CN110423757B - 一种工程化核酸、t细胞及其应用和产生方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种工程化核酸，包括基因工程改造的抗原受体的核酸，能够特异性结合来自HPV的抗原；阻断肿瘤中表达的免疫检查点受体的核酸，该核酸可以编码一种阻断蛋白；一种工程化T细胞，包含上述的核酸序列；一种工程化T细胞在制备治疗癌症药物的应用；一种产生工程化T细胞的方法：将载体导入T细胞得到TCR‑T细胞，然后经扩增得到工程化的T细胞；所述载体包含所述的核酸。本发明一种工程化核酸、T细胞及其应用和产生方法，得到的T细胞可以识别HPV E6肿瘤抗原，同时能够分泌阻断程序性细胞死亡蛋白PD‑1的单链抗体；这些工程化T细胞表现出更强的抗肿瘤作用并能够减少T细胞衰竭；本发明还可用于表达HPV E6癌症的免疫治疗。

Description

一种工程化核酸、T细胞及其应用和产生方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体的说，涉及一种工程化核酸、T细胞及其应用和产生方法。
背景技术
一些癌症(例如宫颈癌)主要由人乳头瘤病毒(HPV)感染引起。尽管化疗等治疗方法有一定效果，但许多癌症(包括HPV相关癌症)的预后可能较差。因此，存在对癌症，特别是HPV相关的癌症的医疗需求。
HPV16是HPV的一种亚型，常引发恶性肿瘤。HPV16可以通过其中的E6蛋白起作用，它可以影响细胞周期从而引发癌症。HPV16的E6蛋白可以在多种癌症中表达，包括但不限于子宫颈癌，口咽癌，肛门癌，肛管癌，肛门直肠癌，阴道癌，外阴癌和阴茎癌。
可以通过对TCR改造使T细胞特异性识别HPV16 E6抗原。于其类似的是嵌合抗原受体(CAR)基因修饰T细胞(CAR-T)是一种有效的改造T细胞疗法，它的核心是使T细胞特异性靶向肿瘤相关抗原(TAA)，例如CD19和GD2，在用于治疗诸如B细胞恶性肿瘤和神经母细胞瘤的临床试验中有不错的效果。
与天然存在的T细胞受体(TCR)不同，CAR是由与细胞内T细胞信号传导和共刺激结构域融合的人工受体。CAR可以以主要组织相容性类别(MHC)非依赖性方式直接识别TAA。尽管CAR-T细胞治疗在血液系统恶性肿瘤患者中取得了成功，但在大部分实体瘤中没有达到预期的效果。这可以归因于实体瘤中的免疫抑制微环境。这种环境涉及由T细胞中免疫检查点受体(IR)的表达。
到目前为止已经发现了多种抑制T细胞功能的免疫检查点，例如CTLA-4、TIM-3、LAG-3以及PD-1。这些分子在慢性感染和癌症中可以促成T细胞功能的衰竭，从而导致肿瘤逃脱免疫监视。其中，PD-1在T细胞活化后会上调，进一步可以与其两个配体PD-L1或PD-L2相互作用从而抑制T细胞细胞因子的释放。PD-L1在T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突细胞上都有表达。同时它也在各种肿瘤细胞中大量表达。而PD-L1在正常组织中的表达很低。PD-1一直是近期研究的焦点，临床研究表明，PD-1阻断剂可用于治疗结肠癌、肾癌、肺癌、黑色素瘤等癌种。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种工程化核酸、T细胞及其应用和产生方法，得到的T细胞可以识别HPV E6肿瘤抗原，同时能够分泌阻断程序性细胞死亡蛋白PD-1的单链抗体；这些工程化T细胞表现出更强的抗肿瘤作用并能够减少T细胞衰竭；本发明还可用于表达HPV E6癌症的免疫治疗。
本发明目的是这样实现的：
一、一种工程化核酸，其关键在于包括：
(a)基因工程改造的抗原受体的核酸，能够特异性结合来自HPV的抗原；所述核酸序列为SEQ ID NO.1:GGACAGCAGCTGAACCAGAGCCCCCAGAGCATGTTCATCCAGGAGGGCGAGGACGTGTCCATGAATTGCACCAGCAGCAGCATCTTCAACACTTGGCTGTGGTACAAGCAGGACCCAGGAGAGGGACCAGTGCTGCTGATTGCCCTGTACAAGGCCGGAGAGCTGACCTCTAACGGCAGACTGACCGCTCAGTTCGGCATCACCAGGAAGGACAGCTTCCTCAACATCAGCGCCAGCATCCCCAGCGACGTCGGAATCTACTTTTGCGCCGGCCACCCTAGCAGCAATAGCGGCTACGCCCTGAACTTCGGCAAGGGCACAAGCCTGCTGGTGACACCA；该核酸可以编码一种特异性识别HPV抗原的工程化受体TCR；
