DE69636831T2

DE69636831T2 - Verfahren zur herstellung heteromultimerer polypeptide

Info

Publication number: DE69636831T2
Application number: DE69636831T
Authority: DE
Inventors: J. Paul San Francisco CARTER; G. Leonard San Francisco PRESTA; B. John San Francisco RIDGWAY
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1995-03-01
Filing date: 1996-02-05
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2016-02-06
Also published as: JP3775798B2; PT812357E; NO973982L; MX9706493A; US20130089553A1; EP0812357B1; DK0812357T3; BR9607622A; US8216805B2; US20070014794A1; WO1996027011A1; AU4973396A; ZA961635B; US8679785B2; US7642228B2; FI973543A0; IL117274A; US5821333A; IL117274A0; FI973543A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Fachgebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von heteromultimeren Polypeptiden, wie z.B. multispezifischen Antikörpern (z.B. bispezifischen Antikörpern), multispezifischen Immunadhäsinen (z.B. bispezifischen Immunadhäsinen) sowie Antikörper-Immunadhäsin-Chimären, und heteromultimere Polypeptide, die unter Einsatz des Verfahrens hergestellt wurden.
Beschreibung verwandter Fachgebiet
Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper (BsAbs), die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene aufweisen, weisen in einer großen Palette klinischer Anwendungen ein signifikantes Potenzial als Targetingmittel zur In-vitro- und In-Vivo-Immundiagnose und -therapie und für diagnostische Immunassays auf.
In den diagnostischen Bereichen sind Bispezifische Antikörper in der Untersuchung der funktionellen Eigenschaften von Zelloberflächenmolekülen mittels Sonde und in der Definition der Fähigkeit der verschiedenen Fc-Rezeptoren zur Vermittlung von Zytotoxizität sehr zweckdienlich (Fanger et al., Crit. Rev. Immunol. 12, 101–124 [1992]). Nolan et al., Biochem. Biophys. Acta. 1040, 1–11 (1990), beschreiben andere diagnostische Anwendungen für BsAbs. Insbesondere können BsAbs zur Immobilisierung von Enzymen zur Verwendung in Enzymimmunassays hergestellt werden. Um dies zu erreichen, kann ein Arm von BsAb so beschaffen sein, dass er an ein spezifisches Epitop auf dem Enzym bindet, sodass die Bindung keine Enzyminhibition verursacht, der andere Arm von BsAB bindet an die immobilisierende Matrix, wodurch eine hohe Enzymdichte an der gewünschten Stelle garantiert wird. Beispiele für diese diagnostischen BsAbs umfassen den Kaninchen-Anti-IgG/Anti-Ferritin-BsAb, von Hammerlin et al., J. Exp. Med. 128, 1461–1473 (1968), beschrieben, der dazu verwendet wurde, den Ort der Oberflächenantigene zu bestimmen. Es sind ebenfalls BsAbs mit Bindungsspezifitäten für Meerrettichperoxidase (HRP) wie auch ein Hormon entwickelt worden. Eine andere potenzielle immunchemische Anwendung für BsAbs umfasst deren Verwendung- in Zwei-Stellen-Immuntests. Zum Beispiel werden zwei BsAbs durch die Bindung zweier separater Epitope an das Analytenprotein gebildet, ein Bsab bindet den Komplex an eine unlösliche Matrix, der andere bindet ein Indikatorenzym (siehe Nolan et al., siehe oben).
Bispezifische Antikörper können auch zur In-vitro- oder In-vivo-Immundiagnose verschiedener Erkrankungen wie z.B. Krebs verwendet werden (Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol. 79, 315 (1990)). Um die diagnostische Verwendung von BsAb zu erleichtern, kann ein Arm von BsAb ein tumorassoziiertes Antigen binden und der andere Arm einen detektierbaren Marker wie z.B. einen Chelatbildner binden, der ein Radionuklid fest bindet. Unter Verwendung dieses Ansatzes erzeugten Le Doussal et al. einen BsAb, der zur Radioimmundetektion von kolorektalen und Schilddrüsenkarzinomen zweckdienlich war, die einen Arm hatten, der ein karzinoembryoniales Antigen (CEA) band, und einen anderen Arm hatten, der Diethylentriaminpentaessigsäure (DPTA) band. Siehe Le Doussal et al., Int. J. Cancer Suppl. 7, 58–62 (1992), und Le Doussal et al., J. Nucl. Med. 34, 1662–1671 (1993). Stickney et al. beschreiben auf ähnliche Weise eine Strategie zur Detektion von CEA-exprimierenden kolorektalen Karzinomen unter Einsatz von Radioimmundetektion. Diese Wissenschafter beschreiben einen BsAb, der CEA wie auch Hydroxyethylthioharnstoffbenzyl-EDTA (EOTUBE) bindet. Siehe Stickney et al., Cancer Res. 51, 6650–6655 (1991).
Bispezifische Antikörper können auch bei geänderter Zytotoxizität zur Humantherapie verwendet werden, indem ein Arm, der ein Taget (z.B. ein Pathogen oder eine Tumorzelle) bindet, und ein anderer Arm bereitgestellt wird, der ein zytotoxisches Startermolekül, wie z.B. den T-Zellrezeptor oder den Fcγ-Rezeptor bindet. Dementsprechend können bispezifische Antikörper verwendet werden, um Zellimmunverteidigungsmechanismen spezifisch auf die Tumorzelle oder das infektiöse Mittel zu lenken. Unter Verwendung dieser Strategie ist gezeigt worden, dass bispezifische Antikörper, die an FcγRIII binden (d.h. CD16), durch natürliche Killer-(NK-)Zelle/große granuläre Lymphozyten-(LGL-)Zellen in vitro Tumorzelltötung vermitteln können und zur Prävention der Tumorwachstums in vivo zweckdienlich sind. Segal et al., Chem. Immunol. 47, 179 (1989), und Segal et al., Biologic Therapy of Cancer 2(4), DeVita et al., Hrsg, J.B. Lippincott, Philadelphia, S. 1 (1992). Auf ähnliche Art und Weise ist ein bispezifischer Antikörper, der einen Arm besitzt, der FcγRIII bindet, und einen anderen Arm hat, der an den HER2-Rezeptor bindet, zur Therapie von Ovarial- und Brusttumoren entwickelt worden, die das HER2-Antigen überexprimieren (Hseih-Ma et al., Cancer Research 52, 6832–6839 (1992), und Weiner et al., Cancer Research 53, 94–100 (1993)). Bispezifische Antikörper können auch die Tötung durch T-Zellen vermitteln. Normalerweise verbinden bispezifische Antikörper den CD3-Komplex auf T-Zellen mit einem tumorassoziierten Antigen. Ein vollständig humanisierter F(ab')₂-BsAb, der aus Anti-CD3 besteht, das an Anti-p185^HER2 gebunden ist, ist verwendet worden, um T-Zellen anzusteuern, um Tumorzellen zu töten, die den HER2-Rezeptor überexprimieren. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175 (1), 217 (1992). Bispezifische Antikörper sind in verschiedenen klinischen Untersuchungen der Frühphase mit vielversprechenden Ergebnissen getestet worden. In einer Untersuchung wurden 12 Patienten mit Lungen-, Ovarial- oder Brustkrebs mit Infusionen aktivierter T-Lymphozyten behandelt, die mit einem bispezifischen Anti-CD3-/Anti-Tumor-(MOC31-)Antikörper angesteuert wurden. deLeij et al., Bispecific Antibodies and Targeted Cellular Cytotoxicity, Romet-Lemonne, Fanger und Segal (Hrsg.), Lienhart, S. 249 (1991). Die angesteuerten Zellen induzierten eine beträchtliche lokale Lyse von Tumorzellen, eine milde Entzündungsreaktion, aber keine toxischen Nebenwirkungen oder Anti-Maus-Antikörperreaktionen. In einem sehr frühen Verfahren eines bispezifischen Anti-CD3/Anti-CD19-Antikörpers bei einem Patienten mit B-Zell-Malignität wurde ebenfalls eine signifikante Reduktion der peripheren Tumorzellzahlen erreicht. Clark et al., Bispecific Antibodies and Targeted Cellular Cytotoxicity, Romet-Lemonne, Fanger und Segal (Hrsg.), Lienhart, S. 243 (1991). Siehe auch Kroesen et al., Cancer Immunol. Immunother. 37, 400–407 (1993), Kroesen at al., Br. J. Cancer 70, 652–661 (1994), und Weiner et al., J. Immunol. 152, 2385 (1994), betreffend therapeutischer Anwendungen für BsAbs.
Bispezifische Antikörper können auch als fibrinolytische Mittel oder Impfstoffadjuvanzien verwendet werden. Weiters können diese Antikörper zur Behandlung von Infektionskrankheiten (z.B. zum Targeting von Effektorzellen auf viral infizierten Zellen wie z.B. HIV oder Influenzavirus oder Protozoa, wie z.B. Toxoplasma gondii) verwendet werden und können dazu verwendet werden, Immunotoxine an Tumorzellen oder Targetimmunkomplexe an Zelloberflächenrezeptoren abzugeben (siehe Fanger et al., siehe oben).
Die Verwendung von BsAbs ist durch die Schwierigkeit, BsAbs in ausreichender Menge und Reinheit zu erhalten, verhindert worden. Traditionellerweise wurden bispezifische Antikörper unter der Verwendung von Hybrid-Hybridom-Technologie (Millstein und Cuello, Nature 305, 537–539 (1983)) hergestellt. Aufgrund der zufälligen Verteilung von Immunglobulin-Schwer- und Immunglobulin-Leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein potenzielles Gemisch aus 10 verschiedenen Antikörpermolekülen, wovon nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist (siehe 1 hierin). Die Reinigung des korrekten Moleküls, die für gewöhnlich mittels Affinitätschromatographieschritten durchgeführt wird, ist eher beschwerlich und die Produktausbeuten gering. Dementsprechend sind Verfahren zur Produktion größerer Ausbeuten von BsAb entwickelt worden. Diese sind in den 2A–2E hierin dargestellt. Wie in 2A dargestellt, können unter Einsatz chemischer Bindung bispezifische Antikörper hergestellt werden. Um eine chemische Bindung von Antikörperfragmenten zu erreichen, beschreiben Brennan et al., Science 229, 81 (1985), ein Verfahren, worin intakte Antikörper proteolytisch gespalten werden, um F(ab')₂-Fragmente zu erzeugen. Diese Fragmente werden in Gegenwart des Dithiol-Komplexierungsmittels Natriumarsenit reduziert, um benachbarte Dithiole zu stabilisieren und intermolekularer Disulfidbildung vorzubeugen. Die erzeugten Fab'-Fragmente werden dann in Thionitrobenzoat-(TNB-)Derivate übergeführt. Eines der Fab'-TNB-Derivate wird dann durch Reduktion mit Mercaptoethylamin in das Fab'-Thiol zurücküberführt und mit einer äquimolaren Menge des anderen Fab'-TNB-Derivats gemischt, um das BsAb zu formen. Die produzierten BsAbs können als Mittel zur selektiven Immobilisierung von Enzymen verwendet werden.
Jüngste Fortschritte haben die direkte Gewinnung von Fab'-SH-Fragmenten aus E. coli erleichtert, die chemisch gebunden werden können, um bispezifische Antikörper zu bilden (siehe 2B). Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217–225 (1992), beschreiben die Produktion eines vollständig humanisierten BsAb-F(ab')₂-Moleküls, das einen Arm hat, der p185^HER2 bindet, und einen anderen Arm, der CD3 bindet. Jedes Fab'-Fragment wurde separat aus E. coli sekretiert und in vitro direkter chemischer Bindung unterworfen, um das BsAb zu bilden. Der so gebildete BsAb war in der Lage, an Zellen, die den HER2-Rezeptor überexprimieren, und an normale menschliche T-Zellen zu binden sowie die lytische Aktivität menschlicher zytotoxischer Lymohozyten gegen menschliche Brusttumortargets auszulösen. Siehe auch Rodrigues et al., Int. J. Cancers (Suppl.) 7, 45–50 (1992).
Verschiedene Verfahren zur direkten Herstellung und Isolierung von BsAB-Fragmenten aus rekombinanten Zellkulturen sind ebenfalls beschrieben worden. Zum Beispiel sind bispezifische F(ab')₂-Heterodimere unter Einsatz von Leucin-Zippern (siehe 2C) beschrieben worden. Kostelny et al., J. Immunol. 148 (5), 1547–1553 (1992). Die Leucin-Zipperpeptide aus den Fos- und Jun-Proteinen wurden mit den Fab'-Abschnitten von Anti-CD3- und Anti-Interleukin-2-Rezeptor-(IL-2R-) Antikörpern durch Genfusion verbunden. Die Antikörperhomodimere wurden in der Gelenksregion reduziert, um Monomere zu bilden, und dann reoxidiert, um Antikörperheterodimere zu bilden. Es wurde festgestellt, dass die BsAbs höchst wirksam in der Rekrutierung von zytotoxischen T-Zellen waren, um HuT-102-Zellen in vitro zu lysieren. Das Aufkommen der „Diakörper"-Technologie, die von Hollinger et al., PNAS (USA) 90, 6444–6448 (1993), beschrieben worden ist, hat einen alternativen Mechanismus zur Herstellung von BsAb-Fragmenten bereitgestellt. Die Fragmente umfassen eine variable Schwerkettendomäne (V_h), die mit einer variablen Leichtkettendomäne (V_L) durch einen Linker verbunden ist, der zu kurz ist, um die Paarung zwischen den zwei Domänen auf derselben Kette zu ermöglichen. Dementsprechend werden die V_H- und V_L-Domänen eines Fragments dazu gezwungen, sich mit den komplementären V_L- und V_H-Domänen eines anderen Fragments zu paaren, wodurch zwei Antigenbindungsstellen gebildet werden (siehe 2D hierin). Es ist ebenfalls von einer anderen Strategie zur Herstellung von BsAb-Fragmenten durch die Ver wendung von Einzelketten-Fv-(sFv-)Dimeren berichtet worden. Siehe Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994). Diese Wissenschafter schufen einen Antikörper, der die V_H- und V_L-Domänen eines Antikörpers umfasste, der gegen den T-Zellrezeptor gerichtet war, der durch einen 25-Aminosäurerest-Linker an die V_H- und V_L-Domänen eines Antifluoresceinantikörpers gebunden war. Das umgefaltete Molekül (siehe 2E hierin) band an Fluorescein und den T-Zellrezeptor und leitete die Lyse menschlicher Tumorzellen um, die Fluorescein aufwiesen, das kovalent an ihre Oberfläche gebunden war.
Es ist offensichtlich, dass verschiedene Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörperfragmente, die direkt aus rekombinanter Zellkultur gewonnen werden können, berichtet wurden. Volllängen-BsAbs können gegenüber BsAb-Fragmenten aufgrund ihrer wahrscheinlich längeren Serumhalbwertszeit und möglicher Effektorfunktionen für viele klinische Anwendungen bevorzugt sein.
Immunadhäsine
Immunadhäsine (Ia's) sind antikörperähnliche Moleküle, welche die Bindungsdomäne eines Proteins, wie z.B. eines Zelloberflächenrezeptors oder eines Liganden (eines „Adhäsins"), mit den Effektorfunktionen einer konstanten Immunglobulindomäne kombinieren. Immunadhäsine können viele der wertvollen chemischen und biologischen Eigenschaften menschlicher Antikörper besitzen. Da Immunadhäsine aus einer menschlichen Proteinsequenz mit einer gewünschten Spezifität hergestellt werden können, die an eine geeignete menschliche Sequenz der Immunglobulingelenksdomäne und konstanten Domäne (Fc) gebunden ist, kann die Bindungsspezifität von Interesse unter Einsatz vollständig menschlicher Komponenten erreicht werden. Solche Immunadhäsine sind für den Patienten minimal immunogen und bei chronischer oder wiederholter Verwendung sicher.
Immunadhäsine, von denen in der Literatur berichtet wurde, umfassen Fusionen des T-Zellrezeptors (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2936–2940 (1987)); CD4 (Capon et al., Nature 337, 525–531 (1989), Traunecker et al., Nature 339, 68–70 (1989), Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9, 347–353 (1990), und Byrn et al., Nature 344, 667–670 (1990)); L-Selectin oder Homing-Rezeptor (Watson et al., J. Cell Biol. 110, 2221–2229 (1990); und Watson et al., Nature 349, 164–167 (1991)); CD44 (Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990)); CD28 und B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173, 721–730 (1991)); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174, 561–569 (1991)), CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 (1991)); TNF-Rezeptor (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535–10539 (1991), Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27, 2883–2886 (1991), und Peppel et al., J. Exp. Med. 174, 1483–1489 (1991)); NP-Rezeptoren (Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 23060–23067 (1991)); Interferon-γ-Rezeptor (Kurschner et al., J. Biol. Chem. 267, 9354–9360 (1992)); 4-1BB (Chalupny et al., PNAS (USA) 89; 10360–10364 (1992)) und IgE-Rezeptor-α (Ridgway and Gorman, J. Cell. Biol., Band 115, Abstract Nr. 1448 (1991)).
Beispiele für Immunadhäsine, die für die therapeutische Anwendung beschrieben worden sind, umfassen das CD4-IgG-Immunadhäsin zum Blockieren der Bindung von HIV an Zelloberflächen-CD4. Daten, die aus den klinischen Untersuchungen der Phase I erhalten wurden, in welchen schwangeren Frauen kurz vor der Entbindung IgG verabreicht wurde, lassen vermuten, dass dieses Immunadhäsin in der Prävention der Übertragung von HIV von der Mutter an den Fötus nützlich sein kann. Ashkenazi et al., Intern. Rev. Immunol. 10, 219–227 (1993). Es ist ebenfalls ein Immunadhäsin entwickelt worden, das den Tumornekrosefaktor (TNF) bindet. TNF ist ein proentzündliches Zytokin, das sich als Hauptvermittler von septischem Schock erwiesen hat. Basierend auf einem Mausmodell für septischen Schock hat sich ein TNF-Rezeptor-Immunadhäsin als Kandidat für die klinische Verwendung in der Behandlung von septischem Schock erwiesen (Ashkenazi et al., siehe oben). Immunadhäsine können auch nicht therapeutisch verwendet werden. Zum Beispiel wurde das L-Selectin-Rezeptor-Immunadhäsin als Reagens zur histochemischen Färbung von peripheren Lymphknoten-Hochendothelvenulen (HEV) verwendet. Dieses Reagens wurde auch dazu verwendet, den L-Selectinliganden zu isolieren und zu charakterisieren (Ashkenazi et al., siehe oben).
Wenn beide Arme der Immunadhäsinstruktur verschiedene Spezifitäten haben, wird das Immunadhäsin in Analogie zu bispezifischen Antikörpern „bispezifisches Immunadhäsin" genannt. Dietsch et al., J. Immunol. Methods 162, 123 (1993), beschreiben ein solches bispezifisches Immunadhäsin; das die extrazellulären Domänen der Adhäsionsmoleküle, E-Selectin und P-Selectin, kombiniert. Bindungsstudien zeigten, dass das auf diese Weise gebildete bispezifische Immunglobulinfusionsprotein eine verstärkte Fähigkeit aufweist, sich an eine myeloide Zelllinie zu binden, die mit den monospezifischen Immunadhäsinen verglichen wurde, von welchen es abgeleitet war.
Antikörper-Immunadhäsin-Chimären
In der Literatur sind ebenfalls Antikörper-Immunadhäsin-(Ab/Ia-)Chimären beschrieben worden. Diese Moleküle kombinieren die Bindungsregion eines Immunadhäsins mit der Bindungsdomäne eines Antikörpers.
Berg et al., PNAS (USA) 88, 4723–4727 (1991), erzeugten eine bispezifische Antikörper-Immunadhäsin-Chimäre, die von murinem CD4-IgG abstammte. Diese Wissenschafter schufen ein tetrameres Molekül mit zwei Armen. Ein Arm bestand aus CD4, das mit einer konstanten Antikörper-Schwerkettendomäne fusioniert war, gemeinsam mit einer CD4-Fusion mit einer konstanten Antikörper-Leichtkettendomäne. Der andere Arm bestand aus einer vollständigen Schwerkette eines Anti-CD3-Antikörpers gemeinsam mit einer vollständigen Leichtkette desselben Antikörpers. Mithilfe des CD4-IgG-Arms bindet sich dieses bispezifische Molekül an CD3 auf der Oberfläche von zytotoxischen T-Zellen. Die Nebeneinanderstellung der zytotoxischen Zellen und HIV-infizierten Zellen resultiert in der spezifischen Tötung der letzteren Zellen.
