JP2006517787A - ポリペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
i)図1aまたは図1bに提示されるアミノ酸配列のおよそ残基128〜224由来のアミノ酸残基からなるポリペプチド断片、
ii)図1aまたは図1bに提示されるアミノ酸配列のおよそ残基128〜224由来のアミノ酸残基からなるポリペプチド断片であって、上記配列は、少なくとも1つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換により修飾されたポリペプチド断片、および
iii)(i)および(ii)に定義されるようなポリペプチドであって、図1aまたは図1bに表されるポリペプチドの生物活性を実質的に保持するポリペプチド
からなる群から選択される核酸分子が提供される。
i)
a)本発明によるポリペプチド、および
b)(a)におけるポリペプチドに関する結合部位(複数可)からなるp53ポリペプチドまたはそれらの断片
を含む調製物を形成すること、
ii)試験されるべき少なくとも1つの作用物質を供給すること、
iii)(a)におけるポリペプチドの(b)におけるポリペプチドへの結合に関して作用物質の活性を決定することと
を含む方法が提供される。
細胞培養、抗体およびプラスミド
Saos−2、MCF−7およびU2OS細胞を、10%FCS、100IU/mlペニシリン−ストレプトマイシンおよび2mM グルタミンを補充したDMEM中で成長させた。抗p53抗体DO−1およびDO−13はモノクローナル抗体であるのに対して、CM−1は、p53に特異的なウサギポリクローナル抗体である。V5および9E10エピトープは、それぞれマウスモノクローナル抗体V5および9E10により認識される。マウスモノクローナルPC−10は、PCNAタンパク質に特異的である。CD20Leuは、細胞表面マーカーCD20(Becton Dickinson)に特異的なFITC結合モノクローナル抗体である。ASPP1およびASPP2に対するマウスおよびウサギ抗体はこれまでに記載されていた1。iASPP(ペプチドRLQPALPPEAQSVPELEE)に対するマウスおよびウサギ抗体は、Harlow and Lane13により記載されているように産生した。この研究で使用する発現プラスミドはすべて、CMV極初期プロモーターにより駆動される。ASPP1、iASPPおよびCe−iASPPは、V5エピトープで標識する一方で、Ce−p53は、9E10エピトープで標識する。
トランスフェクションミックスは、2.5M CaCl2で沈殿させた1×HBS緩衝液(280mM NaCl、10mM KCl、1.4mM Na2HPO4・2H2O、12mM グルコース、39mM HEPES、pH6.9〜7.3に調整)中の所定のDNAを含んでいた。トランスフェクションミックスを細胞に滴下して、DMEMを用いて6時間後に洗い流した。洗浄の16〜24時間後に、ルシフェラーゼアッセイおよびウェスタンブロット用にはレポーター溶解緩衝液(Promega)中に、あるいはウエスタンまたは免疫沈降手順用にはNP40溶解緩衝液中に細胞を溶解させた。
転写アッセイ用に、5×105個のSaos−2細胞を、6cm皿中でトランスフェクションの24時間前に平板培養した。プラスミドDNAの様々な組合せを、以下の量を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションアッセイはすべて、レポータープラスミド1μgを含有する。野生型ヒトp53 50ng、C.エレガンスp53を発現するプラスミド100ng、ASPP2 4μgまたはASPP1 8μg、ヒトiASPP 5μgまたはCe−iASPP 7.5μgを示されるように使用した。トランスフェクション後、洗浄の16〜24時間後に細胞をレポーター溶解緩衝液(Promega, WI, USA)中に溶解させて、ルシフェラーゼアッセイキット(Promega, WI, USA)を用いてアッセイした。特定のレポーターの活性倍数を、ベクター単独の活性を超えるトランスフェクトしたプラスミドの活性により決定した。ASPPによるp53トランス活性化活性の増加倍数は、各アッセイで使用したプロモーターに関してp53単独の活性で除算したASPPと組み合わせた活性p53により得られた。
