PT2787075T - Roedores capazes de produzirem anticorpos híbridos contendo regiões variáveis humanas e regiões constantes de roedores - Google Patents

Roedores capazes de produzirem anticorpos híbridos contendo regiões variáveis humanas e regiões constantes de roedores Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO
Roedores capazes de produzirem anticorpos hibridos contendo regiões variáveis humanas e regiões constantes de roedores Âmbito da invenção 0 domínio da presente invenção é um murganho transgénico que produz anticorpos híbridos contendo regiões humanas variáveis e regiões constantes de murganho e um processo para produzir um anticorpo humano utilizando o referido murganho. A presente invenção também tem por objeto um processo para tratar por engenharia genética e utilizar vetores grandes de ADN para atingir e modificar, por via de recombinação homóloga, de qualquer forma desejável, genes endógenos e loci cromossómicos em células eucarióticas. Estes vetores grandes de ADN para atuar sobre as células eucarióticas, designados por VGACE, derivam de fragmentos de ADN genómico clonado, maiores do que os ADN que são normalmente utilizados para outras abordagens, que pretendem atuar de forma homóloga em células eucarióticas. A presente invenção ainda providencia um processo rápido e conveniente para detetar células eucarióticas nas quais o VGACE tenha atingido corretamente e modificado os genes endógenos ou os loci cromossómicos desejados. A presente invenção também tem por objeto a utilização destas células para gerar organismos portadores desta modificação genética, os próprios organismos e processos para a sua utilização.
Introdução A utilização de VGACE providencia vantagens substanciais em relação aos processos atuais. Por exemplo, dado que derivam de fragmentos de ADN maiores do que os que são normalmente utilizados para gerar vetores de recombinação, os VGACE podem ser gerados mars rapidamente e da forma mais conveniente a partir de bibliotecas disponiveis de fragmentos maiores de ADN genómico (tais como, as bibliotecas de CBA e de CPA) do que os vetores de recombinação que utilizam as tecnologias atuais. Além disso, podem ser geradas de forma mais conveniente, modificações maiores, assim como modificações que abrangem regiões genómicas maiores do que utilizando as tecnologias atuais. Além disso, a presente invenção tira vantagem das regiões longas de homologia para aumentar a frequência de recombinação dos loci "difíceis de atingir" e também diminui o benefício, se é que existe algum, de utilizar ADN isogénico nestes vetores de recombinação. A presente invenção providencia assim um processo rápido, conveniente e aperfeiçoado para modificar sistematicamente e virtualmente todos os genes endógenos e os loci cromossómicos de um dado organismo.
Antecedentes da invenção A recombinação genética, por meio da recombinação homóloga entre ADN exógeno homólogo e sequências cromossómicas endógenas tem provado ser uma via extremamente válida para criar eliminações, inserções, conceber mutações, corrigir mutações de genes, introduzir transgenes ou fazer outras alterações genéticas em murganhos. Os processos atuais envolvem a utilização de vetores normais de recombinação com regiões de homologia com ADN endógeno totalizando normalmente menos do que 10-20 kb, para introduzir a modificação genética desejada nas células estaminais embrionárias (EE) de murganhos, seguido da injecção de células EE alteradas em embriões de murganhos para transmitir estas modificações geradas por engenharia genética na linha germinativa dos murganhos (Smithies et al., Nature, 317: 230-234, 1985;
Thomas et al. , Cell, 51: 503-512, 1987; Roller et al. , Proc Natl Acad Sci EUA, 86: 8927-8931, 1989; Kuhn et al., Science, 254: 707-710, 1991; Thomas et al., Nature, 346: 847-850, 1990; Schwartzberg et al., Science, 246: 799-803, 1989; Doetschman et al., Nature, 330: 576-578, 1987; Thomson et al., Cell, 5: 313-321, 1989; DeChiara et al., Nature, 345: 78-80, 1990; patente norte-americana N2. 5 789 215, registada em 4 de Agosto de 1998 em nome da GenPharm International) . Nestes processos atuais, a deteção de células EE raras em que os vetores-padrão de recombinação se tenham recombinado corretamente e modificado os genes endógenos desejados ou o locus (loci) cromossómico, requer uma sequência de informações fora das sequências de recombinação homóloga contidas dentro do vetor de recombinação. Os ensaios para fazer uma recombinação com sucesso envolvem os ensaios-padrão de "Southern blotting" ou RCP (reação em cadeia de polimerase) prolongada (Cheng, et al., Nature, 369: 684-5, 1994; Foord e Rose, PCR Methods Appl, 3: S149-61, 1994; Ponce e Micol, Nucleic Acids Res, 20: 623, 1992; patente de invenção norte-americana Na. 5 436 149, registada por Takara Shuzo Co., Ltd.) a partir de sequências externas ao vetor de recombinação e que se espalham por todo o braço de homologia (ver definições); assim, por causa destas considerações de dimensões, que limitam estes processos, a dimensão dos braços com homologia está restrita a menos do que 10-20 kb no total (Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999) . A capacidade para utilizar vetores de recombinação com braços com homologia maiores do que os utilizados nos processos atuais seria extremamente valiosa. Por exemplo, esses vetores de recombinação podem ser gerados de uma forma mais rápida e mais conveniente a partir de bibliotecas disponíveis contendo inserções genómicas grandes (por exemplo, as bibliotecas de CBA ou de CPA) do que os vetores de recombinação produzidos utilizando as tecnologias atuais, nas quais essas inserções genómicas têm de ser caracterizadas extensivamente e ordenadas antes da sua utilização. Para além disso, outras modificações maiores, assim como as modificações que se executam em regiões genómicas maiores, podem ser geradas mais convenientemente e em menos etapas do que utilizando as tecnologias atuais. Além disso, a utilização de longas regiões de homologia poderá aumentar a frequência de recombinação de loci "difíceis de atingir" em células eucarióticas, dado que conseguir a recombinação homóloga em células eucarióticas parece estar relacionado com a homologia total contida dentro do vetor de recombinação (Deng e Capecchi, Mol Cell Biol, 12: 3365-71, 1992) . Além disso, o aumento da frequência de recombinação obtido utilizando braços longos de homologia poderia diminuir qualquer benefício potencial que pudesse derivar da utilização de ADN isogénico nestes vetores de recombinação. 0 problema de modificações precisas por engenharia genética em fragmentos genómicos muito grandes, tais como os clonados nas bibliotecas de CBA tem sido resolvido, de uma forma geral, através da utilização de recombinação homóloga em bactérias (Zhang, et al., Nat Genet, 20: 123-8, 1998; Yang, et al., Nat Biotechnol, 15: 859-65, 1997; Angrand, et al., Nucleic Acids Res, 27: el6, 1999; Muyrers, et al., Nucleic Acids Res, 27: 1555-7, 1999; Narayanan, et al., Gene Ther, 6: 442-7, 1999), permitindo a construção de vetores contendo regiões grandes de homologia com genes endógenos eucarióticos ou loci cromossómicos eucarióticos. Contudo, uma vez preparados, estes vetores normalmente não têm sido úteis para a modificação endógena de genes ou dos loci cromossómicos por via da recombinação homóloga, por causa da dificuldade em detetar eventos raros de recombinação correta quando os braços de homologia são maiores do que 10-20 kb (Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999) . Consequentemente, os vetores gerados, utilizando a re-combinação homóloga bacteriana de fragmentos genómicos de CBA, devem ainda ser suficientemente adaptados antes da sua utilização como vetores de recombinação (Hill et al., Genomics, 64: 111-3, 2000). Por isso, há ainda necessidade de encontrar uma metodologia rápida e conveniente que torne possível a utilização de vetores de recombinação contendo regiões extensas de homologia, de modo a modificar os genes endógenos ou os loci cromossómicos nas células eucarióticas. A patente WO 99/45962 descreve animais transgénicos não humanos capazes de produzirem anticorpos heterólogos. A patente WO 91/00906 descreve animais transgénicos e quiméricos capazes de produzirem anticorpos humanos. A patente norte-americana 5 939 598 descreve um processo de produção de murganhos transgénicos aos quais faltam cadeias pesadas endógenas.
Providenciam-se aqui novos processos que permitem a utilização de vetores de recombinação contendo regiões grandes de homologia, de modo a modificar genes endógenos ou loci cromossómicos em células eucarióticas, por via da recombinação homóloga. Esses processos ultrapassam as limitações das tecnologias atuais descritas antes. Além disso, um técnico nesta matéria reconhecerá facilmente que os processos são facilmente adaptados para serem utilizados com qualquer ADN genómico de qualquer organismo eucariótico incluindo, mas não se limitando a animais, tais como, murganhos, ratos, outros roedores ou seres humanos, assim como plantas, tais como, soja, milho e trigo.
Sumário da Invenção A presente invenção tem por objeto um murganho transgénico que produz anticorpos híbridos contendo regiões variáveis humanas e regiões constantes de murganho, em que um locus de uma região variável de cadeia pesada endógena do referido murganho está substituído, in situ, na totalidade ou em parte, por segmentos dos genes V, D e J de cadeia pesada humana. A presente invenção ainda tem por objeto um processo de produção de um anticorpo humano que compreende: a) a exposição do referido murganho em que, adicionalmente, um locus de uma região variável de cadeia leve kapa endógena está substituído, in situ, na totalidade ou em parte, por segmentos dos genes V e J de cadeia leve kapa humana, para a estimulação antigénica, de tal modo que o murganho produz um anticorpo contra o antigénio; b) o isolamento do ADN que codifica as regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo; c) a ligação operacional da sequência de ADN que codifica as regiões variáveis de (b) ao ADN que codifica as regiões constantes das cadeias pesada e leve humanas, numa célula capaz de expressar anticorpos ativos; d) o crescimento de células nessas condições, para expressar o anticorpo humano; e e) a recuperação do anticorpo.
De acordo com a presente invenção, os requerentes desenvolveram um novo processo rápido, eficiente e aperfeiçoado para criar e rastrear células eucarióticas que contenham genes endógenos modificados ou loci cromossómicos modificados. Estes novos processos combinam, pela primeira vez : 1. A recombinação bacteriana homóloga para realizar uma engenharia genética precisa de uma desejada modificação genética dentro de um fragmento genómico grande clonado, criando assim um vetor de recombinação grande para ser utilizado em células eucarióticas (VGACE); 2. A introdução direta destes VGACE em células eucarióticas para modificar locus cromossómicos endógenos de interesse nestas células; e 3. Uma análise para determinar as células eucarióticas raras nas quais o alelo recombinado tenha sido modificado, tal como desejado, envolvendo um ensaio para a modificação do alelo (MOA) do alelo parental que não exige a informação de sequências externas à sequência de recombinação, tal como, por exemplo, RCP quantitativa. A presente invenção tem por objeto um processo para modificar geneticamente um gene endógeno ou um locus cromossómico em células eucarióticas, compreendendo: a) a obtenção de um fragmento genómico grande clonado contendo uma sequência de ADN de interesse; b) a utilização da recombinação bacteriana homóloga para modificar geneticamente o fragmento genómico grande clonado de (a) para criar um vetor recombinante grande para ser utilizado em células eucarióticas (VGACE) ; c) a introdução do VGACE de (b) nas células eucarióticas para modificar o gene endógeno ou o locus cromossómico nas células; e d) a utilização de um ensaio quantitativo para detetar modificações do alelo (MOA) em células eucarióticas de (c) para identificar essas células eucarióticas nas quais o gene endógeno ou o locus cromossómico tenha sido geneticamente modificado. A presente invenção também tem por objeto um processo em que a modificação genética feita no gene endógeno ou no locus cromossómico compreende a eliminação de uma sequência de codificação, um segmento de gene ou um elemento regulador; a alteração de uma sequência de codificação, de um segmento de gene ou de um elemento regulador; a inserção de uma nova sequência de codificação, um segmento de gene ou um elemento regulador; a criação de um alelo condicional; ou a substituição de uma sequência de codificação ou de um segmento de gene de uma das espécies por uma sequência de codificação homóloga ou ortóloga de uma espécie diferente.
Também tem por objeto um processo em que a alteração de uma sequência de codificação, de um segmento de gene ou de um elemento regulador compreende uma substituição, adição ou fusão, em que a fusão compreende um marcador de epitopo ou uma proteína bifuncional.
Também tem por objeto um processo no qual o ensaio quantitativo compreende uma RCP quantitativa, uma hibridação genómica comparativa, uma amplificação isotérmica do ADN ou uma hibridação quantitativa com uma sonda imobilizada, em que a RCP quantitativa compreende a tecnologia de TaqMan® ou uma RCP quantitativa utilizando sinais moleculares.
Adicionalmente, tem por objeto um processo em que a célula eucariótica é uma célula estaminal embrionária de mamífero e, em particular, em que a célula estaminal embrionária é uma célula estaminal embrionária de murganho, rato ou de outro roedor.
Também tem por objeto um processo em que gene endógeno ou o locus cromossómico é um gene ou um locus cromossómico de mamífero, preferencialmente um gene ou um locus cromossómico de um ser humano ou um gene ou locus cromossómico de murganho, rato ou de outro roedor.
Adicionalmente, também tem por objeto um VGACE que é capaz de acomodar fragmentos grandes de ADN, maiores do que 20 kb e, em particular, fragmentos grandes de ADN maiores do que 100 kb.
Também tem por objeto um gene endógeno ou um locus cromossómico modificados geneticamente que são produzidos pelo processo aqui descrito.
Também tem por objeto uma célula eucariótica modificada geneticamente, que é produzida pelo processo aqui descrito.
Também tem por objeto um organismo não humano contendo o gene endógeno ou o locus cromossómico geneticamente modificados, produzidos pelo processo aqui descrito.
Também se descreve um organismo não humano produzido a partir de células eucarióticas geneticamente modificadas ou células estaminais embrionárias produzidas pelo processo aqui descrito.
Descreve-se aqui um organismo não humano contendo um gene endógeno ou um locus cromossómico geneticamente modificados, produzidos por um processo que compreende as etapas de: a) obtenção de um fragmento genómico grande clonado contendo uma sequência de ADN de interesse; b) utilização da recombinação bacteriana homóloga para modificar geneticamente o fragmento genómico grande clonado de (a) para criar um vetor recombinante grande (VGACE) para ser utilizado em células estaminais embrionárias; c) introdução do VGACE de (b) em células estaminais embrionárias para modificar o gene endógeno ou o locus cromossómico nas células; d) utilização de um ensaio quantitativo para detetar modificações do alelo (MOA) nas células estaminais embrionárias de (c) para identificar as células estaminais embrionárias nas quais o gene endógeno ou o locus cromossómico tenha sido geneticamente modificado; e) introdução da célula estaminal embrionária de (d) num blastócito; e f) introdução dos blastócitos de (e) numa mãe-hospedeira para gestação.