Während Berg et al. ein bispezifisches Molekül beschreiben, das in seiner Struktur tetramer war, ist es möglich, ein trimeres Hybridmolekül zu produzieren, das nur eine CD4-IgG-Fusion enthält. Siehe Chamov et al., J. Immunol. 153, 4268 (1994). Der erste Arm dieses Konstrukts wird durch eine humanisierte Anti-CD3-κ-Leichtkette und eine humanisierte Anti-CD3-γ-Schwerkette gebildet. Der zweite Arm ist ein CD4-IgG-Immunadhäsin, das einen Teil der extrazellulären Domäne von CD4, das für die gp120-Bindung verantwortlich ist, mit der Fc-Domäne von IgG kombiniert. Die resultierende Ab/Ia-Chimäre vermittelte die Tötung von HIV-infizierten Zellen unter Einsatz von entweder reinen zytotoxischen T-Zellformulierungen oder peripheren Vollblutlymphozyten-(PBL-)Fraktionen, die zusätzlich Fc-Rezeptor-tragende große granuläre Lymphozyteneffektorzellen umfassen.
Bei der Herstellung der zuvor angeführten Heteromultimere ist es wünschenswert, die Ausbeuten der gewünschten Heteromultimere gegenüber dem/den Homomultimer(en) zu erhöhen. Die hierin beschriebene Erfindung stellt ein Mittel bereit, um dies zu erreichen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Anwendung beschreibt eine „Protuberanz-in-Kavität"-Strategie, die der Herstellung einer Grenzfläche zwischen einem ersten und einem zweiten Polypeptid zur Hetero-Oligomerisierung dient. Siehe 4 für eine schematische Darstellung der verwendeten Strategie. Die bevorzugte Grenzfläche umfasst zumindest einen Teil der C_H3-Domäne einer konstanten Antikörperdomäne. „Protuberanzen" werden hergestellt, indem kleine Aminosäureseitenketten aus der Grenzfläche des ersten Polypeptids durch größere Seitenketten (z.B. Tyrosin oder Tryptophan) ersetzt werden. Kompensatorische „Kavitäten" identischer oder ähnlicher Größe wie jene der Protuberanzen werden gegebenenfalls auf der Grenzfläche des zweiten Polypeptids hergestellt, indem große Aminosäureseitenketten durch kleinere (z.B. Alanin oder Threonin) ersetzt werden. Wo eine geeignet positionierte und dimensionierte Protuberanz oder Kavität an der Grenzfläche von entweder dem ersten oder zweiten Polypeptid besteht, ist es nur notwendig, an der angrenzenden Grenzfläche eine entsprechende Kavität bzw. Protuberanz herzustellen.
Dementsprechend kann sich die Erfindung auf ein Verfahren nach Anspruch 1 beziehen.
Normalerweise wird die Nucleinsäure, die sowohl für das erste Polypeptid als auch das zweite Polypeptid kodiert, verändert, um für die Protuberanz bzw. Kavität zu kodieren. Die ersten und zweiten Polypeptide umfassen jeweils eine konstante Antikörperdomäne, wie z.B. die C_H3-Domäne eines menschlichen IgG₁.
Die Erfindung stellt auch ein Heteromultimer (wie z.B. einen bispezifischen Antikörper, ein bispezifisches Immunadhäsin oder eine Antikörper/Immunadhäsinchimäre) bereit, die mithilfe des Verfahrens nach Anspruch 1 erhalten werden kann. Das Heteromultimer kann in Form einer Zusammensetzung bereitgestellt werden, die weiters einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Die Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, die eine Nucleinsäure umfasst, die für das Heteromultimer des vorangegangen Absatzes kodiert, worin die Nucleinsäure, die für das erste Polypeptid und zweite Polypeptid kodiert, in einem einzigen Vektor oder in verschiedenen Vektoren vorhanden ist. Die Wirtszelle kann in einem Verfahren zur Herstellung eines Heteromultimers verwendet werden, das die Züchtung der Wirtszelle umfasst, sodass die Nucleinsäure exprimiert wird und das Heteromultimer aus der Zellkultur gewonnen wird.
Die Erfindung stellt einen Mechanismus zur Erhöhung der Ausbeuten des Heteromultimers gegenüber anderen unerwünschten Endprodukten, wie z.B. Homomultimeren, bereit. Vorzugsweise sind die Ausbeuten des Heteromultimers, das aus einer rekombinanten Zellkultur gewonnen wird, im Vergleich zu dem/den Nebenprodukten Homomultimer(e), zumindest höher als 80 % und vorzugsweise höher als 90 %.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 stellt die verschiedenen Antikörpermoleküle dar, die erzeugt werden können, wenn das traditionelle Hybrid-Hybridom-Verfahren von Millstein und Cuello, siehe oben, zur Herstellung von Volllängen-BsAbs verwendet wird.
2A–2E veranschaulichen die verschiedenen Verfahren des Stands der Technik des Hintergrunds zur Herstellung von BsAb-Fragmenten, die im obigen Hintergrundabschnitt besprochen wurden.
3A–3C zeigen eine beispielhafte Strategie zur Herstellung eines Immunadhäsindimers (3C), das die Bindungsdomäne eines Rezeptors (3A) und die konstante Domäne eines IgG₂-Immunglobulins (3B) umfasst.
4 veranschaulicht schematisch die Protuberanz-in-Kavität-Strategie der vorliegenden Anmeldung zur Herstellung von Heteromultimeren.
5 zeigt die Grenzflächenreste der C_H3-Domäne der Immunglobuline IgG (Seq.-ID Nr. 1–3), IgA (Seq.-ID Nr. 4), IgD (Seq.-ID Nr. 5), IgE (Seq.-ID Nr. 6) und IgM (Seq.-ID Nr. 7). Die C_H3-Domäne jedes dieser Immunglobuline besteht aus einem „β-Sandwich", das aus zwei getrennten und parallelen „β-Faltblättern" besteht. Eines dieser β-Faltblätter stellt die Grenzflächenreste bereit, das andere ist das „äußere β-Faltblatt". Das β-Faltblatt, welches die Grenzfläche bildet, wird aus vier „β-Strängen" gebildet. Die Reste jedes dieser sieben β-Stränge der C_H3-Domäne der verschiedenen Immunglobuline werden durch die obere Strichlinie identifiziert. Es werden die Reste in den mittleren und Rand-β-Strängen der Grenzfläche identifiziert, wie auch jene des äußeren β-Faltblatts. Die Nummerierung der Reste erfolgt entsprechend der F_c-Kristallstruktur (Deisenhofer, Biochem. 20, 2361 (1981)). Die Reste, die im Inneren der C_H3-Domäne eingebettet sind, werden mit einem „B" identifiziert, jene, die teilweise im Inneren der C_H3-Domäne eingebettet sind, werden mit einem „b" identifiziert, jene „Kontakt"-Reste, die teilweise an der Grenzfläche eingebettet sind (d.h. 26%–10% exponiert), werden mit einem „i" identifiziert, und jene, die an der Grenzfläche eingebettet sind (d.h. < 6 % exponiert), werden mit „I" identifiziert. Die fettgedruckten Reste sind optimale Originalkandidatenreste zum Ersetzen durch Importreste.
6 identifiziert die Grenzflächenreste menschlicher (h) (Seq.-ID Nr. 8–11 und 16) oder muriner (m) (Seq.-ID Nr. 12–15) IgG-Subtypen (B=ASX) und (Z=GLX). Die Reste in den β-Strängen am Rand und in der Mitte der Grenzfläche sind in Klammern dargestellt, und die „Kontakt"-Reste sind mit Pfeilen angezeigt. Die Sequenzen wurden von Miller et al., J. Mol. Biol. 216, 965 (1990), und Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD, Auflage 5 (1991), erhalten. Es ist offensichtlich, dass die Kontaktreste höchst konserviert sind.
7 zeigt die Grenzflächenreste der C_H3-Domäne von menschlichem IgG₁. Die Daten wurden von Miller et al., J. Mol. Biol. 216, 965 (1990), erhalten. „Kontakt"-Reste sind dargestellt, und jene Reste, die in den hierin beschriebenen Beispielen mutiert wurden, sind eingerahmt angegeben.
8 zeigt schematisch den Co-Transfektionstest zur Untersuchung von Fc-Heterodimerisierung, die in den Beispielen beschrieben ist.
9 zeigt ein C_H3-Dimer basierend auf einer 2,9-A-Struktur von menschlichem IgG₁-Fc (Deisenhofer, Biochem. 20, 2361 (1981)), wobei T366Y- und Y407T-Mutationen auf den gegenüberliegenden Seiten der Grenzfläche gemeinsam mit den Resten Phe⁴⁰⁵ und Thr³⁹⁴ hervorgehoben sind („Kabat-Nummerierung" – Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD, Auflage 5, (1991)).
10A–10E zeigten eine densitometrische Scanninganalyse von SDS-Page von Produkten aus der Co-Transfektion von Antikörper-(Ab-) Schwer-(H-) und -Leicht-(L-)Ketten mit Immunadhäsin (Ia). 10A zeigt den Wildtyp; 10B zeigt den mutierten Ab Y407T, Ia T366Y; 10C zeigt den mutierten Ab T366Y, Ia Y407T; 10D zeigt den mutierten Ab F405A, Ia T394W; und 10E zeigt den mutierten Ab T366Y:F405A, Ia T394W:Y407T. Die präsentierten Daten sind der Durchschnitt aus zumindest 2 unabhängigen Versuchen. Die densitometrische Signalreaktion erwies sich im verwendeten Versuchsbereich (0,02–10 μg) als linear (R = 0,9993), wie durch den Kontrollversuch unter Einsatz eines eng verwandten humanisierten Antikörpers, huMAb4D5-8 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992)), beurteilt wurde.
I. Definitionen
Im Allgemeinen haben die folgenden Wörter oder Phrasen die angezeigten Definitionen, wenn sie in der Beschreibung, den Beispielen und Ansprüchen verwendet werden:
Ein „Heteromultimer" oder „heteromultimeres Polypeptid" ist ein Molekül, das zumindest ein erstes Polypeptid und ein zweites Polypeptid umfasst, worin das zweite Polypeptid sich in der Aminosäuresequenz vom ersten Polypeptid durch zumindest einen Aminosäurerest unterscheidet. Vorzugsweise weist das Heteromultimer eine Bindungsspezifität für zumindest zwei verschiedene Liganden oder Bindungsstellen auf. Das Heteromultimer kann ein „Heterodimer" umfassen, das vom ersten und zweiten Polypeptid gebildet wird, kann tertiäre Strukturen höherer Ordnung bilden, wo zusätzlich zum ersten und zweiten Polypeptid Polypeptide gegenwärtig sind. Beispielhafte Strukturen für das Heteromultimer umfassen Heterodimere (z.B. das von Dietsch et al., siehe oben, beschriebene bispezifische Immunadhäsin), Heterotrimere (z.B. die Ab/Ia-Chimäre, die von Chamow et al., siehe oben, beschrieben worden ist), Heterotetramere (z.B. einen bispezifischen Antikörper) und weitere oligomere Strukturen.
Wie hierin verwendet bezeichnet „Polypeptid" im Allgemeinen Peptide und Proteine mit mehr als etwa zehn Aminosäuren. Vorzugsweise werden Säugetierpolypeptide (Polypeptide, die ursprünglich von einem Säugetierorganismus abstammten) verwendet, noch bevorzugter jene, die direkt in das Medium sekretiert werden. Beispiele für bakterielle Polypeptide umfassen z.B. alkalische Phosphatase und β-Lactamase. Beispiele für Säugetierpolypeptide umfassen Moleküle wie Renin, ein Wachstumshormon, einschließlich menschliches Wachstumshormon; Rinderwachstumshormon; einen Wachstumshormon abgebenden Faktor; Parathormon; Thyreotropin; Lipopro teine; Alpha-1-Antitrypsin; Insulin-A-Kette; Insulin-B-Kette; Proinsulin; ein follikelstimulierendes Hormon; Calcitonin; ein luteinisierendes Hormon; Glucagon; Gerinnungsfaktoren, wie z.B. Faktor VIIIC, Faktor IX, Gewebsfaktor und von-Willebrand-Faktor; Anti-Gerinnungsfaktoren wie z.B. Protein C; einen atrialen natriuretischen Faktor; Lungentensid; einen Plasminogenaktivator, wie z.B. Urokinase oder menschlicher Urin oder einen Plasminogenaktivator vom Gewebstyp (t-PA); Bombesin; Thrombin; einen hämatopoetischen Wachstumsfaktor; Tumornekrosefaktor-alpha und -beta; Enkephalinase; RANTES (bei Aktivierung reguliert, normalerweise T-Zellexprimiert und sekretiert); ein menschliches Makrophagenentzündungsprotein (MIP-1-alpha), ein Serumalbumin, wie z.B. menschliches Serumalbumin; Müller-Inhibiting-Substanz; Relaxin-A-Kette; Relaxin-B-Kette; Prorelaxin; gonadotropinassoziiertes Mauspeptid; ein Mikrobenprotein, wie z.B. Beta-Lactamase; DNase; Inhibin; Activin; einen Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF); Rezeptoren für Hormone oder Wachstumsfaktoren; Integrin; Protein A oder D; Rheumafaktoren; einen neurotrophen Faktor, wie z.B. einen vom Knochen abstammenden neurotrophen Faktor (BDNF), Neurotrophin-3, -4, -5 oder -6 (NT-3, NT-4, NT-5 oder NT-6), oder einen Nervenwachstumsfaktor, wie z.B. NGF-b; einen aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktor (PDGF); einen Fibroblastenwachstumsfaktor, wie z.B. einen aFGF und bFGF; einen epidermalen Wachstumsfaktor (EGF); einen transformierenden Wachstumsfaktor (TGF), wie z.B. TGF-alpha und TGF-beta, einschließlich TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGFβ4 oder TGF-β5; einen insulinähnlichen Wachstumsfaktor-I und -II (IGF-1 und IGF-11); des(1-3)-IGF-1 (Gehirn-IGF-1), insulinähnliche wachstumsfaktorbindende Proteine; CD-Proteine, wie z.B. CD-3, CD-4, CD-8 und CD-19: Erythropoietin; osteoinduktive Faktoren; Immunotoxine; ein morphogenetisches Knochenprotein (BMP); ein Interferon, wie z.B. Interferon-alpha, -beta und -gamma; das Koloniewachstum stimulierender Faktoren (ILs), z.B. M-CSF, GM-CSF und G-CSF; Interleukine (ILs), z.B. IL-1 bis IL-10; Superoxiddismutase; T-Zell-Rezeptoren; Oberflächenmembranproteine; einen abbaubeschleunigenden Faktor; ein virales Antigen, wie z.B. einen Abschnitt der AIDS-Hülle; Transportproteine; Homing-Rezeptoren; Addressine; regulierende Proteine; Antikörper; und Fragmente von beliebigen der zuvor angeführten Polypeptide.
Das „erste Polypeptid" ist jedes beliebige Polypeptid, das mit einem zweiten Polypeptid assoziiert werden soll. Das erste und zweite Polypeptid treffen an einer „Grenzfläche" (nachstehend definiert) aufeinander. Zusätzlich zu der Grenzfläche kann das erste Polypeptid eine oder mehrere zusätzliche Domänen umfassen, wie z.B. „Bindungsdomänen" (z.B. eine variable Antikörperdomäne, eine Rezeptorbindungsdomäne, eine Ligandenbindungsdomäne oder enzymatische Domäne) oder konstante Antikörperdomänen (oder Teile davon), einschließlich C_H2-, C_H1- und C_L-Domänen. Normalerweise umfasst das erste Polypeptid zumindest eine Domäne, die von einem Antikörper abstammt. Diese Domäne ist in geeigneter Weise eine konstante Domäne, wie z.B. die C_H3-Domäne eines Antikörpers, und kann die Grenzfläche des ersten Polypeptids bilden. Beispielhafte erste Polypeptide umfassen Antikörper-Schwerkettenpolypeptide, Chimären, die eine konstante Antikörperdomäne mit einer Bindungsdomäne eines heterologen Polypeptids verbinden (d.h. ein Immunadhäsin, siehe die nachstehende Definition), Rezeptorpolypeptide (insbesondere jene, die mit anderen Rezeptorpolypeptiden Dimere bilden, wie z.B. Interleukin-8-Rezeptor [IL-8R] und Integrinheterodimere [z.B. LFA-1 oder GPIIIb/IIIa]), Ligandenpolypeptde (z.B. Nervenwachstumsfaktor [NGF], Neurotrophin-3 [NT-3] und vom Gehirn abstammender Wachstumsfaktor [BDNF] – siehe Arakawa et al., J. Biol. Chem. 269 (45), 27833–27839 (1994), und Radziejewski et al., Biochem. 32 (48), 1350 (1993)) und variable Antikörperdomänenpolypeptide (z.B. Diakörper). Das bevorzugte erste Polypeptid ist aus einer Antikörper-Schwerkette und einem Immunadhäsin ausgewählt.
Das „zweite Polypeptid" ist ein Polypeptid, das mit dem ersten Polypeptid über eine „Grenzfläche" assoziiert werden soll. Zusätzlich zur Grenzfläche kann das zweite Polypeptid weitere Domänen, wie z.B. eine „Bindungsdomäne" (z.B. eine variable Antikörperdomäne, Rezeptorbindungsdomäne, Ligandenbindungsdomäne oder enzymatische Domäne) oder konstante Antikörperdomänen (oder Teile davon), einschließlich C_H2-, C_H1- und C_L-Domänen, umfassen. Normalerweise umfasst das zweite Polypeptid zumindest eine Domäne, die von einem Antikörper abstammt. Diese Domäne ist in geeigneter Weise eine konstante Region, wie z.B. die C_H3-Domäne eines Antikörpers, und kann die Grenzfläche des zweiten Polypeptids bilden. Beispielhafte zweite Polypeptide umfassen Antikörper-Schwerkettenpolypeptide, Chimären, die ei ne konstante Antikörperdomäne mit einer Bindungsdomäme eines heterologen Polypeptids, verbinden (d.h. ein Immunadhäsin, siehe Definition unten), Rezeptorpolypeptide (besonders jene, die mit einem anderen Rezeptorpolypeptid Dimere bilden, z.B. Interleukin-8-Rezeptor [IL-8R] und -Integrin-Heterodimere [z.B. LFA-1 oder GPIIIb/IIIa]), Ligandenpolypeptide (z.B. Nervenwachstumsfaktor [NGF], Neurotrophin-3 [NT-3] und vom Gehirn abstammender Wachstumsfaktor [BDNF] – siehe Arakawa et al., J. Biol. Chem. 269 (45), 27833–27839 (1994), und Radziejewski et al., Biochem. 32 (48), 1350 (1993)) und variable Antikörperdomänenpolypeptide (z.B. Diakörper). Das bevorzugte zweite Polypeptid ist aus einer Antikörper-Schwerkette und einem Immunadhäsin ausgewählt.
Eine „Bindungsdomäne" umfasst eine Region eines Polypeptids, die für die selektive Bindung an ein Molekül von Interesse verantwortlich ist (z.B. Antigen, Ligand, Rezeptor, Substrat oder Inhibitor). Beispielhafte Bindungsdomänen umfassen eine variable Antikörperdomäne, Rezeptorbindungsdomäne, Ligandenbindungsdomäne und eine enzymatische Domäne.
Der Begriff „Antikörper" steht für ein Polypeptid, das eine oder mehrere Domänen enthält, die in der Lage sind; "sich an ein Epitop oder Antigen von Interesse zu binden, wobei eine solche Domäne/solche Domänen von der variablen Region des Antikörpers abstammen oder zu ihr homolog sind. Beispiele für Antikörper umfassen Volllängenantikörper, Antikörperfragmente, Einzelkettenmoleküle, bispezifische oder bifunktionelle Moleküle, Diakörper und chimäre Antikörper (z.B. humanisierte oder bifunktionelle Moleküle, Diakörper, und chimäre Antikörper (z.B. humanisiert und primatisierte^TM Antikörper). „Antikörperfragmente" umfassen Fv-, Fv'-, Fab-, Fab'- und F(ab')₂-Fragmente.