(b)阻断肿瘤中表达的免疫检查点受体的核酸，该核酸包括以下序列模块：
重链CDR1(SEQ ID NO.2)：GGATACACCTTTACCAACTATTAC；
重链CDR2(SEQ ID NO.3)：ATTAACCCAAGTAATGGTGGTACA；
重链CDR3(SEQ ID NO.4)：ACACGGCGAGATTACAATTACGATGGAGGGTTCGACTAC；
轻链CDR1(SEQ ID NO.5)：AAATCAGTCTCAACTTCTGGTTTTAAT；
轻链CDR2(SEQ ID NO.6)：CTGGCGTCA；
轻链CDR3(SEQ ID NO.7)：CAACATGGACGGGAGCTGCCCTTGACG；
该核酸可以编码一种阻断蛋白。
优选地，上述HPV的抗原为E6或E7抗原。
优选地，上述免疫检查点受体为PD-1受体。
二、一种工程化T细胞，其关键在于：包含所述的核酸，所述核酸能够编码基因工程改造的抗原受体和编码阻断抑制型受体的蛋白，所述受体能够特异性结合HPV的抗原，所述蛋白具有阻断肿瘤中免疫检查点受体的功能或表达。工程化的T细胞可以特异性靶向HPV的E6抗原，同时分泌阻断程序性细胞死亡蛋白的抗体，因此这些改造的T细胞能够表现出更强的抗肿瘤反应和降低T细胞衰竭的能力。
优选地，上述抗原受体氨基酸序列为SEQ ID NO.8：Gly Gln Gln Leu Asn GlnSer Pro Gln Ser Met Phe Ile Gln GluGly Glu Asp Val Ser Met Asn Cys Thr TyrLys Ala Gly Glu Leu Thr Ser Asn Gly Arg Leu Thr Ala Gln Phe Gly Ile Thr ArgLys Asp Ser Phe Leu Asn Ile Ser Ala Ser Ile Pro Ser Asp Val Gly Ile Tyr PheCys Ala Gly His Pro Ser Ser Asn Ser Gly Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys Gly ThrSer Leu Leu Val Thr Pro。
优选地，上述阻断抑制型受体的蛋白是一种持续表达的抗PD-1的单链抗体。scFv保留了衍生它的完整抗体的特异性，所述抗PD-1的单链抗体包含以下氨基酸序列模块：
重链CDR1 SEQ ID NO.9：Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr；
重链CDR2 SEQ ID NO.10：Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr；
重链CDR3 SEQ ID NO.11：Thr Arg Arg Asp Tyr Asn Tyr Asp Gly Gly Phe AspTyr；
轻链CDR1 SEQ ID NO.12：Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Phe Asn；
轻链CDR2 SEQ ID NO.13：Leu Ala Ser；
轻链CDR3 SEQ ID NO.14：Gln His Gly Arg Glu Lue Pro Leu Thr；
所述的轻链和重链可以是任何顺序，例如，VH-接头-VL或VL-接头-VH，只要保留scFv的靶抗原特异性即可。
三、一种工程化T细胞在制备治疗癌症药物的应用。
优选地，上述癌症为宫颈癌或头颈癌。
四、一种产生工程化T细胞的方法，其关键在于按以下步骤进行：将载体导入T细胞得到TCR-T细胞，然后经扩增得到工程化的T细胞；所述载体包含所述的核酸。
优选地，上述载体为逆转录病毒载体。
有益效果：
本发明一种工程化核酸、T细胞及其应用和产生方法，得到的T细胞可以识别HPVE6肿瘤抗原，同时能够分泌阻断程序性细胞死亡蛋白PD-1的单链抗体；这些工程化T细胞表现出更强的抗肿瘤作用并能够减少T细胞衰竭；本发明还可用于表达HPV E6癌症的免疫治疗。
