BR112020022400A2 - anticorpos anti-msr1 e métodos de uso dos mesmos - Google Patents

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BR112020022400A2
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BR
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antibody
formula
msr1
antigen
fact
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BR112020022400-6A
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Christos Kyratsous
Matthew Sleeman
Thomas Nittoli
Anna Zumsteg
Jesper Gromada
Viktoria Gusarova
Amy Han
Sokol Haxhinasto
Andrew J. Murphy
William Olson
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Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
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Abstract

  ANTICORPOS ANTI-MSR1 E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS. A invenção refere-se a anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno que se ligam a MSR1 e métodos de uso dos mesmos. De acordo com certas modalidades, os anticorpos se ligam a MRS1 humano com alta afinidade. Em certas modalidades, os anticorpos se ligam a MSR1 sem bloqueio, ou bloqueio de menos do que 90%, de LDL modificada se ligando a MSR1. Em algumas modalidades, os anticorpos se ligam a MSR1 expresso na superfície celular e são internalizados. Os anticorpos da invenção podem ser anticorpos integralmente humanos. A invenção inclui anticorpos anti-MSR1, ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, conjugados a fármacos ou compostos terapêuticos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTI- CORPOS ANTI-MSR1 E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS".
[001] O Presente Pedido de Patente reivindica prioridade do Pe- dido de Patente U.S. provisório Nº 62/669.276, depositado em 9 de maio de 2018, Pedido de Patente U.S. provisório Nº 62/678.200, depo- sitado em 30 de maio de 2018, Pedido de Patente U.S. provisório Nº 62/769.946, depositado em 20 de novembro de 2018, Pedido de Pa- tente U.S. provisório Nº 62/789.987, depositado em 8 de janeiro de 2019, e do Pedido de Patente U.S. provisório Nº 62/821.362, deposita- do em 20 de março de 2019, que são aqui incorporados por referência em suas totalidades para todos os fins.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A presente invenção refere-se a anticorpos, e seus frag- mentos de ligação a antígeno, bem como a conjugados anticorpo- fármaco desses anticorpos, que ligam especificamente o receptor de glicoproteína de membrana (MSR1) trimérico e modulam a transdução de sinal do MSR1, e seus métodos de uso.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[003] Uma cópia oficial da listagem de sequências é apresentada simultaneamente com pedido de patente via EFS-Web como uma có- pia em papel de uma listagem de sequências formatada em ASCII com um nome de arquivo 114581.00244_ST25.TXT, data de criação de 30 de maio de 2018 e tamanho de cerca de 165 quilobytes. A listagem de sequências contida nesta cópia em papel do documento formatado em ASCII faz parte do relatório descritivo e é aqui incorporada por refe- rência em sua totalidade.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[004] O receptor sequestrante de macrófagos 1 (MSR1) é um re- ceptor de reconhecimento de padrões de glicoproteína transmembrana tipo II, trimérico, de passagem única, que faz a mediação da absorção de uma série de ligantes negativamente carregados/polianiônicos, in- cluindo lipoproteínas de baixa densidade (LDL) modificadas (Krieger, M. 1994. Annu. Rev. Biochem. 63:601-637; Platt, N. e S. Gordon.
2001. J Clin Invest. 108(5):649-654) e produtos finais de glicação avançada de albumina sérica bovina (AGE-BSA) (Smedsrød e outros,
1997. Biochem J. 322 (Pt 2): 567-573.) Os receptores MSR1 têm esta- do implicados em muitos processos fisiológicos e patológicos associa- dos a macrófagos, incluindo aterosclerose, doença de Alzheimer e de- fesa do hospedeiro.
[005] A expressão do MSR1 foi originalmente considerada ser específica para macrófagos. No entanto, recentemente ela foi demons- trada estar presente em diferentes classes de células dendríticas (Herber e outros, 2010. Nat. Med. 16(8):880-886). Além disso, o MSR1 parece ser expresso em células endoteliais e células do músculo liso. Ele é internalizado através de poços revestidos na superfície da célula e libera seu ligante em pH ácido antes de ser reciclado de volta à su- perfície da célula a partir do aparelho trans-Golgi (Doi e outros, 1994. Journal of Biological Chemistry; Mori, T. 1994. Lab Invest.). Ele promo- ve a conversão de macrófagos derivados de monócitos em células de espuma, que é uma etapa crítica para a progressão da aterosclerose.
[006] As isoformas do MSR1 tipo 1 e tipo 2 são receptores funci- onais e são capazes de mediar a endocitose de lipoproteínas de baixa densidade (DLs) modificadas. A isoforma do MSR1 tipo 3 pode ligar à LDL modificada (acetil-LDL), mas parece ser incapaz de internalizar o complexo ligado. No entanto, o MSR1 também se liga a uma grande variedade de ligantes além das LDLs modificadas. Esses ligantes in- cluem proteína beta-amiloide, chaperonas moleculares, proteína de matriz extracelular, produtos finais de glicação avançada, células apo- ptóticas e células B ativadas.
[007] O receptor X do fígado (LXR) inclui LXR e LXR, que são fatores de transcrição dependentes do ligante que controlam a expres- são de genes envolvidos na homeostase do colesterol, lipídios e glico- se, inflamação e imunidade inata. O LXR é altamente expresso no fígado, intestino, tecido adiposo e macrófagos diferenciados; e o LXR é expresso ubiquamente. Os LXRs têm várias funções biológicas, in- cluindo (i) estimular a expressão de transportadores de colesterol, por exemplo, ABCA1 e ABCG1, ambos mediando o efluxo de colesterol alveolar; e (ii) regular negativamente a expressão do gene inflamatório em macrófagos pela repressão da ativação de NF-KB. Os LXRs tam- bém têm estado implicados na aterosclerose, doenças proliferativas, distúrbios neurodegenerativos e inflamação. Os distúrbios proliferati- vos incluem melanomas, câncer do pulmão, carcinoma escamoso oral e câncer da próstata. (Pencheva e outros, 2004; Wu e outros, 2015; Kaneko e outros, 2015; Chuu e outros, 2006). As doenças neurode- generativas incluem a doença de Alzheimer e a expressão do gene da mielina. (Terwel e outros, 2011; Sandoval-Hernandez e outros, 2016; Meffre e outros, 2014). A inflamação inclui doença inflamatória intesti- nal, colite ulcerativa, doença de Crohn e artrite. (Anderson e outros, 2011; Huang e outros, 2015; Cui e outros, 2012). Os LXRs em macró- fagos são conhecidos por incluir atividade antiaterogênica. Acredita-se que os agonistas de LXR sejam capazes de (i) inibir o início e retardar a progressão da aterosclerose; (ii) mitigar a aterosclerose e estabilizar as lesões ateroscleróticas estabelecidas; e (iii) reduzir o teor de macró- fagos da lesão por apoptose.
[008] O potencial terapêutico dos moduladores de LXR de pe- quenas moléculas é limitado, por exemplo, pela modulação indesejada do LXR em células não alvo e/ou pela baixa biodisponibilidade. A mo- dulação do LXR em células não alvo pode levar a efeitos colaterais indesejáveis, e a baixa biodisponibilidade pode se manifestar por inú- meras razões, incluindo, sem limitação, a baixa solubilidade que exa-
cerba ainda mais as janelas terapêuticas pobres para o tratamento. O desenvolvimento de ADCs compreendendo moduladores de LXR per- mitiria a modulação específica do alvo do LXR, assim evitando efeitos colaterais causados pela modulação fora do alvo do LXR. Além disso, esses ADCs proporcionariam uma modulação melhorada dos alvos biológicos, uma biodisponibilidade melhorada e uma janela terapêutica melhorada. Assim, há uma necessidade contínua de tratamentos efi- cazes de, por exemplo, doenças metabólicas utilizando conjugados anticorpos-fármacos de moduladores de LXR.
[009] Os glicocorticoides (GCs) são esteroides de pequenas mo- léculas que se ligam aos receptores de glicocorticoides (GRS) e são amplamente utilizados em terapias anti-inflamatórias e imunossupres- soras. Entretanto, devido à expressão ubíqua dos receptores de glico- corticoides em muitos tipos de células, os tratamentos com glicocorti- coides são comprometidos por toxicidades para a maioria dos siste- mas de órgãos. Assim, há necessidade tanto de novos glicocorticoides como de novas terapias que minimizem os efeitos colaterais decorren- tes da administração de glicocorticoides, particularmente os decorren- tes da ativação de receptores de glicocorticoides em células não alvo.
[0010] As rifamicinas formam uma subclasse da família de antibió- ticos ansamicinas com espectro de atividade contra bactérias gram- positivas e gram-negativas, e são comumente fármacos antimicobacte- rianos prescritos para o tratamento da tuberculose, hanseníase e/ou o complexo mycobacterium avium (MAC). O grupo de antibióticos rifami- cinas inclui os fármacos de rifamicina "clássicos", bem como os deri- vados da rifamicina, como a rifamicina (ou rifampina), rifabutina, rifa- pentina, rifalazil e rifaximina. A crescente ocorrência de cepas de bac- térias resistentes a antibióticos (por exemplo, S. aureus resistente à meticilina (MRSA), S. aureus resistente à vancomicina (VRSA), M. tu- berculosis resistente a múltiplos fármacos), particularmente em ambi-
entes nosocomiais, é um problema contínuo. Há necessidade de aná- logos da rifamicina mais eficazes. As rifamicinas são indutores mode- rados a potentes do sistema de enzimas do citocromo P450 (notada- mente CYP3A4), o que pode levar a uma biodisponibilidade reduzida e maior depuração de alguns fármacos coadministrados que sofrem me- tabolismo pelo sistema de enzimas do citocromo P450 (notadamente CYP3A4). Essas interações podem ser retardadas no início, mas per- sistem além da coadministração da rifamicina. A rifamicina também pode induzir transportadores de efluxo de múltiplos fármacos da glico- proteína P (P-gp). Há a necessidade de novas terapias que minimizem os efeitos colaterais decorrentes da administração de rifamicinas, par- ticularmente aqueles decorrentes da ativação do sistema de enzimas do citocromo P450.
[0011] Conforme descrito no presente pedido de patente, os anti- corpos para MSR podem prover um meio para o direcionamento espe- cífico de moléculas terapêuticas, como agonistas de LXR, esteroides e rifamicinas, para minimizar efeitos colaterais indesejáveis decorrentes da administração sistêmica desses compostos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0012] São providos aqui anticorpos, fragmentos de anticorpos de ligação a antígeno e seus conjugados anticorpos-fármacos que ligam o receptor de glicoproteína de membrana, conhecido como MSR1. Os anticorpos são úteis, inter alia, para o direcionamento de células que expressam MSR1, como as células de macrófagos. Os anticorpos anti- MSR1 e suas porções de ligação ao antígeno podem ser utilizados de forma não modificada, ou podem ser incluídos como parte de um con- jugado anticorpo-fármaco.
[0013] Os anticorpos aqui descritos podem ser de comprimento total (por exemplo, um anticorpo IgG1 ou IgG4) ou podem incluir ape- nas uma porção de ligação a antígeno (por exemplo, um fragmento
Fab, F(ab')2 ou scFV) e podem ser modificados para afetar a funciona- lidade, por exemplo, para eliminar funções efetoras residuais (Reddy e outros, 2000, J. Immunol. 164:1925-1933).
[0014] Modalidades dos anticorpos anti-MSR1 aqui descritos estão listadas nas Tabelas 4 e 5. A Tabela 4 apresenta os identificadores de sequência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada (HCVRs), das regiões variáveis de cadeia leve (LCVRs), das regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e das regiões determinantes de complementarida- de de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) dos anticorpos anti- MSR1 exemplares. A Tabela 5 apresenta os identificadores da se- quência de ácidos nucleicos das HCVRs, LCVRs, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 dos anticorpos anti-MSR1 exem- plares.
[0015] São providos aqui anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno que se ligam especificamente a MSR1, os quais uma HCVR composta por uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das sequências de aminoácidos da HCVR listadas na Tabela 4, ou uma sequência substancialmente semelhante das mesmas, com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0016] São também providos aqui anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno que se ligam especificamente a MSR1, os quais compreendem uma LCVR composta por uma sequência de aminoáci- dos selecionada de qualquer uma das sequências de aminoácidos da LCVR listadas na Tabela 4, ou uma sequência substancialmente se- melhante da mesma, com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0017] São também providos aqui anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antígeno que se ligam especificamente a MSR1, os quais compreendem um par de sequências de aminoácidos da HCVR e LCVR (HCVR/LCVR) compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácidos da HCVR listadas na Tabela 4 pareada com qualquer uma das sequências de aminoácidos da LCVR listadas na Tabela 4. Algumas modalidades se referem a anticorpos, ou seus fragmentos de ligação a antígeno, compreendendo um par de sequências de aminoá- cidos HCVR/LCVR contido em qualquer um dos anticorpos anti-MSR1 exemplares listados na Tabela 4. Em algumas modalidades, o par de sequências de aminoácidos HCVR/LCVR é selecionado do grupo que consiste em: 2/10, 23/42, 50/58; 90/98 e 282/290.
[0018] São providos aqui anticorpos ou seus fragmentos de liga- ção a antígeno que se ligam especificamente a MSR1, o qual compre- ende uma CDR1 de cadeia pesada (HCDR1) composta por uma se- quência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das sequências de aminoácidos HCDR1 listadas na Tabela 4 ou uma sequência subs- tancialmente semelhante, com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pe- lo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0019] São também providos aqui anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antígeno que se ligam especificamente a MSR1, os quais compreendem uma CDR2 de cadeia pesada (HCDR2) composta por uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das se- quências de aminoácidos de HCDR2 listadas na Tabela 4 ou uma se- quência substancialmente semelhante da mesma, com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de iden- tidade de sequência.
[0020] São também providos aqui anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antígeno que se ligam especificamente a MSR1, os quais compreendem uma CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) composta por uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das se- quências de aminoácidos de HCDR3 listadas na Tabela 4 ou uma se-
quência substancialmente semelhante da mesma, com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de iden- tidade de sequência.
[0021] São providos aqui anticorpos ou seus fragmentos de liga- ção a antígeno que se ligam especificamente a MSR1, os quais com- preendem uma CDR1 de cadeia leve (LCDR1) composta por uma se- quência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das sequências de aminoácidos LCDR1 listadas na Tabela 4 ou uma sequência subs- tancialmente semelhante da mesma, com pelo menos 90%, pelo me- nos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de se- quência.
[0022] São também providos aqui anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antígeno que se ligam especificamente a MSR1, os quais compreendem uma CDR2 de cadeia leve (LCDR2) compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das se- quências de aminoácidos LCDR2 listadas na Tabela 4 ou uma se- quência substancialmente semelhante da mesma, com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de iden- tidade de sequência.
[0023] São também providos aqui anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antígeno que se ligam especificamente a MSR1, os quais compreendem uma CDR3 de cadeia leve (LCDR3) composta por uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das sequên- cias de aminoácidos LCDR3 listadas na Tabela 4 ou uma sequência substancialmente semelhante da mesma, com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0024] São também providos aqui anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antígeno que se ligam especificamente a MSR1, os quais compreendem um par de sequências de aminoácidos de HCDR3 e
LCDR3 (HCDR3/LCDR3) composto por qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR3 listadas na Tabela 4 pareada com qual- quer uma das sequências de aminoácidos de LCDR3 listadas na Ta- bela 4. Algumas modalidades se referem a anticorpos, ou seus frag- mentos de ligação a antígeno, compreendendo um par de sequências de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 contido em qualquer um dos anti- corpos anti-MSR1 exemplares listados na Tabela 4. Em algumas mo- dalidades, o par de sequências de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 é selecionado do grupo que consiste em: 8/16, 40/48, 56/64; 96/104 e 288/296.
[0025] São providos aqui anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno que se ligam especificamente a MSR1, os quais compreen- dem um conjunto de seis CDRs (ou seja, HCDR1-HCDR2-HCDR3- LCDR1-LCDR2-LCDR3) contidas em qualquer um dos anticorpos anti- MSR1 exemplares listados na Tabela 4. Em algumas modalidades, o conjunto de sequências de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3- LCDR1-LCDR2-LCDR3 é selecionado do grupo constituído por: 4-6-8- 12-14-16; 36-38-40-44-46-48; 52-54-56-60-62-64; 92-94-96-100-102- 104 e 284-286-288-292-294-296.
[0026] Em uma modalidade relacionada, são providos aqui anti- corpos, ou seus fragmentos de ligação a antígeno, que se ligam espe- cificamente a MSR1, compreendendo um conjunto de seis CDRs (ou seja, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contidas em um par de sequências de aminoácidos de HCVR/LCVR, conforme de- finido por qualquer um dos anticorpos anti-MSR1 exemplares listados na Tabela 4. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antígeno que se ligam especificamente a MSR1, compreendendo o conjunto de sequências de aminoácidos de HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 contido em um par de sequências de aminoácidos HCVR/LCVR selecionado do grupo constituído por: 2/10, 23/42, 50/58, 90/98 e 282/290. Métodos e Técni- cas para a identificação de CDRs nas sequências de aminoácidos HCVR e LCVR são bem conhecidos na arte e podem ser utilizados para identificar CDRs nas sequências de aminoácidos HCVR e/ou LCVR específicas aqui descritas. Convenções exemplares que podem ser usadas para identificar os limites das CDRs incluem, por exemplo, a definição Kabat, a definição de Chothia e a definição de AbM. Em termos gerais, a definição de Kabat baseia-se na variabilidade da se- quência, a definição de Chothia baseia-se na localização das regiões de alça estruturais, e a definição de AbM é um compromisso entre as abordagens de Kabat e de Chothia. Consulte, por exemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani e outros,, J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); e Martin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:9268-9272 (1989). Bases de dados públicas também estão dispo- níveis para identificar sequências de CDR dentro de um anticorpo.
[0027] São também providas aqui moléculas de ácido nucleico que codificam anticorpos anti-MSR1 ou porções deles. Por exemplo, são aqui providas moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR listadas na Tabela 4; em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico é constituída por uma sequência de polinucleotídeos selecionada de qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos de HCVR listadas na Tabela 5, ou por uma sequência substancialmente semelhante com pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.
[0028] São também providas aqui moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCVR lis- tadas na Tabela 4; em algumas modalidades, a molécula de ácido nu- cleico é constituída por uma sequência de polinucleotídeos seleciona-
da de qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos de LCVR listadas na Tabela 5, ou por uma sequência substancialmente seme- lhante que tenha pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.
[0029] São também providas aqui moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR1 listadas na Tabela 4; em certas modalidades, a molécula de ácido nu- cleico é constituída por uma sequência de polinucleotídeos seleciona- da de qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos da HCDR1 listadas na Tabela 5, ou uma sequência substancialmente semelhante que tenha pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pe- lo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.
[0030] São também providas aqui moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos da HCDR2 listadas na Tabela 4; em certas modalidades, a molécula de ácido nu- cleico é constituída por uma sequência de polinucleotídeos seleciona- da de qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos de HCDR2 listadas na Tabela 5, ou uma sequência substancialmente semelhante que tenha pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pe- lo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.
[0031] São também providas aqui moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCDR3 listadas na Tabela 4; em certas modalidades, a molécula de ácido nu- cleico é constituída por uma sequência de polinucleotídeos seleciona- da de qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos da HCDR3 listadas na Tabela 5, ou uma sequência substancialmente semelhante que tenha pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pe- lo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.
[0032] São também providas aqui moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR1 listadas na Tabela 4; em certas modalidades, a molécula de ácido nu- cleico é constituída por uma sequência de polinucleotídeos seleciona- da de qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos da LCDR1 listadas na Tabela 5, ou por uma sequência substancialmente seme- lhante que tenha pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.
[0033] São também providas aqui moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos de LCDR2 listadas na Tabela 4; em certas modalidades, a molécula de ácido nu- cleico é constituída por uma sequência de polinucleotídeos seleciona- da de qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos da LCDR2 listadas na Tabela 5, ou por uma sequência substancialmente seme- lhante que tenha pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.
[0034] São também providas aqui moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácidos da LCDR3 listadas na Tabela 4; em certas modalidades, a molécula de ácido nu- cleico é constituída por uma sequência de polinucleotídeos seleciona- da de qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos de LCDR3 listadas na Tabela 5, ou por uma sequência substancialmente seme- lhante que tenha pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma.
[0035] São também providas aqui moléculas de ácido nucleico que codificam uma HCVR, em que a HCVR compreende um conjunto de três CDRs (ou seja, HCDR1-HCDR2-HCDR3), em que o conjunto de sequências de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3 é conforme defi- nido por qualquer um dos anticorpos anti-MSR1 exemplares listados na Tabela 4.
[0036] São também providas aqui moléculas de ácido nucleico que codificam um LCVR, em que a LCVR compreende um conjunto de três
CDRs (ou seja, LCDR1-LCDR2-LCDR3), em que o conjunto de se- quências de aminoácidos LCDR1-LCDR2-LCDR3 é conforme definido por qualquer um dos anticorpos anti-MSR1 exemplares listados na Ta- bela 4.
[0037] São também providas aqui moléculas de ácido nucleico que codificam tanto uma HCVR como uma LCVR, em que a HCVR com- preende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das se- quências de aminoácidos da HCVR listadas na Tabela 4, e em que a LCVR compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das sequências de aminoácidos da LCVR listadas na Tabela 4. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada de qualquer das sequên- cias de ácidos nucleicos da HCVR listadas na Tabela 5, ou uma se- quência substancialmente semelhante da mesma que tenha pelo me- nos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma, e uma sequência de polinu- cleotídeos selecionada de qualquer uma das sequências de ácidos nucleicos da LCVR listadas na Tabela 5, ou uma sequência substanci- almente semelhante tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a mesma. Em algumas modalidades de acordo com este aspecto da in- venção, a molécula de ácido nucleico codifica uma HCVR e LCVR, em que a HCVR e a LCVR são ambas derivadas do mesmo anticorpo anti- MSR1 listado na Tabela 4.
[0038] São também providos aqui vetores de expressão recombi- nantes capazes de expressar um polipeptídeo composto por uma regi- ão variável de cadeia pesada ou leve de um anticorpo anti-MSR1. Por exemplo, as modalidades incluem vetores de expressão recombinan- tes compreendendo qualquer uma das moléculas de ácido nucleico acima mencionadas, ou seja, moléculas de ácido nucleico que codifi-
cam qualquer uma das sequências HCVR, LCVR e/ou CDR, conforme estabelecido na Tabela 4. Também incluídas no escopo da presente invenção estão as células hospedeiras nas quais esses vetores foram introduzidos, bem como os métodos de produção dos anticorpos ou porções dos mesmos, por cultura das células hospedeiras em condi- ções que permitam a produção dos anticorpos ou fragmentos de anti- corpos, e recuperação dos anticorpos e fragmentos de anticorpos as- sim produzidos.
[0039] São providos aqui anticorpos anti-MSR1 com um padrão de glicosilação modificado. Em algumas modalidades, a modificação para remover sítios de glicosilação indesejáveis pode ser útil, por exemplo, para aumentar a função de citotoxicidade celular dependente do anti- corpo (ADCC) (vide Shield e outros, (2002) JBC 277:26733). Em al- gumas modalidades, pode ser útil a modificação para prover um anti- corpo que não tenha uma porção fucose presente na cadeia oligossa- carídica, por exemplo, para aumentar a função de citotoxicidade celu- lar dependente do anticorpo (ADCC). Em outras aplicações, a modifi- cação da galactosilação pode ser feita para modificar a citotoxicidade dependente do complemento (CDC).
[0040] Em outro aspecto, é provida aqui uma composição farma- cêutica composta por um anticorpo humano recombinante ou seu fra- gmento que se liga especificamente a MSR1 e um carreador farma- ceuticamente aceitável. Em um aspecto relacionado, as modalidades se referem a uma composição que é uma combinação de um anticorpo anti-MSR1 e um segundo agente terapêutico. Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico é qualquer agente que seja vantajosa- mente combinado com um anticorpo anti-MSR1. São também providos aqui os conjugados anticorpo-fármaco (ADCs) compreendendo um an- ticorpo anti-MSR1 conjugado a um fármaco ou um agente terapêutico. Terapias de combinação exemplares, coformulações e ADCs envol-
vendo os anticorpos anti-MSR1 são descritos no presente documento.
[0041] São também providos aqui conjugados anticorpos-fármacos (ADCs) compreendendo um anticorpo anti-MSR1, ou um seu fragmen- to de ligação a antígeno MSR1, conjugado com um fármaco ou um agente terapêutico. São também providos aqui ligadores-cargas úteis reativos úteis para a produção de ADCs. Além disso, são providos an- ticorpos anti-MSR1 modificados e fragmentos de ligação a antígeno de MSR1 modificados, úteis para a produção de ADCs.
[0042] São também providos aqui métodos terapêuticos que inclu- em a administração de um anticorpo anti-MSR1, uma porção de liga- ção a antígeno de um anticorpo MSR1, ou um ADC composto por um anticorpo anti-MSR1 do seu fragmento de ligação a antígeno de MSR1, a um indivíduo com necessidade dos mesmos. Os métodos terapêuticos compreendem a administração de uma quantidade tera- peuticamente eficaz de uma composição farmacêutica composta por um anticorpo anti-MSR1, uma porção de ligação a antígeno de um an- ticorpo para MSR1 ou um ADC constituído por um anticorpo anti- MSR1 do seu fragmento de ligação a antígeno de MSR1 ao indivíduo. O distúrbio tratado é qualquer doença ou condição que seja melhora- da, amenizada, inibida ou impedida por direcionamento ao MSR1. Em algumas modalidades, a doença ou a condição é uma doença prolife- rativa, uma doença metabólica, inflamação, uma doença neurodegene- rativa ou doença, distúrbio ou condição associado à sinalização do re- ceptor de glicocorticoide. Em algumas modalidades, a doença ou a condição é a aterosclerose. Em algumas modalidades, a doença, o distúrbio ou a condição associado à sinalização do receptor de glico- corticoide é uma doença, distúrbio ou condição inflamatória. Em algu- mas dessas modalidades, são reduzidos os efeitos colaterais associa- dos à administração da carga útil de esteroide não conjugado do refe- rido composto. São também providos aqui métodos terapêuticos que incluem a administração de um anticorpo anti-MSR1, uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo MSR1, ou um ADC composto por um anticorpo anti-MSR1 do seu fragmento de ligação a antígeno de MSR1, para o tratamento e/ou prevenção de infecção bacteriana em um indivíduo.
[0043] É provido aqui o uso de um anticorpo anti-MSR1, uma por- ção de ligação a antígeno de um anticorpo para MSR1 ou um ADC composto por um anticorpo anti-MSR1 do seu fragmento de ligação a antígeno de MSR1, descrito no presente documento, para o tratamen- to de qualquer doença, distúrbio ou condição descrito no presente do- cumento.
[0044] São também providos aqui métodos terapêuticos para o tratamento, atenuação ou amenização da aterosclerose, incluindo a administração de um anticorpo anti-MSR1, uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo para MSR1, ou um ADC composto por um anticorpo anti-MSR1 ou seu fragmento de ligação a antígeno de MSR1, a um indivíduo com necessidade do mesmo. Os métodos tera- pêuticos compreendem a administração ao indivíduo de uma quanti- dade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica com- posta por um anticorpo anti-MSR1, uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo MSR1 ou um ADC constituído por um anticorpo anti- MSR1 do seu fragmento de ligação a antígeno de MSR1.
[0045] Outras modalidades se tornarão evidentes a partir de uma revisão da descrição detalhada a seguir.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0046] A Figura 1 fornece um esquema para a síntese de P1 e P2B.
[0047] A Figura 2 fornece um esquema para a síntese de LP1.
[0048] A Figura 3 fornece um esquema para a síntese de LP2.
[0049] A Figura 4 fornece um esquema para a síntese de LP5.
[0050] A Figura 5 fornece um esquema para a síntese de LP6.
[0051] A Figura 6 fornece um esquema para a síntese de LP18.
[0052] A Figura 7 fornece um esquema para a síntese de LP4.
[0053] A Figura 8 fornece um esquema para a síntese de LP11.
[0054] A Figura 9 fornece um esquema para a síntese de LP9.
[0055] A Figura 10 fornece um esquema para a síntese de LP12.
[0056] A Figura 11 fornece um esquema para a síntese de P3 e P4.
[0057] A Figura 12 fornece um esquema para a síntese de LP3.
[0058] A Figura 13 fornece um esquema para a síntese de LP13.
[0059] A Figura 14 fornece um esquema para a síntese de LP14.
[0060] A Figura 15 fornece um esquema para a síntese de LP15.
[0061] A Figura 16 fornece um esquema para a síntese de conju- gados anticorpo-fármaco (ADCs).
[0062] A Figura 17 é um gráfico de linhas que ilustra o percentual de efluxo de colesterol dependente da dose em macrófagos THP-1 para um conjugado exemplificativo de anticorpo MSR1-LXR, a sua par- te homóloga não conjugada, um conjugado de controle de isótipo- esteroide e a carga útil livre correspondente.
[0063] A Figura 18 apresenta uma série de gráficos de barras ilus- trando o efeito de um conjugado exemplificativo de anticorpo MSR1- agonista LXR e sua parte homóloga não conjugada sobre os níveis lipídicos séricos em um modelo de camundongo de aterosclerose.
[0064] A Figura 19 apresenta uma série de gráficos de barras ilus- trando o efeito de um conjugado exemplificativo de anticorpo MSR1- agonista LXR e sua parte homóloga não conjugada sobre a área lipídi- ca da lesão e o teor de macrófagos (CD68) em um modelo de camun- dongo de aterosclerose.
[0065] A Figura 20 apresenta uma série de gráficos de barras ilus- trando o efeito de um conjugado exemplificativo de anticorpo MSR1-
agonista LXR e sua parte homóloga não conjugada sobre os níveis hepáticos de triglicerídeos e colesterol em um modelo de rato de ate- rosclerose.
[0066] A Figura 21 apresenta uma série de gráficos de barras ilus- trando o efeito de um conjugado exemplificativo de anticorpo MSR1- agonista LXR e sua parte homóloga não conjugada sobre a lipogênese de novo em um modelo de rato de aterosclerose.
[0067] A figura 22 apresenta um esquema para a síntese de espa- çadores de Budesonida contendo os grupos reativos, ácido succínico (composto 1c), análogos de carbamato (1d, 1e), análogos de THP (1g e 1h), análogos de glicose (1i e 1j), análogos de fosfato (1k e 1l) e um análogo de fosfato comercial (1m).
[0068] A Figura 23 apresenta um esquema para a síntese de car- gas úteis, compostos e carboxamidas de bis-octaidrofenantreno P3B- P9B.
[0069] A Figura 24 apresenta um esquema para a síntese de car- gas úteis, compostos e carboxamidas de bis-octaidrofenantreno P10B- P11B.
[0070] A Figura 25 apresenta um esquema para a síntese de liga- dores e cargas úteis de ligadores LP1B-LP5B.
[0071] A Figura 26 apresenta um esquema para a síntese de liga- dores e carga útil do ligador LP6B.
[0072] A Figura 27 apresenta um esquema para a síntese de liga- dores e carga útil do ligador LP7B.
[0073] A Figura 28 apresenta um esquema para a síntese de liga- dores e carga útil do ligador LP8B.
[0074] A Figura 29 apresenta um esquema para a síntese de liga- dores e carga útil do ligador LP9B.
[0075] A Figura 30 apresenta um esquema para a síntese de liga- dores e cargas úteis dos ligadores LP10B e LP11B.
[0076] A Figura 31 apresenta um esquema para a síntese de car- gas úteis 12B, ligadores e carga útil do ligador LP12B.
[0077] A Figura 32 apresenta um esquema para a síntese de ci- clodextrina-azida 105a.
[0078] A Figura 33 apresenta um esquema para a síntese de azi- do-PEG4-taurina 105b.
[0079] A Figura 34 apresenta um esquema para a síntese de mal- tose-azida 105c.
[0080] A Figura 35 é um gráfico dos resultados do ensaio de inibi- ção do crescimento de S. aureus realizado com análogos de rifamici- na.
[0081] A Figura 36 é um gráfico de barras dos resultados do en- saio de morte intracelular de S. aureus realizado com análogos de ri- famicina.
[0082] A Figura 37 é um gráfico dos resultados do ensaio de morte intracelular de S. aureus realizado com análogos de rifamicina.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0083] Antes da descrição da presente invenção, deve-se entender que esta invenção não se limita aos métodos e condições experimen- tais específicos descritos, visto que esses métodos e condições po- dem variar. Deve também ser entendido que a terminologia utilizada no presente documento se destina meramente à finalidade de descre- ver modalidades específicas e não tem a finalidade de ser limitante, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado unicamente pelas reivindicações anexas.
[0084] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado comumente entendido por aquele com habilidade comum na técnica à qual pertence a presente invenção. Conforme aqui utilizado, o termo "cerca de", quando utilizado em referência a um determinado valor numérico enumerado, significa que o valor pode variar do valor enu- merado em não mais do que 1%. Por exemplo, como aqui usado, a expressão "cerca de 100" inclui 99 e 101 e todos os valores intermedi- ários (por exemplo, 99,1; 99,2; 99,3; 99,4; etc.).
[0085] Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou testes da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as patentes, pedidos de patente e publicações não patentárias mencionados no presente pedido de patente são aqui incorporados por referência em suas totalidades. Definições
[0086] As expressões "MSR1", "hMSR1" e semelhantes, como aqui utilizado, referem-se ao receptor de reconhecimento de padrões de glicoproteína transmembrana tipo II, trimérico, de passagem única, humano compreendendo (i) a sequência de aminoácidos como estabe- lecida em NCBI, número de acesso NP_002436.1, (ii) a sequência de aminoácidos como estabelecida em NCBI, número de acesso NP_619729.1 e/ou (iii) a sequência de aminoácidos como estabelecida em NCBI, número de acesso NP_619730.1, que representam os vá- rios tipos e isoformas dos receptores sequestrantes de macrófagos de classe A. A expressão "MSR1" inclui moléculas de MSR1 monoméri- cas e multiméricas. Como usado aqui, a expressão "MSR1 monoméri- co humano" significa uma proteína MSR1 ou parte dela que não con- tém nem possui domínios multimerizantes e que existe em condições normais como uma única molécula de MSR1 sem uma conexão física direta com outra molécula de MSR1. Uma molécula de MSR1 mono- mérica exemplificativa é a molécula aqui referida como "his-hMSR1" compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 393 (vi- de, por exemplo, o Exemplo 3 no presente documento).
[0087] Todas as referências a proteínas, polipeptídeos e fragmen-
tos de proteínas aqui presentes pretendem fazer referência à versão humana da respectiva proteína, polipeptídeo ou fragmento de proteína, a menos que explicitamente especificado como sendo de uma espécie não humana. Assim, a expressão "MSR1" significa MSR1 humano, a menos que seja especificado como sendo de uma espécie não huma- na, por exemplo, "MSR1 de camundongo", "MSR1 de macaco", etc.
[0088] Tal como aqui utilizada, a expressão "MSR1 expresso na superfície da célula" designa uma ou mais proteínas MSR1 ou seu domínio extracelular, que é/são expressas na superfície de uma célula in vitro ou in vivo, de modo que pelo menos uma porção de uma prote- ína MSR1 seja exposta ao lado extracelular da membrana da célula e seja acessível a uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo. Um "MSR1 expresso na superfície da célula" pode compreender ou consistir em uma proteína MSR1 expressa na superfície de uma célula que normalmente expressa a proteína MSR1. Em alternativa, o "MSR1 expresso na superfície da célula" pode compreender ou consistir na proteína MSR1 expressa na superfície de uma célula que normalmen- te não expressa o MSR1 humano em sua superfície, mas foi artificial- mente engenheirada para expressar o MSR1 em sua superfície.
[0089] Tal como aqui utilizado, a expressão "anticorpo anti-MSR1" inclui anticorpos monovalentes com uma única especificidade, bem como anticorpos biespecíficos compreendendo uma primeira ramifica- ção que liga a MSR1 e uma segunda ramificação que liga um segundo antígeno (alvo), em que a ramificação anti-MSR1 compreende qual- quer uma das sequências de HCVR/LCVR ou CDR, conforme estabe- lecido na Tabela 4 aqui. A expressão "anticorpo anti-MSR1" também inclui conjugados anticorpo-fármaco (ADCs) que incluem um anticorpo anti-MSR1 ou uma porção de ligação a antígeno conjugada a um fár- maco ou um agente terapêutico. A expressão "anticorpo anti-MSR1" também inclui conjugados anticorpo-radionuclídeos (ARCs) compre-
endendo um anticorpo anti-MSR1 ou sua porção de ligação a antígeno conjugada a um radionuclídeo.
[0090] O termo "anticorpo", tal como aqui utilizado, significa qual- quer molécula de ligação a antígeno ou complexo molecular compre- endendo pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) que se liga ou interage especificamente com um antígeno es- pecífico (por exemplo, MSR1). O termo "anticorpo" inclui moléculas de imunoglobulina compostas por quatro cadeias polipeptídicas, duas ca- deias pesadas (H) e duas cadeias leves (L), interligadas por ligações dissulfeto, bem como os seus multímeros (por exemplo, IgM). Cada cadeia pesada é composta por uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é composta por três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é composta por uma re- gião variável de cadeia leve (abreviada aqui como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é composta por um domínio (CL1). As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDRs), intercaladas com re- giões mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRS, dispostas do terminal amino para o terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Em diferentes modalidades da invenção, as FRS do anticorpo anti-MSR1 (ou sua porção de ligação a antígeno) podem ser idênticas às sequências da linhagem germinativa humanas, ou podem ser natural ou artificialmente modificadas. Uma sequência consenso de aminoácidos pode ser definida com base em uma análise lado a lado de duas ou mais CDRs.