„Humanisierte" Formen von nicht-menschlichen (z.B. Nagetier- oder Primaten-) Antikörpern sind spezifische chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon, die eine Minimalsequenz enthalten, die von nicht-menschlichem Immunglobulin abstammt. Meistens sind humanisierte Antikörper menschliche Immunglobuline (Rezipientenantikörper), in welchen Reste einer komplementaritäts bestimmenden Region (CDR) des Rezipienten durch Reste eines CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Spenderantikörper), wie z.B. Maus, Ratte, Kaninchen oder Primat, mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In einigen Fällen werden Fv-Gerüstregion-(FR-)Reste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Weiters kann der humanisierte Antikörper Reste umfassen, die weder im Rezipientenantikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen zu finden sind. Diese Modifikationen werden vorgenommen, um die Antikörperleistung weiter zu verfeinern und zu optimieren. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer, typischerweise von zwei, variablen Domänen, in welchen alle oder im Wesentlichen alle CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins und alle oder im Wesentlichen alle FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulinsequenz entsprechen. Der humanisierte Antikörper umfasst optimalerweise auch zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jene eines menschlichen Immunglobulins. Der humanisierte Antikörper umfasst einen primatisierten^TM Antikörper, worin die Antigenbindungsregion des Antikörpers von einem Antikörper abstammt, der produziert wird, indem Makaken mit dem Antigen von Interesse immunisiert werden.
Ein „multispezifischer Antikörper" ist ein Molekül mit Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene. Während solche Moleküle normalerweise nur zwei Antigene binden (d.h. bispezifische Antikörper, BsAbs), sind Antikörper mit zusätzlichen Spezifitäten, wie z.B. trispezifische Antikörper, in diesem Ausdruck, wenn er hierin verwendet wird, enthalten. Beispiele für BsAbs umfassen jene mit einem Arm, der gegen ein Tumorzellantigen gerichtet ist, und deren anderer Arm gegen ein zytotoxisches Triggermolekül gerichtet ist, wie z.B. Anti-FcγRI/Anti-CD15, Anti-p185^HER2/FcγRIII(CD16), Anti-CD3/Anti-maligne B-Zelle (1D10), Anti-CD3/Antip185^HER2, Anti-CD3/Anti-p97, Anti-CD3/Antirenales Zellkarzinom, Anti-CD3/Anti-OVCAR-3, Anti-CD3/L-D1 (Anti-Colon-Karzinom), Anti-CD3/Anti-melanocytstimulierendes Hormonanalogon, Anti-EGF-Rezeptor/Anti-CD3, Anti-CD3/Anti-CAMA1, Anti-CD3/Anti-CD19, Anti-CD3/MoV18, antineurales Zelladhäsionsmolekül (NCAM)/Anti- CD3, Antifolatbindungsprotein (FBP)/Anti-CD3, Anti-pan-Karzinom-assoziiertes Antigen (AMOC-31)/Anti-CD3, BsAbs mit einem Arm, der sich spezifisch an ein Tumorantigen bindet, und einem Arm, der sich ein ein Toxin bindet, wie z.B. ein Anti-Saporin/Anti-Id-1, Anti-CD22/Anti-Saporin, Anti-CD7/Anti-Saporin, Anti-CD38/Anti-Saporin, Anti-CEA/Anti-Ricin-A-Kette, Anti-Interferon-α (IFN-α)/Anti-Hybridom-Idiotyp, Anti-CEA/Anti-Vincaalkaloid, BsAbs zur Überführung von enzymaktivierten Prodrugs, wie z.B. Anti-CD30/Anti-alkalische Phosphatase (welche die Überführung von Mitomycinphosphat-Prodrug in Mitomycinalkohol katalysiert); BsAbs, die als fibrinolytische Mittel verwendet werden können, wie z.B. Anti-Fibrin/Anti-Gewebs-Plasminogenaktivator (tPA), Anti-Fibrin/Plasminogenaktivator vom Anti-Urokinasetyp (uPA); BsAbs zur Ansteuerung von Immunkomplexen an Zelloberflächenrezeptoren, wie z.B. Anti-Lipoprotein geringer Dichte (LDL)/Anti-Fc-Rezeptor (z.B. FcγRI, FcγRII oder FcγRIII); BsAbs zur Verwendung in der Therapie von Infektionskrankheiten wie z.B. Anti-CD3/Anti-Herpes-Simplex-Virus (HSV), Anti-T-Zell-Rezeptor:CD3-Komplex/Anti-Influenza, Anti-FcγR/Anti-HIV; BsAbs zur In-vitro- oder In-vivo-Tumordetektion, wie z.B. Anti-CEA/Anti-EOTUBE, Anti-CEA/Anti-DPTA, Antip185^HER2/Anti-Hapten; BsAbs wie Impfstoffadjuvanzien (siehe Fanger et al., siehe oben); und BsAbs als diagnostische Mittel, wie z.B. Anti-Kaninchen-IgG/Anti-Ferritin, Anti-Meerrettichperoxidase (HRP)/Anti-Hormon, Anti-Somatostatin/Anti-Substanz-P, Anti-HRP/Anti-FITC, Anti-CEA/Anti-β-Galactosidase (siehe Nolan et al., siehe oben). Beispiele für trispezifische Antikörper umfassen Anti-CD3/Anti-CD4/Anti-CD37, Anti-CD3/Anti-CD5/Anti-CD37 und Anti-CD3/Anti-CD8/Anti-CD37.
Wie hierin beschrieben bezeichnet der Begriff „Immunadhäsin" antikörperähnliche Moleküle, welche die „Bindungsdomäne" eines heterologen Proteins (eines „Adhäsins", z.B. einen Rezeptor, Liganden oder Enzym) mit den Effektorfunktionen von konstanten Immunglobulindomänen kombinieren. Strukturell umfassen die Immunadhäsine eine Fusion der Adhäsinaminosäuresequenz mit der gewünschten Bindungsspezifität, die eine andere ist als die Antigenerkennung, und Bindungsstelle (Antigenkombinationsstelle) eines Antikörpers (d.h. sie ist „heterolog") und eine konstante Immunglobulindomänensequenz. Die konstante Immunglobulindomänense quenz im Immunadhäsin kann aus einem beliebigen Immunglobulin, wie z.B. IgG₁-, IgG₂-, IgG₃- oder IgG₄-Subtypen, IgA, IgE, IgD oder IgM, erhalten werden.
Der Begriff „Ligandenbindungsdomäne" bezeichnet wie hierin verwendet einen beliebigen nativen Zelloberflächenrezeptor oder eine beliebige Region oder ein Derivat davon, das zumindest eine qualitative Ligandenbindungsfähigkeit und vorzugsweise die biologische Aktivität eines entsprechenden nativen Rezeptors beibehält. In einer besonderen Ausführungsform stammt der Rezeptor aus einem Zelloberflächenpolypeptid mit einer extrazellulären Domäne, die zu einem Mitglied der Immunglobulinübergenfamilie homolog ist. Andere typische Rezeptoren sind nicht Mitglieder der Immunglobulinübergenfamilie, aber dennoch speziell durch diese Definition abgedeckt, sie sind Rezeptoren für Zytokine und insbesondere Rezeptoren mit Tyrosinkinaseaktivität (Rezeptortyrosinkinasen), Mitglieder der Hämopoietin- und Nervenwachstumsfaktorrezeptorüberfamilien und Zelladhäsionsmoleküle, z.B. (E-, L- und P-) Selektine.
Der Begriff „Rezeptorbindungsdomäne" wird dazu verwendet, einen beliebigen nativen Liganden für einen Rezeptor zu benennen, einschließlich Zelladhäsionsmoleküle, oder eine beliebige Region oder ein Derivat eines solchen nativen Liganden, der zumindest eine qualitative Rezeptorbindungsfähigkeit und vorzugsweise die biologische Aktivität eines entsprechenden nativen Liganden beibehält. Diese Definition umfasst insbesondere unter anderem Bindungssequenzen von Liganden für die zuvor genannten Rezeptoren.
Wie hierin verwendet bezeichnet der Ausdruck „multispezifisches Immunadhäsin" Immunadhäsine (wie hierin zuvor definiert) mit zumindest zwei Bindungsspezifitäten (d.h. sie kombinieren zwei oder mehrere Adhäsinbindungsdomänen). Multispezifische Immunadhäsine können als Heterodimere, Heterotrimere oder Heterotetramere assembliert werden, wie im Wesentlichen in WO 89/02922 (veröffentlicht am 6. April 1989), in EP 314.317 (veröffentlicht am 3. Mai 1989) und in US-Patent Nr. 5.116.964, das am 2. Mai 1992 ausgegeben wurde, offenbart ist. Bevorzugte multispezifische Immunadhäsine sind bispezifisch. Beispiele für bispezifische Immunadhäsine umfassen CD4-IgG/TNF-Rezeptor-IgG und CD4-IgG/L-Selektin-IgG. Das zuletzt genannte Molekül kombiniert die Lymphknotenbindungsfunktiön des Lymphozyten-Homing-Rezeptors (LHR, L-Selektin) und die HIV-Bindungsfunktion von CD4 und findet potenzielle Anwendung in der Prävention oder Behandlung von HIV-Infektion, verwandten Leiden oder als diagnostisches Mittel.
Eine „Antikörper-Immunadhäsin-Chimäre (Ab/Ia-Chimäre)" umfasst ein Molekül, das zumindest eine Bindungsdomäne eines Antikörpers (wie hierin definiert) mit zumindest einem Immunadhäsin (wie in dieser Anwendung definiert) kombiniert. Beispielhafte Ab/Ia-Chimären sind die bispezifischen CD4-IgG-Chimären, die von Berg et al., siehe oben, und Chamow et al., siehe oben, beschrieben wurden.
Die „Grenzfläche" umfasst jene „Kontakt"-Aminosäurereste (oder andere Nicht-Aminosäuregruppen, wie z.B. Kohlenhydratgruppen, NADH-, Biotin-, FAD- oder haem-Gruppe) im ersten Polypeptid, das mit einem oder mehreren „Kontakt"-Aminosäureresten (oder anderen Nicht-Aminosäuregruppen) in der Grenzfläche des zweiten Polypeptids wechselwirkt. Die Grenzfläche ist eine konstante Antikörperdomäne. Die bevorzugte Grenzfläche umfasst die C_H3-Domäne eines Immunglobulins, das vorzugsweise von einem IgG-Antikörper und am bevorzugtesten von einem menschlichen IgG₁-Antikörper abstammt.
Eine „Protuberanz" bezeichnet zumindest eine Aminosäureseitenkette, die sich von der Grenzfläche des ersten Polypeptids erstreckt und daher in einer kompensatorischen Kavität in der angrenzenden Grenzfläche (d.h. der Grenzfläche des zweiten Polypeptids) positioniert werden kann, um das Heteromultimer zu stabilisieren und deshalb z.B. die Heteromultimerbildung gegenüber der Homomultimerbildung zu bevorzugen. Die Protuberanz kann in der ursprünglichen Grenzfläche auftreten oder kann synthetisch eingeführt werden (z.B. durch Veränderung der Nucleinsäure, die für die Grenzfläche kodiert). Normalerweise wird die Nucleinsäure, die für die Grenzfläche des ersten Poyleptids kodiert, verändert, um für die Protuberanz zu kodieren. Um dies zu erreichen, wird die Nucleinsäure, die für zumindest einen „ursprünglichen" Aminosäurerest in der Grenzfläche des ersten Polypeptids kodiert, durch die Nucleinsäure ersetzt, die zumindest für einen „Import"-Aminosäurerest kodiert, der ein größeres Seitenkettenvolumen als der ursprüngliche Aminosäurerest besitzt. Es wird davon ausgegangen, dass es nicht mehr als einen ursprünglichen und entsprechenden Importrest gibt. Die obere Grenze für die Zahl der ursprünglichen Reste, die ersetzt werden, ist die Gesamtzahl von Resten in der Grenzfläche des ersten Polypeptids. Die Seitenkettenvolumina der verschiedenen Aminoreste sind in der folgenden Tabelle dargestellt. TABELLE 1 Eigenschaften von Aminosäureresten

a Molekulargewicht der Aminosäure minus Molekulargewicht von Wasser. Die Werte stammen aus dem Handbook of Chemistry and Physics, 43. Auflage, Cleveland, Chemical Rubber Publishing Co. (1961)
b Die Werte stammen von A.A. Zamyatnin, Prog. Biophys. Mol. Biol. 24, 107–123 (1972).

Die Werte stammen von C. Chothia, J. Mol. Biol. 105, 1–14 (1975). Die zugängliche Oberfläche ist in den 6–20 dieser Referenz definiert.
Die bevorzugten Importeste für die Bildung einer Protuberanz sind im Allgemeinen natürlich vorkommende Aminosäurereste und sind vorzugsweise aus Arginin (R), Phenylalanin (F), Tyrosin (Y) und Tryptophan (W) ausgewählt. Tryptophan und Tyrosin sind am bevorzugtesten. In der bevorzugten Ausführungsform hat der Originalrest für die Bildung der Protuberanz ein kleines Seitenkettenvolumen, wie z.B. Alanin, Asparagin, Asparaginsäure, Glycin, Serin, Threonin oder Valin.
Eine „Kavität" bezeichnet zumindest eine Aminosäureseitenkette, die von der Grenzfläche des zweiten Polypeptids vertieft ist und daher eine entsprechende Protuberanz auf der angrenzenden Grenzfläche des ersten Polypeptids beherbergt. Die Kavität kann in der ursprünglichen Grenzfläche existieren oder synthetisch eingeführt werden (z.B. durch die Veränderung der Nucleinsäure, die für die Grenzfläche kodiert). Normalerweise wird die Nucleinsäure, die für die Grenzfläche des zweiten Polypeptids kodiert, verändert, um für die Kavität zu kodieren. Um dies zu erreichen, wird die Nucleinsäure, die für zumindest einen „ursprünglichen" Aminosäurerest in der Grenzfläche des zweiten Polypeptids kodiert, durch DNA ersetzt, die für zumindest einen „Import"-Aminosäurerest kodiert, der ein kleineres Seitenkettenvolumen besitzt als der ursprüngliche Aminosäurerest. Es wird davon ausgegangen, dass es mehr als einen ursprünglichen und entsprechenden Importrest gibt. Die Obergrenze für die Zahl ursprünglicher Reste, die ersetzt werden, ist die Gesamtzahl der Reste in der Grenzfläche des zweiten Polypeptids. Die Seitenkettenvolumina der verschiedenen Aminoreste sind in Tabelle 1 oben angeführt. Die bevorzugten Importreste für die Bildung einer Kavität sind für gewöhnlich natürlich vorkommende Aminosäurereste und sind vorzugsweise aus Alanin (A), Serin (S), Threonin (T) und Valin (V) ausgewählt. Am bevorzugtesten sind Serin, Alanin oder Threonin. In der bevorzugten Ausführungsform hat der ursprüngliche Rest für die Bildung der Protuberanz ein großes Seitenkettenvolumen, wie z.B. Tyrosin, Arginin, Phenylalanin oder Tryptophan.
Ein „ursprünglicher" Aminosäurerest ist einer, der durch einen „Import"-Rest ersetzt wird, welcher eine kleineres oder größeres Seitenkettenvolumen besitzen kann als der ursprüngliche Rest. Der Import-Aminosäurerest kann ein natürlich vorkommender oder nicht natürlich vorkommender Aminosäurerest sein, ist aber vorzugsweise ersteres. „Natürlich vorkommende" Aminosäurereste sind jene Reste, für welche der genetische Code kodiert und die in Tabelle 1 oben angeführt sind. Mit „natürlich vorkommendem Aminosäurerest" ist ein Rest gemeint, für welchen der genetische Code nicht kodiert, aber der in der Lage ist, angrenzende Aminosäurerest(e) in der Polypeptidkette kovalent zu binden. Beispiele für natürlich vorkommende Aminosäurereste sind Norleucin, Ornithin, Norvalin, Homoserin und andere Aminosäurerestanaloga wie jene, die z.B. in Ellman et al., Meth. Enzym. 202, 301–336 (1991), beschrieben sind. Um solche nicht-natürlich vorkommende Aminosäurereste zu produzieren, können die Verfahren von Noren et al., Science 244, 182 (1989), und Ellman et al. siehe oben, verwendet werden. Kurz gesagt umfasst dies die chemische Aktivierung einer Suppressor-tRNA mit einem nicht-natürlich vorkommendem Aminosäurerest, gefolgt von In-vitro-Transkription und -Translation der RNA. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst das Ersetzen von zumindest einem ursprünglichen Aminosäurerest, aber es kann mehr als ein ursprünglicher Rest ersetzt werden. Normalerweise umfassen nur die Gesamtreste der Grenzfläche des ersten und zweiten Polypeptids ursprüngliche Aminosäurereste, die ersetzt werden. Die bevorzugten ursprünglichen Reste, die ersetzt werden sollen, werden „eingebettet". Mit „eingebettet" ist gemeint, dass der Rest für das Lösungsmittel im Wesentlichen nicht zugänglich ist. Der bevor zugte Import-Rest ist nicht Cystein, um eine mögliche Oxidation oder Fehlpaarung von Disulfidbindungen zu vermeiden.
Die Protuberanz ist in der Kavität „positionierbar", was bedeutet, dass die räumliche Positionierung der Protuberanz und Kavität an der Grenzfläche des ersten Polypeptids bzw. zweiten Polypeptids und die Größen der Protuberanz und Kavität so sind, dass die Protuberanz sich in der Kavität befinden kann, ohne die normale Assoziierung des ersten und zweiten Polypeptids an der Grenzfläche signifikant zu stören. Da Protuberanzen, wie z.B. Tyr, Phe und Trp, sich von der Achse der Grenzfläche typischerweise nicht lotrecht erstrecken und bevorzugte Konformationen haben, basiert die Anordnung einer Protuberanz mit einer entsprechenden Kavität auf der Modellierung des Protuberanz/Kavitätspaars basierend auf einer dreidimensionalen Struktur, so wie jener, die mittels Röntgen-Kristallographie oder magnetischer Kernresonanz (NMR) erhalten wurde. Dies kann unter Einsatz weitgehend akzeptierter Verfahren auf dem Gebiet der Erfindung erreicht werden.
Mit „ursprünglicher Nucleinsäure" ist die Nucleinsäure gemeint, die für ein Polypeptid von Interesse kodiert, die „geändert" werden kann (d.h. genetisch erzeugt oder mutiert), um für eine Protuberanzoder Kavität zu kodieren. Die ursprüngliche oder Ausgangs-Nucleinsäure kann eine natürlich vorkommende Nucleinsäure sein oder eine Nucleinsäure umfassen, die zuvor einer Änderung unterworden worden ist (z.B. ein humanisiertes Antikörperfragment). Durch "Änderung" der Nucleinsäure ist gemeint, dass die ursprüngliche Nucleinsäure durch Insertion, Deletion oder Ersetzen von zumindest einem Codon, das für einen Aminosäurerest von Interesse kodiert, mutiert wird. Normalerweise wird ein Codon, das für einen ursprünglichen Rest kodiert, durch ein Codon ersetzt, das für einen Importrest kodiert. Von Verfahren zur genetischen Veränderung einer DNA auf diese Art und Weise ist in Mutagenesis: A Practical Approach, M.J. McPherson, Hrsg. (IRL Press, Oxford, UK (1991)) berichtet worden, und diese umfassen z.B. ortsspezifische Mutagenese, Kassettenmutagenese und Poylmerasekettenreaktion-(PCR-)Mutagenese.
Die Protuberanz oder Kavität kann mit synthetischen Mitteln in die Grenzfläche des ersten oder zweiten Polypeptids „eingeführt" werden, z.B. durch Rekombinationsverfahren, In-vitro-Peptidsynthese, jene Verfahren zur Einführung nicht-natürlich vorkommender Aminosäurereste, wie zuvor beschrieben, durch enzymatische oder chemische Kupplung von Peptiden oder eine Kombination dieser Verfahren. Dementsprechend ist die Protuberanz oder Kavität, die „eingeführt" wird, „nicht-natürlich vorkommend" oder „nicht-nativ", was bedeutet, dass es in der Natur oder im ursprünglichen Polypeptid (z.B. einem humanisierten monoklonalen Antikörper) nicht existiert.
Vorzugsweise hat der Import-Aminosäurerest zur Bildung der Protuberanz eine relativ kleine Anzahl von „Rotameren" (z.B. etwa 3–6). Ein „Rotamer" ist eine energetisch günstige Konformation einer Aminosäureseitenkette. Die Anzahl der Rotamere der verschiedenen Aminosäurereste ist in Ponders und Richards, J. Mol. Biol. 193, 775–791 (1987), beschrieben.
