列。オリゴヌクレオチドはすべて、Integrated DNA TechnologiesまたはInvitrogenから購入したものであり、表8に収載する。縮重した位置を有するプライマーは、指定の塩基を79%および他の標準DNA塩基のそれぞれを7%含有する、手動で混合したホスホラミダイトを使用して、Integrated DNA Technologiesにより合成された。
1)シークエンシングリードの両方の対のそれぞれの位置を品質スコアについて検索し、いずれかの位置が品質スコア=「B」である場合、拒絶する。
2)対中の最初の配列がバーコード(「AAT」、「ATA」、「TAA」、「CAC」、「TCG」)で開始するすべての配列リードを別々のファイルに出力し、各バーコードに対応する配列の数をカウントする。
各ビニングされたファイルについて、
1)対中の両方の配列が同じバーコードで開始する配列対のみを受け入れる。
2)定常領域の検索によってシークエンスリードの配向を同定する。
−配向1は、定常領域「CGATCGTTGG」により同定する。
−配向2は、定常領域「CAGTGGAACG」により同定する。
3)同定された定常領域に対応する、CCR5−224およびVF2468のハーフサイトと比較して最少の突然変異を有する部分配列について、位置4(バーコード後)から定常領域の最初の位置までの配列を検索する。
−「GATGAGGATGAC」(CCR5−224(+))および「GACGCTGCT」(VF2468(−))について、配向1の配列を検索する。
−「AAACTGCAAAAG」(CCR5−224(−))および「GAGTGAGGA」(VF2468(+))について、配向2の配列を検索する。
4)両方のハーフサイトにわたって最少の突然変異について調べることによって、CCR5−224またはVF2468として配列をビニングする。
5)ハーフサイトおよび一定配列の位置を使用して、オーバーハング/スペーサー配列、隣接するヌクレオチド配列、およびタグ配列を決定する。
−配向1のハーフサイトと定常領域との間の部分配列はタグ配列である。
oタグ配列がない場合は、タグ配列は「X」と表示される。
−オーバーハング配列は、バーコードの後に開始する、配向1と配向2の部分配列間の最長の逆相補的部分配列を検索することにより決定する。
−スペーサー配列は、オーバーハングとハーフサイト(もしあれば)との間にある、配向1の部分配列の逆相補鎖を、オーバーハングとハーフサイトとの間にある、配向2の部分配列に連結することにより決定する。
oオーバーハングとハーフサイトとの間にオーバーラップがある場合は、オーバーハングの中に存在するオーバーラップしていない部分配列のみをスペーサーの一部としてカウントする。
6)重複配列を除去するために、各配列対をツリーの中にソートする。
−ツリーの各レベルは配列の位置に対応する。
−各レベルの各ノードは、特定の塩基(A、C、G、T、またはX=not(A、C、G、またはT))に対応し、次の位置の塩基(A、C、G、T、X)を指す。
−配列対をノードにコードし、スペーサー配列、隣接するヌクレオチド配列、およびタグ配列の連結からなる部分配列をツリーにソートする。
−ツリーの終端ノードにおいて、新たに加わる各配列を、重複を回避するためにノードにおける他のすべての配列と比較する。
7)ツリーのコンテンツを、バーコードおよびZFNに基づいて別々のファイルに再帰的に出力する。
1)対中の両方の配列が同じバーコードで開始する配列対のみを受け入れる。
2)配列「TCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGAC」を含有しない配列対を分析する(他方の対はライブラリー配列を含有する)。
3)ZFNハーフサイトについて配列を検索し、突然変異がより少ないZFN部位によってビニングする。
−「GTCATCCTCATC」および「AAACTGCAAAAG」(CCR5−224)ならびに「AGCAGCGTC」および「GAGTGAGGA」(VF2468)について検索する。
4)ハーフサイトの位置に基づいて、スペーサー、隣接するヌクレオチド、およびヌクレオチドタグ配列を同定する。
5)ZFNによるフィルタリングの下で、ステップ6のツリーアルゴリズムを使用して、重複配列を除去する。
1)「N」位置を含有せず、スペーサーの長さが4〜7の間である配列のみを分析する。
2)突然変異の総数、スペーサーの長さ、オーバーハングの長さ、(+)および(−)ハーフサイトに関するヌクレオチド頻度、長さが4−bp、5−bp、6−bp、および7−bpのスペーサーに関するヌクレオチド頻度、および隣接するヌクレオチドおよびタグ配列に関するヌクレオチド頻度を表にする。
3)ライブラリー配列について、ステップ1および2を反復する。
