DK175392B1 - Enkelt-domæne-ligander, receptorer omfattende disse ligander, fremgangsmåder til fremstilling af dem og anvendelse af disse ligander og receptorer - Google Patents

Description

.....j _ ^ ,1^·*·_- _;_wqfiBWPWjr .·”··*· ·_· ·- ΐ"»·^··»ΐΓ^Γτ·^·π^:!ί·'.^ϊ· » DK 175392 B1

Den foreliggende opfindelse angår kloning af det variable område af im-munglobulin (Ig). Fremgangsmåder til kloning, amplifikation og ekspression af DNA-sekvenser, som koder for i det mindste en del af det variable område af et molekyle af et immunoglobulin og fremgangsmåder til at anvende så-5 danne DNA-sekvenser ved fremstilling af molekyler af lg-typen beskrives.

Efter beskrivelsen findes der en liste over referencer. De her anførte dokumenter omtales i beskrivelsen ved et tal, som er angivet i (_).

10 lg-superfamilien omfatter ikke alene selve Ig'eme, men også sådanne molekyler som receptorer på lymfoide celler, såsom T-lymfocytter. Immunglobuli-ner omfatter mindst én tung kæde og én let kæde, der er bundet sammen covalent. Hver kæde er delt i en række domæner. Ved den N-terminale ende af hver kæde er der et variabelt domæne. De variable domæner på den tun-15 ge kæde og den lette kæde passer sammen til dannelse af et bindingssted udformet til at modtage et bestemt målmolekyle. I tilfældet med Ig’er er mål-molekylerne antigener. T-cellereceptorer har to kæder med ens størrelse, a-og β-kæderne, som hver består af to domæner. Ved den N-terminale ende af hver kæde er der et variabelt domæne, og de variable domæner på a- og β-20 kæderne formodes at passe sammen til dannelse af et bindingssted for målmolekyler, i dette tilfælde peptider i form af et histokompatibilitetsantigen. De variable domæner kaldes sådan, fordi deres aminosyresekvenser varierer specielt fra et molekyle til et andet molekyle. Denne sekvensvariation sætter molekylerne i stand til at genkende en meget lang række af målmolekyler.

25 lg-molekyler er blevet grundigt undersøgt for at bestemme, hvordan de variable domæner frembringes. Det er blevet vist, at hvert variabelt domæne omfatter en række områder med en relativt konserveret sekvens og tre områder med en hypervariabel sekvens. De tre hypervariable områder kaldes generelt 30 komplementaritetsbestemmende områder (CDR'er).

I DK 175392 B1 I

I 2 I

I Krystallografiske undersøgelser har vist, at i hvert variabelt domæne i et Ig- I

I molekyle bæres CDR'eme på strukturrammeområder frembragt af områder- I

I ne med konserverede sekvenser. De tre CDR'er bringes sammen af struktur- I

I rammeområderne og danner sammen med CDR'eme på den anden kæde I

I 5 en lomme, i hvilken målmolekylet modtages. I

I Efter fremkomsten af rekombinant-DNA-teknologi har der været stor inter- I

I esse for at anvende denne teknologi til at klone og udtrykke lg-molekyler og I

I derivater deraf. Denne interesse er afspejlet i antallet af patentansøgninger I

I 10 og andre publikationer vedrørende emnet. I

I Det tidligste arbejde vedrørende kloning og ekspression af Ig'er i fuld længde I

I i patentlitteraturen er EP-A-0.120.694 (Boss). Boss' ansøgning angår også I

I kloningen og ekspressionen af kimære antistoffer. Kimære antistoffer er mo- I

I 15 lekyler af lg-typen, i hvilke de variable domæner fra ét Ig er fusioneret med I

I konstante domæner fra et andet Ig. Sædvanligvis er de variable domæner I

I afledt fra et Ig fra én art (ofte et muse-lg) og de konstante domæner er afledt I

I fra et Ig fra en anden art (ofte et humant Ig). I

I 20 En senere europæisk patentansøgning, EP-A-0.125.023 (Genentech) angår I

I omtrent det samme emne som Boss' ansøgning, men angår også fremstillin- I

I gen af andre variationer af molekyler af lg-typen ved rekombinant-DNA- I

I teknologi. I

I 25 I beskrivelsen til EP-A-0.194.276 (Neuberger) beskrives ikke alene kimære I

I antistoffer af den type, der er omtalt i Boss’ ansøgning, men også kimære I

I antistoffer, i hvilke nogle eller alle af de konstante domæner er blevet erstat- I

I tet med proteinsekvenser, der ikke er afledt fra Ig. For eksempel kan CH2- og I

I CH3-domænerne i den tunge kæde erstattes med proteinsekvenser afledt fra I

I 30 et enzym eller fra et proteintoxin. I

3 DK 175392 B1 I beskrivelsen til EP-A-0.239.400 (Winter) omtales en anden fremgangsmåde til fremstilling af Ig-molekyler. Ved denne fremgangsmåde podes kun CDR'eme fra en første type af Ig på en anden type af Ig i stedet for dets normale CDR’er. Det således frembragte lg-molekyle er hovedsageligt af den 5 anden type, eftersom CDR'erne udgør en forholdsvis lille del af hele Ig-molekylet. Men eftersom CDR’eme er de dele, som definerer specificiteten af Ig’et, er specificiteten af det således fremstillede lg-molekyle afledt fra det første Ig.

10 Herefter kaldes kimære antistoffer, CDR-podede Ig'er, de af Genentech beskrevne ændrede antistoffer samt fragmenter af sådanne Ig’er, som F(ab')2-og Fv-fragmenter, modificerede antistoffer.

En af hovedårsagerne til al den aktivitet inden for Ig-området under anven-15 delse af rekombinant-DNA-teknologi er ønsket om at anvende Ig'er ved terapi. Det er velkendt, at det ved at anvende hybridomteknikken udviklet af Kohier og Milstein er muligt at fremstille monoklonale antistoffer (MAb'er) med næsten en hvilken som helst specificitet. Der er således blevet produceret MAb'er rettet mod kræftantigener. Man regner med, at disse MAb'er covalent 20 kan bindes eller fusioneres med toxiner til tilvejebringelse af "magiske kugler" til brug ved kræftterapi. Der er også frembragt MAb'er rettet mod normale vævsantigener eller celleoverfladeantigener. Der kan fastgøres mærkninger til disse, således at de kan anvendes til in vivo afbildning.

25 Den vigtigste hindring for at anvende sådanne MAb'er ved terapi eller ved in vivo diagnosticering er, at langt den største del af MAb'er, som er blevet produceret, hidrører fra gnavere, navnlig fra mus. Det er meget vanskeligt at fremstille humane MAb’er. Eftersom de fleste MAb'er er afledt fra ikke-humane arter, er de antigene i mennesker. Indgivelse af disse MAb'er i men-30 nesker resulterer sædvanligvis i, at mennesket rejser et anti-lg-svar. Et sådant svar kan interferere med terapi eller diagnose, for eksempel ved at øde-

I DK 175392 B1 I

I I

I lægge eller rydde antistoffet hurtigt, eller kan fremkalde allergiske reaktioner I

I eller immunkomplekshypersensitivitet, som har ugunstige virkninger på pati- I

I enten. I

I 5 Fremstillingen af modificerede Ig'er er blevet foreslået for at sikre, at det Ig, I

som indgives i en patient, er så "humant" som muligt, men stadig bevarer I

I den hensigtsmæssige specificitet. Det forventes derfor, at modificerede Ig'er I

I vil være lige så effektive som det MAb, fra hvilket specificiteten er afledt, men I

på samme tid ikke særlig antigen. Det skulle således være muligt at anvende I

I 10 det modificerede Ig et rimeligt antal gange ved et behandlings- eller diagno- I

I sticeringsprogram. I

På genniveauet er det kendt, at de variable områder i den tunge kæde er I

I kodet af et "omordnet" gen, som er dannet ud fra tre gensegmenten et "ikke- I

I 15 omordnet" VH-gen (der koder for de tre N-terminale strukturrammeområder, I

I de første to fulde CDR'er og den første del af den tredje CDR), et diversitets- I

I segment (DH-segment) (der koder for den centrale del af det tredje CDR) og I

I et hængselssegment (JH) (der koder for den sidste del af den tredje CDR og I

det fjerde strukturrammeområde). Ved modningen af B-celler omordnes ge- I

I 20 neme således, at hvert ikke-omordnet VH-gen kobles til ét DH-gen og ét JH- I

I gen. Det omordnede gen svarer til VH-DH-JH. Dette omordnede gen kobles I

I til et gen, som koder for den konstante del af Ig-kæden. I

I For de lette kæder er situationen lignende med undtagelse af, at der for de I

I 25 lette kæder ikke er noget diversitetsområde. De variable områder af de lette I

I kæder kodes således af et "ikke-omordnet" VL-gen og et JL-gen. Der er to I

I typer lette kæder, kappa eller lambda, der respektivt er bygget fra ikke- I

I omordnede VkaPpa-gener og Jtappa-segmenter og fra ikke-omordnede ViamMa- I

I gener og Jiambda-segrnenter. I

I 30 I

5 DK 175392 B1

Det har vist sig, at isolerede variable domæner fra en tung Ig-kæde kan bindes til antigen i et forhold på 1:1 og med bindingskonstanter af en ækvivalent størrelse som bindingskonstanter for fuldstændige antistofmolekyler.

5 En enkelt-domæne-ligand bestående af mindst en del af det variable domæne af én kæde af et molekyle fra lg-superfamilien kan være slutproduktet i processer, som inddrager fremgangsmåder ifølge den foreliggende opfindelse.

10 Liganden består fortrinsvis af det variable domæne af en let Ig-kæde eller mest fortrinsvis af en tung kæde.

Om ønsket kan genet for en enkeltdomæneligand muteres for at forbedre egenskaberne af det udtrykte domæne, for eksempel for at forøge ekspressi-15 onsudbyttet eller opløseligheden af liganden, for at sætte liganden i stand til at binde bedre eller for at indføre et andet sted for covalent fastgørelse (ved at indføre kemisk reaktive rester, såsom cystein og histidin) eller ikke-covalent binding af andre molekyler. Det ville navnlig være ønskeligt at indføre et andet bindingssted for serumkomponenter, for at forlænge domænernes 20 opholdstid i serumet, eller for at binde til molekyler med effektorfunktioner, såsom komplementkomponenter, eller receptorer på overfladerne af celler.

Således kunne hydrofobe rester, som normalt ville være ved grænsefladen mellem de variable domæne i den tunge kæde og det variable domæne i den 25 lette kæde, muteres til mere hydrofile rester for at forbedre opløselighed; rester i CDR-sløjferne kunne muteres for at forbedre antigenbinding; rester på andre sløjfer eller dele af β-foldebladet kunne muteres for at indføre nye bin-dingsaktiviter. Mutationer kunne omfatte enkelte punktmutationer, multiple punktmutationer eller mere omfattende ændringer og kunne indføres ved 30 hjælp af en hvilken som helst af en række rekombinant-DNA-metoder, for I DK 175392 B1 I 6 I eksempel gensyntese, stedstyret mutagenisering eller polymerasekædereak- I tionen.

I Eftersom liganderne ifølge den foreliggende opfindelse har en bindingsaffini- I 5 tet, som er ækvivalent med bindingsaffiniteten for komplette lg-molekyler, I kan liganderne anvendes på mange af de måder, lg-molekyler eller fragmen- I ter anvendes på. For eksempel har lg-molekyler været anvendt ved terapi I {såsom behandling af kræft, bakterielle og virale sygdomme), ved diagnosti- I cering (såsom graviditetstest), ved vaccination (såsom ved frembringelse af I 10 anti-idiotype antistoffer, som efterligner antigener), ved modulation af aktivite- I ter af hormoner eller vækstfaktorer, ved påvisning, i biosensorer og ved kata- | lyse.

I Man regner med, at den lille størrelse af liganderne ifølge den foreliggende I 15 opfindelse kan give nogle fordele i forhold til komplette antistoffer, for eksem- pel ved neutraliseringen af aktiviteten af lavmolékylære lægemidler (såsom digoxin) og muliggøre deres filtrering fra nyrerne med tilhæftet lægemiddel; I ved gennemtrængning af væv og tumorer; ved neutralisering af vira ved at I bindes til små, konserverede områder på overfladen af vira, såsom "canyon”- I 20 stederne på vira (16); ved højopløselig epitopkortlægning af proteiner og ved I vaccination med ligander, som efterligner antigener.

I En enkelt-domæne-ligand kan bindes til én eller flere udvalgt blandt et effek- I tormolekyle, en mærkning, en overflade, eller én eller flere andre ligander 25 med den samme eller en anden specificitet til dannelse af en receptor.

En receptor omfattende en ligand bundet til et effektormolekyle kan anven- des ved terapi. Effektormolekylet kan være et toxin, såsom ricin eller pseu- domonas exotoxin, et enzym, som er i stand til at aktivere et pro-lægemiddel, I 30 en bindingspartner eller en radioaktiv isotop. Den radioaktive isotop kan være I bundet direkte til liganden eller kan være fæstnet dertil gennem en chelate- 7 DK 175392 B1 rende struktur, som er direkte bundet til liganden. Sådanne ligander med tilhæftede isotoper er meget mindre end de, der er baseret på Fv-fragmenter og kan lettere gennemtrænge væv og få adgang til tumorer.

5 En receptor omfattende en ligand bundet til en mærkning kan anvendes ved diagnosticering. Mærkningen kan være et tungmetalatom eller en radioaktiv isotop, hvorved receptoren kan anvendes til in vivo afbildning under anvendelse af røntgenstråleapparatur eller andet scan-ningsapparatur. Metalatomet eller den radioaktive isotop kan være fæstnet til liganden enten direkte 10 eller via en chelaterende struktur direkte koblet til liganden. Til in vitro diagnostisk test kan mærkningen være et tungmetalatom, en radioaktiv isotop, et enzym, et fluorescerende molekyle eller et farvet molekyle eller en protein-eller peptidmærkning, som kan påvises med et antistof, et antistoffragment eller et andet protein. Sådanne receptorer ville kunne anvendes ved en hvil-15 ken som helst af de kendte diagnostiske test, såsom ELISA eller fluorescenskoblede analyser.

En receptor omfattende en ligand koblet til en overflade, såsom et kromatografimedium, kunne anvendes til oprensning af andre molekyler ved affini-20 tetskromatografi. Kobling af ligander til celler, for eksempel de ydre membranproteiner fra E. coli eller til hydrofobe ender, som kan lokalisere liganderne i cellemembranerne, ville muliggøre en enkel diagnostisk test, ved hvilken bakterierne eller cellerne ville agglutinere i nærværelse af molekyler, som bærer multiple steder for binding af liganden (liganderne).

25

Receptorer omfattende mindst to ligander kan for eksempel anvendes ved diagnostiske test. Den første ligand vil bindes til et testantigen, og den anden ligand vil bindes til et meddelermolekyle, såsom et enzym, et fluorescerende farvestof, et farvet farvestof, en radioaktiv isotop, et farvet, fluores.censmær-30 ket eller radioaktivt mærket protein.

I DK 175392 B1 I 8

I Alternativt kan sådanne receptorer være nyttige til at forøge bindingen til et . I

antigen. Den første ligand vil bindes til en første epitop af antigenet, og den I

I anden ligand vil bindes til en anden epitop. Sådanne receptorer kan også I

I anvendes til at forøge affiniteten og specificiteten af binding til forskellige an- I

I 5 tigener tæt ved hinanden på overfladen af celler. Den første ligand vil bindes I

I til det første antigen og den anden epitop til det andet antigen: stærk binding I

vil afhænge af co-ekspressionen af epitoperne på overfladen af cellen. Dette I

I kan være nyttigt ved tumorterapi, hvor tu-moreme kan have en forhøjet eks- I

I pression af adskillige overflademarkører. Yderligere ligander kan tilføjes for I

I 10 yderligere at forbedre bindingen eller specificiteten. Endvidere kan anvendel- I

sen af bånd af ligander med den samme specificitet eller multiple specificite- I

I ter frembringe et større molekyle, som vanskeligere filtreres fra cirkulationen I

I ved hjælp af nyren. I

15 Til vaccination med ligander, som efterligner antigener, kan anvendelsen af I

bånd af ligander vise sig at være mere effektive end enkelte ligander på I

I grund af gentagelsen af de immuniserende epitoper. I

Om ønsket kan sådanne receptorer med multiple ligander omfatte effektor- I

I 20 molekyler eller mærkninger, således at de kan anvendes ved terapi eller di- I

I agnosticering som ovenfor beskrevet. I

I Liganden kan være koblet til den anden del af receptoren på en hvilken som I

I helst egnet måde, for eksempel ved covalente eller ikke-covalente kemiske I

I 25 bindinger. Når receptoren omfatter en ligand og et andet proteinmolekyle, I

I foretrækkes det imidlertid, at de fremstilles ved rekombinant-DNA-teknologi I

I som et fusionsprodukt, Om nødvendigt kan en koblingspeptidsekvens an- I

I bringes mellem liganden og det andet proteinmolekyle til til-vejebringelse af I

I flexibilitet. I

I 30 I

9 DK 175392 B1 .De grundlæggende metoder til manipulering af Ig-mole-kyler ved rekombi-nant-DNA-teknologi er beskrevet i de ovenfor citerede patentreferencer. Disse metoder kan tilpasses for at muliggøre produktionen af ligander og receptorer ifølge opfindelsen ved hjælp af rekombinant-DNA-teknologi.

5 Når liganden skal anvendes til in vivo diagnosticering eller terapi hos mennesker, menneskeliggøres den fortrinsvis, for eksempel ved CDR-udskiftning som beskrevet i EP-A-0.239.400.

10 For at opnå en DNA-sekvens, der koder for en ligand, er det almindeligvis nødvendigt først at frembringe en hybridom, som secernerer et passende MAb. Dette kan være en meget tidsrøvende metode. Når man har immuniseret et dyr, er det nødvendigt at fusionere separerede miltceller med en passende myelomcellelinie, dyrke de således producerede cellelinier, selektere 15 passende linier, klone de selekterede linier igen og selektere igen. Dette kan tage lang tid. Dette problem angår også fremstillingen af modificerede Ig’er.