Adicionalmente, descreve-se aqui um organismo não humano contendo um gene endógeno ou um locus cromossómico geneticamente modificados, produzidos por um processo que compreende as etapas de: a) obtenção de um fragmento genómico grande clonado contendo uma sequência de ADN de interesse; b) utilização de recombinação bacteriana homóloga para modificar geneticamente o fragmento genómico grande clonado de (a) para criar um vetor recombinante grande para ser utilizado em células eucarióticas (VGACE); c) introdução do VGACE de (b) nas células eucarióticas para modificar geneticamente o gene endógeno ou o locus cromossómico; d) utilização de um ensaio quantitativo para detetar modificações do alelo (MOA) nas células eucarióticas de (c) para identificar as células eucarióticas nas quais o gene endógeno ou o locus cromossómico tenham sido geneticamente modificados; e) remoção do núcleo da célula eucariótica de (d); f) introdução do núcleo de (e) num oócito; e g) introdução do oócito de (f) numa mãe-hospedeira para gestação.
Preferencialmente, o organismo não humano é um murganho, rato ou outro roedor; o blastócito é um blastócito de murganho, de rato ou de outro roedor; o oócito é um oócito de murganho, de rato ou de outro roedor; e a mãe-hospedeira é um murganho, rato ou outro roedor.
Preferencialmente, as células estaminais embrionárias são células estaminais embrionárias de mamífero, preferencialmente células estaminais embrionárias de murganhos, ratos ou outros roedores.
Também se descreve aqui a utilização de células eucarióticas geneticamente modificadas aqui descritas para a produção de um organismo não humano e, em particular, a utilização de células estaminais embrionárias modificadas geneticamente, aqui descritas, para a produção de um organismo não humano.
Adicionalmente, descreve-se aqui um processo para modificar geneticamente um gene endógeno ou um locus cromossómico de interesse em células estaminais embrionárias de murganho, compreendendo: a) a obtenção de um fragmento genómico grande clonado maior do que 20 kb, que contém uma sequência de ADN de interesse, em que o fragmento grande de ADN clonado é homólogo do gene endógeno ou do locus cromossómico; b) a utilização da recombinação bacteriana homóloga para modificar geneticamente o fragmento genómico grande clonado de (a) para criar um vetor recombinante grande para ser utilizado em células estaminais embrionárias de murganhos, em que a modificação genética consiste na eliminação de uma sequência de codificação, um segmento de gene ou um elemento regulador; c) a introdução do vetor recombinante grande de (b) nas células estaminais embrionárias de murganho para modificar o gene endógeno ou o locus cromossómico nas células; e d) a utilização de um ensaio quantitativo para detetar modificações do alelo (MOA) nas células estaminais embrionárias de murganho de (c) para identificar as células estaminais embrionárias de murganho nas quais o gene endógeno ou o locus cromossómico tenham sido geneticamente modificados, em que o ensaio quantitativo é uma RCP quantitativa. Também se prefere uma célula estaminal embrionária de murganho, modificada geneticamente, produzida por este processo; um murganho contendo um gene endógeno ou um locus cromossómico modificados geneticamente, produzidos por este processo; e um murganho produzido por este processo; a partir de células estaminais embrionárias de murganho modificadas geneticamente.
Ainda se descreve aqui um murganho contendo um gene endógeno ou um locus cromossómico de interesse, geneticamente modificados, produzidos por um processo que compreende as etapas de: a) obtenção de um fragmento genómico grande clonado, maior do que 20 kb, que contém uma sequência de ADN de interesse, em que o fragmento grande de ADN clonado é homólogo do gene endógeno ou do locus cromossómico; b) utilização da recombinação bacteriana homóloga para modificar geneticamente o fragmento genómico grande clonado de (a) para criar um vetor recombinante grande para ser utilizado em células estaminais embrionárias de murganhos, em que a modificação genética consiste na eliminação de uma sequência de codificação, um segmento de gene ou um elemento regulador; c) introdução do vetor recombinante grande de (b) nas células estaminais embrionárias de murganho para modificar o gene endógeno ou o locus cromossómico nas células; e d) utilização de um ensaio quantitativo para detetar modificações do alelo (MOA) nas células estaminais embrionárias de murganhos de (c) para identificar essas células estaminais embrionárias de murganho nas quais o gene endógeno ou o locus cromossómico tenham sido geneticamente modificados, em que o ensaio quantitativo é uma RCP quantitativa; e) introdução de células estaminais embrionárias de murganho de (d) em blastócitos; e f) introdução dos blastócitos de (e) numa mãe-hospedeira para gestação.
Também se descreve aqui a utilização das células estaminais embrionárias de murganho geneticamente modificadas descritas antes para a produção de um murganho.
Adicionalmente, descreve-se aqui um processo de substituição, no todo ou em parte, numa célula eucariótica não humana, num locus de gene de uma região variável endógena de imunoglobulina, por um locus de gene humano homólogo ou ortólogo compreendendo: a) a obtenção de um fragmento genómico grande clonado contendo, no todo ou em parte, o locus do gene humano homólogo ou ortólogo; b) a utilização da recombinação bacteriana homóloga para modificar geneticamente o fragmento genómico clonado de (a) para criar um vetor recombinante grande para ser utilizado nas células eucarióticas (VGACE); c) a introdução do VGACE de (b) em células eucarióticas para substituir, no todo ou em parte, o locus do gene de uma região variável endógena de imunoglobulina; e d) a utilização de um ensaio quantitativo para detetar a modificação do alelo (MOA) nas células eucarióticas de (c) para identificar as células eucarióticas nas quais o locus do gene de uma região variável endógena de imunoglobulina tenha sido substituído, no todo ou em parte, por um locus de gene humano homólogo ou ortólogo.
Ainda se descreve aqui um processo de substituição, no todo ou em parte, de uma célula eucariótica não humana, um locus de um gene de uma região variável endógena de imunoglobulina por um locus de um gene humano homólogo ou ortólogo compreendendo ainda as etapas de: e) obtenção de um fragmento genómico grande clonado contendo uma parte do locus do gene humano homólogo ou ortólogo que difere do fragmento de (a); f) utilização da recombinação bacteriana homóloga para modificar geneticamente o fragmento genómico clonado de (e) para criar um segundo VGACE; g) introdução do segundo VGACE de (f) em células eucarióticas identificadas na etapa (d) para substituir, no todo ou em parte, o locus do gene de uma região variável endógena de imunoglobulina; e h) utilização de um ensaio quantitativo para detetar a modificação do alelo (MOA) em células eucarióticas de (g) para identificar as células eucarióticas nas quais o locus do gene de uma região variável endógena de imunoglobulina tenha sido substituído, no todo ou em parte, por um locus do gene humano homólogo ou ortólogo.
Outro aspeto do processo anterior consiste num processo no qual as etapas (e) até (h) se repetem até que o locus do gene de uma região variável endógena de imunoglobulina esteja substituído no seu todo por um locus de um gene humano homólogo ou ortólogo.
Outro aspeto do processo consiste no facto de o locus do gene de uma região variável de imunoglobulina ser um locus seleccionado no grupo que consiste em: a) um locus do gene de uma região variável de cadeia leve kapa; b) um locus do gene de uma região variável de cadeia leve lambda; e c) um locus do gene de uma região variável de cadeia pesada.
Prefere-se um processo em que o ensaio quantitativo compreende uma RCP quantitativa, FISH, hibridação genómica comparativa, amplificação isotérmica do ADN ou hibridação quantitativa com uma sonda imobilizada e, em particular, em que a RCP quantitativa compreende a tecnologia TaqMan® ou uma RCP quantitativa utilizando sinais moleculares.
Ainda se descreve aqui um processo de substituição, no todo ou em parte, numa célula estaminal embrionária de murganho, de um locus de gene de uma região variável endógena de imunoglobulina por um locus de um gene humano homólogo ou ortólogo compreendendo: a) a obtenção de um fragmento genómico grande clonado contendo, no todo ou em parte, o locus do gene humano homólogo ou ortólogo; b) a utilização da recombinação bacteriana homóloga para modificar geneticamente o fragmento genómico grande clonado de (a) para criar um vetor recombinante grande para ser utilizado nas células estaminais embrionárias; c) a introdução do vetor recombinante grande de (b) em células estaminais embrionárias de murganho para substituir, no todo ou em parte, o locus do gene de uma região variável endógena de imunoglobulina nas células; e d) a utilização de um ensaio de RCP quantitativa para detetar a modificação do alelo (MOA) em células estaminais embrionárias de murganho de (c) para identificar as células estaminais embrionárias de murganho nas quais o locus do gene de uma região variável endógena tenha sido substituído, no todo ou em parte, por um locus de gene humano homólogo ou ortólogo.
Noutro aspeto aqui descrito, o processo compreende ainda: e) a obtenção de um fragmento genómico grande clonado contendo uma parte do locus do gene humano homólogo ou ortólogo gue difere do fragmento de (a); f) a utilização da recombinação bacteriana homóloga para modificar geneticamente o fragmento genómico clonado de (e) para criar um vetor recombinante grande para ser utilizado nas células estaminais embrionárias; g) a introdução do vetor recombinante grande de (f) nas células estaminais embrionárias de murganho identificadas na etapa (d) para substituir, no todo ou em parte, o locus do gene de uma região variável, endógeno de imunoglobulina; e h) a utilização de um ensaio quantitativo para detetar a modificação do alelo (MOA) nas células estaminais embrionárias de murganho de (g) para identificar as células estaminais embrionárias de murganho nas quais o locus do gene de uma região variável endógena de imunoglobulina tenha sido substituído, no todo ou em parte, por um locus do gene humano homólogo ou ortólogo.
Ainda outro aspeto preferido consiste num processo no qual as etapas anteriores (e) a (h) se repetem até que o locus do gene de uma região variável endógena de imunoglobulina esteja substituído, no seu todo, por um locus de um gene humano homólogo ou ortólogo.
Também se prefere um processo no qual o locus do gene de uma região variável de imunoglobulina compreende um locus selecionado no grupo que consiste em: a) um locus do gene de uma região variável da cadeia leve kapa; b) um locus do gene de uma região variável da cadeia leve lambda; e c) um locus do gene de uma região variável da cadeia pesada .
Também se descreve aqui um locus do gene de uma região variável de imunoglobulina, modificado geneticamente, produzido pelos processos descritos antes; uma célula eucariótica modificada geneticamente compreendendo um locus do gene de uma região variável de imunoglobulina, modificado geneticamente, produzido pelos processos descritos antes; um organismo não humano que compreende um locus do gene de uma região variável de imunoglobulina, modificado geneticamente, produzido pelos processos descritos antes; e uma célula estaminal embrionária de murganho contendo um locus do gene de uma região variável de imunoglobulina, modificado geneticamente, produzido pelos processos descritos antes.
Também se descreve aqui uma célula estaminal embrionária em que o locus de uma região variável da cadeia pesada de murganho está substituído, no todo ou em parte, por um locus de um gene de uma região variável humana de cadeia pesada; uma célula estaminal embrionária, tal como reivindicada, em que o locus de uma região variável de cadeia leve kapa de murganho está substituído, no todo ou em parte, por um locus de uma região variável humana de cadeia leve kapa; uma célula estaminal embrionária em que o locus de uma região variável de cadeia leve lambda de murganho está substituído, no todo ou em parte, por um locus de uma região variável de cadeia leve lambda de um ser humano; e uma célula estaminal embrionária em que os loci dos genes das regiões variáveis, de cadeias leve e pesada, estão substituídos, no seu todo, pelos seus homólogos ou ortólogos humanos.
Adicionalmente, descreve-se aqui um murganho produzido a partir das células estaminais embrionárias descritas antes.
Também se descreve aqui um anticorpo que contém uma região variável humana codificada pelo locus do gene de uma região variável, modificado geneticamente, tal como descrito antes; um anticorpo que compreende ainda uma região constante não humana; e um anticorpo compreendendo ainda uma região constante humana.
Adicionalmente, descreve-se aqui um murganho transgénico que tenha um genoma que compreende todos os loci das regiões variáveis humanas de cadeia pesada e leve, que se ligam operacionalmente aos loci da região constante completamente endógena de murganho, de tal modo que o murganho produz um soro que contém um anticorpo que compreende uma região variável humana e uma região constante de murganho em resposta à estimulação antigénica; um murganho transgénico que tenha um genoma que compreende os loci das regiões variáveis humanas de cadeia pesada e/ou leve, que se ligam operacionalmente aos loci da região constante endógena de murganho, de tal modo que o murganho produz um soro que contém um anticorpo que compreende uma região variável humana e uma região constante de murganho em resposta a uma estimulação antigénica; um murganho transgénico que tenha um locus de uma região variável endógena, que tenha sido substituído por um locus variável humano homólogo ou ortólogo, sendo esse rato produzido por um processo que compreende: a) a obtenção de um ou mais fragmentos genómicos grandes clonados contendo todos os locus das regiões variáveis humanas homólogas ou ortólogas; b) a utilização da recombinação bacteriana homóloga para modificar geneticamente os fragmentos genómicos de (a) clonados para criar vetores recombinantes grandes para serem utilizados nas células estaminais embrionárias de murganho; c) a introdução dos vetores recombinantes grandes de (b) em células estaminais embrionárias de murganho para substituir, todos os locus das regiões variáveis endógenas nas células; e d) a utilização de um ensaio de RCP quantitativa para detetar a modificação do alelo (MOA) em células estaminais embrionárias de (c) para identificar as células estaminais embrionárias de murganho nas quais todos os locus de uma região variável endógena completa tenham sido substituídos, por um locus de uma região humana variável, homóloga ou ortóloga; e) a introdução das células estaminais embrionárias de murganho de (d) num blastócito; e f) a introdução dos blastócitos de (e) numa mãe-hospedeira para gestação.
Também se descreve aqui um murganho transgénico descrito antes, em que o locus dos genes de uma região variável de imunoglobulina compreendem um ou mais loci selecionados no grupo que consiste em: a) um locus do gene de uma região variável da cadeia leve kapa; b) um locus do gene de uma região variável da cadeia leve lambda; e c) um locus do gene de uma região variável da cadeia pesada.
Também se preferem os processos descritos antes, em que as células estaminais embrionárias de murganho derivam de um murganho transgénico produzido pelos processos.
Adicionalmente, descreve-se aqui um processo de produção de um anticorpo humano que compreende: a) a exposição do murganho descrito antes a uma estimulação antigénica, de tal modo que o murganho produz um anticorpo contra o antigénio; b) o isolamento do ADN que codifica as regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo; c) a ligação operacional do ADN que codifica as regiões variáveis de (b) ao ADN que codifica as regiões constantes humanas de cadeias pesada e leve numa célula capaz de expressar anticorpos ativos; d) o crescimento da célula em condições tais que permitam expressar o anticorpo humano; e e) a recuperação do anticorpo.