4)各位置での特異性スコアを、正の特異性スコア=(その位置の塩基対の頻度[ポスト選択]−その位置の塩基対の頻度[プレ選択])/(1−その位置の塩基対の頻度[プレ選択])、負の特異性スコア=(その位置の塩基対の頻度[ポスト選択]−その位置の塩基対の頻度[プレ選択])/(その位置の塩基対の頻度[プレ選択])を使用して算出する。
1)ヒトゲノム配列を、5または6塩基のすべてのスペーサー配列を受け入れた正規標的部位の9つの突然変異(CCR5−224)または6つの突然変異(VF2468)以内のすべての部位について、24および25の塩基ウィンドウ(CCR5−224)および18および19の塩基ウィンドウ(VF2468)で検索した。
2)各ポスト選択配列を、CCR5−224およびVF2468のそれぞれ9つおよび6つの突然変異以内のゲノム配列セットと比較した。
1)各配列について、ポスト選択ライブラリー中の出現頻度を、プレ選択ライブラリー中の出現頻度で割る。
1)配列プロファイルにおいて、プレ選択およびポスト選択の両方のデータについて、所与の位置にオフターゲット塩基を有する配列のみをさらに分析することを除いて、上記のアルゴリズムを使用する。
1)両方のハーフサイトにおけるあらゆる位置での突然変異について、フィルタリングされた配列プロファイルアルゴリズムを使用する。
2)Δ(特異性スコア)=フィルタリングされた特異性スコア−フィルタリングされていない特異性スコア、を計算する。
1)正確な隣接配列を検索することにより部位を同定する。
2)計算部位の長さを予測部位の長さと比較し、非改変標的部位(目的部位と比較して5つ以下の突然変異を含む配列を非改変とカウントした)との類似性を検索することにより、挿入または欠失の塩基の数をカウントする。
3)本当の挿入または欠失を同定するために、CCR5、CCR2、およびVEGF−Aプロモーター以外のすべての部位を手動で点検する。
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種々のTALENの部位選択性を、上記のZFNプロファイリングについてなされた研究と同様にしてプロファイリングした。実験および結果を図19〜49に記載する。選択1は、+28リンカー対+63リンカーのTALEN間の比較を含む。選択2は、TALドメインの長さが異なるTALENの比較を含む。
2ul 10pmolのTALNCCR5ライブラリーOligo(各oligoに対して別々の反応)
2ul 10×CircLigase II 10×反応緩衝液
1ul 50mMのMnCl2
1ul CircLigase II ssDNAリガーゼ(100U)[Epicentre]
Xulの水で全容積20uLにする
60℃で16時間インキュベートする。85℃で10分間インキュベートして不活化する。
各Circligase II反応液(精製していない)2.5ulを加える。
TempliPhi(商標)[GE Healthcare]100試料緩衝液25ulを加える。
95℃で3分間インキュベートする。4℃に徐々に冷却する。
TempliPhi(商標)反応緩衝液25ul/酵素混合物1ulを加える。
30℃で16時間インキュベートする。55℃で10分間熱不活化する。
Quant−iT(商標)PicoGreen(登録商標)dsDNA[Invitrogen]を使用して、dsDNA量を定量する。
等モルのTempliPhi(商標)反応液を合わせて、切断部位の数に関して最終2uMにする。
16ul TnT(登録商標)Quick Coupled[Promega]
0.4ul 1mMメチオニン
2uL .8ugのTALNベクター発現プラスミドまたは空溶解物のための水
1.6uL 水
30で1.5時間インキュベートした後、4℃で一晩保存する。
ウエスタンブロットにより、溶解物中のTALN量を定量する。
25uL 10×NEB Buffer 3[New England Biolabs]
10uL 2uMのTempliPhライブラリーDNA
165uL 水
レフトTALN溶解物を20nMの全レフトTALNに加える。
ライトTALN溶解物を20nMの全ライトTALNに加える。
空溶解物を合計50uLの溶解物に加える。
37℃で2時間インキュベートする。5ul(50ug)のRNアーゼA(Qiagen)を加える。室温で10分間インキュベートする。Qiagen PCR精製キットにより精製する。50uLの1mM Tris、pH8.0に溶出する。
50ul 消化されたDNA
3ul dNTP混合物
6ul NEB 2
1ul Klenow[New England Biolabs]
室温で30分間インキュベートする。Qiagen PCR精製キットにより精製する。
50ul 溶出DNA
5.9ul T4DNAリガーゼ緩衝液(NEB)
2ul(20pmol)の加熱/冷却アダプター(選択ごとに異なるアダプター)