Et yderligere problem ved fremstillingen af ligander og receptorer ifølge opfindelsen samt modificerede Ig'er ved rekombinant-DNA-teknologi er klonin-20 gen af det variable domæne, som koder for sekvenser fra hybridomen, der producerer det MAb, fra hvilket specificiteten skal afledes. Dette kan være en forholdsvis lang metode, som involverer frembringelsen af en passende probe, konstruktion af et klonbibliotek ud fra cDNA eller genomisk DNA, omfattende probering af klonbiblioteket og manipulering af alle isolerede kloner for 25 at muliggøre kloningen i en egnet ekspressionsvektor. På grund af den iboende variabilitet af de. DNA-sekvenser, som koder for de variable Ig-domæner, har det tidligere ikke været muligt at undgå sådant tidsrøvende arbejde. Det er derfor et yderligere formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en fremgangsmåde, som muliggør at stort set en hvilken som 30 helst sekvens, der koder for et variabelt domæne (ligand) på et molekyle fra lg-superfamilien, kan klones i løbet af en rimelig tidsperiode.

I DK 175392 B1 I

I 10 I

Ifølge et aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en frem- I

I gangsmåde til kloning af en sekvens (målsekvensen), som koder for idet I

I mindste en del af det variable område af et molekyle af lg-superfamilien, hvil- I

I ken fremgangsmåde omfatter: (a) at der tilvejebringes en prøve af dobbelt- I

I 5 strenget (ds) nucleinsyre, som indeholder målsekvensen, (b) at prøven dena- I

tureres til separering af de to strenge, (c) at der til prøven anneleres (eng.: I

annealing) en fremadrettet og en bagudrettet oligonucleotidprimer, hvor den I

I fremadrettede primer (eng.: the forward primer) er specifik for en sekvens I

I ved eller nær 3'-enden af sense-strengen af målsekvensen, den bagudrette- I

I 10 de primer (eng.: the back primer) er specifik for en sekvens ved eller nær 3- I

enden af antisense-strengen af målsekvensen, under betingelser, som tilla- I

I der primerne at hybridisere til nucleinsyren ved eller nær målsekvensen, (d) I

at den annelerede prøve behandles med et DNA-polymeraseenzym i nærvæ- I

relse af deoxynucleosidtriphosphater, under betingelser, som forårsager at I

15 primerforlængelse finder sted, og (e) at prøven denatureres under sådanne I

I betingelser, at de foriængede primere adskilles fra målsekvensen. I

I Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse omfatter fortrinsvis I

I endvidere trinnet (0 med gentagelse af trinnene (c) til (e) på den denaturere- I

I 20 de blanding et stort antal gange. I

I Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse anvendes fortrinsvis til I

I at klone fuldstændige variable domæner fra lg-molekyler, mest fortrinsvis fra I

tunge kæder af Ig. I

I 25

I det ovenfor anførte trin (c) bliver den fremadrettede primer anneleret til sen- I

se-strengen af målsekvensen ved eller nær 3-enden af strengen. På lignen- I

I de måde bliver den bagudrettede primer anneleret til antisense-strengen af I

I målsekvensen ved eller nær 3-enden af strengen. Den fremadrettede primer I

I 30 annelerer således ved eller nær det område af den dobbeltstrengede I

I nucleinsyre, som koder for den C-terminale ende af det variable område eller I

11 DK 175392 B1 domæne. På lignende måde annelerer den bagudrettede primer ved eller nær det område af den dobbeltstrengede nucleinsyre, som koder for den N-terminale ende af det variable domæne.

5 I trin (d) tilføjes nucleotider på 3'-enden af den fremadrettede og den bagudrettede primer i overensstemmelse med sekvensen af den streng, hvortil de anneleres. Primerforlængelse vil fortsætte på denne måde, indtil den standses ved påbegyndelse af denatureringstrinnet (e). Det må derfor sikres, at trin (d) udføres i en tilstrækkelig lang tidsperiode til at sikre, at primerne er 10 forlænget således, at de forlængede strenge fuldstændig overlapper hinan den.

I trin (e) separeres de forlængede primere fra den dobbeltstrengede nucleinsyre. Den dobbeltstrengede nucleinsyre kan derefter igen tjene som et sub-15 strat, hvortil yderligere primere kan anneleres. Endvidere har selve de forlængede primere de nødvendige komplementære se-kvenser, som sætter primerne i stand til at annelere dertil.

Under yderligere cykler vil mængden af forlængede primere, hvis trin (f) an-20 vendes, stige eksponentielt, således at der ved afslutningen af cyklerne vil være en stor mængde cDNA, som har sekvenser, der er komplementære til sense- og antisense-strengene af målsekvensen. Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse vil således resultere i akkumuleringen af en stor mængde cDNA, der kan danne dobbeltstrenget cDNA, som koder for i det 25 mindste en del af det variable domæne.

Som det vil være indlysende for en fagmand, kan nogle af trinnene ved fremgangsmåden udføres samtidigt eller sekventielt efter ønske.

30 De fremadrettede og bagudrettede primere kan tilvejebringes som isolerede oligonucleotider, i hvilket tilfælde der kun vil blive anvendt to oligonucleotider.

I DK 175392 B1

I 12 I

Alternativt kan de fremadrettede og bagudrettede primere imidlertid hver til- I

I vejebringes som en blanding af nært beslægtede oligonucleotider. Man kan I

I for eksempel finde, at der ved et bestemt punkt i sekvensen, hvortil primeren I

I skal annelere, er mulighed for nucleotidvariation. I dette tilfælde kan der an- I

I 5 vendes en primer for hver mulig nucleotidvariation. Endvidere er det muligt at I

I anvende to eller flere sæt af ’’sammenhobede" primere ved fremgangsmåden I

I for at forøge den specifikke kloning af gener, der koder for det variable områ- I

I de. I

.10 Den ovenfor beskrevne fremgangsmåde ligner fremgangsmåden beskrevet I

I af Saiki et al. (12)· En lignende metode er også anvendt ved de metoder, der I

I er beskrevet i EP-A-0.200.362. I begge tilfælde udføres den beskrevne me- I

tode med primere, der vides at annelere effektivt til den specificerede nucleo- I

tidsekvens. I ingen af disse omtaler blev det foreslået, at metoden kunne bli- I

I 15 ve anvendt til at klone sekvenser, som koder for lg-dele af det variable do- I

mæne, hvor målsekvensen indeholder områder, som iboende er meget vari- I

I able. I

I Den dobbeltstrengede nucleinsyresekvens, der anvendes ved fremgangs- I

I 20 måden ifølge den foreliggende opfindelse, kan være afledt fra mRNA. RNA I

kan for eksempel isoleres på kendt måde fra en celle eller cellelinie, som vi- I

des at producere Ig'er. mRNA kan adskilles fra andet RNA ved oligo-dT- I

kromatografi. En komplementær streng af cDNA kan derefter syntetiseres på I

I mRNA-skabelonen under anvendelse af revers transkriptase og en passende I

I 25 primer til frembringelse af en RNA/DNA-heteroduplex. En anden streng af I

I DNA kan fremstilles på én af adskillige måde, for eksempel ved at prime I

I mRNA-strengen (frembragt ved at inkubere RNA/DNA-heteroduplexen med I

I RNase H) med RNA-fragmenter og anvendes DNA-polymerase eller ved at I

I prime med en syntetisk oligodeoxynucleotidprimer, som annelerer til 3’- I

I 30 enden af den første streng og anvende DNA-polymerase. Det har vist sig, at I

13 DK 175392 B1 fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan udføres under anvendelse af dobbeltstrenget cDNA fremstillet på denne måde.

Når sådant dobbeltstrenget cDNA fremstilles, er det muligt at anvende en 5 fremadrettet primer, som annelerer til en sekvens i CH1-domænet {et variabelt domæne på en tung kæde) eller Ciambda- eller Ckappa-domænet (et variabelt domæne på en let kæde). Disse vil være lokaliseret tilstrækkeligt tæt på målsekvensen til at muliggøre, at sekvensen kan klones.

10 Den bagudrettede primer kan være én, som annelerer til en sekvens ved den N-terminale ende af VH1-, Vkappa* eller Viambda-domænet. Den bagudrettede primer kan bestå af en flerhed af primere med en række sekvenser udformet til at være komplementære til de forskellige familier af kendte VH1-, Vkappa-eller Viambda-sekvenser. Alternativt kan den bagudrettede primer være en en-15 kelt primer med en consensussekvens afledt fra alle familier af gener, der koder et variabelt område.

Det har overraskende vist sig, at fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan udføres med genomisk DNA. Hvis genomisk DNA anvendes, 20 er der en meget stor mængde DNA til stede, herunder faktisk kodende sekvenser, intraner og ikke-translaterede sekvenser mellem gener. Der er således et betragteligt spillerum for ikke-specifik annelering under de anvendte betingelser. Det har imidlertid overraskende vist sig, at der er meget lidt ikke-specifik annelering. Det er derfor uventet, at det har vist sig muligt at klone 25 generne for variable domæner af Ig fra genomisk DNA.

Under nogle omstændigheder kan anvendelsen af genomisk DNA vise sig at være fordelagtig sammenlignet med anvendelsen af mRNA, eftersom mRNA'et let nedbrydes og er specielt vanskeligt at fremstille ud fra kliniske 30 prøver af humant væv.

I DK 175392 B1

I 14 I

I Ifølge ét aspekt af den foreliggende opfindelse er den i trin (a) anvendte dob- I

I beltstrengede nucleinsyre således genomisk DNA. I

I Når genomisk DNA anvendes som den dobbeltstrengede nu-cleinsyrekilde, I

5 vil det som den fremadrettede primer ikke være muligt at anvende et oligo- I

I nucleotid med en sekvens komplementær til en sekvens i et konstant domæ- I

I ne. Dette skyldes, at i genomisk DNA er gener, der koder for konstante do- I

mæner, almindeligvis adskilt fra gener, der koder for det variable domæne, I

I med et betragteligt antal basepar. Anneleringsstedet ville således være for I

I 10 fjernt fra den sekvens, som skal klones. I

I Det skal bemærkes, at fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse I

I både kan anvendes til at klone omordnede og ikke-omordnede sekvenser for I

et variabelt domæne fra genomisk DNA. Det er kendt, at i genomisk DNA fra I

I 15 en kimlinie er de tre gener, som koder for VH, DH henholdsvis JH, adskilt fra I

I hinanden med et betragteligt antal basepar. Ved modning af immunsvaret I

I omordnes disse gener således, at VH-, DH- og JH-geneme fusioneres til til- I

I vejebringelse af det gen, som koder for hele det variable domæne (se figur I

I 1). Ved at anvende en fremadrettet primer, som er specifik for en sekvens I

I 20 ved eller i nærheden af 3-enden af sense-strengen af det genomiske "ikke- I

I omordnede" VH-gen, er det muligt at klone det "ikke-omordnede" VH-gen I

I alene uden også at klone DH- og JH-geneme. Dette kan være nyttigt ved, at I

I det vil være muligt at fusionere VH-genet på præ-klonede eller syntetiske I

I DH- og JH-gener. På denne måde kan omordning af gener for det variable I

I 25 domæne udføres in vitro. I

I De oligonucleotidprimere, der anvendes i trin (c), kan være specifikt udformet I

I til brug med en bestemt målsekvens. I dette tilfælde vil det være nødvendigt I

I at sekventere i det mindste 5’- og 3'-endeme af målsekvensen, således at de I

I 30 hensigtsmæssige oligonucleotider kan syntetiseres. Vi har imidlertid vist, at I

I det ikke er nødvendigt at anvende sådanne specifikt udformede primere. I I

15 DK 175392 B1 stedet for er det muligt at anvende en arts-specifik generel primer eller en blanding af sådanne primere til annelering til hver ende af målsekvensen.

Dette er ikke specielt overraskende hvad angår 3-enden af målsekvensen.

Det er kendt, at denne ende af sekvensen, der koder for det variable domæ-5 ne, går ind i et segment, der koder for JH, der vides at være forholdsvis konserveret. Det blev imidlertid overraskende fundet, at inden for en enkelt art er sekvensen ved 5-enden af målsekvensen tilstrækkeligt velkonserveret til at muliggøre udformning af en artsspecifik generel primer eller en blanding for 5'-enden af målsekvensen.

10

Ifølge et foretrukket aspekt af den foreliggende opfindelse er de to primere, der anvendes i trin (c) derfor artsspecifikke generelle primere, hvad enten de anvendes som enkelte primere eller blandinger af primere. Dette letter i høj grad kloningen af en hvilken som helst ubestemt målsekvens, eftersom man 15 herved undgår at udføre nogen som helst sekventering på målsekvensen for at frembringe målsekvensspecifikke primere. Ved fremgangsmåden ifølge dette aspekt af opfindelsen tilvejebringes således en generel fremgangsmåde til at klone sekvenser, som koder for et variabelt område eller domæne fra en bestemt art.

20 Når genet, der koder for det variable domæne, er blevet klonet under anvendelse af den ovenfor beskrevne metode, kan det direkte indføjes i en ekspressionsvektor, for eksempel under anvendelse af PCR-reaktionen til at indføje genet ind i en vektor.

25

Hver primer omfatter imidlertid fortrinsvis en sekvens, der indeholder et gen-kendelsessted for et restriktionsenzym. Den sekvens, som genkendes af restriktionsenzymet, behøver ikke at være i den del af primeren, som annelerer til den dobbeltstrengede nucleinsyre, men kan være til stede som en forlæn-30 gelse, der ikke annelerer. Anvendelsen af primere med restriktionssteder har den fordel, at DNA'et kan skæres med mindst ét restriktionsenzym, der efter- i I DK 175392 B1

I 16 I

I lader 3'- eller S'-fremspringende nucleotider. Sådant DNA klones lettere ind i I

I de tilsvarende steder på vektorerne end fragmenter med stumpe ender taget I

I direkte fra metoden. Det dobbeltstrengede cDNA, der frembringes ved af- I

I slutning af cyklerne, vil således let kunne indføjes i en kloningsvektor ved I

I 5 anvendelse af passende restriktionsenzymer. Valget af restriktionssteder er I

I fortrinsvis således, at det dobbeltstrengede cDNA klones direkte i en eks- I

I pressionsvektor, således at den ligand, som kodes af genet, udtrykkes. I det- I

I te tilfælde er restriktionsstedet fortrinsvis lokaliseret i den sekvens, som an- I

I neleres til den dobbeltstrengede nucleinsyre. I

I 10 I

I Eftersom primerne måske ikke har en sekvens, der er nøjagtigt komplemen- I

I tær til den målsekvens, hvortil den skal anneleres, for eksempel fordi der er I

I nucleotidvariationer eller fordi der er indført et genkendelsessted for et re- I

I striktionsenzym, kan det være nødvendigt at justere betingelserne i annele- I

I 15 ringsblandingen for at sætte primerne i stand til at annelere med den dob- I

I beltstrengede nucleinsyre. Dette kan uden problemer fore-tages af en fag- I

I mand og behøver ikke yderligere forklaring. I

I I trin (d) kan en hvilken som helst DNA-polymerase anvendes. Sådanne po- I

20 lymeraser er velkendte og kan fås kommercielt. De betingelser, som skal an- I

vendes sammen med hver polymerase, er velkendte og kræver ikke yderlige- I

I re forklaring her. Polymerasereaktionen skal udføres i nærværelse af de fire I

I nucleosidtriphosphater. Disse og polymeraseenzymet kan allerede være til I

stede i prøven og kan tilvejebringes frisk for hver cyklus. I

I 25 I

I Denatureringstrinnet (e) kan for eksempel udføres ved at opvarme prøven, I

ved at anvende chaotrope midler, såsom urinstof eller guanidin, eller ved at I

I anvende ændringer i ionstyrke eller pH-værdi. Denatureringen udføres for- I

I trinsvis ved opvarmning, eftersom denne er let reversibel. Når opvarmning I

I 30 anvendes til at udføre denatureringen, vil man sædvanligvis anvende en ter- I

17 DK 175392 B1 mostabil DNA-polymerase, såsom Taq-polymerase, eftersom denne ikke behøver supplering ved hver cyklus.

Hvis opvarmning anvendes til at styre metoden, omfatter en passende op-5 varmningscyklus denaturering ved ca. 95°C i 1 minut, annelering ved fra 30°C til 65°C i ca. 1 minut og primerforlængelse ved ca. 75°C i ca. 2 minutter. For at sikre at elongering og renaturering er fuldstændig, holdes blandingen efter den sidste cyklus fortrinsvis ved ca. 60°C i ca. 5 minutter.

10 Det dobbeltstrengede cDNA-produkt kan separeres fra blandingen ved for eksempel gelelektroforese under anvendelse af agarosegeler. Det dobbeltstrengede cDNA kan imidlertid om ønsket anvendes i urenset form og direkte indsættes i en passende kloningsvektor eller ekspressionsvektor ved traditionelle metoder. Det vil navnlig være let at udføre, hvis primerne omfatter gen-15 kendelsessekvenser for et restriktionsenzym.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes til at frembringe variationer i de sekvenser, som koder for de variable domæner.

