JP2022538886A - トランスジェニック哺乳動物およびその使用法 - Google Patents

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Abstract

イヌ治療抗体の開発のための、イヌベースの免疫グロブリンを発現するトランスジェニック齧歯類を含む、イヌベースの免疫グロブリンを発現するトランスジェニック哺乳動物がここに記載される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月１日出願の米国仮特許出願６２／８６９,４３５に基づく優先権を主張し、その開示を引用により本明細書に包含させる。
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出し、引用により全体として本明細書に包含させる配列表を含む。該ASCIIコピーは２０２０年６月２４日に作成し、0133-0006WO1_SL.txtなる名称であり、２１９,０６６バイトサイズである。
発明の分野
本発明は、モノクローナル抗体産生のためのイヌ(canine)抗原特異的抗体分泌細胞の産生ができるトランスジェニック哺乳動物を産生する方法を含む、免疫グロブリン分子の産生に関する。
背景
以下の記載において、いくつかの文献および方法が、背景および前置きの目的のために記載されている。先行技術の「承認」として解釈されるべきものは、ここには含まれない。出願人は、適切な場合には、ここに引用する文献および方法が、適用可能な法律の規定のもとに、先行技術とならないことを証明する権利を明示して保持する。
抗体は、(ｉ)多様な分子形態の抗原を標的にできる精巧な結合性を示す、(ii)ヒトおよび動物の処置において忍容性を良好とする望ましい薬物動態を有する生理学的分子である、そして(iii)自然に感染因子を撃退する強力な免疫学的性質と関連するために、重要な生物学的医薬品として台頭してきている。さらに、体内に本来存在しない事実上全ての外来物質に対して特異的抗体応答を容易に搭載できる実験動物から抗体を迅速に単離する確立された技術が存在する。
最も基本的な形態では、抗体は、各々同一軽(Ｌ)鎖と対合する、２個の同一重(Ｈ)鎖からなる。Ｈ鎖およびＬ鎖両者のＮ末端は可変ドメイン(それぞれＶＨおよびＶＬ)を含み、それは一体となって、特有の抗原結合特異性を有するＨ鎖－Ｌ鎖対を提供する。
抗体ＶＨおよびＶＬドメインをコードするエクソンは、生殖系列ＤＮＡに存在しない。代わりに、各ＶＨエクソンは、免疫グロブリンＨ鎖座位(ＩＧＨ)に存在する無作為に選択されたＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメントの組み換えにより産生される；同様に、個々のＶＬエクソンは、軽鎖座位における無作為に選択されたＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントの染色体再配列により産生される。
イヌゲノムは、Ｈ鎖を発現できる２個のアレル(各親から一アレル)、カッパ(κ)Ｌ鎖を発現できる２個のアレルおよびラムダ(λ)Ｌ鎖を発現できる２個のアレルを含む。Ｈ鎖座位に複数のＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメントがあり、同様に免疫グロブリンκ(ＩＧＫ)および免疫グロブリンλ(ＩＧＬ)Ｌ鎖座位両者に複数のＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントがある(Collins and Watson (2018) Immunoglobulin Light Chain Gene Rearrangements, Receptor Editing and the Development of a Self-Tolerant Antibody Repertoire. Front. Immunol. 9:2249. (doi: 10.3389/fimmu.2018.02249))。
典型的免疫グロブリン重鎖可変領域座位において、ＶＨ遺伝子セグメントはＪＨ遺伝子セグメントの上流(５’)に位置し、Ｄ遺伝子セグメントがＶＨ遺伝子セグメントとＪＨ遺伝子セグメントの間に位置する。ＩＧＨ座位のＪＨ遺伝子セグメントの下流(３’)は、抗体の定常領域(ＣＨ)をコードするエクソンのクラスターである。ＣＨエクソンの各クラスターは、異なる抗体クラス(アイソタイプ)をコードする。マウスには、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ(またはＩｇＧ２ｃ)、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＥおよびＩｇＡ(核酸レベルでは、それぞれμ、δ、γ３、γ１、γ２ａ／ｃ、γ２ｂ、εおよびαと称される)の８クラスの抗体が存在する。イヌ動物(例えば、家庭犬およびオオカミ)において、推定上のアイソタイプは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥおよびＩｇＡである(図１２Ａ)。
大部分の哺乳動物種のＩＧＫ座位では、Ｖκ遺伝子セグメントのクラスターは、少数のＪκ遺伝子セグメントの上流に位置し、Ｊκ遺伝子セグメントクラスターは、単一Ｃκ遺伝子の上流に位置する。κ座位のこの構成は(Ｖκ)ａ・・・(Ｊκ)ｂ・・・Ｃκ(ここで、ａおよびｂは、独立して、１以上の整数である)として表わすことができる。イヌκ座位は、Ｖκ遺伝子の半分がＪκおよびＣκ遺伝子セグメントの上流に、そして半分が下流に位置する点で特異である(図１ＣのマウスＩＧＫ座位および図１２ＣのイヌＩＧＫ座位の模式図参照)。
大部分の種のＩＧＬ座位は、各々Ｊλ遺伝子セグメントおよびＣλ遺伝子セグメントからなる、種々の数のＪ－Ｃタンデムカセットに対して５’に位置するＶλ遺伝子セグメントのセットを含む(図１２ＢのイヌＩＧＬ座位の模式図参照)。λ座位の構成は(Ｖλ)ａ・・・(Ｊλ－Ｃλ)ｂ(ここで、ａおよびｂは、独立して、１以上の整数である)として表わすことができる。マウスＩＧＬ座位は、２個のユニットの(Ｖλ)ａ・・・(Ｊλ－Ｃλ)ｂを含む点で、特異である。
Ｂ細胞発達過程において、遺伝子再配列は、Ｈ鎖可変遺伝子セグメントを含む２個の相同染色体の一方でまず起こる。得られたＶＨエクソンはその後ＲＮＡレベルでＩｇＭ Ｈ鎖発現のためのＣμエクソンにスプライスされる。続いて、ＶＬ－ＪＬ再配列が、機能的Ｌ鎖が産生されるまでＬ鎖アレルの一方で起こり、その後、Ｌ鎖ポリペプチドがＩｇＭ Ｈ鎖ホモ二量体と結合して、抗原に対して完全に機能的なＢ細胞受容体(ＢＣＲ)を形成することができる。マウスおよびヒトにおいて、Ｂ細胞が成熟を続けるにつれて、ＩｇＤがオルタナティブスプライシング型としてＩｇＭと共発現され、ＩｇＤは主Ｂ細胞集団においてＩｇＭより１０倍高いレベルで発現される。これは、Ｃδエクソンが非機能的である可能性がある、イヌにおけるＢ細胞発達と対照的である。
マウスおよびヒトにおいて、ＶＬ－ＪＬ再配列が、まず両染色体のＩＧＫ座位で、いずれかの染色体のＩＧＬ軽鎖座位がＶＬ－ＪＬ組み換えに受容性となる前に起こることは、当分野の専門家には広く認識されている。これは、κ軽鎖を発現するマウスＢ細胞において、両染色体のλ座位が非生産的再配列により通常不活性化されることにより、支持される。これは、＞９０％κおよび＜１０％λであるマウスにおける優勢κＬ鎖使用の説明となり得る。
しかしながら、イヌ免疫系における免疫グロブリンはλ軽鎖使用に偏っており、それは、少なくとも９０％λ対＜１０％κと推定されている。イヌで、なぜまずＶκ－Ｊκ再配列がＶλ－Ｊλ再配列に優先的して起きるかの機構は未知である。
抗原に遭遇すると、Ｂ細胞は、ＣμおよびＣδエクソンを除去するためにＩＧＨ座位でもう１回ＤＮＡ組み換えに付され得て、ＣＨ領域を下流アイソタイプの一つに効率的にスイッチングする(この過程はクラススイッチングと称される)。イヌにおいて、イヌＩＧＧ１～ＩｇＧ４をコードするとして同定されているｃＤＮＡクローンは単離されているが(Tang, et al. (2001) Cloning and characterization of cDNAs encoding four different canine immunoglobulin γ chains. Vet. Immunol. and Immunopath. 80:259 PMID 11457479)、ＩｇＧ２定常領域遺伝子のみが、染色体８のイヌＩＧＨ座位に物理的にマッピングされている(Martin, et al. (2018) Comprehensive annotation and evolutionary insights into the canine (Canis lupus familiaris) antigen receptor loci. Immunogenet. 70:223 doi: 10.1007/s00251-017-1028-0)。
種々のイヌおよびマウス免疫グロブリンをコードする遺伝子は、大規模に特徴づけされている。Priat, et al.は、Genomics, 54:361-78 (1998)においてイヌゲノムの全ゲノム放射線マッピングを記載し、Bao, et al.は、Veterinary Immunology and Immunopathology, 137:64-75 (2010)でイエイヌ(Canis familiaris)におけるＶＨレパートリーの分子特徴づけを記載する。Martin et al.は、イヌ(イエイヌ(Canis lupus familiaris))免疫グロブリンカッパおよびラムダ(ＩＧＫ、ＩＧＬ)座位のアノテーションを提供し、Immunogenetics, 70(4):223-236 (2018)でＩＧＨ座位のアノテーションをアップデートしている。
BlankensteinおよびKrawinkelは、マウス可変重鎖領域座位をEur. J. Immunol., 17:1351-1357 (1987)に記載する。トランスジェニック動物は、日常的に種々の研究・開発適用で使用される。例えば、免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスの産生は、国際出願ＷＯ９０／１００７７およびＷＯ９０／０４０３６に記載される。ＷＯ９０／０４０３６は、ヒト免疫グロブリン「ミニ」座位が統合されたトランスジェニックマウスを記載する。ＷＯ９０／１００７７は、トランスジェニック動物産生に使用するための免疫グロブリン座位活性化領域を含むベクターを記載する。
例えば、創薬目的で、一部または完全ヒト抗体を作製するためのヒト免疫グロブリン配列を有するマウス内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座位を修飾するための、多数の方法が開発されている。このようなマウスの例は、例えば、米国特許７,１４５,０５６；７,０６４,２４４；７,０４１,８７１；６,６７３,９８６；６,５９６,５４１；６,５７０,０６１；６,１６２,９６３；６,１３０,３６４；６,０９１,００１；６,０２３,０１０；５,５９３,５９８；５,８７７,３９７；５,８７４,２９９；５,８１４,３１８；５,７８９,６５０；５,６６１,０１６；５,６１２,２０５；および５,５９１,６６９に記載されるものである。しかしながら、完全ヒト化免疫グロブリントランスジェニックマウスの大部分は、これらのマウスでのＢ細胞が非効率的なＶ(Ｄ)Ｊ組み換えおよび完全ヒト抗体／ＢＣＲがマウスシグナル伝達タンパク質では最適に機能できないことにより重度に妨害されるため、最適以下の抗体産生を示す。マウスコード配列が、ヒト配列と「交換」されている他のヒト化免疫グロブリントランスジェニックマウスは、個々のマウスエクソンをシンテニーヒト対応物で置き換えるアプローチのため、きわめて時間がかかり、高価である。
薬物として機能する抗体の用途は、ヒト疾患の予防または治療に限定されない。イヌなどのコンパニオン・アニマルは、ヒトと同じ病気、例えば、癌、アトピー性皮膚炎および慢性疼痛にかかる。ＩＬ３１、ＣＤ２０、ＩｇＥおよび神経増殖因子をそれぞれ標的とするモノクローナル抗体は、既にこれらの状態の処置剤として獣医学的に使用されている。しかしながら、臨床使用前、マウスで産生されたこれらモノクローナル抗体は、レシピエントであるイヌにおける免疫応答を予防するために、イヌ化しなければならない、すなわち、アミノ酸配列をマウスからイヌに変えなければならない。重要なことに、免疫学的耐容性により、イヌタンパク質に対するイヌ抗体は、イヌにおいて容易に誘発できない。前記に基づき、イヌの疾患を処置するための、イヌ抗体を産生する効率的かつ対費用効果の高い方法に対する必要性があるのは明らかである。より具体的に、当分野で、抗原特異的イヌ免疫グロブリンを産生できる、小さな、急速に繁殖する、非イヌ哺乳動物の必要性がある。このような非イヌ哺乳動物は、イヌモノクローナル抗体の大規模産生が可能なハイブリドーマの産生に有用である。
ＰＣＴ公開２０１８／１８９５２０は、イヌ、ネコ、ウマ、鳥類、ウサギ、ヤギ、爬虫類、魚類および両生類などのコンパニオン・アニマルからの外因性動物免疫グロブリン可変領域遺伝子を発現するよう操作されたゲノムを有する、齧歯類および細胞を記載する。
しかしながら、イヌＶ領域を有する抗体を産生できる、トランスジェニック非ヒト動物を産生するための方法の改善の必要性がまだある。
要約
この要約は、以下の詳細な記載にさらに記載する、選択した概念を単純な形で紹介するために提供する。この要約は、本発明の主題の重要なまたは必須の特性を同定することを意図せず、また、本発明の主題の範囲を限定するために使用することも意図しない。本発明の主題の他の特性、詳細、有用性および利点は、添付する図面に説明され、添付する特許請求の範囲において規定される態様を含む、下記詳細な記載から明らかである。
ここに記載されるのは、外的に導入されたここに記載するにイヌの免疫グロブリン座位を含むゲノムを有する、非イヌ哺乳動物細胞および非イヌ哺乳動物であって、ここで、該導入座位が、イヌ免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントのコード配列および非イヌ哺乳動物宿主の内因性免疫グロブリン可変領域座位に基づく非コード配列を含むものである。故に、非イヌ哺乳動物細胞または哺乳動物は、非イヌ哺乳動物宿主細胞または哺乳動物に天然である各定常領域に結合した完全にイヌであるＨ鎖およびＬ鎖可変領域を含む、キメラＢ細胞受容体(ＢＣＲ)または抗体を発現できる。好ましくは、トランスジェニック細胞および動物は、内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座位の一部または全てが除去されたゲノムを有する。
最小でも、非イヌ哺乳動物宿主におけるキメライヌモノクローナル抗体の産生は、宿主が、キメライヌ免疫グロブリンＨ鎖またはＬ鎖を発現する少なくとも１つの座位を有することを必要とする。大部分の態様において、それぞれキメライヌ免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖を発現する１個の重鎖座位および２個の軽鎖座位がある。
ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、非イヌ哺乳動物宿主の内因性ＶＨ遺伝子座位に存在する、イヌＶＨコード配列および非コード制御配列または足場配列を含む。これらの態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、非イヌ哺乳動物宿主細胞ゲノムの内因性ＤおよびＪＨ遺伝子セグメントの近くに存在する非コード制御配列または足場配列と結合した、イヌＤおよびＪＨ遺伝子セグメントコード配列を含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、非イヌ哺乳動物宿主の内因性免疫グロブリン重鎖座位に存在する非コード制御配列または足場配列に包埋(embedded)されたイヌＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメントコード配列を含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、マウスなどの齧歯類の内因性免疫グロブリン重鎖座位に存在する非コード制御配列または足場配列に包埋された、イヌＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメントコード配列を含む。他の態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、非イヌ哺乳動物宿主の内因性ＶＬ遺伝子座位に存在する、イヌＶＬコード配列および非コード制御配列または足場配列を含む。ある態様において、外的に導入された、イヌＶＬコード配列を含む部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、さらに、イヌＬ鎖Ｊ遺伝子セグメントコード配列および非イヌ哺乳動物宿主細胞ゲノムの内因性Ｌ鎖Ｊ遺伝子セグメントの近くに存在する非コード制御配列または足場配列を含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、非イヌ哺乳動物宿主細胞における免疫グロブリン軽鎖座位の非コード制御配列または足場配列に包埋された、イヌＶλおよびＪλ遺伝子セグメントコード配列を含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、非イヌ哺乳動物宿主の免疫グロブリン座位の非コード制御配列または足場配列に包埋された、イヌＶκおよびＪκ遺伝子セグメントコード配列を含む。ある態様において、非イヌ哺乳動物宿主の内因性κ座位は、イヌκ鎖以上にイヌλ免疫グロブリン軽鎖の産生を増加させるために、不活性化されるかまたはイヌλ鎖をコードする配列に置き換えられる。ある態様において、非イヌ哺乳動物宿主の内因性κ座位は、イヌλ鎖をコードする配列に置き換えられるのではなく、不活性化される。
ある態様において、非イヌ哺乳動物は齧歯類、例えば、マウスまたはラットである。
ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、１以上のイヌλ可変領域遺伝子セグメントコード配列を含む、部分的にイヌの免疫グロブリン軽鎖座位を含む。ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、１以上のイヌκ可変領域遺伝子セグメントコード配列を含む、部分的にイヌの免疫グロブリン軽鎖座位である。
ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位を含むゲノムを有する、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞が提供される。ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン軽鎖座位を含むゲノムを有する、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞が提供される。ある態様において、齧歯類または齧歯類細胞の部分的にイヌの免疫グロブリン軽鎖座位は、１以上のイヌ免疫グロブリンλ可変領域遺伝子セグメントコード配列を含む。ある態様において、齧歯類または齧歯類細胞の部分的にイヌの免疫グロブリン軽鎖座位は、１以上のイヌ免疫グロブリンκ可変領域遺伝子セグメントコード配列を含む。ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、イヌ可変ドメインを含む免疫グロブリンを発現できる。
ある態様において、κ軽鎖を含む免疫グロブリンよりも、λ軽鎖を含む免疫グロブリンを多く産生するトランスジェニック齧歯類が提供される。ある態様において、トランスジェニック齧歯類は、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％および最大約１００％λ軽鎖免疫グロブリンを産生する。ある態様において、トランスジェニック齧歯類は、イヌ可変ドメインを含む、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％および最大約１００％λ軽鎖免疫グロブリンを産生する。ある態様において、κ軽鎖産生細胞より多くのλ軽鎖産生細胞が、トランスジェニック齧歯類から単離される可能性がある。ある態様において、イヌ可変ドメインを有するκ軽鎖を産生する細胞より多くの、イヌ可変ドメインを有するλ軽鎖を産生する細胞が、トランスジェニック齧歯類から単離される可能性がある。
ある態様において、κ軽鎖を含む免疫グロブリンよりも、λ軽鎖を含む免疫グロブリンを産生する可能性が高いトランスジェニック齧歯類細胞が提供される。ある態様において、齧歯類細胞は、ここに記載するトランスジェニック齧歯類から単離される。ある態様において、齧歯類細胞は、ここに記載するとおり、組み換えにより産生される。ある態様において、トランスジェニック齧歯類細胞またはその子孫は、λ軽鎖免疫グロブリンを産生する確率が少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％および最大約１００％ある。ある態様において、トランスジェニック齧歯類細胞またはその子孫は、イヌ可変ドメインを有するλ軽鎖免疫グロブリンを産生する確率が、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％および最大約１００％ある。
ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座は、イヌＶλ遺伝子セグメントコード配列およびＪλ遺伝子セグメントコード配列ならびに齧歯類免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座位の制御または足場配列などの非コード配列を含む。
ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、齧歯類免疫グロブリンλ軽鎖可変領域遺伝子座位の齧歯類非コード制御配列または足場配列に包埋された、イヌＶλおよびＪλ遺伝子セグメントコード配列を含む。ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖可変領域遺伝子座位の非コード制御配列または足場配列に包埋されたイヌＶλおよびＪλ遺伝子セグメントコード配列を含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列およびＪλ遺伝子セグメントコード配列ならびに１以上の齧歯類免疫グロブリンλ定常領域コード配列を含む。
ある態様において、操作された免疫グロブリン可変領域座位は、１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列および１以上のＪ－Ｃ単位を含み、ここで、各Ｊ－Ｃ単位はイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列および齧歯類領域Ｃλコード配列を含む。ある態様において、操作された免疫グロブリン可変領域座位は、１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列および１以上のＪ－Ｃ単位を含み、ここで、各Ｊ－Ｃ単位はイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列および齧歯類Ｃλ領域コード配列および非コード配列を含む。ある態様において、齧歯類Ｃλ領域コード配列は、齧歯類Ｃλ１、Ｃλ２またはＣλ３コード配列から選択される。ある態様において、１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列は、１以上のＪ－Ｃ単位の上流に位置し、ここで、各Ｊ－Ｃ単位は、イヌＪλ遺伝子セグメントコード配列および齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントコード配列を含む。ある態様において、１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列は、１以上のＪ－Ｃ単位の上流に位置し、ここで、各Ｊ－Ｃ単位は、イヌＪλ遺伝子セグメントコード配列および齧歯類Ｃλ遺伝子セグメントコード配列および齧歯類Ｃλ非コード配列を含む。ある態様において、Ｊ－Ｃ単位は、齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖座位の非コード制御配列または足場配列に包埋されたイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列および齧歯類Ｃλ領域コード配列を含む。
ある態様において、１以上の齧歯類Ｖκ遺伝子セグメントコード配列および１以上の齧歯類Ｊκ遺伝子セグメントコード配列が欠失され、それぞれ１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列および１以上のＪλ遺伝子セグメントコード配列で置き換えられ、かつ座位における齧歯類Ｃκコード配列が齧歯類Ｃλ１、Ｃλ２またはＣλ３コード配列で置き換えられている、齧歯類免疫グロブリンκ座位を含む、操作された免疫グロブリン座位を有するトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞が提供される。
ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、１以上の齧歯類Ｃλコード配列の上流である１以上のイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列の上流および同じ転写方向で、１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列を含む。
ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、１以上の齧歯類Ｃλコード配列の上流である１以上のイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列の上流および逆の転写方向で、１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列を含む。
ある態様において、内因性齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖座位が、欠失、不活性化または
ａ. 全内因性齧歯類Ｖκ遺伝子セグメントコード配列の欠失または変異；
ｂ. 全内因性齧歯類Ｊκ遺伝子セグメントコード配列の欠失または変異；
ｃ. 内因性齧歯類Ｃκコード配列の欠失または変異；
ｄ. Ｊκ遺伝子セグメントとＣκエクソンの間のイントロン内のスプライス供与部位、ピリミジントラクトまたはスプライス受容部位の欠失または変異；および
ｅ. 内因性イントロンκエンハンサー(ｉＥκ)、３’エンハンサー配列(３’Ｅκ)またはこれらの組み合わせの欠失、変異または破壊
の１以上により非機能的とされた、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞が提供される。
ある態様において、内因性齧歯類免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインが、
ａ. 全内因性齧歯類Ｖλ遺伝子セグメントの欠失または変異；
ｂ. 全内因性齧歯類Ｊλ遺伝子セグメントの欠失または変異；
ｃ. 全内因性齧歯類Ｃλコード配列の欠失または変異；および
ｄ. Ｊλ遺伝子セグメントとＣλエクソンの間のイントロン内のスプライス供与部位、ピリミジントラクトまたはスプライス受容部位またはこれらの組み合わせの欠失または変異
の１以上により抑制または不活性化されている、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞が提供される。
ある態様において、操作された免疫グロブリン座位が、イヌ可変ドメインおよび齧歯類定常ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞が提供される。ある態様において、操作された免疫グロブリン座位が、イヌλ可変ドメインおよび齧歯類λ定常ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞が提供される。ある態様において、操作された免疫グロブリン座位が、イヌκ可変ドメインおよび齧歯類κ定常ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞が提供される。
ある態様において、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞のゲノムが、イヌＶκおよびＪκ遺伝子セグメントコード配列を含む操作された免疫グロブリン座位を含む、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞が提供される。ある態様において、イヌＶκおよびＪκ遺伝子セグメントコード配列が齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖座位に挿入される。ある態様において、イヌＶκおよびＪκ遺伝子セグメントコード配列が、齧歯類齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖可変領域遺伝子座位の非コード制御配列または足場配列に包埋される。ある態様において、イヌＶκおよびＪκコード配列が、齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖定常領域コード配列の上流に挿入される。
ある態様において、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞のゲノムが、齧歯類免疫グロブリンλ軽鎖座位を含む操作された免疫グロブリン座位に挿入されたイヌＶκおよびＪκ遺伝子セグメントコード配列を含む、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞が提供される。ある態様において、イヌＶκおよびＪκ遺伝子セグメントコード配列は、齧歯類免疫グロブリンλ軽鎖可変領域遺伝子座位の齧歯類非コード制御配列または足場配列に包埋される。ある態様において、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞のゲノムは、イヌＶκおよびＪκ遺伝子セグメントコード配列の下流に挿入された、齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖定常領域コード配列を含む。ある態様において、齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖定常領域は、内因性齧歯類Ｃλコード配列の上流に挿入される。ある態様において、齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖定常領域は、内因性齧歯類Ｃλ２コード配列の上流に挿入される。ある態様において、内因性齧歯類免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインの発現は、
ａ. 全内因性齧歯類Ｖλ遺伝子セグメントコード配列の欠失または変異；
ｂ. 全内因性齧歯類Ｊλ遺伝子セグメントコード配列の欠失または変異；
ｃ. 全内因性Ｃλコード配列の欠失または変異；および
ｄ. Ｊλ遺伝子セグメントとＣλエクソンの間のイントロン内のスプライス供与部位、ピリミジントラクトまたはスプライス受容部位の欠失または変異
の１以上により抑制または不活性化される。
ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン軽鎖座位は、齧歯類イントロンκエンハンサー(ｉＥκ)および３’κエンハンサー(３’Ｅκ)制御配列を含む。
ある態様において、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞は、さらに、イヌ免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントコード配列ならびに齧歯類免疫グロブリン重鎖座位の非コード制御および足場配列を含む、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン重鎖座位を含む。ある態様において、操作されたイヌ免疫グロブリン重鎖座位は、イヌＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメントコード配列を含む。ある態様において、各イヌ／齧歯類キメラＶＨ、ＤまたはＪＨ遺伝子セグメントは、齧歯類免疫グロブリン重鎖座位の非コード制御および足場配列に包埋された、ＶＨ、ＤまたはＪＨコード配列を含む。ある態様において、重鎖足場配列は、機能的ＡＤＡＭ６遺伝子の一方または両方が点在する。
ある態様において、齧歯類制御および足場配列は、１以上のエンハンサー、プロモーター、スプライス部位、イントロン、組み換えシグナル配列またはこれらの組み合わせを含む。
ある態様において、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞の内因性齧歯類免疫グロブリン座位は不活性化されている。ある態様において、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞の内因性齧歯類免疫グロブリン座位は、欠失され、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位で置き換えられている。
ある態様において、齧歯類はマウスまたはラットである。ある態様において、齧歯類細胞は、胚幹(ＥＳ)細胞または初期胚の細胞である。ある態様において、齧歯類細胞は、マウスもしくはラット胚幹(ＥＳ)細胞または初期胚のマウスもしくはラット細胞である。
ある態様において、ここに記載するトランスジェニック齧歯類から得られるＢリンパ球系譜の細胞が提供され、ここで、Ｂ細胞は、イヌ可変領域および齧歯類免疫グロブリン定常領域を含むキメラ免疫グロブリン重鎖または軽鎖を発現するかまたは発現できる。ある態様において、ここに記載するトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞から得たＢリンパ球系譜の細胞由来である、ハイブリドーマ細胞または不死化細胞株が提供される。
ある態様において、ここに記載するトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞からの細胞により産生される、抗体またはその抗原結合部分が提供される。
ある態様において、ここに記載するトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞により産生される免疫グロブリン由来である、ＶＨ、ＤもしくはＪＨの核酸配列またはＶＬもしくはＪＬ遺伝子セグメントコード配列が提供される。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位を含む、非イヌ哺乳動物細胞を産生する方法であって、ａ)２以上のリコンビナーゼ標的部位を、非イヌ哺乳動物宿主細胞のゲノムに導入し、少なくとも１つの部位を、内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子を含むゲノム領域の上流および少なくとも１つの部位を下流に統合し、ここで、内因性免疫グロブリン可変遺伝子はＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメントまたはＶκおよびＪκ遺伝子セグメントまたはＶλおよびＪλ遺伝子セグメントまたはＶλ、ＪλおよびＣλ遺伝子セグメントを含むものであり；そしてｂ)リコンビナーゼ介在カセット交換(ＲＭＣＥ)により、イヌ免疫グロブリン可変領域遺伝子コード配列ならびに非イヌ哺乳動物宿主の内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座位に存在する非コード制御配列または足場配列に対応する非コード制御配列または足場配列を含む操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変遺伝子座位を非イヌ哺乳動物宿主細胞に導入することを含む、方法が提供される。
他の態様において、方法は、工程ｂの前に、２個の外的に導入されたリコンビナーゼ標的部位が隣接するゲノム領域の欠失を含む。
この方法の具体的態様において、イヌＶＨ遺伝子セグメントコード配列を含み、さらに、ｉ)イヌＤおよびＪＨ遺伝子セグメントコード配列およびii)非イヌ哺乳動物宿主のゲノムにおける内因性Ｄ遺伝子セグメントの上流に存在する配列に対応するイヌＤ遺伝子セグメントの上流に非コード制御配列または足場配列(ｐｒｅ－Ｄ配列、図１Ａ)をさらに含む、外的に導入され、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン重鎖座位が提供される。ある態様において、これらの上流足場配列は、雄性稔性に必要なＡＤＡＭ６ＡまたはＡＤＡＭ６Ｂ(図１Ａ)などの非免疫グロブリン遺伝子が点在する(Nishimura et al. Developmental Biol. 233(1): 204-213 (2011))。部分的にイヌの免疫グロブリン重鎖座位は、同じ染色体の内因性免疫グロブリンＶＨ遺伝子座位の上流および内因性ＪＨ遺伝子座位の下流に先に導入されている、リコンビナーゼ標的部位を使用して、宿主細胞に導入する。他の態様において、非コード制御配列または足場配列は、(少なくとも部分的に)他の供給源に由来し、例えば、合理的に設計された人工配列または未知機能の他の点で保存された配列、イヌと人工もしくは他の設計配列または他種の配列の組み合わせである。ここで使用する、「人工配列」は、遺伝子座位で自然に生じる配列に由来しない、核酸配列をいう。ある態様において、非コード制御配列または足場配列は、齧歯類免疫グロブリン重鎖可変領域座位の非コード制御配列または足場配列に由来する。ある態様において、非コード制御配列または足場配列は、齧歯類免疫グロブリン重鎖可変領域座位の非コード制御配列または足場配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％配列同一性である。他の態様において、非コード制御配列または足場配列は、齧歯類免疫グロブリン重鎖可変領域非コードまたは足場配列である。