1ul T4DNAリガーゼ(NEB、400単位)
室温で20時間インキュベートする。Qiagen PCR精製キットにより精製する。
6uL TALN消化DNA
30uL 5×Buffer HF
1.5uL 100uMのIllumina_fwdプライマー
1.5uL 100uMのPE_TALN_rev1プライマー
3ul 10mMのdNTP
1.5uL Phusion Hot Start II
106.5uL 水
98℃で3分間、そして98℃で15秒間、60℃で15秒間、72℃で1分間を15サイクル行う。QiagenPCR精製キットにより精製する。
10%グリセロール40uL中の溶出DNA1ugを負荷して、2%アガロースゲル上でゲル精製する。135Vで35分間、ゲル上で泳動させる。切断ハーフサイト+完全ハーフサイト+アダプターに相当する長さのバンドを、濾紙を用いてゲル精製する。濾紙を除去して、上清を回収する。Qiagen PCR精製キットにより精製する。
6uL TALN消化DNA(5−26−12)
30uL 5×Buffer HF
1.5uL 100uMのIllumina_fwdプライマー
1.5uL 100uMのPE_TALN_rev2プライマー
3ul 10mMのdNTP
1.5uL Phusion Hot Start II
106.5uL 水
98℃で3分間、そして98℃で15秒間、60℃で15秒間、72℃で1分間を6サイクル行う。Qiagen PCR精製キットにより精製する。
25uL 10×NEB Buffer 4
10uL 2uMのTempliPhライブラリーDNA
165uL 水
5uL 適切な制限酵素[New England Biolabs]
210uL 水
37℃で1時間インキュベートする。Qiagen PCR精製キットにより精製する。
50ul 溶出DNA
5.9ul T4DNAリガーゼ緩衝液(NEB)
2ul(20pmol)の加熱/冷却アダプター(4アダプター配列のプール)
1ul T4DNAリガーゼ(NEB、400単位)
室温で20時間インキュベートする。Qiagen PCR精製キットにより精製する。
6uL 制限酵素消化DNA(5−26−12)
30uL 5×Buffer HF
1.5uL 100uMのIllumina_revプライマー
1.5uL 100uMのTALNLibPCRプライマー
3ul 10mMのdNTP
1.5uL Phusion Hot Start II
106.5uL 水
98℃で3分間、そして98℃で15秒間、60℃で15秒間、72℃で1分間を12サイクル。Qiagen PCR精製キットにより精製する。
RT−qPCRにより定量する
12.5uL IQ SYBR Green Supermix
1uL 10uMのIllumina_rev
1uL 10uMのIllumina_fwd
9.5uL 水
1uL DNAテンプレート(プレ選択ライブラリーおよびTALN消化の両方)
95℃で5分間、そして95℃で30秒間、65℃で30秒間、72℃で40秒間を30サイクル行う。
DNAを2nMに希釈する(シークエンシング標準に比較して)
5uL TALN消化 2nMのDNA
2.5uL プレ選択ライブラリー 2nMのDNA
10uL .1NのNaOH
室温で5分間インキュベートする
Illumina Mi−Seqによりシークエンシングする
TALN消化配列について、2つの適切に間隔があいた一定オリゴ配列を見出す。
プレ選択ライブラリー配列について、適切に間隔があいた一定オリゴ配列およびライブラリーアダプター配列を見出す。
切断オーバーハング、左ハーフサイト、スペーサー、右ハーフサイトに配列を構文解析する。
ハーフサイト中に悪いIllumina塩基スコアを有する配列を除去する(<B=拒絶)。
ハーフサイトの突然変異の数と濃縮との間の比較的規則的な(対数的な関係)傾向は、塩基対結合する1つのTAL反復結合が他の反復結合に左右されないことと一致している。補償差分析では、切断部位の1つの突然変異が他の突然変異の分布を顕著に変化させることはなく、TAL反復ドメインが独立して結合することが示唆される。+28のリンカーのTALN構築物は、+63のリンカーのTALN構築物よりも特異的である。より大きな標的部位を認識するTALNほど、より多くの突然変異を許容することができるという点で、特異性が低下するが、突然変異したより大きな配列の存在量は、濃縮の増加よりも少なく、したがって、in vitro選択データおよびオフターゲット部位の存在量からは、より長いTALN対ではオフターゲット切断が起こる可能性がかなり低いことが示される。全体の標的部位突然変異が増加するにつれて、切断効率(濃縮)が規則的に低下することと各位置での濃縮とを組み合わせると、任意の配列のオフターゲット部位切断を予測することが可能になる。大体において、TALN選択では、濃縮は両方のハーフサイトにおける突然変異の合計に依存し、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)の場合に観察されたようにハーフサイト間の突然変異の分布に依存することはない。この観察をZFNの文脈依存の結合と組み合わせるとTALENは、そのZFN相当物と同等またはそれより高い特異性に容易に操作することができることがわかる。