Det kan for eksempel opnås ved at anvende en blanding af beslægtede oli-20 gonucleotidprimere som mindst én af primerne. Primerne varierer fortrinsvis specielt meget i midten af primeren og er forholdsvis konserveret ved 5’- og 3-endeme. Enderne af primerne er fortrinsvis komplementære til struktur-rammeområderne af det variable domæne, og det variable område i midten af primeren dækker det hele eller en del af en CDR. Der anvendes fortrinsvis 25 en fremadrettet primer i det område, som danner det tredje CDR. Hvis fremgangsmåden udføres med en sådan blanding af oligonucleotider, vil produktet være en blanding af sekvenser, som koder for variable domæner. Endvidere kan der indføres variationer i sekvensen ved at inkorporere nogle mutagene nucleosidtriphosphater i trin (d), således at punktmutationer er spredt 30 ud i målområdet. Alternativt indføres sådanne punktmutationer ved at udføre et stort antal amplifikationscykler, da fejl på grund af DNA-polymerasens na- I DK 175392 B1 18

I turlige fejlhyppighed multipliceres, navnlig når der anvendes høje koncentra- I

B tioner af nucleosidtriphosphater. I

I Fremgangsmåden ifølge dette aspekt af den foreliggende opfindelse har den I

5 fordel, at den i høj grad letter kloningen af sekvenser, der koder for et varia- I

belt domæne, direkte fra mRNA eller genomisk DNA. Dette vil igen lette I

B fremstillingen af modificerede molekyler af lg-typen ved en hvilken som helst I

B af de ovenfor omtalte kendte metoder. Endvidere kan målgener klones fra I

B vævsprøver indeholdende antistofproducerende celler, og gener kan sekven- I

B 10 teres. Ved at gøre dette vil det være muligt at se direkte på en patients im- I

B munrepertoire. Dette “fingeraftryk" af en patients immunrepertoire vil kunne I

B . anvendes ved diagnosticering, for eksempel af autoimmune sygdomme. I

B I trin (a) er det dobbeltstrengede cDNA afledt fra mRNA. For variable domæ- I

B 15 ner, som er afledt fra Ig, isoleres mRNA’et fortrinsvis fra lymfocytter, som er I

B blevet stimuleret for at forøge produktionen af mRNA. I

B I hvert trin (c) er sættet af primere fortrinsvis forskelligt fra det tidligere trin (c), I

B således at specificificiteten af kopieringen forøges. Sættene af primere dan- I

B 20 ner således et sammenhobet sæt. Til kloning af variable domæner fra den I

B tunge kæde af Ig kan det første sæt af primere for eksempel være lokaliseret I

B i signalsekvensen og det konstante område som beskrevet af Larrick et al. I

B (18), og det andet sæt af primere kan være helt lokaliseret i det variable om- I

B råde som beskrevet af Orlandi et al. (19). Primerne i trin (c) indeholder for- I

B 25 trinsvis restriktionssteder for at lette efterfølgende kloning. I den sidste cyklus I

B bør det sæt af primere, som anvendes i trin (c), fortrinsvis indeholde restrikti- I

B onssteder til indføring i ekspressionsvektorer. I trin (g) korrigeres mulige fejl- I

B parringer mellem primerne og skabelonstrengene ved "nick-translation". I trin I

B (h) spaltes det dobbeltstrengede cDNA fortrinsvis med restriktionsenzymer I

30 ved steder indført i primerne for at lette kloningen. I

19 DK 175392 B1

Ifølge et andet aspekt af den foreliggende opfindelse klones det dobbeltstrengede cDNA-produkt direkte i en ekspressionsvektor. Værten kan være prokaryot eller eukaryot, men er fortrinsvis bakteriel. Fortrinsvis vil valget af restriktionssteder i primerne og i vektoren samt andre træk for vektoren tilla-5 de ekspressionen af komplette ligander, medens alle de træk ved aminosy-resekvensen, som er typiske for (de ved metoden fremstillede) ligander, bevares. Til ekspression af de omordnede variable gener ville primerne for eksempel blive valgt til at tillade kloningen af målsekvenser omfattende mindst alle tre CDR-sekvenser. Kloni.ngsvektoren ville så kode for en signalsekvens 10 (for secernering af liganden) og sekvenser, der koder for den N-terminale ende af det første strukturrammeområde, restriktionssteder for kloning og derefter den C-terminale ende af det sidste (fjerde) strukturrammeområde.

Til ekspression af ikke-omordnede VH-gener som en del af komplette ligan-15 der ville primerne blive udvalgt til at tillade kloningen af målsekvenser omfattende mindst de to første CDR’er. Kloningsvektoren kunne derefter kode for signalsekvensen, den N-terminale ende af det første strukturrammeområde, restriktionssteder for kloning og derefter den C-terminale ende af det tredje strukturrammeområde, det tredje CDR og det fjerde strukturrammeområde.

20

Primere og kloningsvektorer kan ligeledes udformes til ekspression af enkelt-CDR'er, navnlig det tredje CDR, som dele af komplette ligander. Fordelen ved kloningsrepertoirer af enkelt-CDR'er ville muliggøre udformningen af et "universelt" sæt af strukturrammeområder, som inkorporerer ønskelige egen-25 skaber, såsom opløselighed.

Enkelt-ligander kunne udtrykkes alene eller i kombination med et komplementært variabelt domæne. For eksempel kan et variabelt domæne fra en tung kæde udtrykkes som enten et individuelt domæne eller, hvis det udtryk-30 kes med et komplementært variabelt domæne af en let kæde, som et antigenbindingssted. De to partnere ville fortrinsvis blive udtrykt i den samme I DK 175392 B1

I 20 I

I celle eller secerneret fra den samme celle, og proteinerne ville få lov til at I

I associere ikke-covalent til dannelse af et Fv-fragment. De to gener, der koder I

for de komplementære partnere, kan således anbringes i tandem og udtryk- I

I kes fra en enkelt vektor, hvor vektoren inkluderer to sæt af restriktionssteder. I

I 5 I

I Generne indføres fortrinsvis sekventielt: for eksempel kan det variable do- I

I mæne fra den tunge kæde klones først og derefter det variable domæne fra I

den lette kæde. Alternativt indføres de to gener i vektoren i et enkelt trin, for I

I eksempel ved at anvende polymerasekædereaktionen til at sammenklistre I

I 10 hvert gen med en hvilken som helst nødvendig intervenerende sekvens, stort I

I set som beskrevet af Yon og Fried (29). De to partnere kan også udtrykkes I

I som et koblet protein til frembringelse af et enkelt-kæde-Fv-fragment under I

I anvendelse af lignende vektorer som ovenfor beskrevet. Som et yderligere I

I alternativ kan de to gener anbringes i to forskellige vektorer, for eksempel I

I 15 hvor én vektor er en fagvektor og den anden er en plasmidvektor. I

I Endvidere kan det klonede dobbeltstrengede cDNA indføjes i en ekspressi- I

I onsvektor, som allerede indeholder sekvenser, der koder for ét eller flere I

konstante domæner for at muliggøre, at vektoren kan udtrykke kæder af Ig- I

I 20 typen. Ekspressionen af Fab-fragmenter ville for eksempel have den fordel i I

I forhold til Fv-fragmenter, at den tunge og den lette kæde ville have tendens I

I til at associere gennem de konstante domæner ud over de to variable do- I

I mæner. Det endelige ekspressionsprodukt kan være hvilke som helst mole- I

I kyler af de ovenfor omtalte modificerede Ig-typer. I

I 25 I

I Den klonede sekvens kan også indføjes i en ekspressionsvektor, således at I

I den kan blive udtrykt som et fusionsprotein. Den sekvens, som koder for det I

I variable domæne, kan kobles direkte eller via en linkersekvens til en DNA- I

sekvens, der koder for et hvilket som helst proteineffektormolekyle, såsom et I

I 30 toxin, enzym, en mærkning eller en anden ligand. De variable domænese- I

I kvenser kan også kobles til proteiner på ydersiden af bakterier eller fager. I

21 DK 175392 B1

Fremgangsmåden ifølge dette aspekt af opfindelsen kan således anvendes til at fremstille receptorer ifølge opfindelsen.

Ifølge et andet aspekt af opfindelsen muliggør kloningen af dobbeltstrenget 5 cDNA direkte til ekspression en hurtig konstruktion af ekspressionsbiblioteker, som kan screened for bindingsaktiviteter. For gener, der koder de variable domæner af den tunge og den lette kæde af Ig, kan det dobbeltstrengede cDNA omfatte variable gener isoleret som komplette omordnede gener fra dyret eller som variable gener bygget op fra adskillige forskellige kilder, for 10 eksempel et repertoire af ikke-omordnede VH-gener kombineret med et syntetisk repertoire af DH- og JH-gener. Fortrinsvis frembringes repertoirer af gener, der koder for de variable domæner i den tunge kæde af Ig, ud fra lymfocytter fra dyr immuniseret med et antigen.

15 Screeningsmetoden kan være udformet på en række kendte måder. For ek- » sempel kan variable domæner af den tunge kæde af Ig secerneret fra bakterier screenes ved binding til antigen på en fast fase, og de indfangede domæner kan påvises med antistoffer. Domænerne kan således screenes ved at dyrke bakterierne i flydende kultur og ved at bindes til antigen lagt på over-20 fladen af ELISA-plader. Fortrinsvis screenes bakterielle kolonier (eller fagpla-ques), der secernerer ligander (eller modificerede ligander eller ligandfusioner med proteiner), for antigenbinding på membraner. Enten bindes ligander direkte på membranerne (og påvises for eksempel med mærket antigen), eller de indfanges på antigenbelagte membraner (og påvises med reagenser, 25 der er specifikke for ligander). Anvendelsen af membraner er meget bekvem ved screening af mange kloner, og sådanne metoder er velkendte.

Screeningsmetoden kan også lettes meget ved at fremstille proteinfusioner med liganderne, for eksempel ved at indføre en peptidmærkning, som gen-30 kendes at et antistof, ved den N-terminale eller C-terminale ende af liganden, eller ved at sammenføje liganden med et enzym, som katalyserer omdannel-

I DK 175392 B1 I

I 22 I

I sen af et farveløst substrat til et farvet produkt. I sidstnævnte tilfælde kan I

I bindingen af antigen påvises ved simpelthen at tilsætte substrat. For ligan- I

I der, der udtrykkes og foldes korrekt inden i eukaryote celler, kunne sammen- I

I fejningen af liganden og et domæne af en transkriptionel aktivator, såsom I

I 5 GAL4-proteinet fra gær, og sammenføjning af antigenet til det andet domæne I

I af GAL4-proteinet, danne basis for screening af bindingsaktiviteter, hvilket er I

I beskrevet af Fields og Song (21). I

I Fremstillingen af proteiner eller endog celler med multiple kopier af ligander- I

I 10 ne kan forbedre ligandens avididitet for immobiliseret antigen og dermed føl- I

I somheden af screeningsmetoden. Liganden kan for eksempel sammenføjes I

I med en protein-subunit af et multimert protein, med et fagkappeprotein eller I

I et ydre membranprotein fra E. coli, såsom ompA eller lamB. Sådanne fusio- I

I ner til fagproteiner eller bakterielle proteiner giver også muligheder for at se- I

I 15 lektere bakterier, der fremviser ligander med antigenbindingsaktiviteter. Så- I

I danne bakterier kan for eksempel præcipiteres med antigen bundet til et fast I

I bæremateriale eller kan udsættes for affinitetskromatografi eller kan bindes til I

I større celler eller partikler, som er belagt med antigen, og kan sorteres med I

I en fluorescensaktiveret cellesorteringsapparat (FACS). Proteinerne eller pep- I

I 20 tider fusioneret til liganderne kodes fortrinsvis af vektoren, således at klonin- I

I gen af det dobbeltstrengede cDNA-repertoire frembringer fusionsproduktet. I

I Ud over screening for bindingsaktiviteter af enkelte ligander kan det være I

I nødvendigt at screene for bindingsaktivitet eller katalytisk aktivitet hos tilknyt- I

I 25 tede ligander, for eksempel de tilknyttede variable domæner fra den tunge og I

I lette kæde af Ig. For eksempel kan repertoirer af gener, der koder for det va- I

I riable område af den tunge og lette kæde, klones, således at de to domæner I

I kan udtrykkes sammen. Kun nogle af parrene af domæner knyttes sammen, I

I og kun nogle af disse sammenknyttede par kan bindes til antigen. Repertoi- I

I 30 rerne med variable domæner fra den tunge og lette kæde kan klones såle- I

I des, at hvert domæne parres tilfældigt. Denne fremgangsmåde er mest egnet I

23 DK 175392 B1 til isolering af sammenknyttede domæner, i hvilke tilstedeværelsen af begge partnere er nødvendig til frembringelse af et kløft. Alternativt til at tillade binding af hapten. Eftersom repertoirerne af sekvenser for let kæde er mindre forskelligartede end for. tunge kæder, kan et lille repertoire af variable domæ-5 ner fra let kæde, for eksempel inkluderende repræsentative medlemmer af hver familie af domæner, alternativt kombineres med et stort repertoire af variable domæner fra tung kæde.

Et repertoire af variable domæner fra tung kæde screenes imidlertid fortrins-10 vis først fra antigenbinding i fravær af den lette kædepartner, og derefter kombineres kun de variable domæner af den tunge kæde, som bindes til antigen, med repertoiret af variable domæner fra let kæde. Binding mellem sammenknyttede variable domæner fra tung kæde og let kæde kan let skelnes fra binding mellem enkelte domæner, ved for eksempel at fusionere 15 hvert domæne til en forskellig C-terminal peptidmærkning, som specifikt genkendes af forskellige monoklonale antistoffer.

Den hierakiske fremgangsmåde med først at klone variable domæner med bindingsaktiviteter fra den tunge kæde, derefter klone variable domæner fra 20 den lette kæde, som matcher, kan være specielt hensigtsmæssig til konstruktion af katalytiske antistoffer, da den tunge kæde kan screenes først for substratbinding. Et variabelt domæne fra den lette kæde ville derefter kunne identificeres som værende i stand til at associere den tunge kæde, og "katalytiske" aminosyrerester, såsom cystein eller histidin (eller prostetiske grup-25 per), ville blive indført i CDR'eme for at stabilisere overgangstilstanden eller ville angribe substratet, hvilket er beskrevet af Baldwin og Schultz (22).

Omend bindingsaktiviteteme af ikke-covalent sammenknyttede variable domæner fra den tunge kæde og den lette kæde (Fv-fragmenter) kan screenes, 30 kan passende fusionsproteiner drive associeringen af de variable domæne-partnere. Fab-fragmenter sammenknyttes således mere sandsynligt end Fv- I DK 175392 B1

I 24 I

I fragmenterne, når det variable domæne fra den tunge kæde fæstnes til et I

enkelt konstant domæne fra den tunge kæde, og det variable domæne fra I

I den lette kæde fæstnes til et enkelt variabelt domæne fra den lette kæde, og I

I de to konstante domæner sammenknyttes. I

I 5 i

De variable domæner fra den tunge kæde og den lette kæde bindes altema- I

I tivt covalent sammen med et peptid som i enkelt-kæde-antistoffeme, eller I

I peptidsekvenser, fortrinsvis ved den C-terminale ende, vil knyttes sammen I

gennem dannelse af cysteinbindinger eller gennem ikke-covalente veksel- I

I 10 virkninger, såsom indføringen af "leucin-lynlås"-temaer. For at isolere par af I

tæt sammenknyttede variable domæner anvendes imidlertid fortrinsvis Fv- I

I fragmenterne. I

Konstruktionen af Fv-fragmenter isoleret fra et repertoire af gener, der koder I

15 for et variabelt område, giver en mulighed for at bygge komplette antistoffer, I

I og giver et alternativ til hybridomteknologien. Ved for eksempel at fæstne de I

variable domæner til konstante domæner fra en let kæde eller en passende I

I tung kæde, som det er hensigtsmæssigt, og udtrykke de samlede gener i I

I pattedyrceller kan komplette antistoffer fremstilles, og de skulle have naturli- I

I 20 ge effektorfunktioner, såsom komplementlysering. Denne vej er navnlig at- I

I traktiv til konstruktion af humane monoklonale antistoffer, da hybridomtekno- I

logien har vist sig vanskelig, og skønt lymfocytter fra humant perifert blod kan I

udødeliggøres med Epstein Barr-virus, har sådanne hybridomer tendens til at I

secernere IgM-antistoffer med lav affinitet. I

I 25 I

I Det er endvidere kendt, at immunologiske mekanismer sikrer, at lymfocytter I

I ikke almindeligvis secernerer antistoffer, som er rettet mod værtsproteiner. I

I Det er imidlertid ønskeligt at fremstille humane antistoffer rettet mod humane I

I proteiner, for eksempel mod humane celleoverflademarkører til behandling af I

I 30 kræft, eller mod histokompatibilitetsantigener til behandling af autoimmune I

I sygdomme. Konstruktionen af humane antistoffer bygget ud fra kombinati- I

25 DK 175392 B1 onsrepertoiret af variable domæner fra tung kæde og let kæde kan overvinde dette problem, eftersom det er muligt at fremstille humane antistoffer med specificiteter, som normalt ville være blevet elimineret.

5 Fremgangsmåden giver også en ny måde til fremstilling af bispecifikke antistoffer. Antistoffer med dobbelt specificitet kan fremstilles ved at fusionere to hybridomer med forskellige specificiteter til fremstilling af et hybridantistof med en Fab-arm med én specificitet, og hvor den anden Fab-arm har en anden specificitet. Men udbyttet af det bispecifikke antistof er lavt, da de tunge 10 og lette kæder også finder de forkerte partnere. Konstruktionen af Fv-fragmenter, som er tæt knyttet sammen, burde fortrinsvis drive sammenknytningen af de korrekte par af tunge og lette kæder. (Det ville ikke hjælpe med til den korrekte parring af to tunge kæder med hinanden). Den forbedrede produktion af bispecifikke antistoffer vil give en række anvendelser inden for 15 diagnosticering og terapi, hvilket er velkendt.

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes således en artsspecifik generel olionucleotidprimer eller en blanding af sådanne prirriere, der kan anvendes til kloning af sekvenser, der koder for et variabelt domæne, fra dyr af 20 denne art. Fremgangsmåden gør det muligt, at et enkelt par eller par af blandinger af artsspecifikke generelle primere kan anvendes til at klone en hvilken som helst ønsket antistofspecificitet fra denne art. Dette eliminerer behovet for at udføre nogen som helst sekventering af målsekvensen, som skal klones, samt behovet for at udforme specifikke primere for hver specificitet, 25 der skal genfindes.

Opfindelsen muliggør endvidere konstruktionen af repertoirer af variable gener, direkte ekspression af de variable gener ved kloning, screening af de kodede domæner for bindingsaktiviteter og for samling af domænerne med 30 andre variable domæner afledt fra repertoiret.

I DK 175392 B1

I 26 I

I Anvendelsen af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse vil såle- I

I des muliggøre produktionen af variable domæner af tung kæde med bin- I

I dingsaktiviteter samt varianter af disse domæner. Den muliggør produktionen I

af monoklonale antistoffer og bispecifikke antistoffer og vil tilvejebringe et I

5 alternativ til hybridomteknologien. For eksempel kan dobbeltstrenget mRNA I

I eller genomisk DNA fra mus opnås fra en hyperimmuniseret mus. Dette kun- I

I ne klones ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, og deref- I

I ter kunne det klonede dobbeltstrengede DNA indsættes i en passende eks- I

I pressionsvektor. Ekspressionsvektoren ville kunne anvendes til at transfer- I

I 10 mere en værtscelle, for eksempel en bakteriecelle, for at sætte den i stand til I

at producere et Fv-fragment eller et Fab-fragment. Fv-eller Fab-fragmentet I

I ville derefter kunne indbygges i et monoklonalt antistof ved sammenknytning I

I af konstante domæner og udtrykke det i pattedyrceller. I

I 15 Den foreliggende opfindelse beskrives nu ved eksempler under henvisning til I

I den tilhørende tegning, hvor: I

I Figur 1 viser en skematisk gengivelse af de ikke-omordnede og omordnede I

I gener, der koder for variable domæner af tung kæde og let kæde samt lokali- I

I 20 seringen af primerne. I

I Figur 2 viser en skematisk gengivelse af M13-VHPCR1 -vektoren og et klo- I

I ningsskema til amplifikation af variable domæner af tung kæde. I

25 Figur 3 viser sekvenser afledt af det variable område af Ig i M13-VHPCR1. I

Figur 4 viser en skematisk gengivelse af M13-VKPCR1-vektoren og et klo- I

ningsskema for variable domæner af let kæde. I

30 Figur 5 viser sekvenser afledt fra det variable område af Ig i M13-VKPCR1. I

27 DK 175392 B1

Figur 6 viser nucleotidsekvenseme af de sekvenser, der koder for det variable domæne af tung kæde og let kæde fra MAb MBr1.