Preferencialmente, a célula descrita antes é uma célula de OHC (ovário de hamster chinês).
Também se prefere um processo no qual o ADN da etapa (b) descrita antes é isolado a partir de um hibridoma criado a partir do baço do murganho exposto a uma estimulação antigénica na etapa (a) descrita antes.
Também se prefere o processo descrito antes no qual o ADN é isolado por RCP.
Ainda se descreve aqui um processo de substituição, no todo ou em parte, de um locus de um gene de uma região variável endógena de imunoglobulina por um locus de um gene homólogo ou ortólogo, compreendendo: a) a criação de um VGACE compreendendo um sitio de recombinação especifico do sitio, um braço de homologia a jusante contendo a região imediatamente adjacente mas que não inclui os segmentos J da região do locus do gene de uma região variável de imunoglobulina e um braço com homologia, a montante, dentro do locus de uma região variável; b) a criação de um VGACE que compreende um sitio de recombinação especifico do sitio, um braço com homologia a montante contendo a região adjacente do segmento do gene V mais distai, mas não contém quaisquer segmentos do gene V da região do locus do gene de uma região variável de imunoglobulina e um braço de homologia a jusante, dentro do locus do gene de uma região variável; c) a introdução dos VGACE de (a) e (b) em células eucarióticas; d) a utilização de um ensaio quantitativo para detetar a modificação do alelo (MOA) em locus de genes de regiões variáveis para identificar as células eucarióticas em (c) , nas quais os sitios de recombinação específicos do sítio flanqueiam todo ou parte do locus do gene de uma região variável endógena; e) a criação de um vetor que contenha as sequências de recombinação específicas do sítio que flanqueiam todos ou parte dos locus dos genes homólogos ou ortólogos; e f) a introdução do vetor de (e) nas células eucarióticas identificadas na etapa (d) de tal modo que, através da recombinação, o locus do gene de uma região variável endógena de imunoglobulina esteja substituído, no todo ou em parte, pelo locus do gene homólogo ou ortólogo.
Também se descreve aqui um rato transgénico contendo um locus de uma região variável endógena de imunoglobulina que tenha sido substituído por um locus de uma região variável homóloga ou ortóloga de imunoglobulina humana, sendo esse murganho produzido por um processo que compreende: a) a criação de um VGACE compreendendo um sítio de recombinação específico do sítio e um braço com homologia a jusante contendo a região imediatamente adjacente mas que não inclui os segmentos J da região do locus do gene de uma região variável de imunoglobulina de murganho; b) a criação de um VGACE que compreende um sítio de recombinação específico do sítio e um braço de homologia a montante contendo a região adjacente do segmento do gene V de murganho mais distai, mas não contém quaisquer segmentos do gene V da região do locus do gene de uma região variável de imunoglobulina de murganho; c) a introdução dos VGACE de (a) e (b) em células eucarióticas; utilizando um ensaio quantitativo para detetar a modificação do alelo (MOA) em locus de genes de regiões variáveis para identificar as células eucarióticas em (c) , nas quais os sítios de recombinação específicos do sítio flanqueiam o locus do gene de uma região variável endógena de imunoglobulina; d) a criação de um vetor que contenha as sequências de recombinação específicas do sítio que flanqueiam todos ou parte dos locus dos genes homólogos ou ortólogos; e) a introdução do vetor de (e) em células eucarióticas identificadas na etapa (d) de tal modo que, através da recombinação, o locus do gene de uma região variável endógena de imunoglobulina esteja substituído, no todo ou em parte, pelo locus do gene homólogo ou ortólogo; f) a introdução de células estaminais embrionárias de murganho de (d) num blastócito; e a introdução do blastócito de (e) numa mãe-hospedeira para gestação.
Adicionalmente descreve-se aqui um processo de criação, numa célula eucariótica, de um locus de gene endógeno flanqueado a jusante por um sitio de recombinação especifico do sitio compreendendo: a) a criação de um VGACE compreendendo um sitio de recombinação especifico do sitio, um braço de homologia a jusante contendo uma região que flanqueia a extremidade 3' da região do locus do gene endógeno e um braço de homologia a montante dentro do locus; b) a introdução do VGACE de (a) e (b) na célula eucariótica; e c) a utilização de um ensaio quantitativo para detetar a modificação do alelo (MOA) no locus do gene endógeno para identificar as células eucarióticas de (b) nas quais o locus do gene endógeno está flanqueado a jusante pelo sitio de recombinação especifico do sitio.
Ainda se descreve aqui um processo de criação, numa célula eucariótica, de um locus de gene endógeno flanqueado a montante por um sitio de recombinação especifico do sitio compreendendo: a) a criação de um VGACE compreendendo um sitio de recombinação especifico do sitio, um braço de homologia a montante contendo uma região que flanqueia a extremidade 5' da região do locus do gene endógeno e um braço de homologia a jusante dentro do locus; b) a introdução do VGACE de (a) na célula eucariótica; e c) a utilização de um ensaio quantitativo para detetar a modificação do alelo (MOA) no locus do gene endógeno para identificar as células eucarióticas de (b) nas quais o locus do gene endógeno é flangueado a jusante pelo sítio de recombinação específico do sítio.
Também se descreve agui um processo de criação, numa célula eucariótica, de um locus de gene endógeno flangueado pelos sítios de recombinação específico do sítio compreendendo: a) a criação de um VGACE compreendendo um sítio de recombinação específico do sítio, um braço de homologia a jusante contendo uma região que flanqueia a extremidade 3' da região do locus do gene endógeno e um braço de homologia a montante dentro do locus; b) a criação de um VGACE compreendendo um sítio de recombinação específico do sítio, um braço de homologia a montante contendo uma região que flanqueia a extremidade 5' da região do locus do gene endógeno e um braço de homologia a jusante dentro do locus; c) a introdução do VGACE de (a) e (b) na célula eucariótica; e d) a utilização de um ensaio quantitativo para detetar a modificação do alelo (MOA) no locus do gene endógeno para identificar as células eucarióticas de (c) nas quais os sítios de recombinação específicos do sítio estão flanqueados pelo locus do gene endógeno.
Também se descreve aqui um processo de criação, numa célula eucariótica, de um locus de um gene de uma região variável endógena de imunoglobulina, flanqueado por um sítio de recombinação específico do sítio compreendendo: a) a criação de um VGACE compreendendo um sítio de recombinação específico do sítio, um braço de homologia a jusante contendo a região imediatamente adjacente, mas não incluindo os segmentos J da região variável do locus de um gene de imunoglobulina e um braço de homologia a montante dentro do locus do gene de uma região variável; b) a introdução do VGACE de (a) na célula eucariótica; e c) a utilização de um ensaio quantitativo para detetar a modificação do alelo (MOA) no locus do gene de uma região variável para identificar as células eucarióticas de (b) nas quais o sitio de recombinação especifico do sitio flanqueia a extremidade a jusante do locus do gene de uma região variável endógena de imunoglobulina.
Também se descreve aqui um processo de criação, numa célula eucariótica, de um locus de um gene de uma região variável endógena de imunoglobulina, flanqueado por sítios de recombinação específicos do sítio compreendendo: a) a criação de um VGACE compreendendo um sítio de recombinação específico do sítio, um braço de homologia a montante contendo a região adjacente ao segmento mais distal do gene V mas não contendo quaisquer segmentos do gene V da região do locus do gene de uma região variável de imunoglobulina e um braço de homologia a jusante dentro do locus; b) a introdução do VGACE de (a) na célula eucariótica; e c) a utilização de um ensaio quantitativo para detetar a modificação do alelo (MOA) no locus do gene de uma região variável para identificar as células eucarióticas em (b) nas quais os sítios de recombinação específicos do sítios flanqueiam a extremidade a montante do locus do gene de uma região variável endógena de imunoglobulina.
Ainda se descreve aqui um processo de criação, numa célula eucariótica, de um locus de gene de uma região variável endógena de imunoglobulina, flanqueado pelos sitios de recombinação específicos do sitio compreendendo: a) a criação de um VGACE compreendendo um sítio de recombinação específico do sítio, um braço de homologia a jusante contendo a região imediatamente adjacente dos segmentos J, mas não contendo os segmentos J da região do locus do gene de uma região variável de imunoglobulina e um braço de homologia a montante, dentro do locus; b) a criação de um VGACE compreendendo um sitio de recombinação especifico do sítio, um braço de homologia a montante contendo a região adjacente ao segmento mais distal do gene V, mas não contendo quaisquer segmentos do gene V da região do locus do gene de uma região variável de imunoglobulina e um braço a jusante, dentro do locus; c) a introdução dos VGACE de (a) e (b) na célula eucariótica; e d) a utilização de um ensaio quantitativo para detetar a modificação do alelo (MOA) no locus do gene de uma região variável para identificar as células eucarióticas de (c) nas quais os sítios de recombinação específicos do sítios flanqueiam o locus do gene de uma região variável endógena de imunoglobulina.
Breve descrição das figuras
Figura 1: Diagrama esquemático da geração de um VGACE típico utilizando recombinação bacteriana homóloga. (chi = caixa de homologia 1; ch2 = caixa de homologia 2; ER = sítio da enzima de restrição).
Figura 2: Diagrama esquemático do fragmento dador e de VGACE para OCRIO de murganho. (chi = caixa de homologia 1; lacZ = QLA (quadro de leitura aberta) de β-galactosidase; SV40 poliA = um fragmento de ADN derivado do virus de simio 40, contendo um sitio de poliadenilação e um sinal; pFGC (em inglês, PGKp) = promotor de fosfoglicerato-cinase (FGC) de murganho; EM7 = um promotor bacteriano; neo = neomicina-fosfotransferase; FGC poliA = região 3' não traduzida derivada do gene de FGC e contendo um sitio de poliadenilação e um sinal; ch2 = caixa de homologia 2)
Figuras 3A—3D: Sequência do ADNc do OCRIO de murganho, caixa de homologia 1 (chi) , caixa de homologia 2 (ch2) , e sondas TaqMan® e iniciadores utilizados num ensaio de RCP quantitativa para detetar a modificação do alelo (MOA) em células EE recombinadas utilizando o VGACE do OCRIOm. chi: pares de bases 1 a 211 ch2: pares de bases 1586 a 1801, sonda TaqMan® e o correspondente conjunto de iniciadores de RCP derivados do exão 3 do OCRIOm:
Sonda TaqMan®: nucleótidos 413 a 439 - hélice superior
Iniciador ex3-5': nucleótidos 390 a 410 - hélice superior
Iniciador ex3-3': nucleótidos 445 a 461 - hélice inferior
Sonda TaqMan® e correspondente conjunto de iniciadores de RCP derivados do exão 4 do OCRIOm:
Sonda TaqMan®: nucleótidos 608 a 639 - hélice superior
Iniciador ex4-5': nucleótidos 586 a 605 - hélice superior
Iniciador ex4-3': nucleótidos 642 a 662 - hélice inferior
Figuras 4A-4D: Diagrama esquemático dos dois VGACE construídos para substituir a região VDJ de murganho por uma região VDJ humana.
Figura 4A: Isolamento de clones de inserção grandes (CBA) que se espalham por toda a região VDJ do locus humano de cadeia pesada.
Figura 4B: Neste exemplo, isolam-se clones grandes inseridos (CBA) das extremidades da região VDJ de murganho como a fontes dos braços de homologia que são utilizados para a integração direta, por via da recombinação homóloga, das sequências VDJ humanas, num processo em duas etapas.
Figuras 4C-4D: Na primeira etapa, prepara-se um VGACE1 (figura 4D) por recombinação bacteriana homóloga em E. coli. O VGACE1 contém, por ordem: um braço grande de homologia de murganho, derivado de uma região a montante da região VDJ de murganho, mas cujos pontos finais absolutos não são importantes; uma cassete que codifica um marcador selecionável funcional nas células EE (FGC-neomicina R neste exemplo); um sítio loxP; uma inserção grande humana que se estende desde vários segmentos do gene V através de toda a região DJ; e um braço de homologia de murganho contendo a região imediatamente adjacente mas não incluindo os segmentos J de murganho. Na segunda etapa, prepara-se VGACE2 (figura 4C) por recombinação bacteriana homóloga em E. coli. 0 VGACE2 contém, por ordem: um braço grande de homologia de rato contendo a região adjacente do segmento mais distal do gene V de rato, mas não contendo quaisquer segmentos do gene V de rato; uma inserção grande contendo um grande número de segmentos distais do gene V humano; um sitio loxP mutante designado por lox511 numa orientação oposta à dos sítios loxP do tipo selvagem em VGACE2 e VGACE1 (este sítio não se vai recombinar com os sítios loxP de tipo selvagem mas vai recombinar-se prontamente com outros sítios lox511); um sítio loxP de tipo selvagem; um segundo marcador selecionável (FGC-higromicina R neste exemplo); e um braço de homologia derivado da região V de murganho, mas cujos pontos finais absolutos não são importantes.
Definições
Um "vetor recombinante" é uma estrutura de ADN que contém sequências "homólogas" das sequências de ácidos nucleicos cromossómicos endógenos que flanqueiam uma modificação genética desejada. As sequências de homologia de flanqueio, referidas como "braços de homologia", direcionam o vetor de recombinação para uma localização cromossómica específica dentro do genoma em virtude da homologia que existe entre os braços de homologia e as correspondentes sequências endógenas e introduz a desejada modificação genética por meio de um processo referido como "recombinação homóloga". "Homólogo" significa duas ou mais sequências de ácidos nucleicos que ou são idênticas ou são suficientemente parecidas para serem capazes de hibridar uma com a outra ou sofrer permuta intramolecular. "Recombinação de gene" é a modificação de um locus cromossómico endógeno por inserção, eliminação ou substituição da sequência endógena por via da recombinação homóloga, utilizando um vetor de recombinação.
Um "gene knockout" é uma modificação genética que resulta da disrupção da informação genética codificada num locus cromossómico.
Um "gene knockin'' é uma modificação genética resultante da substituição da informação genética codificada num locus cromossómico com uma sequência diferente de ADN.
Um "organismo knockout" é um organismo no qual uma proporção significativa das células do organismo comporta um gene "knockout".
Um "organismo knockin'' é um organismo no qual uma proporção significativa de células do organismo comporta um gene "knockin''.