当業者ならば、単なるルーチン的な実験作業を使用して、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定するように意図されるものではなく、添付の特許請求の範囲に示されるとおりである。
潜在的なVF2468ゲノムオフターゲット部位。ヒトゲノムを、VF2468切断に対するin vitro選択で残存したDNA配列について検索した。「X」マークが付いた部位は、in vitro選択データセット中に見出された部位である。「T」は、部位中の突然変異の総数を指し、「(+)」および「(−)」はそれぞれ、(+)および(−)のハーフサイト中の突然変異の数を指す。部位の配列は、ゲノム中に出現するとおりに記載しており、したがって、(−)ハーフサイトは、配列プロファイルとは逆のセンスで記載されている。
Claims (80)
- ヌクレアーゼの標的部位を同定するための方法であって、前記方法が、
(a)二本鎖の核酸標的部位を切断し、5’オーバーハングを生成するヌクレアーゼを準備するステップであって、前記標的部位が、[左ハーフサイト]−[スペーサー配列]−[右ハーフサイト](LSR)構造を含み、前記ヌクレアーゼが、スペーサー配列内の標的部位を切断するステップと、
(b)前記ヌクレアーゼが前記ヌクレアーゼの標的部位を含む候補核酸分子を切断するのに適切な条件下で、候補核酸分子のライブラリーに前記ヌクレアーゼを接触させるステップであって、各核酸分子が、候補ヌクレアーゼ標的部位および一定の挿入配列を含む配列のコンカテマーを含むステップと、
(c)前記ヌクレアーゼにより2回切断され、一方の側に左ハーフサイトおよび切断スペーサー配列が隣接し、他方の側に右ハーフサイトおよび切断スペーサー配列が隣接した一定の挿入配列を含む核酸分子の5’オーバーハングを充填し、それによって平滑末端を作製するステップと、
(d)ステップ(c)の核酸分子の左ハーフサイト、右ハーフサイト、および/またはスペーサー配列の配列を決定することにより、前記ヌクレアーゼにより切断された前記ヌクレアーゼ標的部位を同定するステップと
を含む方法。 - ステップ(d)の配列決定が、ステップ(c)の核酸分子の平滑末端にシークエンシングアダプターを連結し、前記核酸分子の増幅および/またはシークエンシングを行うステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記方法が、前記シークエンシングアダプターの連結後、PCRにより前記核酸分子を増幅するステップを含む、請求項2に記載の方法。
- 単一の一定挿入配列を含む分子について、ステップ(c)またはステップ(d)の核酸分子を濃縮するステップをさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記濃縮ステップがサイズ分画を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記サイズ分画がゲル精製によりなされる、請求項5に記載の方法。
- 5’オーバーハングが充填された相補対を前記核酸分子が含まなかった場合、ステップ(d)で決定されたいかなる配列も廃棄するステップをさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(d)で同定された複数のヌクレアーゼ標的部位を編集し、それによってヌクレアーゼ標的部位のプロファイルを作成するステップをさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、疾患に関連した遺伝子中の特定のヌクレアーゼ標的部位を切断する治療用ヌクレアーゼである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記治療用ヌクレアーゼが、前記特定のヌクレアーゼ標的部位を切断し、かつ10を超える、5を超える、4を超える、3を超える、2を超える、1を超える、さらなるヌクレアーゼ標的部位を切断しないか、またはまったく切断しない前記治療用ヌクレアーゼの最大濃度を決定するステップをさらに含む、請求項9に記載の方法。
