CN101605814B

CN101605814B - 经工程改造的抗tslp抗体

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Publication number: CN101605814B
Application number: CN200780051241.7A
Authority: CN
Inventors: L·G·普雷斯塔; R·德瓦尔马莱菲特
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 2006-12-14
Filing date: 2007-12-13
Publication date: 2014-02-19
Anticipated expiration: 2027-12-13
Also published as: MX2009006471A; AU2007334499B2; WO2008076321A1; BRPI0720271A2; NO20092652L; CA2671538A1; EP2628752A1; US20130004508A1; CN101605814A; JP2013031441A; JP2010512746A; EP2129690A1; ZA200904078B; US8512705B2; US20100166766A1; AU2007334499A1; US8232372B2; KR20090088950A; US20130004503A1; AR096895A2

Abstract

本发明涉及能特异性结合人TSLP的结合化合物及其用途，例如在治疗炎性疾病中的用途。

Description

经工程改造的抗TSLP抗体

发明领域

本发明主要涉及胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)特异性抗体及其应用，特别是在炎性疾病和过敏性炎性疾病中的应用。

发明背景

免疫系统起到保护个体免遭传染物如细菌、多细胞生物和病毒以及免遭癌症的作用。这个系统包括几种类型的淋巴样细胞和髓样细胞，如单核细胞、巨噬细胞、树突细胞(DC)、嗜酸性粒细胞、T细胞、B细胞和嗜中性粒细胞。这些淋巴样细胞和髓样细胞常常产生称为细胞因子的信号转导蛋白。免疫应答包括炎症，即免疫细胞在全身或身体特定部位的集聚。为响应传染物或外来物质，免疫细胞会分泌细胞因子，而后者会调节免疫细胞增殖、发育、分化或迁移。免疫应答例如当涉及到过度发炎时，可产生病理后果，这比如在过敏性炎性疾病中出现。

TSLP是一种免疫细胞因子，能诱导树突细胞介导的具有前同种基因(proallogenic)表型的CD4⁺T细胞应答(Gilliet et al.，J.Exp.Medicine 197(8)：1059-1063(2003)。TSLP参与到过敏性炎症的引发(Watanabe et al.，Nature Immunology 5：426-434(2004)；Soumelis et al.，Nature Immunology 3：673-680(2002))。

正在开发抗体，来抗击多种参与免疫疾病的抗原靶标。体内使用抗体作为治疗药剂的最显著局限在于抗体的免疫原性。由于大多数单克隆抗体是衍自啮齿动物，在人体中反复使用会导致产生抗治疗性抗体的免疫应答。这种免疫应答小则导致治疗功效的损失，大则导致潜在的致命性过敏应答。最初所作的减少啮齿动物抗体免疫原性的努力，涉及到产生嵌合抗体，其中小鼠可变区与人恒定区融合。Liu等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-43。但是，注射人可变区和小鼠恒定区的杂合体的小鼠，发展出针对人可变区的强烈抗抗体应答，这提示在这种嵌合抗体中保持完整啮齿动物Fv区，仍可能会在患者中导致有害的免疫原性。

一般认为，可变结构域的互补决定区(CDR)环包含有抗体分子的结合位点。因此，尝试了将啮齿动物CDR环移植到人构架(即人源化)，以使啮齿动物序列进一步减到最少。Jones等人(1986)Nature 321：522；Verhoeyen等人(1988)Science 239：1534。但是，CDR环交换可能并不始终如一地导致产生具有与起始抗体相同的结合特性的抗体。还可能需要改变人源化抗体中的构架残基(FR)，即参与CDR环支持的残基，以保持抗原结合亲和力。Kabat等人(1991)J.Immunol.147：1709。尽管CDR移植和构架残基保持在多种人源化抗体构建物中的应用已有报道，但难以预测特定的序列是否会导致抗体具有期望的结合特性，有时是具有生物特性。参见例如Queen等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029，Gorman等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4181和Hodgson(1991)Biotechnology(NY)9：421-5。

本发明提供经工程改造的TSLP抗体，及其治疗炎性疾病特别是过敏性炎性疾病的用途。

发明概述

本发明提供能特异性结合人和食蟹猴(cynomolgus monkey)TSLP的结合化合物，所述结合化合物包含：至少一个抗体重链可变区或其TSLP结合片段，所述重链可变区包含至少一个选自SEQ ID NO：1、2和3的CDR序列；或者至少一个抗体轻链可变区或其TSLP结合片段，所述轻链可变区包含至少一个选自SEQ ID NO：4、5和6的CDR序列。

本发明还提供能特异性结合人和食蟹猴TSLP的结合化合物，所述结合化合物包含至少一个抗体重链可变区或其TSLP结合片段，所述重链可变区包含至少一个选自SEQ ID NO：1、2和3的CDR序列；和至少一个抗体轻链可变区或其TSLP结合片段，所述轻链可变区包含至少一个选自SEQ ID NO：4、5和6的CDR序列。

在一些实施方案中，抗体重链可变区或其TSLP结合片段包含至少两个选自SEQ ID NO：1、2和3的CDR序列。在其他实施方案中，抗体重链可变区或其TSLP结合片段具有SEQ ID NO：1、2和3所示的三个CDR序列。

在一些实施方案中，抗体轻链可变区或其TSLP结合片段包含至少两个选自SEQ ID NO：4、5和6的CDR序列。在其他实施方案中，抗体轻链可变区或其TSLP结合片段具有SEQ ID NO：4、5和6所示的三个CDR序列。

本发明还提供能特异性结合人和食蟹猴TSLP的结合化合物，所述结合化合物包含：至少一个抗体重链可变区或其TSLP结合片段，所述重链可变区包含SEQ ID NO.1的CDR-H1或其变体、SEQ ID NO.2的CDR-H2或其变体和SEQ ID NO.3的CDR-H3或其变体；或者至少一个抗体轻链可变区或其TSLP结合片段，所述轻链可变区包含SEQ ID NO.4的CDR-L1或其变体、SEQ ID NO.5的CDR-L2或其变体和SEQ ID NO.6的CDR-L3或其变体。本发明还提供能特异性结合人和食蟹猴TSLP的结合化合物，所述结合化合物包含至少一个抗体重链可变区或其TSLP结合片段，所述重链可变区包含SEQ IDNO.1的CDR-H1或其变体、SEQ ID NO.2的CDR-H2或其变体和SEQID NO.3的CDR-H3或其变体；和至少一个抗体轻链可变区或其TSLP结合片段，所述轻链可变区包含SEQ ID NO.4的CDR-L1或其变体、SEQ ID NO.5的CDR-L2或其变体和SEQ ID NO.6的CDR-L3或其变体。在一个实施方案中，变体包含最多20个保守修饰的氨基酸残基。在一个实施方案中，变体包含最多10个保守修饰的氨基酸残基。在一个实施方案中，变体包含最多5个保守修饰的氨基酸残基。在一个实施方案中，变体包含最多3个保守修饰的氨基酸残基。

在上述的结合化合物的一些实施方案中，重链可变区的全部或实质上全部剩余部分完全是或实质上完全是人Ig区；轻链可变区的全部或实质上全部剩余部分完全是或实质上完全是人Ig区。在优选的实施方案中，重链可变区的剩余部分是人重链氨基酸序列，轻链可变区的剩余部分是人轻链氨基酸序列。

本发明还提供能特异性结合人和食蟹猴TSLP的结合化合物，所述结合化合物包含：包含SEQ ID NO：10的残基1-116或其变体的重链可变区；和包含SEQ ID NO：12的残基1-108或其变体的轻链可变区。在一个实施方案中，变体包含最多20个保守修饰的氨基酸残基。在一个实施方案中，变体包含最多10个保守修饰的氨基酸残基。在一个实施方案中，变体包含最多5个保守修饰的氨基酸残基。在一个实施方案中，变体包含最多3个保守修饰的氨基酸残基。在一个实施方案中，轻链可变区包含其中SEQ ID NO：12的第49位处的氨基酸已从Y改变成K的变体。

本发明还提供能特异性结合人和食蟹猴TSLP的结合化合物，所述结合化合物包含：包含SEQ ID NO：10的残基1-116的重链可变区；和包含SEQ ID NO：12的残基1-108的轻链可变区。

本发明还提供能特异性结合人和食蟹猴TSLP的结合化合物，所述结合化合物包含：实质上由SEQ ID NO：10的残基1-116组成的重链可变区；和实质上由SEQ ID NO：12的残基1-108组成的轻链可变区。

本发明还提供能特异性结合人和食蟹猴TSLP的结合化合物，所述结合化合物包含：与SEQ ID NO：10的残基1-116具有至少95％、90％、85％或80％同源性的重链可变区；和/或与SEQ ID NO：12的残基1-108具有至少95％、90％、85％或80％同源性的轻链可变区。在一个实施方案中，本发明提供能特异性结合人和食蟹猴TSLP的结合化合物，所述结合化合物包含：与SEQ ID NO：10的残基1-116具有至少90％同源性的重链可变区；和与SEQ ID NO：12的残基1-108具有至少90％同源性的轻链可变区。在一些实施方案中，重链可变区将包含与SEQ ID NO：10的残基1-116至少90％的同源性；轻链可变区将包含与SEQ ID NO：12的残基1-108至少90％的同源性。

在一些实施方案中，本发明的结合化合物还包含重链恒定区和/或轻链恒定区。在一个实施方案中，重链恒定区包含γ1、γ2、γ3或γ4人重链恒定区或其变体。在各个实施方案中，轻链恒定区包含λ或κ人轻链恒定区。

在一些实施方案中，本发明的结合化合物是抗体或其抗原结合片段。在各个实施方案中，本发明的抗体或其片段是多克隆的、单克隆的、嵌合的、食蟹猴源化的(cyno-ized)、人源化的或完全人的。在一个优选的实施方案中，抗体是人源化抗体或其片段。

本发明还设想到，结合片段是选自Fab、Fab’、Fab’-SH、Fv、scFv、F(ab’)₂和双抗体(diabody)的抗体片段。本发明还设想到，结合化合物是纳米抗体(nanobody)、亲和体(avimer)或适体(aptimer)。

在一个优选的实施方案中，结合化合物是由保藏号为PTA-7951的杂交瘤产生的抗体。在另一个实施方案中，结合化合物不是由保藏号为PTA-7951的杂交瘤产生的抗体。

本发明还涵盖能特异性结合人和食蟹猴TSLP的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：18的重链氨基酸序列或其变体；和/或SEQ ID NO：17的轻链氨基酸序列或其变体。本发明还涵盖能特异性结合人和食蟹猴TSLP的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：18的氨基酸19-472或其变体；和/或SEQ ID NO：17的氨基酸20-233或其变体。在一个实施方案中，变体包含最多20个保守修饰的氨基酸残基。在一个实施方案中，变体包含最多10个保守修饰的氨基酸残基。在一个实施方案中，变体包含最多5个保守修饰的氨基酸残基。在一个实施方案中，变体包含最多3个保守修饰的氨基酸残基。

本发明还包含能特异性结合人和食蟹猴TSLP的结合化合物，其中所述结合化合物用KinExA技术和以人TSLP为配体测量出其KD为约2.1pM或以下。本发明还包含能特异性结合人和食蟹猴TSLP的结合化合物，其中所述结合化合物用KinExA技术和以人TSLP为配体测量出其KD为2.1pM(+/-两倍)。在一个实施方案中，结合化合物是人源化抗TSLP抗体或其抗原结合片段。

本发明还包含能特异性结合人和食蟹猴TSLP的结合化合物，其中所述结合化合物用表面等离振子共振和以人TSLP为配体测量出其KD为约111pM或以下。本发明还包含能特异性结合人和食蟹猴TSLP的结合化合物，其中所述结合化合物用表面等离振子共振和以人TSLP为配体测量出其KD为111pM(+/-两倍)。在一个实施方案中，结合化合物是人源化抗TSLP抗体或其抗原结合片段。

本发明还包含能特异性结合人和食蟹猴TSLP的结合化合物，其中所述结合化合物其EC50为约7.6nM或以下。本发明还包含能特异性结合人和食蟹猴TSLP的结合化合物，其中所述结合化合物其EC50为约7.6nM(+/-两倍)。(EC50指为将人TSPL中和至结合化合物不存在下所观察到的水平的50％所需的结合化合物浓度。)在一个实施方案中，结合化合物是人源化抗TSLP抗体或其抗原结合片段。

本发明还提供编码本发明结合化合物的重链可变区或轻链可变区中的至少一个的分离核酸。还提供包含与控制序列可操作地连接的核酸的表达载体，所述控制序列在宿主细胞用所述载体转染时能被宿主细胞识别。还提供包含表达载体的宿主细胞。

还提供产生包含本发明的重链可变区或轻链可变区的多肽的方法，所述方法包括：在其中核酸序列得以表达的条件下在培养基中培养宿主细胞，从而产生包含所述轻链和重链可变区的多肽；和从宿主细胞或培养基回收多肽。

本发明还提供能特异性结合被由保藏号为PTA-7951的杂交瘤产生的抗体所结合的人TSLP上的表位的结合化合物(例如抗体或其抗原结合片段)，其中所述能特异性结合人TSLP上的表位的抗体不是由保藏号为PTA-7951的杂交瘤产生的抗体。

本发明还提供能竞争性抑制由保藏号为PTA-7951的杂交瘤产生的抗体对人TSLP的结合的结合化合物(例如抗体或其抗原结合片段)，其中所述能竞争性抑制结合的抗体不是由保藏号为PTA-7951的杂交瘤产生的抗体。

本发明还包含能阻断TSLP介导的活性的结合化合物(例如抗体或其抗原结合片段)。TSLP介导的活性包括但不限于：与其受体结合、促进树突细胞的活化而导致T_H2细胞的增殖或存活、树突细胞分泌能吸引T_H2的趋化因子如TARC和MDC，产生促过敏细胞因子如IL-4、IL-5、IL-13和TNF-α。有多种测定法可用来测定结合化合物是否阻断TSLP介导的活性。这些测定法包括实施例中描述的测定法和其他测定法，包括本领域描述的那些测定法在内。参见例如Reche等人，J.Immunol.167：336-43(2001)；Isaksen等人，J.Immunol.168：3288-94(2002)。

在一个实施方案中，结合化合物在交叉阻断测定法中能够阻断TSLP与TSLPR的结合。

本发明涵盖抑制人受试对象(subject)中的免疫应答的方法，所述方法包括将能特异性结合人和食蟹猴TSLP的结合化合物，以能有效阻断TSLP的生物活性的量给予有需要的受试对象。本发明还设想到给予另外的免疫抑制剂或抗炎剂。在一个优选的实施方案中，免疫应答是哮喘。在另一个优选的实施方案中，免疫应答是过敏性炎症。在另一个优选的实施方案中，过敏性炎症是过敏性鼻窦炎、过敏性哮喘、过敏性结膜炎或特应性皮炎。在另一个优选的实施方案中，免疫应答是纤维样变性、炎性肠病或何杰金氏淋巴瘤。在另一个优选的实施方案中，将结合化合物与另一免疫调节剂组合给予。