„Isoliertes" Heteromultimer steht für Heteromultimer, das identifiziert und getrennt und/oder aus einer Komponente seiner natürlichen Zellkulturumgebung gewonnen worden ist. Kontaminierende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die in diagnostische und therapeutische Anwendungen des Heteromultimers eingreifen, und können Enzyme, Hormone und andere proteinartige oder nicht-proteinartige Gelöststoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Heteromultimer (1) auf mehr als 95 Gew.-% des Proteins, wie durch das Lowry-Verfahren bestimmt wurde, und noch bevorzugter auf mehr als 99 Gew.-% gereinigt, (2) auf einen ausreichenden Grad gereinigt, um zumindest 15 Reste der N-terminalen oder inneren Aminosäuresequenz durch Verwendung eines Zentrifugenröhrchensequenzierers zu erhalten, oder (3) mittels SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen unter Einsatz von Coomassie-Blau- oder vorzugsweise Silberfärbung auf Homogenität gereinigt.
Die Heteromultimere der vorliegenden Erfindung werden im Allgemeinen auf wesentliche Homogenität gereinigt. Die Ausdrücke „im Wesentlichen homogen", „im We sentlichen homogene Form" und „wesentliche Homogenität" werden verwendet, um anzugeben, dass das Produkt im Wesentlichen frei von Nebenprodukten ist, die aus unerwünschten Polypeptidkombinationen (z.B. Homomultimeren) stammen. Hinsichtlich Reinheit bedeutet wesentliche Homogenität, dass die Menge der Nebenprodukte nicht 10 % überschreitet und bevorzugt unter 5 % liegt, noch bevorzugter unter 1 %, am bevorzugtesten unter 0,5 %, worin die Prozentsätze Gewichtsprozentsätze sind.
Der Ausdruck „Kontrollsequenzen" bezeichnet DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operabel verbundenen kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus zweckdienlich sind. Die Kontrollsequenzen, die für Prokaryoten geeignet sind, enthalten z.B. einen Promotor, optional eine Operatorsequenz, eine Ribosomenbindungsstelle und möglicherweise andere, zur Zeit noch schlecht verstandene Sequenzen. Es ist bekannt, dass eukaryotische Zellen Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer verwenden.
Nucleinsäure ist „operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gesetzt wird. Zum Beispiel ist eine DNA für eine Präsequenz oder einen sekretorischen Leader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt, ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst, oder eine Ribosomenbindungsstelle ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn sie so positioniert wird, dass sie die Translation vereinfacht. Im Allgemeinen bedeutet „operabel gebunden", dass die gebundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und im Fall des sekretorischen Leaders, zusammenhängend und in Lesephase sind. Jedoch müssen Enhancer nicht zusammenhängend sein. Die Verbindung wird durch Ligation an herkömmlichen Restriktionsstellen erreicht. Wenn solche Stellen nicht existieren, werden die synthetischen Oligonucleotidadaptoren oder Linker gemäß der herkömmlichen Praxis verwendet.
II. Herstellung des Heteromultimers
1. Herstellung der Ausgangsmaterialien
Im ersten Schritt werden das erste und zweite Polypeptid (und beliebige zusätzliche Polypeptide, die das Heteromultimer bilden) ausgewählt. Normalerweise muss die Nucleinsäure, die für diese Polypeptide kodiert, isoliert werden, sodass sie verändert werden kann, um für die Protuberanz oder Kavität oder beides wie hierin beschrieben zu kodieren. Jedoch können die Mutationen unter Einsatz synthetischer Mittel eingeführt werden, z.B. durch die Verwendung eines Peptidsynthesegeräts. Auch im Fall, wo der Importrest ein nicht-natürlich vorkommender Rest ist, ist das Verfahren von Noren et al., siehe oben, zur Herstellung von Polypeptiden verfügbar, die solche Substitutionen aufweisen. Außerdem wird ein Teil des Heteromultimers in geeigneter Weise rekombinant in Zellkultur hergestellt, und ein anderer (andere) Teile) des Moleküls wird/werden mithilfe der zuvor beschriebenen Verfahren hergestellt.
Nachstehend sind Verfahren zum Isolieren von Antikörpern und zur Herstellung von Immunadhäsinen beschrieben. Jedoch versteht sich, dass das Heteromultimer andere Polypeptide unter Einsatz von fachbekannten Verfahren aufnehmen kann. Zum Beispiel kann eine Nucleinsäure, die für ein Polypeptid von Interesse (z.B. einen Liganden, Rezeptor oder Enzym) kodiert, aus einer cDNA-Bibliothek isoliert werden, die aus dem Gewebe hergestellt wurde, von dem angenommen wird, dass es die Polypeptid-mRNA besitzt, um es in einer detektierbaren Menge zu exprimieren. Bibliotheken werden mit Sonden gescreent (wie z.B. Antikörpern oder Oligonucleotiden von etwa 20–80 Basen), die geschaffen sind, um das Gen von Interesse oder das Protein, für welches es kodiert, zu identifizieren. Das Screening der cDNA- oder genomischen Bibliothek mit der gewählten Sonde kann unter Einsatz von Standardverfahren wie in den Kapiteln 10–12 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), durchgeführt werden.
(i) Antikörperherstellung
Es sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von Antikörpern beschrieben worden, die das traditionelle Hybridomverfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, rekombinante Verfahren zur Herstellung von Antikörpern (einschließlich chimäre Antikörper, z.B. humanisierte Antikörper), Antikörperproduktion in transgenen Tieren und die zuvor beschriebene Phagendisplaytechnologie zur Herstellung „vollständig menschlicher" Antikörper umfassen. Diese Verfahren sind nachstehend kurz beschrieben.
Polyklonale Antikörper gegen das Antigen von Interesse können im Allgemeinen in Tieren durch multiple subkutane (sc) oder intraperitoneale (ip) Injektionen des Antigens und eines Adjuvans gezüchtet werden. Es kann nützlich sein, das Antigen (oder ein Fragment, das die Target-Aminosäuresequenz enthalt) mit einem Protein, das in den zu immunisierenden Spezies immunogen ist, z.B. Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyreoglobulin oder Sojabohnentrypsininhibitor, unter Einsatz eines bifunktionellen oder derivatisierenden Mittels, z.B. Maleinimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation durch Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (durch Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl₂ oder R¹N=C=NR, wo R und R¹ verschiedene Alkylgruppen sind, zu konjugieren. Tiere werden gegen die immunogenen Konjugate oder Derivate durch Kombination von 1 mg von 1 μg des Konjugats (für Kaninchen oder Mäuse) mit 3 Volumina von komplettem Freudschen Adjuvans und intradermaler Injektion der Lösung an mehreren Stellen immunisiert. Ein Monat später werden die Tiere mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Menge des Konjugats in komplettem Freudschen Adjuvans durch subkutane Injektion an mehreren Stellen geboostet. 7 bis 14 Tage später wird den Tieren Blut abgenommen und das Serum auf Antikörpertiter untersucht. Die Tiere werden geboostet, bis der Titer nicht mehr ansteigt. Vorzugsweise wird das Tier mit dem Konjugat desselben Antigens geboostet, aber an ein anderes Protein und/oder durch einen anderen Vernetzer konjugiert. Konjugate können auch in rekombinanter Zellkultur als Proteinfusionen hergestellt werden. Es werden auch Aggregationsmittel, wie z.B. Alaun, verwendet, um die Immunreaktion zu verstärken.
Monoklonale Antikörper werden aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern unter Einsatz des Hybridomverfahrens erhalten, das zuerst von Kohler & Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschrieben wurde, oder können durch DNA-Rekombinationsverfahren (Cabilly et al., US-Patent Nr. 4.816.567) hergestellt werden. Im Hybridomverfahren wird eine Maus oder ein geeignetes Wirtstier, wie z.B. Hamster, wie hierin zuvor beschrieben immunisiert, um Lymphozyten hervorzurufen, welche Antikörper produzieren oder dazu in der Lage sind, die sich spezifisch an das Protein binden, das zur Immunisierung verwendet wurde. Alternativ dazu können Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Lymphozyten werden mit Myelomzellen unter Einsatz eines geeigneten Fusionsmittels fusioniert, wie z.B. Polyethylenglykol, um eine Hybridomzelle zu bilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 59–103 (1986)). Die so hergestellten Hybridomzellen werden gesät und in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet, das vorzugsweise eine oder mehrer Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der nicht fusionierten parentalen Myelomzellen hemmen. Wenn den parentalen Myelomzellen das Enzym Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, umfasst das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium), Substanzen, die das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen verhindern. Bevorzugte Myelomzellen sind jene, die wirksam fusionieren, eine stabile hochgradige Expression von Antikörpern durch die gewählten antikörperproduzierenden Zellen unterstützen und empfindlich auf ein Medium, wie z.B. HAT-Medium, sind. Unter diesen sind bevorzugte Myelomzelllinien murine Myelomlinien, wie z.B. jene, die von MOPC-21- und MPC-11-Maustumoren abstammen, die vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, USA, erhältlich sind, und SP-2-Zellen, die von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, zu beziehen sind. Menschliches Myelom und Maus-Human-Heteromyelomzelllinien sind ebenfalls für die Produktion von menschlichen monoklonalen Antikörpern beschrieben worden (Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984), und Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51–63, Marcel Dekker, Inc. New York (1987)). Siehe auch Boerner et al., J. Immunol. 147 (1), 86–95 (1991), und WO 91/17769, veröffentlicht am 28. November 1991, für Verfahren zur Produktion von menschlichen monoklonalen Antikörpern. Das Kulturmedi um, in welchem Hybridomzellen wachsen, wird auf die Produktion von monoklonalen Antikörpern getestet, die gegen das Antigen von Interesse gerichtet sind. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität von monoklonalen Antikörpern, die mittels Hybridomzellen produziert werden, durch Immunpräzipitation oder mithilfe eines In-vitro-Bindungstests, wie z.B. eines Radioimmuntests (RIA) oder einer enzymgekoppelten Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), bestimmt.
Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann z.B. mithilfe der Scatchard-Analyse von Munson & Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden. Nachdem Hybridomzellen identifiziert wurden, die Antiköper der gewünschten Spezifität, Affinität und/oder Aktivität produzieren, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und mithilfe von Standardverfahren gezüchtet werden. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 59–104 (1986). Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck umfassen z.B. Dulbecco's Modified Eagle Medium oder RPMI-1640-Medium. Zusätzlich dazu können die Hybridomzellen in vivo als Ascites-Tumoren in einem Tier gezüchtet werden. Die monoklonalen Antiköper, die von den Subklonen sekretiert werden, werden in geeigneter Weise vom Kulturmedium, dem Aszitesfluid oder Serum mithilfe herkömmlicher Immunglobulinreinigungsverfahren, wie z.B. Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, getrennt.
Alternativ dazu ist es nun möglich, transgene Tiere (z.B. Mäuse) zu produzieren, die in der Lage sind, nach Immunisierung eine volle Bandbreite menschlicher Antikörper bei Fehlen von endogener Immunglobulinproduktion zu produzieren. Zum Beispiel ist beschrieben worden, dass die homozygote Deletion des Antikörper-Schwerketten-Bindungsregion-(J_H-)Gens bei chimären und keimbahnmutierten Mäusen in der vollständigen Hemmung der endogenen Antikörperproduktion resultiert. Der Transfer der menschlichen Keimbahnimmunglobulingenanordnung in solche Keimbahnmutantenmäusen resultiert in der Produktion von menschlichen Antikörpern bei Antigenexposition. Siehe z.B. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255 (1993), und Jakobovits et al., Nature 362, 255–258 (1993).
In einer weiteren Ausführungsform können Antikörper oder Antikörperfragmente aus Antikörperphagenbibliotheken isoliert werden, die unter Einsatz der in McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990), beschriebenen Verfahren, unter Einsatz des Antigens von Interesse zur Auswahl eines geeigneten Antikörpers oder Antikörperfragmentes erzeugt wurden. Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991), und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991), beschreiben die Isolation von murinen bzw. menschlichen Antikörpern unter Verwendung von Phagenbibliotheken. Die nachfolgenden Publikationen beschreiben die Produktion von menschlichen Antikörpern hoher Affinität (nM-Bereich) durch Kettenshuffling (Mark et al., Bio/Technol. 10, 779–783 (1992)) sowie kombinatorische Infektion und In-vivo-Rekombination als Strategie zur Herstellung sehr großer Phagenbibliotheken (Waterhouse et al., Nuc. Acids Res. 21, 2265–2266 (1993)). Daher sind diese Verfahren praktikable Alternativen zu herkömmlichen monoklonalen Antikörper-Hybridomverfahren zur Isolation von „monoklonalen" Antikörpern (besonders menschlichen Antikörpern), die in der vorliegenden Erfindung enthalten sind.
DNA, die für Antikörper der Erfindung kodiert, wird unter Einsatz herkömmlicher Verfahren (z.B. durch die Verwendung von Oligonucleotidsonden, die in der Lage sind, sich spezifisch an Gene zu binden, die für die Schwer- und Leichtketten muriner Antikörper kodieren) einfach isoliert und sequenziert. Die Hybridomzellen der Erfindung dienen als bevorzugte Quelle dieser DNA. Wenn sie einmal isoliert ist, kann die DNA in Expressionsvektoren positioniert werden, die dann in die Wirtszellen transfiziert werden, wie z.B. Affen-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstockzellen (CHO) oder Myelomzellen, die andererseits kein Immunglobulinprotein produzieren, um die Synthese von monoklonalen Antikörpern in den rekombinanten Wirtszellen zu erhalten. Die DNA kann auch modifiziert werden, z.B. durch Substitution der kodierenden Sequenz für menschliche konstante Schwer- und Leichtkettendomänen anstelle der homologen murinen Sequenzen. Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 6851 (1984). Auf diese Art und Weise werden „chimäre" Antikörper hergestellt, welche die Bindungsspezifität eines hierin angeführten monoklonalen Anti-Antigenantikörpers haben.
Es sind Verfahren zur Humanisierung von nicht-nienschlichen Antikörpern auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Im Allgemeinen verfügt ein humanisierter Antikörper über einen oder mehrere Aminosäurereste, die aus einer nicht-menschlichen Quelle in diesen eingeführt wurden. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden oft als „Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise aus einer variablen „Import"-Domäne entnommen werden. Humanisierung kann im Wesentlichen nach dem Verfahren von Winter und seinen Mitarbeitern (Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988), Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988)) durch Substitution von Nagetier-CDRs oder -CDR-Sequenzen für die entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durchgeführt werden. Dementsprechend sind solche „humanisierten" Antikörper chimäre Antikörper (Cabily, siehe oben), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte variable menschliche Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies ersetzt worden ist. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, in welchen einige CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nagetierantikörpern ersetzt werden. Es ist wichtig, dass Antikörper mit Beibehaltung von hoher Affinität für das Antigen und anderen günstigen biologischen Eigenschaften humanisiert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, werden nach einem bevorzugten Verfahren humanisierte Antikörper mithilfe eines Verfahrens der Analyse der parentalen Sequenzen und verschiedenen konzeptuellen humanisierten Produkte unter Einsatz dreidimensionaler Modelle der parentalen oder humanisierten Sequenzen hergestellt. Fachleute sind mit dreidimensionalen Immunglobulinmodellen vertraut. Es sind Computerprogramme verfügbar, die mögliche dreidimensionale Konformationsstrukturen ausgewählter Kandidatenimmunglobulinsequenzen veranschaulichen und darstellen. Die Untersuchung dieser Darstellungen ermöglicht die Analyse der wahrscheinlichen Rolle der Reste in der Funktionsweise der Kandidatenimmunglobulinsequenz, d.h. die Analyse von Resten, welche die Fähigkeit des Kandidatenimmunglobulins beeinflussen, sein Antigen zu binden. Auf diese Art und Weise können FR-Reste ausgewählt und aus der Consensus- und Import-Sequenz kombiniert werden, sodass die gewünschte Antikörpereigenschaft, wie z.B. erhöhte Affinität für das (die) Target-Antigen(e), erreicht wird. Für weitere Details siehe WO 92/22653, veröffentlicht am 23. Dezember, 1992.
(ii) Immunadhäsinherstellung
Immunglobuline (Ig) und bestimmte Varianten davon sind bekannt und in rekombinanter Zellkultur hergestellt worden. Siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 4.745.055; EP 256.654 ; Faulkner et al., Nature 298, 286 (1982); EP 120.694 ; EP 125.023 ; Morrison, J. Immun. 123, 793 (1979); Köhler et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2197 (1980); Raso et al., Cancer Res. 41, 2073 (1981), Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2; 239 (1984); Morrison, Science 229, 1202 (1985); Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1984), EP 256.654 ; EP 266.663 und WO 88/03559. Es sind ebenfalls neukombinierte Immunglobulinketten bekannt. Siehe z.B. US-Patent Nr. 4.444.878; WO 88/03565 und EP 68.763 und die darin zitierten Verweise.
Es sind Chimären auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, die aus einer Adhäsinbindungsdomänensequenz hergestellt wurden, die mit einer geeigneten konstanten Immunglobulindomänensequenz (Immunadhäsine) verbunden sind. Immunadhäsine, von denen in der Literatur berichtet wird, umfassen Fusionen des T-Zell-Rezeptors (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2936–2940 (1987)); CD4 (Capon et al., Nature 337, 525–531 (1989); Traunecker et al., Nature 339, 68–70 (1989), Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9, 347–353 (1990); und Byrn et al., Nature 344, 667–670 (1990)); L-Selectin (Homing-Rezeptor) (Watson et al., J. Cell. Biol. 110, 2221–2229 (1990); und Watson et al., Nature 349, 164–167 (1991)); CD44 (Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990)); CD28 und B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173, 721–730 (1991)); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174, 561–569 (1991)); CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 (1991)); TNF-Rezeptor (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535–10539 (1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27, 2883–2886 (1991) ; und Peppel et al., J. Exp. Med. 174, 1483–1489 (1991)) und IgE-Rezeptor-α (Ridgway und Gorman, J. Cell Biol., Band 115, Abstract Nr. 1448 (1991)).
Das einfachste und unkomplizierteste Immunadhäsindesign kombiniert die Bindungsdomäne(n) des Adhäsins (z.B. die extrazelluläre Domäne [ECD] eines Rezeptors) mit den Gelenks- und Fc-Regionen einer Immunglobulinschwerkette (siehe 3). Wenn Immunadhäsine der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, kann Nucleinsäure, die für die Bindungsdomäne des Adhäsins kodiert, üblicherweise C-terminal an Nucleinsäure fusioniert werden, die für den N-Terminus einer konstanten Immunglobulindomänensequenz kodiert, jedoch sind auch N-terminale Fusionen möglich.
Typischerweise behält bei solchen Fusionen das chimäre Polypeptid, für das kodiert wird, zumindest funktionell aktive Gelenks-, C_H2- und C_H3-Domänen der konstanten Region einer Immunglobulinschwerkette. Fusionen werden an den C-Terminus des Fc-Abschnitts einer konstanten Domäne gemacht oder sofort N-terminal an C_H1 der Schwerkette oder der entsprechenden Region der Leichtkette. Die genaue Stelle, an welcher die Fusion gemacht wird, ist nicht entscheidend, es sind bestimmte Stellen bekannt und können ausgewählt werden, um die biologische Aktivität, Sekretion oder Bindungseigenschaften von Ia zu optimieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Adhäsinsequenz an den N-Terminus der Fc-Domäne von Immunglobulin-G₁ (IgG₁) fusioniert. Es ist möglich, die gesamte konstante Schwerkettenregion an die Adhäsinsequenz zu fusionieren. Jedoch wird bevorzugter eine Sequenz, die in der Gelenksregion gleich stromauf der Papain-Spaltstelle beginnt, die IgG Fc chemisch definiert (d.h. Rest 216, worin der erste Rest der konstanten Schwerkettenregion als 114 angenommen wird) oder analoge Stellen anderer Immunglobuline in der Fusion verwendet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Adhäsinaminosäuresequenz an (a) die Gelenksregion und C_H2 und C_H3 oder (b) die C_H1-, Gelenks-, C_H2- und C_H3-Domänen einer IgG₁-, IgG₂- oder IgG₃-Schwerkette fusioniert. Die genaue Stelle, an welcher die Fusion durchgeführt wird, ist nicht entscheidend, und die optimale Stelle kann mittels routinemäßiger Versuche hergestellt werden.