附图说明
图1为所述载体的结构，它包括通过P2A和T2A接头序列连接的三个基因的核酸构片段：(a)能够识别HPV E6抗原的TCRα链的可变区以及不变区；(b)能够识别HPV E6抗原的TCRβ链的可变区以及不变区；(c)通过GS连接肽连接的抗PD-1的重链和轻链可变区构成的单链抗体。
图2为抗PD1 scFv序列中的CDR序列。
图3为工程化TCR-T细胞培养上清液中分泌的抗PD-1 scFv的定量数值。
图4为体现人外周血T细胞经过TCR-T工程化改造后HPV E6特异性TCR的表达情况。
图5为由TCR-T细胞分泌的抗PD-1 scFv可以与靶标细胞表达的PD-1相结合。
图6为TCR-T细胞分泌的抗PD-1 scFv可以竞争并阻断PD1蛋白与PD-L1的结合。
图7为载有抗PD-1 scFv的TCR-T细胞可以在抵消PD-L1的抑制效果，并产生更多的细胞因子IFNγ。
图8为在不同的T细胞刺激配比以及不同的时间节点载有抗PD-1 scFv的TCR-T细胞可以产生更多的细胞因子IFNγ。
图9为载有抗PD-1 scFv的TCR-T细胞有更强的杀伤靶细胞的能力。
图10为载有抗PD-1 scFv工程化TCR-T在小鼠HPV E6肿瘤模型中的肿瘤治疗效果和安全性评估。
具体实施方式
在本发明的描述中，需要理解的是，所用的术语“单链可变片段”，“单链抗体可变区片段”或“scFv”抗体指包含仅重链(VH)和轻链(VL)通过接头肽连通的产物。scFv能够表达为单链多肽。scFv保留了衍生它的完整抗体的特异性。轻链和重链可以是任何顺序，例如，VH-接头-VL或VL-接头-VH，只要保留scFv的靶抗原特异性即可。
本文所用术语“抗原”是指能够被抗体或T细胞受体(TCR)结合的分子，或者由MHC呈递的分子。
本文所用术语“HPV抗原”是指由人类乳头状瘤病毒(HPV)的多肽分子，其中所述HPV是可以是HPV1、HPV2、HPV3、HPV4、HPV6、HPV10、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV27、HPV28、HPV29、HPV30、HPV31、HPV33、HPV34、HPV35、HPV39、HPV40、HPV41、HPV42、HPV43、HPV45、HPV49、HPV51、HPV52、HPV54、HPV55、HPV56、HPV57、HPV58、HPV59、HPV68、HPV69。更多情况下HPV选自高风险HPV，例如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV69。HPV的抗原来自E6和E7抗原。
本文所用的术语“T细胞”包括CD4+T细胞和CD8+T细胞。术语T细胞还包括1型辅助细胞T细胞和2型辅助T细胞。T细胞表达野生型或重组T细胞受体(TCR)，嵌合抗原受体(CAR)，或能够识别与靶细胞相关的抗原部分的任何其他表面受体。一般情况下，TCR具有两条蛋白链(α和β链)，能够识别由MHC呈递的抗原多肽。
“接头”(L)或“接头结构域”或如本文所用指的是寡肽或多肽区从约1至100个氨基酸的长度“接头区”。接头可以由诸如甘氨酸和丝氨酸的柔性残基组成，使得相邻的蛋白质结构域可以相对于彼此自由移动。当希望确保两个相邻的区域不在空间上彼此干扰时，可以使用更长的接头。连接子可以是可切割的或不可切割的。可切割接头的实例包括2A接头(例如T2A)，2A样接头或其功能等同物及其组合。其他接头对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且可以与本发明的备选应用方案结合使用。
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例1：制备方法
1、载体构建设计：使用标准分子生物学技术构建的包括三个编码区的MP71逆转录载体构建体，其中三个编码区是：(A)与TCRα链恒定区融合的人抗E6 TCRα链的可变区(命名为aE6_Va-Ca))；(B)与TCRβ链恒定区融合的相同人抗E6 TCR的β链可变区(命名为aE6_Vb-Cb)；(C)用GS接头与TCR连接的新型抗PD-1抗体的重链(称为PD1_VH)和轻链(称为PD1_VL)的可变区。所得到的逆转录病毒载体通常被指定为E 6.αPD1_m11。本研究中使用的逆转录病毒载体的示意图如图1所示。