[0091] O termo "anticorpo", tal como aqui utilizado, também inclui fragmentos de ligação a antígeno de moléculas de anticorpos comple-
tas. Os termos "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo, "frag- mento de ligação a antígeno" de um anticorpo e semelhantes, confor- me aqui utilizados, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, que possa ser obtida enzimaticamente, sintética ou geneticamente engenheirada, que liga especificamente um antígeno para formar um complexo. Os fragmentos de ligação a antígeno de um anticorpo podem ser derivados, por exemplo, de moléculas de anticor- pos inteiras utilizando quaisquer técnicas padrão adequadas, como as técnicas de digestão proteolítica ou de engenharia genética recombi- nante que envolvam a manipulação e a expressão de variáveis de an- ticorpos de codificação de DNA e domínios opcionalmente constantes. Esse DNA é conhecido e/ou está prontamente disponível a partir de, por exemplo, fontes comerciais, bibliotecas de DNA (incluindo, por exemplo, bibliotecas de fagos-anticorpos) ou pode ser sintetizado. O DNA pode ser sequenciado e manipulado quimicamente ou usando técnicas de biologia molecular, por exemplo, para organizar um ou mais domínios variáveis e/ou constantes em uma configuração ade- quada, ou para introduzir os códons, criar resíduos de cisteína, modifi- car, adicionar ou excluir aminoácidos, etc.
[0092] Exemplos não limitantes de fragmentos de ligação a antí- geno incluem: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmen- tos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas de Fv de cadeia única (scFV); (vi) fragmentos dAb; e (vii) unidades de reconhecimento mínimas constituídas pelos resíduos de aminoácidos que imitam a região hiper- variável de um anticorpo (por exemplo, uma região de determinação de complementaridade (CDR) isolada, como um peptídeo CDR3), ou um peptídeo FR3-CDR3-FR4 restrito. Outras moléculas engenheira- das, como anticorpos específicos do domínio, anticorpos de domínio único, anticorpos com domínio excluído, anticorpos quiméricos, anti- corpos enxertados com CDR, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, mini-
corpos, nanocorpos (por exemplo, nanocorpos monovalentes, nano- corpos bivalentes, etc.), pequenos imunofármacos modulares (SMIPs) e domínios IgNAR variáveis de tubarão, também estão incluídas na expressão "fragmento de ligação a antígeno", como usado aqui.
[0093] Um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo irá normalmente incluir pelo menos um domínio variável. O domínio variá- vel pode ser de qualquer tamanho ou composição de aminoácidos e será geralmente constituído por pelo menos uma CDR adjacente ou em quadro com uma ou mais sequências estruturais. Nos fragmentos de ligação a antígeno com um domínio VH associado a um domínio VL, os domínios VH e VL podem estar situados em relação um ao outro em qualquer disposição adequada. Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e conter dímeros VH-VH, VH-VL ou VL-VL. Em alternativa, o fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo pode conter um do- mínio VH ou VL monomérico.
[0094] Em certas modalidades, um fragmento de ligação a antíge- no de um anticorpo pode conter pelo menos um domínio variável liga- do de forma covalente a pelo menos um domínio constante. As confi- gurações não limitantes e exemplares de domínios variáveis e cons- tantes que podem ser encontradas dentro de um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo da presente invenção incluem: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH- CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1- CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; e (xiv) VL-CL. Em qualquer configuração de domínios variáveis e constantes, incluindo qualquer uma das configurações exemplares listadas acima, os domínios variá- veis e constantes podem estar diretamente vinculados uns aos outros ou vinculados por uma região de dobra ou de ligação total ou parcial. Uma região de dobra pode consistir em pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos que resultam em uma ligação flexível ou semiflexível entre domínios variáveis e/ou constantes adja- centes em uma única molécula de polipeptídeo. Além disso, um frag- mento de ligação a antígeno de um anticorpo da presente invenção pode incluir um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) de qualquer uma das configurações de domínio variável e constante lista- das acima em associação não covalente entre si e/ou com um ou mais domínios VH ou VL monoméricos (por exemplo, por ligação(ões) dissul- feto).
[0095] Tal como acontece com as moléculas de anticorpos intei- ras, os fragmentos de ligação a antígeno podem ser monoespecíficos ou multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos). Um fragmento de li- gação a antígeno multiespecífico de um anticorpo irá normalmente in- cluir pelo menos dois domínios variáveis diferentes, em que cada do- mínio variável é capaz de se ligar especificamente a um antígeno se- parado ou a um epitopo diferente no mesmo antígeno. Qualquer for- mato de anticorpo multiespecífico, incluindo os formatos de anticorpos biespecíficos exemplares aqui descritos, pode ser adaptado para utili- zação no contexto de um fragmento de ligação a antígeno de um anti- corpo da presente invenção utilizando técnicas de rotina disponíveis na arte.
[0096] Os anticorpos da presente invenção podem funcionar atra- vés de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) ou citotoxi- cidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC). "Cito- toxicidade dependente de complemento" (CDC) refere-se à lise das células de expressão de antígeno por um anticorpo da invenção na presença de complemento. "Citotoxicidade mediada por células de- pendente de anticorpos" (ADCC) refere-se a uma reação mediada por células na qual células citotóxicas não específicas que expressam re- ceptores Fc (FcRs) (por exemplo, células assassinas naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado em uma célu-
la-alvo e, consequentemente, levam à lise da célula-alvo. CDC e ADCC podem ser medidas utilizando ensaios que são bem conhecidos e disponíveis na arte. (Consulte, por exemplo, as Patentes norte- americanas nº 5,500,362 e 5,821,337, e Clynes e outros, (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (EUA) 95:652-656). A região constante de um anticor- po é importante na capacidade de um anticorpo fixar a citotoxicidade dependente de complemento e mediar a citotoxicidade dependente de célula. Assim, o isótipo de um anticorpo pode ser selecionado com ba- se em se é desejável para o anticorpo mediar a citotoxicidade.
[0097] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-MSR1 aqui descritos são anticorpos humanos. O termo "anticorpo humano", tal como aqui utilizado, deve incluir anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulinas da linhagem germinativa humanas. Os anticorpos humanos da invenção podem in- cluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imu- noglobulinas da linhagem germinativa humanas (por exemplo, muta- ções introduzidas por mutagênese aleatória ou específica para sítio in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo nas CDRs e, em particular, na CDR3. No entanto, o termo "anticorpo humano", tal como aqui utilizado, não se destina a incluir anticorpos nos quais as sequên- cias de CDR derivadas da linhagem germinativa de outra espécie de mamíferos, como um camundongo, tenham sido enxertadas em se- quências estruturais humanas.
[0098] Os anticorpos aqui descritos podem, em algumas modali- dades, ser anticorpos humanos recombinantes. O termo "anticorpo humano recombinante", tal como aqui utilizado, destina-se a incluir to- dos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, como anticorpos expressos utili- zando um vector de expressão recombinante transfectado para uma célula hospedeira (descritos mais adiante), anticorpos isolados de uma biblioteca combinatorial de anticorpos humanos recombinantes (descri- tos mais adiante), anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes da imunoglobulina huma- na (vide, por exemplo, Taylor e outros, (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isola- dos por qualquer outro meio que envolva a junção de sequências de genes da imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Esses anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulinas da linhagem germinativa humanas. Em certas modalidades, contudo, esses anticorpos huma- nos recombinantes são submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando se usa um animal transgênico para sequências de Ig humanas, muta- gênese somática in vivo) e, por conseguinte, as sequências de amino- ácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequên- cias que, embora derivadas e relacionadas a sequências VH e VL da linhagem germinativa humanas, podem não existir naturalmente no repertório da linhagem germinativa de anticorpos humanos in vivo.
[0099] Os anticorpos humanos podem existir em duas formas que são associadas à heterogeneidade da dobra. Em uma forma, uma mo- lécula de imunoglobulina é composta por uma construção estável de quatro cadeias de aproximadamente 150 a 160 kDa, na qual os díme- ros são mantidos juntos por uma ligação dissulfeto de cadeia pesada intercadeia. Em uma segunda forma, os dímeros não estão ligados por ligações dissulfeto entre cadeias, e uma molécula de cerca de 75 a 80 kDa é formada por uma cadeia leve e uma pesada covalentemente acopladas (meio anticorpo). Essas formas têm sido extremamente difí- ceis de separar, mesmo após purificação por afinidade.
[00100] A frequência de aparecimento da segunda forma em vários isótipos de IgG intactos deve-se, mas não se limita a, às diferenças estruturais associadas ao isótipo da região de dobra do anticorpo. A substituição de um único aminoácido na região de dobra da dobra de IgG4 humano pode reduzir significativamente o aparecimento da se- gunda forma (Angal e outros, (1993) Molecular Immunology 30:105) a níveis normalmente observados usando uma dobra de IgG1 humano. As modalidades aqui descritas abrangem anticorpos com uma ou mais mutações na região CH2 ou CH3 da dobra, o que pode ser desejável, por exemplo, na produção, para melhorar o rendimento da forma de anticorpo desejada.
[00101] Os anticorpos aqui descritos podem ser anticorpos isola- dos. Um "anticorpo isolado", tal como aqui utilizado, significa um anti- corpo que foi identificado e separado e/ou recuperado de, pelo menos, um componente do seu ambiente natural. Por exemplo, um anticorpo que foi separado ou removido de pelo menos um componente de um organismo, ou de um tecido ou célula em que o anticorpo exista natu- ralmente, ou seja, produzido naturalmente, é um "anticorpo isolado" para efeitos da presente invenção. Um anticorpo isolado também inclui um anticorpo in situ dentro de uma célula recombinante. Os anticorpos isolados são anticorpos que foram submetidos a pelo menos uma eta- pa de purificação ou isolamento. De acordo com certas modalidades, um anticorpo isolado pode ser substancialmente isento de outros ma- teriais celulares e/ou substâncias químicas.
[00102] Os anticorpos anti-MSR1 aqui descritos podem incluir uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos nas regiões estruturais e/ou CDR dos domínios variáveis de cadeias pesa- da e leve, em comparação com as sequências da linhagem germinati- va correspondentes das quais os anticorpos foram derivados. Essas mutações podem ser facilmente verificadas comparando as sequên- cias de aminoácidos aqui descritas com as sequências da linhagem germinal disponíveis, por exemplo, a partir de bases de dados públicas de sequências de anticorpos. As modalidades incluem os anticorpos, e seus fragmentos de ligação a antígeno, que são derivados de qualquer uma das sequências de aminoácidos aqui descritas, em que um ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais regiões estruturais e/ou CDR são mutados para o(s) resíduo(s) correspondente(s) da sequên- cia da linhagem germinativa da qual o anticorpo foi derivado, ou para o(s) resíduo(s) correspondente(s) de outra sequência da linhagem germinativa humana, ou para uma substituição conservativa de ami- noácidos do(s) resíduo(s) da linhagem germinativa correspondentes (essas alterações de sequência são aqui referidas coletivamente como "mutações da linhagem germinativa"). Aquele versado na técnica, a partir com as sequências da região variável de cadeias pesada e leve aqui descritas, pode facilmente produzir numerosos anticorpos e frag- mentos de ligação a antígenos que compreendem uma ou mais muta- ções individuais da linhagem germinativa ou suas combinações.
Em certas modalidades, todos os resíduos estruturais e/ou da CDR nos domínios VH e/ou VL são mutados de volta aos resíduos encontrados na sequência da linhagem germinativa original a partir da qual o anti- corpo foi derivado.
Em outras modalidades, apenas alguns resíduos são mutados de volta à sequência da linhagem germinativa original, por exemplo, apenas os resíduos mutados encontrados nos primeiros 8 aminoácidos da FR1 ou nos últimos 8 aminoácidos da FR4, ou ape- nas os resíduos mutados encontrados na CDR1, CDR2 ou CDR3. Em outras modalidades, um ou mais resíduos estruturais e/ou da CDR são mutados para o(s) resíduo(s) correspondente(s) de uma sequência da linhagem germinativa diferente (ou seja, uma sequência da linhagem germinativa diferente da sequência da linhagem germinativa a partir da qual o anticorpo foi originalmente derivado). Além disso, os anticorpos da presente invenção podem conter qualquer combinação de duas ou mais mutações da linhagem germinativa nas regiões estruturais e / ou CDR, por exemplo, em que determinados resíduos individuais são mu-
tados para o resíduo correspondente de uma sequência da linhagem germinativa específica, enquanto determinados outros resíduos que diferem da sequência da linhagem germinativa original são mantidos ou são mutados para o resíduo correspondente de uma sequência da linhagem germinativa diferente. Uma vez obtidos, os anticorpos e os fragmentos de ligação a antígeno que contenham uma ou mais muta- ções da linhagem germinativa podem ser facilmente testados para uma ou mais propriedades desejadas, como melhor especificidade de ligação, maior afinidade de ligação, propriedades biológicas antagonis- tas ou agonistas melhores ou acentuadas (conforme o caso), menor imunogenicidade, etc. Os anticorpos e os fragmentos de ligação a an- tígeno obtidos dessa forma geral são incluídos nas modalidades aqui descritas.
[00103] As modalidades também incluem anticorpos anti-MSR1 que compreendem variantes de qualquer uma das sequências de aminoá- cidos da HCVR, LCVR e/ou CDR aqui descritas, com uma ou mais substituições conservativas. Por exemplo, as modalidades incluem an- ticorpos anti-MSR1 com sequências de aminoácidos da HCVR, LCVR e/ou CDR com, por exemplo, 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, etc. substituições conservativas de aminoácidos relativas a qualquer uma das sequências de aminoácidos da HCVR, LCVR e/ou CDR estabelecidas na Tabela 4.
[00104] O termo "epitopo" refere-se a um determinante antigênico que interage com um sítio de ligação a antígeno específico na região variável de uma molécula de anticorpo conhecida como parátopo. Um único antígeno pode ter mais do que um epitopo. Assim, diferentes an- ticorpos podem se ligar a diferentes áreas de um antígeno e pode ter diferentes efeitos biológicos. Os epitopos podem ser conformacionais ou lineares. Um epitopo conformacional é produzido por aminoácidos espacialmente justapostos de diferentes segmentos da cadeia linear de polipeptídeos. Um epitopo linear é aquele produzido por resíduos de aminoácidos adjacentes em uma cadeia polipeptídica. Em algumas circunstâncias, um epitopo pode incluir porções de sacarídeos, grupos fosforila ou grupos sulfonila no antígeno.
[00105] O termo "identidade substancial" ou "substancialmente idêntico", quando se refere a um ácido nucleico ou fragmento de ácido nucleico, indica que, quando perfeitamente alinhado com inserções ou deleções de nucleotídeos apropriadas com outro ácido nucleico (ou seu filamento complementar), existe uma identidade de sequência de nucleotídeos em pelo menos 95%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% das bases nucleotídicas, conforme medido por qualquer algoritmo conhecido de identidade de sequência, como FASTA, BLAST ou GAP, conforme discutido abaixo. Uma molé- cula de ácido nucleico com uma identidade substancial a uma molécu- la de ácido nucleico de referência pode, em alguns casos, codificar um polipeptídeo tendo a mesma sequência de aminoácidos, ou substanci- almente semelhante, que o polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de referência.
[00106] Assim como aplicado aos polipeptídeos, o termo "similari- dade substancial" ou "substancialmente semelhante" significa que du- as sequências de peptídeos, quando perfeitamente alinhadas, como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de lacuna predefini- dos, compartilham pelo menos 95% de identidade de sequência, ainda mais preferencialmente pelo menos 98% ou 99% de identidade de se- quência. De preferência, posições de resíduos que não sejam idênti- cas diferem por substituições conservativas de aminoácidos. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é aquela em que um resí- duo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido ten- do uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas semelhan- tes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substitui-
ção de aminoácido conservativa não irá alterar substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Nos casos em que duas ou mais sequências de aminoácidos diferem umas das outras em substi- tuições conservativas, a identidade ou grau de semelhança percentual da sequência pode ser ajustado para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição. Os meios para fazer este ajuste são bem conhecidos para aqueles versados na técnica. Consulte, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Exemplos de grupos de aminoácidos que possuem cadeias laterais com propriedades quí- micas semelhantes incluem (1) cadeias laterais alifáticas: glicina, ala- nina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadeias laterais hidroxila alifáti- cas: serina e treonina; (3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; (4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e trip- tofano; (5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; (6) ca- deias laterais ácidas: aspartato e glutamato, e (7) as cadeias laterais contendo enxofre são cisteína e metionina. Os grupos de substituição de aminoácidos conservativos preferidos são: valina-leucina- isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutama- to-aspartato e asparagina-glutamina. Alternativamente, uma substitui- ção conservativa é qualquer alteração que tenha um valor positivo na matriz de log-verossimilhança PAM250 descrita em Gonnet e outros, (1992) Science 256: 1443-1445. Uma substituição "moderadamente conservativa" é qualquer alteração que tenha um valor não negativo na matriz de log-verossimilhança PAM250.
[00107] A similaridade de sequência para polipeptídeos, também referida como identidade de sequência, é normalmente medida utili- zando software de análise de sequência. O software de análise de pro- teínas combina sequências semelhantes utilizando medidas de seme- lhança atribuídas a várias substituições, eliminações e outras modifi- cações, incluindo substituições conservativas de aminoácidos. Por exemplo, o software GCG contém programas como GAP e BESTFIT que podem ser utilizados com parâmetros predefinidos para determi- nar a homologia da sequência ou a identidade da sequência entre po- lipeptídeos estreitamente relacionados, como polipeptídeos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína de tipo selvagem e um mutante. Vide, por exemplo, GCG versão 6.1. As se- quências de polipeptídeos também podem ser comparadas usando FASTA, que usa parâmetros pré-definidos ou recomendados, um pro- grama em GCG versão 6.1. O FASTA (por exemplo, FASTA2 e FAS- TA3) fornece alinhamentos e identidade de sequência percentual das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de consulta e pesquisa (Pearson (2000) supra). Outro algoritmo preferido ao compa- rar uma sequência da invenção com uma base de dados contendo um grande número de sequências de organismos diferentes é o programa de computador BLAST, especialmente BLSTP ou TBLASN, que usa parâmetros predefinidos. Consulte, por exemplo, Altschul e outros, (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 e Altschul e outros, (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.
[00108] Quando em referência aos compostos aqui providos, os termos a seguir têm os seguintes significados, salvo indicação em con- trário. Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científi- cos aqui utilizados têm o mesmo significado comumente entendido por aquele que é versado na técnica. Caso exista uma pluralidade de defi- nições para um termo aqui fornecido, as presentes Definições prevale- cem, salvo indicação em contrário.
[00109] Os termos "um", "uma", "uns", "umas", conforme usados no presente documento, significam um ou mais, a menos que o contexto determine claramente o contrário.
[00110] Conforme aqui utilizado, "alquila" refere-se a uma porção de radical hidrocarboneto monovalente e saturado. A alquila é opcio-
nalmente substituída e pode ser linear, ramificado ou cíclica, ou seja, cicloalquila. A alquila inclui, mas não se limita a, aqueles radicais com 1-20 átomos de carbono, isto é, C1-20 alquila; 1-12 átomos de carbono, isto é, C1-12 alquila; 1-8 átomos de carbono, isto é, C1-8 alquila; 1-6 átomos de carbono, isto é, C1-6 alquila, e 1-3 átomos de carbono, isto é, C1-3 alquila. Exemplos de porções alquila incluem, mas não se limi- tam a, metila, etila, n-propila, i-propila, n-butila, s-butila, t-butila, i- butila, uma porção pentila, uma porção hexila, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila e cicloexila. Uma porção pentila inclui, mas não se limita a, n-pentila e i-pentila. Uma porção hexila inclui, mas não se limita a, n- hexila.
[00111] Como usado aqui, "alquileno" se refere a um grupo alquila divalente. Salvo especificação em contrário, o alquileno inclui, mas não se limita a, 1-20 átomos de carbono. O grupo alquileno é opcionalmen- te substituído como aqui descrito para alquila. Em algumas modalida- des, o alquileno não é substituído. Em algumas modalidades, o alqui- leno é um grupo alquila ramificado divalente.
[00112] O termo "amino" significa - NH2.
[00113] O termo "alquilamino", conforme aqui utilizado, e a menos que especificado de outra forma, refere-se ao grupo - NHR', em que R' é C1-10alquila, conforme definido no presente documento. Em algumas ou em quaisquer modalidades, o alquilamino é C1-6alquilamino.
[00114] O termo "dialquilamino", conforme aqui utilizado, e a menos que especificado de outra forma, refere-se ao grupo -NR'R', em que cada R' é independentemente C1-10 alquila, conforme aqui definido. Em algumas ou em quaisquer modalidades, o dialquilamino é di-C1-6 alqui- lamino.
[00115] O termo "aminoalquila", conforme aqui utilizado, e a menos que especificado de outra forma, refere-se a um grupo alquila, confor- me definido no presente documento, que é substituído por um ou mais grupos amino. Em algumas ou em quaisquer modalidades, o aminoal- quila é um grupo alquila substituído por um grupo -NH2 (por exemplo, - R'(NH2), onde R' é -C1-10 alquil, conforme definido aqui). Em algumas ou quaisquer modalidades, o aminoalquila é um grupo alquila substitu- ído por dois grupos -NH2. Em algumas modalidades, o "aminoalquila" é aminoC1-6alquila.
[00116] Um "alquilaminoalquila", como aqui usado, e a menos que especificado de outra forma, refere-se a um grupo alquila, como aqui definido, que é substituído por um ou mais grupos alquilaminos, como definido no presente documento. Em algumas modalidades, um "alqui- laminoalquila" é C1-6alquilaminoC1-6alquila. Em algumas modalidades, cada alquila em alquilaminoalquila é selecionado de forma indepen- dente.
[00117] Um "dialquilaminoalquila", como aqui usado, e a menos que especificado de outra forma, refere-se a um grupo alquila, como aqui definido, que é substituído por um ou mais grupos dialquilaminos, co- mo definido no presente documento. Em algumas modalidades, o "di- alquilaminoalquila" é o di-C1-6alquilaminoC1-6alquila. Em algumas mo- dalidades, cada alquila em dialquilaminoalquila é selecionado de forma independente.
[00118] Conforme aqui utilizado, o termo "O-aminoácido" ou "HO- amino ácido" designa um aminoácido em que o grupo amino nativo no terminal N de um aminoácido ou uma sequência de aminoácidos foi substituído por um grupo oxigênio ou hidroxila, respectivamente. Por exemplo, "O-AAAA" ou "HO-AAAA" tem o objetivo de designar uma sequência de aminoácidos (AAAA) na qual o grupo amino nativo no terminal N foi substituído por um grupo oxigênio ou hidroxila, respecti- vamente (por exemplo, , onde cada R é uma cadeia lateral de aminoácidos). Da mesma forma, os termos "re-
síduo de O-aminoácido" e "resíduo de HO-aminoácido" referem-se à porção química dentro de um composto que permanece após uma re- ação química. Por exemplo, "resíduo de O-aminoácido" ou "resíduo de HO-aminoácido" refere-se ao produto de um acoplamento de amida ou acoplamento de peptídeo de um O-aminoácido ou um HO-aminoácido a um parceiro de acoplamento adequado; em que, por exemplo, uma molécula de água é expelida após o acoplamento de amida ou peptí- deo do O-aminoácido ou um HO-aminoácido, resultando no produto tendo o resíduo de O-aminoácido ou um resíduo de HO-aminoácido a ele incorporado.
[00119] A designação de um aminoácido ou resíduo de aminoáci- dos sem especificação de sua estereoquímica destina-se a abranger a forma L do aminoácido, a forma D do aminoácido ou uma mistura ra- cêmica do mesmo.
[00120] Conforme aqui utilizado, "haloalquila" refere-se a alquila, conforme definido acima, em que o alquila inclui pelo menos um subs- tituinte selecionado a partir de um halogênio, por exemplo, flúor (F), cloro (Cl), bromo (Br) ou iodo (I). Exemplos de haloalquila incluem, mas não se limitam a -CF3, -CH2CF3, -CCl2F e -CCl3.
[00121] Tal como aqui utilizado, "alquenila" refere-se a uma porção de radical hidrocarboneto monovalente contendo pelo menos dois átomos de carbono e uma ou mais duplas ligações não aromáticas carbono-carbono. O alquenila é opcionalmente substituído e pode ser linear, ramificado ou cíclico. O alquenila inclui, mas não se limita a, os radicais tendo 2-20 átomos de carbono, isto é, C2-20 alquenila; 2-12 átomos de carbono, isto é, C2-12 alquenila; 2-8 átomos de carbono, isto é, C2-8 alquenila; 2-6 átomos de carbono, isto é, C2-6 alquenila; e 2-4 átomos de carbono, isto é, C2-4 alquenila. Exemplos de porções alque- nila incluem, mas não se limitam a, vinila, propenila, butenila e cicloe- xenila.
[00122] Conforme aqui utilizado, "alquinila" refere-se a uma porção de radical hidrocarboneto monovalente contendo pelo menos dois átomos de carbono e uma ou mais triplas ligações carbono-carbono. O alquinila é opcionalmente substituído e pode ser linear, ramificado ou cíclico. O alquinila inclui, mas não se limita a, aqueles radicais tendo 2- 20 átomos de carbono, isto é, C2-20 alquinila, 2-12 átomos de carbono, isto é, C2-12 alquinila; 2-8 átomos de carbono, isto é, C2-8 alquinila; 2-6 átomos de carbono, isto é, C2-6 alquinila; e 2-4 átomos de carbono, isto é, C2-4 alquinila. Exemplos de porções alquinila incluem, mas não se limitam a, etinila, propinila e butinila.
[00123] Como usado aqui, "alcóxi" refere-se a uma porção de radi- cal hidrocarboneto monovalente e saturado, em que o hidrocarboneto inclui uma única ligação a um átomo de oxigênio e em que o radical está localizado no átomo de oxigênio, por exemplo, CH3CH2-O· para etóxi. Os substituintes alcóxi ligam-se ao composto que substituem através deste átomo de oxigênio do substituinte alcóxi. O alcóxi é op- cionalmente substituído e pode ser linear, ramificado ou cíclico, ou se- ja, cicloalcóxi. O alcóxi inclui, mas não se limita a, aqueles tendo 1-20 átomos de carbono, isto é, C1-20 alcóxi; 1-12 átomos de carbono, isto é, C1-12 alcóxi; 1-8 átomos de carbono, isto é, C1-8 alcóxi; 1-6 átomos de carbono, isto é, C1-6 alcóxi e 1-3 átomos de carbono, isto é, C1-3 alcóxi. Exemplos de porções alcóxi incluem, mas não se limitam a, metóxi, etóxi, n-propóxi, i-propóxi, n-butóxi, s-butóxi, t-butóxi, i-butóxi, uma porção pentóxi, uma porção hexóxi, ciclopropóxi, ciclobutóxi, ciclopen- tóxi e cicloexóxi.
[00124] Como usado aqui, "haloalcóxi" refere-se ao alcóxi, como definido acima, em que o alcóxi inclui pelo menos um substituinte se- lecionado a partir de um halogênio, por exemplo, F, Cl, BR ou I.
[00125] Como usado aqui, "arila" se refere a uma porção monova- lente que é um radical de um composto aromático, em que os átomos do anel são átomos de carbono. A arila é opcionalmente substituída e pode ser monocíclica ou policíclica, por exemplo, bicíclica ou tricíclica. Exemplos de porções arila incluem, mas não se limitam a, aquelas tendo 6 a 20 átomos de carbono no anel, isto é, C6-20 arila; 6 a 15 áto- mos de carbono no anel, isto é, C6-15 arila e 6 a 10 átomos de carbono no anel, isto é, C6-10 arila. Exemplos de porções arila incluem, mas não se limitam a fenila, naftila, fluorenila, azulenila, antrila, fenantrila e pi- renila.
[00126] Como aqui usado, "arilalquila" refere-se a uma porção mo- novalente que é um radical de um composto alquila, em que o com- posto alquila é substituído com um substituinte aromático, ou seja, o composto aromático inclui uma única ligação a um grupo alquila, e em que o radical está localizado no grupo alquila. Um grupo arilalquila li- ga-se à estrutura química ilustrada através do grupo alquila. Um arilal- quila pode ser representado pela estrutura, por exemplo, , em que B é uma porção aromática, por exemplo, fenila. A arilalquila é opcional- mente substituída, ou seja, o grupo arila e/ou o grupo alquila pode ser substituído, conforme aqui se encontra indicado. Exemplos de arilal- quila incluem, mas não se limitam a, benzila.
[00127] Como usado aqui, "alquilarila" refere-se a uma porção mo- novalente que é um radical de um composto arila, em que o composto arila é substituído com um substituinte alquila, ou seja, o composto ari- la inclui uma única ligação a um grupo alquila, e em que o radical está localizado no grupo arila. Um grupo alquilarila liga-se à estrutura quí- mica ilustrada através do grupo arila. Um alquilarila pode ser represen- tado pela estrutura, por exemplo, ,
em que B é uma porção aromática, por exemplo, fenila. A alquilarila é opcionalmente substituída, ou seja, o grupo arila e/ou o grupo alquila pode ser substituído, conforme aqui se encontra indicado. Exemplos de alquilarila incluem, mas não se limitam a, toluíla.
[00128] Tal como aqui utilizado, "arilóxi" refere-se a uma porção monovalente que é um radical de um composto aromático em que os átomos do anel são átomos de carbono, e em que o anel é substituído por um radical oxigênio, ou seja, o composto aromático inclui uma úni- ca ligação a um átomo de oxigênio, e em que o radical está localizado no átomo de oxigênio, por exemplo, , para fenóxi. Os substi- tuintes arilóxi se ligam ao composto que substituem através deste átomo de oxigênio. O arilóxi é opcionalmente substituído. O arilóxi in- clui, mas não se limita a, aqueles radicais tendo de 6 a 20 átomos de carbono no anel, isto é, C6-20 arilóxi; 6 a 15 átomos de carbono no anel, isto é, C6-15 arilóxi, e 6 a 10 átomos de carbono do anel, isto é, C6-10 arilóxi. Exemplos de porções arilóxi incluem, mas não se limitam a, fe- nóxi, naftóxi e antróxi.
[00129] Conforme aqui utilizado, "RaRbN-arilóxi" refere-se a uma porção monovalente que é um radical de um composto aromático, em que os átomos do anel são átomos de carbono, e em que o anel é substituído por pelo menos um substituinte RaRbN e pelo menos um radical oxigênio, ou seja, o composto aromático inclui uma única liga- ção a um substituinte RaRbN e uma única ligação a um átomo de oxi- gênio, e em que o radical está localizado no átomo de oxigênio, por exemplo, . Os substituintes RaRbN-arilóxi se ligam ao com- posto que substituem através deste átomo de oxigênio. RaRbN-arilóxi é opcionalmente substituído. RaRbN-arilóxi inclui, mas não se limita a,
aqueles tendo de 6 a 20 átomos de carbono no anel, por exemplo, C6- 20 (RaRbN)n-arilóxi, de 6 a 15 átomos de carbono no anel, por exemplo, C6-15 (RaRbN)n-arilóxi, e de 6 a 10 átomos de carbono no anel, por exemplo, C6-10 (RaRbN)n-arilóxi, em que n representa o número de substituintes RaRbN. Um exemplo de uma porção RaRbN-arilóxi inclui, mas não se limita a, 4-(dimetilamino)-fenóxi, .
[00130] Conforme aqui utilizado, "arileno" se refere a uma porção divalente de um composto aromático em que os átomos do anel são átomos de carbono apenas. O arileno é opcionalmente substituído e pode ser monocíclico ou policíclico, por exemplo, bicíclico ou tricíclico. Exemplos de porções arileno incluem, mas não se limitam a, aquelas tendo de 6 a 20 átomos de carbono no anel, isto é, C6-20 arileno; 6 a 15 átomos de carbono mo anel, isto é, C6-15 arileno, e 6 a 10 átomos de carbono no anel, isto é, C6-10 arileno.
[00131] Conforme aqui utilizado, "heteroalquila" refere-se a um al- quila no qual um ou mais átomos de carbono são substituídos por he- teroátomos. Conforme aqui utilizado, "heteroalquenila" refere-se a um alquenila no qual um ou mais átomos de carbono são substituídos por heteroátomos. Conforme aqui utilizado, "heteroalquinila" refere-se a um alquinila no qual um ou mais átomos de carbono são substituídos por heteroátomos. Heteroátomos adequados incluem, mas não se limi- tam a, átomos de nitrogênio, oxigênio e enxofre. O heteroalquila é op- cionalmente substituído. Exemplos de porções heteroalquila incluem, mas não se limitam a, aminoalquila, sulfonilalquila e sulfinilalquila. Exemplos de porções heteroalquila também incluem, mas não se limi- tam a, metilamino, metilsulfonila e metilsulfinila.
[00132] Conforme aqui utilizado, "heteroarila" refere-se a uma por- ção monovalente que é um radical de um composto aromático, em que os átomos do anel contêm átomos de carbono e pelo menos um átomo de oxigênio, enxofre, nitrogênio ou fósforo. Exemplos de porções hete- roarila incluem, mas não se limitam a, aquelas tendo de 5 a 20 átomos de anel; 5 a 15 átomos de anel e 5 a 10 átomos de anel. O heteroarila é opcionalmente substituído.
[00133] Tal como aqui utilizado, "heteroarileno" refere-se a um ari- leno no qual um ou mais átomos de anel do anel aromático são substi- tuídos por um átomo de oxigênio, enxofre, nitrogênio ou fósforo. O he- teroarileno é opcionalmente substituído.
[00134] Como aqui utilizado, "heterocicloalquila" refere-se a um ci- cloalquila no qual um ou mais átomos de carbono são substituídos por heteroátomos. Heteroátomos adequados incluem, mas não se limitam a, átomos de nitrogênio, oxigênio e enxofre. O heterocicloalquila é op- cionalmente substituído. Exemplos de porções heterocicloalquila inclu- em, mas não se limitam a, morfolinila, piperidinila, tetraidropiranila, pir- rolidinila, imidazolidinila, oxazolidinila, tiazolidinila, dioxolanila, ditiolani- la, oxanila ou tianila.
[00135] Conforme aqui utilizado, "heterocicloalquila contendo N" refere-se a um cicloalquila no qual um ou mais átomos de carbono são substituídos por heteroátomos, e em que pelo menos um heteroátomo é um átomo de nitrogênio. Heteroátomos adequados, além do nitrogê- nio, incluem, mas não se limitam a, átomos de oxigênio e enxofre. O heterocicloalquila contendo N é opcionalmente substituído. Exemplos de porções heterocicloalquila contendo N incluem, mas não se limitam a, morfolinila, piperidinila, pirrolidinila, imidazolidinila, oxazolidinila ou tiazolidinila.
[00136] Conforme aqui utilizado, "opcionalmente substituído", quando usado para descrever uma porção de radical, por exemplo, alquila opcionalmente substituído, arila opcionalmente substituído, he- teroarila opcionalmente substituído, arileno opcionalmente substituído e heteroarileno opcionalmente substituído, significa que essa porção é opcionalmente ligada a um ou mais substituintes. Exemplos desses substituintes incluem, mas não se limitam a, halo, ciano, nitro, haloal- quila opcionalmente substituído, azido, epóxi, heteroarila opcionalmen- te substituído, heterocicloalquila opcionalmente substituído, , , , , , , , , , , , , ou , em que RA, RB e RC são, independentemente em cada caso, um átomo de hidrogênio, alquila, alquenila, alquinila, arila, alquilarila, ari- lalquila, heteroalquila, heteroarila ou heterocicloalquila, ou RA e RB, juntamente com os átomos aos quais estão ligados, formam um anel carbocíclico saturado ou insaturado, em que o anel é opcionalmente substituído, e em que um ou mais átomos do anel são opcionalmente substituídos por um heteroátomo. Em certas modalidades, quando uma porção de radical é opcionalmente substituída por um heteroarila opcionalmente substituído, heterocicloalquila opcionalmente substituí- do ou anel carbocíclico saturado ou insaturado opcionalmente substitu- ído, os substituintes no heteroarila opcionalmente substituído, hetero- cicloalquila opcionalmente substituído ou anel carbocíclico saturado ou insaturado opcionalmente substituído, se forem substituídos, eles não são substituídos por substituintes que são ainda opcionalmente substi- tuídos por substituintes adicionais. Em algumas modalidades, quando um grupo aqui descrito é opcionalmente substituído, o substituinte li- gado ao grupo é não substituído, a menos que especificado de outra forma.
[00137] Tal como aqui utilizado, "O-glicose" refere-se a uma porção monovalente ligada através de um átomo de oxigênio da glicose exo- cíclica. Porções O-glicose adequadas incluem, sem limitação,
e semelhantes.
[00138] Conforme aqui utilizado, "o-PEGn" refere-se a uma porção monovalente ligada através do átomo de oxigênio terminal, onde n é de 1 a 100. Por exemplo, quando n é 1, então O-PEGn é -O- CH2CH2OH; quando n é dois, então O-PEGn é -O-CH2CH2O- CH2CH2OH; e quando n é três, então O-PEGn é -O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2OH.
[00139] Conforme aqui utilizado, o "agente de ligação" refere-se a qualquer molécula, por exemplo, proteína ou anticorpo, capaz de se ligar com especificidade a um determinado parceiro de ligação, por exemplo, antígeno.
[00140] Conforme aqui utilizado, "ligador" refere-se a uma porção divalente, trivalente ou polivalente que liga covalentemente o agente de ligação a um ou mais compostos aqui descritos, por exemplo, com- postos de carga útil e/ou um grupo hidrofílico, conforme descrito no presente documento.
[00141] Conforme aqui usado, um "grupo conector" ou um "resíduo de grupo conector" refere-se a qualquer grupo que possa facilitar a li- beração de uma carga útil. Grupos conectores adequados facilitam a liberação de cargas úteis conjugadas divalentes ou multivalentes de volta às formas originais não conjugadas, com pouca ou nenhuma de- rivatização. Exemplos de grupos conectores incluem e não se limitam a , ou seus derivados. Em outro exemplo, um grupo conector é .