- 最大濃度以下の最終濃度を生じさせるのに有効な量で、前記治療用ヌクレアーゼを被験体に投与するステップをさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが非特異的核酸切断ドメインを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼがFokI切断ドメインを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、切断ドメインが二量体形成すると標的配列を切断する核酸切断ドメインを含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、核酸配列に特異的に結合する結合ドメインを含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合ドメインがジンクフィンガーを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記結合ドメインが、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、または少なくとも5つのジンクフィンガーを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合ドメインが転写活性化因子様エレメントを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、転写活性化因子様エレメントヌクレアーゼ(TALEN)である、請求項1〜15または19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが有機化合物を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼがエンジインを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが抗生物質である、請求項21または22に記載の方法。
- 前記化合物が、ジネミシン(dynemicin)、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、ブレオマイシン、またはそれらの誘導体である、請求項22または23に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼがホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の核酸分子を含む、核酸分子のライブラリーであって、各核酸分子が、候補ヌクレアーゼ標的部位および一定の挿入配列スペーサー配列のコンカテマーを含むライブラリー。
- 前記候補ヌクレアーゼ標的部位が、[左ハーフサイト]−[スペーサー配列]−[右ハーフサイト](LSR)構造を含む、請求項26に記載のライブラリー。
- 前記左ハーフサイトおよび/または前記右ハーフサイトが、10〜18ヌクレオチド長の間である、請求項26または27に記載のライブラリー。
- 前記ライブラリーが、FokI切断ドメインを含むヌクレアーゼにより切断され得る候補ヌクレアーゼ標的部位を含む、請求項26〜28のいずれか一項に記載のライブラリー。
- 前記ライブラリーが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、ホーミングエンドヌクレアーゼ、有機化合物ヌクレアーゼ、エンジイン、抗生物質ヌクレアーゼ、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、および/またはブレオマイシンにより切断され得る候補ヌクレアーゼ標的部位を含む、請求項26〜29のいずれか一項に記載のライブラリー。
- 前記ライブラリーが、少なくとも105、少なくとも106、少なくとも107、少なくとも108、少なくとも109、少なくとも1010、少なくとも1011、または少なくとも1012の異なる候補ヌクレアーゼ標的部位を含む、請求項26〜30のいずれか一項に記載のライブラリー。
- 前記ライブラリーが、少なくとも5kDa、少なくとも6kDa、少なくとも7kDa、少なくとも8kDa、少なくとも9kDa、少なくとも10kDa、少なくとも12kDa、または少なくとも15kDaの分子量の核酸分子を含む、請求項26〜31のいずれか一項に記載のライブラリー。
- 前記候補ヌクレアーゼ標的部位が、部分的に無作為化された左ハーフサイト、部分的に無作為化された右ハーフサイト、および/または部分的に無作為化されたスペーサー配列を含む、請求項26〜32のいずれか一項に記載のライブラリー。
- 前記ライブラリーが、目的のヌクレアーゼの公知の標的部位のテンプレートである、請求項33に記載のライブラリー。