Um "marcador" ou um "marcador selecionável" é um marcador de selecção que permite o isolamento de células raras transfectadas, que expressam o marcador a partir da maioria das células tratadas na população. Esses genes de marcadores incluem, mas não se limitam a neomicina-fosfo-transferase e higromicina B-fosfotransferase ou proteínas fluorescentes, tais como GFP.
Uma "célula EE" é uma célula estaminal embrionária. Esta célula normalmente deriva de uma massa celular mais interna de um embrião no estado de blastócito.
Um "clone de uma célula EE" é uma subpopulação de células derivadas de uma única célula de uma população de células EE, no seguimento da introdução de ADN e subsequente seleção.
Um "ADN de flanqueio" é um segmento de ADN que é colinear e adjacente a um ponto de referência particular. "VGACE" são vetores grandes recombinantes, para células eucarióticas, que derivam de fragmentos de ADN genómico clonado, maiores do que os que são normalmente utilizados por outras abordagens que se destinam a realizar a recombinação homóloga em células eucarióticas.
Um "organismo não humano" é um organismo que não é normalmente aceite pelo público como sendo um ser humano. "Modificação de alelo" (MOA) refere-se à modificação da sequência exata de ADN de um alelo de um locus de gene ou cromossómico (loci) num genoma. Esta modificação do alelo (MOA) inclui, mas não se limita, a eliminações, substituições ou inserções de uma porção tão pequena como um simples nucleótido ou eliminações de muitas quilobases que se estendem por um locus (loci) de gene ou cromossómico de interesse, assim como, qualquer uma ou todas as modificações possíveis entre estes dois extremos.
Sequência "ortóloga" refere-se a uma sequência de uma espécie que é o equivalente funcional dessa sequência noutras espécies. A descrição e os exemplos apresentados infra são dados a título ilustrativo do tema da presente invenção. Um especialista nesta matéria reconhecerá que estes exemplos são dados apenas a título ilustrativo e não estão incluídos com a finalidade de limitar a presente invenção.
Descrição detalhada da invenção
Os requerentes desenvolveram um processo novo, rápido, aperfeiçoado e eficiente para criar e rastrear células eucarióticas que contêm genes endógenos modificados ou loci cromossómicos modificados. Nestas células, a modificação pode ser "knockout" de genes, "knockin" de genes, mutações pontuais ou inserções ou eliminações genómicas grandes ou outras modificações. A título de exemplo não limitativo, estas células podem ser células estaminais embrionárias que são úteis para criar organismos "knockout" ou "knockin" e, em particular, murganhos "knockout" ou "knockin", com a finalidade de determinar a função dos genes que tenham sido alterados, eliminados e/ou inseridos.
Os novos processos aqui descritos combinam, pela primeira vez: 1. a recombinação bacteriana homóloga para realizar com precisão, por engenharia genética, uma modificação genética desejada, dentro de um fragmento grande de ADN genómico clonado, criando assim um grande vetor de recombinação para ser utilizado em células eucarióticas (VGACE); 2. a introdução direta destes VGACE em células eucarióticas para modificar os genes endógenos correspondentes ou os locus (loci) cromossómicos de interesse nestas células; e 3. uma análise para determinar as células eucarióticas raras em que o alelo recombinado tenha sido modificado, conforme desejado, envolvendo um ensaio quantitativo para a modificação do alelo (MOA) do alelo parental.
Deve ser enfatizado que os processos anteriores, para detetar com sucesso a recombinação homóloga em células eucarióticas, não podem ser utilizados em conjunto com os VGACE da invenção dos requerentes, por causa dos longos braços de homologia presentes nos VGACE. Utilizando um VGACE para modificar deliberadamente genes endógenos ou loci cromossómicos em células eucarióticas, por via da recombinação homóloga, tornou-se possível, pela nova aplicação de um ensaio para determinar as células eucarióticas raras, nas quais o alelo recombinado tenha sido modificado conforme desejado, de tal maneira que envolve um ensaio quantitativo para a modificação do alelo (MOA) de um alelo parental, por meio da utilização, por exemplo, de RCP quantitativa ou de outros ensaios quantitativos apropriados para MOA. A capacidade para utilizar vetores de recombinação com braços de homologia maiores do que os utilizados nos processos actuais é extremamente válida pelas seguintes razões: 1. Os vetores de recombinação são gerados mais rapidamente e de forma mais conveniente a partir de bibliotecas disponíveis contendo inserções genómicas grandes (por exemplo, as bibliotecas CBA ou CPA) do que os vetores de recombinação preparados utilizando as tecnologias anteriores, em que as inserções genómicas têm de ser extensivamente caracterizadas e "adaptadas" antes da sua utilização (explicada em detalhe a seguir). Além disso, é preciso conhecer uma informação mínima sobre a sequência, no que respeita aos locus de interesse, isto é, só é preciso conhecer aproximadamente os 80-100 nucleótidos que são necessários para gerar as caixas de homologia (descritas em detalhe a seguir) e para gerar sondas que podem ser utilizadas em ensaios quantitativos para MOA (descritos em detalhe a seguir). 2. Modificações maiores, assim como modificações que se estendem por regiões genómicas maiores, são geradas de uma forma mais conveniente e em menos etapas do que utilizando as tecnologias anteriores. Por exemplo, o processo aqui descrito torna possível a modificação precisa de loci grandes que não podem ser acomodados pelos vetores tradicionais de recombinação, à base de plasmidos, por causa das limitações da sua dimensão. Também torna possível a modificação de qualquer locus, em diversos pontos (por exemplo, a introdução de mutações específicas em diferentes exões de um gene com vários exões), numa só etapa, evitando a necessidade de fazer a engenharia de vários vetores de recombinação e de realizar múltiplos ciclos de recombinação e rastreio para a recombinação homóloga em células EE. 3. A utilização de regiões longas de homologia (braços longos de homologia) aumenta a frequência de recombinação de loci, "difíceis de atingir", em células eucarióticas, consistente com as observações anteriores em que a recombinação homóloga, em células eucarióticas, parece estar relacionada com a homologia total contida dentro do vetor de recombinação. 4. O aumento da frequência de recombinação obtido utilizando braços longos de homologia aparentemente diminui o benefício, se houver algum, de utilizar ADN isogénico nestes vetores de recombinação. 5. A aplicação de ensaios quantitativos de MOA para o rastreio de células eucarióticas para a recombinação homóloga não só fortalece a utilização dos VGACE como vetores de recombinação (vantagens sublinhadas antes) mas também reduz o tempo para identificar correctamente as células eucarióticas modificadas desde os clássicos vários dias até várias horas. Além disso, a aplicação de MOA quantitativa não requer a utilização de sondas localizadas fora dos genes endógenos ou dos locus (loci) cromossómicos que tenham sido modificados, obviando assim à necessidade de conhecer a sequência que flanqueia os genes modificados ou o locus (loci). Esta é uma melhoria significativa na via de rastreio que tem sido realizada no passado e torna a actual abordagem de rastreio, para eventos de recombinação homóloga em células eucarióticas, muito menos intensiva em termos de trabalho e muito mais efectiva em termos de custos.
Processos
Muitas das técnicas utilizadas para preparar os vetores de ADN descritos aqui, são técnicas-padrão da biologia molecular, bem conhecidas dos especialistas na matéria (ver, por exemplo, Sambrook, J., E. F. Fritsch e T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, vols 1, 2 e 3, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Eds., Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley Interscience, NY). Toda a sequenciação do ADN é feita por técnicas-padrão utilizando um sequenciador de ADN ABI 373A e um estojo de sequenciação de ciclos com terminador de di-desoxi Taq (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA).
Etapa 1. Obtenção de um grande clone de ADN qenómico contendo os genes ou os locus (loci) cromossómicos de interesse.
Um gene (s) ou o locus (loci) de interesse pode selecionar-se com base em critérios específicos, tais como a estrutura detalhada ou os dados funcionais ou pode ser selecionado, na ausência dessa informação detalhada, como genes potenciais ou fragmentos de genes que se tornam previsíveis através dos esforços de vários projectos de sequenciação do genoma. É importante notar que não é necessário conhecer a sequência completa e a estrutura genética de um gene de interesse para aplicar o processo aqui descrito para produzir o VGACE. De facto, a única informação sobre a sequência que é necessária é de aproximadamente 80-100 nucleótidos de forma a obter o clone genómico de interesse, assim como gerar as caixas de homologia utilizadas na preparação do VGACE (descrita em detalhe a seguir) e para preparar sondas para serem utilizadas em ensaios quantitativos de MOA.
Uma vez selecionado um gene ou um locus (loci) de interesse obtêm-se grandes clones genómicos contendo este gene ou estes locus (loci). Estes clones podem ser obtidos por qualquer uma das várias vias, incluindo, mas não se limitando a rastreio de bibliotecas apropriadas de ADN (por exemplo, CBA, CPA, YAC ou cosmidos) por hibridação-padrão ou técnicas de RCP ou por qualquer outro processo familiar para um especialista na matéria.
Etapa 2. Caixas de homologia 1 e 2 anexas a uma cassete de modificação e geração do VGACE.
As caixas de homologia marcam os sítios da recombinação bacteriana homóloga que são utilizados para gerar o VGACE a partir de grandes fragmentos genómicos clonados (figura 1) . As caixas de homologia são segmentos curtos de ADN, geralmente de hélice dupla e com pelo menos 40 nucleótidos de comprimento, que são homólogas das regiões dentro do fragmento genómico grande clonado que flanqueia a "região a ser modificada". As caixas de homologia estão anexas à cassete de modificação, de forma que na recombinação homóloga que se segue, em bactérias, a cassete de modificação substitua a região a ser modificada (figura 1) . A técnica de criação de um vetor de recombinação utilizando a recombinação bacteriana homóloga pode ser utilizada em vários sistemas (Yang et al., Nat Biotechnol, 15: 859-65, 1997; Muyrers et al., Nucleic Acids Res, 27: 1555-7, 1999; Angrand et al., Nucleic Acids Res, 27: el6, 1999; Narayanan et al., Gene Ther, 6: 442-7, 1999; Yu, et al., Proc Natl Acad Sei EUA, 97: 5978-83, 2000). Um exemplo de uma tecnologia favorável vulgarmente utilizada na clonagem de ET (Zhang et al., Nat Genet, 20:1 23-8, 1998; Narayanan et al., Gene Ther, 6: 442-7, 1999) e variações desta tecnologia (Yu, et al., Proc Natl Acad Sei EUA, 97: 5978-83, 2000) . ET refere-se às proteínas recE (Hall e Kolodner, Proc Natl Acad Sei EUA, 91: 3205-9, 1994) e às proteínas recT (Kusano et al., Gene, 138: 17-25, 1994) que comportam a reação de recombinação homóloga. RecE é uma exonuclease que se adapta a uma hélice de 5' a 3' de ADN linear de hélice dupla (praticamente o fator dador de ADN descrito infra), deixando assim para trás um fragmento linear de hélice dupla com uma excrescência de hélice simples em 3'. Esta excrescência de hélice simples está revestida pela proteína recT, que tem atividade de ligação de ADN de hélice simples (ADNhs) (Kovall e Matthews, Science, 277: 1824-7, 1997) . A clonagem de ET realiza-se utilizando E. coli que expressa temporariamente os produtos do gene de E. coli de recE e de recT (Hall e Kolodner, Proc Natl Acad Sei EUA, 91:3 205-9, 1994; Clark et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 49: 453-62, 1984; Noirot e Kolodner, J Biol Chem, 273: 12274-80, 1998; Thresher et al., J Mol Biol, 254: 364-71, 1995;
Kolodner et al., Mol Microbiol, 11: 23-30, 1994; Hall et al., J Bacteriol, 175: 277-87, 1993) e a proteína lambda (λ) do bacteriófago Àgam (Murphy, J Bacteriol, 173: 5808-21, 1991;
Poteete et al., J Bacteriol, 170: 2012-21, 1988). A proteína Àgam é necessária para proteger o fragmento dador de ADN da degeneração pelo sistema da exonuclease recBC (Myers e Stahl, Annu Rev Genet, 28: 49-70, 1994) e é necessária para uma clonagem eficiente de ET em hospedeiros de recBC+, tais como a estirpe DHIOb de E. coli frequentemente utilizada. A região a ser modificada e substituída utilizando a recombinação bacteriana homóloga pode variar desde zero nucleótidos de comprimento (criando uma inserção no locus original) até muitas dezenas de quilobases (criando uma eliminação e/ou uma substituição do locus original). Consoante a cassete de modificação, a modificação pode resultar no seguinte: (a) eliminação das sequências de codificação, segmentos de genes ou elementos reguladores; (b) alterações da sequência de codificação, dos segmentos de genes ou dos elementos reguladores incluindo substituições, adições e fusões (por exemplo, marcadores de epítopos ou criação de proteínas bifuncionais, tais como as de GFP); (c) inserção de novas regiões de codificação, segmentos de genes ou elementos reguladores, tais como os que se destinam aos genes de marcadores selecionáveis ou aos genes-repórteres ou pondo novos genes sob o controlo transcricional endógeno; (d) criação de alelos condicionais, por exemplo, por introdução de sítios de loxP que flanqueiam a região a ser excisada pela recombinase Cre (Abremski e Hoess, J Biol Chem, 259: 1509-14, 1984) ou sítios de FRT que flanqueiam a reqião a ser excisada pela recombinase Flp (Andrews et al., Cell, 40: 795-803, 1985; Meyer-Leon et al., Cold Sprinq Harb Symp Quant Biol, 49: 797-804, 1984; Cox, Proc Natl Acad Sci EUA, 80: 4223-7, 1983); ou (e) substituição de sequências de codificação ou segmentos de genes de uma espécie por sequências de codificação ortólogas de espécies diferentes, por exemplo, substituição de um locus genético de murino por um locus genético humano ortólogo, por engenharia genética, num murganho, em que o locus particular tenha sido "humanizado".
Qualquer uma ou todas estas modificações podem ser incorporadas num VGACE. Um exemplo específico, não limitativo, em que uma sequência de codificação endógena é totalmente eliminada e simultaneamente substituída quer por um gene-repórter quer por um marcador selecionável, é dada a seguir no exemplo 1, tal como as vantagens do processo aqui descrito, quando comparado com as tecnologias anteriores.
Etapa 3 (opcional) . Verificação de que cada VGACE tenha sido correctamente tratado por engenharia.
Verificação de que cada VGACE tenha sido tratado correctamente por engenharia por meio de: a. Diagnóstico, por RCP, para verificar as novas junções criadas pela introdução do fragmento dador nos genes ou nos locus (loci) cromossómicos de interesse. Os fragmentos de RCP assim obtidos podem ser sequenciados para uma posterior verificação das novas junções criadas pela introdução do fragmento dador nos genes ou nos locus (loci) cromossómicos de interesse. b. Diagnóstico da digestão das enzimas de restrição para assegurar que apenas as modificações desejadas foram introduzidas no VGACE durante o processo de recombinação bacteriana homóloga. c. Sequenciação direta do VGACE, particularmente das regiões que se espalham desde o sitio da modificação para verificar as novas junções criadas pela introdução do fragmento dador nos genes ou nos locus (loci) cromossómicos de interesse.