2、细胞系和培养基。HEK-293T和Ca Ski细胞购自ATCC。来自匿名供体的外周血单核细胞(PBMC)购自Hemacare。通过用过表达人PD-1的慢病毒载体转导293T细胞构建293T-PD-1细胞。细胞在DMEM+10％FBS，RPMI+10％FBS或X-Vivo+5％人血清A/B+1％HEPES+1％GlutaMAX中培养。
3、逆转录病毒的制备。使用标准磷酸钙沉淀转染的方法将逆转录病毒载体和病毒包装载体共转染293T细胞。48小时后收获病毒上清液并用于T细胞转导。
4、T细胞转导和培养。逆转录病毒转导之前，先用T细胞刺激磁珠将PBMC活化2天，转导时，在32℃离心2小时将新鲜收获的逆转录病毒上清液离心到包被有每孔15ugRetroNectin的非组织培养处理的24孔板中(Clontech公司)。将活化的PBMC加载到板上，并在32℃下以600g离心30分钟。将T细胞在37℃和5％CO 2下孵育。每2天补充培养基。
5、TCR和PD-1染色。所有抗体均购买于Biolegend公司。细胞转染后72小时，用抗TCRβ链的抗体染色，然后进行流式检测重组TCR的表达。在与CaSki靶细胞共培养72小时后，通过PD-1抗体检测PD-1的表达。同时进行CD3，CD4和CD8抗体染色。
6、TCR-T体外增殖。Ca Ski肿瘤细胞先用CFSE预染后，和E6，E 6.αPD1_m11或E6.αPD1_5C4 TCR-T细胞共培养72小时，然后通过流式测量CFSE信号强度。非转导的T(NT)细胞用阴性对照。
7、T细胞体外抗原特异性刺激后PD-1的表达。所有TCR-T细胞与CaSki细胞共培养72小时后收集T细胞并通过流式检测CD8T或CD4T细胞亚群中PD-1的表达。NT为非转导的T细胞中，其作为阴性对照。
实施例2：体外抗PD-1 scFv表达。
用编码E6，E6.αPD1_m11或E6.αPD1_5C4TCR的逆转录病毒载体转染293T细胞，转染后48小时收集细胞培养物上清液。通过ELISA检测20μl上清液中的抗PD-1 scFv的表达量。
图3展示抗PD-1 scFv在表达细胞培养上清中的表达量。E6表示没有抗PD-1 scFV的E6 TCR；E6.aPD1_m11表示新型抗PD-1单链抗体的E6 TCR；E6.αPD1_5C4表示含来自公开抗PD-1单链抗体的E6 TCR。
实施例3：E6 TCR-T体外表达。
先在T细胞转导图4所示的载体。培养72小时后，通过抗TCRβ的抗体染色检测重组TCR的表达。TCRβ流式检测基于CD3阳性淋巴细胞门。
结果：图4展示了E6 TCR高表达在E6.αPD1_m11转导过的T细胞中。
实施例4：抗PD-1 scFv的亲和力。
将编码E6，E 6.αPD1_m11或E6.αPD1_5C4 TCR的逆转录病毒载体转染293T细胞，转染后48小时后分别取300μl上清液与293T-PD-1细胞在室温下孵育30分钟，然后用HA标签抗体检测与293T-PD-1细胞结合的带HA标记的抗PD-1抗体。
结果：如图5所示，两种分泌的抗PD1抗体均与293T-PD-1细胞强烈结合。E 6.αPD1_m11和E6.αPD1_5C4抗体对细胞上表达的PD-1具有类似亲和力。
实施例5：重组PD-L1的竞争结合。
用1μl 100μg/ml的rhPD-L1/Fc，300μl E6，E6.αPD1_m11或E6.αPD1_5C4TCR转染后的293T细胞上清液与293T-PD1细胞孵育30分钟。然后用PE偶联的抗人Fc对细胞进行染色。
结果：如图6所示，E6.αPD1_m11和E6.αPD1_5C4TCR-T的细胞上清液能够与重组PD-L1竞争结合，证明单链抗PD1抗体可以阻断PD-1与其配体PD-L1之间的相互作用。
实施例6：TCR-T细胞体外IFNγ分泌。
用3μg/ml抗人CD3抗体包被96孔测定板4℃过夜。第二天吸出孔里的上清液，每孔用100μl的PBS洗涤一次。加入100μl PBS稀释的10μl/ml rhPD-L1/Fc。然后在每个孔中加入10μl PBS稀释的100μg/ml山羊抗人IgG Fc抗体。将测定板在37℃下温育4小时。人T细胞转染2天后放入包被的96空板中，取100μl E6，E6.αPD1_m11或E6.αPD1_5C4TCR转染过的293T细胞培养物的上清液，同时加入高尔基体分泌抑制剂。37℃和5％CO2下孵育过夜。孵育后，收获T细胞进行细胞内IFN-γ染色。