Für bispezifische Immunadhäsine werden die Immunadhäsine als Multimere und insbesondere als Heterodimere oder Heterotetramere zusammengestellt. Im Allgemeinen weisen diese assemblierten Immunglobuline bekannte Einheitsstrukturen auf. Eine grundlegende vierkettige strukturelle Einheit ist die Form, in welcher IgG, IgD und IgE existieren. Eine vierkettige Einheit wird in Immunglobulinen mit höherem Molekulargewicht wiederholt. IgM existiert im Allgemeinen als ein Pentamer aus vier Grundeinheiten, die durch Disulfidbindungen zusammengehalten werden. IgA-Globulin und gegebenenfalls IgG-Globulin kann auch in Multimerform in Serum vorliegen. Im Fall eines Multimers kann jede der vier Einheiten gleich oder anders sein.
Verschiedene beispielhaft assemblierte Immunadhäsine innerhalb des hierin angeführten Schutzumfangs sind nachstehend schematisch dargestellt:

(a) AC_L-AC_L;
(b) AC_H-[AC_H, AC_L- AC_H, AC_L-V_HC_H oder V_LC_L-AC_H];
(c) AC_L-AC_H-[AC_L- AC_H, AC_L-V_HC_H, V_LC_L-AC_H oder V_LC_L-V_HC_H];
(d) AC_L-V_HC_H-[AC_H oder AC_L-V_HC_H oder V_LC_L-AC_H];
(e) V_LC_L-AC_H-[AC_L-V_HC_H oder V_LC_L-AC_H]; und
(f) [A-Y]_n-[V_LC_L-V_HC_H]₂,

V_L: eine variable Immunglobulin-Leichtkettendomäne;
V_H: eine variable Immunglobulin-Schwerkettendomäne;
C_L: eine konstante Immunglobulin-Leichtkettendomäne;
C_H: eine konstante Immunglobulin-Schwerkettendomäne;
n: eine ganze Zahl größer als 1 ist und
Y: den Rest eines kovalenten Vernetzers benennt.

Im Interesse der Kürze zeigen die vorangegangenen Strukturen nur Schüsseleigenschaften, sie geben weder die Bindungs-(J-) oder andere Domänen der Immunglobuline an, noch sind Disulfidbindungen dargestellt. Jedoch sollen sie, wenn solche Domänen für Bindungsaktivität erforderlich sind, so hergestellt werden, dass sie an den ursprünglichen Stellen gegenwärtig sind, die sie in den Immunglobulinmolekülen besetzten.
Alternativ dazu können die Adhäsinsequenzen zwischen Immunglobulinschwerketten- und -leichtkettensequenzen insertiert werden, sodass ein Immunglobulin, das eine chimäre Schwerkette enthält, erhalten wird. In dieser Ausführungsform werden die Adhäsinsequenzen an das 3'-Ende einer Immunglobulinschwerkette in jedem Arm eines Immunglobulins fusioniert, entweder zwischen der Gelenks- und der C_H2-Domäne oder zwischen den C_H2- und C_H3-Domänen. Hoogenboom et al., Mol. Immunol. 28, 1027–1037 (1991), haben von ähnlichen Konstrukten berichtet.
Obwohl die Gegenwart einer Immunglobulinleichtkette in den Immunadhäsinen der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich ist, kann eine Immunglobulinleichtkette entweder kovalent an ein Adhäsin-Immunglobulinschwerketten-Fusionspolypeptid gebunden oder direkt an das Adhäsin fusioniert vorliegen. Im ersten Fall wird DNA, die für eine Immunglobulinleichtkette kodiert, typischerweise gemeinsam mit der DNA co-exprimiert, die für das Adhäsin-Immunglobulinschwerketten-Fusionsprotein kodiert. Nach Sekretion werden die hybride Schwerkette und Leichtkette kovalent gebunden, um eine immunglobulinähnliche Struktur bereitzustellen, die zwei disulfidgebundene Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paare umfasst. Verfahren, die zur Herstellung solcher Strukturen geeignet sind, sind z.B. in US-Patent Nr. 4.816.567, ausgegeben am 28. März 1989, offenbart.
In einer bevorzugten Ausführungsform stammen die Immunglobulinsequenzen, die in der Herstellung von Immunadhäsinen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, aus einer konstanten IgG-Immunglobulinschwerkettendomäne. Für menschliche Immunadhäsine ist die Verwendung von menschlichen IgG₁- und IgG₃-Immunglobulinsequnezen bevorzugt. Ein großer Vorteil der Verwendung von IgG₁ ist, dass IgG₁-Immunadhäsine effizient auf immobilisiertem Protein A gereinigt werden können. Hingegen erfordert die Reinigung von IgG₃ Protein G, ein signifikant weniger versatiles Medium. Jedoch sollten andere strukturelle und funktionelle Eigenschaften von Immunglobulinen berücksichtigt werden, wenn der Ig-Fusionspartner für eine bestimmte Form der Immunadhäsinherstellung ausgewählt wird. Zum Beispiel ist das IgG₃-Gelenk länger und flexibler, daher kann es größere „Adhäsin"-Domänen beherbergen, die, wenn sie an IgG₁ fusioniert sind, sich nicht korrekt falten oder funktionie ren. Eine andere Überlegung kann die Valenz sein; IgG-Immunadhäsine sind bivalente Homodimere, während Ig-Subtypen wie IgA und IgM Dimer- oder Pentamerstrukturen der grundlegenden Ig-Homodimereinheit entstehen lassen. Für Immunadhäsine, die zur In-vivo-Anwendung hergestellt werden, sind auch die pharmakokinetischen Eigenschaften und Effektorfunktionen wichtig, die durch die Fc-Region spezifiziert sind. Obwohl IgG₁, IgG₂ und IgG₄ alle In-vivo-Halbwertszeiten von 21 Tagen haben, sind ihre relativen Wirksamkeiten beim Aktivieren des Komplementsystems unterschiedlich. IgG₄ aktiviert kein Komplement, und IgG₂ ist in der Komplementaktivierung signifikant schwächer als IgG₁. Außerdem bindet IgG₂ anders als IgG₁, nicht an Fc-Rezeptoren auf mononuklearen Zellen oder Neutrophilen. Während IgG₃ für die Komplementaktivierung optimal ist, ist seine In-vivo-Halbwertszeit etwa ein Drittel der von anderen IgG-Isotypen. Eine andere wichtige Überlegung für Immunadhäsine, die hergestellt werden, um als Humantherapeutika verwendet zu werden, ist die Zahl der allotypischen Varianten des besonderen Isotyps. Im Allgemeinen sind IgG-Isotypen mit weniger serologisch-definierten Allotypen bevorzugt. Zum Beispiel hat IgG₁ nur vier serologisch definierte allotypische Stellen, wovon sich 2 (G1m und 2) in der Fc-Region befinden und eine dieser Stellen, G1m1, nicht-immunogen ist. Hingegen gibt es zwölf serologisch definierte Allotypen in IgG3, wovon sich alle in der Fc-Region befinden, nur drei dieser Stellen (G3m5, 11 und 21) haben einen Allotyp, der nicht-immunogen ist. Daher ist die potenzielle Immunogenität eines γ3-Immunadhäsins größer als jene eines γ1-Immunadhäsins.
Immunadhäsine werden in geeignetster Weise durch Fusion der cDNA-Sequenz hergestellt, die für den Adhäsinabschnitt kodiert, im Raster an eine Ig-cDNA-Sequenz. Jedoch kann auch die Fusion an genomische Ig-Fragmente verwendet werden (siehe z.B. Gascoigne et al., siehe oben; Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990), und Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 (1991)). Letzterer Fusionstyp erfordert die Gegenwart von Ig-regulierenden Sequenzen zur Expression. cDNAs, die für konstante IgG-Schwerkettenregionen kodieren, können mittels Hybridisierung oder durch Polymerasekettenreaktionsverfahren (PCR) basierend auf veröffentlichten Sequenzen aus cDNA-Bibliotheken isoliert werden, die aus Milz oder peripheren Blutlymphozyten stammen. Die cDNAs, die für das „Adhäsin" und die Ig-Teile des Immunadhäsins kodieren, werden in Tandem in einen Plasmidvektor insertiert, welcher effiziente Expression in den gewählten Wirtszellen steuert.
2. Herstellung einer Protuberanz und/oder Kavität
Als erster Schritt zur Selektion ursprünglicher Reste zur Bildung von Protuberanz und/oder Kavität wird die dreidimensionale Struktur des Heteromultimers unter Einsatz von fachbekannten Verfahren erhalten, wie z.B. Röntgenkristallographie oder NMR. Basierend auf der dreidimensionalen Struktur können Fachleute die Grenzflächenreste identifizieren.
Die bevorzugte Grenzfläche ist die C_H3-Domäne einer konstanten Immunglobulindomäne. Die Grenzflächenreste der C_H3-Domänen von IgG, IgA, IgD, IgE und IgM sind in 5 identifiziert, einschließlich jener, die zum Ersetzen durch Importreste optimal geeignet sind. Die Grenzflächenreste verschiedener IgG-Subtypen sind in 6 veranschaulicht. „Eingebettete" Reste sind ebenfalls identifiziert. Die Grundlage zur Herstellung der C_H3-Grenzfläche ist, dass Röntgenkristallographie gezeigt hat, dass die intermolekulare Assoziation zwischen menschlichen IgG₁-Schwerketten in der Fc-Region eine extensive Protein/Protein-Wechselwirkung zwischen C_H3-Domänen umfasst, während die glykosylierten C_H2-Domänen über ihr Kohlenhydrat wechselwirken (Deisenhofer, Biochem. 20, 2361 (1981)). Zusätzlich dazu gibt es zwei Inter-Schwerkettendisulfidbindungen, die während der Antikörperexpression wirksam in Säugetierzellen gebildet werden, wenn die Schwerkette nicht trunkiert wird, um C_H2- und C_H3-Domänen zu entfernen (King et al., Biochem. J. 281, 317 (1992)). Daher scheint eine Schwerkettenanordnung eher die Bildung einer Disulfidbindung zu fördern als vice versa. Zusammen führen diese strukturellen und funktionellen Daten zu der Hypothese, dass die Antikörperschwerkettenassoziation von den C_H3-Domänen gesteuert wird. Es wurde weiters spekuliert, dass die Grenzfläche zwischen C_H3-Domänen erzeugt werden kann, um die Bildung von Heteromultimeren verschiedener Schwerketten zu fördern und die Anordnung entsprechender Homomultimere zu verhindern. Die hierin beschriebenen Versuche zeigten, dass es mög lich war, die Bildung von Heteromultimeren gegenüber Homomultimeren unter Verwendung dieses Ansatzes zu fördern. Daher ist es möglich, eine Polypeptidfusion zu erzeugen, umfassend ein Polypeptid von Interesse und die C_H3-Domäne eines Antikörpers, um ein erstes oder zweites Polypeptid zu erzeugen. Die bevorzugte C_H3-Domäne stammt von einem IgG-Antikörper, wie z.B. einem menschlichen IgG₁. Die Grenzflächenreste von menschlichem IgG₁ sind in 7 dargestellt.
Es werden diese Grenzflächenreste, die potenzielle Kandidaten zur Bildung der Protuberanz oder Kavität darstellen können, identifiziert. Es ist bevorzugt, „eingebettete" Reste auszuwählen, die ersetzt werden sollen. Zur Bestimmung, ob ein Rest eingebettet ist, kann das Oberflächenzugänglichkeitsprogamm von Lee et al., J. Mol. Biol. 55, 379–400 (1971), verwendet werden, um die Lösungsmittelzugänglichkeit (SA) von Resten in der Grenzfläche zu berechnen. Dann kann die SA für die Reste sowohl des ersten als auch des zweiten Polypeptids separat berechnet werden, nachdem das andere Polypeptid entfernt worden ist. Dann kann der Unterschied in der SA jedes Restes zwischen Monomer- und Dimerformen der Grenzfläche berechnet werden, durch SA (Dimer) – SA (Monomer). Dies stellt eine Liste von Resten bereit, welche bei Bildung des Dimers SA verlieren. Die SA jedes Rests im Dimer wird mit der theoretischen SA derselben Aminosäure im Tripeptid GIy-X-Gly verglichen, wo X = die Aminosäure von Interesse ist (Rose et al., Science 229, 834–838 (1985)). Reste, die (a) im Vergleich zum Monomer SA im Dimer verloren und (b) eine SA unter 26 % von jener in ihrem entsprechenden Tripeptid hatten, werden als Grenzflächenreste betrachtet. Es können zwei Kategorien angeführt werden: jene, die eine SA < 10 % im Vergleich zu ihrem entsprechenden Tripeptid aufweisen (d.h. „eingebettet" sind), und jene, die 25 % > SA > 10 % im Vergleich zu ihrem entsprechenden Tripeptid aufweisen (d.h. „teilweise eingebettet" sind). TABELLE 2

' Restnummerierung wie in IgG-Kristallstruktur (Deisenhofer, Biochemistry 20, 2361–2370 (1981)).

Die Wirkung des Ersetzens von Resten auf der Polypeptidkettenstruktur kann unter Verwendung eines graphischen Molekularmodellierungsprogramms, wie z.B. dem Insight^TM-Programm (Biosym Technologies), studiert werden. Unter Verwendung des Programms können diese eingebetteten Reste in der Grenzfläche des ersten Polypeptids, die ein kleines Seitenkettenvolumen haben, auf Reste geändert werden, die z.B. ein größeres Seitenkettenvolumen (d.h. eine Protuberanz) besitzen. Dann werden die Reste in der Grenzfläche des zweiten Polypeptids, die sich in der Nähe der Protuberanz befinden, untersucht, um einen geeigneten Rest zur Bildung der Kavität zu finden. Normalerweise hat dieser Rest ein großes Seitenkettenvolumen und wird durch einen Rest mit einem kleineren Seitenkettenvolumen ersetzt. In bestimmten Ausführungsformen zeigt die Untersuchung der dreidimensionalen Struktur der Grenzfläche eine geeignet positionierte und dimensionierte Protuberanz auf der Grenzfläche des ersten Polypeptids oder eine Kavität auf der Grenzfläche des zweiten Polypeptids. In diesen Fällen ist es nur notwendig, einen einzelnen Mutanten zu modellieren, d.h. mit einer synthetisch eingeführten Protuberanz oder Kavität.
Was die Auswahl potenzieller ursprünglicher Reste für die Substitution betrifft, wo das erste und das zweite Polypeptid jeweils eine C_H3-Domäne umfasst, umfasst die C_H3/C_H3-Grenzfläche von menschlichem IgG₁ sechzehn Reste auf jeder Domäne, die auf vier antiparallelen β-Strängen positioniert sind, die 1090 Å² jeder Oberfläche begräbt (Deisenhofer, siehe oben, und Miller, J. Mol. Biol. 216, 965 (1990)). Siehe 7 hierin. Mutationen sind bevorzugt auf Reste gerichtet, die auf den zwei zentralen anti-parallelen β-Strängen positioniert sind. Das Ziel ist es, das Risiko zu minimieren, dass die geschaffenen Protuberanzen eher durch Hineinragen in das umgebende Lösungsmittel akkommodiert werden können als durch Kompensationsaktivitäten in der Partner-C_H3-Domäne.
Wenn bevorzugte ursprüngliche Reste/Importreste mittels Molekularmodellierung identifiziert werden, werden Aminosäuresubstitutionen unter Einsatz fachbekannter Verfahren in das Polypeptid eingeführt. Normalerweise wird DNA, die für das Polypeptid kodiert, unter Einsatz von Verfahren, die in Mutagenesis: a Practical Approach, siehe oben, beschrieben sind, gentechnologisch hergestellt.
Oligonucleotidvermittelte Mutagenese ist ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Substitutionsvarianten der DNA, die für das erste oder zweite Polypeptid kodiert. Dieses Verfahren ist fachbekannt, wie in Adelman et al., DNA 2, 183 (1983), beschrieben. Kurz gesagt, die DNA des ersten oder zweiten Polypeptids wird durch Hybridisierung eines Oligonucleotids verändert, das für die gewünschte Mutation an eine DNA-Matrize kodiert, wo die Matrize die einzelsträngige Form eines Plasmids oder eines Bakteriophagen ist, das/der die unveränderte oder native DNA-Sequenz des Heteromultimers enthält. Nach Hybridisierung wird eine DNA-Polymerase verwendet, um einen vollständigen zweiten komplementären Strang der Matrize zu synthetisieren, die somit den Oligonucleotidprimer aufnimmt und für die gewählte Änderung in der heteromultimeren DNA kodiert.
Kassettenmutagenese kann wie von Wells et al., Gene 34, 315 (1985), beschrieben durchgeführt werden, indem eine Region der DNA von Interesse durch ein syntheti sches Mutantenfragment substituiert wird, das durch das Annealing komplementärer Oligonucleotide erzeugt wird. PCR-Mutagenese ist auch zur Herstellung von Varianten der ersten oder zweiten Polypeptid-DNA geeignet. Während die folgende Diskussion sich auf DNA bezieht, ist es verständlich, dass das Verfahren auch mit RNA Anwendung findet. Das PCR-Verfahren bezieht sich im Allgemeinen auf das folgende Verfahren (siehe Erlich, Science 252, 1643–1650 (1991), Kapitel von R. Higuchi, S. 61–70).
Diese Erfindung umfasst auch zusätzlich zu Protuberanz- oder Kaivitätmutationen Aminosäuresequenzvarianten des Heteromultimers, die durch Einführung geeigneter Nucleotidänderungen in die Heteromultimer-DNA oder durch Synthese des gewünschten Heteromultimerpolypeptids hergestellt werden können. Solche Varianten umfassen z.B. Deletionen von oder Insertionen oder Substitutionen von Resten innerhalb der Aminosäuresequenzen der ersten und zweiten Polypeptide, die das Heteromultimer bilden. Es wird eine beliebige Kombination von Deletion, Insertion und Substitution hergestellt, um das Endkonstrukt zu erreichen, vorausgesetzt, dass das Endkonstrukt die gewünschten Antigenbindungseigenschaften besitzt. Die Aminosäureänderungen können auch Posttranslationsprozesse des Heteromultimers verändern, wie z.B. die Veränderung der Zahl oder Position von Glykosylierungsstellen.
Ein nützliches Verfahren zur Identifikation bestimmter Reste oder Regionen der Heteromultimerpolypeptide, die bevorzugte Stellen für Mutagenese sind, wird „Alanin-Scanning-Mutagenese" genannt, wie von Cunningham und Wells, Science 244, 1081–1085 (1989), beschrieben. Hier werden ein Rest oder eine Gruppe von Targetresten identifiziert (z.B. geladene Reste, wie z.B. arg, asp, his, lys und glu) und durch eine neutrale oder negativ geladene Aminosäure (am bevorzugtesten Alanin oder Polyalanin) ersetzt, um die Wechselwirkung der Aminosäuren mit der umgebenden wässrigen Umwelt in oder außerhalb der Zelle zu beeinflussen. Jene Domänen, die eine funktionelle Empfindlichkeit gegenüber Substitutionen zeigen, werden dann verbessert, indem weitere oder andere Varianten an oder für die Stellen der Substitution eingeführt werden. Deshalb muss, obwohl die Stelle zur Einführung ei ner Aminosäuresequenzvariation vorbestimmt wird, die Natur der Mutation per se nicht vorbestimmt werden.