Etapa 4. Purificação, preparação e linearização do ADN de VGACE para a introdução em células eucarióticas. a. Preparação do ADN de VGACE:
Prepara-se uma mini-preparação de ADN (Sambrook, J., E. F. Fritsch e T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, vols 1, 2 e 3, 1989; Tillett e
Neilan, Biotechniques, 24: 568-70, 572, 1998; http:// www.qiagen.com/literature/handbooks/plkmini/plm_399.pdf) de VGACE seleccionados e volta a transformar-se a mini-preparação de ADN de VGACE em E. coli utilizando eletro-poração (Sambrook, J., E. F. Fritsch e T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, vol 1, 2 e 3, 1989) . Esta etapa é necessária para nos livrarmos deste plasmido que codifica as proteínas recombinogénicas que são utilizadas para a etapa de recombinação bacteriana homóloga (Zhang et al., Nat Genet, 20: 123-8, 1998; Narayanan et al.,
Gene Ther, 6: 442-7, 1999). É útil livrarmo-nos deste plasmido (a) porque é um plasmido com um número elevado de cópias e pode reduzir o rendimento obtido nas preparações de VGACE em larga escala; (b) para eliminar a possibilidade de induzir a expressão das proteínas recombinogénicas; e (c) porque pode obscurecer o mapeamento físico dos VGACE. Antes da introdução dos VGACE em células eucarióticas, preparam-se grandes quantidades do ADN de VGACE por uma metodologia-padrão (http ://www.qiagen. com/literature/handbooks/plk/plklow. pdf; Sambrook, J., E. F. Fritsch e T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, vols 1, 2 e 3, 1989;
Tillett e Neilan, Biotechniques, 24: 568-70, 572, 1998).
Contudo, esta etapa pode ser ultrapassada se se utilizar um processo de recombinação bacteriana homóloga que utiliza um pró-fago recombinogénico, isto é, quando os genes que codificam as proteínas recombinogénicas são integrados no cromossoma bacteriano (Yu, et al., Proc Natl Acad Sei EUA, 97: 5978-83, 2000) . b. Linearização do ADN de VGACE:
Para preparar o VGACE para a introdução em células eucarióticas, o VGACE é preferencialmente linearizado de uma forma que deixa os genes endógenos modificados ou o ADN dos locus (loci) cromossómicos flanqueados com braços longos de homologia. Isto pode conseguir-se pela linearização do VGACE, preferencialmente na estrutura do vetor, com qualquer enzima de restrição apropriada que digira apenas raramente. Exemplos de enzimas de restrição apropriadas incluem Notl, Pad, Sfil, Srfl, SwaI, Fsel, etc. A escolha da enzima de restrição pode ser determinada experimentalmente (isto é, fazendo vários ensaios de vários cortadores raros de diferentes candidatos) ou, se a sequência de VGACE for conhecida, analisando a sequência e escolhendo uma enzima de restrição apropriada com base na análise. Em situações em que o VGACE tem uma estrutura vetorial contendo sítios raros, tais como os sítios CosN, então pode ser clivada com enzimas que reconheçam esses sítios, por exemplo, a terminase λ (Shizuya et al., Proc Natl Acad Sei EUA, 89: 8794-7, 1992; Becker e Gold, Proc Natl Acad Sei EUA, 75: 4199-203, 1978; Rackwitz et al., Gene, 40: 259-66, 1985).
Etapa 5. Introdução do VGACE em células eucarióticas e seleção das células quando tem lugar a introdução, com sucesso, do VGACE. 0 ADN de VGACE pode ser introduzido em células eucarióticas utilizando uma metodologia padrão, tal como transfecção mediada por fosfato de cálcio, lípidos ou electroporação (Sambrook, J., E. F. Fritsch e T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, vols 1, 2 e 3, 1989). As células onde o VGACE tenha sido introduzido com sucesso podem ser selecionadas pela exposição a agentes de seleção, consoante o gene marcador selecionável que tenha sido tratado por engenharia no VGACE. Como exemplo não limitativo, se o marcador seleccionável for o gene da fosfotransferase de neomicina (neo) (Beck, et al., Gene, 19: 327-36, 1982), então as células que retiveram o VGACE podem ser selecionadas em meios contendo G418; as células que não têm o VGACE irão morrer, enquanto as células que retêm o VGACE irão sobreviver (Santerre, et al., Gene, 30: 147-56, 1984). Outros marcadores selecionáveis apropriados incluem qualquer fármaco que tenha actividade em células eucarióticas (Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999) , tal como, higromicina B (Santerre, et al., Gene, 30: 147-56, 1984; Bernard, et al., Exp Cell Res, 158: 237-43, 1985; Giordano e McAllister, Gene, 88: 285-8, 1990), blasticidina S (Izumi, et al., Exp Cell Res, 197: 229-33, 1991) e outros que são familiares para os especialistas na matéria.
Etapa 6. Rastreio de eventos de recombinação homóloga em células eucarióticas utilizando um ensaio quantitativo da modificação do alelo (MOA).
As células eucarióticas que tenham sido modificadas com sucesso por recombinação do VGACE no locus de interesse podem ser identificadas utilizando uma variedade de abordagens que podem detetar modificações de alelos dentro do locus de interesse e que não dependem de ensaios que percorram todo o braço ou os braços de homologia. Essas abordagens podem incluir, mas não se limitam a: (a) uma RCP quantitativa utilizando TaqMan® (Lie e Petropoulos, Curr Opin Biotechnol, 9: 43-8, 1998); (b) um ensaio quantitativo de MOA utilizando sinais moleculares (Tan, et al., Chemistry, 6: 1107-11, 2000); (c) hibridação por fluorescência in situ (FISH) (Laan, et al., Hum Genet, 96: 275-80, 1995) ou hibridação genómica comparativa (HGC) (Forozan, et al., Trends Genet, 13: 405-9, 1997; Thompson e Gray, J Cell Biochem Supl, 139-43, 1993; Houldsworth e Chaganti, Am J Pathol, 145: 1253-60, 1994); (d) amplificação isotérmica de ADN (Lizardi, et al., Nat Genet, 19: 225-32, 1998; Mitra e Church, Nucleic Acids Res, 27: e34, 1999); e (e) hibridação quantitativa com sondas imobilizadas (Southern, J. Mol. Biol. 98: 503, 1975; Kafatos FC; Jones CW; Efstratiadis A, Nucleic Acids Res 7 (6) : 1541-52, 1979).
Os requerentes providenciam aqui um exemplo em que se utiliza a RCP quantitativa TaqMan® para rastrear, com sucesso, células eucarióticas recombinadas. Neste exemplo, não limitativo, utiliza-se TaqMan® para identificar células eucarióticas que tenham sofrido recombinação homóloga em que uma porção de um de dois alelos endógenos num genoma diplóide tenha sido substituida por outra sequência. Ao contrário dos processos tradicionais, em que uma diferença do comprimento do fragmento de restrição que se estende por todo o braço ou braços de homologia indica a modificação de um dos dois alelos, o processo quantitativo TaqMan® irá detetar a modificação de um alelo medindo a redução do número de cópias (para metade) do alelo não modificado. Especificamente, a sonda deteta o alelo não modificado e não deteta o alelo modificado. Por isso, o processo é independente da natureza exacta da modificação e não está limitado à substituição da sequência descrita neste exemplo. 0 TaqMan® é utilizado para quantificar o número de cópias de uma matriz de ADN numa amostra de ADN genómico, especialmente por comparação com um gene de referência (Lie e Petropoulos, Curr Opin Biotechnol, 9: 43-8, 1998). 0 gene de referência é quantificado no mesmo ADN genómico que o genes ou os locus (loci) alvo. Por isso, realizam-se duas amplificações com TaqMan® (cada uma com a sua respetiva sonda). Uma sonda de TaqMan® determina o ciclo limiar "Cl" do gene de referência, enquanto a outra sonda determina o Cl da região dos genes ou do locus (loci) recombinados que estão substituidos por uma recombinação com sucesso. 0 Cl é uma quantidade que reflecte a quantidade de ADN inicial para cada uma das sondas de TaqMan®, isto é, uma sequência menos abundante requer mars sitios de RCP para atingir o ciclo limiar. A diminuição para metade do número de cópias da sequência da matriz para uma reação de TaqMan®, resultará num aumento de cerca de uma unidade de Cl. As reacções de TaqMan® nas células em que um alelo dos genes ou dos locus (loci)-alvo tenham sido substituidos por recombinação homóloga, irão resultar num aumento de um Cl para a reação-alvo por TaqMan® sem o aumento de Cl para o gene de referência, quando comparado com o ADN de células não recombinadas. Isto permite uma deteção rápida da modificação de um alelo dos genes de interesse em células eucarióticas, utilizando os VGACE.
Tal como definido antes, o rastreio da modificação de alelo (MOA) consiste na utilização de qualquer processo que detete a modificação de um alelo para identificar células que tenham sofrido recombinação homóloga. Não existe o requisito de que os alelos recombinados sejam idênticos (homólogos) um ao outro e, de facto, podem conter polimorfismos, tal como é o caso na progenia resultante do cruzamento de duas estirpes diferentes de murganho. Além disso, uma situação especial é aquela que está também coberta pelo rastreio de MOA, que consiste na recombinação de genes que estão normalmente presentes numa única cópia nas células, tais como alguns dos utilizados nos cromossomas sexuais e, em particular, no cromossoma Y. Neste caso, os processos que irão detetar a modificação do alelo simples recombinado, tal como RCP quantitativa, "Southern blotting", etc., podem ser utilizados para detetar um evento de recombinação. É claro que o processo aqui descrito pode ser utilizado para gerar células eucarióticas modificadas mesmo quando os alelos são poli-mórficos ou quando estão presentes numa única cópia nas células recombinadas.
Etapa 8. Utilizações de células eucarióticas geneticamente modificadas. (a) As células eucarióticas geneticamente modificadas, geradas pelos processos descritos nas etapas 1 a 7 podem ser utilizadas em qualquer ensaio in vitro ou in vivo, quando é desejável alterar o fenótipo da célula. (b) A célula eucariótica geneticamente modificada, gerada pelos processos descritos nas etapas 1 a 7, pode também ser utilizada para gerar um organismo portador da modificação genética. Os organismos geneticamente modificados podem ser gerados por várias técnicas diferentes incluindo, mas não se limitando a: 1. Células estaminais embrionárias (EE) modificadas, tais como as células EE de ratos e murganhos frequentemente utilizadas. As células EE podem ser utilizadas para criar ratos ou murganhos geneticamente modificados por uma tecnologia-padrão de injecção de blastócitos ou por técnicas de agregação (Robertson, Practical Approach Series, 254, 1987; Wood, et al., Nature, 365: 87-9, 1993; Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999), injecção de blastócitos tetraplóides (Wang, et al., Mech Dev, 62: 137-45, 1997) ou transferência nuclear e clonagem (Wakayama, et al., Proc Natl Acad Sci EUA, 96: 14984-9, 1999) . As células EE derivadas de outros organismos, tais como coelhos (Wang, et al., Mech Dev, 62: 137-45, 1997; Schoonjans, et al., Mol Reprod Dev, 45: 439-43, 1996) ou galinhas (Pain, et al., Development, 122: 2339-48, 1996) ou outras espécies também são aproveitáveis para modificações genéticas utilizando os processos aqui descritos. 2. Podem utilizar-se protoplastos modificados para gerar plantas geneticamente modificadas (ver, por exemplo, a patente norte-americana 5 350 689 "Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells" e a patente norte-americana 5 508 189 "Regeneration of plants from cultured guard cell protoplasts" e as respectivas referências). 3. Transferência nuclear de células eucarióticas modificadas para oócitos para gerar organismos clonados com alelos modificados (MOA) (Wakayama, et al., Proc Natl Acad Sei EUA, 96: 14984-9, 1999; Baguisi, et al., Nat Biotechnol, 17: 456-61, 1999; Wilmut, et al., Reprod Fértil Dev, 10: 639-43, 1998; Wilmut, et al., Nature, 385: 810-3, 1997; Wakayama, et al., Nat Genet, 24: 108-9, 2000; Wakayama, et al., Nature, 394: 369-74, 1998; Rideout, et al., Nat Genet, 24: 109-10, 2000; Campbell, et al., Nature, 380: 64-6, 1996). 4. Fusão de células para transferir o alelo modificado para outra célula, incluindo a transferência de cromossomas tratados por engenharia genética e a utilização dessas células para gerar organismos portadores do alelo modificado ou cromossomas tratados por engenharia genética (Kuroiwa, et al., Nat Biotechnol, 18: 1086-1090, 2000). 5. Os processos aqui descritos são também utilizáveis para quaisquer outras abordagens que tenham sido utilizadas ou que ainda estão por descobrir.
Embora muitas das técnicas utilizadas na prática das etapas individuais dos processos aqui descritos sejam familiares para os especialistas na matéria, os requerentes entendem que a novidade do processo aqui descrito recai na combinação única dessas etapas e técnicas acopladas com o processo nunca descrito antes da introdução de um VGACE diretamente nas células eucarióticas para modificar um locus cromossómico e a utilização dos ensaios quantitativos de MOA para identificar células eucarióticas que tenham sido modificadas de uma forma apropriada. Esta nova combinação representa uma melhoria significativa sobre as tecnologias anteriores para a criação de organismos que possuam modificações de genes endógenos ou de loci cromossómicos.
Exemplos
Exemplo 1: Células EE de rato tratadas por engenharia que comportam uma eliminação do gene OCRIO. a. Seleção de vim clone grande de ADN genómico contendo OCRlOm.
Obteve-se um clone de um cromossoma bacteriano artificial (CBA) comportando um fragmento grande de ADN genómico que continha sequência de codificação do gene OCRIO de murganho (OCRlOm) por rastreio numa biblioteca ordenada de CBA de ADN genómico de murganho (Incyte Genomics) utilizando RCP. Os iniciadores utilizados para rastrear esta biblioteca derivaram da sequência do ADNc do gene OCRlOm.
Utilizaram-se dois pares de iniciadores:
(a) OCRIO.RAA
e OCRIO.PVIrc
que amplifica um ADN de 102 pb; e
(b) OCRIO.TDY
e OCRIO.QETrc
que amplifica um ADN de 1500 pb.