结果：如图7所示，E6 TCR-T细胞可被CD3抗体激活并分泌IFNγ，重组PD-L1(rhPD-L1)可以抑制CD3抗体诱导的IFNγ分泌。然而，在加入E6.αPD1_m11和E6.αPD1_5C4上清液的实验中，PD-L1没有抑制CD3抗体诱导的IFNγ分泌。
实施例7：TCR-T细胞体外IFNγ分泌。将TCR-T细胞与Ca Ski按1：0，1：2，1：1和3：1的效应物与靶标比率混合共培养48或者72小时后收集上清液，并根据制造商的说明书用人IFN-γELISA试剂盒测量IFN-γ的表达。
结果：分泌的抗PD-1的scFv对抗原刺激TCR-T细胞IFNγ分泌的效果展示于图8(NT为用作对照的非转导对照)。E6.αPD1_m11和E6.αPD1_5C4TCR-T细胞中上清液中可检测到IFNγ分泌，然而，E6.αPD1_m11z组中IFNγ分泌显著更高。
实施例8：特异性靶细胞杀伤。Ca Ski肿瘤细胞先用CFSE预染后，和E6，E 6.αPD1_m11或E6.αPD1_5C4 TCR-T细胞以1：2,1：1和3：1比例混合共培养过夜。然后通过Annexin V/7-AAD染色测量T细胞对Ca Ski细胞的细胞毒性。非靶293T细胞作为本实验对照。
结果：如图9所示，E6 TCR-T细胞可以特异性杀伤E6+靶细胞Ca Ski。E 6.αPD1_m11和E6.αPD1_5C4可以更有效地杀伤E6+靶细胞Ca Ski。
实施例9：TCR-T体内活性和毒性试验。6-8周雌性NSG小鼠进行皮下注射2e6的Caski肿瘤细胞。24小时后，通过尾静脉给小鼠分别注射10e6E6-TCR-T，E 6.αPD1_m11-TCR-T转导或未转导的T细胞。每周测量肿瘤大小两次以评估TCR-T抗肿瘤功效，每周测量两次小鼠身体状况和体重以评估TCR-T相关毒性。
TCR-T体内试验结果：如图10所示，相对于未经过工程化的T细胞，经过HPV E6特异性TCR改造的TCR-T细胞有一定的肿瘤治疗效果，而同时载有抗PD1 scFv的工程化T细胞有更强的治疗效果。在安全性方面，这两种工程化TCR-T细胞产品均没有对小鼠造成显著毒性，说明产品有安全性。
最后需要说明的是，上述描述仅仅为本发明的优选实施例，如：
工程细胞 在各种应用方案中，可以由细菌、真菌、人类、大鼠、小鼠、兔、猴、猪或任何其他物种获得经改造的细胞。主要的来说，细胞可以来自人，大鼠或小鼠。更主要的来说，细胞获自人的T细胞、B细胞或NK细胞。
在优选的应用方案中，所述细胞是T细胞。用于本发明的T细胞的实例包括但不限于通过体外培养从患者分离的T细胞(例如，肿瘤浸润淋巴细胞)。
重组载体 重组载体是可以用于遗传物质递送至细胞内进行表达的工具，重组载体包括但不限于质粒载体、病毒载体、BAC、YAC、HACS等。可以使用的病毒载体包括但不限于重组逆转录病毒载体，重组慢病毒载体，重组腺病毒载体，泡沫病毒载体，重组腺相关病毒(AAV)载体，杂合载体和/或质粒转座子(为例如睡美人座子系统)等系统。
在主要的应用方案中，采用的重组载体是转录病毒载体。该载体可以通过一种特殊的病毒载体培养基生产。在本发明的应用方案中，这种培养基包括各种适合该病毒载体生产的培养基基质以及营养补充物。
基因工程改造的受体 基因工程改造的受体包括但不限于T细胞受体(TCR)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体家族(KIR)、C型凝集素受体家族、白细胞免疫球蛋白样受体家族、I型细胞因子受体、II型细胞因子受体家族、肿瘤坏死因子家族、TGFβ受体家族、趋化因子受体、IgSF。
在主要的应用方案中，所述受体是通过基因工程改造的T细胞受体(TCR)，表达该受体的T细胞是αβ-T细胞，在备选应用方案中，表达该受体的T细胞也可以是γδ-T细胞。
靶标抗原