本发明的抗体或其片段可在包含本发明结合化合物和与之组合的药物可接受载体或稀释剂的组合物中。在又一个实施方案中，组合物还包含免疫抑制剂或抗炎剂。

本发明还涵盖包含本发明结合化合物和药物可接受载体或稀释剂的组合物。

本发明涵盖编码本发明抗体或其片段的多肽序列的分离核酸。该核酸可与控制序列可操作地连接在表达载体中，所述控制序列能被转染有该载体的宿主细胞识别。还涵盖包含该载体的宿主细胞，和产生多肽的方法，所述方法包括在核酸序列得以表达的条件下培养宿主细胞，从而产生多肽，并从宿主细胞或培养基回收多肽。

在各个实施方案中，本发明涉及包含本发明抗体或其片段的药物。例如，本发明涵盖能特异性结合人和食蟹猴TSLP的结合化合物(例如任何一个本发明结合化合物)用于制备治疗/抑制免疫应答的药物的用途。本发明涵盖能特异性结合人和食蟹猴TSLP的结合化合物(例如任何一个根据本发明的结合化合物)用于制备治疗哮喘的药物的用途。本发明涵盖能特异性结合人和食蟹猴TSLP的结合化合物(例如任何一个根据本发明的结合化合物)用于制备治疗炎性疾病的药物的用途。在一个实施方案中，炎性疾病是过敏性炎性疾病。在一个实施方案中，过敏性炎性疾病是过敏性鼻窦炎、过敏性哮喘、过敏性结膜炎或特应性皮炎。

发明详述

本文及所附权利要求书中用到的名词形式上看似单数，但却包含其相应的复数指代，除非上下文清楚表明并非如此。本文中引述的所有参考文献都通过引用并入本文，犹如每个单独的出版物、专利申请或专利都具体地和单独地被指出通过引用并入本文。

I.定义

“活化”、“刺激”和“治疗”当应用于细胞或受体时，可具有相同的含义，例如用配体对细胞或受体进行的活化、刺激或治疗，除非上下文表明或者明确地表明并非如此。“配体”涵盖天然和合成配体，例如细胞因子、细胞因子变体、类似物、突变蛋白(mutein)和衍自抗体的结合组合物(binding composition)。“配体”还涵盖小分子，例如细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。“活化”可指由内部机制调节的细胞活化，也可指由外部或环境因素调节的细胞活化。例如细胞、组织、器官或生物体的“应答”，涵盖生化或生理行为的变化，所述生化或生理行为例如生物区室(compartment)当中的浓度、密度、黏附或迁移情况，基因表达的速度，或者分化的状态，其中该变化与活化、刺激或治疗相关，或者与内部机制如遗传编程相关。

分子的“活性”可描述或者指分子与配体或与受体的结合，指催化活性；指刺激基因表达或细胞信号转导、分化或成熟的能力；指抗原活性，指对其他分子的活性的调节，等等。分子的“活性”还可指调节或维持细胞间相互作用(例如黏附)的活性，或者维持细胞的结构(例如细胞膜或细胞骨架)的活性。“活性”也可指比活，例如[催化活性]/[mg蛋白质]或[免疫活性]/[mg蛋白质]，生物区室中的浓度，等等。“增殖活性”涵盖对例如正常细胞分裂以及癌症、肿瘤、发育异常、细胞转化、转移和血管发生具有促进作用、具有必要性或具有明确相关性的活性。

“给予”和“治疗”当应用于动物、人、实验受试对象、细胞、组织、器官或生物流体时，指将外源的药剂或组合物、治疗剂或组合物、诊断剂或组合物与该动物、人、受试对象、细胞、组织、器官或生物流体进行接触。“给予”和“治疗”可例如指治疗方法、药代动力学方法、诊断方法、研究方法和实验方法。对细胞的治疗涵盖试剂(reagent)与细胞的接触以及试剂与流体的接触，其中该流体与该细胞处于接触状态。“给予”和“治疗”还可意指某细胞通过试剂、诊断剂、结合组合物或通过另一细胞进行的体外(in vitro)和离体(ex vivo)治疗。“治疗”当应用于人受试对象、兽医受试对象或研究受试对象时，指医疗性治疗、预防性或防止性措施，指研究和诊断应用。

本文所用的术语“抗体”指任何形式的能显示期望生物活性的抗体或其片段。因此，它以最广义的含义使用，具体覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体在内)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们能显示期望的生物活性。

本文所用的术语“TSLP结合片段”或者“其结合片段”，涵盖抗体的仍实质上保持其抑制TSLP活性的生物活性的片段或衍生物。因此，术语“抗体片段”或TSLP结合片段指全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab片段、Fab′片段、F(ab′)₂片段和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv；域抗体(domain antibody)；和从各抗体片段形成的多特异性抗体。通常，结合片段或衍生物保持其TSLP抑制活性的至少10％。优选地，结合片段或衍生物保持其TSLP抑制活性的至少25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％(或更多)，不过任何具有足够亲和力以发挥期望生物作用的结合片段也将是有用的。还认为，TSLP结合片段可包括不会实质上改变其生物活性的保守氨基酸取代。

本文所用的术语“单克隆抗体”指获自实质上均一抗体的群体的某抗体，即构成该群体的各个抗体除了可能少量存在的天然突变外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对的是单个抗原表位。相反，常规(多克隆)抗体制品通常包括许多针对不同表位(或对不同表位有特异性)的抗体。修饰语“单克隆”表示该抗体是从实质上均一的抗体群体获得的这么一个特征，并不能解释为要求通过任何特定的方法来产生该抗体。例如，按本发明进行使用的单克隆抗体可通过首先由Kohler等人，(1975)Nature 256：495描述的杂交瘤方法制备，或者通过重组DNA方法制备(参见例如4,816,567号美国专利)。“单克隆抗体”还可用例如Clackson等人，(1991)Nature 352：624-628和Marks等人，(1991)J.Mol.Biol.222：581-597中描述的技术，从噬菌体抗体文库分离。

本文的单克隆抗体特地包括这样的“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍自特定物种或者属于特定抗体类(class)或亚类(subclass)的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的其余部分与衍自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，且还特地包括这种“嵌合”抗体的片段，只要它们显示期望的生物活性(4,816,567号美国专利；Morrison等人，(1984)Proc.Natl.Acad Sci.USA 81：6851-6855)。

“域抗体”是仅含重链的可变区或轻链的可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或更多个V_H区与肽接头共价连接，产生二价域抗体。二价域抗体的两个V_H区可靶向相同的或不同的抗原。

“二价抗体”包含两个抗原结合位点。在一些情况下，该两个结合位点具有相同的抗原特异性。但是，二价抗体可以是双特异性的(见下文)。

本文所用的术语“单链Fv”或“scFv”抗体，是指包含抗体的V_H结构域和V_L结构域的抗体片段，其中这些结构域以单一多肽链形式存在。通常，Fv多肽还包含V_H结构域和V_L结构域之间的多肽接头，该接头使sFv能够形成期望的结构以进行抗原结合。有关sFv的综述，参见Pluckthun(1994)T_HE P_{HARMACOLOGY OF} M_ONOCLONALA_NTIBODIES，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，NewYork，第269-315页。

本文的单克隆抗体还包括骆驼源化单域抗体(camelized singledomain antibody)。参见例如Muyldermans等人(2001)Trends Biochem.Sci.26：230；Reichmann等人(1999)J.Immunol.Methods 231：25；WO94/04678；WO 94/25591；6,005,079号美国专利，这些文献和专利通过引用整体并入本文)。在一个实施方案中，本发明提供包含两个具有能使单域抗体得以形成的修饰的V_H结构域的单域抗体。

本文所用的术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段在同一多肽链中包含重链可变结构域(V_H)和与之连接的轻链可变结构域(V_L)(V_H-V_L或V_L-V_H)。通过使用短得不能让同一链上的两个结构域之间发生配对的接头，各结构域被迫与另一条链的互补结构域发生配对，从而产生两个抗原结合位点。在例如EP 404,097、WO 93/11161和Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448中，对双抗体有更充分的描述。有关经工程改造的抗体变体的综述，通常参见Holliger和Hudson (2005)Nat.Biotechnol.23：1126-1136。

本文所用的术语“人源化抗体”指含有非人(例如鼠)抗体的序列以及人抗体的序列的抗体形式。这种抗体含有最小限度的衍自非人免疫球蛋白的序列。一般来说，人源化抗体会包含至少一个、通常两个可变结构域的实质上全部(substantially all)，其中超可变环的全部或实质上全部对应于非人免疫球蛋白的全部或实质上全部，而FR区的全部或实质上全部是人免疫球蛋白序列的全部或实质上全部。人源化抗体任选还会包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，该恒定区通常是人免疫球蛋白的恒定区。当有必要将人源化抗体(例如“hu23B12”)与亲本啮齿动物抗体(例如大鼠23B12或“r23B12”)加以区分时，在抗体克隆标号前加上前缀“hu”或“hum”。啮齿动物抗体的人源化形式，通常会包含亲本啮齿动物抗体的相同CDR序列，不过可包括某些氨基酸取代，以提高亲和力或增加人源化抗体的稳定性。

本发明的抗体还包括具有经修饰的(或经封闭的)Fc区以提供改变了的效应子功能的抗体。参见例如5,624,821号美国专利；WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702；Presta(2006)Adv.Drug Delivery Rev.58：640-656。这种修饰可用来增强或抑制免疫系统的各种反应，在诊断和治疗中有可能有益的作用。Fc区的变更包括氨基酸变化(取代、缺失和插入)、糖基化或去糖基化，和加入多个Fc区。对Fc的变化还可改变治疗性抗体中的抗体的半寿期，而更长的半寿期会导致给药频率更少，伴随而来的是方便性的提高和材料耗费的减少。参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731第734-35页。

术语“完全人抗体“指仅包含人免疫球蛋白序列的抗体。完全人抗体如果是在小鼠中、在小鼠细胞中或在衍自小鼠细胞的杂交瘤中产生的话，可含有鼠碳水化合物链。同样，“小鼠抗体”指仅包含小鼠免疫球蛋白序列的抗体。

本文所用的术语“超可变区”指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。超可变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变结构域中的残基24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)和89-97(CDRL3)和重链可变结构域中的残基31-35(CDRH1)、50-65(CDRH2)和95-102(CDRH3)；Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.)，和/或来自“超可变环”的氨基酸残基(即轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变结构域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)。本文所用的术语“构架”或“FR”残基，是指本文定义为CDR残基的超可变区残基之外的那些可变结构域残基。以上残基编号涉及Kabat编号系统，并不一定在细节上对应于本文所附序列表中的序列编号。参见表2和3，其中序列编号参考序列表。

“结合”指结合组合物与靶标的缔合，其中在结合组合物能溶于或悬浮于溶液中的情况下，该缔合导致结合组合物的正常布朗运动的减少。

“结合化合物”指包含一个或多个能特异性结合人TSLP的氨基酸序列的分子。在一个优选的实施方案中，结合化合物是抗体。在另一个优选的实施方案中，结合化合物包含抗体片段。

“结合组合物”指与稳定剂、赋形剂、盐、缓冲剂、溶剂或添加剂进行组合的，能够结合靶标的TSLP结合化合物。

“保守修饰变体”或“保守取代”指本领域技术人员所知道的，通常可作出但又不会改变所产生的分子的生物活性的氨基酸取代。本领域技术人员认识到，一般来说，多肽的非必需区域中的单一氨基酸取代不会实质上改变生物活性(参见例如Watson等人，Molecular Biology ofthe Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页(1987年第4版))。这种示例性的取代优选按照下表1所示的取代来作出：

表1

示例性的保守氨基酸取代

原始残基	保守取代
		Ala(A)	Gly；Ser
Arg(R)	Lys，His
		Asn(N)	Gln；His
Asp(D)	Glu；Asn
		Cys(C)	Ser；Ala
Gln(Q)	Asn
		Glu(E)	Asp；Gln
Gly(G)	Ala
		His(H)	Asn；Gln
Ile(I)	Leu；Val
		Leu(L)	Ile；Val
Lys(K)	Arg；His
		Met(M)	Leu；Ile；Tyr
Phe(F)	Tyr；Met；Leu
		Pro(P)	Ala
Ser(S)	Thr
		Thr(T)	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe
		Tyr(Y)	Trp；Phe
Val(V)	Ile；Leu

说明书和权利要求书通篇中用到的术语“实质上由......组成”，是表示包括任何述及的要素或要素群组，同时任选包括其他要素，这些其他要素与所述及的要素性质相似或不同，不会本质上改变所指定的剂量方案、方法或组合物的基本或新型特性。作为非限制性实例，实质上由所述及的氨基酸序列组成的抗体或其片段，还可包括一个或多个不会本质上改变结合化合物的特性的氨基酸，包括一个或多个氨基酸残基的取代在内。

“有效量”涵盖足以改善或防止医疗状况的症状或征候的量。有效量还意指足以允许或便于进行诊断的量。针对特定患者或兽医受试对象的有效量，可根据诸如以下的因素而变：所治疗的病况、患者的总体健康情况、方法途径和给药剂量及副作用的严重程度(参见例如授予Netti等人的5,888,530号美国专利)。有效量可以是能避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或投药方案。效果将是导致诊断量度(measure)或参数改进达至少5％，通常达至少10％，更通常至少20％，最通常至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，最优选至少60％，理想地至少70％，更理想地至少80％，最理想地至少90％，其中100％定义为正常受试对象的诊断参数(参见例如Maynard等人(1996)AHandbook of SOPs for Good Clinical Practice，Interpharm Press，BocaRaton，FL；Dent(2001)Good Laboratory and Good Clinical Practice，Urch Publ.，London，UK)。

“外源(exogenous)”指视情形而定在生物体、细胞或人体的外部产生的物质。

“内源(endogenous)”指视情形而定在细胞、生物体或人体的内部产生的物质。

本文所用的术语“分离核酸分子”指从至少一个污染性核酸分子鉴定出和分离开来的核酸分子，在抗体核酸的天然来源中它与所述污染性核酸分子通常相结合在一起。分离核酸分子其所处的形式或环境(setting)不同于其在自然界中所处的形式或环境。分离核酸分子因此与天然细胞中所存在的核酸分子有区别。但是，分离核酸分子包括在平常表达抗体的细胞中包含的这样的核酸分子，该核酸分子例如说其所处的染色体位置不同于正常细胞。

词语“控制序列”指可操作地连接的编码序列在特定宿主生物中的表达所必需的DNA序列。适合于例如说原核生物的控制序列，包括启动子，任选的操纵基因序列(operator sequence)，和核糖体结合位点。真核细胞已知能利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。

