JP5872377B2 - ＰｒｏｇｒａｍｍｅｄＤｅａｔｈ１（ＰＤ−１）に対するヒトモノクローナル抗体および抗ＰＤ−１抗体単独または他の免疫療法と併用した癌治療方法 - Google Patents

Description

本発明は、一般的に、ヒト疾患治療における免疫療法とそれに関連した有害事象の低減に関する。さらに詳細には、本発明は、癌を治療するためのおよび／またはそれぞれの抗体治療に関連した有害事象の頻度または重篤度を低減するための、抗ＰＤ−１抗体の用途および抗ＣＴＬＡ−４と抗ＰＤ−１抗体との併用を含む併用免疫療法の用途に関する。

タンパク質のＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ １（ＰＤ−１）は、ＣＤ２８ファミリーレセプターの阻害メンバーであり、ＣＤ２８ファミリーには、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡもまた含まれる。ＰＤ−１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞上で発現する（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。当該ファミリーの最初のメンバーであるＣＤ２８およびＩＣＯＳは、モノクローナル抗体添加後のＴ細胞増殖上昇に及ぼす機能的影響により発見された（非特許文献４、非特許文献５）。ＰＤ−１は、アポトーシス細胞中における異なった発現をスクリーニングすることにより発見された（非特許文献６）。当該ファミリーの他のメンバーであるＣＴＬＡ−４とＢＴＬＡは、それぞれ、細胞傷害性Ｔリンパ球とＴＨ１細胞中における異なった発現をスクリーニングすることにより発見された。ＣＤ２８、ＩＣＯＳおよびＣＴＬＡ−４は全て、対になっていないシステイン残基を有しており、それらはホモダイマー化を可能にする。対照的に、ＰＤ−１はモノマーとして存在すると考えられており、他のＣＤ２８ファミリーメンバーに特徴的な対になっていないシステインを有していない。

ＰＤ−１遺伝子は、Ｉｇ遺伝子スーパーファミリーの一部である５５ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質である（非特許文献７）。ＰＤ−１は、膜近位免疫レセプターチロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）および膜遠位のチロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）（非特許文献８、非特許文献９）を含む。ＰＤ−１は、ＣＴＬＡ−４に構造的に類似しているが、Ｂ７−１およびＢ７−２結合に重要なＭＹＰＰＰＹモチーフを欠損している。ＰＤ−１に対する２個のリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２が同定されており、ＰＤ−１に結合するとＴ細胞活性化を負に制御することが明らかとなっている（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は両者ともに、ＰＤ−１に結合するが、他のＣＤ２８ファミリーメンバーには結合しないＢ７ホモログである。ＰＤ−１の一つのリガンドであるＰＤ−Ｌ１は、様々なヒト癌に豊富に存在している（非特許文献１３）。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用の結果、腫瘍浸潤性リンパ球の減少、Ｔ細胞レセプター媒介性増殖の低下、および癌性細胞による免疫回避が起こる（非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６）。免疫抑制は、ＰＤ−Ｌ１とのＰＤ−１の局所的相互作用を阻害することにより回復でき、ＰＤ−Ｌ２とのＰＤ−２との相互作用が同様に阻害される時、その効果は付加的である（非特許文献１７、非特許文献１８）。

ＰＤ−１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞上で発現するＣＤ２８ファミリーの阻害メンバーである（非特許文献１、非特許文献１９、非特許文献３）。ＰＤ−１欠損動物は、自己免疫性心筋症および関節炎および腎炎を伴うループス様症候群を含む様々な自己免疫性表現型を発症する（非特許文献２０、非特許文献２１）。さらに、ＰＤ−１は、自己免疫性脳脊髄炎、全身性ループスエリテマトーデス、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、Ｉ型糖尿病およびリウマチ性関節炎に重要な役割を果たすことがわかった（非特許文献２２、非特許文献２３および非特許文献２４）。マウスＢ細胞腫瘍株において、ＰＤ−１のＩＴＳＭは、ＢＣＲ媒介Ｃａ２^＋の流れおよび下流エフェクター分子のチロシンリン酸化を阻害する際に必須であることが明らかになった（非特許文献２５）。

Ａｇａｔａら、同上 Ｏｋａｚａｋｉら（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４：３９１７７９−８２ Ｂｅｎｎｅｔｔら（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７０：７１１−８ Ｈｕｔｌｏｆｆら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ３９７：２６３−２６６ Ｈａｎｓｅｎら（１９８０）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｓ １０：２４７−２６０ Ｉｓｈｉｄａら（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ． １１：３８８７−９５ Ａｇａｔａら（１９９６）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８：７６５−７２ Ｔｈｏｍａｓ、Ｍ．Ｌ．（１９９５）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８１：１９５３−６ Ｖｉｖｉｅｒ，ＥおよびＤａｅｒｏｎ，Ｍ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌｏ Ｔｏｄａｙ １８：２８６−９１ Ｆｒｅｅｍａｎら（２０００）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：１０２７−３４ Ｌａｔｃｈｍａｎら（２００１）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：２６１−８ Ｃａｒｔｅｒら（２００２）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：６３４−４３ Ｄｏｎｇら（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ． ８：７８７−９ Ｄｏｎｇら（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ． ８１：２８１−７ Ｂｌａｎｋら（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ５４：３０７−３１４ Ｋｏｎｉｓｈｉら（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １０：５０９４−１００ Ｉｗａｉら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ' ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９９：１２２９３−７ Ｂｒｏｗｎら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７０：１２５７−６６ Ｏｋａｚａｋｉら（２００２）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４：３９１７７９−８２ Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１：１４１−５１ Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：３１９−２２ Ｓａｌａｍａら（２００３）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９８：７１−７８ ＰｒｏｋｕｎｉａおよびＡｌａｒｃｏｎ−Ｒｉｑｕｅｌｍｅ（２００４）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １３：Ｒ１４３ Ｎｉｅｌｓｅｎら（２００４）Ｌｕｐｕｓ １３：５１０ Ｏｋａｚａｋｉら（２００１）ＰＮＡＳ ９８：１３８６６−７１

したがって、ＰＤ−１を認識する薬剤およびそのような薬剤の使用方法が望まれている。

本発明は、ＰＤ−１に結合し数々の望ましい性質を示す単離モノクローナル抗体、特に、ヒトモノクローナル抗体を提供する。これらの性質には、例えば、ヒトＰＤ−１への高親和性結合が含まれるが、これは、ヒトＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４またはＩＣＯＳのいずれかとの実質的交差反応性を欠如している。さらに、本発明の抗体は免疫応答を調節することが明らかとなった。したがって、本発明のもう一つの側面は、抗ＰＤ−１抗体を用いて免疫応答を調節する方法に関する。特に、本発明は、抗ＰＤ−１抗体を用いてインビボで腫瘍細胞増殖を阻害する方法を提供する。

本発明は、一面において、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関し、ここで、当該抗体は、下記の性質の少なくともひとつを示す。
（ａ）Ｋ_Ｄが１×１０^−７Ｍ以下でヒトＰＤ−１に結合する。
（ｂ）ヒトＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４またはＩＣＯＳに実質的に結合しない。
（ｃ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいてＴ細胞増殖を上昇させる。
（ｄ）ＭＬＲアッセイにおいてインターフェロン−γ産生を増加させる。
（ｅ）ＭＬＲアッセイにおいてＩＬ−２分泌を増加させる。
（ｆ）ヒトＰＤ−１およびカニクイザルＰＤ−１に結合する。
（ｇ）ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１に対する結合を阻害する。
（ｈ）抗原特異的記憶応答を刺激する。
（ｉ）抗体応答を刺激する。
（ｊ）腫瘍細胞増殖をインビボで阻害する。

別の態様において、当該抗体は、例えば、マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体であることもできるが、好適には、当該抗体はヒト抗体である。

さらに好適な態様において、当該抗体は、ヒトＰＤ−１に対してＫ_Ｄが５×１０^−８Ｍ以下で結合し、ヒトＰＤ−１に対してＫ_Ｄが１×１０^−８Ｍ以下で結合し、ヒトＰＤ−１に対してＫ_Ｄが５×１０^−９Ｍ以下で結合し、またはヒトＰＤ−１に対してＫ_Ｄが１×１０^−８ＭとＫ_Ｄ１×１０^−１０Ｍの間で結合する。

別の態様において、本発明は、
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６および７から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域および
（ｂ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３および１４から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含む参考抗体とＰＤ−１に対する結合を交差競合する単離ヒトモノクローナル抗体またはその結合部分を提供する。

さまざまな態様において、当該参考抗体は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域および
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含むか、または当該参考抗体は、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域および
（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含むか、または当該参考抗体は、
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域および
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含むか、または当該参考抗体は、
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域および
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含むか、または当該参考抗体は、
（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域および
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含むか、または当該参考抗体は、
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域および
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含むか、または当該参考抗体は、
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域および
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含む。

別の面において、本発明は、さらに、ヒトＶ_Ｈ３−３３遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関し、ここで、当該抗体は特異的にＰＤ−１に結合する。本発明は、さらに、ヒトＶ_Ｈ４−３９遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含み、抗体が特異的にＰＤ−１に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。本発明はさらに、ヒトＶ_ＫＬ６遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含み、抗体が特異的にＰＤ−１に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。本発明は、さらに、ヒトＶ_ＫＬ１５遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含み、抗体が特異的にＰＤ−１に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。

好適な態様において、本発明は、
（ａ）ヒトＶ_Ｈ３−３３遺伝子の重鎖可変領域および
（ｂ）ヒトＶ_ＫＬ６遺伝子の軽鎖可変領域
を含み、抗体が特異的にＰＤ−１に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。

別の好適な態様において、本発明は、
（ａ）ヒトＶ_Ｈ４−３９遺伝子の重鎖可変領域および
（ｂ）ヒトＶ_ＫＬ１５遺伝子の軽鎖可変領域
を含み、抗体が特異的にＰＤ−１に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。

別の面において、本発明は、
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域
を含み、
（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４および３５、およびその保存的修飾体から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号５０、５１、５２、５３、５４、５５および５６、およびその保存的修飾体から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含み、
（ｃ）当該抗体は特異的にＰＤ−１に結合する、
単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。

好適には、当該重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７および２８、およびその保存的修飾体から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含み、当該軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号４３、４４、４５、４６、４７、４８および４９、およびその保存的修飾体から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含む。好適には、当該重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１、およびその保存的修飾体から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、４１および４２、およびその保存的修飾体から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含む。

さらに別の面において、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
（ａ）当該重鎖可変領域は、配列番号１、２、３、４、５、６および７から構成される群から選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、
（ｂ）当該軽鎖可変領域は、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３および１４から構成される群から選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、
（ｃ）当該抗体は、ヒトＰＤ−１に対してＫ_Ｄが１×１０^−７Ｍ以下で結合し、
（ｄ）当該抗体は、ヒトＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４またはＩＣＯＳに対して実質的に結合しない、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。

好適な態様において、当該抗体は、さらに、下記の性質の少なくともひとつを有する。
（ａ）当該抗体は、ＭＬＲアッセイにおいてＴ細胞増殖を上昇させる。
（ｂ）当該抗体は、ＭＬＲアッセイにおいてインターフェロン−γ産生を増大させる。
（ｃ）当該抗体は、ＭＬＲアッセイにおいてインターロイキン−２（ＩＬ−２）分泌を増大させる。

さらにまたはこれとは別に、当該抗体は、上記に述べた他の特徴の一つ以上を有することができる。

好適な態様において、本発明は：
（ａ）配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７および２８から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４および３５から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３６、３７、３８、３９、４０、４１および４２から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４３、４４、４５、４６、４７、４８および４９から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｆ）配列番号５０、５１、５２、５３、５４、５５および５６から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含み、抗体が、ＰＤ−１と特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。

好適な組み合わせは、
（ａ）配列番号１５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号２９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および
（ｆ）配列番号５０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。

別の好適な組み合わせは、
（ａ）配列番号１６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および
（ｆ）配列番号５１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。

さらに別の好適な組み合わせは、
（ａ）配列番号１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および
（ｆ）配列番号５２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。

別の好適な組み合わせは、
（ａ）配列番号１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および
（ｆ）配列番号５３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。

別の好適な組み合わせは、
（ａ）配列番号１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および
（ｆ）配列番号５４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。

別の好適な組み合わせは、
（ａ）配列番号２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および
（ｆ）配列番号５５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。

別の好適な組み合わせは、
（ａ）配列番号２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および
（ｆ）配列番号５６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。

他の好適な本発明の抗体およびその抗原結合部分は：
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６および７から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および
（ｂ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３および１４から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含み、当該抗体はＰＤ−１に特異的に結合する。

好適な組み合わせは、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。

別の好適な組み合わせは、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および
（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。

別の好適な組み合わせは、
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。

別の好適な組み合わせは、
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。

別の好適な組み合わせは、
（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。

別の好適な組み合わせは、
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。

別の好適な組み合わせは、
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。

本発明の抗体は、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプの全長抗体であることが可能である。これとは別に、当該抗体は、ＦａｂまたはＦａｂ´２断片のような抗体断片または一重鎖抗体であってもよい。

本発明は、また、サイトトキシンまたは放射性元素のような治療薬剤に結合させた本発明の抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合物を提供する。本発明は、また、当該抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第２の機能的部分に結合させた本発明の抗体またはその抗原結合部分を含む二特異性分子を提供する。

本発明の抗体またはその抗原結合部分、または免疫複合物または二特異性分子、ならびに薬学的に許容できる担体を含む組成物も提供される。

本発明の抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子ならびに当該核酸を含む発現ベクターおよび当該発現ベクターを含む宿主も、本発明に包含される。さらに、本発明は、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンを含む形質転換マウスを提供し、ここで、当該マウスは、本発明の抗体を発現し、さらに、このようなマウスから調製したハイブリドーマも提供され、ここで、当該ハイブリドーマは、本発明の抗体を産生する。

さらに別の面において、本発明は、被験者に対して本発明の抗体またはその抗原結合部分を、被験者における免疫応答を調節するように投与し、被験者における免疫応答を調節する方法を提供する。好適には、本発明の抗体は、当該被験者における免疫応答を増強させるか、刺激するか、または上昇させる。

別の面において、本発明は、被験者に対して治療有効量の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、被験者における腫瘍細胞増殖を阻害する方法を提供する。本発明の抗体は、その代わりに他の抗ＰＤ−１抗体も（または本発明の抗ＰＤ−１抗体と併用して）使用できるものの、本方法における用途に好適である。例えば、キメラ、ヒト化または完全ヒト抗ＰＤ−１抗体を腫瘍増殖阻害方法に使用できる。

別の面において、本発明は、被験者に対して治療有効量の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、被験者における感染性疾患を治療する方法を提供する。本発明の抗体は、代わりに他の抗ＰＤ−１抗体も（または本発明の抗ＰＤ−１抗体と併用して）使用できるものの、本方法における用途に好適である。例えば、キメラ、ヒト化または完全ヒト抗ＰＤ−１抗体を感染性疾患治療方法に使用できる。

さらに、本発明は、被験者に対して（ｉ）抗原および（ｉｉ）抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分を投与し、被験者における当該抗原に対する免疫応答を増強させることを含む、被験者における当該抗原に対する免疫応答を増強する方法を提供する。当該抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌性抗原、または病原体からの抗原であってもよい。本発明の抗体は、代わりに他の抗ＰＤ−１抗体も（または本発明の抗ＰＤ−１抗体と併用して）使用できるものの、本方法における用途に好適である。例えば、キメラ、ヒト化または完全にヒトの抗ＰＤ−１抗体を被験者における抗原に対する免疫応答増強方法に使用できる。

本発明はまた、本発明で提供した抗ＰＤ−１抗体の配列に基づく“第２世代”抗ＰＤ−１抗体を作成する方法を提供する。例えば、本発明は、
（ａ）（ｉ）配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１から構成される群から選択したＣＤＲ１配列および／または配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７および２８から構成される群から選択したＣＤＲ２配列；および／または配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４および３５から構成される群から選択したＣＤＲ３配列を含む重鎖可変抗体配列；または（ｉｉ）配列番号３６、３７、３８、３９、４０、４１および４２から構成される群から選択したＣＤＲ１配列および／または配列番号４３、４４、４５、４６、４７、４８および４９から構成される群から選択したＣＤＲ２配列；および／または配列番号５０、５１、５２、５３、５４、５５および５６から構成される群から選択したＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変抗体配列を提供すること；
（ｂ）重鎖可変領域抗体配列および軽鎖可変領域抗体配列から選択した少なくとも１個の可変領域抗体配列内部の少なくとも１個のアミノ酸残基を改変し、少なくとも１個の改変抗体配列を作成すること；および
（ｃ）当該改変抗体配列をタンパク質として発現させること
を含む、抗ＰＤ−１抗体を調製する方法を提供する。

本発明の他の特徴および利点は、下記の詳細な説明および実施例から明らかであるが、それらに限定されるものではない。本明細書に引用したあらゆる参考文献、ＧｅｎＢａｎｋエントリ、特許および公表特許明細書の内容は、ここに明確に参照として取り込まれる。

１７Ｄ８ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域の塩基配列（配列番号５７）およびアミノ酸配列（配列番号１）を示している。ＣＤＲ１（配列番号１５）、ＣＤＲ２（配列番号２２）およびＣＤＲ３（配列番号２９）領域を図示し、そのＶ、ＤおよびＪの生殖細胞型の由来を示している。 １７Ｄ８ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域の塩基配列（配列番号６４）およびアミノ酸配列（配列番号８）を示している。ＣＤＲ１（配列番号３６）、ＣＤＲ２（配列番号４３）およびＣＤＲ３（配列番号５０）領域を図示し、そのＶおよびＪ生殖細胞型の由来を示している。 ２Ｄ３ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域の塩基配列（配列番号５８）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示している。ＣＤＲ１（配列番号１６）、ＣＤＲ２（配列番号２３）およびＣＤＲ３（配列番号３０）領域を図示し、そのＶおよびＪ生殖細胞型の由来を示している。 ２Ｄ３ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域の塩基配列（配列番号６５）およびアミノ酸配列（配列番号９）を示している。ＣＤＲ１（配列番号３７）、ＣＤＲ２（配列番号４４）およびＣＤＲ３（配列番号５１）領域を図示し、そのＶおよびＪ生殖細胞型の由来を示している。 ４Ｈ１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域の塩基配列（配列番号５９）およびアミノ酸配列（配列番号３）を示している。ＣＤＲ１（配列番号１７）、ＣＤＲ２（配列番号２４）およびＣＤＲ３（配列番号３１）領域を図示し、そのＶおよびＪ生殖細胞型の由来を示している。 ４Ｈ１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域の塩基配列（配列番号６６）およびアミノ酸配列（配列番号１０）を示している。ＣＤＲ１（配列番号３８）、ＣＤＲ２（配列番号４５）およびＣＤＲ３（配列番号５２）領域を図示し、そのＶおよびＪ生殖細胞型の由来を示している。 ５Ｃ４ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域の塩基配列（配列番号６０）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示している。ＣＤＲ１（配列番号１８）、ＣＤＲ２（配列番号２５）およびＣＤＲ３（配列番号３２）領域を図示し、そのＶおよびＪ生殖細胞型の由来を示している。 ５Ｃ４ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域の塩基配列（配列番号６７）およびアミノ酸配列（配列番号１１）を示している。ＣＤＲ１（配列番号３９）、ＣＤＲ２（配列番号４６）およびＣＤＲ３（配列番号５３）領域を図示し、そのＶおよびＪ生殖細胞型の由来を示している。 ４Ａ１１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域の塩基配列（配列番号６１）およびアミノ酸配列（配列番号５）を示している。ＣＤＲ１（配列番号１９）、ＣＤＲ２（配列番号２６）およびＣＤＲ３（配列番号３３）領域を図示し、そのＶおよびＪ生殖細胞型の由来を示している。 ４Ａ１１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域の塩基配列（配列番号６８）およびアミノ酸配列（配列番号１２）を示している。ＣＤＲ１（配列番号４０）、ＣＤＲ２（配列番号４７）およびＣＤＲ３（配列番号５４）領域を図示し、そのＶおよびＪ生殖細胞型の由来を示している。 ７Ｄ３ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域の塩基配列（配列番号６２）およびアミノ酸配列（配列番号６）を示している。ＣＤＲ１（配列番号２０）、ＣＤＲ２（配列番号２７）およびＣＤＲ３（配列番号３４）領域を図示し、そのＶおよびＪ生殖細胞型の由来を示している。 ７Ｄ３ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域の塩基配列（配列番号６９）およびアミノ酸配列（配列番号１３）を示している。ＣＤＲ１（配列番号４１）、ＣＤＲ２（配列番号４８）およびＣＤＲ３（配列番号５５）領域を図示し、そのＶおよびＪ生殖細胞型の由来を示している。 ５Ｆ４ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域の塩基配列（配列番号６３）およびアミノ酸配列（配列番号７）を示している。ＣＤＲ１（配列番号２１）、ＣＤＲ２（配列番号２８）およびＣＤＲ３（配列番号３５）領域を図示し、そのＶおよびＪ生殖細胞型の由来を示している。 ５Ｆ４ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域の塩基配列（配列番号７０）およびアミノ酸配列（配列番号１４）を示している。ＣＤＲ１（配列番号４２）、ＣＤＲ２（配列番号４９）およびＣＤＲ３（配列番号５６）領域を図示し、そのＶおよびＪ生殖細胞型の由来を示している。 １７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４および７Ｄ３の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞Ｖ_H ３−３３のアミノ酸配列（配列番号７１）との配列比較を示している。 １７Ｄ８、２Ｄ３および７Ｄ３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞Ｖ_K Ｌ６のアミノ酸配列（配列番号７３）との配列比較を示している。 ４Ｈ１と５Ｃ４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞Ｖ_K Ｌ６のアミノ酸配列（配列番号７３）との配列比較を示している。 ４Ａ１１と５Ｆ４の重鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞Ｖ_H ４−３９のアミノ酸配列（配列番号７２）との配列比較を示している。 ４Ａ１１と５Ｆ４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列とヒト生殖細胞Ｖ_K Ｌ１５のアミノ酸配列（配列番号７４）との配列比較を示している。 図１３Ａ−１３Ｂは、ヒトＰＤ−１に対して作製したヒトモノクローナル抗体５Ｃ４および４Ｈ１が全長ヒトＰＤ−１を移入したＣＨＯ細胞の細胞表面に結合することを明らかにしたフローサイトメトリー実験結果を示している。図１３Ａは、５Ｃ４についてのフローサイトメトリープロットを示している。図１３Ｂは、４Ｈ１についてのフローサイトメトリープロットを示している。細線は、ＣＨＯ細胞に対する結合を示し、太線は、ＣＨＯ ｈＰＤ−１細胞に対する結合を示している。 ヒトＰＤ−１に対して作製したヒトモノクローナル抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４および４Ａ１１がＰＤ−１に特異的に結合し、他のＣＤ２８ファミリーメンバーには結合しないことを示したグラフを示している。 図１５Ａ−１５Ｃは、ヒトＰＤ−１に対して作製したヒトモノクローナル抗体５Ｃ４および４Ｈ１が細胞表面においてＰＤ−１に結合することを明らかにしたフローサイトメトリー実験結果を示している。図１５Ａは、活性化ヒトＴ細胞への結合を示している。 図１５Ｂは、カニクイザルＴ細胞への結合を示している。 図１５Ｃは、ＰＤ−１発現ＣＨＯ移入細胞に対する結合を示している。 図１６Ａ−１６Ｃは、ヒトＰＤ−１に対するヒトモノクローナル抗体がＴ細胞増殖、ＩＦＮ−γ分泌およびＩＬ−２分泌を混合リンパ球反応アッセイにおいて促進することを明らかにした実験結果を示している。図１６Ａは、濃度依存的なＴ細胞増殖を示す棒グラフである。 図１６Ｂは、濃度依存的なＩＦＮ−γ分泌を示した棒グラフである。 図１６Ｃは、濃度依存的なＩＬ−２分泌を示した棒グラフである。 図１７Ａ−１７Ｂは、ヒトＰＤ−１に対して作製したヒトモノクローナル抗体が、ＰＤ−１発現ＣＨＯ移入細胞に対するＰＤ−Ｌ１およびＰＤ-Ｌ２の結合を阻害することを明らかにしたフローサイトメトリー実験結果を示している。図１７Ａは、ＰＤ−Ｌ１結合阻害を示す棒グラフである。 図１７Ｂは、ＰＤ−Ｌ２結合阻害を示す棒グラフである。 ヒトＰＤ−１に対して作製したヒトモノクローナル抗体がＴ細胞アポトーシスを促進しないことを明らかにしたフローサイトメトリー実験結果を示している。 抗ＰＤ−１ ＨｕＭａｂｓがＰＢＭＣｓをＣＭＶ溶解物および抗ＰＤ−１で刺激したときＣＭＶ陽性ドナーからのＰＢＭＣｓによるＩＦＮγ分泌に対して濃度依存的効果を有していることを明らかにした実験結果を示している。 抗ＰＤ−１抗体によるマウス腫瘍のインビボ処理が腫瘍増殖を阻害することを明らかにしたマウスモデル系における腫瘍増殖実験の結果を示している。 図２１Ａ〜２１Ｄは、ＭＣ３８結腸腫瘍細胞（ＰＤ−Ｌ１^-）を移植し、同日に下記の処方の一つで処置したマウスにおける経時的腫瘍容積を示している：（Ａ）マウスＩｇＧ（対照）、（Ｂ）抗ＣＴＬＡ−４、（Ｃ）抗ＰＤ−１または（Ｄ）抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＰＤ−１抗体。このマウスは、第３、６および１０日において実施例１３に記載のようにその後抗体処理を受け、腫瘍容積を６０日間にわたりモニタリングした。 図２１に示したマウスの平均腫瘍容積を示している。 図２１に示したマウスの腫瘍容積中央値を示している。 図２４Ａ〜図２４Ｄは、ＭＣ３８結腸腫瘍細胞（ＰＤ−Ｌ１^-）を移植し、１週後下記の処方の一つで処置したマウスにおける経時的腫瘍容積を示している：（Ａ）マウスＩｇＧ（対照）、（Ｂ）抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体、（Ｃ）抗ＰＤ−１、または（Ｄ）抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＰＤ−１抗体。処理第１日における腫瘍容積は、３１５ｍｍ³であった。マウスは、第３、６および１０日において実施例１４に記載のようにその後抗体処理を受けた。 図２４に示したマウスの平均腫瘍容積を示している。 図２４に示したマウスの腫瘍容積中央値を示している。 図２７Ａ−Ｈは、ＭＣ３８結腸腫瘍細胞（ＰＤ−Ｌ１^-）を移植し（第−７日）、その後、移植後第０、３、６および１０日に下記の処方の一つで（実施例１５に記載のように）処置したマウスにおける経時的平均腫瘍容積値を示している。図２７Ａは、対照としてのマウスＩｇＧ（２０ｍｇ／ｋｇ、Ｘ₂₀）で処置した結果を示す。 図２７Ｂは、抗ＰＤ−１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）およびマウスＩｇＧ（１０ｍｇ／ｋｇ）（Ｐ₁₀Ｘ₁₀）で処置した結果を示す。 図２７Ｃは、抗ＣＴＬＡ−４抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）およびマウスＩｇＧ（１０ｍｇ／ｋｇ）（Ｃ₁₀Ｘ₁₀）で処置した結果を示す。 図２７Ｄは、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＰＤ−１抗体（各１０ｍｇ／ｋｇ）（Ｃ₁₀Ｐ₁₀）で処置した結果を示す。 図２７Ｅは、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＰＤ−１抗体（各３ｍｇ／ｋｇ）（Ｃ₃Ｐ₃）で処置した結果を示す。 図２７Ｆは、抗ＣＴＬＡ−４抗体およびＰＤ−１抗体（各１ｍｇ／ｋｇ）（Ｃ₁Ｘ₁）で処置した結果を示す。 図２７Ｇは、抗ＣＴＬＡ−４抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、第０日）、抗ＣＴＬＡ−４抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、第３日）、抗ＰＤ−１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、第６日）、および抗ＰＤ−１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、第１０日）（Ｃ₁₀Ｃ₁₀Ｐ₁₀Ｐ₁₀）で順次処理した結果を示す。 図２７Ｈは、抗ＰＤ−１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、第０日）、抗ＰＤ−１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、第３日）、抗ＣＴＬＡ−４抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、第６日）および抗ＣＴＬＡ−４抗体（１０ｍｇ／ｋｇ、第１０日）（Ｐ₁₀Ｐ₁₀Ｃ₁₀Ｃ₁₀）で順次処理した結果を示す。 図２７に示したマウスの平均腫瘍容積を示している。 図２７に示したマウスの腫瘍容積中央値を示している。 図３０Ａ〜３０Ｆは、ＳＡ１／Ｎ線維肉腫細胞（ＰＤ−Ｌ１^-）を移植し、１日後に下記の処方の一つで処置したマウスにおける経時的腫瘍容積を示している。このマウスは、その後第４、７および１１日において実施例１６に記載のようにその後抗体処理を受け、腫瘍容積を４１日間にわたりモニタリングした。図３０Ａは、ＡＰＢＳ（溶媒対照）で処置した結果を示す。 図３０Ｂは、マウスＩｇＧ（抗体対照、１０ｍｇ／ｋｇ）で処置した結果を示す。 図３０Ｃは、抗ＰＤ−１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置した結果を示す。 図３０Ｄは、抗ＣＴＬＡ−４抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置した結果を示す。 図３０Ｅは、抗ＣＴＬＡ−４抗体（０．２ｍｇ／ｋｇ）で処置した結果を示す。 図３０Ｆは、抗ＰＤ−１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）および抗ＣＴＬＡ−４抗体（０．２ｍｇ／ｋｇ）で処置した結果を示す。 図２９に示したマウスの平均腫瘍容積を示している。 図２９に示したマウスの腫瘍容積中央値を示している。 図３３Ａ〜３３Ｊは、ＳＡ１／Ｎ線維肉腫細胞（ＰＤ−Ｌ１^-）を移植し、その後、移植後第７、１０、１３および１７日に下記の処方のひとつで（実施例１７に記載のように）処置したマウスにおける経時的腫瘍容積を示している。処理第１日の腫瘍容積は、約１１０ｍｍ³であった。図３３Ａは、ＰＢＳ（溶媒対照）を示す。 図３３Ｂは、マウスＩｇＧ（抗体対照、１０ｍｇ／ｋｇ）を示す。 図３３Ｃは、抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（０．２５ｍｇ／ｋｇ）を示す。 図３３Ｄは、抗ＣＴＬＡ−４抗体（０．５ｍｇ／ｋｇ）を示す。 図３３Ｅは、抗ＣＴＬＡ−４抗体（５ｍｇ／ｋｇ）を示す。 図３３Ｆは、抗ＰＤ−１抗体（３ｍｇ／ｋｇ）を示す。 図３３Ｇは、抗ＰＤ−１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）を示す。 図３３Ｈは、抗ＰＤ−１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）および抗ＣＴＬＡ−４抗体（０．２５ｍｇ／ｋｇ）を示す。 図３３Ｉは、抗ＰＤ−１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）および抗ＣＴＬＡ−４抗体（０．５ｍｇ／ｋｇ）を示す。 図３３Ｊは、抗ＰＤ−１抗体（３ｍｇ／ｋｇ）および抗ＣＴＬＡ−４抗体（０．５ｍｇ／ｋｇ）を示す。 図３３に示したマウスの平均腫瘍容積を示している。 図３３に示したマウスの腫瘍容積中央値を示している。 図３６Ａ〜３６Ｂは、ＳＡ１／ＮＡ線維肉腫細胞（ＰＤ−Ｌ１^-）を移植し、その後、移植後第１０、１３、１６および１９日に下記の処方の一つで（実施例１７に記載のように）処置したマウスにおける経時的腫瘍容積を示している：（Ａ）マウスＩｇＧ（抗体対照、１０ｍｇ／ｋｇ）、または（Ｂ）抗ＰＤ−１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）および抗ＣＴＬＡ−４抗体（１ｍｇ／ｋｇ）。処理第１日の腫瘍容積は、約２５０ｍｍ³であった。 図３６に示したマウスの平均腫瘍容積を示している。 図３６に示したマウスの腫瘍容積中央値を示している。 図３３および図３６に示した腫瘍容積から計算された腫瘍阻害平均率および中央値を示している。 図４０Ａ〜４０Ｄは、ＲＥＮＣＡ腎アデノカルシノーマ細胞（ＰＤ−Ｌ１⁺）を皮下移植し（Ｍｕｒｐｈｙ ａｎｄ Ｈｒｕｓｈｅｓｋｙ（１９７３）Ｊ．Ｎａｔ'ｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：１０１３−１０２５）（第１２日）、次に、移植後第０、３、６および９日において下記の処理のうちのひとつで腹腔内治療したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける腫瘍容積を示している。処理第１日の腫瘍容積は、約１１５ｍｍ³であった。図４０Ａは、マウスＩｇＧ（抗体対照、２０ｍｇ／ｋｇ）で処置した結果を示す。 図４０Ｂは、抗ＰＤ−１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置した結果を示す。 図４０Ｃは、抗ＣＴＬＡ−４抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置した結果を示す。 図４０Ｄは、抗ＣＴＬＡ−４抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）と抗ＰＤ−１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）との併用で処置した結果を示す。 マウスＰＤ−Ｌ２−Ｆｃ融合タンパク質のマウスＰＤ−１（ｍＰＤ−１）に対する結合が、抗ｍＰＤ−１抗体４Ｈ２により、用量依存的に阻害されることを示している。結合は、ＦＩＴＣ−標識ロバ−抗ラットＩｇＧの蛍光をＥＬＩＳＡにより測定することによって検出する。ＭＦＩ（平均蛍光強度）が高ければ高いほど結合も強い。 固定化ｍＰＤ−１−Ｆｃ融合タンパク質に対する抗ｍＰＤ−１抗体のＥＬＩＳＡによる結合曲線を示している。 ｍＰＤ−１−発現ＣＨＯ細胞に対するラット抗ｍＰＤ−１抗体４Ｈ２．Ｂ３の結合曲線を示している。結合は、ＦＩＴＣ結合ロバ抗ラットＩｇＧにより検出し、ＦＡＣＳ（ＭＦＩ）により測定した。 高濃度抗ｍＰＤ−１抗体４Ｈ２．Ｂ３の存在下における、ｍＰＤ−１発現ＣＨＯ細胞に対するｍＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃ融合タンパク質の結合曲線を示している。結合は、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧにより検出し、ＦＡＣＳ（ＭＦＩ）により測定した。 キメララット：マウス抗ｍＰＤ−１抗体４Ｈ２に比較して、ｍＰＤ−１発現ＣＨＯ細胞に対するラット抗ｍＰＤ−１抗体４Ｈ２．Ｂ３の結合曲線を示している。 高濃度ｍＰＤ−１抗体４Ｈ２．Ｂ３またはキメララット：マウス抗ｍＰＤ−１抗体４Ｈ２の存在下における、ｍＰＤ−１発現ＣＨＯ細胞に対するｍＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃ融合タンパク質の結合曲線を示している。 抗ＰＤ−１抗体で先に処理し、ＳＡ１／Ｎ線維肉腫細胞（ＰＤ−Ｌ１^-）で再チャレンジした腫瘍を有さないマウスの平均腫瘍容積を示している。また、ＳＡ１／Ｎ線維肉腫細胞を移植した未処理マウス（対照、先にチャレンジまたは処理を受けていない）の平均腫瘍容積を示した。 ＭＣ３８結腸細胞癌移植（ＰＤ−Ｌ１^-）を移植し、抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体と抗ＰＤ−１抗体との併用による処理を受けた後も無腫瘍で生存し、最初の処理よりも１０倍以上のＭＣ３８結腸腫瘍細胞で再チャンレジしたマウスのそれぞれにおける経時的腫瘍容積を示している。また、ＭＣ３８結腸腫瘍細胞を移植した未処理マウス（対照、先にチャレンジまたは処理を受けていない）の平均腫瘍容積を示した。 図４８におけるマウスの平均腫瘍容積を示している。 ＣＴ２６結腸腫瘍細胞を移植したマウスのそれぞれの平均腫瘍容積を示す。 図５１Ａ−Ｂは、ヒトＰＤ−１に対するヒトモノクローナル抗体がＴ制御細胞を含む培養物中においてＴ細胞増殖とＩＦＮ−γ分泌を促進することを明らかにした実験結果を示している。図５１Ａは、濃度依存的なＴ細胞増殖をＨｕＭＡｂ ５Ｃ４を用いて示した棒グラフを示している。図５１Ｂは、濃度依存的なＩＦＮ−γ分泌をＨｕＭＡｂ ５Ｃ４を用いて示した棒グラフを示している。 図５２Ａ−Ｂは、ヒトＰＤ−１に対するヒトモノクローナル抗体が活性化Ｔ細胞を含む培養物中においてＴ細胞増殖とＩＦＮ−γ分泌を促進することを明らかにした実験結果を示している。図５２Ａは、濃度依存的なＴ細胞増殖をＨｕＭＡｂ ５Ｃ４を用いて示した棒グラフを示しており、図５２Ｂは、濃度依存的なＩＦＮ−γ分泌をＨｕＭＡｂ ５Ｃ４を用いて示した棒グラフを示している。 ヒトモノクローナル抗ＰＤ−１抗体がヒト活性化Ｔ細胞をＡＤＣＣ濃度依存的に死滅させることを明らかにした抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の結果を、抗ＰＤ−１抗体のＦｃ領域と関連させて示した。 ヒトモノクローナル抗ＰＤ−１抗体がヒト活性化Ｔ細胞をＣＤＣ濃度依存的に死滅させないことを明らかにした補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイの結果を示した。