Biowhittakerから入手したラット胚線維芽細胞(REF)を、90mm皿中で50%集密にまでDMEM中で成長させた。次に、これまでに記載されているように14、細胞を形質転換した。簡潔に述べると、EJ ras 6.6 2μg、pCE(E1A) 2μg、pCB6−16E 5μg、野生型ヒトp53 5μg、ヒトもしくはC.エレガンスiASPP 1μgまたは5μgを示されるようにREFSにトランスフェクトした。細胞すべてを、同量のneo遺伝子を発現するプラスミドDNAでトランスフェクトした。次に、トランスフェクトした細胞を、400μg/mlのG418で選択し、形質学的に形質転換されたコロニーを、トランスフェクションの3〜4週後にスコア付けした。
FACS分析用に、106個のSaos−2細胞を、10cm皿中でトランスフェクションの24〜48時間前に平板培養した。次に、細胞をCD20を発現するプラスミド 2μgでトランスフェクトした。CD20発現は、トランスフェクションマーカーとして使用した。トランスフェクションは、示されるように、ヒトp53 1μgまたはCe−p53 4μg、ASPP1およびASPP2 10μg、Bax 2μg、アンチセンスiASPP 15μg、ヒトiASPP 7.5μg〜10μgまたはCe−iASPPプラスミド 7.5μgから構成されていた。トランスフェクションの36時間後、接着細胞および浮遊細胞をともに、4mM EDTA/PBSを使用して収集し、FITC結合抗CD20抗体CD20Leuで染色した。各実験に関して、細胞の一皿を、CD20なしで対照ベクターのみでトランスフェクトした。その後、これらの細胞は、CD20プラスミドとともに同時トランスフェクトした場合と同条件下にて抗体CD20Leuで染色し、ネガティブ対照として使用した。CD20プラスミドの発現を欠如した細胞を使用して、CD20ポジティブ(したがって、トランスフェクトした)細胞のゲーティング(gating)を可能にするように基線を設定した。抗体CD20Leuで染色した後、細胞を固定して、ヨウ化プロピジウムで染色した。CD20を発現する細胞すべてのDNA含有量を、記載されているように15フローサイトメーター(Becton Dickson)を用いて分析した。
ウェスタンブロッティング用に、単層で成長させた細胞を、1×PBSで洗浄して、NP40溶解緩衝液(1% Nonidet P40、50mM トリス(pH8.0)、150mM NaCl、1mM EDTA(pH8.0))またはルシフェラーゼレポーター溶解緩衝液のいずれかに溶解させた。細胞抽出物のタンパク質濃度は、BioRadタンパク質タンパク質アッセイ系(BioRad)を用いて標準曲線に対して決定した。抽出物15〜100μgを5×試料緩衝液と混合して、SDS−PAGEゲル上に載せた。ゲルをProtranニトロセルロース膜上へ湿潤転写して、得られたブロットを1×PBS中の10%再構成粉乳中でブロックした。続いて、ブロットを、組織培養培地中であるいは未希釈ハイブリドーマ上清として調製した一次抗体とともにインキュベートして、適切な二次HRP結合抗体(Dako)とともにインキュベートした。各段階間で、ブロットを、TBST(10mM トリス(pH8.0)、150mM NaCl、0.5%Tween20)の繰り返し交換により洗浄した。ブロットを、ECL基質溶液(Amersham Life Science)の使用に続いて、ハイパーフィルムに感光させた。
ASPPファミリーの成員およびp53をin vitro翻訳させて、TNT T7 Quick連結転写/翻訳系(Promega)を用いて35S−メチオニンで標識した。図1Eに示した実験に関して、iASPPのin vitro翻訳した溶解産物15μl、30μlおよび45μlを、p53およびASPP2に加えて添加した。ウサギ抗p53抗体CM1を用いて、非標識p53の存在を検出した。