方法のさらに他の具体的態様において、導入され、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、イヌ免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメントコード配列を含み、ｉ)イヌＬ鎖Ｊ遺伝子セグメントコード配列およびii)非イヌ哺乳動物宿主細胞ゲノムの内因性Ｌ鎖座位に存在する非コード制御配列または足場配列に対応する非コード制御配列または足場配列をさらに含む。ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、同じ染色体の内因性免疫グロブリンＶＬ遺伝子座位の上流および内因性Ｊ遺伝子座位の下流に先に導入されているリコンビナーゼ標的部位を使用して、宿主細胞に導入される。
この方法のさらなる具体的態様において、イヌＶλ遺伝子セグメントコード配列およびイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列を含む、外的に導入され、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン軽鎖座位が提供される。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン軽鎖座位は、同じ染色体の内因性免疫グロブリンＶλ遺伝子座位の上流および内因性Ｊλ遺伝子座位の下流に先に導入されているリコンビナーゼ標的部位を使用して、宿主細胞に導入される。
ある態様において、外的に導入され、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン軽鎖座位は、イヌＶκ遺伝子セグメントコード配列およびイヌＪκ遺伝子セグメントコード配列を含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン軽鎖座位は、同じ染色体の内因性免疫グロブリンＶκ遺伝子座位の上流および内因性Ｊκ遺伝子座位の下流に先に導入されているリコンビナーゼ標的部位を使用して、宿主細胞に導入される。
ある態様において、非コード制御配列または足場配列は、齧歯類λ免疫グロブリン軽鎖可変領域座位の非コード制御配列または足場配列由来である。ある態様において、非コード制御配列または足場配列は、齧歯類免疫グロブリンλ軽鎖可変領域座位の非コード制御配列または足場配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％配列同一性を有する。他の態様において、非コード制御配列または足場配列は、齧歯類免疫グロブリンλ軽鎖可変領域非コードまたは足場配列である。
ある態様において、非コード制御配列または足場配列は、齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖可変領域座位の非コード制御配列または足場配列由来である。ある態様において、非コード制御配列または足場配列は、齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖可変領域座位の非コード制御配列または足場配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％配列同一性を有する。他の態様において、非コード制御配列または足場配列は、齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖可変領域非コードまたは足場配列である。
ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位は単一核酸として合成され、単一核酸領域として非イヌ哺乳動物宿主細胞に導入される。ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位は２以上の連続的セグメントとして合成され、分離したセグメントとして哺乳動物宿主細胞に導入される。他の態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位は組み換え方法を使用して産生され、非イヌ哺乳動物宿主細胞への導入前に単離される。
他の態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位を含む非イヌ哺乳動物細胞を産生する方法であって、ａ)非イヌ哺乳動物宿主細胞のゲノムに、互いに組み換えできない２以上の配列特異的組み換え位置を導入し、ここで、少なくとも１つの組み換え位置が内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座位の上流に導入され、少なくとも１つの組み換え位置が同じ染色体の内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座位の下流に導入されるものであり；ｂ)ｉ)イヌ免疫グロブリン可変領域遺伝子コード配列およびii)宿主細胞ゲノムの内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座位に基づく非コード制御配列または足場配列を有する操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位を含むベクターを提供し、ここで、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、ａ)の宿主細胞の内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座位に隣接された、同じ２つの配列特異的組み換え位置が隣接するものであり；ｃ)宿主細胞に工程ｂ)のベクターおよび２つのリコンビナーゼ位置を認識できる部位特異的リコンビナーゼを導入し；ｄ)ａ)の細胞のゲノムと操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位の間で組み換え事象を生じさせ、内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座位の操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域遺伝子座位への置き換えをもたらすことを含む、方法が提供される。
ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位はＶＨ免疫グロブリン遺伝子セグメントコード配列を含み、さらにｉ)イヌＤおよびＪＨ遺伝子セグメントコード配列、ii)非イヌ哺乳動物宿主のゲノムに内因性に存在する個々のＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメントのコドン周囲の非コード制御配列または足場配列およびiii)非イヌ哺乳動物宿主細胞の内因性ゲノムに基づくｐｒｅ－Ｄ配列を含む。リコンビナーゼ標的部位は、内因性免疫グロブリンＶＨ遺伝子座位の上流および内因性ＤおよびＪＨ遺伝子座位の下流に導入される。
ある態様において、齧歯類内因性免疫グロブリン可変遺伝子座位が欠失したゲノムを有するトランスジェニック齧歯類であって、ここで、該欠失齧歯類内因性免疫グロブリン可変遺伝子座位は、イヌ免疫グロブリン可変遺伝子コード配列および齧歯類内因性免疫グロブリン可変遺伝子座位に基づく非コード制御配列または足場配列を含む操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位に置き換えられており、トランスジェニック齧歯類の操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位は機能的であり、イヌ可変ドメインおよび齧歯類定常ドメインを有する免疫グロブリン鎖を発現するものである、トランスジェニック齧歯類が提供される。ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位はイヌＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列を含み、ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、イヌＶＬおよびＪＬコード配列を含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、イヌＶλおよびＪλコード配列を含む。他の態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、イヌＶκおよびＪκコード配列を含む。
ある態様は、トランスジェニック齧歯類からのＢリンパ球系譜の細胞、Ｂリンパ球系譜の細胞から得たイヌ可変ドメインおよび齧歯類定常ドメインを含む免疫グロブリン分子の一部または全部、Ｂリンパ球系譜の細胞由来のハイブリドーマ細胞、ハイブリドーマ細胞から得たイヌ可変ドメインおよび齧歯類定常ドメインを含む免疫グロブリン分子の一部または全部、ハイブリドーマ細胞から得た免疫グロブリン分子由来のイヌ可変ドメインを含む免疫グロブリン分子の一部または全部、Ｂリンパ球系譜の細胞由来の不死化細胞、不死化細胞から得たイヌ可変ドメインおよび齧歯類定常ドメインを含む免疫グロブリン分子の一部または全部、不死化細胞から得た免疫グロブリン分子由来のイヌ可変ドメインを含む、免疫グロブリン分子の一部または全部を提供する。
ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位が、イヌＶＬおよびＪＬコード配列を含むトランスジェニック齧歯類および操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位はイヌＶＨ、ＤおよびＪＨまたはＶＬおよびＪＬコード配列を含むトランスジェニック齧歯類が提供される。ある態様において、齧歯類はマウスである。ある態様において、非コード制御配列は、内因性宿主起源の次の配列、各Ｖ遺伝子セグメントコード配列前のプロモーター、イントロン、スプライス部位およびＶ(Ｄ)Ｊ組み換えのための組み換えシグナル配列を含み；他の態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、内因性宿主起源の次の配列、ＡＤＡＭ６ＡまたはＡＤＡＭ６Ｂ遺伝子、Ｐａｘ－５－活性化遺伝子間反復(ＰＡＩＲ)要素または重鎖遺伝子間調節領域１からのＣＴＣＦ結合部位の１以上をさらに含む。
ある態様において、上記方法の各々に使用するための非イヌ哺乳動物細胞は、哺乳動物細胞、例えば、哺乳動物胚幹(ＥＳ)細胞である。ある態様において、哺乳動物細胞は、初期胚の細胞である。ある態様において、非イヌ哺乳動物細胞は、齧歯類細胞である。ある態様において、非イヌ哺乳動物細胞は、マウス細胞である。
細胞が導入された部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域遺伝子座位による内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座位の置き換えに付されたら、細胞を選択および単離できる。ある態様において、細胞は非イヌ哺乳動物ＥＳ細胞、例えば、齧歯類ＥＳ細胞であり、次いで、少なくとも１つの単離ＥＳ細胞クローンが単離されて、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域遺伝子座位を発現するトランスジェニック非イヌ哺乳動物を作るために利用される。
ある態様において、トランスジェニック齧歯類を産生する方法であって、ａ)齧歯類細胞のゲノムの内因性免疫グロブリン可変遺伝子座位の上流に部位特異的リコンビナーゼに対する少なくとも１つの標的部位および内因性免疫グロブリン可変遺伝子座位の下流に部位特異的リコンビナーゼに対する少なくとも１つの標的部位を導入し、ここで、内因性免疫グロブリン可変座位はＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメントまたはＶκおよびＪκ遺伝子セグメントまたはＶλおよびＪλ遺伝子セグメントまたはＶλ、ＪλおよびＣλ遺伝子セグメントを含み；ｂ)操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位を含むベクターを提供し、該操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位はキメライヌ免疫グロブリン遺伝子セグメントを含み、ここで、部分的にイヌの免疫グロブリン遺伝子セグメントの各々はイヌ免疫グロブリン可変遺伝子コード配列および齧歯類非コード制御配列または足場配列を含み、部分的にイヌの免疫グロブリン可変遺伝子座位は、部位特異的リコンビナーゼに対する標的部位が隣接し、ここで、標的部位は、齧歯類細胞に導入された標的部位と再結合でき；ｃ)細胞に、ベクターおよび標的部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼを導入し；ｄ)細胞のゲノムと操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位の間で組み換え事象を生じさせ、内因性免疫グロブリン可変遺伝子座位の操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位への置き換えをもたらし；ｅ)工程ｄ)で産生した操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変座位を含む細胞を選択し；そして該細胞を使用して、部分的にイヌの操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変座位を含むトランスジェニック齧歯類を作ることを含む、方法が提供される。ある態様において、細胞は齧歯類胚幹(ＥＳ)細胞であり、ある態様において、細胞はマウス胚幹(ＥＳ)細胞である。この方法のある態様は、さらに、工程ａ)の後かつ工程ｂ)の前、標的部位の第一セットを認識するリコンビナーゼの導入により、内因性免疫グロブリン可変遺伝子座位を欠失する工程をさらに含み、ここで、欠失工程は、齧歯類細胞のゲノムと互いに組み換えできない少なくとも１つのセットの標的部位をその場所に残す。ある態様において、ベクターはイヌＶＨ、ＤおよびＪＨ、コード配列を含み、ある態様において、ベクターはイヌＶＬおよびＪＬコード配列を含む。ある態様において、ベクターは、齧歯類プロモーター、イントロン、スプライス部位および可変領域遺伝子セグメントの組み換えシグナル配列をさらに含む。
他の態様において、外的に外的に導入され、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域遺伝子座位を含むトランスジェニック非イヌ哺乳動物を産生する方法であって、ａ)非イヌ哺乳動物宿主細胞のゲノムに、内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座位が隣接し、互いに組み換えできない１以上の配列特異的組み換え位置を導入し；ｂ)ｉ)イヌ可変領域遺伝子コード配列およびii)内因性宿主免疫グロブリン可変領域遺伝子座位に基づく非コード制御配列または足場配列を有する部分的にイヌの免疫グロブリン座位を含むベクターを提供し、ここで、コード配列および非コード制御配列または足場配列がａ)の宿主細胞のゲノムに導入されたのと同じ配列特異的組み換え位置により隣接され；ｃ)細胞に工程ｂ)のベクターおよび１セットのリコンビナーゼ位置を認識できる部位特異的リコンビナーゼを導入し；ｄ)ａ)の細胞のゲノムと、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域遺伝子座位の間で組み換え事象を生じさせ、内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座位と部分的にイヌの免疫グロブリン座位の置き換えをもたらし；ｅ)部分的にイヌの免疫グロブリン座位を含む細胞を選択し；そしてｆ)該細胞を利用して、部分的にイヌの免疫グロブリン座位を含むトランスジェニック動物を産生することを含む、方法が提供される。
特異的態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、非イヌ哺乳動物宿主の内因性ゲノムに存在する、イヌＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメントコード配列および非コード制御および足場ｐｒｅ－Ｄ配列(妊孕性遺伝子を含む)を含む。ある態様において、次いで、配列特異的組み換え位置は内因性免疫グロブリンＶＨ遺伝子セグメントの上流および内因性ＪＨ遺伝子セグメントの下流に導入される。
ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位を含むトランスジェニック非イヌ動物を産生する方法であって、ａ)互いに組み換えできず、宿主ゲノムの内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座位が隣接した２セットの配列特異的組み換え位置を含むゲノムを有する非イヌ哺乳動物細胞を提供し；ｂ)第一セットの配列特異的組み換え位置を認識するリコンビナーゼの導入により宿主ゲノムの内因性免疫グロブリン座位の部分を欠失させ、ここで、ゲノムにおけるこのような欠失は第二のセットの配列特異的組み換え位置を保持し；ｃ)イヌコード配列および内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座位に基づく非コード制御配列または足場配列を有する操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域遺伝子座位を含むベクターを提供し、ここで、コードおよび非コード制御配列または足場配列は第二セットの配列特異的組み換え位置により隣接され；ｄ)工程ｃ)のベクターおよび第二セットの配列特異的組み換え位置を認識できる部位特異的リコンビナーゼを該細胞に導入し；ｅ)細胞のゲノムと部分的にイヌの免疫グロブリン座位の間で組み換え事象を生じさせ、内因性免疫グロブリン座位の操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変座位での置き換えをもたらし；ｆ)部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域遺伝子座位を含む細胞を選択し；そしてｇ)該細胞を利用して、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域遺伝子座位を含むトランスジェニック動物を産生することを含む、方法が提供される。
ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位を含むトランスジェニック非イヌ哺乳動物を産生する方法であって、ａ)互いに組み換えできず、内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座位に隣接された２個の配列特異的組み換え位置を含むゲノムを有する非イヌ哺乳動物胚幹ＥＳ細胞を提供し；ｂ)イヌ免疫グロブリン可変遺伝子コード配列および内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座位に基づく非コード制御配列または足場配列を含む操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位を含むベクターを提供し、ここで、部分的にイヌの免疫グロブリン座位はＥＳ細胞における内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座位に隣接する同じ２個の配列特異的組み換え位置に隣接され；ｃ)ＥＳ細胞およびベクターを、ＥＳ細胞における内因性免疫グロブリン可変領域遺伝子座位と操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域遺伝子座位の置き換えをもたらす組み換え事象の促進に適切な条件下で２個のリコンビナーゼ位置を認識できる部位特異的リコンビナーゼと接触させ；ｄ)操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位を含むＥＳ細胞を選択し；そしてｅ)該細胞を利用して、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位を含むトランスジェニック動物を産生することを含む、方法が提供される。
ある態様において、トランスジェニック非イヌ哺乳動物は齧歯類、例えば、マウスまたはラットである。
ある態様において、イヌ可変領域遺伝子コード配列および宿主ゲノムの内因性非イヌ免疫グロブリン座位に基づき非コード制御配列または足場配列を有する導入された免疫グロブリン可変領域遺伝子座位を発現する非イヌ哺乳動物細胞および非イヌトランスジェニック哺乳動物が提供され、ここで、非イヌ哺乳動物細胞およびトランスジェニック動物は、非イヌ哺乳動物細胞または動物に天然である各定常領域と共に、完全イヌＨ鎖またはＬ鎖可変ドメインを有するキメラ抗体を発現する。
さらに、完全イヌ可変配列を有する部分的にイヌの抗体を発現できるトランスジェニック動物からのＢ細胞が提供され、ここで、このようなＢ細胞は、特定の抗原に特異的なモノクローナル抗体の供給源をもたらすために不死化される。ある態様において、イヌ可変領域および齧歯類定常領域を含む部分的にイヌの重鎖または軽鎖抗体を発現できる、トランスジェニック動物からのＢリンパ球系譜の細胞が提供される。
ある態様において、診断、予防および治療使用のための抗体の産生または最適化に使用するための、Ｂ細胞からクローン化されたイヌ免疫グロブリン可変領域遺伝子配列が提供される。
ある態様において、完全イヌ免疫グロブリン可変領域配列を有する部分的にイヌのモノクローナル抗体を産生できる、ハイブリドーマ細胞が提供される。ある態様において、Ｂリンパ球系譜のハイブリドーマまたは不死化細胞株が提供される。
他の態様において、ここに記載のトランスジェニック動物または細胞により産生された抗体またはその抗原結合部分が提供される。他の態様において、ここに記載するトランスジェニック動物または細胞により産生された抗体由来の可変重鎖または可変軽鎖配列を含む抗体またはその抗原結合部分が提供される。
ある態様において、イヌに注射したときに免疫原性ではない、完全イヌ抗体を産生するために、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマまたは初代形質細胞またはＢ細胞からのＨおよびＬ鎖免疫グロブリン可変ドメインの配列を決定し、ＶＨおよびＶＬ配列とイヌ定常領域を組み合わせる方法が、提供される。
これらおよび他の態様、目的および特性を、以下にさらに詳述する。
染色体１２のテロメア末端に位置する内因性マウスＩＧＨ座位の模式図である。
染色体１６に位置する内因性マウスＩＧＬ座位の模式図である。
染色体６に位置する内因性マウスＩＧＫ座位の模式図である。
第一セットの配列特異的組み換え位置を、非イヌ哺乳動物宿主細胞のゲノムにおけるＨ鎖可変領域遺伝子座位の上流領域に導入するための、相同組み換えによるターゲティングの戦略を説明する模式図である。
第一セットの配列特異的組み換え位置を、非イヌ哺乳動物宿主細胞のゲノムにおけるＨ鎖可変領域遺伝子座位の上流領域に導入するための、相同組み換えによるターゲティングの戦略を説明する別の模式図である。
相同性ターゲティングベクターにより、非イヌ哺乳動物細胞のゲノムにおけるＨ鎖可変領域遺伝子座位の下流の領域への第二セットの配列特異的組み換え位置の導入を説明する模式図である。
非イヌ哺乳動物宿主細胞のゲノムからの内因性免疫グロブリンＨ鎖可変領域遺伝子座位の欠失を説明する模式図である。
内因性免疫グロブリンＨ鎖可変領域遺伝子座位を欠失するために予め修飾されている非イヌ哺乳動物宿主細胞ゲノムへの操作された部分的にイヌの免疫グロブリンＨ鎖座位の導入のためのＲＭＣＥ戦略を説明する模式図である。
内因性免疫グロブリンＨ鎖可変領域遺伝子を欠失するために予め修飾されている非イヌ哺乳動物宿主細胞ゲノムへのさらなる制御配列を含む操作された部分的にイヌの免疫グロブリンＨ鎖座位の導入のためのＲＭＣＥ戦略を説明する模式図である。
マウスゲノムの内因性免疫グロブリンＨ鎖座位への操作された部分的にイヌの免疫グロブリンＨ鎖可変領域遺伝子座位の導入を説明する模式図である。
マウスゲノムの内因性免疫グロブリンκＬ鎖座位への操作された部分的にイヌの免疫グロブリンκＬ鎖可変領域遺伝子座位の導入を説明する模式図である。
マウスゲノムの内因性免疫グロブリンλＬ鎖座位への操作された部分的にイヌの免疫グロブリンλＬ鎖可変領域遺伝子座位の導入を説明する模式図である。
ＲＭＣＥによる、イヌＶＨミニ座位を含む操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位の導入を説明する模式図である。
Ｉｇｈ座位(１２０１)全体およびＩＧＨＣ領域(１２０２)の拡大図を示す、染色体８に位置する内因性イヌＩＧＨ座位の模式図である。
染色体２６に位置する内因性イヌＩＧＬ座位の模式図である。
染色体１７に位置する内因性イヌＩＧＫ座位の模式図である。矢印は、Ｖκ遺伝子セグメントの転写方向を示す。天然イヌＩＧＫ座位(１２２０)において、一部Ｖκ遺伝子セグメントは、Ｃκエクソンの下流である。ここに記載する部分的にイヌのＩｇκ座位において(１２２１)、Ｖκ遺伝子セグメントコード配列の全てはＣκエクソンの上流であり、Ｃκエクソンと同じ転写方向である(実施例４参照)。
１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列が、１以上の齧歯類Ｃλ領域コード配列の上流にある１以上のイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列の齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖座位上流に挿入された、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン軽鎖可変領域座位を説明する模式図である。
１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列がＪλ－Ｃλタンデムカセットのアレイの上流齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖座位に挿入された模式図であり、ここで、Ｊλはイヌ起源であり、Ｃλはマウス起源、Ｃλ１、Ｃλ２またはＣλ３である。
ヒトＣＤ４(ｈＣＤ４)、ＩｇＭｂアロタイプからのイヌＩＧＨＶ３－５－マウスＣμ膜およびマウスＣκおよびＣλの種々の組み合わせに結合したイヌＩＧＬＶ３－２８／Ｊλ６(１５０１)またはマウスＣκおよびＣλの種々の組み合わせに結合したイヌＩＧＫＶ２－５／Ｊκ１(１５０２)をコードする発現ベクターでトランスフェクトした２９３Ｔ／１７細胞のフローサイトメトリープロファイルを示す。細胞は、細胞表面ｈＣＤ４(１５０９)またはマウスＩｇＭｂ(１５１０)について染色されている。
ヒトＣＤ４(ｈＣＤ４)、ＩｇＭｂアロタイプからのイヌＩＧＨＶ３－５－マウスＣμ膜およびマウスＣκおよびＣλの種々の組み合わせに結合したイヌＩＧＬＶ３－２８／Ｊλ６(１６０１)またはマウスＣκおよびＣλの種々の組み合わせに結合したイヌＩＧＫＶ２－５／Ｊκ１(１６０２)をコードする発現ベクターでトランスフェクトした２９３Ｔ／１７細胞のフローサイトメトリープロファイルを示す。細胞は、細胞表面マウスλＬＣ(１６０１)またはマウスκＬＣ(１６０２)に対して染色されている。
ヒトＣＤ４(ｈＣＤ４)、ＩｇＭｂアロタイプからのイヌＩＧＨＶ４－１－マウスＣμ膜およびマウスＣκおよびＣλの種々の組み合わせに結合したイヌＩＧＬＶ３－２８／Ｊλ６(１７０１)またはマウスＣκおよびＣλの種々の組み合わせに結合したイヌＩＧＫＶ２－５／Ｊκ１(１７０２)をコードする発現ベクターでトランスフェクトした２９３Ｔ／１７細胞のフローサイトメトリープロファイルを示す。細胞は、細胞表面ｈＣＤ４(１７０９)またはマウスＩｇＭｂ(１７１０)に対して染色されている。
ヒトＣＤ４(ｈＣＤ４)、ＩｇＭｂアロタイプからのイヌＩＧＨＶ３－１９－マウスＣμ膜およびマウスＣκおよびＣλの種々の組み合わせに結合したイヌＩＧＬＶ３－２８／Ｊλ６(１８０１)またはマウスＣκおよびＣλの種々の組み合わせに結合したイヌＩＧＫＶ２－５／Ｊκ１(１８０２)をコードする発現ベクターでトランスフェクトした２９３Ｔ／１７細胞のフローサイトメトリープロファイルを示す。細胞は、細胞表面ｈＣＤ４(１８０９)またはマウスＩｇＭｂ(１８１０)に対して染色されている。
図１９Ａは、マウスＣγ２αに結合したイヌＩＧＨＶ３－５(１９０１)、マウスＣγ２αに結合したＩＧＨＶ３－１９(１９０２)またはマウスＣγ２αに結合したＩＧＨＶ４－１(１９０３)およびマウスＣκ(１９０７)およびＣλ(１９０８～１９１０)の種々の組み合わせに結合したイヌＩＧＬＶ３－２８／Ｊλ６をコードする発現ベクターでトランスフェクトした３９３Ｔ／１７細胞の培養上清のウェスタンブロットを示し、図１９Ｂは、細胞ライセートのウェスタンブロットを示す。サンプルを還元条件下で電気泳動し、ブロットを抗マウスＩｇＧ２ａ抗体でプローブした。
図２０Ａは、図１８からの細胞ライセートのウェスタンブロットローディング・コントロールＭｙｃを示し、図２０Ｂは、図１８からの細胞ライセートのウェスタンブロットローディング・コントロールＧＡＰＤＨを示す。
図２１Ａは、イヌＩＧＨＶ３－５－マウスＣγ２αおよびマウスＣκ(２１０２)およびＣλ(２１０３、２１０４)の種々の組み合わせに結合したイヌＩＧＬＶ３－２８／Ｊλ６をコードする発現ベクターでトランスフェクトしたまたはイヌＩＧＨＶ３－５－マウスＣγ２αおよびマウスＣκ(２１０５)およびＣλ(２１０６、２１０７)の種々の組み合わせに結合したイヌＩＧＫＶ２－５／Ｊκ１をコードする発現ベクターでトランスフェクトした３９３Ｔ／１７細胞の培養上清のウェスタンブロット(非還元条件)を示し、図２１Ｂは、細胞ライセート(還元条件)のウェスタンブロットを示す。図２１Ａにおけるブロットは、マウスＩｇＧ２ａに対する抗体でプローブし、図２１Ｂにおけるブロットは、マウスκＬＣに対する抗体でプローブした。
ヒトＣＤ４(ｈＣＤ４)、マウスＣδ膜に結合したイヌＩＧＨＶ３－５およびマウスＣκに結合したイヌＩＧＫＶ２－５／Ｊκ１(２２０１)またはマウスＣλ１、Ｃλ２またはＣλ３に結合したイヌＩＧＬＶ３－２８／Ｊλ６(２２０２～２２０４)をコードする発現ベクターでトランスフェクトした２９３Ｔ／１７細胞のフローサイトメトリープロファイルを示す。細胞は、細胞表面ｈＣＤ４(２２０５)、マウスＣＤ７９ｂ(２２０６)、マウスＩｇＤ(２２０７)、マウスκＬＣ(２２０８)またはマウスλＬＣ(２２０９)に対して染色されている。
ヒトＣＤ４(ｈＣＤ４)、マウスＣδ膜に結合したイヌＩＧＨＶ３－１９およびマウスＣκに結合したイヌＩＧＫＶ２－５／Ｊκ１(２３０１)またはマウスＣλ１、Ｃλ２またはＣλ３に結合したイヌＩＧＬＶ３－２８／Ｊλ６(２３０２～２３０４)をコードする発現ベクターでトランスフェクトした２９３Ｔ／１７細胞のフローサイトメトリープロファイルを示す。細胞は、細胞表面ｈＣＤ４(２２０５)、マウスＣＤ７９ｂ(２２０６)、マウスＩｇＤ(２２０７)、マウスκＬＣ(２２０８)またはマウスλＬＣ(２２０９)に対して染色されている。
ヒトＣＤ４(ｈＣＤ４)、マウスＣδ膜に結合したイヌＩＧＨＶ４－１およびマウスＣκに結合したイヌＩＧＫＶ２－５／Ｊκ１(２４０１)またはマウスＣλ１、Ｃλ２またはＣλ３に結合したイヌＩＧＬＶ３－２８／Ｊλ６(２４０２～２４０４)をコードする発現ベクターでトランスフェクトした２９３Ｔ／１７細胞のフローサイトメトリープロファイルを示す。細胞は、細胞表面ｈＣＤ４(２４０５)、マウスＣＤ７９ｂ(２４０６)、マウスＩｇＤ(２４０７)、マウスκＬＣ(２４０８)またはマウスλＬＣ(２４０９)に対して染色されている。
定義
ここで使用する用語は、当業者により理解される、平易かつ通常の意味を有することが意図される。次の定義は、本発明の理解の一助となることが意図されるが、具体的に示されない限り、このような用語の意味を変えるかまたは他に限定することを意図しない。
ここで使用する用語「座位」は、それぞれ、ゲノムに内因性に存在するまたはゲノムに外的に導入される(またはその予定である)染色体セグメントまたは核酸配列をいう。例えば、免疫グロブリン座位は、免疫グロブリンＨ鎖またはＬ鎖ポリペプチドの発現を支持する遺伝子(すなわち、Ｖ、Ｄ、Ｊ遺伝子セグメントならびに定常領域遺伝子)および介在配列(すなわち、イントロン、エンハンサーなど)の一部または全てを含み得る。故に、座位(例えば、免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座位)は、大型座位の特定の一部を指し得る(例えば、ＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリンＨ鎖座位の部分)。同様に、免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座位は、大型座位の特定の一部を指し得る(例えば、ＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリンＬ鎖座位の部分)。ここで使用する用語「免疫グロブリン可変領域遺伝子」は、免疫グロブリンＨ鎖またはＬ鎖可変ドメインの部分をコードするＶ、ＤまたはＪ遺伝子セグメントをいう。ここで使用する用語「免疫グロブリン可変領域遺伝子座位」は、Ｖ、ＤまたはＪ遺伝子セグメントのクラスターを含む、染色体セグメントまたは核酸鎖の一部または全体をいい、非コード制御配列または足場配列を含み得る。
ここで使用する「遺伝子セグメント」は、免疫グロブリン分子の重鎖または軽鎖可変ドメインの部分をコードする核酸配列をいう。遺伝子セグメントは、コード配列および非コード配列を含み得る。遺伝子セグメントのコード配列は、リーダーペプチドおよび重鎖または軽鎖可変ドメインのＮ末端などのポリペプチドに翻訳され得る核酸配列である。非遺伝子セグメントのコード配列は、プロモーター、５’非翻訳配列、リーダーペプチドのコード配列が介在するイントロン、組み換えシグナル配列(ＲＳＳ)およびスプライス部位を含み得る、コード配列に隣接する配列である。免疫グロブリン重鎖(ＩＧＨ)座位における遺伝子セグメントは、ＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメントを含む(それぞれＩＧＨＶ、ＩＧＨＤおよびＩＧＨＪとも称する)。免疫グロブリンκおよびλ軽座位における軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントと称し得る。κ軽鎖において、ＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントは、ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントまたはＩＧＫＶおよびＩＧＫＪと称し得る。同様に、λ軽鎖において、ＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントは、ＶλおよびＪλ遺伝子セグメントまたはＩＧＬＶおよびＩＧＬＪと称し得る。
重鎖定常領域は、ＣＨまたはＩＧＨＣと称し得る。ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１～４、ＩｇＥまたはＩｇＡをコードするＣＨ領域エクソンは、それぞれ、Ｃμ、Ｃδ、Ｃγ１～４、ＣεまたはＣαと称し得る。同様に、免疫グロブリンκまたはλ定常領域は、それぞれＣκまたはＣλおよびＩＧＫＣまたはＩＧＬＣと称し得る。
ここで使用する「部分的にイヌ」は、イヌおよび非イヌ哺乳動物宿主の両者のある座位に見られる配列を含む、核酸鎖またはその発現タンパク質およびＲＮＡ産物をいう。ここで使用する「部分的にイヌ」は、イヌおよび非イヌ哺乳動物、例えば、齧歯類の両者からの核酸配列を含む、動物もいう。ある態様において、部分的にイヌの核酸は、イヌ免疫グロブリンＨ鎖またはＬ鎖可変領域遺伝子セグメントのコード配列および非イヌ哺乳動物の内因性免疫グロブリン座位の非コード制御配列または足場配列に基づく配列を有する。
用語「基づく」は、非イヌ哺乳動物宿主細胞ゲノムからの内因性非コード制御配列または足場配列に関して使用するとき、哺乳動物宿主細胞ゲノムの対応する内因性座位に存在する、非コード制御配列または足場配列をいう。ある態様において、用語「基づく」は、部分的にイヌの免疫グロブリン座位に存在する非コード制御配列または足場配列が、宿主哺乳動物の内因性座位の非コード制御配列または足場配列と相当高い程度の相同性を共有することを意味する。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位における非コード配列は、宿主哺乳動物の内因性座位に見られる対応する非コード配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同性を共有する。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位における非コード配列は、宿主哺乳動物の免疫グロブリン座位から保持される。ある態様において、イヌコード配列は、宿主哺乳動物の免疫グロブリン座位の非制御または足場配列に包埋される。ある態様において、宿主哺乳動物は、ラットまたはマウスなどの齧歯類である。