Figur 7 viser en skematisk gengivelse af pSV-gpt-vektoren (også kendt som 5 a-Lys 30), der indeholder et variabelt område klonet som et Hindlll-BamHI-fragment, der udskæres ved indføjelse af det nye variable område. Genet for human lgG1 er også blevet manipuleret til fjernelse af et genkendelsessted for BamHI, således at genkendelsesstedet for BamHI i vektoren er unikt.

10 Figur 8 viser en skematisk gengivelse af pSV-hygrovektoren (også kendt som a-Lys 17). Den er afledt fra pSV gpt-vektoren, idet det gen, der koder for mycophenolsyre er blevet erstattet med et gen, der koder for hygromycinre-sistens. Konstruktionen indeholder et variabelt gen klonet som et HindiII-BamHI-fragment, som udskæres ved indføjelse af det nye variable område.

15 Genet for human Ckappa er også blevet manipuleret til fjernelse af et BamHI-sted, således at BamHI-stedet i vektoren er unikt.

Figur 9 viser samlingen af det kimære antistof mellem mus og human MBr1.

20 Figur 10 viser kodede aminosyresekvenser af 48 oitiordnede muse VH-gener.

Figur 11 viser kodede aminosyresekvenser af omordnede humane VH-gener.

25 Figur 12 viser kodede aminosyresekvenser af ikke-omordnede humane VH-gener.

Figur 13 viser sekvensen af en del af plasmidet pSW1: i det væsentlige sekvensen af en pectatlyaseleder koblet til VHLYS i pSW1 og klonet som et 30 Sphl-EcoRI-fragment i pUC19 samt translationen af den åbne læseramme, der koder for pectatlyaseleder-VHLYS-polypeptidet.

I DK 175392 B1

I 28 I

Figur 14 viser sekvensen af en del af plasmidet pSW2: i det væsentlige se- I

kvensen af en pectatlyaseleder koblet til VHLYS og til VKLYS og klonet som I

et Sphl-EcoRI-EcoRI-fragment i pUC19 samt translationen af de åbne læse- I

5 rammer, der koder for pectatlyaseleder-VHLYS-polypeptidet og pectatlyase- I

I leder-VKLYS-polypeptidet. I

I Figur 15 viser sekvensen af en del af plasmidet pSW1 HPOLYMYC, som er I

baseret på pSW1, og i hvilket en polylinkersekvens har erstattet det variable I

I 10 område af VHLYS og fungerer som et kloningssted til amplifikation af VH- I

I gener, og en peptidmærkning er indført ved den C-terminale ende. I

H Figur 16 viser de kodede aminosyresekvenser af to VH-domæner afledt fra I

musemilt og med lysozymbindingsaktivitet og sammenlignet med VH- I

15 domænet fra D1,3-anti-stoffet. Pilene markerer punkter med forskelle mellem I

I de to VH-domæner. I

Figur 17 viser den kodede aminosyresekvens af et VH-domæne afledt fra I

lymfocytter i humant perifert blod og med lysozymbindingsaktivitet. I

I 20 I

I Figur 18 viser et skema til frembringelse og kloning af mutanter af VHLYS- I

I genet, hvilket sammenlignes med skemaet for kloning af naturlige repertoirer I

I af VH-gener. I

25 Figur 19 viser sekvensen af en del af vektoren pSW2HPOLY. I

I Figur 20 viser sekvensen af en del af vektoren pSW3, som koder for to kob- I

I lede VHLYS-domæner. I

I 30 Figur 21 viser sekvensen af VHLYS-domænet og pelB-ledersekvensen fusi- I

I oneret til genet for alkalisk phosphatase. I

29 DK 175392 B1

Figur 22 viser sekvensen af vektoren pSWIVHLYSVKPOLYMYC til ekspression af et repertoire af variable domæner fra Vkappa let kæde sammenknyttet med VHLYS-domænet.

5

Figur 23 viser sekvensen af VH-domænet, som secerneres i høje niveauer fra E. coli. Forskellene i forhold til VHLYS-domænet er markeret.

Primere 10 I de nedenfor beskrevne eksempler blev følgende oligonucleotidprimere eller blandede primere anvendt. Deres lokaliseringer er markeret på figur 1, og sekvenserne er følgende:

I DK 175392 B1 I

I 30 I

I VH1FOR 5’ TGAG'GAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG 31; I

I VH1FOR-2 5' TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC 3’; I

I HulVHFOR 5’ CTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACC 3'; - I

I Hu2VHFOR 51 CTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACC 3'; I

I HU3VHFOR 5' CTTGGTGGATGCTGAGGAGACGGTGACC 3'; I

I HU4VHFOR 5' CTTGGTGGATGCTGATGAGACGGTGACC 3'; I

I MOJH1FOR 5' TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTGCGCCCCAG 3'; I

I MOJH2FOR 5' TGAGGAGACGGTGACCGTGGTGCCTTGGCCCCAG 3'; I

I MOJH3FOR 5' TGCAGAGACGGTGACCAGAGTCCCTTGGCCCCAG 3'; I

I MOJH4FOR 5' TGAGGAGACGGTGACCGAGGTTCCTTGACCCCAG 3'; I

I HUJH1FOR 5' TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCCCTGGCCCCAG 3'; I

I HUJH2FOR 5' TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCCACGGCCCCAG 3'; I

I HUJH4FOR 5' TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCTTGGCCCCAG 3'; I

I VK1FOR 5' GTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC 3'; I

I VK2FOR 5' CGTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC 3'; I

I VK3FOR 5' CCGTTTCAGCTCGAGCTTGGTCCC 3'; I

I MOJK1FOR 5 ’ CGTTAGATCTCCAGCTTGGTGCC 3'; I

I MOJK3FOR 5' GGTTAGATCTCCAGTCTGGTCCC 3'; I

I MOJK4FOR 5' CGTTAGATCTCCAACTTTGTCCC 3'; I

I HUJK1FOR 5' CGTTAGATCTCCACCTTGGTCCC 3'; I

I HUJK3FOR 5' CGTTAGATCTCCACTTTGGTCCC 3'; I

I HUJK4FOR 5' CGTTAGATCTCCACCTTGGTCCC 3’; I

I HUJK5FOR 5' CGTTAGATCTCCAGTCGTGTCCC 3'; I

VHIBACK 5' AGGT(C/G)(C/A)A(G/A)CTGCAG{G/C)AGTC(T/A)GG 3' I

31 DK 175392 B1

Hu2VHIBACK: 5’ CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGG 3 * ;

HuVHIIBACK: 5' CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG 3';

Hu2VHIIIBACK: 5’ GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG 3';

HuVHIVBACK: 5' CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGG 3'; MOVHIBACK 5' AGGTGCAGCTGCAGGAGTCAG 3'; MOVHIIABACK 5' AGGTCCAGCTGCAGCA(G/A)TCTGG 3'; MOVHIIBBACK 5’ AGGTCCAACTGCAGCAGCCTGG 3'; MOVHIIBACK 5' AGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGG 3'; VK1BACK 5' GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA 3'; VK2BACK ·. 5' GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA 3'; MOVKIIABACK 5’ GATGTTCAGCTGACCCAAACTCCA 3' HOVKIIBBACK 5’ GATATTCAGCTGACCCAGGATGAA 3’;

HuHeplFOR 5' C(A/G)(C/G)TGAGCTCACTGTGTCTCTCGCACA 3';

HuOctalBACK 5' CGTGAATATGCAAATAA 3';

HuOcta2BACK 5' AGTAGGAGÅCATGCAAAT 3' og:

HuOcta3BACK 5' CACCACCCACATGCAAAT 3‘;

VHMUTl 51 GGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAGTAGTCAAG

NNNNNNNHNNHNCTCTCTGGC 3 ' ( hvor N er en ækviniolær blanding af j. C, G og A)

Hl3 pRIKER 5' AACAGCTATGACCATG 3' (Nev England Biolabs * 12 Oi) I DK 175392 B1 I 32 I EKSEMPEL 1

I Kloning af omordnede musegener, der koder for et variablelt område, fra hy- I

I bridomer, samling af gener, der koder for kimæriske antistoffer og ekspressi- I

5 on af antistoffer fra myelomceller

I VH1FOR er udformet til at annelere med 3'-enden af sense-strengen fra en I

hvilken som helst sekvens, der koder for det variable domæne af tung kæde I

I fra mus. Den indeholder et genkendelsessted for BstEII. VK1FOR er udfor- I

I 10 met til at annelere med 3’-enden af sense-strengen fra en hvilken som helst I

I sekvens, der koder for det variable domæne af let kæde af kappa-typen fra I

I mus, og som indeholder et genkendelsessted for Bglll. VH1BACK er udfor- I

met til at annelere med 3’-enden af anti-sense-strengen af en hvilken som I

I helst sekvens, der koder for det variable domæne af tung kæde fra mus, og 15 som indeholder et genkendelsessted for Pstl. VH1BACK er udformet til at

I annelere med 3’-enden af anti-sense-strengen af en hvilken som helst se- I

I kvens, der koder for det variable domæne af let kæde fra kappa-typen fra I

I mus, og som indeholder et genkendelsessted for Pvull. I

20 I dette eksempel blev fem musehybridomer anvendt som en kilde for dob- I

I beltstrenget nucleinsyre. Hybridomeme producerede monoklonale antistoffer I

I (MAb’er) betegnet MBr1(23), BW431/26 (24), BW494/32 (25), BW250/184 I (24, 26) og BW704/152 (27). MAb MBr1 er navnlig interessant, da det vides

I at være specifikt for en saccharidepitop på en human brystcarcinomlinie I

I 25 MCF-7 (28).

I Kloning via mRNA

I Hver af de fem ovenfor omtalte hybridomer blev dyrket i rulleflasker, og ca. 5 I 30 x 10® celler af hver hybridom blev anvendt til at isolere RNA. mRNA blev se- pareret fra det isolerede RNA under anvendelse af oligodT-cellulose (29).

33 DK 175392 B1

Den første streng af cDNA blev syntetiseret ifølge fremgangsmåden beskrevet af Maniatis et al. (30) som anført nedenfor.

For at klone den sekvens, der koder for det variable område af den tunge 5 kæde, blev 50 μΙ reaktionsopløsning, som indeholdt 10 pg mRNA, 20 pmol VH1 FOR-primer, 250 pM af hver af dATP, dTTP, dCTP og dGTP, 10 mM di-thiothreitol (DTT), 100 mM Tris-HCI, 10 mM MgC^ og 140 mM KCI indstillet til pH 8,3, fremstillet. Reaktionsopløsningen blev opvarmet ved 70°C i 10 minutter og fik derefter lov til at afkøle for at annelere primeren til 3'-enden af den 10 sekvens, som koder for det variable område i mRNA'et. Til reaktionsblandingen tilsattes derefter 46 enheder revers transkriptase (Angli-an Biotec), og opløsningen blev derefter inkuberet ved 42°C i 1 time til syntese af den første streng af cDNA.

15 For at klone den sekvens, som koder for det variable område af den lette kæde, blev der anvendt den samme procedure som ovenfor med undtagelse af, at VK1 FOR-primeren blev anvendt i stedet for VH1 FOR-primeren.

Amplifikation fra RNA/DNA-hybrid 20 Når de dobbeltstrengede RNA/DNA-hybrider var blevet produceret, blev de sekvenser, der koder for det variable domæne, opformeret på følgende måde. Ti! amplifikation af sekvenser, der koder for det variable domæne af tung kæde, blev der fremstillet en 50 pi reaktionsopløsning indeholdende 5 pi af 25 opløsningen indeholdende den dobbeltstrengede RNA/DNA-hybrid, 25 pmol af hver af VH1 FOR-og VHIBACK-primere, 250 pM af dATP, dTTP, dCTP og dGTP, 67 mM Tris-HCI, 17 mM ammoniumsulfat, 10 mM MgCl2, 200 pg/ml gelatine og 2 enheder Taq-polymerase (Cetus). Oven på reaktionsopløsningen blev der lagt paraffinolie, og opløsningen blev udsat for 25 omgange 30 med temperaturcykler under anvendelse af en programmerbar Techne PHC- 1-opvarmningsblok. Hver cyklus bestod af 1 minut og 95°C (for at denaturere

I DK 175392 B1 I

I 34 I

I nu-cleinsyrerne), 1 minut ved 30°C (for at annelere primerne til nucleinsyrer- I

I ne) og 2 minutter ved 72°C (for at frembringe elongering fra primerne). Efter I

I de 25 cykler blev reaktionsopløsningen og olien ekstraheret to gange med I

ether, én gang med phenol og én gang med phenol/CHCh. Derefter blev det I

I 5 dobbeltstrengede cDNA præcipiteret med ethanol. Det præcipiterede dob- I

I beltstrengede cDNA blev derefter taget op i 50 μΙ vand og blev frosset. I

I Proceduren for amplifikation af let kæde var nøjagtig som ovenfor beskrevet I

I med undtagelse af, at VK1 FOR- og VK1 BACK-primerne blev anvendt i stedet I

I 10 for VH1 FOR-henholdsvis VH1 BACK-primerne. I

I 5 μΙ af hver prøve af opformeret cDNA blev fraktioneret på 2% agarosegeler I

ved elektroforese og blev farvet med ethidiumbromid. Dette viste, at det op- I

I formerede dobbeltstrengede cDNA gav et hovedbånd med den forventede I

I 15 størrelse (ca. 330 bp). (Men båndet for VK-DNA fra MBr1 var meget svagt. I

I Det blev derfor udskåret fra gelen og igen opformeret i en anden runde). Ved I

denne enkle procedure blev der således frembragt rimelige mængder af I

I dobbeltstrenget DNA, der koder for de variable domæner af let kæde og tung I

I kæde fra de fem MAb'er. I

I 20 I

I Konstruktion af vektor med tung kæde I

I Et genkendelsessted for BstEII blev indført i vektoren M13-HuVHNP (31) ved I

I stedstyret mutagenisering (32, 33) til frembringelse af vektoren M13- I

I 25 VHPCR1 (figurerne 2 og 3). I

Hver opformeret sekvens, som koder for det variable domæne på den tunge I

I kæde, blev fordøjet med restriktionsenzymerne Pstl og BstEII. Fragmenterne I

blev phenolekstraheret, blev oprenset på geler med 2% lavtsmeltende aga- I

30 rose og blev tvangsklonet i vektor M13-VHPCR1, som var blevet fordøjet I

I med Pstl og BstEII, og blev oprenset på en 0,8% agarosegel. Kloner inde- I

35 DK 175392 B1 holdende indføjelserne med det variable domæne blev identificeret direkte ved sekventering (34) under anvendelse af primere baseret på 3-enden af genet, som ikke koder for det variable domæne, i M13-VHPCR1 -vektoren.

5 Der er et internt genkendelsessted for Pstl i de sekvenser, der koder for det variable domæne på den tunge kæde, i BW431/26. Denne sekvens, der koder for det variable domæne, blev derfor samlet i to trin. 3-Pstl-BstEII-fragmentet blev først klonet i M13-VHPCR1, efterfulgt i et andet trin af 5-Pstl-fragmentet.

10

Vektorkonstruktion med let kæde

Vektor M13mp18 (35) blev skåret med Pvull, og vektorgrundskellettet blev stumpligeret til en syntetisk Hindlll-BamHI-polylinker. Vektor M13-HuVKLYS 15 (36) blev fordøjet med Hindlll og BamHI til isolering af HuVKLYS-genet. Det te Hindlll-BamHI-fragment blev derefter indsat i Hindll-BamHI-polylinkerstedet til frembringelse af en vektor M13-VKPCR1, som mangler alle Pvull-steder i vektorgrundskellettet (figurerne 4 og 5). Denne vektor blev fremstillet i E. coli JM110 (22) for at undgå dam-methylering ved Bcll-stedet.

20

Hver opformeret sekvens, som koder for det variable domæne på let kæde, blev fordøjet med Pvull og Bglll. Fragmenterne blev phenolekstraheret, blev oprenset på geler med 2% lavtsmeltende agarose og blev tvangsklonet i vektor M13-VKPCR1, som var blevet fordøjet med Pvull og Bell, blev oprenset 25 på 0,8% agarosegel og blev behandlet med kalvetarmphosphatase. Kloner indeholdende indføjelser, der koder for det variable område på let kæde, blev identificeret direkte ved sekventering (34) under anvendelse af primere baseret på det ikke-kodende 3'-område af det variable domæne i M13-VKPCR1-vektoren.