トランスフェクトしたプラスミド(図1Aおよび図2Cに示されるように)の非存在下または存在下でのU20S細胞をPBSで洗浄し、続いてメチオニンおよびシステインをともに欠如したDMEM中で250μci/mlの35S−メチオニンおよび250μciの35−システインとともに37℃で2時間インキュベートした。次に、細胞をPBSで洗浄した後、収集した。図2Cに関して、トランスフェクションの24時間後に、細胞を、35S−メチオニンおよび35S−システインで2時間in vivo標識した。CD20を発現する細胞(トランスフェクトした細胞)をFITC結合抗CD20抗体で染色した。次に、ビオチン結合抗FITC抗体を細胞ペレットに添加して、インキュベーション後に、細胞をストレプトアビジン結合磁性ビーズと混合して、CD20発現細胞を単離した。続いて、細胞をNP40溶解緩衝液を用いて溶解し、マウス抗iASPP抗体によりタンパク質を免疫沈降させた。免疫沈降物をNET緩衝液で洗浄して、SDS−PAGEおよびオートラジオグラフィで分離した。
細胞の単層を30mm皿で成長させて、1×PBSで洗浄させた。細胞を4%パラホルムアルデヒド1mlで15分間固定させた後、1×PBSで洗浄した。1×PBS中の0.2%トリトン−X100 1mlを使用して、細胞を2分間透過処理して、これを1×PBSの3回洗浄により洗い流した。一次抗体を適切な濃度にて組織培養培地中で調製し、皿に3時間添加した。皿を1×PBSで洗浄し、抗ウサギTRITC(テトラメチルローダミンイソチオシアネート)または抗マウスFITC(フルオレセインイソチオシアネート)のいずれかの二次抗体を製造業者が推奨した希釈(Sigma, UK)にて組織培養培地中で調製し、皿に1時間添加した。細胞を1×PBS中で洗浄して、風乾させた。Citifluor遮蔽剤(Citifluor, UK)を細胞の表面に1滴として適用し、最上部上にカバースリップを配置させた。カバースリップの最上部上に浸漬油1滴により、Zeiss Axiophot蛍光顕微鏡を用いて免疫複合体を可視化させた。抗体9E10およびV5を用いて、それぞれエピトープ標識Ce−p53(9E10)、ヒトiASPP(V5)およびCe−iASPP(V5)の発現を検出した。ヒトp53は、DO.1抗体により検出した。
Ce−ape−1(iASPP)およびCe−cep−1(p53)の完全コード領域を保有するcDNAを、Promegaアクセスキットを用いてRT−PCRにより生成し、ベクターpCR4−TOPO(Invitrogen)にクローニングし、配列決定した。次に、C.エレガンスp53およびiASPPを、それぞれ9E10およびV5のエピトープとフレームで哺乳類発現ベクターpcDNA3にサブクローニングした。完全長Ce−ape−1は、SL1にトランススプライシングされていると予測される(Y. Kohara、未公開)。
RNAiは、確立された手順(Fire et al., 1998、Timmons and Fire, 1998)を用いて摂食またはマイクロインジェクションにより実施した。RNAiによるCe−iASPPおよびCe−p53活性を排除するために、まずN2動物をCe−iASPP RNAi摂食(feeding)にさらした。続いて、20F1動物を摂食プレートから取り出して、Ce−p53 dsRNAを注射し、別個のCe−iASPP dsRNA摂食プレートに戻した。Ce−iASPPを摂食させた動物(Ce−p53 dsRNAの+/−注射)のF2子孫をSYTO12で染色して、アポトーシス死を記載されているように12にスコア付けした。したがって、動物はすべてCe−iASSP摂食RNAiにさらしているため、2つの群で検出されるアポトーシス細胞死の平均数におけるいずれの差異も、Ce−p53 dsRNA注射に起因する可能性が高い。
配列分析により、C.エレガンスp53遺伝子であるcep−1は、p53ファミリーの遠い成員であるが、ASPPに重要な残基およびDNA結合活性は保存されているようであることが示されている3、4。したがって、本発明者等は、ASPP相同体に関するC.エレガンスゲノムを研究し、F46F3.4が、ASPPファミリーの3つすべての成員に対して有意な配列相同性を有するタンパク質をコードする唯一のC.エレガンス遺伝子であることを見出した。F46F3.4に相当する遺伝子は、ape−1(RNAi)により産生される突然変異体表現型に基づいてape−1(アポトーシスエンハンサーのため)と呼ばれている(以下参照)。