「非コード制御配列」は、(ｉ)Ｖ(Ｄ)Ｊ組み換え、(ii)アイソタイプスイッチング、(iii)Ｖ(Ｄ)Ｊ組み換え後の完全長免疫グロブリンＨ鎖またはＬ鎖の適切な発現および(iv)例えば、膜および免疫グロブリンＨ鎖の分泌形態を産生するための、選択的スプライシングに必須であることが知られる配列をいう。「非コード制御配列」は、内因性起源の次の配列：ＣＴＣＦおよびＰＡＩＲ配列などのエンハンサーおよび座位制御要素(Proudhon, et al., Adv. Immunol. 128:123-182 (2015))；各内因性Ｖ遺伝子セグメントの前のプロモーター；スプライス部位；イントロン；各Ｖ、ＤまたはＪ遺伝子セグメントに隣接する組み換えシグナル配列をさらに含み得る。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位の「非コード制御配列」は、非イヌ哺乳動物宿主細胞の標的内因性免疫グロブリン座位に見られる対応する非コード配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および最大１００％相同性を共有する。
「足場配列」は、宿主細胞ゲノムの内因性免疫グロブリン座位に存在する遺伝子セグメントが介在する配列をいう。ある態様において、足場配列は、機能的非免疫グロブリン遺伝子、例えば、ＡＤＡＭ６ＡまたはＡＤＡＭ６Ｂの発現に必須である配列が散在する。ある態様において、足場配列は、他の供給源に(少なくとも部分的に)由来する － 例えば、合理的に設計されたまたは人工の配列、イヌゲノムの免疫グロブリン座位に存在する配列、他の種の免疫グロブリン座位に存在する配列またはこれらの組み合わせであり得る。用語「非コード制御または足場配列」は、包括的な意味を有することは理解される(すなわち、ある座位に既存の非コード制御配列および足場配列の両者をいう)。
用語「相同性ターゲティングベクター」は、相同組み換えによる哺乳動物宿主細胞の内因性ゲノムの修飾に使用される核酸配列をいい、このような核酸配列は、(ｉ)非イヌ哺乳動物宿主のゲノムに存在する座位に隣接する対応する内因性配列と相当な相同性を有するターゲティング配列(ii)少なくとも１つの配列特異的組み換え位置、(iii)非コード制御配列または足場配列および(iv)所望により１以上の選択可能マーカー遺伝子を含み得る。そのようなものとして、相同性ターゲティングベクターは、宿主細胞ゲノムの特定の領域に配列特異的組み換え位置を導入するために使用できる。
「部位特異的組み換え」または「配列特異的組み換え」は、次の３つの事象ａ)組み換え位置が隣接する予め選択された核酸の欠失；ｂ)組み換え位置が隣接する予め選択された核酸のヌクレオチド配列の反転およびｃ)異なる核酸鎖に位置する組み換え位置に近接する核酸配列の相互交換の何れかを含む、２つの適合性組み換え配列(「配列特異的組み換え位置」または「部位特異的組み換え配列」とも称する)間のＤＮＡ再配列の過程をいう。核酸セグメントのこの相互交換は、宿主細胞のゲノムに外因性核酸配列を導入するためのターゲティング戦略として利用され得ることは理解される。
用語「ターゲティング配列」は、修飾される免疫グロブリン座位の領域に隣接または近接する細胞のゲノムにおけるＤＮＡ配列に相同な配列をいう。隣接または近接配列は、座位自体の中または宿主細胞のゲノムにおけるコード配列の上流もしくは下流にあり得る。ターゲティング配列は、トランスフェクトに使用する組み換えＤＮＡベクター、例えば、ＥＳ細胞に、組み換え位置の配列などの宿主細胞ゲノムに挿入される配列が、ベクターのターゲティング配列に隣接するように、挿入される。
ここで使用する用語「部位特異的ターゲティングベクター」は、リコンビナーゼ介在部位特異的組み換えに使用する宿主における内因性免疫グロブリン座位の修飾に使用する、配列特異的組み換え位置、操作された部分的にイヌの座位および所望により選択可能マーカー遺伝子をコードする核酸を含むベクターをいう。ターゲティングベクターの組み換え位置は、修飾される免疫グロブリン座位に隣接する、宿主細胞のゲノム配列に(例えば、相同性ターゲティングベクターにより)挿入されている、他の対応する組み換え位置との部位特異的組み換えに適する。免疫グロブリン座位における組み換え位置への操作された部分的にイヌの配列の組込みは、内因性座位の外的に導入された部分的にイヌの領域による置き換えをもたらす。
用語「導入遺伝子」は、ここでは、細胞および特に哺乳動物宿主動物の細胞のゲノムに、人工的に挿入されているまたは挿入する予定である、遺伝物質をいうために使用される。ここで使用する用語「導入遺伝子」は、部分的にイヌの核酸、例えば、操作された発現構築物またはターゲティングベクターの形の部分的にイヌの核酸をいう。
「トランスジェニック動物」は、その細胞の一部に余分な染色体要素として存在するまたはその生殖細胞系ＤＮＡ(すなわち、その細胞の大部分または全てのゲノム配列において)に安定に統合された外因性核酸配列を有する、非イヌ動物、通常、哺乳動物をいう。ある態様において、部分的にイヌの核酸は、当分野で周知の方法により、例えば、宿主動物の胚または胚幹細胞の遺伝子操作により、このようなトランスジェニック動物の生殖細胞系に導入される。
「ベクター」は、細胞の形質転換またはトランスフェクトに使用できる、自己複製性の有無に拘わらず、プラスミドおよびウイルスおよびあらゆるＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含む。
ここでおよび添付する特許請求の範囲で使用する単数表現は、文脈から異なる指示がされない限り、複数表現を含むことは注意すべきである。故に、例えば、「座位」なる記載は１以上の座位をいい、「方法」なる記載は、当業者に知られる同等な工程および方法への言及を含むなどである。
ここで使用する、用語「または」は、選択肢のみをいうことが明らかに示されるかまたは選択肢が本質的に排他的でない限り、「および／または」を意味し得る。用語「含む」、「含み」および「含んで」は限定ではない。
特に定義しない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。ここに記載する全ての刊行物は、ここに記載する発明と関連して使用し得るデバイス、製剤および方法を記載および開示する目的で、引用により包含させる。
値の範囲が提供されるとき、範囲の上限と下限の間の各値および記載する範囲内のあらゆる他の記載するまたは間の値は、本発明の範囲内に包含されることは理解される。これらの小さい範囲の上限および下限は、独立して小さい範囲に含まれ得て、また記載された範囲内で特に除外制限を条件として、本発明の範囲に包含される。記載する範囲が、一方または両方の限界を含むとき、その含まれる両方の限界のどちらかを除いた範囲も本発明に包含される。
ここに記載する技術の実施は、特に断らない限り、当業者の技術の範囲内である有機化学、ポリマーテクノロジー、分子生物学(組み換え技術を含む)、細胞生物学、生化学およびシーケンシングテクノロジーの慣用の技術および説明を用い得る。このような慣用の技術は、ポリマーアレイ合成、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよびライゲーション、ポリメラーゼ連鎖反応ならびに標識を使用するハイブリダイゼーションの検出を含む。適当な技術の具体的説明は、本明細書の実施例を参照して入手し得る。しかしながら、他の同等な慣用の技術も、当然にまた使用し得る。このような慣用の技術および記載は、全ての目的で引用により全体として本明細書に包含させる、Green, et al., Eds. (1999), Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV); Weiner, Gabriel, Stephens, Eds. (2007), Genetic Variation: A Laboratory Manual; Dieffenbach and Veksler, Eds. (2007), PCR Primer: A Laboratory Manual; Bowtell and Sambrooｋ(2003), DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual; Mount (2004), Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis; Sambrook and Russell (2006), Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual; and Sambrook and Russell (2002), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (all from Cold Spring Harbor Laboratory Press); Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) W.H. Freeman, New York N.Y.; Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" 1984, IRL Press, London; Nelson and Cox (2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 3.sup.rd Ed., W. H. Freeman Pub., New York, N.Y.;およびBerg et al. (2002) Biochemistry, 5.sup.th Ed., W.H. Freeman Pub., New York, N.Y.などの標準的研究室マニュアルに見られ得る。
詳細な記載
次の記載において、本発明のより完全な理解を提供するための多数の具体的な詳細が示されている。しかしながら、本発明は、これらの具体的な詳細の１以上がなくても実施し得ることは、当業者には明らかである。他の例において、周知の特性および当業者に周知の方法は、本発明を曖昧にしないために記載していない。
ここに記載されるのは、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン重鎖または軽鎖座位を含むゲノムを有する、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞である。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン重鎖座位は、１以上のイヌ免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン軽鎖座位は、１以上のイヌ免疫グロブリンλ軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン軽鎖座位は、１以上のイヌ免疫グロブリンκ軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む。
ある態様において、イヌ可変領域のコード配列および哺乳動物宿主ゲノムの免疫グロブリン座位に存在する非コード制御配列または足場配列、例えば、宿主哺乳動物がマウスであるとき、マウスゲノム非コード配列を含む外的に導入され、操作された部分的にイヌの核酸配列を含む、非イヌ哺乳動物細胞が提供される。ある態様において、イヌ可変領域遺伝子セグメントの１以上のコード配列は、哺乳動物宿主ゲノムの免疫グロブリン座位のものに対応する非コード制御配列または足場配列に包埋される。ある態様において、イヌ可変領域遺伝子セグメントのコード配列は、齧歯類またはマウス免疫グロブリン座位の非コード制御配列または足場配列に包埋される。
ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は合成され、内因性宿主の制御要素の制御下にあるイヌＶＨ、ＤまたはＪＨまたはＶＬまたはＪＬ遺伝子セグメントコード配列を含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、哺乳動物宿主ゲノムにおける免疫グロブリン座位のものに対応する非コード制御配列または足場配列に包埋された、イヌＶＨ、ＤまたはＪＨまたはＶＬまたはＪＬ遺伝子セグメントコード配列を含む。
外的に導入され、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位を含むトランスジェニック齧歯類または齧歯類ＥＳ細胞を産生する方法であって、得られたトランスジェニック齧歯類がκ軽鎖を含む免疫グロブリンよりもλ軽鎖を含む免疫グロブリンをより多く産生できる、方法も提供される。
ここに記載する構築物および方法により抗原特異的イヌ抗体を産生できるトランスジェニックマウスまたはラットなどの非イヌ哺乳動物を産生するとき、次のものを含むが、これらに限定されない、多くの困難(challenges)がある。
１. ９０％κ軽鎖を優先的に使用するマウスまたはラットなどの生物において、如何にして９０：１０のλ：κ軽鎖使用比を得るか；
２. マウスλ座位が３個のみの機能的Ｖλ遺伝子セグメントを含むとき、マウスＢ細胞が多数のイヌＶλ遺伝子セグメント(イヌλ座位は少なくとも７０個の機能的な、特有のＶλ遺伝子セグメントを含む)を発現できるか；
３. マウスとイヌλ軽鎖座位の構造差異の観点から、マウスなどの非イヌ哺乳動物におけるイヌＶλの発現および使用を如何に改善するか。
ａ. マウスλ軽鎖座位は、Ｖλ遺伝子セグメント、Ｊλ遺伝子セグメントおよびＣλエクソンの２個のクラスター：
ｉ. Ｖ λ２ －Ｖ λ３ －Ｊ λ２ －Ｃ λ２
ii. Ｖ λ１ －Ｊ λ３ －Ｃ λ３ －Ｊ λ１ －Ｃ λ１
を含み；そして
ｂ. イヌλ座位は、Ｊλ－Ｃλクラスター上流にタンデムＶλ遺伝子セグメントを含む。
４. イヌＩＧＤは機能的ではなく、ＩｇＭおよびＩｇＤがマウスおよびラットＢ細胞でオルタナティブスプライシング型として共発現されるとの事実の観点から、マウスＩｇＤがイヌＶＨと共に発現されるとしても、マウスＢ細胞が正常に発育できるか。
マウスおよびイヌにおける免疫グロブリン座位
液性免疫系において、多様な抗体レパートリーが、Ｖ(Ｄ)Ｊ組み換えと称される過程により、ＩＧＨおよびＩＧＬ鎖遺伝子座位の組み合わせおよび接合多様性により産生される。拡大中のＢ細胞において、最初の組み換え事象が重鎖座位の１個のＤと１個のＪＨ遺伝子セグメントの間で起こり、これら２個の遺伝子セグメント間のＤＮＡは欠失される。このＤ－ＪＨ組み換えの後、新たに形成されたＤＪＨ複合体の上流の領域からのＶＨ遺伝子セグメントが連結し、再配列ＶＨＤＪＨエクソンを形成する。新たに産生されたＶＨＤＪＨエクソンの組み換えＶＨとＤ遺伝子セグメントの間の全ての他の配列は、個々のＢ細胞のゲノムから欠失される。この再配列エクソンは、最終的にＨ鎖ポリペプチドの可変領域としてＢ細胞表面に発現され、これは、Ｌ鎖ポリペプチドと結合して、Ｂ細胞受容体(ＢＣＲ)を形成する。
マウスの軽鎖レパートリーは、遺伝子再配列の順序により成型されると考えられる。両染色体のＩＧＫ軽鎖座位は、いずれかの染色体のＩＧＬ軽鎖座位がＶλ－Ｊλ組み換えを受け入れるようになる前に、まずＶκ－Ｊκ再配列を受けると考えられる。初期κ再配列が非生産的であるならば、さらなるラウンドの二次的再配列が、受容体編集として知られる過程で進行し得る(Collins and Watson. (2018) Immunoglobulin light chain gene rearrangements, receptor editing and the development of a self-tolerant antibody repertoire. Front. Immunol. 9:2249)。全ての可能な組み換えが底をつくまで、κ鎖座位の連続再配列の過程は継続し得る。次いで、第二のκ染色体で組み換えが進む。複数回再配列後、第二染色体で生産的再配列を産生できなければ、λ座位での再配列が続く(Collins and Watson (2018) Immunoglobulin light chain gene rearrangements, receptor editing and the development of a self-tolerant antibody repertoire. Front. Immunol. 9:2249)。
軽鎖再配列のこの優先順は、マウスで＞９０％κおよび＜１０％λである軽鎖レパートリーを生じると考えられる。しかしながら、イヌ免疫系における免疫グロブリンは、λ軽鎖使用に偏っており、少なくとも９０％λ対＜１０％κと推定されている(Arun et al. (1996) Immunohistochemical examination of light-chain expression (λ/κ ratio) in canine, feline, equine, bovine and porcine plasma cells. Zentralbl Veterinarmed A. 43(9):573-6)。
マウスおよびイヌＩＧ座位は、それらが含む多くの特性およびコード領域がＶ(Ｄ)Ｊ再配列によりどのように多様化されるかが高度に複雑である；しかしながら、この複雑さは、各可変領域遺伝子セグメントの構造の基本的な詳細にまで及ばない。Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントは、組成および構成が高度に均一である。例えば、Ｖ遺伝子セグメントは、免疫グロブリン座位において本質的に不変の逐次形態で配置される次の特性を有する：短転写プロモーター領域(＜６００bp長)、５’ＵＴＲおよび抗体鎖のシグナルペプチドの大部分をコードするエクソン；イントロン；抗体鎖のシグナルペプチドの小部分および抗体可変ドメインの大部分をコードするエクソンおよびＶ(Ｄ)Ｊ再配列に必要な３’組み換えシグナル配列。同様に、Ｄ遺伝子セグメントは、次の必要かつ不変の特性を有する：５’組み換えシグナル配列、コード領域および３’組み換えシグナル配列。Ｊ遺伝子セグメントは、次の必要かつ不変の特性を有する：５’組み換えシグナル配列、コード領域および３’スプライスドナー配列。
イヌゲノムＶＨ領域は、イヌ染色体８の１.４６Mb領域にマッピングされた約３９個の機能的ＶＨ、６個の機能的Ｄおよび５個の機能的ＪＨ遺伝子セグメントを含む。ＲＳＳで非カノニカル７量体であるため非機能的と考えられる、多数のＶＨシュード遺伝子および１個のＪＨ遺伝子セグメント(ＩＧＨＪ１)および１個のＤ遺伝子セグメント(ＩＧＨＤ５)がある。(このような遺伝子セグメントは、オープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)と称される)。図１２Ａは、内因性イヌＩＧＨ座位(１２０１)の模式図およびＩＧＨＣ領域(１２０２)の拡大図を提供する。ＶＨ(１２０３)、Ｄ(１２０４)およびＪＨ(１２０５)遺伝子セグメントを含むイヌ免疫グロブリン重鎖可変領域座位は、全て、定常領域遺伝子(１２０６)と同じ転写方向の機能的遺伝子を有し、２個のシュード遺伝子(ＩＧＨＶ３－４およびＩＧＨＶ１－４－１)は逆の転写方向である(示していない)。転写エンハンサー(１２０７)および(１２０８)μスイッチ領域は、ＪＨ－Ｃμイントロン内に位置する。Martin et al. (2018) Comprehensive annotation and evolutionary insights into the canine (Canis lupus familiaris) antigen receptor loci. Immunogenetics. 70:223-236参照。ＩＧＨＣ遺伝子のうち、Ｃδ(１２１０)は非機能的であると考えられる。さらに、イヌＩＧＧ１(１２１２)、ＩｇＧ２(１２１３)、ＩｇＧ３(１２１１)およびＩｇＧ４(１２１４)をコードするとして同定されたｃＤＮＡクローンは単離されているが(Tang, et al. (2001) Cloning and characterization of cDNAs encoding four different canine immunoglobulin γ chains. Vet. Immunol. and Immunopath. 80:259 PMID 11457479)、ＩｇＧ２定常領域遺伝子のみが染色体８のイヌＩＧＨＣ座位に物理的にマッピングされている。Ｃμ(１２０９)、Ｃε(１２１５)およびＣα(１２１６)の機能的バージョンも、そこで物理的にマッピングされている。
イヌＩＧＨＣの配列は表４に示される。
イヌＩＧＬ座位はイヌ染色体２６にマッピングされているが、イヌＩＧＫコード領域は、イヌ染色体１７にマッピングされる。図１２Ｂおよび１２Ｃは、それぞれ、内因性イヌＩＧＬおよびＩＧＫ座位の模式図を提供する。
イヌＩＧＫＣおよびＩＧＬＣの配列は表４に示される。
イヌλ座位(１２１７)は大きく(２.６Mbp)、１６２個のＶλ遺伝子(１２１８)があり、その中で少なくとも７６個は機能的である。イヌλ座位は９個のタンデムカセットまたはＪ－Ｃ単位も含み、各Ｊλ遺伝子セグメントおよびＣλエクソン(１２１９)を含む。Martin et al. (2018) Comprehensive annotation and evolutionary insights into the canine (Canis lupus familiaris) antigen receptor loci. Immunogenetics. 70:223-236参照。
イヌκ座位(１２２０)は小さく(４００Kbp)、機能的Ｖκ遺伝子セグメントの８個がＪκ(１２２３)遺伝子セグメントおよびＣκ(１２２４)エクソンの上流(１２２２)に位置し、５個が下流(１２２６)に位置する点で、異常な構造を有する。イヌ上流Ｖκ領域は、Ｊκ遺伝子セグメントおよびＣκエクソンと同じ転写方向の全機能的遺伝子セグメントを有し、逆の転写方向の２個のシュード遺伝子(ＩＧＫＶ３－３およびＩＧＫＶ７－２)および１個のＯＲＦ(ＩＧＫＶ４－１)がある(示していない)。イヌ下流Ｖκ領域は、Ｊκ遺伝子セグメントおよびＣκエクソンと逆の転写方向の全機能的遺伝子セグメントを有し、６個のシュード遺伝子を含む。リボース５－ホスフェートイソメラーゼＡ(ＲＰＩＡ)遺伝子(１２２５)も、下流Ｖκ領域、ＣκとＩＧＫＶ２Ｓ１９の間に見られる。Martin et al. (2018) Comprehensive annotation and evolutionary insights into the canine (Canis lupus familiaris) antigen receptor loci. Immunogenetics. 70:223-236参照。
マウス免疫グロブリンκ座位は染色体６に位置する。図１Ｂは、内因性マウスＩＧＫ座位の模式図を提供する。ＩＧＫ座位(１１２)は３３００Kbpに及び、５個の連結(Ｊκ)遺伝子セグメント(１１４)および１個の定常(Ｃκ)遺伝子(１１５)の上流に位置する、１００個を超える可変Ｖκ遺伝子セグメント(１１３)を含む。マウスκ座位は、ＪκとＣκの間に位置するイントロンエンハンサー(ｉＥκ、１１６)を含み、これはκ再配列を活性化し、λよりκのより早期かつより効率的再配列の維持を助ける(Inlay et al. (2004) Important Roles for E Protein Binding Sites within the Immunoglobulin κ chain intronic enhancer in activating VκJκ rearrangement. J. Exp. Med. 200(9):1205-1211)。他のエンハンサー、３’エンハンサー(３’Ｅκ、１１７)はＣκエクソンの９.１Kb下流に位置し、またκ再配列および転写に関与する；ｉＥκおよび３’Ｅκ両者を欠く変異体マウスは、κ座位でＶκＪκ再配列がない(Inlay et al. (2002) Essential roles of the kappa light chain intronic enhancer and 3' enhancer in kappa rearrangement and demethylation. Nature Immunol. 3(5):463-468)。しかしながら、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子の挿入によるｉＥκの破壊も大部分のＶκＪκ再配列を無効にするのに十分である(Xu et al. (1996) Deletion of the Igκ Light Chain Intronic Enhancer/Matrix Attachment Region Impairs but Does Not Abolish VκJκ Rearrangement)。
マウス免疫グロブリンλ座位は、染色体１６に位置する。図１Ｃは、内因性マウスＩＧＬ座位(１１８)の模式図を提供する。マウス免疫グロブリンλ座位の構成は、マウス免疫グロブリンκ座位と異なる。座位は２４０kbに及び、３個の機能的可変(Ｖλ)遺伝子セグメント(ＩＧＬＶ２、１１９；ＩＧＬＶ３、１２０およびＩＧＬＶ１、１２３)およびλ連結(Ｊλ)遺伝子セグメントおよび定常(Ｃλ)遺伝子セグメントの３個のタンデムカセット(ＩＧＬＪ２、１２１；ＩＧＬＣ２、１２２；ＩＧＬＪ３、１２４：ＩＧＬＣ３、１２５；ＩＧＬＪ１、１２６；ＩＧＬＣ１、１２７)を含む２個のクラスターがあり、ここで、Ｖλ遺伝子セグメントは、種々の数のＪ－Ｃタンデムカセットの上流(５’)に位置する。座位はまた３個の転写エンハンサー(Ｅλ２～４、１２８；Ｅλ、１２９；Ｅλ３～１、１３０)を含む。
部分的にイヌの核酸配列は、トランスジェニック動物が、宿主における効率的抗体産生および抗原認識を促進することを助ける宿主ゲノム(例えば、齧歯類)の介在配列内に見られ得る制御配列および他の要素を保持しながら、イヌＶＨまたはＶＬ領域を含む重鎖または軽鎖レパートリーを産生することを可能とする。
ある態様において、合成または組み換えにより産生された、部分的にイヌの核酸は、イヌコード配列および免疫グロブリンＶＨ、ＶλまたはＶκ座位、または、ある態様において、これらの組み合わせからの非イヌ非コード制御配列または足場配列の両方を含むように操作される。
ある態様において、イヌ可変領域を有する免疫グロブリンを発現するトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞は、１以上のイヌＶＨ遺伝子セグメントコード配列を、齧歯類重鎖免疫グロブリン座位のＶＨ座位に挿入することにより産生され得る。他の態様において、イヌ可変領域を有する免疫グロブリンを発現するトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞は、１以上のイヌＶＬ遺伝子セグメントコード配列を、齧歯類軽鎖免疫グロブリン座位のＶＬ座位に挿入することにより産生され得る。
２個の軽鎖座位 － κおよびλ － の存在は、齧歯類Ｖλ座位への１以上のイヌＶλまたはＪλ遺伝子セグメントコード配列の挿入、齧歯類Ｖκ座位への１以上のイヌＶκまたはＪκ遺伝子セグメントコード配列の挿入、齧歯類Ｖκ座位への１以上のイヌＶλまたはＪλ遺伝子セグメントコード配列の挿入および齧歯類Ｖλ座位への１以上のイヌＶκまたはＪκ遺伝子セグメントコード配列の挿入を含むが、これらに限定されない多様な軽鎖挿入組み合わせが、イヌ可変領域を有する免疫グロブリンを発現するトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞の産生に可能であることを意味する。
マウスにより産生される軽鎖の９０％超がκであり、１０％未満がλであるのに対し、イヌにより産生される軽鎖の９０％超がλであり、１０％未満がκであるとの事実およびイヌ免疫グロブリンλ座位は大きく、１００個を超えるＶλ遺伝子セグメントを含むのに対し、マウス免疫グロブリンλはわずか３個の機能的Ｖλ遺伝子セグメントを含むとの事実により、部分的にイヌの免疫グロブリンを発現するトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞の選択および開発は複雑である。
マウスは主にκＬＣ含有抗体を産生するため、トランスジェニック齧歯類によるλＬＣ含有部分的にイヌの免疫グロブリンの産生を増加させる一つの合理的な方法は、齧歯類κ座位への１以上のイヌＶλまたはＪλ遺伝子セグメントコード配列の挿入である。しかしながら、下記実施例９に示すとおり、イヌＶλ領域エクソンと齧歯類Ｃκ領域エクソンのカップリングで、インビトロでもたらされる部分的にイヌの免疫グロブリンの発現は最適とはいえない。
イヌ可変ドメインを含む免疫グロブリンを発現できるトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞が提供され、ここで、該トランスジェニック齧歯類は、κ軽鎖を含む免疫グロブリンよりもλ軽鎖を含む免疫グロブリンを多く産生するまたは産生する可能性が高い。理論に拘束されることを望まないが、λ軽鎖を含む免疫グロブリンを多く産生するまたは産生する可能性が高いトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞は、治療剤開発のためのより完全な抗体レパートリーをもたらすと考えられる。
部分的にイヌの免疫グロブリン軽鎖座位を含むゲノムを有する、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞が、ここで提供される。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン軽鎖座位は、イヌ免疫グロブリンλ軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む。ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、イヌ可変ドメインを含む免疫グロブリンを発現できる。ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、イヌλ可変ドメインを含む免疫グロブリンを発現できる。ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、イヌκ可変ドメインを含む免疫グロブリンを発現できる。ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、イヌ可変ドメインおよび齧歯類定常ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、イヌλ可変ドメインおよび齧歯類λ定常ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、イヌκ可変ドメインおよび齧歯類κ定常ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。
ある態様において、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞は、κ軽鎖を含む免疫グロブリンよりλ軽鎖を含む免疫グロブリンを多く産生するまたは産生する可能性が高い。ある態様において、トランスジェニック齧歯類が提供され、ここで、κ軽鎖産生細胞よりも多くのλ軽鎖産生細胞が該齧歯類から単離される可能性が高い。ある態様において、λ軽鎖を含む免疫グロブリンを少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％および最大約１００％産生する、トランスジェニック齧歯類が提供される。ある態様において、κ軽鎖を有する免疫グロブリンよりもλ軽鎖を有する免疫グロブリンを産生する可能性が高いトランスジェニック齧歯類細胞またはその子孫が提供される。ある態様において、トランスジェニック齧歯類細胞またはその子孫は、λ軽鎖を含む免疫グロブリンを産生する確率が少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％および最大約１００％である。ある態様において、内因性齧歯類軽鎖免疫グロブリン座位が欠失されかつ操作された部分的にイヌの軽鎖免疫グロブリン座位で置き換えられている、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞が提供される。ある態様において、トランスジェニック齧歯類はマウスである。
免疫グロブリン軽鎖座位
ある態様において、組み換えにより産生された部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域座位を含むゲノムを有する、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞が提供される。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域座位は軽鎖可変領域(ＶＬ)座位である。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域座位は、１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列または１以上のイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列を含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域座位は、１以上のイヌＶκ遺伝子セグメントコード配列または１以上のイヌＪκ遺伝子セグメントコード配列を含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域座位は、１以上の齧歯類定常ドメイン遺伝子またはコード配列を含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域座位は、１以上の齧歯類Ｃλ遺伝子またはコード配列を含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域座位は、１以上の齧歯類Ｃκ遺伝子またはコード配列を含む。ある態様において、内因性齧歯類軽鎖免疫グロブリン座位は不活性化されている。ある態様において、内因性齧歯類軽鎖免疫グロブリン座位は欠失されかつ操作された部分的にイヌの軽鎖免疫グロブリン座位で置き換えられている。
ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、イヌλ可変ドメインおよび齧歯類λ定常ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、イヌκ可変ドメインおよび齧歯類κ定常ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。
ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域座位は、イヌゲノムからのＶλ遺伝子セグメントコード配列の大部分または全てを含むＶＬ座位を含む。ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位可変領域は、少なくとも２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個および最大７６個のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列を含むＶＬ座位を含む。ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域座位は、イヌゲノムからのＶλ遺伝子セグメントコード配列を少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および最大１００％含む、ＶＬ座位を含む。
ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位可変領域は、イヌゲノムに見られるＪλ遺伝子セグメントコード配列の大部分または全てを含むＶＬ座位を含む。ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位可変領域は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個のイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列を含むＶＬ座位を含む。ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域座位は、イヌゲノムに見られるＪλ遺伝子セグメントコード配列を少なくとも約５０％、７５％および最大１００％含むＶＬ座位を含む。
ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位可変領域は、イヌゲノムからのＶλおよびＪλ遺伝子セグメントコード配列の大部分または全てを含むＶＬ座位を含む。ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域座位は、イヌゲノムからのＶλおよびＪλ遺伝子セグメントコード配列を少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および最大１００％含むＶＬ座位を含む。
ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位可変領域は、イヌゲノムからのＶκ遺伝子セグメントコード配列の全ての大部分または全てを含むＶＬ座位を含む。ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位可変領域は、少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個および最大１４個のイヌＶκ遺伝子セグメントコード配列を含むＶＬ座位を含む。ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域座位は、イヌゲノムからのＶκ遺伝子セグメントコード配列を少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および最大１００％含むＶＬ座位を含む。
ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位可変領域は、イヌゲノムに見られるＪκ遺伝子セグメントコード配列の大部分または全てを含むＶＬ座位を含む。ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位可変領域は、少なくとも１個、２個、３個、４個または５個のイヌＪκ遺伝子セグメントコード配列を含むＶＬ座位を含む。ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域座位は、イヌゲノムに見られるＪκ遺伝子セグメントコード配列を少なくとも約５０％、７５％および最大１００％含むＶＬ座位を含む。
ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位可変領域は、イヌゲノムからのＶκおよびＪκ遺伝子セグメントコード配列の大部分または全てを含むＶＬ座位を含む。ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域座位は、イヌゲノムからのＶκおよびＪκ遺伝子セグメントコード配列を少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および最大１００％含むＶＬ座位を含む。
ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、イヌＶＬ遺伝子セグメントコード配列および齧歯類免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座位からの齧歯類非コード制御配列または足場配列を含む。ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、イヌＶλまたはＪλ遺伝子セグメントコード配列および齧歯類免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座位からの齧歯類非コード制御配列または足場配列を含む。ある態様において、齧歯類非コード制御配列または足場配列は、齧歯類免疫グロブリンλ軽鎖可変領域遺伝子座位からである。ある態様において、齧歯類非コード制御配列または足場配列は、齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖可変領域座位からである。ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、イヌＶλおよびＪλ遺伝子セグメントコード配列ならびに齧歯類免疫グロブリンλ軽鎖可変領域遺伝子座位からの齧歯類非コード制御配列または足場配列を含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、１以上の齧歯類免疫グロブリンλ定常領域(Ｃλ)コード配列を含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、１以上のイヌＶλおよびＪλ遺伝子セグメントコード配列ならびに１以上の齧歯類免疫グロブリンＣλコード配列を含む。ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、齧歯類免疫グロブリンλ軽鎖可変領域遺伝子座位の齧歯類非コード制御配列または足場配列に包埋されたイヌＶλおよびＪλ遺伝子セグメントコード配列ならびに１以上の齧歯類Ｃλコード配列を含む。
ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、イヌＶλまたはＪλ遺伝子セグメントコード配列および齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖可変領域遺伝子座位からの齧歯類非コード制御配列または足場配列を含む。ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖可変領域遺伝子座位の齧歯類非コード制御配列または足場配列に包埋されたイヌＶλまたはＪλ遺伝子セグメントコード配列を含む。ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、イヌＶλおよびＪλ遺伝子セグメントコード配列ならびに１以上の齧歯類免疫グロブリンＣλコード配列および齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖可変領域遺伝子座位からの齧歯類非コード制御配列または足場配列を含む。ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖可変領域遺伝子座位の齧歯類非コード制御配列または足場配列に包埋されたイヌＶλおよびＪλ遺伝子セグメントコード配列ならびに１以上の齧歯類免疫グロブリンＣλコード配列を含む。
ある態様において、１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列は、１以上の齧歯類Ｃλ遺伝子の上流に位置する１以上のＪλ遺伝子セグメントコード配列の上流に位置する。ある態様において、１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列は、１以上の齧歯類ラムダＣλ遺伝子の上流に位置する１以上のＪλ遺伝子セグメントコード配列の上流にかつ同じ転写方向で位置する。
ある態様において、操作された免疫グロブリン可変領域座位は、１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列、１以上のイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列および１以上の齧歯類Ｃλ遺伝子を含む。ある態様において、操作された免疫グロブリン可変領域座位は、１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列、１以上のイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列および１以上の齧歯類Ｃλ領域遺伝子を含み、ここで、ＶλおよびＪλ遺伝子セグメントコード配列ならびに齧歯類Ｃλ領域遺伝子が齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖座位に挿入される。ある態様において、操作された免疫グロブリン可変領域座位は、１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列、１以上のイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列および１以上の齧歯類Ｃλ遺伝子を含み、ここで、ＶλおよびＪλ遺伝子セグメントコード配列ならびに齧歯類(Ｃλ)領域遺伝子は、齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖座位の非コード制御配列または足場配列に包埋される。
ある態様において、１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列は、１以上の齧歯類Ｃλ遺伝子の上流に位置する１以上のＪλ遺伝子セグメントコード配列の上流に位置し、ここで、ＶλおよびＪλ遺伝子セグメントコード配列ならびに齧歯類Ｃλ遺伝子が齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖座位に挿入される。ある態様において、１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列は、１以上の齧歯類Ｃλ遺伝子の上流に位置する１以上のＪλ遺伝子セグメントコード配列の上流に位置し、ここで、ＶλおよびＪλ遺伝子セグメントコード配列ならびに齧歯類Ｃλ遺伝子は、齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖座位の非コード制御配列または足場配列に包埋される。
ある態様において、齧歯類Ｃλコード配列は、齧歯類Ｃλ１、Ｃλ２またはＣλ３コード配列から選択される。
ある態様において、操作された免疫グロブリン座位が、１以上の齧歯類Ｖκ遺伝子セグメントコード配列および１以上の齧歯類Ｊκ遺伝子セグメントコード配列が欠失されかつそれぞれ１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列および１以上のＪλ遺伝子セグメントコード配列に置き換えられており、該座位における齧歯類Ｃκコード配列が齧歯類Ｃλ１、Ｃλ２またはＣλ３コード配列に置き換えられている、齧歯類免疫グロブリンκ座位を含む、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞が提供される。
ある態様において、操作された免疫グロブリン可変領域座位は、１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列および１以上のＪ－Ｃ単位を含み、ここで、各Ｊ－Ｃ単位はイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列および齧歯類Ｃλ遺伝子を含む。ある態様において、操作された免疫グロブリン可変領域座位は、１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列および１以上のＪ－Ｃ単位を含み、ここで、各Ｊ－Ｃ単位はイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列および齧歯類Ｃλ領域コード配列を含み、ここで、Ｖλ遺伝子セグメントコード配列およびＪ－Ｃ単位が齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖座位に挿入される。ある態様において、操作された免疫グロブリン可変領域座位は、１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列および１以上のＪ－Ｃ単位を含み、ここで、各Ｊ－Ｃ単位はイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列および齧歯類Ｃλコード配列を含み、ここで、Ｖλ遺伝子セグメントコード配列およびＪ－Ｃ単位は、齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖座位の非コード制御配列または足場配列に包埋される。
ある態様において、１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列は、１以上のＪ－Ｃ単位の上流にかつ同じ転写方向で位置し、ここで、各Ｊ－Ｃ単位はイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列および齧歯類Ｃλ遺伝子を含む。ある態様において、１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列は、１以上のＪ－Ｃ単位の上流にかつ同じ転写方向で位置し、ここで、各Ｊ－Ｃ単位はイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列および齧歯類Ｃλコード配列を含む。ある態様において、操作された免疫グロブリン可変領域座位は、１以上のＪ－Ｃ単位の上流に位置する１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列を含み、ここで、各Ｊ－Ｃ単位はイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列および齧歯類Ｃλコード配列を含み、ここで、Ｖλ遺伝子セグメントコード配列およびＪ－Ｃ単位が齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖座位に挿入される。ある態様において、操作された免疫グロブリン可変領域座位は、１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列を、１以上のＪ－Ｃ単位の上流にかつ同じ転写方向で含み、ここで、各Ｊ－Ｃ単位はイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列および齧歯類Ｃλコード配列を含み、ここで、Ｖλ遺伝子セグメントコード配列およびＪ－Ｃ単位は、齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖座位の非コード制御配列または足場配列に包埋される。ある態様において、齧歯類Ｃλコード配列は、齧歯類Ｃλ１、Ｃλ２またはＣλ３コード配列から選択される。
ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、イヌＶκコード配列および齧歯類免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座位からの齧歯類非コード制御配列または足場配列を含む。ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、イヌＶκまたはＪκ遺伝子セグメントコード配列および齧歯類免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座位からの齧歯類非コード制御配列または足場配列を含む。ある態様において、齧歯類非コード制御配列または足場配列は、齧歯類免疫グロブリンλ軽鎖可変領域遺伝子座位からである。ある態様において、齧歯類非コード制御配列または足場配列は、齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖可変領域座位からである。ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、イヌＶκおよびＪκ遺伝子セグメントコード配列および齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖可変領域遺伝子座位からの齧歯類非コード制御配列または足場配列を含む。ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、イヌＶκおよびＪκ遺伝子セグメントコード配列および齧歯類免疫グロブリンλ軽鎖可変領域遺伝子座位からの齧歯類非コード制御配列または足場配列を含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、１個の齧歯類免疫グロブリンＣκコード配列を含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、１以上の齧歯類免疫グロブリンＣλコード配列を含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、１以上のイヌＶκおよびＪκ遺伝子セグメントコード配列および１個の齧歯類免疫グロブリンＣκコード配列を含む。ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、齧歯類κ軽鎖可変領域遺伝子座位の齧歯類非コード制御配列または足場配列に包埋されたイヌＶκおよびＪκ遺伝子セグメントコード配列および１個の齧歯類免疫グロブリンＣκコード配列を含む。ある態様において、操作された免疫グロブリン座位は、齧歯類免疫グロブリンλ軽鎖可変領域遺伝子座位の齧歯類非コード制御配列または足場配列に包埋されたイヌＶκおよびＪκ遺伝子セグメントコード配列および１個の齧歯類免疫グロブリンＣκコード配列を含む。
理論に拘束されることを望まないが、内因性齧歯類κ軽鎖座位を不活性化または非機能的とすることにより、部分的にイヌの免疫グロブリン座位からのλ軽鎖免疫グロブリンの発現が増加し得ると考えられる。生殖系列においてκ軽鎖座位が不活性化されている、他の点で慣用のマウスにおいてこれが当てはまることが示されている(Zon, et al. (1995) Subtle differences in antibody responses and hypermutation of λ light chains in mice with a disrupted κ constant region. Eur. J. Immunol. 25:2154-2162)。ある態様において、内因性齧歯類κ軽鎖座位を不活性化または非機能的とすることは、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞により産生されるκ軽鎖を含む免疫グロブリンの量に対するλ軽鎖を含む免疫グロブリンの相対量を増加させ得る。
ある態様において、内因性齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖座位が欠失、不活性化または非機能的とされたトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞が提供される。ある態様において、内因性齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖座位は、次の全内因性齧歯類Ｖκ遺伝子セグメントコード配列の欠失または変異；全内因性齧歯類Ｊκ遺伝子セグメントコード配列の欠失または変異；内因性齧歯類Ｃκコード配列の欠失または変異；内因性イントロンκエンハンサー(ｉＥκ)および３’エンハンサー配列(３’Ｅκ)の欠失、変異または破壊；またはこれらの組み合わせの１以上により、不活性化または非機能的とされる。
ある態様において、内因性齧歯類免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインが欠失、不活性化または非機能的とされたトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞が提供される。ある態様において、内因性齧歯類免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインは、次の全内因性齧歯類Ｖκ遺伝子セグメントの欠失または変異；全内因性齧歯類Ｊλ遺伝子セグメントの欠失または変異；全内因性齧歯類Ｃλコード配列の欠失または変異；またはこれらの組み合わせの１以上により、不活性化または非機能的とされる。
ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、エンハンサー、プロモーター、スプライス部位、イントロン、組み換えシグナル配列およびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない齧歯類制御または足場配列を含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、齧歯類λ制御または足場配列を含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、齧歯類κ制御または足場配列を含む。
ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、遺伝子発現を駆動するためのプロモーターを含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、κＶ領域プロモーターを含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、λＶ領域プロモーターを含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、ＶλからＪλ遺伝子セグメント再配列後に作られた１以上のλＬＣ遺伝子コード配列の発現を駆動するためのλＶ領域プロモーターを含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、ＶκからＪκ遺伝子セグメント再配列後に作られた１以上のκＬＣ遺伝子コード配列の発現を駆動するためのλＶ領域プロモーターを含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、ＶλからＪλ遺伝子セグメント再配列後に作られた１以上のλＬＣ遺伝子コード配列を駆動するためのκＶ領域プロモーターを含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、ＶκからＪκ遺伝子セグメント再配列後に作られた１以上のκＬＣ遺伝子コード配列の発現を駆動するためのκＶ領域プロモーターを含む。
ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、１以上のエンハンサーを含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、マウスκｉＥκまたは３’Ｅκエンハンサーを含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、１以上のＶλまたはＪλ遺伝子セグメントコード配列およびマウスκｉＥκまたは３’Ｅκエンハンサーを含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、１以上のＶκまたはＪκ遺伝子セグメントコード配列およびκｉＥκまたは３’Ｅκエンハンサーを含む。
免疫グロブリン重鎖座位
ある態様において、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞は、組み換えにより産生した部分的にイヌの免疫グロブリン重鎖可変領域(ＶＨ)座位を含むゲノムを有する。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域座位は、１以上のイヌＶＨ、ＤまたはＪＨ遺伝子セグメントコード配列を含む。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン重鎖可変領域座位は、１以上の齧歯類定常ドメイン(ＣＨ)遺伝子またはコード配列を含む。ある態様において、内因性齧歯類重鎖免疫グロブリン座位は不活性化されている。ある態様において、内因性齧歯類重鎖免疫グロブリン座位は欠失されかつ操作された部分的にイヌの重鎖免疫グロブリン座位で置き換えられている。
ある態様において、合成Ｈ鎖ＤＮＡセグメントは、雄妊孕性に必要なＡＤＡＭ６ＡまたはＡＤＡＭ６Ｂ遺伝子、Ｉｇｈ座位収縮に関与するＰａｘ－５－活性化遺伝子間反復(ＰＡＩＲ)要素および正常ＶＤＪ再配列制御に関与する重鎖遺伝子間調節領域１からのＣＴＣＦ結合部位((Proudhon, et al., Adv. Immunol., 128:123-182 (2015))またはそれらの種々の組み合わせを含む。マウスＩＧＨ座位におけるこれら内因性非コード制御および足場配列の位置は図１に記載され、それは、左から右に約１００個の機能的重鎖可変領域遺伝子セグメント(１０１)；ＶＤＪ組み換えのためのＩＧＨ座位収縮に関与するＰａｘ－５活性化遺伝子間反復であるＰＡＩＲ(１０２)；雄性稔性に必要なディスインテグリンおよびメタロペプチダーゼドメイン６Ａ遺伝子であるＡＤＡＭ６ＡまたはＡＤＡＭ６Ｂ(１０３)；最遠位ＤＨ遺伝子セグメント、ＩＧＨＤ－５ Ｄの２１６０９bpフラグメント上流のＰｒｅ－Ｄ領域(１０４)；ＶＨ遺伝子セグメント使用を制御するためのＣＴＣＦインスレーター位置を含む遺伝子間制御領域１(ＩＧＣＲ１)(１０６)；多様性遺伝子セグメントであるＤ(マウス系統に依存して１０～１５)(１０５)；４連結ＪＨ遺伝子セグメント(１０７)；ＶＤＪ組み換えに関与するイントロンエンハンサーであるＥμ(１０８)；アイソタイプスイッチングのμスイッチ領域であるＳμ(１０９)；８重鎖定常領域遺伝子：Ｃμ、Ｃδ、Ｃγ３、Ｃγ１、Ｃγ２ｂ、Ｃ２γａ／ｃ、ＣεおよびＣα(１１０)；アイソタイプスイッチングおよび体細胞超変異を制御する３’制御領域(３’ＲＲ)(１１１)を記載する。図１Ａは、Proudhon, et al., Adv. Immunol., 128:123-182 (2015)から得た図を修飾して得た。
ある態様において、哺乳動物宿主細胞に統合される操作された部分的にイヌの領域は、既知イヌＶＨ遺伝子セグメントの全てまたは相当数を含む。ある場合、しかしながら、このようなＶＨ遺伝子セグメントのサブセットを使用することが望ましい可能性があり、特定の場合には、わずか１個のイヌＶＨコード配列を細胞または動物に導入し得る。
ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位可変領域は、イヌゲノムからのＶＨ遺伝子セグメントコード配列の大部分または全てを含むＶＨ座位を含む。ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位可変領域は、少なくとも２０個、３０個および最大３９個の機能的イヌＶＨ遺伝子セグメントコード配列を含むＶＨ座位を含む。ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域座位は、イヌゲノムからのＶＨ遺伝子セグメントコード配列を少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および最大１００％含むＶＨ座位を含む。
ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位可変領域は、イヌゲノムからのＶＨ遺伝子セグメントコード配列の大部分または全てを含むＶＨ座位を含む。ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位可変領域は、少なくとも２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個および最大８０個のイヌＶＨ遺伝子セグメントコード配列を含むＶＨ座位を含む。この態様において、ＶＨ遺伝子セグメントシュード遺伝子は、例えば、当分野で周知の方法を使用して、フレーム内停止コドンを機能的コドンに変異することにより、機能性を回復するよう復帰させる。ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域座位は、イヌゲノムからのＶＨ遺伝子セグメントコード配列を少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および最大１００％含むＶＨ座位を含む。
ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位可変領域は、イヌゲノムに見られるＤ遺伝子セグメントコード配列の大部分または全てを含むＶＨ座位を含む。ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位可変領域は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個および最大６個のイヌＤ遺伝子セグメントコード配列を含むＶＨ座位を含む。ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域座位は、イヌゲノムに見られるＤ遺伝子セグメントコード配列を少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および最大１００％含むＶＨ座位を含む。
ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位可変領域は、イヌゲノムに見られるＪＨ遺伝子セグメントコード配列の大部分または全てを含むＶＨ座位を含む。ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位可変領域は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個および最大６個のイヌＪＨ遺伝子セグメントコード配列を含むＶＨ座位を含む。ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域座位は、イヌゲノムに見られるＪＨ遺伝子セグメントコード配列を少なくとも約５０％、７５％および最大１００％含むＶＨ座位を含む。
ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位可変領域は、イヌゲノムからのＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメントコード配列の大部分または全てを含むＶＨ座位を含む。ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域座位は、イヌゲノムからのＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメントコード配列を少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および最大１００％含むＶＨ座位を含む。
ある態様において、イヌ免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子コード配列および齧歯類免疫グロブリン重鎖座位の非コード制御配列または足場配列を含むイヌの免疫グロブリン重鎖座位を含む、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞が提供される。ある態様において、操作されたイヌ免疫グロブリン重鎖座位は、イヌＶＨ、ＤまたはＪＨ遺伝子セグメントコード配列を含む。ある態様において、操作されたイヌ免疫グロブリン重鎖座位は、齧歯類免疫グロブリン重鎖座位の非コード制御配列または足場配列に包埋されたイヌＶＨ、ＤまたはＪＨ遺伝子セグメントコード配列を含む。
ある態様において、イヌＶＨ、イヌＤおよびイヌＪＨ遺伝子のコード配列を含み、さらに非イヌ哺乳動物宿主の内因性ＩＧＨ座位に基づくｐｒｅ－Ｄ配列を含む非コード制御および足場配列を含む、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位を含む非イヌ哺乳動物および哺乳動物細胞が提供される。ある態様において、外的に導入され、操作された部分的にイヌの領域は、完全に組み換えられたＶ(Ｄ)Ｊエクソンを含み得る。
ある態様において、トランスジェニック非イヌ哺乳動物は、複数イヌＶＨ、イヌＤおよびイヌＪＨ遺伝子のコドンと、齧歯類における介在(非コード制御または足場)配列に基づき、ｐｒｅ－Ｄ領域を含む介在配列を含む、外的に導入され、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位を含む、齧歯類、例えば、マウスである。ある態様において、トランスジェニック齧歯類は、それぞれイヌＶκまたはＶλ遺伝子およびＪκまたはＪλ遺伝子のコード配列を、齧歯類のＩＧＬ座位に存在する免疫グロブリン介在配列に対応する介在(非コード制御または足場)配列と共に含む、部分的にイヌのＩＧＬ座位をさらに含む。
例示的実施態様において、実施例部分にさらに詳述するとおり、マウスゲノムの内因性ＶＨ免疫グロブリン座位全体が欠失され、続いてマウスゲノムのＪ５５８ ＶＨ座位の非コード配列に対応する散在非コード配列を含む３９個のイヌＶＨ遺伝子セグメントを含む部分的にイヌの免疫グロブリン座位と置き換えられる。完全な、外的に導入され、操作された免疫グロブリン座位は、イヌＤおよびＪＨ遺伝子セグメントならびにマウスｐｒｅ－Ｄ領域をさらに含む。故に、イヌＶＨ、ＤおよびＪＨコドン配列は、齧歯類遺伝子間およびイントロン配列に包埋される。
部分的にイヌの免疫グロブリン座位の調製
ある態様において、ＶＨ、ＤおよびＪＨまたはＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントを含む、齧歯類、例えばラットまたはマウスなどの非イヌ哺乳動物の内因性免疫グロブリン座位可変領域が部位特異的リコンビナーゼを使用して欠失され、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位に置き換えられる。ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、単一核酸またはカセットとして、宿主動物ゲノムに挿入される。部分的にイヌの免疫グロブリン座位を含むカセットを使用して内因性免疫グロブリン座位可変領域を置き換えら得るため、イヌコード配列は、一挿入工程で宿主ゲノムに挿入され、故に、トランスジェニック動物を得る、迅速かつ直接的方法を提供する。
ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位可変領域は、マウス免疫グロブリン座位可変領域からマウスＶＨ、ＤおよびＪＨまたはＶＬおよびＪＬコード配列を欠失させ、マウスコード配列をイヌコード配列で置き換えることにより、調製される。ある態様において、制御配列および他の要素を含む、マウス免疫グロブリン座位の非コードフランキング配列は、無傷のままである。
ある態様において、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位のためのヌクレオチド配列はコンピュータで調製され、該座位は、遺伝子合成の既知技術を使用して、合成される。ある態様において、イヌ免疫グロブリン可変領域座位からのコード配列および宿主動物免疫グロブリン座位の配列は、ＢＬＡＳＴ(基本的な局所的アラインメント検索ツール)などの検索ツールを使用して、同定される。宿主免疫グロブリン座位のゲノム配列およびイヌ免疫グロブリン可変領域座位のコード配列を得た後、宿主コード配列を、コンピュータで既知コンピュータアプローチを使用してイヌコード配列と置き換えて、内因性宿主動物免疫グロブリンコード配列を位置決定し、欠失させ、内因性制御およびフランキング配列は無傷のまま、イヌコード配列のコード配列と置き換えることができる。
相同組み換え
ある態様において、ここに記載する細胞および動物を作るために、相同組み換えと部位特異的組み換えの組み合わせを使用する。ある実施態様において、相同性ターゲティングベクターを、まず内因性免疫グロブリン座位の所望の位置で、配列特異的組み換え位置を哺乳動物宿主細胞ゲノムに導入するために使用する。ある態様において、リコンビナーゼタンパク質非存在下、相同組み換えにより哺乳動物宿主細胞のゲノムに挿入された配列特異的組み換え位置は、哺乳動物宿主細胞の如何なる遺伝子の発現およびアミノ酸コドンにも影響しない。このアプローチは、組み換え位置の挿入後、所望の抗体を産生する免疫グロブリン遺伝子、および、所望により選択可能マーカー遺伝子などの何らかの付加的配列の適切な転写および翻訳を維持する。しかしながら、ある場合、抗体分子のアミノ酸配列が挿入により変えられるが、抗体が所望の目的のためになお十分な機能性を保持するように、リコンビナーゼ部位および他の配列を免疫グロブリン座位配列に挿入することが可能である。このようなコドン改変相同組み換えの例は、内因性座位から異なるアイソタイプが発現されるように、内因性座位への多型の導入および定常領域エクソンの変化を含み得る。ある態様において、免疫グロブリン座位は、このような挿入の１以上を含む。
ある態様において、相同性ターゲティングベクターを、内因性ゲノム内の特定の配列の置き換えならびに宿主細胞ゲノムへの特定の配列特異的組み換え位置および１以上の選択可能マーカー遺伝子の挿入に利用できる。ここで使用する選択可能マーカー遺伝子は、相同組み換えを受けていない個々の細胞とターゲティングベクターの無作為組込みを有する細胞の除去に利用できることは当業者には理解される。
相同組み換えの例示的方法は、各々引用によりその全体として本明細書に包含させる、米国特許６,６８９,６１０；６,２０４,０６１；５,６３１,１５３；５,６２７,０５９；５,４８７,９９２；および５,４６４,７６４に記載される。
部位／配列特異的組み換え
部位／配列特異的組み換えは、リコンビナーゼによる認識に必要である短特異的ＤＮＡ配列が、組み換えが生ずる唯一の部位である点で、一般的相同組み換えと異なる。特定のＤＮＡ鎖または染色体上のこれら部位の配向によって、これら特異的配列を認識する特殊化リコンビナーゼが、ｉ)ＤＮＡ切除またはii)ＤＮＡ反転または回転を触媒し得る。部位特異的組み換えは、これら位置が同じ染色体に存在しないならば、２個のＤＮＡ鎖間でも生じ得る。各々リコンビナーゼおよび特異的同族部位を含む多数のバクテリオファージおよび酵母由来部位特異的組み換え系が真核生物細胞で機能することが示されており、それゆえに、ここに記載する方法に関連した使用に適用でき、これらは、バクテリオファージＰ１ Ｃｒｅ／ｌｏｘ、酵母ＦＬＰ－ＦＲＴ系および部位特異的リコンビナーゼのチロシンファミリーのＤｒｅ系を含む。このような系および使用方法は、例えば、米国特許７,４２２,８８９；７,１１２,７１５；６,９５６,１４６；６,７７４,２７９；５,６７７,１７７；５,８８５,８３６；５,６５４,１８２；および４,９５９,３１７に記載され、各々、このようなリコンビナーゼの使用方法の教示を引用することにより、本明細書に包含させる。
バクテリオファージラムダインテグラーゼ、ＨＫ２０２２インテグラーゼなどの部位特異的リコンビナーゼのチロシンファミリーの他の系およびさらにバクテリオファージｐｈｉＣ３１、Ｒ４Ｔｐ９０１インテグラーゼなどのリコンビナーゼの別のセリンファミリーに属する系は、それらの各組み換え部位を使用して、哺乳動物細胞で機能することが知られ、また、ここに記載する方法における使用に適用可能である。
部位特異的組み換えが２個の異なるＤＮＡ鎖間で生じ得るため、部位特異的組み換え発生は、リコンビナーゼ介在カセット交換(ＲＭＣＥ)と呼ばれる過程により、外的座位を宿主細胞ゲノムに導入する機構として利用できる。ＲＭＣＥ過程は、負の選択と共に同じリコンビナーゼタンパク質に対する野生型および変異体配列特異的組み換え位置の組み合わせ使用により利用され得る。例えば、標的とすべき染色体座位は、一端で野生型ＬｏｘＰ位置および他端で変異体ＬｏｘＰ位置に隣接し得る。同様に、宿主細胞ゲノムに挿入すべき配列を含む外因性ベクターは、同様に、一端で野生型ＬｏｘＰ位置および他端で変異体ＬｏｘＰ位置が隣接し得る。この外因性ベクターがＣｒｅリコンビナーゼ存在下宿主細胞にトランスフェクトされるとき、Ｃｒｅリコンビナーゼは、各ＤＮＡ鎖の野生型ＬｏｘＰおよび変異体ＬｏｘＰ位置が互いに組み換えに不適合であるため、同じＤＮＡ鎖の切除反応ではなく、２個のＤＮＡ鎖間のＲＭＣＥを触媒する。故に、一方のＤＮＡ鎖のＬｏｘＰ位置は、他方のＤＮＡ鎖のＬｏｘＰ位置と組み換えられる；同様に、一方のＤＮＡ鎖の変異ＬｏｘＰ位置は、他方のＤＮＡ鎖の同様に変異されたＬｏｘＰ位置と組み換えられる。