[00142] Em outros exemplos, um grupo conector é um grupo autoi- molativo. Um "grupo autoimolativo" refere-se a qualquer grupo desse tipo conhecido por aqueles versados na técnica. Em modalidades par- ticulares, o grupo autoimolativo é p-aminobenziloxicarbonila (PAB/PABC), ou seja, . Aqueles versados na técnica reconhecerão que um grupo autoimolativo é capaz de realizar uma reação química que libere os átomos restantes de um ligador de uma carga útil.
[00143] Conforme aqui utilizado. "Ligador de conexão" (L2) ou "liga- dores de conexão" refere-se a grupos divalentes que são cliváveis ou não cliváveis. Os ligadores cliváveis são ligadores que são clivados pelo metabolismo intracelular após a internalização, por exemplo, a clivagem via hidrólise, redução ou reação enzimática. Os ligadores não cliváveis são ligadores que liberam uma carga útil ligada via degrada- ção lisossômica do anticorpo após a internalização. Ligadores de co- nexão adequados incluem, mas não se limitam a, ligadores ácido- lábeis, ligadores hidrólise-lábeis, ligadores enzimaticamente cliváveis, ligadores lábeis em redução e ligadores não cliváveis. Ligadores ade- quados também incluem, mas não se limitam a, aqueles que são ou compreendem glicuronídeos, succinimida-tioéteres, unidades de polie- tilenoglicol (PEG), hidrazonas, unidades mal-caproíla, unidades dissul- fetos (por exemplo, -S-S-, -S-C(R1bR2b)-, em que R1b e R2b são, inde- pendentemente, hidrogênio ou hidrocarbila), unidades carbamato, uni- dades para-amino-benzila (PAB), unidades fosfato, por exemplo, uni- dades mono-, bi- ou trifosfato e unidades de peptídeo, por exemplo, unidades de peptídeo contendo dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais resíduos de aminoácidos, incluindo, mas não se limitando a, unidades de resíduos valina-citrulina. Tal como aqui utilizado, o grupo "caproíla" significa um grupo -(CH2)5-C(O)-.
[00144] Tal como se utiliza, a expressão "grupo reativo" ("RG") refe-
re-se a um grupo funcional ou uma porção que reage com uma porção reativa de um anticorpo, anticorpo modificado ou seu fragmento de li- gação a antígeno.
Em certas modalidades, o "grupo reativo" é um gru- po funcional ou uma porção (por exemplo, maleimida ou éster NHS) que reage com um resíduo cisteína ou lisina de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno.
Em algumas modalidades, o "grupo reativo" é um grupo funcional ou uma porção capaz de sofrer uma rea- ção química de clique.
Em algumas modalidades da referida reação química de clique, o grupo reativo compreende um alquileno que é ca- paz de sofrer uma reação de 1,3 cicloadição com uma azida.
Esses grupos reativos adequados incluem, entre outros, alcinos tensos, por exemplo, aqueles adequados para cicloadições de alcino-azida pro- movidas por cepa (SPAAC), cicloalcinos, por exemplo, ciclo-octinas, alcinos benzanulados e alcinos capazes de sofrer reações de 1,3 ci- cloadição com azidas na ausência de catalisadores de cobre.
Alcinos adequados também incluem, mas não se limitam a, DIBAC (onde a porção -C(O)CH2CH2C(O)- da porção DIBAC pode ser representada por L e/ou L2), DIBO (onde a porção -O- da porção DIBO pode ser re- presentada por L e/ou L2), BARAC (onde a porção da porção BARAC pode ser representada por L e/ou L2), DIFO (onde a porção -O- pode ser representada por L e/ou L2), alcinos substituídos, por exemplo, alcinos fluorados, azaciclo- alcinos, BCN e seus derivados.
Cargas úteis de ligador compreenden- do esses grupos reativos são úteis para a conjugação de anticorpos que foram funcionalizados com grupos azido.
Esses anticorpos funcio- nalizados incluem anticorpos funcionalizados com grupos azido- polietilenoglicol.
Em algumas modalidades, este anticorpo funcionali- zado é derivado por reação de um anticorpo composto por pelo menos um resíduo glutamina, por exemplo, Q295 de cadeia pesada (numera-
ção da UE), com um composto de acordo com a fórmula H2N-LL-N3, em que LL é um grupo polietilenoglicol divalente, na presença da en- zima transglutaminase.
[00145] Em algumas modalidades, o grupo reativo (RG) é um alci- no, por exemplo, , que pode reagir via a química de clique com uma azida, por exemplo, , para formar um produto quí- mico de clique, por exemplo, , o seu regioisômero ou mis- tura dos mesmos. Em algumas modalidades, o grupo reativo é um al- cino, por exemplo, ou (onde L e/ou L2 abrange -OCH2C(O)-), que pode reagir via a química de clique com uma azida, por exemplo, , para formar um produto químico de clique, por exemplo, . Em algumas modalidades, o grupo reativo é um alcino, por exemplo, , que pode reagir via química de clique com uma azida, por exemplo, , para formar um produto quí- mico de clique, por exemplo, , o seu regioisômero ou mistura dos mesmos. Em algumas modalidades, o grupo reativo é um grupo funcional, por exemplo, , que reage com um resíduo cisteína em um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, para formar uma ligação ao mesmo, por exemplo, , em que AB se refere a um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno e S se refere ao átomo S em um resíduo cisteína através do qual o grupo funcional se liga ao Ab. Em algumas modalidades, o grupo reativo é um grupo fun- cional, por exemplo, , que reage com um resíduo lisina em um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, para formar
O
N Ab uma ligação ao mesmo, por exemplo, , em que Ab se refere a um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno e N se refere ao átomo de N em, por exemplo, um resíduo lisina ou um resíduo do terminal amino, através do qual o grupo funcional se liga ao Ab. Em alguns casos, um grupo reativo é , que reage com dois tióis (por exemplo, tióis em duas cadeias diferentes) de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, para formar uma ligação ao mesmo, por exemplo, . Em alguns casos, um grupo reativo é , que reage com dois tióis (por exemplo, tióis em duas cadeias diferentes) de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, para formar uma ligação ao mesmo, por exemplo,
.
[00146] Conforme aqui utilizado, a expressão "resíduo de grupo reativo" refere-se a um produto da reação de um grupo funcional na porção de ligador com a parte reativa de um agente de ligação (BA), incluindo o produto da química de clique. O resíduo do grupo reativo é formado pela reação de um grupo reativo em um aminoácido do agen- te de ligação e é ligado ao agente de ligação (por exemplo, anticorpo) e ao ligador. Em algumas modalidades, o resíduo do grupo reativo é um grupo que compreende 1,2,3-tetrazol, ou seja, é formado pela rea- ção de um alcino com uma azida. Em algumas modalidades, o resíduo do grupo reativo é (a), em que S se refere ao átomo de S em um resíduo de cisteína, através do qual (a) se liga ao Ab, e que é formado pela reação de com um resíduo cisteína em um anti- corpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modali- dades, o resíduo do grupo reativo é , em que N se refere ao átomo de N em um resíduo lisina, e que é formado pela reação de um grupo funcional, por exemplo, , com um resíduo lisina em um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno. Aqueles com conhecimento na técnica reconhecem que partes do resíduo do grupo reativo podem se originar do grupo reativo, do anticorpo ou de ambos.
Em alguns casos, o resíduo do grupo reativo é , em que S se refere ao átomo de S em um resíduo cisteína, e que é formado pela reação de um grupo funcional ou com um resí- duo cisteína em um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno.
[00147] Como usado aqui, "sal farmaceuticamente aceitável" refere- se a qualquer sal adequado para administração a um paciente. Sais adequados incluem, mas não são limitados a, aqueles divulgados em Berge e outros, "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci., 1977, 66:1, aqui incorporado por referência. Exemplos de sais incluem, entre ou- tros, sais derivados de ácido, derivados de base, orgânicos, inorgâni- cos, de amina, de metais alcalinos ou alcalino-terrosos, incluindo, en- tre outros, sais de cálcio, sais de magnésio, sais de potássio, sais de sódio, sais de ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malônico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido eta- nossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido salicílico e similares. Em alguns exemplos, uma carga útil aqui descrita (por exemplo, um aná- logo de rifamicina aqui descrito) compreende uma amina terciária, em que o átomo de nitrogênio na amina terciária é o átomo através do qual a carga útil é ligada a um ligador ou a um ligador-espaçador. Nesses casos, a ligação à amina terciária da carga útil produz uma amina quaternária na molécula de ligador-carga útil. A carga útil positi- va sobre a amina quaternária pode ser equilibrada por um contraíon (por exemplo, cloro, bromo, iodo ou qualquer outra porção adequada- mente carregada, como as descritas acima).
[00148] Alguns grupos, porções, substituintes e átomos são repre- sentados por uma linha ondulada. A linha ondulada pode interceptar ou revestir uma ligação ou ligações. A linha ondulada indica o átomo através do qual os grupos, porções, substituintes ou átomos estão li- gados. Por exemplo, um grupo fenila que é substituído por um grupo propila representado como: ou tem a seguinte estrutura: .
[00149] Conforme aqui utilizado, "condições de síntese de amida" refere-se a condições de reação adequadas para realizar a formação de uma amida, por exemplo, pela reação de um ácido carboxílico, áci- do carboxílico ativado ou haleto de acila com uma amina. Em alguns exemplos, as condições de síntese de amida referem-se a condições de reação adequadas para a formação de uma ligação amida entre um ácido carboxílico e uma amina. Em alguns destes exemplos, o ácido carboxílico é convertido primeiramente em um ácido carboxílico ativa- do antes que o ácido carboxílico ativado reaja com uma amina para formar uma amida. As condições adequadas para realizar a formação de uma amida incluem, mas não se limitam a, aquelas que utilizam reagentes para realizar a reação entre um ácido carboxílico e uma amina, incluindo, mas não se limitando a, dicicloexilcarbodi-imida (DCC), di-isopropilcarbodi-imida (DIC), hexafluorfosfato de (benzo- triazol-1-iloxi)tris(dimetilamino)fosfônio (BOP), hexafluorfosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tripirrolidinofosfônio (PyBOP), hexafluorfosfato de (7-azabenzotriazol-1-iloxi)tripirrolidinofosfônio (PyAOP), hexafluorfosfa- to de bromotripirrolidinofosfônio (PyBrOP), hexafluorfosfato de O- (benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametilurônio (HBTU), tetrafluorborato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametilurônio (TBTU), 3-óxido he-
xafluorfosfato de 1-Bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazol[4,5- b]piridínio (HATU), N-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-di-idroquinolina (EEDQ), N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida (EDC), hexafluorfosfato de 2-cloro-1,3-dimetilimidazolidínio (CIP), 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5- triazina (CDMT) e carbonildi-imidazol (CDI). Em alguns exemplos, um ácido carboxílico é convertido primeiramente em um éster carboxílico ativado antes de tratar o éster carboxílico ativado com uma amina para formar uma ligação amida. Em certas modalidades, o ácido carboxílico é tratado com um reagente. O reagente ativa o ácido carboxílico des- protonando o ácido carboxílico e, em seguida, formando um complexo de produtos com o ácido carboxílico desprotonado como resultado do ataque nucleofílico pelo ácido carboxílico desprotonado sobre o rea- gente protonado. Os ésteres carboxílicos ativados para determinados ácidos carboxílicos são posteriormente mais susceptíveis a ataques nucleofílicos por uma amina do que o ácido carboxílico é antes de ser ativado. Isto resulta em formação de ligação amida. Dessa forma, o ácido carboxílico é descrito como ativado. Os reagentes exemplares incluem DCC e DIC.
[00150] "Aminoácido" ou "resíduo de aminoácido" refere-se, em al- gumas modalidades, a aminoácidos de ocorrência natural. Em outras modalidades, um aminoácido ou resíduo de aminoácido pode ser um aminoácido de ocorrência natural e/ou um aminoácido não natural (por exemplo, β-aminoácidos (β3e β2), homo-aminoácidos, derivados de prolina e ácido pirúvico, derivados de alanina 3-substituídos, derivados de glicina, derivados de tirosina e fenilalanina substituídos no anel, aminoácidos de núcleo linear e/ou aminoácidos N-metila ou qualquer outro aminoácido não natural comercialmente disponível (por exemplo, aminoácidos não naturais disponíveis por Sigma-Aldrich). Em outras modalidades, um resíduo de aminoácido pode ser um resíduo que te- nha uma cadeia lateral envolvida em uma reação mediada por uma transglutaminase, por exemplo, uma reação mediada por transgluta- minase de uma cadeia lateral de aminoácidos com uma amina primá- ria. Por exemplo, uma reação de uma cadeia lateral de asparagina e/ou glutamina com uma amina primária é utilizada para a preparação de alguns ADCs descritos no presente documento. Em algumas moda- lidades, este anticorpo funcionalizado é derivado por reação de um anticorpo composto por pelo menos um resíduo glutamina , por exem- plo, Q295 de cadeia pesada (numeração da UE), com um composto de acordo com a fórmula H2N-LL-N3, em que LL é um grupo polietile- noglicol divalente, na presença da enzima transglutaminase.
[00151] Tal como aqui utilizado, "taurina" refere-se ao reagente ou ao grupo , em que indica o átomo através do qual a taurina é ligada aos grupos adjacentes na fórmula.
[00152] Conforme aqui utilizado, "forma estereoisomérica" ou "este- reoisômero" refere-se à orientação espacial relativa de diferentes gru- pos em um composto. As formas estereoisoméricas incluem enantiô- meros, diastereômeros e/ou misturas desses.
[00153] Conforme aqui utilizado, "regioisômero", "regioisômeros" ou "mistura de regioisômeros" refere-se ao(s) produto(s) de 1,3- cicloadições ou cicloadições de alcino-azida promovidas por cepa (SPAACs) - também conhecidas como reações click - que derivam de azidas adequadas (por exemplo, -N3 ou anticorpos derivatizados de PEG-N3 ) tratados com alcinos adequados. Em algumas modalidades, por exemplo, os regioisômeros e as misturas de regioisômeros são caracterizados pelos produtos da reação de clique mostrados abaixo:
[00154] A título de exemplo apenas, são apresentados abaixo os regioisômeros do composto A1', ou seja, A2', A3', A4', em que cada é uma ligação ao agente de ligação; e cada é uma ligação à carga útil: composto A1' composto A2'; composto A3'; composto A4'. Anticorpos anti-MSR1 Compreendendo Variantes de Fc
[00155] De acordo com certas modalidades, são providos anticor- pos anti-MSR1 com um domínio Fc composto por uma ou mais muta- ções que melhoram ou diminuem a ligação do anticorpo ao receptor
FcRn, por exemplo, a pH ácido em comparação ao pH neutro. Por exemplo, São providos aqui anticorpos anti-MSR1 que compreendem uma mutação na região CH2 ou CH3 do domínio Fc, em que a(s) muta- ção(ões) aumenta(m) a afinidade do domínio Fc para FcRn em um ambiente ácido (por exemplo, em um endossoma, onde o pH varia de cerca de 5,5 a cerca de 6,0). Essas mutações podem resultar em um aumento da meia-vida sérica do anticorpo quando administrado a um animal. Exemplos não limitantes dessas modificações de Fc incluem, por exemplo, uma modificação na posição 250 (por exemplo, E ou Q); 250 e 428 (por exemplo, L ou F); 252 (por exemplo, L/Y/F/W ou T), 254 (por exemplo, S ou T) e 256 (por exemplo, S/R/Q/E/D ou T) ou uma modificação na posição 428 e/ou 433 (por exemplo, H/L/R/S/P/Q ou K) e/ou 434 (por exemplo , H/F ou Y); ou uma modificação na posi- ção 250 e/ou 428 ou uma modificação na posição 307 ou 308 (por exemplo, 308F, V308F) e 434. Em uma modalidade, a modificação compreende uma modificação 428L (por exemplo, M428L) e uma 434S (por exemplo, N434S); uma modificação 428L, 259I (por exem- plo, V259I) e 308F (por exemplo, V308F); uma modificação 433K (por exemplo, H433K) e uma 434 (por exemplo, 434Y); uma modificação 252, 254 e 256 (por exemplo, 252Y, 254T e 256E); uma modificação 250Q e 428L (por exemplo, T250Q e M428L) e uma modificação 307 e/ou 308 (por exemplo, 308F ou 308P).
[00156] Por exemplo, as modalidades incluem anticorpos anti- MSR1 compreendendo um domínio FC composto por um ou mais pa- res ou grupos de mutações selecionados do grupo constituído por: 250Q e 248L (por exemplo, T250Q e M248L); 252Y, 254T e 256E (por exemplo, M252Y, S254T e T256E); 428L e 434S (por exemplo, M428L e N434S), e 433K e 434F (por exemplo, H433K e N434F). Todas as combinações possíveis das mutações do domínio Fc acima referidas e outras mutações nos domínios variáveis de anticorpos aqui descritas são abrangidas pelo âmbito da presente invenção. Características Biológicas dos Anticorpos
[00157] As modalidades incluem anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno que ligam a MSR1 humana com alta afinidade. Por exem- plo, a presente invenção inclui anticorpos anti-MSR1 que ligam o do- mínio extracelular da MSR1 humana expresso com uma etiqueta no- na-histidina N-terminal (por exemplo, His9-hMSR1) com um KD inferior a cerca de 10 Nm, conforme medido por ressonância de plasmons de superfície a 25 ºC ou 37 ºC, por exemplo, utilizando um formato de en- saio conforme definido no Exemplo 3 no presente documento ou um ensaio substancialmente semelhante. De acordo com algumas moda- lidades, são providos anticorpos anti-MSR1 que ligam a MSR1 huma- na a 37 ºC com um KD inferior a cerca de 10 nM, inferior a cerca de 9 nM, inferior a cerca de 8 nM, inferior a cerca de 7 nM, inferior a cerca de 6 nM, inferior a cerca de 5 nM, inferior a cerca de 4 nM, inferior a cerca de 3 nM, inferior a cerca de 2 nM, inferior a cerca de 1 nM, infe- rior a cerca de 900 pM, inferior a cerca de 800 pM, inferior a cerca de 700 pM, inferior a cerca de 600 pM, inferior a cerca de 500 pM, inferior a cerca de 400 pM, inferior a cerca de 300 pM, inferior a cerca de 200 pM, inferior a cerca de 100 pM, inferior a cerca de 90 pM, inferior a cerca de 80 pM, inferior a cerca de 70 pM, inferior a cerca de 60 pM, inferior a cerca de 50 pM, inferior a cerca de 40 pM, inferior a cerca de 30 pM, inferior a cerca de 20 pM ou inferior a cerca de 10 pM, confor- me medido por ressonância de plasmons de superfície, por exemplo, utilizando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 3 aqui presente, ou um ensaio substancialmente semelhante. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-MSR1 aqui descritos ligam a MSR1 humana a 25 ºC com um KD inferior a cerca de 6 nM, inferior a cerca de 5 nM, inferior a cerca de 4 nM, inferior a cerca de 3 nM, inferior a cerca de 2 nM, inferior a cerca de 1 nM, inferior a cerca de 900 pM,
inferior a cerca de 800 pM, inferior a cerca de 700 pM, inferior a cerca de 600 pM, inferior a cerca de 500 pM, inferior a cerca de 400 pM, infe- rior a cerca de 300 pM, inferior a cerca de 200 pM, inferior a cerca de 100 pM, inferior a cerca de 90 pM, inferior a cerca de 80 pM, inferior a cerca de 70 pM, inferior a cerca de 60 pM, inferior a cerca de 50 pM, inferior a cerca de 40 pM, inferior a cerca de 30 pM ou inferior a cerca de 20 pM, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície, por exemplo, utilizando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 3, ou um ensaio substancialmente semelhante.
[00158] As modalidades também incluem anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno que ligam o MSR1 de macaco com alta afinida- de. Por exemplo, são aqui descritos anticorpos anti-MSR1 que ligam o domínio extracelular MSR1 do macaco expresso com uma etiqueta myc-myc-hexahistidina N-terminal (por exemplo, HMM-mfMSR1) com um KD inferior a cerca de 20 Nm, conforme medido por ressonância de plasmons de superfície a 25 ºC ou 37 ºC, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 3 ou um ensaio substancialmente semelhante. De acordo com certas modalidades, são providos anticorpos anti-MSR1 que ligam a MSR1 de macaco a 37 ºC com um KD inferior a cerca de 20 Nm, inferior a cerca de 18 pM, inferior a cerca de 15 nM, inferior a cerca de 12 nM, inferior a cerca de 10 nM, inferior a cerca de 9 nM, inferior a cerca de 8 nM, inferior a cer- ca de 7 nM, inferior a cerca de 6 nM, inferior a cerca de 5 nM, inferior a cerca de 4 nM, inferior a cerca de 3 nM, inferior a cerca de 2 nM, infe- rior a cerca de 1 nM, inferior a cerca de 900 pM, inferior a cerca de 800 pM, inferior a cerca de 700 pM, inferior a cerca de 600 pM, inferior a cerca de 500 pM, inferior a cerca de 400 pM, inferior a cerca de 300 pM, inferior a cerca de 200 pM, inferior a cerca de 100 pM, inferior a cerca de 90 pM, inferior a cerca de 80 pM, inferior a cerca de 70 pM, inferior a cerca de 60 pM, inferior a cerca de 50 pM, inferior a cerca de
40 pM, inferior a cerca de 30 pM, inferior a cerca de 20 pM ou inferior a cerca de 10 pM, conforme medido por ressonância plasmônica de su- perfície, por exemplo, utilizando um formato de ensaio conforme defi- nido no Exemplo 3 aqui, ou um ensaio substancialmente semelhante. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-MSR1 aqui descritos li- gam a MSR1 de macaco a 25 ºC com um KD inferior a cerca de 12 nM, inferior a cerca de 10 nM, inferior a cerca de 9 nM, inferior a cerca de 8 nM, inferior a cerca de 7 nM, inferior a cerca de 6 nM, inferior a cerca de 5 nM, inferior a cerca de 4 nM, inferior a cerca de 3 nM, inferior a cerca de 2 nM, inferior a cerca de 1 nM, inferior a cerca de 900 pM, inferior a cerca de 800 pM, inferior a cerca de 700 pM, inferior a cerca de 600 pM, inferior a cerca de 500 pM, inferior a cerca de 400 pM, infe- rior a cerca de 300 pM, inferior a cerca de 200 pM, inferior a cerca de 100 pM, inferior a cerca de 90 pM, inferior a cerca de 80 pM, inferior a cerca de 70 pM, inferior a cerca de 60 pM, inferior a cerca de 50 pM, inferior a cerca de 40 pM, inferior a cerca de 30 pM ou inferior a cerca de 20 pM, conforme medido por ressonância plasmônica de superfície, por exemplo, utilizando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 3 aqui presente, ou um ensaio substancialmente semelhante.
[00159] A presente invenção também inclui anticorpos e seus frag- mentos de ligação a antígeno que ligam o domínio extracelular da MSR1 humana expressa com um marcador de nona-histidina N- terminal (por exemplo, His9-hMSR1) com uma meia-vida dissociativa (t½) superior a cerca de 5 minutos, conforme medido por ressonância de plasmon de superfície a 25 ºC ou 37 ºC, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 3 aqui ou um ensaio substancialmente semelhante. De acordo com algumas modalidades, são providos anticorpos anti-MSR1 que ligam a MSR1 humana a 37 ºC com uma t½ superior a cerca de 4 minutos, superior a cerca de 5 mi- nutos, superior a cerca de 6 minutos, superior a cerca de 8 minutos,
superior a cerca de 10 minutos, superior a cerca de 12 minutos, supe- rior a cerca de 14 minutos, superior a cerca de 16 minutos, superior a cerca de 18 minutos, superior a cerca de 20 minutos, superior a cerca de 30 minutos, superior a cerca de 40 minutos, superior a cerca de 50 minutos, superior a cerca de 60 minutos, superior a cerca de 70 minu- tos, superior a cerca de 80 minutos, superior a cerca de 90 minutos, superior a cerca de 120 minutos, superior a cerca de 150 minutos, su- perior a cerca de 180 minutos, superior a cerca de 210 minutos, supe- rior a cerca de 240 minutos, ou mais, conforme medido por ressonân- cia de plasmon de superfície, por exemplo, utilizando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 3 aqui, ou um ensaio substanci- almente semelhante.
[00160] As modalidades também incluem anticorpos e seus frag- mentos de ligação a antígeno que podem ligar o domínio extracelular da MSR1 do macaco expresso com uma etiqueta myc-myc- hexaistidina N-terminal (por exemplo, HMM-mfMSR1) com alta afini- dade. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-MSR1 que ligam o HMM-mfMSR1 com um KD inferior a cerca de 20 Nm, con- forme medido por ressonância de plasmon de superfície a 25 ºC ou 37 ºC, por exemplo, utilizando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 3 aqui, ou um ensaio substancialmente semelhante. De acor- do com algumas modalidades, são providos anticorpos anti-MSR1 que ligam HMM-mfMSR1 a 37 ºC com um KD inferior a cerca de 20 Nm, inferior a cerca de 15 nM, inferior a cerca de 10 nM, inferior a cerca de 9 nM, inferior a cerca de 8 nM, inferior a cerca de 7 nM, inferior a cerca de 6 nM, inferior a cerca de 5 nM, inferior a cerca de 4 nM, inferior a cerca de 3 nM, inferior a cerca de 2 nM, inferior a cerca de 1 nM, infe- rior a cerca de 900 pM, inferior a cerca de 800 pM, inferior a cerca de 800 pM, inferior a cerca de 700 pM, inferior a cerca de 600 pM, inferior a cerca de 500 pM, inferior a cerca de 400 pM, inferior a cerca de 300 pM, inferior a cerca de 200 pM, inferior a cerca de 150 pM, inferior a cerca de 100 pM, inferior a cerca de 90 pM, inferior a cerca de 80 pM, inferior a cerca de 70 pM, inferior a cerca de 60 pM ou inferior a cerca de 50 pM, conforme medido por ressonância de plasmon de superfície, por exemplo, utilizando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 3 aqui presente, ou um ensaio substancialmente semelhante. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-MSR1 aqui descritos li- gam HMM-mfMSR1 a 25 ºC com um KD inferior a cerca de 12 nM, infe- rior a cerca de 10 nM, inferior a cerca de 9 nM, inferior a cerca de 8 nM, inferior a cerca de 7 nM, inferior a cerca de 6 nM, inferior a cerca de 5 nM, inferior a cerca de 4 nM, inferior a cerca de 3 nM, inferior a cerca de 2 nM, inferior a cerca de 1 nM, inferior a cerca de 900 pM, inferior a cerca de 800 pM, inferior a cerca de 800 pM, inferior a cerca de 700 pM, inferior a cerca de 600 pM, inferior a cerca de 500 pM, infe- rior a cerca de 400 pM, inferior a cerca de 300 pM, inferior a cerca de 200 pM, inferior a cerca de 150 pM, inferior a cerca de 100 pM, inferior a cerca de 90 pM, inferior a cerca de 80 pM, inferior a cerca de 70 pM, inferior a cerca de 60 pM ou inferior a cerca de 50 pM, conforme medi- do por ressonância de plasmons de superfície, por exemplo, utilizando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 3 aqui, ou um ensaio substancialmente semelhante.
[00161] As modalidades também incluem anticorpos e seus frag- mentos de ligação a antígeno que ligam o domínio extracelular da MSR1 de macaco expresso com uma etiqueta myc-myc-hexaistidina N-terminal (por exemplo, HMM-mfMSR1) com uma meia-vida dissocia- tiva ( t½) superior a cerca de 55 minutos, conforme medido por resso- nância de plasmons de superfície a 25 ºC ou 37 ºC, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 3 aqui ou um ensaio substancialmente semelhante. De acordo com algumas modalidades, são providos anticorpos anti-MSR1 que ligam a MSR1 humana dimérica a 37 ºC com uma t½ superior a cerca de 1 minuto, superior a cerca de 2 minutos, superior a cerca de 3 minutos, superior a cerca de 4 minutos, superior a cerca de 5 minutos, superior a cerca de 6 minutos, superior a cerca de 8 minutos, superior a cerca de 10 minutos, superior a cerca de 12 minutos, superior a cerca de 14 minu- tos, superior a cerca de 16 minutos, superior a cerca de 18 minutos, superior a cerca de 20 minutos, superior a cerca de 30 minutos, supe- rior a cerca de 40 minutos, superior a cerca de 50 minutos, superior a cerca de 60 minutos, superior a cerca de 70 minutos, superior a cerca de 80 minutos, superior a cerca de 90 minutos, superior a cerca de 120 minutos, superior a cerca de 150 minutos, superior a cerca de 180 minutos, superior a cerca de 210 minutos, ou mais, conforme medido por ressonância de plasmons de superfície, por exemplo, utilizando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 3, ou um ensaio substancialmente semelhante.
[00162] As modalidades também incluem anticorpos e seus frag- mentos de ligação a antígeno que ligam a hMSR1 engenheirada ex- pressa na superfície de células com razões de ligação das células que expressam HMSR1 engenheiradas para células que não expressam de pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 12 vezes, pelo menos cerca de 15 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 25 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 35 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 45 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, uu superior, conforme medido por ensaio de ligação de anticor- pos, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 5 aqui, ou um ensaio substancialmente semelhante. Em al-
gumas modalidades, São providos aqui anticorpos que ligam células com hMSR1 expressa de forma endógena com razões de ligação de células endógenas que expressam hMSR1 para células que não ex- pressam de pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 ve- zes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, ou mais, pelo menos cerca de 12 vezes, pelo menos cerca de 15 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 25 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 35 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 45 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, ou mais, conforme medido por ensaio de ligação de anticorpos, por exemplo, utilizando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 5 aqui, ou um ensaio substancialmente semelhante.
Em algumas modalidades, um anticorpo MSR1 ou o fra- gmento de ligação a antígeno aqui descrito liga a MSR1 de camun- dongo engenheirada expressa na superfície de células com razões de ligação de células engenheiradas que expressam MSR1 de camun- dongo para células que não expressam de pelo menos cerca de 2 ve- zes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 12 ve- zes, pelo menos cerca de 15 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 25 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 35 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 45 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes ou mais, conforme medido por ensaio de ligação de anticorpos, por exemplo, utilizando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 5 do presente documento, ou um ensaio substancialmente semelhante.
[00163] As modalidades também incluem anticorpos e seus frag- mentos de ligação a antígeno que ligam a MSR1 e exibem inibição máxima da absorção da lipoproteína de baixa densidade (LDL) modifi- cada em células que expressam MSR1 humana de menos de 95%. Por exemplo, as modalidades incluem anticorpos anti-MSR1 que apre- sentam inibição máxima da absorção de LDL modificada (por exemplo, oxidada ou acetilada) em células que expressam MSR1 humana de menos de 95%, com um IC50 de menos de cerca de 6,1 Nm, conforme medido utilizando um ensaio de absorção de ligante, por exemplo, uti- lizando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 8 ou um ensaio substancialmente semelhante. De acordo com certas modali- dades, são providos anticorpos anti-MSR1 que apresentam inibição máxima da absorção de LDL modificada em células que expressam MSR1 humana de menos de 95%, com um IC50 inferior a cerca de 6,1 Nm, inferior a cerca de 5 nM, inferior a cerca de 4 nM, inferior a cerca de 3 nM, inferior a cerca de 2 nM, inferior a cerca de 1,5 nM, inferior a cerca de 1,4 nM, inferior a cerca de 1,3 nM, inferior a cerca de 1,2 nM, inferior a cerca de 1,0 nM, inferior a cerca de 900 pM, inferior a cerca de 800 pM, inferior a cerca de 600 pM, inferior a cerca de 400 pM, infe- rior a cerca de 200 pM, inferior a cerca de 100 pM, inferior a cerca de 80 pM, inferior a cerca de 60 pM, inferior a cerca de 40 pM, inferior a cerca de 20 pM, conforme medido com um ensaio de absorção de li- gante, por exemplo, usando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 8 ou um ensaio substancialmente semelhante.
[00164] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-MSR1 apre- sentam inibição máxima da absorção de LDL modificada em células que expressam MSR1 humana inferior a cerca de 90%, com um IC50 inferior a cerca de 6,1 Nm, inferior a cerca de 5 nM, inferior a cerca de 4 nM, inferior a cerca de 3 nM, inferior a cerca de 2 nM, inferior a cerca de 1,5 nM, inferior a cerca de 1,4 nM, inferior a cerca de 1,3 nM, inferi-
or a cerca de 1,2 nM, inferior a cerca de 1,0 nM, inferior a cerca de 900 pM, inferior a cerca de 800 pM, inferior a cerca de 600 pM, inferior a cerca de 400 pM, inferior a cerca de 200 pM, inferior a cerca de 100 pM, inferior a cerca de 80 pM, inferior a cerca de 60 pM, inferior a cer- ca de 40 pM, inferior a cerca de 20 pM, conforme medido utilizando um ensaio de absorção de ligante, por exemplo, utilizando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 8 aqui, ou um ensaio substanci- almente semelhante.
[00165] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-MSR1 apre- sentam inibição máxima da absorção de LDL modificada em células que expressam MSR1 humana inferior a cerca de 75%, com um IC50 inferior a cerca de 6,1 Nm, inferior a cerca de 5 nM, inferior a cerca de 4 nM, inferior a cerca de 3 nM, inferior a cerca de 2 nM, inferior a cerca de 1,5 nM, inferior a cerca de 1,4 nM, inferior a cerca de 1,3 nM, inferi- or a cerca de 1,2 nM, inferior a cerca de 1,0 nM, inferior a cerca de 900 pM, inferior a cerca de 800 pM, inferior a cerca de 600 pM, inferior a cerca de 400 pM, inferior a cerca de 200 pM, inferior a cerca de 100 pM, inferior a cerca de 80 pM, inferior a cerca de 60 pM, inferior a cer- ca de 40 pM, inferior a cerca de 20 pM, conforme medido utilizando um ensaio de absorção de ligante, por exemplo, utilizando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 8 do presente documento, ou um ensaio substancialmente semelhante.
[00166] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-MSR1 apre- sentam inibição máxima da absorção de LDL modificada em células que expressam MSR1 humana inferior a cerca de 60%, com um IC50 inferior a cerca de 6,1 Nm, inferior a cerca de 5 nM, inferior a cerca de 4 nM, inferior a cerca de 3 nM, inferior a cerca de 2 nM, inferior a cerca de 1,5 nM, inferior a cerca de 1,4 nM, inferior a cerca de 1,3 nM, inferi- or a cerca de 1,2 nM, inferior a cerca de 1,0 nM, inferior a cerca de 900 pM, inferior a cerca de 800 pM, inferior a cerca de 600 pM, inferior a cerca de 400 pM, inferior a cerca de 200 pM, inferior a cerca de 100 pM, inferior a cerca de 80 pM, inferior a cerca de 60 pM, inferior a cer- ca de 40 pM, inferior a cerca de 20 pM, conforme medido utilizando um ensaio de absorção de ligante, por exemplo, utilizando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 8 do presente documento, ou um ensaio substancialmente semelhante.
[00167] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-MSR1 apre- sentam inibição máxima da absorção de LDL modificada em células que expressam MSR1 humana inferior a cerca de 50%, com um IC50 inferior a cerca de 6,1 Nm, inferior a cerca de 5 nM, inferior a cerca de 4 nM, inferior a cerca de 3 nM, inferior a cerca de 2 nM, inferior a cerca de 1,5 nM, inferior a cerca de 1,4 nM, inferior a cerca de 1,3 nM, inferi- or a cerca de 1,2 nM, inferior a cerca de 1,0 nM, inferior a cerca de 900 pM, inferior a cerca de 800 pM, inferior a cerca de 600 pM, inferior a cerca de 400 pM, inferior a cerca de 200 pM, inferior a cerca de 100 pM, inferior a cerca de 80 pM, inferior a cerca de 60 pM, inferior a cer- ca de 40 pM, inferior a cerca de 20 pM, conforme medido utilizando um ensaio de absorção de ligante, por exemplo, utilizando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 8 do presente documento, ou um ensaio substancialmente semelhante.
[00168] As modalidades também incluem anticorpos e seus frag- mentos de ligação a antígeno que ligam a MSR1 expressa na superfí- cie da célula e são internalizados pelas células. Por exemplo, São pro- vidos aqui anticorpos que se ligam à MSR1 expressa na superfície da célula em células THP-1 e se tornam internalizados pelas células. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-MSR1 que se li- gam à MSR1 expressa na superfície da célula em células THP-1 e tor- nam-se internalizadas pelas células com uma percentagem relativa de pelo menos 10%, conforme medido por quimiluminescência, por exemplo, utilizando um formato de ensaio como definido no Exemplo 9 deste documento, ou um ensaio substancialmente semelhante. Em algumas modalidades, anticorpos anti-MSR1 que se ligam à MSR1 expressa na superfície da célula em células THP-1 e tornam-se inter- nalizados pelas células com uma percentagem relativa de pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% ou 50%, conforme medi- do por quimioluminescência, por exemplo, utilizando um formato de ensaio conforme definido no Exemplo 9 deste documento, ou um en- saio substancialmente semelhante.
[00169] Os anticorpos aqui descritos podem possuir uma ou mais das características biológicas acima mencionadas ou qualquer combi- nação delas. A lista anterior de características biológicas dos anticor- pos aqui descritos não pretende ser exaustiva. Outras características biológicas dos anticorpos aqui descritos serão evidentes para uma pessoa com habilidades comuns na arte a partir de uma revisão da presente descrição, incluindo os exemplos de trabalho aqui apresenta- dos. Conjugados Anticorpo-Fármaco (ADCs)
[00170] São providos aqui conjugados anticorpos-fármacos (ADCs) que incluem um anticorpo anti-MSR1 ou seu fragmento de ligação a antígeno conjugado a um fármaco ou um agente terapêutico. Em al- gumas formas de realizações, o agente terapêutico é um agonista do receptor X do fígado (LXR) ou um esteroide. São também providos aqui ligador-cargas úteis reativos úteis para a produção de ADCs. Além disso, são providos anticorpos anti-MSR1 modificados e frag- mentos de ligação a antígeno do MSR1 modificados, úteis para a pro- dução de ADCs.