Normalerweise umfassen die Mutationen konservative Aminosäuresubstitutionen in nicht-funktionellen Regionen des Heteromultimers. Beispielhafte Mutation sind in der folgenden Tabelle angeführt. TABELLE 3
Kovalente Modifikationen des Heteromultimers können in das Molekül eingeführt werden indem Aminosäurereste des Heteromultimers oder von Fragmenten davon, auf welche abgezielt wird, mit einem organischen Derivatisierungsmittel umgesetzt werden, das in der Lage ist, mit gewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten zu reagieren. Eine andere Form von kovalenter Modifikation des Heteromultimerpolypeptids umfasst die Änderung des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. Unter Änderung versteht man die Deletion einer oder mehrere Kohlenhydratgruppierungen, die im ursprünglichen Heteromultimer zu finden sind, und/oder Addition einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen, die im ursprünglichen Heteromultimer nicht gegenwärtig sind. Addition von Glykosylierungsstellen zum Heteromultimerpolypeptid wird in geeigneter Weise durch Änderung der Aminosäuresequenz erreicht, sodass es eine oder mehrere N-gebundene Glykosylierungsstellen enthält. Die Änderung kann auch durch die Addition von oder Substitution durch einen oder mehrere Serin- oder Threoninreste zur ursprünglichen Heteromultimersequenz (für O-gebundene Glykosylierungsstellen) erfolgen. Zur Vereinfachung wird die Heteromultimeraminosäuresequenz bevorzugt durch Änderungen auf DNA-Ebene verändert, insbesondere durch Mutation der DNA, die für das Heteromultimerpolypeptid kodiert, an vorausgewählten Basen, sodass Codons erzeugt werden, die in die gewünschten Aminosäuren translatiert werden. Ein anderes Mittel zur Erhöhung der Zahl von Kohlenhydratgruppierungen auf dem Heteromultimerpolypeptid erfolgt durch chemische oder enzymatische Kupplung von Glykosiden an das Polypeptid. Diese Verfahren sind. in WO 87/05330, veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259–306 (1981), beschrieben. Eine Entfernung von Kohlenhydratgruppierungen, die auf dem Heteromultimer gegenwärtig sind, kann chemisch oder enzymatisch erreicht werden Eine andere Form von kovalenter Modifikation von Heteromultimer umfasst die Bindung des Heteromultimerpolypeptids an ein Polypeptid einer Vielzahl von nichtproteinartigen Polymeren, z.B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylenen, auf jene Art und Weise, die in den US-Patenten Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 dargelegt ist.
Da es oft schwierig ist, die Eigenschaften einer Heteromultimervariante vorauszusagen, versteht es sich, dass ein Screening der gewonnenen Variante notwendig ist, um die optimale Variante auszuwählen.
3. Expression des Heteromultimers
Nach der im vorangegangenen Abschnitt diskutierten Mutation der DNA wird die DNA, die für das Molekül kodiert, unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung weitgehend zugänglichen Rekombinationsverfahren exprimiert. Oft umfasst das Expressionssystem der Wahl einen Säugetierzellexpressionsvektor und -Wirt, sodass das Heteromultimer in geeigneter Weise glykosyliert wird (z.B. im Fall von Heteromultimeren, die Antikörperdomänen umfassen, die glykosyliert sind). Jedoch können die Moleküle auch in den nachstehend beschriebenen prokaryotischen Expressionssystemen produziert werden. Normalerweise wird die Wirtszelle mit DNA, die sowohl für das erste Polypeptid als auch das zweite Polypeptid und andere Polypeptid(e) kodiert, die erforderlich sind, um das Heteromultimer zu bilden, auf einem einzigen Vektor oder unabhängigen Vektoren transformiert. Es ist jedoch möglich, das erste Polypeptid und zweite Polypeptid in unabhängigen Expressionssystemen zu exprimieren und die exprimierten Polypeptide in vitro zu koppeln.
Die Nucleinsäure (z.B. cDNA oder genomische DNA), die für das Heteromultimer kodiert, wird zur weiteren Klonierung (Amplifikation der DNA) oder zur Expression in einen replizierbaren Vektor eingeführt. Es sind viele Vektoren verfügbar. Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, jedoch nicht ausschließlich, ein oder mehrere der folgenden: eine Signalsequenz, einen Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancerelement, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz.
Die Polypeptide des Heteromultimers können als Fusionspolypeptide mit einer Signalsequenz oder als anderes Polypeptid produziert werden, das eine spezifische Spaltstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids aufweist. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein oder Teil der DNA, die in den Vektor eingeführt wird. Die ausgewählte heterologe Signalsequenz ist vorzugsweise eine, die erkannt und durch die Wirtszelle verarbeitet (d.h. durch eine Signalpeptidase gespalten) wird. Bei prokaryotischen Wirtszellen kann die Signalsequenz durch eine prokaryotische Signalsequenz substituiert werden, die z.B. aus der Gruppe der alkalischen Phosphatase, Penicillinase, Ipp oder aus hitzestabilen Enterotoxin-II-Leadern ausgewählt ist. Zur Hefesekretion kann die native Signalsequenz z.B. durch Hefeinvertase-Leader, Alpha-Faktor-Leader (einschließlich Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktor-Leader, letzterer ist in US-Patent Nr. 5.010.182, ausgegeben am 23. April 1991, beschrieben) oder Säurephosphataseleader, den C.-albicans-Glucoamylase-Leader ( EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990) oder das in WO 90/13646 beschriebene Signal, veröffentlicht am 15. November 1990, substituiert werden. Bei der Säugetierzellexpression ist die native Signalsequenz (z.B. die Antikörper- oder Adhäsinpräsequenz, welche normalerweise die Sekretion dieser Moleküle aus menschlichen Zellen in vivo steuert) zufrieden stellend, obwohl andere Säugetiersignalsequenzen wie auch virale sekretorische Leader, zum Beispiel das Herpes-simplex-gD-Signal, geeignet sein können. Die DNA für eine solche Vorläuferregion wird im Leserahmen an DNA ligiert, die für Polypeptide kodiert, die das Heteromultimer bilden.
Sowohl Expressions- als auch Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, welche dem Vektor ermöglicht, sich in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Im Allgemeinen ist diese Sequenz in Klonierungsvektoren eine, die dem Vektor ermöglicht, sich unabhängig von der chromosomalen Wirts-DNA zu replizieren, und umfasst Replikationsstartpunkte oder sich autonom replizierende Sequenzen. Solche Sequenzen sind für eine Vielzahl von Bakterien, Hefen und Viren bekannt. Der Replikationsstartpunkt des Plasmids pBR322 ist für die meisten gramnegativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmidstartpunkt ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Startpunkte (SV40, Polyom, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Klonierungsvektoren in Säugetierzellen nützlich. Im Allgemeinen ist der Replikationsstartpunkt für Säugetierexpressionsvektoren nicht erforderlich (typi scherweise kann der SV40-Startpunkt nur verwendet werden, weil er den frühen Promotor enthält).
Expressions- und Klonierungsvektoren sollten ein Selektionsgen enthalten, das auch selektierbarer Marker genannt wird. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, welche (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophe Defizite ergänzen oder (c) kritische Nährstoffe, die aus den komplexen Medien nicht verfügbar sind, z.B. das Gen, das für eine D-Alaninracemase für Bacilli kodiert, bereitstellen. Ein Beispiel für ein Selektionsschema verwendet ein Arzneimittel, um das Wachstum einer Wirtszelle aufzuhalten. Diese Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transformiert werden, produzieren ein Protein, das Arzneimittelresistenz verleiht und so das Selektionsregime überlebt. Beispiele für eine solche dominante Selektion verwenden die Arzneimittel Neomycin (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet. 1, 327 (1982)), Mycophenolsäure (Mulligan et al., Science 209, 1422 (1980)) oder Hygromycin (Sugden et al., Mol. Cell Biol. 5, 410–413 (1985)). Die drei oben angegebenen Beispiele verwenden bakterielle Gene unter eukaryotischer Kontrolle, um Resistenz gegenüber dem geeigneten Arzneimittel G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin zu verleihen.
Ein anderes Beispiel für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind jene, welche die Identifikation von Zellen ermöglichen, die in der Lage sind, die Heteromultimer-Nucleinsäure aufzunehmen, wie z.B. DHFR oder Thymidinkinase. Die Säugetierzelltransformanten werden unter Selektionsdruck gestellt, sodass nur die Transformanten einheitlich angepasst werden, um durch die Aufnahme des Markers zu überleben. Selektionsdruck wird durch Kultivierung der Transformanten unter Bedingungen ausgeübt, unter welchen die Konzentration des Selektionsmittels im Medium in der Folge geändert wird, wodurch die Amplifikation sowohl des Selektionsgens als auch der DNA, die für das Heteromultimer kodiert, verändert wird. Erhöhte Mengen des Heteromultimers werden aus der amplifizierten DNA synthetisiert. Andere Beispiele für amplifizierbare Gene umfassen Metallothionein-I und -II, vorzugsweise Primatenmetallothioneingene, Adenosindesaminase, Ornithindecarboxylase etc.
Zum Beispiel werden Zellen, die mit dem DHFR-Selektionsgen transformiert werden, zuerst durch Züchtung aller Transformanten in einem Kulturmedium identifiziert, das Methotrexat (Mtx), einen kompetitiven Antagonisten von DHFR, enthält. Eine geeignete Wirtszelle bei Verwendung von Wild-Typ-DHFR ist die Chinahamster-Eierstock-(CHO-)Zelllinie, welcher DHFR-Aktivität fehlt und die wie von Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben hergestellt und vermehrt wurde. Die transformierten Zellen werden dann erhöhten Methotrexatspiegeln ausgesetzt. Dies führt zur Synthese von multiplen Kopien des DHFR-Gens und gleichzeitig zu multiplen Kopien anderer DNA, die Expressionsvektoren umfassen, wie z.B. die DNA, die für die Komponenten des Heteromultimers kodiert. Dieses Amplifikationsverfahren kann mit einem beliebigen ansonsten geeigneten Wirt, z.B. ATCC Nr. CCL61 CHO-K1, ungeachtet der Gegenwart von endogenem DHFR verwendet werden, wenn z.B. ein mutiertes DHFR-Gen, das gegenüber Mtx höchst resistent ist, verwendet wird ( EP 117.060 ).
Alternativ dazu können Wirtszellen (insbesondere Wirte vom Wildtyp, die endogenes DHFR enthalten) mit DNA-Sequenzen transformiert oder co-transformiert werden, die für Heteromultimer, Wild-Typ-DHFR-Protein und einen anderen selektierbaren Marker, wie z.B. Aminoglycosid-3'-Phosphotransferase (APH), kodieren, mittels Zellwachstum in Medium ausgewählt werden, das ein Selektionsmittel für den selektierbaren Marker, wie z.B. ein Aminoglycosidantibiotikum, z.B. Kanamycin, Neomycin oder G418, enthält. Siehe US-Patent Nr. 4.965.199.
Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen, das im Hefeplasmid YRp7 vorhanden ist (Stinchomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979), oder Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)). Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen MutantenStamm von Hefe bereit, welchem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachen, z.B. ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 (1977)). Die Gegenwart der trp1-Läsion im Hefewirtszellgenom stellt dann eine wirksame Umgebung zur Detektion von Transformation durch das Wachstum bei Fehlen von Tryptophan bereit. Auf ähnliche Weise werden Hefestämme, de nen Leu2 fehlt (ATCC 20.622 oder 38.626), durch bekannte Plasmide ergänzt, die das Leu2-Gen tragen.
Zusätzlich dazu können Vektoren zur Transformation von Kluyveromyces-Hefen verwendet werden, die vom zirkulären 1,6-μm-Plasmid pKD1 abstammen. Bianchi et al., Curr. Genet. 12, 185 (1987). Kürzlich wurde von einem Expressionssystem zur großtechnischen Produktion von rekombinantem Kalbchymosin für K. lactis berichtet. Van den Berg, Bio/Technology 8, 135 (1990). Stabile Multi-Kopien-Expressionsvektoren zur Sekretion von reifem rekombinantem menschlichem Serumalbumin durch industrielle Stämme von Kluyveromyces sind ebenfalls offenbart worden. Fleer et al., Bio/Technology 9, 968–975 (1991).
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der vom Wirtsorganismus erkannt wird und operabel an die heteromultimere Nucleinsäure gebunden ist. Es ist eine große Zahl von Promotoren bekannt, die von einer Vielzahl potenzieller Wirtszellen erkannt wird. Diese Promotoren sind operabel an die für das Heteromultimer kodierende DNA gebunden, indem der Promotor von der Quellen-DNA durch Restriktionsenzymverdau entfernt wird und die isolierte Promotorensequenz in den Vektor eingeführt wird.
Promotoren, die für die Verwendung mit prokaryotischen Wirten nützlich sind, umfassen die β-Lactamase- und Lactosepromotorensysteme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978), und Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)), alkalische Phosphatase, ein Tryptophan-(trp-)Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980), und EP 36.776 ) und Hybridpromotoren, wie z.B. den tac-Promotor (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)). Jedoch sind andere bekannte bakterielle Promotoren geeignet. Deren Nucleotidsequenzen sind veröffentlicht worden, wodurch einem Fachmann ermöglicht wird, diese operabel an DNA, die für das Heteromultimer kodiert, unter Einsatz von Linkern oder Adaptoren zu ligieren, um beliebige erforderliche Restriktionsstellen bereitzustellen (Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980)). Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine- Dalgarno-(S.D.-)Sequenz, die operabel an DNA gebunden ist, die für das Heteromultimer kodiert.
Es sind Promotorensequenzen für Eukaryoten bekannt. Im Wesentlichen alle eukaryotischen Gene haben eine AT-reiche Region, die etwa 25 bis 30 Basen stromauf der Stelle liegt, wo Transkription initiiert wird. Eine andere Sequenz, die 70 bis 80 Basen stromauf des Starts der Transkription vieler Gene zu finden ist, ist eine CXCAAT-Region, wo X ein beliebiges Nucleotid sein kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryotischen Gene befindet sich eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für die Addition des Poly-A-Schwanzes an das 3'-Ende der kodierenden Sequenz sein kann. All diese Sequenzen werden in geeigneter Weise in eukaryotische Expressionsvektoren insertiert.
Beispiele für geeignete Promotorensequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968), und Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren sind, die den zusätzlichen Vorteil von Transkription aufweisen, die durch Wachstumsbedingungen kontrolliert wird, sind die Promotorenregionen für Alkohol-Dehydrogenase-2, Isocytochrom-C, saure Phosphatase, Abbauenzyme, die mit dem Stickstoffmetabolismus verbunden sind, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für die Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung in Hefeexpression sind weiters in Hitzeman et al., EP 73.657A , beschrieben. Hefeenhancer werden ebenfalls vorteilhaft mit Hefepromotoren verwendet.
Heteromultimertranskription von Vektoren in Säugetierwirtszellen wird z.B. durch Promotoren, die von den Genomen der Viren, wie z.B. Polyomvirus, Geflügelpockenvirus (UK 2.211.504, veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z.B. Adenovirus 2), Rinderpapillomvirus, Vogelsarkomvirus, Cytomegalievirus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und am bevorzugtesten Simian-Virus 40 (SV40), erhalten wurden, von heterologen Säugetierpromotoren, z.B. dem Actinpromotor oder einem Immunglobulinpromotor oder von Hitze-Schock-Promotoren, gesteuert.
Die frühen und späten Promotoren des SV40-Vrius werden in geeigneter Weise als ein SV40-Restriktionsfragment erhalten, das auch den viralen SV40-Replikationsstartpunkt enthält. Fiers et al., Nature 273, 113 (1978); Mulligan und Berg, Science 209, 1422–1427 (1980) ; Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7398–7402 (1981). Der unmittelbare frühe Promotor des menschlichen Cytomegalievirus wird in geeigneter Weise als HindIII-E-Restriktionsfragment erhalten. Greenaway et al., Gene 18, 355–360 (1982). Ein System zur Expression von DNA in Säugetierwirten unter Einsatz des Rinderpapillomvirus als Vektor ist in US-Patent Nr. 4.419.446 beschrieben. Eine Modifikation dieses Systems ist in US Patent Nr. 4.601.978 beschreiben. Siehe auch Gray et al., Nature 295, 503–508 (1982), über die Expression von cDNA, die fürr das Immuninterferon in Affenzellen kodiert; Reyes et al., Nature 297, 598–601 (1982), über die Expression von menschlicher β-Interferon-cDNA in Mäusezellen unter der Kontrolle eines Thymidinkinasepromotors des Herpes-Simplex-Virus; Canaani und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5166–5170 (1982), über die Expression des menschlichen Interferon-β1-Gens in gezüchteten Maus- und Kaninchenzellen; und Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777–6781 (1982), über die Expression von bakteriellen CAT-Sequenzen in CV-1-Affennierenzellen, Huhnembryo-Fibroblasten, Chinahamster-Eierstockzellen, HeLa-Zellen und Maus-NIH-3T3-Zellen unter Einsatz der langen terminalen Wiederholung des Rous-Sarkom-Virus als Promotor.
Transkription von DNA, die für das Heteromultimer kodiert, durch höhere Eukaryoten wird oft durch die Insertion einer Enhancer-Sequenz in den Vektor erhöht. Enhancer sind relativ orientierungs- und positionsunabhängig, da sie 5' (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 993 (1981)) und 3' (Lusky et al., Mol. Cell Biol. 3, 1108 (1983)) zur Transkriptionseinheit, innerhalb eines Introns (Banerji et al., Cell 33, 729 (1983)) wie auch innerhalb der kodierenden Sequenz selbst festgestellt worden sind (Osborne et al., Mol. Cell Biol. 4, 1293 (1984)). Viele Enhancer-Sequenzen sind nun aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird ein Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus verwendet. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikatonsstartpunkts (bp 100–270), den frühen Cytomegalievirus-Promotor-Enhancer, den Polyom-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsstartpunkts und Adenovirus-Enhancer. Siehe auch Yaniv, Nature 297, 17–18 (1982), über die Steigerung von Elementen zur Aktivierung von eukaryotischen Promotoren. Der Enhancer kann in den Vektor an einer Position 5' oder 3' zur für das Heteromultimer kodierenden Sequenz gespleißt werden, befindet sich aber vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor.
Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, menschliche oder kernhaltige Zellen aus anderen mehrzelligen Organismen) verwendet werden, können auch Sequenzen enthalten, die für die Termination von Transkription und zur Stabilisierung der mRNA erforderlich sind. Solche Sequenzen sind üblicherweise von nicht-translatierten 5'- und gelegentlich 3'-Regionen von eukaryotischen oder viralen DNAs oder cDNAs erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente in den nicht-translatierten Abschnitt der mRNA transkribiert sind, die für das Heteromultimer kodiert.
In der Konstruktion von geeigneten Vektoren, die eine oder mehrere der oben angeführten Komponenten enthalten, werden Standardligationsverfahren verwendet. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, geschnitten und in die zur Erzeugung der erforderlichen Plasmide gewünschte Form religiert.
Zur Analyse zum Nachweisen korrekter Sequenzen in den hergestellten Plasmiden werden Ligationsgemische verwendet, um E.coli-K12-Stamm 294 (ATCC 31.446) zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten werden, wenn angemessen, über Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz ausgewählt. Es werden Plasmide der Transformanten hergestellt, mittels Restriktonsendonucleaseverdau analysiert und/oder mithilfe des Verfahrens von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder durch das Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
Expressionsvektoren, die eine vorübergehende Expression in Säugetierzellen von DNA ermöglichen, die für das Heteromultimer kodiert, sind in der Umsetzung dieser Erfindung besonders nützlich. Im Allgemeinen umfasst vorübergehende Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der in der Lage ist, sich wirkungsvoll in einer Wirtszelle zu replizieren, sodass die Wirtszelle viele Kopien des Expressionsvektors akkumuliert und wiederum ein hohes Ausmaß eines gewünschten Polypeptids synthetisiert, für welches der Expressionsvektor kodiert. Sambrook et al., siehe oben, 16.17–16.22. Vorübergehende Expressionssysteme, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfassen, ermöglichen die geeignete positive Identifizierung von Polypeptiden, für welche klonierte DNAs kodieren, wie auch das rasche Screening von Heteromultimeren, die gewünschte Bindungsspezifitäten/-aftinitäten aufweisen.
Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die für eine Adaptation an die Synthese des Heteromultimers in rekombinanter Wirbeltierzellkultur zweckdienlich sind, sind in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantei et al, Nature 281, 40–46 (1979); Levinson et al., EP 117.060 und EP 117.058 , beschrieben. Ein besonders nützliches Plasmid für die Säugetierzellkulturexpression des Heteromultimers ist pRK5 ( EP 307.247 ) oder pSV16B (PCT-Veröffentlichung Nummer WO 91/08291, veröffentlicht am 13. Juni 1991).