本発明は、一面において、ＰＤ−１に特異的に結合する単離したモノクローナル抗体、特に、ヒトモノクローナル抗体に関する。ある態様において、本発明の抗体は、ＰＤ−１に対する高親和性結合、他のＣＤ２８ファミリーメンバーに対する交差反応性の欠如、Ｔ細胞増殖刺激能、混合リンパ球反応におけるＩＦＮ−γおよび／またはインターロイキン−２（ＩＬ−２）分泌を刺激する能力、１個以上のＰＤ−１リガンド（例えば、ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２）の結合阻害能力、カニクイザルＰＤ−１との交差反応能力、抗原特異的記憶応答を刺激する能力、抗体応答刺激能力および／またはインビボにおける腫瘍細胞増殖阻害能力のような１個以上の望ましい機能的性質を有している。さらにまたはこれとは別に、本発明の抗体は、特定の重鎖および軽鎖生殖細胞型配列に由来しているかおよび／または特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域のような特定の構造的特徴を有している。別の面において、本発明は、ＰＤ−１に特異的に結合するモノクローナル抗体とＣＴＬＡ−４に特異的に結合するモノクローナル抗体の併用に関する。

本発明は、例えば、単離抗体、当該抗体を作製する方法、当該抗体を含む免疫複合物および二重特異性分子、および本発明の当該抗体、免疫複合物または二重特異性分子を含有する薬剤組成物を提供する。

別の面において、本発明は、抗ＰＤ−１抗体を用いて被験者における腫瘍細胞増殖を阻害する方法に関する。本文に明らかにしたように、抗ＰＤ−１抗体は、インビボにおいて腫瘍細胞増殖を阻害できる。本発明は、また、免疫応答調節ならびに癌または感染性疾患のような疾患治療または防御的自己免疫応答刺激または（例えば、問題の抗原とともに抗ＰＤ−１抗体を同時投与することによって）抗原特異的免疫応答を刺激するための当該抗体を用いた方法に関する。

本発明をさらに容易に理解できるようにするため、用語を最初に定義する。詳細な説明において、追加の定義を述べる。

用語“Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ １”、“Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ １”、“タンパク質ＰＤ−１”、“ＰＤ−１”、“ＰＤ１”、“ＰＤＣＤ１”、“ｈＰＤ−１”および“ｈＰＤ−１”は、相互に交換使用され、ヒトＰＤ−１の改変体、アイソフォーム、種ホモログ、およびＰＤ−１と少なくとも１個の共通エピトープを有するアナログを含む。完全なＰＤ−１配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ６４８６３で同定される。

用語“細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原−４”、“ＣＴＬＡ−４”、“ＣＴＬＡ４”、“ＣＴＬＡ−４抗原”および“ＣＤ１５２”（例えば、Ｍｕｒａｔａ，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９９９）１５５：４５３−４６０を参照）は、相互に交換使用され、ヒトＣＴＬＡ−４の改変体、アイソフォーム、種ホモログ、およびＣＴＬＡ−４と少なくとも１個の共通エピトープを有するアナログを含む。完全なＣＴＬＡ−４配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ１５００６で同定される（例えば、Ｂａｌｚａｎｏ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ．（１９９２）７：２８−３２を参照）。

用語“免疫応答”とは、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、およびそれら細胞または肝臓によって産生された可溶性巨大分子（抗体、サイトカインおよび補体を含む）の作用を称し、その結果、病原体感染、細胞若しくは病原体に侵された組織、癌性細胞の人体からの選択的傷害、その破壊若しくは撲滅、または自己免疫若しくは病原性炎症の場合には、正常ヒト細胞若しくは組織の選択的傷害、破壊または撲滅が起こる。

“シグナル伝達経路”とは、細胞のある部分から細胞の別の部分への信号伝達において役割を果たしている様々なシグナル伝達分子間の生化学的関係を称している。本文では、“細胞表面レセプター”という文言には、例えば、細胞の形質膜を横断して信号を受けとり、この信号を伝達できる分子および分子の複合体が含まれるものとして使用する。本発明の“細胞表面レセプター”の場合には、ＰＤ−１レセプターがある。

用語“抗体”は、本文では、全長抗体およびそのいかなる抗原結合断片（すなわち、“抗原結合部分”）またはその一重鎖を含むものとして使用する。“抗体”は、ジスルフィド結合で連結された少なくとも２個の重鎖（Ｈ）と２個の軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質またはその抗原結合部分を称する。各重鎖は、重鎖可変領域（本文においてＶ_Ｈと略す。）と重鎖定常領域とから構成されている。重鎖定常領域は、３個のドメインＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３から構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本文においてＶ_Ｌと略す。）と軽鎖定常領域から構成されている。軽鎖定常領域は、１個のドメインＣ_Ｌで構成されている。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される変異性の高い領域に小分割され、それらには、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されより保存性の高い領域が散在している。各Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、３個のＣＤＲと４個のＦＲで構成され、下記の順序、すなわち、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置されている。当該重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含んでいる。抗体の定常領域は、イムノグロブリンの宿主組織または因子への結合を媒介でき、それらには、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および旧来の補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）が含まれる。

ここで用いられる抗体の“抗原結合部分”（または、単に“抗体部分”）という用語は、本文において、特異的に抗原（例えば、ＰＤ−１）に結合する能力を保持する抗体の１個以上の断片を称するものとして使用する。抗体の抗原結合機能が全長抗体の断片によって行われることが明らかとなっている。抗体の“抗原結合部分”という用語に含まれる結合断片の例として、（ｉ）Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_ＬおよびＣ_Ｈ１ドメインから構成される１価の断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域中ジスルフィド架橋で結合した２個のＦａｂ断片を含む２価の断片であるＦ（ａｂ´）_２断片、（ｉｉｉ）Ｖ_ＨおよびＣ_Ｈ１ドメインから構成されるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体のシングルアームのＶ_ＬおよびＶ_Ｈドメインで構成されるＦｖ断片、（ｖ）Ｖ_Ｈドメインから構成されるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）、および（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに、Ｆｖ断片の２個のドメインであるＶ_ＬおよびＶ_Ｈは別々の遺伝子によりコードされているが、それらは、組み換え技術を用いてそれらを単一タンパク質鎖として作製できる合成リンカーにより連結でき、この鎖中では、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域が対となって１価の分子を形成する（単一鎖のＦｖ（ｓｃＦｖ）。Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３）。このような単一鎖の抗体も、抗体の“抗原結合部分”という用語に含まれる。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、当該断片について、未改変抗体の場合と同様に有用性を求めてスクリーニングされる。

ここでは、“単離抗体”とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を称する（例えば、ＰＤ−１に特異的に結合するが、ＰＤ−１以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）ものとして使用する。しかし、ＰＤ−１に特異的に結合する単離抗体は、他の種由来のＰＤ−１のような他の抗原に対する交差反応性を有することもある。さらに、単離抗体は、実質的に他の細胞性物質および／または化学物質を含まない。

ここでの“モノクローナル抗体”または“モノクローナル抗体組成物”という用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を称するものとして使用する。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一結合特異性と親和性を示す。

ここでの“ヒト抗体”という用語とは、フレームワークとＣＤＲ領域の両方ともにヒト生殖細胞型免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むものとして使用する。さらに、もし抗体が定常領域を含むならば、この定常領域もヒト生殖細胞型イムノグロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞型イムノグロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロにおけるランダムまたは部位特異的変異誘発またはインビボにおける体細胞変異により導入される変異）も含むものとする。しかし、ここでは、“ヒト抗体”という用語は、マウスのような別の哺乳種の生殖細胞型に由来するＣＤＲ配列をヒトフレームワーク配列上に融合させた抗体も含むことを意図していない。

“ヒトモノクローナル抗体”という用語は、単一結合特異性を示す抗体を称し、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両者ともにヒト生殖細胞型イムノグロブイン配列に由来する可変領域を有している。１つの態様において、ヒトモノクローナル抗体は、例えば、形質転換マウスのような不死化細胞に融合させたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する形質転換非ヒト動物から得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。

ここでの“組み換えヒト抗体”という用語、（ａ）ヒトイムノグロブイン遺伝子のために形質転換またはトランス染色体されている動物（例えば、マウス）から単離された抗体、またはそれらから調製したハイブリドーマから単離した抗体（以下にさらに明記される）、（ｂ）ヒト抗体発現のために形質転換した宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離した抗体、（ｃ）組み換え、組み合わせヒト抗体ライブラリーから単離した抗体、および（ｄ）ヒトイムノグロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む他の全ての手段によって調製、発現、創製または単離した抗体のような組み換え手段によって、調製、発現、創製または単離した全てのヒト抗体を含む。このような組み換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ配列がヒト生殖細胞型イムノグロブリン配列に由来している可変領域を有している。しかし、ある態様においては、このような組み換えヒト抗体をインビトロ変異誘発処理（または、ヒトＩｇ配列のために形質転換処理した動物を使用する際には、インビボ体細胞変異誘発処理）に供することができ、したがって、組み換え抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域のアミノ酸配列はヒト生殖細胞型Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列に由来し、それに関連しているもののインビボでヒト抗体生殖細胞型レパートリ内部に天然には存在しないであろう配列である。

ここでの“アイソタイプ”とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を称するものとして使用する。

“抗原認識抗体”および“抗原特異的抗体”という用語は、ここで、用語“抗原に特異的に結合する抗体”と相互に使用する。

“ヒト抗体誘導体”という用語とは、ヒト抗体と別の物質または抗体との複合物のようなヒト抗体の全ての修飾形状を称する。

“ヒト化抗体”という用語は、マウスのような別の哺乳種の生殖細胞型に由来するＣＤＲ配列をヒトフレームワーク配列上に移植した抗体を称する。追加のフレームワーク領域改変も、ヒトフレームワーク配列内部で行うこともできる。

“キメラ抗体”という用語は、可変領域配列が１種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体を称し、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体である。

ここでは、“ヒトＰＤ−１に特異的に結合する”抗体とは、ヒトＰＤ−１に対してＫ_Ｄが１×１０^−７Ｍ以下、さらに好適には、Ｋ_Ｄが５×１０^−８Ｍ以下で結合し、さらに好適には、Ｋ_Ｄが１×１０^−８Ｍ以下で結合し、さらに好適には、Ｋ_Ｄが５×１０^−９Ｍ以下で結合する抗体を称するものとして使用する。

“Ｋ_{ａｓｓｏｃ}”または“Ｋ_ａ”という用語は、ここでは、特定抗体−抗原相互作用の結合速度を称し、一方、用語“Ｋ_ｄｉｓ”または“Ｋ_ｄ”は、ここでは、特定抗体−抗原相互作用の解離速度と称する。本文では、用語“Ｋ_Ｄ”は、当該解離速度と称するが、それは、“Ｋ_ａ”に対する“Ｋ_ｄ”の比率（すなわち、Ｋ_ｄ／Ｋ_ａ）から算出され、モル濃度（Ｍ）で表される。抗体のＫ_ｄ値は、当該技術で確立した手法により決定できる。抗体のＫ_Ｄ決定のための好適な方法は、表面プラズマ共鳴を用いることによって、好適にはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムのようなバイオセンサーシステムを用いることによる。

本文では、ＩｇＧ抗体についての用語“高親和性”とは、Ｋ_Ｄが１０^−８Ｍ以下、好適には１０^−９Ｍ以下、さらに好適には１０^−１０Ｍ以下の標的抗原に対するＫ_Ｄを有する抗体を称するものとして使用する。しかし、“高親和性”結合は、他の抗体アイソタイプに対しては変動する。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する“高親和性”結合は、Ｋ_Ｄが１０^−７Ｍ以下、さらに好適には１０^−８Ｍ以下、さらに好適には１０^−９Ｍ以下のＫ_Ｄを有する抗体を称する。

用語“治療”または“療法”は、症状（例えば、疾患）、その症状の兆候を治癒し、癒し、緩和し、軽減し、改善し、治療し、改善し、改良し若しくは処置するため、疾患の症状、合併症、生化学的指標の発生を予防しもしくは遅らせるため、またはそうでない場合には当該疾患、症状若しくは疾患のそれ以上の発生を統計的に有意に停止させるかもしくは阻害するために活性物質を投与することを称する。

ここでは、“有害事象”（ＡＥ）とは、医療を用いることに関連したすべての好ましくなくかつ一般的には故意でなく、さらには望ましくない症候（臨床検査所見異常を含む）、症状または疾患として使用する。例えば、有害事象とは、治療に応答しての免疫系の活性化または免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞）の拡大に関連していることもある。医療には１種以上のＡＥを伴うことがあり、各ＡＥは、重篤度が同一であることも異なることもある。“有害事象を改善できる”方法とは、異なる医療レジメ使用に関連した１種以上のＡＥの頻度および／または重篤度を低下させる医療レジメを意味する。

ここでは、“高増殖性疾患”とは、細胞増殖が正常レベルを超える状態を称するものとして使用する。例えば、高増殖性疾患または障害には、悪性疾患（例えば、食道癌、結腸癌、胆のう癌）および非悪性疾患（例えば、アテローム硬化症、良性過形成、良性前立腺肥大）が含まれる。

ここでは、“治療量以下”とは、高増殖性疾患（例えば、癌）治療に単独で投与した際治療化合物の通常量または典型的量よりも低い当該治療化合物（例えば、抗体）の投与量を意味するものとして使用する。例えば、ＣＴＬＡ−４抗体の治療量以下とは、抗ＣＴＬＡ−４抗体の公知量である約３ｍｇ／ｋｇ未満の抗体１回量を称するものとして使用する。

別のという意味の語句（例えば、“または”）を使用したときには、代替物のいずれかひとつ、両者またはそのいかなる組み合わせをも意味するものと理解する。本文では、不定冠詞“ａ”または“ａｎ”とは、全ての記述したまたは数え上げた成分の“１個以上”を称するものと理解されたい。

ここでは、“約”または“基本的に含む”とは、当業者が決定した特定値の許容可能な誤差範囲内部にあることを意味し、その値がどのようにして測定または決定されたか、すなわち、測定系の限界に部分的に依存する。例えば、“約”または“基本的に含む”とは、１または当技術で１回当たりの１標準偏差以上の範囲内であることを意味することができる。これとは別に、“約”または“基本的に含む”とは、２０％までの範囲を意味することもできる。さらに、生物系システムまたはプロセスに関する場合、特に、当該用語は、大きさが一桁大きいかまたは値の５倍までを意味することができる。特定値が明細書およびクレームで述べられており、他に断りがなければ、“約”または“基本的に含む”の意味は、その特定値の許容できる誤差範囲内部にあるとみなすべきである。

ここでは、全ての濃度範囲、百分率範囲、比率範囲または整数範囲は、記載の範囲内部の全ての整数値を含むものとみなすべきであり、他に断りがなければ、適当である場合には、その端数（整数の１０分の１とか１００分の１）も含む。

ここでは、“被験者”という用語は、全てのヒトまたは非ヒト動物を含むものとして使用する。用語“非ヒト動物”とは、非ヒト霊長、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生、爬虫等のような哺乳および非哺乳のような全ての脊椎動物を含む。断りがあるとき以外には、用語“患者”または“被験者”は相互交換して使用する。

本発明の様々な面を、さらに下記の細区分で詳細に説明する。

抗ＰＤ−１抗体
本発明の抗体は、抗体の特定の機能的特徴または性質によって特徴づけられる。例えば、当該抗体は、ＰＤ−１に特異的に結合する（例えば、ヒトＰＤ−１に結合し、カニクイザルのような他の種由来のＰＤ−１に交差反応できる）。好適には、本発明の抗体はヒトＰＤ−１に対してＫ_Ｄが１×１０^−７以下の高親和性で結合する。本発明の抗ＰＤ−１抗体は、好適には下記の性質を１個以上示す。
（ａ）Ｋ_Ｄが１×１０^−７Ｍ以下でヒトＰＤ−１に結合する。
（ｂ）ヒトＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４またはＩＣＯＳに実質的に結合しない。
（ｃ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいてＴ細胞増殖を上昇させる。
（ｄ）ＭＬＲアッセイにおいてインターフェロン−γ産生を増加させる。
（ｅ）ＭＬＲアッセイにおいてインターロイキン−２（ＩＬ−２）分泌を増加させる。
（ｆ）ヒトＰＤ−１およびカニクイザルＰＤ−１に結合する。
（ｇ）ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１に対する結合を阻害する。
（ｈ）抗原特異的記憶応答を刺激する。
（ｉ）抗体応答を刺激する。
（ｊ）腫瘍細胞増殖をインビボで阻害する。

好適には、当該抗体は、ヒトＰＤ−１に対してＫ_Ｄが５×１０^−８Ｍ以下で結合し、ヒトＰＤ−１に対してＫ_Ｄが１×１０^−８Ｍ以下で結合し、ヒトＰＤ−１に対してＫ_Ｄが５×１０^−９Ｍ以下で結合し、またはヒトＰＤ−１に対してＫ_Ｄ１×１０^−８Ｍ〜Ｋ_Ｄ１×１０^−１０Ｍで結合する。

本発明の抗体は、上記特徴のうちの２個、３個、４個または５個以上の上記特徴のいかなる組み合わせをも示すことができる。

ＰＤ−１抗体の結合能を評価するための標準的アッセイが当該技術で公知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよびＲＩＡを含む。当該抗体の結合動態（例えば、結合親和性）もまた、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）分析のような当該技術で公知の標準的アッセイによって評価できる。上述の特徴のいずれを評価するための適切なアッセイは、実施例において詳細に記載されている。

モノクローナル抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４
本発明の好適な抗体は、実施例１と２に述べたように単離および構造解析したヒトモノクローナル抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４である。１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４のＶ_Ｈアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３、４、５、６および７である。１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４のＶ_Ｌアミノ酸配列は、それぞれ配列番号８、９、１０、１１、１２、１３および１４である。

これらの抗体がそれぞれＰＤ−１に結合できるとすると、このＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列を“混合して適合させ”、本発明の他の抗ＰＤ−１結合分子を作製できる。このような“混合適合させた”抗体のＰＤ−１結合は、上記に述べ実施例にも述べた結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって試験できる。好適には、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ鎖を混合適合させ、特定のＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ対由来のＶ_Ｈ配列を構造的に類似のＶ_Ｈ配列で置き換える。同様に、特定のＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ対由来のＶ_Ｌ配列を構造的に類似のＶ_Ｌ配列で置き換える。

したがって、一面において、本発明は、
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６および７から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域および
（ｂ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３および１４から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含み、抗体が、ＰＤ−１、好適には、ヒトＰＤ−１に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。

好適な重鎖および軽鎖組み合わせには：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域および
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含むか、または
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域および
（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含むか、または
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域および
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含むか、または
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域および
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含むか、または
（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域および
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含むか、または
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域および
（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含むか、または
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域および
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含む。

別の面において、本発明は、１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４またはその組み合わせの重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む抗体を提供する。１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４のＶ_ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１に示した。１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４のＶ_ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７および２８に示した。１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４のＶ_ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４および３５に示した。１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４のＶ_ＫＣＤＲ１のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３６、３７、３８、３９、４０、４１および４２に示した。１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４のＶ_ＫＣＤＲ２のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４３、４４、４５、４６、４７、４８および４９に示した。１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４のＶ_ＫＣＤＲ３のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号５０、５１、５２、５３、５４、５５および５６に示した。当該ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステム（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版、米国保健・保健省、ＮＩＨ発行、第９１−３２４２号）を用いて描いた。

これらの抗体のそれぞれがＰＤ−１に結合できることおよび抗原結合特異性が主にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域によって提供されるならば、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列とＶｋ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を“混合して適合させ”（すなわち、各抗体はＶ_Ｈ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とＶ_Ｋ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含まなければならないが、異なる抗体由来のＣＤＲを混合適合させることができる）本発明の他の抗ＰＤ−１結合分子を作製できる。このような“混合適合させた”抗体のＰＤ−１結合は、上記に述べ実施例にも述べた結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ビアコア分析）によって試験できる。好適には、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ配列を混合適合させ、特定のＶ_Ｈ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３は構造的に類似のＣＤＲ配列で置き換える。同様にＶ_ＫＣＤＲ配列を混合適合させ、特定のＶ_Ｋ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３は構造的に類似のＣＤＲ配列（）で置き換える。新規のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列をモノクロナール抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４についてここで開示したＣＤＲ配列由来の構造的に類似の配列で、１個以上のＶ_Ｈおよび／またはＶ_ＬＣＤＲ領域を置き換えることによって作製できることは当業者には明らかであろう。

したがって、別の態様において、本発明はさらに：
（ａ）配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７および２８から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４および３５から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号３６、３７、３８、３９、４０、４１および４２から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号４３、４４、４５、４６、４７、４８および４９から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｆ）配列番号５０、５１、５２、５３、５４、５５および５６から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含み、抗体がＰＤ−１に、好適にはヒトＰＤ−１に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。

好適な態様において、当該抗体は
（ａ）配列番号１５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号２９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および
（ｆ）配列番号５０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。

別の好適な態様において、当該抗体は
（ａ）配列番号１６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および
（ｆ）配列番号５１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。

さらに別の好適な態様において、当該抗体は
（ａ）配列番号１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および
（ｆ）配列番号５２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。

別の好適な態様において、当該抗体は
（ａ）配列番号１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および
（ｆ）配列番号５３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。

別の好適な態様において、当該抗体は
（ａ）配列番号１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２および
（ｆ）配列番号５４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。

特定の生殖細胞型配列を有する抗体
ある態様において、本発明の抗体は、特定の生殖細胞型重鎖イムノグロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および／または特定の生殖細胞型軽鎖イムノグロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。

例えば、好適な態様において、本発明は、ヒトＶ_Ｈ３−３３遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含み、抗体がＰＤ−１に、好適にはヒトＰＤ−１に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。別の好適な態様において、本発明は、ヒトＶ_Ｈ４−３９遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含み、抗体がＰＤ−１に、好適にはヒトＰＤ−１に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。さらに、好適な態様において、本発明は、ヒトＶ_ＫＬ６遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含み、抗体がＰＤ−１に、好適にはヒトＰＤ−１に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。さらに、別の好適な態様において、本発明は、ヒトＶ_ＫＬ１５遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含み、抗体がＰＤ−１に、好適にはヒトＰＤ−１に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。さらに、好適な態様において、本発明は、抗体が
（ａ）ヒトＶ_Ｈ３−３３または４−３９遺伝子（この遺伝子は、それぞれ配列番号７１または７３に記載のアミノ酸配列をコードする）の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含み、
（ｂ）ヒトＶ_ＫＬ６またはＬ１５遺伝子（この遺伝子は、それぞれ配列番号７２または７４に記載のアミノ酸配列をコードする）の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含み、
（ｃ）ＰＤ−１に特異的に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。

Ｖ_Ｈ３−３３およびＶ_ＫＬ６のＶ_ＨおよびＶ_Ｋをそれぞれ有する抗体の例としては、１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４および７Ｄ３である。Ｖ_Ｈ４−３９とＶ_ＫＬ１５のＶ_ＨおよびＶ_Ｋをそれぞれ有する抗体例は、４Ａ１１および５Ｆ４である。

ここでは、ヒト抗体は、この抗体の可変領域がヒト生殖細胞型イムノグロブリン遺伝子を用いるシステムから得られるならば、特定の生殖細胞型配列の“産物”であるかまたは“それに由来する”重鎖または軽鎖可変領域を含む。このようなシステムには、ヒトイムノグロブイン遺伝子を有する形質転換マウスを問題の抗原で免疫するかまたはファージディスプレイヒトイムノグロブリン遺伝子ライブラリーを問題の抗原でスクリーニングすることを含む。ヒト生殖細胞型イムノグロブイン配列の“産物”であるかまたは“それに由来する”ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞型イムノグロブリンのアミノ酸配列と比較し、配列上ヒト抗体配列に最も近い（即ち最大同一性％）ヒト生殖細胞型イムノグロブリン配列を選択することによって、そのものとして同定できる。ヒト生殖細胞型イムノグロブイン配列の“産物”であるかまたは“それに由来する”ヒト抗体は、例えば、天然の体細胞変異または意図的な部位特異的変異導入によって、生殖細胞型配列と比較して相違するアミノ酸を含有することもできる。しかし、選択したヒト抗体は典型的には、アミノ酸配列上、ヒト生殖細胞型イムノグロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、他の種（例えば、マウス生殖細胞型配列）の生殖細胞型イムノグロブインアミノ酸配列と比較した際、ヒトのものであるとヒト抗体を特定するアミノ酸残基を含んでいる。ある場合には、ヒト抗体は、少なくともアミノ酸配列上、ヒト生殖細胞型イムノグロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるかまたは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であることもある。典型的には、特定のヒト生殖細胞型配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖細胞型イムノグロブイン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と１０個以下のアミノ酸の相違を示す。ある場合には、当該ヒト抗体は、ヒト生殖細胞型イムノグロブイン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と５個以下、または４、３、２または１個以下のアミノ酸差を示す。

相同抗体
さらに別の態様において、本発明の抗体は、ここに記載の好適な抗体のアミノ酸配列に相同のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、当該抗体は、本発明の抗ＰＤ−１抗体の望ましい機能的性質を保持している。

例えば、本発明は、
（ａ）重鎖可変領域は、配列番号１、２、３、４、５、６および７から構成される群から選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも８０％相同のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域は、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３および１４から構成される群から選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも８０％相同のアミノ酸配列を含み、当該抗体が下記の性質：
（ｃ）Ｋ_Ｄ１×１０^−７Ｍ以下でヒトＰＤ−１に結合する、
（ｄ）ヒトＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４またはＩＣＯＳに実質的に結合しない、
（ｅ）ＭＬＲアッセイにおいてＴ細胞増殖を増大させる、
（ｆ）ＭＬＲアッセイにおいてインターフェロン−γ産生を増加させる、
（ｇ）ＭＬＲアッセイにおいてＩＬ−２分泌を増加させる、
（ｈ）ヒトＰＤ−１およびカニクイザルＰＤ−１に結合する、
（ｉ）ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１に対する結合を阻害する、
（ｊ）抗原特異的記憶応答を刺激する、
（ｋ）抗体応答を刺激する、
（ｌ）腫瘍細胞増殖をインビボで阻害する、
のうちの１個以上を示す重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。

他の態様において、Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌアミノ酸配列は、上述の配列に対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相同であってもよい。上述の配列のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域に対して高い（すなわち、８０％以上）相同性を有するＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域を有する抗体は、配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９および７０をコードする核酸分子の変異誘発性（例えば、部位特異的またはＰＣＲ媒介性変異誘発性）によって得ることができ、その後、機能（すなわち、上記（ｃ）から（ｌ）に記載の機能）保持については、ここに説明した機能的アッセイを用いて、コードされた改変抗体を試験する。

本文に述べたように、２つのアミノ酸配列間の相同性百分率は、その２つの同一性百分率と同じである。２つの配列間の同一性百分率は、その２つの配列を最適に配列させるために導入する必要のあるギャップ数および各ギャップの長さを考慮して、当該配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、相同性％＝＃同一位置の数／＃総位置数×１００）。配列比較と２つの配列の同一性百分率の決定は、下記の非限定的な事例に述べたように、数学的アルゴリズムを用いて達成できる。

２個のアミノ酸配列の同一性百分率は、ＡＬＩＧＮプログラムに取り入れたＥ．ＭｅｙｅｒｓとＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズムを用いて、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティと４のギャップペナルティを用いて決定できる。さらに、２つのアミノ酸配列の同一性百分率は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（1151649245004_0で入手可能）においてＧＡＰプログラムに取り入れたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズムを用いて、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５または６の長さ重みを用いて決定できる。

さらにまたはこれとは別に、本発明のタンパク質配列は、公表されたデータベースに対してサーチを行うための“クエリー配列”としてさらに用い、例えば、関連配列の同定のために使用することができる。このようなサーチは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＸＢＬＡＳＴプログラム（ヴァージョン２．０）を用いて実行できる。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチは、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３を用いて実行して、本発明の抗体分子に相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためギャップ付きのアラインメントを得るため、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載のように用いることができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる際、それぞれのプログラム（例 ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用できる（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照）。

保存的修飾体を有する抗体
ある態様において、本発明の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域とＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで、これらのＣＤＲ配列の１つ以上は、ここに記載の好適な抗体に基づく特定のアミノ酸配列（例えば、１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３または５Ｆ４）またはその保存的修飾体を含み、かつ、当該抗体は、本発明の抗ＰＤ−１抗体の望ましい機能的性質を保持している。したがって、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域とＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、
（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４および３５のアミノ酸配列およびその保存的修飾体から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号５０、５１、５２、５３、５４、５５および５６のアミノ酸配列およびその保存的修飾体から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含み、
抗体が下記の性質：
（ｃ）抗体が、Ｋ_Ｄ１×１０^−７Ｍ以下でヒトＰＤ−１に結合する、
（ｄ）抗体が、ヒトＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４またはＩＣＯＳに実質的に結合しない、
（ｅ）抗体が、ＭＬＲアッセイにおいてＴ細胞増殖を上昇させる、
（ｆ）抗体が、ＭＬＲアッセイにおいてインターフェロン−γ産生を増加させる、
（ｇ）抗体が、ＭＬＲアッセイにおいてＩＬ−２分泌を増加させる、
（ｈ）抗体が、ヒトＰＤ−１およびカニクイザルＰＤ−１に結合する、
（ｉ）抗体が、ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１に対する結合を阻害する、
（ｊ）抗体が、抗原特異的記憶応答を刺激する、
（ｋ）抗体が、抗体応答を刺激する、
（ｌ）抗体が、腫瘍細胞増殖をインビボで阻害する、
のうちの１個以上を示す単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。