[00171] Os ADCs geralmente têm a fórmula (I): BA - [(L)0-1 - PA]N. Na fórmula, BA é um agente de ligação, por exemplo, um anti-MSR1, anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno da MSR1. L é um ligador, descrito em detalhes abaixo. PA é uma carga útil. As cargas úteis adequadas incluem qualquer molécula pequena que possa pro- porcionar um benefício terapêutico através da sua entrega à MSR1. Em algumas modalidades, uma carga útil pode ser, por exemplo, um esteroide, um modulador de LXR ou um análogo de rifamicina. As car- gas úteis são descritas em detalhes abaixo. Na fórmula, n é um núme- ro inteiro de 1 a 30, por exemplo, de 1 a 4, por exemplo, 2 ou 4. Cada L - PA é covalentemente ligado a um grupo funcional de PA. Em al- gumas modalidades particulares, cada L - PA é covalentemente ligado a uma cadeia lateral de lisina, a uma cadeia lateral de cisteína, a uma cadeia lateral de glutamina ou a um terminal amino de BA.
[00172] Técnicas e ligadores para conjugação a resíduos de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno são conhecidos na arte. Anexos exemplares de aminoácidos que podem ser usados no contex- to deste aspecto, por exemplo, lisina (vide, por exemlo, os Documen- tos US 5.208.020; US 2010/0129314; Hollander e outros,, Bioconjuga- te Chem., 2008, 19:358-361; WO 2005/089808; US 5.714.586; US 2013/0101546 e US 2012/0585592), cisteína (vide, por exemplo, os Documentos US 2007/0258987; WO 2013/055993; WO 2013/055990; WO 2013/053873; WO 2013/053872; WO 2011/130598; US 2013/0101546; e US 7,750,116), selenocisteína (vide, por exemplo, o Documento WO 2008/122039; e Hofer e outros, Proc. Natl. Acad. Sci., EUA, 2008, 105:12451-12456), formil glicina (vide, por exemplo, Carri- co e outros, Nat. Chem. Biol., 2007, 3:321-322; Agarwal e outros, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2013, 110:46-51 e Rabuka e outros, Nat. Proto- cols, 2012, 10:1052-1067), aminoácidos não naturais (vide, por exem- plo, os Documentos WO 2013/068874 e WO 2012/166559) e aminoá- cidos ácidos (vide, por exemplo, o Documento WO 2012/05982). Os ligadores também podem ser conjugados a uma proteína de ligação a antígeno via ligação a carboidratos (vide, por exemplo, os Documentos US 2008/0305497, WO 2014/065661 e Ryan e outros, Food & Agricul-
ture Immunol., 2001, 13:127-130) e ligadores dissulfeto (vide, por exemplo, os Documentos WO 2013/085925, WO 2010/010324, WO 2011/018611 e Shaunak e outros, Nat. Chem. Biol., 2006, 2:312-313). Técnicas de conjugação específicas para sítios também podem ser utilizadas para a conjugação direta a resíduos específicos do anticorpo ou da proteína de ligação a antígeno (consulte, por exemplo, Schuma- cher e outros, J Clin Immunol (2016) 36 (Supl 1): 100). Técnicas de conjugação específicas para sítio incluem, mas não se limitam a, con- jugação de glutamina via transglutaminase (vide, por exemplo, Schibli, Angew Chemie Inter Ed. 2010, 49, 9995).
[00173] Os ligadores podem ser conjugados a um ou mais resíduos glutamina via conjugação quimoenzimática à base de transglutami- nase (vide, por exemplo, Dennler e outros, Bioconjugate Chem. 2014, 25, 569-578 e WO 2017/147542). Por exemplo, na presença de trans- glutaminase, um ou mais resíduos glutamina de um anticorpo podem ser acoplados a um composto amina primária. Brevemente, em algu- mas modalidades, um anticorpo com um resíduo glutamina (por exem- plo, um resíduo Gln295) é tratado com um composto amina primária, descrito mais detalhadamente abaixo, na presença da enzima trans- glutaminase. Os compostos de amina primária incluem cargas úteis ou ligador-cargas úteis, que fornecem diretamente conjugados anticorpos- fármacos via acoplamento mediado por transglutaminase. Os compos- tos de amina primária também incluem ligadores e espaçadores que são funcionalizados com grupos reativos que podem ser posteriormen- te reagidos com outros compostos para a síntese de conjugados anti- corpo-fármaco. Anticorpos contendo resíduos glutamina podem ser isolados de fontes naturais ou engenheirados para conter um ou mais resíduos glutamina. Técnicas para a engenharia de resíduos glutamina em uma cadeia de polipeptídeos de anticorpos (anticorpos modificados com glutaminila ou moléculas de ligação a antígeno) estão dentro do conhecimento daqueles versados na técnica. Em algumas modalida- des, o anticorpo é não glicosilado.
[00174] Em algumas modalidades, o anticorpo ou um anticorpo mo- dificado com glutaminila ou uma molécula de ligação a antígeno é composta por pelo menos um resíduo glutamina em pelo menos uma sequência de cadeia de polipeptídeos. Em algumas modalidades, o anticorpo ou um anticorpo modificado com glutaminila ou uma molécu- la de ligação a antígeno é composta por dois polipeptídeos de cadeia pesada, cada um com um resíduo Gln295. Em outras modalidades, o anticorpo ou um anticorpo modificado com glutaminila ou uma molécu- la de ligação a antígeno é composta por um ou mais resíduos glutami- na em um sítio diferente de uma cadeia pesada 295. Em algumas mo- dalidades, um anticorpo pode ser preparado por mutagênese dirigida a sítio para inserir um resíduo glutamina em um sítio, sem resultar em função de anticorpo desativada ou ligação. Por exemplo, estão aqui incluídos anticorpos que portam mutação(ões) Asn297Gln (N297Q), conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, um anticorpo com um resíduo Gln295 e/ou mutação N297Q contém um ou mais resíduos glutamina de ocorrência natural adicionais em suas regiões variáveis, que podem ser acessíveis à transglutaminase e, por conseguinte, capazes de se conjugar a um ligador ou um liga- dor-carga útil. Um resíduo glutamina de ocorrência natural exemplifica- tivo pode ser encontrado, por exemplo, no Q55 da cadeia leve. Nestes casos, o anticorpo conjugado via transglutaminase pode ter um valor DAR superior ao esperado (por exemplo, um DAR superior a 4). Qual- quer um desses anticorpos pode ser isolado de fontes naturais ou arti- ficiais.
[00175] O composto amina primária útil para o acoplamento media- do por transglutaminase de um anticorpo (ou composto de ligação a antígeno) compreendendo uma glutamina pode ser qualquer composto amina primária considerado útil pelo técnico na arte. Geralmente, o composto amina primária tem a fórmula H2N-R, em que R pode ser qualquer grupo compatível com o anticorpo e as condições de reação. Em algumas modalidades, R é alquila, alquila substituída, heteroalqui- la ou heteroalquila substituída.
[00176] Em algumas modalidades, o composto amina primária compreende um grupo reativo ou um grupo reativo protegido. Grupos reativos úteis incluem azidas, alcinos, cicloalcinos, tióis, álcoois, ceto- nas, aldeídos, ácidos, ésteres, hidrozidas, analinas e aminas. Em al- gumas modalidades, o grupo reativo é selecionado do grupo constituí- do por azida, alcino, sulfidrila, cicloalcino, aldeído e carboxila.
[00177] Em algumas modalidades, o composto amina primária está de acordo com a fórmula H2N-LL-X, onde LL é um espaçador divalente e X é um grupo reativo ou um grupo reativo protegido. Em certas mo- dalidades, LL é um grupo divalente de polietilenoglicol (PEG) divalen- te. Em algumas modalidades, X é selecionado do grupo constituído por - SH, - N3, alcino, aldeído e tetrazol. Em certas modalidades, X é - N3.
[00178] Em algumas modalidades, o composto amina primária está de acordo com uma das seguintes fórmulas:
[00179] H2N-(CH2)n-X;
[00180] H2N-(CH2CH2O)n-(CH2)p-X;
[00181] H2N-(CH2)n-N(H)C(O)-(CH2)m-X;
[00182] H2N-(CH2CH2O)n-N(H)C(O)-(CH2CH2O)m-(CH2)p-X;
[00183] H2N-(CH2)n-C(O)N(H)-(CH2)m-X;
[00184] H2N-(CH2CH2O)n-C(O)N(H)-(CH2CH2O)m-(CH2)p-X;
[00185] H2N-(CH2)n-N(H)C(O)-(CH2CH2O)m-(CH2)p-X;
[00186] H2N-(CH2CH2O)n-N(H)C(O)-(CH2)m-X;
[00187] H2N-(CH2)n-C(O)N(H)-(CH2CH2O)m-(CH2)p-X; e
[00188] H2N-(CH2CH2O)n-C(O)N(H)-(CH2)m-X;
[00189] que n é um número inteiro selecionado de 1 a 12;
[00190] m é um número inteiro selecionado de 0 a 12;
[00191] p é um número inteiro selecionado de 0 a 2;
[00192] e X é selecionado do grupo constituído por -SH, -N3, - C≡CH, -C(O)H, tetrazol e qualquer um dentre .
[00193] Acima, qualquer dos grupos alquila ou alquileno (ou seja, CH2-) pode ser opcionalmente substituído, por exemplo, por C1- 8alquila, metilformila ou -SO3H. Em algumas modalidades, os grupos alquila são não substituídos.
[00194] Em algumas modalidades, o composto amina primária é selecionado do grupo constituído por:
O
SH H2 N N
H O
SH H2N N
H O
O O H2 N N O O SH
H
O O H2 N O N3
O N3 H2N N
H e and
O
O O H2 N N O O N3 H .
[00195] Em modalidades específicas, o composto amina primária é .
[00196] Condições exemplares para as reações acima são providas nos Exemplos abaixo.
[00197] Deste modo, são providos anticorpos anti-MSR1 modifica- dos e seus fragmentos de ligação a antígeno, ligados a um ou mais compostos amina primária. Em modalidades específicas, são providos aqui anticorpos anti-MSR1 modificados e seus fragmentos de ligação a antígeno, de acordo com a fórmula: .
[00198] Na fórmula, BA é um anticorpo anti-MSR1 ou um seu frag- mento de ligação a antígeno. A variável n é um número inteiro de 1 a
30. Em certas modalidades, n é de 1 até o número de resíduos gluta- mina em BA. Em certas modalidades, n é de 1 a 4. Em certas modali-
dades, n é 1, 2, 3 ou 4. Em algumas modalidades, n é 2. Em algumas modalidades, n é 4. Os anticorpos anti-MSR1 modificados e seus fra- gmentos de ligação a antígeno são úteis, por exemplo, para ligação a uma ou mais moléculas L - PA para formar um ADC.
[00199] Em certas modalidades, BA compreende dois ou quatro re- síduos glutamina. Em certas modalidades, BA compreende um resíduo Q295. Em certas modalidades, BA compreende uma mutação N297Q. Em certas modalidades, BA compreende Q295 e N297Q. Nessas mo- dalidades, como BA pode ser dimérico, BA tem quatro resíduos gluta- mina para conjugação a porções L - PA. Compostos
[00200] Em um aspecto, é provido aqui um composto e/ou um con- jugado anticorpo-fármaco composto por qualquer anticorpo, ou seu fragmento de ligação a antígeno, descrito no presente documento, conjugado a um resíduo de carga útil opcionalmente através de um ligador ou através de um ligador-espaçador.
[00201] Em um grupo de modalidades, o composto e/ou o conju- gado anticorpo-fármaco tem a estrutura da Fórmula (I): Fórmula (I) em que: BA é um agente de ligação; L é um ligador; PA é uma porção de carga útil selecionada do grupo que consiste um resíduo de esteroide, um resíduo de modulador LXR ou um resíduo análogo à rifamicina; e n subscrito é um número inteiro de 1 a 30.
[00202] Em um grupo de modalidades, um composto e/ou conjuga- do anticorpo-fármaco descrito acima e no presente documento tem a estrutura da fórmula (IA):
Fórmula (IA) em que SP1 está ausente ou é um espaçador; RG1 é um resíduo de grupo reativo; AA1 está ausente ou é um ligador divalente ou trivalente constituído por um resíduo de aminoácido opcionalmente ligado direta ou indiretamente a um grupo HG; AA2 está ausente ou é um resíduo de dipeptídeo, tripeptí- deo ou de tetrapeptídeo; Q, quando presente, é um resíduo de grupo conector; SP está ausente ou é um espaçador; e HG, quando presente, é um grupo hidrofílico.
[00203] Em um grupo de modalidades, um composto e/ou conjuga- do anticorpo-fármaco descrito acima e no presente documento tem a estrutura da Fórmula (IB-1): Fórmula (IB-1) em que SP1 está ausente ou é um espaçador; RG1 é um resíduo de grupo reativo; Q, quando presente, é , ou ou ; e SP está ausente ou é um espaçador; em que o indica os átomos pelos quais o grupo refe- renciado é ligado aos grupos adjacentes na fórmula.
[00204] Em um grupo de modalidades, um composto e/ou conjuga- do anticorpo-fármaco descrito acima e no presente documento tem a estrutura da Fórmula (IB-2):
Fórmula (IB-2) em que SP1 está ausente ou é um espaçador; RG1 é um resíduo de grupo reativo; AA1 está ausente ou é um ligador divalente ou trivalente constituído por um resíduo de aminoácido opcionalmente ligado direta ou indiretamente a um grupo HG; AA2 está ausente ou é um resíduo de dipeptídeo, tripeptí- deo ou de tetrapeptídeo;
Q, quando presente, é ,
ou ; SP está ausente ou é um espaçador; e HG, quando presente, é
, ,
, ou , em que o indica os átomos pelos quais o grupo referenciado é ligado aos grupos adjacentes na fórmula.
[00205] Em um grupo de modalidades, um composto e/ou conjuga- do anticorpo-fármaco descrito acima e no presente documento tem a estrutura da Fórmula (IC), Fórmula (ID) ou Fórmula (IE): Fórmula (IC) Fórmula (ID) Fórmula (IE) em que SP1 está ausente ou é um espaçador; RG1 é um resíduo de grupo reativo; SP2 está ausente ou é um espaçador; RG2 é um resíduo de grupo reativo; AA1 é um ligador divalente ou trivalente compreendendo um resíduo de aminoácido; AA2 é um resíduo de dipeptídeo, tripeptídeo ou tetrapeptí-
deo;
Q, quando presente, é ,
ou ; SP está ausente ou é um espaçador; e HG é
, ,
, ou
,
em que o indica os átomos pelos quais o grupo referenciado é ligado aos grupos adjacentes na fórmula.
Em alguns ou quaisquer ca- sos, para qualquer composto e/ou conjugado anticorpo-fármaco des- crito acima e no presente documento, AA1-AA2 é de acordo com a Fórmula (LL1):
(LL1) em que RAA1, RAA2 e RAA3 são, cada um, independentemente, cadeias laterais de aminoácidos, pelo menos uma delas é ligada a -(RG2)-SP2- HG, -(RG2)-HG ou HG; em que o indica os átomos pelos quais AA1-AA2 é ligado aos grupos adjacentes na fórmula. Em algumas des- sas modalidades, RAA1 é uma cadeia lateral de lisina, glutamina, ácido glutâmico ou ácido aspártico ligada direta ou indiretamente a HG, e RAA2 e RAA3 são, cada um, cadeias laterais de valina e alanina ou vali- na e citrulina, respectivamente.
[00206] Em alguns ou quaisquer casos, para qualquer composto e/ou conjugado anticorpo-fármaco descrito acima e no presente docu- mento, AA1-AA2 é ou , em que o indica os átomos pelos quais AA1-AA2 é ligado aos gru- pos adjacentes na fórmula.
[00207] Em alguns ou quaisquer casos, para qualquer composto e/ou conjugado anticorpo-fármaco descrito acima e no presente docu- mento, os resíduos RG1 e RG2 são independentemente, em cada ca- so, selecionados do grupo que consiste em: , , , ,
N N
N , , , , , , ou , , , , , , , , , e ; em que o indica o átomo pelo qual o resíduo RG1 ou RG2 é ligado aos grupos adjacentes na fórmula.
[00208] Em alguns ou quaisquer casos, para qualquer composto e/ou conjugado anticorpo-fármaco descrito acima e no presente docu- mento, SP, SP1 e SP2 estão independente, em cada caso, ausentes, ou selecionados do grupo constituído por C1-6 alquileno, -NH-, -S-, -O-, -C(O)-, (-CH2-CH2-O)e, -NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-, -C(O)-
(CH2)u-C(O)-, -C(O)-NH-(CH2)v-, (glicina)4-serina e suas combinações, em que o "e" subscrito é um número inteiro de 0 a 4, o "u" subscrito é um número inteiro de 1 a 8 e o subscrito "v" é um número inteiro de 1 a
8.
[00209] Em alguns ou quaisquer casos, para qualquer composto e/ou conjugado anticorpo-fármaco descrito acima e no presente docu- mento, n é um número inteiro de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 6, de 1 a 4, ou n é 1, 2, 3 ou 4.
[00210] Em alguns ou quaisquer casos, para qualquer composto, o ligador-carga útil e/ou o conjugado anticorpo-fármaco descrito acima e no presente documento, é
O O O O O H O O N N O O N N H H H O O
O N NH2
H O S O S O S S S S O O O O S O N O N S
H H ou .
[00211] Em algumas ou quaisquer modalidades, para qualquer composto e/ou conjugado anticorpo-fármaco descrito acima e no pre- sente documento, o anticorpo, ou seu fragmento de ligação a antíge- no, é conjugado a uma carga útil de esteroide através de um ligador ou um ligador-espaçador.
[00212] Em algumas ou quaisquer modalidades, para qualquer composto e/ou conjugado anticorpo-fármaco descrito acima e no pre- sente documento, o anticorpo, ou seu fragmento de ligação a antíge- no, é conjugado a uma carga útil do modulador de LXR através de um ligador.
[00213] Em algumas ou quaisquer modalidades, para qualquer composto e/ou conjugado anticorpo-fármaco descrito acima e no pre- sente documento, o anticorpo, ou seu fragmento de ligação a antíge- no, é conjugado a uma carga útil de análogo de rifamicina via um liga- dor. Cargas úteis
[00214] Na Fórmula (I) BA - [L - PA]n, PA pode ser qualquer carga útil considerada útil. Essas cargas úteis incluem pequenas moléculas que fornecem um benefício terapêutico através de sua administração por meio de MSR1. Em certas modalidades, PA é o resíduo de uma molécula selecionada do grupo que consiste em um esteroide, um modulador de LXR ou um análogo de rifamicina. Em alguns casos, PA é um esteroide. Em alguns casos, PA é um modulador de LXR. Em alguns casos, PA é um agonista de LXR. Em algumas modalidades, PA é um antagonista de LXR. Cargas úteis exemplares do modulador de LXR são descritas, por exemplo, no pedido de patente U.S. Nº 62/508,327, depositado em 18 de maio de 2017, intitulado "BIS-
OCTAHYDROPHENANTHRENE CARBOXAMIDES AND PROTEIN CONJUGATES THEREOF", publicado como U.S. 2018/0334426, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Em alguns casos, PA é um análogo de rifamicina, incluindo qualquer análogo de rifamici- na aqui descrito. Em alguns casos, PA é um análogo de rifamicina, tendo a seguinte estrutura:
.
[00215] Em certas modalidades, as cargas úteis nos compostos da Fórmula (i) são glicocorticoides de acordo com a Fórmula (A): Fórmula (A) ou um sal, solvato ou forma estereoisomérica farmaceuticamente acei- tável; em que R1 e R2 são, independentemente, -H, alquila, alquil-C(O)-O- , -OH ou halo; ou R1 e R2 juntos formam , em que R4 é alquila, arila, arilalquila ou heterocicloalquila contendo N, em que a alquila, arila, arilalquila e heterocicloalquila con- tendo N são, independentemente em cada caso, opcionalmente substi- tuídas por -NRAARAB; R3 é -OH, RZ-C(O)-X-, heteroalquila, piperidinila, -NRAaRAb, - oxiaril-NRAaRAb ou -Z-A'(RP)t; RZ é alquila; X é O ou NRAa; Z é S, S(O), S(O)2, SO2NRAa, O, C(O)NRAa, C(O) ou NRAa; A' é arila, arilalquila ou heteroarila;
RP é, independentemente em cada caso, halo, alquila opci- onalmente substituído, -OH ou -NRAaRAb; RAa e RAb são, independentemente em cada caso, -H, alqui- la opcionalmente substituído ou arila opcionalmente substituído; a subscrito é um número inteiro de 0 a 19; e t é um número inteiro de 1 a 3; contanto que: (1) R3 não seja -OH (a) quando R1 for -OH ou (b) quando R1 e R2 juntos formarem , em que R4 é C1-9alquila ou e (2) R3 não seja . e R5A e R5B são, cada um, independentemente, halo ou um átomo de hidrogênio; em que o grupo R3 ou R4 é ligado ao ligador.
[00216] Em algumas dessas modalidades, R3 é NH2. Em algumas outras dessas modalidades, R3 é , em que indica o átomo pelo qual R3 é ligado aos grupos adjacentes na Fórmula (I).
[00217] Em algumas modalidades, PA é um esteroide. Cargas úteis de esteroides exemplares são descritas, por exemplo, no Pedido de Patente U.S. Nº 62/614.905, depositado em 8 de janeiro de 2018, inti- tulado "STEROIDS AND ANTIBODY CONJUGATES THEREOF", e no Pedido de Patente US nº 15/806,197, depositado em 7 de novembro de 2017, intitulado "STEROIDS AND PROTEIN-CONJUGATES THE- REOF", depositado como Pedido US 2018/0155389, cada um deles é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Em algumas moda- lidades, o PA é selecionado de ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou estereoisômero do mesmo.
Em certas modalidades de acordo com qualquer das Fórmu- las 1110-1140, R3 é -O-arila, -NRAaRAb, -alquileno-NRAaRAb, -X-arileno- Y-NRAaRAb, -X-heteroarileno-Y-NRAaRAb ou N-heterocicloalquila con- tendo N; em que X está ausente, -N-, -CH2- ou -O-; em que Y está au- sente ou -CH2-; e R4 é alquila, arila, alquilarila ou arilalquila.
Em certas modalidades, R3 é -O-arileno-NRAaRAb, -O-heteroarileno-NRAaRAb; em que a arila ou heteroarila é opcionalmente substituída por halogêneo, deutério, hidroxila ou metoxila.
Em certas modalidades, R3 é -O-fenil- NRAaRAb, -O-heteroarileno-NRAaRAb; em que a fenila ou heteroarila é opcionalmente substituída por halogêneo ou deutério.
Em algumas modalidades, R4 é n-propila.
Em algumas modalidades, RAa e RAb são, cada um independentemente, hidrogênio ou alquila.
Em certas modali- dades, um dentre RAa e RAb é substituído por uma ligação ao ligador (por exemplo, L ou LL). Em certas modalidades, PA é
, , ,
ou , ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou estereoisômero do mesmo. Em certas modalidades, PA é ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou estereoisômero do mesmo.
Em algumas modalidades, PA é ou um sal farma- ceuticamente aceitável, solvato ou estereoisômero do mesmo. Em al- gumas modalidades, PA é ou um sal farmaceuti- camente aceitável, solvato ou estereoisômero do mesmo. Em algumas modalidades, PA é ou um sal farmaceuticamen- te aceitável, solvato ou estereoisômero do mesmo. Em algumas moda-
lidades, PA é ou um sal farmaceuticamente acei- tável, solvato ou estereoisômero do mesmo. Nessas modalidades, a linha ondulada indica uma ligação ao ligador (por exemplo, L ou LL).
[00218] Em algumas modalidades, PA é selecionado dos resíduos dos seguintes:
,
ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou estereoisômero do mesmo. Em algumas modalidades, uma amina primária ou secundária é ligada a um ligador L para formar uma carga útil de ligador, que é ligada a BA para formar um conjugado. Aqueles com conhecimento na técnica reconhecerão que os compostos acima podem ser ligados a L com uma ligação a um grupo amina primária ou secundária, em substi- tuição a um H.
[00219] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-MSR1 descri- tos aqui são conjugados a: ou .
[00220] Em algumas modalidades, os conjugados anticorpo- fármaco descritos aqui compreendem uma carga útil de esteroide, em que a carga útil de esteroide é selecionada do grupo consistindo em: e ou suas misturas.
[00221] Em certas modalidades, PA é:
ou um sal farmaceuticamente aceitável ou es- tereoisômero do mesmo. Em certas modalidades, PA é: ou um sal farmaceuticamente aceitável ou es- tereoisômero do mesmo. Em certas modalidades, PA é: ou um sal farmaceuticamente aceitável ou es- tereoisômero do mesmo.
[00222] Em certas modalidades, PA é: ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo. Em certas modalidades, PA é:
ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo. Em certas modalidades, PA é: ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo.
[00223] Em certas modalidades, PA é um modulador de receptor do fígado X (LXR). Em certas modalidades, PA é de acordo com a Fór- mula (B): Fórmula (B) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoiso- mérica do mesmo, em que
[00224] W é -CH2-, -N(H)- ou -O-;
[00225] RB1 é -H, -OH, -NH2, alquila ou -OP(O)(OR6)2;
[00226] RB2 é -H, -OH, -CH2NH2, RB3, RB4, RB5 ou -O-RB5, em que RB1 e RB2 não são simultaneamente -H;
[00227] RB3 é -N(R6)2;
[00228] RB4 é -X-Y-Z;
[00229] X é selecionado do grupo consistindo em -O- e -N(H)-;
[00230] Y é selecionado do grupo consistindo em alquileno, alquile- no substituído (incluindo, sem limitação, substituição oxo, i.e., =O)), heteroalquileno e heteroalquileno substituído (incluindo, sem limitação, substituição oxo (i.e., =O));
[00231] Z é selecionado do grupo consistindo em -OH e -NH2;
[00232] RB5 é alquila, heterocicloalquila ou heterocicloalquila substi- tuída, em que cada heterocicloalquila ou heterocicloalquila substituída inclui um, dois ou três heteroátomos selecionados de nitrogênio e oxi- gênio e inclui pelo menos um de substituinte -OH e -CH2OH, ou pelo menos um nitrogênio primário ou secundário, por exemplo, O-glicose;
[00233] cada R6 é em cada caso, -H, um resíduo de aminoácido, um resíduo de aminoácido N-alquila, um peptídeo ou alquila; e
[00234] cada R7 é, independentemente, halo, C1-6 alquila, C1-6 alcó- xi, -CN, O-glicose, resíduo de O-aminoácido e O-PEGb, em que cada b subscrito é um inteiro de a partir de 0-3;
[00235] em que o grupo RB1, RB2 ou R7 é ligado ao ligante.
[00236] Em modalidades particulares, RB1 ou RB2 é substituído com uma ligação para o ligador (por exemplo, L ou LL).
[00237] Em certas modalidades, PA é selecionado de:
.
[00238] Em modalidades particulares, a linha ondulada em indi- ca uma ligação ao ligador (por exemplo, L ou LL).
[00239] Em certas modalidades, a carga útil de Fórmula (B) é sele- cionada do grupo consistindo em: , , , , , ,
, , , , , , e , ou uma forma estereoisomérica farmaceuticamente aceitável do mes- mo.
[00240] Em certas modalidades, PA é: ou um sal farmaceuticamente aceitável ou este- reoisômero do mesmo.
[00241] Em certas modalidades, PA é: ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo.
[00242] Em certas modalidades, PA é: ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo.
[00243] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-MSR1 descri- tos aqui são conjugados a: , , ou .
[00244] Em algumas modalidades, PA é um modulador de receptor do fígado X (LXR) de acordo com a Fórmula (B-1): Fórmula (B-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoiso- mérica do mesmo, em que RB1 é -N(H)R8 ou -N(R9)2; RB2 é -N(H)R8; cada R8 é, independentemente em cada caso, hidrogênio, um resíduo de aminoácido, um resíduo de aminoácido N-alquila, um resíduo de peptídeo, uma porção biodegradável ou alquila; R9 é alquila, arila, arilalquila, heterocicloalquila ou heteroci- cloalquila substituída, em que cada heterocicloalquila ou heterocicloal- quila substituída compreende um, dois ou três heteroátomos selecio- nados de nitrogênio e oxigênio, e quando substituído inclui pelo menos um -OH e -CH2OH ou pelo menos um nitrogênio primário ou secundá- rio; cada R7 é independentemente halo, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, -CN, O-glicose, resíduo de O-aminoácido ou O-PEGb, em que cada b subscrito é um inteiro de 0-3; em que o grupo RB1, RB2 ou R7 é ligado ao ligante.
[00245] Em alguns casos, um composto de Fórmula (B-1) é seleci- onado do grupo consistindo em:
P4B;
P5B;
P6B;
P7B;
P8B;
P9B;
P12B;
P2B;
P10B; P11B; e P3B; ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo.
[00246] Em modalidades particulares, RB1 ou RB2 é substituído com uma ligação para o ligador (por exemplo, L ou LL).
[00247] Em certas modalidades, PA é
P4B ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo. Em certas modalidades, PA é: P5B ou um sal farmaceutica- mente aceitável ou estereoisômero do mesmo. Em certas modalida- des, PA é: P6B ou um sal farma- ceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo.
[00248] Em certas modalidades, PA é:
P7B ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo.
Em certas modalidades, PA é P8B ou um sal farmaceutica- mente aceitável ou estereoisômero do mesmo.
Em certas modalida-
des, PA é P9B ou um sal farma- ceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo.
Em certas mo-
dalidades, PA é P12B ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo.
Em certas modalidades, PA é P2B ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo.
Em certas modalidades, PA é ou ou
P10B, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo.
Em algumas de tais modalidades, o grupo de ácido carboxílico de P10B é ligado ao ligante através de uma ligação amida como mostra- do acima.
Em certas modalidades, PA é ou
P11B, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo.
Em algumas de tais modalidades, o grupo de ácido carboxílico de P11B é ligado ao ligante através de uma ligação amida como mostra- do acima.
Em certas modalidades, PA é
P3B ou um sal farmaceuticamente aceitável ou estereoisômero do mesmo.
[00249] Para quaisquer modalidades descritas nesse parágrafo, a linha ondulada em indica uma ligação ao ligador (por exemplo, L ou LL) como descrito aqui.
[00250] Em um grupo de modalidades, são providos aqui compos- tos de Fórmula (III): Fórmula (III); ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou estereoisômero dos mesmos, em que: R34 é alquila, arila, arilalquila ou uma heterocicloalquila con- tendo N; ambos Rx são hidrogênio; e SP é -C(O)-C1-C10-alquileno- C(O)-, -C(O)-N(C1-6alquila)-C1-C10-alquileno-X1- onde X1 é ligado a L' na Fórmula (III), -C(O)-N(H)-(C1-C10-alquileno)-S- onde S é ligado a L' na Fórmula (III), -C(O)-N(C1-6alquila)-(C1-C10-alquileno)-S- onde S é ligado a L' na Fórmula (III), onde o ponto de ligação no lado direito (i.e. em N) é para L' na Fórmula (III), -CH2-NH- onde o N é ligado a L' na Fórmula (III), onde o N é ligado a L' na Fórmula (III) e onde Ar é arileno opcionalmente substituído ou hetero- arileno opcionalmente substituído, -(C1-C10-alquileno)-NR50C(O)-(C1- C10-alquileno)-NR50a- onde NR50a é ligado a L' na Fórmula (III), -C(O)- (C1-C10-alquileno)-NR50C(O)-(C1-C10-alquileno)-NR50a- onde NR50a é ligado a L' na Fórmula (III) e onde cada C1-C10-alquileno é indepen- dentemente opcionalmente substituído com um ou mais hidróxi, -C(O)- N(R35)-C1-C10-alquileno-C(O)NH-X2- onde X2 é ligado a L' na Fórmula
(III), ou onde X4 é ligado a L' na Fórmula (III); ou ambos Rx são flúor; e SP é -C(O)-C1-C10-alquileno-C(O)-, - C(O)-N(C1-6alquila)-C1-C10-alquileno-X1b- onde X1b é ligado a L na Fórmula (III), -C(O)-N(H)-(C1-C10-alquileno)-X1b- onde X1b é ligado a L'
na Fórmula (III), onde o ponto de ligação no lado direito (i.e. em N) é para L' na Fórmula (III), -CH2-NH- onde o N é ligado a L'
na Fórmula (III), onde o N é ligado a L' na Fórmula (III) e onde Ar é arileno opcionalmente substituído ou heteroarileno opcio- nalmente substituído, -(C1-C10-alquileno)-NR50C(O)-(C1-C10-alquileno)- NR50a- onde NR50a é ligado a L' na Fórmula (III), -C(O)-(C1-C10- alquileno)-NR50C(O)-(C1-C10-alquileno)-NR50a- onde NR50a é ligado a L' na Fórmula (III) e onde cada C1-C10-alquileno é independentemente opcionalmente substituído com um ou mais hidróxi, -C(O)-N(R35)-(C1- C10-alquileno)-C(O)NH-X2- onde X2 é ligado a L' na Fórmula (III), ou onde X4 é ligado a L' na Fórmula (III); e X1 é -N(C1-6alquila)-; X1b é -S-, -NH- ou -N(C1-6alquila)-; X2 é -NH-; X3 é -CH2-, X3 é -CH2-O-(C1-C10-alquileno)-C(O)- onde o C(O) é ligado a X4 ou X3 é -C(O)-; X4 é -O-; R35 é H, -OH, -OCH3 ou C1-6alquila; R50 e R50a são independentemente hidrogênio ou C1-C6- alquila; Rd, Re e Rf são independentemente -H, -OH, hidroxialquila, al- coxicarbonila, -C(O)OH ou -CH2ORg, onde cada Rg é independente- mente -CH2C(O)OH ou -CH2C(O)O(alquila); e mm é 0 ou 1; n é um inteiro selecionado de 1-30, inclusive; L' é um ligador; e BA é um agente de ligação.
[00251] Em algumas modalidades, em um composto de Fórmula (III), ambos Rx são hidrogênio, e SP, BA, L', R34 e n são como descrito aqui em alguma ou quaisquer modalidades. Em algumas modalidades, em um composto de Fórmula (III), ambos Rx são flúor, e SP, BA, L', R34 e n are como descrito aqui em alguma ou quaisquer modalidades. Em algumas modalidades, R34 está na configuração R. Em algumas modalidades, R34 está na configuração S. Em algumas modalidades, R34 é uma mistura de configurações R- e S-. Em algumas modalida- des, R34 é uma mistura de configurações R- e S-, onde na mistura R:S é cerca de 1:1, cerca de 2:1, cerca de 3;1, cerca de 4:1, cerca de 5:1, cerca de 6;1, cerca de 7:1, cerca de 8:1, cerca de 9:1 ou cerca de 10:1.
[00252] Em algumas modalidades estão compostos de Fórmula (III) onde ambos Rx são hidrogênio; e SP é -C(O)-C1-C10-alquileno- C(O)-, -C(O)-N(C1-6alquila)-C1-C10-alquileno-X1- onde X1 é ligado a L' na Fórmula (III), -C(O)-N(H)-(C1-C10-alquileno)-S- onde S é ligado a L' na Fórmula (III), -C(O)-N(C1-6alquila)-(C1-C10-alquileno)-S- onde S é ligado a L' na Fórmula (III), -(C1-C10-alquileno)-NR50C(O)-(C1-C10- alquileno)-NR50a- onde NR50a é ligado a L' na Fórmula (III), -C(O)-(C1- C10-alquileno)-NR50C(O)-(C1-C10-alquileno)-NR50a- onde NR50a é ligado a L' na Fórmula (III) e onde cada C1-C10-alquileno é independentemen- te opcionalmente substituído com um ou mais hidróxi, -C(O)-N(R5)-C1- C10-alquileno-C(O)NH-X2- onde X2 é ligado a L' na Fórmula (III) ou onde X4 é ligado a L' na Fórmula (III); ou ambos Rx são flúor; e SP é -C(O)-N(C1-6alquila)-C1-C10- alquileno-X1b- onde X1b é ligado a L' na Fórmula (III), -C(O)-N(H)-(C1- C10-alquileno)-X1b- onde X1b é ligado a L' na Fórmula (III), onde o ponto de ligação no lado direito (i.e. em N) é para L' na Fórmu- la (III), -(C1-C10-alquileno)-NR50C(O)-(C1-C10-alquileno)-NR50a- onde NR50a é ligado a L' na Fórmula (III), -C(O)-(C1-C10-alquileno)- NR50C(O)-(C1-C10-alquileno)-NR50a- onde NR50a é ligado a L' na Fór- mula (III) e onde cada C1-C10-alquileno é independentemente opcio- nalmente substituído com um ou mais hidróxi ou -C(O)-N(R5)-(C1-C10- alquileno)-C(O)NH-X2- onde X2 é ligado a L' na Fórmula (III).