Die Auswahl der Wirtszelllinie für die Expression des Heteromultimers hängt hauptsächlich vom Expressionsvektor ab. Eine andere Überlegung ist die Menge des erforderlichen Proteins. Milligramm-Mengen können oft mithilfe vorübergehender Transfektionen produziert werden. Zum Beispiel kann die mit dem Adenovirus EIA transformierte menschliche embryonale 293-Nierenzelllinie vorübergehend mit pRK5-basierten Vektoren durch die Modifikation des Kalziumphosphatverfahrens transfiziert werden, um eine wirkungsvolle Heteromultimerexpression zu ermöglichen. CDM8-basierte Vektoren können verwendet werden, um COS-Zellen durch das DEAE-Dextran-Verfahren zu transfizieren (Aruffo et al. Cell 61, 1303–1313 (1990), und Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. (US) 9, 347–353 (1990)). Wenn größere Proteinmengen erwünscht sind, kann das Immunadhäsin nach stabiler Transfektion einer Wirtszelllinie exprimiert werden. Zum Beispiel kann ein auf pRK5 basierender Vektor in Gegenwart eines weiteren Plasmids, das für Dihydrofolatreductase (DHFR) kodiert und Resistenz gegenüber G418 verleiht, in Chinahamster-Eierstockzellen (CHO-Zellen) eingeführt werden. Klone, die gegen G418 resistent sind, können in Kultur selektiert werden. Diese Klone werden in Gegenwart zunehmender Spiegel des DHFR-Inhibitors Methotrexat wachsen gelassen, und es werden Klone ausgewählt, in welchen die Zahl der Genkopien, die für das DHFR kodieren, und Heteromultimersequenzen co-amplifiziert wird. Wenn das Immunadhäsin eine hydrophobe Leadersequenz an seinem N-Terminus enthält, wird es wahrscheinlich von den transfizierten Zellen verarbeitet und sekretiert. Die Expression von Immunadhäsinen mit komplexeren Strukturen kann einzigartig geeignete Wirtszellen erfordern. Zum Beispiel können Komponenten wie z.B. Leichtkette oder J-Kette durch bestimmte Myelom- oder Hybridom-Wirtszellen bereitgestellt werden (Gascoigne et al., siehe oben, und Martin et al., J. Virol. 67, 3561–3568 (1993)).
Andere geeignete Wirtszellen zum Klonieren und Exprimieren der hierin erwähnten Vektoren sind Prokaryoten-, Hefe- oder andere höhere Eukaryotenzellen, die zuvor beschrieben wurden. Geeignete Prokaryoten für diesen Zweck umfassen Eubacteria, wie z.B. gramnegative oder grampositive Organismen, z.B. Enterobacteriaceae, wie z.B. Escherichia, z.B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z.B. Salmonella typhimurium, Serratia, z.B. Serratia marcescans, und Shigella sowie Bacilli, wie z.B. B. Subtilis und B. licheniformis (z.B. B. licheniformis 41P, in DD 266.710 offenbart, veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas, wie z.B. P. aeruginosa, und Streptomyces. Ein bevorzugter E.coli-Klonierungswirt ist E. coli 294 (ATCC 31.446), obwohl andere Stämme, wie z.B. E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) und E. coli W3110 (ATCC 27 325), geeignet sind. Diese Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung. Stamm W3110 ist ein besonders bevorzugter Wirt oder Elternwirt, da er ein üblicher Wirtsstamm für rekombinante DNA-Produktfermentationen ist. Die Wirtszelle sollte vorzugweise minimale Mengen proteolytischer Enzyme sekretieren. Zum Beispiel kann Stamm W3110 modifiziert werden, um eine Genmutation in den Genen auszulösen, die für Proteine kodieren; Beispiele für einen solchen Wirt umfassen E.-coli-W3110-Stamm 27C7. Der komplette Genotyp von 27C7 ist tonAΔ ptr3 phoAΔE15 Δ(argF-lac) 169 ompTΔ degP41kan^r. Stamm 27C7 wurde am 30. Oktober 1991 bei der American Type Culture Collection als ATCC Nr. 55.244 hinterlegt. Alternativ dazu kann der Stamm von E. coli verwendet werden, der eine mutierte periplasmische Protease hat, die in US-Patent Nr. 4.946.783, ausgegeben am 7. August 1990, offenbart ist. Alternativ dazu sind Klonierungsverfahren, z.B. PCR oder andere Nucleinsäurepolymerasereaktionen, geeignet.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben wie z.B. fädige Pilze oder Hefe geeignete Klonierungs- oder Expressionswirte für Vektoren, die für Heteromultimer kodieren. Saccharomyces cerevisiae oder gewöhnliche Bäckerhefe ist der am häufigsten verwendete niedrige eukaryotische Wirtsmikroorganismus. Jedoch sind für gewöhnlich eine Reihe anderer Genera, Spezies und Stämme verfügbar und hierin nützlich, wie z.B. Schizosaccharomyces pombe (Beach und Nurse, Nature 290, 140 (1981), EP 139.383 , veröffentlicht am 2. Mai 1985); Kluyveromyces-Wirte (US-Patent Nr. 4.943.529, Fleer et al., siehe oben), wie z.B. K. lactis [MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737 (1983)]; K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., siehe oben), K. thermotolerans und K. marxianus; Yarrowia [ EP 402.226 ]; Pichia pastoris ( EP 183.070 ; Sreekishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265–278 (1988); Candida; Trichoderma reesia [ EP 244.234 ]; Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259–5236 (1979)); Schwanniomyces, wie z.B. Schwanniomyces occidentalis ( EP 394.538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990); und fädige Pilze, wie z.B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, veröffentlicht am 10. Jänner 1991), und Aspergillus-Wirte, wie z.B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284–289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205–221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470–1474 (1984)) und A. niger (Kelly und Hynes, EMBO J. 4, 47,5–479 (1985)).
Geeignete Wirtszellen für die Expression von glykosyliertem Heteromultimer stammen aus mehrzelligen Organismen. Solche Wirtszellen sind zur komplexen Verarbeitung und zu Glykosylierungsaktivitäten in der Lage. Im Prinzip funktioniert jede beliebige höhere eukaryotische Zellkultur, ob aus einer Vertebraten- oder einer Invertebratenkultur. Beispiele für Invertebratenzellen umfassen Pflanzen- und Insektenzellen. Es sind zahlreiche Baculovirus-Stämme und Varianten und entsprechende permissive Insektenwirtszellen von Wirten, wie z.B. Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti (Stechmücke), Aedes albopictus (Stechmücke), Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) und Bombyx mori, identifiziert worden. Siehe z.B. Luckow et al., Bio/Technology 6, 47–55 (1988); Miller et al., in Genetic Engineering, Setlow et al., Hrsg., Band 8, Plenum Publishing, 277–279 (1986); und Maeda et al., Nature 315, 592–594 (1985). Eine Vielzahl von viralen Stämmen zur Transfektion sind öffentlich zugänglich, z.B. die L-1-Variante von Autographa californica NPV und der Bm-5-Stamm von Bombyx-mori-NPV, und solche Viren können hierin als Virus gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, insbesondere zur Transfektion von Spodoptera-frugiperda-Zellen.
Pflanzenzellkulturen von Baumwolle, Kukuruz (Mais), Erdapfel (Kartoffel), Sojabohne, Petunie, Paradeiser (Tomate) und Tabak können als Wirte verwendet werden. Typischerweise werden Pflanzenzellen mittels Inkubation mit bestimmten Stämmen des Bakteriums Agrobacterium tumefaciens transfiziert, das zuvor manipuliert worden ist, um die Heteromultimer-DNA zu enthalten. Während der Inkubation der Pflanzenzellkultur mit A. tumefaciens wird die DNA, die für das Heteromultimer kodiert, auf die Pflanzenwirtszelle übertragen, sodass sie transfiziert ist, und wird unter geeigneten Bedingungen die Heteromultimer-DNA exprimieren. Zusätzlich dazu sind regulierende Sequenzen und Signalsequenzen verfügbar, die mit Pflanzenzellen kompatibel sind, wie z.B. der Nopalinsynthasepromotor und Polyadenylierungssignalsequenzen. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1, 561 (1982). Zusätzlich dazu sind DNA-Segmente, die aus der Stromauf Region des T-DNA-780-Gens isoliert werden in der Lage, Transkriptionsausmaße von pflanzenexprimierbaren Genen in rekombinante DNA enthaltendem Pflanzengewebe zu aktivieren oder zu erhöhen. EP 321.196 , veröffentlicht am 21. Juni 1989.
Die bevorzugten Wirte sind Wirbeltierzellen, und die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebskultur) ist in den letzten Jahren zu einem routinemäßigen Verfahren geworden. (Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Patterson, Hrsg. (1973)). Beispiele für nützliche Säugetierwirtszelllinien sind Affennieren-CV1-Linie, die mit SV40 transformiert ist (COS-7, ATCC CRL 1651), menschliche embryonale Nierenlinie (293- oder 293-Zellen, für das Wachstum in Suspensionskultur subkloniert, Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)); Babyhamsternierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maussertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); Affennierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche zervikale Karzinomzellen (HELA, ATCC CCL2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelrattenleberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442), menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche "Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Mausmammatumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44–68 (1982)); MRC-5-Zellen; FS4-Zellen und eine menschliche Hepatomlinie (Hep G2).
Wirtszellen werden mit den oben beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren der vorliegenden Erfindung transfiziert und in herkömmlichen Nährstoffmedien kultiviert, die für die Induktion von Promotoren, Auswahl von Transformanten oder Amplifizierung von Genen, die für die gewünschten Sequenzen kodieren, geeignet modifiziert wurden. Abhängig von der verwendeten Wirtszelle wird die Transfektion unter Einsatz von Standardverfahren durchgeführt, die für solche Zellen geeignet sind. Die Kalziumbehandlung, die Kalziumchlorid verwendet, wie in Abschnitt 1.82 von Sambrook et al., siehe oben, beschrieben, oder Elektroporation wird im Allgemeinen für Prokaryoten oder andere Zellen verwendet, die wesentliche Zellwandbar rieren enthalten. Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird wie von Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und WO 89/05859, veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschrieben zur Transformation von bestimmten Pflanzenzellen verwendet. Zusätzlich dazu können Pflanzen unter Einsatz von Ultraschallbehandlung wie in WO 91/00358, veröffentlicht am 10. Jänner 1991, beschrieben transfiziert werden.
Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände ist das Kalziumphosphatpräzipitationsverfahren von Graham und van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978), bevorzugt. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellwirtsystemtransformationen sind von Axel in US-Patent Nr. 4.399.216, ausgegeben am 16. August 1983, beschrieben worden. Transformationen in Hefe werden typischerweise gemäß dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3829 (1979), durchgeführt. Jedoch können auch andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen, wie z.B. durch Kern-Mikroinjektion, Elektroporation, bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zellen oder Polykationen, z.B. Polybren, Polyornithin etc., verwendet werden. Für verschiedene Verfahren zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology (1989), Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348–352 (1988).
Prokaryotische Zellen, die verwendet werden, um das Heteromultimerpolypeptid dieser Erfindung zu produzieren, werden in geeignetem Medium wie im Allgemeinen in Sambrook et al., siehe oben, beschrieben kultiviert.
Die Säugetierwirtszellen, die verwendet werden, um das Heteromultimer der Erfindung zu produzieren, können in einer Vielzahl von Medien kultiviert werden. Im Handel erhältliche Medien, wie z.B. Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle Medium ([DMEM], Sigma), sind geeignet, um die Wirtszellen zu kultivieren. Zusätzlich dazu kann jedes beliebige der in Ham und Wallace, Meth. Enz. 58, 44 (1979), Barnes und Sato, Anal. Biochem. 102, 255 (1980), US-Patent Nr. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762 oder 4.560.655; WO 90/03430; WO 87/00195; US-Patent Re. 30.985; o der US-Patent Nr. 5.122.469 beschriebenen Medien als Kulturmedium für die Wirtszellen verwendet werden. Jedes beliebige dieser Medien kann, wenn notwendig, mit Hormonen und/oder Wachstumsfaktoren (z.B. Insulin, Transferrin oder epidermalem Wachstumsfaktor), Salzen (wie z.B. Natriumchlorid, Kalzium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie z.B. HEPES), Nucleosiden (wie z.B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie z.B. Gentamycin^TM-Arzneimittel), Spurenelementen (als anorganische Verbindungen definiert, die für gewöhnlich in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich gegenwärtig sind) und Glucose oder einer äquivalenten Energiequelle ergänzt werden. Es können auch beliebige andere notwendige Ergänzungen in geeigneten, Fachleuten bekannten Konzentrationen aufgenommen werden. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Temperatur, pH und dergleichen, sind jene, die zuvor bei der Wirtszelle angewendet wurden, die für die Expression ausgewählt wurde, und sind für den durchschnittlichen Fachmann offensichtlich.
Im Allgemeinen können Prinzipien, Protokolle und praktische Verfahren zur Maximierung der Produktivität von Säugetierzellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, Hrsg., IRL Press (1991), gefunden werden.
Die Wirtszellen, auf die in dieser Offenbarung Bezug genommen wird, umfassen Zellen in Kultur sowie Zellen, die sich innerhalb eines Wirtstiers befinden.
4. Gewinnung des Heteromultimers
Das Heteromultimer wird vorzugsweise im Allgemeinen als sekretiertes Polypeptid aus dem Kulturmedium gewonnen, obwohl es auch aus Wirtszelllysat gewonnen werden kann, wenn es direkt ohne sekretorisches Signal produziert wird. Wenn das Heteromultimer membrangebunden ist, kann es unter Einsatz einer geeigneten Detergenslösung (z.B. Triton-X-100) von der Membran freigesetzt werden.
Wenn das Heteromultimer in einer rekombinanten Zelle, die keine menschlichen Ursprungs ist, produziert wird, ist es komplett frei von Proteinen oder Polypeptiden menschlichen Ursprungs. Jedoch ist es notwendig, das Heteromultimer aus rekombi nanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu remigen, um Formulierungen zu erhalten, die zum Heteromultimer im Wesentlichen homogen sind. Als erster Schritt wird das Kulturmedium oder Lysat normalerweise zentrifugiert, um teilchenförmige Zelltrümmer zu entfernen.
sHeterodimere, die konstante Antikörperdomänen aufweisen, können auf einfache Art und Weise mittels Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie gereinigt werden, wobei Affinitätschromatographie das bevorzugte Reinigungsverfahren ist. Wo das Heteromultimer eine C_H3-Domäne umfasst, ist das Bakerbond-ABX^TM-Harz (J.T. Baker, Phillipsburg, New Jersey) zur Reinigung zweckdienlich. Es sind ebenfalls andere Verfahren zur Proteinreinigung, wie z.B. Fraktionierung auf einer Ionenaustauschsäule, Ethanolpräzipitation, Umkehrphasen-HPLC, Chromatographie auf Silica, Chromatographie auf Heparin-Sepharose, Chromatographie auf einem Anionen- oder Kationenaustauschharz (wie z.B. einer Polyasparaginsäure-Säule), Chromatofokussierung, SDS-PAGE und Ammoniumsulfatpräzipitation, verfügbar, abhängig vom Polypeptid, das gewonnen werden soll. Die Eignung von Protein A als Affinitätsligand hängt von der Spezies und dem Isotyp der Immunglobulin-Fc-Domäne ab, die in der Chimäre verwendet wird. Protein A kann verwendet werden, um Immunahdhäsine zu reinigen, die auf menschlichen γ1-, γ2- oder γ4-Schwerketten basieren (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62, 1–13 (1983)). Protein G wird für alle Mausisotypen und für menschliches γ3 empfohlen (Guss et al., EMBO J. 5, 1567–1575 (1986)). Die Matrix, an welche der Affinitätsligand gebunden wird, ist meistens Agarose, aber es sind auch andere Matrizen verfügbar. Mechanisch stabile Matrizen, wie z.B. Controlled Pore Glass oder Poly(styroldivinyl)benzol, ermöglichen höhere Druchflussgeschwindigkeiten und kürzere Verarbeitungszeiten als mit Agarose erreicht werden können. Die Bedingungen für die Bindung eines Immunadhäsins an die Protein-A- oder -G-Affinitätssäule werden vollständig von den Eigenschaften der Fc-Domäne vorgegeben, das heißt von ihrer Spezies und ihrem Isotyp. Im Allgemeinen tritt wirksame Bindung, wenn der richtige Ligand ausgewählt wird, direkt durch ein nicht-konditioniertes Kulturfluid auf. Ein Unterscheidungsmerkmal von Immunadhäsinen ist, dass die Bindungskapazität für Pro tein A im Vergleich zu einem Antikörper desselben Fc-Typs verringert ist. Gebundene Immunadhäsine können wirksam eluiert werden, entweder bei einem sauren pH (bei oder über 3,0) oder in einem neutralen pH-Puffer, der ein mildes chaotropes Salz enthält. Dieser Affinitätschromatographieschritt kann in einer Heterodimerformulierung resultieren, die > 95 % rein ist.
5. Verwendungen für das Heteromultimer
Es sind viele therapeutische Anwendungen für das Heteromultimer beabsichtigt. Zum Beispiel kann das Heteromultimer zur neu ausgerichteten Zytotoxizität (z.B. zum Abtöten von Tumorzellen), als Impfstoffadjuvans, zur Lieferung von thrombolytischen Mitteln an Blutgerinnsel, zur Lieferung von Immunotoxinen an Tumorzellen, zur Überführung von aktivierten Prodrugs an einer Targetstelle (z.B. einem Tumor), zur Behandlung von Infektionskrankheiten oder zum Targeting von Immunkomplexen an Zelloberflächenrezeptoren verwendet werden.
Therapeutische Formulierungen des Heteromultimers werden zur Lagerung durch Mischung des Heteromultimers mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit optionalen physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren in der Form von gefriergetrockneten Kuchen oder wässrigen Lösungen hergestellt (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol, Hrsg. (1980)). Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Rezipienten in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer, wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidanzien, einschließlich Ascorbinsäure; Polypeptide mit geringem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Resten); Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide; Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrin; Chelatbildner, wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z.B: Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie z.B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie z.B. Tween, Pluronics oder Polyethylenglykol (PEG).
Das Heteromultimer kann auch in Mikrokapseln, die z.B. durch Koazervierungsverfahren oder durch Grenzflächenpolymerisation (z.B. Hydroxymethylzellulose oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly[methylmethacylat]-Mikrokapseln) hergestellt werden, in kolloidalen Arzneimittelverabreichungssystemen (z.B. Liposomen, Albuminmikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanoteilchen und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen eingeschlossen sein. Diese Verfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, siehe oben, offenbart.
Das zur In-Vivo-Verabreichung verwendende Heteromultimer muss steril sein. Dies wird durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen vor oder nach Gefriertrocknung und Rekonstitution erreicht. Das Heteromultimer wird üblicherweise in gefriergetrockneter Form oder in Lösung gelagert.
Therapeutische Heteromultimerzusammensetzungen werden im Allgemeinen in einen Behälter positioniert, der eine sterile Zugangsstelle aufweist, z.B. eine intravenöse Lösungstasche oder Phiole mit einem Stöpsel, der mithilfe einer Injektionsnadel zur subkutanen Injektion durchstochen werden kann.
Der Verabreichungsweg für das Heteromultimer stimmt mit bekannten Verfahren überein, z.B. Injektion oder Infusion über intravenöse, intraperitoneale, intrazerebrale, intramuskuläre, intraokulare, intrarterielle oder intraläsionale Wege oder mithilfe von nachstehend beschriebenen Systemen zur anhaltenden Feisetzung. Das Heteromultimer wird kontinuierlich mittels Infusion oder Bolusinjektion verabreicht.
Geeignete Beispiele für Formulierungen zur anhaltenden Freisetzung umfassen halbdurchlässige Matrizen fester hydrophober Polymere, die das Protein enthalten, wobei diese Matrizen in Form von geformten Artikeln vorliegen, z.B. Filmen oder Mikrokapseln. Beispiele für Matrizen zur nachhaltigen Freisetzung umfassen Polyester, Hydrogele [z.B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) wie von Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167–277 (1981), und Langer, Chem. Tech. 12, 98–105 (1982), beschrieben oder Poly(vinylalkohol)], Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919, EP 58.481 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und Gamma-Ethyl-L-Glutamat (Sidman et al., Bio polymers 22, 547–556 (1983)), nichtabbaubares Ethylen-Vinylacetat (Langer et al., siehe oben), abbaubare Milchsäure-Glycolsäure-Copolymere, wie z.B. Lupron Depot^TM (injizierbare Mikrokügelchen bestehend aus Milchsäure-Glycolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat) und Poly-D-(–)3-Hydroxybuttersäure ( EP 133.988 ).