好適な態様において、当該重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７および２８のアミノ酸配列およびその保存的修飾体から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含み、当該軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号４３、４４、４５、４６、４７、４８および４９のアミノ酸配列およびその保存的修飾体から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含む。別の好適な態様において、当該重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１のアミノ酸配列およびその保存的修飾体から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含み；当該軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、４１および４２のアミノ酸配列およびその保存的修飾体から構成される群から選択されたアミノ酸配列を含む。

ここでは、“保存配列修飾”とは、当該アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意な影響を及ぼさないかまたは改変しないアミノ酸修飾を称するものとして使用する。このような保存的修飾体には、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾は、本発明の抗体に、部位特異的変異およびＰＣＲ媒介性変異のような当該技術で公知の標準的手法により導入できる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸で置き換えることをいう。類似側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、当該技術で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内部の１つ以上のアミノ酸残基は、同一側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置き換えることができ、改変した抗体は、本文に述べた機能的アッセイを用いて保持機能（すなわち、上記の（ｃ）から（ｌ）に述べた機能）について試験できる。

本発明の抗ＰＤ−１抗体と同一エピトープに結合する抗体
別の態様において、本発明は、本発明のＰＤ−１モノクローナル抗体のいずれかと同一のヒトＰＤ−１上エピトープに結合する抗体（すなわち、本発明のモノクローナル抗体のいずれかとＰＤ−１結合を交差競合する能力を有する抗体）を提供する。好適な態様において、交差競合研究の参考抗体は、モノクローナル抗体１７Ｄ８（それぞれ配列番号１および８に示したようなＶ_ＨおよびＶ_Ｌを有する）、またはモノクローナル抗体２Ｄ３（それぞれ配列番号２および９に示したようなＶ_ＨおよびＶ_Ｌを有する）、またはモノクローナル抗体４Ｈ１（それぞれ配列番号３および１０に示したようなＶ_ＨおよびＶ_Ｌを有する）、またはモノクローナル抗体５Ｃ４（それぞれ配列番号４および１１に示したようなＶ_ＨおよびＶ_Ｌを有する）、またはモノクローナル抗体４Ａ１１（それぞれ配列番号５および１２に示したようなＶ_ＨおよびＶ_Ｌを有する）、またはモノクローナル抗体７Ｄ３（それぞれ配列番号６および１３に示したようなＶ_ＨおよびＶ_Ｌを有する）、またはモノクローナル抗体５Ｆ４（それぞれ配列番号７および１４に示したようなＶ_ＨおよびＶ_Ｌを有する）であってもよい。このような交差競合性抗体は、標準的なＰＤ−１結合アッセイにおいて１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３または５Ｆ４と交差競合する能力に基づいて同定できる。例えば、ビアコア分析、ＥＬＩＳＡアッセイまたはフローサイトメトリーを用いて、本発明の抗体との交差競合を明らかにすることもできる。ヒトＰＤ−１に対する１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３または５Ｆ４の結合を阻害する試験抗体の能力は、試験抗体がヒトＰＤ−１に対する結合を１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３または５Ｆ４と競合でき、従って、１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１と同一のヒトＰＤ−１上エピトープに結合することを明らかにする。好適な態様において、１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３または５Ｆ４と同一のヒトＰＤ−１上エピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体は、実施例に記載のようにして調製して単離できる。

工学的に作製しかつ修飾した抗体
本発明の抗体は、修飾抗体を工学的に作製するための出発物質として、ここに開示した１つ以上のＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列を有する抗体を用いて調製でき、ここで、当該修飾抗体は、当該出発物質から改変された性質を有することがある。抗体は、１つ以上の可変領域（すなわち、Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ）内部、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域内部および／または１つ以上のフレームワーク領域内部の１つ以上の残基を修飾することによって工学的に作製できる。さらにまたはこれとは別に、抗体は、例えば、抗体のエフェクター機能を改変するために定常領域内部の残基を修飾することによって工学的に作製できる。

実施可能な可変領域エンジニアリングの一つの例は、ＣＤＲグラフトである。抗体は、主に６個の重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に局在するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内部のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外部の配列よりもそれぞれの抗体間でより多様性が高い。ＣＤＲ配列はほとんどの抗原抗体相互作用に関与しているので、異なる性質を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列に移植した特定の天然抗体由来ＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、この特定の天然抗体の性質を模倣する組み換え抗体を発現させることが可能である（例 Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ、Ｌ．ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７、Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５、Ｑｕｅｅｎ，Ｃ．ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｅ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許５，２２５、５３９およびＱｕｅｅｎらの米国特許５，５３０，１０１，５，５８５，０８９，５，６９３，７６２および６，１８０，３７０を参照）。

したがって、本発明の別の態様は、それぞれ配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１、配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７および２８、および配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４および３５から構成される群から選択したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、およびそれぞれ配列番号３６、３７、３８、３９、４０、４１および４２、配列番号４３、４４、４５、４６、４７、４８および４９および配列番号５０、５１、５２、５３、５４、５５および５６から構成される群から選択したアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。したがって、上記抗体は、モノクローナル抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３または５Ｆ４のＶ_ＨおよびＶ_ＬＣＤＲ配列を含むが、これらの抗体と異なるフレームワーク配列も含むことができる。

このようなフレームワーク配列は、公表されたＤＮＡデータベースまたは生殖細胞型抗体遺伝子配列を含む公表された文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子についての生殖細胞型ＤＮＡ配列は、“ＶＢａｓｅ”ヒト生殖細胞型配列データベース（インターネットでｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅから入手可能）ならびにＫａｂａｔ，Ｅ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国健康およびヒトサービス部、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．ら（１９９２）“Ｔｈｅ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ Ｖ_Ｈ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａｂｏｕｔ Ｆｉｆｔｙ Ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ Ｖ_Ｈ Ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｌｏｏｐｓ”、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；およびＣｏｘ，Ｊ．Ｐ．Ｌ．ら（１９９４）“Ａ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ Ｖ_Ｈ Ｓｅｇｍｅｎｔｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａ Ｓｔｒｏｎｇ Ｂｉａｓ ｉｎ ｔｈｅｉｒ Ｕｓａｇｅ”，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６；それらのそれぞれの内容は、本文で参考として引用している。別の例として、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞型ＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース中で同定できる。例えば、ＨＣｏ７ ＨｕＭＡｂマウス中で認められる下記の重鎖生殖細胞型配列は、１−６９（ＮＧ＿００１０１０９、ＮＴ＿０２４６３７およびＢＣ０７０３３３）、３−３３（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）および３−７（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）の付属ＧｅｎＢａｎｋ登録番号で入手可能である。別の例として、ＨＣｏ１２ ＨｕＭＡｂマウス中で見られる下記の重鎖生殖細胞型配列は、１−６９（ＮＧ＿００１０１０９、ＮＴ＿０２４６３７およびＢＣ０７０３３３）、５−５１（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）、４−３４（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）、３−３０．３（ＡＪ５５６６４４）および３−２３（ＡＪ４０６６７８）の付属ＧｅｎＢａｎｋ登録番号で入手可能である。

本発明の抗体における使用に好適なフレームワーク配列は、本発明の選択抗体によって使用されたフレームワーク配列に構造的に類似するものであり、例えば、本発明の好適なモノクローナル抗体において用いられたＶ_Ｈ３−３３フレームワーク配列（配列番号７１）および／またはＶ_Ｈ４−３９フレームワーク配列（配列番号７３）および／またはＶ_ＫＬ６フレームワーク配列（配列番号７２）および／またはＶ_ＫＬ１５フレームワーク配列（配列番号７４）に類似である。Ｖ_Ｈ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列およびＶ_Ｋ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖細胞型イムノグロブリン遺伝子に認められるものと同一の配列を有するフレームワーク領域に移植でき、または当該ＣＤＲ配列は、当該生殖細胞型配列と比較して１つ以上の変異を含むフレームワーク領域に移植できる。例えば、ある場合において、フレームワーク領域内部の残基を変異させ、当該抗体の抗原結合能力を保持するかまたは増強することが有益であることが見出されている（例えば、Ｑｕｅｅｎらの米国特許５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６２および６，１８０，３７０を参照）。

別のタイプの可変領域の修飾としては、Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_Ｋ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内部のアミノ酸残基を変異させ、それによって問題の抗体の１つ以上の結合性質を改善させることである。部位特異的変異またはＰＣＲ媒介性変異を実施して変異を導入でき、抗体結合または問題の他の機能的性質に及ぼす効果を、インビトロまたはインビボアッセイでここに述べたようにおよび実施例に述べたようにして評価できる。好適には、（上記に述べたような）保存的修飾体を導入する。当該変異は、アミノ酸置換、付加または欠失であるが、好適には置換である。さらに、典型的には、ＣＤＲ領域内の１個以下、２個以下、３個以下、４個以下または５個以下の残基を改変する。

したがって、別の態様において、本発明は、（ａ）配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１から構成される群から選択されたアミノ酸配列または配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ１領域、（ｂ）配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７および２８から構成される群から選択されたアミノ酸配列または配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７および２８と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ２領域、（ｃ）配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４および３５から構成される群から選択されたアミノ酸配列または配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４および３５と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ３領域、（ｄ）配列番号３６、３７、３８、３９、４０、４１および４２から構成される群から選択されたアミノ酸配列または配列番号３６、３７、３８、３９、４０、４１および４２と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_ＫＣＤＲ１領域、（ｅ）配列番号４３、４４、４５、４６、４７、４８および４９から構成される群から選択されたアミノ酸配列または配列番号４３、４４、４５、４６、４７、４８および４９と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_ＫＣＤＲ２領域；および（ｆ）配列番号５０、５１、５２、５３、５４、５５および５６から構成される群から選択されたアミノ酸配列または配列番号５０、５１、５２、５３、５４、５５および５６と比較して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶ_ＫＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を含む単離抗ＰＤ−１モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。

工学的に作製した本発明の抗体には、例えば、抗体の性質を改良するためにＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｋ内部のフレームワーク残基に修飾を行ったものを含む。典型的には、このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を減ずるために行われる。例えば、ひとつの手法は、生殖細胞型配列に対応する１個以上のフレームワーク残基を“バック変異”させる。さらに詳細には、体細胞変異を受けた抗体は、抗体が由来する生殖細胞型配列と異なるフレームワーク残基を含むことができる。このような残基は、抗体が由来する生殖細胞型配列に対して抗体フレームワーク配列を比較することによって識別できる。

例えば、下記の表１は、重鎖親生殖細胞型配列と異なる抗ＰＤ−１抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４のフレームワーク領域中におけるアミノ酸変化数を示している。フレームワーク領域配列中の１個以上のアミノ酸残基をそれらの生殖細胞型配置に戻すため、体細胞変異を、例えば、部位特異的変異誘発またはＰＣＲ媒介性変異誘発によって、生殖細胞型配列に“バック変異”させることができる。

アミノ酸変化は、軽鎖親生殖細胞型配列と異なる抗ＰＤ−１抗体のフレームワーク領域中でも起こりうる。例えば、１７Ｄ８について、Ｖｋのアミノ酸残基＃４７（ＦＲ２内部）はイソロイシンであるが、一方、対応するＶ_ＫＬ６生殖細胞型配列におけるこの残基はロイシンである。フレームワーク領域配列をそれらの生殖細胞型配置に戻すため、体細胞変異を、例えば、部位特異的変異誘発またはＰＣＲ媒介性変異（例えば、１７Ｄ８のＶ_Ｋの残基＃４７（ＦＲ２の＃１３）は、イソロイシンからロイシンに“バック変異”させることができる）によって、生殖細胞型配列に“バック変異”させることができる。

別の例として、４Ａ１１について、Ｖｋのアミノ酸残基＃２０（ＦＲ１内部）はセリンであるが、一方、対応するＶ_ＫＬ１５生殖細胞型配列におけるこの残基はスレオニンである。フレームワーク領域配列をそれらの生殖細胞型配置に戻すため、例えば、４Ａ１１のＶ_Ｋの残基＃２０をセリンからスレオニンに“バック変異”させることができる。このような“バック変異”抗体も、本発明に包含するものとしている。

１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４および７Ｄ３についてのＶ_Ｈ領域の親生殖細胞型Ｖ_Ｈ３−３３配列に対する配置を図８に示した。４Ａ１１と５Ｆ４についての親生殖細胞型Ｖ_Ｈ４−３９配列に対するＶ_Ｈ領域の配置を図１１に示した。

別のタイプのフレームワーク修飾では、当該フレームワーク領域内部の１個以上の残基または１個以上のＣＤＲ領域内部の１個以上の残基を変異させ、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって抗体の潜在的免疫原性を低下させることが必要である。この手法は“脱免疫”とも称され、さらに詳細には、Ｃａｒｒらによる米国特許公報２００３０１５３０４３に記載されている。

フレームワークまたはＣＤＲ領域内部に作製した修飾に加えて、またはそれとは別に、本発明の抗体を工学的に処理し、Ｆｃ領域内部に修飾を行い、典型的には、血清半減期、補体固定、Ｆｃレセプター結合および／または抗原依存性細胞傷害性のような１個以上の抗体の機能的特徴を改変する。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾でき（例えば、１個以上の化学成分を当該抗体に付加できる）、または修飾してそのグリコシル化を改変させ、また、抗体の１個以上の機能的特徴を改変させることもできる。これらのそれぞれの態様を、さらに下記で詳細に説明する。Ｆｃ領域中の残基の数字は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの数字である。

一つの態様において、ＣＨ１のヒンジ領域をヒンジ領域中のシステイン残基数を、例えば、増加させるかまたは低下させるなど改変させるように修飾する。この手法は、さらにＢｏｄｍｅｒらの米国特許５，６７７，４２５に記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基数を改変し、例えば、軽鎖および重鎖の集合を促進させるかまたは抗体安定性を増すかあるいは減じる。

別の態様において、抗体の生物学的半減期を短くするため、抗体のＦｃヒンジ領域を変異させる。さらに詳細には、抗体が天然のＦｃヒンジドメインＳｐＡ結合に比較して、不完全なブドウ球菌タンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合を持つように、１個以上のアミノ酸変異をＦｃヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入する。この手法は、Ｗａｒｄらの米国特許６，１６５，７４５に詳細に記載されている。

別の態様において、当該抗体を修飾して、その生物学的半減期を長くする。様々な手法が可能である。例えば、１個以上の下記変異：Ｗａｒｄの米国特許６，２７７，３７５に記載のようなＴ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆを導入できる。これとは別に、Ｐｒｅｓｔａらの米国特許５，８６９，０４６および６，１２１，０２２に記載されているとおり、生物学的半減期を長くするため、ＣＨ１またはＣＬ領域内部で抗体を改変し、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２個のループから取ったサルベージレセプター結合エピトープを含ませる。

さらに他の態様において、Ｆｃ領域を、少なくとも１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換え改変し、抗体のエフェクター機能を改変する。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択した１個以上のアミノ酸を、抗体がエフェクターリガンドに対して改変された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能は保持するように、異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。親和性を改変したエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃレセプターまたは補体のＣ１成分であってもよい。この手法は、両者ともにＷｉｎｔｅｒらの米国特許５，６２４，８２１および５，６４８，２６０に詳細に記載されている。

別の態様において、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択した１個以上のアミノ酸を、抗体が改変されたＣ１ｑ結合および／または低下若しくは停止した補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を有するように異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。この手法は、さらに詳細に、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらの米国特許６，１９４，５５１に記載されている。

別の例において、アミノ酸位置２３１および２３９内部の１個以上のアミノ酸残基を改変し、それによって抗体の補体固定能力を改変する。この手法は、さらに詳細に、ＢｏｄｍｅｒらのＰＣＴ公報ＷＯ９４／２９３５１に記載されている。

さらに別の例において、Ｆｃ領域を修飾して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増加させるかおよび／または下記の２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９の位置にある１個以上のアミノ酸を修飾することによって、Ｆｃγレセプターに対する抗体の親和性を増加させる。この手法は、Ｐｒｅｓｔａにより、ＰＣＴ公報ＷＯ００／４２０７２にさらに説明されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対する結合部位は、マップに示されており、改良された結合を有する改変体も記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７６：６５９１−６６０４を参照）。２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９の位置における特異的変異がＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改善することが示されている。さらに、下記のＴ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａの組み合わせ変異体がＦｃγＲＩＩＩ結合を改善することが示されている。

さらに別の態様において、抗体をグリコシル化修飾する。例えば、非グリコシル化抗体を作製できる（すなわち、当該抗体はグリコシル化を欠いている）。グリコシル化改変は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を高めることができる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内部の１個以上のグリコシル化部位を改変することによって達成できる。例えば、１個以上のアミノ酸置換を作製し、その結果、１個以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位を消失させ、それによってその部位でのグリコシル化を消失させる。このような非グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を高めることができる。このような手法は、さらに詳細に、Ｃｏらによる米国特許５，７１４，３５０および６，３５０，８６１に記載されている。

さらにまたはこれとは別に、フコシル残基量が少ない低フコシル化抗体または二分性ＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体のような改変されたタイプのグリコシル化を有する抗体を作製できる。このような改変グリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を高めることが明らかになっている。このような炭水化物修飾は、例えば、改変グリコシル化機構を有する宿主細胞中で抗体を発現させることによって達成できる。改変グリコシル化機構を有する細胞は先行技術で説明されており、本発明の組み換え抗体を発現させる宿主細胞として使用し、それによって改変グリコシル化を有する抗体を産生させる。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８α（１，６）フコシルトランスフェラーゼを欠失しており、ＭＳ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９細胞株で発現した抗体がその炭水化物上にフコースを欠失している。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９のＦＵＴ８−／−細胞株は、２つのリプレイスメントベクター（Ｙａｍａｎｅらによる米国特許公報２００４０１１０７０４およびＹａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８７：６１４−２２を参照）を用いて、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞中でＦＵＴ８遺伝子を標的破壊することによって作製した。別の例として、ＨａｎａｉらによるＥＰ１，１７６，１９５は、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株を記載している。この遺伝子はフコシルトランスフェラーゼをコードしており、このような細胞株中で発現した抗体は、α １，６結合関連酵素の減少または消失によって低フコシル化を示している。Ｈａｎａｉらは、抗体のＦｃ領域に結合するかまたはその酵素活性を有していないＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加する酵素活性が低い細胞株、例えば、ラット骨髄細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２）についても述べている。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公報ＷＯ０３／０３５８３５には、フコースをＡｓｎ（２９７）結合炭水化物に結合させる能力が低下しており、その結果、その宿主細胞中で発現した抗体のフコシル化が低下することになる様々なＣＨＯ細胞やＬｅｃ１３細胞について記載されている（同様に、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０を参照）。ＵｍａｎａらによるＰＣＴ公報ＷＯ９９／５４３４２は、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）を発現するように工学的に作製した細胞株を記載しており、この工学的に作製した細胞株中で発現した抗体が、二分性ＧｌｃＮａｃ構造の増加を示し、その結果、抗体のＡＤＣＣ活性が増加することになる（同様に、Ｕｍａｎａら（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ． １７：１７６−１８０参照）。これとは別に、抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を用いて切断除去することができる。例えば、当該フコシダーゼ α−Ｌ−フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ，Ａ．Ｌ．ら（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ． １４：５５１６−２３）。

本発明で検討した抗体の別の修飾は、ＰＥＧ化である。抗体をＰＥＧ化し、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清中）半減期を長くすることができる。抗体をＰＥＧ化するため、抗体またはその断片を通常、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体のようなポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と１個以上のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に結合するようになる条件化で反応させる。好適には、ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応により、実施する。ここでは、用語“ポリエチレングリコール”とは、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリルオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドのような他のタンパク質を誘導体化するために用いるいかなる形状のＰＥＧをも含むものとする。ある態様においてＰＥＧ化される抗体は非グリコシレーションされた抗体である。タンパク質ＰＥＧ化方法は、当該技術により公知であり、本発明の抗体にも適用できる。例えば、ＮｉｓｈｉｍｕｒａらによるＥＰ０１５４３１６およびＩｓｈｉｋａｗａらによるＥＰ０４０１３８４が参照できる。

抗体の工学的処理方法
上記にも述べたように、ここに開示したＶ_ＨおよびＶ_Ｋ配列を有する抗ＰＤ−１抗体を用いて、Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_Ｋ配列またはそれに結合した定常領域を修飾することによって、新しい抗ＰＤ−１抗体を作製できる。したがって、本発明の別の面において、本発明の抗ＰＤ−１抗体の構造的特徴、例えば、１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３または５Ｆ４を用いてヒトＰＤ−１に対する結合のような本発明の抗体の少なくとも一つの機能的特徴を保持する構造的に関連した抗ＰＤ−１抗体を作製できる。例えば、１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３または５Ｆ４またはその変異体の１個以上のＣＤＲ領域を公知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組み換えで組み合わせて、付加的な組み換え工学で作成された本発明の抗体を上述のように作製できる。他の修飾タイプには、前章で述べたものが含まれる。工学的方法の出発物質は、ここで提供したＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｋ配列の１個以上またはその１個以上のＣＤＲ領域である。工学的抗体を作製するため、Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_Ｋ配列の１個以上またはその１個以上のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製（すなわち、タンパク質として発現させる）する必要はない。むしろ、配列に含まれる情報を出発物質として用いて当初の配列に由来する“第二世代”配列を作製し、次に、この“第二世代”配列をタンパク質として調製し発現させる。

したがって、別の態様において、本発明は、
（ａ）（ｉ）配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１から構成される群から選択したＣＤＲ１配列、配列番号２２、２３、２４、２５、２６、２７および２８から構成される群から選択したＣＤＲ２配列、および／または配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４および３５から構成される群から選択したＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域抗体配列、および／または（ｉｉ）配列番号３６、３７、３８、３９、４０、４１および４２から構成される群から選択したＣＤＲ１配列、配列番号４３、４４、４５、４６、４７、４８および４９から構成される群から選択したＣＤＲ２配列、および／または配列番号５０、５１、５２、５３、５４、５５および５６から構成される群から選択したＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を提供すること、
（ｂ）重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列から選択した少なくとも１個の可変領域抗体配列内部の少なくとも１個のアミノ酸残基を改変し、少なくとも１個の改変抗体配列を作成すること；および
（ｃ）当該改変抗体配列をタンパク質として発現させること、
を含む抗ＰＤ−１抗体を調製する方法を提供する。

標準的な分子生物学的技術を用いて改変抗体配列を調製、発現できる。

好適には、改変抗体配列によってコードされた抗体は、ここに記載した抗ＰＤ−１抗体の機能的特徴の一つ、一部または全てを保持するものであり、その機能的特徴には下記が含まれるが、それらに限定されない。

（ａ）当該抗体は、Ｋ_Ｄが１×１０^−７Ｍ以下でヒトＰＤ−１に結合する。
（ｂ）当該抗体は、ヒトＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４またはＩＣＯＳに実質的に結合しない。
（ｃ）当該抗体は、ＭＬＲアッセイにおいてＴ細胞増殖を増大させる。
（ｄ）当該抗体は、ＭＬＲアッセイにおいてインターフェロン−γ産生を増加させる。
（ｅ）当該抗体は、ＭＬＲアッセイにおいてＩＬ−２分泌を増加させる。
（ｆ）当該抗体は、ヒトＰＤ−１およびカニクイザルＰＤ−１に結合する。
（ｇ）当該抗体は、ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１に対する結合を阻害する。
（ｈ）当該抗体は、抗原特異的記憶応答を刺激する。
（ｉ）当該抗体は、抗体応答を刺激する。
（ｊ）当該抗体は、腫瘍細胞増殖をインビボで阻害する。

改変抗体の機能的特徴は、先行技術が利用可能でおよび／またはここに記載した標準的アッセイ、例えば、実施例に述べたもの（例えば、フローサイトメトリ、結合アッセイ）を用いて評価できる。

本発明の抗体を工学的に作製する方法のある態様において、抗ＰＤ−１抗体コード配列の全体または一部に沿ってランダムにまたは選択的に変異を導入でき、生成した修飾抗ＰＤ−１抗体について、ここに記載したような結合活性および／または他の機能的特徴をスクリーニングできる。変異方法は先行技術に記載されている。例えば、ＳｈｏｒｔのＰＣＴ公報ＷＯ０２／０９２７８０は、飽和突然変異法、合成ライゲーション連結法またはそれらの組み合わせを用いて抗体変異を作製し、スクリーニングする方法を記載している。これとは別に、ＬａｚａｒらによるＰＣＴ公報ＷＯ０３／０７４６７９は、抗体の物理化学的性質を最適化するため、コンピュータによりスクリーニングする方法を用いる方法を記載している。

本発明の抗体をコードする核酸分子
本発明の別の面は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、細胞溶解物として、細胞全体または部分精製若しくは実質的に純粋な形状で存在できる。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌ結合、カラムクロマトグラフィ、アガロースゲル電気泳動およびその他当該技術の周知の方法を含む標準的技術によって、例えば、他の細胞性核酸またはタンパク質のような他の細胞性成分または他の夾雑物から精製して取り出す際に“単離される”かまたは“実質的に純粋にされる”。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、イントロン配列を含んでいてもよいし、含まなくてもよい。好適な態様において、当該核酸はｃＤＮＡ分子である。

本発明の核酸は、標準的な分子生物学的技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、さらに下記で説明するようなヒトイムノグロブリン遺伝子を有する形質転換マウスから調製したハイブリドーマ）発現抗体の場合には、ハイブリドーマ作製抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的ＰＣＲ増幅法またはｃＤＮＡクローニング技術によって得ることができる。イムノグロブリン遺伝子ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイ技術を用いて）得られた抗体の場合には、抗体をコードする核酸をライブラリーから回収できる。

本発明の好適な核酸分子は、１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３または５Ｆ４モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ配列をコードするものである。１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４のＶＨ配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２および６３で示される。１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４のＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号６４、６５、６６、６７、６８、６９および７０に示されている。

ＶＨおよびＶＬ部分をコードするＤＮＡ断片を一旦得ると、これらのＤＮＡ断片は、さらに、標準的な組み換えＤＮＡ技術によって処理し、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換できる。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域または可動性リンカーのような別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に適切に作用するように連結させる。ここで使われる用語“適切に作用するように連結する”とは、２つのＤＮＡ断片が、この２つのＤＮＡ断片でコードされるアミノ酸配列がインフレームの状態で結合することを意味する。

ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子にＶＨをコードするＤＮＡを適切に作用するように連結することによって全長重鎖遺伝子に変換できる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術において公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版、米国保健・保健省、ＮＩＨ発行、第９１−３２４２号を参照）、これらの領域を含むＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅法で得られる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であってもよいが、最も好適には、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子について、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に適切に作用するように連結できる。

ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子にＶＬをコードするＤＮＡを適切に作用するように連結することによって、全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換できる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術において公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版、米国保健・保健省、ＮＩＨ発行、第９１−３２４２号を参照）、これらの領域を網羅するＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅法によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κまたはλ定常領域であってもよいが、最も好適には、κ定常領域である。

ｓｃＦｖ遺伝子作製のため、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片は、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ_４−Ｓｅｒ）_３をコードする可動性リンカーをコードする別の断片に適切に作用するように連結させ、ＶＨおよびＶＬ配列を連続的な一重鎖タンパク質として発現できるようにし、ＶＬおよびＶＨ領域はこの可動性リンカーで結合されている（例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６、Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５、５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４参照）。

本発明のモノクローナル抗体作製
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、例えば、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５の標準的体細胞ハイブリダイゼーション技術のような従来のモノクローナル抗体方法を含む様々な手法によって作製できる。体細胞ハイブリダイゼーション操作が好適であるが、原則的には、モノクローナル抗体作製のための他の技術として、例えば、Ｂリンパ細胞のウイルス性または癌性形質転換を用いることができる。

ハイブリドーマ調製のための好適な動物は、マウスである。マウスにおけるハイブリドーマ産生は、非常に確立された操作である。免疫化プロトコールおよび免疫した融合用脾臓細胞単離のための技術は、当該技術において公知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄細胞）および融合操作も公知である。

本発明のキメラまたはヒト化抗体は、上記のように調製したマウスモノクローナル抗体配列に基づき調製できる。重鎖および軽鎖イムノグロブリンをコードするＤＮＡは、標準的な生物学的技術を用いて、問題のマウスハイブリドーマから得ることができ、工学的に処理した非マウス（例えば、ヒト）イムノグロブリン配列を含ませることができる。例えば、キメラ抗体作製のため、マウス可変領域を、当該技術において公知の方法を用いてヒト定常領域に連結させることができる（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらの米国特許４，８１６，５６７）。ヒト化抗体作製のため、マウスＣＤＲ領域を、当該技術において公知の方法を用いてヒトフレームワークに挿入できる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許５，２２５，５３９および米国特許５，５３０，１０１、Ｑｕｅｅｎらの米国特許５，５８５，０８９および６，１８０，３７０を参照）。

好適な態様において、本発明の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。ＰＤ−１に対して作製したヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりはむしろヒト免疫系部分を含む形質転換またはトランス染色体マウスを用いて産生させることができる。これらの形質転換およびトランス染色体マウスには、ここでＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウス（商標）とそれぞれ称したマウスが含まれ、本文で“ヒトＩｇマウス”と総称する。

ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ社）は、内因性μおよびκ鎖座（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９）を不活性化する標的変異とともに、非再配置ヒト重鎖（μおよびκ）およびκ軽鎖イムノグロブリン配列をコードするヒトイムノグロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含む。したがって、当該マウスは、マウスＩｇＭまたはκ発現低下を示し、免疫化に応答して、導入したヒト重鎖および軽鎖トランスジーンがクラススイッチングと体細胞変異を受け、高親和性のヒトＩｇＧκモノクローナルを産生する（Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎ．ら（１９９４）同上；Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎ．（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９−１０１中でレビュー、Ｌｏｂｅｒｇ，Ｎ．およびＨｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３：６５−９３およびＨａｒｄｉｎｇ，Ｆ．およびＬｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ７６４：５３６−５４６）。ＨｕＭａｂマウスの調製とその使用およびこのようなマウスが有するゲノム修飾は、さらに、Ｔａｉｌｏｒ，Ｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：３２８７−６２９５、Ｃｈｅｎ，Ｊ．ら（１９９３）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：６４７−６５６、Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３７２０−３７２４、Ｃｈｏｉら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１１７−１２３、Ｃｈｅｎ，Ｊ．ら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ． １２：８２１−８３０、Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：２９１２−２９２０、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ら（１９９４）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：５７９−５９１、およびＦｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１に記載されており、それらの全ての内容は、ここに、特に断ってその全文を参考として引用している。さらに、米国特許５，５４５，８０６、５，５６９，８２５、５，６２５，１２６、５，６３３，４２５、５，７８９，６５０、５，８７７，３９７、５，６６１，０１６、５，８１４，３１８、５，８７４，２９９および５，７７０，４２９を参照、全てＬｏｎｂｅｒｇとＫａｙによる、Ｓｕｒａｎｉらの米国特許５，５４５，８０７、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙのＰＣＴ公報ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７／１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ９９／４５９６２、およびＫｏｒｍａｎらのＰＣＴ公報ＷＯ０１／１４４２４を参照。

別の態様において、本発明のヒト抗体は、ヒト重鎖トランスジーンとヒト軽鎖トランス染色体を有するマウスのようなトランスジーンおよびトランス染色体上にヒトイムノグロブリン配列を有するマウスを用いて作製できる。本文でこのようなマウスを“ＫＭマウス（商標）”と称し、ＩｓｈｉｄａらのＰＣＴ公報ＷＯ０２／４３４７８に詳細に記載されている。

さらに、ヒトイムノグロブリン遺伝子を発現する別の形質転換動物システムは、公知技術により利用可能であり、本発明の抗ＰＤ−１抗体を作製するために使用できる。例えば、ゼノマウス（Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ）（Ａｂｇｅｎｉｘ社）と称されている別の形質転換系も用いることができ、このようなマウスは、例えば、米国特許５，９３９，５９８、６，０７５，１８１、６，１１４，５９８、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらの６，１５０，５８４および６，１６２，９６３に記載されている。

さらに、ヒトイムノグロブリン遺伝子を発現する別の形質転換動物システムは、公知技術により利用可能であり、本発明の抗ＰＤ−１抗体を作製するために使用できる。例えば、“Ｔｃマウス”）と称されているヒト重鎖トランス染色体とヒト軽鎖トランス染色体を両者ともに有するマウスも使用でき、このようなマウスは、Ｔｏｍｉｚｕｋａら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：７２２−７２７に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖トランス染色体を有するウシも先行技術において記載されており（Ｋｕｒｏｉｗａら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：８８９−８９４）、本発明の抗ＰＤ−１抗体作製に使用できる。

また、本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒトイムノグロブリン遺伝子ライブラリースクリーニングのためのファージディスプレイ方法を用いて調製できる。ヒト抗体単離のためのこのようなファージディスプレイ方法は、公知技術において確立されている。例えば、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許５，２２３，４０９、５，４０３，４８４および５，５７１，６９８、Ｄｏｗｅｒらの米国特許５，４２７，９０８および５，５８０，７１７、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらの米国特許５，９６９，１０８および６，１７２，１９７、およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓらの米国特許５，８８５，７９３、６，５２１，４０４、６，５４４，７３１、６，５５５，３１３、６，５８２，９１５および６，５９３，０８１を参照。

また、本発明のヒトモノクローナル抗体は、免疫によりヒト抗体応答が起こるように、ヒト免疫細胞を再構築したＳＣＩＤマウスを用いて調製できる。このようなマウスは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎらの米国特許５，４７６，９９６および５，６９８，７６７に記載されている。