某核酸当被安排与另一核酸序列发生功能关系时，则(与该另一核酸序列)“可操作地连接”。例如，前序列或分泌前导序列的DNA如果被表达成参与某多肽的分泌的前体蛋白质，则它与该多肽的DNA可操作地连接；启动子或增强子如果影响到某编码序列的转录，则它与该编码序列可操作地连接；或者核糖体结合位点如果被置于能促进某编码序列的翻译的位置，则它与该编码序列可操作地连接。一般来说，“可操作地连接”意指被连接的各DNA序列是邻接的，在分泌前导序列的情况下，是邻接且处在阅读相位(reading phase)的。但是，各增强子不必是邻接的。连接(linking)是通过在方便的限制位点处进行连接反应(ligation)完成。如果不存在这样的位点，则按照常规做法使用合成的寡核苷酸衔接子(adaptor)或接头(linker)。

本文所用的词语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，且所有这些称谓都包括后代。因此，词“转化子”和“转化细胞”包括受试对象原代细胞和从中衍生的培养物，不管转移次数多少。还要理解到，由于故意或无意的突变，所有的后代可能不会在DNA含量上正好相同。本发明包括其功能或生物活性与原始转化细胞中筛查到的功能或生物活性相同的突变后代。如果要有分明的称谓，则从上下文将清楚知道。

本文所用的“聚合酶链反应”或“PCR”指据以扩增微量的特定一段核酸、RNA和/或DNA的程序或技术，如在4,683,195号美国专利中所述。通常，需要获得从目的区域的末端或末端之外起的序列信息，以便可设计出寡核苷酸引物；这些引物要在序列上与待扩增的模板的相对链相同或近似。两个引物的5′末端核苷酸可与被扩增材料的末端相一致。PCR可用来扩增特定RNA序列、总基因组DNA的特定DNA序列和从总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体序列或质粒序列等。主要参见Mullis等人(1987)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263；Erlich编辑，(1989)PCR T_ECHNOLOGY(Stockton Press，N.Y.)。本文所用的PCR被认为是用以扩增核酸试样的核酸聚合酶反应方法的一个实例，但不是唯一的实例，所述方法包括使用已知的核酸作为引物和核酸聚合酶，来扩增或产生特定的一段核酸。

本文所用的术语“种系序列”指未重排(unrearranged)免疫球蛋白DNA序列中的某序列。任何合适来源的未重排免疫球蛋白DNA都可使用。

“抑制剂”是能减少、阻断、防止、延迟活化、失活、减敏或下调例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞的化合物。抑制剂还可定义为能减少、阻断或灭活组成型活性(constitutive activity)的组合物。“拮抗剂”是能对抗激动剂的作用的化合物。拮抗剂能防止、减少、抑制或中和激动剂的活性。拮抗剂还能防止、抑制或减少靶标如靶标受体的组成型活性，即使是在没有指明的激动剂的情况下。

为检验抑制程度，例如说，将包含给定的(例如)蛋白质、基因、细胞或生物的样品或被化验物(assay)，用潜在的活化性或抑制性物质进行处理，并与不加该物质的对照样品进行比较。给对照样品即不用该物质处理的样品分配100％的相对活性值。当活性值相对于对照为约90％或以下、通常85％或以下、更通常80％或以下、最通常75％或以下、一般70％或以下、更一般65％或以下、最一般60％或以下、通常55％或以下、常常50％或以下、更常常45％或以下、最常常40％或以下、优选35％或以下、更优选30％或以下、还更优选25％或以下、最优选小于25％时，则实现了抑制。

抑制的终点可如下进行监测。例如细胞、生理流体、组织、器官和动物或人受试对象的抑制和治疗应答，可通过终点进行监测。终点可包含指示炎症、致癌性或者细胞脱粒或分泌情况的预定量或百分比的(例如)标记(indicia)，如细胞因子、毒性氧或蛋白酶的释放。终点可包含例如预定量的离子流动或运输；细胞迁移、细胞黏附；细胞增殖；转移潜力；细胞分化；和表型变化，例如与炎症、凋亡、转化、细胞周期或转移有关的基因的表达的变化(参见例如Knight(2000)Ann.Clin.Lab.Sci.30：145-158；Hood和Cheresh(2002)Nature Rev.Cancer2：91-100；Timme等人(2003)Curr.Drug Targets 4：251-261；Robbins和Itzkowitz(2002)Med.Clin.North Am.86：1467-1495；Grady和Markowitz(2002)Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.3：101-128；Bauer等人(2001)Glia 36：235-243；Stanimirovic和Satoh(2000)Brain Pathol.10：113-126)。

抑制终点通常为对照的75％或以下，优选为对照的50％或以下，更优选为对照的25％或以下，最优选为对照的10％或以下。通常，活化终点为对照的至少150％，优选为对照的至少2倍，更优选为对照的至少4倍，最优选为对照的至少10倍。

“特异性”或“选择性”结合当指配体/受体、抗体/抗原或其他结合对时，表示能确定蛋白质如TSLP在众多蛋白质和/或其他生物物质的不均一群体中的存在的结合反应。因此，在指明的条件下，指定的配体/抗原会结合特定的受体/抗体，而不会大量地结合样品中存在的其他蛋白质。

所设想的方法的抗体或者衍自抗体的抗原结合位点的结合组合物，能以比其与非相关抗原的亲和力大至少2倍、优选大至少10倍、更优选大至少20倍、最优选大至少100倍的亲和力，来结合其抗原。在一个优选的实施方案中，由例如Scatchard分析(Munsen等人(1980)Analyt.Biochem.107：220-239)测出，抗体会具有大于约10⁹升/mol的亲和力。

本文所用的术语“炎性疾病”指任何以损伤或感染部位的局部炎症为特征的疾病(disease)或病恙(disorder)，包括但不限于过敏性炎症、自身免疫疾病和其他以局部组织部位处不期望的免疫细胞集聚为特征的病恙。

本文所用的术语“免疫调节剂”指能抑制或调节免疫应答的天然或合成物质。免疫应答可以是体液应答或细胞应答。免疫调节剂涵盖免疫抑制剂或抗炎剂。

本文所用的“免疫抑制剂”、“免疫抑制药物”或“免疫抑制物”是可在免疫抑制疗法中用来抑制或防止免疫系统的活性的治疗剂。在临床上，它们用来防止移植器官和组织(例如骨髓、心脏、肾脏、肝脏)的排斥，和/或用来治疗自身免疫疾病或极可能有自身免疫起因的疾病(例如类风湿性关节炎、重症肌无力、系统性红斑狼疮、溃疡性大肠炎、多发性硬化)。免疫抑制药物可归为以下四类：糖皮质类固醇细胞生长抑制剂(cytostatics)；抗体(包括生物反应调节物(Biological ResponseModifiers)或DMARDs在内)；作用于亲免蛋白的药物；其他药物，包括用于治疗增殖性疾病的已知化疗剂。具体的说，对于多发性硬化，可将本发明抗体与称为copaxone的新一类髓鞘结合蛋白样治疗剂联合给予。

“抗炎剂”或“抗炎药物”用来表示甾体类和非甾体类治疗剂。类固醇也称皮质类固醇，是与皮质醇这一由肾上腺天然产生的激素非常相似的药物。对于某些炎性病症，如系统性血管炎(血管的炎症)和肌炎(肌肉的炎症)，类固醇是作为主要治疗药来使用。类固醇还可有选择地用来治疗诸如以下炎性病症：类风湿性关节炎(在身体两侧关节中出现的慢性炎性关节炎)；系统性红斑狼疮(由异常免疫系统功能引起的全身性疾病(generalized disease))；

综合征(会引起干眼症和干口症的慢性失调)。

非甾体抗炎药(常简称NSAIDs)是具有镇痛、退热和抗炎作用的药物，即它们能减少疼痛、发热和炎症。术语“非甾体”用来将这些药物与具有类似的二十烷酸-抑制(eicosanoid-depressing)、抗炎作用(当然还有广泛的其他作用)的类固醇区分开来。NSAIDs通常适用于缓解以下病症的症状：类风湿性关节炎；骨关节炎；炎性关节病(例如强直性脊椎炎、牛皮癣关节炎、Reiter综合征)；急性痛风；痛经；转移性骨痛；头痛和偏头痛；手术后疼痛；炎症和组织损伤所致的轻度至中度疼痛；热病；和肾绞痛。NSAIDs包括水杨酸盐类、芳基烷酸类、2-芳基丙酸类(profens)、N-芳基邻氨基苯甲酸类(芬那酸类(fenamic acids))、西康类(oxicams)、西布类(coxibs)和硫酰替苯胺类(sulphonanilides)。

II.概述

本发明提供经工程改造的抗TSLP抗体及其用于治疗炎性疾病特别是过敏性炎性疾病的用途。在一个优选的实施方案中，炎性疾病是哮喘。在一个优选的实施方案中，过敏性炎性疾病是过敏性鼻窦炎、过敏性哮喘、过敏性哮喘、过敏性结膜炎或特应性皮炎。本发明还提供经工程改造的抗TSLP抗体来治疗纤维样变性、炎性肠病或何杰金氏淋巴瘤。

TSLP是造血细胞因子的“长链”家族的成员之一。对“长链”细胞因子/受体识别作用的结构基础的深入研究，证明了尽管大面积的蛋白质表面被埋藏在细胞因子-受体复合物的构造中，但该相互作用的亲和力是由少数的往往紧密簇集的氨基酸残基所支配，所述残基在结合界面的中央形成高能的“热点”。已将支配大蛋白质-蛋白质界面的结合能的残基的身份(identity)称为“功能表位”。相互作用的亲和力(从而生物特异性)因此是由配体和受体的功能表位的结构互补性所确定。详尽的诱变研究已证实，构成细胞因子和受体的功能表位的最显著残基，是涉及非极性侧链如色氨酸、非极性侧链的脂族成分或多肽骨架的疏水接触。非极性“核心”的周围包围着一圈对结合能而言重要性较低的极性残基。动力学研究表明，功能表位的主要作用是通过降低复合物的解离速率来稳定蛋白质-蛋白质相互作用。已提出，细胞因子和受体之间的初始接触主要是蛋白质表面的随机扩散或“翻滚”，从而产生出许多不稳定的接触。当受体和配体的功能表位发生接合时，复合物就得以稳定化(参见例如Bravo和Heath，出处同上)。

III.TSLP特异性抗体的产生

任何产生单克隆抗体的合适方法都可使用。例如，可用连接或非连接(例如天然)形式的TSLP异型二聚体或其片段，对受方(recipient)进行免疫。可使用任何合适的免疫方法。这些方法可包括佐剂(adjuvant)、其他免疫刺激剂、反复强化免疫和使用一个或多个免疫途径。

任何合适来源的TSLP都可用作免疫原，来产生本文所公开的组合物和方法的非人抗体。这种形式包括但不限于通过本领域知道的重组方法、合成方法、化学方法或酶促降解方法产生的完整蛋白质(包括连接的和天然的异型二聚体在内)、肽和表位。

任何形式的抗原都可用来产生足以产生生物活性抗体的抗体。因此，引发抗原(eliciting antigen)可以是单一表位、多个表位，或者单独的或与一种或多种本领域公知免疫原性增强剂组合的完整蛋白质。引发抗原可以是分离的全长蛋白、细胞表面蛋白(例如用转染有抗原的至少一部分的细胞进行免疫)或可溶性蛋白质(例如仅用蛋白质的胞外结构域部分进行免疫)。抗原可在经遗传修饰的细胞中产生。编码抗原的DNA可以是基因组DNA或非基因组DNA(例如cDNA)，编码胞外结构域的至少一部分。本文所用的术语“部分”指视乎适当而定，构成目的抗原的免疫原性表位的最低数目的氨基酸或核酸。可采用任何适合于转化目的细胞的遗传载体，包括但不限于腺病毒载体、质粒和非病毒质粒，如阳离子脂质。

可用任何合适的方法来引发具有抑制TSLP的期望生物特性的抗体。从各种哺乳动物宿主如小鼠、啮齿动物、灵长类动物、人等制备单克隆抗体(mAbs)是合乎需要的。有关制备这种单克隆抗体的技术的描述，可见于例如Stites等人(编辑)B_ASIC AND C_LINICAL I_MMUNOLOGY(第4版)Lange Medical Publications，Los Altos，CA及其中引用的参考文献；Harlow和Lane(1988)A_NTIBODIES：AL_ABORATORY M_ANUAL CSHPress；Goding(1986)M_ONOCLONAL A_NTIBODIES：P_{RINCIPLES AND}P_RACTICE(第2版)Academic Press，New York，NY。因此，单克隆抗体可通过本领域研究人员熟知的多种技术获得。通常，使来自用期望抗原免疫的动物的脾细胞无限增殖化，这往往通过与骨髓瘤细胞融合来实现。参见Kohler和Milstein(1976)Eur.J.Immunol.6：511-519。无限增殖化的另选方法包括用Epstein Barr病毒、癌基因或反转录病毒进行转化，或者本领域知道的其他方法。参见例如Doyle等人(1994年版和定期增刊)C_ELL AND T_ISSUE C_ULTURE：L_ABORATORY P_ROCEDURES，John Wiley and Sons，New York，NY。对于从各单个无限增殖化细胞产生的集落，筛查它们是否产生具有期望的抗原特异性和亲和力的抗体，由这些细胞所产生的单克隆抗体的产率可通过各种技术进行提高，包括向脊椎动物宿主的腹膜腔的注射在内。或者，可通过例如Huse等人(1989)Science 246：1275-1281所概述的一般方案，通过筛查来自人B细胞的DNA文库，分离出编码单克隆抗体或其结合片段的DNA序列。

其他合适的技术涉及到在噬菌体或类似载体中选择抗体的文库。参见例如Huse等人，Science 246：1275-1281(1989)；和Ward等人，Nature 341：544-546(1989)。本发明的多肽和抗体可加以或不加以修饰来使用，包括嵌合抗体或人源化抗体在内。多肽和抗体常常会通过共价或非共价连接上能提供可检测信号的物质，来进行标记。有多种标记和缀合技术是公知的，在科学和专利文献中广泛报道。合适的标记包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光部分、化学发光部分、磁性颗粒等。教导这些标记的使用的专利包括以下各美国专利：3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。另外，还可产生重组免疫球蛋白，参见Cabilly的4,816,567号美国专利；和Queen等人(1989)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA86：10029-10033；或者在转基因小鼠中制备，参见Mendez等人(1997)Nature Genetics 15：146-156；另参见Abgenix和Medarex技术。

抗预定的TSLP片段的抗体或结合组合物，可通过用多肽、片段、肽或表位与载体蛋白的缀合物免疫动物来产生。单克隆抗体从分泌期望的抗体的细胞制备。可对这些抗体筛查其与正常或缺陷TSLP的结合情况。这些单克隆抗体通常会以至少约1μM、更常常至少约300nM、通常至少约30nM、优选至少约10nM、更优选至少约3nM或更佳的K_d发生结合，所述数值通常是通过ELISA测定。