Während Polymere, wie z.B. Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glycolsäure, die Feisetzung von Molekülen über 100 Tage hinweg ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine in kürzeren Zeiträumen frei. Wenn eingekapselte Proteine für einen längeren Zeitraum im Körper bleiben, können sie als Ergebnis von Exposition gegenüber Feuchtigkeit bei 37°C denaturieren oder aggregieren, was zu einem Verlust der biologischen Aktivität und möglichen Veränderungen der Immunogenität führt. Es können vernünftige Strategien zur Proteinstabilisierung entwickelt werden, abhängig vom involvierten Mechanismus. Wenn festgestellt wird, dass der Aggregationsmechanismus eine intermolekulare S-S-Bindungsbildung durch Thiodisulfidaustausch ist, kann zum Beispiel durch Modifikation von Sulfhydrylresten, Gefriertrocknung aus sauren Lösungen, Regulierung des Feuchtigkeitsgehalts unter Einsatz geeigneter Zusatzstoffe und durch Entwicklung spezifischer Polymermatrixzusammensetzungen Stabilisierung erreicht werden.
Heteromultimerzusammensetzungen mit anhaltender Freisetzung umfassen auch ein liposomal eingeschlossenes Heteromultimer. Liposome, die Heteromultimer enthalten, werden mithilfe Verfahren per se bekannter hergestellt: DE 3.218.121 ; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688–3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030–4034 (1980); EP 52.322 ; EP 36.676 ; EP 88.046 ; EP 143.949 ; EP 142.641 ; japanische Patentanmeldung 83-118008; US-Patente Nr. 4.485.045 und 4.544.545 udn EP 102.324 . Üblicherweise sind die Liposomen vom kleinen (etwa 200–800 Angström) einschichtigen Typ, bei welchen der Lipidgehalt größer als etwa 30 Mol-% Cholesterin ist, wobei das gewählte Verhältnis zur optimalen Heteromultimertherapie angepasst wird.
Eine wirksame Menge des therapeutisch zu verwendenen Heteromultimers hängt zum Beispiel von den therapeutischen Zielen, dem Verabreichungsweg und dem Leiden des Patienten ab. Dementsprechend ist es für den Therapeuten notwendig, die Dosis zu titrieren und den Verabreichungsweg wenn nötig zu modifzieren, um die optimale therapeutische Wirkung zu erzielen. Eine typische tägliche Dosis kann von etwa 1 μg/kg bis 10 mg/kg oder mehr reichen, abhängig von den oben genannten Faktoren. Typischerweise verabreicht der Kliniker ein Heteromultimer bis eine Dosis erreicht wird, die den gewünschten Effekt erzielt. Der Fortschritt dieser Therapie ist mithilfe herkömmlicher Tests einfach zu überwachen.
Die hierin beschriebenen Heteromultimere können auch in Enzymimmuntests verwendet werden. Um dies zu erreichen, kann ein Arm des Heteromultimers so entworfen werden, dass es sich an ein spezifisches Epitop auf dem Enzym bindet, sodass die Bindung keine Enzyminhibition hervorruft, der andere Arm des Heteromultimers kann so entworfen werden, dass er sich an die immobilisierende Matrix bindet, wodurch eine hohe Enzymdichte an der gewünschten Stelle gesichert wird. Beispiele für solche diagnostischen Heteromultimere umfassen jene mit einer Spezifität für IgG sowie Ferritin und jene mit Bindungsspezifitäten für Meerrettichperoxidase (HRP) sowie zum Beispiel ein Hormon.
Die Heteromultimere können zur Verwendung in Zwei-Seiten-Immuntests entworfen werden. Zum Beispiel werden zwei bispezifische Heteromultimere produziert, die sich an zwei separate Epitope auf dem Analytenprotein binden – ein Heteromultimer bindet den Komplex an eine unlösliche Matrix, das andere bindet ein Indikatorenzym.
Heteromultimere können auch zur In-vitro- oder In-vivo-Immundiagnose verschiedener Erkrankungen wie z.B. Krebs verwendet werden. Um diese diagnostische Verwendung zu erleichtern, kann ein Arm des Heteromultimers so entworfen werden, dass er ein tumorassoziiertes Antigen bindet, und der andere Arm kann einen detektierbaren Marker (z.B. einen Chelatbildner, der ein Radionuclid bindet) binden. Zum Beispiel kann ein Heteromultimer mit Spezifitäten für das tumorassoziierte Antigen CEA sowie ein bivalentes Hapten zur Darstellung von kolorektalen Karzinomen und Schilddrüsenkarzinomen verwendet werden. Andere nicht-therapeutische, diagnostische Verwendungen für das Heteromultimer sind dem Fachmann bekannt.
Für diagnostische Anwendungen wird zumindest ein Arm des Heteromultimers typischerweise direkt oder indirekt mit einer detektierbaren Gruppierung markiert. Die detektierbare Gruppierung kann jede beliebige Gruppierung sein, die in der Lage ist, entweder direkt oder indirekt ein detektierbares Signal zu produzieren. Zum Beispiel kann die detektierbare Gruppierung ein Radioisotop sein, wie z.B. ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I, eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Verbindung, wie z.B. Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin, oder ein Enzym, wie z.B. alkalische Phosphatase, Beta-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase (HRP).
Es kann jedes beliebige fachbekannte Verfahren zur separaten Konjugation des Heteromultimers an die detektierbare Gruppierung verwendet werden, einschließlich jene Verfahren, die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982), beschrieben wurden.
Die Heteromultimere der vorliegenden Erfindung können in jedem beliebigen bekannten Testverfahren, wie z.B. kompetitiven Bindungstests, direkten und indirekten Sandwichtests und Immunpräzipitationstests, verwendet werden. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press Inc., 147–158 (1987).
Kompetitive Bindungstests basieren auf der Fähigkeit eines markierten Standards, mit dem Testprobenanalyten um die Bindung mit einer begrenzten Menge des Neteromultimers zu konkurrieren. Die Menge des Analyten in der Testprobe ist umgekehrt proportional zur Menge des Standards, der an das Heteromultimer gebunden wird. Um die Bestimmung der Menge des Standards zu erleichtern, der gebunden wird, werden die Heteromultimere im Allgemeinen vor oder nach der Konkurrenz unlöslich gemacht, sodass Sandard und Analyt, die an die Heteromultimere gebunden sind, in geeigneter Weise vom Standard und Analyten getrennt werden können, die ungebunden bleiben.
Die Heteromultimere sind besonders für Sandwichtests zweckdienlich, welche die Verwendung zweier Moleküle umfassen, wovon jedes zur Bindung an einen anderen immunogenen Abschnitt oder ein anderes Epitop der zu detektierenden Probe in der Lage ist. In einem Sandwichtest ist der Testprobenanalyt durch einen ersten Arm des Heteromultimers gebunden, der auf einem festen Träger immobilisiert ist, und danach bindet sich ein zweiter Arm des Heteromultimers an den Analyten, wodurch ein unlöslicher dreiteiliger Komplex gebildet wird. Siehe z.B. US-Patent Nr. 4.376.110. Der zweite Arm des Heteromultimers kann selbst mit einer detektierbaren Gruppierung markiert werden (direkte Sandwichtests) oder kann unter Einsatz eines Anti-Immunglobulin-Antikörpers gemessen werden, der mit einer detektierbaren Gruppierung markiert wird (indirekter Sandwichtest). Zum Beispiel ist eine Form des Sandwichtests ein ELISA-Test, in welchem die detektierbare Gruppierung ein Enzym ist.
Nachstehend sind Beispiele für spezifische Ausführungsformen zur Durchführung der vorliegenden Erfindung angeführt. Die Beispiele dienen nur der Veranschaulichung und sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung in keinster Weise einschränken.
BEISPIELE
Die C_H3-Grenzfläche zwischen der humanisierten Anti-CD3/CD4-IgG-Chimäre, die zuvor von Chamov et al., J. Immunol. 153, 4268 (1994), beschrieben wurde, wurde gentechnisch hergestellt, um den Prozentsatz des zu gewinnenden Heteromultimers zu maximieren. Protuberanz-in-Kavität- und Wildtyp-C_H3-Varianten wurden in ihrer Fähigkeit verglichen, die Bildung eines humanisierten Antikörper-Immunadhäsin-Chimäre-(Ab/Ia-)Anti-CD3/CD4-IgG zu steuern.
Daher wurden in der C_H3-Domäne der humanisierten Anti-CD3-Antikörper-Schwerkette und in CD4-IgG durch ortsspezifische Mutagenese unter Einsatz von fehlgepaarten Oligonucleotiden Mutationen hergestellt (Kunkel et al., Methods Enzymol. 154, 367 (1987), und P. Carter, in Mutagenesis: a Practical Approach, M. J. McPherson, Hrsg., IRL Press, Oxford, UK, 1–25 (1991)) und durch Didesoxynucleotidsequenzierung verifiziert (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 74, 5436 (1977)). Siehe Tabelle 4 unten und 7 hierin. TABELLE 4
Rest T366 befindet sich innerhalb des Wasserstoffbindungsabstands von Rest Y407 auf der Partner-C_H3-Domäne. Tatsächlich ist der hauptsächliche intermolekulare Kontakt von Rest T366 mit Rest Y407 und vice versa. Ein Protuberanz-in-Kavität-Paar wurde durch Inversion dieser Reste mit den reziproken Mutationen von T366Y in einer C_H3-Domäne und Y407T in der Partnerdomäne hergestellt, wodurch das Volumen der Seitenketten an der Grenzfläche beibehalten wird (9). Mutationen werden durch den Wildtyprest angezeigt, gefolgt von der Position unter Verwendung des Kabat-Nummerierungssystems (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD, Auflage 5 (1991)) und dann vom Ersatzrest im Einbuchstabencode. Multiple Mutationen werden durch Auflistung der Komponenteneinzelmutationen angegeben, die durch ein Kolon getrennt sind.
Phagemiden, die für Anti-CD3-Leicht-(L-) und -Schwer-(H-)Kettenvarianten kodieren (Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217 (1992), und Rodrigues et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7, 45 (1992)) wurden in menschliche embryonale Nierenzellen, 293S, gemeinsam mit einer CD4-IgG-Variante, die für Phagemid kodiert (Byrn et al., Nature 344, 667 (1990)) wie zuvor beschrieben (Chamov et al., J. Immunol. 153, 4268 (1994)) co-transfiziert. Das Verfahren ist in 8 hierin veranschaulicht. Die Gesamtmenge der transfizierten Phagemid-DNAs wurde fixiert, während das Verhältnis verschiedener DNAs variabel gehalten wurde, um die Ausbeute der Ab/Ia-Chimäre zu maximieren. Das Verhältnis (nach Masse) von Ia:H-Kette:L-Ketten-Input-DNAs (15 μg gesamt) wurde wie folgt variiert: 8:1:3, 7:1:3, 6:1:3, 5:1:3; 4:1:3; 3:1:3; 1:0:0; 0:1:3.
Die Produkte wurden unter Einsatz des Staphylokokkenproteins A (ProSep A, Bioprocessing Ltd., Vereinigtes Königreich) vor der Analyse durch SDS-Page gefolgt von Scanning-Laser-Densitometrie (10A–10E) affinitätsgereinigt. Es wurden mehr L- als H-Ketten-DNA-Produkte verwendet, um zu vermeiden, dass die L-Kette einschränkend ist. Die Identität von Produkten wurde durch Elektroblotting auf der PVDF-Membran verifiziert (Matsudaira, J. Biol. Chem. 262, 10035 (1987)), gefolgt von aminoterminaler Sequenzierung.
Co-Transfektion von Phagemiden für L-Kette gemeinsam mit jenen für H-Kette und Ia, die Wildtyp-C_H3 inkorporieren, resultierte wie erwartet in einem Gemisch aus Ab/Ia-Chimäre, IgG- und Ia-Homodimerprodukten (Chamow et al., H. Immunol. 153, 4268 (1994)). Siehe 10A. Je größer der Anteil der Input-DNA, die für den Antikörper-H- und -L-Ketten kodiert, oder Ia ist, desto höher ist der Anteil der entsprechenden gewonnenen Homodimere. Ein Input-DNA-Verhältnis von 6:1:3 von Ia:H:L ergab 54,5 % Ab/Ia-Chimäre mit ähnlichen Fraktionen von Ia-Homodimer (22,5 %) und IgG (23,0 %). Diese Anteile stimmen mit jenen gut überein, die aus der äquimolaren Expression jeder Kette gefolgt von der zufälligen Anordnung von H-Ketten erwartet werden, wobei durch das Analyseverfahren keine Beeinflussung eingeführt worden ist: 50 % Ab/Ia-Chimäre, 25 % IA-Homodimer, und 25 % IgG:
Im Gegensatz zu Ketten, die Wildtyp-C_H3 enthalten, wird die Ab/Ia-Chimäre mit Ausbeuten von bis zu 92 % aus Cotransfektionen gewonnen, in welchen die Anti-CD3-H-Kette und CD4-IgG-Ia die Y407T-Kavität- beziehungsweise T366Y-Protuberanzmutationen enthielt (10B). Es wurden ähnliche Ausbeuten von Ab/Ia-Chimären er halten, wenn diese reziproken Mutationen mit der Protuberanz auf der H-Kette und der Kavität in Ia geschaffen wurden (10C). In beiden Fällen wurde für die Kette, welche die Protuberanz, aber nicht die Kavität enthielt, Monomer beobachtet. Ohne auf eine beliebige Theorie eingeschränkt zu sein, wird davon ausgegangen, dass die T366Y-Protuberanz die Homodimerbildung mehr stört als die Y407T-Kavität. Der Anteil von Ab/Ia-Hybrid wurde durch die Erhöhung der Größe von sowohl der Protuberanz als auch der Kavität nicht signifikant verändert (Ab T366W, Ia Y407A). Ein zweites Protuberanz- und Kavitätspaar (Ab F405A, Ia T394W) ergab bis zu 71 % Ab/Ia Chimäre unter Einsatz einer kleinen Fraktion von Ia-Input-DNA, um die nicht erwartete Neigung der Ia-T394W-Protuberanzvariante zu homodimerisieren, zu kompensieren (10D). Die Kombination aus zwei unabhängigen Protuberanz-in-Kavität-Mutantenpaaren (Ab T366Y:F405A, Ia T394W:Y407T) verbesserte die Ausbeute von Ab/Ia-Hybrid gegenüber dem Ab-T366Y-Ia-Y407T-Paar nicht (vergleiche 10C und 10E)
Der Anteil der Ab/IA-Chimäre, der mit dem T366Y-Y407T-Mutantenpaar erhalten wurde, war im Wesentlichen unabhängig vom Verhältnis von Input-DNAs im getesteten Bereich. Weiters wurden die kontaminierenden Spezies einfach von der Ab/Ia-Chimäre durch Ionenaustauschchromatographie (0–300 mM NaCl in 20 mM Tris-HCl, pH 8,0) auf einer Mono-S-HR-5/5-Säule (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) entfernt. Dies deutete auf die Herstellung von größeren Mengen von Ab/Ia-Chimären unter Verwendung von stabilen Zelllinien hin, wo die relativen Expressionsausmaße von Ab und Ia weniger leicht zu manipulieren sind als im vorübergehenden Expressionssystem.
Die identifizierten Protuberanz-in-Kavität-Mutationen werden antizipiert, um die potenziellen Anwendungen von Fc-enthaltendem BsAb durch Reduktion der Komplexität des Gemisches aus Produkten, die aus möglichen zehn Hauptspezies erhalten werden, auf vier oder weniger zu erhöhen (Suresh et al., Methods Enzymol. 121, 210 (1990)). Es wird erwartet, dass das T366Y-Y407T-Mutantenpaar zur Herstellung von Heteromultimeren anderer menschlicher IgG-Isotope nützlich ist, da T366 und Y407 vollständig konserviert sind und andere Reste an der C_H3-Domänengrenzfläche von IgG₁ höchst konserviert sind (siehe 6 hierin). SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Heteromultimers, das ein erstes Polypeptid und ein zweites Polypeptid umfasst, worin das erste Polypeptid und das zweite Polypeptid jeweils eine konstante Antikörperdomäne umfassen, worin die konstanten Antikörperdomänen an einem Verbindungsteil zusammentreffen, das ein ursprüngliches Verbindungsteil zwischen den konstanten Antikörperdomänen umfasst, das so verändert ist, dass es die Bildung eines Heteromultimers fördert, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) die Veränderung einer ersten Nucleinsäure, die für die konstante Antikörperdomäne des ersten Polypeptids kodiert, sodass im ursprünglichen Verbindungsteil der konstanten Antikörperdomäne des ersten Polypeptids, das mit dem ursprünglichen Verbindungsteil der konstanten Antikörperdomäne des zweiten Polypeptids im Heteromultimer zusammentrifft, ein Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest mit einem größeren Seitenkettenvolumen ersetzt wird, wodurch eine Protuberanz im Verbindungsteil der konstanten Antikörperdomäne des ersten Polypeptids gebildet wird, die in einer Kavität im Verbindungsteil der konstanten Antikörperdomäne des zweiten Polypeptids anordenbar ist; und/oder (b) die Veränderung einer zweiten Nucleinsäure, die für die konstante Antikörperdomäne des zweiten Polypeptids kodiert, sodass im ursprünglichen Verbindungsteil der konstanten Antikörperdomäne des zweiten Polypeptids, das mit der ursprünglichen konstanten Antikörperdomäne des ersten Polypeptids im Heteromultimer zusammentrifft, ein Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest mit einem geringeren Seitenkettenvolumen ersetzt wird, wodurch eine Kavität in der Oberfläche der konstanten Antikörperdomäne des zweiten Polypeptid gebildet wird, in der eine Protuberanz im Verbindungsteil der konstanten Antikörperdomäne des zweiten Polypeptids anordenbar ist; (c) das Einführen der ersten und der zweiten Nucleinsäure in eine Wirtszelle und das Kultivieren der Zelle, sodass Expression der ersten und der zweiten Nucleinsäure erfolgt; (d) das Gewinnen des gebildeten Heteromultimers aus der Zellkultur.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die Veränderung der Nucleinsäure, die für die konstante Antikörperdomäne des ersten Polypeptids kodiert, und der Nucleinsäure, die für die konstante Antikörperdomäne des zweiten Polypeptids kodiert, wie angeführt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Aminosäurerest mit größerem Seitenkettenvolumen Arginin (R) ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Aminosäurerest mit größerem Seitenkettenvolumen Phenylalanin (F) ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Aminosäurerest mit größerem Seitenkettenvolumen Tyrosin (Y) ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Aminosäurerest mit größerem Seitenkettenvolumen Tryptophan (W) ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Aminosäurerest mit geringerem Seitenkettenvolumen nicht Cystein (C) ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Aminosäurerest mit geringerem Seitenkettenvolumen Alanin (A) ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Aminosäurerest mit geringerem Seitenkettenvolumen Serin (S) ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Aminosäurerest mit geringerem Seitenkettenvolumen Threonin (T) ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Aminosäurerest mit geringerem Seitenkettenvolumen Valin (V) ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die konstante Antikörperdomäne eine C_H3-Domäne ist.
Verfahren nach Anspruch 12, worin die konstante Antikörperdomäne von einem IgG stammt.
Verfahren nach Anspruch 13, worin das IgG menschliches IgG₁ ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Heteromultimer ein bispezifischer Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Heteromultimer ein bispezifisches Immunadhäsin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Heteromultimer eine Antikörper-Immunadhäsin-Chimäre ist.
Durch ein Verfahren nach Anspruch 1 erhaltenes Heteromultimer.
Heteromultimer nach Anspruch 18, worin die Protuberanz und die Kavität in das Verbindungsteil der konstanten Antikörperdomäne des ersten bzw. zweiten Polypeptids eingeführt sind.
Heteromultimer nach Anspruch 19, worin die Protuberanz und die Kavität jeweils einen natürlich vorkommenden Aminosäurerest umfassen.
Zusammensetzung, die ein Heteromultimer nach Anspruch 18 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Wirtszelle, die für das Heteromultimer nach Anspruch 18 kodierende Nucleinsäure umfasst.
Wirtszelle nach Anspruch 22, worin die für das erste Polypeptid kodierende Nucleinsäure und die für das zweite Polypeptid kodierende Nucleinsäure in einem einzigen Vektor enthalten sind.
Wirtszelle nach Anspruch 22, worin die für das erste Polypeptid kodierende Nucleinsäure und die für das zweite Polypeptid kodierende Nucleinsäure in getrennten Vektoren enthalten sind.
Verfahren zur Herstellung eines Heteromultimers, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 22, sodass die Nucleinsäure exprimiert wird, und das Gewinnen des Heteromultimers aus der Zellkultur.
Verfahren nach Anspruch 25, worin die Wirtszelle eine Säugetierzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 25, worin das Heteromultimer aus dem Zellkulturmedium gewonnen wird.