在一些应用方案中，与疾病或病症相关的抗原可以来自HPV、HIV、HCV、HBV、EBV、HTLV-1、CMV、腺病毒、多瘤病毒、HHV-8或其他病原体所表达的蛋白，也可以来自细胞表达的蛋白，包括ROR1、EGFR、Her2、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2,3或4、FBP、胎乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、Lewis Y、L1细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MA RT-1、gp100、癌胚抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、ephrinB2、CD123、CS-1、c-Met、GD-2和MAGE A3和/或生物素化分子。
主体上，靶标抗原选自人类乳头瘤病毒(HPV)抗原。HPV的亚型包括但不限于HPV1、HPV2、HPV3、HPV4、HPV6、HPV10、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV27、HPV28、HPV29、HPV30、HPV31、HPV33、HPV34、HPV35、HPV39、HPV40、HPV41、HPV42、HPV43、HPV45、HPV49、HPV51、HPV52、HPV54、HPV55、HPV56、HPV57、HPV58、HPV59、HPV68、HPV69。
在一些应用方案中，HPV抗原选自但不局限于E1、E2、E3、E4、E6和E7、L1和L2蛋白。在主要的应用方案中，抗原是E6抗原。在另一个主要的应用方案中，抗原是E7抗原。
在一些应用方案中，所述病症是病毒引发的恶性肿瘤，包括但不限于HPV、HCV、EBV、HIV、HHV-8、HTLV-1、MCV引发的恶性肿瘤。本发明中，主要的应用是HPV引发的恶性肿瘤，包括但不限于子宫颈癌、口咽癌、肛门癌、肛管癌、肛门直肠癌、阴道癌、外阴癌和阴茎癌。
检查点抑制剂 在各种应用方案中，工程化的细胞表达至少一种免疫检查点抑制剂(CPI)。其中免疫检查点包括但不限于PD-1、PD-L1、PD-L2、2B4(CD244)、4-IBB、A2AR、B7.1、B7.2、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、BTLA、butyrophilins、CD160、CD48、CTLA4、GITR、gp49B、HHLA2、HVEM、ICOS、ILT-2、ILT-4、KIR家族受体、LAG-3、OX-40、PIR-B、SIRPalpha(CD47)、TFM-4、TIGIT、TIM-1、TIM-3、TIM-4、VISTA及其组合。
在主要的应用方案中，检查点是PD-1或PD-L1。在各种应用方案中，检查点抑制剂是抗PD-1 scFv。该蛋白能够导致PD-1或PD-L1的表达降低和/或阻断检查点的功能。
载体的核酸组成
参见图1。如图1所示，载体的核酸序列包括三个序列。这三个序列包括：(a)特异性识别HPV E6 TCR的TCRα链的可变区和不变区的组合序列，定义为“aE6_Va-Ca”，其中aE6_Va对应可变区，Ca对应不变区；(b)特异性识别HPV E6 TCR的TCRβ链的可变区和不变区的组合序列，定义为“aE6_Vb-Cb”，其中aE6_Vb对应可变区，Cb对应不变区；(c)抗PD-1 scFv的重链可变区定义为“aPD1_VH”，抗PD-1 scFv的轻链可变区定义为“aPD1_VL”。其中，所述抗PD-1scFv序列的关键区域包括：重链可变区的框架FR1区域；包含具有SEQ ID NO.1所示的重链CDR1；重链可变区的框架FR2区域；包含具有SEQ ID NO.2所示的重链CDR2；重链可变区的框架FR3区域；包含具有SEQ ID NO.3所示的重链CDR3；轻链可变区的框架FR1区域；包含具有SEQ ID NO.1所示的轻链CDR1；轻链可变区的框架FR2区域；包含具有SEQ ID NO.2所示的轻链CDR2；轻链可变区的框架FR3区域；包含具有SEQ ID NO.3所示的轻链CDR3；和轻链可变区的框架FR4区。
载体的核酸组成还包含连接上述序列(a)、(b)和(c)的P2A和T2A序列。此外，抗PD-1 scFv的重链和轻链的可变区(分别鉴定为aPD1_VH和aPD1_VL)与GS接头连接。
载体和核酸组成还包括其他的辅助序列，用于辅助载体的转染、转导、集成、复制、转录、翻译以及稳定表达。
制备工程化细胞的方法