ヒトＩｇマウスの免疫
ヒトＩｇマウスを用いて本発明のヒト抗体を作製する場合、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）；８５６−８５９、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１およびＰＣＴ公報ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ０１／１４４２４に記載されているようにして、精製または高含量のＰＤ−１抗原および／または組み換えＰＤ−１またはＰＤ−１融合タンパク質により、このようなマウスを免疫できる。好適には、６−１６週齢の当該マウスに対して最初の注入を行う。例えば、ＰＤ−１抗原の精製または組み換え調製物（５−５０μｇ）を用いて、腹腔中でヒトＩｇマウスに免疫できる。

ＰＤ−１に対する全長ヒトモノクローナル抗体を作製するための詳細な操作を、下記の実施例１に述べた。様々な抗原による累積的な経験により、完全フロイントアジュバントの抗原で最初に腹腔内（ＩＰ）免疫し、次に２週おきに不完全フロイントアジュバントの抗原でＩＰ免疫（最大６まで）した時、形質転換マウスが応答することが明らかにされている。しかし、フロイント以外のアジュバントも有効であることがわかる。さらに、アジュバントの非存在下において全細胞が極めて免疫原性が高いことがわかっている。この免疫応答を、眼窩後方出血により得られた血漿サンプルによる免疫化プロトコール過程でモニターできる。血漿は、ＥＬＩＳＡ（下記で述べたように）によりスクリーニングでき、十分な抗ＰＤ−１ヒトイムノグロブリン力価を有するマウスを融合に使用できる。マウスを、屠殺３日前に抗原を静注することでブーストし、脾臓を取り出した。各免疫化について２−３回融合を実施する必要がある。通常、６〜２４匹のマウスを各抗原について免疫する。通常、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２株の両者を使用する。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２トランスジーンの両者を、２つの異なるヒト重鎖導入遺伝子（ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２）を有する１匹のマウスで作製できる。これとは別に、またはこれに加えて、ＫＭマウス（商標）系統を、実施例１に記載のようにして使用できる。

本発明のヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
本発明のヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ作製のため、免疫したマウス由来の脾臓および／またはリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄細胞株のような適切な不死化細胞株に融合できる。得られたハイブリドーマについて、抗原特異的抗体の産生をスクリーニングできる。例えば、免疫したマウス由来の脾臓リンパ球の単細胞懸濁物を、５０％ＰＥＧにより、６分の１数のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８０）に融合できる。これとは別に、免疫したマウス由来の脾臓リンパ球の単細胞懸濁物を、サイトパルス大型チェンバー細胞融合エレクトロポレータ（Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ，ＭＤ）を用いて電場に基づく電気融合法により融合させることができる。細胞は、約２×１０^５で平底マイクロタイタープレートに播種し、２０％胎児クローン血清、１８％“６５３”調製培地、５％オリゲン（ＩＧＥＮ）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ ２−メルカプトメタノール、５０単位／ｍＬペニシリン、５０ｍｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍＬ ゲンタマイシンおよび１ｘＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ；ＨＡＴを、注入２４時間後に添加する）を含む選択培地中で２週間インキュベーションする。約２週後、細胞を、ＨＡＴをＨＴに置き換えた培地中で培養する。次に、それぞれのウェルをＥＬＩＳＡでスクリーニングし、ヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体をスクリーニングする。いったん広範なハイブリドーマ増殖が起こると、培地は、通常、１０−１４日後に観察できる。抗体分泌ハイブリドーマを再播種し、再度スクリーニングし、もしヒトＩｇＧがまだ陽性であるならば、モノクローナル抗体を少なくとも２回、限定希釈によってサブクローニングする。次に、安定なサブクローンをインビトロで培養し、少量の抗体を組織培地に産生させ、特性解析する。

ヒトモノクローナル抗体を精製するため、選択したハイブリドーマを２リットルのスピナーフラスコ中で増殖させ、モノクローナル抗体を精製できる。上清をろ過し、濃縮した後、プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）によるアフィニティクロマトグラフィを行う。溶出したＩｇＧをゲル電気泳動と高速液体クロマトグラフィでチェックし、純度を確認できる。緩衝液はＰＢＳに交換し、濃度は、１．４３吸光係数を用いてＯＤ_２８０で決定できる。モノクローナル抗体を等量に分け、−８０℃で保存できる。

本発明のモノクローナル抗体産生トランスフェクトーマの作製
また、本発明の抗体は、例えば、当該技術において周知の組み換えＤＮＡ技術と遺伝子トランスフェクション技術を組み合わせて用いて、宿主細胞中で産生させることができる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２）。

例えば、抗体またはその抗体断片発現のため、部分または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、標準的な分子生物学技術（例えば、ＰＣＲ増幅または問題の抗体を発現するハイブリドーマを用いたｃＤＮＡクローニング）により得られ、このＤＮＡを、遺伝子が適切に作用するように転写および翻訳調節配列に連結されるように、発現ベクター中に挿入できる。この本文において、用語“適切に作用するように連結する”とは、ベクター内部の転写および翻訳調節配列が抗体遺伝子の転写と翻訳を制御するというそれらの目的機能を果たすようにベクターに連結されることを意図している。発現ベクターと発現調節配列は、使用した発現宿主細胞に適合するように選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を別々のベクターに挿入できるが、さらに典型的には、両者の遺伝子ともに同一発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子は、標準的方法（例えば、抗体遺伝子断片上の相補性制限部位とベクターとのライゲーション、または制限部位が全く存在しないならば、平滑末端ライゲーション）によって発現ベクター中に挿入される。ここに述べた抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用いて、Ｖ_Ｈセグメントがベクター内部のＣ_Ｈセグメントに作用可能なように連結され、Ｖ_Ｋセグメントはベクター内部のＣ_Ｌセグメントに作用可能なように連結されるよう、それらを所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域をすでにコードしている発現ベクター中に挿入することによって、いかなる抗体のアイソタイプの全長抗体遺伝子をも創製できる。さらにまたはこれとは別に、組み換え発現ベクターは、宿主細胞から抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードできる。当該抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドがインフレームで抗体鎖遺伝子のアミノ末端に連結されるようにベクター中にクローニングできる。当該シグナルペプチドは、イムノグロブリンシグナルペプチドまたは非相同シグナルペプチド（すなわち、非イムノグロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であってもよい。

抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞中において抗体鎖遺伝子の発現を調節できる制御配列を有している。用語“制御配列”とは、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を調節するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。このような制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０））に記載されている。当業者は、制御配列の選択を含む発現ベクターの設計が形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等のような因子に依存することを理解できる。哺乳類宿主細胞発現のための好適な制御配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）およびパピローマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーのような、哺乳類細胞におけるタンパク質高発現を指示するウイルスエレメントを含む。これとは別に、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターのような非ウイルス制御配列も使用できる。さらに、制御エレメントは、ＳＲαプロモーターシステムのような異なる起源由来の配列で構成され、それらはＳＶ４０アーリープロモーターおよびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端繰り返し由来の配列を含む（Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ．ら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ８：４６６−４７２）。

抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、本発明の組み換え発現ベクターは、宿主細胞中におけるベクターの複製を制御する配列（例えば、複製開始点）および選択マーカー遺伝子のような付加的配列も有することができる。当該選択マーカー遺伝子は、ベクターを導入した宿主細胞の選択を促進する（例えば、全てＡｘｅｌらの米国特許４，３９９，２１６、４，６３４，６６５および５，１７９，０１７を参照）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターを導入した宿主細胞上でＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートのような薬物に対する耐性を付与する。好適な選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅とともにｄｈｆｒ−宿主細胞中で使用するため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）を含む。

軽鎖および重鎖発現のため、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターは、標準的な技術により宿主細胞に導入できる。用語“トランスフェクション”の様々な形態は、外来性ＤＮＡを原核生物または真核生物宿主細胞に導入するために一般的に用いた広範囲の技術を包含することを意図しており、例えば、エレクトロポレーション、カルシウム−ホスフェート沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション等である。本発明の抗体を原核生物または真核生物の宿主細胞のいずれにも発現させることは理論的には可能であるが、そのような真核細胞、特に、哺乳類細胞が原核生物に比べて、適切に折りたたまれ、免疫学的に活性のある抗体を集合させ分泌させやすいため、真核細胞での抗体の発現、さらにもっとも好適には哺乳類宿主細胞での抗体の発現が最も好適である。抗体遺伝子の原核生物における発現は高収率の活性抗体産生には無効であると報告されている（Ｂｏｓｓ，Ｍ．Ａ．およびＷｏｏｄ、Ｃ．Ｒ．（１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ６：１２−１３）。

本発明の組み換え抗体発現のために好適な哺乳類宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）（例えば、Ｒ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎおよびＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されているようなＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用したｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含み、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０に記載されている）、ＮＳＯ骨髄細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が含まれる。特に、ＮＳＯ骨髄細胞とともに使用する場合には、別の好適な発現システムは、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８，８４１に開示されたＧＳ遺伝子発現システムである。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターを哺乳類宿主細胞中に導入する時、宿主細胞中で抗体を発現させるまたはさらに好適には宿主細胞を増殖させる培地中に抗体を分泌させるだけの十分な時間宿主細胞を培養することによって、抗体は産生される。抗体は標準的なタンパク質精製方法を用いて培地から回収できる。

抗原への抗体結合の特性解析
本発明の抗体について、例えば、標準的ＥＬＩＳＡによってＰＤ−１への結合を試験できる。簡単に述べると、マイクロタイタープレートをＰＢＳ中０．２５μｇ／ｍＬの精製ＰＤ−１でコートし、次に、ＰＢＳ中５％のウシ血清アルブミンでブロックする。抗体希釈物（例えば、ＰＤ−１免疫マウス由来の血漿の希釈物）を各ウェルに添加し、３７℃で１−２時間インキュベーションする。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次に、アルカリホスファターゼ結合第２試薬（例えば、ヒト抗体用には、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−特異的ポリクローナル試薬）とともに３７℃で１時間、インキュベーションする。洗浄後、プレートをｐＮＰＰ基質（１ｍｇ／ｍＬ）で発色させ、ＯＤ４０６−６５０で分析する。好適には、最大力価を示したマウスを融合用に用いる。

上述のようなＥＬＩＳＡアッセイも同様に用いて、ＰＤ−１抗原と陽性反応を示すハイブリドーマをスクリーニングする。ＰＤ−１に高親和力で結合するハイブリドーマをサブクローニングし、さらに特性解析する。各ハイブリドーマから親細胞の反応性を保持するクローンを１個（ＥＬＩＳＡにより）選択し、抗体精製のために５−１０個のバイアル細胞バンクを作成し、−１４０℃で保存する。

抗ＰＤ−１抗体精製のため、選択したハイブリドーマを２リットルのスピナーフラスコ中で増殖させることができ、モノクローナル抗体を精製する。上清をろ過し濃縮した後、プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）によるアフィニティクロマトグラフィを行う。溶出したＩｇＧをゲル電気泳動と高速液体クロマトグラフィでチェックし、純度を確認できる。緩衝液は、ＰＢＳに交換し、濃度は、１．４３吸光係数を用いてＯＤ_２８０で決定できる。モノクローナル抗体を一定分量に分け、−８０℃で保存できる。

選択した抗ＰＤ−１モノクローナル抗体が独自のエピトープに結合したかどうかを決定するため、各抗体を市販の試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いてビオチン化できる。非標識モノクローナル抗体とビオチン化モノクローナル抗体を用いた競合実験を、ＰＤ−１塗布ＥＬＩＳＡプレートを用いて上記のように実施できる。ビオチン化ｍＡｂ結合は、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼプローブにより検出できる。

精製した抗体のアイソタイプを決定するため、アイソタイプＥＬＩＳＡを特定アイソタイプの抗体に特異的な試薬を用いて実施できる。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプ決定のため、マイクロタイタープレートウェルを１μｇ／ｍＬの抗ヒトイムノグロブリンで、一晩、４℃でコートできる。１％ＢＳＡでブロックした後、プレートを試験モノクローナル抗体または精製アイソタイプコントロール１μｇ／ｍＬ以下と室温で１〜２時間反応させる。次に、当該ウェルをヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭ特異的アルカリホスファターゼ結合プローブと反応させる。プレートを上記のようにして発色分析する。

抗ＰＤ−１ヒトＩｇＧは、さらに、ウェスタンブロッティングによりＰＤ−１抗原との反応性を試験できる。簡単に述べると、ＰＤ−１を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することができる。電気泳動後、分離した抗原をニトロセルロース膜に移し、１０％ウシ胎児血清でブロックし、試験すべきモノクローナル抗体により調べることができる。ヒトＩｇＧ結合は、抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを用いて検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠剤（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）により発色させることができる。

免疫複合物
別の面において、本発明は、サイトトキシン、薬物（例えば、免疫抑制剤）または放射性トキシンのような治療分子に複合させた抗ＰＤ−１抗体またはその断片を特徴とする。このような複合物は、ここで、“免疫複合物”と称する。１個以上のサイトトキシンを含む免疫複合物は、“イムノトキシン”と称される。サイトトキシン、すなわち、細胞傷害性物質には、細胞に有害な（例えば、死滅させる）いかなる物質も含まれる。例として、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジハイドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンおよびそのアナログまたはホモログを含む。また、治療薬には、例えば、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルカリ化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブチル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロソスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアンスラマイシン（ＡＭＣ））、および有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれる。

本発明の抗体に複合できる治療薬サイトトキシンの他の好適な例として、デュオカルマイシン、カリケアミシン、マイタンシンおよびオーリスタチン並びにそれらの誘導体が含まれる。カリケアミシン抗体複合物の例は、市販されている（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標）；Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）。

サイトトキシンは、先行技術であるリンカー技術を用いて本発明の抗体に結合できる。サイトトキシンを抗体に結合するために用いたリンカータイプの例として、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィドおよびペプチド含有リンカーが含まれるが、これらに限定されない。リンカーは、例えば、リソソームコンパートメント内部の低ｐＨによる切断を受けやすいか、カテプシン（例えば、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）のような癌組織中に主に発現するプロテアーゼのような、プロテアーゼによる切断を受けやすいものが選択される。

サイトトキシンのタイプ、リンカーおよび抗体に治療物質を結合する方法をさらに検討するためには、Ｓａｉｔｏ，Ｇ．ら（２００３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ． ５５：１９９−２１５、Ｔｒａｉｌ，Ｐ．Ａ．ら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ５２：３２８−３３７、Ｐａｙｎｅ，Ｇ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３：２０７−２１２、Ａｌｌｅｎ、Ｔ．Ｍ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ２：７５０−７６３、Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．およびＫｒｅｉｔｍａｎ，Ｒ．Ｊ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ ３：１０８９−１０９１、Ｓｅｎｔｅｒ，Ｐ．Ｄ．およびＳｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｊ．（２００１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ． ５３：２４７−２６４も参照できる。

また、本発明の抗体は放射性同位元素に結合させ、放射性免疫複合物と称される細胞傷害性放射性薬物を作製できる。診断または治療に使用するための抗体結合放射性同位元素の例として、ヨード^１３１、インジウム^１１１、イットリウム^９０およびルテチウム^１７７が含まれるが、これらに限定されない。放射免疫複合物を調製する方法は、先行技術で確立されている。放射免疫複合物の例は市販されており、Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）（ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＢｅｘｘａｒ（商標）（Ｃｏｒｉｘａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が含まれ、類似の方法を用いて本発明の抗体を用いて放射免疫複合物を調製できる。

ある生物応答を修飾するために、本発明の抗体複合物を用いることができるが、薬物分子は、旧来の化学的治療薬剤のみに限定されるとみなされない。例えば、薬物分子は所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質には、アブリン、リシンＡ、シュードモナス菌体外毒素またはジフテリアトキシンのような、例えば、酵素的に活性の毒物またはその活性断片、腫瘍壊死因子またはインターフェロン−γのようなタンパク質、または、例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（“ＩＬ−１”）、インターロイキン−２（“ＩＬ−２”）、インターロイキン−６（“ＩＬ−６”）、顆粒マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（“Ｇ−ＣＳＦ”）または他の増殖因子のような生物学的応答調節物質が含まれる。

このような治療分子を抗体に結合するための技術は、周知で、例えば、Ａｒｎｏｎら“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＯＦ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”、ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編著）、ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”、 ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編著）、ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．１９８７）、Ｔｈｏｒｐｅ， “Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ａ ｒｅｖｉｅｗ“，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ‘８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編著）、ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）、”Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ“、ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎら（編著）、ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ１９８５）、ａｎｄ Ｔｈｏｒｐｅら、”Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ“、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２：１１９−５８（１９８２）を参照できる。

二重特異性分子
別の面において、本発明は、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその断片を含む二重特異性分子を特徴とする。本発明の抗体またはその抗原結合部分は、誘導体化することができ、または、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、別の抗体またはレセプターに対するリガンド）のような別の機能分子に連結することによって、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を作製できる。本発明の抗体は、実際に、誘導体化することもできあるいは１つ以上の他の機能分子に連結することによって、２つ以上の異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子を作製することができる。このような多重特異性分子も、本文中、用語“二重特異性分子”に含まれるものとする。本発明の二重特異性分子を作製するため、二重特異性分子ができるように本発明の抗体を別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣物のような１つ以上の結合分子に機能的に（例えば、化学的カップリング、遺伝的融合、非共有結合またはその他で）連結することができる。

したがって、本発明には、ＰＤ−１に対する少なくとも１つの第一の結合特異性と第二の標的エピトープに対する第二の結合特異性を含む二重特異性分子を含む。本発明の特定の態様において、第２標的エピトープは、例えば、ヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）またはヒトＦｃαレセプター（ＣＤ８９）のようなＦｃレセプターである。したがって、本発明は、ＦｃγＲＩまたはＦｃαＲを発現するエフェクター細胞（例えば、単球、マクロファージまたは多形核細胞（ＰＭＮｓ））およびＰＤ−１を発現している標的細胞の両者に結合できる二重特異性分子を含む。これらの二重特異性分子は、ＰＤ−１発現細胞をエフェクター細胞の標的とさせ、ＰＤ−１発現細胞の食作用、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、サイトカイン放出、またはスーパーオキサイドアニオン産生のようなＦｃレセプターを介したエフェクター細胞活性を惹起する。

二重特異性分子が多重特異特異性である本発明の態様において、さらに、当該分子は、抗Ｆｃ結合特異性と抗ＰＤ−１結合特異性の他に、第三の結合特異性を有することができる。一つの態様において、第三の結合特異性は、例えば、抗増強因子（ＥＦ）部分のような細胞傷害活性に関与し、それによって標的細胞に対する免疫応答を増強する表面タンパク質に結合する分子である。この“抗増強因子部分”とは、例えば、抗原またはレセプターのようなある分子に結合し、その結果、Ｆｃレセプターまたは標的細胞抗原の結合決定基の効果を増強する抗体、抗体の機能的断片またはリガンドであってもよい。“抗増強因子部分”は、Ｆｃレセプターまたは標的細胞抗原に結合できる。これとは別に、抗増強因子部分は、第１および第２結合特異性が結合する物質とは異なる物質に結合してもよい。例えば、抗増強因子部分は、細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ−１を介して）または、標的細胞に対する免疫応答を増強するような他の免疫細胞と結合することができる。

一つの態様において、本発明の二重特異性分子は、結合特異性として、抗体または、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖまたは一重鎖Ｆｖのようなその抗体の断片を少なくとも１つ含む。また、本抗体は軽鎖若しくは重鎖ダイマーであるかまたはＦｖのようなその最小断片若しくはその内容を本文で断って参考として引用しているＬａｄｎｅｒら、米国特許４，９４６，７７８に記載の一本鎖構築物であってもよい。

一つの態様において、Ｆｃγレセプターに対する結合特異性は、モノクローナル抗体によって提供され、その結合は、ヒトイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）によって阻害されない。本文中、用語“ＩｇＧレセプター”は、第１染色体上に位置する８個のγ鎖遺伝子のいずれかを示す。これらの遺伝子は、総計１２個の膜貫通型または可溶化型レセプターのアイソフォームをコードし、それらは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の３種のＦｃγクラスに分けられる。一つの好適な態様としては、当該Ｆｃγレセプターは、ヒト高親和性ＦＣγＲＩである。ヒトＦｃγＲＩは、７２ｋＤａの分子であり、ＩｇＧ単量体に対して高親和性を示す（１０^８−１０^９Ｍ^−１）。

好適な抗Ｆｃγモノクローナル抗体の作製と特異性解析には、ＦａｎｇｅｒらによりＰＣＴ公報ＷＯ８８／０００５２および米国特許４，９５４，６１７に記載されているものがあり、これらの開示は全て本文で参考文献として引用している。これらの抗体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩのエピトープに、レセプターのＦｃγ結合部位から離れた部位で結合し、従って、それらの結合が生理学的レベルのＩｇＧによっては実質的に阻害されない。本発明で有用な特異的抗ＦｃγＲＩ抗体は、ｍＡｂ２２、ｍＡｂ３２、ｍＡｂ４４、ｍＡｂ６２およびｍＡｂ１９７である。ｍＡｂ３２産生ハイブリドーマは、アメリカンタイプカルチャーコレクションからＡＴＣＣ 寄託番号ＨＢ９４６９として入手可能である。他の態様において、抗Ｆｃγレセプター抗体は、モノクローナル抗体２２のヒト型抗体である（Ｈ２２）。Ｈ２２抗体の産生と特異性解析は、Ｇｒａｚｉａｎｏ，Ｒ．Ｆ．ら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５５（１０）：４９９６−５００２およびＰＣＴ公報ＷＯ９４／１０３３２に記載されている。Ｈ２２抗体産生細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクションにＨＡ０２２ＣＬ１として寄託され、寄託番号ＣＲＬ１１１７７を有している。

さらに、他の好適な態様において、Ｆｃレセプターに対する結合特異性は、例えば、Ｆｃ−αレセプター（ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９））のようなヒトＩｇＡレセプターに結合する抗体によって付与され、その結合は、好適には、ヒトイムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）によって阻害されない。用語“ＩｇＡレセプター”は、第１９染色体に位置する１個のα−遺伝子（ＦｃαＲＩ）の遺伝子産物を含むことを意味する。この遺伝子は、５５〜１１０ｋＤａの数個のオルタナティブスプライシングされた膜貫通型アイソフォームをコードすることが知られている。ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）は、単球／マクロファージ、好酸球性および好中球性顆粒球上で構成的に発現されるが、非エフェクター細胞群上では発現しない。ＦｃαＲＩは、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２の両者に対して中程度の親和性（約５×１０^７Ｍ^−１）を有しており、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカインによって増加する（Ｍｏｒｔｏｎ，Ｈ．Ｃ．ら（１９９６）Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６：４２３−４４０）。４個のＦｃαＲＩ特異的モノクローナル抗体がＡ３、Ａ５９、Ａ６２およびＡ７７として同定されており、それらは、ＩｇＡリガンド結合ドメインの外側でＦｃαＲＩを結合することが記載されている（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，Ｒ．Ｃ．ら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１７６４）。

ＦｃαＲＩおよびＦｃγＲＩは、本発明の二重特異性分子として用いる場合、好適なトリガーレセプターであり、その理由としては、それらが、（１）主に、例えば、単球、ＰＭＮ、マクロファージおよび樹状細胞のような免疫エフェクター細胞で発現されること、（２）高レベルで発現すること（例えば、５０００−１００，０００／細胞）、（３）細胞傷害活性の媒介するもの（例えば、ＡＤＣＣ、食作用）、（４）自己抗原を含むそれらを標的化した抗原の抗原提示増強を介することが挙げられる。

ヒトモノクローナル抗体が好適であるが、本発明の二重特異性分子で使用できる他の抗体は、マウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。

本発明の二重特異性分子は、例えば、抗ＦｃＲおよび抗ＰＤ−１結合特異性のような構成要素となる結合特異性を当業者における公知の方法を用いて結合することによって、調製できる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性は、別々に作製し、その後互いに連結できる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである時、様々なカップリングまたは架橋剤を共有結合に使用できる。架橋剤の例として、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−サクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５´−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクインイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙら（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １６０：１６８６、Ｌｉｕ，ＭＡら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：８６４８を参照）が含まれる。他の方法には、Ｐａｕｌｕｓ（１９８５）Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ． Ｎｏ．７８、１１８−１３２、Ｂｒｅｎｎａｎら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１−８３、およびＧｌｅｎｎｉｅら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３９：２３６７−２３７５に記載のものが含まれる。好適な結合剤は、ＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、両者ともにＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から入手可能である。

結合特異性が抗体である時、それらは、２個の重鎖Ｃ末端ヒンジ領域のスルフィドリル結合により結合できる。特に好適な態様において、結合させる前にヒンジ領域を奇数の、好適には１つのスルフィドリル残基を含むように修飾する。

あるいは、２つの結合特異性を同一ベクター中でコードでき、同一宿主細胞中で発現させ、構築させることができる。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）_２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有効である。本発明の二重特異性分子は、一重鎖抗体および結合決定基を含む一重鎖分子であるか、または、２個の結合決定基を含む一重鎖二重特異性分子であってもよい。二重特異性分子は、少なくとも２個の一重鎖分子を含むこともできる。二重特異性分子調製方法は、例えば、米国特許５，２６０，２０３、米国特許５，４５５，０３０、米国特許４，８８１，１７５、米国特許５，１３２，４０５、米国特許５，０９１，５１３、米国特許５，４７６，７８６、米国特許５，０１３，６５３、米国特許５，２５８，４９８、米国特許５，４８２，８５８に記載されている。

二重特異性分子のそれらの特異的標的への結合は、例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害）またはウェスタンブロットアッセイにより確認できる。これらのそれぞれのアッセイは、一般に、特に問題となっているタンパク質−抗体複合体の存在を、問題の複合体に特異的な標識試薬（例えば、抗体）を用いて検出する。例えば、ＦｃＲ−抗体複合体は、例えば、抗体−ＦｃＲ複合体を認識して特異的に結合する酵素結合抗体または抗体断片を用いて検出できる。あるいは、当該複合体は、様々な他のイムノアッセイのいずれかを用いて検出できる。例えば、抗体を放射性標識し、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で使用できる（例えば、本文で参考として引用したＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｍａｒｃｈ、１９８６を参照）。放射性同位元素は、γカウンターまたはシンチレーションカウンターを用いてまたはオートラジオグラフィのような手段により検出できる。

薬剤組成物
本発明は、例えば、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を１種またはその組み合わせを含有し、薬学的に許容できる担体とともに処方された医薬組成物を提供するという側面がある。このような組成物は、本発明の（例えば、２種以上の異なる）抗体、または免疫複合物または二重特異性分子を１個、または、その組み合わせを含んでいてもよい。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するかまたは補完的活性を有する抗体（または免疫複合物または二重特異性抗体）の組み合わせを含むことができる。

本発明の医薬組成物は、また、併用療法すなわち他の物質と組み合わせて投与することができる。例えば、併用療法は、その他の抗炎症剤または免疫抑制剤を少なくとも１つ組み合わせた本発明の抗ＰＤ−１抗体を含んでいてもよい。併用療法で使用できる治療物質の例として、より詳細に下記で本発明の抗体使用についての章で説明されている。

本文中、“薬学的に許容できる担体”には、いかなる溶媒、分散剤、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延物質等が全て含まれ、それらは生理的に両立できる。好適には、当該担体は、（例えば、注入または点滴による）静注、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与に適している。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗体、免疫複合物または二重特異性分子は、化合物を不活性化する可能性のある酸や他の自然条件の作用から化合物を保護する物質で被覆することもできる。

本発明の医薬組成物は、１種以上の薬学的に許容できる塩を含むことができる。“薬学的に許容できる塩”とは、親化合物が目的とする生物活性を保持するが、目的としない毒性効果を全く示さない塩を称する（例えば、Ｂｅｒｇｅｓ，Ｓ．Ｍ．ら（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ． ６６：１−１９を参照）。このような塩の例として、酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、燐等のような無毒性の無機酸由来ならびに脂肪族モノ−およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸等のような無毒性の有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のようなアルカリ土金属ならびにＮ，Ｎ’−ジベンチルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等のような無毒の有機アミン由来のものが含まれる。

また、本発明の薬剤組成物は薬学的に許容できる抗酸化剤を含むことができる。薬学的に許容できる抗酸化剤の例として、（１）アスコルビン酸、システインハイドロクロライド、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のような水溶性抗酸化剤、（２）アスコルビルパルミテート、ブチル化ハイドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ハイドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、プロピルガレート、α−トコフェロール等のような油溶性抗酸化剤、および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等のような金属キレート剤が含まれる。

本発明の薬剤組成物に使用できる適切な水性および非水性担体の例として、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、およびその適切な混合物、オリーブオイルのような植物油、およびエチルオレイン酸のような注入可能な有機エステルが含まれる。適切な流動性は、レシチンのような被覆物質を使用すること、分散体の場合、必要な粒子径を保持すること、および界面活性剤を使用することによって保持することができる。

また、これらの組成物は保存剤、湿潤化剤、乳化剤および分散剤のようなアジュバントを含むことができる。微生物存在の防止は、殺菌操作、同上のようにおよび、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等のような様々な抗菌剤および抗真菌剤を包含させることによって確保できる。また、糖、塩化ナトリウム等のような等張化剤を当該組成物に含ませることが望ましい。さらに、注射製剤形態の吸収を持続させることは、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅らせる物質を包含させることによって実現することができる。

薬学的に許容できる担体には、無菌の注射用溶液または分散体を即時調製するための無菌水溶液または分散体および無菌粉末が含まれる。このような媒体および物質を薬学的に活性の物質のために使用することが当該技術において知られている。これまで従来の媒体または物質が当該活性化合物と両立できなかったので、本発明の薬剤組成物中でそれを使用することを検討している。補助的な活性化合物もまた、当該組成物中に組み込むことができる。

治療用組成物は、通常、製造および保存条件下で無菌でかつ安定でなければならない。当該組成物は、溶液、ミクロエマルジョン、リポゾームまたはその他高濃度の薬物に適した、しつらえた構造体として製剤化できる。当該担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、およびその適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であってもよい。適切な流動性は、レシチンのようなコーティング剤を使用すること、分散体の場合必要な粒子径を保持することおよび界面活性剤を使用することによって保持できる。多くの場合、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコールまたは塩化ナトリウムのような等張化剤を当該組成物に含有させることが望ましい。モノステアリン酸アルミニウム塩およびゼラチンのような吸収を遅らせる物質を包含させることによって、注射用組成物の吸収を持続させることができる。

無菌の注射用溶液は、必要量の活性化合物を、上記に述べた成分の一つまたはそれらの組み合わせとともに適切な溶媒中に組み込み、必要に応じて無菌的精密ろ過をすることにより調製できる。一般的に、分散体は、基本的分散媒体と上記に述べたものの中から必要な他の成分を含む無菌媒体中に活性化合物を組み込むことによって調製する。無菌の注射用溶液調製のための無菌粉末の場合、好適な調製方法は真空乾燥および凍結乾燥（凍結乾燥）であり、活性成分に、事前に無菌ろ過した溶液からのあらゆる所望の追加成分を加えた粉末を産生できる。

一単位投与形態を作製するために担体物質と組み合わせられる活性成分の量は、治療すべき対象と特定の投与様式に応じて変わる。一単位投与形態を作製するために担体物質と組み合わせられる活性成分の量は、一般的に、治療効果をもたらす組成物量である。一般的に、この活性成分の量は、１００％のうち、薬学的に許容できる担体との配合中、約０．０１％〜約９９％、好適には約０．１％〜約７０％、さらに好適には約１％〜約３０％の範囲である。

投与法は、目的とする最適な応答（例えば、治療応答）をもたらすように調整される。例えば、単回のボーラスで投与することができるか、数回に投与量を分けて時間をかけて投与することもでき、または治療状況の緊急性に応じて投与量を減ずるかまたは増量することもできる。特に、投与の容易性および投与量の均一性のため、非経口組成物を単位投与形態として製剤化するのが好都合である。本文中、単位投与形態とは、治療対象に対する単位投与として適した物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要な薬剤担体と関連させて所望の治療効果をもたらすために計算され、あらかじめ決定した量の活性化合物を含む。本発明の単位投与形態の仕様は、（ａ）活性化合物の独自の特異性と目的とする特定の治療効果、および（ｂ）個人への治療感受性のため、そのような活性化合物を調剤する技術に固有の限界により規定されかつ直接それらに依存する。

抗体投与のため、当該投与量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、さらに一般的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲である。例えば、投与量は、約０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重であるかまたは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。典型的な治療方法には、例えば、週１回投与、２週間おきに１回投与、３週おきに１回投与、４週おきに１回投与、月１回投与、３ヶ月おきに１回投与または３〜６ヶ月おきに１回投与を伴う。本発明の抗ＰＤ−１抗体の好適な投与方法は、静注投与により、１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重であり、当該抗体は、下記の投与スケジュール、すなわち、（ｉ）投与６回を４週おきに、次に３週おき、（ｉｉ）３週おき、（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、次に３週おきに１ｍｇ／ｋｇ体重の一つを用いて投与される。

ある方法では、異なる結合特異性を有する２種以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合、投与した各抗体の投与量は、例示した範囲内に入る。通常、抗体は、複数回投与される。単回投与間隔は、例えば、毎週、毎月、３カ月おきまたは１年おきとすることができる。また、患者の標的抗原に対する抗体の血中レベルを測定することによって示唆されるように、不定期とすることもできる。血漿中の抗体濃度を約１〜１０００μｇ／ｍＬとなるように調整する方法や、約２５〜３００μｇ／ｍＬとなるように調整する方法もある。