IV.TSLP特异性抗体的人源化

任何合适的非人抗体都可用作超可变区的来源。非人抗体的来源包括但不限于鼠类动物、兔类动物(包括家兔)、牛类动物和灵长类动物。基本上，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受方抗体)，其中受方的超可变区残基被来自非人物种(供方抗体)如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类动物的具有期望特异性、亲和力和能力的超可变区残基所替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基所替代。此外，人源化抗体可包含在受方抗体中或在供方抗体中不存在的残基。作出这些修饰是为了进一步改进期望的生物活性的抗体性能。更多的细节参见Jones等人(1986)Nature 321：522-525；Reichmann等人(1988)Nature 332：323-329；和Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。

对抗体进行重组工程改造的方法已有描述，例如Boss等人(4,816,397号美国专利)，Cabilly等人(4,816,567号美国专利)，Law等人(欧洲专利申请公开号438 310)和Winter(欧洲专利申请公开号239400)。

人源化抗TSLP抗体的氨基酸序列变体，是通过将适当的核苷酸变化导入到人源化抗TSLP抗体DNA中或者通过肽合成来制备。这种变体包括例如人源化抗TSLP F(ab)情况下所显示的氨基酸序列当中的残基的缺失和/或插入和/或取代。作出缺失、插入和取代的任何组合以获得最终构建物，前提是该最终构建物具有期望的特性。氨基酸变化还可改变人源化抗TSLP抗体的翻译后加工，如改变糖基化位点的数目或位置。

用以鉴定人源化抗TSLP抗体多肽的某些作为优选诱变位置的残基或区域的有用方法，称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science 244：1081-1085所描述。这里，鉴定了某残基或靶标残基群(例如带电荷残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影响氨基酸与TSLP抗原的相互作用。然后通过在或给取代位点导入更多的或其他的变体，将显示出对取代的功能敏感性的氨基酸残基进行改进。因此，虽然用于导入氨基酸序列变异的位点是预定的，但突变本身的特性不需要是预定的。例如，为分析给定位点处的突变的性能，在靶标密码子或区域处进行Ala扫描或随机诱变，并对所表达的人源化抗TSLP抗体变体进行筛查以寻找期望的活性。

氨基酸序列插入包括氨基末端和/或羧基末端融合，其长度从1个残基到含有100个或更多个残基的多肽，还包括单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端蛋氨酰(methionyl)残基的人源化抗TSLP抗体或者与表位标签融合的抗体。人源化抗TSLP抗体分子的其他插入变体，包括能提高人源化抗TSLP抗体血清半寿期的酶或多肽与该抗体的N末端或C末端的融合。

另一类变体是氨基酸取代变体。这些变体去除了人源化抗TSLP抗体分子中的至少一个氨基酸残基，并在其位置插入别的残基。进行取代诱变的最有意义的位点包括超可变环，但也设想到进行FR变更。参与抗原结合的超可变区残基或FR残基，通常是以相对保守的方式进行取代。

抗体的另一类氨基酸变体能改变抗体的原始糖基化模式。所谓改变是指缺失掉抗体中存在的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加一个或多个在抗体中不存在的糖基化位点。抗体的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸这两个三肽序列——其中X为脯氨酸之外的任何氨基酸——是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶促连接的识别序列。因此，这两个三肽序列任一个在多肽中的存在产生出潜在的糖基化位点。O-连接糖基化指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖这几个糖之一与羟基氨基酸的连接，所述羟基氨基酸最常见的是丝氨酸或苏氨酸，不过也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。

糖基化位点向抗体的添加，是通过改变氨基酸序列使得它含有一个或多个上述三肽序列，来方便地实现(对于N-连接糖基化位点)。还可通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加或取代到原始抗体的序列，来作出变更(对于O-连接糖基化位点)。

又一类氨基酸变体是取代残基以使最终人源化抗体有更大的化学稳定性。例如，可将天冬酰胺(N)残基加以改变，以减少在啮齿动物CDR当中任何NG序列处形成异天冬氨酸的潜在可能性。在一个实施方案中，将天冬酰胺改变成谷氨酰胺(Q)。异天冬氨酸形成会削弱或完全消除抗体与其靶标抗原的结合。Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731，第734页。另外，可将啮齿动物CDRs中的甲硫氨酸残基加以改变，以减少甲硫氨酸中的硫会发生氧化的可能性，所述氧化会降低抗原结合亲和力，而且会造成最终抗体制品中的分子不均一性(molecular heterogeneity)。出处同上。在一个实施方案中，将甲硫氨酸改变成丙氨酸(A)。随后筛查具有这种取代的抗体，以确保取代不会使TSLP结合亲和力降低到不可接受的水平。

编码人源化TSLP特异性抗体的氨基酸序列变体的核酸分子，是通过多种本领域知道的方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然氨基酸序列变体的情况下)，或者通过对之前制备的人源化抗TSLP抗体变体形式或非变体形式的寡核苷酸介导(或位点定向)诱变、PCR诱变和盒式诱变来进行制备。

通常，人源化抗TSLP抗体的氨基酸序列变体，会具有与重链或轻链的原始人源化抗体氨基酸序列有至少75％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，更优选是至少80％，还更优选是至少85％，又更优选是至少90％，最优选是至少95％。与这个序列的同一性或同源性，在本文中定义为将这个序列与候选序列进行比对并按需引入空隙以达到最大序列同一性百分数后，在不将任何保守取代考虑作为序列同一性的一部分的情况下，候选序列中与人源化抗TSLP残基相同的氨基酸残基的百分数。对抗体序列N末端、C末端或内部的延伸、缺失或插入，都不被应认作会改变序列同一性或同源性。

人源化抗体可从任何类别的免疫球蛋白选择，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE在内。优选地，抗体是IgG抗体。可使用IgG的任何同种型，包括IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄在内。还设想到各IgG同种型的变体。人源化抗体可包含来自超过一个类别或同种型的序列。对必需恒定结构域序列进行优化以产生期望的生物活性，这可容易地通过按下文所述的生物学测定法筛查抗体来实现。

同样，任一类别的轻链也可用于本文所述的组合物和方法中。具体的说，κ轻链、λ轻链或它们的变体可用于本发明的组合物和方法中。

可使用来自非人抗体的CDR序列的任何合适部分。CDR序列可通过取代、插入或缺失至少一个残基来进行诱变，使得CDR序列不同于所采用的人和非人抗体序列。设想到，这种突变会是最小限度的。通常，至少75％的人源化抗体残基会对应于非人CDR残基，更通常90％，最优选95％以上。

可使用来自人抗体的FR序列的任何合适部分。FR序列可通过取代、插入或缺失至少一个残基来进行诱变，使得FR序列不同于所采用的人和非人抗体序列。设想到，这种突变会是最小限度的。通常，至少75％的人源化抗体残基会对应于人FR残基，更通常90％，最优选95％以上。

CDR残基和FR残基按Kabat的标准序列定义来确定。Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，National Institutesof Health，Bethesda Md.(1987)。表2提供大鼠(r23B12)和人(hu23B12)可变重链CDRs的序列标识符(sequence identifier)信息。表3提供r23B12和hu23B12可变轻链CDRs的序列标识符信息。

表2

重链序列和结构域

抗体克隆

SEQ ID

V_H残基

重链CDR残基

			CDR-H1	CDR-H2	CDR-H3
						r23B12	7	1-116	26-35	50-65	95-105
hu23B12	10	1-116	26-35	50-65	95-105

表3

轻链序列和结构域

r23B12和hu23B12CDR-H1序列是GYIFTDYAMH(SEQ ID NO.1)。r23B12和hu23B12CDR-H2序列是TFIPLLDTSDYNQNFKG(SEQID NO.2)。r23B12和hu23B12CDR-H3序列是MGVTHSYVMDA(SEQ ID NO.3)。

r23B12和hu23B12CDR-L1序列是RASQPISISVH(SEQ ID NO.4)。r23B12和hu23B12CDR-L2序列是FASQSIS(SEQ ID NO.5)。r23B12和hu23B12CDR-L3序列是QQTFSLPYT(SEQ ID NO.6)。

r23B12可变重链氨基酸序列是EEKLQQSGDD LVRPGAAVKMSCKASGYIFTDYAMHWVKQRPGQGLEWIGTFIPLLDTSDYNQNFKGRATLTADKSSNTAYMELSRLTSEDSAVYYCARMGVTHSYVMDAWGQGASVTVSS(SEQ ID NO.7)。

r23B12可变轻链氨基酸序列是DIVLTQSPATLSVTPGESVSLSCRASQPISISVHWFQQKSNESPRLLIKFASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTL NINRVESEDFSVYYCQQTFSLPYTFGTGTKLELKR(SEQ ID NO.8)。

hu23B12可变重链的核酸序列是

CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGC GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGC

GCC TCC GTG AAG GTC TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ATC TTC ACC

GAC TAC GCC ATG CAC TGG GTG CGG CAG GCC CCT GGC CAG GGG CTG

GAG TGG ATG GGT ACC TTC ATC CCT CTG CTG GAC ACC AGC GAC TAC

AAC CAG AAC TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC ACA GAC ACA TCC

ACC AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGG AGC CTG AGA TCT GAC GAC

ACC GCC GTG TAT TAC TGT GCC AGA ATG GGA GTG ACC CAC AGC TAC

GTG ATG GAT GCA TGG GGC CAG GGC ACC CTG GTC ACC GTC TCC AGC

(SEQ ID NO：9)，它编码hu23B12可变重链氨基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTDYAMHWVRQAPGQGLEWMGTFIPLLDTSDYNQNFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARMGVTHSYVM DAWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.10)。

hu23B12可变轻链的核酸序列是

GAA ATT GTG CTG ACT CAG AGC CCA GGC ACC CTG TCT CTG TCT CCA

GGC GAG AGA GCC ACC CTC TCC TGC CGG GCC AGC CAG CCC ATC TCC

ATC AGC GTG CAC TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGA CAG GCT CCA AGG

CTG CTG ATC TAC TTT GCC TCC CAG AGC ATC TCC GGG ATC CCC GAT

AGG TTC AGC GGA TCC GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACC CTC ACC ATC

AGC AGA CTG GAG CCT GAA GAT TTC GCA GTG TAT TAC TGT CAG CAG

ACC TTC AGC CTG CCT TAC ACT TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAG

ATC AAG CGT(SEQ ID NO：11)，它编码hu23B12可变轻链氨基酸序列

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQPISISVHWYQQKPGQA

PRLLIYFASQSISGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTFSLPYTFG

QG TKVEIKR(SEQ ID NO.12)。

hu23B12重链的核酸序列是

CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGC GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGC

GCC TCC GTG AAG GTC TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ATC TTC ACC

GAC TAC GCC ATG CAC TGG GTG CGG CAG GCC CCT GGC CAG GGG CTG

GAG TGG ATG GGT ACC TTC ATC CCT CTG CTG GAC ACC AGC GAC TAC

AAC CAG AAC TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC ACA GAC ACA TCC

ACC AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGG AGC CTG AGA TCT GAC GAC

ACC GCC GTG TAT TAC TGT GCC AGA ATG GGA GTG ACC CAC AGC TAC

GTG ATG GAT GCA TGG GGC CAG GGC ACC CTG GTC ACC GTC TCC AGC

GCT AGC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC TCC TCC

AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG

GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC

CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA

GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC

TTG GGC ACC CAG ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC

AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA

ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA

CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG

ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC

CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG

GAG GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC

AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC

TGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC

CTC CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG

CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG

CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC

TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG

GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC

TCC TTC TTC CTC TAC AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG

CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG

CAC AAC CAC TAC ACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA

(SEQ ID NO：13)，它编码hu23B12重链氨基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTDYAMHWVRQAPGQGLEWMGTFIPLLDTSDYNQNFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARMGVTHSYVMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：14)。

hu23B12轻链的核酸序列是

GAA ATT GTG CTG ACT CAG AGC CCA GGC ACC CTG TCT CTG TCT CCA

GGC GAG AGA GCC ACC CTC TCC TGC CGG GCC AGC CAG CCC ATC TCC

ATC AGC GTG CAC TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGA CAG GCT CCA AGG

CTG CTG ATC TAC TTT GCC TCC CAG AGC ATC TCC GGG ATC CCC GAT

AGG TTC AGC GGA TCC GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACC CTC ACC ATC

AGC AGA CTG GAG CCT GAA GAT TTC GCA GTG TAT TAC TGT CAG CAG

ACC TTC AGC CTG CCT TAC ACT TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAG

ATC AAG CGT ACG GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA

TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG

CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG

GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG

CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG

CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GAA

GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC

AGG GGA GAG TGT(SEQ ID NO：15)，

它编码hu23B12轻链氨基酸序列EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQPISISVHWYQQKPGQAPRLLIYFASQSISGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTFSLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：16)。

还设想到嵌合抗体。如上所述，典型的嵌合抗体包含重链和/或轻链的一部分，这部分重链和/或轻链与衍自特定物种或者属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的其余部分与衍自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体以及这种嵌合抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们显示期望的生物活性(4,816,567号美国专利；Morrison等人，(1984)Proc.Natl.Acad Sci.USA 81：6851-6855)。

双特异性抗体也可用于本发明方法和组合物。本文所用的术语“双特异性抗体”指具有对至少两个不同抗原表位的结合特异性的抗体，通常是单克隆抗体。在一个实施方案中，各表位来自同一抗原。在另一个实施方案中，各表位来自两个不同的抗原。制备双特异性抗体的方法是本领域知道的。例如，可采用两个免疫球蛋白重链/轻链对，来重组产生双特异性抗体。参见例如Milstein等人(1983)Nature 305：537-39。或者，可用化学连接来制备双特异性抗体。参见例如Brennan等人(1985)Science 229：81。双特异性抗体包括双特异性抗体片段。参见例如Hollinger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-48，Gruber等人，J.Immunol.152：5368(1994)。

在另外其他的实施方案中，可将不同的恒定结构域附加到本文提供的人源化V_L区和V_H区。例如，如果本发明抗体(或片段)的特定预定用途是产生(call for)改变的效应子功能，可使用IgG1之外的重链恒定结构域。尽管IgG1抗体能提供长半寿期和效应子功能，如补体激活和抗体依赖性细胞毒性，但这些活性可能不是抗体的所有用途都需要的。在这种情况下，例如可使用IgG4恒定结构域。

V.人源化抗TSLP的生物活性

对于具有本文认为在人源化抗TSLP抗体中合乎需要的特性的抗体，可筛查它们的体外抑制性生物活性或者筛查其合适的结合亲和力。为筛查能结合被目的抗体(例如能阻断细胞因子与其受体的结合的那些抗体)结合的人TSLP上的表位的抗体，可进行常规的交叉阻断测定(cross-blocking assay)，如A_NTIBODIES，A L_ABORATORY M_ANUAL，ColdSpring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane(1988)中描述的测定。结合同一表位的各抗体在这种测定中很可能会发生交叉阻断，但不是所有的交叉阻断性抗体必定会正好在同一表位处结合，因为交叉阻断可能由在附近结合的抗体乃至重叠的表位对抗体结合的空间位阻作用所引起。