[00253] Em algumas modalidades, um composto de Fórmula (I) é um composto de Fórmula (3000): BA-(L'-SP-D)n Fórmula (3000)
ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou estere- oisômero do mesmo, em que D é selecionado de a) Fórmula (a), onde ambos Rx na Fórmula (a) são hidrogênio; R34 é alquila, arila, ari- lalquila ou uma heterocicloalquila contendo N; e SP é -C(O)-C1-C10- alquileno-C(O)-, -C(O)-N(C1-6alquila)-C1-C10-alquileno-X1- onde X1 é ligado a L' na Fórmula (3000), -C(O)-N(H)-(C1-C10-alquileno)-S- onde S é ligado a L' na Fórmula (3000), -C(O)-N(C1-6alquila)-(C1-C10-
alquileno)-S- onde S é ligado a L' na Fórmula (3000), on- de o ponto de ligação no lado direito (i.e. em N) é para L' na Fórmula (3000), -CH2-NH- onde o N é ligado a L' na Fórmula (3000),
onde o N é ligado a L' na Fórmula (3000) e onde Ar é arileno opcionalmente substituído (em algumas modalidades
) ou heteroarileno opcionalmente substituído, -(C1-C10- alquileno)-NR50C(O)-(C1-C10-alquileno)-NR50a- onde NR50a é ligado a L' na Fórmula (3000), -C(O)-(C1-C10-alquileno)-NR50C(O)-(C1-C10- alquileno)-NR50a- onde NR50a é ligado a L' na Fórmula (3000) e onde cada C1-C10-alquileno é independentemente opcionalmente substituído com um ou mais hidróxi, -C(O)-N(R35)-C1-C10-alquileno-C(O)NH-X2-
onde X2 é ligado a L' na Fórmula (3000), ou on- de X4 é ligado a L' na Fórmula (3000); ou onde ambos Rx na Fórmula (a) são flúor; R34 é alquila, arila, arilalquila ou uma heterocicloalquila contendo N; e SP é -C(O)-C1-C10- alquileno-C(O)-, -C(O)-N(C1-6alquila)-C1-C10-alquileno-X1b- onde X1b é ligado a L' na Fórmula (3000), -C(O)-N(H)-(C1-C10-alquileno)-X1b- onde
X1b é ligado a L' na Fórmula (3000), onde o ponto de li- gação no lado direito (i.e. em N) é para L' na Fórmula (3000), -CH2-
NH- onde o N é ligado a L' na Fórmula (3000), onde o N é ligado a L na Fórmula (3000) e onde Ar é arileno opcionalmente substituído (em algumas modalidades ) ou heteroarileno op- cionalmente substituído, -(C1-C10-alquileno)-NR50C(O)-(C1-C10- alquileno)-NR50a- onde NR50a é ligado a L' na Fórmula (3000), -C(O)- (C1-C10-alquileno)-NR50C(O)-(C1-C10-alquileno)-NR50a- onde NR50a é ligado a L' na Fórmula (3000) e onde cada C1-C10-alquileno é inde- pendentemente opcionalmente substituído com um ou mais hidróxi, - C(O)-N(R35)-(C1-C10-alquileno)-C(O)NH-X2- onde X2 é ligado a L' na
Fórmula (3000), ou onde X4 é ligado a L' na Fórmula (3000); e/ou b) os compostos na Tabela A abaixo, onde os compostos na Tabela A são ligados a BA do Composto de Fórmula (III) através do hidróxi do grupo -C(O)CH2OH, i.e. através de -C(O)CH2-O-SP-L'-, ou através do hidróxi de Mapracorat, i.e. através de -O-SP-L'-; X1 é -N(C1-6alquila)-; X1b é -S-, -NH- ou -N(C1-6alquila)-; X2 é -NH-; X3 é -CH2-, X3 é -CH2-O-(C1-C10-alquileno)-C(O)- onde o C(O) é ligado a X4 ou X3 é -C(O)-; X4 é -O-; R35 é H, -OH, -OCH3 ou C1-6alquila; R50 e R50a são independentemente hidrogênio ou C1-C6- alquila; Rd, Re e Rf são independentemente -H, -OH, hidroxialquila, alcoxicarbonila, -C(O)OH ou -CH2ORg, onde cada Rg é independente- mente -CH2C(O)OH ou -CH2C(O)O(alquila); e mm é 0 ou 1; n é um inteiro selecionado de 1-30, inclusive; L' é um ligador; e BA é um agente de ligação.
[00254] Em alguns casos de Fórmula (3000), D é budenosida ou qualquer outro esteroide mostrado na Tabela A. Em alguns casos de Fórmula (3000), D é qualquer análogo de budenosida descrito aqui. Os compostos na Tabela A são ligados a BA do Composto de Fórmula (III) através do hidróxi do grupo -C(O)CH2OH, i.e. através de - C(O)CH2-O-SP-L'-, ou através do hidróxi de Mapracorat, i.e. através de -O-SP-L'-. Em alguns casos de Fórmula (3000), a porção SP-D (ou H-SP-D) é referida aqui como um "espaçador de budenosida" e inclui, por exemplo, espaçadores de budenosida mostrados na Tabela B, na seção de exemplos e no Esquema 1 na FIG. 22.
Tabela A Marca registrada Estrutura
Butirato de Hidrocortisona Locoid®
Halometasona Sicorten®/ (C-48401-Ba)
Betametasona Celestone®/Rinderon®/Diprosone® (NSC-39470; Sch-4831)
Fluclorolona Acetonida Cutanit®/Topicon® (RS-2252)
Marca registrada Estrutura
Fluocinolona Acetonida Flucort®/Fluonid®/Iluvien®/Retisert®/ Synalar®/Synalar-HP®/Synemol® (NSC-92339; DF-277)
Flunisolida (RS-3999; RS-1320)
Cloprednol (RS-4691)
Triamcinolona Aristocort®/Kenacort®
Budesonida
Marca registrada Estrutura
Flurandrenolida Cordran®
Desoximetasona Topicort® (DSXS)
Benzoato de betametasona Uticort® (W-5975)
Desonida Desonate® (D-2083)
Meprednisona (NSC-527579; Sch-4358)
Marca registrada Estrutura
Prednisolona Delta-Cortef® (NCS-9120)
Triamcinolona Acetonida
Metilprednisolona Depo-Medrol; Medrol; Urbason® (NSC-19987)
Prednisona Decortin®/Deltasone®/Lodotra®/ Meticorten®/Rayos® (NSC-10023)
Dexametasona Decadron® (FT-4145; ENV-1105; IBI-10090; ISV- 305; OTO-104)
Marca registrada Estrutura
Valerato de hidrocortisona Westcort®
Mapracorate (BOL-242X; BOL-303242-X; ZK-245186; BAY-865319; BOL-303242-X)
Benzodrocortisona
Tabela B.
Espaçador de budenosida (Budesonida-SP) Nº do Composto Estrutura
1a (Budesonide)
1c
1d
Nº do Composto Estrutura 1e 1g 1h
H HH O
O O 1i O O H
O OH HO HO OH OH H HH O O
O O 1j H
O O O OH HO HO OH OH H
O HH 1k O O
O
O O H H 2N P O OH
OH
Nº do Composto Estrutura
H HH O O O
O H 1l O
P O OH O OH O P O
OH H 2N
H H
HO H O 1m
O O OH Na+ -
P O - O Na+
O 100 101a 101b 101c
Nº do Composto Estrutura
101d
102c
102d
102e
102f
103a
103b
Nº do Composto Estrutura 104a 104b 105aa 106a 107a ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou estereoisômero do mesmo.
[00255] Em alguns casos, a n-propila de em cada uma das estruturas acima está na configuração R, i.e. no carbono indicado pelo asterisco. Em alguns casos, a n-propila de em cada uma das estruturas acima está na configuração S, i.e. no carbono indi- cado pelo asterisco. Em alguns casos, a n-propila de em cada uma das estruturas acima é uma mistura de configurações R- e S-, i.e. no carbono indicado pelo asterisco. Em alguns casos, a n- propila de em cada uma das estruturas acima é uma mis- tura de configurações R- e S-, i.e. no carbono indicado pelo asterisco, onde na mistura R:S é cerca de 1:1, cerca de 2:1, cerca de 3;1, cerca de 4:1, cerca de 5:1, cerca de 6;1, cerca de 7:1, cerca de 8:1, cerca de 9:1 ou cerca de 10:1.
[00256] Em várias modalidades, -SP-D de Ab-L'-SP-D ou de Fórmula (3000) é selecionado de , , , ,
, , , , , , ,
O H H O H O O H OH N O S O , , , , , ,
, , , , ,E , em que a é a ligação ao ligador.
[00257] Em alguns casos, a n-propila de em cada uma das estruturas acima está na configuração R, i.e. no carbono indicado pelo asterisco. Em alguns casos, a n-propila de em cada uma das estruturas acima está na configuração S, i.e. no carbono indi- cado pelo asterisco. Em alguns casos, a n-propila de em cada uma das estruturas acima é uma mistura de configurações R- e S-, i.e. no carbono indicado pelo asterisco. Em alguns casos, a n- propila de em cada uma das estruturas acima é uma mis-
tura de configurações R- e S-, i.e. no carbono indicado pelo asterisco, onde na mistura R:S é cerca de 1:1, cerca de 2:1, cerca de 3;1, cerca de 4:1, cerca de 5:1, cerca de 6;1, cerca de 7:1, cerca de 8:1, cerca de 9:1 ou cerca de 10:1.
[00258] Em várias modalidades, é selecionado de Tabela B ou é selecionado de , , ou .
[00259] Em algumas modalidades, a carga útil é um análogo de ri- famicina tendo a estrutura de Fórmula (C):
Fórmula (C) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoiso- mérica do mesmo; em que: X1c é selecionado de -O-, -S-- e -NR5c; R1c é hidrogênio; amino-C1-6alquila; C1-6alquilaminoC1- 6alquila; di-C1-6alquilaminoC1-6alquila; hidroxi-C1-6alquila; HS-C1- 6alquila; (R5c)2N-C1-6alquileno-N(R5c)-C1-6alquila; (R5c)2N-C1-6alquileno- O-C1-6alquila; (R5c)2N-C1-6alquileno-S-C1-6alquila; heterocicloalquila ou heterocicloalquil-C1-6alquila; em que a heterocicloalquila inclui um, dois ou três heteroátomos selecionados de O, N e S; e em que heterociclo- alquila é opcionalmente substituída com halo, C1-6alquila, -OH, =O ou - N(R5c)2; R2c, R3c e R4c são independentemente selecionados de hi- drogênio, C1-6alquila e -(C=O)-R5c; Rac é selecionado de -F; -Cl; -Br; -I; -OH; -NH2; e C1-6alcóxi; Rbc é hidrogênio em cada ocorrência; e R5c é independentemente, em cada ocorrência, selecionado de hidrogênio; e C1-6alquila; contanto que R1c não seja um grupo n-butila; e contanto que quando X1c for -O-, R1c não seja hidrogênio; em que o grupo R1c é ligado ao ligante.
[00260] Em algumas modalidades, a carga útil é um análogo de ri-
famicina tendo a estrutura de Fórmula (C-1): Fórmula (C-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoiso- mérica do mesmo; em que: X1c é selecionado de -S-; -O- e -NR5c; R1c é amino-C1-6alquila; C1-6alquilaminoC1-6alquila; di-C1- 6alquilaminoC1-6alquila; hidroxi-C1-6alquila; HS-C1-6alquila; (R5c)2N-C1- 5c 6alquileno-N(R )-C1-6alquila; (R5c)2N-C1-6alquileno-O-C1-6alquila; (R5c)2N-C1-6alquileno-S-C1-6alquila; heterocicloalquila ou heterocicloal- quil-C1-6alquila; em que a heterocicloalquila inclui um, dois ou três he- teroátomos selecionados de O, N e S; e em que heterocicloalquila é opcionalmente substituída com halo, C1-6alquila, -OH, =O ou -N(R5c)2; R2c, R3c e R4c são independentemente selecionados de hi- drogênio, C1-6alquila e -(C=O)-R5c; cada Rac, quando presente, é independentemente selecio- nado de -F; -Cl; -Br; -I; -OH; -NH2; e C1-6alcóxi; e R5c é independentemente, em cada ocorrência, selecionado de hidrogênio; e C1-6alquila; em que o grupo R1c é ligado ao ligante.
[00261] Em algumas modalidades, a carga útil é um análogo de ri- famicina tendo a estrutura de Fórmula (C-2):
Fórmula (C-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoiso- mérica do mesmo; em que: X1c é selecionado de -S-; -O- e -NR5c; R1c é amino-C1-6alquila; C1-6alquilaminoC1-6alquila; di-C1- 6alquilaminoC1-6alquila; hidroxi-C1-6alquila; HS-C1-6alquila; (R5c)2N-C1- 5c 6alquileno-N(R )-C1-6alquila; (R5c)2N-C1-6alquileno-O-C1-6alquila; (R5c)2N-C1-6alquileno-S-C1-6alquila; heterocicloalquila ou heterocicloal- quil-C1-6alquila; em que a heterocicloalquila inclui um, dois ou três he- teroátomos selecionados de O, N e S; e em que heterocicloalquila é opcionalmente substituída com halo, C1-6alquila, -OH, =O ou -N(R5c)2; R2c, R3c e R4c são independentemente selecionados de hi- drogênio, C1-6alquila e -(C=O)-R5c; Rac e Rbc são independentemente selecionados de -F; -Cl; - Br; -I; -OH; -NH2; e C1-6alcóxi; e R5c é independentemente, em cada ocorrência, selecionado de hidrogênio; e C1-6alquila; em que o grupo R1c é ligado ao ligante.
[00262] Em algumas modalidades, a carga útil é um análogo de ri- famicina tendo a estrutura de Fórmula (C-3):
Fórmula (C-3) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoiso- mérica do mesmo; em que: R1c é di-C1-6alquilaminoC1-6alquila; (R5c)2N-C1-6alquileno- N(R5c)-C1-6alquila; heterocicloalquila ou heterocicloalquil-C1-6alquila; em que a heterocicloalquila inclui um, dois ou três heteroátomos sele- cionados de O, N e S; e em que heterocicloalquila é opcionalmente substituída com halo, C1-6alquila, -OH, =O ou -N(R5c)2; e R2c, R3c e R4c são independentemente selecionados de hi- drogênio, C1-6alquila e -(C=O)-R5c; e R5c é selecionado de hidrogênio e C1-6alquila; em que o grupo R1c é ligado ao ligante.
[00263] Em algumas modalidades, a carga útil é um análogo de ri- famicina tendo a estrutura de Fórmula (C-4): Fórmula (C-4)
ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoiso- mérica do mesmo; em que: R1c é , ; ou ; em que Y é C ou N; R2c, R3c e R4c são independentemente selecionados de hi- drogênio, C1-6alquila e -(C=O)-R5c; e R5c é selecionado de hidrogênio e C1-6alquila; em que o grupo R1c é ligado ao ligante por meio do átomo de nitrogênio como indicado pela linha ondulada .
[00264] Em alguma ou quaisquer modalidades de Fórmula (C-1) e/ou (C-2) e/ou (C-3) e/ou (C-4), Rbc é hidrogênio e/ou Rac é hidrogê- nio. Em alguma ou quaisquer modalidades de Fórmula (C-1) e/ou (C- 2) e/ou (C-3) e/ou (C-4), R2c é metila, etila, propila ou isopropila, prefe- rivelmente metila. Em alguma ou quaisquer modalidades de Fórmula (C-1) e/ou (C-2) e/ou (C-3) e/ou (C-4), R3c é grupo CH3-(C=O)- (aceti- la), CH3CH2-(C=O)-, CH3CH2CH2-(C=O)- ou (CH3)2CH-(C=O)-; preferi- velmente acetila. Em alguma ou quaisquer modalidades de Fórmula (C-1) e/ou (C-2) e/ou (C-3) e/ou (C-4), R4c é hidrogênio.
[00265] Em algumas modalidades de Fórmula (C-1) e/ou (C-2) e/ou (C-3) e/ou (C-4), -OR1c é um ou mais de , , , , ou . Em algumas modalidades de Fórmula (C-1) e/ou (C-2) e/ou (C-3) e/ou (C-4), -OR1c é e/ou
.
[00266] Em alguma ou quaisquer modalidades de Fórmula (C-1) e/ou (C-2) e/ou (C-3) e/ou (C-4), X1c é O e -OR1c compreende uma amina terciária, a dita amina terciária, após ligação a um ligador, muda para uma amina quaternária. Em algumas de tais modalidades, -OR1c é ou . Em tais modalidades, onde uma amina quaternária é formada, um contraíon adequado está presente, i.e., o análogo de rifamicina está presente como um sal farmaceutica- mente aceitável compreendendo uma amina quaternária carregando uma carga útil positive e, como um sal, por exemplo, um contraíon ne- gativamente carregado de equilíbrio de carga útil (por exemplo, I-, Br- , Cl- ou qualquer outro contraíon adequado).
[00267] Em algumas modalidades, um composto de Fórmula (C-1) e/ou (C-2) e/ou (C-3) e/ou (C-4) é selecionado do grupo consistindo em: , , , ,
, , , e , em que o é a ligação ao ligador. Ligadores
[00268] Em algumas modalidades de Fórmula (I), (III) ou (3000), L compreende -L1-L2-(L3)0-1- e L2 compreende , , ,
O O O O O N O N S H H , , ,
, , , ,
, , -C(O)CH2CH2C(O)NH-,
, ,
, , -OCH2C(O)- ou resíduo de ciclodextrina (CD); ou combinações dos mesmos.
Em algumas modalidades, L compreende -L1-L2-(L3)0-1- e L2 compreende
, , ,
, ,
ou CD ou combinações dos mesmos.
Em algumas modalidades, L compreende -L1-L2-(L3)0-1- e L2 compre- ende CD.
Em algumas modalidades, onde L e/ou L2 compreende CD, CD é selecionado do grupo consistindo em
, , , , e .
[00269] Em algumas modalidades de Fórmula (I), (III) ou (3000), L compreende -L1-L2-(L3)0-1- e L2 compreende HG como descrito aqui.
Em algumas modalidades, L e/ou L2 compreende ou . Em algumas modalidades, L e/ou L2 compreende ou .
[00270] Em algumas modalidades de Fórmula (I), (III) ou (3000), L compreende -L1-L2-(L3)0-1- e L1 é selecionado de ou um regioisômero ou mistura de isômeros do mesmo; ; ; ; ; ou um estereoisômero ou mis- tura de estereoisômeros do mesmo, onde S se refere ao átomo de S em um resíduo cisteína através do qual o resíduo do grupo reativo é ligado a BA; e onde N se refere ao átomo de N em um resíduo lisina através do que o resíduo do grupo reativo é ligado a BA.
[00271] Em algumas modalidades, L compreende -L1-L2-(L3)0-1- e - L2-(L3)0-1- como descrito aqui. Em algumas modalidades, L é L'-SP como descrito aqui para Fórmula (III) e Fórmula (3000). Em algumas modalidades L compreende:
O O S O S S O O O O O N O N S
H H ou .
[00272] Em alguns casos, um composto de Fórmula (I) ou (III) ou (3000), é selecionado de , e ou uma mistura dos mesmos;
ou uma forma estereoisomérica do mesmo ou um regioisômero do mesmo ou uma mistura de regioisômeros do mesmo, em que cada Ab é um anticorpo anti-MSR1 ou um fragmento de ligação a antí- geno do mesmo; e cada n é um inteiro de a partir de 1 a 4,
[00273] Em alguns casos, um composto de Fórmula (I) ou (III) ou (3000) é selecionado de ; ou uma mistura dos mesmos; ;
;
;
ou uma mistura dos mesmos,
ou uma mistura dos mesmos ou uma mistura dos mesmos ou uma mistura dos mesmos ou uma forma estereoisomérica do mesmo ou um regioisômero do mesmo ou uma mistura de regioisômeros do mesmo, em que cada Ab é um anticorpo anti-MSR1 ou um fragmento de ligação a antí- geno do mesmo; cada BA é onde Ab1 é um anticorpo anti-MSR1 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo; R é C2- 4-alquileno; e nn é um inteiro selecionado de 2 a 4, inclusive, e cada n é um inteiro de a partir de 1 a 4.
[00274] Em algumas modalidades adicionais, os ADCs descritos aqui podem compreender ligadores descritos na US 9,951,141 B2, de- positada em 29 de novembro de 2016 e concedida em 24 de abril de 2018, cujos ligadores são aqui incorporados a título de referência. Em alguns casos, o ligador compreende:
, em que b é um inteiro de 2 a 8 e e é uma ligação para o agente de ligação.
Em algumas modalida- des, o ligante compreende dois grupos reativos e pode formar ligações com, por exemplo, tióis em duas cadeias diferentes de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo:
; em que b é um inteiro de a partir de 2 a 8. Em modalidades adicionais, o ligante compreende dois grupos reativos e pode formar ligações com, por exemplo, tióis em du- as cadeias diferentes de um anticorpo ou fragmento de ligação a antí-
geno do mesmo: ; em que b é um inteiro de a partir de 2 a 8. Em algumas outras modalidades, o li- gante compreende dois grupos reativos e pode formar ligações com, por exemplo, tióis em duas cadeias diferentes de um anticorpo ou fra- gmento de ligação a antígeno do mesmo:
O NH2
NH
N RM Br O R O O
H O (CH2)b N
N H
O H3C CH3 ; em que b é um inteiro de a partir de 2 a 8, RN é um átomo de hidrogênio ou alquila e RM é alquila. Em modalidades adicionais, o ligante compreende dois grupos reativos e pode formar ligações com, por exemplo, tióis em duas cadeias dife- rentes de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo: ; em que b é um inteiro de a partir de 2 a 8. Em certas modalidades, o ligante compreende dois grupos reativos e pode formar ligações com, por exemplo, tióis em du- as cadeias diferentes de um anticorpo ou fragmento de ligação a antí- geno do mesmo: ; em que b é um inteiro de a partir de 2 a 8. Em algumas modalidades, o ligante compreende dois grupos reativos e pode formar ligações com, por exemplo, tióis em duas cadeias diferentes de um anticorpo ou frag- mento de ligação a antígeno do mes-
mo: ; em que b é um inteiro de a partir de 2 a 8; RN é um átomo de hidrogênio ou alquila; e RM é alqui- la.
[00275] Nas Fórmulas (I), (IA), (IB), (IB-1), (IB-2), (IC), (ID), (IE), (III), (3000), (5001), (5002), (5003), (5004), (6001), (6002), (6003), (6004), (6005), (7001), (7002), (7003), (7004) e/ou (7005) descritas aqui e/ou em BA - [(L)0-1 - PA]n, PA pode ser ligado a BA com qual- quer ligador L considerado adequado. Ligadores são qualquer grupo ou porção que liga, conecta ou une o anticorpo ou proteínas de ligação a antígeno descritas aqui com uma porção terapêutica, por exemplo, um esteroide ou um modulador LXR. Ligadores adequados podem ser encontrados, por exemplo, em Antibody-Drug Conjugates and Immu- notoxins; Phillips, G. L., Ed.; Springer Verlag: New York, 2013; Antibo- dy-Drug Conjugates; Ducry, L., Ed.; Humana Press, 2013; Antibody- Drug Conjugates; Wang, J., Shen, W.-C. e Zaro, J. L., Eds.; Springer International Publishing, 2015, os conteúdos de cada um são aqui in- corporados a título de referência em sua totalidade. Em geral, ligado- res de agente de ligação adequados para os conjugados de anticorpo descritos aqui são aqueles que são suficientemente estáveis para ex- plorar a meia-vida de circulação do anticorpo e, ao mesmo tempo, ca- pazes de liberar sua carga útil após internalização mediada por antí- geno do conjugado. Ligadores podem ser cliváveis ou nao cliváveis. Ligadores cliváveis incluem ligadores que são clivados através de me- tabolismo intracelular seguindo internalização, por exemplo, clivagem por meio de hidrólise, redução ou reação enzimática. Ligantes não cli- váveis incluem ligantes que liberam uma carga útil afixada por meio de degradação lisossomal do anticorpo seguindo internalização. Ligado- res adequados incluem, mas não estão limitados a, ligadores lábeis a ácido, ligadores lábeis à hidrólise, ligadores enzimaticamente cliváveis, ligadores lábeis por redução, ligadores/grupos autoimolativos e ligado- res não cliváveis. Ligadores adequados também incluem, mas não es- tão limitados a, aqueles que são ou compreendem peptídeos, glucuro- nidas, succinimida-tioéteres, unidades de polietileno glicol (PEG), hi- drazonas, unidades de mal-caproíla, unidades dipeptídicas, unidades valina-citrulina e unidades para-aminobenzila (PAB).
[00276] Qualquer molécula ligadora ou tecnologia ligadora conheci- da na técnica pode ser usada para criar ou construir um ADC da pre- sente invenção. Em certas modalidades, o ligador é um ligador clivá- vel. De acordo com outras modalidades, o ligador é um ligador não clivável. Ligadores exemplares que podem ser usados no contexto da presente invenção incluem ligadores que compreendem ou consistem em, por exemplo, MC (6-maleimidocaproíla), MP (maleimidopropanoí- la), val-cit (valina-citrulina), val-ala (valina-alanina), sítio dipeptídico em ligador clivável por protease, ala-phe (alanina-fenilalanina), sítio dipep- tídico em ligador clivável por protease, PAB (p- aminobenziloxicarbonila), SPP (N-Succinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoa- to), SMCC (N-Succinimidil 4-(N-maleimidometi)cicloexano-1 carboxila- to), SIAB (N-Succinimidil (4-iodo-acetil)aminobenzoato) e variantes e combinações dos mesmos. Exemplos adicionais de ligadores que po- dem ser usados no contexto da presente invenção são providos, por exemplo, na US 7,754,681 e em Ducry, Bioconjugate Chem., 2010, 21:5-13 e as referências citadas no mesmo, cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência em suas totalidades.
[00277] Em certas modalidades, os ligadores são estáveis em con- dições fisiológicas. Em certas modalidades, os ligadores são cliváveis, por exemplo, capazes de liberar pelo menos a porção de carga útil na presença de uma enzima ou em uma faixa ou valor de pH particular. Em algumas modalidades, um ligador compreende uma porção clivá- vel por enzima. Porções cliváveis por enzima ilustrativas incluem, mas não estão limitadas a, ligações peptídicas, ligações éster, hidrazonas e ligações dissulfeto. Em algumas modalidades, o ligante compreende um ligador clivável por catepsina.
[00278] Em algumas modalidades, o ligador compreende uma por- ção não clivável.
[00279] Ligadores adequados incluem também, mas não estão limi- tados a, aqueles que são quimicamente ligados a dois resíduos cisteí- na de um agente de ligação único, por exemplo, anticorpo. Tais ligado- res podem servir para imitar as ligações dissulfeto de anticorpo que são rompidas como um resultado do processo de conjugação.
[00280] Em algumas modalidades, o ligador compreende um ou mais aminoácidos. Aminoácidos adequados incluem L- ou D- α- aminoácidos naturais, não naturais, padrão, não padrão, proteinogêni- co, não proteinogênicos. Em algumas modalidades, o ligador compre- ende alanina, valina, glicina, leucina, isoleucina, metionina, triptofano, fenilalanina, prolina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glu- tamina, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, arginina, histidina ou citrulina, um derivado dos mesmos ou combinação dos mesmos. Em certas modalidades, uma ou mais cadeias laterais dos aminoácido é ligada a um grupo de cadeia lateral, descrito abaixo. Em algumas mo- dalidades, o ligador compreende valina e citrulina. Em algumas moda- lidades, o ligador compreende lisina, valina e citrulina. Em algumas modalidades, o ligador compreende lisina, valina e alanina. Em algu- mas modalidades, o ligador compreende valina e alanina.
[00281] Em algumas modalidades, o ligador compreende um grupo autoimolativo. O grupo autoimolativo pode ser qualquer grupo do tipo conhecido daqueles de habilidade. Em modalidades particulares, o grupo autoimolativo é p-aminobenzila (PAB) ou um derivado do mes- mo. Em algumas modalidades, o grupo autoimolativo é p- aminobenzilóxi. Em algumas modalidades, o grupo autoimolativo com- preende um grupo dissulfeto clivável. Derivados úteis incluem p- aminobenziloxicarbonila (PABC). Aqueles de habilidade reconhecerão que um grupo autoimolativo é capaz de realizar uma reação química que libera os átomos restantes de um ligador a partir de uma carga útil.
[00282] Em algumas modalidades, o ligador é: em que é uma ligação ao anticorpo ou proteína de ligação a antí- geno (por exemplo, através do resíduo lisina) e é uma ligação à carga útil. Em algumas modalidades, o ligador é: em que é uma ligação ao anticorpo ou proteína de ligação a antí- geno (por exemplo, através do resíduo lisina) e é uma ligação à carga útil. Em certas modalidades, o ligador é:
.
[00283] Em certas modalidades, o ligador é: .
[00284] Em algumas modalidades, o ligador é derivado de maleimi- dilmetil-4-trans-cicloexanocarboxissucinato: .
[00285] Em algumas modalidades, o ligador é: em que é uma ligação ao anticorpo ou proteína de ligação a antí- geno (por exemplo, através do resíduo lisina) e é uma ligação à carga útil.
[00286] Em algumas modalidades, L é um ligador clivável. Em al- gumas modalidades, L é um ligador não clivável. Em algumas modali-
dades, L compreende um dipeptídeo. Em algumas modalidades, L compreende uma porção PAB. Em algumas modalidades, L compre- ende uma porção dissulfeto.
[00287] Em algumas modalidades, L compreende uma porção ten- do a estrutura que segue: .
[00288] Em algumas modalidades, L compreende uma porção ten- do a estrutura que segue: .
[00289] Em algumas modalidades, L compreende uma porção ten- do a estrutura que segue: .
[00290] Em algumas modalidades, L compreende uma porção ten- do a estrutura que segue:
.
[00291] Em certas modalidades, o ligador compreende um grupo ciclodextrina. Em certas modalidades, o ligador provê um ADC de acordo com a Fórmula (Ia): (Ia).
[00292] Na Fórmula (Ia), BA é um anticorpo anti-MSR1, ou um fra- gmento de ligação a antígeno do mesmo, LL é um ligador trivalente, RG é um resíduo de ligador reativo, SP está, independentemente em cada caso, ausente ou é um grupo espaçador, o subscrito n é um intei- ro de a partir de 1 a 30; e PA é uma carga útil. Em certas modalidades, n é de a partir de 1 a 4. Em certas modalidades, n é 4. Em certas mo- dalidades, n é 2. Em certas modalidades, n é 1. Em certas modalida- des, n é 3.
[00293] Em certas modalidades, o ligador compreende um grupo ciclodextrina. Em certas modalidades, o ligador provê um ADC de acordo com a Fórmula (Id):
(Id)
[00294] Na Fórmula (Id), BA é um anticorpo anti-MSR1, ou um fra- gmento de ligação a antígeno do mesmo; RG é um resíduo de grupo reativo; SP1 e SP2 estão, cada um, independentemente em cada caso, ausentes ou um são resíduo de grupo espaçador, e em que SP1 com- preende um ligador trivalente; AA1 é um ligador trivalente compreen- dendo resíduo de aminoácido; AA2 é um resíduo de dipeptídeo; PEG é um resíduo de polietileno glicol; PAB é , em que a indica o átomo através do qual o PAB é ligado aos grupos adjacentes na fórmula, CD está, independentemente em cada caso, ausente ou é um resíduo de ciclodextrina, em que pelo menos um CD está presente, o subscrito n é um inteiro de a partir de 1 a 30; o subscrito m é um in- teiro de a partir de 0 a 5; o subscrito p é 0 ou 1; e PA é uma porção de carga útil. Nesses exemplos, o subscrito m é 0, 1, 2, 3, 4 ou 5. Em al- guns exemplos, o subscrito m é 0. Em alguns exemplos, o subscrito m é 1. Em alguns exemplos, o subscrito m é 2. Em alguns exemplos, o subscrito m é 3. Em alguns exemplos, o subscrito m é 4. Em alguns exemplos, o subscrito m é 5. Em alguns exemplos, o subscrito p é 0. Em alguns exemplos, o subscrito p é 1. Em alguns exemplos, qualquer um de AA1 ou AA2 compreende, independentemente em cada caso, um aminoácido selecionado de alanina, valina, leucina, isoleucina, me- tionina, triptofano, fenilalanina, prolina, serina, treonina, cisteína, tirosi- na, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, ar- ginina, histidina ou citrulina, um derivado dos mesmos ou uma combi- nação dos mesmos. Em certas modalidades, AA1 é um aminoácido selecionado de alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, triptofa-
no, fenilalanina, prolina, glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, as- paragina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, arginina, histidina ou citrulina, um derivado dos mesmos ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, AA1 é lisina. Em certas modali- dades, AA1 é lisina ou um derivado de lisina. Em certas modalidades, o AA2 é valina-citrulina. Em algumas modalidades, o AA2 é citrulina- valina. Em algumas modalidades, o AA2 é valina-alanina. Em algumas modalidades, o AA2 é alanina-valina. Em algumas modalidades, o AA2 é valina-glicina. Em algumas modalidades, o AA2 é glicina-valina. Em algumas modalidades, o AA1-AA2 glutamina-valina-citrulina. Em algu- mas modalidades, o AA1-AA2 é glutamina-valina-citrulina. Em algumas modalidades, o AA1-AA2 é lisina-valina-alanina. Em algumas modali- dades, o AA1-AA2 é lisina-valina-citrulina. Em algumas modalidades, o AA1-AA2 é glutamina-valina-citrulina. Em certas modalidades, a lisina é L-lisina. Em certas modalidades, a lisina é D-lisina. Em alguns exem- plos, SP1 é independentemente em cada caso selecionado do grupo consistindo em C1-6 alquileno, -NH-, -C(O)-, (-CH2-CH2-O)e, -NH-CH2- CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-, -C(O)-(CH2)u-C(O)-, -C(O)-NH-(CH2)v- e combinações dos mesmos, em que o subscrito e é um inteiro de a par- tir de 0 a 4, o subscrito u é um inteiro de a partir de 1 a 8 e o subscrito v é um inteiro de a partir de 1 a 8. Em alguns exemplos, SP2 é inde- pendentemente em cada caso selecionado do grupo consistindo em C1-6 alquileno, -NH-, -C(O)-, (-CH2-CH2-O)e, -NH-CH2-CH2-(-O-CH2- CH2)e-C(O)-, -C(O)-(CH2)u-C(O)-, -C(O)-NH-(CH2)v- e combinações dos mesmos, em que o subscrito e é um inteiro de a partir de 0 a 4, o subscrito u é um inteiro de a partir de 1 a 8 e o subscrito v é um inteiro de a partir de 1 a 8.
[00295] Em certas modalidades, para Fórmulas (I), (IA), (IB), (IB-1), (IB-2), (IC), (ID), (IE), (III), (3000), (5001), (5002), (5003), (5004), (6001), (6002), (6003), (6004), (6005), (7001), (7002), (7003), (7004)
e/ou (7005), o ligador é selecionado de:
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
, ,
HO HO , ,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
e
.
[00296] Também incluídos nesses exemplos está um sal farmaceu- ticamente aceitável, solvato, forma estereoisomérica do mesmo, um regioisômero do mesmo ou mistura de regioisômeros do mesmo, em que cada e é uma ligação para o agente de ligação; e cada é uma ligação à carga útil.
[00297] Em certas modalidades, o ligador compreende um grupo hidrofílico terminal (HG). Em certas modalidades, o ligador compreen- de um grupo taurina. Em certas modalidades, o ligador compreende um grupo ácido sulfônico terminal. Em certas modalidades, o ligador provê um ADC de acordo com a Fórmula (II): (II) em que, na Fórmula (II), BA é um agente de ligação; LL é um ligador trivalente; RG1 e RG2 são resíduos de grupo reativo; SP1 e SP2 estão independentemente, em cada caso, ausentes, ou são um resíduo de grupo espaçador; HG é um resíduo hidrofílico; PA é um resíduo de carga útil; o subscrito n é um inteiro de a partir de 1 a 30; e o subscrito q é 0 ou 1. Em alguns casos mais de um ligador trivalente LL pode estar presente. Em alguns casos, n é um inteiro de a partir de 1 a 4. Em alguns casos n é 1. Em alguns casos n é 2.Em alguns casos n é
3. Em alguns casos n é 4. Em alguns casos, HG é um grupo hidrofílico terminal. Em alguns casos, HG compreende um grupo ácido sulfônico terminal ou um sal do mesmo. Em outros casos, HG compreende mais de um grupo ácido sulfônico terminal ou sais do mesmo. Em alguns casos, HG compreende um grupo ácido fosfônico terminal ou um sal do mesmo. Em outros casos, HG compreende mais de um grupo ácido fosfônico terminal ou sais do mesmo. Em alguns casos, HG compre- ende um grupo amina terciário terminal ou um sal do mesmo. Em ou- tros casos, HG compreende mais de um grupo amina terciário terminal ou sais do mesmo. Em alguns casos, HG compreende um poliol termi- nal (por exemplo, glicose, maltose) ou um derivado do mesmo. Em ou- tros casos, HG compreende mais de um terminal poliol (por exemplo, glicose, maltose) ou derivados do mesmo.
[00298] Em um outro exemplo, o composto de Fórmula (II) é de acordo com a Fórmula (IV): (IV).