I DK 175392 B1

I 36 I

I Nucleotidsekvenseme for de variable domæner af den tunge og lette kæde I

I af MBr1 er vist i figur 6 sammen med dele af de flankerende områder af M13- I

I VHPCR1-og M13-VKPCR1-vektorerne. I

I 5 Antistofekspression I

I Hindlll-BamHI-fragmentet, som bar den sekvens, der koder for det variable I

I domæne på den tunge kæde af MBr1, i M13-VHPCR1 blev klonet igen i en I

pSV-gpt-vektor med humane gamma-1 -konstante områder (37) (figur 7). Den I

I 10 sekvens, som koder for det variable domæne på den lette kæde af MBr1, i I

I M13-VKPCR1 blev klonet igen som et Hindlll-BamHI-fragment i en pSV- I

I vektor, PSV-hyg-HuCK, med en hygromycinresistensmarkør og et humant I

I konstant kappa-domæne (figur 8). Samlingen af generne er opsummeret i I

I figur 9. I

I 15 I

De således frembragte vektorer blev lineariseret med Pvul (i tilfældet med I

I pSV-hydro-vektoreme var Pvul-fordøjelsen kun delvis) og blev cotransficeret I

i den ikke-secemerende mysemyelomlinie NSO (38) ved elektroperforering I

(39). En dag efter cotransfektion blev cellerne selekteret i 0,3 pg/ml my- I

20 cophenolsyre (MPA) og efter 7 dage i 1 pg/ml MPA. Efter 14 dage blev fire I

brønde, som hver indeholdt én eller to hovedkolonier, screenet ved inkorpo- I

rering af 14C-lysin (40), og det secernerede antistof blev påvist efter præcipi- I

I tering med protein-A-Sepharose (Pharmacia) på SDS-PAGE (41). Gelerne I

I blev farvet, blev fikseret, blev gennemvædet i et fluografisk reagens, Amplify I

I 25 (Amersham), blev tørret og autoradiograferet på flash-forbehandlet film ved - I

I 70°C i 2 dage. I

I Supematanten blev også undersøgt for binding til brystcarcinomlinien MCF-7 I

I og coloncarcinomlinien HT-29 stort set som beskrevet af Menard et al. (23) I

I 30 enten ved en indirekte immunfluorescensanalyse på cellesuspensioner (un- I

I der anvendelse af et fluoresceinmærket gede-antistof mod human IgG I

37 DK 175392 B1 (Amersham) eller ved en fastfase-RIA på monolag af fikserede celler (under anvendelse af 125l-protein A (Amersham)).

Det viste sig, at én af supernatanterne fra de fire brønde indeholdt secerneret 5 antistof. Det kimære antistof i supernatanten fandtes lige som muse-MBr1-moderantistoffet at bindes til MCF-7-celler, men ikke til HT-29-celler, hvilket viste, at specificiteten var blevet korrekt klonet og udtrykt.

EKSEMPEL 2 10

Kloning af omordnede gener, der koder for variable områder, fra genomisk DNA fra musemilt

Fremstilling af DNA fra milt: 15 DNA'et fra musemilten blev fremstillet på én af to måder (omend andre måder kan anvendes).

Metode 1. En musemilt blev skåret i to stykker, og hvert stykke blev anbragt i 20 et standard Eppendorf-rør med 200 pi PBS. Spidsen af en 1 ml glaspipette blev lukket og afrundet i den blå flamme fra en bunsenbrænder. Pipetten blev anvendt til af mase miltstykket i hvert rør. De således frembragte celler blev overført til et frisk Eppendorf-rør, og metoden blev gentaget tre gange, indtil miltens bindevæv så hvidt ud. Alt bindevæv, som var blevet overført med 25 cellerne, blev fjernet med en udtrukket Pasteur-pipette. Cellerne blev derefter vasket i PBS og blev fordelt i fire rør.

Musemiltcellerne blev derefter bundfældet ved 2 minutters centrifugering i en Microcentaur-centrifuge ved lav hastighed. Al supernatant blev aspireret med 30 en udtrukket Pasteur-pipette. Om ønsket kan celleprøven på dette tidspunkt fryses og opbevares ved -20°C. i

I DK 175392 B1 I

I 38 I

I Til celleprøven (når den var optøet, hvis den havde været trosset) tilsattes I

I 500 pi vand og 5 μΙ af en 10% opløsning af NP-40, et ikke-ionisk detergent. I

I Røret blev lukket, og der blev prikket et hul i låget. Røret blev anbragt i et I

I 5 bad med kogende vand i 5 minutter for at åbne cellerne, og prøven blev der- I

I efter afkølet på is i 5 minutter. Røret blev derefter centrifugeret i 2 minutter I

I ved høj hastighed for at fjerne cellerester. I

I Supematanten blev overført til et nyt rør, og der tilsattes 125 μΙ 5 M NaCI og I

I 10 30 μΙ 1 M MOPS indstillet til pH 7,0. DNA'et i supematanten blev absorberet I

I på en Quiagen 5-spids og oprenset ved at følge producentens instruktioner I

I for lambda-DNA. Efter isopropanolpræcipitering blev DNA'et resuspenderet i I

I 500 μΙ vand. I

I 15 Metode 2. Denne metode er baseret på teknikken beskrevet i Maniatis et al. I

I (30). En musemilt blev skåret i meget fine stykker og anbragt i en 2 ml I

I glashomogenisator. Cellerne blev derefter befriet fra vævet ved adskillige I

I langsomme opadgående og nedadgående bevægelser med stemplet. Celle- I

I suspensionen blev fremstillet i 500 μΙ phosphatpufferet salin (PBS) og blev I

I 20 overført til et Eppendorf-rør. Cellerne blev derefter centrifugeret i 2 minutter I

I ved lav hastighed i en Microcentaur-centrifuge. Dette resulterer i en synlig I

I adskillelse af hvide og røde blodlegemer. De hvide blodlegemer, som bund- I

I fældes langsommere, danner et lag på toppen af de røde blodlegemer. Su- I

I pernatanten blev fjernet omhyggeligt og centrifugeret for at sikre, at alle hvide I

I 25 blodlegemer var bundfældet. Laget af hvide blodlegemer blev resuspenderet I

I i to portioner af 500 μΙ PBS og blev overført til et andet rør. I

I De hvide blodlegemer blev præcipiteret ved at centrifugere i en Microcentaur- I

I centrifuge ved lav hastighed i 1 minut. Cellerne blev vasket yderligere to I

I 30 gange med 500 μΙ PBS og blev endelig resuspenderet i 200 μΙ PBS. De hvi- I

I de blodlegemer blev tilsat til 2,5 ml 25 mM EDTA og 10 mM Tris-HCI, pH 7,4, I

39 DK 175392 B1

J

! og blev langsomt vortex-behandlet. Under vortex-behandlingen tilsattes 25 μΙ 20% SDS. Cellerne lyserede straks, og opløsningen blev viskøs og klar. Der blev tilsat 100 μΙ 20 mg/ml proteinase K, og blandingen blev inkuberet i 1 til 3 timer ved 50°C.

5

Prøven blev ekstraheret med et lige så stort volumen phenol og det samme volumen chloroform og blev vortex-behandlet. Efter centrifugering blev den vandige fase fjernet, og der blev tilsat 1/10 volumen 3 M ammoniumacetat.

Oven på dette anbragtes 3 voluminer kold éthanol, og røret blev vippet for-10 sigtigt, indtil DNA-strengene blev synlige. DNA'et blev spolet op med en Pa-steur-pipette, ethanolen fik lov til at afdryppe og DNA’et blev overført til 1 ml 10 mM Tris-CI, pH 7,4, 0,1 mM EDTA i et Eppendorf-rør. DNA'et fik lov til at opløse i kulde natten over på et vippeapparat.

15 Amplifikation fra genomisk DNA

DNA-opløsningen blev fortyndet 1/10 i vand og blev kogt i 5 minutter forud for anvendelsen af polymerasekædereaktionen (PCR). Til hver PCR-reaktion blev der typisk anvendt 50-200 ng DNA.

20

De sekvenser, der koder for. det variable domæne på den tunge og lette kæde i det genomiske DNA isoleret fra human PBL eller musemiltceller, blev derefter opformeret og klonet under anvendelse af den generelle protokol beskrevet i de to første afsnit i sektionen med overskriften "Amplifikation fra 25 RNA/DNA-hybrid" i eksempel 1 med undtagelse af, at under anneleringsde-len af hver cyklus blev temperaturen holdt ved 65°C, og at der blev anvendt 30 cykler. For at gøre anneleringen mellem 3'-endeme af de to primere mindst mulig blev prøven endvidere først opvarmet til 95°C, blev derefter an-neleret ved 65°C, og først derefter blev Taq-polymerasen tilsat. Efter afslut-30 ning af 30 cykler blev reaktionsblandingen holdt ved 60°C i 5 minutter for at

DK 175392 B1 I

40 I

sikre, at fuldstændig eiongering og renaturering af de opformerede fragmen- I

ter havde fundet sted. I

Primerne anvendt til at opformere genomisk DNA fra musemilt var VH1FOR I

5 og VH1BACK for det variable domæne fra den tunge kæde og VK2FOR og I

VK1 BACK for det variable domæne af den lette kæde. (VK2FOR adskiller sig I

kun fra VK1 FOR ved, at den har en ekstra C-rest på 5'enden). I

Andre sæt af primere udformet til optimering af annelering med forskellige I

10 familier af muse-VH- og Vkappa-gener blev udformet og anvendt i blandinger I

med de ovenfor omtalte primere. For eksempel blev blandinger af VK1 FOR, I

MOJK1 FOR, MOJK3FOR og MOJK4FOR anvendt som fremadrettede prime- I

re og blandinger VK1BACK, MOVKIIABACK og MOVKIIBBACK som bagud- I

rettede primere til amplifikation af Vkappa-gener. Ligeledes blev blandinger af I

15 VH1FOR, MOJH1FOR, MOJH2FOR, MOJH3FOR og MOJH4FOR anvendt I

som fremadrettede primere, og blandinger af VHIBACK, MOVHIBACK, I

MOVHIIABACK, MOVHIIBBACK, MOVHIIIBACK anvendt som bagudrettede I

primere til amplifikation af VH-gener. I

20 Alle disse ovenfor omtalte FOR-primere for tung kæde indeholder et genken- I

delsessted for BstEII, og alle de ovenfor omtalte BACK-primere indeholder et I

genkendelsessted for Pstl. Disse FOR- og BACK-primere for let kæde omtalt I

ovenfor indeholder alle genkendelsessteder for Bglll henholdsvis Pvull. Der I

blev også udformet primere for let kæde (VK3FOR og VK2BACK), hvilke pri- I

25 mere udnyttede forskellige restriktionssteder, Sacl og Xhol. I

Alle disse primere gav typisk opformeret DNA af den korrekte størrelse ved I

gelelektroforese, omend også andre bånd var til stede. Der blev imidlertid I

identificeret et problem, hvor 5 - og 3'-endeme af de fremadrettede og bagud- I

30 rettede primere for VH-generne var delvis komplementære, og dette kunne I

give et hovedbånd af "primer-dimer", hvor de to oligonucleotider var primere I

41 DK 175392 B1 på hinanden. Derfor blev der udformet en forbedret fremadrettet primer, VH1FOR-2, i hvilken de to 3'-nu-cleotider var blevet fjernet fra VH1 FOR.

De foretrukne amplifikationsbetingelser for muse VH-gener var således føl-5 gende: prøven blev fremstillet i et volumen på 50-100 pi, 50-100 ng DNA, VH1 FOR-2 og VHIBACK-primere (25 pmol af hver), 250 μΜ af hver af deo-xynucleosidtriphosphater, 10 mM Tris-HCI, pH 8,8, 50 mM KCI, 1,5 mM MgCh og 100 pg/ml gelatine. Oven på prøven blev der lagt paraffinolie, prøven blev opvarmet til 95°C i 2 minutter, blev behandlet ved 65°C i 2 minutter 10 og derefter opvarmet til 72°C: taq-polymerase blev tilsat efter at prøven havde nået forlængelsestemperaturen, og reaktionen forløb i 2 minutter ved 72°C. Prøven blev udsat for yderligere 29 omgange med temperaturskift under anvendelse af en programmerbar Techne PHC-1-opvarmningsblok.

15 De foretrukne amplifikationsbetingelser for muse VK-gener fra genomisk DNA var følgende: prøven blev behandlet som oven med undtagelse af, at der blev anvendt Vkappa-phmere, for eksempel VK3FOR og VK2BACK, og under anvendelse af en cyklus på 94°C i 1 minut, 60°C i 1 minut og 72°C i 1 minut.

20

De betingelser, som blev udformet for genomisk DNA, var også egnet til amplifikation fra cDNA afledt fra mRNA fra musemilt eller musehybridom.

25 Kloning og analyse af gener, der koder for variable områder ,

Reaktionsblandingen blev derefter ekstraheret to gange med 40 μΙ vandmættet diethylether. Dette blev efterfulgt af en standardphenolekstraktion og ethanolpræcipitering som beskrevet i eksempel 1. DNA-pelleten blev derefter 30 opløst i 100 μ110 mM Tris-CI, 0,1 mM EDTA.

I DK 175392 B1 I

I 42 I

I Hver reaktionsblanding indeholdende en sekvens, der koder for et variabelt I

I domæne af en let kæde, blev fordøjet med Sacl og Xhol (eller med Pvull og I

I Bglll) for at muliggøre ligering i en egnet ekspressionsvektor. Hver reaktions- I

I blanding indeholdende en sekvens, der koder for et variabelt domæne af en I

5 tung kæde, blev fordøjet med Pstl og BstEII af den samme grund. I

I De gener, som koder for det variable område af en tung kæde isoleret som I

ovenfor fra en mus hyperimmuniseret med lysozym, blev klonet i I

M13VHPCR1-vektoren og blev sekventeret. De fuldstændige sekvenser for I

I 10 48 VH-gen-kloner blev bestemt (figur 10). Alle på nær to af muse VH- I

I genfamilierne var repræsenteret med frekvenser på: VA (1), IIIC (1), HIB (8), I

I MIA (3), IIB (17), HA (2), IB (12), IA (4). I 30 kloner kunne D-segmenterne I

I henregnes til familierne SP2 (14), FL16 (11) og Q52 (5), og i 38 kloner kunne I

I JH-minigeneme henregnes til familierne JH1 (3), JH2 (7), JH3 (14) og JH4 I

I 15 (14). De forskellige sekvenser af CDR3 markerede hver af de 48 kloner som I

I unik. Der blev identificeret 9 pseudogener og 16 ikke-produktive omordnin- I

I ger. Af de sekventerede kloner havde 27 åbne læserammer. I

Ved fremgangsmåden er det således muligt at frembringe et forskelligartet I

I 20 repertoire af gener, der koder for variable domæner af tung kæde fra muse- I

I milt-DNA. I

I EKSEMPEL 3 I

I 25 Kloning af omordnede gener, der koder for et variabelt område, fra mRNA fra I

I lymfocytter fra humant perifert blod I

Fremstilling af mRNA: 43 DK 175392 B1

Lymfocytter fra humant perifert blod blev oprenset, og mRNA blev fremstillet direkte (metode 1), eller mRNA blev fremstillet efter tilsætning af Epstein Barr-virus (metode 2).

5 Metode 1. 20 ml heparin behandlet humant blod fra en sund frivilling person blev fortyndet med et lige så stort volumen phosphatpufferet salin (PBS) og blev fordelt ligeligt i 50 ml Falcon-centrifugeglas. Under blodet blev der derefter anbragt 15 ml Ficoll Hypaque (Pharmacia 10-A-001-07). For at adskille lymfocytter fra de røde blodlegemer blev centrifugeglassene centrifugeret i 10 10 minutter ved 1800 omdrejninger pr. minut ved stuetemperatur i en IEC

Centra 3E-bordcentrifuge. Lymfocytterne fra det perifere blod (PBL) blev derefter opsamlet fra grænsefladen ved aspiration med en Pasteur-pipette. Cellerne blev fortyndet med et lige så stort volumen PBS og blev centrifugeret igen ved 1500 omdrejninger pr. minut i 15 minutter. Supematanten blev aspi-15 reret, cellepelleten blev resuspenderet i 1 ml PBS, og cellerne blev fordelt i to Eppendorf-rør.

Metode 2. 40 ml humant blod fra en patient med HIV i præ-AIDS-tilstanden blev lagt på Ficoll for at adskille de hvide blodlegemer (se metode 1 ovenfor).

20 De hvide blodlegemer blev derefter inkuberet i vævsdyrkningsmedium i 4-5 dage. På dag 3 blev de inficeret med Epstein Barr-virus. Cellerne blev pelle-teret (ca. 2 x 107 celler) og blev vasket i PBS.

Cellerne blev igen pelleteret og lyseret med 7 ml 5 M quanidinisothiocyanat, 25 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0,1 mM dithiothreitol. Cellerne blev vortex- behandlet kraftigt, og der blev tilsat 7 voluminer 4 M LiCI. Blandingen blev inkuberet ved 4°C i 15-20 timer. Suspensionen blev centrifugeret, og super-natanten blev resuspenderet i 3 M LiCI og centrifugeret igen. Pelleten blev opløst i 2 ml 0,1% SDS, 10 mM Tris-HCI og 1 mM EDTA. Suspensionen blev 30 frosset ved -20°C og optøet ved vortex-behandling i 20 sekunder hver 10. minut i 45 minutter. Der blev efterladt en stor hvid pellet, og den klare super-

I DK 175392 B1 I

I 44 I

I natant blev ekstraheret med phenol/chloroform og derefter med chloroform. I

I RNA'et blev præcipiteret ved tilsætning af 1/10 volumen 3 M natriumacetat I

I og 2 voluminer ethanol og blev efterladt natten over ved -20°C. Pelleten blev I

I suspenderet i 0,2 ml vand og blev igen præcipiteret med ethanol. Delprøver I

I 5 til cDNA-syntese blev taget fra ethanolpræcipitatet, som var blevet vortex- I

I behandlet for at frembringe en fin suspension. I

I 100 pi af suspensionen blev præcipiteret og opløst i 20 pi vand til cDNA- I

I syntese (30) under anvendelse af 10 pmol af en HUFOR-primer (se neden- I

I 10 for) i et slutvolumen på 50 μΙ. En prøve på 5 μ! af cDNA’et blev opformeret I

I som i eksempel 2 med undtagelse af, at primerne for de humane VH- I

I genfamilier (se nedenfor) blev anvendt med en cyklus på 95°C, 60°C og I

I 72°C. I

I 15 De bagudrettede primere til amplifikation af humant DNA blev udformet til at I

I matche de tilgængelige sekvenser, som koder for human tung kæde og let I

I kæde, hvor de forskellige familier har lidt forskellige nucleotidsekvenser ved I

I 5-enden. For de humane VH-gener blev således primerne Hu2VHIBACK, I

I HuVHIIBACK, Hu2VHIIIBACK og HuVH1-VBACK udformet som bagudrette- I

I 20 de primere og HUJH1FOR, HUJH2FOR og HUJH4FOR som fremadrettede I

I primere baseret på hele det variable gen. Et andet sæt af fremadrettede pri- I

I mere HulVHFOR, Hu2VHFOR, Hu3VHFOR og Hu4VHFOR blev også an- I

I vendt, hvilke primere var udformet til at matche de humane J-områder og 5- I

I enden af de konstante områder af forskellige humane isotoper. I

I 25 I

I Ved at anvende sæt af disse primere var det muligt at påvise et bånd af op- I

I formeret dobbeltstrenget cDNA ved gelelektroforese. I

I Ét sådant forsøg blev analyseret i detaljer for at finde ud af, om der var et I

I 30 forskelligartet repertoire hos en patient med HIV-infektion. Det er kendt, at I

I under AlDS-forløbet er T-cellerne og også antistofferne i høj grad formind- I

45 DK 175392 B1 sket i blodet. Repertoiret af lymfocytter er antagelig også formindsket. Til dette forsøg blev der til den fremadrettede priming anvendt en ækvi-molær blanding af primerne HulVHFOR, Hu2VHFOR, Hu3VHFOR og Hu4VHFOR (i PCR 25 pmol primer 5'-ender). Til bagudrettet priming blev primerne 5 Hu2VHIBACK, HuVHIIBACK, Hu2VHIIIBACK og HuVHIVBACK anvendt separat i fire separate priminger. Det opformerede DNA fra de separate primin-ger blev derefter hældt sammen, blev fordøjet med restriktionsenzymerne Pstl og BstEII som ovenfor og blev derefter klonet i vektoren M13VHPCR1 til sekventering. Sekvenserne afslørede et forskelligartet repertoire (figur 11) på 10 dette trin af sygdommen.