Este CBA de OCRlOm continha aproximadamente 180 kb de ADN genómico incluindo toda a sequência de codificação de OCRlOm. Este clone de CBA foi utilizado para gerar um VGACE que foi em seguida utilizado para eliminar uma porção da região de codificação de OCRlOm ao mesmo tempo que introduzia simultaneamente um gene repórter cujo codão de iniciação substituía precisamente o codão de iniciação de OCRIO substituído, assim como a inserção de um gene marcador selecionável útil para a seleção tanto de E. coli como de células de mamíferos, no seguimento do gene repórter (figura 2). 0 gene-repórter (neste exemplo não limitativo LacZ, cuja sequência está facilmente disponível para um especialista na matéria) codifica a enzima β-galactosidase de E. coli. Por causa da posição de inserção de LacZ (o seu codão de iniciação está na mesma posição que o codão de iniciação de OCRIOm) a expressão de LacZ deve simular a de OCRIOm, como já foi observado noutros exemplos onde se realizaram substituições semelhantes com LacZ utilizando as tecnologias anteriores (ver "Gene trap strategies in ES cells", por W Wurst e A. Gossler, em Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999). 0 gene LacZ permite um ensaio enzimático simples e padrão que pode revelar os seus modelos de expressão in situ, providenciando assim um ensaio de substituição que reflete os modelos normais de expressão dos genes substituídos ou dos locus (loci) cromossómicos. b. Preparação de um fragmento dador e geração de um VGACE. A cassete de modificação utilizada na preparação de um VGACE de OCRIOm é a cassete de lacZ-SV40 poliA-pFGC-EM7-neo-FGC poliA em que LacZ é um gene marcador, tal como descrito antes, SV40 poliA é um fragmento derivado do vírus 40 de símio (Subramanian, et al., Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 19: 157-64, 1976; Thimmappaya, et al. , J Biol Chem, 253: 1613-8, 1978; Dhar, et al., Proc Natl Acad Sci EUA, 71: 371-5, 1974; Reddy, et al., Science, 200: 494-502, 1978) e contendo um sítio e um sinal de poliadenilação (Subramanian, et al., Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 19: 157-64, 1976; Thimmappaya, et al., J Biol Chem, 253: 1613-8, 1978; Dhar, et al., Proc Natl Acad Sci EUA, 71: 371-5, 1974; Reddy, et al., Science, 200: 494-502, 1978), pFGC é um promotor de fosfoglicerase-cinase (FGC) de murganho (Adra, et al., Gene, 60: 65-74, 1987) (que tem sido largamente utilizado para acionar a expressão de genes de resistência a fármacos em células de mamíferos), EM7 é um promotor bacteriano forte que tem a vantagem de permitir a seleção positiva em bactérias da estrutura completa de VGACE por acionamento da expressão do gene de fosfo-transferase de neomicina (neo) , neo é um marcador selecionável que confere resistência a canamicina em células procarióticas e resistência a G418 em células eucarióticas (Beck, et al., Gene, 19: 327-36, 1982) e FGC poliA é uma região 3' não traduzida derivada de um gene de FGC e contendo um sítio de poliadenilação e um sinal (Boer, et al., Biochem Genet, 28: 299-308, 1990).
Para preparar o VGACE de OCRlOm, primeiro gerou-se um fragmento dador que consiste numa caixa com homologia (chi) com OCRlOm ligada, a montante do gene LacZ, à cassete de modificação e uma caixa de homologia 2 (ch2) de OCRlOm ligada, a jusante da sequência de neo-FGC poliA, à cassete de modificação (figura 2), utilizando uma tecnologia-padrão de engenharia genética recombinante. A caixa de homologia 1 (chi) consiste em 211 pb de uma sequência não traduzida imediatamente a montante da metionina de iniciação do quadro de leitura aberta de OCRlOm (QLA de ORCIOm) (figura 3A-3D). A caixa de homologia 2 (ch2) consiste nos últimos 216 pb do QLA de OCRlOm, terminando no codão de terminação (figura 3A-3D).
Em seguida, utilizando a recombinação bacteriana homóloga (Zhang, et al., Nat Genet, 20: 123-8, 1998; Angrand, et al., Nucleic Acids Res, 27: el6, 1999; Muyrers, et al., Nucleic Acids Res, 27: 1555-7, 1999; Narayanan, et al., Gene Ther, 6: 442-7, 1999; Yu, et al., Proc Natl Acad Sci EUA, 97: 5978-83, 2000), utilizou-se este fragmento dador para substituir com precisão a região de codificação de OCRIOm (desde a metionina de iniciação até ao codão de terminação) com a cassete de inserção, resultando numa estrutura do VGACE de OCRIOm (figura 2). Assim, neste VGACE de OCRIOm, a sequência de codificação de OCRIOm foi substituída pela cassete de inserção criando uma eliminação de, aproximadamente, 20 kb no locus de OCRIOm, ao mesmo tempo que deixava aproximadamente 130 kb de homologia a montante (braço de homologia a montante) e 32 kb de homologia a jusante (braço de homologia a jusante). É importante notar que os VGACE podem ser gerados de forma mais rápida e conveniente a partir de bibliotecas disponíveis de CBA, do que os vetores de recombinação preparados utilizando as tecnologias anteriores, porque é necessário apenas uma única etapa de recombinação bacteriana homóloga e a única informação sobre sequências necessária é a que é precisa para gerar as caixas de homologia. Ao contrário, as abordagens anteriores para gerar vetores recombinantes utilizando a recombinação bacteriana homóloga requerem que muitos vetores recombinantes sejam "adaptados" antes da sua introdução nas células EE (Hill et al., Genomics, 64: 111-3, 2000). Esta adaptação é necessária por causa da necessidade de gerar braços de homologia suficientemente curtos para acomodar os processos de rastreio utilizados pelas abordagens anteriores. A principal desvantagem do processo de Hill et al., consiste no facto de serem necessárias duas etapas adicionais de recombinação homóloga simplesmente para a adaptação (uma para adaptar a região a montante do locus modificado e uma para adaptar a região a jusante do locus modificado). Para fazer isto, é necessária bastante mais informação sobre as sequências, incluindo a informação de sequências que abrangem os sítios de adaptação.
Além disso, uma outra vantagem óbvia, ilustrada pelo exemplo anterior, reside no facto de uma eliminação muito grande que abarca o gene de OCRIOm (aproximadamente 2 0 kb) , poder ser facilmente gerada numa única etapa. Ao contrário, utilizando as tecnologias anteriores, para conseguir realizar a mesma tarefa, pode exigir várias etapas e pode envolver a marcação de regiões a montante e a jusante das sequências de codificação com sítios loxP para utilizar a recombinase Cre para remover a sequência flanqueada por estes sítios após a introdução do locus modificado nas células eucarióticas. Isto pode ser inatingível numa só etapa e assim pode exigir a preparação de dois vetores de recombinação utilizando diferentes marcadores de seleção e dois eventos sequenciais de recombinação nas células EE, um para introduzir o sítio loxP na região a montante da sequência de codificação e outro para introduzir o sítio loxP na região a jusante da sequência de codificação. Ainda se deve notar que a criação de eliminações grandes ocorre muitas vezes com uma baixa eficiência utilizando as tecnologias de recombinação anteriores nas células eucarióticas, por causa da frequência do atingimento da recombinação homóloga poder ser baixa quando se utilizam vetores de recombinação contendo eliminações grandes flanqueadas por braços de homologia relativamente curtos. A elevada eficiência obtida, utilizando o processo aqui descrito (ver a seguir) é devida a estes braços de homologia muito longos, presentes no VGACE, que aumentam a taxa de recombinação homóloga em células eucarióticas. c. Verificação, preparação e introdução de ADN de VGACE de OCRlOm em células EE. A sequência que rodeia a junção da cassete de inserção e a sequência de homologia foram verificadas por sequenciação do ADN. A dimensão do VGACE de OCRlOm foi verificada por análise de restrição seguida de electroforese em gel de campo pulsado (EGCP) (Cantor, et al., Annu Rev Biophys Biophys Chem, 17: 287-304, 1988; Schwartz e Cantor, Cell, 37: 67-75, 1984) . Fez-se uma preparação-padrão de plasmido, em larga escala, do VGACE de OCRlOm, o ADN do plasmido foi digerido com enzima de restrição Notl, que corta na estrutura do vetor VGACE de OCRlOm, para gerar ADN linear. Em seguida introduziu-se o ADN linearizado em células EE de murganho, por eletroporação (Robertson, Practical Approach Series, 254, 1987; Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999;
Sambrook, et al., Sambrook, J., E. F. Fritsch e T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, vols 1, 2 e 3, 1989) . As células EE foram transfectadas, com sucesso, com o VGACE de OCRlOm e foram selecionadas num meio contendo G418 utilizando processos-padrão de seleção (Robertson, Practical Approach Series, 254, 1987; Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999). d. Identificação de clones de células EE recombinadas utilizando uma modificação quantitativa do ensaio do alelo (MOA).
Para identificar células EE nas quais um dos dois genes endógenos de OCRlOm tenha sido substituído pela sequência da cassete de modificação, analisou-se o ADN de clones de células EE individuais, por RCP quantitativa, utilizando a metodologia-padrão TaqMan®, tal como descrita (Applied Biosystems, TaqMan® Universal PCR Master Mix, número de catálogo P/N 4304437; ver também http://www.pebiodocs.com/pebiodocs/04 30444 9.pdf) . Os iniciadores e as sondas de TaqMan® utilizados estão descritos nas figuras 3A-3D. Rastreou-se um total de 69 clones independentes de células EE e identificaram-se 3 como positivos, isto é, como clones nos quais uma das sequências endógenas de codificação de OCRIOm tinha sido substituída pela cassete de modificação descrita antes. Várias vantagens da abordagem de MOA são evidentes: (i) Não exige a utilização de uma sonda fora do locus a ser modificado, obviando assim à necessidade de conhecer a sequência de flanqueio do locus modificado. (ii) Exige muito pouco tempo para a sua realização, comparado com o tempo da metodologia convencional de "Southern blot" que tem sido o método escolhido anteriormente (Robertson, Practical Approach Series, 254, 1987, Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999), reduzindo assim o tempo para identificar corretamente células modificadas desde os habituais vários dias até apenas algumas horas.
Esta é uma melhoria significativa na via de rastreio que tem sido realizado no passado e torna o processo muito menos intensivo em termos de trabalho e uma abordagem muito mais eficaz em termos de custos para rastrear eventos de recombinação homóloga em células eucarióticas.
Ainda uma outra vantagem do processo aqui descrito consiste no facto de ser também superior às tecnologias anteriores por causa da sua capacidade para atingir loci difíceis. Utilizando as tecnologias anteriores, tem sido demonstrado que, para certos loci, a frequência ou a taxa de sucesso da recombinação pode ser tão baixa quanto 1 em 2000 eventos de integração, talvez mesmo menos. Utilizando o processo aqui descrito, os requerentes demonstraram que esses loci difíceis podem ser atingidos muito mais eficientemente utilizando um VGACE que contenha braços de homologia longos (isto é, maiores do que os que são permitidos pelas tecnologias anteriores). Como nos exemplos não limitativos descritos anteriormente o demonstram, os requerentes recombinaram o locus de OCRIO, um locus que se tinha provado anteriormente ser recalcitrante à recombinação, utilizando a tecnologia convencional. Utilizando o processo aqui descrito, os requerentes demonstraram que tiveram sucesso na recombinação em 3 de 69 clones de células EE nos quais o VGACE de OCRIOm (contendo mais do que 160 kb de braços de homologia e introduzindo uma eliminação de 20 kb) tinham integrado, enquanto utilizando a tecnologia anterior para a recombinação de células EE (Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999), utilizando um vetor à base de plasmido com braços de homologia mais curtos do que 10-20 kb, embora também introduzindo uma eliminação inferior a 15 kb, não se identificaram eventos de recombinação entre mais do que 600 integrantes do vetor. Estes dados demonstram claramente a superioridade do processo aqui descrito sobre as tecnologias anteriores.
Exemplo 2: Alimento da frequência de recombinação e anulação da necessidade de utilizar ADN isogénico quando os VGACE são utilizados como vetores de recombinação.
Tal como se fez notar antes, o aumento da frequência de recombinação obtido utilizando braços longos de homologia deve diminuir o benefício, se houver algum, derivado da utilização de ADN genómico na preparação de VGACE que é isogénico (isto é, idêntico nas suas sequências) com o ADN das células eucarióticas que vão ser recombinadas. Para testar esta hipótese, os requerentes prepararam numerosos VGACE utilizando ADN genómico derivado da mesma sub-estirpe de murganho que as células eucarióticas a serem recombinadas (presumivelmente isogénicas) e numerosos outros VGACE utilizando ADN genómico derivado de sub-estirpes de murganho que diferem das estirpes das células eucarióticas a serem recombinadas (presumivelmente não isogénicas). Os dois conjuntos de VGACE exibiram frequências de recombinação semelhantes, variando de 1-13 % (quadro 1), indicando que a taxa de sucesso da recombinação utilizando VGACE não depende da isogenicidade. QUADRO 1
RESUMO DA RECOMBINAÇÃO DE GENES UTILIZANDO VETORES DE CLONES
DE CBA
Em resumo, a abordagem de criação de VGACE e a sua utilização direta como vetores de recombinação combinados com o rasteio de MOA para eventos de recombinação homóloga em células EE cria um novo processo para tratar, por engenharia genética, loci modificados, processo que é rápido, barato e representa uma melhoria significativa sobre os processos utilizados anteriormente que eram entediantes e consumidores de tempo. Abre-se assim a possibilidade de uma análise genómica funcional in vivo em larga escala e rápida, para praticamente qualquer gene num genoma de organismos, numa fracção de tempo e com um custo muito melhorados em relação às metodologias anteriores.