しかしながら、タンパク質産物は、以後Ce−iASPPと称する。Ce−iASPPは、769個のアミノ酸から構成され、配列比較により、Ce−iASPPのC末端が他のASPP成員と最も保存された領域であることが明らかである(図7)。ASPP2のC末端はp53と相互作用することがこれまでに示された。さらに、この相互作用に関与する1つだけ除いたすべて(7つのうち6つ)の残基が、iASPPおよびCe−iASPPの両方で保存されている。総合すると、これらの結果により、Ce−iASPPはヒトおよびC.エレガンスp53の両方と相互作用する可能性があることが示唆された。このことを、共免疫沈降によりin vitroで試験した。図8Bに示されるように、Ce−iASPPは、ヒトおよびCe−p53の両方と相互作用する。Ce−p53とCe−iASPPとの間の相互作用は、相互免疫沈降によりさらに確認した(図8B、右側のパネル)。
ヒトp53とC.エレガンスp53との間の限定された配列類似性のために、Ce−p53が哺乳類細胞中でアポトーシスを誘発することができるかどうかは明らかではないが、ASPPと接触するCe−p53残基のほとんどが保存されている。Ce−iASPPが、ヒトiASPPと類似した様式でヒトp53の活性を阻害する場合、これは、ASPPファミリーによるp53の調節が進化的に保存されていることを論じる。このことはさらに、Ce−p53の活性が、ASPPファミリーのタンパク質により調節の影響を受けやすいことを示唆する。これらの問題に対処するために、Ce−p53を、同時免疫沈降によりヒトASPPファミリーの成員とin vitroで相互作用するその能力に関して試験した。図6Aに示されるように、Ce−p53は、ASPP2およびiASPPと相互作用する。Ce−p53の発現は、ヒトp53に類似した効率で、ヒト細胞においてアポトーシスを誘発した。意外にも、ヒトASPP、特にヒトASPP2の発現は、Ce−p53の、アポトーシスを誘発する能力を、ヒトp53に類似した程度にまで有意に高め、ヒトiASPPの発現はまた、Ce−p53のアポトーシス機能を阻害した(図6B)。さらに、ヒトおよびC.エレガンスiASPPはともに、同程度にまでCe−p53誘発アポトーシスを阻害した(図6C)。Ce−p53の、p53標的遺伝子プロモーター(例えば、Bax−luc)をトランス活性化する能力もまた試験して、ヒトp53の能力よりもかなり低いことが見出された。興味深いことに、ASPP2とCe−p53の同時発現は、Ce−p53のトランス活性化の機能のわずかではあるが検出可能な増加をもたらし、ヒトASPPファミリーが、ヒトp53と類似した様式でCe−p53を調節することができることを示した(図6D)。ASPP2によるCe−p53のトランス活性化機能のわずかな増加は、mdm2プロモーター上では観察されない。これらの結果すべてが、ヒトp53とC.エレガンスp53との間で保存された残基は、p53のアポトーシス機能にとっておよびASPPファミリーにより調節されるべきp53にとって極めて重要かつ十分であることを示唆する。
ヒトp53と同様に、C.エレガンスp53の最も重要な機能の1つは、DNA損傷に応答して生殖細胞においてアポトーシスを誘発するその能力である3、4。ヒトまたはC.エレガンスiASPPの同時発現が哺乳類細胞系においてp53のアポトーシス機能を阻害することができるということを踏まえて、本発明者等は、Ce−iASPPの発現が、アポトーシスによる死からC.エレガンス生殖細胞を同様に保護し得ると仮定した。この問題は、RNA媒介性干渉(RNAi)5を用いてin vivoで対処した。内因性Ce−iASPPの欠乏により、アポトーシスを受けた生殖細胞数が増加し、Ce−iASPPの正常機能が、アポトーシスを阻害することを示した(図9A、レーン1および5、6)。Ce−iASPPの欠乏により引き起こされる生殖細胞アポトーシスの増大は、RNAiがC.エレガンスCED−3カスパーゼを欠如している突然変異体において実施された場合に、検出されず、コアのアポトーシス機構がこのプロセスに関与していることを示した(図9A、レーン3および4)6。本発明者等はまた、Ce−iASPPの主要な役割がCe−p53のアポトーシス促進活性を阻害することであり、アポトーシス促進活性は通常遺伝毒性ストレスに応答して刺激される3、4という仮定に関するさらなる支持を得た。