- 前記目的のヌクレアーゼが、ZFN、TALEN、ホーミングエンドヌクレアーゼ、有機化合物ヌクレアーゼ、エンジイン、抗生物質ヌクレアーゼ、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、ブレオマイシン、またはそれらの誘導体である、請求項34に記載のライブラリー。
- 部分的に無作為化された部位が、二項分布的に、平均して5%超、10%超、15%超、20%超、25%超、または30%超、コンセンサス部位と異なる、請求項33〜35のいずれか一項に記載のライブラリー。
- 部分的に無作為化された部位が、二項分布的に、平均して10%以下、15%以下、20%以下、25%以下、30%以下、40%以下、または50%以下、コンセンサス部位と異なる、請求項33〜36のいずれか一項に記載のライブラリー。
- 前記候補ヌクレアーゼ標的部位が、無作為化されたスペーサー配列を含む、請求項26〜37のいずれか一項に記載のライブラリー。
- コンセンサス標的部位を特異的に切断するヌクレアーゼを複数のヌクレアーゼから選択する方法であって、前記方法が、
(a)同じコンセンサス配列を切断する複数の候補ヌクレアーゼを準備するステップと、
(b)ステップ(a)の候補ヌクレアーゼのそれぞれについて、前記コンセンサス標的部位とは異なる、前記候補ヌクレアーゼにより切断されたヌクレアーゼ標的部位を同定するステップと、
(c)ステップ(b)で同定された1つまたは複数のヌクレアーゼ標的部位に基づいて、ヌクレアーゼを選択するステップと
を含む方法。 - ステップ(c)で選択されるヌクレアーゼが、最高の特異性で前記コンセンサス標的部位を切断するヌクレアーゼである、請求項39に記載の方法。
- 最高の特異性で前記コンセンサス標的部位を切断する前記ヌクレアーゼが、前記コンセンサス部位とは異なる標的部位の切断数が最小である前記候補ヌクレアーゼである、請求項39に記載の方法。
- 最高の特異性で前記コンセンサス標的部位を切断する前記候補ヌクレアーゼが、標的ゲノムの文脈において前記コンセンサス部位とは異なる標的部位の切断数が最小である前記候補ヌクレアーゼである、請求項39に記載の方法。
- ステップ(c)で選択される候補ヌクレアーゼが、前記コンセンサス標的部位以外のいかなる標的部位も切断しないヌクレアーゼである、請求項39〜42のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)で選択される候補ヌクレアーゼが、ヌクレアーゼの治療有効濃度で、被験体のゲノム内の前記コンセンサス標的部位以外のいかなる標的部位も切断しないヌクレアーゼである、請求項43に記載の方法。
- ステップ(c)で選択されたヌクレアーゼとゲノムを接触させるステップをさらに含む、請求項39〜44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ゲノムが、脊椎動物、哺乳動物、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、爬虫類、両生類、魚類、線虫、昆虫、またはハエのゲノムである、請求項45に記載の方法。
- 前記ゲノムが生細胞内にある、請求項45または46に記載の方法。
- 前記ゲノムが被験体内にある、請求項45〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記コンセンサス標的部位が、疾患または障害に関連する対立遺伝子内にある、請求項39〜48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記コンセンサス標的部位の切断が、疾患または障害の治療または予防をもたらす、請求項49に記載の方法。
- 前記コンセンサス標的部位の切断が、疾患または障害の症候の緩和をもたらす、請求項49に記載の方法。
- 前記疾患がHIV/AIDSまたは増殖性疾患である、請求項49〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対立遺伝子が、CCR5またはVEGFAの対立遺伝子である、請求項49〜52のいずれか一項に記載の方法。
- ゲノム内のヌクレアーゼ標的部位を選択するための方法であって、前記方法が、
(a)候補ヌクレアーゼ標的部位を同定するステップと、
(b)汎用コンピューターを使用して、前記候補ヌクレアーゼ標的部位を前記ゲノム内の他の配列と比較するステップであって、前記候補ヌクレアーゼ標的部位が、ゲノム内の他のいかなる配列とも、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、または少なくとも10ヌクレオチド異なる場合、そのヌクレアーゼ部位を選択するステップと
を含む方法。 - 前記候補ヌクレアーゼ標的部位が、[左ハーフサイト]−[スペーサー配列]−[右ハーフサイト](LSR)構造を含む、請求項54に記載の方法。