Exemplo 3: Utilização dos VGACE para produzir anticorpos quiméricos e humanos. a. Introdução
Os anticorpos são compostos por duas cadeias, as cadeias leve e pesada, cada uma das quais é composta por dois domínios, os domínios variável e constante. A região variável da proteína do anticorpo é a porção do terminal N do anticorpo que se liga ao antigénio. 0 domínio variável da cadeia pesada é codificado pelo ADN do locus do gene de uma região variável da cadeia pesada, que é composto pelos segmentos de genes de regiões variáveis (V) , de diversidade (D) e de junção (J). Os domínios variáveis da cadeia leve são codificados pelo ADN dos loci de genes de regiões variáveis da cadeia leve, kapa e lambda, que são compostos pelos segmentos de genes de regiões variáveis (V) e de junção (J) . 0 rearranjo dos genes de regiões variáveis (VDJ/VJ) durante o desenvolvimento inicial de células B é o mecanismo principal por meio do qual o sistema imunitário produz anticorpos capazes de reconhecer o enorme número de antigénios que podem encontrar. Praticamente, através dos rearranjos do ADN durante o desenvolvimento de células B, compõe-se um reportório enorme de sequências de regiões variáveis (VDJ/VJ) que se juntam em seguida a uma região contante (C) para produzir cadeias pesadas e leves completas que se juntam para formar um anticorpo. Depois dos anticorpos funcionais se terem juntado, a hipermutação somática que ocorre nos órgãos linfóides secundários introduz maior diversidade, o que permite ao organismo selecionar e otimizar a afinidade do anticorpo. A produção de anticorpos para vários antigénios em espécies não humanas providenciou inicialmente uma grande promessa para a produção de anticorpos em larga escala que poderiam ser usados como agentes terapêuticos humanos. Contudo, espécies diferentes levam à produção de anticorpos pelos seres humanos que inativam os anticorpos exógenos e causam reacções alérgicas. Fizeram-se em seguida tentativas para "humanizar" os anticorpos, fazendo assim com que fosse menos provável que fossem reconhecidos como exógenos nos seres humanos. Inicialmente este processo envolveu a combinação de porções de ligação ao antigénio de anticorpos derivados de murganhos com a região constante de anticorpos humanos, criando assim anticorpos recombinantes que eram menos imunogénicos nos seres humanos. Desenvolveu-se uma segunda abordagem que foi a exibição de fagos, por meio da qual as regiões humanas V foram clonadas numa biblioteca de exibição de fagos e regiões com as caracteristicas de ligação apropriadas que se ligaram a regiões constantes humanas para criar anticorpos humanos. Contudo, esta tecnologia é limitada pela falta de desenvolvimento de anticorpos e pela afinidade de maturação que naturalmente ocorre em células B.
Mais recentemente, fez-se o "knockout" de genes endógenos de murganho e os genes foram substituídos com as suas contrapartes humanas para produzir anticorpos inteiramente humanos. Infelizmente, a utilização destes vetores tem sublinhado a importância de uma região endógena constante no desenvolvimento e na otimização de anticorpos em células B. Os murganhos que produzem anticorpos completamente humanos reduziram as respostas imunitárias. Isto pode acontecer porque os anticorpos humanos produzidos por murganhos transgénicos, com vetores completamente humanos, reduziram a afinidade, quando comparados com as suas contrapartes de murganho. A redução da afinidade pode afectar a maturação e a sobrevivência das células B. De acordo com isto, os muito aclamados processos de produção de anticorpos humanizados em murganhos e noutros organismos onde as regiões endógenas variáveis e regiões constantes dos ratos foram "knockouted" e substituídas pelas suas contrapartes humanas, não resultou em anticorpos ótimos. Já foi sugerida a utilização de anticorpos quiméricos, que utilizam regiões variáveis humanas (VDJ/VJ) com regiões contantes de murganhos através da maturação de células B, seguida da subsequente engenharia dos anticorpos para substituir as regiões constantes de murganho pelas suas contrapartes humanas (patente norte-americana N2. 5 770 429, publicada em 23 de Junho de 1998). Contudo, a única metodologia que existiu até à data para preparar esses anticorpos quiméricos tem sido a transmutação, em que a formação de anticorpos quiméricos é apenas um evento raro que ocorre apenas em cadeias pesadas. Na verdade, não existe nenhum mecanismo para produzir, em larga escala, em animais transgénicos, a substituição de todos os segmentos que codificam o gene de uma região variável completa por genes humanos, produzindo assim quimeras tanto nas cadeias pesadas como leves. Utilizando a tecnologia dos requerentes, tal como aqui descrita, geram-se anticorpos quiméricos que podem então ser alterados, através de uma tecnologia-padrão para criar anticorpos humanos de elevada afinidade. b. Descrição resumida
Cria-se um murganho transgénico que produz anticorpos híbridos contendo regiões varáveis humanas (VDJ/VJ) e regiões constantes de murganho. Consegue-se isto por meio de uma substituição, in situ, de genes da região variável de murganho (VDJ/VJ) pelas suas contrapartes humanas. Os loci de imunoglobulina híbrida resultantes irão sofrer o processo natural de rearranjo durante o desenvolvimento de células B para produzir anticorpos híbridos.
Em seguida, produzem-se anticorpos completamente humanos substituindo as regiões constantes de murganho pelas desejadas contrapartes humanas. Esta abordagem dará origem a anticorpos terapêuticos muito mais eficientes do que os dos processos anteriores, por exemplo, a "humanização" de anticorpos monoclonais de murganhos ou a geração de anticorpos completamente humanos em ratos AcMHu. Além disso, este processo irá ter sucesso na produção de anticorpos terapêuticos para muitos antigénios para os quais os processos anteriores falhavam. Este murganho vai criar anticorpos que são uma região constante humana de murganho (VDJ/VJ), que terá os seguintes benefícios em relação aos ratos de AcMHu previamente disponíveis, que produziam anticorpos totalmente humanos. Os anticorpos gerados pelo novo rato irão reter as regiões Fc de murino que irão interagir de forma mais eficiente com os outros componentes do complexo do receptor das células B de murganho, incluindo as componentes de sinalização necessárias para uma diferenciação apropriada das células B (tais como Iga e Igb). Além disso, as regiões Fc de murinos serão mais específicas do que as regiões Fc humanas nas suas interacções com os receptores Fc em células de murganho, moléculas de complemento, etc. Estas interações são importantes para uma resposta imunitária forte e específica, para a proliferação e a maturação de células B e para maturação da afinidade de anticorpos.
Como há uma substituição direta das regiões humanas V-D-J/V-J pelas regiões equivalentes de todos os loci de murganhos, as sequências necessárias para uma transcrição, recombinação e/ou mutação apropriadas permanecerão intatas. Por exemplo, o melhorador intrónico da cadeia pesada de imunoglobulina de murino, Em, tem demonstrado ser crítico para a recombinação de V-D-J, assim como para a expressão de genes de cadeia pesada, durante os estados permilinares do desenvolvimento das células B [Ronai, D. Berru, M., e Shulman, M. J. Mol Cell Biol 19: 7031-7040 (1999)], enquanto a região do melhorador de 3' de cadeia pesada de imunoglobulina parece ser crítico para a mutação de classe [Pan, Q., Petit-Frere, C., Stavnezer, J. e Hammarstrom, L. Eur J Immunol 30: 1019-1029 (2000)], assim como, para a expressão de genes de cadeia pesada nos estados terminais da diferenciação de células B [Ong. J., Stevens, S., Roeder, R. G. e Eckhardt, L. A. J Immunol 160 : 4896-4903 (1998)]. Considerando estas várias funções dos elementos de controlo transcricional, que são cruciais, é desejável manter estas sequências intatas.
Os eventos de recombinação necessários que ocorrem nos loci de imunoglobulina durante o curso normal da diferenciação de células B podem aumentar a frequência de re-arranjos aberrantes e não produtivos de imunoglobulina quando estes loci são inseridos em localizações cromossómicas impróprias ou em cópias múltiplas, tal como acontece correntemente em murganhos. Com as reduções no rearranjo produtivo de imunoglobulina e portanto na sinalização apropriada em etapas especificas do desenvolvimento de células B, as células aberrantes são eliminadas. As reduções do número de células B nos estádios precoces de desenvolvimento diminuem significativamente a população global final de células B e limitam fortemente as respostas imunitárias dos murganhos. Dado que haverá apenas um locus quimérico de cadeia pesada ou leve (em oposição aos loci de imunoglobulina mutados e aos loci transgénicos humanos integrados em localizações cromossómicas distintas para as cadeias pesada e leve nos ratos, actualmente disponíveis) não deve haver trans-combinações ou trans-rearranjos dos loci, o que pode resultar em rearranjos não produtivos ou anticorpos quiméricos, irrelevantes sob o ponto de vista terapêutico (Willers, J., Kolb, C. e Weiler, E. Immunobiology 200: 150-164 (2000); Fujieda, S., Lin, Y. Q., Saxon, A. e Zhang, K. J Immunol 157: 3450-3459 (1996)).
As substituições das regiões V-D-J ou V-J humanas nos loci genuínos da imunoglobulina cromossómica de murino devem ser substancialmente mais estáveis, com taxas de transmissão aumentadas para a progenia e um menor mosaicismo dos genótipos de células B, em comparação com os ratos actualmente disponíveis (Tomizuka, K., Shinohara, T., Yoshida, H., Uejima, H., Ohguma, A., Tanaka, S., Sato, K., Oshimura, M. e Ishida, I. Proc Natl Acad Sei (EUA) 97: 722-727 (2000)) . Além disso, a introdução de regiões variáveis humanas (VDJ/VJ) em loci genuínos de murino, in vivo, irá manter uma regulação global apropriada da acessibilidade da cromatina previamente evidenciada como sendo importante para eventos de recombinação em prazos apropriados (Haines, B. B., e Brodeur, P. H. Eur J Immunol. 28: 4228-4235 (1998)).
Aproximadamente 1/3 dos anticorpos humanos contêm cadeias levas lambda, 5' a 3', em comparação com os ratos em que apenas 1/20 dos anticorpos de murino contêm cadeias leves lambda. Por isso, a substituição de sequências V-J de cadeia leve lambda de murino por sequências V-J, de cadeia leve lambda, derivadas de locus humano, servirá para aumentar o reportório de anticorpos, assim como combinar, de uma forma mais aproximada, a resposta imunitária qenuina humana, aumentando assim a probabilidade de obtenção de anticorpos úteis sob o ponto de vista terapêutico.
Como beneficio adicional da inteqração das sequências humanas em loci qenuínos de imunoqlobulina de murino, existe o facto de não se introduzirem novos sítios de integração que podem dar origem a rompimentos mutagénicos no sítio da inserção e pré-coludirem o isolamento de ratos homozigóticos viáveis. Isto irá simplificar muito a produção e a manutenção de uma colónia de descendentes de murganhos. A seguir, providencia-se um novo processo para a produção de anticorpos com todas as vantagens anteriores. Um especialista na matéria reconhecerá que o processo geral descrito aqui pode ser modificado e produzir resultados equivalentes. c. Materiais e processos: A substituição precisa da região variável (VDJ) do locus da cadeia pesada de murganho, pela sua contraparte humana, está exemplificada utilizando uma combinação de recombinação homóloga e específica do sítio no exemplo que se segue, que utiliza um processo em duas etapas. Um especialista na matéria reconhecerá que a substituição do locus de murganho pelo locus homólogo ou ortólogo humano pode ser conseguida em uma ou mais etapas. De acordo com isto, a presente invenção contempla a substituição do locus de murino, em todo ou em parte, sendo cada uma das integrações feita através de recombinação homóloga.
Isolam-se clones com grandes inserções (CBA) abarcando toda a região VDJ do locus humano de cadeia pesada (figura 4A) . A sequência de toda esta região está disponível nos ficheiros do GenBank (AB019437, AB019438, AB019439, AB019440, AB019441, X97051 e X54713). Neste exemplo, isolam-se clones (CBA) grandes de inserção a partir das extremidades da região VDJ de murganho como fonte de braços de homologia (figura 4B) que são utilizados para a integração direta por via da recombinação homóloga das sequências VDJ humanas, num processo em duas etapas.
Na primeira etapa, o VGACEl (figura 4D) é preparado por recombinação bacteriana homóloga em E. coli. 0 VGACEl contém, por esta ordem: um grande braço de homologia, de murganho, derivado da região a montante da região DJ de murganho, mas cujos pontos finais absolutos não são importantes; uma cassete que codifica um marcador selecionável funcional nas células EE (neste exemplo FGC-neomicina R) ; um sítio loxP; uma grande inserção humana que abarca vários segmentos do gene V através de toda a região DJ; e um braço de homologia de murganho contendo a região imediatamente adjacente, mas que não inclui os segmentos J de murganho. A extremidade 5' do braço a jusante e a localização dos sítios loxP define a extremidade 3' da região a ser substituída no locus. As células EE de murganho serão transformadas, por técnicas-padrão, por exemplo, eletroporação, com VGACEl linearizado. Como a introdução direta de VGACEl resulta numa modificação dos loci dos genes endógenos variáveis, as colónias resistentes a neomicina podem ser rastreadas para uma recombinação correcta utilizando o ensaio MOA. Estas células EE recombinadas podem dar origem a murganhos que produzem anticorpos com cadeias pesadas híbridas. Contudo, será preferível continuar com as etapas subseguentes gue irão eliminar a parte remanescente dos segmentos variáveis de murganho.
Na segunda etapa, o VGACE2 (figura 4C) é preparado por recombinação bacteriana homóloga em E. coli. 0 VGACE2 contém, por ordem: um ramo grande de homologia de murganho contendo a região adjacente ao segmento mais distal do segmento do gene V de murganho mas não contém quaisquer segmentos do gene V de murganho; uma inserção grande contendo um grande número de segmentos distais dos segmentos do gene V humano; um sítio loxP mutante designado por lox511 [Hoess, R.H., Wierzbicki, A. e Abremski, K. Nucleic Acids Res. 14: 2287-2300 (1986)] na orientação oposta aos sítios loxP de tipo selvagem em VGACE2 e VGACE1 (este sítio não se irá recombinar com os sítios loxP de tipo selvagem mas vai recombinar-se, prontamente, com outros sítios de lox511); um sítio de loxP de tipo selvagem; um segundo marcador selecionável (neste exemplo FGC-higromicina R); e um braço de homologia de murganho, derivado da região V, mas cujos pontos terminais absolutos não são importantes. A extremidade 3' do ramo de homologia a montante e a colocação dos sítios de loxP define a extremidade 5' da região a ser substituída no locus. As células EE de murganho que tenham sido corretamente recombinadas com VGACE1 serão então transformadas, por técnicas-padrão com VGACE2 linearizado e as colónias resistentes a higromicina irão ser rastreadas para a recombinação correta utilizando um ensaio MOA para modificações nos loci endógenos de genes de regiões variáveis. As células EE corretamente recombinadas, resultantes desta transformação, serão daqui para a frente referidas como "células EE duplamente recombinadas". A expressão transitória subsequente da recombinase CRE nas células EE duplamente recombinadas vai resultar na eliminação da parte remanescente da região V de murganho. Alternativamente, as células EE duplamente recombinadas podem ser injetadas em blastócitos hospedeiros para a produção de murganhos quiméricos. A criação dos murganhos quiméricos resultantes com murganhos que expressam precocemente a recombinase CRE no seu desenvolvimento, irá resultar na eliminação da parte remanescente da região V de murganho na progenia Fl. Esta última alternativa aumenta a probabilidade de o locus híbrido de cadeia pesada ser passado através da linha germinativa porque envolve a cultura de células EE para um número mais pequeno de gerações. A inclusão de loxõll em VGACE2 irá permitir a inserção de segmentos adicionais do gene V humano no locus híbrido. Uma abordagem consistiria em utilizar a recombinação bacteriana homóloga para flanquear um clone grande de ADN genómico contendo muitos segmentos adicionais do gene V humano com sítios loxõll e ΙοχΡ. A co-transformação desse clone de ADN genómico grande modificado em células EE duplamente recombinadas, com um plasmido que expressa transitoriamente a recombinase CRE irá resultar na introdução de segmentos adicionais do gene V por meio de uma cassete de permuta (Bethke, B. e Sauer, B. Nucleic Acids Res. 25: 2828-2834 (1997)).