For humane VkaPpa-gener blev primerne HuJKIFOR, HUJK-3FOR, HUJK4FOR og HUJK5FOR anvendt som fremadrettede primere og VK1 BACK som bagudrettet primer. Under anvendelse af disse primere var 15 det ved gelelektroforese muligt at se et bånd af opformeret dobbeltstrenget cDNA med den korrekte størrelse.

EKSEMPEL 4 20 Kloning af ikke-omordnede gener, der koder for et variabelt område, fra ge-nomisk DNA fra lymfocytter fra humant perifert blod

Lymfocytter fra humant perifert blod fra en patient med ikke-Hodgkins lymphom blev fremstillet som i eksempel 3 (metode 1). Det genomiske DNA 25 blev fremstillet fra PBL under anvendelse af den i eksempel 2 beskrevne metode (metode 2). VH-området af det isolerede genomiske DNA blev derefter opformeret og klonet under anvendelse af den generelle protokol beskrevet i de to første afsnit under sektionen med overskriften "Amplifikation fra RNA/DNA-hybrid" i eksempel 1 ovenfor med undtagelse af, at under annele-30 ringsdelen af hver cyklus blev temperaturen holdt ved 55°C og, at der blev anvendt 30 cykler. Efter afslutningen af de 30 cykler blev reaktionsblandin-

I DK 175392 B1 I

I 46 I

I gen holdt ved 60°C i 5 minutter for at sikre, at fuldstændig forlængelse og I

I renaturering af de opformerede fragmenter havde fundet sted. I

I Den anvendte fremadrettede primer var HuHepIFOR, som indeholder et I

I 5 genkendelsessted for Sacl. Denne primer var udformet til at annelere til 3'- I

I enden af det ikke-omordnede humane gen, der koder for VH-området, og I

I omfatter navnlig en sekvens, der er komplementær til de tre sidste codoner i I

I genet, der koder for VH-området, og 9 nucleotider nedenstrøms disse tre I

codoner. I

I 10 I

I Som den bagudrettede primer blev der anvendt en ækvimolær mængde af I

I HuOctalBACK, HuOcta2BACK og HuOcta3BACK. Disse primere annelerer I

til en sekvens i promotorområdet af VH-genet i det genomiske DNA (se figur I

I 1). 5 pi af det opformerede DNA blev undersøgt på 2% agarosegeler i TBE- I

I 15 puffer og blev farvet med ethidiumbromid. Der blev set et dobbelt bånd på I

I 620 nucleotider, som svarer til den forventede størrelse for det ikke- I

I omordnede VH-gen. Det dobbeltstrengede cDNA blev fordøjet med Sacl og I

I klonet i en M13-vektor til sekventering. Selv om der er nogle sekvenser, som I

I er identiske, blev der identificeret en række forskellige ikke-omordnede hu- I

20 mane VH-gener (figur 12). I

I EKSEMPEL 5 I

I Kloning af variable domæner med bindingsaktiviteter fra en hybridom I

I 25 I

I Det variable domæne på den tunge kæde (VHLYS) af D1,3-antistoffet (anti- I

I lysozym) blev klonet i en lignende vektor som den, der blev beskrevet tidlige- I

I re (42), men under styringen af lacz-promotoren, således at VHLYS- I

I domænet blev knyttet til en pelB-ledersekvens til udføring i periplasmaet. I

I 30 Vektoren blev konstrueret ved syntese af pelB-ledersekvensen (43) under I

I anvendelse af overlappende oligonucleotider og kloning i en pUC19-vektor I

47 DK 175392 B1 (35). VHLYS-domænet af D1.3-antistoffet blev afledt fra en cDNA-klon (44), og konstruktionen (pSW1) blev sekventeret (figur 13).

For at udtrykke de variable domæner fra både den tunge og den lette kæde 5 sammen, blev det variable område fra den lette kæde (VKLYS) af D1.3-antistoffet indført i pSW1 -vektoren med en pelB-signalsekvens til frembringelse af konstruktionen pSW2 (figur 14).

En stamme af E. coli (BMH71-18) (45) blev derefter transformeret (46, 47) 10 med plasmidet pSW1 eller pSW2, og kolonier, som var resistente over for ampicillin (100 pg/ml), blev selekteret på en rig plade (2 xTY = pr. liter vand, 16 g Bacto-tryptone, 10 g gærekstrakt, 5 g NaCI), hvilken plade indeholdt11% glucose for at undertrykke ekspressionen af et variabelt domæne (variable domæner) ved catabolitrepression.

15

Kolonierne blev inokuleret i 50 ml 2 x TY (med 1% glucose og 100 pg/ml ampicillin) og blev dyrket i kolber ved 37°C under omrystning i 12-16 timer. Cellerne blev centrifugeret, pelleten blev vasket to gange med 50 mM natrium-chlorid, blev resuspenderet i 2 x TY-medium indeholdende 100 pg/ml ampi-20 cillin og induceren IPTG (1 mM) og blev dyrket i yderligere 30 timer ved 37°C. Cellerne blev centrifugeret, og supematanten blev ført gennem et Nal-gene-filter (0,45 pm) og derefter gennem en 1-5 ml lysozym-Sepharose-affinitetssøjle. (Søjlen blev fremstillet ved at koble lysozym ved 10 mg/ml til CNBr-aktiveret Sepharose). Søjlen blev først vasket med phosphatpufferet 25 salin (PBS), derefter med 50 mM diethylamin for at eluere VHLYS-domænet (fra pSW1) eller VHLYS sammen med VKLYS (fra pSW2).

VHLYS- og VKLYS-domæneme blev identificeret ved SDS-polyacrylamidelektroforese som havende den korrekte størrelse. Endvidere 30 viste N-terminal sekvensbestemmelse af VHLYS og VKLYS isoleret fra en polyacrylamidgel, at signalpeptidet var blevet produceret korrekt. Således er

I DK 175392 B1 I

I 48 I

både Fv-fragmentet og VHLYS-domænerne i stand til at bindes til lysozymaf- I

I finitetssøjlen, hvilket antyder, at begge bevarer i det mindste nogen affinitet I

fra det oprindelige antistof. I

I 5 Størrelsen af VHLYS-domænet blev sammenlignet ved FPLC med størrelsen I

I af Fv-fragmentet på Superose 12. Dette indicerede, at VHLYS-domænet var I

I en monomer. Bindingen af VHLYS- og Fv-fragmentet til lysozym blev under- I

I søgt ved ELISA, og ligevægtsundersøgelser og undersøgelser for hurtig re- I

I aktion blev udført med fluorescens-quench. I

I 10 I

I ELISA for lysozymbinding blev udført på følgende måde: (1) Pladerne (Dyna- I

I tech Immulon) blev belagt med 200 pi pr. brønd af 300 pg/ml lysozym i 50 I

I mM NaHC03, pH 9,6, natten over ved stuetemperatur, (2) brøndene blev va- I

I sket med tre vask af PBS og blev blokeret med 300 μΙ pr. brønd af 1% af I

15 Sainsburys tørmælkspulver fra skummetmælk i PBS i 2 timer ved 37°C, (3) I

I brøndene blev skyllet med tre vask af PBS, og der blev tilsat 200 μΙ VHLYS- I

I fragment eller Fv-fragment (VHLYS associeret med VKLYS), og der blev in- I

I kuberet i 2 timer ved stuetemperatur, (4) brøndene blev vasket tre gange I

I med 0,05% Tween 20 i PBS og derefter tre gange med PBS for at fjerne de- I

I 20 tergent, (5) 200 μΙ af en passende fortynding (1:1000) af polyklonale kaninan- I

I tisera rejst mod Fv-fragmentet i 2% skummetmælkspulver i PBS blev tilsat til I

I hver brønd, og der blev inkuberet ved stuetemperatur i 2 timer, (6) vask blev I

I gentaget som i (4), (7) 200 μΙ af en passende fortynding (1:1000) af gedean- I

I tistof mod kanin (ICN Immunochemicals) koblet til peber-rod peroxidase i 2% I

I 25 skummetmælkspulver i PBS blev til-sat til hver brønd, og der blev inkuberet I

I ved stuetemperatur i 1 time, (8) vask blev gentaget som i (4), og (9) 200 μΙ I

I 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazolinsulfonsyre) (Sigma) (0,55 mg/ml, med 1 μΙ I

I 20% hydrogenperoxid: vand pr. 10 ml) blev tilsat til hver brønd, og farven fik I

I lov til at udvikle i op til 10 minutter ved stuetemperatur. I

I 30 I

DK 175392 B1 - mi—— ----ir· · i mit ^ -!___" 49

Reaktionen blev standset ved at tilsætte 0,05% natriumazid i 50 mM citronsyre, pH 4,3. ELISA-plader blev aflæst i en Titertek Multiscan pladeaflæser. Supernatant fra de inducerede bakteriekulturer af både pSW1 (VHLYS-domæne) eller pSW2 (Fv-fragment) fandtes at bindes til lysozym ved ELISA.

5

De oprensede VHLYS- og Fv-f rag menter blev titreret med lysozym under anvendelse af fluorescens-quench (Perkin Elmer LS5B luminiscensspektro-meter) for at måle støkiometrien af bindingen og affinitetskonstanten for lyso-zym (48, 49). Titreringen af Fv-fragmentet ved en koncentration på 30 nM 10 indicerer en dissociationskonstant på 2,8 nM ved en Scatchard-analyse.

En lignende analyse med fluorescens-quench og en Scatchard-afbildning blev udført for VHLYS ved en VHLYS-koncentration på 100 nM. Støkiometrien for antigenbinding var ca. 1 mol lysozym pr. mol VHLYS (beregnet ud fra 15 afbildningen). (Koncentrationen af VH-domæner blev beregnet ud fra optisk densitet ved 280 nm under anvendelse af den typiske ekstinktionskoefficient for komplette immunglobuliner). På grund af mulige fejl ved måling af lave optiske densiteter og antagelsen om ekstinktionskoefficienten blev støkiometrien også målt mere omhyggeligt. VHLYS blev titreret med lysozym som 20 ovenfor under anvendelse af fluorescens-quench. For at bestemme koncentrationen af VHLYS blev en prøve af stamopløsningen fjernet, en kendt mængde norleucin blev tilsat, og prøven blev udsat for kvantitativ ami-nosyreanalyse. Dette viste en støkiometri på 1,2 mol lysozym pr. mol VHLYS-domæne. Dissociationskonstanten blev beregnet som ca. 12 nM.

25

Bindingshastighederne (on-rates) for VHLYS- og Fv-fragmenter med lysozym blev bestemt ved stop-flow-analyse (Hl Tech Stop Flow SHU-maskine) under pseudo-førsteordens betingelser med fragmentet ved en ti gange høje-re koncentration end lysozym (50). Koncentrationen af lysozymbindingssteder 30 blev først målt ved titrering med lysozym under anvendelse af fluorescens-quench som ovenfor. Bindingshastighederne blev beregnet pr. mol bindings-

I DK 175392 B1 I

I 50 I

I sted (frem for mængde VHLYS-protein). Bindingshastigheden for Fv- I

I fragmentet fandtes af være 2,2 x 106 M‘1 s'1 ved 25°C. Bindingshastigheden I

for VHLYS-fragmentet fandtes at være 3,8 x 106 M'1 s'1 og en af- I

I givelseshastighed (off-rate) på 0,075 s*1 ved 20°C. Den beregnede affinitets- I

I 5 konstant var 19 nM. VHLYS bindes således til lysozym med en dissociati- I

onskonstant på ca. 19 nM sammenlignet med dissociationskonstanten for Fv I

I på 3 nM. I

I EKSEMPEL 6 I

I 10 I

I Kloning af komplette variable domæner med bindingsaktiviteter fra mRNA I

I eller DNA fra antistofsecernerende celler I

I En mus blev immuniseret med hønseæggehvidelysozym (100 pg i.p. dag 1 i I

15 komplet Freunds adjuvans), blev efter 14 dage igen immuniseret i.p. med I

100 pg lysozym med ikke-komplet Freunds adjuvans og på dag 35 i.v. med I

I 50 pg lysozym i salin. På dag 39 blev milten taget ud. En anden mus blev I

I immuniseret med albueskælhæmocyanin (KLH) (eng.: keyhole limpet hae- I

I mocyanin) på lignende måde. DNA’et blev fremstillet ud fra milten ifølge ek- I

I 20 sempel 2 (metode 2). VH-geneme blev opformeret ifølge den foretrukne me- I

I tode i eksempel 2. I

Lymfocytter fra humant perifert blod fra en patient inficeret med HIV blev I

fremstillet som i eksempel 3 (me-tode 2), og mRNA blev fremstillet. VH- I

25 generne blev opformeret ifølge den metode, der er beskrevet i eksempel 3, I

under anvendelse af primere udformet for humane VH-genfamilier. I

Efter PCR blev reaktionsblandingen og olien ekstraheret to gange med ether, I

én gang med phenol og én gang med phenol/CHCI3. Det dobbeltstrengede I

30 DNA blev taget op i 50 pi vand og blev frosset. 5 pi blev fordøjet med Pstl og I

......... ..............— ' ^ - : :-Ig Wil —P .........: ^ DK 175392 B1 51

BstEII (kodet i amplifikationsprimerne) og blev sat på en agarosegel til elek-troforese. Båndet af opformeret DNA ved ca. 350 bp blev ekstraheret.

Ekspression af anti-lysozymaktiviteter 5

Repertoiret af opformerede variable domæner fra tung kæde (fra mus immuniseret med lysozym og fra humane PBL'er) blev derefter klonet direkte i ekspressionsvektoren pSWIHPOLYMYC. Denne vektor er afledt fra pSW1 med undtagelse af, at VHLYS-genet er blevet fjernet og erstattet med et poly-10 linker restriktionssted. En sekvens, som kodede for en peptidmærkning, blev indsat (figur 15). Kolonier blev ved hjælp af tandstikkere overført til 1 ml kulturer. Efter induktion (se eksempel 5 for detaljer) blev 10 μΙ af supematanten fra 14 1 ml kulturer sat på SDS-PAGE-geler, og proteinerne blev overført elektroforetisk til nitrocellulose. Det frembragte blot blev proberet med anti-15 stof 9E10 rettet mod peptid mærkningen.

Proberingen blev udført på følgende måde. Nitrocellulosefilteret blev inkuberet i 3% bovin serumalbumin (BSA)/TBS-puffer i 20 minutter (10 x TBS-puffer er 100 mM Tris-HCI, pH 7,4, 9% vægt/volumen NaCI). Filteret blev inkuberet i 20 en passende fortynding af antistof 9E10 (ca. 1/500) i 3% BSA/TBS i 1-4 timer. Efter tre vask i TBS (100 ml pr. vask, hver vask i 10 minutter), blev filteret inkuberet med 1:500 fortynding af anti-stof mod mus (peroxidasekonjuge-ret anti-mus Ig (Dakopats)) i 3% BSA/TBS i 1-2 timer. Efter tre vask i TBS og 0,1% Triton X-100 (ca. 100 ml pr. vask, hver vask i 10 minutter), blev der 25 over blottet tilsat en opløsning indeholdende 10 ml chlomapthol i methanol (3 mg/ml), 40 ml TBS og 50 pi hydrogenperoxidopløsning, og det fik lov til at reagere i op til 10 minutter. Substratet blev vasket ud med overskud af vand.

Blottet afslørede bånd med samme mobilitet som VHLYSMYC på Western-blot, hvilket viste, at andre VH-domæner kunne udtrykkes.

30

I DK 175392 B1 I

I 52 I

I Kolonier blev derefter individuelt opsamlet med tand-stikkere i brønde på en I

I ELISA-plade (200 μΙ) for vækst og induktion. De blev analyseret for lysozym- I

I binding med 9E1 O-antistoffet (som i eksemplerne 5 og 7). Brønde med lyso- I

I zymbindingsaktivitet blev identificeret. To positive brønde (af 200) blev identi- I

5 ficeret fra det opformerede musemilt-DNA og én brønd fra det humane I

I cDNA. De variable domæner fra tung kæde blev oprenset på en søjle med I

lysozym-Sepharose. Klonernes affinitet for lysozym blev vurderet ved fluore- I

scens-quench-titrering som større end 50 nM. Affiniteterne af de to kloner I

I (VH3 og VH8) afledt fra musegeneme blev også vurderet ved stop-flow- I

I 10 analyse (forholdet kon/koff) som 12 nM henholdsvis 27 nM. Begge disse kloner I

I har således en sammenlignelig affinitet for VHLYS-domænet. De kodede I

I aminosyresekvenser af VH3 og VH8 er anført i figur 16 og sekvensen for det I

I humane variable domæne i figur 17. I

I 15 Et bibliotek over VH-domæner fremstillet ud fra musen immuniseret med ly- I

I sozym blev screenet for både bindingsaktiviteter til lysozym og albueskæl- I

I hæmocyanin (KLH). Totusind kolonier blev i grupper på fem med tandstikke- I

I re overført i brønde på ELISA-plader, og supematanterne blev undersøgt for I

I binding til lysozymbelagte plader og separat til plader belagt med KLH. 21 I

I 20 supematanter viste sig at have lysozymbindingsaktiviteter og to at have KLH- I

I bindende aktiviteter. Et andet ekspressionsbibliotek fremstillet ud fra en mus I

I immuniseret med KLH blev screenet som ovenfor. 14 supematanter havde I

I KLH-bindingsaktiviteter og en enkelt supernatant havde lysozymbindingsakti- I

I vitet. I

I 25 I

Dette viser, at antigenbindingsaktiviteter kan fremstilles ud fra enkelt-VH- I

I domæner, og at immunisering gør isoleringen af disse domæner lettere. I

53 DK 175392 B1 EKSEMPEL 7

Kloning af variable domæner med bindinqsaktiviteter ved mutagenisering Ud fra et enkelt, omordnet VH-gen er det muligt at aflede helt nye antigen-5 bindingsaktiviteter ved omfattende mutering af hver af CDR'eme. Mutageni-seringen kan være fuldstændigt tilfældig eller kan være afledt fra præeksisterende repertoirer af CDR'er. Der kan således frembringes et repertoire af CDR3'er som i de foranstående eksempler ved at anvende "universelle” primere baseret i de flankerende sekvenser og ligeledes repertoirer af de 10 andre CDR'er (enkeltvis eller i kombination). CDR-repertoireme kan sættes på plads i de flankerende strukturrammeområder ved hjælp af en række re-kombinant-DNA-metoder.