ある態様において、ＲＭＣＥについて同じリコンビナーゼにより認識される、配列特異的組み換え位置のバリアントの組み合わせが使用される。このような配列特異的組み換え位置バリアントの例は、倒置反復の組み合わせを含むものまたは変異体スペーサー配列を有する組み換え位置を含むものを含む。例えば、安定なＣｒｅ－ｌｏｘＰ統合的組み換えの設計のために、２クラスのバリアントリコンビナーゼ位置が利用可能である。両者とも、８bpスペーサー領域または１３bp倒置反復内のＣｒｅ認識配列における配列変異を利用する。ｌｏｘ５１１(Hoess, et al., Nucleic Acids Res, 14:2287-2300 (1986))、ｌｏｘ５１７１およびｌｏｘ２２７２(Lee and Saito, Gene, 216:55-65 (1998))、ｍ２、ｍ３、ｍ７およびｍ１１(Langer, et al., Nucleic Acids Res, 30:3067-3077 (2002))などのスペーサー変異体は、それら自体、容易に組変わるが、野生型位置との組み換えの速度は有意に減少している。このクラスの変異体は、非相互作用Ｃｒｅ－Ｌｏｘ組み換え位置および非相互作用ＦＬＰ組み換え位置を使用するＲＭＣＥによるＤＮＡ挿入のために利用されている(Baer and Bode, Curr Opin Biotechnol, 12:473-480 (2001); Albert, et al., Plant J, 7:649-659 (1995); Seibler and Bode, Biochemistry, 36:1740-1747 (1997); Schlake and Bode, Biochemistry, 33:12746-12751 (1994))。
倒置反復変異体は、第二クラスのバリアントリコンビナーゼ位置を表す。例えば、ＬｏｘＰ位置は、左倒置反復(ＬＥ変異体)または右倒置反復(ＲＥ変異体)で改変塩基を含み得る。ＬＥ変異体、ｌｏｘ７１は、左倒置反復の５’末端に野生型配列からＴＡＣＣＧに変化した５bpを有する(Araki, et al, Nucleic Acids Res, 25:868-872 (1997))。同様に、ＲＥ変異体、ｌｏｘ６６は、ＣＧＧＴＡに変化した、最も３’の５塩基を有する。倒置反復変異体は、「ドナー」ＲＥ変異体が組み換わる「標的」染色体ｌｏｘＰ位置として指定されたＬＥ変異体を有する染色体ＤＮＡへのプラスミド挿入体の統合のために使用される。組み換え後、ｌｏｘＰ位置は挿入セグメントに隣接して、シスに位置する。組み換えの機構は、組み換え後１個のｌｏｘＰ位置が二重変異体(ＬＥおよびＲＥ倒置反復変異両者を含む)であり、他方が野生型であるようなものである(Lee and Sadowski, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 80:1-42 (2005); Lee and Sadowski, J Mol Biol, 326:397-412 (2003))。二重変異体は、Ｃｒｅリコンビナーゼにより認識されず、挿入セグメントが切除されないよう十分に野生型位置と異なる。
ある態様において、配列特異的組み換え位置は、コード核酸領域または制御配列とは逆に、イントロンに導入され得る。これにより、動物細胞のゲノムへの配列特異的組み換え位置の挿入により、適切な抗体発現に必要な何れかの制御配列またはコード領域が不注意に破壊されることが回避される。
配列特異的組み換え位置の導入は、慣用の相同組み換え技術により達成され得る。このような技術は、例えば、Sambrook and Russell (2001) (Molecular cloning: a laboratory manual 3rd ed. (Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press) and Nagy, A. (2003)(Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, 3rd ed. (Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Renault and Duchateau, Eds. (2013) (Site-directed insertion of transgenes. Topics in Current Genetics 23. Springer). Tsubouchi, H. Ed. (2011) (DNA recombination, Methods and Protocols. Humana Press)などの参考書に記載される。
ゲノムへの特異的組み換えは、当分野で知られるとおり、正または負の選択のためのベクター設計を使用して、促進され得る。置き換え反応を受けている細胞の同定を容易にするために、適切な遺伝子マーカーシステムを使用し、細胞を、例えば、選択組織培養培地の使用により選択することができる。しかしながら、ゲノム配列が、置換間隔の２末端またはそれに隣接する外来性核酸配列が実質的にないことを確実にするために、望ましくは、マーカーシステム／遺伝子を、置換された核酸を含む細胞の選択後除去し得る。
ある態様において、内因性免疫グロブリン座位の全てまたは一部の置換が起きている細胞を、毒素または薬物への暴露により負に選択する。例えば、ＨＳＶ－ＴＫ発現を保持する細胞を、ガンシクロビルなどのヌクレオシドアナログの使用により選択できる。他の態様において、内因性免疫グロブリン座位の欠失を含む細胞は、所望により組み換え事象後またはその結果として除去され得る、マーカー遺伝子の使用により正に選択できる。使用し得る正の選択系は、組み換え事象により一緒になる、ＨＰＲＴなどのマーカー遺伝子の２個の非機能的部分の使用に基づき得る。これら２個の部分は、置き換え反応が成功したら機能的結合され、ここで、マーカー遺伝子が、適切な部位特異的リコンビナーゼを使用して、ゲノムから切断されるように、機能的に再構成されたマーカー遺伝子の何れかの側には、さらに配列特異的組み換え位置(置き換え反応に使用した配列特異的組み換え位置と異なる)が隣接する。
リコンビナーゼは、精製タンパク質または宿主細胞に一過性にトランスフェクトされたもしくは宿主細胞ゲノムに安定に統合されたベクター構築物から発現されたタンパク質として提供され得る。あるいは、まず細胞を使用してトランスジェニック動物を作製し、次いで、それを該リコンビナーゼを発現する動物と交配させ得る。
ここに記載する方法が、操作されたゲノム内の２以上のセットの配列特異的組み換え位置の利点があるため、複数ラウンドのＲＭＣＥを利用して、非イヌ哺乳動物宿主細胞ゲノムに部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域遺伝子を導入し得る。
大ＤＮＡセグメントの挿入についてはまだ日常的ではないが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓテクノロジーは、キメライヌＩＧ座位を導入する他の方法である。
トランスジェニック動物の産生
ある態様において、導入された部分的にイヌの免疫グロブリン座位を含む、トランスジェニック動物、例えばマウスなどの齧歯類を産生する方法が、提供される。
ある態様において、内因性免疫グロブリン遺伝子の置き換えに利用する宿主細胞は胚幹(ＥＳ)細胞であり、これをその後トランスジェニック哺乳動物の産生に使用できる。ある態様において、宿主細胞は、初期胚の細胞である。ある態様において、宿主細胞は、前核期胚または接合体である。故に、ある態様によって、ここに記載する方法は、導入された部分的にイヌの免疫グロブリン座位を含む前核期胚または接合体などの胚幹細胞または初期胚の細胞を単離し、該ＥＳ細胞を使用して、置き換えられた部分的にイヌの免疫グロブリン座位を含むトランスジェニック動物を産生することをさらに含む。
使用方法
ある態様において、イヌ可変領域を含む抗体を産生する方法が、提供される。ある態様において、方法は、ここに記載するトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞を提供し、該トランスジェニック齧歯類により発現されるイヌ可変領域を含む抗体を単離することを含む。ある態様において、イヌ可変領域を含むモノクローナル抗体を産生する方法が提供される。ある態様において、方法は、ここに記載するトランスジェニック齧歯類または細胞からＢ細胞を提供し、Ｂ細胞を不死化し、該不死化Ｂ細胞から発現されるイヌ可変ドメインを含む抗体を単離することを含む。
ある態様において、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞により発現される抗体は、イヌＨＣ可変ドメインを含む。ある態様において、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞により発現される抗体は、マウスＨＣ定常ドメインを含む。これらは、いずれのアイソタイプ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ／ｃ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＥまたはＩｇＡでもよい。
ある態様において、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞により発現される抗体は、イヌＨＣ可変ドメインおよびマウスＨＣ定常ドメインを含む。ある態様において、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞により発現される抗体は、イヌＬＣ可変ドメインおよびマウスＬＣ定常ドメインを含む。ある態様において、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞により発現される抗体は、イヌＨＣ可変ドメインおよびイヌＬＣ可変ドメインおよびマウスＨＣ定常ドメインおよびマウスＬＣ定常ドメインを含む。
ある態様において、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞により発現される抗体は、イヌλＬＣ可変ドメインを含む。ある態様において、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞により発現される抗体は、マウスλ定常ドメインを含む。ある態様において、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞により発現される抗体は、イヌλＬＣ可変ドメインおよびマウスλ定常ドメインを含む。ある態様において、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞により発現される抗体は、イヌκＬＣ可変ドメインを含む。ある態様において、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞により発現される抗体は、マウスκ定常ドメインを含む。ある態様において、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞により発現される抗体は、イヌκＬＣ可変ドメインおよびマウスκ定常ドメインを含む。
ある態様において、イヌ可変領域を含む抗体または抗原結合フラグメントを産生する方法が、提供される。ある態様において、方法は、ここに記載するトランスジェニック齧歯類または細胞を提供し、該トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞により発現されるイヌ可変領域を含む抗体を単離することを含む。ある態様において、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞により発現される抗体の可変領域はシークエンシングされるトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞により発現される抗体から得たイヌ可変領域を含む抗体を、既知方法を使用して、組み換えにより産生し得る。
ある態様において、目的の抗原に特異的な免疫グロブリンを産生する方法が提供される。ある態様において、方法は、ここに記載するトランスジェニック齧歯類を抗原で免疫化し、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞により発現される該抗原に特異的な免疫グロブリンを単離することを含む。ある態様において、齧歯類または齧歯類細胞により発現される抗体の可変ドメインがシークエンシングされ、目的の抗原に特異的に結合するイヌ可変領域を含む抗体を、既知方法を使用して組み換えにより産生する。ある態様において、組み換えにより産生した抗体または抗原結合フラグメントは、イヌＨＣおよびＬＣ、κまたはλ、定常ドメインを含む。
引用による取り込み
特許、特許出願、論文、教科書などを含む、ここで引用した全ての参考文献およびそれらに引用されている文献は、既出でない限り、全ての目的でそれら全体として、引用により本明細書に包含させる。
次の実施例は、本発明をどのように製造および使用するかについての完全な開示および記載を当業者に提供するために示され、発明者らが、自身の発明とみなした範囲を限定する意図も、下記実験が、実施された全てのまたは唯一の実験であることを表すまたは含意する意図もない。広義に記載されている本発明の精神または範囲から逸脱することなく、具体的実施態様に示される本発明に、多数の変動および修飾をなし得ることは、当業者には認識される。それゆえに、本実施態様は、全ての点において説明であり、限定ではないと解釈されるべきである。
使用した期間および数値(例えば、ベクター、量、温度など)について、確実な精度となるよう努力しているが、ある程度の実験誤差および偏差が考慮されるべきである。特に断らない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧もしくはほぼ大気圧である。
実施例は、合成ＤＮＡの組み換えおよび導入位置に隣接する５’ベクターおよび３’ベクター両者によるターゲティングを記載する。本明細書に接した当業者には、５’ベクターターゲティングがまず起こり、続いて３’であっても、３’ベクターターゲティングがまず起こり、続いて５’ベクターによるものであってもよいことは認識される。ある状況下、ターゲティングは、デュアル検出機構により同時に実施され得る。
実施例１：非イヌ哺乳動物宿主細胞ゲノムの免疫グロブリンＨ鎖可変領域遺伝子座位への操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域遺伝子座位の導入
非哺乳動物ＥＳ細胞のゲノム座位への操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位の導入を説明する例示的方法は、図２～６にさらに詳細に示される。図２において、各野生型対応物／位置(すなわち、野生型ＦＲＴ(２０７)および野生型ｌｏｘＰ(２０５))と組み換わる能力を欠く、２個の異なるリコンビナーゼ認識位置(例えば、それぞれＦｌｐおよびＣｒｅについてＦＲＴ(２０７)およびｌｏｘＰ(２０５))および２個の異なる変異体位置(例えば、修飾変異体ＦＲＴ(２０９)および変異体ｌｏｘＰ(２１１))が隣接するピューロマイシンホスホトランスフェラーゼ－チミジンキナーゼ融合タンパク質(ｐｕｒｏ－ＴＫ)(２０３))を含む、相同性ターゲティングベクター(２０１)が提供される。ターゲティングベクターは、さらなる工程において、導入された構築物を含む細胞の負の選択に使用するための、ジフテリア毒素受容体(ＤＴＲ)ｃＤＮＡ(２１７)を含む。ターゲティングベクターは、所望により緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)などの可視マーカーも含む(示していない)。領域２１３および２１５は、内因性非イヌＶＨ遺伝子セグメント(２１９)を含むゲノム領域に５’である内因性非イヌ座位における連続領域(２２９)の５’および３’部分とそれぞれ相同である。内因性ＶＨ遺伝子セグメント(２１９)、ｐｒｅ－Ｄ領域(２２１)、Ｄ遺伝子セグメント(２２３)、ＪＨ遺伝子セグメント(２２５)および免疫グロブリン定常遺伝子領域遺伝子(２２７)を含む免疫グロブリン座位(２３１)を有する、ＥＳ細胞に相同性ターゲティングベクター(２０１)が導入される(２０２)。相同性ターゲティングベクター(２０１)からの部位特異的組み換え配列およびＤＴＲ ｃＤＮＡは、内因性マウスＶＨ遺伝子座位の位置５’で非イヌゲノムに統合され(２０４)、２３３で示すゲノム構造をもたらす。ゲノムに統合された外因性ベクター(２０１)を有しないＥＳ細胞は、培養培地にピューロマイシンを含めることにより選択される(殺される)；ゲノムに安定に統合された外因性ベクター(２０１)を有し、ｐｕｒｏ－ＴＫ遺伝子を構成的に発現するＥＳ細胞のみがピューロマイシンに耐性である。
図３は、さらなるセットの配列特異的組み換え位置、例えば、Ｄｒｅリコンビナーゼと共に使用するためのＲｏｘ位置(３３１)および修飾Ｒｏｘ位置(３３５)が加えられた以外、図２と効果的に同じアプローチを説明する。図３において、ＦＲＴ(３０７)、ｌｏｘＰ(３０５)およびＲｏｘ(３３１)に対する野生型リコンビナーゼ認識位置およびそれぞれ野生型位置３０７、３０５および３３１と組み換わる能力を欠くＦＲＴ(３０９)、ｌｏｘＰ(３１１)およびＲｏｘ(３３５)リコンビナーゼに対する変異体位置が隣接したｐｕｒｏ－ＴＫ融合タンパク質(３０３)を含む、相同性ターゲティングベクター(３０１)が提供される。ターゲティングベクターは、ジフテリア毒素受容体(ＤＴＲ)ｃＤＮＡ(３１７)も含む。領域３１３および３１５は、内因性マウスＶＨ遺伝子セグメント(３１９)を含むゲノム領域に５’である内因性非イヌ座位における連続領域(３２９)の５’および３’部分とそれぞれ相同である。相同性ターゲティングが、内因性ＶＨ遺伝子セグメント(３１９)、ｐｒｅ－Ｄ領域(３２１)、Ｄ遺伝子セグメント(３２３)、ＪＨ(３２５)遺伝子セグメントおよびＩｇｈ座位の定常領域遺伝子(３２７)を含む、マウス免疫グロブリン座位(３３９)に導入される(３０２)。相同性ターゲティングベクター(３０１)における部位特異的組み換え配列およびＤＴＲ ｃＤＮＡ(３１７)は、内因性マウスＶＨ遺伝子座位の位置５’でマウスゲノムに統合され(３０４)、３３３で示すゲノム構造をもたらす。
図４に示すとおり、ＨＰＲＴ欠損ＥＳ細胞の正の選択に使用できる任意のヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＰＲＴ)遺伝子(４３５)；ネオマイシン耐性遺伝子(４３７)；第一相同性ターゲティングベクターからマウスゲノムに際に統合されているＦＲＴ(４０７)およびｌｏｘＰ(４０５)位置と組み換わる能力を有する、それぞれＦｌｐおよびＣｒｅに対するリコンビナーゼ認識位置ＦＲＴ(４０７)およびｌｏｘＰ(４０５)を含む、第二相同性ターゲティングベクター(４０１)が提供される。先の相同性ターゲティングベクターは、内因性マウスＶＨ遺伝子座位(４１９)の位置５’に、変異体ＦＲＴ位置(４０９)、変異体ｌｏｘＰ位置(４１１)、ｐｕｒｏ－ＴＫ融合タンパク質(４０３)およびＤＴＲ ｃＤＮＡも含む。領域４２９および４３９は、内因性ＪＨ遺伝子セグメント(４２５)の下流および定常領域遺伝子(４２７)の上流である、内因性マウス非イヌ座位における連続領域(４４１)の５’および３’部分とそれぞれ相同である。相同性ターゲティングベクターは、内因性ＶＨ遺伝子セグメント(４１９)、ｐｒｅ－Ｄ領域(４２１)、Ｄ遺伝子セグメント(４２３)、ＪＨ遺伝子セグメント(４２５)および定常領域遺伝子(４２７)を含む修飾マウス免疫グロブリン座位(４３１)に導入される(４０２)。相同性ターゲティングベクターの部位特異的組み換え配列(４０７、４０５)、ＨＰＲＴ遺伝子(４３５)およびネオマイシン耐性遺伝子(４３７)は、内因性マウス定常領域遺伝子(４２７)の上流のマウスゲノムに統合され(４０４)、４３３に示すゲノム構造をもたらす。
哺乳動物宿主細胞ゲノムに組み換え位置が統合されると、次いで、免疫グロブリンドメインの内因性領域は、ゲノムに統合された配列特異的組み換え位置、例えば、ＦｌｐまたはＣｒｅに対応するリコンビナーゼの導入による組み換えに付される。図５に、２個の統合ＤＮＡフラグメントを含む、哺乳動物宿主細胞ゲノムの修飾Ｉｇｈ座位を説明する。変異体ＦＲＴ位置(５０９)、変異体ＬｏｘＰ位置(５１１)、ｐｕｒｏ－ＴＫ遺伝子(５０３)、野生型ＦＲＴ位置(５０７)および野生型ＬｏｘＰ位置(５０５)およびＤＴＲ ｃＤＮＡ(５１７)を含む１個のフラグメントが、ＶＨ遺伝子座位(５１９)の上流に統合される。ＨＰＲＴ遺伝子(５３５)、ネオマイシン耐性遺伝子(５３７)、野生型ＦＲＴ位置(５０７)および野生型ＬｏｘＰ位置(５０５)を含む他方のＤＮＡフラグメントが、ｐｒｅ－Ｄ(５２１)、Ｄ(５２３)およびＪＨ(５２５)遺伝子座位の下流であるが、定常領域遺伝子(５２７)の上流に統合される。ＦｌｐまたはＣｒｅ(５０２)存在下、ＤＴＲ遺伝子(５１７)、内因性ＩＧＨ可変領域遺伝子座位(５１９、５２１、５２５)およびＨＰＲＴ(５３５)およびネオマイシン耐性(５３７)遺伝子を含む野生型ＦＲＴまたは野生型ＬｏｘＰ位置間の全介在配列が欠失され、５３９に示すゲノム構造をもたらす。過程は、そのホモログではなく、同じ染色体で生じている第二ターゲティングによる(すなわち、トランスではなくシス)。意図どおりターゲティングがシスで生じたら、齧歯類におけるジフテリア毒素への感受性をもたらすＤＴＲ遺伝子が、宿主細胞ゲノムにない(欠失)ため、細胞は、培地に導入されたジフテリア毒素によるＣｒｅまたはＦｌｐ介在組み換え後、負の選択に感受性ではない。同様に、第一または第二ターゲティングベクターの無作為組込みを担持するＥＳ細胞は、非欠失ＤＴＲ遺伝子の存在により、ジフテリア毒素に対して感受性である。
次いで、ジフテリア毒素に非感受性であるＥＳ細胞を、内因性可変領域遺伝子座位の欠失についてスクリーニングする。欠失内因性免疫グロブリン座位の一次スクリーニング方法は、サザンブロッティングまたはポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により実施し、その後、サザンブロッティングなどの第二スクリーニング技術で確認することができる。
図６は、重鎖可変領域ドメインとＶＨとＪＨ遺伝子座位の間の全介在配列をコードする内因性Ｉｇｈ座位(ＶＨ、ＤおよびＪＨ)の一部が欠失するように先に修飾されている、非イヌゲノムへの操作された部分的にイヌの配列の統合を示す。部分的にイヌのＶＨ遺伝子座位(６１９)、内因性非イヌｐｒｅ－Ｄ遺伝子領域(６２１)、部分的にイヌのＤ遺伝子座位(６２３)、部分的にイヌのＪＨ遺伝子座位(６２５)ならびにフランキング変異体ＦＲＴ(６０９)、変異体ＬｏｘＰ(６１１)、野生型ＦＲＴ(６０７)および野生型ＬｏｘＰ(６０５)位置を含む部位特異的ターゲティングベクター(６２９)は、宿主細胞に導入される(６０２)。具体的に、部分的にイヌのＶＨ座位(６１９)は、内因性非イヌゲノム配列に基づく介在配列と共に３９個の機能的イヌＶＨコード配列を含み；ｐｒｅ－Ｄ領域(６２１)は、内因性イヌＩＧＨ座位の対応する領域と相当な相同性を有する２１.６kbマウス配列を含み；Ｄ遺伝子座位(６２３)は、内因性非イヌＤ遺伝子セグメント周囲の介在配列に包埋された６個のＤ遺伝子セグメントのコドンを含み；そしてＪＨ遺伝子座位(６２５)は、内因性非イヌゲノムに基づく介在配列に包埋された６個のイヌＪＨ遺伝子セグメントのコドンを含む。宿主細胞ゲノムのＩＧＨ座位(６０１)は、図５に記載するとおり、介在配列を含むＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメント全てが欠失するよう先に修飾されている。この修飾の結果、内因性非イヌ宿主細胞Ｉｇｈ座位(６０１)は、上流で変異体ＦＲＴ位置(６０９)および変異体ＬｏｘＰ位置(６１１)ならびに下流で野生型ＦＲＴ(６０７)および野生型ＬｏｘＰ(６０５)に隣接した、ｐｕｒｏ－ＴＫ融合遺伝子(６０３)と共に残る。適切なリコンビナーゼ(６０４)の導入により、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、内因性非イヌ定常領域遺伝子(６２７)上流でゲノムに統合され、６３１で示すゲノム構造をもたらす。
イヌＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメントコード領域の配列は、表１に示される。
部分的にイヌの免疫グロブリン座位の導入のための一次スクリーニング方法は、サザンブロッティングまたはＰＣＲにより実施され、続いて、サザンブロッティングなどの二次スクリーニング方法で確認することができる。スクリーニング方法は、挿入ＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子座位ならびに全介在配列の存在を検出するよう設計される。
実施例２：非イヌ哺乳動物宿主細胞ゲノムの免疫グロブリンＨ鎖可変領域遺伝子座位へのさらなる非コード制御配列または足場配列を含む操作された部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域遺伝子座位の導入
ある態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、さらなる非コード制御配列または足場配列、例えば、導入された免疫グロブリン座位内の所望の間隔を確実にする、あるコード配列が置き換えられた免疫グロブリン座位と隣接する他の配列と適切な並置であることを確実にするなどのために、さらなる制御配列を導入するために戦略的に加えられた配列を有する以外、実施例１に記載の要素を含む。図７は、図２～５におよび上の実施例１に記載するとおり産生された、修飾非イヌゲノムへの第二の例示的操作された部分的にイヌの配列の導入を示す。
図７は、重鎖可変領域ドメインならびに内因性ＶＨとＪＨ遺伝子座位の間の全介在配列をコードする内因性非イヌＩＧＨ座位(ＶＨ、ＤおよびＪＨ)の一部を欠失するよう先に修飾された、マウスゲノムへの操作された部分的にイヌの配の導入を示す。非イヌ宿主ゲノムに導入される操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位を含む部位特異的ターゲティングベクター(７３１)は、ゲノム領域(７０１)に導入される(７０２)。部分的にイヌのＶＨ遺伝子座位(７１９)、マウスｐｒｅ－Ｄ領域(７２１)、部分的にイヌのＤ遺伝子座位(７２３)、部分的にイヌのＪＨ遺伝子座位(７２５)、ＰＡＩＲ要素(７４１)ならびにフランキング変異体ＦＲＴ(７０９)、変異体ＬｏｘＰ(７１１)、野生型ＦＲＴ(７０７)および野生型ＬｏｘＰ(７０５)位置を含むターゲティングベクター(７３１)は、宿主細胞に導入される(７０２)。具体的に、操作された部分的にイヌのＶＨ遺伝子座位(７１９)は、内因性非イヌゲノム配列に基づく介在配列と共に、８０個のイヌＶＨ遺伝子セグメントコード領域を含み；ｐｒｅ－Ｄ領域(７２１)は、内因性非イヌゲノムの上流に位置する２１.６kb非イヌ配列を含み；Ｄ領域(７２３)は、内因性非イヌＤ遺伝子セグメント周囲の介在配列に包埋された６個のイヌＤ遺伝子セグメントのコドンを含み；そしてＪＨ遺伝子座位(７２５)は、内因性非イヌゲノムに基づく介在配列に包埋された６個のイヌＪＨ遺伝子セグメントのコドンを含む。宿主細胞ゲノムのＩＧＨ座位(７０１)は、図５に関連して記載するとおり、介在配列を含むＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメント全てを検出するように先に修飾されている。この修飾の結果、内因性非イヌＩＧｈ座位(７０１)は、上流で変異体ＦＲＴ位置(７０９)および変異体ＬｏｘＰ位置(７１１)ならびに下流で野生型ＦＲＴ(７０７)および野生型ＬｏｘＰ(７０５)に隣接された、ｐｕｒｏ－ＴＫ融合遺伝子(７０３)と共に残る。適切なリコンビナーゼ(７０４)の導入により、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、内因性マウス定常領域遺伝子(７２７)の上流のゲノムに統合され、７２９で示すゲノム構造をもたらす。
操作された部分的にイヌの免疫グロブリン領域の導入のための一次スクリーニング方法は、サザンブロッティングまたはＰＣＲにより実施され、続いて、サザンブロッティングなどの二次スクリーニング方法で確認することができる。スクリーニング方法は、挿入されたＰＡＩＲ要素、ＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子座位ならびに全介在配列の存在を検出するよう、設計される。
実施例３：マウスゲノムの免疫グロブリン重鎖遺伝子座位への操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位の導入
マウスゲノムの一部を操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位で置き換える方法は、図８に示される。この方法は、マウスゲノムへの第一部位特異的リコンビナーゼ認識配列の導入と、続くマウスゲノムへの第二部位特異的リコンビナーゼ認識配列の導入を使用する。２つの位置は、内因性マウスＶＨ、ＤおよびＪＨ領域遺伝子セグメントのクラスター全体に隣接する。隣接領域は、ここに記載するとおり適切な部位特異的リコンビナーゼを使用して欠失される。
野生型マウス免疫グロブリン座位(８０１)におけるＶＨ(８１５)、Ｄ(８１７)およびＪＨ(８１９)遺伝子セグメントクラスターの何れかの側および定常領域遺伝子(８２１)の上流の部位特異的リコンビナーゼ配列の導入に用いるターゲティングベクター(８０３、８０５)は、リコンビナーゼによりなお効率的に認識されるが、非修飾位置と組み換わらないように修飾されている、さらなる部位特異的組み換え配列を含む。この変異体修飾位置(例えば、ｌｏｘ５１７１)は、内因性ＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメント(８０２)の欠失後、ＤＮＡの非天然断片がＲＭＣＥにより修飾ＩＧＨ座位に移動する第二部位特異的組み換え事象に使用できるように、ターゲティングベクターに配置される。この例において、非天然ＤＮＡは、イヌおよび非イヌ配列(８０９)両者を含む、合成核酸である。
上記で概説したとおりの方法を達成するために、２個の遺伝子ターゲティングベクターが構築される。ベクターの一方(８０３)は、最遠位ＶＨ遺伝子セグメントの上流のＩｇｈ座位の５’末端から取ったマウスゲノムＤＮＡを含む。他のベクター(８０５)は、ＪＨ遺伝子セグメントの下流内の座位から取ったマウスゲノムＤＮＡを含む。
５’ベクター(８０３)の重要な特性は、５’から３’で次のとおりである：ポリオーマウイルスからの２個の変異体転写エンハンサーに結合した修飾単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ遺伝子プロモーターの制御下にジフテリア毒素Ａ(ＤＴＡ)サブユニットをコードする遺伝子(８２３)；Ｉｇｈ座位における最遠位ＶＨ遺伝子セグメントの上流にマッピングされた４.５KbのマウスゲノムＤＮＡ(８２５)；ＦｌｐリコンビナーゼについてのＦＲＴ認識配列(８２７)；マウスＰｏｌｒ２ａ遺伝子プロモーターを含むゲノムＤＮＡ片(８２９)；翻訳開始配列(「コザック」コンセンサス配列に包埋されたメチオニンコドン、８３５))；Ｃｒｅリコンビナーゼに対する変異ｌｏｘＰ認識配列(ｌｏｘ５１７１)(８３１)；転写終結／ポリアデニル化配列(ｐＡ。８３３)；Ｃｒｅリコンビナーゼに対するｌｏｘＰ認識配列(８３７)；マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１遺伝子からのプロモーターの転写制御下にチミジンキナーゼ(ｐｕ－ＴＫ)の切断形態に融合したピューロマイシンに対する耐性を付与するタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子(８３９)；およびベクターの５’末端近くに存在し、天然相対配向で配置された４.５KbマウスゲノムＤＮＡ配列近くにマッピングされた３KbのマウスゲノムＤＮＡ(８４１)。
３’ベクター(８０５)の重要な特性は、５’から３’で次のとおりである：ＪＨとＣＨ遺伝子座位の間のイントロン内にマッピングされる３.７KbのマウスゲノムＤＮＡ(８４３)；マウスＰｏｌｒ２ａ遺伝子プロモーター転写制御下のＨＰＲＴ遺伝子(８４５)；マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１遺伝子プロモーター制御下のネオマイシン耐性遺伝子(８４７)；Ｃｒｅリコンビナーゼに対するｌｏｘＰ認識配列(８３７)；ベクターの５’末端近位に存在する３.７KbマウスゲノムＤＮＡフラグメントのすぐ下流にマッピングされ、天然相対配向で配置される、２.１KbのマウスゲノムＤＮＡ(８４９)；およびポリオーマウイルスからの２個の変異体転写エンハンサーに結合した修飾単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ遺伝子プロモーターの転写制御下にＤＴＡサブユニットをコードする遺伝子(８２３)。
マウス胚幹(ＥＳ)細胞(Ｃ５７Ｂ１／６ＮＴａｃマウス由来)を、広く使用されている方法に従い、３’ベクター(８０５)でのエレクトロポレーションによりトランスフェクトする。エレクトロポレーション前、ベクターＤＮＡを、原核生物プラスミド配列またはそれと結合したポリリンカーしか切断しない希少切断制限酵素で線形化する。トランスフェクト細胞を播種し、約２４時間後、ネオマイシンアナログ薬物Ｇ４１８の使用により、ＤＮＡに統合された３’ベクターを有する細胞について、正の選択をする。ベクターがＤＮＡに統合されているが、相同組み換えによってではない細胞について負の選択もある。非相同組み換えは、遺伝子が発現されたとき細胞を死滅させるＤＴＡ遺伝子(８２３)を保持させるが、一方ＤＴＡ遺伝子は、マウスＩＧＨ座位と相同性であるベクターの領域外にあるため、相同組み換えにより欠失される。薬物耐性ＥＳ細胞のコロニーを、約１週間後、視認できるようになった後、物理的に摘出する。これら選択したコロニーを脱凝集させ、マイクロウェルプレートに再播種し、数日間培養する。その後、細胞のクローンの各々を、一部細胞をアーカイブとして凍結し、残りを分析目的でのＤＮＡの単離に使用できるように、分ける。
広く実施されている遺伝子ターゲティングアッセイデザインを使用するＰＣＲにより、ＥＳ細胞クローンからのＤＮＡをスクリーニングする。このアッセイについて、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー配列の一方は、３’ベクター(８０５)とゲノムＤＮＡの間で共有される同一性の領域外にマッピングされ、他方は、ベクターにおけるゲノム同一性の２アームの間の新規ＤＮＡ内、すなわち、ＨＰＲＴ(８４５)またはネオマイシン耐性(８４７)遺伝子にマッピングされる。標準デザインにより、これらのアッセイは、３’ターゲティングベクターと内因性マウスＩＧＨ座位の間の十分に合理的な相同組み換えを受けたトランスフェクト細胞由来のＥＳ細胞のクローンにしか存在しないであろうＤＮＡ片を検出する。２回の別々のトランスフェクションを、３’ベクター(８０５)で実施する。２回のトランスフェクションからのＰＣＲ陽性クローンを拡大のために選択し、その後、サザンブロットアッセイを使用してさらに分析する。
サザンブロットアッセイを、プローブと消化物の組み合わせがクローンにおける標的座位の構造を相同組み換えにより適切に修飾されたとして同定することができるように選択した複数制限酵素で消化した３個のプローブとゲノムＤＮＡを使用して、広く使用される方法に従い実施する。プローブの一つは、３’ターゲティングベクターとゲノムＤＮＡの間で共有される同一性の領域の５’側に隣接するＤＮＡ配列にマッピングされる；第二プローブは、同一性の領域外であるが、３’側にマッピングされる；そして第三プローブは、ベクターにおけるゲノム同一性の２アームの間の新規ＤＮＡ内、すなわち、ＨＰＲＴ(８４５)またはネオマイシン耐性(８４７)遺伝子にマッピングされる。サザンブロットは、外部プローブの一方およびネオマイシンまたはＨＰＲＴプローブで検出して、正しく、すなわち、３’Ｉｇｈターゲティングベクターとの相同組み換えにより、変異された、ＩＧＨ座位の部分に対応するＤＮＡの予測される制限酵素産生フラグメントの存在を同定する。外部プローブは、変異体フラグメントおよび相同染色体上の免疫グロブリンＩｇｈ座位の非変異体コピーからの野生型フラグメントもまた検出する。
マウスＥＳ細胞で起こる最も一般的に生ずる染色体異常と区別するために設計されたインサイチュ蛍光ハイブリダイゼーション法を使用して、ＥＳ細胞のＰＣＲおよびサザンブロット陽性クローンの核型を分析する。このような異常があるクローンはさらなる使用から除外する。サザンブロットデータに基づき、予測された正しいゲノム構造を有すると判断される － そして核型分析に基づき、検出可能な染色体異常も有しない － ＥＳ細胞クローンを、さらなる使用のために選択する。
次いで、許容されるクローンを、選択のためにＧ４１８／ネオマイシンの代わりにピューロマイシン選択を使用する以外、３’ベクター(８０５)で使用したのに類似する設計の方法およびスクリーニングアッセイを使用して、５’ベクター(８０３)で修飾する。ＰＣＲアッセイ、プローブおよび消化物も、５’ベクター(８０５)により修飾されるゲノム領域に適合するよう調整する。