あるいは、抗体は、徐放性製剤として投与することもでき、この場合、投与頻度を少なくすることが必要となる。投与量と頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変わる。一般的に、ヒト抗体の半減期が最も長く、次に、ヒト化抗体、キメラ抗体、非ヒト抗体が続く。投与量と投与頻度は、治療が予防なのか治療なのかにより変わる。予防的用途においては、比較的低用量が比較的頻度が低く、長期にわたり投与される。寿命のある限り治療を受けることになる患者もいる。治療的用途では、疾患進行を遅らせるかまたは停止させるまで、好ましくは、患者が部分的または完全に疾患症状の改善を示すまで、比較的高用量を比較的短期間に必要とすることがある。その後、患者は、予防的方法で投与される。

本発明の医薬組成物中における活性成分の実際の投与レベルを変化させることで、毒性を起こすことなしに、特定患者に対して目的とする治療応答を得る有効な活性成分、組成および投与様式を得ることができる。選択した投与量は、本発明で使用した特定組成物、そのエステル、その塩若しくはそのアミドの活性、投与経路、投与時間、使用した特定化合物の排泄速度、治療期間、他の薬物、化合物および／または使用した特定組成物と併用使用した物質、治療患者の年齢、性、体重、状態、全般的健康および既往歴および医療技術において周知の因子を含む様々な薬物動態因子に左右される。

本発明の抗ＰＤ−１抗体の“治療有効投与量”は、疾患症状の重篤度の低下、疾患に由来する症状が消失する期間の頻度と期間の増加、または疾患に罹患したことによる不全または障害の予防につながるものである。例えば、腫瘍治療のための“治療有効投与量”は、未処理被験者に比較して、好適には少なくとも約２０％、さらに好適には少なくとも約４０％、はるかに好適には約６０％、さらに好適には約８０％だけ、細胞増殖すなわち腫瘍増殖を阻害する。化合物の腫瘍増殖阻害能は、ヒト腫瘍における有効性を予測できる動物モデル系で評価できる。これとは別に、このような組成物の特性は、当業者に公知のアッセイによって化合物の阻害活性、例えば、インビトロにおける阻害能を調べることによって評価することができる。治療化合物の治療有効投与量は、腫瘍の大きさを減じるか、またはそうでなければ、被験者の症状を改善させる。当業者は、被験者の大きさ、被験者の症状の重篤度、および特定組成物または選択した投与経路のような要素に基づき量を決定することができる。

別の面において、本開示は、ここに記載の抗ＰＤ−１抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体をその一部に含む医薬キットを提供する。当該キットは、また、さらに高増殖性疾患（ここに述べた癌のような）を治療するために用いる指示書を含んでいてもよい。別の態様において、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体は、単位投与形態として共に包装することもできる。

ある態様において、異なる結合特異性を有する（例えば、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４のような）２種以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合、投与した各抗体の投与量は、例示した範囲内に入る。抗体は、単回投与することができ、またはより一般的には、複数回投与できる。単回投与間隔は、例えば、１週間、１か月、３か月、１年間が可能である。単回投与間隔は、患者において標的抗原に対する抗体の血中レベルを測定することによって示されるように、不規則であってもよい。血漿中抗体濃度約１〜１０００μｇ／ｍＬを達成するように調整される方法や、約２５〜３００μｇ／ｍＬを達成するように調整される方法もある。

本発明の組成物は、当該技術で公知の様々な方法の１つ以上の方法を用いて、１種以上の投与経路にて投与することもできる。当業者には明らかであろうが、投与経路および／または様式は、目的とする結果に応じて変わる。本発明の抗体の好適な投与経路は、例えば、注射または輸液によって、静脈内、筋肉内、皮膚内、腹腔内、皮下、脊髄投与または他の非経口投与経路を含む。本文中、用語“非経口投与”とは、腸および局所投与以外の通常の注入による投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腹腔内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮膚内、腹腔内、経気管的、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注入および点滴が含まれるが、これらに限定されない。

あるいは、本発明の抗体は、局所、上皮のような非経口経路で、または、例えば、鼻腔内、口腔内、膣内、直腸内、舌下または局所で粘膜投与経路により投与できる。

活性化合物は、インプラント、経皮パッチおよびミクロカプセル包含デリバリシステムのような徐放性製剤のような、迅速放出に対して当該化合物を保護する担体とともに調製できる。エチレンビニルアセテート、ポリアンハイドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステルおよびポリ乳酸といった、生分解性、生体適合性ポリマーも使用できる。このような製剤の調製方法は多くが特許を得ており、すなわち、当業者に一般に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編著，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７８参照。

治療用組成物は、当該技術において公知の医療用具により投与できる。例えば、好適な態様において、本発明の治療組成物は、米国特許５，３９９，１６３、５，３８３，８５１、５，３１２，３３５、５，０６４，４１３、４，９４１，８８０、４，７９０，８２４または４，５９６，５５６に開示された用具のような針のない皮下注入用具により投与できる。本発明で有用な公知のインプラントおよびモジュールの例として、制御された速度で医薬を投薬するためのインプラント可能なミクロインフィージョンポンプを開示した米国特許４，４８７，６０３、皮膚から医薬を投与するための治療用具を開示した米国特許４，４８６，１９４、精密な点滴速度で医薬を運搬するための医薬インヒュージョンポンプを開示した米国特許４，４４７，２３３、連続的薬物運搬のための可変フローインプラント可能な点滴装置を開示した米国特許４，４４７，２２４、複数チャンバーコンパートメントを有する浸透圧ドラッグデリバリシステムを開示した米国特許４，４３９，１９６および浸透圧ドラッグデリバリシステムを開示した米国特許４，４７５，１９６が含まれる。これらの特許は参考として本文に組み込まれている。他にも多くのインプラント、デリバリシステムおよびモジュールが当業者に公知である。

ある態様において、本発明のヒトモノクローナル抗体を製剤化して、インビボにおける適切な分布を確保することができる。例えば、血液−脳関門（ＢＢＢ）バリアは、多くの高親和性化合物を排除する。本発明の治療化合物がＢＢＢを（もし望むならば）確実に通過できるようにするため、それらを、例えば、リポソーム中に処方することができる。リポゾーム製造方法については、例えば、米国特許４，５２２，８１１；５，３７４，５４８；および５，３９９，３３１を参照できる。当該リポソームは、特定細胞または臓器に選択的に運搬される一種以上の分子を含むことができ、それによって標的ドラッグデリバリを増強できる（例えば、Ｖ．ＶＲａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５を参照）。標的となる分子の例として、葉酸またはビオチン（例えば、Ｌｏｗらによる米国特許５，４１６，０１６を参照）、マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． １５３：１０３８）、抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎら（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５７：１４０、Ｍ．Ｏｗａｉｓら（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０）、界面活性剤プロテインＡレセプター（Ｂｒｉｓｃｏｅら（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２３３：１３４）、ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６９：９０９０）が含まれ、また、Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３４６：１２３、Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ；Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２７３を参照することができる。

本発明の用途および方法
本発明の抗体、抗体組成物および方法は、例えば、ＰＤ−１検出またはＰＤ−１阻害により免疫応答を増強の検出といった、多数のインビトロおよびインビボ用途を有している。好適な態様において、本発明の抗体はヒト抗体である。例えば、これらの分子は、培養細胞に対してインビトロでまたはエクスビボであるいはヒト被験者に対して、例えば、インビボで投与して、様々な状況において免疫性を高めることができる。したがって、一面において、本発明は、被験者の免疫応答が修正されるように本発明の抗体またはその抗原結合部分を当該被験者に投与することを含む、被験者に対する免疫応答を修正する方法を提供する。好適には、当該応答は、増強、刺激または上方制御される。

本文中、用語“被験者”とは、ヒトおよび非ヒト動物類を含むことを意味している。非ヒト動物には、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等のような哺乳類および非哺乳類である、全脊椎動物類が含まれる。非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシおよびウマのような哺乳類が好適である。好適な被験者には、免疫応答増強を必要としているヒト患者が含まれる。当該方法は、Ｔ細胞介在性免疫応答を促進することにより治療できる疾患を有するヒト患者の治療に特に適している。特定の態様において、当該方法は、インビボにおける癌細胞治療に適している。免疫性の抗原特異的増強を図るため、抗ＰＤ−１抗体を関係する抗原とともに投与することができる。ＰＤ−１に対する抗体を別の物質とともに投与するときには、それらは、順番にまたは同時に投与できる。

本発明は、さらに、抗体またはその部分とヒトＰＤ−１との複合体形成を可能とする条件下で、ヒトＰＤ−１に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分にサンプルまたは対照サンプルを接触させることを含む、サンプル中におけるヒトＰＤ−１抗原存在を検出するかまたはヒトＰＤ−１抗原量を測定する方法を提供する。次に、複合体の形成を検出し、ここで、対照サンプルとサンプル間の複合体形成の違いから、サンプル中におけるヒトＰＤ−１抗原の存在が示唆される。

ＣＤ２８、ＩＣＯＳおよびＣＴＬＡ−４に比較して本発明の抗体のＰＤ−１に対する特異的結合があれば、本発明の抗体を用いて細胞表面においてＰＤ−１発現を特異的に検出でき、さらにこれを用いて、免疫親和性精製によりＰＤ−１を精製できる。

癌
抗体によるＰＤ−１阻害は、患者において癌性細胞に対する免疫応答を増強できる。ＰＤ−１に対するリガンドＰＤ−Ｌ１は、正常なヒト細胞では発現されないが、様々なヒト癌には多く発現している（Ｄｏｎｇら（２００２）Ｎａｔ Ｍｅｄ ８：７８７−９）。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用の結果、腫瘍浸潤性リンパ球の減少、Ｔ細胞レセプターを介した増殖の低下、癌性細胞による免疫回避が起こる（Ｄｏｎｇら（２００３）Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ８１：２８１−７、Ｂｌａｎｋら（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ５４：３０７−３１４、Ｋｏｎｉｓｈｉら（２００４）Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １０：５０９４−１００）。免疫抑制は、ＰＤ−Ｌ１に対するＰＤ−１の局所相互作用を阻害することによって元に戻すことができ、ＰＤ−Ｌ２に対するＰＤ−１の相互作用を同様に阻害する時、その効果は相加的である（Ｉｗａｉら（２００２）ＰＮＡＳ ９９：１２２９３−７、Ｂｒｏｗｎら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７０：１２５７−６６）。これまでの研究において、Ｔ細胞増殖がＰＤ−Ｌ１に対するＰＤ−１の相互作用を阻害することによって回復できることが示されているが、インビボにおいて、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の阻害による癌腫瘍の増殖に対する直接的な効果については全く報告がない。本発明は、一面において、癌性腫瘍の増殖を阻害するように抗ＰＤ−１抗体を用いる、被験者のインビボ治療に関する。抗ＰＤ−１抗体だけを用いて癌性腫瘍の増殖を阻害できる。あるいは、抗ＰＤ−１抗体を、他の免疫原性物質、標準的癌治療または他の抗体と組み合わせて、下記に記載のように用いることができる。

したがって、本発明は、一つの態様において、被験者における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供し、当該被験者に対して治療有効量の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む。好適には、当該抗体は（ここに記載のヒト抗ヒトＰＤ−１抗体のいずれかのような）ヒト抗ＰＤ−１抗体である。さらにまたはこれとは別に、当該抗体は、キメラまたはヒト化抗ＰＤ−１抗体であってもよい。

本発明の抗体を用いて増殖を阻害できる好適な癌は、免疫療法に応答する一般的な癌を含む。治療に好適な癌の例は限定されないが、メラノーマ（例えば、転移性悪性メラノーマ）、腎癌（例えば、透明細胞カルシノーマ）、前立腺癌（例えば、ホルモン難治性前立腺アデノカルシノーマ）、乳癌、結腸癌および肺癌（例えば、非小細胞肺癌）が含まれる。さらに、本発明の抗体でその増殖が阻害できる難治性または再発性の悪性疾患が含まれる。

本発明の方法を用いて治療できる他の癌の例としては、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚若しくは眼窩内悪性メラノーマ、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管のカルシノーマ、子宮内膜カルシノーマ、子宮頚部カルシノーマ、膣カルシノーマ、外陰部カルシノーマ、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、柔組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む慢性若しくは急性白血病、小児固形癌、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓若しくは尿管の癌、腎盂カルシノーマ、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍新脈管形成、脊椎腫瘍、脳幹グリオーム、下垂体アデノーマ、カポシ肉腫、扁平上皮癌、扁平細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベスト誘発癌を含む環境誘発癌および上記癌の組み合わせが挙げられる。また、本発明は、転移性癌、特にＰＤ−Ｌ１を発現する転移性癌の治療に有用である（Ｉｗａｉら（２００５）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１３３−１４４）。

ＰＤ−１に対する抗体は、適宜、癌性細胞、精製腫瘍抗原（組み換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む）、細胞および免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子を導入した細胞のような免疫原性物質と組み合わせることができる（Ｈｅら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７３：４９１９−２８）。使用できる腫瘍ワクチンの例として、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼのペプチドのようなメラノーマ抗原のペプチド、またはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するように形質転換した腫瘍細胞（下記でさらに説明）が含まれる。

ヒトにおいて、ある腫瘍が、メラノーマのように免疫原性であることが示されている。ＰＤ−１阻害によりＴ細胞活性化閾値をあげることによって、宿主における腫瘍応答を活性化できる。

ＰＤ−１阻害は、ワクチンプロトコールと組み合わせる時、最も有効であるようである。腫瘍に対するワクチンの接種について、多くの試験方法が工夫されてきた（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｓ．、２０００、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ Ｓｐｒｉｎｇ：６０−６２、Ｌｏｇｏｔｈｅｔｉｃｓ，Ｃ．，２０００、ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ Ｓｐｒｉｎｇ：３００−３０２、Ｋｈａｙａｔ，Ｄ．２０００，ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ Ｓｐｒｉｎｇ：４１４−４２８、Ｆｏｏｎ，Ｋ．２０００，ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ Ｓｐｒｉｎｇ：７３０−７３８、また、Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．およびＳｚｎｏｌ，Ｍ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｃｈ．６１，ｐｐ．３０２３−３０４３ 、ＤｅＶｉｔａ，Ｖ．ら（編著）、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ． Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎを参照）。これらの戦略の一つとして、ワクチンは自己または同種異系の腫瘍細胞を用いて調製される。これらの細胞性ワクチンは、腫瘍細胞を形質転換してＧＭ−ＣＳＦを発現させる時、最も有効であることが明らかとなっている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチンにとって抗原提示の強力な活性化剤であることが明らかとなっている（Ｄｒａｎｏｆｆら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：３５３９−４３）。

様々な腫瘍における遺伝子発現と大規模遺伝子発現パターンの研究により、いわゆる腫瘍特異的抗原が定義されることになった（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、ＳＡ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：２８１−７）。多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍中および腫瘍化した細胞中で発現する分化抗原であり、例えば、メラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原およびＴｒｐ−２である。さらに重要なこととして、これらの抗原の多くが宿主において認められる腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であることを明らかにすることができる。ＰＤ−１阻害薬は、腫瘍で発現した組み換えタンパク質および／またはペプチドの集団と組み合わせて、これらのタンパク質に対する免疫応答を生み出すために使用できる。これらのタンパク質は、通常、免疫系によって自己抗原としてみなされるため、それらに対して寛容である。また、腫瘍抗原にはタンパク質テロメラーゼが含まれ、これは、染色体のテロメアの合成に必要なものであり、８５％を超えるヒト癌中で発現しているが、限られた数の体細胞組織中でしか発現していない（Ｋｉｍ，Ｎら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：２０１１−２０１３）。（これらの体細胞組織は、様々な手段で免疫攻撃から保護されている）。腫瘍抗原はまた、タンパク質配列を改変するかまたは２個の関連のない配列（すなわち、フィラデルフィア染色体におけるｂｃｒ−ａｂ１）の融合タンパク質を生じる体細胞変異であるため、癌細胞に発現する“新抗原”であり得るか、またはＢ細胞腫瘍由来のイデオタイプであり得る。

他の腫瘍ワクチンには、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）およびカポジヘルペス肉腫ウイルス（ＫＨＳＶ）のようなヒトの癌に関連するウイルス由来のタンパク質を含むことができる。ＰＤ−１阻害と併用して使用できる、腫瘍特異的抗原の他の形態としては、腫瘍組織それ自体から単離した精製熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）である。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞由来のタンパク質断片を含み、これらのＨＳＰｓは、腫瘍免疫性惹起のために抗原提示細胞への運搬が極めて効率的である（Ｓｕｏｔ，Ｒ＆Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｐ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１５８５−１５８８；Ｔａｍｕｒａ，Ｙ．ら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１１７−１２０）。

樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的応答を引き起こすために用いることができる強力な抗原提示細胞である。ＤＣは、エクスビボで作り出すことでき、腫瘍細胞抽出物と同様、様々なタンパク質およびペプチド抗原を産生し得る（Ｎｅｓｔｌｅ，Ｆ．ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：３２８−３３２）。ＤＣはまた、遺伝的手段により形質導入することができ、同様にこれらの腫瘍抗原を発現させることができる。ＤＣはまた、免疫を目的として直接腫瘍細胞に融合させている（Ｋｕｇｌｅｒ、Ａ．ら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：３３２−３３６）。ワクチンの接種方法としては、ＤＣ免疫をＰＤ−１阻害と効果的に組み合わせ、より強力な抗腫瘍応答を活性化する。

ＰＤ−１阻害薬はまた、標準的な癌の治療法と組み合わせることができる。ＰＤ−１阻害薬は、化学療法とも効果的に組み合わせることができる。これらの場合、投与した化学療法剤の投与量を少なくすることも可能である（Ｍｏｋｙｒ，Ｍ．ら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：５３０１−５３０４）。このような組み合わせの例としては、メラノーマ治療のため、デカルバチンと併用した抗ＰＤ−１抗体が挙げられる。このような組み合わせの他の例としては、メラノーマ治療のためのインターロイキン−２（ＩＬ−２）と併用した抗ＰＤ−１抗体が挙げられる。ＰＤ−１阻害薬と化学療法を併用して用いることの背景にある科学的理論とは、ほとんどの化学療法化合物の細胞毒性作用の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原レベルの増加をもたらすはずであるというものである。細胞死を介してＰＤ−１阻害薬との相乗作用をもたらす他の組合せ療法は、放射線、外科、およびホルモン療法である。これらのプロトコールはそれぞれ、宿主中で腫瘍抗原のもとを作る。血管新生阻害剤はまた、ＰＤ−１阻害と組み合わせることができる。血管新生阻害は、宿主抗原提示経路に腫瘍抗原を供給できる細胞死を腫瘍に対して起こす。

ＰＤ−１を阻害する抗体は、また、ＦｃαまたはＦｃγレセプターを発現するエフェクター細胞を腫瘍細胞に誘導する二重特異性抗体と併用して用いることができる（例えば、米国特許５，９２２，８４５および５，８３７，２４３を参照）。二重特異性抗体を用いて、２個の別々の抗原を標的とすることもできる。例えば、抗Ｆｃレセプター／抗腫瘍抗原（例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）二重特異性抗体を用いて、腫瘍部位をマクロファージの標的とすることができる。この標的化によって、より効果的に腫瘍特異的応答を活性化できる。これらの応答に対するＴ細胞の活性は、ＰＤ−１阻害薬を用いることによって増強できる。あるいは、抗原を直接、腫瘍抗原と樹状細胞特異的細胞表面マーカーに結合する二重特異性抗体を用いてＤＣに送達することもできる。

腫瘍は、極めて様々なメカニズムにより宿主免疫監視を回避する。これらのメカニズムの多くは、腫瘍に発現しかつ免疫抑制性であるタンパク質を不活性化することにより克服できる。これらには、特に、ＴＧＦ−β（Ｋｅｈｒｌ、Ｊ．ら（１９８６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １６３：１０３７−１０５０）、ＩＬ−１０（Ｈｏｗａｒｄ，Ｍ．＆Ｏ´Ｇａｒｒａ，Ａ．（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １３：１９８−２００）、およびＦａｓリガンド（Ｈａｈｎｅ，）Ｍ．ら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：１３６３−１３６５）が含まれる。これらすべてのそれぞれに対する抗体は、抗ＰＤ−１と併用して用いることができ、免疫抑制剤の効果に対抗しかつ宿主による腫瘍免疫応答に有利に作用する。

宿主免疫応答性を活性化させるために用いられ得る他の抗体は、抗ＰＤ−１と併用して用いることができる。これらには、ＤＣ機能と抗原提示を活性化させる樹状細胞の表面上の分子が含まれる。抗ＣＤ４０抗体は、事実上、Ｔ細胞ヘルパー活性の代わりとなることができ（Ｒｉｄｇｅ，Ｊ．ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４７４−４７８）、ＰＤ−１抗体と併用して用いることができる（Ｉｔｏ、Ｎ．ら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１（５）５２７−４０）。ＣＴＬＡ−４（例えば、米国特許５，８１１，０９７）、ＯＸ−４０（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．ら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：２１６０−２１６９）、４−１ＢＢ（Ｍｅｌｅｒｏ，Ｉ．ら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：６８２−６８５（１９９７））およびＩＣＯＳ（Ｈｕｔｌｏｆｆ，Ａ．ら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ３９７：２６２−２６６）のようなＴ細胞共刺激性の分子に対する抗体活性化によっても、Ｔ細胞活性化レベルを増加することができる。

現在、骨髄移植は様々な造血系由来の腫瘍の治療に使用されている。移植片対宿主疾患がこの治療の結果として起こるが、治療上の利益は、移植片対腫瘍応答から得ることができる。ＰＤ−１阻害薬を用いて、ドナーから移植した腫瘍特異的Ｔ細胞の効果を高めることができる。

また、腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞のため、抗原特異的Ｔ細胞のエクスビボ活性化と進展ならびにこれらの細胞をレシピーエントに養子移入することを含む試験的な治療プロトコールもいくつか存在する（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｒ．＆Ｒｉｄｄｅｌｌ，Ｓ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：５４６−５１）。これらの方法を用いて、ＣＭＶのような感染性物質に対するＴ細胞応答を活性化することもできる。抗ＰＤ−１抗体存在下におけるエクスビボ活性化は、養子移入されたＴ細胞の頻度および活性を高めると予測できる。

感染性疾患
本発明の他の方法としては、特定の毒素または病原体に暴露した患者を治療するものが挙げられる。したがって、本発明の別の側面においては、被験者に対して抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分を、当該被験者の感染性疾患を治療できるように投与することを含む、当該被験者における感染性疾患を治療する方法を提供できる。好適には、当該抗体は、（本文で記載のヒト抗ＰＤ−１抗体のいずれかのような）ヒト抗ヒトＰＤ−１抗体である。さらにまたはこれとは別に、当該抗体はキメラまたはヒト化抗体であってもよい。

上記したような腫瘍への適用と同様に、抗体介在性のＰＤ−１阻害薬は単独でまたはワクチンと併用してアジュバントとして用いることで、病原体、毒素および自己抗原に対する免疫応答を刺激することができる。この治療手法が特に有用な病原体の例として、現在有効なワクチンが全くない病原体、または従来のワクチンが完全に有効ではない病原体が含まれる。これらには、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ、＆Ｃ）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リューシュマニア、黄色ブドウ球菌、緑膿菌が含まれるが、それらに限定されない。ＰＤ−１阻害薬は、特に感染経過に伴い変化した抗原を提示するＨＩＶのような物質によって確立した感染に対して特に有用である。これらの新規エピトープは、抗ヒトＰＤ−１を投与した時点では外来性と認識され、従って、ＰＤ−１を介した負のシグナルによって低下しない強力なＴ細胞応答を惹起する。

本発明の方法で治療可能な感染症を起こす病原性ウイルスの例としては、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、ＢまたはＣ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩ、およびＣＭＶ、エプスタインバーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器多核体ウイルス、おたふくかぜウイルス、ロタウイルス、はしかウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクチシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスが挙げられる。

本発明の方法で治療可能な感染症を起こす病原菌の例としては、クラミジア、リケッチアバクテリア、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、ニューモコッカス、髄膜炎菌およびコノコッカス、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、テタヌス、ボツリズム、炭素菌、ペスト、レストスピラ症およびライムス病菌が挙げられる。

本発明の方法で治療可能な感染症を起こす病原性真菌の例としては、カンジダ（アルビカンス、クルセイ、グラブラタ、トロピカリス等）、クリプトコッカスネオフォルマンス、アスパルギルス（フミガツス、ニゲル等）、ムコラレス属（ムコル、アブスディア、リゾファス）、スポロスリックスシェンキ、ブラストマイセスデルマチチディス、パラコッキジオイデスブラシリエンシス、コッキジオイデスイミチスおよびヒストプラズマカプスラツムが挙げられる。

本発明の方法で治療可能な感染症を起こす病原性寄生体の例としては、赤痢アメーバ寄生体、大腸バランチジウム、ナエグレリアファウレリ、アカンテャモエーバ種、ジアルジアランビア、クリプトスポリジウム種、ニューモシスチスカリニ、プラスモディウムビバックス、バベシアミクロチ、トリパノゾーマブルーセイ、クルーズトリパノゾーマ、リューシュマニアドノヴァニ、トキシプラズマゴンジ、およびブラジル鉤虫が挙げられる。

上記方法の全てにおいて、ＰＤ−１阻害薬は、サイトカイン療法（例えば、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２）または二重特異性抗体療法のような腫瘍抗原の提示増強を付与する他の形態の免疫療法と併用することできる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８、Ｐｏｌｊａｋ（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３を参照）。

自己免疫反応
抗ＰＤ−１抗体は、自己免疫応答を惹起し増幅できる。実際、腫瘍細胞とペプチドワクチンを用いた抗腫瘍応答の誘発により、多くの抗腫瘍応答には、抗自己反応性を伴う（抗ＣＴＬＡ−４＋ＧＭ−ＣＳＦ修飾Ｂ１６メラノーマに見られる脱色、 ｖａｎ Ｅｌｓａｓら、同上、Ｔｒｐ−２ワクチンマウスにおける脱色（Ｏｖｅｒｗｉｊｋ、Ｗ．ら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：２９８２−２９８７）；ＴＲＡＭＰ腫瘍細胞ワクチンにより惹起された自己免疫前立腺炎（Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ａ．（２０００）同上）；メラノーマペプチド抗原ワクチン化およびヒト臨床治験で観察された尋常性白斑（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ＳＡおよびＷｈｉｔｅ，ＤＥ（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９（１）：８１−４）。

したがって、疾患治療としてこれらの自己タンパク質に対する免疫応答を効率的に起こすためのワクチン接種プロトコールを考案するため、抗ＰＤ−１阻害薬をさまざまな自己タンパク質とともに用いることを考えることも可能である。例えば、アルツハイマー病は、脳内アミロイド沈着物中におけるＡβタンパク質の不適切な集積を伴い、アミロイドに対する抗体応答は、これらのアミロイド沈着物を一掃できる（Ｓｃｈｅｎｋら、（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ４００：１７３−１７７）。

他の自己タンパク質はまた、ＩｇＥのような標的として、アレルギーおよび喘息治療のために使用でき、リウマチ性関節炎のためにＴＮＦαが使用できる。最後に、様々なホルモンに対する抗体応答が、抗ＰＤ−１抗体の使用により誘発できる。生殖ホルモンに対する中和抗体応答は、避妊のために使用できる。特定腫瘍増殖のために必要なホルモンおよび他の可溶性因子に対する中和抗体の応答性はまた、ワクチン標的としての可能性があると考えることができる。

抗ＰＤ−１抗体の使用において上記に記載した同様の方法は、治療のための自己免疫応答を誘発するために使用でき、アルツハイマー病におけるＡβ、ＴＮＦαのようなサイトカインおよびＩｇＥを含むアミロイド沈着物のような他の自己抗原の不適切な集積を有する患者を治療できる。

ワクチン
抗ＰＤ−１抗体は、抗ＰＤ−１抗体を問題となる抗原（例えば、ワクチン）を同時投与することによって抗原特異的応答を刺激することができる。したがって、別の側面において、本発明は、被験者に対して（ｉ）抗原、および（ｉｉ）抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分を投与し、被験者における抗原に対する免疫応答を増強することを含む、被験者における抗原に対する免疫応答を増強する方法を提供することができる。好適には、当該抗体は、ヒト抗ヒトＰＤ−１抗体（上述のヒト抗ＰＤ−１抗体のいずれかのような）である。さらにまたはこれとは別に、当該抗体は、キメラまたはヒト化抗体であってもよい。その抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体由来の抗原であってもよい。このような抗原の例として、上述の腫瘍抗原（または腫瘍ワクチン）若しくは上述のウイルス、細菌または他の病原体由来の抗原が挙げられるが、それらに限定されない。

本発明の抗体組成物（例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子並びに免疫複合物）をインビボおよびインビトロで投与する適切な経路は、当該技術により周知であり、当業者によって選択できる。例えば、抗体組成物は、注入（例えば、静注または皮下）によって投与できる。使用する分子の適切な投与量は、被験者の年齢および体重および抗体組成物の濃度および／または処方に依存する。

先にも述べたように、本発明のヒト抗ＰＤ−１抗体は、細胞毒性物質、放射性毒性物質または免疫抑制物質のような一種以上の他の治療物質と共投与できる。抗体は、当該物質に（免疫複合体として）連結させることができ、または、当該物質とは別々に投与できる。後者の場合（別々の投与の場合）、抗体は当該物質の前に、後にまたは同時に投与できるか、または、例えば、放射線のような抗癌療法のような他の公知の療法により共投与できる。このような治療物質には、特に、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチンブレオマイシン硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシル、デカルバチンおよびシクロホスファマイドヒドロキシウレアのような抗腫瘍物質が含まれるが、それらはそれ自体、患者にとって有毒であるかまたは準毒性であるレベルでのみ有効である。シスプラチンは、１００ｍｇ／投与として４週おきに静注し、アドリアマイシンは、６０〜７５ｍｇ／ｍＬ投与として２１日おきに静注する。本発明のヒト抗ＰＤ−１またはその抗原結合部分の化学療法剤との共投与は、異なるメカニズムで作用する二種の抗癌剤が付与され、それらは、ヒト腫瘍細胞に対して細胞毒性効果をもたらす。このような共投与は、薬物耐性の進展または抗体に反応しなくなるという腫瘍細胞の抗原性の変化に起因する問題を解決できる。

本発明の範囲にはまた、本発明の抗体組成物（例えば、ヒト抗体、二重特異性若しくは多重特異性分子または免疫複合物）と使用説明書を含むキットが含まれる。当該キットはさらに、少なくとも一個の付加的試薬または一種以上の本発明のヒト抗体（例えば、第１ヒト抗体と異なるＰＤ−１抗原エピトープに結合する相補性活性を有するヒト抗体）を含むことができる。キットは、通常、キット内容物の目的用途を示したラベルを有している。用語ラベルは、すべての文書を含み、キットの上面またはキットとともに付与されるか、そうでない場合にはキットに添付される。

併用療法
本発明は、部分的に、下記の実験データに基づいている。マウス腫瘍モデル（ＭＣ３８結腸癌およびＳＡ１／Ｎ線維肉腫）を用いて、免疫刺激治療用抗体−抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ−１を組み合わせることによって、腫瘍を治療するインビボ効果を検討した。併用免疫療法は、腫瘍細胞移植と同時に（実施例１４と１７）または形成された腫瘍となるまでに十分な時間腫瘍細胞を移植後（実施例１５、１６および１８）に行われた。抗体治療タイミングにかかわらず、単独での抗ＣＴＬＡ−４抗体治療および単独での抗ＰＤ−１抗体（ラット抗マウスＰＤ−１をマウスイムノグロブリンＦｃ領域で修飾したキメラ抗体、実施例１を参照）治療は、ＭＣ３８腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖の低下に中等度の効果を示した（例えば、図２１、２４および２７を参照）。抗ＣＴＬＡ−４抗体は単独でも、ＳＡ１／Ｎ腫瘍モデルにおいて非常に効果的で（図３０Ｄを参照）、このモデルにおける併用試験では、抗ＣＴＬＡ−４抗体の必要量は低用量であった。にもかかわらず、抗ＣＴＬＡ−４抗体と抗ＰＤ−１抗体の併用治療は、腫瘍増殖の低下に対し、いずれかの抗体単独による治療に比較して予想外の極めて高い効果を示した（例えば、図２１Ｄ、２４Ｄ、３０Ｆおよび３３Ｈ−Ｊを参照）。さらに、実施例１４、１６および１８の結果は、抗ＣＴＬＡ−４抗体と抗ＰＤ−１抗体の併用治療が、いずれかの抗体単独に比較して最適治療用量以下でも有意の（相乗的）効果を示すことが明らかである（すなわち、併用療法は、いずれかの単独療法よりも治療用量以下で驚くほど高い効果を示した）。理論にしばられることなく、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４阻害によるＴ細胞活性化閾値の上昇によって、抗腫瘍応答を宿主中で活性化することができる。

一つの態様において、本発明は、ＰＤ−１抗体およびＣＴＬＡ−４抗体を被験者に投与することを含む、高増殖性疾患を治療する方法を提供することができる。さらなる態様において、抗ＰＤ−１抗体を治療用量以下で投与し、抗ＣＴＬＡ−４抗体を治療用量以下で投与し、または両者を治療用量以下で投与する。別の態様において、本発明は、被験者に対して抗ＰＤ−１抗体と治療量以下の抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与することを含む、免疫刺激剤による高増殖性疾患治療に関連する有害事象を回避する方法を提供する。当該被験者がヒトである実施形態も存在する。また、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ヒト配列モノクローナル抗体１０Ｄ１であり、抗ＰＤ−１抗体は、１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４および４Ａ１１のようなヒト配列モノクローナル抗体であるような実施形態も存在する。ヒト配列モノクローナル抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４および４Ａ１１は、米国仮特許６０／６７９，４６６に記載のようにして単離し構造解析されている。