Uma segunda abordagem para a incorporação de segmentos adicionais do gene V consiste em recombinar, independent emente, um clone grande de ADN genómico, contendo muitos segmentos adicionais do gene V humano, no locus de murganho, utilizando, por exemplo, os mesmos braços de homologia de murganho incluídos no VGACE2. Neste caso, os segmentos adicionais de gene V humano seriam flanqueados pelos sítios lox511 e loxP e as células EE recombinadas seriam utilizadas para criar um murganho. Os murganhos derivados de células EE duplamente recombinadas e os murganhos derivados de células EE contendo os segmentos adicionais de gene V seriam criados com um terceiro murganho que dirige a expressão da recombinase CRE durante a meiose. A grande proximidade dos dois loci recombinantes durante o emparelhamento meiótico iria resultar numa elevada frequência da recombinação inter-cromossómica induzida por CRE, tal como já foi visto noutros sistemas (Hérault, Y., Rassoulzadegan, M., Cuzin, F. e Duboule, D. Nature Genetics 20: 381-384 (1998)).
Uma outra abordagem é semelhante à sublinhada antes mas, em vez da introdução dos sítios loxP e lox511 com os VGACE 1 e 2 humanos, os sítios são introduzidos nos VGACE de murganhos e depois a CRE é utilizada para recombinar especif icamente nos loci humanos por meio da permuta de cassetes por via do flanqueio dos sítios loxP e lox511. A metodologia sublinhada a seguir demonstra como a tecnologia dos VGACE pode ser usada para colocar sítios de recombinação específicos do sítio de flanqueamento nas extremidades de qualquer gene endógeno de interesse, em qualquer animal não humano. 0 VGACE1 de murganho contém uma cassete inserida por recombinação bacteriana a jusante e adjacente à região J. Esta cassete contém um sítio loxP e um marcador selecionável bacteriano/de mamífero, tal como a resistência a higromicina. O VGACE1 contém, por ordem: um braço de homologia grande, derivado da região a montante da região DJ de murganho (mas dentro do locus do gene de região variável) mas cujos pontos terminais absolutos não são importantes; uma cassete que codifica um marcador selecionável funcional em células EE (neste exemplo FGC-higromicina R) ; um sitio loxP; e um braço de homologia contendo a região imediatamente adjacente mas não incluindo os segmentos J de murganho. A extremidade 5' do braço de homologia a jusante e a colocação dos sítios loxP define a extremidade 3' da região a ser substituída no locus. A modificação da extremidade 3' do gene de uma região variável endógena no sítio da inserção da cassete permite a deteção de VGACE1 corretamente inserido nas células EE, por meio de um ensaio de MOA. Os marcadores de resistência a fármacos estão flanqueados por sítios FRT. A introdução de sítios FRT permite a eliminação de quaisquer marcadores remanescentes de resistência a fármacos por meio de FLPe quer em células EE ou por cruzamento do murganho resultante de um murganho que expressa FLPe nas células que tenham potencial de linha germinal.
Prepara-se VGACE2 por recombinação bacteriana para inserir uma cassete a montante da região V mais distai dos loci. Esta cassete contém um sítio lox511 e um marcador selecionável bacteriano/de mamífero, tal como resistência à neomicina. 0 VGACE2 contém, por ordem: um ramo grande de homologia contendo a região adjacente ao segmento mais distai do gene V de murganho mas não contendo quaisquer segmentos do gene V de murganho; um sítio lox511 numa orientação oposta à dos sítios loxP de tipo selvagem nos VGACE2 e VGACE1; um sítio loxP de tipo selvagem; um segundo marcador selecionável (neste exemplo FGC-neomicina R) ; e um braço de homologia de murganho derivado da região V (e por isso dentro do locus do gene de uma região variável) mas cujos pontos terminais absolutos não são importantes. A extremidade 3' do ramo de homologia a montante e a colocação dos sítios loxP definem a extremidade 5' da região a ser substituída no locus. A modificação da extremidade 5' do gene de uma região variável
endógena no sítio da inserção da cassete permite a deteção de VGACE2 corretamente inserido nas células EE por meio de um ensaio MOA. Estes VGACE são introduzidos em conjunto ou sequencialmente nas células EE utilizando técnicas-padrão e são rastreados quanto à recombinação correta utilizando um ensaio MOA
Modifica-se um CBA humano contendo a região VDJ/VJ, totalmente ou em parte, por recombinação bacteriana para inserir cassetes que flanqueiam sequências humanas com os sítios lox511 e ΙοχΡ. A cassete a montante é inserida imediatamente a montante da região que irá substituir a região variável de murganho e contém, por ordem, um sítio loxóll seguido de um marcador selecionável bacteriano/de mamífero, tal como o de resistência a puromicina. A cassete a jusante é inserida a jusante e adjacente à região J e contém, por esta ordem, um sítio loxP seguido de um marcador selecionável para bactérias, tal como o de resistência a espectinomicina.
Podem utilizar-se vários processos para inserir uma peça maior da região variável humana do que a que ocorre num único CBA isolado de uma biblioteca. Descrevem-se alguns destes processos a seguir.
Os sítios loxP e lox511 podem ser inseridos separadamente, por recombinação bacteriana, em CBA sobrepostos, que se recombinam uns com os outros quando transformados nas células EE. Neste caso, o CBA a montante tem uma cassete, recombinada imediatamente a montante da região que irá substituir a região variável de murganho, que tem um sítio loxõll seguido de um marcador selecionável bacteriano/de mamífero, tal como o de resistência a neomicina. 0 CBA a jusante tem uma cassete recombinada imediatamente a jusante e adjacente à região J, que contém um marcador selecionável bacteriano/de mamífero, tal como o de resistência a puromicina, seguido de um sítio loxP. Se estes dois CBA não estiverem sobrepostos, incorporam-se neste esquema CBA adicionais que ligam os CBA a montante e a jusante por sobreposição da homologia. Estes são modificados por recombinação bacteriana para conter marcadores selecionáveis bacterianos/de mamíferos, tais como os de resistência a puromicina e os CBA a montante e a jusante são modificados para conterem cassetes de loxP e lox511 que comportam marcadores de resistência à neomicina e à higromicina.
Os CBA humanos são co-transformados com a recombinase de CRE na linha de células EE contendo os sítios de recombinação lox511 e loxP que flanqueiam a região variável. Se se utilizam CBA que se sobrepõem, ocorre a recombinação homóloga entre eles para criar um fragmento maior de ADN e os sítios de loxP e loxõll que o flanqueiam recombinam este fragmento grande no locus de murganho. Selecionam-se as células quanto à resistência a puromicina e rastreiam-se para fazer a substituição da região variável de murganho. Alternativamente, as sequências de murganho podem ser primeiro eliminadas por via de dois sítios loxP e depois as sequências humanas podem ser introduzidas por via dos sítios loxõll e loxP remanescentes.
Pode-se inserir um quarto CBA se o VGACE1 também contiver um terceiro sítio de recombinação específico do sítio, por exemplo, lox2272 (Anal Biochem 15 Mar 2001; 290 (2): 260-71) imediatamente a jusante do gene de resistência bacteriana/de mamífero, tal como o de resistência a puromicina, criando um VGACE com, por esta ordem, o gene de resistência a puromicina, um sítio loxP e um sítio lox2272, seguido das sequências humanas. Depois deste CBA ter sido integrado no locus de imunoglobulina de murganho, os sítios lox511/lox2272 podem servir como recetores num segundo ciclo de permuta da cassete, em que o gene de resistência à puromicina é substituído por uma porção adicional a montante da região variável do locus humano de imunoglobulina e um gene diferente de resistência bacteriana/de mamífero flanqueado pelos sítios lox511 e lox2272.
Outro processo para a inserção de uma extensão maior da região variável humana consiste em combinar sequências de vários CBA, in vitro, utilizando sítios de clivagem de endonucleases de restrição raras. Consegue-se isto utilizando recombinação bacteriana homóloga para inserir um sítio loxP e um gene de resistência a espectinomicina imediatamente a jusante do último J dos CBA mais em baixo da corrente e inserindo um segundo marcador bacteriano selecionável e um sítio raro de I-Ceul na extremidade a montante das sequências humanas do CBA a jusante. Insere-se um sítio loxãll e um marcador selecionável bacteriano/de mamífero, por exemplo, um gene de resistência a puromicina, na extremidade a montante de um segundo CBA contendo uma região da região variável humana a montante das sequências no primeiro CBA. Insere-se um sítio I-Ceul, na extremidade a jusante do segundo CBA. Após a digestão de ambos os CBA com I-Ceul e Notl, que é único na porção de vetor de ambos os CBA modificados, ligam-se os dois CBA e seleciona-se um recombinante em bactérias para a resistência a puromicina e a espectinomicina. 0 CBA maior resultante contém, por esta ordem, um sítio loxãll, sequências humanas a montante, um sítio I-Ceul, sequências humanas a jusante, um sítio loxP e um gene de resistência a espectinomicina. A região entre o sítio loxõll e o sítio loxP é inserida no locus da imunoglobulina de murganho por uma permuta de cassete e a seleção de puromicina, tal como descrito antes.
Um terceiro processo para inserir uma extensão maior da região variável humana consiste em combinar sequências de vários CBA, tal como descrito antes, mas utilizando recombinação bacteriana homóloga em vez da digestão/ligação da restrição. Aplica-se a mesma seleção para CBA recombinantes em bactérias, excepto apenas se um dos dois CBA for digerido, as suas extremidades, após a digestão, estarão concebidas para serem homólogas ao outro CBA "receptor" e o CBA recetor estará na estirpe bacteriana modificada para ser permissivo para a recombinação bacteriana homóloga.
As etapas finais na criação de murganhos que produzem anticorpos monoclonais, variáveis humanos/constantes de murganho, vão realizar as substituições equivalentes da região variável nos loci de cadeia leve lambda e kapa e na criação dos três loci híbridos com uma homozigocitidade conjunta no mesmo murganho. 0 murganho transgénico resultante terá um genoma que compreenderá todos os loci dos genes variáveis humanos de cadeia pesada e leve, ligados operacionalmente a toda a região constante endógena de murganho, de tal modo que o murganho produz um soro contendo um anticorpo que compreende uma região variável humana e uma região constante de murganho em resposta à estimulação antigénica. Esse murganho pode então ser utilizado como uma fonte de ADN que codifica as regiões variáveis de anticorpos humanos. Utilizando uma tecnologia-padrão recombinante, o ADN que codifica as regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo fica operacionalmente ligado ao ADN que codifica as regiões constantes humanas de cadeia pesada e leve em células, tal como em células de OHC, que são capazes de expressar anticorpos ativos. As células crescem em condições apropriadas para expressar os anticorpos completamente humanos que são depois recuperados. As sequências de codificação da região variável podem ser isoladas, por exemplo, por amplificação por RCP ou clonagem de ADNc. Podem utilizar-se hibridomas preparados a partir de murganhos transgénicos que compreendem alguns ou todos os loci de imunoglobulina de regiões variáveis humanas (Kohler e Milstein, Eur. J. Immunol., 6: 511-519 (1976)), como fonte de ADN que codifica as regiões variáveis humanas.
Em resumo, a abordagem de criação de VGACE e a sua utilização direta como vetores de recombinação combinados com o rastreio por MOA para eventos de recombinação homóloga em células EE, cria um novo processo para modificar os loci, por engenharia genética, o que é rápido, barato e representa uma melhoria significativa sobre os processos previamente utilizados que são fastidiosos e consumidores de tempo. Abre-se assim a possibilidade de uma análise genómica funcional in vivo muito rápida, em larga escala, de praticamente qualquer gene no genoma de um organismo, numa fração de tempo e a um custo muito melhores do que as metodologias anteriores.
Embora a invenção anterior tenha sido descrita com algum detalhe, a titulo ilustrativo e com exemplos, será obviamente evidente para os especialistas nesta técnica que se podem fazer algumas alterações e modificações aos ensinamentos da presente invenção.

Claims (9)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Murganho transgénico caracterizado pelo facto de produzir anticorpos híbridos contendo regiões humanas variáveis e regiões constantes de murganho em que um locus de uma região variável de cadeia pesada endógena do referido murganho está substituído, in situ, na totalidade ou em parte, por segmentos dos genes humanos V, D e J de cadeia pesada.
  2. 2. Murganho transgénico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de os segmentos dos genes V, D e J do locus da região variável endógena de cadeia pesada do referido murganho estarem substituídos, in situ, por segmentos dos genes humanos V, D e J de cadeia pesada.
  3. 3. Murganho transgénico, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto de um locus de uma região variável de cadeia leve kapa endógena do referido murganho estar substituído, in situ, na totalidade ou em parte, por segmentos dos genes humanos V e J de cadeia leve kapa.
  4. 4. Murganho transgénico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de os segmentos dos genes V e J do locus da região variável endógena de cadeia leve kapa do referido murganho estarem substituídos, in situ, por segmentos dos genes humanos V e J de cadeia leve kapa.
  5. 5. Processo de produção de um anticorpo humano caracterizado pelo facto de compreender: a) a exposição de um murganho, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, a uma estimulação anti- génica, de tal modo que o murganho produza um anticorpo contra o antigénio; b) o isolamento do ADN que codifica as regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo; c) a ligação operacional da sequência de ADN que codifica as regiões variáveis de (b) ao ADN que codifica as regiões constantes humanas de cadeias pesada e leve, numa célula capaz de expressar anticorpos ativos; d) o crescimento de células em condições tais que expressem o anticorpo humano; e e) a recuperação do anticorpo.
  6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de a célula ser uma célula de OHC.
  7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo facto de o referido ADN que codifica a referida região variável ser isolado a partir de uma célula obtida do murganho exposto à estimulação antigénica.
  8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o referido ADN que codifica a referida região variável ser isolado a partir de um hibridoma criado no baço do referido murganho.
  9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o referido ADN que codifica a referida região variável ser isolado por RCP.
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