或者，可进行如Champe等人(1995)J.Biol.Chem.270：1388-1394中描述的表位作图，来测定抗体是否结合目的表位。也可采用Cunningham和Wells(1989)Science 244：1081-1085所描述的“丙氨酸扫描诱变”，或者一些其他形式的对人TSLP中氨基酸残基的点诱变，来确定本发明抗TSLP抗体的功能表位。但是，诱变研究还可揭示对TSLP的总体三维结构重要、但不直接参与抗体-抗原接触的氨基酸残基，因此可能需要其他的方法来证实用这个方法确定的功能表位。

被特定抗体结合的表位，还可通过评估该抗体与包含人TSLP的片段的肽的结合来确定。人TSLP的氨基酸序列在WO 00/17362中的SEQ ID NO：4中给出。可合成一系列的包涵TSLP的序列的重叠肽，并例如在直接ELISA、竞争性ELISA(在评估肽是否能够防止抗体与结合到微量滴定板壁的TSLP发生结合时)中或者在芯片上筛查结合情况。这种肽筛查方法可能不能够检测一些不连续的功能表位，即涉及到在TSLP多肽链的一级序列上不毗连的氨基酸残基的功能表位。

被本发明抗体结合的表位也可通过结构方法来测定，如X射线晶体结构测定(例如WO2005/044853)、分子建模和核磁共振(NMR)光谱学，包括对TSLP在游离时和在与目的抗体成复合物而被结合时其中的不稳定酰胺氢的H-D交换速度的NMR测定在内(Zinn-Justin等人(1992)Biochemistry 31，11335-11347；Zinn-Justin等人(1993)Biochemistry 32，6884-6891)。

就X射线晶体学来说，可使用本领域的任何已知方法来实现结晶化(例如Giege等人(1994)Acta Crystallogr.D50：339-350；McPherson(1990)Eur.J.Biochem.189：1-23)，包括微批量(microbatch)(例如Chayen(1997)Structure 5：1269-1274)、悬滴气相扩散(例如McPherson(1976)J.Biol.Chem.251：6300-6303)、加晶种和透析在内。适宜使用浓度为至少约1mg/mL、优选约10mg/mL至约20mg/mL的蛋白质制品。结晶化可最好在含有浓度约10％至约30％(w/v)的聚乙二醇1000-20,000(PEG；平均分子量在约1000至约20,000Da之间、优选约5000至约7000Da之间、更优选约6000Da)的沉淀剂溶液(precipitantsolution)中实现。还可能需要包括蛋白质稳定剂，例如浓度约0.5％至约20％的甘油。在沉淀剂溶液中也可能需要合适的盐，如氯化钠、氯化锂或柠檬酸钠，浓度范围优选在约1mM至约1000mM。沉淀剂优选缓冲到约3.0至约5.0的pH，优选约4.0。适用于沉淀剂溶液的具体缓冲剂可不同，且是本领域公知的(Scopes，Protein Purification：Principles and Practice，第三版，(1994)Springer-Verlag，New York)。有用的缓冲剂的实例包括但不限于HEPES、Tris、MES和乙酸盐。晶体可在广泛范围的温度下生长，包括2℃、4℃、8℃和26℃在内。

抗体：抗原晶体可用公知的X-射线衍射技术进行研究，并可用计算机软件如X-PLOR(耶鲁大学，1992，Molecular Simulations，Inc.经销；参见例如Blundell&Johnson(1985)Meth.Enzymol.114&115，H.W.Wyckoff等人(编辑)，Academic Press；美国专利申请公开号2004/0014194)和BUSTER(Bricogne(1993)Acta Cryst.D49：37-60；Bricogne(1997)Meth.Enzymol.276A：361-423，Carter&Sweet(编辑)；Roversi等人(2000)Acta Cryst.D56：1313-1323)进行精修，所有这些文献和专利的公开内容通过引用整体并入本文。

作为本发明抗体结合同一表位的另外的抗体，可例如通过筛查针对TSLP产生的抗体是否结合该表位来获得，或者通过用包含有包含表位序列的人TSLP的片段的肽免疫动物来获得。结合同一功能表位的各抗体可预期能显示相似的生物活性，如阻断受体结合，且这种活性可通过抗体的功能测定来确证。

抗体亲和力(例如对人TSLP)可用标准的分析来测定。优选的人源化抗体是那些以不超过约1x10^-7、优选不超过约1x10^-8、更优选不超过约1x10^-9、最优选不超过约1x10^-10M的K_D值结合人TSLP的人源化抗体。

可用于本发明组合物和方法的抗体及其片段是生物活性抗体和片段。本文所用的术语“生物活性”指能够结合期望的抗原表位并直接或间接发挥生物作用的抗体或抗体片段。通常，这些作用因TSLP不能与其受体结合而产生。在一个实施方案中，可用于本发明组合物和方法的抗体及其片段能抑制：转染有hTSLP受体和IL-7Rα的Baf-3细胞系的hTSLP诱导的增殖；从转染有TSLP受体和萤光素酶受体系统的Baf-3细胞系的hTSLP诱导的萤光素酶表达；从分离自PBMCs的人原代单核细胞的hTSLP诱导的TARC分泌；和Th2分化的诱导。

本文所用的术语“特异性”指抗体与靶标抗原表位的选择性结合。可通过在给定的一组条件下，将与TSLP的结合情况和与非相关抗原或抗原混合物的结合情况进行比较，来测试抗体的结合特异性。如果抗体结合TSLP比它结合非相关抗原或抗原混合物多至少10倍、优选50倍，则认为它是特异性的。“特异性结合”TSLP的抗体不会结合不包含TSLP衍生序列的蛋白质，即本文所用的“特异性”与TSLP特异性有关，而不是与所涉及的蛋白质中可能存在的任何其他序列有关。例如，本文所用的“特异性结合”TSLP的抗体通常会结合FLAG-hTSLP，后者是包含TSLP和

蛋白标签的融合蛋白，但它不会结合单独的

肽标签或者与TSLP之外的蛋白质融合的肽标签。

VI.药用组合物

为制备药物组合物或无菌组合物，将抗体或其片段与药物可接受载体或赋形剂混合，参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences和U.S.Pharmacopeia：National Formulary，Mack Publishing Company，Easton，PA(1984)。治疗剂和诊断剂的制剂，可通过与生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂以例如冻干粉、浆液、水溶液或悬浮液的形式混合来制备(参见例如Hardman等人(2001)Goodman and Gilman′s ThePharmacological Basis of Therapeutics，McGraw-Hill，New York，NY；Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Lippincott，Williams和Wilkins，New York，NY；Avis等人(编辑)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications，Marcel Dekker，NY；Lieberman等人(编辑)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets，Marcel Dekker，NY；Lieberman等人(编辑)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems，Marcel Dekker，NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety，Marcel Dekker，Inc.，New York，NY)。

单独给予或与免疫抑制剂组合给予的抗体组合物的毒性和治疗功效，可通过细胞培养或实验动物的标准药物程序来测定，例如是测定LD₅₀(对50％的群体致死的剂量)和ED₅₀(在50％的群体中治疗上有效的剂量)。毒性作用和治疗作用之间的剂量比是治疗指数，它可以LD₅₀和ED₅₀之比表示。优选显示高治疗指数的抗体。从这些细胞培养测定和动物研究获得的数据，可用于配制一系列用于人类的剂量。这些化合物的剂量优选落在包括ED₅₀的一系列循环浓度之内，且毒性极少或没有。取决于所采用的剂型和所应用的给予途径，剂量可在这个范围内变化。

合适的给予途径包括胃肠外给予，如肌肉内、静脉内或皮下给予。用于药物组合物或用以实施本发明方法的抗体的给予，可按多种常规方式执行，如口服摄入、吸入、局部应用或者皮肤、皮下、腹膜内、胃肠外、动脉内或静脉内注射。在一个实施方案中，本发明的结合化合物是静脉内给予。在另一个实施方案中，本发明的结合化合物是皮下给予。

或者，可以以局部方式而不是全身方式给予抗体，例如通过将抗体直接注射到关节或者以免疫病理学为特征的病原体引发伤口中来给予，这往往是以长效制剂(depot formulation)或缓释制剂给予。此外，可以在定向药物递送系统中给予抗体，例如在包被组织特异性抗体的脂质体中给予，以靶向例如关节或者以免疫病理学为特征的病原体引发伤口。脂质体会被导向到受影响组织并被该组织选择性吸收。

为某治疗剂选择给药方案要取决于几个因素，包括治疗剂实体(entity)的血清或组织周转率、症状的程度、治疗剂实体的免疫原性以及生物基质中的靶标细胞的可接近性。优选地，给药方案能使递送到患者的治疗剂的量最大，同时符合可接受的副作用水平。因此，所递送的生物药剂的量，部分取决于该具体的生物药剂实体和所治疗的病症的严重程度。有关选择抗体、细胞因子和小分子的适当剂量的指导是现成可得的(参见例如Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy，BiosScientific Pub.Ltd，Oxfordshire，UK；Kresina(编辑)(1991)MonoclonalAntibodies，Cytokines and Arthritis，Marcel Dekker，New York，NY；Bach(编辑)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy inAutoimmune Diseases，Marcel Dekker，New York，NY；Baert等人(2003)New Engl.J.Med.348：601-608；Milgrom等人(1999)New Engl.J.Med.341：1966-1973；Slamon等人(2001)New Engl.J.Med.344：783-792；Beniaminovitz等人(2000)New Engl.J.Med.342：613-619；Ghosh等人(2003)New Engl.J.Med.348：24-32；Lipsky等人(2000)New Engl.J.Med.343：1594-1602)。

适当剂量的确定，由临床医生例如使用本领域已知或怀疑会影响治疗或者预知会影响治疗的参数或因素来作出。一般来说，剂量从稍低于最佳剂量的量开始，之后少量递增，直到相对于任何负面副作用达到期望或最佳的效果。重要的诊断度量(measure)包括例如炎症的症状的度量或者所产生的炎性细胞因子的水平。优选地，所要使用的生物药剂衍自所要治疗的动物的同一物种，从而使对试剂的炎性应答、自身免疫应答或增殖应答减至最低。

抗体、抗体片段和细胞因子可通过连续输注来提供，或者通过在例如一天、一星期或每星期1-7次的时间间隔给予的各剂量来提供。各剂量可通过静脉内、皮下、局部、口服、鼻内、直肠内、肌肉内、大脑内、脊柱内方式提供，或者通过吸入提供。优选的剂量方案是这样的方案，它能达到最大剂量或剂量频率，但该最大剂量或剂量频率能避免显著的不需要的副作用。每周总剂量一般为至少0.05μg/kg体重，更一般至少0.2μg/kg，最一般至少0.5μg/kg，通常至少1μg/kg，更通常至少10μg/kg，最通常至少100μg/kg，优选至少0.2mg/kg，更优选至少1.0mg/kg，最优选至少2.0mg/kg，理想地至少10mg/kg，更理想地至少25mg/kg，最理想地至少50mg/kg(参见例如Yang等人(2003)New Engl.J.Med.349：427-434；Herold等人(2002)New Engl.J.Med.346：1692-1698；Liu等人(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67：451-456；Portielji等人(20003)Cancer Immunol.Immunother.52：133-144)。小分子治疗剂如肽模拟物、天然产物或有机化学品的期望剂量，以摩尔/kg为单位，与抗体或多肽的大约相同。

本文所用的“抑制”或“治疗”，包括与自身免疫疾病或病原体引起的免疫病理有关的症状的发展的延缓，和/或会发展或预期要发展的这种症状的严重程度的减低。这些术语还包括改善现有的不受控制或有害的自身免疫相关或病原体引起的免疫病理症状，防止另外的症状，和改善或防止这些症状的潜在原因。因此，这些术语表示有利的结果已赋予到具有炎性疾病的脊椎动物受试对象。

本文所用的术语“治疗有效量”或“有效量”，指当单独地给予或与另外的治疗剂组合给予细胞、组织或受试对象时，能有效防止或改善自身免疫疾病、或者病原体引起的与疾病或病症有关的免疫病理、或者疾病的进展的抗TSLP抗体或其片段的量。治疗有效剂量还指化合物的足以导致症状的改善的量，所述改善例如相关医学病症的治疗、康复、预防或改进，或者这种病症的治疗、康复、预防或改进的速度的提高。治疗有效量当应用于单独给予的单个活性成分时，仅指该成分。治疗有效量当应用于组合时，指导致治疗作用的各活性成分的组合量，不管这些活性成分是组合给予、依序给予或同时给予。治疗剂的有效量会减少症状通常达至少10％，常常达至少20％，优选至少约30％，更优选至少40％，最优选达至少50％。

共给予的方法或者用第二治疗剂如细胞因子、类固醇、化学治疗剂、抗生素或放射进行治疗的方法，是本领域公知的，参见例如Hardman等人(编辑)(2001)Goodman and Gilman’s ThePharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill，NewYork，NY；Poole和Peterson(编辑)(2001)Pharmacotherapeutics forAdvanced Practice：A Practical Approach，Lippincott，Williams&Wilkins，Phila.，PA；Chabner和Longo(编辑)(2001)CancerChemotherapy and Biotherapy，Lippincott，Williams&Wilkins，Phila.，PA。本发明的药物组合物还可含有其他的免疫抑制剂或免疫调节剂。可采用任何合适的免疫抑制剂，包括但不限于抗炎剂、皮质类固醇、环胞菌素、他克莫司(即FK-506)、西罗莫司、干扰素、可溶性细胞因子受体(例如sTNRF和sIL-1R)、能中和细胞因子活性的药剂(例如英夫利昔单抗、依那西普)、麦考酚酸莫酯、15-脱氧精胍菌素、沙利度胺、格拉默、硫唑嘌呤、来氟米特、环磷酰胺、甲氨喋呤等。药物组合物还可与其他的治疗方式如光疗法和放射一起应用。

典型的兽医学、实验或研究受试对象包括猴、狗、猫、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、马和人。

VII.抗体产生

为重组产生本发明的抗体，将编码两条链的核酸分离并插入到一个或多个可复制载体中，以进行进一步的克隆(DNA的扩增)或进行表达。编码单克隆抗体的DNA容易用常规程序进行分离和测序(例如通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。有许多载体是现成可得的。载体成分一般包括但不限于以下中的一个或多个：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。在一个实施方案中，本发明人源化抗TSLP抗体的轻链和重链都从同一载体(例如质粒和腺病毒载体)表达。

本发明的抗体可通过任何本领域知道的方法产生。在一个实施方案中，抗体在培养中的哺乳动物或昆虫细胞中表达，所述细胞例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚胎肾(HEK)293细胞、小鼠骨髓瘤NSO细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢(Sf9)细胞。在一个实施方案中，通过标准的层析方法回收和纯化从CHO细胞分泌的抗体，所述方法例如A蛋白、阳离子交换、阴离子交换、疏水相互作用和羟基磷灰石层析。所得的抗体进行浓缩并在20mM乙酸钠，pH 5.5中保存。