まず、Ce−iASPPの欠乏後にアポトーシスを受けたC.エレガンス生殖細胞数の増加が、RNAiにより、Ce−p53を同時に欠乏させることにより廃止されることを見出した(図9A、レーン5、6および8を比較せよ)。さらに、RNAiによるCe−iASPPとCe−p53の両方の欠乏により、アポトーシスは完全に排除されなかったが、代わりにアポトーシスを受けた生殖細胞数が野生型生理学的レベルにまで回復した。第二に、野生型の虫(worms)を100Gy IRに暴露させた後に検出されるアポトーシス生殖細胞死数の増加が、100Gy IRへの暴露の存在または非存在下でRNAiによるCe−iASSPの欠乏後に観察されるよりも上回らなかった(図9A、レーン2および7)。これらの結果は、iASPPがC.エレガンスにおいてp53機能の重要な阻害剤であることを明らかに実証するが、本発明者等は、遺伝的ノックアウトにより、Ce−iASPPがさらなる活性を有することが明らかとなり得るという可能性を排除することができない。ASPPファミリーによるp53の調節は高度に保存されるため、iASPPはまた、ヒトを含む他の生物においてp53の重要な阻害剤である可能性が高い。
iASPPは、完全長ASPPよりもN末端切断ASPP2突然変異体53BP2とより高い配列類似性を共有する。iASPPの発現は、p53のアポトーシス機能を阻害した。53BP2と同様に、p53のアポトーシス機能に対するiASPPの最も顕著な影響は、ASPPの競合物質として作用するその能力により媒介される。しかしながら、C.エレガンスでは、iASPPは、ヒトASPPファミリーに対して相同性を有する唯一の遺伝子である。したがって、iASPPは、C.エレガンスにおいてp53のアポトーシス機能を直接阻害する。同様のメカニズムはまた哺乳類細胞においても適用され得る。これと一致して、iASPPアンチセンスRNAは、U2OSおよびMCF7細胞においてアポトーシス細胞の3〜5倍増加を誘発した。この後者のモデルでは、ASPPは、iASPPがp53に課した負の影響を取り除くことによりp53のアポトーシス機能を刺激することができる。iASPPアンチセンスRNAがシスプラチン処理したU2OSおよびMCF7細胞においてアポトーシスの有意な増加をもたらすことができないことは、シスプラチンが、ASPPの活性を増加させることによりp53のアポトーシス機能を刺激するという事実に起因し得る。このことは続いて、ASPPアンチセンスRNAの発現が、シスプラチンにより誘発されるアポトーシスに対する顕著な阻害効果を生み出したことの理由を説明し得る。また、この条件下で、iASPPの抗アポトーシス機能は最も顕著である。したがって、p53のアポトーシス機能は、iASPPにより負に調節され、ASPPにより正に調節される。これらの2つの対抗するシグナル間の競合が、p53のアポトーシス状態、最終的には細胞運命を決定することができる。iASPPがASPPの優性ネガティブな調節因子またはp53の直接的な阻害剤として作用するかどうかに関わらず、p53の結合に関するiASPPとASPPとの間の競合は、p53のアポトーシス機能に重要である。このモデルと一致して、ASPP2と複合体形成したp53の割合の変化がDNA損傷に応答して見られた。iASPPおよびASPPと複合体形成したp53の割合は、死または生存を誘発するシグナルにより調節される可能性が高い。
配列比較により、ヒトとC.エレガンスのiASPPアミノ酸配列との間に38%の同一性が存在し、アンキリン反復およびSH3ドメイン内では相同性は78%程度と高い(ヒトiASPPの残基154〜227およびCe−iASPPの残基557〜630で、55/74残基が類似している)ことが明らかである。p53と接触しているiASPP残基のほとんどが保存されている。ヒトとC.エレガンスのiASPPとの間の構造的保存は、ヒト細胞においてp53機能を調節するそれらの能力により反映される。ヒトiASPPと同様に、C.エレガンスiASPPは、細胞系においてヒトp53と相互作用して、ヒトp53のトランス活性化およびアポトーシス機能を阻害する。ASPP/p53調節の保存は、ヒト細胞におけるC.