本发明提供了用于制造和使用所工程化细胞用于治疗病理疾病或病症的方法或过程。该方法包括以下步骤：(I)从患者血液中分离T细胞；(II)用TCR-T载体转导T细胞以将细胞工程化；(III)体外扩增工程化的T细胞；(IV)将细胞回输患者体内，其中工程化的T细胞将寻找并破坏抗原表达为阳性肿瘤细胞。同时，这些工程化T细胞将阻断PD-1/PD-L1免疫检查点并增强抗肿瘤免疫应答。
可以使用任何标准方法来实现细胞的转染，如磷酸钙法，电击法，脂质体介导法，显微注射法，生物粒子递送系统，或任何其它已知的方法。
根据在此描述的各种应用例中，本发明提供了免疫治疗HPV相关癌症特别HPV16E6+或HPV16 E7+癌症。该工程化T细胞识别肿瘤抗原HPV E6和同时分泌一个阻断程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的单链抗体(scFv)。这些工程改造的T细胞表现出更强的抗肿瘤反应和减少的T细胞衰竭。
已经通过以上实验发现，对PD-1检查点的阻断是更有效的，因为：(1)抗PD-1的药物递送定位于肿瘤部位和(2)本发明中抗PD-1 scFv比目前的抗PD-1抗体的结合能力更强。由于抗PD-1药物递送定位于肿瘤部位，因非特异性炎症引起的毒性降低。
此外，本发明可被用于个性化的抗肿瘤免疫疗法。可以从患者的血液中容易地产生抗HPV E6抗原特异性，且具有抗PD-1功能工程化的T细胞。然后将这些工程化的T细胞重新注入患者体内作为细胞治疗产品。该产品可应用于任何患有HPV E6阳性肿瘤的患者，包括宫颈癌、头颈癌等。
序列表
<110> 广东天科雅生物医药科技有限公司
<120> 一种工程化核酸、T细胞及其应用和产生方法
<150> 62717787
<151> 2018-8-11
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ggacagcagc tgaaccagag cccccagagc atgttcatcc aggagggcga ggacgtgtcc 60
atgaattgca ccagcagcag catcttcaac acttggctgt ggtacaagca ggacccagga 120
gagggaccag tgctgctgat tgccctgtac aaggccggag agctgacctc taacggcaga 180
ctgaccgctc agttcggcat caccaggaag gacagcttcc tcaacatcag cgccagcatc 240
cccagcgacg tcggaatcta cttttgcgcc ggccacccta gcagcaatag cggctacgcc 300
ctgaacttcg gcaagggcac aagcctgctg gtgacacca 339
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ggatacacct ttaccaacta ttac 24
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
attaacccaa gtaatggtgg taca 24
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<212> DNA
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<400> 4
acacggcgag attacaatta cgatggaggg ttcgactac 39
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
aaatcagtct caacttctgg ttttaat 27
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
ctggcgtca 9
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<211> 27
<212> DNA
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<400> 7