在另一个实施方案中，按照WO2005/040395中描述的方法在酵母中产生本发明的抗体。简单的说，将编码目的抗体的各条轻链或重链的各载体导入到不同的酵母单倍体细胞中，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的不同接合型，所述各酵母单倍体细胞任选是互补营养缺陷体。然后使被转化的各单倍体酵母细胞交配或融合，以产生出能够产生重链和轻链两条链的双倍体酵母细胞。双倍体菌株因而能够分泌完全装配和有生物活性的抗体。两条链的相对表达水平可例如如下进行优化：使用具有不同拷贝数的载体，使用不同强度的转录启动子，或者从驱动编码一条或两条链的基因的转录的可诱导启动子诱导表达。

在一个实施方案中，将抗TSLP抗体的各条重链和轻链导入到酵母单倍体细胞中，以产生表达多条轻链的一种接合型的单倍体酵母菌株的文库，和表达多条重链的另一种接合型的单倍体酵母菌株的文库。这些单倍体菌株的文库可进行接合(或者融合成球形体)，以产生表达抗体的组合文库的一系列双倍体酵母细胞，所述抗体组合文库由轻链和重链的各种可能排列(permutation)所组成。然后可对抗体的组合物文库进行筛查，以确定是否有抗体具有优于原始抗体的特性(例如对TSLP的更高亲和力)。参见例如WO2005/040395。

在另一个实施方案中，本发明的抗体是人域抗体，其中抗体可变结构域的各部分连接成分子量大约13kDa的多肽。参见例如美国专利公开号2004/0110941。这种单一结构域、低分予量的药剂在合成方便性、稳定性和给予途径方面具有多个优点。

VIII.应用

本发明提供使用经工程改造的抗TSLP来治疗和诊断炎性疾病的方法。

在一个优选的实施方案中，炎性疾病是哮喘。

在另一个优选的实施方案中，炎性疾病是过敏性炎性疾病。在一个优选的实施方案中，过敏性炎性疾病是过敏性鼻窦炎、过敏性哮喘、过敏性结膜炎或特应性皮炎。

本发明提供使用经工程改造的抗TSLP来治疗和诊断以下疾病的方法：纤维样变性、炎性肠病、何杰金氏淋巴瘤、呼吸道病毒感染或其他病毒感染、类风湿性关节炎，或者任何其他以损伤部位出现炎症为特征的疾病。

参考以下实施例可更好地理解本发明的广泛范围，这些实施例并不意在将本发明局限于具体的实施方案。

本文所有的引述文献都通过引用并入本文，犹如每个单独的出版物或专利申请都具体地和单独地被指明通过引用并入本文。

本领域技术人员会明白，可不背离本发明的精神和范围，对本发明作出许多修改和变化。本文所描述各个具体实施方案仅以举例的方式给出，本发明要受所附权利要求书的条款以及这些权利要求的等同权利要求的全部范围所限定；本发明不受本文中以举例方式给出的具体实施方案的限定。

实施例1

一般方法

分子生物学的标准方法已有描述(Maniatis等人(1982)MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Wu(1993)Recombinant DNA，第217卷，Academic Press，San Diego，CA)。标准的方法还见于Ausbel等人(2001)Current Protocols inMolecular Biology，Vols.1-4，John Wiley and Sons，Inc.New York，NY，其中描述了细菌细胞中克隆和DNA诱变(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)和生物信息学(第4卷)。

蛋白质纯化方法，包括免疫沉淀法、层析、电泳、离心和结晶在内，已有描述(Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science，Vol.1，John Wiley and Sons，Inc.，New York)。化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白产生、蛋白质糖基化已有描述(参见例如Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science，Vol.2，John Wiley andSons，Inc.，New York；Ausubel等人(2001)Current Protocols inMolecular Biology，Vol.3，John Wiley and Sons，Inc.，NY，NY，第16.0.5-16.22.17页；Sigma-Aldrich，Co.(2001)Products for Life ScienceResearch，St.Louis，MO；第45-89页；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory，Piscataway，N.J.，第384-391页)。多克隆抗体和单克隆抗体的产生、纯化和片段化已有描述(Coligan等人(2001)CurrentProtcols in Immunology，Vol.1，John Wiley and Sons，Inc.，New York；Harlow和Lane(1999)Using Antibodies，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY；Harlow和Lane，同上)。表征配体/受体相互作用的标准技术现成可得(参见例如Coligan等人(2001)CurrentProtcols in Immunology，Vol.4，John Wiley，Inc.，New York)。

流式细胞术方法，包括荧光激活细胞分选术(FACS)在内，是现成可得的(参见例如Owens等人(1994)Flow Cytometry Principles forClinical Laboratory Practice，John Wiley and Sons，Hoboken，NJ；Givan(2001)Flow Cytometry，2^nd ed.；Wiley-Liss，Hoboken，NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry，John Wiley and Sons，Hoboken，NJ)。适用于修饰核酸(包括核酸引物和探针)、多肽和抗体以用作例如诊断试剂的荧光试剂，是现成可得的(Molecular Probes(2003)Catalogue，MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue，St.Louis，MO)。

免疫系统组织学的标准方法已有描述(参见例如Muller-Harmelink(编辑)(1986)Human Thymus：Histopathology and Pathology，SpringerVerlag，New York，NY；Hiatt等人(2000)Color Atlas of Histology，Lippincott，Williams，and Wilkins，Phila，PA；Louis等人(2002)BasicHistology：Text and Atlas，McGraw-Hill，New York，NY)。

用于测定例如抗原片段、前导序列、蛋白质折叠、功能域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库，是现成可得的(参见例如GenBank，Vector

Suite(Informax，Inc，Bethesda，MD)；GCGWisconsin Package(Accelrys，Inc.，San Diego，CA)；(TimeLogic Corp.，Crystal Bay，Nevada)；Menne等人(2000)Bioinformatics 16：741-742；Menne等人(2000)BioinformaticsApplications Note 16：741-742；Wren等人(2002)Comput.MethodsPrograms Biomed.68：177-181；von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133：17-21；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14：4683-4690)。

实施例2

抗人TSLP抗体的人源化

大鼠抗人TSLP抗体23B12通过以专利保藏号(patent depositdesignation)“PTA-7951”保藏在美国模式培养物保藏所(Manassas，VA)(“ATCC”)的杂交瘤产生。大鼠抗人TSLP抗体23B12的人源化基本上按PCT专利申请公开说明书WO 2005/047324和WO 2005/047326(通过引用并入本文)的描述进行。

将抗TSLP单克隆抗体(23B12)的可变轻链和重链结构域克隆，并分别与人κ轻链(CL结构域)和人IgG1重链(CH1-铰链-CH2-CH3)融合。

将非人VH结构域的氨基酸序列与一组三个人VH种系氨基酸序列进行比较；该组由亚组IGHV1、IGHV3和IGHV4中每个亚组选一个代表组成。在M.-P.Lefranc，″Nomenclature of the HumanImmunoglobulin Heavy(IGH)Genes″，Experimental and ClinicalImmunogenetics，18：100-116，2001中列举有VH亚组。在亚组VH1中，大鼠23B12抗体对人重链种系DP-14得分最高。

对于大鼠23B12抗体，VL序列属VL的κ亚类。将非人VL结构域的氨基酸序列与一组四个人VLκ种系氨基酸序列进行比较。该四个序列的组是由以下文献中列举的四个确立的人VL亚组每个亚组选一个代表组成的：V.Barbie&M.-P.Lefranc，″The HumanImmunoglobulin Kappa Variable(IGKV)Genes and Joining(IGKJ)Segments″，Experimental and Clinical Immunogenetics，15：171-183，1998，和M.-P.Lefranc，″Nomenclature of the Human ImmunoglobulinKappa(IGK)Genes″，Experimental and Clinical Immunogenetics，18：161-174，2001。这四个亚组还对应于以下文献中列举的四个亚组：Kabat等人″Sequences of Proteins of Immunological Interest″，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Pub.91-3242，第5版，1991，第103-130页。在亚组VLkIII中，大鼠23B12抗体对人轻链种系Z-A27得分最高。

一旦确定了可变重链和轻链的靶标氨基酸序列，就产生编码全长人源化抗体的质粒。从编码具有VH1DP-14种系构架的人源化抗IL-23抗体的质粒，和编码具有VLkIII Z-A27种系构架的人源化抗IGFR抗体出发，用Kunkel诱变(参见例如Kunkel T A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 82：488-492)改变质粒，以将DNA序列变化成靶标人源化23B12序列。同时，在所述变化中还进行密码子优化，以提供潜在最佳的表达。人源化重可变链和轻可变链氨基酸序列在SEQ ID NO：10和12中显示。全长人源化重链和轻链氨基酸序列在SEQ ID NO：14和16中显示。还产生了轻链的变体，其中该变体在SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16的氨基酸位置49处包含K(而不是Y)。

实施例3

用KinExA技术测定人源化抗人TSLP的平衡解离常数(K_D)

用KinExA 3000仪(Sapidyne Instruments Inc.，www.sapidyne.com)测定平衡解离常数(K_D)。KinExA使用的是动力学排除测定(KineticExclusionAssay)方法的原理，该方法基于测量抗体、抗原和抗体-抗原复合物的混合物中的未复合抗体的浓度。游离抗体的浓度是通过将该混合物暴露于固相固定化抗原非常短的时间来测量。在实践中，这是通过使溶液相抗原-抗体混合物流过截留在流通池中的抗原包被颗粒来实现。仪器产生的数据用定制软件进行分析。平衡常数是使用基于以下假定的数学理论进行计算：

1.结合遵循可逆结合平衡方程：

k_on[Ab][Ag]＝k_off[AbAg]

2.抗体和抗原1∶1发生结合，总抗体等于抗原-抗体复合物加游离抗体。

3.仪器信号与游离抗体浓度线性相关。

材料

抗体：

大鼠抗人TSLP mAb 23B12.H8.A4(SPB批号PAB330)

大鼠抗人TSLP mAb 23B12.H8.A4(SPB批号PAB330A)

人源化抗人TSLP mAb 23B12(VL Y49)

人源化抗人TSLP mAb 23B12(VL K49)

人源化抗人TSLP mAb 23B12(VL Y49)

抗原：

重组人TSLP(SPB批号P345)

重组人TSLP(SPB批号P367)

重组人TSLP(R&D，目录号1398-TS/CF，批号IDK 015031)

生物素酰化抗原：

生物素酰化人TSLP(SPB批号p367AC)

生物素酰化人TSLP(SPB批号p367AA)

生物素酰化人TSLP(SPB批号38ABMA)

其他试剂：

PMMA颗粒，98微米(Sapidyne，目录号440198)

中和亲和素(Neutravidin)(Pierce，目录号31000)

Cy5缀合山羊抗大鼠IgG(H+L)(Jackson ImmunoresearchLaboratories目录号112-175-167，批号60306)

Cy5缀合山羊抗HuIgG(H+L)(Jackson ImmunoresearchLaboratories目录号109-175-088，批号49069and批号58552)

实验条件：

按照Sapidyne的《用具有短接头臂或不存在接头臂的生物素酰化配体包被PMMA颗粒的方案》，用生物素酰化人TSLP包被PMMA颗粒。所有的实验程序都按照KinExA 3000手册进行。所有运行都一式两份进行。

对于大鼠抗人TSLP单克隆抗体23B12.H8.A4(SPB批号PAB330)，使用以下条件：

样品体积：2mL

样品流速：0.25mL/min

标记体积：1mL

标记流速：0.25mL/min

抗体浓度：0.1nM

最高抗原浓度：10nM

最低抗原浓度：10pM

对于大鼠抗人TSLP单克隆抗体23B12.H8.A4(SPB批号PAB330A)，使用以下条件：

样品体积：4mL

样品流速：0.25mL/min

标记体积：1mL

标记流速：0.25mL/min

抗体浓度：0.05nM

最高抗原浓度：0.5nM

最低抗原浓度：0.5pM

对于人源化抗人TSLP单克隆抗体，使用以下条件：

样品体积：2mL

样品流速：0.25mL/min

标记体积：1mL

标记流速：0.25mL/min

抗体浓度：0.02nM

最高抗原浓度：0.2nM

最低抗原浓度：0.2pM

制备了抗原的两倍系列稀释液，并与恒定浓度的抗体混合。混合物在25℃下温育2小时至平衡。

表4显示KinExA分析的结果。

表4

KinExA测出的K_D值

实施例4

用ELISA测定人源化抗人TSLP的EC₅₀

ELISA测量与腺病毒衍生人TSLP(S-P Biopharma)或大肠杆菌衍生人TSLP(S-P Biopharma或R&D 1398-TS)结合的、从杂交瘤上清液纯化的大鼠23B12或重组人源化23B12IgG1的EC50。

材料：

Nunc Maxisorb96孔Immunoplate cert.(Nunc#439454)

0X磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH 7.4(Fisher#BP399-20)

20X Tris缓冲盐水(TBS)，pH 7.4(Technova#1680)

Tween-20，酶级(Fisher#BP337-500)

500mM EDTA(Technova#E0306)

清蛋白，牛血清PIA级(Sigma#A7888)

包被缓冲液：1μg/mL TSLP于PBS中，100μL/孔

检测试剂：

HRP-F(ab)′2山羊抗人IgG H+L(Jackson#109-036-088)；

HRP-F(ab)′2山羊抗大鼠IgG H+L(Jackson#112-032-072)

底物和终止溶液：

TMB Microwell过氧化物酶底物系统2C(Kirkegaard&PerryLabs#50-76-00)1∶1；1M H₃PO₄0.1mL/孔

ABTS(Kirkegaard&Perry Labs#50-66-06)100μL/孔

ABTS过氧化物酶终止溶液(Kirkegaard&Perry Labs#50-085-02)5X浓缩稀释剂(concentrate diluter)1∶5于MIlli-Q水中，100μL/孔

ELISA稀释液和测定缓冲液：

50mM TBS或PBS；0.5％BSA；0.05％Tween-20；4mM EDTA

ELISA洗涤缓冲液：

50mM TBS或PBS；0.05％Tween-20；4mM EDTA

设备：

Skatron Scanwasher300^TM

Molecular Devices VersaMax^TM微板读数器

方案

如下进行各板的包被：将TSLP(100或200ng/孔)(于PBS中)在4℃下温育过夜。将各板在Skatron洗板机上以1个循环(4次洗涤/循环)进行洗涤，加入0.2mL/孔ELISA测定缓冲液进行封闭，在定轨振荡器上25℃下温育60分钟，然后洗涤1个循环。然后采用系列三倍稀释，将抗体滴定到一排8孔中，浓度从1000ng/mL到0.4572ng/mL，在定轨振荡器上25℃下温育90分钟。将各板洗涤1个循环，以0.1mL/孔加入HRP-山羊F(ab’)₂抗人或抗大鼠IgG(H+L)(1∶5,000稀释)，在定轨振荡器上25℃下温育60分钟。将各板洗涤2个循环，两个循环之间将板旋转。以0.1mL/孔加入TMB或ABTS底物，在定轨振荡器上温育5分钟。然后以0.1mL/孔加入终止溶液，各板在A_450-570nm(TMB)或A_405nm(ABTS)处读数。