本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびヒト配列抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５のような標準的体細胞ハイブリダイゼーション法のような従来のモノクローナル抗体方法を含め、様々な技術により作製できる。例えば、Ｂリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換のような、モノクローナル抗体産生のためのいかなる技術も使用できる。ハイブリドーマ調製のための一つの動物系は、マウスの系である。マウスにおけるハイブリドーマ産生は、非常によく確立された操作である。免疫プロトコールと融合する免疫脾臓細胞を単離する技術は、当該技術で公知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄細胞）および融合操作もまた、公知である（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照）。

本発明の抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ヒトＣＴＬＡ−４上のエピトープに結合するため、ヒトＢ７カウンターレセプターとヒトＣＴＬＡ−４の相互作用を阻害することができる。ヒトＣＴＬＡ−４のヒトＢ７との相互作用は、ヒトＣＴＬＡ−４レセプターを有するＴ細胞の不活性化を起こすシグナルを伝達するので、相互作用を拮抗することは、ヒトＣＴＬＡ−４レセプターを有するＴ細胞活性化を効果的に誘発するか、増強するかまたは持続させるため、免疫応答を持続させたりまたは増強したりする。抗ＣＴＬＡ−４抗体は米国特許５，８１１，０９７、５，８５５，８８７、６，０５１，２２７中に、ＰＣＴ出願公報ＷＯ０１／１４４２４およびＷＯ００／３７５０４中におよび米国特許公報２００２／００３９５８１中に記載されている。これらの参考文献はそれぞれ、ここで、抗ＣＴＬＡ−４抗体の説明する目的のため参考文献として引用している。臨床抗ＣＴＬＡ−４抗体の例としては、ヒトモノクローナル抗体１０Ｄ１であり、ＷＯ０１／１４４２４および米国特許出願０９／６４４，６６８に開示されている。抗体１０Ｄ１は、単独またはワクチン、化学療法またはインターロイキン−２と組み合わせて単回投与または複数回投与で、転移性メラノーマ、前立腺癌、リンパ腫、腎細胞癌、乳癌、卵巣癌およびＨＩＶと診断された５００名以上の患者に対して投与された。本発明の方法に含まれる他の抗ＣＴＬＡ−４抗体は、例えば、ＷＯ９８／４２７５２、ＷＯ００／３７５０４、米国特許６，２０７，１５６、Ｈｕｒｗｉｔｚら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（１７）：１００６７−１００７１、Ｃａｍａｃｈｏら（２００４）Ｊ．Ｃｌｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２２（１４５）：アブストラクト番号２５０５（抗体ＣＰ−６７５２０６）、およびＭｏｋｙｒら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８：５３０１−５３０４に開示されている。本発明の方法には、ヒト配列抗体、好適にはモノクローナル抗体である抗ＣＴＬＡ−４抗体の使用する実施形態も存在し、また、モノクローナル抗体１０Ｄ１を使用する実施形態も存在する。

ある態様において、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ヒトＣＴＬＡ−４に対してＫ_Ｄが５×１０^−８Ｍ以下で結合し、ヒトＣＴＬＡ−４に対してＫ_Ｄが１×１０^−８Ｍ以下で結合し、ヒトＣＴＬＡ−４に対してＫ_Ｄが５×１０^−９Ｍ以下で結合し、またはヒトＣＴＬＡ−４に対してＫ_Ｄが１×１０^−８Ｍ〜Ｋ_Ｄ１×１０^−１０Ｍの間で結合する。

抗体の組み合わせは、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４の阻害による高増殖性疾患に対する免疫応答の増強に有用である。好適な態様において、本発明の抗体は、ヒト抗体である。例えば、これらの分子は、インビトロまたはエクスビボにおける培養細胞または、例えば、インビボでヒト被験者に投与することができ、様々な状況における免疫性を増強することができる。したがって、本発明は、被験者における免疫応答が変化するような本発明の抗体の組み合わせまたはそれらの抗原結合部分の組み合わせを被験者に投与して、当該被験者における免疫応答が修飾されるようにすることを含む、被験者の免疫応答を変化させる方法を提供するという側面がある。好適には、当該応答は、増強、刺激または上方制御される。別の態様において、本開示は、被験者に対して抗ＰＤ−１抗体と治療用量以下のの抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与することを含む、免疫刺激治療剤により高増殖性疾患治療に関連した有害事象の回避方法を提供する。

抗体によるＰＤ−１とＣＴＬＡ−４の阻害は、患者における癌性細胞に対する免疫応答を増強できる。本開示の抗体を用いて増殖を阻害できる癌には、一般的に免疫療法応答性の癌が含まれる。本開示の併用療法による治療に適した癌の代表例としては、メラノーマ（例えば、転移性悪性メラノーマ）、腎癌、前立腺癌、乳癌、結腸癌および肺癌（例えば、非小細胞肺癌）を含む。本発明の方法を用いて治療できる他の癌の例として、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚または眼窩内悪性メラノーマ、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管のカルシノーマ、子宮内膜カルシノーマ、子宮頚部カルシノーマ、膣カルシノーマ、外陰部カルシノーマ、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、柔組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む慢性または急性白血病、小児固形癌、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、腎盂カルシノーマ、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍新脈管形成、脊椎腫瘍、脳幹グライオーマ、脳下垂体アデノーマ、カポシ肉腫、表皮腫、扁平細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベスト誘発癌を含む環境誘発癌、および上記癌の組み合わせを含む。本発明はまた、転移性癌の治療に有用である。

ある態様において、ここで論じた治療用抗体の併用は、薬学的に許容できる担体中の単独組成物として同時に投与できるか、薬学的に許容できる担体中の個々の組成物として各抗体とともに同時に投与することもできる。他の実施形態としては、併用する治療用抗体は、順次投与することができる。例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＰＤ−１抗体は、最初に抗ＣＴＬＡ−４抗体を、次に抗ＰＤ−１を投与する、あるいは最初に抗ＰＤ−１を、次に抗ＣＴＬＡ−４を投与するというように順次投与することができる。さらにもし一種以上の併用療法の投与が順次投与されるならば、順次投与の順番は、各投与時点で逆にすることもあるいは同一順番にすることもでき、順次投与を、同時投与と組み合わせることもできるし、あるいはその併用物を投与することもできる。例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体と抗ＰＤ−１抗体の併用の最初の投与は同時投与とし、第２回目の投与は、抗ＣＴＬＡ−４を最初に、次に抗ＰＤ−１を投与し、第３回目の投与は、抗ＰＤ−１を最初に、次に抗ＣＴＬＡ−４を投与することができる。投与方法として他の代表例としては、抗ＰＤ−１を最初に抗ＣＴＬＡ−４を次に行うという初回投与を行い、その後は同時投与を行うこともできる。

必要に応じて、さらに、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体の併用を、癌性細胞、精製腫瘍抗原（組み換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む）、細胞および免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子を移入した細胞のような免疫原性物質と組み合わせることができる（Ｈｅら（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７３：４９１９−２８）。使用できる腫瘍ワクチンの例には、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼのペプチドのようなメラノーマ抗原のペプチドまたはサイトカインＧＭ−ＣＳＦ発現のために移入した腫瘍細胞（下記でさらに説明）を含む。

ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４の複合的な阻害は、さらに、ワクチンプロトコールと併用することができる。腫瘍に対するワクチン接種について、多くの試験的方法が工夫されてきた（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｓ．、２０００、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ Ｓｐｒｉｎｇ：６０−６２、Ｌｏｇｏｔｈｅｔｉｓ，Ｃ．，２０００、ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ Ｓｐｒｉｎｇ：３００−３０２、Ｋｈａｙａｔ，Ｄ．２０００，ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ Ｓｐｒｉｎｇ：４１４−４２８、Ｆｏｏｎ，Ｋ（２０００）ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ Ｓｐｒｉｎｇ：７３０−７３８、また、ＲｅｓｔｉｆｏおよびＳｚｎｏｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｃｈ．６１，ｐｐ．３０２３−３０４３ （ＤｅＶｉｔａ，Ｖ．ら（編著）、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ． Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ中）を参照）。これら方法の一つとして、自己または同種異系の腫瘍細胞を用いてワクチンを調製する方法が存在する。これらの細胞性ワクチンは、ＧＭ−ＣＳＦを発現するように腫瘍細胞を形質転換した時、最も有効であることが明らかとなっている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種にとって抗原提示の強力な活性化剤であることが明らかとなっている（Ｄｒａｎｏｆｆら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：３５３９−４３）。

様々な腫瘍における遺伝子発現と大規模な遺伝子発現パターンの研究により、いわゆる腫瘍特異的抗原が定義されることになった（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：２８１−７）。多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍中および腫瘍が起こった細胞中で発現する分化抗原であり、例えば、メラノサイト抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原およびＴｒｐ−２である。さらに重要なこととして、これらの抗原の多くが宿主において発見された腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であることを示されている。ある態様において、ここに述べた抗原組成物を用いた、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４による複合的な阻害は、腫瘍で発現した組み換えタンパク質および／またはペプチドの集団とともに、これらのタンパク質に対する免疫応答を生み出すために用いることができる。これらのタンパク質は、通常、免疫系によって自己抗原とみなさるため、それらに対して寛容である。腫瘍抗原にはまた、タンパク質テロメラーゼを含むことができ、それは、染色体テロメアの合成に必要でかつそれは８５％を超えるヒト癌と限定された体細胞組織にみで発現する（Ｋｉｍ，Ｎら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：２０１１−２０１３）。（これらの体細胞組織は、さまざまな手段で免疫攻撃から保護されている）。腫瘍抗原は、タンパク質配列を改変するかまたは２個の関連のない配列（すなわち、フィラデルフィア染色体におけるｂｃｒ−ａｂ１）の融合タンパク質を生じる体細胞変異であるため、癌細胞に発現する“新抗原”であり得るか、またはＢ細胞腫瘍由来のイデオタイプであり得る。

他の腫瘍ワクチンには、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）およびカポジヘルペス肉腫ウイルス（ＫＨＳＶ）のようなヒト癌で指摘されているウイルス由来のタンパク質を含むことができる。ＰＤ−１阻害薬と併用して使用できる、腫瘍特異的抗原の別の形態は、腫瘍組織それ自体から単離した精製熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）である。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞由来のタンパク質断片を含み、これらのＨＳＰは、腫瘍免疫性惹起のために抗原提示細胞への運搬が極めて効率的である（Ｓｕｏｔ，Ｒ＆Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｐ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１５８５−１５８８、Ｔａｍｕｒａ，Ｙ．ら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１１７−１２０）。

樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的応答を引き起こすために使用できる強力な抗原提示細胞である。ＤＣは、エクスビボで作り出すことができ、腫瘍細胞抽出物と同様、様々なタンパク質およびペプチド抗原および腫瘍細胞抽出物を産生することができる（Ｎｅｓｔｌｅ，Ｆ．ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：３２８−３３２）。ＤＣはまた、遺伝的手段により形質導入でき、同様にこれらの腫瘍抗原を発現させることができる。ＤＣはまた、免疫を目的として直接腫瘍細胞に融合させている（Ｋｕｇｌｅｒ、Ａ．ら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：３３２−３３６）。ワクチン化方法として、ＤＣ免疫をＰＤ−１とＣＴＬＡ−４複合阻害薬と効果的にさらに組み合わせることで、より強力な抗腫瘍応答を活性化することができる。

ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４複合阻害薬はまた、標準的な癌の治療法と組み合わせることができる。例えば、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４の複合阻害薬は、化学療法とも効果的に組み合わせることができる。これらの場合、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体を併用することで観察されたように、ここに開示した併用して投与する化学療法剤の投与量を少なくすることも可能である（Ｍｏｋｙｒら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：５３０１−５３０４）。このような組み合わせの例としては、メラノーマ治療のため、さらに、デカルバチンと併用して組み合わせた抗ＰＤ−１抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体が挙げられる。このような組み合わせの他の例としては、メラノーマ治療のためのインターロイキン−２（ＩＬ−２）と併用した抗ＰＤ−１抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体が挙げられる。ＰＤ−１と抗ＣＴＬＡ−４複合阻害薬と化学療法を併用することの背後にある科学的理論とは、ほとんどの化学療法化合物の細胞毒性作用がもたらす細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原レベルの増加をもたらすはずであるということである。細胞死を介したＰＤ−１とＣＴＬＡ−４複合阻害薬と相乗作用をもたらす他の組合せ療法は、放射線、外科およびホルモン療法である。これらのプロトコールのそれぞれは、宿主中で腫瘍抗原の起源を作る。血管新生阻害剤はまた、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４複合阻害薬と組み合わせることができる。血管新生阻害は腫瘍細胞死を起こすことによって、宿主抗原提示経路に腫瘍抗原を供給できる。

ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４阻害抗体の併用はまた、腫瘍細胞をＦｃαまたはＦｃγレセプター発現エフェクター細胞の標的とするような二重特異性抗体と併用して用いることができる（例えば、米国特許５，９２２，８４５および５，８３７，２４３を参照）。二重特異性抗体を用いて、２種の別々の抗原を標的とすることもできる。例えば、抗Ｆｃレセプター／抗腫瘍抗原（例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）二重特異性抗体は、腫瘍部位をマクロファージの標的としている。この標的化によって、より効果的に腫瘍特異的応答を活性化できる。これらの応答におけるＴ細胞の攻撃力は、ＰＤ−１とＣＴＬＡ−４複合阻害薬の使用により増強することができる。これとは別に、抗原を直接、腫瘍抗原と樹状細胞特異的細胞表面マーカーに結合する二重特異性抗体を用いてＤＣに運搬させることもできる。

別の例として、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体併用は、リツキサン（登録商標）（リツキシマブ）、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）、ベキサール（登録商標）（トシツモマブ）、ゼバリン（登録商標）（イブリツモマブ）、カムパス（登録商標）（アレムツズマブ）、リンホサイド（登録商標）（エプルチズマブ）、アバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）、およびタルセバ（登録商標）（エルロチニブ）等のような抗腫瘍抗体と併用して用いることができる。一例として、理論に拘束されることはないが、抗癌抗体または毒素と結合させた抗癌抗体を用いて治療することによって、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１介在性免疫応答を増強するであろう癌細胞死（例えば、腫瘍細胞）をもたらすことができる。実施形態として、例えば、高増殖性疾患（例えば、癌性腫瘍）の治療には、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体と同時または順次またはその組み合わせによる併用して用いる抗癌抗体を含んでいてもよく、それらは、宿主による抗腫瘍免疫応答を増強することができる。

腫瘍は、極めて様々なメカニズムにより宿主免疫監視を回避する。これらのメカニズムの多くは、腫瘍に発現しかつ免疫抑制性であるタンパク質を不活性化することにより克服できる。これらには、特に、ＴＧＦ−β（Ｋｅｈｒｌ、Ｊ．ら（１９８６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １６３：１０３７−１０５０）、ＩＬ−１０（Ｈｏｗａｒｄ，Ｍ．＆Ｏ´Ｇａｒｒａ，Ａ．（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １３：１９８−２００）、およびＦａｓリガンド（Ｈａｈｎｅ，Ｍ．ら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：１３６３−１３６５）が含まれる。これらすべてのそれぞれに対する抗体は、抗ＰＤ−１と抗ＣＴＬＡ−４の組み合わせと併用して用いることができ、免疫抑制剤の効果に対抗しかつ宿主による腫瘍免疫応答に有利に作用する。

宿主免疫応答性を活性化させるために使用できる他の抗体は、抗ＰＤ−１と抗ＣＴＬＡ−４の組み合わせと併用して用いることができる。これらには、ＤＣ機能と抗原提示を活性化させる樹状細胞の表面上の分子が含まれる。抗ＣＤ４０抗体は、有効にＴ細胞ヘルパー活性の代わりとなることができ（Ｒｉｄｇｅ，Ｊ．ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４７４−４７８）、ＰＤ−１抗体およびＣＴＬＡ−４抗体と併用使用できる（Ｉｔｏ、Ｎ．ら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１（５）５２７−４０）。ＯＸ−４０（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．ら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：２１６０−２１６９）、４−１ＢＢ（Ｍｅｌｅｒｏ，Ｉ．ら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：６８２−６８５（１９９７））およびＩＣＯＳ（Ｈｕｔｌｏｆｆ，Ａ．ら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ３９７：２６２−２６６）のようなＴ細胞共刺激性の分子に対する抗体活性化もまた、Ｔ細胞の活性化レベルを増加することができる。

骨髄移植は現在、様々な造血系由来の腫瘍の治療に使用されている。移植片対宿主疾患がこの治療の結末であるので、治療上の利益は、移植片対腫瘍応答から得ることができる。抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４複合阻害薬を用いて、ドナーから移植した腫瘍特異的Ｔ細胞の効果を高めることができる。

また、腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を誘発するため、抗原特異的Ｔ細胞のエクスビボ活性化および進展ならびにこれらの細胞のレシピーエントへの養子導入を含む試験的な治療プロトコールがいくつか存在する（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｒ．＆Ｒｉｄｄｅｌｌ，Ｓ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：５４６−５１）。これらの方法は、ＣＭＶのような感染性物質に対するＴ細胞応答を活性化するために用いることもできる。抗ＰＤ−１抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体存在下におけるエクスビボ活性化は、養子導入したＴ細胞の頻度および活性を高めると予測できる。

本文に述べたように、免疫刺激治療の抗体療法後、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体による治療後の消化管（下痢および大腸炎）および皮膚（発疹および膿胞）のような臓器は免疫関連性の有害事象を示す。例えば、非結腸性消化管免疫関連性の有害事象もまた、抗ＣＴＬＡ−４抗体療法後の食道（食道炎）、十二指腸（十二指腸炎）および回腸（回腸炎）で観察されている。

ある態様において、本発明は、被験者に対して抗ＰＤ−１抗体と治療用量以下の抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与することを含む、免疫刺激剤による高増殖性疾患治療に関連する有害事象を回避する方法を提供する。例えば、本発明の方法は、非吸収性ステロイドを患者に投与することを含む、免疫刺激治療抗体−誘発回腸炎または下痢の頻度を低下させる方法を提供する。免疫刺激治療抗体を投与されるいずれの患者もこのような抗体によって誘発された回腸炎または下痢を発症するリスクがあるので、この全患者群は、本発明の方法による治療に適している。ステロイドは炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を治療しかつＩＢＤの増悪を防止するために投与されてきたのであるが、それらは、ＩＢＤと診断されなかった患者のＩＢＤを予防するために（その頻度を低下させるために）使用されたことはなかった。ステロイドに関連した深刻な副作用は、非吸収性ステロイドでさえも予防用途には適していなかった。

さらに態様において、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４複合阻害（すなわち、免疫刺激治療抗体抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４）はさらに、いかなる非吸収性ステロイドの使用とも組み合わせることができる。本文中、“非吸収性ステロイド”とは、肝での代謝後ステロイドの生体利用性が約２０％未満と低くなるように広い初回通過代謝を示す糖質コルチコイドステロイドである。本発明の一態様において、非吸収性ステロイドは、ブデソニドである。ブデソニドは局所作用性の糖質コルチコイドで、経口投与後、主に、肝により広く代謝される。ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（登録商標）（アストラ−ゼネカ）はブデソニドのｐＨおよび時間依存性経口製剤であり、回腸への薬物運搬および結腸全体における薬物運搬を最適化するように開発された。ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（登録商標）は、米国において回腸および／または下向結腸を巻き込む軽度から中等度のクローン病の治療に承認されている。クローン病治療のための通常の用量のＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（登録商標）は、６〜９ｍｇ／日である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（登録商標）は、消化管粘膜から吸収され保持される前に小腸において放出される。いったん消化管粘膜標的組織を通過すると、ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（登録商標）は、肝のサイトクロームＰ４５０系で広く代謝物に代謝されるが、糖質コルチコイド活性は無視できる。したがって、生体利用性は低い（約１０％）。ブデソニドの生体利用性が低いことから、ファーストパス代謝がそれほど広範ではない他の糖質コルチコイドに比較して治療率が改善されることになる。ブデソニドは有害事象はほとんどなく、全身作用性のコルチコステロイドに比較して、視床下部−下垂体抑制は少ない。しかし、ＥＮＴＯＣＯＲＴ ＥＣ（登録商標）の慢性的投与の結果、高コルチコイド症や副腎抑制のような全身的糖質コルチコイド効果が起こることになる。ＰＤＲ 第５８版、２００４；６０８−６１０を参照。

さらに別の態様において、非吸収性ステロイドと組み合わせたＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４複合阻害（すなわち、免疫刺激治療抗体抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４）はさらに、サリシレートと組み合わせることができる。サリシレートには、例えば、スルファサラジン（ＡＺＵＬＦＩＤＩＮＥ（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆ＵｐＪｏｈｎ）、オルサラジン（ＤＩＰＥＮＴＵＭ（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆ＵｐＪｏｈｎ）、バルサラジド（ＣＯＬＡＺＡＬ（登録商標）、Ｓａｌｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）およびメサラミン（ＡＳＡＣＯＬ（登録商標）、Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＰＥＮＴＡＳＡ（登録商標）、Ｓｈｉｒｅ ＵＳ；ＣＡＮＡＳＡ（登録商標），Ａｘｃａｎ Ｓｃａｎｄｉｐｈａｒｍ，Ｉｎｃ．；ＲＯＷＡＳＡ（登録商標）、Ｓｏｌｖａｙ）のような５−ＡＳＡ剤が含まれる。

本発明の方法によれば、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体および非吸収性ステロイドと併用投与したサリシレートは、免疫刺激抗体によって誘発された大腸炎頻度を低下させる目的で、サリシレートおよび非吸収性ステロイドの重複または順次投与を含んでいてもよい。したがって、例えば、本発明の免疫刺激抗体によって誘発された大腸炎頻度を低下させる方法は、サリシレートおよび非吸収性ステロイドを同時にまたは順次（例えば、サリシレートを非吸収性ステロイドの６時間後に投与する）またはそのいかなる組み合わせ投与も含む。さらに本発明によれば、サリシレートおよび非吸収性ステロイドは、同一経路（例えば、両者を経口投与する）または異なる経路（例えば、サリシレートを経口投与し、非吸収性ステロイドを直腸投与する）により投与でき、それらは、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体投与に用いた経路とは異なっていてもよい。

本発明をさらに下記の実施例で説明するが、それらは、さらに限定するものとしてはみなしてはいけない。本明細書で引用した図全ておよび参考文献、特許および公表された特許出願は、本文で参考文献として組み込まれている。

（実施例１）
ＰＤ−１に対するヒトモノクローナル抗体の作製
抗原
抗原として、免疫プロトコールでは、（ｉ）ＰＤ−１の細胞外部分を含む組み換え融合タンパク質および（ｉｉ）膜結合全長ＰＤ−１の両者を利用した。両抗原とも、ＣＨＯ細胞株中で組み換えトランスフェクション方法により作製した。

形質転換ＨｕＭａｂおよびＫＭマウス（商標）
ＰＤ−１に対する完全ヒトモノクローナル抗体を、それぞれがヒト抗体遺伝子を発現するＨｕＭａｂ形質転換マウスのＨＣｏ７系と形質転換トランス染色体マウスのＫＭ系を用いて調製した。これらのマウス系のそれぞれにおいて、内因性マウスκ軽鎖遺伝子を、Ｃｈｅｎら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ． １２：８１１−８２０に記載のようにホモ接合により破壊し、内因性マウス重鎖遺伝子は、ＰＣＴ公報ＷＯ０１／０９１８７の実施例１に記載のように、ホモ接合により破壊した。これらのマウス系のそれぞれは、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１に記載されているようにヒトκ軽鎖導入遺伝子ＫＣｏ５を有している。ＨＣｏ７系は、米国特許５，５４５，８０６、５，６２５，８２５、および５，５４５，８０７に記載されているように、ＨＣｏ７ヒト重鎖導入遺伝子を有している。ＫＭ系は、ＰＣＴ公報ＷＯ０２／４３４７８に記載されているように、ＳＣ２０トランス染色体を含む。

ＨｕＭａｂおよびＫＭの免疫
ＰＤ−１に対する完全ヒトモノクローナル抗体を産生させるため、ＨｕＭａｂおよびＫＭマウス（商標）を、精製組み換えＰＤ−１融合タンパク質およびＰＤ−１移入ＣＨＯ細胞を抗原として免疫した。ＨｕＭａｂマウスのための一般的免疫スキームは、Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎ．ら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８（６４７４）：８５６−８５９；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１およびＰＣＴ公報ＷＯ９８／２４８８４に記載されている。当該マウスは、第１回抗原注入時に６−１６週齢であった。ＰＤ−１融合タンパク質抗原と５−１０×１０^６細胞の精製組み換え調製物（５〜５０μｇ）を用いて、ＨｕＭａｂマウスおよびＫＭマウス（商標）を腹腔内、皮下（Ｓｃ）または足蹠注入により免疫した。

形質転換マウスは完全フロイントアジュバントまたはＲｉｂｉアジュバント中抗原で、腹腔内に、２回免疫し、次に不完全フロイントアジュバントまたはＲｉｂｉアジュバント中抗原により（総計１１回まで）、腹腔内に３〜２１日間免疫した。免疫応答は、眼窩後方出血によりモニタリングした。血漿は、ＥＬＩＳＡ（下記に説明）によりスクリーニングし、抗ＰＤ−１ヒトイムノグロブリンの十分な力価をもつマウスを融合に用いた。屠殺３日前にマウスに抗原を静注によりブーストし、脾臓を除去した。典型的には、各抗原について１０〜３５回の注入を行った。数ダースのマウスを各抗原について免疫した。

抗ＰＤ−１抗体産生ＨｕＭａｂまたはＫＭマウス（商標）の選択
ＰＤ−１に結合する抗体を産生するＨｕＭａｂまたはＫＭマウス（商標）を選択するため、免疫マウス由来の血清をＦｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ら（１９９６）に記載のようにＥＬＩＳＡによって試験した。簡単に述べると、マイクロタイタープレートに、ＰＢＳ中１〜２μｇ／ｍＬで形質移入ＣＨＯ細胞由来の精製組み換えＰＤ−１融合タンパク質をコートし、１００μＬ／ウェルを４℃で一晩インキュベーションし、次に、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）中５％ウシ胎児血清によりブロックした。ＰＤ−１免疫マウス由来の血清希釈物を各ウェルに添加し、室温で１〜２時間インキュベーションした。このプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、その後、西洋わさびパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体とともに室温で１時間インキュベーションした。洗浄後、プレートをＡＢＴＳ基質（Ｓｉｇｍａ，Ａ−１８８８，０．２２ｍｇ／ｍＬ）で発色させ、分光光度計によりＯＤ４１５−４９５で分析した。最大力価の抗ＰＤ−１抗体を産生したマウスを融合に使用した。融合は、下記に記載のように実施し、ハイブリドーマ上清を、ＥＬＩＳＡにより抗ＰＤ−１活性について試験した。

ＰＤ−１に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの産生
ＨｕＭａｂまたはＫＭマウスから単離したマウス脾臓細胞を、標準的プロトコールによるＰＥＧまたはＣｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ大型チェンバー細胞融合エレクトポレータ（Ｃｙｔｏ Ｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ，ＭＤ）を用いる電場に基づくエレクトロフュージョンを用いて、マウス骨髄細胞株に融合させた。生成したハイブリドーマは、次に抗原結合抗体の産生をスクリーニングした。免疫マウスからの脾臓細胞の単細胞懸濁物を、５０％ＰＥＧ（Ｓｉｇｍａ）により、その４分の１数のＳＰ２／０非分泌性マウス骨髄細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８１）に融合させた。細胞を、約１×１０^５／ウェルで平底マイクロタイタープレートに接種し、１０％胎児クローン血清、１０％Ｐ３８８Ｄ１（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ ＴＩＢ−６３）調製培地、ＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，ＣＲＬ １００１３、高グルコース、Ｌ−グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを有する）中３〜５％オリゲン（ＩＧＥＮ）及び５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５０ｍｇ／ｍＬ ゲンタマイシン、および１ＸＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ、ＣＲＬ Ｐ−７１８５）を含む選択培地中で約２週間、インキュベーションした。１〜２週後、細胞を、ＨＡＴをＨＴに置き換えた培地中で培養した。次に、それぞれのウェルを、ヒト抗ＰＤ−１モノクローナルＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡ（上記で記載）でスクリーニングした。いったん強いハイブリドーマ増殖が起こったならば、培地を通常１０〜１４日後にモニタリングした。抗体分泌ハイブリドーマを再度接種し、再度スクリーニングし、もしヒトＩｇＧがまだ陽性であるならば、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体を少なくとも２回、限定希釈によってサブクローニングした。次に、安定なサブクローンをインビトロで培養し、少量の抗体を組織培地に産生させ、さらに特性解析した。

ハイブリドーマ１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４を選択し、さらに分析した。

（実施例２）
ヒトモノクローナル抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４の構造特性解析
１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４の重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列を、標準的ＰＣＲ技術を用いて１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４ハイブリドーマからそれぞれ得て、標準的ＤＮＡ配列決定技術を用いて配列決定した。

１７Ｄ８の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図１Ａおよび配列番号５７および１にそれぞれ示した。

１７Ｄ８の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図１Ｂおよび配列番号６４および８にそれぞれ示した。

１７Ｄ８重鎖イムノグロブリン配列を公知のヒト生殖細胞型イムノグロブリン重鎖配列と比較し、１７Ｄ８重鎖がヒト生殖細胞型ＶＨ３−３３由来のＶＨ部分、未決定Ｄ部分、およびヒト生殖細胞型ＪＨ４ｂ由来のＪＨ部分を利用することを明らかにした。１７Ｄ８ ＶＨ配列の生殖細胞ＶＨ３−３３配列への配列比較を図８に示した。さらに１７Ｄ８ ＶＨ配列をＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いて分析し、図１Ａおよび８ならびにそれぞれ配列番号１５、２２および２９に示した重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域を図示できた。

１７Ｄ８軽鎖イムノグロブリン配列を公知のヒト生殖細胞型イムノグロブリン軽鎖配列と比較し、１７Ｄ８軽鎖がヒト生殖細胞型ＶＫ Ｌ６由来のＶＬ部分およびヒト生殖細胞型ＪＫ４由来のＪＫ部分を利用することを明らかにした。１７Ｄ８ ＶＬ配列の生殖細胞ＶＫ Ｌ６配列への配列比較を図９に示した。さらに１７Ｄ８ ＶＬ配列をＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いて分析し、図１Ｂおよび９ならびにそれぞれ配列番号３６、４３および５０に示した軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域を図示できた。

２Ｄ３の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図２Ａおよび配列番号５８および２にそれぞれ示した。

２Ｄ３の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図２Ｂおよび配列番号６５および９にそれぞれ示した。

２Ｄ３重鎖イムノグロブリン配列を公知のヒト生殖細胞型イムノグロブリン重鎖配列と比較し、２Ｄ３重鎖がヒト生殖細胞型ＶＨ３−３３由来のＶＨ部分、ヒト生殖細胞型７−２７由来のＤ部分、およびヒト生殖細胞型ＪＨ４ｂ由来のＪＨ部分を利用することを明らかにした。２Ｄ３ ＶＨ配列の生殖細胞ＶＨ３−３３配列への配置を図８に示した。さらに２Ｄ３ ＶＨ配列をＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いて分析し、図２Ａおよび８ならびにそれぞれ配列番号１６、２３および３０に示した重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域を図示できた。

２Ｄ３軽鎖イムノグロブリン配列を公知のヒト生殖細胞型イムノグロブリン軽鎖配列と比較し、２Ｄ３軽鎖がヒト生殖細胞型ＶＫ Ｌ６由来のＶＬ部分およびヒト生殖細胞型ＪＫ４由来のＪＫ部分を利用することを明らかにした。２Ｄ３ ＶＬ配列の生殖細胞ＶＫ Ｌ６配列への配列比較を図９に示した。さらに２Ｄ３ ＶＬ配列をＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いて分析し、図２Ｂおよび９ならびにそれぞれ配列番号３７、４４および５１に示した軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域を図示できた。

４Ｈ１の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図３Ａおよび配列番号５９および３にそれぞれ示した。

４Ｈ１の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図３Ｂおよび配列番号６６および１０にそれぞれ示した。

４Ｈ１重鎖イムノグロブリン配列を公知のヒト生殖細胞型イムノグロブリン重鎖配列と比較し、４Ｈ１重鎖がヒト生殖細胞型ＶＨ３−３３由来のＶＨ部分、未決定Ｄ部分、およびヒト生殖細胞型ＪＨ ４ｂ由来のＪＨ部分を利用することを明らかにした。４Ｈ１ ＶＨ配列の生殖細胞ＶＨ３−３３配列への配列比較を図８に示した。さらに４Ｈ１ ＶＨ配列をＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いて分析し、図３Ａおよび８ならびにそれぞれ配列番号１７、２４および３１に示した重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域を図示できた。

４Ｈ１軽鎖イムノグロブリン配列を公知のヒト生殖細胞型イムノグロブリン軽鎖配列と比較し、４Ｈ１軽鎖がヒト生殖細胞型ＶＫ Ｌ６由来のＶＬ部分およびヒト生殖細胞型ＪＫ １由来のＪＫ部分を利用することを明らかにした。４Ｈ１ ＶＬ配列の生殖細胞ＶＫ Ｌ６配列への配列比較を図１０に示した。さらに、４Ｈ１ ＶＬ配列をＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いて分析し、図３Ｂおよび１０ならびにそれぞれ配列番号３８、４５および５２に示した軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域を図示できた。

５Ｃ４の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図４Ａおよび配列番号６０および４にそれぞれ示した。

５Ｃ４の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図４Ｂおよび配列番号６７および１１にそれぞれ示した。