caacatggac gggagctgcc cttgacg 27
<210> 8
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 8
Gly Gln Gln Leu Asn Gln Ser Pro Gln Ser Met Phe Ile Gln Glu Gly
1 5 10 15
Glu Asp Val Ser Met Asn Cys Thr Tyr Lys Ala Gly Glu Leu Thr Ser
20 25 30
Asn Gly Arg Leu Thr Ala Gln Phe Gly Ile Thr Arg Lys Asp Ser Phe
35 40 45
Leu Asn Ile Ser Ala Ser Ile Pro Ser Asp Val Gly Ile Tyr Phe Cys
50 55 60
Ala Gly His Pro Ser Ser Asn Ser Gly Tyr Ala Leu Asn Phe Gly Lys
65 70 75 80
Gly Thr Ser Leu Leu Val Thr Pro
85
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 9
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 10
Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr
1 5
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 11
Thr Arg Arg Asp Tyr Asn Tyr Asp Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 12
Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Phe Asn
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 13
Leu Ala Ser
1
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 14

Claims (7)

1.一种工程化核酸，其特征在于包括：(a)基因工程改造的抗原受体的核酸，能够特异性结合来自HPV的抗原；该核酸序列为SEQ ID NO.1；(b)阻断肿瘤中表达的免疫检查点受体的核酸，该核酸包括以下序列模块：重链CDR1：SEQ ID NO.2；重链CDR2：SEQ ID NO.3；重链CDR3：SEQ ID NO.4；轻链CDR1：SEQ ID NO.5；轻链CDR2：SEQ ID NO.6；轻链CDR3：SEQ IDNO.7。
2.一种工程化T细胞，其特征在于：包含权利要求1所述的核酸，所述核酸能够编码基因工程改造的抗原受体和编码阻断抑制型受体的蛋白，所述抗原受体能够特异性结合HPV的抗原，所述蛋白具有阻断肿瘤中免疫检查点受体的功能或表达。
3.根据权利要求2所述的一种工程化T细胞，其特征在于：所述抗原受体氨基酸序列为SEQ ID NO.8。
4.根据权利要求2所述的一种工程化T细胞，其特征在于：所述阻断抑制型受体的蛋白是一种持续表达的抗PD-1的单链抗体，该抗PD-1的单链抗体包含以下氨基酸序列模块：重链CDR1：SEQ ID NO.9；重链CDR2：SEQ ID NO.10；重链CDR3：SEQ ID NO.11；轻链CDR1：SEQID NO.12；轻链CDR2：SEQ ID NO.13；轻链CDR3：SEQ ID NO.14。
5.一种权利要求2～4任一项所述的工程化T细胞在制备治疗癌症药物的应用；其中，所述癌症为表达HPV E6抗原的癌症。
6.一种产生工程化T细胞的方法，其特征在于按以下步骤进行：将载体导入离体的T细胞得到TCR-T细胞，然后经体外扩增得到所述工程化T细胞；所述载体包含权利要求1所述的核酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述载体为逆转录病毒载体或慢病毒载体。
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