エレガンスp53の研究においてさらに実証される。ヒトとC.エレガンスのp53との間の配列相同性が非常に限定されている(タンパク質レベルで13.7%同一性)ということに注目することは興味深く、かつ重要なことである。2つの種間のp53相同性の最高レベルは、非常に限定された領域でおよそ50%である(残基9/18残基が類似している)。しかしながら、結晶構造から同定された10ASPP2接触残基のほとんどが、ヒトとC.エレガンスのp53との間で保存される(8残基のうち5残基が保存されている)。C.エレガンスp53の、in vivoでヒトASPPファミリーの成員と相互作用する能力は、これらの保存残基の重要性を強調する。意外にも、C.エレガンスp53は、ヒト細胞において非常に効率よくアポトーシスを誘発する。ヒトp53に類似して、C.エレガンスp53のアポトーシス機能は、ヒトASPPおよびiASPPによりそれぞれ正および負に調節される。これらの結果により、p53のアポトーシス機能が、ヒトとC.エレガンスのp53との間で限定された配列相同性にも関わらず保存されることが初めて実証される。ヒトとC.エレガンスのp53との間で保存される数個の重要な残基は、ASPPファミリーの成員がin vitroおよびin vivoの両方でp53のアポトーシス機能を調節するのに十分である。
ヒト腫瘍の50%が野生型p53を維持するため、癌を治療するためのアプローチの1つは、腫瘍細胞においてp53を再活性化して、アポトーシスを誘発することであり得る。実際に、化学療法剤および放射線療法剤は、DNA損傷を発生し、それが腫瘍細胞において機能性p53を活性化することができる。しかしながら、これらの薬物により影響を受ける経路は様々であり、腫瘍細胞は、生存を可能にするための防御的戦略を展開することができる。すでに記載されているように、ASPP1およびASPP2は、アポトーシス促進性遺伝子のプロモーター上でp53のDNA結合およびトランス活性化機能を刺激することによりp53のアポトーシス機能を特異的に高める(Samuels-Lev et al., 2001)のに対して、iASPPは、p53の非常の保存された阻害剤である(Bergamaschi et al., 2003)。総合すると、このことは、ASPPファミリーのタンパク質の機能は、化学療法剤により影響される可能性があり、次いでそれは、続くp53アポトーシス応答を変化させ、したがって癌治療において使用される薬剤の有効性で役割を果たす。
合成分子とのp53/iASPP相互作用を阻害することにより、p53陽性のストレスをかけた細胞においてp53媒介性アポトーシスを導くことができる。
Claims (54)
- ポリペプチドをコードする単離核酸分子、またはそれらの配列変異体であって、前記ポリペプチドは、図1aまたは図1bに表されるポリペプチド配列の断片であって、該断片は、
i)図1aまたは図1bに提示されるアミノ酸配列のおよそ残基128〜224由来のアミノ酸残基からなるポリペプチド断片、
ii)図1aまたは図1bに提示されるアミノ酸配列のおよそ残基128〜224由来のアミノ酸残基からなるポリペプチド断片であって、前記配列は、少なくとも1つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換により修飾されたポリペプチド断片、および
iii)(i)および(ii)に定義されるようなポリペプチドであって、図1aまたは図1bに表されるポリペプチドの生物活性を実質的に保持するポリペプチド
からなる群から選択される核酸分子。 - 前記分子は、図1aに表される配列のおよそ残基128〜224由来のアミノ酸残基からなる断片をコードする、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記分子は、ヒトから単離される、請求項2に記載の核酸分子。
- 前記分子は、図1bに表される配列のおよそ残基128〜224由来のアミノ酸残基からなる断片をコードする、請求項1または2に記載の核酸分子。
- 前記分子は、線虫から単離される、請求項4に記載の核酸分子。
- 前記線虫は、カエノラブディティス(Caenorhabditis)種属である、請求項5に記載の核酸分子。