[00299] Na Fórmula (IV), BA, RG1, SP1, RG2, SP2 e HG são como acima definido, AA1 é um ligador trivalente compreendendo um resí- duo de aminoácido; AA2 é um resíduo dipeptídico; e PAB é , em que o indica o átomo através do qual o PAB é ligado aos grupos adjacentes na fórmula; o subscrito p é 0 ou 1; e o subscrito q é 0 ou 1. Em alguns casos, o subscrito p é 0 e subscrito q é 0. Em alguns casos, o subscrito p é 1; e o subscrito q é 0. Em alguns casos, o subscrito p é 0; e o subscrito q é 1. Em alguns casos, o subs- crito p é 1; e o subscrito q é 1, Em alguns casos SP1 compreende de a partir de 0-5 resíduos de polietileno glicol (PEG). Em alguns casos SP2 compreende de a partir de 0-5 resíduos de PEG. Em alguns exemplos, SP1 é independentemente, em cada caso, selecionado do grupo consistindo em C1-6 alquileno, -NH-, -C(O)-, (-CH2-CH2-O)e, -NH- CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-, -C(O)-(CH2)u-C(O)-, -C(O)-NH-(CH2)v- e combinações dos mesmos, em que o subscrito e é um inteiro de a partir de 0 a 4, o subscrito u é um inteiro de a partir de 1 a 8 e o subs- crito v é um inteiro de a partir de 1 a 8. Em alguns exemplos, SP2 é independentemente, em cada caso, selecionado do grupo consistindo em C1-6 alquileno, -NH-, -C(O)-, (-CH2-CH2-O)e, -NH-CH2-CH2-(-O-CH2- CH2)e-C(O)-, -C(O)-(CH2)u-C(O)-, -C(O)-NH-(CH2)v- e combinações dos mesmos, em que o subscrito e é um inteiro de a partir de 0 a 4, o subscrito u é um inteiro de a partir de 1 a 8 e o subscrito v é um inteiro de a partir de 1 a 8. Em alguns exemplos, qualquer um de AA1 ou AA2 compreende, independentemente em cada caso, um aminoácido sele- cionado de alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, triptofano, fenilalanina, prolina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glu- tamina, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, arginina, histidina ou citrulina, um derivado dos mesmos ou uma combinação dos mesmos.
Em certas modalidades, AA1 é um aminoácido selecionado de alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, triptofano, fenilalanina, prolina, glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, arginina, histidina ou citrulina, um derivado dos mesmos ou uma combinação dos mesmos.
Em certas modalidades, AA1 é lisina.
Em certas modalidades, AA1 é lisina ou um derivado de lisina.
Em certas modalidades, AA1 é ácido glutâmico.
Em certas modalidades, o AA2 é valina-citrulina.
Em algumas modalidades, o AA2 é citrulina-valina.
Em algumas modalidades, o AA2 é valina- alanina.
Em algumas modalidades, o AA2 é alanina-valina.
Em algu- mas modalidades, o AA2 é valina-glicina.
Em algumas modalidades, o AA2 é glicina-valina.
Em algumas modalidades, o AA1-AA2 é glutami- na-valina-citrulina.
Em algumas modalidades, o AA1-AA2 é lisina-
valina-citrulina. Em algumas modalidades, o AA1-AA2 é lisina-valina- alanina. Em algumas modalidades, o AA1-AA2 é glutamina-valina- alanina. Em certas modalidades, a lisina é L-lisina. Em certas modali- dades, a lisina é D-lisina.
[00300] Em certas modalidades, para Fórmulas (I), (IA), (IB), (IB-1), (IB-2), (IC), (ID), (IE), (III), (3000), (5001), (5002), (5003), (5004), (6001), (6002), (6003), (6004), (6005), (7001), (7002), (7003), (7004) e/ou (7005), o ligador é selecionado de: , , e ,
ou uma forma estereoisomérica do mesmo ou um regioisômero do mesmo ou uma mistura de regioisômeros do mesmo, em que cada é uma ligação para o agente de ligação; e cada é uma ligação para o resíduo de carga útil.
[00301] Em alguns casos, a porção L-PA é ligada a um grupo reati- vo (RG) para formar RG-L-PA (por exemplo, cargas úteis de ligador mostradas na Tabela 3). Em alguns casos, BA (ou uma forma modifi- cada de BA, por exemplo, Ab modificado com PEG, como mostrado na Tabela 2, ou Ab1) reage com cargas úteis de ligador para formar os ADCs descritos na Tabela 1 na Tabela 2.Também compreendidos no escopo das modalidades apresentadas aqui estão ADCs preparados a partir de quaisquer cargas úteis de ligador descritas na Tabela 5A e na Tabela 5B. Ligadores cargas úteis
[00302] São providos aqui ligadores-esteroides de acordo com a Fórmula (2000), RG-L2-(L3)0-1-SP-D ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou estereoisômero dos mesmos; que são úteis na preparação de conjugados de anticorpo- fármaco, em que D é selecionado de a) Fórmula (a), onde ambos Rx na Fórmula (a) são hidrogênio; R34 é alquila, arila, ari- lalquila ou uma heterocicloalquila contendo N; e SP é -C(O)-C1-C10- alquileno-C(O)-, -C(O)-N(C1-6alquila)-C1-C10-alquileno-X1- onde X1 é ligado a (L3)0-1 na Fórmula (2000), -C(O)-N(H)-(C1-C10-alquileno)-S- onde S é ligado a (L3)0-1 na Fórmula (2000), -C(O)-N(C1-6alquila)-(C1- C10-alquileno)-S- onde S é ligado a (L3)0-1 na Fórmula (2000),
onde o ponto de ligação no lado direito (i.e. em N) é para (L3)0-1 na Fórmula (2000), -CH2-NH- onde N é ligado a (L3)0-1 na Fór-
mula (2000), onde o N é ligado a (L3)0-1 na Fórmula (2000) e onde Ar é arileno opcionalmente substituído (em algumas modalidades, ) ou heteroarileno opcionalmente substituído, - (C1-C10-alquileno)-NR50C(O)-(C1-C10-alquileno)-NR50a- onde NR50a é ligado a (L3)0-1 na Fórmula (2000), -C(O)-(C1-C10-alquileno)-NR50C(O)- (C1-C10-alquileno)-NR50a- onde NR50a é ligado a (L3)0-1 na Fórmula (2000) e onde cada C1-C10-alquileno é independentemente opcional- mente substituído com um ou mais hidróxi, -C(O)-N(R5)-C1-C10- alquileno-C(O)NH-X2- onde X2 é ligado a (L3)0-1 na Fórmula (2000)
ou onde X4 é ligado a (L3)0-1 na Fórmula (2000); ou onde ambos Rx na Fórmula (a) são flúor; R34 é alquila, arila, arilalquila ou uma heterocicloalquila contendo N; e SP é -C(O)-C1-C10- alquileno-C(O)-, -C(O)-N(C1-6alquila)-C1-C10-alquileno-X1b- onde X1b é ligado a (L3)0-1 na Fórmula (2000), -C(O)-N(H)-(C1-C10-alquileno)-X1b-
onde X1b é ligado a (L3)0-1 na Fórmula (2000), onde o ponto de ligação no lado direito (i.e. em N) é para (L3)0-1 na Fórmula (2000), -CH2-NH- onde N é ligado a (L3)0-1 na Fórmula (2000),
onde o N é ligado a (L3)0-1 na Fórmula (2000) e onde Ar é arileno opcionalmente substituído (em algumas modalidades,
) ou heteroarileno opcionalmente substituído, -(C1-C10- alquileno)-NR50C(O)-(C1-C10-alquileno)-NR50a- onde NR50a é ligado a (L3)0-1 na Fórmula (2000), -C(O)-(C1-C10-alquileno)-NR50C(O)-(C1-C10- alquileno)-NR50a- onde NR50a é ligado a (L3)0-1 na Fórmula (2000) e on- de cada C1-C10-alquileno é independentemente opcionalmente substi- tuído com um ou mais hidróxi, -C(O)-N(R5)-(C1-C10-alquileno)-C(O)NH- X2- onde X2 é ligado a (L3)0-1 na Fórmula (2000), ou onde X4 é ligado a (L3)0-1 na Fórmula (2000); e/ou b) os compostos na Tabela A acima, onde os compostos na Tabela A são ligados a RG do Composto de Fórmula (2000) através do hidróxido do grupo -C(O)CH2OH, i.e. através de -C(O)CH2-O-SP- (L3)0-1 -, ou através do hidróxi de Mapracorat, i.e. através de -O-SP- (L3)0-1 -: X1 é -N(C1-6alquila)-; X1b é -S-, -NH- ou -N(C1-6alquila)-; X2 é -NH-; X3 é -CH2-, X3 é -CH2-O-(C1-C10-alquileno)-C(O)- onde o C(O) é ligado a X4 ou X3 é -C(O)-; X34 é -O-; R35 é H, -OH, -OCH3 ou C1-6alquila;
R50 e R50a são independentemente hidrogênio ou C1-C6- alquila; Rd, Re e Rf são independentemente -H, -OH, hidroxialquila, alcoxicarbonila, -C(O)OH ou -CH2ORg, onde cada Rg é independente- mente -CH2C(O)OH ou -CH2C(O)O(alquila); e mm é 0 ou 1; RG é um resíduo de grupo reativo; L2 é um ligador de conexão; e L3, quando presente, é um grupo autoimolativo.
[00303] São providos aqui ligante-LXR-moduladores de acordo com a Fórmula (4000), RG-L-E Fórmula (4000) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou estereoisômero dos mesmos; que são úteis na preparação de conjugados de anticorpo- fármaco, em que E é selecionado de a) compostos de Fórmula (B) descritos acima e aqui; e/ou b) compostos de Fórmula (B-1) descritos acima e aqui; e/ou c) cargas úteis descritas na Tabela C aqui; L é um ligador descrito aqui; e RG é qualquer resíduo de grupo reativo descrito aqui.
[00304] Em algumas modalidades, a carga útil LXR é . Em algumas modalidades, a carga útil LXR é .
[00305] Em algumas modalidades, ligador-carga útil de Fórmula (4000) têm as estruturas de Fórmula (4001), (4002), (4003) ou (4004): Fórmula (4001) Fórmula (4002) Fórmula (4003) ou
Fórmula (4004) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou estereoisômero do mesmo; em que SP1 e SP2, quando presentes, são grupos espaça- dores como aqui definido em algumas e quaisquer modalidades; cada AA é um resíduo de aminoácido; p é um inteiro de a partir de 1 a 10; RG é um resíduo de grupo reativo; e RB1, RB2, R7 e b são como aqui definido em alguma ou quaisquer modalidades.
[00306] Em algumas modalidades, ligador-cargas úteis de Fórmula (4000), (4001), (4002), (4003) ou (4004) são selecionadas de cargas úteis de ligante na Tabela 3.
[00307] São providos aqui ligador-análogos de rifamicina de acordo com a Fórmula (7000), RG-L-F Fórmula (7000) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou estereoisômero dos mesmos; em que F é um análogo de rifamicina; L é um ligador descrito aqui; e RG é qualquer resíduo de grupo reativo descrito aqui.
[00308] Em algumas modalidades, F é um análogo de rifamicina descrito aqui. Em algumas modalidades, F é rifálogo:
. Em algumas modalidades, F é ri- fampicina: .
[00309] É também provida aqui uma carga útil de ligador de acordo com a Fórmula (D): Fórmula (D).
[00310] São providos aqui ligador-esteroides em que o esteroide conjugado ao anticorpo, ou fragmento de ligação a antígeno do mes- mo, através de um ligador ou um ligador-espaçador é um composto de Fórmula (A-1) Fórmula (A-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoiso-
mérica do mesmo; em que R1 e R2 são, independentemente, -H, alquila, alquila-C(O)- O-, -OH ou halo; ou R1 e R2 juntos formam , em que R4 é alquila, arila, arilalquila ou uma heterocicloal- quila contendo N, em que a alquila, arila, arilalquila e Heterocicloalquila con- tendo N são, independentemente em cada caso, opcionalmente substi- tuídos com -NRAaRAb; R3 é -O, RZ-C(O)-X-, -heteroalquila, -piperidinila, -NRAaRAb, -oxiaril-NRAaRAb ou -Z-A'(RP)t; RZ é alquila; X é O ou NRAa; Z é S, S(O), S(O)2, SO2NRAa, O, C(O)NRAa, C(O) ou NRAa; A' é arila, arilalquila ou heteroarila; RP é, independentemente em cada caso, halo, alquila opci- onalmente substituída, -OH ou -NRAaRAb; RAa e RAb são, independentemente em cada caso, -H, alqui- la opcionalmente substituída ou arila opcionalmente substituída; o subscrito a é um inteiro de a partir de 0-19; e t é um inteiro de a partir de 1-3; e R5A eR5B são, cada um, independentemente, halo ou um átomo de hidrogênio; em que o grupo R3 ou R4 é ligado ao ligante.
[00311] São providos aqui conjugados de anticorpo-fármaco de Fórmula Ab-L'-SP-D ou BA-L'-SP-D, onde D é um profármaco de bu- denosida ou um profármaco de um análogo ou derivado de budenosi- da (incluindo análogos e derivados fluorados), e onde Ab, BA, L' e SP são como definido em qualquer modalidade descrita aqui. Em algumas modalidades, SP é uma porção capaz de liberar D ou . Em algumas modalidades, sob condi- ções fisiológicas a condição entre L e SP é Clivada para liberar um profármaco esteroide, i.e. H-SP-D ou e a ligação entre SP e D ou entre SP e , é Subsequentemente clivada para liberar um esteroide biologicamente ativo.
[00312] Em alguns casos, ADCs de Fórmula (I), (IA), (IB), (IB-1), (IB-2), (IC), (ID), (IE), (III) ou (3000), são ADCs descritos na Tabela 1 e/ou Tabela 2 e na seção de Exemplos. Em algumas modalidades, a carga útil de esteroide em qualquer conjugado de anticorpo-fármaco descrito aqui é ou ou um sal farmaceutica- mente aceitável, solvato ou estereoisômero dos mesmos.
[00313] São providos aqui conjugados de anticorpo-fármaco de qualquer um dos compostos moduladores de LXR descritos aqui de
Fórmula (5001), (5002), (5003) ou (5004):
Fórmula (5001)
Fórmula (5002)
Fórmula (5003) ou
Fórmula (5004) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisoméri- ca do mesmo ou regioisômero do mesmo ou suas misturas; em que L é qualquer ligante descrito aqui em alguma ou quaisquer modalidades;
n é um inteiro de a partir de 1 a 30; BA é um agente de ligação ou um agente de ligação modi- ficado com PEG; e RB1, RB2, R7 e b são como aqui definido em alguma ou quaisquer modalidades.
[00314] São providos aqui conjugados de anticorpo-fármaco de qualquer um dos compostos moduladores de LXR descritos aqui de Fórmula (6001), (6002), (6003) ou (6004): Fórmula (6001) Fórmula (6002) Fórmula (6003) ou
Fórmula (6004) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisoméri- ca do mesmo ou regioisômero do mesmo ou suas misturas; em que SP1 e SP, quando presente, são grupos espaçado- res como aqui definido em algumas e quaisquer modalidades; cada AA é um resíduo de aminoácido; p é um inteiro de a partir de 1 a 10; n é um inteiro de a partir de 1 a 30; BA é um agente de ligação ou um agente de ligação modi- ficado com PEG; e RB1, RB2, R7 e b são como aqui definido em alguma ou quaisquer modalidades.
[00315] São providos aqui conjugados de anticorpo-fármaco de qualquer um dos compostos moduladores de LXR descritos aqui de Fórmula (6005): Fórmula (6005) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisoméri- ca do mesmo ou regioisômero do mesmo ou suas misturas; em que RB1, RB2, R7, b, BA, RG1, SP1, AA1 e AA2 são como aqui definido em alguma ou quaisquer modalidades.
[00316] Em alguns casos, ADCs de Fórmula (I), (IA), (IB), (IB-1), (IB-2), (IC), (ID), (IE), (5001), (5002), (5003), (5004), (6001), (6002), (6003), (6004) ou (6005) são ADCs descritos na Tabela 1 e/ou Tabela 2 e na seção de Exemplos. Em algumas modalidades, a carga útil de modulador de LXR em qualquer conjugado de anticorpo-fármaco des- crito aqui é ou ; ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo.
[00317] São providos aqui conjugados de anticorpo-fármaco de quaisquer análogos de rifamicina descritos aqui e tendo a estrutura de Fórmula (7001) Fórmula (7001) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisoméri- ca dos mesmos ou regioisômero dos mesmos ou suas misturas; em que: X1c é selecionado de -S-; -O- e -NR5c; R1c é amino-C1-6alquila; C1-6alquilaminoC1-6alquila; di-C1-
6alquilaminoC1-6alquila; hidroxi-C1-6alquila; HS-C1-6alquila; (R5c)2N-C1- 5c 6alquileno-N(R )-C1-6alquila; (R5c)2N-C1-6alquileno-O-C1-6alquila; (R5c)2N-C1-6alquileno-S-C1-6alquila; heterocicloalquila ou heterocicloal- quil-C1-6alquila; em que a heterocicloalquila inclui um, dois ou três he- teroátomos selecionados de O, N e S; e em que heterocicloalquila é opcionalmente substituída com halo, C1-6alquila, -OH ou =O; R2c, R3c e R4c são independentemente selecionados de hi- drogênio, C1-6alquila e -(C=O)-R5c; cada Rac, quando presente, é independentemente selecio- nado de -F; -Cl; -Br; -I; -OH; -NH2; e C1-6alcóxi; e R5c é independentemente, em cada ocorrência, selecionado de hidrogênio; e C1-6alquila; L é um ligador; BA é um agente de ligação; e o subscrito n é um inteiro de a partir de 1 a 30.
[00318] São providos aqui conjugados de anticorpo-fármaco de quaisquer análogos de rifamicina descritos aqui e tendo a estrutura de Fórmula (7002): Fórmula (7002); ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisoméri- ca dos mesmos ou regioisômero dos mesmos ou suas misturas; em que BA, RG1, SP1, AA1, AA2, R1c, Rbc, Rac, X1c, R2c,
R3c, R4c e n são como aqui definido em alguma ou quaisquer modali- dades.
[00319] São providos aqui conjugados de anticorpo-análogo de ri- famicina tendo a estrutura de Fórmula (7003): Fórmula (7003) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisoméri- ca dos mesmos ou regioisômero dos mesmo ou suas misturas; em que: X1c é selecionado de -S-; -O- e c; R1c é , ; ou ; em que Y é C ou N; R2c, R3c e R4c são independentemente selecionados de hi- drogênio, C1-6alquila e -(C=O)-R5c; R5c está independentemente, em cada ocorrência, ausente ou é selecionado de hidrogênio; e C1-6alquila; cada AA é um aminoácido independentemente seleciona- do; SP1 está ausente ou é um espaçador; RG1 é um resíduo de grupo reativo; BA é um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo; o subscrito n é um inteiro de a partir de 1 a 30; o subscrito w é 2, 3 ou 4; em que R1c é ligado ao ligante por meio de um átomo de nitrogênio como indicado pela linha ondulada .
[00320] Em várias modalidades de Fórmula (7003), SP1, RG1 e AA são como aqui definido em algumas e/ou quaisquer modalidades parti- culares.
[00321] Em algumas modalidades de Fórmula (7003), X1c é O. Em algumas modalidades de Fórmula (7003), X1c é S. Em algumas moda- lidades de Fórmula (7003), X1c é NR5c.
[00322] Em algumas modalidades de Fórmula (7003), BA é um an- ticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo; compreendendo uma mutação N297Q.
[00323] Em algumas modalidades de Fórmula (7003), o subscrito w é 2.
[00324] Em algumas modalidades de Fórmula (7003), (AA)2 é vali- na-citrulina.
[00325] Em algumas modalidades de Fórmula (7003), SP1 compre- ende . Em algumas modalidades de Fórmula (7003), SP1 compreende .
[00326] Em algumas modalidades de Fórmula (7003), RG1 compre- ende .
[00327] Em algumas modalidades de Fórmula (7003), X1c é O;
R1c é , ; ou ; em que Y é C ou N; em que R1c é ligado ao ligante por meio do átomo de nitrogênio quaternário de R1c; R5c é C1-6alquila; e R6c é um contraíon.
[00328] Em algumas de tais modalidades, R1c é ou . Em algumas de tais modalidades, R1c é .
Em algumas de tais modalidades, R1c é . Em algumas de tais modalidades, R6c é I-, Cl- ou Br- e Em alguns casos, R6c é I-.
[00329] Em algumas modalidades de Fórmula (7003), o análogo de rifamicina é: ou . Em algumas modalidades de
Fórmula (7003), o análogo de rifamicina é: . Em algumas modalidades de Fórmula (7003), o análogo de rifamicina é: .
[00330] É ainda provido aqui um conjugado de anticorpo-fármaco compreendendo um composto rifamicina (por exemplo, rifampicina), de acordo com a Fórmula (7004):
O O O OMe HO OAc
OH OH Ab OH
O N N HN HO O H O N+ O
N N N N O H O H
NH O NH2 Fórmula (7004).
[00331] É ainda provido aqui um conjugado de anticorpo-fármaco compreendendo um composto rifamicina (por exemplo, rifampicina), de acordo com a Fórmula (7005):
O O O OMe HO OAc
OH OH OH
BA L N N HN HO N+ O n Fórmula (7005) em que L e BA são como aqui definido em alguma ou quaisquer mo- dalidades.
[00332] Em alguns casos, ADCs de Fórmula (I), (IA), (IB), (IB-1), (IB-2), (IC), (ID), (IE), (7001) (7002), (7003), (7004) e/ou (7005) são ADCs descritos na Tabela 2 e/ou na seção de Exemplos.
[00333] Também estão incluídos nesses exemplos de ADCs um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisomérica do mesmo, um regioisômero do mesmo ou mistura de regioisômero dos mesmos, em que cada é uma ligação para o agente de ligação; e cada é uma ligação à carga útil.
[00334] Em certas modalidades, é provido aqui um ADC compreen- dendo um anticorpo anti-MSR1 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou um anticorpo anti-MSR1 modificado com PEG ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, descrito aqui e uma carga útil de ligador (LP) selecionada do grupo consistindo nas cargas úteis de ligador na Tabela 3 ou uma forma estereoisomérica da mesma ou um regioisômero da mesmo ou uma mistura de regioisômeros da mesma ou uma mistura de regioisômeros da mesma.
[00335] São também providos aqui conjugados de anticorpo- radionuclídeo (ARCs) compreendendo anticorpos anti-MSR1 conjuga- dos a um ou mais radionuclídeos. Radionuclídeos exemplares que po- dem ser usados no contexto deste aspecto da descrição incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, Ac, Bi, Bi, I, Re, Th, 222 Rn, 223Ra, 224Ra e 90Y.
Tabela 1: lista de ADCs e suas estruturas
,
,
,
,
,
,
,
,
O H O H O O O H H H N O O N N N N O O N N N OH O H O H H N O N HN
O H O Ab O N N O O N
N O O S
O HO O n , , , , , ,
,
O OH Ab
O N H H N O O O O N N OH H N N N O O N H H H N O O N N O O O O H H O H
O n
N
H NH2 , , , , ,
,
,
,
,
,
,
, , e ,
[00336] Nos ADCs da Tabela 1, Ab é um anticorpo anti-MSR1 pro- vido aqui, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em mo- dalidades particulares, Ab é modificado com um grupo de PEG em uma cadeia lateral de glutamina descrita aqui (referi- do aqui como anticorpo modificado com PEG). Em certas modalida- des, o grupo de PEG termina com um grupo azido, facilitando a reação com cargas úteis de ligador descritas aqui (por exemplo, cargas úteis de ligador descritas na Tabela 3 e nos exemplos). Em certas modali- dades, o grupo de PEG é ligado a uma carga útil de ligador através de um triazol ou derivado de triazol como aqui descrito. Nos ADCs, n é um inteiro de a partir de 1 a 10, por exemplo, 1, 2, 3, ou 4, No grupo de PEG, nn é um inteiro de a partir de 1-10, por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5. Em outras modalidades, cada BA nos ADCs na Tabela 1 é onde Ab1 é um anticorpo anti-MSR1 ou um frag- mento de ligação a antígeno do mesmo; R é C2-4-alquileno; e nn é um inteiro selecionado de 2 a 4, inclusive, e cada n é um inteiro de a partir de 1 a 10, por exemplo, 1, 2, 3 ou 4.
[00337] Em certas modalidades, é provido aqui um ADC compreen- dendo um anticorpo descrito aqui e uma carga útil de ligador (LP) se- lecionada do grupo consistindo nas cargas úteis de ligador na Tabela 2 ou uma forma estereoisomérica da mesma ou um regioisômero da mesma ou uma mistura de regioisômeros da mesma.
Tabela 2: lista de ADCs e suas estruturas e
.
,
ou uma mistura dos mesmos;
ou um estereoisômero ou uma mistura de estereoisômeros dos mes- mos;
,
ou uma mistura dos mesmos;
ou um estereoisômero ou mistura de estereoisômeros dos mesmos;
ou um estereoisômero ou mistura de estereoisômeros dos mesmos;
ou uma mistura dos mesmos onde L1A é um resíduo de grupo reativo compreen- dendo um porção triazol ou uma mistura dos mesmos ou um estereoisômero ou mistura de estereoisômeros dos mesmos;
ou uma mistura dos mesmos;
ou uma mistura dos mesmos;
ou uma mistura dos mesmos;
ou uma mistura dos mesmos;
ou uma mistura dos mesmos;
ou uma mistura dos mesmos;
ou uma mistura dos mesmos;
,
ou uma mistura dos mesmos;
[00338] Nos ADCs na Tabela 2, Ab é um anticorpo anti-MSR1 pro- vido aqui ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em mo- dalidades particulares, Ab é modificado com um grupo de PEG em uma cadeia lateral da glutamina como descrito aqui. Nos ADCs, n é um inteiro de a partir de 1 a 10, por exemplo, 1, 2, 3 ou 4.
[00339] É provido aqui um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, conjugado à carga útil ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoisomérica do mesmo. Em algumas modalidades, o anti- corpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo com- preende uma mutação N297Q.
[00340] É provido aqui um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, o qual compreende um conjunto de seis regiões de determinação de complementaridade (CDRs) (HCDR1,
HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3) da Tabela 4 e conjugado à carga útil ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoisomérica do mesmo. Em algumas modalida- des, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende um conjunto de seis regiões de determinação de complementaridade (CDRs) (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3) da Tabela 4 e uma mutação N297Q.
[00341] É provido aqui um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, compreendendo uma região de deter- minação de complementaridade de cadeia pesada (HCDR)-1 compre- endendo SEQ ID NO: 52; uma HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 54; uma HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 56; uma região de de- terminação de complementaridade de cadeia leve (LCDR)-1 compre- endendo SEQ ID NO: 60; uma LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 62; e uma LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 64 e conjugado à car- ga útil ou sal farmaceuticamente aceitável, sol- vato ou forma estereoisomérica do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada (HCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 52; uma
HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 54; uma HCDR3 compreenden- do SEQ ID NO: 56; uma região de determinação de complementarida- de de cadeia leve (LCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 60; uma LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 62; e uma LCDR3 compreen- dendo SEQ ID NO: 64 e uma mutação N297Q.
[00342] É provido aqui um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo um conjunto de regiões variáveis de cadeia pesada (HCVR) de regiões variáveis e um conjun- to de regiões variáveis de cadeia leve (LCVR) da Tabela 4 e conjuga- do à carga útil ou sal farmaceuticamente acei- tável, solvato ou forma estereoisomérica do mesmo. Em algumas mo- dalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende um conjunto de regiões variáveis de cadeia pesada (HCVR) de regiões variáveis e um conjunto de regiões variá- veis de cadeia leve (LCVR) da Tabela 4 e uma mutação N297Q.
[00343] É provido aqui um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo SEQ ID NO: 50 e uma região variável de cadeia leve (LCVR) SEQ ID NO: 58 e conjugado à carga útil ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoisomérica do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compre- endendo SEQ ID NO: 50 e uma região variável de cadeia leve (LCVR) SEQ ID NO: 58 e uma mutação N297Q.
[00344] Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) de acordo com as fórmulas: e/ou ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisomérica ou regioisômero do mesmo ou suas misturas; em que o anticorpo é um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas de tais modalidades, a razão de fármaco para anticorpo (DAR) é de a partir de 1-4. Em algumas modalidades, a DAR é 1. Em algumas modalidades, a DAR é 2. Em algumas modalidades, a DAR é
3. Em algumas modalidades, a DAR é 4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma mutação N297Q.
[00345] Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) de acordo com as fórmulas:
e/ou ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisomérica ou regioisômero do mesmo ou suas misturas; em que o anticorpo é um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, o qual compreende um conjunto de seis regiões de determinação de complementaridade (CDRs) (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3) da Tabela 4. Em algumas de tais modalidades, a ra- zão de fármaco para anticorpo (DAR) é de a partir de 1-4. Em algumas modalidades, a DAR é 1. Em algumas modalidades, a DAR é 2. Em algumas modalidades, a DAR é 3. Em algumas modalidades, a DAR é
4.Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende um conjunto de seis regi- ões de determinação de complementaridade (CDRs) (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3) da Tabela 4 e uma muta- ção N297Q.
[00346] Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) de acordo com as fórmulas:
e/ou ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisomérica ou regioisômero do mesmo ou suas misturas; em que o anticorpo é um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada (HCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 52; uma HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 54; uma HCDR3 compreenden- do SEQ ID NO: 56; uma região de determinação de complementarida- de de cadeia leve (LCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 60; uma LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 62; e uma LCDR3 compreen- dendo SEQ ID NO: 64. Em algumas de tais modalidades, a razão de fármaco para anticorpo (DAR) é de a partir de 1-4. Em algumas moda- lidades, a DAR é 1. Em algumas modalidades, a DAR é 2. Em algu- mas modalidades, a DAR é 3. Em algumas modalidades, a DAR é 4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de li- gação a antígeno do mesmo compreende uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada (HCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 52; uma HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 54; uma HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 56; uma região de determinação de complementaridade de cadeia leve (LCDR)-1 compreendendo SEQ
ID NO: 60; uma LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 62; e uma LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 64 e uma mutação N297Q.
[00347] Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) de acordo com as fórmulas: e/ou ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisomérica ou regioisômero do mesmo ou suas misturas; em que o anticorpo é um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo um conjunto de regiões variáveis de cadeia pesada (HCVR) de regiões variáveis e um conjunto de regiões variáveis de cadeia leve (LCVR) da Tabela 4. Em algumas de tais modalidades, a razão de fármaco para anticorpo (DAR) é de a partir de 1-4. Em algu- mas modalidades, a DAR é 1. Em algumas modalidades, a DAR é 2. Em algumas modalidades, a DAR é 3. Em algumas modalidades, a DAR é 4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo compreende um conjunto de regiões variáveis de cadeia pesada (HCVR) de regiões variáveis e um conjunto de regiões variáveis de cadeia leve (LCVR) da Tabela 4 e uma mutação N297Q.
[00348] Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) de acordo com as fórmulas:
e/ou ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisomérica ou regioisômero do mesmo ou suas misturas; em que o anticorpo é um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (HCVR) com- preendendo SEQ ID NO: 50 e uma região variável de cadeia leve (LCVR) SEQ ID NO: 58. Em algumas de tais modalidades, a razão de fármaco para anticorpo (DAR) é de a partir de 1-4. Em algumas moda- lidades, a DAR é 1. Em algumas modalidades, a DAR é 2. Em algu- mas modalidades, a DAR é 3. Em algumas modalidades, a DAR é 4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de li- gação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de ca- deia pesada (HCVR) compreendendo SEQ ID NO: 50 e uma região variável de cadeia leve (LCVR) SEQ ID NO: 58 e uma mutação N297Q.
[00349] É provido aqui um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo conjugado à carga útil ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoisomérica do mesmo.
[00350] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma mutação N297Q.
[00351] É provido aqui um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, o qual compreende um conjunto de seis regiões de determinação de complementaridade (CDRs) (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3) da Tabela 4 e conjugado à carga útil ou sal farmaceuticamente aceitá- vel, solvato ou forma estereoisomérica do mesmo. Em algumas moda- lidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende um conjunto de seis regiões de determinação de complementaridade (CDRs) (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3) da Tabela 4 e uma mutação N297Q.
[00352] É provido aqui um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região de determi- nação de complementaridade de cadeia pesada (HCDR)-1 compreen- dendo SEQ ID NO: 52; uma HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 54; uma HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 56; uma região de determi- nação de complementaridade de cadeia leve (LCDR)-1 compreenden-
do SEQ ID NO: 60; uma LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 62; e uma LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 64 e conjugado à carga útil ou sal farmaceuticamente aceitável, sol- vato ou forma estereoisomérica do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada (HCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 52; uma HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 54; uma HCDR3 compreenden- do SEQ ID NO: 56; uma região de determinação de complementarida- de de cadeia leve (LCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 60; uma LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 62; e uma LCDR3 compreen- dendo SEQ ID NO: 64 e uma mutação N297Q.
[00353] É provido aqui um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo um conjunto de regiões variáveis de cadeia pesada (HCVR) de regiões variáveis e um conjun- to de regiões variáveis de cadeia leve (LCVR) da Tabela 4 e conjuga- do à carga útil ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoisomérica do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antí- geno do mesmo compreende um conjunto de regiões variáveis de ca- deia pesada (HCVR) de regiões variáveis e um conjunto de regiões variáveis de cadeia leve (LCVR) da Tabela 4 e uma mutação N297Q.
[00354] É provido aqui um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo SEQ ID NO: 50 e uma região variável de cadeia leve (LCVR) SEQ ID NO: 58 e conjugado à carga útil ou sal farmaceuticamente aceitável, sol- vato ou forma estereoisomérica do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compre- endendo SEQ ID NO: 50 e uma região variável de cadeia leve (LCVR) SEQ ID NO: 58 e uma mutação N297Q.
[00355] Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) de acordo com as fórmulas: e/ou ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisomérica ou regioisômero do mesmo ou suas misturas; em que o anticorpo é um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas de tais modalidades, a razão de fármaco para anticorpo (DAR) é de a partir de 1-4. Em algumas modalidades, a DAR é 1. Em algumas modalidades, a DAR é 2. Em algumas modalidades, a DAR é
3. Em algumas modalidades, a DAR é 4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma mutação N297Q.
[00356] Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) de acordo com as fórmulas:
e/ou ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisomérica ou regioisômero do mesmo ou suas misturas; em que o anticorpo é um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, o qual compreende um conjunto de seis regiões de determinação de complementaridade (CDRs) (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3) da Tabela 4. Em algumas de tais modalidades, a ra- zão de fármaco para anticorpo (DAR) é de a partir de 1-4. Em algumas modalidades, a DAR é 1. Em algumas modalidades, a DAR é 2. Em algumas modalidades, a DAR é 3.Em algumas modalidades, a DAR é
4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende um conjunto de seis regi- ões de determinação de complementaridade (CDRs) (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3) da Tabela 4 e uma muta- ção N297Q.
[00357] Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) de acordo com as fórmulas: e/ou ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisomérica ou regioisômero do mesmo ou suas misturas; em que o anticorpo é um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada (HCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 52; uma HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 54; uma HCDR3 compreenden- do SEQ ID NO: 56; uma região de determinação de complementarida- de de cadeia leve (LCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 60; uma LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 62; e uma LCDR3 compreen- dendo SEQ ID NO: 64. Em algumas de tais modalidades, a razão de fármaco para anticorpo (DAR) é de a partir de 1-4. Em algumas moda- lidades, a DAR é 1. Em algumas modalidades, a DAR é 2. Em algu- mas modalidades, a DAR é 3. Em algumas modalidades, a DAR é 4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de li- gação a antígeno do mesmo compreende uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada (HCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 52; uma HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 54; uma
HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 56; uma região de determinação de complementaridade de cadeia leve (LCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 60; uma LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 62; e uma LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 64 e uma mutação N297Q.
[00358] Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) de acordo com as fórmulas: e/ou ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisomérica ou regioisômero do mesmo ou suas misturas; em que o anticorpo é um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo um conjunto de regiões variáveis de cadeia pesada (HCVR) de regiões variáveis e um conjunto de regiões variáveis de cadeia leve (LCVR) da Tabela 4. Em algumas de tais modalidades, a razão de fármaco para anticorpo (DAR) é de a partir de 1-4. Em algu- mas modalidades, a DAR é 1. Em algumas modalidades, a DAR é 2. Em algumas modalidades, a DAR é 3. Em algumas modalidades, a DAR é 4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo compreende um conjunto de regiões variáveis de cadeia pesada (HCVR) de regiões variáveis e um conjunto de regiões variáveis de cadeia leve (LCVR) da Tabela 4 e uma mutação N297Q.
[00359] Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) de acordo com as fórmulas: e/ou ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisomérica ou regioisômero do mesmo ou suas misturas; em que o anticorpo é um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (HCVR) com- preendendo SEQ ID NO: 50 e uma região variável de cadeia leve (LCVR) SEQ ID NO: 58. Em algumas de tais modalidades, a razão de fármaco para anticorpo (DAR) é de a partir de 1-4. Em algumas moda- lidades, a DAR é 1. Em algumas modalidades, a DAR é 2. Em algu- mas modalidades, a DAR é 3. Em algumas modalidades, a DAR é 4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de li- gação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de ca- deia pesada (HCVR) compreendendo SEQ ID NO: 50 e uma região variável de cadeia leve (LCVR) SEQ ID NO: 58 e uma mutação N297Q.
[00360] É provido aqui um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo conjugado à carga útil ou sal farmaceuticamente aceitável, sol- vato ou forma estereoisomérica do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma mutação N297Q.
[00361] É provido aqui um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, o qual compreende um conjunto de seis regiões de determinação de complementaridade (CDRs) (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3) da Tabela 4 e conjugado à carga útil ou sal farmaceuticamente acei- tável, solvato ou forma estereoisomérica do mesmo. Em algumas mo- dalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende um conjunto de seis regiões de determinação de complementaridade (CDRs) (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3) da Tabela 4 e uma mutação N297Q.
[00362] É provido aqui um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região de determi- nação de complementaridade de cadeia pesada (HCDR)-1 compreen- dendo SEQ ID NO: 52; uma HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 54; uma HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 56; uma região de determi- nação de complementaridade de cadeia leve (LCDR)-1 compreenden-
do SEQ ID NO: 60; uma LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 62; e uma LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 64 e conjugado à carga útil ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoisomérica do mesmo. Em algumas modalida- des, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região de determinação de complementari- dade de cadeia pesada (HCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 52; uma HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 54; uma HCDR3 compre- endendo SEQ ID NO: 56; uma região de determinação de complemen- taridade de cadeia leve (LCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 60; uma LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 62; e uma LCDR3 compre- endendo SEQ ID NO: 64 e uma mutação N297Q.