表5显示ELISA分析的结果。

表5

ELISA测出EC₅₀的值

1)-B＝TSLP生物素酰化

-F＝TSLP通过K101A/R102A除去弗林蛋白酶(furin)切割位点

2)直接包被200ng TSLP而不是100ng

实施例5

大鼠23B12和人源化23B12抗体对人和食蟹猴TSLP的亲和力

亲本大鼠及其人源化衍生的抗人TSLP抗体23B 12对人(hu)和食蟹猴(cyno)TSLP的动力结合活性，是用BIAcore T100系统(BIAcore AB，Upsalla，瑞典)通过表面等离振子共振进行测量。通过胺偶联化学，将大约100RU的人TSLP或食蟹猴TSLP固定化到传感器芯片CM5(研究级，BR-1006-68)上。用HBS-EP缓冲液(BR-1006-69)作为运行缓冲液，流速为30μL/min。将0.82-600nM的不同浓度的大鼠和人源化23B 12抗体，以30μL/min的流速注射到固定化的人或食蟹猴TSLP表面上。每次注射循环后，用一系列的溶液(分别为10mM甘氨酸pH 1.5和25mM NaOH)以75μL/min的流速使CM5芯片表面再生。

用背景扣除结合传感图(background subtraction bindingsensorgram)，分析缔合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)及平衡解离常数K_D。用BIAevaluation软件(版本1.0)，将所得的数据集与二价分析物模型(bivalent analyte model)拟合。所测出的亲本大鼠23B12抗体对人TSLP的K_D为64pM，而对食蟹猴TSLP配体的数值为86pM(表6)。所测出的人源化23B12抗体对人TSLP的K_D为111pM，而对食蟹猴TSLP配体的数值为132pM(表6)，这表明23B12单克隆抗体人源化后亲和力损失小于两倍。

表6

BIAcore分析

实施例6

评估中和性抗TSLP抗体的增殖生物测定法

应用短期增殖生物测定法，评估单克隆抗体生物学上中和TSLP的能力，该测定法利用能表达重组TSLP受体的细胞。转染子Ba/F3-TSLPR-IL7Ra细胞应答TSLP而增殖，该应答可被中和性抗TSLP抗体抑制。针对在TSLP剂量-应答曲线线性区域当中、高原区域(plateau)附近和TSLP EC₅₀以上选定的TSLP浓度，滴定每个抗体。用Alamar Blue通过比色法测量是否有增殖，Alamar Blue是一种基于代谢活性的检测的生长指示染料。抗体中和TSLP的能力通过其EC50值进行评估，或通过诱导TSLP增殖发生半数最大抑制的抗体浓度进行评估。

Ba/F3转染子维持在RPMI-1640培养基(10％胎牛血清，50μM 2-巯基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，50μug/mL青霉素-链霉素和10ng/mL小鼠IL-3)。

Ba/F3增殖生物测定在RPMI-1640中进行(10％胎牛血清，50μM2-巯基乙醇，2mM L-谷氨酰胺和50μg/mL青霉素-链霉素)。

测定是在96孔平底板(Falcon 3072或类似的板)中进行。各试剂和细胞悬浮液的所有制品都采用适当的生物测定培养基。测定体积为150μL/孔。将抗TSLP抗体的各滴定液与TSLP在室温下预温育30-60分钟，期间制备细胞。在抗体-细胞因子预温育后，将细胞加到各板中。将各生物测定板在加湿的组织培养箱(37C，5％CO₂)中温育40-48小时。在培养时间结束时，加入Alamar Blue(Biosource目录号DAL1100)显色8-12小时。然后在570nm和600nm(VERSAmax微板读数器，Molecular Probes)处读取吸光度，获得OD_570-600。推荐进行两次重复或三次重复试验。

细胞是在健康的生长状态使用，通常密度为3-8x10⁵/mL。将细胞计数、离心沉淀、在生物测定培养基中洗涤两次，悬浮至适当的密度以待接种。

制备TSLP至工作浓度，以75μL加到第一孔。如下进行1∶3系列稀释：取前一孔25μL加入后一孔50μL生物测定培养基，最终留下50μL/孔。将细胞悬浮至适当的密度备以100μL/孔接种。

制备抗体至工作浓度，以75μL加到第一孔。如下进行1∶3系列稀释：取前一孔25μL加入后一孔50μL生物测定培养基，最终留下50μL/孔。将适当浓度的TSLP以50μL/孔加到含有被滴定抗体的各孔中。将细胞悬浮至适当的密度备以50μL/孔接种，在抗体-细胞因子预温育后加入。

使用GraphPad Prism 3.0软件，将吸光度对细胞因子或抗体浓度作图，用S形剂量应答的非线性回归(曲线拟合)测定EC50值。

测定结果在表7中显示。

表7

增殖的抑制

实施例7

抗TSLP单克隆抗体r23B12对人原代树突细胞(CD)的TSLP诱导的TARC产生的中和活性

外周血单核细胞(PBMCs)是通过Ficoll离心从获自健康血液供方(斯坦福医学院血液中心，斯坦福，加州)的血沉棕黄层(buffy coat)分离，CD11c+树突细胞是通过用负选择进行MACS(Miltenyi Biotech，Auburn，CA)后用FACS进行细胞分选获得。谱系阴性(Lin^-)细胞是使用小鼠抗人CD3单克隆抗体(OKT3，DNAX)和小鼠抗CD16单克隆抗体和山羊抗小鼠IgG包被的磁珠(Miltenyi Biotech)，和使用直接包被有抗CD19、CD56和CD14单克隆抗体(Miltenyi Biotech)的磁珠，通过MACS将T细胞、B细胞、NK细胞、红细胞和单核细胞从PBMC排除出来获得。随后，将Lin^-细胞用TC-抗CD4(Caltag，Burlingame，CA)、PE-抗CD11c和FITC-抗CD3、-抗CD14、-抗CD19、-抗CD56、-抗CD16和-抗CD20(均获自BD Biosciences，San Diego，CA)染色，在Vantage FACsorter^TM(BD Biosciences)上将CD11c+DC分选至纯度大于99％的CD11c⁺CD4⁺Lin^-细胞。

分选后立即将CD11c⁺CD4⁺DCs在含有10％FCS和1％丙酮酸(Mediatech)、HEPES(Invitrogen，Grand Island，NY)和青霉素-链霉素(Mediatech)的RPMI(Mediatech，Herndon，VA)中培养。将细胞以0.5x10⁶/ml接种在平底96孔板中，各板中存在着单独培养基、TSLP(15ng/ml，DNAX)，或者TSLP与中和性抗TSLP单克隆抗体(克隆23B12)或抗TSLPR单克隆抗体或同种型对照大鼠IgG2a(R&D Systems，Minneapolis，MN)的组合。培养24小时后收集DC培养上清液，-20℃下冻藏，通过ELISA(R&D Systems)分析TARC蛋白水平。

结果在表8中提供。

表8

	TARC(pg/ml)
		DC	5
TSLP-DC	1400.5
		TSLP+5μg/ml r23B12抗体	41.5
TSLP+0.5μg/ml r23B12抗体	146
		TSLP+0.05μg/ml r23B12抗体	570.5

TSLP+20μg/ml r23B12抗体

199

在单独培养基中培养的CD11c+DC不产生显著水平的TARC。向CD11c+DC加入TSLP(15ng/ml)诱导了显著的TARC产生水平，最高达约1500pg/ml。TARC的这一TSLP介导诱导，被同时加入的抗TSLP单克隆抗体23B12以剂量依赖性方式阻断。

实施例8

抗TSLP单克隆抗体r23B12对人原代树突细胞的TSLP诱导的Th2分化的中和活性

外周血单核细胞(PBMCs)是通过Ficoll离心从获自健康血液供方(斯坦福医学院血液中心，斯坦福，加州)的血沉棕黄层分离，CD11c+树突细胞是通过用负选择进行MACS(Miltenyi Biotech，Auburn，CA)后用FACS进行细胞分选获得。谱系阴性(Lin-)细胞是使用小鼠抗人CD3单克隆抗体(OKT3，DNAX)和小鼠抗CD16单克隆抗体和山羊抗小鼠IgG包被的磁珠(Miltenyi Biotech)，和使用直接包被有抗CD19、CD56和CD14单克隆抗体(Miltenyi Biotech)的磁珠，通过MACS将T细胞、B细胞、NK细胞、红细胞和单核细胞从PBMC排除出来获得。随后，将Lin^-细胞用TC-抗CD4(Caltag，Burlingame，CA)、PE-抗CD11c和FITC-抗CD3、-抗CD14、-抗CD19、-抗CD56、-抗CD16和-抗CD20(均获自BD Biosciences，San Diego，CA)染色，在VantageFACsorter^TM(BD Biosciences)上将CD11c⁺DC分选至纯度大于99％的CD11c⁺CD4⁺Lin^-细胞。

分选后立即将CD11c⁺CD4⁺DCs在含有10％FCS和1％丙酮酸(Mediatech)、HEPES(Invitrogen，Grand Island，NY)和青霉素-链霉素(Mediatech)的RPMI(Mediatech，Herndon，VA)中培养。将细胞以0.5x10⁶/ml接种在平底96孔板中，各板中存在着单独培养基、TSLP(15ng/ml，DNAX)，或者TSLP与中和性抗TSLP单克隆抗体(克隆23B12)或抗TSLPR单克隆抗体或同种型对照大鼠IgG2a(R&D Systems，Minneapolis，MN)的组合。在不同条件下培养24小时后，收集CD11c⁺DC，洗涤两次，与异基因(allogeneic)CD4⁺CD45RA⁺幼稚T细胞再培养。

CD4⁺CD45RA⁺幼稚T细胞是用磁珠(Myltenyi Biotech)对CD8、CD16、CD20、CD19、CD56和CD14细胞进行负排除(negative depletion)后，通过细胞分选分离到的。在不同条件下培养24小时后，收集CD11c⁺DC，洗涤两次，与5x10⁴异基因幼稚CD4⁺T细胞在圆底96孔板中以1∶5DC∶T细胞的比例进行共培养。培养6天后，收集上清液，-20℃下冷冻，通过台盼蓝排斥试验测定活细胞数。为测试它们分泌细胞因子的能力，将DC致敏(DC-primed)的CD4⁺T细胞(10⁶/ml)，在可溶性抗CD28单克隆抗体(1000ng/ml)存在下，用交联到链霉亲和素包被的组织培养板的生物素酰化抗CD3(10ng/ml)单克隆抗体进行再刺激。培养24小时后，收集培养上清液，-20℃下冷冻，或者通过Luminex测定法分析IFNγ-、TNFα-、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10和IL-13(Linco Research Inc.，St Charles，MO)。

结果在表9中提供。

表9

细胞因子产生	DC+CD4	TSLP-DC+CD4	TSLP-DC+5μg/mlr23B12+CD4	TSLP-DC+0.5μg/mlr23B12+CD4	TSLP-DC+0.05μg/mlr23B12+CD4
						IL-5(pg/ml)	115	777	24	70.6	32
IL-4(pg/ml)	14	89	14.5	21.3	27.3
						IL-13(pg/ml)	136	1290	55.5	182	43.3

幼稚CD4+CD45RA+T细胞与已在单独培养基中培养过的CD11c+DC的共培养，导致了T细胞群体在被抗CD3+抗CD28单克隆抗体再活化时产生低水平的Th2细胞因子。向原代CD11c+DC培养物加入TSLP(15ng/ml)，诱导了应答T细胞产生显著水平的IL-4、IL-5和IL-13，这提示TSLP-DC诱导了幼稚T细胞向Th2细胞的分化。Th2分化的这一TSLP介导诱导，被同时加入到原代DC培养物的抗TSLP单克隆抗体23B12以剂量依赖性方式阻断。

实施例9

抗人TSLP抗体的食蟹猴源化

有两个研究已证实，食蟹猴(Macaca fascicularis)VL类似于人VLκ-I，而食蟹猴VH类似于人VH-III(41％)、VH-IV(39％)和VH-I(14％)。(Lewis等人，Dev.Comp.Immunol.17：549-560(1993)；和Druar等人，Immunogentics 57：730-738(2005)。为了使hu23B12在食蟹猴中的潜在免疫原性减至最低，将大鼠23B12CDR转移到人VLκ-I和VH-III构架上；然后将它们融合到食蟹猴IgG恒定结构域上。

食蟹猴源化轻链的氨基酸序列是MAPVQLLGLLVLFLPAMRCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQPISISVHWYQQKPGKAPKLLIYFASQSISGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTFSLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSEDQVKSGTVSVVCLLNNFYPREASVKWKVDGVLKTGNSQESVTEQDSKDNTYSLSSTLTLSSTDYQSHNVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：17)。下划线部分为信号序列。

食蟹猴源化重链的氨基酸序列是MAVLGLLFCLVTFPSCVLSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGYIFTDYAMHWVRQAPGKGLEWVATFIPLLDTSDYNQNFKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARMGVTHSYVMDAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYVCNVNHKPSNTKVDKRVEIKTCGGGSKPPTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPDVKFNWYVNGAEVHHAQTKPRETQYNSTYRVVSVLTVTHQDWLNGKEYTCKVSNKALPAPIQKTISKDKGQPREPQVYTLPPSREELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESSGQPENTYKTTPPVLDSDGSYFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：18)。下划线部分为信号序列。

然后在CHO细胞中重组产生食蟹猴源化抗人TSLP 23B12抗体。

实施例10

评估食蟹猴源化抗人TSLP抗体的中和活性的增殖生物测定

应用短期增殖生物测定法，评估食蟹猴源化抗人TSLP 23B12抗体生物学上中和人或食蟹猴TSLP的能力，该测定法利用能表达重组TSLP受体的细胞。转染子Ba/F3-人TSLPR/huIL-7Ra和Ba/F3-cyTSLPR/cyIL-7Ra细胞应答人TSLP和食蟹猴TSLP而增殖，该应答可被中和性抗TSLP抗体抑制。针对在剂量-应答曲线线性区域当中、高原区域附近和EC50以上选定的人或食蟹猴TSLP浓度，滴定抗体。用Alamar Blue通过比色法测量是否有增殖，Alamar Blue是一种基于代谢活性的检测的生长指示染料。抗体中和TSLP的能力通过其EC50值进行评估，或通过诱导TSLP增殖发生半数最大抑制的抗体浓度进行评估。

Ba/F3转染子维持在RPMI-1640培养基(10％胎牛血清，50μM 2-巯基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，50ug/mL青霉素-链霉素、10ng/mL小鼠IL-3、1mg/ml G418和2ug/ml嘌呤霉素)。