５Ｃ４重鎖イムノグロブリン配列を公知のヒト生殖細胞型イムノグロブリン重鎖配列と比較し、５Ｃ４重鎖がヒト生殖細胞型ＶＨ３−３３由来のＶＨ部分、未決定Ｄ部分、およびヒト生殖細胞型ＪＨ ４ｂ由来のＪＨ部分を利用することを明らかにした。５Ｃ４ ＶＨ配列との生殖細胞ＶＨ３−３３配列への配列比較を図８に示した。さらに５Ｃ４ ＶＨ配列をＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いて分析し、図４Ａおよび８ならびにそれぞれ配列番号１８、２５および３２に示した重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域を図示できた。

５Ｃ４軽鎖イムノグロブリン配列を公知のヒト生殖細胞型イムノグロブリン軽鎖配列と比較し、５Ｃ４軽鎖がヒト生殖細胞型ＶＫ Ｌ６由来のＶＬ部分およびヒト生殖細胞型ＪＫ １由来のＪＫ部分を利用することを明らかにした。５Ｃ４ ＶＬ配列の生殖細胞ＶＫ Ｌ６配列への配列比較を図１０に示した。さらに５Ｃ４ ＶＬ配列をＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いて分析し、図４Ｂおよび１０ならびにそれぞれ配列番号３９、４６および５３に示した軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域を図示できた。

４Ａ１１の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図５Ａおよび配列番号６１および５にそれぞれ示した。

４Ａ１１の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図５Ｂおよび配列番号６８および１２にそれぞれ示した。

４Ａ１１重鎖イムノグロブリン配列を公知のヒト生殖細胞型イムノグロブリン重鎖配列と比較し、４Ａ１１重鎖がヒト生殖細胞型ＶＨ４−３９由来のＶＨ部分、ヒト生殖細胞型３−９由来のＤ部分、およびヒト生殖細胞型ＪＨ ４ｂ由来のＪＨ部分を利用することを明らかにした。４Ａ１１ ＶＨ配列の生殖細胞ＶＨ４−３９配列への配列比較を図１１に示した。さらに、４Ａ１１ ＶＨ配列をＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いて分析し、図５Ａおよび１１ならびにそれぞれ配列番号１９、２６および３３に示した重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域を図示できた。

４Ａ１１軽鎖イムノグロブリン配列を公知のヒト生殖細胞型イムノグロブリン軽鎖配列と比較し、４Ａ１１軽鎖がヒト生殖細胞型ＶＫ Ｌ１５由来のＶＬ部分およびヒト生殖細胞型ＪＫ １由来のＪＫ部分を利用することを明らかにした。４Ａ１１ ＶＬ配列の生殖細胞ＶＫ Ｌ６配列への配列比較を図１２に示した。さらに、４Ａ１１ ＶＬ配列をＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いて分析し、図５Ｂおよび１２ならびにそれぞれ配列番号４０、４７および５４に示した軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域を図示できた。

７Ｄ３の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図７Ａおよび配列番号６２および６にそれぞれ示した。

７Ｄ３の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図７Ｂおよび配列番号６９および１３にそれぞれ示した。

７Ｄ３重鎖イムノグロブリン配列を公知のヒト生殖細胞型イムノグロブリン重鎖配列と比較し、７Ｄ３重鎖がヒト生殖細胞型ＶＨ３−３３由来のＶＨ部分、ヒト生殖細胞型７−２７Ｄ部分、およびヒト生殖細胞型ＪＨ ４ｂ由来のＪＨ部分を利用することを明らかにした。７Ｄ３ ＶＨ配列の生殖細胞ＶＨ３−３３配列への配列比較を図８に示した。さらに、７Ｄ３ ＶＨ配列をＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いて分析し、図６Ａおよび８ならびにそれぞれ配列番号２０、２７および３４に示した重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域を図示できた。

７Ｄ３軽鎖イムノグロブリン配列を公知のヒト生殖細胞型イムノグロブリン軽鎖配列と比較し、７Ｄ３軽鎖がヒト生殖細胞型ＶＫ Ｌ６由来のＶＬ部分およびヒト生殖細胞型ＪＫ ４由来のＪＫ部分を利用することを明らかにした。７Ｄ３ ＶＬ配列の生殖細胞ＶＫ Ｌ６配列への配列比較を図９に示した。さらに７Ｄ３ ＶＬ配列をＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いて分析し、図６Ｂおよび９ならびにそれぞれ配列番号４１、４８および５５に示した軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域を図示できた。

５Ｆ４の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図７Ａおよび配列番号６３および７にそれぞれ示した。

５Ｆ４の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図７Ｂおよび配列番号７０および１４にそれぞれ示した。

５Ｆ４重鎖イムノグロブリン配列を公知のヒト生殖細胞型イムノグロブリン重鎖配列と比較し、５Ｆ４重鎖がヒト生殖細胞型ＶＨ４−３９由来のＶＨ部分、ヒト生殖細胞３−９由来のＤ部分、およびヒト生殖細胞型ＪＨ ４ｂ由来のＪＨ部分を利用することを明らかにした。５Ｆ４ ＶＨ配列の生殖細胞ＶＨ４−３９配列への配列比較を図１１に示した。さらに、５Ｆ４ ＶＨ配列をＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いて分析し、図７Ａおよび１１ならびにそれぞれ配列番号２１、２８および３５に示した重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域を図示できた。

５Ｆ４軽鎖イムノグロブリン配列を公知のヒト生殖細胞型イムノグロブリン軽鎖配列と比較し、５Ｆ４軽鎖がヒト生殖細胞型ＶＫ Ｌ１５由来のＶＬ部分およびヒト生殖細胞型ＪＫ １由来のＪＫ部分を利用することを明らかにした。５Ｆ４ ＶＬ配列の生殖細胞ＶＫ Ｌ６配列への配列比較を図１２に示した。さらに、５Ｆ４ ＶＬ配列をＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いて分析し、図７Ｂおよび１２ならびにそれぞれ配列番号４２、４９および５６に示した軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域を図示できた。

（実施例３）
抗ＰＤ−１ヒトモノクローナル抗体の結合特性および結合動態の特性解析
この実施例では、抗ＰＤ−１抗体の結合特性および結合動態をビアコア分析により調べた。結合特性および交差競合性は、フローサイトメトリーによって調べた。

結合親和性と動態
抗ＰＤ−１抗体は、ビアコア分析（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）によって親和性と結合動態を特性解析した。精製した組み換えヒトＰＤ−１融合タンパク質を、１級アミンによりＣＭ５チップ（カルボキシメチルデキストラン塗布チップ）に標準的アミンカップリング化学およびビアコアが提供しているキットを用いて、共有結合させた。結合は、濃度２６７ｎＭでかつフロー速度５０μＬ／分でＨＢＳ ＥＰ緩衝液（ビアコアＡＢ提供）中に抗体を流すことによって測定した。抗原抗体会合動態は、３分間追跡し、解離動態は、７分間追跡した。会合および解離曲線は、ＢＩＡ評価ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を用いて、１：１ラングミュア結合モデルに適合した。結合定数推定においてアビィディティ効果を最小とするため、会合および解離相に対応する最初のデータ部分のみを適合に使用した。決定したＫ_Ｄ、ｋ_ｏｎおよびｋ_ｏｆｆ値を表２に示した。

フローサイトメトリによる結合特性
細胞表面で組み換えヒトＰＤ−１を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を作製し、ＰＤ−１ヒトモノクローナル抗体の特異性をフローサイトメトリーで決定するために用いた。ＣＨＯ細胞に、膜型ＰＤ−１をコードする全長ｃＤＮＡを含む発現プラスミドを移入させた。５Ｃ４および４Ｈ１抗ＰＤ−１ヒトモノクローナル抗体の結合を、移入細胞と２０μｇ／ｍＬの抗ＰＤ−１ヒトモノクローナル抗体とをインキュベーションすることによって評価した。細胞を洗浄し、結合をＦＩＴＣ−標識抗ヒトＩｇＧ Ａｂにより検出した。フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳスキャンフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて行った。結果を、図１３Ａ（５Ｃ４）および１３Ｂ（４Ｈ１）に示した。抗ＰＤ−１ヒトモノクローナル抗体は、ＰＤ−１移入ＣＨＯ細胞に結合したが、ヒトＰＤ−１を移入していなかったＣＨＯ細胞には結合しなかった。これらのデータは、ＰＤ−１に対する抗ＰＤ−１ヒトモノクローナル抗体の特異性を明らかにしている。

他のＣＤ２８ファミリーメンバーに対するＥＬＩＳＡによる結合特性
ＣＤ２８ファミリーメンバーに対する抗ＰＤ−１抗体の結合比較を、４種の異なるＣＤ２８ファミリーメンバーを用いる標準的ＥＬＩＳＡにより行い、ＰＤ−１に対する結合特性を調べた。

ＣＤ２８ファミリーメンバーＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の融合タンパク質を、抗ＰＤ−１ヒトモノクローナル抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４および４Ａ１１に対する結合について試験した。標準的ＥＬＩＳＡ操作を実施した。抗ＰＤ−１ヒトモノクローナル抗体は、濃度２０μｇ／ｍＬで添加した。西洋わさびパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ（κ鎖特異的）ポリクローナル抗体を第２抗体として用いた。結果を図１４に示した。抗ＰＤ−１ヒトモノクローナル抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４のそれぞれは、高い特異性でＰＤ−１に結合したが、他のＣＤ２８ファミリーメンバーには結合しなかった。

（実施例４）
ヒトおよびサル細胞表面で発現したＰＤ−１に対する抗ＰＤ−１抗体結合の特性解析
抗ＰＤ−１抗体について、細胞表面におけるＰＤ−１発現細胞への結合をフローサイトメトリーによって試験した。

活性化ヒトＴ細胞、サル末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびＰＤ−１移入ＣＨＯ細胞をそれぞれ、抗体結合について試験した。ヒトＴ細胞およびカニクイザルＰＢＭＣを、抗ＣＤ３抗体により活性化させ、ヒト抗ＰＤ−１モノクローナル抗体による結合前にＴ細胞上にＰＤ−１発現を誘導させた。５Ｃ４および４Ｈ１抗ＰＤ−１ヒトモノクローナル抗体の結合は、移入細胞を抗ＰＤ−１ヒトモノクローナル抗体のＩｇＧまたはＩｇＧ４のいずれかと異なる濃度でインキュベーションすることによって評価した。細胞を洗浄し、結合をＦＩＴＣ−標識抗ヒトＩｇＧ Ａｂにより検出した。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳスキャンフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて行った。その結果を図１５Ａ（活性化ヒトＴ細胞）、１５Ｂ（カニクイザルＰＢＭＣ）および１５Ｃ（ＰＤ−１移入ＣＨＯ細胞）に示した。抗ＰＤ−１ヒトモノクローナル抗体５Ｃ４および４Ｈ１は、活性化Ｔ細胞、活性化サルＰＢＭＣおよびヒトＰＤ−１移入ＣＨＯ細胞に結合し、染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定した。これらのデータは、抗ＰＤ−１ ＨｕＭａｂが、ヒトおよびカニクイザル細胞表面ＰＤ−１の両者に結合することを明らかにしている。

（実施例５）
混合リンパ球反応における細胞増殖およびサイトカイン産生に及ぼすヒト抗ＰＤ−１抗体の効果
混合リンパ球反応を用いて、リンパ球エフェクター細胞へのＰＤ−１経路を阻害する効果を明らかにした。本アッセイにおけるＴ細胞について、抗ＰＤ−１ ＨｕＭａｂ抗体存在下または非存在下における増殖、ＩＦＮ−γ分泌およびＩＬ−２分泌を試験した。

ヒトＴ細胞は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞高含量カラム（Ｒ＆Ｄシステム）を用いてＰＢＭＣから精製した。各培養物は、１０^５個の精製Ｔ細胞と１０^４個の同種異系の樹状細胞を総容量２００μＬ中に含んでいた。抗ＰＤ−１モノクローナル抗体５Ｃ４、４Ｈ１、１７Ｄ８、２Ｄ３または５Ｃ４のＦａｂ断片部分を、異なる抗体濃度で各培養物に添加した。抗体を全く用いないかまたはアイソタイプコントロール抗体を、陰性コントロールとして使用した。細胞を３７℃で５日間培養した。第５日後、培地１００μＬを各培養物から採取し、サイトカインを測定した。ＩＦＮ−γと他の抗体のレベルは、ＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。細胞を^３Ｈ−チミジンで標識し、さらに１８時間培養し、細胞増殖を分析した。その結果を図１６Ａ（Ｔ細胞増殖）、１６Ｂ（ＩＦＮ−γ分泌）および１６Ｃ（ＩＬ−２分泌）に示した。抗ＰＤ−１ヒトモノクローナル抗体は、Ｔ細胞増殖、ＩＦＮ−γ分泌およびＩＬ−２分泌を濃度依存的に促進した。５Ｃ４のＦａｂ断片もまたＴ細胞増殖、ＩＦＮ−γ分泌およびＩＬ−２分泌を濃度依存的に促進した。対照的に、アイソタイプコントロール抗体を含む培養物は、Ｔ細胞増殖、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−２分泌の上昇を示さなかった。

（実施例６）
ヒト抗ＰＤ−１抗体によるＰＤ−１に対するリガンド結合阻害
抗ＰＤ−１ ＨｕＭａｂを、フローサイトメトリー分析を用いることによって移入ＣＨＯ細胞上で発現したＰＤ−１に対するリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の結合阻害能を試験した。

ＰＤ−１発現ＣＨＯ細胞は、ＦＡＣＳ緩衝液（４％ウシ胎児血清を有するＰＢＳ）中に懸濁した。様々な濃度の抗ＰＤ−１ ＨｕＭａｂ ５Ｃ４および４Ｈ１を当該細胞懸濁液に添加し、４℃で３０分間インキュベーションした。未結合抗体を洗浄除去し、ＦＩＴＣ−標識ＰＤ−Ｌ１融合タンパク質またはＦＩＴＣ−標識ＰＤ−Ｌ２融合タンパク質を当該試験管に添加し、４℃で３０分間インキュベーションした。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳスキャンフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて実施した。その結果を図１７Ａ（ＰＤ−Ｌ１の阻害）および１７Ｂ（ＰＤ−Ｌ２の阻害）に示した。抗ＰＤ−１モノクローナル抗体５Ｃ４および４Ｈ１は、ヒトＰＤ−１移入ＣＨＯ細胞に対するＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２結合を阻害し、染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定した。これらのデータは、抗ＰＤ−１ ＨｕＭａｂが、細胞表面ＰＤ−１に対するリガンド（ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の両者）結合を阻害することを明らかにしている。

（実施例７）
ヒト血中におけるサイトカイン放出に及ぼすヒト抗ＰＤ−１抗体の効果
抗ＰＤ−１ ＨｕＭａｂが単独でヒト血球からのサイトカイン放出を刺激するかどうかを決定するため、抗ＰＤ−１ ＨｕＭａｂを新鮮ヒト全血と混合した。

ヘパリン化新鮮ヒト全血５００μＬを各ウェルに添加した。抗ＰＤ−１ ＨｕＭａｂ（４Ｈ１または５Ｃ４、後者は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプのいずれかである）１０μｇまたは１００μｇを各ウェルに添加した。一部のウェルを、陽性コントロールとしての抗ＣＤ３抗体またはアイソタイプにマッチングさせた陰性コントロールとしてのヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４抗体とインキュベーションした。細胞を６または２４時間、３７℃でインキュベーションした。細胞をスピンダウンし、血漿を採取し、サイトカインＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２をサイトカインサイトメータビーズアレイアッセイ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。各サイトカインの濃度（ｐｇ／ｍＬ）は、下記で、６時間インキュベーションのものは表３ａに示され、２４時間インキュベーションのものは表３ｂに示されている。その結果は、ヒト抗ＰＤ−１抗体５Ｃ４および４Ｈ１単独による処理は、ヒト血球を刺激してＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２のいずれのサイトカインの放出も行わないことを示している。

（実施例８）
Ｔ細胞のアポトーシスに及ぼす抗ＰＤ−１抗体の効果
Ｔ細胞のアポトーシス誘導に及ぼす抗ＰＤ−１抗体の効果を、アネキシンＶ染色試験を用いて測定した。

Ｔ細胞は、実施例５に記載のように混合リンパ球反応において培養した。抗ＰＤ−１抗体５Ｃ４を、濃度２５μｇ／ｍＬで試験管に添加した。非特異的抗体をコントロールとして使用した。アネキシンＶおよびヨウ化プロピオジウムを、標準的プロトコールにより添加した（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。混合物を、暗所で１５分間、室温でインキュベーションし、次に、ＦＡＣＳスキャンフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて解析した。その結果を図１８に示した。抗ＰＤ−１抗体５Ｃ４は、Ｔ細胞アポトーシスに対して効果を有していなかった。

（実施例９）
ウイルス陽性ドナー由来ウイルス刺激ＰＢＭＣ細胞によるサイトカイン分泌に及ぼす抗ＰＤ−１抗体の効果
この例では、ＣＭＶ陽性ドナーから末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離し、抗ＰＤ−１抗体存在下または非存在下ＣＭＶ溶解物に暴露し、当該抗体の抗原刺激サイトカイン分泌に及ぼす効果を調べた。

ＣＭＶ陽性ドナー由来２×１０^５ヒトＰＢＭＣを総量２００μＬ中で培養し、ＣＭＶ感染細胞の溶解物とともに各ウェルに添加した。抗ＰＤ−１ ＨｕＭＡｂ ５Ｃ４を様々な濃度で各ウェルに４日間添加した。第４日後、培地１００μＬを各培養物から取り出し、サイトカインを測定した。ＩＦＮ−γのレベルを、ＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。細胞を^３Ｈ−チミジンで標識し、さらに１８時間培養し、細胞増殖を分析した。細胞増殖は、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて分析した。その結果を図１９に示した。抗ＰＤ−１ ＨｕＭａｂ ５Ｃ４は、濃度依存的にＩＦＮ−γ分泌を増加させた。これらの結果は、抗ＰＤ−１ ＨｕＭＡｂｓが先に抗原に対して刺激されたＰＢＭＣ細胞から記憶Ｔ細胞応答においてＩＦＮ−γ放出を刺激できることを示唆している。

（実施例１０）
抗原に対する二次抗体応答に及ぼす抗ＰＤ−１抗体の効果
マウスをＴＩ−抗原（ＤＮＰ−Ｆｉｃｏｌｌ）により免疫し、再度チャレンジし、さらに、ラット抗マウスＰＤ−１抗体または対照抗体により処理し、抗体力価に及ぼす抗ＰＤ−１抗体の効果を調べた。

雌性Ｃ５７ＢＬ６マウスを６匹マウス／群の２群に分けた。１群は、対照ラットＩｇＧで処理し、他群はラット抗マウスＰＤ−１抗体で処理した。当該マウスを、第０日に５０μＬのＣＦＡ中のＤＮＰ−Ｆｉｃｏｌｌ（Ｔ１−抗原）５μｇで腹腔内に免疫した。対照ラットＩｇＧ抗体またはラットｍＰＤ−１抗体（２００μｇ／マウス）を、−１日、０日および２日に腹腔内に投与した。４週後、マウスを５０μＬのＩＦＡ中のＤＮＰ−Ｆｉｃｏｌｌ（ＴＩ−抗原）５μｇで、第０日に腹腔内に再チャレンジした。ラット抗ｍＰＤ−１抗体または対照抗体（２００μｇ／マウス）を腹腔内に第０日および１日に投与した。抗体力価は、ブースト後第７日に標準的ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。その結果を下記の表４に示した。抗ｍＰＤ−１抗体で処理したマウスにおいて、ＩｇＭおよびＩｇＧ３アイソタイプの両者は、対照抗体で処理したマウスに比較して、Ｔ１抗原チャレンジ後力価の最大増加を示した。これらの結果は、抗ＰＤ−１処理が、Ｔ１抗原に応答して抗体力価を増加できることを示している。

（実施例１１）
抗ＰＤ−１抗体を用いたインビボ腫瘍モデルへの処理
癌性腫瘍を移植したマウスをインビボで、抗ＰＤ−１抗体で処理し、腫瘍増殖に及ぼす抗体のインビボ効果を調べた。陽性対象として、抗ＣＴＬＡ−４抗体を用いたが、その理由は、このような抗体が腫瘍増殖をインビボで阻害することが明らかとされているからである。

この実験において、使用した抗ＰＤ−１抗体は、周知の実験技術を用いて作製したキメララット抗マウスＰＤ−１抗体であった。ラット抗マウスＰＤ−１抗体を作製するため、組み換えマウスＰＤ−１融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ． １０２１−ＰＤ）を発現させるために移入されたマウス細胞でラットを免疫し、モノクローナル抗体を、ＥＬＩＳＡによってマウスＰＤ−１抗原に対する結合でスクリーニングした。次に、ラット抗ＰＤ−１抗体Ｖ領域を、マウスＩｇＧ１定常領域に標準的な分子生物学技術を用いて、組み換えて結合させ、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによってマウスＰＤ−１に対する結合を再度スクリーニングした。ここで使用したキメララット抗マウスＰＤ−１抗体を４Ｈ２と称する。

腫瘍試験のため、週齢６〜８週の雌性ＡＪマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を体重により無作為に６群に分けた。第０日に、マウスの右側腹皮下に、２００μＬのＤＭＥＭ培地に溶解した２×１０^６ＳＡ１／Ｎ線維肉腫細胞を注入した。マウスをＰＢＳ溶媒または抗体１０ｍｇ／ｋｇで処理した。その動物に抗体または溶媒を含む約２００μＬのＰＢＳを、第１、４、８および１１日に腹腔内注入により投与した。各群は動物１０匹を含み、当該群は、（ｉ）溶媒群、（ｉｉ）対照マウスＩｇＧ、（ｉｉｉ）対照ハムスターＩｇＧ、（ｉｖ）ハムスター抗マウスＣＴＬＡ−４抗体および（ｖ）キメラ抗ＰＤ−１抗体４Ｈ２で構成されていた。そのマウスを、週に２回、約６週間における腫瘍増殖をモニタリングした。電子カリパスを用いて、腫瘍を３次元（高さ×幅×長さ）で測定し、腫瘍容積を計算した。腫瘍が腫瘍終点（１５００ｍｍ^３）に到達したかあるいは１５％を超える体重減少を示した時、マウスを安楽死させた。その結果を図２０に示した。抗ＰＤ−１抗体は、対照群で約２５日から約４０日まで腫瘍終点（１５００ｍｍ^３）に到達する平均時間延長を示した。したがって、抗ＰＤ−１抗体による処理は、腫瘍増殖に直接的なインビボ阻害効果を有している。

（実施例１２）
キメラ（ラット−マウス）抗ＰＤ−１抗体４Ｈ２の産生
マウスＰＤ−１抗体に対するラットモノクローナル抗体（ラット抗ｍＰＤ−１）を、標準的ハイブリドーマ作製方法（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５、およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照）を用いてｍＰＤ−１−ｈＦｃ融合タンパク質で免疫したラットから作製した。ハイブリドーマ８個をサブクローニングし、抗体を単離し、ｍＰＤ−１に対するマウスＰＤ−Ｌ２（ｍＰＤ−Ｌ２）結合を阻害する能力をスクリーニングした。ｍＰＤ−１に対するｍＰＤ−Ｌ２結合を阻害できる数種の抗ｍＰＤ−１抗体を同定し（例えば、４Ｈ２活性、図４１を参照）、これらの数種のタンパク質のｍＰＤ−１−Ｆｃ融合タンパク質の結合アフィニティをＥＬＩＳＡによって決定した（図４２）。

抗体４Ｈ２．Ｂ３をさらに特性解析し、それを、ここで“４Ｈ２”とも称する。マウスＰＤ−１発現ＣＨＯ細胞を構築し、４Ｈ２ 抗ＰＤ−１抗体と２００μｇ／ｍＬ〜０．０１２μｇ／ｍＬの範囲の濃度でインキュベーションし、４Ｈ２のＰＤ−１に対する結合アフィニティを決定した。ＰＤ−１発現ＣＨＯ細胞に対する抗ｍＰＤ−１抗体の結合は、ＦＩＴＣ結合ロバ抗ラットＩｇＧとインキュベーションすることによって検出し、ＦＡＣＳにより測定した。抗ｍＰＤ−１抗体は、約０．３８μｇ（図４３）のＥＣ_５０（５０％有効濃度）とＫ_Ｄ４．７×１０^−９Ｍを有していた。ＰＤ−１に対するＰＤ−Ｌ１結合阻害を調べるため、同アッセイを行った。ただし、細胞は０．１６μｇのｍＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃ融合タンパク質とともインキュベーションし、次に、ＰＤ−１発現ＣＨＯ細胞に対するＰＤ−Ｌ１結合は、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）とインキュベーションし、ＦＡＣＳ（ＭＦＩ、平均蛍光強度）により結合シグナルを測定することによって検出した。抗ｍＰＤ−１抗体は、約０．７２μｇのＥＣ_５０を有していた（図４４）。

マウス腫瘍モデルにおいて使用するため、マウス免疫系が免疫治療抗体を中和しないように（すなわち、抗体がそれによってよりすぐれた薬物動態を有するように）およびＦｃレセプター相互作用を低下させることによって抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を回避する（すなわち、それにより抗ＰＤ−１による阻害が、ＡＤＣＣ効果により障害された状態で評価できる）ため、４Ｈ２ラット抗ｍＰＤ−１を修飾する必要があった。当初のラット抗ｍＰＤ−１抗体４Ｈ２は、ラットＩｇＧ２ａアイソタイプであることがわかった。したがって、４Ｈ２抗体のＦｃ部分を、マウスＩｇＧ１アイソタイプ由来のＦｃ部分と置き換えた。上記アッセイを用いて、ラット−マウスキメラ４Ｈ２のｍＰＤ−１に対する結合アフィニティが、ラット４Ｈ２．Ｂ３抗ｍＰＤ−１抗体に匹敵することがわかった（図４５）。同様に、ＰＤ−１に対するＰＤ−１Ｌ１結合阻害は、両抗体に匹敵した（図４６）。したがって、ラット−マウスキメラ４Ｈ２抗ｍＰＤ−１抗体を用いて、抗ＣＴＬＡ−４併用抗ＰＤ−１の治療効果を調べた。

（実施例１３）
腫瘍形成と増殖に及ぼす併用療法（抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ−１抗体）のインビボ効果
ＭＣ３８結直腸癌細胞（ＰＤ−Ｌ１⁻）（Ｄｒ．Ｎ．Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、またはＪｅｆｆｒｅｙ Ｓｃｈｌｏｍ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに（２×１０^６細胞／マウス）で移植した。第０日（すなわち、マウスにＭＣ３８細胞を移植した日）において、それぞれマウス１０匹で構成した４群のそれぞれに：（１）マウスＩｇＧ（対照）、（２）抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体９Ｄ９（Ｊ．Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹから得たマウス抗マウスＣＴＬＡ−４抗体）、（３）抗ＰＤ−１モノクローナル抗体４Ｈ２（ラット抗マウスＰＤ−１をマウスＦｃ抗原で修飾したキメラ抗体、実施例６に記載）または（４）抗ＣＴＬＡ−４抗体９Ｄ９および抗ＰＤ−１抗体４Ｈ２のいずれかを、腹腔内（ＩＰ）注入した。次に、第３、６および１０日に、抗体注入を行った。単独抗体による処理は、１０ｍｇ／ｋｇで投与し、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＰＤ−１抗体併用は、各抗体５ｍｇ／ｋｇで投与した（すなわち、総抗体１０ｍｇ／ｋｇ）。電子カリパスを用いて、腫瘍を３次元（高さ×幅×長さ）で測定し、腫瘍容積を計算した。腫瘍が指定された腫瘍終点に到達した時、マウスを安楽死させた。その結果を表５および図２１に示した。

ＩｇＧ群のマウス８匹は、およそ第３０日までには腫瘍終点に到達し、ＩｇＧ群のマウス２匹（８６０６６および８７２６０）は、潰瘍性腫瘍を有していた（図２１Ａ）。抗ＣＴＬＡ−４単独群において、マウス７匹がおよそ第６０日までには腫瘍終点に到達し、マウス１匹が、潰瘍性腫瘍を有しており（８４９５２）、マウス１匹が１５００ｍｍ^３未満の腫瘍容積を有しており（８５２４６）、さらに１匹のマウスが無腫瘍であった（８６０５７）（図２１Ｂ）。抗ＰＤ−１抗体単独群において、マウス６匹は、およそ第６０日までには腫瘍終点に到達し、マウス１匹（８６０５５）が、潰瘍性腫瘍を有しており、マウス３匹が無腫瘍であった（８４９５５、８５２３９および８６７５０）（図２１Ｃ）。抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＰＤ−１抗体併用群において、マウス４匹は、約第４０日までには腫瘍終点に到達し、マウス６匹が無腫瘍であった（８４５９６、８５２４０、８６０５６、８６０７１、８６０８２および８６７６１）（図２１Ｄ）。

図２２は、第２１日に測定した平均腫瘍容積がＩｇＧ対照群では約２９５５ｍｍ^３であり、抗ＣＴＬＡ−４抗体単独群では約６５５ｍｍ^３であり、抗ＰＤ−１抗体単独群では約５１０ｍｍ^３であり、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＰＤ−１抗体併用群では約２８０ｍｍ^３であることを示している。図２３は、第２１日に測定した腫瘍容積中央値がＩｇＧ対照群では約２７１５ｍｍ^３であり、抗ＣＴＬＡ−４抗体単独群では約６２５ｍｍ^３であり、抗ＰＤ−１抗体単独群では約５２５ｍｍ^３であり、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＰＤ−１抗体併用群では約１０ｍｍ^３であることを示している（さらに、第３２日までには０ｍｍ^３まで低下している）。

本試験は、マウス腫瘍モデルにおいて、ＣＴＬＡ−４抗体単独処理およびＰＤ−１抗体単独処理が腫瘍増殖に対して中等度の効果を有していること、およびＣＴＬＡ−４抗体とＰＤ−１抗体の併用治療が、腫瘍増殖に対して有意に高い効果を有していることを示している。ＣＴＬＡ−４抗体およびＰＤ−１抗体による併用療法が、それぞれを１０ｍｇ／ｋｇの高用量で投与した各抗体単独の効果に比較して、各抗体５ｍｇ／ｋｇの投与量で腫瘍増殖に対して、はるかに有意な効果を有していたことには興味深い。

（実施例１４）
形成された腫瘍の増殖に及ぼす併用療法（抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ−１抗体）のインビボ効果
ＭＣ３８結直腸癌細胞（ＰＤ−Ｌ１⁻）をＣ５７ＢＬ／６マウスに（２×１０^６細胞／マウスで）腫瘍形成に十分な時間（約６乃至７日）移植した。移植後第６日（第−１日）において腫瘍測定を行い、その後の抗体治療のため、マウスを平均腫瘍容積（約２５０ｍｍ^３）に基づき無作為に１１群に振り分けた。第０日において（すなわち、ＭＣ３８細胞を移植後１週）、マウスに（１）マウスＩｇＧ（対照）、（２）抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体９Ｄ９、（３）抗ＰＤ−１モノクローナル抗体４Ｈ２、または（４）抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体９Ｄ９および抗ＰＤ−１モノクローナル抗体４Ｈ２を、濃度１０ｍｇ／ｋｇ／マウスでＩＰ注入した。また、抗体は、第３、６および１０日に投与した。使用したモノクローナル抗体組成は、低レベルのエンドトキシンを有し、有意に凝集することはなかった。電子カリパスを用いて、腫瘍を３次元（高さ×幅×長さ）で測定し、腫瘍容積を計算した。腫瘍測定は、第０日（治療開始時点の腫瘍は、容積約１２５ｍｍ^３であった）、および抗体注入後第３、６、１０、１３、１７および２０日に行った。マウスは、腫瘍が所定の腫瘍終点（１５００ｍｍ^３のような特定の腫瘍容積および／または、マウスが約１５％を超える体重減少を示した時）、マウスを安楽死させた。

ＩｇＧ群における全マウス１１匹は、およそ第１７日までには腫瘍終点に到達した（図２４Ａ）。抗ＣＴＬＡ−４単独群では、マウス１１匹のうちの７匹がおよそ第１２日までには腫瘍終点に到達した（図２４Ｂ）。抗ＰＤ−１抗体単独群では、マウス４匹がおよそ第１３日までに腫瘍終点に到達し、マウス２匹が無腫瘍であった（図２４Ｃ）。抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＰＤ−１抗体併用群では、マウス１匹がおよそ第１７日までには腫瘍終点に到達し、マウス１匹がおよそ第４５日までには腫瘍終点に到達し、マウス９匹が第４５日において無腫瘍であった（図２４Ｄ）。

図２５は、第１０日に測定した平均腫瘍容積がＩｇＧ対照群では約１４８５ｍｍ^３であり、抗ＣＴＬＡ−４抗体単独群では約１０１０ｍｍ^３であり、抗ＰＤ−１抗体単独群では約６９５ｍｍ^３であり、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＰＤ−１抗体併用群では約８０ｍｍ^３であることを示している。図２６は、第１０日に測定した腫瘍容積中央値がＩｇＧ対照群では約１３６５ｍｍ^３であり、抗ＣＴＬＡ−４抗体単独群では約１０６０ｍｍ^３であり；抗ＰＤ−１抗体単独群では約４８０ｍｍ^３であり、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＰＤ−１抗体併用群では約１５ｍｍ^３であることを示している（さらに、第１７日までには０ｍｍ^３まで低下している）。