CDR3 synes at være det mest lovende område for mutagenisering, eftersom 15 CDR3 er mere variabelt i størrelse og sekvens end CDR'eme 1 og 2. Dette område ville forventes at give et hovedbidrag til antigenbinding. Det variable område (VHLYS) af den tunge kæde af antistoffet D1.3 mod lysozym vides at have adskillige vigtige kontakter i CDR3-området.

20 Der blev foretaget multiple mutationer i CDR3. Polymerasekædereaktionen (PCR) og en meget degenereret primer blev anvendt til at foretage mutationerne, og på denne måde blev den oprindelige sekvens CDR3 ødelagt. (Det ville også have været muligt at konstruere mutationerne i CDR3 ved at klone en blandet oligonucleotidduplex i restriktionssteder, som flankerer CDR, eller 25 ved hjælp af andre metoder til stedstyret mutagenisering). Mutanter, som udtrykker variable domæner af tung kæde med affiniteter for lysozym, blev screenet, og mutanter med forbedrede affiniteter eller nye specificiteter blev identificeret.

30 Kilden til det variable domæne af den tunge kæde var en M13-vektor indeholdende VHLYS-genet. Hoveddelen af den sekvens, som koder for det vari-

I DK 175392 B1 I

I 54 I

I able område, blev opformeret med polymerasekædereaktionen (PCR) med I

I den mutagene primer VHMUT1 baseret på CDR3 og M13-primeren, som er I

I baseret på M13-vektorgrundstrukturen. Den mutagene primer hypermuterer I

I de centrale fire aminosyrerester i CDR3 (Arg-Asp-Tyr-Arg). PCR blev udført i I

I 5 25 cykler på en programmerbar Techne PHC-1-opvarmningsblok under an- I

I vendelse af 100 ng enkeltstrenget M13mp19SWO-skabelon med 25 pmol af I

I VHMUT1 og M13-primeren, 0,5 mM af hver dNTP, 67 mM Tris-HCI, pH 8,8, I

I 10 mM MgCI2, 17 mM (NH4)2S04, 200 pg/ml gelatine og 2,5 enheder Taq- I

I polymerase i et slutvolumen på 50 pi. Temperaturprogrammet var 95°C i 1,5 I

I 10 minutter, 25°C i 1,5 minutter og 72°C i 3 minutter (der kan imidlertid anven- I

I des en række PCR-betingelser). Reaktionsprodukterne blev ekstraheret med I

phenol/chloroform, blev præcipiteret med ethanol og resuspenderet i 10 mM I

I Tris-HCI og 0,1 mM EDTA, pH 8,0.

I 15 Produkterne fra PCR blev fordøjet med Pstl og BstEII og blev oprenset på en I

1,5% LGT-agarosegel i Tris-acetatpuffer under anvendelse af Geneclean I

I (Bio 101, LaJolla). Det geloprensede bånd blev ligeret i pSW2HPOLY (figur I

19). (Denne vektor er beslægtet med pSW2 med undtagelse af, at hovedpar- I

ten af VHLYS-genet er blevet erstattet med en polylinker). Vektoren blev I

20 først fordøjet med BstEII og Pstl og blev behandlet med kalvtarmphosphata- I

I se. Delprøver af reaktionsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli I

BMH 71-18 til ampicillinresistens. Kolonier blev selekteret på ampicillin (100 I

I pg/ml) berigede plader indeholdende glucose ved 0,8% vægt/volumen.

25 Kolonier fremkommet efter transfektion blev opsamlet i puljer på fem i to

Corning microtiterplader med 96 brønde indeholdende 200 μΙ 2 x TY-medium og 100 μΙ TY-medium, 100 pg/ml ampicillin og 1% glucose. Kolonierne blev dyrket i 24 timer ved 37°C, og cellerne blev derefter vasket to gange i 200 μΙ I 50 mM NaCI, hvorefter cellerne blev pelleteret i en I EC Centra-3- I 30 bordcentrifuge med et hoved, der passer til microtiterplader. Pladerne blev I centrifugeret ved 2.500 omdrejninger pr. minut i 10 minutter ved stuetempe- 55 DK 175392 B1 ratur. Cellerne blev resuspenderet i 200 μΙ 2 x TY, 100 pg/ml ampicillin og 1 mM IPTG (Sigma) til induktion af ekspression, og de blev dyrket i yderligere 24 timer.

5 Cellerne blev centrifugeret ned, og supernatanteme blev anvendt ved ELISA med lysozymbelagte plader og anti-idiotype sera (rejst i kaniner mod Fv-fragmentet af D1.3-antistoffet). Bundet anti-idiotypt serum blev påvist med peberrodperoxidase konjugeret til antisera mod kanin (ICN Immunochemicals). Syv af brøndene gav et positivt resultat ved ELISA. Der blev lavet 10 stregkulturer af disse puljer til enkeltkolonier, som blev samlet op, blev dyrket, blev induceret i microtiterplader og blev screenet igen i ELISA som ovenfor. Po-sitive kloner blev dyrket i 50 ml skalaen, og ekspression blev induceret. Kultursupernatanter blev oprenset som i eksempel 5 på søjler af lyso-zym-Sepharose, og eluater blev analyseret på SDS-PAGE og blev farvet 15 med Page Blue 90 (BDH). Ved eluering af søjlen med diethylamin blev der identificeret bånd, som svarer til VHLYS-mutantdomænerne, men ingen som svarer til VKLYS-domæner. Dette lader formode, at skønt mutantdomæneme kunne binde til lysozym, kunne de ikke længere associere med VKLYS-domænerne.

20

For syv kloner, som gav en positiv reaktion i ELISA, blev der fremstillet plasmider, og VKLYS-genet blev udskåret med EcoRI og blev genligeret. Plasmideme skulle således kun dirigere ekspressionen af VHLYS-mutanteme. 1,5 ml kulturer blev dyrket og induceret til ekspression som 25 ovenfor. Cellerne blev centrifugeret ned, og supematanten blev vist at binde lysozym som ovenfor. (Alternativt kunne de opformerede mutant-VKLYS-gener være blevet klonet direkte i pSWIHPOLY-vektoren til ekspression af mutantaktiviteteme i fravær af VKLYS).

30 Der blev udformet en ELISA-metode, ved hvilken aktiviteterne af bakterielle supernatanter for binding af lysozym (eller KLH) blev sammenlignet. Der blev I DK 175392 B1 I 56

I først udformet en vektor til mærkning af VH-domænerne i dens C-terminale I

I område med et peptid fra c-myc-proteinet, som genkendes af et monoklonalt I

I antistof 9E10. Vektoren var afledt fra pSW1 ved en dobbeltfordøjelse med I

I Bst-EII og Smal og ligering af en oligonucleotidduplex fremstillet ud fra: I

I 5

I 5' GTC ACC GTC TCC TCA G AA C AA AAA CTC ATC TCA G AA GAG

I GAT CTG AAT TAA TAA 3' og

I 5' TTA TT A ATT CAG ATC CTC TT C TGA GAT GAG TTT TT G TT C

I 10 TGA GGA GAC G 3\

I VHLYSMYC-proteindomænet, som blev udtrykt efter induktion, blev vist at I

I bindes til lysozym og til 9E1 O-antistoffet ved ELISA på følgende måde: (1) I

Falcon (3912) fladbundede brønde blev belagt med 180 pi lysozym (3 mg/ml) I

I 15 eller KLH (50 pg/ml) pr. brønd i 50 mM NaHC03, pH 9,6, og henstod ved I

I stuetemperatur natten over. (2) Brøndene blev vasket med PBS og blev bio- I

I keret i 2 timer ved 37°C med 200 pi 2% Sainsburys tørmælkspulver af I

I skummetmælk i PBS pr. brønd. (3) Blokeringsopløsningen blev hældt bort, I

I og væggene blev vasket med PBS (tre vask), og 150 pi testopløsning (su- I

I 20 pematant eller oprenset mærket domæne) blev pipetteret i hver brønd. Prø- I

ven blev inkuberet ved 37°C i 2 timer. (4) Testopløsningen blev hældt bort, I

I og brøndene blev vasket med PBS (tre vask). 100 pi af 4 pg/ml oprenset I

9E10 antistof i 2% Sainsburys tørmælkspulver af skummetmælk i PBS blev I

I tilsat og inkuberet ved 37°C i 2 timer. (5) 9E10-antistoffet blev hældt bort, I

25 brøndene blev vasket med PBS (tre vask). 100 pi af 1/500 fortynding af anti- I

I stof mod mus (peroxidasekonjugeret anti-muse Ig (Dakopats)) blev tilsat og inkuberet ved 37°C i 2 timer. (6) Det andet antistof blev hældt bort, og brøn- I dene blev vasket tre gange med PBS. (7) 100 pi 2,2'-azino-bis(3- ethylbenzthiazolinsulfonsyre) (Sigma) (0,55 mg/ml), med 1 pi 20% hydrogen- I 30 peroxid: vand pr. 10 ml) blev tilsat til hver brønd, og farven fik lov til at udvikle I i op til 10 minutter ved stuetemperatur.

πΕ"τ~"~ ~ -1 -g-· —jr;—;__'-1 _^3BMgBMMjBMKElgg6MÉ^MgPB!BS|§iWPBlEg^E^B

DK 175392 B1 57

Reaktionen blev standset ved at tilsætte 0,05% natriumazid i 50 mM citronsy* re, pH 4,3. ELISA-plader blev aflæst i en Titertek Multiscan-pladeaflæser.

5 Aktiviteterne af mutantsupernatanteme blev sammenlignet med VHLYS-supernatanten ved konkurrence med VHLYS-MYC-domænet for binding til lysozym. Resultaterne viser, at supernatant fra klon VHLYSMUT59 er mere effektiv end vildtype VHLYS-supematant ved konkurrence for VHLYSMYC.

Endvidere indicerede Western-blot af SDS-PAGE-delprøver af supernatant 10 fra VHLYS-domænet og VH-LYSMUT59-domænet (under anvendelse af antiserum mod Fv) sammenlignelige mængder af de to prøver. Under antagelse af identiske mængder af VHLYS og VHLYSMUT59 synes affiniteten af mutanten således at være større end for VHLYS-domænet.

15 For at undersøge affiniteten af VHLYSMUT59-domænet direkte blev klonen dyrket i en skala på 1 liter og 200-300 pg blev oprenset på lysozym-Sepharose som i eksem-pel 5. Ved fluorescens-quench-titrering af prøver af VHLYS og VHLYSMUT59 blev antallet af bindingssteder for lysozym bestemt. Prøverne af VHLYS og VHLYSMUT59 blev derefter sammenlignet ved 20 konkurrence, ELISA med VHLYS-MYC over to størrelsesordner. Ved konkurrenceanalysen indeholdt hver microtiterbrønd en konstant mængde VHLYSMYC (ca. 0,6 pg VHLYSMYC). Der blev tilsat varierende mængder af VHLYS eller VHLYSMUT59 (3,8 pM i lysozymbindingssteder) (0,166-25 pi). Slutvoluminet og puffer-koncentrationen i alle brønde var konstant. 9E10-25 anti-stoffet (anti-myc) blev anvendt til at kvantificere bundet VHLYSMYC i hver analysebrønd. Procent hæmning af VHLYSMYC-binding blev beregnet for hver tilsætning af VHLYS eller VHLYSMUT59 efter subtraktion af baggrundsbinding. Der blev udført dobbeltanalyser. Resultaterne indicerer, at VHLYSMUT59 har en højere affinitet for lysozym end VHLYS.

30 I DK 175392 B1

I 58 I

I VHLY$MUT59-genet blev sekventeret (efter omkloning i M13), og viste sig at I

I være identisk med VHLYS-genet med undtagelse af de centrale aminosyre- I

I rester af CDR3 (Arg-Asp-Tyr-Arg). Disse var blevet erstattet med Thr-GIn- I

I Arg-Pro: (kodet af ACACAAAGGCCA). I

I 5 I

I Et bibliotek på 2000 mutant-VH-kloner blev screenet for lysozym-binding og I

I også for KLH-binding (ved med tand-stikkere at opsamle 5 kolonier pr. brønd I

I som beskrevet i eksempel 6). Der blev identificeret 19 supematanter med I

I lysozymbindingsaktiviteter og 4 med KLH-bindingsaktiviteter. Dette indicerer, I

I 10 at nye specificiteter og forbedrede affiniteter kan afledes ved at frembringe et I

tilfældigt repertoire af CDR3. I

I EKSEMPEL 8 I

I 15 Konstruktion og ekspression af et dobbeltdomæne for lysozymbinding I

I Det resultat, at enkeltdomæner har udmærkede bindingsaktiviteter, burde I

I muliggøre konstruktionen af strenge af domæner (concatamerer). Multiple I

I specificiteter kunne således bygges ind i det samme molekyle, hvilket tillader I

20 binding til forskellige epitoper anbragt med afstand mellem domænehoveder. I

Flexible linkerområder kunne indbygges til at sprede domænerne. I princippet I

I kunne sådanne molekyler udformes til at have exceptionel specificitet og affi- I

nitet. I

I 25 To kopier af det klonede gen, som koder for det variable domæne fra tung I

I kæde, fra D1,3-antistoffet blev koblet til en nucleotidsekvens, der koder for I

en flexibel linker: I

I Gly-Gly-Gly-Ala-Pro-Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Gly-Gly-Gly- I

I 30 I

59 DK 175392 B1 (ved adskillige trin med skæring, sammenføjning og stedstyret mutagenise-ring) til frembringelse af plasmidet pSW3 (figur 20). Ekspressionen blev drevet af en lacz-promotor, og proteinet blev secerneret i det peri-plasmatiske rum via en pelB-ledersekvens (som beskrevet i eksempel 5 til ekspression af 5 pSW1 og pSW2). Proteinet kunne oprenset til homogenitet på en lysozymaf-finitetssøjle. På SDS-polyacrylamidgeler gav det et bånd med den korrekte størrelse (molekylevægt ca. 26.000). Proteinet bandt også kraftigt til lysozym, hvilket blev påvist ved ELISA (se eksempel 5) under anvendelse af anti-idiotypt antiserum rettet mod Fv-fragmentet fra D1,3-antistoffet til påvisning af 10 proteinet. Sådanne konstruktioner kan således let fremstillet og secerneres, og mindst ét af domænerne bindes til lysozym.

EKSEMPEL 9

15 Indføring af cysteinrest ved C-terminal ende i VHLYS

En cysteinrest blev indført i den C-terminale ende af VHLYS-domænet i vektoren pSW2. Cysteinen blev indført ved at spalte vektoren med restriktionsenzymerne Bstl og Smal (som udskærer den C-terminale del af J-segmentet) 20 og ligere en kort oligonucleotidduplex: 5’ GTC ACC GTC TCC TCA TGT TAA TAA 3’ og 5* TTA TTA ACA TGA GGA GAC G 3’.

25

Ved oprensning på en affinitetssøjle af lysozym-Sepharose blev det vist, at VHLYS-Cys-domænet blev udtrykt sammen det variable domæne VKLYS, men de samlede udbytter var meget lavere end vildtype Fv-fragmentet. Sammenligning af ikke-reducerende og reducerende SDS-30 polyacrylamidgeler af det oprensede Fv-Cys-protein in-dicerede, at de to VH-Cys-domæner var blevet koblet sammen gennem den indførte cysteinrest.

I DK 175392 B1 60 I EKSEMPEL 10

I Kobling af VH-domæne med enzym I

I 5

I Kobling af enzymaktiviteter til VH-domæner skulle være mulig enten ved klo- I

I ning af enzymet på enten den N-terminale eller C-terminale side af VH- I

I domænet. Eftersom begge partnere skal være aktive, er det nødvendigt at I

I udforme en passende linker (se eksempel 8) mellem de to domæner. Til se- I

I 10 cernering af VH-enzymfusionen ville man fortrinsvis anvende et enzym, som I

I sædvanligvis secerneres. I figur 21 er sekvensen af en fusion af et VH- I

I domæne med alkalisk phosphatase vist. Genet for alkalisk phosphatase blev I

klonet fra et plasmid, som bærer E. coli genet for alkalisk phosphatase, i et I

plasmid pEK48 (5Vj under anvendelse af polymerasekædereaktionen. Genet I

I 15 blev opformeret med primerne: I

I 5’ CAC CAC GGT CAC CGT CTC CTC ACG GAC ACC AGA AAT GCC

I TGT TCT G 3’ og I 20 5’ GCG AAA ATT CAC TCC CGG GCG CGG TTT TAT TTC 3'.

I Genet blev indført i vektoren pSW1 ved at skære med BstEII og Smal. Kon- I

I struktionen (figur 21) blev udtrykt i E. coli stamme BMH71-18 som i eksempel I

I 5 og blev screenet for phosphataseaktivitet med 1 mg/mi p- I

I 25 nitrophenylphosphat som substrat i 10 mM diethanolamin og 0,5 mM MgCI2, pH 9,5, og også på SDS-polyacrylamidgeler, som havde undergået et We- I stern-blot (påvisning med anti-idiotypt antiserum). Der blev ikke fundet be-vis I for secerneringen af koblingen VHLYS-alkalisk phosphatase som påvist ved I Wéstem-blot (se eksempel 5) eller for secernering af phosphataseaktivitet.