- 前記分子は、ポリペプチド、またはそれらの配列変異体をコードし、前記ポリペプチドは、図2に表されるアミノ酸配列により表されるポリペプチドの活性を阻害する、請求項1ないし6のいずれか1項に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子はcDNAである、請求項1ないし7のいずれか1項に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子はゲノムDNAである、請求項1ないし7のいずれか1項に記載の核酸分子。
- 請求項1ないし9のいずれか1項に記載の核酸分子によりコードされるポリペプチド断片またはそれらの配列変異体。
- 請求項1ないし9のいずれか1項に記載の核酸を含むベクター。
- 前記ベクターは発現ベクターである、請求項11に記載のベクター。
- 請求項1ないし9のいずれか1項に記載の核酸分子、または請求項11または12に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトした細胞。
- 医薬品として使用するための請求項1ないし9のいずれか1項に記載の核酸。
- 医薬品として使用するための請求項10に記載のポリペプチド。
- 希釈剤、キャリアまたは賦形剤をさらに含む、請求項14または15に記載の核酸またはポリペプチド。
- 請求項1ないし9のいずれか1項に記載の核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記ポリペプチドのp53への結合を阻害する作用物質の同定のためのスクリーニング方法における請求項10に記載のポリペプチドまたはそれらの断片の使用。
- ポリペプチドまたはそれらの断片のp53への結合を阻害する作用物質を同定するスクリーニング方法であって、
i)
c)本発明によるポリペプチド、および
d)(a)におけるポリペプチドに関する結合部位(複数可)からなるp53ポリペプチドまたはそれらの断片
を含む調製物を形成すること、
ii)試験されるべき少なくとも1つの作用物質を供給すること、
iii)(a)におけるポリペプチドの(b)におけるポリペプチドへの結合に関して前記作用物質の活性を決定することと
を含む方法。 - 前記作用物質はポリペプチドである、請求項19に記載の方法。
- 前記ポリペプチドはペプチドである、請求項19に記載の方法。
- 前記ポリペプチドは、抗体またはそれらの結合部分である、請求項20に記載の方法。
- 前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項22に記載の方法。
- 前記断片はFab断片である、請求項22または23に記載の方法。
- 前記Fab断片は、F(ab’)2、Fab、FvおよびFb断片、ならびにCDR3領域からなる群から選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記抗体はヒト化されている、請求項23ないし25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体はキメラ抗体である、請求項23ないし25のいずれか1項に記載の方法。
- 線虫から単離される単離核酸分子であって、図1bにより表されるような核酸配列をハイブリダイズし、p53の阻害剤をコードする核酸分子。
- 前記分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、請求項28に記載の核酸分子。
- 前記線虫は、カエノラブディティス(Caenorhabditis)種属である、請求項28または29に記載の核酸分子。
- 図2bに表されるようなアミノ酸を含む単離ポリペプチドまたは変異ポリペプチドであって、少なくとも1つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換により修飾され、かつp53の阻害剤である単離ポリペプチドまたは変異ポリペプチド。
- 有効量の請求項10に記載のポリペプチドを投与することを含む動物の治療方法であって、前記有効量は、p53のアポトーシス活性を誘発する方法。