Ba/F3增殖生物测定在RPMI-1640培养基中进行(10％胎牛血清，50μM 2-巯基乙醇，2mM L-谷氨酰胺和50μg/mL青霉素-链霉素)。

测定是在96孔平底板(Falcon 3072或类似的板)中进行。各试剂和细胞悬浮液的所有制品都采用适当的生物测定培养基。测定体积为150μL/孔。将抗TSLP抗体的各滴定液与人TSLP或食蟹猴TSLP在室温下预温育大约30分钟，期间制备细胞。在抗体-细胞因子预温育后，将细胞加到各板中。将各生物测定板在加湿的组织培养箱(37C，5％CO2)中温育40-48小时。在培养时间结束时，以16.5uL/孔加入AlamarBlue(Biosource目录号DAL1100)显色5-12小时。然后在570nm和600nm(VERSAmax微板读数器，Molecular Devices)处读取吸光度，获得OD_570-600。每个样品进行重复试验。

细胞是在健康的生长状态使用，通常密度为7-9x10⁵/mL。将细胞在生物测定培养基中洗涤两次、计数，悬浮至适当的密度，备以7500个细胞/50ul/孔接种。

制备人或食蟹猴TSLP至工作浓度(600ng/mL)，以75μL加到第一孔。如下进行1∶3系列稀释：取前一孔25μL加入后一孔50μL生物测定培养基，最终留下50μL/孔。将细胞悬浮至适当的密度，备以7500个细胞/50uL/孔接种。为替代抗体的加入，将50ul的生物测定培养基加到这些孔，使最终体积达150ul。

将抗体制备至工作浓度(3X终浓度；每个抗体的最终其实浓度不同)，以75uL加到第一孔。如下进行1∶3系列稀释：取前一孔25μL加入后一孔50μL生物测定培养基，最终留下50μL/孔。将TSLP(对人TSLP而言，工作浓度为9ng/ml，对食蟹猴TSLP则为3ng/ml)以50uL/孔加到含有被滴定抗体的各孔中。然后将细胞悬浮至适当密度备以7500个细胞/50uL/孔接种，在抗体-细胞因子预温育后加入。

使用GraphPad Prism 4软件，通过用S形剂量应答的非线性回归(曲线拟合)测定EC50值。对于TSLP剂量应答，将吸光度对细胞因子浓度作图。对于中和活性，将抑制百分数对抗体浓度作图。

测定结果在表10中显示。

表10

人或食蟹猴TSLPR转染细胞的基于Ba/F3细胞的测定

^*人-食蟹猴＝食蟹猴恒定结构域上人源化23B 12VL/VH

^**食蟹猴-人＝人恒定结构域上食蟹猴源化23B12VL/VH

实施例11

食蟹猴源化抗TSLP抗体的BIAcore和KinExA亲和测定

用实施例5所述的BIAcore T100系统，通过表面等离振子共振测定食蟹猴源化抗人TSLP 23B12抗体对人和食蟹猴TSLP配体的亲和力。

用实施例3所述的KinExA 3000仪器(Sapidyne Instruments Inc.)测定抗TSLP抗体的平衡解离常数。

使用了以下材料：

抗体：

大鼠抗人TSLP GNE01.23B 12.H8.A4(SPB批号pab 330A)

人源化抗人TSLP单克隆抗体23B12(621HC/780LC)

食蟹猴源化抗人TSLP单克隆抗体23B12

(782+MAFA19/781MAFA7)

食蟹猴源化抗人TSLP单克隆抗体23B12(782+hIgG1/781人κ)

食蟹猴源化抗人TSLP单克隆抗体23B12(人V-食蟹猴C嵌合体)

抗原：

重组人TSLP，R&D Systems(目录号1398-TS/CF，Lot.IDK015031)

重组人TSLP，R&D Systems(目录号1398-TS，Lot.IDK 026031)

生物素酰化人TSLP(SPB批号38ABMA)

其他试剂：

PMMA颗粒，98微米(Sapidyne，目录号440198)

中和亲和素(Neutravidin)(Pierce，目录号31000)

Cy5缀合山羊抗huIgG(H+L)(Jackson ImmunoresearchLaboratories目录号109-175-088，批号58552)

对于大鼠23B12，使用以下条件：

样品体积：2ml

样品流速：0.25ml/min

标记体积：1ml

标记流速：0.25ml/min

单克隆抗体浓度：0.05nM

最高抗原(TSLP)浓度：0.5nM

最低抗原(TSLP)浓度：0.5pM

对于人23B12，使用以下条件：

样品体积：2ml

样品流速：0.25ml/min

标记体积：1ml

标记流速：0.25ml/min

单克隆抗体浓度：0.02nM

最高抗原(TSLP)浓度：0.4nM

最低抗原(TSLP)浓度：0.4pM

对于食蟹猴23B12，使用以下条件：

样品体积：2ml

样品流速：0.25ml/min

标记体积：1ml

标记流速：0.25ml/min

单克隆抗体浓度：0.1nM

最高抗原(TSLP)浓度：1nM

最低抗原(TSLP)浓度：1pM

对于人-食蟹猴23B12^*和食蟹猴-人23B12^**，使用以下条件：

样品体积：2ml

样品流速：0.25ml/min

标记体积：1ml

标记流速：0.25ml/min

单克隆抗体浓度：0.05nM

最高抗原(TSLP)浓度：1nM

最低抗原(TSLP)浓度：1pM

对于所有的实验，制备了抗原的两倍系列稀释液，并与恒定浓度的抗体混合。混合物在室温下温育2小时至平衡。上述的BIAcore和KinExA实验的结果在表11中总结。

表11

Biacore和Kinexa结合亲和力测量值KD(pM)

^*人-食蟹猴＝食蟹猴恒定结构域上人源化23B12VL/VH

^**食蟹猴-人＝人恒定结构域上食蟹猴源化23B12VL/VH

总之，根据BIAcore和KinExA测量值(表11)，人源化抗人TSLP23B12抗体所显示的结合比亲本大鼠抗体减少大约5倍。用在食蟹猴中潜在免疫原性较低的人源化23B12构架(VLκ-I/VH-III)代替人源化23B12构架(VLκ-III/VH-I)，相比于亲本大鼠23B12实现了结合降低10倍，相比于人23B12实现了结合降低5倍(表10、11)。

实施例12

食蟹猴源化抗TSLP 23B12抗体的药代动力学研究

设计了ELISA测定，以测量食蟹猴源化抗TSLP抗体到达接种这种抗体的动物体内的血浆、血清或支气管肺泡灌洗(BAL)液的量。

试剂和缓冲液：

固相载体：Nunc Maxisorp 96孔板(目录号439454)

包被缓冲液：50mM碳酸钠/碳酸氢钠pH9.6

封闭缓冲液：0.5％BSA于PBS中

测定稀释剂缓冲液0.5％BSA[wt/v]，0.05％Tween 20[v/v]，0.25％CHAPS[wt/v]，5mM EDTA，0.35M NaCl于PBS中(AD)，pH7.4

洗涤缓冲液：0.05％Tween 20于PBS中

捕捉分子：人TSLP，38ABM，2497μg/mL

检测分子：

·QED R799，3600ug/mL(兔多克隆抗食蟹猴23B12抗体)

·抗兔HRP，JIR目录号711-036-152

底物：TMB(Kirkegaard&Perry，目录号50-76-03)

终止溶液：1M H3PO4

板洗涤机SkanWasher 300型号12010(Molecular Devices目录号0200-3903)

终止溶液：SpectraMax Plus 384微量滴定板分光光度计(MolecularDevices零件号码0112-0056

方案：

如下进行各板的包被：将包被缓冲液中的人TSLP(100ng/孔)在40C下温育过夜。将各板在Skatron洗板机上洗涤1个循环(3次洗涤/循环)，加入150μL/孔的封闭缓冲液进行封闭，在定轨振荡器上室温下温育60分钟，然后洗涤1个循环。采用系列两倍稀释，将食蟹猴源化抗TSLP 23B12抗体标准物滴定到一排8孔中(重复两次)，浓度从200ng/mL到1.56ng/mL。各样品分别系列稀释至它们的预期水平。将100μL的标准物、对照物和样品加到包被板，在定轨振荡器上室温下温育120分钟。将各板洗涤2个循环，以100μL/孔加入兔多克隆抗cy23B12抗体，在定轨振荡器上室温下温育60分钟。将各板洗涤2个循环，以100μL/孔加入HRP-驴抗兔IgG(H+L)(1∶10,000稀释)，在定轨振荡器上室温下温育60分钟。将各板洗涤2个循环，两个循环之间将板旋转。以100μL/孔加入TMB底物，在定轨振荡器上温育大约5分钟。然后以100μL/孔加入终止溶液，各板在A_450-570nm(TMB)处读数。

这个测定能检测血浆(5％稀释)和血清中低至156ng/mL的食蟹猴源化抗TSLP抗体，和BAL液中低至3.2ng/mL的食蟹猴源化抗TSLP抗体。

这个ELISA测定用来测量食蟹猴源化抗TSLP 23B12抗体在给予小鼠和猴子后的药代动力学。

在正常CD-1小鼠中进行了单剂量药代动力学(PK)研究。在这个研究中，10只小鼠通过静脉内(IV)给药接受了10mg/kg的抗体；还有10只小鼠通过皮下(SC)给药接受了10mg/kg的抗体。研究结果在表12中总结。

表12

途径	清除率(mL/天/kg)	Vss(mL/kg)	AUC 0-最后(μg*天/mL)	t ¹/₂最终(terminal)(天)	Tmax(天)	Cmax(μg/mL)	F(％)
								IV	24.8	220	366	6.69	-	-	-
IV(不含(w/o)第10天)	22.8	198	404	6.36
								SC	-	-	370	3.13	0.667	73.7	95.6

表13总结了IV或SC给药后，在不同时间点见到的食蟹猴源化抗TSLP抗体在BAL液和血清中的百分比。

表13

时间点(天)	IVBAL/血清平均值(％)	SCBAL/血清平均值(％)
			0.250	1.686	4.080
1.000	2.811	5.880

3.000	5.677	7.301
			7.000	13.740	16.945
10.000	14.319	5.064
			14.000	6.517	16.912

还在食蟹猴中进行了两个单剂量药代动力学研究。这两个研究使用到不同配方的食蟹猴源化抗TSLP 23B12抗体：一个配方含有0.05％的Triton X-100，另一个配方不含Triton X-100。每个研究有三只猴子。每个研究所用的剂量在表14中给出。抗体是皮下给予。研究结果在表14和15中总结。

表14

表15

实施例13

将食蟹猴化抗TSLP 23B12抗体给予食蟹猴

从悬浮培养的稳定转染CHO细胞系产生食蟹猴化抗TSLP 23B12抗体。收获上清液，浓缩(contreated)，用几个标准的层析步骤进行纯化，获得内毒素低、纯度95％以上的制品。经纯化的抗体在20mM乙酸钠，pH 5.5、7％(w/v)蔗糖和0.05％Triton X-100中进行配制，以便操作和使用(包括多次冷冻-解冻在内)时稳定。要将这个抗体给予马尘螨(HDM)过敏食蟹猴，以证明抗TSLP抗体治疗过敏性肺部炎症的有效性。这个动物模型使得有可能从对照动物和cy23B12处理的动物收集呼吸道组织、BAL液和相关PBMC；并将提供在早期过敏反应(EAR)和晚期过敏反应(LAR)中取得功效的能力。有关慢性过敏性哮喘的非灵长类动物模型的更多信息，是本领域公知的。参见例如Schelegle等人，Am.J.Pathology 158(1)：333-341(2001)；Avdalovic等人，Am.J.Respir.Crit.Care Med.174：1069-74(2006)；Care和Van Scott等人，J.Appl.Physiol.99(6)：2080-2086(2005)。

本领域技术人员会明白，可不背离本发明的精神和范围，对本发明作出许多修改和变化。本文所描述各个具体实施方案仅以举例的方式给出，本发明要受所附权利要求书的条款以及这些权利要求的等同权利要求的全部范围所限定；本发明并不能受本文中以举例方式给出的具体实施方案的限定。

对以上出版物或文献的引述，并不意在承认任何前述出版物或文献是相关现有技术，也不构成对这些出版物或文献的内容或日期的确认。本文参考的各件美国专利和其他出版物通过引用并入本文。

Claims

1.一种特异性结合人和食蟹猴TSLP的结合化合物，所述结合化合物包含：

至少一个抗体重链可变区或其TSLP结合片段，所述重链可变区包含SEQ ID NO：1的CDR-H1、SEQ ID NO：2的CDR-H2和SEQ IDNO：3的CDR-H3；和

至少一个抗体轻链可变区或其TSLP结合片段，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：4的CDR-L1、SEQ ID NO：5的CDR-L2和SEQ IDNO：6的CDR-L3。

2.权利要求1的结合化合物，所述结合化合物包含：

包含SEQ ID NO：10的残基1-116的重链可变区；和

包含SEQ ID NO：12的残基1-108的轻链可变区。

3.一种分离核酸，所述分离核酸编码权利要求1-2的结合化合物中的任一个。

4.一种表达载体，所述表达载体包含可操作地与控制序列连接的权利要求3的核酸，所述控制序列在宿主细胞被所述载体转染时能被宿主细胞识别。

5.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求4的表达载体。

6.一种产生多肽的方法，所述方法包括：

在其中核酸序列得以表达的条件下在培养基中培养权利要求5的宿主细胞，从而产生包含轻链和重链可变区的多肽；和

从宿主细胞或培养基回收多肽。

7.权利要求1-2的任一项的结合化合物，其中所述结合化合物是人源化抗体或其TSLP结合片段。

8.权利要求1-2的任一项的结合化合物，其中所述结合化合物是选自Fab、Fab’、Fab'-SH、Fv、scFv、F(ab’)₂和双抗体的TSLP结合抗体片段。

9.一种用于抑制人受试对象中的免疫应答的组合物，所述组合物包含权利要求1-2的结合化合物中的任一个和与之组合的药物可接受载体或稀释剂。

10.权利要求1-2的任一项的结合化合物，其中所述结合化合物能阻断TSLP介导的活性。

11.权利要求1-2的任一项的结合化合物，其中所述结合化合物在交叉阻断测定中能够阻断TSLP与TSLPR的结合。

12.权利要求1-2的任一项的结合化合物或其TSLP结合片段用于制备抑制免疫应答的药物的用途。

13.权利要求1-2的任一项的结合化合物或其TSLP结合片段用于制备治疗炎症的药物的用途。

14.权利要求1-2的任一项的结合化合物或其TSLP结合片段用于制备治疗过敏性炎症的药物的用途。

15.权利要求1-2的任一项的结合化合物或其TSLP结合片段用于制备治疗过敏性鼻窦炎、过敏性哮喘、过敏性结膜炎或特应性皮炎的药物的用途。

16.权利要求1-2的任一项的结合化合物或其TSLP结合片段用于制备治疗哮喘的药物的用途。