[00363] É provido aqui um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo um conjunto de regiões variáveis de cadeia pesada (HCVR) de regiões variáveis e um conjun- to de regiões variáveis de cadeia leve (LCVR) da Tabela 4 e conjuga- do à carga útil ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoisomérica do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antí- geno do mesmo compreende um conjunto de regiões variáveis de ca-
deia pesada (HCVR) de regiões variáveis e um conjunto de regiões variáveis de cadeia leve (LCVR) da Tabela 4 e uma mutação N297Q.
[00364] É provido aqui um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo SEQ ID NO: 50 e uma região variável de cadeia leve (LCVR) SEQ ID NO: 58 e conjugado à carga útil ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoisomérica do mesmo. Em algumas modalida- des, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo SEQ ID NO: 50 e uma região variável de cadeia leve (LCVR) SEQ ID NO: 58 e uma mutação N297Q.
[00365] Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) de acordo com as fórmulas: e/ou ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisomérica ou regioisômero do mesmo ou suas misturas; em que o anticorpo é um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algumas de tais modalidades, a razão de fármaco para anticorpo (DAR) é de a partir de 1-4. Em algumas modalidades, a DAR é 1. Em algumas modalidades, a DAR é 2. Em algumas modalidades, a DAR é
3. Em algumas modalidades, a DAR é 4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma mutação N297Q.
[00366] Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) de acordo com as fórmulas: e/ou ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisomérica ou regioisômero do mesmo ou suas misturas; em que o anticorpo é um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, o qual compreende um conjunto de seis regiões de determinação de complementaridade (CDRs) (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3) da Tabela 4. Em algumas de tais modalidades, a ra- zão de fármaco para anticorpo (DAR) é de a partir de 1-4. Em algumas modalidades, a DAR é 1. Em algumas modalidades, a DAR é 2. Em algumas modalidades, a DAR é 3. Em algumas modalidades, a DAR é
4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende um conjunto de seis regi- ões de determinação de complementaridade (CDRs) (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3) da Tabela 4 e uma muta- ção N297Q.
[00367] Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) de acordo com as fórmulas:
e/ou ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisomérica ou regioisômero do mesmo ou suas misturas; em que o anticorpo é um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada (HCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 52; uma HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 54; uma HCDR3 compreenden- do SEQ ID NO: 56; uma região de determinação de complementarida- de de cadeia leve (LCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 60; uma LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 62; e uma LCDR3 compreen- dendo SEQ ID NO: 64. Em algumas de tais modalidades, a razão de fármaco para anticorpo (DAR) é de a partir de 1-4. Em algumas moda- lidades, a DAR é 1. Em algumas modalidades, a DAR é 2. Em algu- mas modalidades, a DAR é 3. Em algumas modalidades, a DAR é 4.
Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de li- gação a antígeno do mesmo compreende uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada (HCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 52; uma HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 54; uma HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 56; uma região de determinação de complementaridade de cadeia leve (LCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 60; uma LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 62; e uma LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 64 e uma mutação N297Q.
[00368] Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) de acordo com as fórmulas: e/ou ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisomérica ou regioisômero do mesmo ou suas misturas; em que o anticorpo é um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo um conjunto de regiões variáveis de cadeia pesada
(HCVR) de regiões variáveis e um conjunto de regiões variáveis de cadeia leve (LCVR) da Tabela 4. Em algumas de tais modalidades, a razão de fármaco para anticorpo (DAR) é de a partir de 1-4. Em algu- mas modalidades, a DAR é 1. Em algumas modalidades, a DAR é 2. Em algumas modalidades, a DAR é 3. Em algumas modalidades, a DAR é 4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo compreende um conjunto de regiões variáveis de cadeia pesada (HCVR) de regiões variáveis e um conjunto de regiões variáveis de cadeia leve (LCVR) da Tabela 4 e uma mutação N297Q.
[00369] Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) de acordo com as fórmulas: e/ou ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisomérica ou regioisômero do mesmo ou suas misturas; em que o anticorpo é um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (HCVR) com- preendendo SEQ ID NO: 50 e uma região variável de cadeia leve (LCVR) SEQ ID NO: 58. Em algumas de tais modalidades, a razão de fármaco para anticorpo (DAR) é de a partir de 1-4. Em algumas moda- lidades, a DAR é 1. Em algumas modalidades, a DAR é 2. Em algu- mas modalidades, a DAR é 3. Em algumas modalidades, a DAR é 4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de li- gação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de ca- deia pesada (HCVR) compreendendo SEQ ID NO: 50 e uma região variável de cadeia leve (LCVR) SEQ ID NO: 58 e uma mutação N297Q.
[00370] É provido aqui um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo conjugado à carga útil ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoisomérica do mesmo.
[00371] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou frag- mento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma mutação N297Q.
[00372] É provido aqui um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, o qual compreende um conjunto de seis regiões de determinação de complementaridade (CDRs) (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3) da Tabela 4 e conjugado à carga útil ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoisomérica do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antí- geno do mesmo compreende um conjunto de seis regiões de determi- nação de complementaridade (CDRs) (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3) da Tabela 4 e uma mutação N297Q.
[00373] É provido aqui um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região de determi- nação de complementaridade de cadeia pesada (HCDR)-1 compreen- dendo SEQ ID NO: 52; uma HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 54; uma HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 56; uma região de determi- nação de complementaridade de cadeia leve (LCDR)-1 compreenden- do SEQ ID NO: 60; uma LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 62; e uma LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 64 e conjugado à carga útil ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoisomérica do mesmo. Em algumas modalida- des, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região de determinação de complementari- dade de cadeia pesada (HCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 52; uma HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 54; uma HCDR3 compre- endendo SEQ ID NO: 56; uma região de determinação de complemen-
taridade de cadeia leve (LCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 60; uma LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 62; e uma LCDR3 compre- endendo SEQ ID NO: 64 e uma mutação N297Q.
[00374] É provido aqui um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo um conjunto de regiões variáveis de cadeia pesada (HCVR) de regiões variáveis e um conjun- to de regiões variáveis de cadeia leve (LCVR) da Tabela 4 e conjuga- do à carga útil ou sal farmaceuticamen- te aceitável, solvato ou forma estereoisomérica do mesmo. Em algu- mas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende um conjunto de regiões variáveis de cadeia pesada (HCVR) de regiões variáveis e um conjunto de regiões variáveis de cadeia leve (LCVR) da Tabela 4 e uma mutação N297Q.
[00375] É provido aqui um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo SEQ ID NO: 50 e uma região variável de cadeia leve (LCVR) SEQ ID NO: 58 e conjugado à carga útil ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoisomérica do mesmo. Em algumas modalida- des, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR)
compreendendo SEQ ID NO: 50 e uma região variável de cadeia leve (LCVR) SEQ ID NO: 58 e uma mutação N297Q.
[00376] Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) de acordo com a fórmula:
O OMe
O O OAc
N O OH H
O O O HO O O O H O N+ HN O O O O O N -
N N O O O O N N X
H H O H Ab O
NH O NH2 ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisomérica ou regioisômero do mesmo ou suas misturas; em que X- é um contraí- on farmaceuticamente aceitável e em que o anticorpo é um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Em algu- mas de tais modalidades, a razão de fármaco para anticorpo (DAR) é de a partir de 1-4. Em algumas modalidades, a DAR é 1. Em algumas modalidades, a DAR é 2. Em algumas modalidades, a DAR é 3. Em algumas modalidades, a DAR é 4. Em algumas modalidades, o anti- corpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo com- preende uma mutação N297Q.
[00377] Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) de acordo com a fórmula: ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisomérica ou regioisômero do mesmo ou suas misturas; em que X- é um contraí- on farmaceuticamente aceitável e em que o anticorpo é um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, o qual compreende um conjunto de seis regiões de determinação de com- plementaridade (CDRs) (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3) da Tabela 4. Em algumas de tais modalidades, a razão de fármaco para anticorpo (DAR) é de a partir de 1-4. Em algumas moda- lidades, a DAR é 1. Em algumas modalidades, a DAR é 2. Em algu- mas modalidades, a DAR é 3. Em algumas modalidades, a DAR é 4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de li- gação a antígeno do mesmo compreende um conjunto de seis regiões de determinação de complementaridade (CDRs) (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3) da Tabela 4 e uma mutação N297Q.
[00378] Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) de acordo com a fórmula: ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisomérica ou regioisômero do mesmo ou suas misturas; em que X- é um contraí- on farmaceuticamente aceitável e em que o anticorpo é um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreen- dendo uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada (HCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 52; uma HCDR2 com- preendendo SEQ ID NO: 54; uma HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 56; uma região de determinação de complementaridade de cadeia leve (LCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 60; uma LCDR2 compre- endendo SEQ ID NO: 62; e uma LCDR3 compreendendo SEQ ID NO:
64. Em algumas de tais modalidades, a razão de fármaco para anti- corpo (DAR) é de a partir de 1-4. Em algumas modalidades, a DAR é
1. Em algumas modalidades, a DAR é 2. Em algumas modalidades, a DAR é 3. Em algumas modalidades, a DAR é 4. Em algumas modali- dades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região de determinação de complementari- dade de cadeia pesada (HCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 52; uma HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 54; uma HCDR3 compre- endendo SEQ ID NO: 56; uma região de determinação de complemen- taridade de cadeia leve (LCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 60; uma LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 62; e uma LCDR3 compre- endendo SEQ ID NO: 64 e uma mutação N297Q.
[00379] Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) de acordo com a fórmula:
O OMe
O O OAc
N O OH H
O O O HO O O O H O N+ HN O O O O O N -
N N O O O O N N X
H H O H Ab O
NH O NH2 ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisomérica ou regioisômero do mesmo ou suas misturas; em que X- é um contraí- on farmaceuticamente aceitável e em que o anticorpo é um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreen- dendo um conjunto de regiões variáveis de cadeia pesada (HCVR) de regiões variáveis e um conjunto de regiões variáveis de cadeia leve (LCVR) da Tabela 4. Em algumas de tais modalidades, a razão de fármaco para anticorpo (DAR) é de a partir de 1-4. Em algumas moda- lidades, a DAR é 1. Em algumas modalidades, a DAR é 2. Em algu- mas modalidades, a DAR é 3. Em algumas modalidades, a DAR é 4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de li- gação a antígeno do mesmo compreende um conjunto de regiões va- riáveis de cadeia pesada (HCVR) de regiões variáveis e um conjunto de regiões variáveis de cadeia leve (LCVR) da Tabela 4 e uma muta- ção N297Q.
[00380] Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) de acordo com a fórmula: ou sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisomérica ou regioisômero do mesmo ou suas misturas; em que X- é um contraí- on farmaceuticamente aceitável e em que o anticorpo é um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreen- dendo uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo SEQ ID NO: 50 e uma região variável de cadeia leve (LCVR) SEQ ID NO: 58. Em algumas de tais modalidades, a razão de fármaco para anticorpo (DAR) é de a partir de 1-4. Em algumas modalidades, a DAR é 1. Em algumas modalidades, a DAR é 2. Em algumas modalidades, a DAR é 3. Em algumas modalidades, a DAR é 4. Em algumas moda- lidades, o anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo SEQ ID NO: 50; uma região variável de cadeia leve (LCVR) SEQ ID NO: 58; e uma mutação N297Q.
[00381] Como aqui usado, em certas modalidades, onde um ami- noácido é ligado ao espaçador SP1, por exemplo, em uma porção - SP1-AA1-AA2-, o aminoácido AA1 é ligado por meio de seu grupo ami- no ao espaçador SP1, O resíduo espaçador inclui porções de um grupo funcional que formou a ligação com um grupo amino no aminoácido. A título de exemplo apenas, na estrutura que segue:
, o resíduo valina é ligado a SP1 como mostrado, e o resíduo SP1, nesse exemplo, compreende uma porção (C=O). Também, nesse exemplo, o resíduo SP1 compreende um grupo funcional adequado para formação de uma ligação com o grupo reativo e o resíduo SP1 compreende uma porção -NH-. Aqueles de habilidade na técnica reconhecerão que agrupamentos similares podem se aplicar a todas as outras fórmulas descritas aqui.
[00382] Os conjugados de anticorpo-fármaco descritos aqui podem ser preparados usando condições de conjugação conhecidas daqueles de habilidade na técnica (vide, por exemplo, Doronina e outros, Nature Biotechnology 2003, 21, 7, 778, que é aqui incorporado a título de refe- rência em sua totalidade). Em algumas modalidades um ADC é prepa- rado contatando um anticorpo anti-MSR1 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo com um composto compreendendo o ligador e carga útil desejados, em que o dito ligador possui uma porção que é reativa com o anticorpo ou proteína de ligação a antígeno, por exem- plo, no resíduo desejado do anticorpo ou proteína de ligação a antíge- no. Condições exemplares são descritas nos Exemplos abaixo. Preparação de conjugados de anticorpo-fármaco
[00383] Em algumas modalidades, são providos aqui processos pa- ra preparação de um conjugado de anticorpo-fármaco compreendendo contato de um anticorpo anti-MSR1 ou um anticorpo anti-MSR1 modi- ficado com PEG ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo com ligador-carga útil ou um ligador-espaçador-carga útil selecionado da Tabela 3, É também provido aqui um conjugado de anticorpo- fármaco preparado através da conjugação de um anticorpo anti-MSR1 ou um anticorpo anti-MSR1 modificado com PEG, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com um ligador-carga útil ou um ligador- espaçador-carga útil ou uma forma estereoisomérica do mesmo ou um regioisômero do mesmo ou uma mistura de regioisômero do mesmo selecionado da Tabela 3, Tabela 3: lista de ligador-cargas úteis (LPs) e suas estruturas
LP1
LP2
LP5
LP6
LP18
LP4
LP11
LP9
LP12
LP3
LP13 LP14 LP15
O H O O O H H O O O O
H 2a N N O
N N O H H H O HO O
O N NH 2
H O H O O H H O O O O O
H 2b N
N H O O O O N H N N H O H O O HO O
NH O NH 2 2f H HH
O O O O O O O H O OH N O O H O O N N H N O H
NH O NH 2 2g
O O O O H O N O O O N N O
H 2j N N
H O H O H H N N O H H H O HO
NH O NH 2 O O NH 2
NH O O H H N N O
N N O 2k O
H O O N O H N O H O O O H HO
O 2l
H HH O O O O N O H O O O O N O OH H H N N O N N N H H O O
O O N NH 2
H
HN O HO 2m O OHO
O OH OH O N HO O OH O OH HO N O N N O OH OH HO O O HO OH OH OHO O HO O
OH 2n ou uma mistura dos mesmos
O HH H O O O O H
H OH 2q N N O O O
N O O H O O
O N NH2 H . LP1A
F LP2A H HH
O O O O F N O O O H O O N O OH N O O N O N O O N N O H H O H
NH O NH2
LP3A LP4A LP5A
O O H O O O H N S H O S N O H F O O F HO
O LP6A LP7A LP8A LP9A
LP10A
LP11A
LP12A
LP13A
LP18A
LP19A
LP20A
LP21A
LP22A
LP23A
LP24A
LP25A
LP26A
LP27A
LP28A
LP29A
LP30A
LP31A
LP1B
LP2B
LP3B
LP4B
LP5B
LP6B
LP7B
LP8B
LP9B
LP10B
LP11B
LP12B
R20 e R25 .
[00384] Os compostos nas tabelas acima podem ser preparados como descrito nos presentes Exemplos.
[00385] É também provido aqui um método de preparado de um conjugado de anticorpo-fármaco de um análogo de rifamicina (por exemplo, rifampicina), compreendendo a etapa de contato de um anti- corpo anti-MSR1, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com um ligador-carga útil de acordo com a Fórmula (D): Fórmula (D). sob condições adequadas para formação de uma ligação entre anti- corpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Mapeamento de Epitopo e Tecnologias Relacionadas
[00386] O epitopo ao qual os anticorpos da presente invenção se ligam pode consistir em uma sequência contígua única de 3 ou mais (por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais) aminoácidos de uma proteína MSR1. Alternativamente, o epitopo pode consistir em uma pluralidade de aminoácidos não contí- guos (ou sequências de aminoácido) de MSR1. Em algumas modali- dades, o epitopo está localizado no ou próximo do domínio de ligação à LDL modificado de MSR1. Em outras modalidades, o epitopo está localizado fora do domínio de ligação à LDL modificado de MSR1, por exemplo, em um local na superfície de MSR1 na qual um anticorpo, quando ligado a tal epitopo, não interfere com ligação modificada por LDL a MSR1.
[00387] Várias técnicas conhecidas de versados de habilidade co- mum no campo podem ser usadas para determinar se um anticorpo "interage com um ou mais aminoácidos" dentro de um polipeptídeo ou proteína. Técnicas exemplares incluem, por exemplo, ensaios de blo- queio cruzado de rotina tais como aquelas descritas Antibodies, Har- low and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), aná- lise mutacional de varredura de alanina, análise de blots de peptídeo (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463) e análise de clivagem de peptídeo. Ainda, métodos tais como excisão de epitopo, extração de epitopo e modificação química de antígenos podem ser emprega- dos (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Um outro método que pode ser usado para identificar os aminoácidos dentro de um polipep- tídeo com o qual um anticorpo interage é troca de hidrogênio/deutério detectada através de espectrometria de massa. Em termos gerais, o método de troca de hidrogênio/deutério envolve marcação com deuté- rio da proteína de interesse, seguido por ligação do anticorpo à proteí- na marcada com deutério. Em seguida, o complexo de proteí- na/anticorpo é transferido para água para permitir que troca de hidro- gênio-deutério ocorra em todos os resíduos exceto os resíduos prote-
gidos pelo anticorpo (que permanece marcado com deutério). Após dissociação do anticorpo, a proteína-alvo é submetida à clivagem por protease e análise de espectrometria de massa, dessa maneira reve- lando os resíduos marcados com deutério que correspondem aos ami- noácidos específicos com os quais o anticorpo interage. Vide, por exemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A.
[00388] As modalidades incluem anticorpos anti-MSR1 que se ligam ao mesmo epitopo que qualquer um dos anticorpos exemplares espe- cíficos descritos aqui (por exemplo, anticorpos compreendendo qual- quer uma das sequências de aminoácido como mostrado na Tabela 4 aqui). Da mesma maneira, modalidades incluem também anticorpos anti-MSR1 que competem por ligação a MSR1 com qualquer um dos anticorpos exemplares específicos descritos aqui (por exemplo, anti- corpos compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácido como mostrado na Tabela 4 aqui).
[00389] Uma pessoa pode determinar facilmente se um anticorpo se liga ao mesmo epitopo que, ou compete por ligação com, um anti- corpo anti-MSR1 de referência usando métodos de rotina conhecidos na técnica e exemplificados aqui no, por exemplo, Exemplo 7. Por exemplo, para determinar se um anticorpo de teste se liga ao mesmo epitopo que um anticorpo anti-MSR1 de referência descrito aqui, o an- ticorpo de referência é deixado se ligar a uma proteína MSR1. Em se- guida, a habilidade de um anticorpo de teste em se ligar à molécula MSR1 é avaliada. Se o anticorpo de teste for capaz de se ligar a MSR1 seguindo ligação de saturação com o anticorpo anti-MSR1 de referência, pode ser concluído que o anticorpo de teste se liga a um epitopo diferente do anticorpo anti-MSR1 de referência. Por outro lado, se o anticorpo de teste não for capaz de se ligar à molécula de MSR1 seguindo ligação de saturação com o anticorpo anti-MSR1 de referên-
cia, então o anticorpo de teste pode se ligar ao mesmo epitopo que o epitopo ligado pelo anticorpo anti-MSR1 de referência da invenção. Experimentação de rotina adicional (por exemplo, mutação peptídica e análises de ligação) pode então ser realizada para confirmar se a falta observada de ligação do anticorpo de teste é de fato devido à ligação ao mesmo epitopo que o anticorpo de referência ou se bloqueio estéri- co (ou um outro fenômeno) é responsável pela falta de ligação obser- vada. Experimentos desse tipo podem ser realizados usando ELISA, RIA, Biacore, citometria de fluxo ou qualquer outro ensaio de ligação de anticorpo quantitativo ou qualitativo disponível na técnica. De acor- do com certas modalidades da presente invenção, dois anticorpos se ligam ao mesmo epitopo (ou sobreposto) se, por exemplo, um excesso de 1, 5, 10, 20 ou 100 vezes de um anticorpo inibir ligação do outro em pelo menos 50%, mas preferivelmente 75%, 90% ou até mesmo 99% conforme medido em um ensaio de ligação competitivo (vide, por exemplo, Junghans e outros, Cancer Res. 1990:50:1495-1502). Alter- nativamente, dois anticorpos são considerados se ligar ao mesmo epi- topo se essencialmente todas as mutações de aminoácido no antígeno que reduzem ou eliminam ligação de um anticorpo reduzirem ou elimi- naram ligação do outro. Dois anticorpos são considerados ter "epito- pos sobrepostos" se apenas um subconjunto das mutações de amino- ácido que reduz ou elimina ligação de um anticorpo reduzir ou eliminar ligação do outro.
[00390] Para determinar se um anticorpo compete por ligação (ou compete cruzado por ligação) com um anticorpo anti-MSR1 de refe- rência, a metodologia de ligação descrita acima é realizada em duas orientações. Em uma primeira orientação, o anticorpo de referência é deixado se ligar a uma proteína MSR1 sob condições de saturação seguido por avaliação de ligação do anticorpo de teste à molécula de MSR1. Em uma segunda orientação, o anticorpo de teste é permitido se ligar a uma molécula de MSR1 sob condições de saturação seguido por avaliação de ligação do anticorpo de referência à molécula de MSR1. Se, em ambas as orientações, apenas o primeiro anticorpo (sa- turação) for capaz de se ligar à molécula de MSR1, então é concluido que o anticorpo de teste e o anticorpo de referência competem por li- gação a MSR1. Como será compreendido por um versado de habilida- de comum na técnica, um anticorpo que compete por ligação com um anticorpo de referência pode não necessariamente se ligar ao mesmo epitopo que o anticorpo de referência, mas pode bloquear esterica- mente ligação do anticorpo de referência através da ligação de um epi- topo sobreposto ou adjacente. Preparação de Anticorpos Humanos
[00391] Os anticorpos anti-MSR1 descritos aqui podem ser anticor- pos totalmente humanos. Métodos para geração de anticorpos mono- clonais, incluindo anticorpos monoclonais totalmente humanos, são conhecidos na técnica. Quaisquer tais métodos conhecidos podem ser usados no contexto da presente invenção para fazer anticorpos huma- nos que se ligam especificamente a MSR1 humano.
[00392] Usando tecnologia VELOCIMMUNE™, por exemplo, ou qualquer outro método conhecido similar para geração de anticorpos monoclonais totalmente humanos, anticorpos quiméricos de alta afini- dade para MSR1 são inicialmente isolados tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo. Como na seção ex- perimental abaixo, os anticorpos são caracterizados e selecionados quanto a características desejadas, incluindo afinidade, atividade de bloqueio de ligante, seletividade, epitopo, etc. Se necessário, regiões constantes de camundongo são substituídas com uma região constan- te humana desejada, por exemplo, IgG1 ou IgG4 do tipo selvagem ou modificada, para gerar um anticorpo anti-MSR1 totalmente humano. Embora a região constante selecionada possa variar de acordo com uso específico, características de ligação a antígeno de alta afinidade e especificidade do alvo residem na região variável. Em certos casos, anticorpos anti-MSR1 humanos são isolados diretamente das células B positivas para antígeno. Bioequivalentes
[00393] Os anticorpos anti-MSR1 e fragmentos de anticorpo descri- tos aqui compreendem proteínas tendo sequências de aminoácido que variam daquelas dos anticorpos descritos, mas que retêm a habilidade em se ligar a MSR1 humano. Tais anticorpos variantes e fragmentos de anticorpo compreendem uma ou mais adições, deleções ou substi- tuições de aminoácidos quando comparado com sequência parental, mas exibem atividade biológica que é essencialmente equivalente àquela dos anticorpos descritos. Da mesma maneira, as sequências de DNA de codificação de anticorpo anti-MSR1 descritas aqui compre- endem sequências que compreendem uma ou mais adições, deleções ou substituições de nucleotídeos quando comparado com a sequência descrita, mas que codificam um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de anticorpo que é essencialmente bioequivalente a um anticorpo anti- MSR1 ou fragmento de anticorpo descrito aqui. Exemplos de tais se- quências de aminoácido e DNA variantes são discutidos abaixo.
[00394] Duas proteínas de ligação a antígeno, ou anticorpos, são consideradas bioequivalentes se, por exemplo, elas foram equivalen- tes farmacêuticos ou alternativas farmacêuticas cujas taxa e grau de absorção não mostram uma diferença significante quando administra- das na mesma dose molar sob condições experimentais similares, ou dose única ou dose múltipla. Alguns anticorpos serão considerados equivalentes ou alternativas farmacêuticas se eles forem equivalentes no grau de sua absorção, mas não em sua taxa de absorção, e ainda podem ser considerados bioequivalentes porque tais diferenças na ta- xa de absorção são intencionais e são refletidas na marcação, não são essenciais para obter concentrações de fármaco no corpo eficazes sob, por exemplo, uso crônico, e são consideradas medicamente in- significantes para o produto de fármaco particular estudado.
[00395] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação a antígeno são bioequivalentes se não houver quaisquer diferenças clinicamente significantes em sua segurança, pureza e potência.
[00396] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação a antígeno são bioequivalentes se o paciente puder mudar uma ou mais vezes entre o produto de referência e o produto biológico sem um aumento esperado no risco de efeitos adversos, incluindo uma mudança clini- camente significante em imunogenicidade, ou eficácia diminuída, com- parado com terapia continuada sem tal mudança.
[00397] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação a antígeno são bioequivalentes se elas ambas agirem através de um mecanismo ou mecanismos de ação comuns para a condição ou condição de uso, até o ponto que tais mecanismos são conhecidos.
[00398] Bioequivalência pode ser demonstrada através de métodos in vivo e in vitro. Medidas de bioequivalência incluem, por exemplo, (a) um teste in vivo em humanos ou outros mamíferos, em que a concen- tração do anticorpo ou seus metabolitos é medida em sangue, plasma, soro ou outro fluido biológico como uma função de tempo; (b) um teste in vitro que foi correlacionado com e é razoavelmente previsível de da- dos de biodisponibilidade humanos in vivo; (c) um teste in vivo em hu- manos ou outros mamíferos em que o efeito farmacológico agudo apropriado do anticorpo (ou seu alvo) é medido como uma função de tempo; e (d) em um teste clínico bem controlado que estabelece segu- rança, eficácia ou biodisponibilidade ou bioequivalência de um anticor- po.
[00399] Variantes bioequivalentes de anticorpos anti-MSR1 descri- tos aqui podem ser construídas através de, por exemplo, realização de várias substituições de resíduos ou sequências ou deleção de resí- duos ou sequências terminais ou internos não necessários para ativi- dade biológica. Por exemplo, resíduos cisteína não essenciais para atividade biológica podem ser deletados ou substituídos com outros aminoácidos para evitar formação de pontes dissulfeto intramolecula- res desnecessárias ou incorretas quando da renaturação. Em outros contextos, anticorpos bioequivalentes podem incluir variantes de anti- corpo anti-MSR1 compreendendo mudanças de aminoácido que modi- ficam as características de glicosilação dos anticorpos, por exemplo, mutações que eliminam ou removem glicosilação. Seletividade de Espécies e Reatividade Cruzada de Espécies
[00400] De acordo com certas modalidades, são providos aqui anti- corpos anti-MSR1 que se ligam a MSR1 humano, mas não a MSR1 de outras espécies. As modalidades incluem também anticorpos anti- MSR1 que se ligam a MSR1 humano e a MSR1 de uma ou mais espé- cies não humanas. Por exemplo, os anticorpos anti-MSR1 descritos aqui podem se ligar a MSR1 humano e podem se ligar ou não ligar, conforme for o caso, a um ou mais de MSR1 de camundongo, rato, porquinho-da-índia, hamster, gerbil, porco, gato, cachorro, coelho, ca- bra, ovelha, vaca, cavalo, camelo, cynomolgus, sagui, rhesus ou chim- panzé. De acordo com certas modalidades exemplares, anticorpos an- ti-MSR1 são providos, os quais se ligam especificamente a MSR1 hu- mano e MSR1 de macaco cynomolgus (por exemplo, Macaca fascicu- laris). Outros anticorpos anti-MSR1 descritos aqui se ligam a MSR1 humano, mas não se ligam, ou se ligam apenas fracamente, a MSR de macaco cynomolgus. Anticorpos Multiespecíficos
[00401] Os anticorpos descritos aqui podem ser monoespecíficos ou multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos). Anticorpos multies- pecíficos podem ser específicos para epitopos diferentes de um poli-
peptídeo-alvo ou podem conter domínios de ligação a antígeno especí- ficos para mais de um polipeptídeo-alvo. Vide, por exemplo, Tutt e ou- tros, 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer e outros, 2004, Trends Bio- technol. 22:238-244. Os anticorpos anti-MSR1 descritos aqui podem ser ligados a ou coexpressos com uma outra molécula funcional, por exemplo, um outro peptídeo ou proteína. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, através de acoplamento químico, fusão genética, associação não co- valente ou outro) a uma ou mais entidades moleculares, tal como um outro anticorpo ou fragmento de anticorpo para produzir um anticorpo biespecífico ou um multiespecífico com uma segunda especificidade de ligação.
[00402] As modalidades incluem anticorpos biespecíficos em que um braço de uma imunoglobulina se liga a MSR1 humano, e ou outro braço da imunoglobulina é específico para um segundo antígeno. O braço de ligação a MSR1 pode compreender qualquer uma das se- quências de aminoácido HCVR/LCVR ou CDR como mostrado na Ta- bela 4 aqui. Em certas modalidades, o braço de ligação a MSR1 se liga a MSR1 humano e bloqueia ligação de LDL modificado a MSR1. Em outras modalidades, o braço de ligação a MSR1 se liga a MSR1 humano, mas não bloqueia ligação de LDL modificado a MSR1. Em algumas modalidades, o braço de ligação a MSR1 se liga a MSR1 humano e ativa sinalização de MSR1. Em outras modalidades, o braço de ligação de MSR1 bloqueia estimulação de receptor mediada por MSR1. As modalidades incluem também anticorpos biespecíficos em que um braço do anticorpo se liga a um primeiro epitopo de MSR1 humano, e o outro braço do dito anticorpo se liga a um segundo epito- po distinto de MSR1 humano.
[00403] Um formato de anticorpo biespecífico que pode ser usado no contexto da presente invenção envolve o uso de um primeiro domí-
nio CH3 de imunoglobulina (Ig) e um segundo CH3 de Ig, em que os primeiro e segundo domínios CH3 diferem um do outro em pelo menos um aminoácido, e em que pelo menos uma diferença de aminoácido reduz ligação do anticorpo biespecífico à Proteína A comparado com um anticorpo biespecífico sem a diferença de aminoácido. Em uma modalidade, o primeiro domínio CH3 de Ig se liga à Proteína A e o se- gundo domínio CH3 contém uma mutação que reduz ou abole ligação da Proteína A tal como uma modificação de H95R (através da nume- ração exon IMGT: H435R pela numeração EU). O segundo CH3 pode compreender ainda uma modificação de Y96F (pela IMGT; Y436F pela EU). Modificações adicionais que podem ser encontradas com o se- gundo CH3 incluem: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M e V82I (pela IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M e V422I pela EU) no caso de anticorpos IgG1; N44S, K52N e V82I (IMGT; N384S, K392N e V422I pela EU) no caso de anticorpos IgG2; e Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q e V82I (pela IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q e V422I pela EU) no caso de anticorpos IgG4. Variações no formato de anticorpo biespecífico descritas acima são compreendidas no escopo da presente invenção.
[00404] Outros formatos biespecíficos exemplares que podem ser usados no contexto da presente invenção incluem, sem limitação, por exemplo, formatos biespecíficos baseados em scFv ou de diacorpo, fusões de IgG-scFv, domínio variável duplo (DVD)-Ig, Quadroma, knobs-into-hole, cadeia leve comum (por exemplo, cadeia leve comum com knobs-into-holes, etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)body, zíper de leucina, Duobody, IgG1/IgG2, Fab de ação dupla (DAF)-IgG e for- matos específicos de Mab2 (vide, por exemplo, Klein e outros, 2012, mAbs 4:6, 1-11 e referências citadas no mesmo, para uma revisão dos formatos acima). Anticorpos biespecíficos podem ser também constru- ídos usando conjugação de peptídeo/ácido nucleico, por exemplo, em que aminoácidos não naturais com reatividade química ortogonal são usados para gerar conjugados de anticorpo-oligonucleotídeo específi- cos de sítio que então realizam automontagem em complexos multi- méricos com composição, valência e geometria definidas. (Vide, por exemplo, Kazane e outros, J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec. 4, 2012]). Formulação e Administração Terapêuticas
[00405] As modalidades se referem a composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos anti-MSR1 ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos descritos aqui. As composições farmacêuticas da invenção são formuladas com carreadores, excipientes e outros agentes adequados que proveem transferência, administração, tole- rância e similar melhorados. Um grande número de formulações apro- priadas pode ser encontrado no formulário conhecido de todos os químicos farmacêuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Essas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, unguentos, geleias, ceras, óleos, lipídeos, vesí- culas contendo lipídeo (catiônico ou aniônico) (tal como LIPOFEC- TIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), conjugados de DNA, pastas de absorção anidras, emulsões óleo-em-água ou água-em-óleo, emul- sões carbowax (polietileno glicóis de vários pesos moleculares), géis semissólidos e misturas semissólidas contendo carbowax. Vide tam- bém Powell e outros, "Compendium of excipients for parenteral formu- lations" PDA (1998) J. Pharm. Sci. Technol. 52:238-311.
[00406] A dose de anticorpo administrada a um paciente pode vari- ar dependendo da idade e do tamanho do paciente, doença-alvo, con- dições, via de administração e similar. A dose preferida é tipicamente calculada de acordo com o peso do corpo ou área de superfície do corpo. Em um paciente adulto, pode ser vantajoso administrar intrave- nosamente o anticorpo da presente invenção normalmente em uma dose única de cerca de 0,01 a cerca de 20 mg/kg de peso corporal,
mais preferivelmente cerca de 0,02 a cerca de 7, cerca de 0,03 a cerca de 5 ou cerca de 0,05 a cerca de 3 mg/kg de peso corporal. Depen- dendo da severidade da condição, a frequência e a duração do trata- mento podem ser ajustadas. Dosagens e programas eficazes para administração de anticorpos anti-MSR1 podem ser determinados em- piricamente; por exemplo, o progresso do paciente pode ser monitora- do através de avaliação periódica e a dose ajustada de acordo. Além disso, aumento de dosagens interespécies pode ser realizado usando métodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, Mordenti e outros, 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).
[00407] Vários sistemas de administração são conhecidos e podem ser usados para administrar as composições farmacêuticas descritas aqui, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, mi- crocápsulas, células recombinantes capazes de expressar os vírus mutantes, endocitose mediada por receptor (vide, por exemplo, Wu e outros, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Métodos de introdução incluem, mas não estão limitados a, vias intradermais, intramuscula- res, intraperitoneais, intravenosas, subcutâneas, intranasais, epidurais e orais. A composição pode ser administrada através de qualquer via conveniente, por exemplo, através de infusão ou injeção de bolus, através da absorção de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosas retal e intestinal, etc.) e pode ser ad- ministrada junto com outros agentes biologicamente ativos. Adminis- tração pode ser sistêmica ou local.
[00408] Uma composição farmacêutica como aqui descrito pode ser administrada subcutaneamente ou intravenosamente com agulha e seringa padrão. Ainda, com relação à administração subcutânea, um dispositivo de administração de caneta tem prontamente aplicações na administração de uma composição farmacêutica da presente invenção. Tal dispositivo de administração de caneta pode ser reutilizável ou descartável. Um dispositivo de administração reutilizável geralmente utiliza um cartucho que pode ser substituído que contém uma compo- sição farmacêutica. Uma vez toda a composição farmacêutica dentro do cartucho tendo sido administrada e o cartucho estando vazio, o car- tucho vazio pode ser prontamente descartado e substituído com um cartucho novo que contém a composição farmacêutica. O dispositivo de administração de caneta pode ser então reutilizado. Em um disposi- tivo de administração de caneta descartável, não há nenhum cartucho substituível. Ao contrário, o dispositivo de administração de canela descartável vem pré-cheio com a composição farmacêutica mantida em um reservatório dentro do dispositivo. Uma vez o reservatório sen- do esvaziado da composição farmacêutica, o dispositivo inteiro é des- cartado.
[00409] Vários dispositivos de administração de caneta e autoinjeto- res reutilizáveis têm aplicações na administração subcutânea de uma composição farmacêutica descrita aqui. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Reino Unido), caneta DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suíça), caneta HUMALOG MIX 75/25™, caneta HUMA- LOG™, caneta HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II e III (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca), NO- VOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca), caneta lBD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ e OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frank- furt, Alemanha), para mencionar alguns. Exemplos de dispositivos de administração de caneta descartáveis tendo aplicações em adminis- tração subcutânea de uma composição farmacêutica da presente in- venção incluem, mas não estão limitados à, caneta SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), a FLEXPEN™ (Novo Nordisk) e a KWIKPEN™ (Eli Lilly), o Autoinjetor SURECLICKTM (Amgen, Thousand Oaks, CA), o
PENLETTM (Haselmeier, Stuttgart, Alemanha), o EPIPEN (Dey, L.P.) e o HUMIRATM Pen (Abbott Labs, Abbott Park IL), para citar alguns.