３’および５’ベクター両者により予測される形態で変異されているＥＳ細胞のクローン、すなわち、操作された変異両方を有する二重標的細胞を、ベクターターゲティングおよび分析後単離する。クローンは、相同染色体ではなく、同じ染色体上の遺伝子ターゲティングを受けていなければならない(すなわち、ターゲティングベクターにより作られた操作された変異が、別の相同ＤＮＡ鎖上のトランスではなく、同じＤＮＡ鎖上のシスでなければならない)。シス配置のクローンを、ゲノム同一性のアーム間の２個の遺伝子ターゲティングベクター(８０３および８０５)に存在する新規ＤＮＡとハイブリダイズするプローブを使用する中期スプレッドの蛍光インサイチュハイブリダイゼーションなどの分析法により、トランス配置のものと分ける。２タイプのクローンは、また、ターゲティングベクターがシスで統合されているならばｐｕ－ＴＫ(８３９)、ＨＰＲＴ(８４５)およびネオマイシン耐性(８４７)遺伝子を欠失させるＣｒｅリコンビナーゼを発現するベクターでトランスフェクトし、次いで、５’ベクター(８０３)により導入されたチミジンキナーゼ遺伝子に対するガンシクロビル選択で生存するコロニー数を比較し、そして、クローンからの一部細胞をピューロマイシンまたはＧ４１８／ネオマイシンに対する耐性について試験する、「同胞選択」スクリーニング法による生存クローンの薬物耐性表現型の分析により、互いに区別できる。シス配置の変異を有する細胞は、トランス配置を有する細胞より、約１０３多くガンシクロビル耐性クローンを産生すると予測される。得られたシス由来ガンシクロビル耐性クローンの大部分は、ピューロマイシンおよびＧ４１８／ネオマイシン両剤に対する耐性を保持するはずであるトランス由来ガンシクロビル耐性クローンと比較して、両剤にまた感受性である。重鎖座位におけるシス配置の操作された変異を有する細胞の二重標的クローンを、さらなる使用のために選択する。
細胞の二重標的クローンを、上に要約した分析実験におけるとおり、一過性にＣｒｅリコンビナーゼを発現するベクターでトランスフェクトし、続いて、トランスフェクト細胞をガンシクロビル選択下に置く。細胞のガンシクロビル耐性クローンを単離し、５’(８０３)および３’(８０５)ターゲティングベクターにより作られた２個の操作された変異の間の予測された欠失の存在についてＰＣＲおよびサザンブロットにより分析する。これらクローンにおいて、Ｃｒｅリコンビナーゼは、８０７で示すゲノムＤＮＡ配置を作るために２個のベクターにより重鎖座位に導入されたｌｏｘＰ位置(８３７)間で組み換え(８０２)が生ずるようにする。ＬｏｘＰ位置が２個のベクターで同じ相対配向で配置されるため、組み換えは、２個のｌｏｘＰ位置間のゲノム間隔全体を含む、ＤＮＡの輪の切除をもたらす。輪は複製起点を含まず、故に、有糸分裂の間複製せず、それゆえに細胞が増殖するに連れて細胞から失われていく。得られたクローンは、もともと２個のｌｏｘＰ位置間にあったＤＮＡの欠失を担持する。予測される欠失を有するクローンを、さらなる使用のために選択する。
免疫グロブリン重鎖座位の２個の相同コピーの一方に配列の欠失を担持するＥＳ細胞クローンを、マウス制御およびフランキング配列に隣接したイヌＶＨ、ＤおよびＪＨ領域遺伝子コード領域配列を含む部分的にイヌの免疫グロブリン重鎖座位を含むＤＮＡ(８０９)の一片と共に、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターで再トランスフェクトする(８０４)。この合成ＤＮＡ(８０９)片の重要な特性は次のとおりである。ｌｏｘ５１７１位置(８３１)；イニシエーターメチオニンコドンを欠くが、インフレームであり、ｌｏｘ５１７１位置における中断されていないオープンリーディングフレームと連続的であるネオマイシン耐性遺伝子オープンリーディングフレーム(８４７)；ＦＲＴ位置(８２７)；３９個の機能的イヌＶＨ重鎖可変領域遺伝子(８５１)のアレイ、各々、マウス非コード配列に包埋されたイヌコード配列を伴う；所望によりマウス重鎖座位からの２１.６kb ｐｒｅ－Ｄ領域(示していない)；６個のイヌＤＨ遺伝子セグメント(８５３)および６個のイヌＪＨ遺伝子セグメント(８５５)を含む５８Kb片のＤＮＡであって、ここで、イヌＶＨ、ＤおよびＪＨコード配列はマウス非コード配列に包埋される；ｌｏｘ５１７１位置(８３１)に対する逆相対配向のｌｏｘＰ位置(８３７)。
トランスフェクトクローンを、Ｇ４１８選択下に置き、これは、操作された部分的にイヌのドナー免疫グロブリン座位(８０９)は、８１１に示すＤＮＡ領域を作るために、ｌｏｘ５１７１(８３１)とｌｏｘＰ(８３７)位置の間の欠失内因性免疫グロブリン重鎖座位に、その全体が統合されている、ＲＭＣＥを受けている細胞のクローンを濃縮する。ＲＭＣＥを適切に受けている細胞のみがネオマイシン耐性遺伝子(８４７)を発現する能力を有し、これは、その発現に必要であるプロモーター(８２９)およびイニシエーターメチオニンコドン(８３５)がベクター(８０９)に存在しないが、宿主細胞ＩＧＨ座位(８０７)に既に予め存在するためである。５’ベクター(８０３)からの残りの要素をインビトロまたはインビボでＦｌｐ介在組み換え(８０６)により除去し、８１３に示す最終イヌベースの座位をもたらす。
Ｇ４１８耐性ＥＳ細胞クローンを、望まない再配列または欠失なく予測されたＲＭＣＥ過程を受けていることを決定するために、ＰＣＲおよびサザンブロットにより分析する。予測されたゲノム構造を有するクローンを、さらなる使用のために選択する。
標準法により部分的にＥＳ細胞由来キメラマウスを作るために、マウス重鎖座位に部分的にイヌの免疫グロブリン重鎖ＤＮＡ(８１３)を担持するＥＳ細胞クローンを、ＤＢＡ／２系統からのマウス胚盤胞に微量注入する。外被に最高レベルのＥＳ細胞由来寄与を有する雄キメラマウスを、雌マウスとの交配のために選択する。ここで選択する雌マウスは、Ｃ５７Ｂ１／６ＮＴａｃ系統であり、また生殖系列で発現されるＦｌｐリコンビナーゼをコードする導入遺伝子も担持する。これら交配による子孫を、部分的にイヌの免疫グロブリン重鎖座位の存在およびＲＭＣＥ工程により作られたＦＲＴ隣接ネオマイシン耐性遺伝子の喪失について分析する。部分的にイヌの座位を担持するマウスを、マウスのコロニーの確立のために使用する。
実施例４：マウスゲノムの免疫グロブリンκ鎖遺伝子座位への操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位の導入
マウスゲノムの一部を部分的にイヌの免疫グロブリン座位で置き換える他の方法を、図９に示す。この方法は、まず、マウスゲノムの内因性Ｖκ(９１５)およびＪκ(９１９)領域遺伝子セグメントのクラスターの５’または３’に導入され得る、マウスゲノムへの第一部位特異的リコンビナーゼ認識配列の導入、続いて第一配列特異的組み換え位置と組み合わせて、上流でＶκおよびＪκ遺伝子セグメント定常領域遺伝子(９２１)を含む座位全体に隣接する第二部位特異的リコンビナーゼ認識配列のマウスゲノムへの導入を含む。ここに記載する、適切な部位特異的リコンビナーゼを使用して、隣接領域が欠失され、次いで、部分的にイヌの免疫グロブリン座位で置き換えられる。
Ｖκ(９１５)およびＪκ(９１９)遺伝子セグメントの何れかの側に部位特異的組み換え配列を導入するために用いるターゲティングベクターも、リコンビナーゼによりなお効率的に認識されるが、非修飾位置と組み換わらないように修飾されている、さらなる部位特異的組み換え配列を含む。この位置は、ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントクラスターの欠失後、ＤＮＡ非天然片がＲＭＣＥにより修飾Ｖκ座位に移動するよう、ターゲティングベクターで配置される。この例において、非天然ＤＮＡは、マウス制御およびフランキング配列に包埋されたイヌＶκおよびＪκ遺伝子セグメントコード配列を含む、合成核酸である。
上記で概説したとおりの方法を達成するために、２個の遺伝子ターゲティングベクターが構築される。一方のベクター(９０３)は、最遠位Ｖκ遺伝子セグメントの上流、座位の５’末端から取ったマウスゲノムＤＮＡを含む。他のベクター(９０５)は、Ｊκ遺伝子セグメント(９１９)の下流(３’)かつ定常領域遺伝子(９２１)の上流の座位から取ったマウスゲノムＤＮＡを含む。
５’ベクター(９０３)の重要な特性は、次のとおりである。ポリオーマウイルスからの２個の変異体転写エンハンサーに結合した修飾単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ遺伝子プロモーターの制御下にジフテリア毒素Ａ(ＤＴＡ)サブユニットをコードする遺伝子(９２３)；κ鎖座位における最遠位可変領域遺伝子の上流にマッピングされた６KbのマウスゲノムＤＮＡ(９２５)；ＦｌｐリコンビナーゼについてのＦＲＴ認識配列(９２７)；マウスＰｏｌｒ２ａ遺伝子プロモーターを含むゲノムＤＮＡ片(９２９)；翻訳開始配列(９３５、「コザック」コンセンサス配列に包埋されたメチオニンコドン)；Ｃｒｅリコンビナーゼに対する変異ｌｏｘＰ認識配列(ｌｏｘ５１７１)(９３１)；転写終結／ポリアデニル化配列(９３３)；Ｃｒｅリコンビナーゼに対するｌｏｘＰ認識配列(９３７)；マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１遺伝子からのプロモーターの転写制御下にチミジンキナーゼ(ｐｕ－ＴＫ)の切断形態に融合したピューロマイシンに対する耐性を付与するタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子(９３９)；ベクターの５’末端で６Kb配列に近接してマッピングされ、天然相対配向で配置される２.５KbのマウスゲノムＤＮＡ(９４１)。
３’ベクター(９０５)の重要な特性は、次のとおりである。Ｊκ(９１９)とＣκ(９２１)遺伝子座位の間にマッピングされる６KbのマウスゲノムＤＮＡ(９４３)；マウスＰｏｌｒ２ａ遺伝子プロモーター(９４５)の転写制御下にヒトヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＰＲＴ)をコードする遺伝子；マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１遺伝子プロモーター制御下のネオマイシン耐性遺伝子(９４７)；Ｃｒｅリコンビナーゼに対するｌｏｘＰ認識配列(９３７)；ベクターの５’末端に含まれる６Kb ＤＮＡフラグメントのゲノムのすぐ下流にマッピングされ、マウスゲノムにおけるのと同じ相対的方向で配向された２個のフラグメントを有する、３.６KbのマウスゲノムＤＮＡ(９４９)；ポリオーマウイルスからの２個の変異体転写エンハンサーに結合した修飾単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ遺伝子プロモーターの制御下にジフテリア毒素Ａ(ＤＴＡ)サブユニットをコードする遺伝子(９２３)。
広く使用されている方法に従い、Ｃ５７Ｂ１／６ＮＴａｃマウス由来のマウス胚幹(ＥＳ)細胞を、３’ベクター(９０５)でエレクトロポレーションする。エレクトロポレーション前、ベクターＤＮＡを、原核生物プラスミド配列またはそれと結合したポリリンカーしか切断しない希少切断制限酵素で線形化する。トランスフェクト細胞を播種し、約２４時間後、ネオマイシンアナログ薬物Ｇ４１８の使用により、ＤＮＡに統合された３’ベクターを有する細胞について、正の選択をする。ベクターがＤＮＡに統合されているが、相同組み換えによってではない細胞について負の選択もある。非相同組み換えは、遺伝子が発現されたとき細胞を死滅させるＤＴＡ遺伝子の保持をもたらし、一方、相同組み換えでは、マウスＩｇκ座位のベクター相同性の領域外にあるため、ＤＴＡ遺伝子は欠失される。薬物耐性ＥＳ細胞のコロニーを、約１週間後、視認できるようになった後、物理的に摘出する。これら選択したコロニーを脱凝集させ、マイクロウェルプレートに再播種し、数日間培養する。その後、細胞のクローンの各々を、一部細胞をアーカイブとして凍結し、残りを分析目的でのＤＮＡの単離に使用できるように、分ける。
広く実施されている遺伝子ターゲティングアッセイデザインを使用するＰＣＲにより、ＥＳ細胞クローンからのＤＮＡをスクリーニングする。このアッセイについて、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー配列の一方は、３’ベクター(９０５)とゲノムＤＮＡ(９０１)の間で共有される同一性の領域外にマッピングされ、他方は、ベクターにおけるゲノム同一性の２アームの間の新規ＤＮＡ内、すなわち、ＨＰＲＴ(９４５)またはネオマイシン耐性(９４７)遺伝子にマッピングされる。標準デザインにより、これらのアッセイは、３’ベクター(９０５)と内因性マウスＩｇκ座位の間の十分に合理的な相同組み換えを受けたトランスフェクト細胞由来のＥＳ細胞のクローンにしか存在しないであろうＤＮＡ片を検出する。２回の別々のトランスフェクションを、３’ベクター(９０５)で実施する。２回のトランスフェクションからのＰＣＲ陽性クローンを拡大のために選択し、その後、サザンブロットアッセイを使用してさらに分析する。
サザンブロットアッセイを、プローブおよび消化物がクローンにおける標的座位の構造および相同組み換えいより適切に修飾されたか否かの結論を可能とするように選択した複数制限酵素で消化した３個のプローブとゲノムＤＮＡを含む、広く使用される方法に従い実施する。プローブの一つは、３’κターゲティングベクター(９０５)とゲノムＤＮＡの間で共有される同一性の領域の５’側に隣接するＤＮＡ配列にマッピングされる；第二プローブも、同一性の領域外であるが、３’側にマッピングされる；第三プローブは、ベクターにおけるゲノム同一性の２アームの間の新規ＤＮＡ内、すなわち、ＨＰＲＴ(９４５)またはネオマイシン耐性(９４７)遺伝子にマッピングされる。サザンブロット、外部プローブの一方およびネオマイシンまたはＨＰＲＴ遺伝子プローブで検出して、正しく、すなわち、３’κターゲティングベクター(９０５)との相同組み換えにより、変異された、κ座位の部分に対応するＤＮＡの予測される制限酵素産生フラグメントの存在を同定する。外部プローブは、変異体フラグメントおよびまた相同染色体の免疫グロブリンκ座位の非変異体コピーからの野生型フラグメントも検出する。
マウスＥＳ細胞で起こる最も一般的に生ずる染色体異常と区別するために設計されたインサイチュ蛍光ハイブリダイゼーション法を使用して、ＥＳ細胞のＰＣＲおよびサザンブロット陽性クローンの核型を分析する。このような異常があるクローンはさらなる使用から除外する。サザンブロットデータに基づき、予測された正確なゲノム構造を有すると判断された核型的に正常なクローンを、さらなる使用のために選択する。
次いで、許容されるクローンを、選択のためにＧ４１８／ネオマイシンの代わりにピューロマイシン選択を使用し、プロトコールを５’ベクター(９０３)によるゲノム領域修飾に適合するよう調製する以外、３’ベクター(９０５)で使用したのに類似する設計の方法およびスクリーニングアッセイを使用して、５’ベクター(９０３)で修飾する。５’ベクター(９０３)トランスフェクション実験の目的は、３’ベクター(９０５)および５’ベクター(９０３)の両方により予測される形態で変異されているＥＳ細胞のクローン、すなわち、操作された変異両方を有する二重標的細胞を、単離することである。これらクローンにおいて、Ｃｒｅリコンビナーゼは、２個のベクターにより、κ座位に導入されたｌｏｘＰ位置の間で組み換え(９０２)を起こし、９０７に示すゲノムＤＮＡ配置をもたらす。
さらに、クローンは、相同染色体ではなく、同じ染色体上の遺伝子ターゲティングを受けていなければならない；すなわち、ターゲティングベクターにより作られた操作された変異が、別の相同ＤＮＡ鎖上のトランスではなく、同じＤＮＡ鎖上のシスでなければならない。に存在する新規ＤＮＡとハイブリダイズするプローブを使用する中期スプレッドの蛍光インサイチュハイブリダイゼーションなどの分析法により、トランス配置のものと分ける。２タイプのクローンは、また、ターゲティングベクターがシスで統合されているならばｐｕ－Ｔｋ(９３９)、ＨＰＲＴ(９４５)およびネオマイシン耐性(９４７)遺伝子を欠失させるＣｒｅリコンビナーゼを発現するベクターでトランスフェクトし、次いで、５’ベクター(９０３)により導入されたチミジンキナーゼ遺伝子に対するガンシクロビル選択で生存するコロニー数を比較し、そして、クローンからの一部細胞をピューロマイシンまたはＧ４１８／ネオマイシンに対する耐性について試験する、「同胞選択」スクリーニング法による生存クローンの薬物耐性表現型の分析により、互いに区別できる。シス配置の変異を有する細胞は、トランス配置を有する細胞より、約１０３多くガンシクロビル耐性クローンを産生すると予測される。得られたシス由来ガンシクロビル耐性クローンの大部分は、ピューロマイシンおよびＧ４１８／ネオマイシン両剤に対する耐性を保持するはずであるトランス由来ガンシクロビル耐性クローンと比較して、両剤にまた感受性である。κ鎖座位におけるシス配置の操作された変異を有する細胞の二重標的クローンを、さらなる使用のために選択する。
細胞の二重標的クローンを、上に要約した分析実験におけるとおり、一過性にＣｒｅリコンビナーゼを発現するベクター(９０２)でトランスフェクトし、続いて、トランスフェクト細胞をガンシクロビル選択下に置く。細胞のガンシクロビル耐性クローンを単離し、５’ベクター(９０３)および３’ベクター(９０５)により作られた２個の操作された変異の間の予測された欠失(９０７)の存在についてＰＣＲおよびサザンブロットにより分析する。これらクローンにおいて、Ｃｒｅリコンビナーゼは、２個のベクターによりκ鎖座位に導入されたｌｏｘＰ位置(９３７)間で組み換えが生ずるようにする。ＬｏｘＰ位置が２個のベクターで同じ相対配向で配置されるため、組み換えは、２個のｌｏｘＰ位置間のゲノム間隔全体を含む、ＤＮＡの輪の切除をもたらす。輪は複製起点を含まず、故に、有糸分裂の間複製せず、それゆえにクローン増殖するに連れて細胞から失われていく。得られたクローンは、もともと２個のｌｏｘＰ位置間にあったＤＮＡの欠失を担持する。予測される欠失を有するクローンを、さらなる使用のために選択する。
免疫グロブリンκ鎖座位の２個の相同コピーの一方に配列の欠失を担持するＥＳ細胞クローンを、Ｖκ(９５１)およびＪκ(９５５)遺伝子セグメントコード配列を含む部分的にイヌの免疫グロブリンκ鎖座位を含むＤＮＡ(９０９)の一片と共に、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターで再トランスフェクトする(９０４)。この合成ＤＮＡ(「Ｋ－Ｋ」と称する)片の重要な特性は次のとおりである。ｌｏｘ５１７１位置(９３１)；ネオマイシン耐性遺伝子オープンリーディングフレーム(９４７、イニシエーターメチオニンコドンを欠くが、インフレームであり、ｌｏｘ５１７１位置(９３１)における中断されていないオープンリーディングフレーム)と連続的である)；ＦＲＴ位置(９２７)；各々マウス非コード配列に包埋されたイヌコード配列を伴う、１４個のイヌＶκ遺伝子セグメント(９５１)のアレイ；所望によりマウスκ鎖座位におけるＪκ領域遺伝子セグメントのクラスターのすぐ上流の１３.５Kb片のゲノムＤＮＡ(示していない)；マウス非コードＤＮＡに包埋された５イヌＪκ領域遺伝子セグメント(９５５)を含む、２Kb片のＤＮＡ；ｌｏｘ５１７１位置(９３１)に対する逆相対配向のｌｏｘＰ位置(９３７)。
イヌＶκおよびＪκ遺伝子コード領域の配列は表２に示される。
第二の独立した実験において、部分的にイヌのＤＮＡ(９０９)の別の片を、Ｋ－Ｋ ＤＮＡの代わりに使用する。このＤＮＡ(「Ｌ－Ｋ」と称する)重要な特性は、次のとおりである。ｌｏｘ５１７１位置(９３１)；イニシエーターメチオニンコドンを欠くが、インフレームであり、ｌｏｘ５１７１位置(９３１)における中断されていないオープンリーディングフレームと連続的であるネオマイシン耐性遺伝子オープンリーディングフレーム(９４７)；ＦＲＴ位置(９２７)；各々マウス非コード制御または足場配列に包埋されたイヌコード配列を伴う、７６個の機能的イヌＶλ可変領域遺伝子セグメント(９５１)のアレイ；所望により、マウスκ鎖座位のＪκ領域遺伝子セグメントのクラスターのすぐ上流の１３.５Kb片のゲノムＤＮＡ(示していない)；マウス非コードＤＮＡに包埋された７イヌＪλ領域遺伝子セグメントを含む２Kb片のＤＮＡ(９５５)；ｌｏｘ５１７１位置(９３１)に対する逆相対配向のｌｏｘＰ位置(９３７)。(イヌは９個の機能的Ｊλ領域遺伝子セグメントを有するが、しかしながら、Ｊλ４とＪλ９およびＪλ７とＪλ８のコードされるタンパク質配列は同一であり、よって、７個のＪλ遺伝子セグメントのみが含まれる。)
Ｋ－ＫおよびＬ－Ｋトランスフェクション実験からのトランスフェクトクローンをＧ４１８選択下に置き、これは、部分的にイヌのドナーＤＮＡ(９０９)が、それぞれ５’(９０３)および３’(９０５)ベクターにより配置された、ｌｏｘ５１７１(９３１)とｌｏｘＰ(９３７)位置の間の欠失免疫グロブリンκ鎖座位に全体として統合されている、ＲＭＣＥを受けている、細胞のクローンについて濃縮する。ＲＭＣＥを適切に受けている細胞のみがネオマイシン耐性遺伝子(９４７)を発現する能力を有し、これは、その発現に必要であるプロモーター(９２９)およびイニシエーターメチオニンコドン(９３５)がベクター(９０９)に存在しないが、宿主細胞Ｉｇｈ座位(９０７)に既に予め存在するためである。Ｋ－Ｋ配列を使用して作ったＤＮＡ領域を、９１１に示す。５’ベクター(９０３)からの残りの要素は、インビトロまたはインビボでＦｌｐ介在組み換え(９０６)により除去され、９１３に示す最終イヌベースの軽鎖座位をもたらす。
Ｇ４１８耐性ＥＳ細胞クローンを、望まない再配列または欠失なく予測されたＲＭＣＥ過程を受けていることを決定するために、ＰＣＲおよびサザンブロッティングにより分析する。予測されたゲノム構造を有するＫ－ＫおよびＬ－Ｋクローン両方を、さらなる使用のために選択する。
標準法により部分的にＥＳ細胞由来キメラマウスを作るために、マウスκ鎖座位(９１３)に部分的にイヌの免疫グロブリンＤＮＡを担持するＫ－Ｋ ＥＳ細胞クローンおよびＬ－Ｋ ＥＳ細胞クローンを、ＤＢＡ／２系統からのマウス胚盤胞に微量注入する。外被に最高レベルのＥＳ細胞由来寄与を有する雄キメラマウスを、雌マウスとの交配のために選択する。交配における使用のために選択する雌マウスは、Ｃ５７Ｂ１／６ＮＴａｃ系統であり、また生殖系列で発現されるＦｌｐリコンビナーゼをコードする導入遺伝子も担持する。これら交配による子孫を、部分的にイヌの免疫グロブリンκまたはλ軽鎖座位の存在およびＲＭＣＥ工程により作られたＦＲＴ隣接ネオマイシン耐性遺伝子の喪失について分析する。部分的にイヌの座位を担持するマウスを、Ｋ－ＫおよびＬ－Ｋマウスのコロニーの確立のために使用する。
実施例３に記載のとおり産生した部分的にイヌの重鎖座位を担持するマウスを、イヌベースのκ鎖座位を担持するマウスと交配させ得る。それらの子孫を、次いで、最終的に両イヌベースの座位についてホモ接合型である、すなわち、重鎖およびκについてイヌベースであるマウスを産生するスキームで共に交配させる。このようなマウスは、イヌ可変ドメインおよびマウス定常ドメインを有する部分的にイヌの重鎖を産生する。また、イヌκ可変ドメインおよびκ座位からのマウスκ定常ドメインを有する部分的にイヌのκタンパク質も産生する。これらのマウスから回収したモノクローナル抗体は、イヌκ可変ドメインと対合したイヌ重鎖可変ドメインを有する。
繁殖スキームのバリエーションは、イヌベースの重鎖座位についてホモ接合であるが、κ座位において、一方の染色体にＫ－Ｋイヌベースの座位を有し、他方の染色体にＬ－Ｋイヌベースの座位を有するようにヘテロ接合であるマウスの産生を含む。このようなマウスは、イヌ可変ドメインおよびマウス定常ドメインを有する部分的にイヌの重鎖を産生する。イヌκ可変ドメインおよびκ座位の一方からのマウスκ定常ドメインを含む部分的にイヌのκタンパク質も産生する。他方のκ座位から、イヌλ可変ドメインおよびマウスκ定常ドメインを有する部分的にイヌのλタンパク質を産生する。これらマウスから回収したモノクローナル抗体は、ある場合にはイヌκ可変ドメインとそして他の場合にはイヌλ可変ドメインと対合したイヌ可変ドメインを有する。
実施例５：マウスゲノムの免疫グロブリンλ鎖遺伝子座位への操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位の導入
マウスゲノムの一部を操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位で置き換える他の方法を、図１０に示す。この方法は、Ｊλ３、Ｃλ３、Ｊλ１およびＣλ１ λ遺伝子クラスター(１０２３)のすぐ近くのＶλｘ／Ｖλ２遺伝子セグメント(１０１３)の上流およびＶλ１遺伝子セグメント(１０１７)の下流の両方の座位と同一性を共有するターゲティングベクター(１００３)を含む相同組み換え法による、野生型マウス免疫グロブリンλ座位(１００１) － Ｖλｘ／Ｖλ２遺伝子セグメント(１０１３)、Ｊλ２／Ｃλ２遺伝子クラスター(１０１５)およびＶλ１遺伝子セグメント(１０１７)を含む － からの約１９４KbのＤＮＡの欠失を含む。ベクターは、１９４KbのＤＮＡを、ＤＮＡの非天然片がＲＭＣＥ(１００４)により修飾Ｖλ座位に移動する、その後の部位特異的組み換えを可能にするよう設計された要素で置き換える。この例において、非天然ＤＮＡは、イヌおよびマウス配列両者を含む、合成核酸である。
１９４Kb欠失の達成のための遺伝子ターゲティングベクター(１００３)の重要な特性は次のとおりである。ジフテリア毒素のＡサブユニット(ＤＴＡ、１０５９)または単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子(示していない)をコードする遺伝子などの負の選択遺伝子；λ座位におけるマウスＶλｘ／Ｖλ２可変領域遺伝子セグメントの５’からの４KbのゲノムＤＮＡ(１０２５)；ＦＲＴ位置(１０２７)；マウスＰｏｌｒ２ａ遺伝子プロモーターを含むゲノムＤＮＡ片(１０２９)；翻訳開始配列(「コザック」コンセンサス配列に包埋されたメチオニンコドン)(１０３５)；Ｃｒｅリコンビナーゼに対する変異ｌｏｘＰ認識配列(ｌｏｘ５１７１)(１０３１)；転写終結／ポリアデニル化配列(１０３３)；ピューロマイシン耐性に寄与するタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム(１０３７)、ここで、このオープンリーディングフレームはＰｏｌｒ２ａプロモーターおよびその横の翻訳開始配列に対してアンチセンス鎖にあり、それ自身の転写終結／ポリアデニル化配列が続く(１０３３)；Ｃｒｅリコンビナーゼに対するｌｏｘＰ認識配列(１０３９)；ピューロマイシン耐性遺伝子オープンリーディングフレームと同じアンチセンス鎖の翻訳開始配列(「コザック」コンセンサス配列に包埋されたメチオニンコドン)(１０３５)；ピューロマイシン耐性オープンリーディングフレームの転写を支持するよう配向されたニワトリベータアクチンプロモーターおよびサイトメガロウイルス早期エンハンサー要素(１０４１)であって、全てＰｏｌｒ２ａプロモーターおよびその横の翻訳開始配列に対してアンチセンス鎖であるｌｏｘＰ位置の下流の開始コドンで翻訳が開始され、ｌｏｘＰ位置からピューロマイシンオープンリーディングフレームに逆に進む；「Ｆ３」位置として知られるＦｌｐリコンビナーゼに対する変異認識位置(１０４３)；Ｊλ３、Ｃλ３、Ｊλ１およびＣλ１遺伝子セグメントの上流のゲノムＤＮＡ片(１０４５)。
広く使用される方法により、Ｃ５７Ｂ１／６ＮＴａｃマウス由来のマウス胚幹(ＥＳ)細胞を、ターゲティングベクター(１００３)でのエレクトロポレーションによりトランスフェクトする(１００２)。相同組み換えは、天然ＤＮＡを１９６Kb領域においてターゲティングベクター(１００３)からの配列と置き換え、１００５に示すゲノムＤＮＡ配置をもたらす。
エレクトロポレーション前、ベクターＤＮＡを、原核生物プラスミド配列またはそれと結合したポリリンカーしか切断しない希少切断制限酵素で線形化する。トランスフェクト細胞を播種し、約２４時間後、ピューロマイシンを使用する正の薬物選択下に置く。ベクターがＤＮＡに統合されているが、相同組み換えによってではない細胞について負の選択もある。非相同組み換えは、遺伝子が発現されたとき細胞を死滅させるＤＴＡ遺伝子の保持をもたらし、一方、相同組み換えでは、マウスＩＧＬ座位のベクター相同性の領域外にあるため、ＤＴＡ遺伝子は欠失される。薬物耐性ＥＳ細胞のコロニーを、約１週間後、視認できるようになった後、物理的に摘出する。これら選択したコロニーを脱凝集させ、マイクロウェルプレートに再播種し、数日間培養する。その後、細胞のクローンの各々を、一部細胞をアーカイブとして凍結し、残りを分析目的でのＤＮＡの単離に使用できるように、分ける。
広く実施されている遺伝子ターゲティングアッセイデザインを使用するＰＣＲにより、ＥＳ細胞クローンからのＤＮＡをスクリーニングする。これらアッセイについて、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー配列の一方は、ターゲティングベクターおよびゲノムＤＮＡの間で共有される同一性の領域外にマッピングされ、他方は、ベクターのゲノム同一性の２アーム間の新規ＤＮＡ内、例えば、ｐｕｒｏ遺伝子(１０３７)にマッピングされる。標準デザインにより、これらのアッセイは、ターゲティングベクター(１００３)と天然ＤＮＡ(１００１)の間の十分に合理的な相同組み換えを受けたトランスフェクト細胞由来のＥＳ細胞のクローンにしか存在しないであろうＤＮＡ片を検出する。
トランスフェクション(１００２)からの６個のＰＣＲ陽性クローンを拡大と、続くサザンブロットアッセイを使用するさらなる分析のために選択する。サザンブロットは、プローブおよび消化物の組み合わせは、ＥＳ細胞ＤＮＡが相同組み換えにより適切に修飾されているか否かの同定を可能とするように選択した複数制限酵素で消化されたクローンからの３個のプローブおよびゲノムＤＮＡを含む。
ＥＳ細胞の６個のＰＣＲおよびサザンブロット陽性クローンの核型を、マウスＥＳ細胞で生ずる最も一般的染色体異常と区別するよう設計されたインサイチュ蛍光ハイブリダイゼーション法を使用して分析する。異常の証拠を示すクローンは、さらなる使用から除外する。サザンブロットデータに基づき、予測された正確なゲノム構造を有すると判断された核型的に正常なクローンを、さらなる使用のために選択する。
免疫グロブリンλ鎖座位の２個の相同コピーの一方の欠失を担持するＥＳ細胞クローンを、Ｖλ、ＪλおよびＣλ領域遺伝子セグメントを含む部分的にイヌの免疫グロブリンλ鎖座位を含むＤＮＡ(１００７)片と共に、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターで再トランスフェクトする(１００４)。このＤＮＡ(１００７)片の重要な特性は、次のとおりである。ｌｏｘ５１７１位置(１０３１)；イニシエーターメチオニンコドンを欠くが、ｌｏｘ５１７１位置でインフレームであり、中断されていないオープンリーディングフレームと連続的であるネオマイシン耐性遺伝子オープンリーディングフレーム(１０４７)；ＦＲＴ位置１０２７)；各々マウスλ非コード配列に包埋されたイヌλコード配列を伴う、７６個の機能的イヌλ領域遺伝子セグメントのアレイ(１０５１)；各単位がイヌＪλ遺伝子セグメントおよびマウスλ定常ドメイン遺伝子セグメントからの非コード配列に包埋されているイヌＪλ遺伝子セグメントおよびマウスλ定常ドメイン遺伝子セグメントを有する、Ｊ－Ｃ単位のアレイ(１０５５)(イヌＪλ遺伝子セグメントはＪλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ４、Ｊλ５、Ｊλ６およびＪλ７をコードするものであるのに対し、マウスλ定常ドメイン遺伝子セグメントはＣλ１またはＣλ２またはＣλ３である)；「Ｆ３」位置として知られるＦｌｐリコンビナーゼに対する変異認識位置(１０４３)；構築物における免疫グロブリン遺伝子セグメントコード情報に対してアンチセンス鎖に位置するハイグロマイシン耐性を付与するオープンリーディングフレーム(１０５７)；ｌｏｘ５１７１位置に対する逆相対配向のｌｏｘＰ位置(１０３９)。
イヌＶλおよびＪλ遺伝子コード領域の配列は表３に示される。
トランスフェクトクローンをＧ４１８またはハイグロマイシン選択下に置き、これは、部分的にイヌのドナーＤＮＡが、遺伝子ターゲティングベクターによりそこに置かれたｌｏｘ５１７１およびｌｏｘＰ位置の間の欠失免疫グロブリンλ鎖座位に全体として統合される、ＲＭＣＥ過程に付された細胞のクローンを濃縮する。ターゲティングベクター(１００３)からの残りの要素は、インビトロまたはインビボでＦＬＰ介在組み換え(１００６)インビトロまたはインビボにより除去され、１０１１に示す最終イヌ化座位をもたらす。
Ｇ４１８／ハイグロマイシン耐性ＥＳ細胞クローンを、望まない再配列または欠失なく予測されたリコンビナーゼ介在カセット交換過程を受けているかを決定するために、ＰＣＲおよびサザンブロッティングにより分析する。予測されたゲノム構造を有するクローンを、さらなる使用のために選択する。
標準法により部分的にＥＳ細胞由来キメラマウスを作るために、マウスλ鎖座位に部分的にイヌの免疫グロブリンＤＮＡ(１０１１)を担持するＥＳ細胞クローンを、ＤＢＡ／２系統からのマウス胚盤胞に微量注入する。外被に最高レベルのＥＳ細胞由来寄与を有する雄キメラマウスを、雌マウスとの交配のために選択する。ここで選択される雌マウスは、生殖系列で発現されるＦｌｐリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を担持するＣ５７Ｂ１／６ＮＴａｃ系統である。これら交配からの子孫を、部分的にイヌの免疫グロブリンλ鎖座の存在およびＲＭＣＥ工程で作られたＦＲＴ隣接ネオマイシン耐性遺伝子およびＦ３隣接ハイグロマイシン耐性遺伝子の喪失について分析する。部分的にイヌの座位を担持するマウスを、マウスのコロニーの確立のために使用する。
ある態様において、イヌベースの重鎖およびκ座位(実施例３および４に記載のとおり)を含むマウスを、イヌベースのλ座位を担持するマウスと交配させる。このタイプの交配スキームにより産生されたマウスは、イヌベースの重鎖座位についてホモ接合であり、Ｋ－Ｋイヌベースの座位またはＬ－Ｋイヌベースの座位についてホモ接合であり得る。あるいは、κ座位で一方の染色体にＫ－Ｋ座位および他方の染色体にＬ－Ｋ座位を担持するヘテロ接合であり得る。これらマウス系統の各々は、イヌベースのλ座位についてホモ接合である。これらマウスから回収したモノクローナル抗体は、ある場合、イヌκ可変ドメインとそして他の場合イヌλ可変ドメインと対合したイヌκ可変ドメインを有する。λ可変ドメインは、イヌベースのＬ－Ｋ座位またはイヌベースのλ座位に由来する。
実施例６：マウスゲノムへの操作された部分的にイヌの免疫グロブリンミニ座位の導入
ある他の態様において、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、図１１に示すもののようなイヌ可変ドメインミニ座位を含む。ここで、イヌＶＨ遺伝子セグメントコード配列の全てまたは実質的に全てを含む部分的にイヌの免疫グロブリン座位の代わりに、マウス免疫グロブリン座位を、機能的であると決定された、すなわち、シュード遺伝子ではない、少ないキメライヌＶＨ遺伝子セグメント、例えば１～３９個のイヌＶＨ遺伝子セグメントを含む、ミニ座位(１１１９)で置き換える。
統合すべき部分的にイヌの免疫グロブリン座位を含む部位特異的ターゲティングベクター(１１３１)を、ｐｕｒｏ－ＴＫ遺伝子(１１０５)および次のフランキング配列特異的組み換え位置：変異体ＦＲＴ位置(１１０９)、変異体ＬｏｘＰ位置(１１１１)、野生型ＦＲＴ位置(１１０７)および野生型ＬｏｘＰ位置(１１０５)を含む内因性免疫グロブリン座位の欠失と共に、ゲノム領域(１１０１)に導入する(１１０２)。部位特異的ターゲティングベクターは、ｉ)任意のＰＡＩＲ要素のアレイ(１１４１)；ii)例えば、１～３９個の機能的イヌＶＨコード領域およびマウスゲノム内因性配列に基づく介在配列を含む、ＶＨ座位(１１１９)；iii)マウス配列を含む２１.６kb ｐｒｅ－Ｄ領域(１１２１)；iv)６個のＤおよび６個のＪＨイヌコード配列およびマウスゲノム内因性配列に基づく介在配列を含むＤ座位(１１２３)およびＪＨ座位(１１２５)を含む。部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、修飾内因性座位での組み換えを可能とする組み換え位置 － 変異体ＦＲＴ(１１０９)、変異体ＬｏｘＰ(１１１１)、野生型ＦＲＴ(１１０７)および野生型ＬｏｘＰ(１１０５) － が隣接する。適切なリコンビナーゼ、例えば、Ｃｒｅ)(１１０４)の導入により、部分的にイヌの免疫グロブリン座位は、１１２９に示すとおり、定常遺伝子領域(１１２７)の上流のゲノムに統合される。
実施例１に記載のとおり、部分的にイヌの免疫グロブリン可変領域座位の導入のための一次スクリーニングは、二次サザンブロッティングアッセイにより支持される一次ＰＣＲスクリーニングにより実施される。組み換え事象の一部としてのｐｕｒｏ－ＴＫ遺伝子(１１０５)の欠失は、ガンシクロビル負の選択を使用して組み換え事象に付されなかった細胞の同定を可能とする。
実施例７：κ免疫グロブリン非コード配列に包埋されたマウスλ定常領域配列を伴うイヌλ可変領域コード配列を伴う操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位の導入
イヌ抗体は大部分λ軽鎖を含み、一方マウス抗体は大部分κ軽鎖を含む。λＬＣ含有抗体の産生を増加させるために、内因性マウスＶκおよびＪκを、実施例４のＬ－ＫマウスであるマウスＶκ領域フランキングおよび制御配列で包埋されたＶλおよびＪλ遺伝子セグメントコード配列を含む部分的にイヌの座位で置き換える。このようなマウスにおいて、高レベルκ座位再配列および発現を促進する内因性制御配列は、異所性λ座位で同等な効果を有すると予測される。しかしながら、インビトロ試験は、イヌＶλドメインがマウスＣκで十分に機能しないことを示した(実施例９参照)。故に、Ｌ－ＫマウスにおけるλＬＣ含有抗体の予測された増加は生じていないはずである。別の戦略として、内因性マウスＶκおよびＪκを、マウスＶκ領域フランキングおよび制御配列で置き換え、マウスＣκをマウスＣλで包埋されたＶλおよびＪλ遺伝子セグメントコード配列を含む部分的にイヌの座位で置き換える。