- 有効量の請求項1ないし9のいずれか1項に記載の核酸分子、あるいは請求項11または12に記載のベクターを投与することを含む動物の治療方法であって、前記有効量は、p53のアポトーシス活性を誘発する方法。
- 前記治療は、癌治療である、請求項32または33に記載の方法。
- DGPEETD、GPEETD、TTLSDG、AEFGDE、またはPRNYFGからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド。
- 前記ペプチドの長さは、少なくとも6アミノ酸残基である、請求項35に記載のペプチド。
- 前記ペプチドの長さは、少なくとも7アミノ酸残基、8アミノ酸残基、9アミノ酸残基、10アミノ酸残基、11アミノ酸残基、12アミノ酸残基、13アミノ酸残基、14アミノ酸残基、15アミノ酸残基、16アミノ酸残基、17アミノ酸残基、18アミノ酸残基、19アミノ酸残基または20アミノ酸残基からなる群から選択される、請求項35に記載のペプチド。
- 前記ペプチドの長さは、少なくとも20アミノ酸残基、30アミノ酸残基、40アミノ酸残基、50アミノ酸残基、60アミノ酸残基、70アミノ酸残基、80アミノ酸残基、90アミノ酸残基または100アミノ酸残基である、請求項35に記載のペプチド。
- DGPEETD、GPEETD、TTLSDG、AEFGDE、またはPRNYFGからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる請求項35に記載のペプチド。
- 前記ペプチドは、複数のアルギニン残基をさらに含む、請求項35ないし39のいずれか1項に記載のペプチド。
- 前記複数のアルギニン残基は、少なくとも2アルギニン残基長、3アルギニン残基長、4アルギニン残基長、5アルギニン残基長、6アルギニン残基長、7アルギニン残基長、8アルギニン残基長、9アルギニン残基長または10アルギニン残基長である、請求項40に記載のペプチド。
- 医薬品として使用するためのDGPEETD、GPEETD、TTLSDG、AEFGDE、またはPRNYFGからなる群から選択されるペプチド。
- DGPEETD、GPEETD、TTLSDG、AEFGDE、またはPRNYFGからなる群から選択されるペプチドを含む医薬組成物。
- 前記組成物は、キャリア、希釈剤または賦形剤をさらに含む、請求項43に記載の医薬組成物。
- 請求項35ないし42のいずれか1項に記載の少なくとも1つのペプチドおよび少なくとも1つの抗癌剤を含む医薬組成物。
- 前記抗癌剤は、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、メルファラン、カルムスチン、メトトレキサート、5−フルオロウラシル、シタラビン、メルカプトプリン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ダクチノマイシン、マイトマイシンC、タキソール、L−アスパラギナーゼ、G−CSF、エトポシド、コルヒシン、メシル酸デフェロキサミン、およびカンプトテシンからなる群から選択される、請求項45に記載の医薬組成物。
- 前記抗癌剤はシスプラチンである、請求項46に記載の医薬組成物。
- 前記抗癌剤はドキソルビシンである、請求項46に記載の医薬組成物。
- 請求項35ないし42のいずれか1項に記載のペプチドおよび抗体またはその結合部分を含む複合体。
- 前記抗体またはその結合部分は、細胞特異的抗体である、請求項49に記載の複合体。
- 前記抗体は、癌細胞特異的抗体である、請求項49または50に記載の複合体。
- 動物、好ましくはヒトの治療方法であって、前記動物は、有効量の請求項35ないし41のいずれか1項に記載のペプチドを投与することを含むアポトーシスの誘発から利益を得る方法。
- 動物、好ましくはヒトの治療方法であって、前記動物は、有効量の請求項43ないし48のいずれか1項に記載の組成物、または請求項49ないし51のいずれか1項に記載の複合体を投与することを含むアポトーシスの誘発から利益を得る方法。
- 前記治療は、癌治療である、請求項52または53に記載の方法。
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