- 前記左ハーフサイトおよび/または前記右ハーフサイトが、10〜18ヌクレオチド長である、請求項55に記載の方法。
- 前記スペーサーが10〜24ヌクレオチド長である、請求項55または56に記載の方法。
- ステップ(b)で選択された候補ヌクレアーゼ部位を標的とするヌクレアーゼを設計および/または作製するステップをさらに含む、請求項54〜57のいずれか一項に記載の方法。
- 設計および/または作製が、組換え技術により行われる、請求項58に記載の方法。
- 設計および/または作製が、前記選択された候補標的部位またはそのハーフサイトに特異的に結合する結合ドメインを設計するステップを含む、請求項58または59に記載の方法。
- 設計および/または作製が、前記結合ドメインと核酸切断ドメインとをコンジュゲートするステップを含む、請求項60に記載の方法。
- 前記核酸切断ドメインが非特異的切断ドメインであり、かつ/または前記核酸切断ドメインが核酸を切断するために二量体または多量体を形成しなければならない、請求項61に記載の方法。
- 前記核酸切断ドメインがFokI切断ドメインを含む、請求項61または62に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼを単離するステップをさらに含む、請求項58〜63のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)もしくは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、ホーミングエンドヌクレアーゼであるか、あるいは有機化合物ヌクレアーゼ、エンジイン、抗生物質ヌクレアーゼ、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、ブレオマイシン、もしくはそれらの誘導体であるかまたはそれらを含む、請求項58〜64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記候補標的部位が、その切断が疾患または障害の症候の緩和に関連することが知られているゲノム配列内にある、請求項54〜65のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患がHIV/AIDSまたは増殖性疾患である、請求項66に記載の方法。
- 前記ゲノム配列がCCR5またはVEGFA配列である、請求項67に記載の方法。
- ゲノム内の標的部位を切断するように操作された単離ヌクレアーゼであって、前記ヌクレアーゼが、請求項26〜38のいずれか一項に記載の方法に従って選択された、単離ヌクレアーゼ。
- 請求項39〜53のいずれか一項に従って選択された単離ヌクレアーゼ。
- 請求項54〜58のいずれか一項に記載の方法に従って選択された標的部位を切断する単離ヌクレアーゼ。
- 請求項56〜68のいずれか一項に従って設計または操作された単離ヌクレアーゼ。
- 前記ヌクレアーゼが、請求項64に従って単離されている単離ヌクレアーゼ。
- 前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)もしくは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、ホーミングエンドヌクレアーゼであるか、あるいは有機化合物ヌクレアーゼ、エンジイン、抗生物質ヌクレアーゼ、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリチアマイシン、エスペラマイシン、ブレオマイシン、もしくはそれらの誘導体であるかまたはそれらを含む、請求項69〜72のいずれか一項に記載の単離ヌクレアーゼ。
- 請求項69〜74のいずれか一項に記載の単離ヌクレアーゼを含むキット。
- 前記単離ヌクレアーゼの標的部位を含む核酸をさらに含む、請求項76に記載のキット。
- 前記キットが、賦形剤ならびにヌクレアーゼと賦形剤を接触させてヌクレアーゼと核酸を接触させるのに適した組成物を生成させるためのインストラクションを含む、請求項76または78に記載のキット。
- 前記ゲノムが細胞内にある、請求項77に記載のキット。
- 前記ゲノムが被験体内にあり、前記賦形剤が薬学的に許容される賦形剤である、請求項77に記載のキット。
- 被験体に投与するための医薬組成物であって、前記組成物が、請求項69〜74のいずれか一項に記載の単離ヌクレアーゼまたは請求項69〜74のいずれか一項に記載の単離ヌクレアーゼをコードする核酸と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
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