I 30 61 DK 175392 B1

Men når konstruktionen blev overført ved transfektion i en bakteriestamme BL21DE3 (52), som er defekt i protease, blev der påvist et bånd af den korrekte størrelse (såvel som nedbrudte produkter) på Western-blot. Endvidere kunne phosphataseaktivitet nu blive påvist i bakteriesupematanten. En sådan 5 aktivitet er ikke til stede i supernatant fra den stamme, som ikke var blevet transficeret med konstruktionen.

En række linkersekvenser kunne derefter indføres ved genkendelsesstedet for BstEII til at forbedre afstanden mellem de to domæner.

10 EKSEMPEL 11

Coekspression af VH-domæner med Vkappa-repertoire: 15 Et repertoire af Vkappa-gener blev afledt ved PCR under anvendelse af prime-re som beskrevet i eksempel 2 fra DNA fremstillet fra musemilt og også fra musemilt-mRNA under anvendelse af primerne VK3FOR og VK2BACK og en cyklus på 94°C i 1 minut, 60°C i 1 minut, 72°C i 2 minutter. Det ved PCR op-formerede DNA blev fraktioneret på agarosegelen, båndet blev udskåret og 20 klonet i en vektor, som bærer VHLYS-domænet (fra D1.3-antistoffet) og et kloningssted (Sacl og Xhol) til kloning af variable domæner fra den lette kæde med en myc-hale (pSW1 VHLYS-VKPOLYMYC, figur 22).

Kloner blev screenet for lysozymbindingsaktiviteter som beskrevet i eksem-25 pierne 5 og 7 via myc-mærkningen på det variable område på den lette kæde, da dette skulle muliggøre identifikation af følgende typer af V^ppa-domæner: (1) De, der bindes til lysozym i fra-vær af VHLYS-domænet. (2)

De, der associerer med den tunge kæde og ikke bidrager til binding af lysozym. (3) De, der associerer med den tunge kæde og også bidrager til binding 30 af lysozym (enten hjælper eller hæmmer).

I DK 175392 B1 I 62

Dette ville ikke identificere de Vkappa-domæner, som associerede med VHLYS-domænet og fuldstændig ødelagde dets binding til lysozym.

Η I et yderligere forsøg blev VHLYS-domænet erstattet med det variable do- I

I 5 mæne VH3 fra de tunge kæde, der var blevet isoleret fra repertoiret (se ek- I

sempel 6), og derefter blev V^ppa-domænerne klonet i vektoren. (Bemærk at VH3-domænet har et indre genkendelsessted for Sacl, og dette blev først

fjernet for at muliggøre kloningen af Vkappa-repertoiret som Sacl-Xhol- I

fragmenter). I

10

H Ved at screene supernatanten med den ELISA, der er beskrevet i eksempel I

I 6, vil bakterielle supernatanter, som binder lysozym, blive identificeret. I

I EKSEMPEL 12 I 15

I Høj ekspression af VH-domæner I

I Ved at screene adskillige kloner fra et VH-bibliotek afledt fra en muse, som I

I var immuniseret med lysozym, via et Western-blot og under anvendelse af I

I 20 9E1 O-antistoffet rettet mod peptidmærkningen, blev der bemærket en klon I

I med meget høje ekspressionsniveauer af domænet (beregnet til 25-50 I

mg/liter). Klonen blev sekventeret for at bestemme naturen af sekvensen. I

I Sekvensen viste sig at være nært beslægtet med sekvensen af VHLYS- I

I domænet med undtagelse af nogle få ami-nosyreændringer (figur 23). Resul- I

I 25 tatet var uventet og viste, at et begrænset antal aminosyreændringer, måske I

I endog en enkelt aminosyresubstitution, kan frembringe meget hævede ni- I

I veauer af ekspression. I

I Ved at frembringe mutationer i det højt udtrykte domæne ved disse aminosy- I

I 30 rerester, viste det sig, at en enkelt aminosyreændring i VHLYS-domænet I

63 DK 175392 B1 (Asn 35 til His) er tilstrækkelig til at bevirke, at domænet bliver udtrykt ved høje niveauer.

KONKLUSION

5

Det fremgår således, at den foreliggende opfindelse muliggør kloning, ampli-fikation og ekspression af sekvenser, som koder for variable domæner fra tung kæde og let kæde, på en meget mere enkel måde end det tidligere var muligt. Det er også blevet vist, at isolerede variable domæner eller sådanne 10 domæner koblet til effektormolekyler er uventet nyttige.

Det skal forstås, at den foreliggende opfindelse er blevet beskrevet ved hjælp af eksempler, og at variationer og modifikationer kan foretages af en fagmand uden at afvige fra opfindelsens rækkevidde.

15

I DK 175392 B1 I

I 64 I

I REFERENCER I

I (1) Inbar et al., PNAS-USA, 69, 2659-2662,1972. I

I (2) Amit et al., Science, 233,747,1986. I

I 5 (3) Satowetal., J. Mol. Biol., 190,593, 1986. . I

I (4) Colman et al., Nature, 326,358,1987. I

I (5) Sheriff et al., PNAS-USA, 84, 8075-8079, 1987. I

I (6) Padlan et al., PNAS-USA, 86, 5938-5942,1989. I

I (7) Skerra og Pltickthun, Science, 240,1038-1041,1988. I

I 10 (8) Bird et al., Science, 242,423-426,1988. I

I (9) Hustonetal., PNAS-USA, 85,5879-5833,1988. I

I (10) Fleischman, Arch. Biochem. Biophys. Suppl., 1, 174,1966. I

I (11) Porter og Weir, J. Cell. Physiol. Suppl., 1, 51,1967. I

I (12) Jaton et al., Biochemistry, 7,4185, 1968. I

I 15 (13) Rockey, J. Exp. Med., 125,249,1967. I

I (14) Stevenson, Biochem. J., 133,827-836,1973. I

I (15) Edmundson et al., Biochemistry, 14, 3953,1975. I

I (16) Rossman et al., Nature, 317,145-153,1985. I

I (1Z) Saiki et al., Science, 230,1350-1354, 1985. I

I 20 (18) Larrick et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 160,1250,1989. I

I (19) Orlandi et al., PNAS-USA, 86,3833, 1989. I

I (20) Yon og Fried, Nuc. Acids Res., 17, 4895,1989. I

I {2Λ) Fields og Song, Nature, 340,245-246,1989. I

I (22) Baldwin dg Schultz, Science, 245,1104-1107,1989. I

I 25 (23) Menard et al., Cancer Res., 43,1295-1300,1983. I

I (24) Bosslet et al., Eur. J. Nuc. Med., 14, 523-528,1988. I

I (25) Bosslet et al., Cancer Immunol. Immunother., 23,185-191,1986. I

I (26) Bosslet al., Int. J. Cancer, 36,75-84,1985. I

I m I

I 30 (28) Bremer et al., J. Biol. Chem., 259.14773-14777,1984. I

65 DK 175392 B1 (29) Griffiths og Milstein, Hybridoma Technology in the Biosciences and Medicine, 103-115, 1985.

(30) Maniatis et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

5 (31) Jones et al., Nature, 321, 522-525,1986.

(32) Zoller og Smith, Nuc. Acids Res., 10, 6457-6500,1982.

(33) Carter et al., Nuc. Acids Res., 13, 4431-4443,1985.

(34) Sanger et al., PNAS-USA, 74, 5463-5467,1977.

(35) Yannisch-Perron et al.. Gene, 33,103-119,1985.

10 (36) (37) Riechmann et al., Nature, 332, 323-327,1988.

(38) Kearney et al., J. Immunol., 123,1548-1550,1979.

(39) Potter et al., PNAS-USA, 81, 7161-7163, 1984.

(40) Galfre og Milstein, Meth. Enzym., 73,1-46,1981.

15 (41) Laemmli, Nature, 227, 680-685, 1970.

(42) Better et al., Science, 240,1041, 1988.

(43) Lei et al., J. Bacteriol., 169, 4379, 1987.

(44) Verhoeyen et al., Science, 239,1534,1988.

(45) Gronenborn, Mo). Gen. Genet., 148, 243, 1976.

20 (46) Dagert et al., Gene, 6, 23, 1974.

(£7) Hanahan, J. Mol. Biol., 166, 557, 1983.

(48) Jones et al., Nature, 321,522, 1986.

(49) Segal, Enzyme Kinetics, 73, Wiley, New York, 1975.

(50) Gutfreund, Enzymes, Physical Principles, Wiley Interscience, London, 25 1972.

(51) Chaidaroglou, Biochem., 27, 8338,1988.

(52) Grodberg og Dunn, J. Bacteriol., 170,1245-1253,1988.

Claims (34)

1. Fremgangsmåde til kloning af sekvenser {målsekvenser), der hver inde- I I holder en sekvens, som koder for i det mindste en del af et immunoglobulin- I I 5 variabelt domæne, kendetegnet ved, at der tilvejebringes et prøverepertoire I I af nucleinsyrer indeholdende målsekvenser og anvendes fremad- og tilbage- I I primere ved fremgangsmåden til kopiering og kloning af målsekvenseme til I I ekspression af et repertoire af proteiner, der hvert omfatter i det mindste en I I del af et immunoglobulin-variabelt domæne, hvorved fremad-primeren er I I 10 specifik for en sekvens ved eller op til 3-enden af sense-strengen af hver af I I målsekvenserne, og tilbage-primeren er specifik for en sekvens ved eller op I I til 3-enden af antisense-strengen af hver af målsekvenseme. I

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man I I 15 (a) tilvejebringer et prøverepertoire af dobbeltstrenget nucleinsyre indehol- I I dende målsekvenser; I I (b) får de to strenge af den dobbeltstrengede nucleinsyre ti) at adskilles; I I (c) annealer en fremad- og en tilbage-oligonucleotid-primer til prøven, hvor I I fremad-primeren er specifik for en sekvens ved eller op til 3-enden af I I 20 sense-strengen af hver af målsekvenserne, og tilbage-primeren er spe- I I cifik for en sekvens ved eller op til 3’-enden af antisense-strengen af I I hver af målsekvenseme, under betingelser, som tillader primerne at I I hybridisere specifikt til nucleinsyren; I I (d) behandler den annealede prøve med et DNA-polymerase-enzym i nær- I I 25 vær af deoxynucleosidtriphosphater under betingelser, som får primer- I I forlængelse til at finde sted, således at der frembringes dobbeltstrenget I I nucleinsyre; I I (e) gentager trin (b) til (d), således at der frembringes noget dobbeltstren- I I get DNA (produkt-DNA), der kun indeholder målsekvenseme; I 67 DK 175392 B1 (f) kloner produkt-DNA ind i ekspressionsvektorer til ekspression af et repertoire af proteiner, der hver omfatter i det mindste en del af et immu-noglobulin-variabelt domæne.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at trin (b) til (d) gentages flere gange fortrin (f).

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man (a) tilvejebringer et repertoire af mRNA; 10 (b) annealer en oligonucleotid-primer, der er specifik for en sekvens ved eller op til 3'-enden af hver af målsekvenseme på sense-strengene til mRNA'en under betingelser, som tillader primeren at hybridisere specifikt til nucleinsyren; (c) behandler den primer-annealede mRNA med et polymerase-enzym i 15 nærvær af deoxynucleosidtriphosphater under betingelser, som får pri mer-forlængelse til at finde sted, således at der frembringes antisense-cDNA; (d) annealer en oligonucleotid-primer, der er specifik for en sekvens ved eller op til 3-enden af hver af målsekvenseme på antisense-strengene 20 til cDNA’en under betingelser, som tillader primeren at hybridisere spe cifikt til nucleinsyren; (e) behandler den primer-annealede cDNA med et polymerase-enzym i nærvær af deoxynucleosidtriphosphater under betingelser, som får primer-forlængelse til at finde sted, således at der frembringes dobbelt- 25 strenget DNA (produkt-DNA); (f) kloner produkt-DNA ind i ekspressionsvektorer til ekspression af et repertoire af proteiner, der hvert omfatter i det mindste en del af et immu-noglobulin-variabelt domæne.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at der efter trin (e) gen nemføres følgende trin før trin (f): I DK 175392 B1 I I 68 I I (i) man får de to strenge af produkt-DNA'en til at adskilles; I I (ii) man annealer en fremad- og en tilbage-oligonucleotid-primer til de ad- I I skilte strenge, hvor fremad-primeren er specifik for en sekvens ved eller op til I I 3-enden af sense-strengen af hver af målsekvenserne, og tilbage-primeren I 5 er specifik for en sekvens ved eller op til 3'-enden af antisense-strengen af I I hver af målsekvenseme under betingelser, som tillader primerne at hybridise- I I re specifikt til nucleinsyren; I I (iii) man behandler den annealede prøve med et DNA-polymerase-enzym i I I nærvær af deoxynucleosidtriphosphater under betingelser, som får primer- I I 10 forlængelse til at finde sted, således at der frembringes dobbeltstrenget I nucleinsyre. I

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet I I ved, at tilbage-primeren er specifik for en sekvens ved eller op til 3-enden af I I 15 antisense-strengen af de sekvenser, som er indeholdt i målsekvenseme, og I I som hver koder for i det mindste en del af et immunoglobulin-variabelt do- I mæne. I

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, kendetegnet I I 20 ved, at prøverepertoiret af dobbeltstrenget nucleinsyre er afledt fra lympho- I I cytter. I

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at lymphocytteme er af- I I ledt fra et dyr eller menneske, som har fået påført et immunrespons over for I 25 et antigen. I

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at lymphocytteme er af- I I ledt fra en patient med en autoimmun sygdom. I ΙΓΤΈΓΊ Μ Ill Ι·| || . Ί il I -' ” ~ ' —— Μ'ΙίΙΡ—Β DK 175392 Β1 69

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at prøverepertoiret af nucleinsyrer er afledt fra omarrangerede gener for immunoglobulin-variabelt område.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at prøverepertoiret af nucleinsyrer er genomisk DNA.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at prøverepertoiret af nucleinsyrer er afledt fra ikke-omarrangerede gener for immunoglobulin- 10 variabelt område.

13. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-12, kendetegnet ved, at målsekvensen indeholder en sekvens, som koder for et variabelt domæne fra en immunoglobulin-tung kæde. 15

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet ved, at produkt-DNA'en indsættes i en ekspressionsvektor til ekspression af enkelt-domæne-ligander, som er selekterbare ved deres bindingsaffinitet for antigen.

15. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-13, kendetegnet ved, at produkt-DNA indsættes i en ekspressionsvektor til ekspression af antistoffer eller antistoffragmenter, der er selekterbare ved deres bindingsaffinitet for antigen.

16. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-13, kendetegnet ved, at produkt-DNA'en indsættes i en ekspressionsvektor til ekspression alene.

17. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-13, kendetegnet 30 ved, at produkt-DNA'en indsættes i en ekspressionsvektor til ekspression i kombination med et komplementært variabelt domæne. I DK 175392 B1 I I 70 I

18. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-13, kendetegnet I I ved, at produkt-DNA'en indsættes i en ekspressionsvektor, der allerede in- I I deholder sekvenser, som koder for et eller flere konstante domæner til eks- I I 5 pression. I

19. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-13, kendetegnet I I ved, at produkt-DNA'en indsættes i en ekspressionsvektor til ekspression I I som fusionsproteiner. I I 10 I

20. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-13, kendetegnet I I ved, at produkt-DNA’en indsættes i en ekspressionsvektor til ekspression I I med peptid-tags. I I 15

21. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-13, kendetegnet I I ved, at produkt-DNA indeholdende sekvenser, som koder for i det mindste I I immunoglobulin-tung kæde-variable domæner og produkt-DNA indeholdende I I sekvenser, som koder for i det mindste immunoglobulin-let kæde-variable I I domæner indsættes i ekspressionsvektorer til ekspression af et kombinato- I I 20 risk repertoire af komplementære variablé domæner. I

22. Fremgangsmåde ifølge krav 21, kendetegnet ved, at produkt-DNA’en I I indsættes i en ekspressionsvektor, der allerede indeholder sekvenser, som I I koder for et eller flere konstante domæner til ekspression. I I 25 I

23. Fremgangsmåde ifølge krav 21, kendetegnet ved, at produkt-DNA ind- I I sættes i ekspressionsvektorer til ekspression som fusionsproteiner. I

24. Fremgangsmåde ifølge krav 21, kendetegnet ved, at produkt-DNA’en I I 30 indsættes i en ekspressionsvektor til ekspression med peptid-tags. I r 11 \ DK 175392 B1 71

25. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-24, kendetegnet ved, at fremad- og tilbage-primerne tilvejebringes som enkelte oligonucleoti-der.

26. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-24, kendetegnet ved, at fremad-primeme tilføres som en blanding af oligonucleotider.

27. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-24, kendetegnet ved, at tilbage-primerne tilføres som en blanding af oligonucleotider. 10

28. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-27, kendetegnet ved, at hver primer inkluderer en sekvens, som koder for et restriktionsenzym-genkendelsessted.

29. Fremgangsmåde ifølge krav 28, kendetegnet ved, at restriktionsenzym genkendelsesstedet er beliggende i den sekvens, som anneales til nucleinsy-ren.

30. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at tilbage-primeren er 20 en almen primer, der er nyttig til kloning af en ønsket antistofspécificitet fra en specifik art.

31. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at tilbage-primeren er en blanding af primere med en række forskellige sekvenser, der er udformet 25 til at være komplementære til de forskellige familier af VH-, Vk- eller V-sekvenser.

32. Ekspressionsbibliotek omfattende et repertoire af nucleinsyresekvenser til ekspression af et repertoire af proteiner, der hvert omfatter et immunoglobu- 30 lin-variabelt domæne. i I DK 175392 B1 I I 72 I

33. Ekspressionsbibliotek omfattende et repertoire af nucleinsyresekvenser til I I ekspression af et repertoire af proteiner, der hvert omfatter et immunoglobu- I I lin-tung kæde-variabelt domæne, hvor nucleinsyresekvenserne hver yderlige- I I re koder for et immunoglobulin-let kæde-variabelt domæne til ekspression I I 5 med det nævnte tung kæde-variable domæne til frembringelse af antistoffer I I eller antistoffragmenter, der er selekterbare ved deres bindingsaffinitet til an- I I tigen. I

34. Ekspressionsbibliotek omfattende et repertoire af tredie CDR-sekvenser, I I 10 hvilke sekvenser er beliggende i et ellers invariant VH-gen. I