図１３は、１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列が、１以上の齧歯類Ｃλ領域コード配列の上流である、１以上のイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列の上流の齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖座位に挿入される操作された部分的にイヌの軽鎖可変領域座位の導入を説明する模式図である。
マウスゲノムの一部を部分的にイヌの免疫グロブリン座位で置き換える方法は、図１３に示す。この方法は、まず、マウスゲノムの内因性Ｖκ(１３１５)およびＪκ(１３１９)領域遺伝子セグメントのクラスターの５’または３’ならびにＣκ(１３２１)エクソンに導入され得る、マウスゲノムへの第一部位特異的リコンビナーゼ認識配列の導入、続いて第一配列特異的組み換え位置と組み合わせて、ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントのクラスターおよびＣκエクソンを含む座位全体に隣接する第二部位特異的リコンビナーゼ認識配列のマウスゲノムへの導入を含む。ここに記載する、適切な部位特異的リコンビナーゼを使用して、隣接領域が欠失され、次いで、部分的にイヌの免疫グロブリン座位で置き換えられる。
Ｖκ(１３１５)遺伝子セグメントおよびＣκエクソン(１３２１)の何れかの側の部位特異的組み換え配列の導入に用いるターゲティングベクターも、リコンビナーゼによりなお効率的に認識されるが、非修飾位置と組み換わらないように修飾されている、さらなる部位特異的組み換え配列を含む。この位置は、ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントクラスターおよびＣκエクソンの欠失後、ＤＮＡの非天然片がＲＭＣＥにより修飾Ｖκ座位に移動する第二位置特異的組み換え事象に使用できるように、ターゲティングベクターに位置する。この例において、非天然ＤＮＡは、マウスＩＧＫ制御およびフランキング配列に包埋されたイヌＶλおよびＪλ遺伝子セグメントコード配列ならびにマウスＣλエクソンを含む、合成核酸である。
前記にに概説したとおりの方法を達成するために、２個の遺伝子ターゲティングベクターが構築される。一方のベクター(１３０３)は、最遠位Ｖκ遺伝子セグメントの上流、座位の５’末端から取ったマウスゲノムＤＮＡを含む。他のベクター(１３０５)は、Ｃκエクソン(１３２１)の上流(５’)および下流(３’)に及ぶ領域における座位内から取る。
５’ベクター(１３０３)の重要な特性は、次のとおりである。ポリオーマウイルスからの２個の変異体転写エンハンサーに結合した修飾単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ遺伝子プロモーターの制御下にジフテリア毒素Ａ(ＤＴＡ)サブユニットをコードする遺伝子(１３２３)；κ鎖座位に最も遠位可変領域遺伝子の上流にマッピングされる６KbのマウスゲノムＤＮＡ(１３２５)；ＦｌｐリコンビナーゼについてのＦＲＴ認識配列(１３２７)；マウスＰｏｌｒ２ａ遺伝子プロモーターを含むゲノムＤＮＡ片(１３２９)；翻訳開始配列(１３３５、「コザック」コンセンサス配列に包埋されたメチオニンコドン)；Ｃｒｅリコンビナーゼに対する変異ｌｏｘＰ認識配列(ｌｏｘ５１７１)(１３３１)；転写終結／ポリアデニル化配列(１３３３)；Ｃｒｅリコンビナーゼに対するｌｏｘＰ認識配列(１３３７)；マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１遺伝子からのプロモーターの転写制御下にチミジンキナーゼ(ｐｕ－ＴＫ)の切断形態に融合したピューロマイシンに対する耐性を付与するタンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子(１３３９)；ベクターにおける５’末端で６Kb配列近くにマッピングされ、天然相対配向で配置される、２.５KbのマウスゲノムＤＮＡ(１３４１)。
３’ベクター(１３０５)の重要な特性は、次のとおりである。Ｃκエクソンの上流(５’)および下流(３’)下流に及ぶ領域における座位内にマッピングされる６KbのマウスゲノムＤＮＡ(１３４３)(１３２１)；マウスＰｏｌｒ２ａ遺伝子プロモーター(１３４５)の転写制御下にヒトヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＰＲＴ)をコードする遺伝子；マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１遺伝子プロモーター制御下のネオマイシン耐性遺伝子(１３４７)；Ｃｒｅリコンビナーゼに対するｌｏｘＰ認識配列(１３３７)；ベクターの５’末端に含まれる６Kb ＤＮＡフラグメントのゲノムのすぐ下流にマッピングされ、マウスゲノムにおけるのと同じ相対的方向で配向された２個のフラグメントを有する、３.６KbのマウスゲノムＤＮＡ(１３４９)；ポリオーマウイルスからの２個の変異体転写エンハンサーに結合した修飾単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ遺伝子プロモーターの制御下にジフテリア毒素Ａ(ＤＴＡ)サブユニットをコードする遺伝子(１３２３)。
内因性マウスＩＧＫ座位を欠失させる一つの戦略は、３’ベクター(１３０５)のマウスＣκエクソン(１３２１)の下流の隣接領域への導入である。しかしながら、修飾座位に保持されるために必要である３’κエンハンサーは、計９.６Kbである、３’ベクターの上流および下流相同性アームに存在するには短すぎる、Ｃκエクソンの９.１Kb下流に位置する。それ故に、相同性の上流領域を拡大した。
広く使用される方法により、Ｃ５７Ｂ１／６ＮＴａｃマウス由来のマウス胚幹(ＥＳ)細胞を、３’ベクター(１３０５)でのエレクトロポレーションにより、３’ベクター(１３０５)でトランスフェクトする。エレクトロポレーション前、ベクターＤＮＡを、原核生物プラスミド配列またはそれと結合したポリリンカーしか切断しない希少切断制限酵素で線形化する。トランスフェクト細胞を播種し、約２４時間後、ネオマイシンアナログ薬物Ｇ４１８を使用するＤＮＡに統合された３’ベクターを有する細胞について正の選択下に置く。ベクターがＤＮＡに統合されているが、相同組み換えによってではない細胞について負の選択もある。非相同組み換えは、遺伝子が発現されたとき細胞を死滅させるＤＴＡ遺伝子を保持するが、ＤＴＡ遺伝子は、マウスＩｇκ座位とのベクター相同性の領域外にあるため、相同組み換えにより欠失される。薬物耐性ＥＳ細胞のコロニーを、約１週間後、視認できるようになった後、プレートから物理的に摘出する。これらコロニーを脱凝集させ、マイクロウェルプレートに再播種し、数日間培養する。その後、細胞のクローンの各々を分ける － 細胞の一部はアーカイブとして凍結され、残りは分析目的でＤＮＡの単離に使用される。
広く実施されている遺伝子ターゲティングアッセイデザインを使用するＰＣＲにより、ＥＳ細胞クローンからのＤＮＡをスクリーニングする。このアッセイについて、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー配列の一方は、３’ベクター(１３０５)とゲノムＤＮＡ(１３０１)の間で共有される同一性の領域外にマッピングされ、他方は、ベクターにおけるゲノム同一性の２アームの間の新規ＤＮＡ内、すなわち、ＨＰＲＴ(１３４５)またはネオマイシン耐性(１３４７)遺伝子にマッピングされる。標準デザインにより、これらのアッセイは、３’ベクター(１３０５)と内因性マウスＩｇκ座位の間の十分に合理的な相同組み換えを受けたトランスフェクト細胞由来のＥＳ細胞のクローンにしか存在しないであろうＤＮＡ片を検出する。２回の別々のトランスフェクションを、３’ベクター(１３０５)で実施する。２回のトランスフェクションからのＰＣＲ陽性クローンを拡大のために選択し、その後、サザンブロットアッセイを使用してさらに分析する。
プローブおよび消化物の組み合わせが、クローンの標的座位の構造および相同組み換えにより適切に修飾されたか否かの結論を可能とするように選択された複数制限酵素で消化した３個のプローブおよびゲノムＤＮＡを使用して、広く使用される方法に従い実施する。第一プローブは、３’κターゲティングベクター(１３０５)とゲノムＤＮＡの間で共有される同一性の領域の５’側に隣接するＤＮＡ配列にマッピングされる；第二プローブも、同一性の領域外であるが、３’側にマッピングされる；第三プローブは、ベクターにおけるゲノム同一性の２アームの間の新規ＤＮＡ内、すなわち、ＨＰＲＴ(１３４５)またはネオマイシン耐性(１３４７)遺伝子にマッピングされる。サザンブロット、外部プローブの一方およびネオマイシンまたはＨＰＲＴ遺伝子プローブで検出して、正しく、すなわち、３’κターゲティングベクター(１３０５)との相同組み換えにより、変異された、κ座位の部分に対応するＤＮＡの予測される制限酵素産生フラグメントの存在を同定する。外部プローブは、変異体フラグメントおよびまた相同染色体の免疫グロブリンκ座位の非変異体コピーからの野生型フラグメントも検出する。
マウスＥＳ細胞で起こる最も一般的に生ずる染色体異常と区別するために設計されたインサイチュ蛍光ハイブリダイゼーション法を使用して、ＥＳ細胞のＰＣＲおよびサザンブロット陽性クローンの核型を分析する。このような異常があるクローンはさらなる使用から除外する。サザンブロットデータに基づき、予測された正確なゲノム構造を有すると判断された核型的に正常なクローンを、さらなる使用のために選択する。
次いで、許容されるクローンを、選択のためにＧ４１８／ネオマイシンの代わりにピューロマイシン選択を使用し、プロトコールを５’ベクター(１３０３)によるゲノム領域修飾に適合するよう調製する以外、３’ベクター(１３０５)で使用したのに類似する設計の方法およびスクリーニングアッセイを使用して、５’ベクター(１３０３)で修飾する。５’ベクター(１３０３)トランスフェクション実験の目的は、３’ベクター(１３０５)および５’ベクター(１３０３)の両方により予測される形態で変異されているＥＳ細胞のクローン、すなわち、操作された変異両方を有する二重標的細胞を、単離することである。これらクローンにおいて、Ｃｒｅリコンビナーゼは、２個のベクターにより、κ座位に導入されたｌｏｘＰ位置の間で組み換え(１３０２)を起こし、１３０７に示すゲノムＤＮＡ配置をもたらす。
さらに、クローンは、相同染色体ではなく、同じ染色体上の遺伝子ターゲティングを受けていなければならない；すなわち、ターゲティングベクターにより作られた操作された変異が、別の相同ＤＮＡ鎖上のトランスではなく、同じＤＮＡ鎖上のシスでなければならない。シス配置に存在する新規ＤＮＡとハイブリダイズするプローブを使用する中期スプレッドの蛍光インサイチュハイブリダイゼーションなどの分析法により、トランス配置のものと分ける。２タイプのクローンは、また、ターゲティングベクターがシスで統合されているならばｐｕ－Ｔｋ(１３３９)、ＨＰＲＴ(１３４５)およびネオマイシン耐性(１３４７)遺伝子を欠失させるＣｒｅリコンビナーゼを発現するベクターでトランスフェクトし、次いで、５’ベクター(１３０３)により導入されたチミジンキナーゼ遺伝子に対するガンシクロビル選択で生存するコロニー数を比較し、そして、クローンからの一部細胞をピューロマイシンまたはＧ４１８／ネオマイシンに対する耐性について試験する、「同胞選択」スクリーニング法による生存クローンの薬物耐性表現型の分析により、互いに区別できる。シス配置の変異を有する細胞は、トランス配置を有する細胞より、約１０３多くガンシクロビル耐性クローンを産生すると予測される。得られたシス由来ガンシクロビル耐性クローンの大部分は、ピューロマイシンおよびＧ４１８／ネオマイシン両剤に対する耐性を保持するはずであるトランス由来ガンシクロビル耐性クローンと比較して、両剤にまた感受性である。κ鎖座位におけるシス配置の操作された変異を有する細胞の二重標的クローンを、さらなる使用のために選択する。
細胞の二重標的クローンを、上に要約した分析実験におけるとおり、一過性にＣｒｅリコンビナーゼを発現するベクター(１３０２)でトランスフェクトし、続いて、トランスフェクト細胞をガンシクロビル選択下に置く。細胞のガンシクロビル耐性クローンを単離し、５’ベクター(１３０３)および３’ベクター(１３０５)により作られた２個の操作された変異の間の予測された欠失(１３０７)の存在についてＰＣＲおよびサザンブロットにより分析する。これらクローンにおいて、Ｃｒｅリコンビナーゼは、２個のベクターによりκ鎖座位に導入されたｌｏｘＰ位置(１３３７)の間で組み換えを生じさせる。ＬｏｘＰ位置が２個のベクターで同じ相対配向で配置されるため、組み換えは、２個のｌｏｘＰ位置間のゲノム間隔全体を含む、ＤＮＡの輪の切除をもたらす。輪は複製起点を含まず、故に、有糸分裂の間複製せず、それゆえにクローン増殖するに連れて細胞から失われていく。得られたクローンは、もともと２個のｌｏｘＰ位置間にあったＤＮＡの欠失を担持し、１３０７に示すゲノム構造を有する。予測される欠失を有するクローンを、さらなる使用のために選択する。
免疫グロブリンκ鎖座位の２個の相同コピーの一方に配列欠失を担持するＥＳ細胞クローンを、Ｖλ(１３５１)およびＪλ(１３５５)遺伝子セグメントコード配列およびマウスＣλエクソン(１３５７)を含む部分的にイヌの免疫グロブリンλ鎖座位を含むＤＮＡ(１３０９)片と共に、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターで再トランスフェクトする(１３０４)。この合成ＤＮＡ片の重要な特性は次のとおりである。ｌｏｘ５１７１位置(１３３１)；ネオマイシン耐性遺伝子オープンリーディングフレーム(１３４７、イニシエーターメチオニンコドンを欠くが、ｌｏｘ５１７１位置(１３３１)でインフレームであり、中断されていないオープンリーディングフレームと連続的である)；ＦＲＴ位置(１３２７)；各々マウス非コード制御または足場配列に包埋されたイヌコード配列を伴う、１～７６個の機能的イヌＶλ可変領域遺伝子セグメント(１３５１)のアレイ；所望により、マウスκ鎖座位のＪκ領域遺伝子セグメントのクラスターのすぐ上流の１３.５Kb片のゲノムＤＮＡ(示していない)；マウス非コードＤＮＡに包埋された１～７個のイヌＪλ領域遺伝子セグメントを含む２Kb片のＤＮＡ(１３５５)およびマウスＣλエクソン(１３５７)；ｌｏｘ５１７１位置(１３３１)に対する逆相対配向のｌｏｘＰ位置(１３３７)。ＤＮＡ片は欠失ｉＥκも含む(示していない)。
イヌＶλおよびＪλ遺伝子コード領域の配列は表３に示されている。
トランスフェクト細胞をＧ４１８選択下に置き、これは、部分的にイヌのドナーＤＮＡ(１３０９)がそれぞれ５’(１３０３)および３’(１３０５)ベクターにより配置されたｌｏｘ５１７１(１３３１)とｌｏｘＰ(１３３７)位置の間で欠失された免疫グロブリンκ鎖座位に、その全体が統合されているＲＭＣＥを受けている、細胞のクローンについて濃縮する。ＲＭＣＥを適切に受けている細胞のみがネオマイシン耐性遺伝子(１３４７)を発現する能力を有し、これは、その発現に必要であるプロモーター(１３２９)ならびにイニシエーターメチオニンコドン(１３３５)がベクター(１３０９)に存在しないが、宿主細胞ＩＧＫ座位(１３０７)に既に予め存在するためである。ＲＭＣＥにより作られるＤＮＡ領域は、１３１１に示す。５’ベクター(１３０３)からの残りの要素は、インビトロまたはインビボでＦｌｐ介在組み換え(１３０６)により除去され、１３１３に示す最終イヌベースの軽鎖座位をもたらす。
Ｇ４１８耐性ＥＳ細胞クローンを、望まない再配列または欠失なく予測されたＲＭＣＥ過程を受けていることを決定するために、ＰＣＲおよびサザンブロッティングにより分析する。予測されたゲノム構造を有するクローンを、さらなる使用のために選択する。
標準法により部分的にＥＳ細胞由来キメラマウスを作るために、マウスκ鎖座位(１３１３)に部分的にイヌの免疫グロブリンＤＮＡを担持するクローンを、ＤＢＡ／２系統からのマウス胚盤胞に微量注入する。外被に最高レベルのＥＳ細胞由来寄与を有する雄キメラマウスを、雌マウスとの交配のために選択する。交配における使用のために選択する雌マウスは、Ｃ５７Ｂ１／６ＮＴａｃ系統であり、また生殖系列で発現されるＦｌｐリコンビナーゼをコードする導入遺伝子も担持する。これら交配による子孫を、部分的にイヌの免疫グロブリンλ軽鎖座位の存在およびＲＭＣＥ工程により作られたＦＲＴ隣接ネオマイシン耐性遺伝子の喪失について分析する。部分的にイヌの座位を担持するマウスを、マウスのコロニーの確立に使用する。
実施例３に記載のとおり産生した部分的にイヌの重鎖座位を担持するマウスを、イヌλベースのκ鎖座位を担持するマウスと交配させ得る。それらの子孫を、次いで、最終的に両イヌベースの座位についてホモ接合型である、すなわち、重鎖およびλベースのλについてイヌベースであるマウスを産生するスキームで共に交配させる。このようなマウスは、イヌ可変ドメインおよびマウス定常ドメインを有する部分的にイヌの重鎖を産生する。また、イヌλ可変ドメインおよびκ座位からのマウスλ定常ドメインを有する部分的にイヌのλタンパク質も産生する。これらのマウスから回収したモノクローナル抗体は、イヌλ可変ドメインと対合したイヌ重鎖可変ドメインを有する。
繁殖スキームのバリエーションは、イヌベースの重鎖座位についてホモ接合であるが、κ座位において、一方の染色体に実施例４に記載するＫ－Ｋイヌベースの座位を有し、他方の染色体にこの実施例に記載する部分的にイヌのλベースのκ座位を有するようにヘテロ接合であるマウスの産生を含む。このようなマウスは、イヌ可変ドメインおよびマウス定常ドメインを有する部分的にイヌの重鎖を産生する。イヌκ可変ドメインおよびκ座位の一方からのマウスκ定常ドメインを含む部分的にイヌのκタンパク質も産生する。他方のκ座位から、イヌλ可変ドメインおよびマウスλ定常ドメインを含む部分的にイヌのλタンパク質が産生される。これらマウスから回収されるモノクローナル抗体は、ある場合イヌκ可変ドメインおよび他の場合イヌλ可変ドメインと対合したイヌ可変ドメインを含む。
実施例８. マウスκ免疫グロブリン非コード配列に包埋されたマウスλ定常領域配列を有するイヌλ可変領域コード配列を有する操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位の導入
この実施例は、内因性マウスＶκおよびＪκがマウスＶκ領域フランキングおよび制御配列に包埋されたイヌＶλおよびＪλ遺伝子セグメントコード配列を含む部分的にイヌの座位で置き換えられ、マウスＣκをマウスＣλに置き換える、実施例７の別の戦略を記載する。しかしながら、この実施例において、部分的にイヌの座位を含むターゲティングベクターの構造は異なる。イヌＶ遺伝子座位コード配列は、１～７６個の機能的Ｖλ遺伝子セグメントコード配列のどこかのアレイ、続いてＪλ－Ｃλタンデムカセットのアレイを含み、ここで、Ｊλはイヌ起源であり、Ｃλはマウス起源、例えば、Ｃλ１、Ｃλ２またはＣλ３である。カセット数は、特有の機能的イヌＪλ遺伝子セグメントの数である、１～７の範囲である。この実施例の部分的にイヌのλ座位の全体的構造は内因性マウスλ座位に類似し、一方実施例７における座位の構造は、その実施例で部分的にイヌのλ座位に置き換えられている内因性マウスκ座位に類似する。
図１４は、１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列がＪλ－Ｃλタンデムカセットのアレイの上流齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖座位に挿入された模式図を説明し、ここで、Ｊλはイヌ起源であり、Ｃλはマウス起源、例えば、Ｃλ１、Ｃλ２またはＣλ３である。
マウスゲノムの一部を部分的にイヌの免疫グロブリン座位で置き換える方法は、図１４に示す。この方法マウスゲノムの内因性Ｖκ(１４１５)およびＪκ(１４１９)領域遺伝子セグメントのクラスターおよびＣκ(１４２１)エクソンに導入され得る、マウスゲノムへの第一部位特異的リコンビナーゼ認識配列の導入、続いて第一配列特異的組み換え位置と組み合わせて、ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントのクラスターおよびＣκエクソンを含む座位全体に隣接する第二部位特異的リコンビナーゼ認識配列のマウスゲノムへの導入を含む。ここに記載する、適切な部位特異的リコンビナーゼを使用して、隣接領域が欠失され、次いで、部分的にイヌの免疫グロブリン座位で置き換えられる。
Ｖκ(１４１５)遺伝子セグメントおよびＣκエクソン(１４２１)の何れかの側の部位特異的組み換え配列の導入に用いるターゲティングベクターも、リコンビナーゼによりなお効率的に認識されるが、非修飾位置と組み換わらないように修飾されている、さらなる部位特異的組み換え配列を含む。この位置は、ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントクラスターおよびＣκエクソンの欠失後、ＤＮＡの非天然片がＲＭＣＥにより修飾Ｖκ座位に移動する第二位置特異的組み換え事象に使用できるように、ターゲティングベクターに位置する。この例において、非天然ＤＮＡは、マウスＩＧＫ制御およびフランキング配列に包埋された、イヌＶλ遺伝子セグメントコード配列のアレイおよびＪλはイヌ起源であり、Ｃλはマウス起源、例えば、Ｃλ１、Ｃλ２またはＣλ３であるＪλ－Ｃλタンデムカセットのアレイを含む、合成核酸である。
上記に概説したとおりの方法を達成するために、２個の遺伝子ターゲティングベクターが構築される。一方のベクター(１４０３)は、最遠位Ｖκ遺伝子セグメントの上流、座位の５’末端から取ったマウスゲノムＤＮＡを含む。他のベクター(１４０５)は、Ｃκエクソン(１３２１)の上流(５’)および下流(３’)に及ぶ領域における座位内から取る。
５’ベクター(１４０３)および３’ベクター(１４０５)の重要な特性は、実施例７に記載するとおりである。
広く使用される方法により、Ｃ５７Ｂ１／６ＮＴａｃマウス由来のマウス胚幹(ＥＳ)細胞を、３’ベクター(１４０５)でのエレクトロポレーションにより、３’ベクター(１４０５)で、実施例７に記載のとおり、トランスフェクトする。ＥＳ細胞クローンからのＤＮＡを、広く使用される遺伝子ターゲティングアッセイを使用して、実施例７に記載のとおり、ＰＣＲによりスクリーニングする。サザンブロットアッセイを、実施例７に記載されるとおり、広く使用される方法により、実施する。
マウスＥＳ細胞で起こる最も一般的に生ずる染色体異常と区別するために設計されたインサイチュ蛍光ハイブリダイゼーション法を使用して、ＥＳ細胞のＰＣＲおよびサザンブロット陽性クローンの核型を分析する。このような異常があるクローンはさらなる使用から除外する。サザンブロットデータに基づき、予測された正確なゲノム構造を有すると判断された核型的に正常なクローンを、さらなる使用のために選択する。
実施例７に記載の方法およびスクリーニングアッセイを使用して、許容されるクローンは、５’ベクター(１４０３)で修飾される。得られた正しく標的化されたＥＳクローンは、５’ベクター(１４０３)が内因性Ｖκ遺伝子セグメントの上流に挿入され、３’ベクター(１４０５)が内因性Ｃκの下流に挿入される、内因性κ座位のゲノムＤＮＡ配置を有する。これらクローンにおいて、Ｃｒｅリコンビナーゼは、２個のベクターによりκ座位に導入されたｌｏｘＰ位置間の組み換え(１４０２)を生じさせ、１４０７で示すゲノムＤＮＡ配置をもたらす。
許容されるクローンは、相同染色体とは逆に同じ染色体上の遺伝子ターゲティングに付され、その結果、ターゲティングベクターにより作られた操作された変異は、別々の相同ＤＮＡ鎖のトランスではなく、同じＤＮＡ鎖のシスである。シス配置のクローンは、実施例７に記載する分析法により、トランス配置のものと区別される。
細胞の二重標的クローンを、実施例７に記載のとおり、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するベクター(１４０２)で一過性にトランスフェクトし、続いて、トランスフェクト細胞を、ガンシクロビル選択下に置き、分析する。選択クローンにおいて、Ｃｒｅリコンビナーゼは、２個のベクターによりκ鎖座位に導入されたｌｏｘＰ位置(１４３７)間で組み換えが生ずるようにする。ＬｏｘＰ位置が２個のベクターで同じ相対配向で配置されるため、組み換えは、２個のｌｏｘＰ位置間のゲノム間隔全体を含む、ＤＮＡの輪の切除をもたらす。輪は複製起点を含まず、故に、有糸分裂の間複製せず、それゆえにクローン増殖するに連れて細胞から失われていく。得られたクローンは、もともと２個のｌｏｘＰ位置間にあったＤＮＡの欠失を担持し、１４０７に示すゲノム構造を有する。予測される欠失を有するクローンを、さらなる使用のために選択する。
免疫グロブリンκ鎖座位の２個の相同コピーの一方に配列の欠失を担持するＥＳ細胞クローンを、マウスＩＧＫフランキングおよび制御ＤＮＡ配列(１４５７)に包埋されたＶλ(１４５１)セグメントコード配列およびイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列およびマウスＣλエクソンを含むカセットのタンデムアレイを含む部分的にイヌの免疫グロブリンλ鎖座位を含むＤＮＡ(１４０９)の一片と共に、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターで再トランスフェクトする(１４０４)。この合成ＤＮＡ片の重要な特性は次のとおりである。ｌｏｘ５１７１位置(１４３１)；ネオマイシン耐性遺伝子オープンリーディングフレーム(１４４７、イニシエーターメチオニンコドンを欠くが、ｌｏｘ５１７１位置(１４３１)でインフレームであり、中断されていないオープンリーディングフレームと連続的である)；ＦＲＴ位置(１４２７)；各々マウス非コード制御または足場配列に包埋されたイヌコード配列を含む、１～７６個の機能的イヌＶλ可変領域遺伝子セグメント(１４５１)のアレイ；所望により、マウスκ鎖座位のＪκ領域遺伝子セグメントのクラスターのすぐ上流の１３.５Kb片のゲノムＤＮＡ(示していない)；マウスＩＧＫフランキングおよび制御ＤＮＡ配列に包埋された、イヌＪλ遺伝子セグメントコード配列およびマウスＣλエクソンを含むカセットのタンデムアレイを含むＤＮＡ(１４５７)；ｌｏｘ５１７１位置(１４３１)に対する逆相対配向のｌｏｘＰ位置(１４３７)。
イヌＶλおよびＪλ遺伝子コード領域の配列は表３に示されている。
トランスフェクト細胞をＧ４１８選択下に置き、これは部分的にイヌのドナーＤＮＡ(１４０９)が、それぞれ５’(１４０３)および３’(１４０５)ベクターによりそこに配置される免疫グロブリンκ鎖座位の間の欠失免疫グロブリンκ鎖座位に全体として統合された部分的にイヌのドナーＤＮＡ(１４０９)を含む、ＲＭＣＥを受けている、細胞のクローンについて濃縮する。ＲＭＣＥを適切に受けている細胞のみがネオマイシン耐性遺伝子(１４４７)を発現する能力を有し、これは、その発現に必要であるプロモーター(１４２９)ならびにイニシエーターメチオニンコドン(１４３５)がベクター(１４０９)に存在せず、宿主細胞ＩＧＫ座位(１４０７)に既に予め存在するためである。ＲＭＣＥにより作られるＤＮＡ領域は、１４１１に示す。５’ベクター(１４０３)からの残りの要素は、インビトロまたはインビボでＦｌｐ介在組み換え(１４０６)により除去され、１４１３に示す最終イヌベースの軽鎖座位をもたらす。
Ｇ４１８耐性ＥＳ細胞クローンを、望まない再配列または欠失なく予測されたＲＭＣＥ過程を受けていることを決定するために、ＰＣＲおよびサザンブロッティングにより分析する。予測されたゲノム構造を有するクローンを、さらなる使用のために選択する。
標準法により部分的にＥＳ細胞由来キメラマウスを作るために、マウスκ鎖座位(１４１３)に部分的にイヌの免疫グロブリンＤＮＡを担持するクローンを、ＤＢＡ／２系統からのマウス胚盤胞に微量注入する。外被に最高レベルのＥＳ細胞由来寄与を有する雄キメラマウスを、雌マウスとの交配のために選択する。交配における使用のために選択する雌マウスは、Ｃ５７Ｂ１／６ＮＴａｃ系統であり、また生殖系列で発現されるＦｌｐリコンビナーゼをコードする導入遺伝子も担持する。これら交配による子孫を、部分的にイヌの免疫グロブリンλ軽鎖座位の存在およびＲＭＣＥ工程により作られたＦＲＴ隣接ネオマイシン耐性遺伝子の喪失について分析する。部分的にイヌの座位を担持するマウスを、マウスのコロニーの確立に使用する。
実施例３に記載のとおり産生した部分的にイヌの重鎖座位を担持するマウスを、イヌλベースのκ鎖座位を担持するマウスと交配させ得る。それらの子孫を、次いで、最終的に両イヌベースの座位についてホモ接合型である、すなわち、重鎖およびλベースのκについてイヌベースであるマウスを産生するスキームで共に交配させる。このようなマウスは、イヌ可変ドメインおよびマウス定常ドメインを有する部分的にイヌの重鎖を産生する。また、イヌλ可変ドメインおよびκ座位からのマウスλ定常ドメインを有する部分的にイヌのλタンパク質も産生する。これらのマウスから回収したモノクローナル抗体は、イヌλ可変ドメインと対合したイヌ重鎖可変ドメインを有する。
繁殖スキームのバリエーションは、イヌベースの重鎖座位についてホモ接合であるが、κ座位において、一方の染色体に実施例４に記載するＫ－Ｋイヌベースの座位を有し、他方の染色体にこの実施例に記載する部分的にイヌのλベースのκ座位を有するようにヘテロ接合であるマウスの産生を含む。このようなマウスは、イヌ可変ドメインおよびマウス定常ドメインを有する部分的にイヌの重鎖を産生する。イヌκ可変ドメインおよびκ座位の一方からのマウスκ定常ドメインを含む部分的にイヌのκタンパク質も産生する。他方のκ座位から、イヌλ可変ドメインおよびマウスλ定常ドメインを有する部分的にイヌのλタンパク質を産生する。これらマウスから回収したモノクローナル抗体は、ある場合にはイヌκ可変ドメインとそして他の場合にはイヌλ可変ドメインと対合したイヌ可変ドメインを有する。
マウスκ免疫グロブリン非コード配列に包埋されたイヌλ可変領域コード配列およびマウスλ定常領域配列を有する操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位を導入する上記方法は、マウスＣκエクソンの欠失を含む。別の方法は、スプライス受容部位の変異によるＣκエクソンの不活性化を含む。イントロンは、核に位置する大型分子機構であるスプライソソームが、イントロンの５’(スプライスドナー)および３’(スプライスアクセプター)末端の配列ならびにスプライスアクセプターのすぐ上流に位置するポリピリミジントラクトを含むイントロンの他の特性を認識する、ＲＮＡスプライシングとして知られる過程により、一次ｍＲＮＡ転写物から除去されなければならない。ＤＮＡにおけるスプライスドナー配列はＮＧＴであり、ここで、「Ｎ」は何らかのデオキシヌクレオチドであり、スプライスアクセプターはＡＧＮである(Cech TR, Steitz JA and Atkins JF Eds. (2019)(RNA Worlds: New Tools for Deep Exploration, CSHL Press) ISBN 978-1-621822-24-0)。
マウスＣκエクソンは、スプライスアクセプター配列およびポリピリミジントラクトの変異により不活性化される。Ｃκエクソンの野生型配列上流は、ＣＴＴＣＣＴＴＣＣＴＣＡＧ(配列番号４７０)(スプライス受容部位は下線)である。ＡＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣ(配列番号４７１)に変異され、非機能的スプライス受容部位、そして故に非機能的Ｃκエクソンをもたらす。変異体配列は、ＰａｃＩ制限酵素位置(下線)も導入する。８塩基対認識配列として、この制限位置は、マウスゲノムで稀にしか存在しないと予測され(約６５,０００bp毎)、ＰａｃＩおよび他の高頻度の切断制限酵素で消化されているＥＳ細胞ＤＮＡのサザンブロット分析により、変異体配列がＩＧＫ座位に挿入されているか否かの確認を単純化する。野生型配列３’ ＲＭＣＥベクターの挿入に関して、当分野で広く知られる技術である、相同組み換えにより、変異体配列と置き換えられる。Ｃκエクソンスプライスアクセプター配列およびポリピリミジントラクトを変異する相同組み換えベクター(ＭＳＡ、１４５７)の重要な特性は、次のとおりである。Ｃκエクソンのすぐ上流の天然に位置における、野生型ＣＴＴＣＣＴＴＣＣＴＣＡＧ(配列番号４７０)配列の代わりの、Ｃκエクソン(１４２１)の上流(５’)および下流(３’)に及ぶκ座位内の領域にマッピングされ、変異体ＡＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣ(配列番号４７１)(１４５９)配列を含む、６KbのマウスゲノムＤＮＡ(１４４３)；マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１遺伝子プロモーター制御下にあり、変異体ＦＲＴ位置(１４６１)に隣接されるネオマイシン耐性遺伝子(１４４７)；ベクターの５’末端に含まれる６Kb ＤＮＡフラグメントのゲノムのすぐ下流にマッピングされ、マウスゲノムにおけるのと同じ相対的方向で配向された２個のフラグメントを有する、３.６KbのマウスゲノムＤＮＡ(１４４９)；ポリオーマウイルスからの２個の変異体転写エンハンサーに結合した修飾単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ遺伝子プロモーターの制御下にジフテリア毒素Ａ(ＤＴＡ)サブユニットをコードする遺伝子(１４２３)。変異体ＦＲＴ位置(１４６１)、例えば、ＦＲＴ Ｆ３またはＦＲＴ Ｆ５(Schlake and Bode (1994) Use of mutated FLP recognition target (FRT) sites for the exchange of expression cassettes at defined chromosomal loci. Biochemistry 33:12746-12751 PMID: 7947678 DOI: 10.1021/bi00209a003)が、ＦＬＰリコンビナーゼ発現ベクター(１４０６)の一過性トランスフェクションによりスプライシング変異が導入され、Ｎｅｏ遺伝子が欠失されたら、ＥＳ細胞がさらなる遺伝子操作に付されるため、ここで使用される。この過程は、他のＮｅｏ選択遺伝子を欠失するための野生型ＦＲＴ位置を必要とする(１４０３での１４４７)。スプライシング変異導入後のＩＧＫ座位(１４６９)に残るＦＲＴ位置(１４６１)が野生型であるならば、この第二のＮｅｏ遺伝子(１４１３での１４０６)のＦＲＴ介在欠失の試みは、完全に新規の導入された部分的にイヌの座位および不活性化マウスＣκエクソンの欠失を不注意にもたらし得る。
広く使用される方法により、Ｃ５７Ｂ１／６ＮＴａｃマウス由来のマウス胚幹(ＥＳ)細胞を、ＭＳＡベクター(１４５７)でのエレクトロポレーションにより、ＭＳＡベクター(１４５７)でトランスフェクトする。エレクトロポレーション前、ベクターＤＮＡを、原核生物プラスミド配列またはそれと結合したポリリンカーしか切断しない希少切断制限酵素で線形化する。トランスフェクト細胞を播種し、約２４時間後、ネオマイシンアナログ薬物Ｇ４１８を使用して、ＤＮＡに統合されたＭＳＡベクターを有する細胞について正の選択下に置く。ベクターがＤＮＡに統合されているが、相同組み換えによってではない細胞について負の選択もある。非相同組み換えは、遺伝子が発現されたとき細胞を死滅させるＤＴＡ遺伝子の保持をもたらし、一方、相同組み換えでは、マウスＩＧＫ座位のベクター相同性の領域外にあるため、ＤＴＡ遺伝子は欠失される。薬物耐性ＥＳ細胞のコロニーを、約１週間後、視認できるようになった後、物理的に摘出する。これら選択したコロニーを脱凝集させ、マイクロウェルプレートに再播種し、数日間培養する。その後、細胞のクローンの各々を、細胞の一部がアーカイブとして凍結され、残りが分析目的でＤＮＡを単離するために使用されるよう、分ける。
相同組み換えにより正しく標的化されたＥＳ細胞におけるＩＧＫ座位は、１４６３に示す配置を有する。
広く実施されている遺伝子ターゲティングアッセイデザインを使用するＰＣＲにより、ＥＳ細胞クローンからのＤＮＡをスクリーニングする。このアッセイについて、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー配列の一方は、ＭＳＡベクター(１４５７)とゲノムＤＮＡ(１４０１)の間で共有される同一性の領域外にマッピングされ、他方は、ベクターにおけるゲノム同一性の２個のアームの間の新規ＤＮＡ内、すなわち、ネオマイシン耐性(１４４７)遺伝子にマッピングされる。標準デザインにより、これらのアッセイは、ＭＳＡベクター(１４５７)と内因性マウスＩＧＫ座位の間の十分に合理的な相同組み換えを受けたトランスフェクト細胞由来のＥＳ細胞のクローンにしか存在しないであろうＤＮＡ片を検出する。２回の別々のトランスフェクションを、ＭＳＡベクター(１４５７)で実施する。２回のトランスフェクションからのＰＣＲ陽性クローンを拡大のために選択し、その後、サザンブロットアッセイを使用してさらに分析する。
サザンブロットアッセイを、プローブおよび消化物の組み合わせが、クローンにおける標的座位の構造および相同組み換えにより適切に修飾されたか否かの結論を可能とするように選択された、複数制限酵素で消化された３個のプローブおよびゲノムＤＮＡを使用する、広く使用される方法により実施する。この特定の実施例において、ＤＮＡは、ＭＳＡベクターが統合された細胞のみがＰａｃＩ位置を含むため、Ｐａｃ１およびＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄIIIなどの他の制限酵素で二重消化される。第一プローブは、ＭＳＡベクター(１４５７)およびゲノムＤＮＡの間で共有される同一性の領域の５’側に隣接するＤＮＡ配列にマッピングされる；第二プローブも、同一性の領域外であるが、３’側にマッピングされる；第三プローブは、ベクターにおけるゲノム同一性の２個のアームの間の新規ＤＮＡ内、すなわち、ネオマイシン耐性(１４４７)遺伝子にマッピングされる。サザンブロットは、外部プローブの一つおよびネオマイシン耐性遺伝子プローブにより検出して、正確に、すなわち、κ座位のＭＳＡ κターゲティングベクター(１４５７)部分の相同組み換えにより、変異された、対応するＤＮＡの予測制限酵素産生フラグメントの存在を同定する。外部プローブは、変異体フラグメントおよびまた相同染色体の免疫グロブリンκ座位の非変異体コピーからの野生型フラグメントも検出する。サザンブロットアッセイは、実施例７に記載の、広く使用される方法に従い実施される。