本研究は、マウス腫瘍モデルにおいて、ＣＴＬＡ−４抗体とＰＤ−１抗体の併用処理が、腫瘍がすでに十分に確立されている時でさえもいずれかの抗体単独よりも腫瘍増殖に対して有意に高い効果を有していることを示している。

（実施例１５）
形成された腫瘍の増殖に及ぼす併用療法（抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ−１抗体）の投与量測定
実施例３に記載のように、ＭＣ３８結直腸癌細胞（ＰＤ−Ｌ１⁻）をＣ５７ＢＬ／６マウスに（２×１０^６細胞／マウスで）腫瘍形成に十分な時間（約６〜７日）移植した。マウス１０匹の群に対して、第０、３、６および１０日に下記のように腹腔内注入した。（Ａ）群 マウスＩｇＧ（対照、２０ｍｇ／ｋｇ）、（Ｂ）群 抗ＰＤ−１モノクローナル抗体４Ｈ２（１０ｍｇ／ｋｇ）およびマウスＩｇＧ（１０ｍｇ／ｋｇ）、（Ｃ）群 抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体９Ｄ９（１０ｍｇ／ｋｇ）およびマウスＩｇＧ（１０ｍｇ／ｋｇ）、（Ｄ）群 抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体９Ｄ９（１０ｍｇ／ｋｇ）および抗ＰＤ−１モノクローナル抗体４Ｈ２（１０ｍｇ／ｋｇ）、（Ｅ）群 抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体９Ｄ９（３ｍｇ／ｋｇ）および抗ＰＤ−１モノクローナル抗体４Ｈ２（３ｍｇ／ｋｇ）、または（Ｆ）群 抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体９Ｄ９（１ｍｇ／ｋｇ）および抗ＰＤ−１モノクローナル抗体４Ｈ２（１ｍｇ／ｋｇ）。電子カリパスを用いて、腫瘍を３次元（高さ×幅×長さ）で測定し、腫瘍容積を計算した。腫瘍測定は、処理開始時点（すなわち、第０日において、腫瘍は平均容積約９０ｍｍ^３であった）、および抗体処理後第３、６、１０、１３、１７および２０日に行った。マウスを、腫瘍が所定の腫瘍終点（１５００ｍｍ^３のような特定の腫瘍容積および／またはマウスが約１５％を超える体重減少を示した時）に達した時、安楽死させた。

図２７Ａは、対照マウス１０匹全てが腫瘍終点に到達したことを示している。図２７Ｂは、１０ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ−１抗体（Ｂ群）で処理した群では、腫瘍終点に到達したマウスが６匹であり、約７５０ｍｍ^３以下の容積を有する腫瘍を有しているマウスが４匹であることを示している。図２７Ｃは、１０ｍｇ／ｋｇ抗ＣＴＬＡ−４抗体（Ｃ群）で処理した群では、腫瘍終点に到達したマウスが３匹であり、約１０００ｍｍ^３以下の容積を有する腫瘍を有しているマウスが７匹であることを示している。図２７Ｄは、１０ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ−１抗体と１０ｍｇ／ｋｇ抗ＣＴＬＡ−４抗体を併用で処理した群（Ｄ群）では、約１０００ｍｍ^３以下の容積を有する腫瘍を有しているマウスが２匹であり、腫瘍を全く有していないマウスが８匹であることを示している。図２７Ｅは、３ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体と３ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１抗体で併用処理した群（Ｅ群）では、腫瘍終点に到達したマウスが１匹であり、約５００ｍｍ^３以下の容積を有する腫瘍を有しているマウスが７匹、および無腫瘍のマウスが２匹であることを示している。図２７Ｆは、１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＴＬＡ−４抗体と抗ＰＤ−１抗体１ｍｇ／ｋｇで併用処理した群（Ｆ群）では、腫瘍終点に到達したマウスが４匹であり、約１１００ｍｍ^３以下の容積を有する腫瘍を有しているマウスが５匹、および無腫瘍マウスが１匹であることを示している。

図２７Ｇおよび図２７Ｈは、最初に抗ＰＤ−１抗体で次に抗ＣＴＬＡ−４抗体であるいはその逆に順次処理したマウスにおける腫瘍容積を示している。図２７Ｇのマウスは、最初に１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体を第０日および３日にそれぞれ投与され、次に、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１抗体を第６日および１０日のそれぞれにおいて投与されている。図２７Ｈのマウスは、最初に１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１抗体を第０日および３日にそれぞれ投与され、次に、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ−４１抗体を第６日および１０日のそれぞれにおいて投与されている。Ｇ群について、第２７日において、マウス８匹が腫瘍終点に到達し、マウス１匹が非常に小さい腫瘍を有しており（かなり遅れて、最終的に成長が止まった）、マウス１匹が無腫瘍であった。Ｈ群について、第２７日において、マウス８匹が腫瘍終点に到達し、マウス２匹が無腫瘍であった。

図２８は、ＩｇＧ対照群では第１０日において測定した平均腫瘍容積が約１２５０ｍｍ^３であり、ＩｇＧ対照を伴う抗ＰＤ−１抗体では約４７０ｍｍ^３であり、ＩｇＧ対照を伴う抗ＣＴＬＡ−４抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）では約２９０ｍｍ^３であり（第６日に測定）、抗ＣＴＬＡ−４抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）および抗ＰＤ−１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）併用群では約４０ｍｍ^３であり、抗ＣＴＬＡ−４抗体（３ｍｇ／ｋｇ）および抗ＰＤ−１抗体（３ｍｇ／ｋｇ）併用群では約１６５ｍｍ^３であり；および抗ＣＴＬＡ−４抗体（１ｍｇ／ｋｇ）および抗ＰＤ−１抗体（１ｍｇ／ｋｇ）併用群では約４００ｍｍ^３であることを示している。図２９は、ＩｇＧ対照群では第１３日において測定した腫瘍容積中央値が約１６８０ｍｍ^３であり、ＩｇＧ対照を伴う抗ＰＤ−１抗体では約４００ｍｍ^３であり、ＩｇＧ対照を伴う抗ＣＴＬＡ−４抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）では６６０ｍｍ^３であり、抗ＣＴＬＡ−４抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）および抗ＰＤ−１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）併用群では約０ｍｍ^３であり、抗ＣＴＬＡ−４抗体（３ｍｇ／ｋｇ）および抗ＰＤ−１抗体（３ｍｇ／ｋｇ）併用群では約９０ｍｍ^３であり、および抗ＣＴＬＡ−４抗体（１ｍｇ／ｋｇ）および抗ＰＤ−１抗体（１ｍｇ／ｋｇ）併用群では約６５０ｍｍ^３であることを示している。抗ＣＴＬＡ−４抗体と抗ＰＤ−１抗体の併用処理では、本試験の第２７日において無腫瘍マウスの各群当たりの数は、８／１０（１０ｍｇ／ｋｇ）、２／１０（３ｍｇ／ｋｇ）および１／１０（１ｍｇ／ｋｇ）であった（データを示さず）。

本研究は、ＣＴＬＡ−４抗体とＰＤ−１抗体の併用処理が用量依存性に機能し、両抗体を単独処理したときよりも低用量においても、さらに腫瘍が十分に形成されている時でさえも、腫瘍増殖に有意に高い効果を有していることを示している。さらに、前記抗体は、順次投与でき（最初に抗ＣＴＬＡ−４を次に抗ＰＤ−１抗体を投与する、あるいはその逆で）、その併用は抗体単独療法よりもはるかに優れている。

（実施例１６）
線維肉腫形成および増殖に及ぼす併用療法（抗ＣＴＬＡ−４と抗ＰＤ−１抗体）のインビボ効果
ＳＡ１／Ｎ線維肉腫細胞（ＰＤ−Ｌ１⁻）（Ｌｅａｃｈら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１：１７３４−１７３６）を、第０日にＡ／Ｊマウスに皮下移植した（２×１０^６細胞／マウス）。移植後第１、４、７および１１日に、下記：（Ａ）群 ＰＢＳ（“溶媒”と称する）単独、（Ｂ）群 マウスＩｇＧ（対照、マウス当たり１０ｍｇ／ｋｇ）、（Ｃ）群 抗ＰＤ−１モノクローナル抗体４Ｈ２（マウス当たり１０ｍｇ／ｋｇ）、（Ｄ）群 抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体９Ｄ９（マウス当たり１０ｍｇ／ｋｇまたは０．２ｍｇ／ｋｇ）、（Ｅ）群 抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体９Ｄ９（マウス当たり０．２ｍｇ／ｋｇ）と併用した抗ＰＤ−１モノクローナル抗体４Ｈ２（マウス当たり１０ｍｇ／ｋｇ）のようにマウスに腹腔内投与した。本試験を４１日間継続し、本試験過程での様々な時点で腫瘍測定を行った（図２９参照）。腫瘍容積は、電子カリパスを用いて３次元（高さ×幅×長さ）で腫瘍を測定し、計算した。腫瘍が１５００ｍｍ^３の所定の腫瘍終点に到達したかあるいは潰瘍化腫瘍になった時に、マウスを安楽死させた。

図３０Ａおよび３０Ｂは、対照２０匹中１９匹（Ａ群で９／１０、Ｂ群で１０／１０）のマウスが腫瘍終点に達するかまたは潰瘍性腫瘍を発症したことを示している。図３０Ｃは、１０ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ−１抗体で処理した群（Ｃ群）では、腫瘍終点に到達したマウスが６匹（２匹は容積が１５００ｍｍ^３を超えており、４匹は潰瘍性腫瘍を有していた）であり、および腫瘍を全く有していないマウスが４匹であることを示している。図３０Ｄは、１０ｍｇ／ｋｇ抗ＣＴＬＡ−４抗体で処理した群（Ｄ群）では、腫瘍終点に到達したマウスが５匹（２匹は容積が１５００ｍｍ^３を超えており、３匹は潰瘍性腫瘍を有していた）であり、１匹のマウスは小さな腫瘍（約７０ｍｍ^３の容積）があり、および腫瘍を全く有していないマウスが４匹であることを示している。図３０Ｅは、０．２ｍｇ／ｋｇ抗ＣＴＬＡ−４で処理した群（Ｅ群）では、腫瘍終点に到達したマウスが１０匹（６匹は容積が１５００ｍｍ^３を超えており、４匹は潰瘍化腫瘍を有していた）であることを示している。図３０Ｆは、０．２ｍｇ／ｋｇ抗ＣＴＬＡ−４抗体と併用した１０ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ−１抗体で処理した群（Ｆ群）では、腫瘍終点に到達したマウスが２匹（１匹は容積が１５００ｍｍ^３を超えており、１匹は潰瘍化腫瘍を有していた）であり、および腫瘍を全く有していないマウスが８匹であることを示している。

図３１および３２は、本試験過程全体にわたる処理および未処理マウスに発現した腫瘍容積の平均および中央値をそれぞれ示している。これらの抗体で処理したマウスにおける腫瘍増殖阻害を、対照抗体マウスＩｇＧで処理したマウスと比較し、表６に示した。

これらのデータはさらに、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体を含む併用療法がいずれかの抗体単独による処理よりも実質的に効果的であることを示している。実際、併用は、併用療法が治療用量以下の抗ＣＴＬＡ−４抗体を含むときでさえも単独抗体治療よりもはるかに効果的である。腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１発現が同様に抗腫瘍Ｔ細胞応答を阻害することになるという点において、ＰＤ−Ｌ１の存在が抗体の単独療法における効果に影響を有しているかもしれないが、これらのデータもまた、驚くべきことに、腫瘍上でのＰＤ−Ｌ１の存在または非存在がこの抗体併用による治療効果に全く影響していないらしいことを示唆している（図４０を参照）。

（実施例１７）
ＰＤ−Ｌ１⁻線維肉腫の増殖に及ぼす併用療法（抗ＣＴＬＡ−４と抗ＰＤ−１抗体）のインビボ効果と用量測定
ＳＡ１／Ｎ線維肉腫細胞（ＰＤ−Ｌ１⁻）を、第０日に腫瘍形成に十分な時間（約７日）、Ａ／Ｊマウスに皮下移植した（２×１０^６細胞／マウス）。移植後第７、１０、１３および１６日に、平均１１０ｍｍ^３の腫瘍容積を有するマウス８匹の１０群に、下記：（Ａ）群 ＰＢＳ（“溶媒”と称する）単独、（Ｂ）群 マウスＩｇＧ（対照、１０ｍｇ／ｋｇ／マウス）、（Ｃ）群 抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体９Ｄ９（０．２５ｍｇ／ｋｇ／マウス）、（Ｄ）群 抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体９Ｄ９（０．５ｍｇ／ｋｇ／マウス）、（Ｅ）群 抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体９Ｄ９（５ｍｇ／ｋｇ／マウス）、（Ｆ）群 抗ＰＤ−１モノクローナル抗体４Ｈ２（３ｍｇ／ｋｇ／マウス）、（Ｇ）群 抗ＰＤ−１モノクローナル抗体４Ｈ２（１０ｍｇ／ｋｇ／マウス）、（Ｈ）群 抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体９Ｄ９（０．２５ｍｇ／ｋｇ／マウス）と抗ＰＤ−１モノクローナル抗体４Ｈ２（１０ｍｇ／ｋｇ／マウス）との併用、（Ｉ）群 抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体９Ｄ９（０．５ｍｇ／ｋｇ／マウス）と抗ＰＤ−１モノクローナル抗体４Ｈ２（１０ｍｇ／ｋｇ／マウス）との併用、および（Ｊ）群 抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体９Ｄ９（０．５ｍｇ／ｋｇ／マウス）と抗ＰＤ−１モノクローナル抗体４Ｈ２（３ｍｇ／ｋｇ／マウス）との併用、のようにＩＰ投与した。

移植後第１０、１３、１６および１９日に、平均２５５ｍｍ^３の腫瘍容積を有するマウス６匹の２群に、下記：（Ｋ）群 マウスＩｇＧ（対照、１０ｍｇ／ｋｇ／マウス）、および（Ｌ）群 抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体９Ｄ９（１ｍｇ／ｋｇ／マウス）と抗ＰＤ−１モノクローナル抗体４Ｈ２（１０ｍｇ／ｋｇ／マウス）との併用、のようにＩＰ投与した。本試験を５１日間継続し、本試験過程での様々な時点で腫瘍測定を行った（図３３−３８参照）。腫瘍容積は、電子カリパスを用いて３次元（高さ×幅×長さ）で腫瘍を測定し、計算した。腫瘍が１５００ｍｍ^３の所定の腫瘍終点に到達したかあるいは潰瘍化腫瘍になった時に、マウスを安楽死させた。

図３３は、当初の容積約１１０ｍｍ^３（すなわち、最初の抗体処理時点において）を有する腫瘍マウスにおける免疫刺激抗体治療に対する応答を示している。図３３Ａおよび３３Ｂは、対照マウス全１６匹（ＡおよびＢ群）が腫瘍終点に到達することを示している（１５００ｍｍ^３を超える腫瘍容積のマウス１５匹および潰瘍化腫瘍のマウス１匹）。図３３Ｃ−３３Ｅは、癌に侵されたマウスが抗ＣＴＬＡ−４抗体処理に用量依存性に応答することを示している（例えば、０．２５ｍｇ／ｋｇ投与Ｃ群では７／８匹が腫瘍終点に達し、マウス１匹が２００ｍｍ^３未満の腫瘍容積しか有しておらず、一方、５ｍｇ／ｋｇ投与Ｅ群では、６／８匹が腫瘍終点に達し、２／８匹が無腫瘍であった）。図３３Ｆおよび３３Ｇは、抗ＰＤ−１抗体用量（Ｆ群は、３ｍｇ／ｋｇ投与を受けており、一方、Ｇ群は１０ｍｇ／ｋｇ投与を受けていた）にかかわらずおよそ同等に応答した。対照的に、１０または３ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１抗体を０．２５または０．５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体とともに併用処理されていたマウス（グループＨ、ＩとＪ）は、腫瘍増殖が有意に低下していた。例えば、図３３Ｊは、３ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１抗体を０．５ｍｇ／ｋｇ抗ＣＴＬＡ−４抗体とともに併用処理されていた群（Ｊ群）では、マウス２匹が潰瘍性腫瘍を有しており、マウス２匹の腫瘍容積は５００ｍｍ^３未満であり、マウス４匹は無腫瘍であったことを示している。図３４（平均腫瘍容積）および図３５（腫瘍容積中央値）は、併用した抗ＣＴＬＡ−４抗体の治療レベル以下での驚くべき効果とともに、抗ＣＴＬＡ−４抗体と併用した抗ＰＤ−１抗体の予測外の相乗効果を示している。

図３６は、大型腫瘍をもつマウス、すなわち、当初の容積約２５０ｍｍ^３（すなわち、最初の抗体処理時点において）を有するものにおける免疫刺激抗体治療に対する応答を示している。図３６Ａは、対照マウス全６匹（Ｋ群）が腫瘍終点に到達することを示している（１５００ｍｍ^３を超える腫瘍容積のマウス４匹および潰瘍性腫瘍のマウス２匹）。図３６Ｂは、１ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ−４抗体と１０ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ−１抗体とが併用処理された群（Ｌ群）では、マウス１匹が潰瘍性腫瘍を有しており、マウス４匹の腫瘍容積は１５００ｍｍ^３を超えており、マウス１匹は無腫瘍であったことを示している。腫瘍容積平均および中央値を、図３７および３８に示した。

これらの抗体で処理したマウスにおける腫瘍増殖阻害を対照抗体マウスＩｇＧで処理したマウスと比較し、表７と図３９に示した。

これらのデータは、さらに、抗ＰＤ−１および抗ＣＴＬＡ−４抗体を含む併用療法がいずれかの抗体単独による処理よりも実質的に効果的であることを示している。また、驚くべきことに免疫刺激治療抗体の併用の相乗効果を損なうことなく、各抗体用量を減ずることができる。この併用療法は、腫瘍容量がより成熟していても（すなわち、より大型のもの）有効であるようである。

（実施例１８）
抗ＰＤ−１抗体処理およびＰＤ−Ｌ１⁻線維肉腫細胞の再チャレンジ後のマウスにおける腫瘍免疫
腫瘍細胞によるチャレンジと抗ＰＤ−１抗体処理（すなわち、実施例５および６に記載の有効性試験に類似の処理）でも腫瘍を有さず生き延びたマウスを、次に、腫瘍細胞で再チャレンジし、このような処理後の腫瘍形成に対する免疫性を調べた。簡単に述べると、最初のチャレンジにおいて、ＳＡ１／Ｎ線維肉腫細胞（ＰＤ−Ｌ１⁻）を、第０日にＡ／Ｊマウスに皮下移植した（１×１０^６細胞／マウス）。各群に、移植後第１、４、７、１０、１４、１７日および２０日に、マウスＩｇＧ（対照、マウス当たり１０ｍｇ／ｋｇ）または様々な用量の抗ＰＤ−１モノクローナル抗体４Ｈ２（３０、１０、３、１、および０．３ｍｇ／ｋｇ）の一つを腹腔内注入した。腫瘍形成および容積を、試験完了まで週２回、精密電子カリパスを用いてモニタリングした。マウス８匹の群は、抗ＰＤ１抗体処理後も無腫瘍であった（４匹は３０ｍｇ／ｋｇで処理し、２匹は３ｍｇ／ｋｇで処理し、１匹は０．３ｍｇ／ｋｇで処理した）。

８匹の処理した無腫瘍Ａ／Ｊマウスを、皮下に１×１０^６ＳＡ１／Ｎ線維肉腫細胞／マウスを移入することで再チャレンジした。対照として、９匹の未処理マウスに、皮下に１×１０^６ＳＡ１／Ｎ線維肉腫細胞／マウスを移入した。腫瘍形成と容積を、精密電子カリパスにより週に２回、移入後第６２日までモニタリングした。９匹の未処理（対照）マウス全ては、線維肉腫細胞の移入後第２２日までに腫瘍終点に到達した。対照的に、線維肉腫細胞で再チャレンジした８匹の無腫瘍マウスは、移入後第６２日まで腫瘍を発現しなかった。図４７は、未処置および再チャレンジしたマウスの平均腫瘍容積を示している。これらの結果は、抗ＰＤ−１のような抗体処理が、腫瘍形成可能な細胞存在下においてさえも、処理対象に腫瘍形成に対する免疫性を付与することを示している。

（実施例１９）
結直腸癌細胞で再チャレンジしたマウスにおける単一抗体療法（抗ＰＤ−１）または併用抗体療法（抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ−１）後のＰＤ−Ｌ１⁻腫瘍免疫性
腫瘍細胞によるチャレンジと抗ＰＤ−１抗体単独または抗ＣＴＬＡ−４抗体と抗ＰＤ−１抗体との併用（すなわち、実施例２−４に記載の有効性試験に類似の処理）による治療でも腫瘍を有さず生き延びたマウスを、次に、腫瘍細胞で再チャレンジし、このような処理後の腫瘍形成に対する免疫性を調べた。簡単に述べると、最初のチャレンジにおいて、ＭＣ３８結直腸癌細胞（ＰＤ−Ｌ１⁻）を、第０日にＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下移植した（２×１０^６細胞／マウス）。各群に、移植後第０、３、６および１０日に下記の一つを腹腔内注入した。（１）マウスＩｇＧ（対照、１０ｍｇ／ｋｇ／マウス）、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体４Ｈ２、または（３）抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体９Ｄ９と抗ＰＤ−１モノクローナル抗体４Ｈ２との併用。腫瘍増殖は、精密電子カリパスにより実施例１５に記載のようにしてモニタリングした。１１匹のマウス群は、抗ＰＤ−１抗体処理後（総計２匹）または併用抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４抗体処理後（総計９匹）も無腫瘍であった。

１１匹の処理した無腫瘍のＣ５７ＢＬ／６マウスの皮下に、２×１０^７個のＭＣ３８結直腸癌細胞／マウスを移入することで再チャレンジした（すなわち、当初のチャレンジよりも１０倍多い細胞用量）。対照として、７匹の未処理マウスに、２×１０^７個のＭＣ３８結直腸癌細胞／マウスを移入した。腫瘍形成と容積を、精密電子カリパスにより、再チャレンジ試験期間の間（少なくとも２０日）、モニタリングした。図４８は、７匹の未処理マウス全て（対照）が腫瘍を発症し、結直腸癌細胞の移入後第１８日までに腫瘍終点に到達したことを示している。対照的に、結直腸癌細胞で再チャレンジした１１匹の無腫瘍マウスは全て、移入後第１８日まで腫瘍を発現しなかった。図４９は、未処置および再チャレンジマウスの平均腫瘍容積を示している。これらのデータは、抗体単独療法と同様に、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４阻害を起こす抗体療法が腫瘍再発に対して持続的な免疫性を付与することを示唆している。

（実施例２０）
形成された腫瘍の増殖に及ぼす併用療法（抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ−１抗体）のインビボ効果
ＣＴ２６結直腸癌細胞を、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに腫瘍形成できる十分な時間（約１０日）移植した（２×１０^６細胞／マウス）。移植後第１０日において、腫瘍測定を行い、マウスを平均腫瘍容積（約２５０ｍｍ^３）に基づき無作為に５群に分け、次に抗体療法を行った。第０日（すなわち、ＣＴ２６細胞を移入１０日後）において、マウスに（１）マウスＩｇＧ（対照）、（２）抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体９Ｄ９、（３）抗ＰＤ−１モノクローナル抗体４Ｈ２または（４）マウス当たり濃度１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体９Ｄ９と抗ＰＤ−１モノクローナル抗体４Ｈ２を腹腔注入した。抗体注入は、第３、６および１０日にも行った。使用したモノクローナル抗体組成物は、低レベルのエンドドキシンを有しており、有意に凝集することはなかった。電子カリパスを用いて、腫瘍を３次元（高さ×幅×長さ）で測定し、腫瘍容積を計算した。腫瘍測定は、第０日（処理開始時点における腫瘍は、約１２５ｍｍ^３の容積を有していた）に行い、抗体注入後３、６、１０、１３、１７および２０日にも行った。腫瘍が所定の腫瘍終点（１５００ｍｍ^３のような特定腫瘍容積および／またはマウスが約１５％の体重減少を示した時点）に到達した時に、マウスを安楽死させた。結果は図５０に示されている。本試験では、マウス腫瘍モデルにおいて、ＣＴＬＡ−４抗体およびＰＤ−１抗体の併用処理が、腫瘍がすでに十分に確立している時でさえもいずれかの抗体単独よりもはるかに高い効果を腫瘍増殖に対して有することを示唆している。

（実施例２１）
制御性Ｔ細胞機能に及ぼすヒト抗ＰＤ−１抗体の効果
制御性Ｔ細胞は、免疫応答を抑制するリンパ球である。この実施例において、制御性Ｔ細胞を、抗ＰＤ−１ヒトモノクローナル抗体の存在下または非存在下においてＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖およびＩＦＮ−γ分泌その阻害機能について試験した。

制御性Ｔ細胞を、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＰＢＭＣから精製した。制御性Ｔ細胞を、制御性Ｔ細胞に対するＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の比率が２：１となるよう精製ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞と同種異系樹状細胞を含む混合リンパ球反応物（上記参照）に添加した。抗ＰＤ−１モノクローナル抗体５Ｃ４は、濃度１０μｇ／ｍＬ濃度で添加した。無抗体またはイソタイプ対照抗体のいずれかを陰性コントロールとして用いた。培養上清物を第５日に採取し、サイトカイン測定をＢｅａｄｌｙｔｅ サイトカイン検出システム（Ｕｐｓｔａｔｅ）を用いて行った。細胞に^３Ｈ−チミジンを標識し、さらに、１８時間培養し、細胞増殖を分析した。その結果を、図５１Ａ（Ｔ細胞増殖）および５１Ｂ（ＩＦＮ−γ分泌）に示した。抗ＰＤ−１ヒトモノクローナル抗体５Ｃ４を添加すると、Ｔｒｅｇ細胞による増殖阻害およびＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞のＩＦＮ−γ分泌阻害を部分的に緩和し、抗ＰＤ−１抗体が制御性Ｔ細胞に効果を有していることを示唆している。

（実施例２２）
ヒト抗ＰＤ−１抗体のＴ細胞活性化に及ぼす効果
この実施例において、抗ＰＤ−１抗体５Ｃ４によるＰＤ−１経路の阻害がＴ細胞活性化に及ぼす効果を調べた。精製ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｄｙｎａｌ ＣＤ４ Ｔ細胞精製キット）を１μｇ／ｍＬの可溶性抗ＣＤ３抗体（ＢＤ）により、自己単球または単球由来樹状細胞（ＤＣｓ）存在下において活性化した。単球を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣＤ１４単球精製キットを用いて精製し、単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ）とともに７日間培養後、ＤＣをインビトロで産生させた。力価検定した抗ＰＤ−１抗体または関連のないアイソタイプ対照ｍＡｂの存在下または非存在下３日間活性化した後、培養上清を採取し、ＩＦＮγ分泌のＥＬＩＳＡ分析と行い、一方、Ｔ細胞増殖を測定するため、トリチウム化チミジンをアッセイ中、最終１８時間時点で添加した。図５２Ａおよび５２Ｂに示した結果は、抗ＰＤ−１抗体によるＰＤ−１阻害の結果、Ｔ細胞増殖とＩＦＮ−γ分泌が増強された。単球存在下における抗ＰＤ−１抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体によるＴ細胞活性化に及ぼす（特に、ＩＦＮ−γ分泌に及ぼす）相乗的効果もまた、観察された。

（実施例２３）
抗ＰＤ−１抗体のＡＤＣＣ活性評価
この実施例において、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイを実施し、抗ＰＤ−１抗体が標的細胞に対してＡＤＣＣを誘発できるか評価した。５Ｃ４の２種のバージョンであるヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を有するもの（５Ｃ４−ＩｇＧ１）とヒトＩｇＧ４のＦｃ領域を有するもの（５Ｃ４−ＩｇＧ４）を本アッセイで評価した。Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒのＤｅｌｆｉａ Ｃｅｌｌ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｋｉｔを本アッセイに用いた。簡単に述べると、精製ヒトＣＤ４ Ｔ細胞（Ｄｙｎａｌ ＣＤ４ Ｔ細胞精製キット）を、プレート結合抗ＣＤ３抗体（ＢＤ）により活性化し、ＰＤ−１発現を誘発させた。次に、標的活性化ＣＤ４ Ｔ細胞をＢＡＴＤＡ試薬で標識した。標識ＣＤ４ Ｔ細胞を、Ｖ底９６ウェルプレートに添加し、ヒトＰＢＭＣ（標的（Ｅ／Ｔ）細胞に対するエフェクターの比は５０：１）に添加し、抗体を設計した。３７℃で１時間インキュベーションした後、プレートをスピンダウンした。上清を平底９６ウェルプレートに移し、プレートをＲｕｂｙＳｔａｒ プレートリーダーで読み取った。その結果は、５Ｃ４−ＩｇＧ４が活性化ＣＤ４ Ｔ細胞においてＡＤＣＣを媒介せず、一方、５Ｃ４−ＩｇＧ１は、活性化ＣＤ４ Ｔ細胞においてＡＤＣＣを媒介した（図５３）が、このことは、ＡＤＣＣ活性が抗ＰＤ−１抗体のＦｃ領域に関連していることを示唆している。

（実施例２４）
抗ＰＤ−１抗体の補体依存性細胞傷害活性の評価
この実施例において、抗ＰＤ−１抗体の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を調べた。５Ｃ４の２種のバージョンであるヒトＩｇＧ１（５Ｃ４−ＩｇＧ１）のＦｃ領域を有するものとヒトＩｇＧ４のＦｃ領域を有するもの（５Ｃ４−ＩｇＧ４）を本アッセイで評価した。簡単に述べると、精製ヒトＣＤ４ Ｔ細胞（Ｄｙｎａｌ ＣＤ４ Ｔ細胞精製キット）を、プレート結合抗ＣＤ３抗体（ＢＤ）により活性化し、ＰＤ−１発現を誘発させた。抗ＰＤ−１抗体（５Ｃ４）および対照抗体の５０μｇ／ｍＬから６４０ｐｇ／ｍＬまでの系列希釈を、ヒト補体（Ｑｕｉｄｅｌ−Ａ１１３）存在下においてＣＤＣについて試験した。Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｓ）を用いて細胞傷害を測定した。プレートを蛍光プレートリーダ（ＥＸ５３０ ＥＭ５９０）により測定した。生細胞数は、蛍光単位に比例している。その結果は、５Ｃ４−ＩｇＧ１または５Ｃ４−ＩｇＧ４のいずれも活性化ＣＤ４ Ｔ細胞上でＣＤＣを媒介せず、一方、陽性対照抗体（抗ＨＬＡ−Ａ−ＡＢＣ抗体）は媒介した（図５４）。

（実施例２５）
ヒトＴ細胞上におけるＰＤ−１発現の評価
この実施例では、異なるドナー由来ヒトＰＢＭＣを、様々な細胞サブセット上でのＰＤ−１発現について、ＦＡＣＳにより調べた。ビオチン化抗ＰＤ−１は、細胞表面におけるＰＤ−１分子検出時に、市販の抗ＰＤ−１抗体よりもはるかに高い感度を示し、それを本アッセイに用いた。結合抗体を、ＰＥ結合ストレプトアビジンを用いて検出した。フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳスキャンフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＦｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を用いて実施した。ＰＤ−１発現は、いくつかの末梢ヒトＴ細胞上で検出されたが、Ｂ細胞または単球上では検出されなかった。Ｔ細胞サブセットをさらに調べ、ＣＤ４およびＣＤ８記憶およびエフェクターＴ細胞上でＰＤ−１が発現するが、未処理のＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞にはないことを示唆している。

本発明は、ここに記載の具体的態様によって、その範囲を限定されない。実際に、本文に記載のものに加えて本発明の様々な改良も、先の説明および付属の図面から当業者には明らかである。このような改良は、付属の請求の範囲内に入るものと意図している。したがって、本発明は、請求の範囲に包含される均等物の全範囲に沿って付属の請求の範囲の用語のみによって限定されるべきである。

Claims (9)

1. 配列番号４のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、ヒトＰＤ−１に特異的に結合する単離ヒトモノクローナルＩｇＧ４抗体を有効成分として含み、抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせて投与されることを特徴とする、メラノーマ、腎癌および肺癌から選択される癌に対する癌治療剤。
2. ヒトＰＤ−１に特異的に結合する単離ヒトモノクローナルＩｇＧ４抗体の投与量が、治療量以下である請求項１記載の癌治療剤。
3. 抗ＣＴＬＡ−４抗体の投与量が、治療量以下である請求項１または２記載の癌治療剤。
4. ヒトＰＤ−１に特異的に結合する単離ヒトモノクローナルＩｇＧ４抗体及び抗ＣＴＬＡ−４抗体が順次投与される請求項１記載の癌治療剤。
5. ヒトＰＤ−１に特異的に結合する単離ヒトモノクローナルＩｇＧ４抗体が、抗ＣＴＬＡ−４抗体の投与前に投与される請求項１記載の癌治療剤。
6. ヒトＰＤ−１に特異的に結合する単離ヒトモノクローナルＩｇＧ４抗体が、抗ＣＴＬＡ−４抗体の投与後に投与される請求項１記載の癌治療剤。
7. ヒトＰＤ−１に特異的に結合する単離ヒトモノクローナルＩｇＧ４抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体が同時に投与される請求項１記載の癌治療剤。
8. ヒトＰＤ−１に特異的に結合する単離ヒトモノクローナルＩｇＧ４抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体が単一組成物として混合される請求項１記載の癌治療剤。
9. 抗ＣＴＬＡ−４抗体が、ヒトモノクローナル抗体１０Ｄ１である請求項１〜８のいずれか１項記載の癌治療剤。

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