マウスＥＳ細胞で起こる最も一般的に生ずる染色体異常と区別するために設計されたインサイチュ蛍光ハイブリダイゼーション法を使用して、ＥＳ細胞のＰＣＲおよびサザンブロット陽性クローンの核型を分析する。このような異常があるクローンはさらなる使用から除外する。サザンブロットデータに基づき、予測された正確なゲノム構造を有すると判断された核型的に正常なクローンを、さらなる使用のために選択する。
ＥＳ細胞ＤＮＡが変異ＩＧＫアレルにおけるＰａｃＩで消化される能力は、ＴＴＡＡＴＴＡＡ配列の存在を確認するが、完全予測スプライシング変異の存在を確認するため、Ｃκエクソンの上流の領域に焦点を絞ったＤＮＡシーケンシングを実施する。領域を、変異に隣接するプライマーを使用するゲノムＰＣＲにより増幅する[１４６５および１４６７(表６：配列番号４１７および配列番号４１８)]。別のプライマー対を、配列番号４１９および配列番号４２０に示す。これらプライマーは、NCBI Primer-Blastを使用して設計し、マウスゲノムにおけるあらゆる予測されるオフターゲット結合部位がないことをコンピュータで検証する。
配列検証ＥＳ細胞クローンを、ＦＬＰリコンビナーゼ発現ベクターで一過性にトランスフェクトして(１４０６)、ネオマイシン耐性遺伝子(１４２７)を欠失させる。次いで、細胞をサブクローンし、欠失をＰＣＲにより確認する。ＥＳ細胞におけるＩＧＫ座位は、１４６９に示すゲノム配置を有する。
ＥＳ細胞を、上記のとおり、５’および３’ ＲＭＣＥベクターで電気穿孔する。唯一の差異は、３’ベクター(１４０５)が、図９の９０１に示す位置で変異体Ｃκエクソンの上流に挿入され、３’ベクター(１４０５)の上流および下流相同性アームが、それぞれ、図９に示す３’ベクター(９０５)の配列９４３および９４９で置き換えられることである。その結果、３’ベクター(１４０５)の正確な組込みに使用されるＰＣＲプライマーおよびサザンブロットプローブは、１４４３および１４４９の代わりに配列９４３および９４９に由来する。ｉＥκエンハンサーは、この配列が欠失されていないため、ターゲティングベクター(１４０９)に含まれない。
実施例９：イヌＶ λ ドメインはマウスＣ κ ドメインと良好に機能せず、イヌＶ κ ドメインはマウスＣ λ ドメインと良好に機能しない。
提案されるＬ－Ｋマウス(実施例４)について、マウス非コードおよび制御配列に隣接されたイヌＶλおよびＪλ遺伝子セグメントコード配列を、内因性ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントが欠失されたマウスＩＧＫ座位に包埋する。生産的Ｖλ→Ｊλ遺伝子再配列後、得られたＩｇ遺伝子はイヌλ可変ドメインおよびマウスκ定常ドメインを有するＬＣをコードする。このようなハイブリッドが適切に発現され、インタクトＩｇ分子を形成するか否かを試験するために、一連の一過性トランスフェクションアッセイを、種々のＶの組み合わせ、ＶκおよびＶλおよびＣ軽鎖エクソンの両者、ＣκおよびＣλの両者で、Ｉｇ ＨＣと共に実施し、コードＩｇの細胞表面および細胞内発現ならびに分泌を試験した。
これらの実験についてマウスＩｇＭｂアロタイプＨＣと結合したイヌＩＧＨＶ３－５(Accession No. MF785020.1)、ＩＧＨＶ３－１９(Accession No. FJ197781.1)またはＩＧＨＶ４－１(Accession No. DN362337.1)を、ｐＣＭＶベクターに個々にクローン化した。各ＶＨコード化ＤＮＡは、内因性イヌＬ１－イントロン－Ｌ２および生殖系列、すなわち、非変異ＶＤＪ配列を含んだ。非変異イヌＩＧＬＶ３－２８(Accession No. EU305423)またはＩＧＫＶ２－５(Accession No. EU295719.1)を、ｐＦＵＳＥベクターにクローン化した。各イヌＶＬエクソンを、マウスＣκ、Ｃλ１またはＣλ２の定常領域と結合した(Ｃλ３は、ほぼ同一タンパク質配列を有するため、Ｃλ２と同じ性質を有すると推定される。)各ＶＬにおけるＬ１－イントロン－Ｌ２配列は、イヌ起源であった。２９３Ｔ／１７細胞を、ＨＣおよびＬＣ構築物の一つに加えて、トランスフェクション対照としてのヒトＣＤ４発現ベクターおよびＣＤ７９ａ／ｂ発現ベクターと共トランスフェクトした。ＣＤ７９ａ／ｂヘテロ二量体は、ＩｇＭの細胞表面発現に必要であった。約２４時間後、トランスフェクト細胞を、フローサイトメトリーによる細胞表面または細胞内染色に付した。Ｉｇ分泌の分析について、上記と同じＶＨ遺伝子を、マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ含有ｐＦＵＳＥベクターにクローン化した。２９３Ｔ／１７細胞を、上記のとおり、ＨＣおよびＬＣ構築物の一つに加えて、トランスフェクション対照として、ヒトＣＤ４(ｈＣＤ４)発現ベクターと共トランスフェクトした。(これらの実験で、Ｃλ３も試験した。)約４８時間後、トランスフェクト細胞およびその対応する上清を採取し、ウェスタンブロッティングによりＨＣ／ＬＣ発現／分泌について分析した。
これらの実験から得たデータをまとめると、イヌＩＧＬＶ３－２８をマウスＣκに結合したとき、細胞表面のＩｇＭ発現は、同じイヌＶλをＣλ１またはＣλ２に結合させたときより少なくとも２倍少なかった。同様に、ＩＧＫＶ２－５をマウスＣλに結合したとき、表面ＩｇＭのレベルは、大幅に減少した。発現欠損の程度は、使用した特定のＶＨ遺伝子に依存した；あるＶＨ遺伝子は、ハイブリッド軽鎖の一部細胞表面発現を可能としたが、他はより厳しかった。同じ傾向がＩｇ分泌でみられた。
図１５は、あまり厳しくない、イヌＩＧＶＬ３－２８／ＩＧＬＪ６(１５０１)またはイヌＩＧＶＫ２－５／ＩＧＪＫ１(１５０２)を伴うＶＨ遺伝子の一つであるＩＧＨＶ３－５を発現する細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す。最上行パネルは、ｈＣＤ４ ｍＡｂ抗体(１５０９)で染色するトランスフェクション対照であり、下部パネルはマウスＩｇＭｂアロタイプｍＡｂ(１５１０)で染色する。トランスフェクトしていないｈＣＤ４細胞(１５１３)およびトランスフェクトしたｈＣＤ４＋細胞(１５１４)を、異なって影をつけたヒストグラムにより、全パネルにおいて示す。トランスフェクトしていないｈＣＤ４細胞の頻度は、最上行における各パネルの上部左の数値により示し、トランスフェクトしたｈＣＤ４＋細胞の頻度は、最上行における各パネルの上部右の数値により示す。トランスフェクション効率は、全例で類似した。しかしながら、イヌＶλをマウスＣκ(１５０３、下部行)に結合したとき、細胞表面のＩｇＭ発現は、同じイヌＶλをマウスＣλ１またはＣλ２(１５０４、１５０５、下部行)に結合したときより少なかった。同様に、Ｖκを有するイヌＩＧＭは、Ｃλ１またはＣλ２(１５０７、１５０８、下部行)よりもＣκ(１５０６、下部行)に結合したとき、良好に発現された。下部行における各パネルの上部右の数値は、発現レベルの定量的指標である、細胞表面ＩｇＭｂ染色の平均蛍光強度(ＭＦＩ)を示す。
図１６は、あまり厳しくない、イヌＩＧＶＬ３－２８／ＩＧＬＪ６(１６０１)またはイヌＩＧＶＫ２－５／ＩＧＪＫ１(１６０２)を伴うＶＨ遺伝子の一つであるＩＧＨＶ３－５を発現する細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す。これらは図１５と同じ細胞であるが、図１５に示す結果を確認する、細胞表面マウスκＬＣ(１６０９)またはマウスλＬＣ(１６１０)で染色した。
図１７は、ＩＧＨＶ３－５より厳しい、イヌＩＧＶＬ３－２８／ＩＧＬＪ６(１７０１)またはイヌＩＧＶＫ２－５／ＩＧＪＫ１(１７０２)を有する、ＩＧＨＶ４－１を発現する細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す。最上行パネルは、ｈＣＤ４ ｍＡｂ抗体(１７０９)で染色するトランスフェクション対照であり、下部パネルは、マウスＩｇＭｂアロタイプｍＡｂ(１７１０)で染色する。トランスフェクトしていないｈＣＤ４細胞(１７１３)およびトランスフェクトしたｈＣＤ４＋細胞(１７１４)は、異なって影をつけたヒストグラムにより、全て下部パネルに示す。トランスフェクトしていないｈＣＤ４細胞の頻度は、最上行における各パネルの上部左の数値により示し、トランスフェクトしたｈＣＤ４＋細胞の頻度は、最上行における各パネルの上部右の数値により示す。トランスフェクション効率は、全例で類似した。しかしながら、イヌＶλをマウスＣκ(１７０３、下部行)に結合したとき、細胞表面のＩｇＭ発現は、同じイヌＶλをマウスＣλ１またはＣλ２(１７０４、１７０５、下部行)に結合したときよりはるかに少なかったが、この場合の最良発現は、Ｃλ２(１７０５、下部行)であった。同様に、Ｖκを有するイヌＩＧＭは、Ｃλ１またはＣλ２(１７０７、１７０８、下部行)よりＣκ(１７０６、下部行)と結合したとき、はるかに良好であった。実際、この場合、Ｃλ１またはＣλ２を有するＩｇＭの発現は、本質的に検出不可能であった。下部行における各パネルの上部右の数値は、発現レベルの定量的指標である、細胞表面ＩｇＭｂ染色の平均蛍光強度(ＭＦＩ)を示す。マウスλＬＣまたはκＬＣに特異的な抗体での染色を全実験で実施し、ＩｇＭｂアロタイプｍＡｂでの染色の結果を確認した(示していない)。
図１８は、マウスＣκで機能するイヌＶλの能力の点について試験したＩＧＨＶ遺伝子で最も厳しい、イヌＩＧＶＬ３－２８／ＩＧＬＪ６(１８０１)またはｗｉｔｈイヌＩＧＶＫ２－５／ＩＧＪＫ１(１８０２)を伴う、ＩＧＨＶ３－１９を発現する細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す。最上行パネルは、ｈＣＤ４ ｍＡｂ抗体(１８０９)で染色するトランスフェクション対照であり、下部パネルは、マウスＩｇＭｂアロタイプｍＡｂ(１８１０)で染色する。トランスフェクトしていないｈＣＤ４細胞(１８１３)およびトランスフェクトしたｈＣＤ４＋細胞(１８１４)は、異なって影をつけたヒストグラムにより、全て下部パネルに示す。トランスフェクトしていないｈＣＤ４細胞の頻度は、最上行における各パネルの上部左の数値により示し、トランスフェクトしたｈＣＤ４＋細胞の頻度は、最上行における各パネルの上部右の数値により示す。トランスフェクション効率は、全例で類似した。イヌＶλをマウスＣκ(１８０３、下部行)に結合させたとき、本質的に表面ＩｇＭ発現はなく、イヌＶκをマウスＣλ１またはＣλ２(１８０７、１８０８、下部行)に結合させたとき、低レベルの発現しかなかった。下部行における各パネルの上部右の数値は、発現レベルの定量的指標である、細胞表面ＩｇＭｂ染色の平均蛍光強度(ＭＦＩ)を示す。マウスλＬＣまたはκＬＣに特異的な抗体での染色を全実験で実施し、ＩｇＭｂアロタイプｍＡｂでの染色の結果を確認した(示していない)。
この分析の結果は、イヌＶλおよびマウスＣκまたはイヌＶκおよびマウスＣλ１またはＣλ２を含むハイブリッド軽鎖が、しばしば、μＨＣを有する細胞表面でほとんど発現されなかったことを示す。細胞表面ＩｇＭのレベルはμＨＣにより使用される特定のＶＨに依存したが、特定のＶＨが、適度な細胞表面ＩｇＭ発現を可能とするかまたは発現しないかを予測することを可能とする識別可能なパターンはなかった。Ｂ細胞生存がＩｇＭ ＢＣＲ発現に依存するため、イヌＶλおよびマウスＣκのペアリングは、λＬＣ発現Ｂ細胞の進展の大きな減少をもたらす。同様に、イヌＶκとマウスＣλ１またはＣλ２のペアリングは、κ－ＬＣ発現Ｂ細胞の進展を減少させる。
ハイブリッドまたは相同ＬＣを有するＩｇの発現および分泌も試験した。一過性にトランスフェクトした細胞の上清および細胞ライセートを、ウェスタンブロッティングにより分析した。図１９Ａは、マウスＣκ、Ｃλ１、Ｃλ２またはＣλ３と対合させたイヌＩＧＶＬ３－２８およびイヌＩＧＨＶＨ３－５(１９０１)、ＩＧＨＶＨ３－１９(１９０２)またはＩＧＨＶＨ４－１(１９０３)を含むマウスＩｇＧ２ａ ＨＣを使用する、細胞の上清の結果を示す。図１９Ｂは、マウスＣκ、Ｃλ１、Ｃλ２またはＣλ３と対合させたイヌＩＧＶＬ３－２８およびイヌＩＧＨＶＨ３－５(１９０４)、ＩＧＨＶＨ３－１９(１９０５)またはＩＧＨＶＨ４－１(１９０６)を含むマウスＩｇＧ２ａ ＨＣを使用する、細胞のライセートの結果を示す。サンプルを、非還元(示していない)または還元条件下で電気泳動し、ブロットをＩｇＧ２ａ抗体でプローブした。イヌＩＧＶＬ３－２８をマウスＣκ(１９０７)と対合させたときに分泌されるＩｇＧ２ａの量は、一貫してＣλ１(１９０８)、Ｃλ２(１９０９)またはＣλ３(１９１０)(図１８Ａ)と対合させたときよりはるかに低かった。この差異は、レベルが各群の遺伝子導入体で類似したため(図１９Ｂ)、イヌＩＧＶＬ３－２８－マウスＣκ細胞におけるγ２ａ ＨＣの発現低下または分解増強によるものでもまたは分析されるタンパク質が少ないからでもなかった。ローディング・コントロール、Ｍｙｃ(図２０Ａ)およびＧＡＰＤＨ(図２０Ｂ)は、各群のタンパク質量はほぼ同等であったことを示した。(図１９Ｂで使用したブロットは剥奪され、ＭｙｃおよびＧＡＰＤＨに対する抗体で連続的に再プローブされ、よって、図２０Ａおよび２０Ｂにおけるレーンは、図１９Ｂと同一である。)
他のセットの実験において、トランスフェクト細胞におけるイヌＩＧＶＬ３－２８－マウスＣκＬＣの安定性(図２１Ｂ、還元条件)を、分泌分析と平行して試験した(図２１Ａ、非還元条件)。同様に、ＬＣがイヌＩＧＶＬ３－２８－マウスＣλ１(図２Ａ、２１０３)またはＩＧＶＬ３－２８－マウスＣλ２(図２Ａ、２１０４)よりも、イヌＩＧＶＬ３－２８－マウスＣκ(図２Ａ、２１０２)であるとき、はるかに少ないＩｇＧ２ａが分泌されたが、しかしながら、ＬＣがイヌＩＧＶＫ２－５－マウスＣκ(図２０Ｂ、２１０５)であるときに見られたレベルに類似する、ＩＧＶＬ３－２８－マウスＣκ細胞ライセートにおける相当量の細胞内κＬＣが、抗κ抗体で検出可能であった(図２Ｂ、２１０２。故に、ハイブリッドＩＧＶＬ３－２８－マウスＣκは、細胞内で十分に発現され、迅速に分解されない。この特定のイヌＶＨ－ＶＫ組み合わせにおいて、ＶＫ２－５を使用するイヌＩＧＧ２ａの分泌は、Ｖκ(２１０５)、Ｃλ１(２１０６)またはＣλ２(２１０７)に結合したとき、類似した。
図２１Ａおよび２１Ｂの結果は、ハイブリッドイヌＶλ－マウスＣκ担持Ｉｇ分子の分泌減少は、折り畳みができないことまたはγ２ａ ＨＣと正確に対合されないことによるものであったことを示す。理論に拘束されることを望まないが、これは、小胞体(ＥＲ)における不完全に集合されたＩｇＧ２ａ分子の、Ｉｇ ＨＣ保持分子ＢｉＰなどのＥＲ品質制御機構による保持をもたらすと考えられる(Haas and Wabl (1983) Immunoglobulin Heavy Chain Binding Protein. Nature 306:387-389 PMID 6417546; Bole, et al. (1986) Posttranslational association of immunoglobulin heavy chain binding protein with nascent heavy chains in nonsecreting and secreting hybridomas. J. Cell Biology 102:1558-1566 PMID 3084497)。
実施例１０：マウスＩｇＤを有する部分的にイヌの免疫グロブリンの発現
ＩｇＤは、大部分の哺乳動物において成熟Ｂ細胞のＩｇＭと共発現する。しかしながら、イヌが、δＨＣをコードする機能的定常領域遺伝子を有するか否かの問題は、相当物議を醸している。ｍＡｂを使用する先の血清学的試験は、イヌリンパ球で発現された「ＩｇＤ様」分子を同定した(Yang, et al. (1995) Identification of a dog IgD-like molecule by a monoclonal antibody. Vet. Immunol. and Immunopath. 47:215-224. PMID: 8571542)。しかしながら、このＩｇＤの血清レベルは、イヌをブタクサ抽出物で免疫化したとき、増加した。これは、血清にほとんどないくらい小量しか存在せず、免疫化によりブーストされない真正ＩｇＤの典型ではない；ＩｇＤは、特にマウスで主にＢＣＲアイソタイプである。後に、Rogers, et al. ((2006) Molecular characterization of immunoglobulin D in mammals: immunoglobulin heavy constant delta genes in dogs, chimpanzees and four old world monkey species. Immunol. 118:88-100 (doi:10.1111/j.1365-2567.2006.02345.x))は、イヌ血液から単離したＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲによりｃＤＮＡをクローン化し、それは、配列相同性により、真のδＨＣをコードした。しかしながら、International ImMunoGeneTics information system(登録商標) /www.imgt.org(ＩＭＧＴ)によるイヌＩＧＨ座位のより最近のアノテーションは、ヒンジ２エクソンについての、ＮＧＴではなくＮＧＣである非カノニカルスプライス供与部位のため、非機能的オープンリーディングフレームとしてＣδを記載する。イヌにおいてある低レベルの正確な「漏れやすい」スプライシングおよびＩｇＤ発現が生じ得て、故に、Rogers, et al.がＣδ ｃＤＮＡクローンを単離できる原因となる可能性がある。しかしながら、イヌＶＨ遺伝子領域が部分的にまたは完全に非機能的Ｃδ遺伝子を持って進化しているように見えるため、イヌＶＨドメインがマウスＣδと結合したとき、適切に折りたたまれないはずであるというのが、懸念である。部分的にイヌのＩｇＤの集合が部分的であるまたは存在しないとの問題は、正常Ｂ細胞進展を妨害する。
Ｃδ主鎖を有するイヌＶＨドメインが、細胞膜に発現可能なＩｇＤ分子に集合できるか否かを試験するため、一過性トランスフェクションおよびフローサイトメトリー分析を、実施例８に記載のものに類似する方法を使用して、実施した。
２９３Ｔ／１７細胞を、ＣＤ７９ａ／ｂ発現ベクターと共に、トランスフェクション対照としてのヒトＣＤ４(ｈＣＤ４)発現ベクターと、ＣμがＣδで置き換えられた以外、実施例８からのＨＣ構築物の一つおよびκまたはλＬＣ構築物の一つで共トランスフェクトした。図２２～２４に見られ得るとおり、マウスＩｇＤ主鎖を有するイヌＶＨドメインのＨＣは、イヌＶκ－マウスＣκまたはイヌＣλ－マウスＣλＬＣと対合したとき、細胞表面で発現した。
図２２は、マウスＣλ１(２２０２)、Ｃλ２(２２０３)またはＣλ３(２２０４)に結合したマウスＩｇＤ主鎖およびイヌＩＧＫＶ２－５／ＩＧＫＪ１－Ｃκ(カラム２２０１)およびイヌＩＧＬＶ３－２８／ＩＧＬＪ６を有する細胞表面イヌＩＧＨＶ３－５の発現を示す。これらの試験で、最上行(２２０５)は、トランスフェクション効率の対照である細胞表面ｈＣＤ４の染色を示す。行２２０６は、細胞表面ＩｇＤ発現を確認するＢＣＲの偏性成分であるＣＤ７９ｂの染色を示す。行２２０７はＩｇＤ染色を示し、２２０８はκＬＣを示し、２２０９はλＬＣを示す。これら特定のイヌＶＨ／ＶκまたはＶＨ／ＶλＬＣ組み合わせは、細胞表面で良好に発現された。
図２３は、マウスＣλ１(２３０２)、Ｃλ２(２３０３)またはＣλ３(２３０４)に結合したマウスＩｇＤ主鎖およびイヌＩＧＫＶ２－５／ＩＧＫＪ１－Ｃκ(カラム２３０１)およびイヌＩＧＬＶ３－２８／ＩＧＬＪ６を有する細胞表面イヌＩＧＨＶ３－１９の発現を示す。(細胞表面染色データは図２２と同じ配置である。)これら特定のイヌＶＨ／ＶκまたはＶＨ／ＶλＬＣ組み合わせを有するＩｇＤの細胞表面発現は、図２２におけるほど高くなかった。イヌＩＧＨＶ３－１９も、イヌＶκ－マウスＣλＬＣと結合する能力に関して、最も厳しいＶＨであったことが想起される(図１９)。
図２４は、マウスＣλ１(２４０２)、Ｃλ２(２４０３)またはＣλ３(２４０４)に結合したマウスＩｇＤ主鎖およびイヌＩＧＫＶ２－５／ＩＧＫＪ１－Ｃκ(カラム２４０１)およびイヌＩＧＬＶ３－２８／ＩＧＬＪ６を有する細胞表面イヌＩＧＨＶ４－１の発現を示す。(細胞表面染色データは図２２と同じ配置である。)これら特定のイヌＶＨ／ＶκまたはＶＨ／ＶλＬＣ組み合わせを有するＩｇＤの細胞表面発現は、図２２および図２３で観察されたものの中間である。
このデータは、イヌＶＨ遺伝子が、マウスＩｇＤ主鎖で発現されたが、細胞表面発現レベルは、特定のＨＣ／ＬＣ組み合わせに依存して変わったことを示す。細胞表面のＩｇＤとして発現され得るＨＣ／ＬＣ組み合わせは、Ｂ細胞進展中濾胞性Ｂ細胞区画に分泌され、適切なＢＣＲレパートリーを作ると考えられる。
上記は、ここに記載する方法の原則の説明に過ぎない。当業者は、ここには明示的に記載も表示もしていないが、本発明の原則を具現化し、その精神および範囲内に包含される、種々の脚色を考案できることは認識される。さらに、ここに記載する全ての例示的および条件的用語は、主として読み手が本発明の原則および当分野の進歩のために本発明者らが意図する概念を理解する助けとなることを意図し、このような具体的に記載された例および条件への限定はされないとして解釈されるべきである。さらに、本発明の原則、態様および実施態様ならびのその具体例を記載するここでの全ての記載は、その構造的および機能的等価物を包含することが意図される。さらに、このような均等物は、構造とは無関係に同じ機能を実施する、現在知られている均等物および将来的に開発される均等物、すなわち開発中のあらゆる要素の両者を含むことが意図される。従って、本発明の範囲は、ここに示し、記載する例示的実施態様に限定されることは意図されない。むしろ、本発明の範囲および精神は、添付する特許請求の範囲により具現化される。次の特許請求の範囲において、用語「手段」が使用されない限り、そこに記載される特性または要素のいずれも、米国特許法第１１２条パラグラフ６に従うミーンズ・プラス・ファンクション限定として解釈すべきではない。ここに引用する全ての参考文献は、全ての目的のために、その全体として引用により本明細書に包含される。
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Claims (41)

  1. イヌ免疫グロブリンλ軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む操作された部分的にイヌの免疫グロブリン軽鎖座位を含む、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞であって、ここで、操作された免疫グロブリン座位がイヌ可変ドメインを含む免疫グロブリンを発現でき、トランスジェニック齧歯類がκ軽鎖を含む免疫グロブリンよりλ軽鎖を含む免疫グロブリンを多く産生するまたは産生する可能性が高い、トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  2. κ軽鎖産生細胞より多くのλ軽鎖産生細胞が該齧歯類から単離される可能性が高い、請求項１のトランスジェニック齧歯類。
  3. トランスジェニック齧歯類が少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％および最大約１００％λ軽鎖を含む免疫グロブリンを産生する、請求項１のトランスジェニック齧歯類。
  4. トランスジェニック齧歯類細胞またはその子孫がλ軽鎖を含む免疫グロブリンを産生する確率が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％および最大約１００％である、請求項１のトランスジェニック齧歯類細胞。
  5. 操作された免疫グロブリン座位がイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列およびＪλ遺伝子セグメントコード配列ならびに齧歯類免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座位からの齧歯類非コード制御配列または足場配列を含む、請求項１～４の何れかのトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  6. 操作された免疫グロブリン座位が齧歯類免疫グロブリンλ軽鎖可変領域遺伝子座位の齧歯類非コード制御配列または足場配列に包埋されたイヌＶλおよびＪλ遺伝子セグメントコード配列を含む、請求項１～５の何れかのトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  7. 部分的にイヌの免疫グロブリン座位が１以上のイヌＶλおよびＪλ遺伝子セグメントコード配列ならびに１以上の齧歯類免疫グロブリンλ定常領域コード配列を含む、請求項１～６の何れかのトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  8. 操作された免疫グロブリン座位が齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖可変領域遺伝子座位の齧歯類非コード制御配列または足場配列に包埋されたイヌＶλおよびＪλ遺伝子セグメントコード配列を含む、請求項１～４の何れかのトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  9. 操作された免疫グロブリン可変領域座位が１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列および１以上のＪ－Ｃ単位を含み、ここで、各Ｊ－Ｃ単位がイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列および齧歯類λ定常領域コード配列を含む、請求項８のトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  10. 齧歯類λ定常領域コード配列が齧歯類Ｃλ１、Ｃλ２、Ｃλ３コード配列またはこれらの組み合わせを含む、請求項９のトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  11. １以上のＪ－Ｃ単位の上流に位置する１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列を含み、ここで、各Ｊ－Ｃ単位がイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列および齧歯類Ｃλコード配列を含む、請求項９または１０のトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  12. １以上のＪ－Ｃ単位の上流に位置する１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列を含み、ここで、各Ｊ－Ｃ単位がイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列および齧歯類Ｃλコード配列および齧歯類Ｃλ非コード配列を含む、請求項９または１０のトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  13. Ｊ－Ｃ単位が齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖座位の非コード制御配列または足場配列に包埋されたイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列および齧歯類λ定常領域コード配列を含む、請求項９～１２の何れかのトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  14. 操作された免疫グロブリン座位が齧歯類免疫グロブリンκ座位を含み、ここで、１以上の齧歯類Ｖκ遺伝子セグメントコード配列および１以上の齧歯類Ｊκ遺伝子セグメントコード配列が欠失され、それぞれ１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列および１以上のＪλ遺伝子セグメントコード配列で置き換えられており、座位における齧歯類Ｃκコード配列が齧歯類Ｃλ１、Ｃλ２、Ｃλ３コード配列またはこれらの組み合わせで置き換えられている、請求項８のトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  15. 操作された免疫グロブリン座位が１以上の齧歯類Ｃλコード配列の上流である１以上のイヌＪλ遺伝子セグメントコード配列の上流に１以上のイヌＶλ遺伝子セグメントコード配列を含む、請求項１４のトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  16. 内因性齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖座位が、欠失、不活性化または
    ａ. 全内因性齧歯類Ｖκ遺伝子セグメントコード配列の欠失または変異；
    ｂ. 全内因性齧歯類Ｊκ遺伝子セグメントコード配列の欠失または変異；
    ｃ. 全内因性齧歯類Ｃκコード配列の欠失または変異；
    ｄ. 齧歯類Ｃκコード配列の５’スプライス位置および隣接ポリピリミジントラクトの欠失または変異；
    ｅ. 内因性イントロンκエンハンサー(ｉＥκ)および３’エンハンサー配列の欠失、変異または破壊
    の１以上により非機能的とされる、請求項１～１５の何れかに記載のトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  17. 内因性齧歯類免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインの発現が
    ａ. 全内因性齧歯類Ｖλ遺伝子セグメントの欠失または変異；
    ｂ. 全内因性齧歯類Ｊλ遺伝子セグメントの欠失または変異；および
    ｃ. 全内因性齧歯類Ｃλコード配列の欠失または変異
    の１以上により抑制または不活性化される、請求項１～１６の何れかに記載のトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  18. 操作された免疫グロブリン座位がイヌλ可変ドメインおよび齧歯類λ定常ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を発現する、請求項１～１７の何れかのトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  19. トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞のゲノムがイヌＶκおよびＪκ遺伝子セグメントコード配列を含む操作された免疫グロブリン座位を含む、請求項１～４の何れかのトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  20. イヌＶκおよびＪκ遺伝子セグメントコード配列が齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖座位に挿入される、請求項１９のトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  21. イヌＶκおよびＪκ遺伝子セグメントコード配列が、齧歯類齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖可変領域遺伝子座位の非コード制御配列または足場配列に包埋される、請求項１９または２０のトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  22. イヌＶκおよびＪκコード配列が、齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖定常領域コード配列の上流に挿入される、請求項１９～２１の何れかのトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  23. トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞のゲノムが齧歯類免疫グロブリンλ軽鎖座位に挿入されたイヌＶκおよびＪκ遺伝子セグメントコード配列を含む操作された免疫グロブリン座位を含む、請求項１～４の何れかのトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  24. イヌＶκおよびＪκ遺伝子セグメントコード配列が齧歯類免疫グロブリンλ軽鎖可変領域遺伝子座位の齧歯類非コード制御配列または足場配列に包埋される、請求項２３のトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  25. イヌＶκおよびＪκ遺伝子セグメントコード配列の下流に挿入された齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖定常領域コード配列を含む、請求項２３または２４のトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  26. 齧歯類免疫グロブリンκ軽鎖定常領域が内因性齧歯類Ｃλ２コード配列の上流に挿入される、請求項２５のトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  27. 内因性齧歯類免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインの発現が
    ａ. 全内因性齧歯類Ｖλ遺伝子セグメントコード配列の欠失または変異；
    ｂ. 全内因性齧歯類Ｊλ遺伝子セグメントコード配列の欠失または変異；および
    ｃ. 全内因性Ｃλコード配列またはスプライス部位の欠失または変異
    の１以上により抑制または不活性化される、請求項２３～２６の何れかのトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  28. 操作されたイヌ免疫グロブリン軽鎖座位が齧歯類イントロンκエンハンサー(ｉＥκ)および３’Ｅκ制御配列を含む、請求項１～２７の何れかのトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  29. トランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞がイヌ免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子コード配列および齧歯類免疫グロブリン重鎖座位の非コード制御配列または足場配列を含む操作された部分的にイヌの免疫グロブリン重鎖座位を含む、請求項１～２８の何れかのトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  30. 操作されたイヌ免疫グロブリン重鎖座位がイヌＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子セグメントを含む、請求項２９のトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  31. 各イヌＶＨ、ＤまたはＪＨコード遺伝子セグメントが齧歯類免疫グロブリン重鎖座位の非コード制御配列または足場配列に包埋されたＶＨ、ＤまたはＪＨコード配列を含む、請求項３０のトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  32. 重鎖足場配列に機能的ＡＤＡＭ６Ａ遺伝子、ＡＤＡＭ６Ｂ遺伝子またはこれらの組み合わせが散在する、請求項３１のトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  33. 齧歯類制御または足場配列がエンハンサー、プロモーター、スプライス部位、イントロン、組み換えシグナル配列またはこれらの組み合わせを含む、請求項１～３２の何れかのトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  34. 内因性齧歯類免疫グロブリン座位が欠失され、操作された部分的にイヌの免疫グロブリン座位で置き換えられている、請求項１～３３の何れかのトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  35. 齧歯類がマウスまたはラットである、請求項１～３４の何れかのトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  36. 齧歯類細胞が胚幹(ＥＳ)細胞または初期胚の細胞である、請求項１～３５の何れかのトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  37. 齧歯類細胞がマウスもしくはラット胚幹(ＥＳ)細胞または初期胚のマウスもしくはラット細胞である、請求項１～３６の何れかのトランスジェニック齧歯類または齧歯類細胞。
  38. 請求項１～３７の何れかのトランスジェニック齧歯類から得たＢリンパ球系譜の細胞であって、ここで、操作された免疫グロブリン座位がイヌ可変領域および齧歯類免疫グロブリン定常領域を含むキメラ免疫グロブリン重鎖または軽鎖を発現する、Ｂリンパ球系譜の細胞。
  39. 請求項３８のＢリンパ球系譜の細胞に由来する、ハイブリドーマ細胞または不死化細胞株。
  40. 請求項３８または３９の細胞により産生された、抗体またはその抗原結合部分。
  41. 請求項３８または３９の細胞により産生された免疫グロブリン由来のＶＨ、ＤまたはＪＨまたはＶＬまたはＪＬ遺伝子セグメントコード配列の核酸配列。
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