[00410] Em certas situações, a composição farmacêutica pode ser administrada em um sistema de liberação controlada. Em uma modali- dade, uma bomba pode ser usada (vide Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). Em uma outra modalidade, ma- teriais poliméricos podem ser usados; vide, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. Em ainda uma outra modalidade, um sistema de libera- ção controlada pode ser posto em proximidade do alvo da composi- ção, dessa maneira necessitando apenas uma fração da dose sistêmi- ca (vide, por exemplo, Goodson, 1984, em Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138). Outros sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão de Langer, 1990, Sci- ence 249:1527-1533.
[00411] As preparações injetáveis podem incluir formas de dosa- gem para injeções intravenosa, subcutânea, intracutânea e intramus- cular, infusões por gotejamento, etc. Essas preparações injetáveis po- dem ser preparadas através de métodos publicamente conhecidos. Por exemplo, as preparações injetáveis podem ser preparadas, por exemplo, através de dissolução, suspensão ou emulsificação do anti- corpo ou seu sal descrito acima em um meio aquoso estéril ou um meio oleoso convencionalmente usado para injeções. Como o meio aquoso para injeções, existem, por exemplo, solução salina fisiológica, uma solução isotônica contendo glicose e outros agentes auxiliares, etc., que podem ser usados em combinação com um agente de solubi- lização adequado tal como um álcool (por exemplo, etanol), um poliál- cool (por exemplo, propileno glicol, polietileno glicol), um tensoativo não iônico [por exemplo, polissorbato 80, aduto de óleo de rícino hi- drogenado HCO-50 (polioxietileno (50 mol)], etc. Como o meio oleoso,
são empregados, por exemplo, óleo de sésamo, óleo de soja, etc., que pode ser usado em combinação com um agente de solubilização tais como benzoato de benzila, álcool benzílico, etc. A injeção então prepa- rada é preferivelmente cheia em uma ampola apropriada.
[00412] Vantajosamente, as composições farmacêuticas para uso oral ou parenteral descritas acima são preparadas em formas de do- sagem em uma dose unitária adequada para ajustar uma dose dos ingredientes ativos. Tais formas de dosagem em uma dose unitária incluem, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas, injeções (ampo- las), supositórios, etc. A quantidade do anticorpo mencionado acima contido é geralmente cerca de 5 a cerca de 500 mg por forma de do- sagem em uma dose unitária; especialmente na forma de injeção, é preferido que o anticorpo mencionado acima esteja contido em cerca de 5 a cerca de 100 mg em cerca de 10 a cerca de 250 mg para as outras formas de dosagem. Usos Terapêuticos de Anticorpos
[00413] As modalidades incluem métodos compreendendo adminis- trar a um indivíduo com necessidade dos mesmos uma composição terapêutica compreendendo um anticorpo anti-MSR1 ou um conjugado anticorpo-fármaco compreendendo um anticorpo anti-MSR1 (por exemplo, um anticorpo anti-MSR1 ou ADC compreendendo qualquer uma das sequências de HCVR/LCVR ou CDR como mostrado na Ta- bela 4 aqui). A composição terapêutica pode compreender qualquer um dos anticorpos anti-MSR1, fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos ou ADCs descritos aqui (por exemplo, ADCs de Fórmula (I), (IA), (IB), (IB-1), (IB-2), (IC), (ID), (IE), (III), (3000), (5001), (5002), (5003), (5004), (6001), (6002), (6003), (6004), (6005), (7001), (7002), (7003), (7004) e/ou (7005)) e um carreador ou diluente farmaceutica- mente aceitável.
[00414] Os anticorpos e ADCs descritos aqui são úteis, inter alia,
para o tratamento, prevenção e/ou melhora de qualquer doença ou distúrbio associado com ou mediado por expressão ou atividade de MSR1 ou tratável através de ligação a MSR1 sem competir contra LDL modificado e/ou promover internalização de receptor de MSR1 e/ou diminuir número de receptor na superfície celular. Por exemplo, os an- ticorpos e ADCs descritos aqui são úteis para o tratamento, atenuação ou melhora de aterosclerose, distúrbios proliferativos, distúrbios neu- rodegenerativos e inflamação ao se direcionar a células que expres- sam MSR1 e/ou que respondem à sinalização mediada por MSR1, por exemplo, macrófagos.
[00415] No contexto dos métodos de tratamento descritos aqui, o anticorpo anti-MSR1 ou um ADC do mesmo, pode ser administrado como uma monoterapia (isto é, como o único agente terapêutico) ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais (cu- jos exemplos são descritos em um outro lugar aqui).
[00416] É provido aqui um método de tratamento de uma doença proliferativa, uma doença metabólica, inflamação, uma doença neuro- degenerativa ou doença, distúrbio ou condição associado com sinali- zação de receptor de glucocorticoide, em um indivíduo compreenden- do administrar ao indivíduo uma quantidade de tratamento eficaz de um composto descrito aqui (por exemplo, um ADC anti-MSR1) ou uma composição farmacêutica compreendendo um composto descrito aqui.
[00417] Em algumas modalidades, onde a carga útil é um esteroide, a doença, distúrbio ou condição é estado alérgico, incluindo, mas não limitado a, asma, dermatite atópica, dermatite de contato, dermatite alérgica, reações de hipersensibilidade a fármaco, rinite anafilática, rinite alérgica perene ou sazonal e doença do soro; doenças e condi- ções dermatológicas, incluindo, mas não limitado a, coceira na pele, dermatite seborreica, neurodermatite, eczema, dermatite bolhosa her- petiformis, eritroderma esfoliativo, micose fungoide, pênfigo e eritema multiforme severo (síndrome de Stevens-Johnson); distúrbios endócri- nos, incluindo, mas não limitado a, insuficiência adrenocortical primária ou secundária, hiperplasia adrenal congênita, hipercalcemia associada com câncer e tireoidite não supurativa; doenças gastrintestinais; dis- túrbios hematológicos, incluindo, mas não limitado a, anemia hemolíti- ca adquirida (autoimune), anemia hipoplástica congênita (eritroide) (anemia de Diamond-Blackfan), púpura trombocitopênica idiopática em adultos, aplasia de célula vermelha pura e trombocitopenia secundária; triquinose; meningite tuberculosa com bloqueio subaracnoide ou blo- queio de iminente; doenças neoplásticas, incluindo, mas não limitado a, leucemias e linfomas; distúrbios do sistema nervoso, incluindo, mas não limitado a, exacerbações agudas de esclerose mulitpla, edema cerebral associado com tumor cerebral primário ou metastático, cranio- tomia ou lesão à cabeça; doenças oftálmicas, incluindo, mas não limi- tado a, oftalmia simpática, arterite temporal, uveíte, xeroftalmia e con- dições inflamatórias oculares não responsivas a corticosteroides tópi- cos; doenças renais, incluindo, mas não limitado a, indução de uma diurese ou remissão de proteinuria em síndrome nefrótica idiopática ou aquela devido a lúpus eritematoso; doenças respiratórias, incluindo, mas não limitado a, beriliose, tuberculose pulmonar fulminante ou dis- seminada quando usada concomitantemente com quimioterapia anti- tuberculose apropriada, pneumonias eosinofílicas idiopáticas, sarcoi- dose sintomático; e distúrbios reumáticos, incluindo, mas não limitado a uso como terapia adjunta para administração a curto prazo (para ori- entar o paciente em um episódio agudo ou exacerbação) em artrite gotosa aguda, cardite reumática aguda, espondilite anquilosante, artri- te psoriática, artrite reumatoide, incluindo artrite reumatoide juvenil e para uso em dermatomiosite, polimiosite, estomatite e lúpus eritemato- so sistêmico.
Em certas modalidades, são providos aqui métodos de tratamento ou prevenção de artrite.
[00418] Em algumas modalidades, é mostrado aqui um método pa- ra tratamento de uma doença, distúrbio ou condição selecionado de uma doença autoimune, uma alergia, artrite, asma, um distúrbio respi- ratório, um distúrbio do sangue, um câncer, uma doença do colágeno, um distúrbio do tecido conectivo, uma doença dermatológica, uma do- ença do olho, um problema endócrino, uma doença imunológica, uma doença inflamatória, um distúrbio intestinal, uma doença gastrintesti- nal, um distúrbio neurológico, uma condição de transplante de órgão, um distúrbio reumatoide, um distúrbio de pele, uma condição de in- chaço, uma condição de cicatrização de ferida e uma combinação dos mesmos compreendendo administrar uma carga útil de esteroide ou conjugado dos mesmos descrito aqui.
[00419] Em algumas modalidades, o distúrbio autoimune é selecio- nado de esclerose múltipla, hepatite autoimune, herpes zóster, lúpus eritematoso sistêmico (isto é, lúpus), miastenia grave, distrofia muscu- lar de Duchenne e sarcoidose. Em algumas modalidades, o distúrbio respiratório é selecionado de asma, doença respiratória crônica, doen- ça pulmonar obstrutiva crônica, inflamação brônquica e bronquite agu- da. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado de leucemia, leucemia linfoblástica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblás- tica crônica, linfoma de Hodgkin, linfoma Não Hodgkin (NHL) e mielo- ma múltiplo. Em algumas modalidades, a doença do colágeno é lúpus eritematoso sistêmico. Em algumas modalidades, a doença do olho é queratite. Em algumas modalidades, o problema endócrino é selecio- nado de Doença de Addison, insuficiência adrenal, disfunção cortical adrenal, hiperplasia adrenal adrenocortical e congênita. Em algumas modalidades, a doença inflamatória é selecionada de inflamação após cirurgia de catarata, inflamação das articulações, inflamação imune, inflamação de tendão, bursite, epicondilite, doença de Crohn, doença inflamatória do intestino, pneumonia lipoide, tireoidite, urticária (erup-
ções de pele), pericartide, síndrome nefrótica e uveíte. Em algumas modalidades, o distúrbio intestinal é selecionado de colite colagenosa, colite ulcerativa, doença de Crohn e doenças inflamatórias do intesti- no. Em algumas modalidades, o distúrbio reumatoide é selecionado de artrite reumatoide, polimialgia reumática, artrite psoriática, espondilite anquilosante e lúpus eritematoso sistêmico. Em algumas modalidades, o distúrbio de pele é selecionado de psoríase, eczema e hera veneno- sa. Em algumas modalidades, o distúrbio neurológico é polirradiculo- neuropatia desmielinante inflamatória crônica.
[00420] Em algumas modalidades, os compostos descritos aqui são administrados a um paciente para tratar um evento inflamatório agudo, incluindo, mas não limitado a, acidente vascular cerebral, edema cere- bral e doença enxerto-vs-hospedeiro. Em algumas modalidades, os compostos descrito aqui são administrados para tratar efeitos linfolíti- cos, incluindo, mas não limitado àqueles associados com males hema- tológicos, por exemplo, leucemias, linfomas e mielomas.
[00421] Em algumas modalidades, é mostrado aqui um método pa- ra redução de inflamação em um indivíduo com necessidade do mes- mo compreendendo administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um esteroide ou conjugado do mesmo descrito aqui. Em algumas modalidades, é mos- trado aqui um método para modulação do sistema imune em um indi- víduo com necessidade do mesmo, compreendendo administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo uma quantidade terapeutica- mente eficaz de um esteroide ou conjugado do mesmo descrito aqui. Em algumas modalidades, é mostrado aqui um método para modula- ção dos níveis de cortisol em um indivíduo com necessidade do mes- mo, compreendendo administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz e um esteroide ou conjugado do mesmo descrito aqui. Em algumas modalidades, é des-
crito aqui um método de redução de migração de linfócitos em um in- divíduo com necessidade do mesmo compreendendo administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo uma quantidade terapeutica- mente eficaz de um esteroide ou conjugado do mesmo descrito aqui. Em algumas modalidades, é mostrado aqui um método de tratamento de hipercalcemia decido a câncer, doença de Meniere, enxaqueca, uma cefalia em cachos, uma úlcera aftosa severa, laringite, tuberculo- se severa, uma reação de Herxheimer na sífilis, uma falência cardíaca descompensada, rinite alérgica ou pólipos nasais compreendendo ad- ministrar a um indivíduo com necessidade do mesmo uma carga útil esteroide ou conjugado da mesma descrito aqui. Em algumas modali- dades, os compostos descritos aqui podem ser usados para tratamen- to de doença inflamatória do intestino, doença de Crohn ou colite ulce- rativa. Em algumas modalidades, a doença, distúrbio ou condição é uma condição inflamatória crônica, incluindo, mas não limitado a, as- ma, infecções de pele e infecções oculares. Em algumas modalidades, os compostos descritos aqui são usados para imunossupressão em pacientes sofrendo transplante de órgão.
[00422] Em algumas modalidades, as cargas úteis de esteroide e seus conjugados descritos aqui são administrados a um paciente para tratar um distúrbio nervoso associado com sinalização GR, incluindo, mas não limitado a, distúrbios psiquiátricos tais como esquizofrenia, vício de fármaco, distúrbio do estresse pós-traumático (PTSD) e dis- túrbios de humor, abuso de substância, estresse e ansiedade.
[00423] Em algumas modalidades, as cargas úteis de esteroide e seus conjugados descritos aqui são administrados a um paciente para tratar um distúrbio do sistema visual incluindo, mas não limitado a, in- flamação ocular (por exemplo, conjuntivite, queratite, uveíte), edema macular e degeneração macular. Em algumas modalidades, as cargas úteis de esteroides e seus conjugados descritos aqui são administra-
dos a um paciente para tratar um distúrbio cardiovascular. Em algu- mas modalidades, as cargas uteis de esteroide e seus conjugados descritos aqui são administrados a um paciente para tratar um distúr- bio do metabolismo de glicose e/ou fígado. Em algumas modalidades, as cargas úteis de esteroide e seus conjugados descritos aqui são administrados a um paciente para tratar um distúrbio do sistema mus- culoesqueletal. Em algumas modalidades, as cargas úteis de esteroide e seus conjugados descritos aqui são administrados a um paciente para tratar uma condição inflamatória cutânea, tal como eczema e pso- ríase.
[00424] Os conjugados de proteína descritos aqui proveem um meio para administração direcionada de sua carga útil de esteroide a células ou sistemas de órgão particulares, dessa maneira reduzindo ou evitando efeitos colaterais que resultem da administração da carga útil de esteroide não conjugada livre. Exemplos de tais efeitos colaterais potenciais a serem reduzidos ou evitados incluem aqueles listados no rótulo do fármaco aprovado Decadron® (dexametasona), que é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade. Em algumas mo- dalidades, o efeito colateral a ser reduzido ou evitado é selecionado de elevação da pressão sanguínea; retenção de sódio; retenção de água/fluido (edema, angioedema, edema pulmonar); excreção aumen- tada de potássio; supressão do eixo hipotalâmico-pituitária-adrenal (HPA) reversível; insuficiência de corticosteroide potencial após retira- da do tratamento; susceptibilidade a infecções; exacerbação de infec- ções fúngicas sistêmicas; piora da severidade de catapora em pacien- tes pediátricos e adultos; piora da severidade sarampo em pacientes pediátricos e adultos; cataratas subcapsulares posteriores; glaucoma com possível dano aos nervos ópticos; melhora do estabelecimento de infecções oculares secundárias devido a bactérias, fungos ou vírus; aumento em novos episódios de neurite óptica; sarcoma de Kaposi;
insuficiência adrenocortical secundária induzida por fármaco; risco aumentado de uma perfuração quando úlceras pépticas ativas ou la- tentes, diverticulite, anastomoses intestinais frescas e colite ulcerativa não específica estão presentes; irritação peritoneal seguindo perfura- ção gastrintestinal; formação de osso diminuída; reabsorção óssea aumentada; inibição de função de osteoblasto; inibição de crescimento de osso em pacientes pediátricos; desenvolvimento de osteoporose em qualquer idade; miopatia aguda (possivelmente envolvendo mús- culos oculares e respiratórios e resultando potencialmente em quadri- parese); elevação de cinase de creatinina; perturbações psíquicas, va- riando de euforia, insônia, mudanças de humor, mudanças de perso- nalidade e depressão severa, a manifestações psicóticas abertas; agravamento de instabilidade emocional ou tendências psicóticas exis- tentes; pressão intraocular elevada; bradicardia; parada cardíaca; ar- ritmias cardíacas; aumento cardíaco; colapso circulatório; falência car- díaca congestiva; embolia gordurosa; hipertensão; cardiomiopatia hi- pertrófica em bebês prematuros; ruptura miocardial seguindo infarto do miocárdio recente; síncope; taquicardia; tromboembolia; tromboflebite; vasculite; acne; dermatite alérgica; pele escamosa seca; equimoses e petéquias; eritema; cicatrização de ferida prejudicada; aumento da su- dorese; erupção cutânea; estrias; supressão de reações a testes de pele; pele frágil fina; cabelo ralo; urticária; tolerância a carboidrato e glicose diminuída; desenvolvimento do estado de Cushing; hiperglice- mia; glicosúria; hirsutismo; hipertricose; necessidades aumentadas de insulina ou agentes hipoglicêmicos orais em diabetes (resistência à insulina); manifestações de diabetes mellitus latente; irregularidades menstruais; não responsividade adrenocortical e da pituitária secundá- ria (particularmente em momentos de estrese; como em trauma; cirur- gia; ou doença); supressão de crescimento em pacientes pediátricos; falência cardíaca congestiva em pacientes suscetíveis; retenção de fluido; alcalose hipocalêmica; perda de potássio; retenção de sódio; distensão abdominal; elevação em níveis de enzima do fígado no soro (geralmente reversível quando da descontinuação); hepatomegalia; apetite aumentado; náusea; pancreatite; úlcera péptica com possível perfuração e hemorragia; perfuração do intestino delgado e grosso (particularmente em pacientes com doença inflamatória do intestino); esofagite ulcerativa; equilíbrio de nitrogênio negativo devido a catabo- lismo de proteína; necrose asséptica de cabeças femoral e humeral; perda de massa muscular; fraqueza muscular; osteoporose; fratura patológica de ossos longos; miopatia esteroide; ruptura de tendão; fra- turas por compressão vertebral; convulsões; depressão; instabilidade emocional; euforia; cefaleia; pressão intracraniana aumentada com papiledema (pseudotumor cerebral) geralmente seguindo descontinu- ação de tratamento; insônia; mudanças de humor; neurite; neuropatia; parestesia; mudanças de personalidade; distúrbios psíquicos; verti- gem; exoftalmos; glaucoma; pressão intraocular aumentada; cataratas subcapsulares posteriores; resistência diminuída à infecção; motilidade e número de espermatozoides aumentados ou diminuídos; mal-estar; face-de-lua-cheia; e ganho de peso; e aqueles efeitos colaterais asso- ciados com interações fármaco-fármaco.
Em algumas modalidades, o efeito colateral a ser reduzido ou evitado são aqueles associados com interação fármaco-fármaco.
Em algumas modalidades, o efeito colate- ral a ser reduzido ou evitado está associado com interações fármaco- fármaco a partir do uso de um corticosteroide com aminoglutetimida incluindo diminuição de supressão adrenal por corticosteroides; inje- ção de anfotericina B e agentes de depleção de potássio, incluindo de- senvolvimento de hipocalemia, aumento cardíaco e falência cardíaca congestiva; antibióticos incluindo uma diminuição significante em eli- minação de corticosteroide; anticolinesterases incluindo produção de fraqueza severa em pacientes com miastenia grave; anticoagulantes orais incluindo inibição de resposta à warfarina; antidiabéticos incluin- do concentrações de glicose no sangue aumentadas; fármacos antitu- berculares incluindo concentrações no soro diminuídas de isoniazida; colestiramina incluindo eliminação aumentada de corticosteroides; ci- closporina incluindo atividade aumentada de ambos ciclosporina e cor- ticosteroides e incidência de convulsões; interferência em teste de su- pressão de dexametasona (DST) incluindo resultados falso-negativos em pacientes sendo tratados com indometacina; glicosídeos digitálicos incluindo risco aumentado de arritmias devido à hipocalemia; efedrina incluindo aumento da eliminação metabólica de corticosteroides; resul- tando em níveis diminuídos no sangue e menos atividade fisiológica; estrógenos, incluindo contraceptivos orais, incluindo metabolismo he- pático diminuído de certos corticosteroides e aumento associado em seu efeito; indutores, inibidores e substratos de enzima hepáticos (fármacos que induzem atividade de enzima P450 3A4 (CYP 3A4) do citocromo, por exemplo, barbituratos, fenitoína, carbamazepina, rifam- pina), incluindo aumento do metabolismo de corticosteroides; fármacos que inibem CYP 3A4 (por exemplo, cetoconazol, antibióticos macrolí- deos tal como eritromicina), incluindo o potencial para concentrações no plasma aumentadas de corticosteroides; fármacos que são metabo- lizados por CYP 3A4 (por exemplo, indinavir, eritromicina), incluindo aumento em sua eliminação, resultando em concentração no plasma diminuída; cetoconazol incluindo metabolismo diminuído de certos cor- ticosteroides em até 60%, levando a risco aumentado de efeitos cola- terais de corticosteroides e inibição de síntese de corticosteroide adre- nal causando potencialmente insuficiência adrenal durante retirada do corticosteroide; agentes anti-inflamatórios não esteroidas (NSAIDS), incluindo risco aumentado de efeitos colaterais gastrintestinaise elimi- nação aumentada de salicilatos; fenitoína, incluindo aumentos e dimi- nuições em nível de fenitoína, controle de ataques alterado; testes de pele, incluindo supressão de reações a testes de pele; talidomida in- cluindo necrólise epidérmica tóxica; e vacinas incluindo uma resposta diminuída a toxoides e vacinas vivas ou inativadas devido à inibição de resposta de anticorpo ou potenciação de replicação de alguns orga- nismos contidos em vacinas atenuadas vivas).
[00425] Portanto, são providos aqui métodos para tratamento de uma doença, distúrbio ou condição associado com o receptor de glu- cocorticoide compreendendo administrar um conjugado de Fórmula (I), (IA), (IB), (IB-1), (IB-2), (IC), (ID), (IE), Fórmula (III) ou Fórmula (3000) a um paciente tendo a dita doença, distúrbio ou condição, em que os efeitos colaterais associados com administração da carga livre de es- teroide livre do dito conjugado são reduzidos. Ainda, são providos aqui métodos de administração de um composto de Fórmula (III), ou Fór- mula (3000), a uma célula compreendendo contato da dita célula com um conjugado de proteína do composto de Fórmula (3000) ou Fórmula (III), em que o conjugado de proteína compreende um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a um antígeno de superfície da dita célula.
[00426] Em alguns exemplos, onde a carga útil é um modulador de LXR, é mostrado aqui um método de tratamento de uma doença, dis- túrbio ou condição compreendendo administrar a um paciente tendo o dito distúrbio uma quantidade terapeuticamente eficaz de um compos- to e/ou um ADC (por exemplo, ADCs de Fórmula (I), (IA), (IB), (IB-1), (IB-2), (IC), (ID), (IE), (5001), (5002), (5003), (5004), (6001), (6002), (6003), (6004) ou (6005)) ou uma composição farmacêutica do mes- mo.
[00427] Em alguns exemplos, é mostrado aqui um método de pre- venção de uma doença, distúrbio ou condição compreendendo admi- nistrar a um paciente tendo o dito distúrbio uma quantidade profilati- camente eficaz de um composto e/ou um ADC (por exemplo, ADCs de
Fórmula (I), (IA), (IB), (IB-1), (IB-2), (IC), (ID), (IE), (5001), (5002), (5003), (5004), (6001), (6002), (6003), (6004) ou (6005) ou uma com- posição farmacêutica do mesmo.
[00428] Em alguns exemplos, são mostrados aqui métodos para tratamento ou prevenção de qualquer doença, distúrbio ou condição responsivo à modulação de sinalização de LXR. Em alguns exemplos, a doença ou distúrbio é associado com função de LXR, polimorfismos de LXR, atividade agonista de LXR ou atividade antagonista de LXR. Em alguns exemplos, é mostrado aqui um método de tratamento ou prevenção de uma doença, distúrbio ou condição selecionado do gru- po consistindo em um distúrbio proliferativo, um distúrbio neurodege- nerativo, um distúrbio imunológico, uma doença autoimune, um distúr- bio inflamatório, uma doença dermatológica, uma doença metabólica, doença cardiovascular e uma doença gastrintestinal.
[00429] O distúrbio proliferativo pode ser qualquer distúrbio prolife- rativo conhecido daqueles de habilidade. Em certas modalidades dis- túrbios proliferativos incluem, sem limitação, distúrbios de oncologia, onde o distúrbio de oncologia pode ser qualquer distúrbio de câncer conhecido daqueles de habilidade. Em certas modalidades, são provi- dos aqui métodos de tratamento ou prevenção de um melanoma. Em certas modalidades, são providos aqui métodos de tratamento ou pre- venção de melanoma metastático. Em certas modalidades, são provi- dos aqui métodos de tratamento ou prevenção de câncer de pulmão. Em certas modalidades, são providos aqui métodos de tratamento ou prevenção de câncer de pulmão resistente a inibidor de tirosina ci- nase-EGFR. Em certas modalidades, são providos aqui métodos de tratamento ou prevenção de câncer oral. Em certas modalidades, são providos aqui métodos de tratamento ou prevenção de carcinoma de célula escamosa oral. Em certas modalidades, são providos aqui mé- todos de tratamento ou prevenção de câncer de próstata. Em certas modalidades, são providos aqui métodos de tratamento ou prevenção de linfoma de Hodgkin. Em certas modalidades, são providos aqui mé- todos de tratamento ou prevenção de câncer de mama.
[00430] O distúrbio neurodegenerativo pode ser qualquer distúrbio neurodegenerativo conhecido daqueles de habilidade. Em certas mo- dalidades, são providos aqui métodos de tratamento ou prevenção de doença de Alzheimer. Em certas modalidades, são providos aqui mé- todos de tratamento ou prevenção de doença de Parkinson. Em certas modalidades, são providos aqui métodos de tratamento ou prevenção de doença de Huntington. Em certas modalidades, são providos aqui métodos de tratamento ou prevenção de esclerose lateral amiotrófica. Em certas modalidades, são providos aqui métodos de tratamento ou prevenção de expressão do gene da mielina. Em certas modalidades, são providos aqui métodos de tratamento ou prevenção de condições, doenças ou distúrbios de mielinação e remielinação.
[00431] O distúrbio imunológico pode ser qualquer distúrbio imuno- lógico conhecido daqueles de habilidade. Em certas modalidades, são providos aqui métodos de tratamento ou prevenção de doenças infla- matórias do intestino. Em certas modalidades, são providos aqui mé- todos de tratamento ou prevenção de colite ulcerativa. Em certas mo- dalidades, são providos aqui métodos de tratamento ou prevenção de doença de Crohn.
[00432] O distúrbio inflamatório pode ser qualquer distúrbio inflama- tório conhecido daqueles de habilidade. Em certas modalidades, são providos aqui métodos de tratamento ou prevenção de artrite. Em cer- tas modalidades, são providos aqui métodos de tratamento ou preven- ção de artrite reumatoide.
[00433] A doença metabólica pode ser qualquer doença metabólica conhecida daqueles de habilidade. Em certas modalidades, a doença metabólica é dislipidemia. Dislipidemia pode ser qualquer dislipidemia conhecida daqueles de habilidade. Em certas modalidades, dislipide- mia é selecionada do grupo consistindo em hiperlipidemia, hipercoles- terolemia, hipertrigliceridemia, hiperlipoproteinemia, deficiência de HDL, deficiência de ApoA-I e doença cardiovascular tal como doença da artéria coronária (incluindo, por exemplo, tratamento e prevenção de angina, infarto do miocárdio e morte cardíaca súbita); aterosclerose (incluindo, por exemplo, tratamento e prevenção de aterosclerose); e restenose (incluindo, por exemplo, prevenção ou tratamento de placas ateroscleróticas que se desenvolvem como uma consequência de pro- cedimentos metidos tal como angioplastia com balão). Em certas mo- dalidades, são providos aqui métodos de tratamento ou prevenção de diabetes.
[00434] A doença cardiovascular pode ser qualquer doença cardio- vascular conhecida daqueles de habilidade. Em certas modalidades, são providos aqui métodos de tratamento ou prevenção de ateroscle- rose. Em certas modalidades, são providos aqui métodos de tratamen- to ou prevenção de aterosclerose derivada de processamento de ma- crófago anormal. Em certas modalidades, são providos aqui métodos de tratamento ou prevenção de aterosclerose derivada da formação de lipoproteínas de baixa densidade oxidadas (oxLDLs), onde macrófagos falham em processar oxLDLs. Em certas modalidades, são providos aqui métodos de tratamento ou prevenção de doença cardíaca isquê- mica. Em certas modalidades, são providos aqui métodos de tratamen- to ou prevenção de acidente vascular cerebral. Em certas modalida- des, são providos aqui métodos de tratamento ou prevenção de doen- ça cardíaca hipertensiva. Em certas modalidades, são providos aqui métodos de tratamento ou prevenção de aneurisma aórtico. Em certas modalidades, são providos aqui métodos de tratamento ou prevenção de endocardite. Em certas modalidades, são providos aqui métodos de tratamento ou prevenção de doença da artéria periférica. Em certas modalidades, são providos aqui métodos de tratamento ou prevenção de combinações de qualquer uma das doenças mencionadas nesse parágrafo.
[00435] Em alguns exemplos, é mostrado aqui um método para modulação da função de um receptor nuclear. A título de exemplo não limitante, a função pode ser selecionada de expressão/secreção de mediadores inflamatórios (por exemplo, citocinas, quimiocinas), regu- lagem de colesterol, ingestão de colesterol, efluxo de colesterol oxida- ção de colesterol, migração, quimiotaxia, apoptose e necrose, uma ati- vidade inflamatória, regulagem de lipídio, apoptose, migração, quimio- taxia, transcrição de gene e expressão de proteína.
[00436] Em alguns exemplos, é mostrado aqui um método de pre- venção de uma doença, distúrbio ou condição compreendendo admi- nistrar a um paciente tendo o dito distúrbio uma quantidade terapeuti- camente eficaz de um composto e/ou um ADC de Fórmula (I), (IA), (IB), (IB-1), (IB-2), (IC), (ID), (IE), (7001), (7002), (7003), (7004) e/ou (7005) ou uma composição farmacêutica do mesmo.
[00437] S. aureus é uma bactéria intracelular facultativa que pode sobreviver à fagocitose por macrófagos e outros tipos de célula (Horn, J. e outros, Inside job: Staphylococcus aureus host-pathogen interac- tions. Int J Med Microbiol, 2018, 308(6): p. 607-624; Jubrail, J. e ou- tros, Inability to sustain intraphagolysosomal killing of Staphylococcus aureus predisposes to bacterial persistence in macrophages. Cell Mi- crobiol, 2016, 18(1): p. 80-96). Imagem intravital demonstrou que ma- crófagos podem servir como um reservatório onde S. aureus replica e então semeia outros órgãos durante infecção (Surewaard, B.G. e ou- tros, Identification and treatment of the Staphylococcus aureus reser- voir in vivo. J Exp Med, 2016, 213(7): p. 1141-51). A maioria dos anti- bióticos não penetra nas células, incluindo macrófagos, muito bem, indicando que o reservatório de S. aureus intracelular pode evadir tra-
tamento com antibióticos de padrão de cuidado (Lehar, S.M. e outros, Novel anticorpo-antibiotic conjugate eliminates intracellular S. aureus. Nature, 2015, 527(7578): p. 323-8). No entanto, formulação lipossomal de vancomicina aumentou a penetração do antibiótico nos macrófagos e reduziu a carga de S. aureus em órgão mais efetivamente do que a vancomicina de padrão de cuidado (Surewaard, B.G. e outros, Identifi- cation and treatment of the Staphylococcus aureus reservoir in vivo. J Exp Med, 2016, 213(7): p. 1141-51). Juntos, esses dados indicam que administração de um antibiótico a macrófagos pode ser um método eficaz para eliminar o reservatório de S. aureus intracelular.
[00438] S. aureus resistente a antibiótico permanece um problema de saúde pública e aproximadamente 40% das infecções na corrente sanguínea são causadas por S. aureus resistente à meticilina (MRSA) nos Estados Unidos. Existem poucas opções de tratamento aprovadas pelo FDA para infecções na corrente sanguínea por MRSA, com van- comicina permanecendo um antibiótico de escolha. Apesar do trata- mento antibiótico apropriado, a mortalidade de infecções na corrente sanguínea por S. aureus é ~18%, encorajando investigação de combi- nações que possam melhorar o tratamento.
[00439] A classe de antibióticos rifamicina inibe polimerase de RNA bacteriana (RNAP) e tem atividade potente contra S. aureus. Monote- rapia com a classe de antibióticos, no entanto, pode levar à seleção de uma população resistente durante tratamento. Portanto, antibióticos rifamicina podem ser usados em combinação com antibióticos de pri- meira linha para melhorar os resultados, comumente em infecções en- volvendo próteses ou dispositivo estranhos.
[00440] Os ADCs descritos aqui compreendendo análogos de rifa- micina são úteis para prevenção ou tratamento de crescimento de uma bactéria e/ou infecção bacteriana em um indivíduo. Em alguns casos, a bactéria é uma bactéria gram-positiva (uma bactéria gram-positiva é a causa da infecção bacteriana). Em alguns casos, a bactéria é uma bactéria resistente à penicilina (uma bactéria resistente à penicilina é a causa da infecção bacteriana). Em alguns casos, a bactéria é uma Staphylococcus aureus, uma bactéria Staphylococcus aureus resisten- te à meticilina (MRSA) (uma bactéria MRSA é a causa da infecção bacteriana). Em alguns casos, a bactéria é uma bactéria Staphylococ- cus aureus suscetível à meticilina (MSSA) (uma bactéria MSSA é a causa da infecção bacteriana). Em alguns casos, a bactéria é uma Staphylococcus aureus resistente à vancomicina (VRSA) (uma bacté- ria VRSA é a causa da infecção bacteriana). Em alguns casos, a bac- téria é uma M. tuberculosis resistente a multifármaco (uma bactéria M. tuberculosis resistente a múltiplos fármacos é a causa da infecção bacteriana). Em mais casos, a bactéria é Chlamydia trachomatis resis- tente a, por exemplo, azitromicina (Chlamydia trachomatis resistente à, por exemplo, azitromicina é a causa da infecção bacteriana). Em mais casos, a bactéria é Clostridium difficile resistente a, por exemplo, me- tronidazol, vancomicina e/ou fidaxomicina (Clostridium difficile resisten- te a, por exemplo, metronidazol, vancomicina e/ou fidaxomicina (Clos- tridium difficile resistente a, por exemplo, metronidazol, vancomicina e/ou fidaxomicina é a causa da infecção bacteriana).
[00441] É provido aqui um método de prevenção ou tratamento de celulite, bacteremia, dermonecrose, infecção da pálpebra, infecção do olho, conjuntivite neonatal, osteomielite, impetigo, furúnculos, síndro- me da pele escaldada, envenenamento de alimento, pneumonia, in- fecção cirúrgica, infecção do trato urinário, infecção de queimadura, meningite, endocardite, septicemia, síndrome do choque séptico, artri- te séptica, mastite, infecção associada com uma articulação com pró- tese, infecção associada com um cateter ou infecção associada com um implante, em um indivíduo compreendendo administrar ao indiví- duo uma quantidade de tratamento eficaz de um conjugado anticorpo-
fármaco compreendendo um análogo de rifamicina (por exemplo, ADCs de Fórmula (I), (IA), (IB), (IB-1), (IB-2), (IC), (ID), (IE), (7001), (7002), (7003), (7004) e/ou (7005)). É também provido aqui um méto- do de prevenção ou tratamento de uma infecção bacteriana intracelu- lar em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade de tratamento eficaz de um conjugado anticorpo-fármaco de um conjugado anticorpo-fármaco compreendendo um análogo de rifamicina (por exemplo, ADCs de Fórmula (I), (IA), (IB), (IB-1), (IB-2), (IC), (ID), (IE), (7001), (7002), (7003), (7004) e/ou (7005)).
[00442] Em alguns casos, são providos aqui métodos terapêuticos compreendendo administração de um anticorpo anti-MSR1, uma por- ção de ligação a antígeno de um anticorpo para MSR1 ou um ADC compreendendo um anticorpo anti-MSR1 de fragmento de ligação a antígeno de MSR1 do mesmo, a um indivíduo com necessidade do mesmo, que são uteis para o tratamento e/ou prevenção de infecção bacteriana em um indivíduo e/ou doença ou distúrbio ou condição as- sociada com infecção Staphylococcal, por exemplo, uma infecção por S. aureus e/ou para melhora de pelo menos um sintoma associado com tal doença, distúrbio ou condição. Tal doença, distúrbio ou condi- ção pode ser celulite, bacteremia, dermonecrose, infecção da pálpe- bra, infecção do olho, conjuntivite neonatal, osteomielite, impetigo, fu- rúnculos, síndrome da pele escaldada, envenenamento de alimento, pneumonia, infecção cirúrgica, infecção do trato urinário, infecção de queimadura, meningite, endocardite, septicemia, síndrome do choque séptico, artrite séptica. Em alguns casos, o indivíduo tem uma articula- ção protética e os anticorpos descritos aqui são usados para tratamen- to e/ou prevenção de infecção por S. aureus do tecido circundando a articulação protética. Em alguns casos, o indivíduo tem um cateter e os anticorpos descritos aqui são usados para tratamento e/ou preven- ção de infecção por S. aureus do cateter e/ou do tecido circundando o cateter. Em alguns casos, o indivíduo tem um corpo estranho implan- tado e os anticorpos descritos aqui são usados para tratamento e/ou prevenção de infecção por S. aureus do corpo estranho e/ou o tecido circundando o corpo estranho. Em alguns casos, o indivíduo tem mas- tite e os anticorpos descritos aqui são úteis para tratamento de masti- te.
[00443] Em alguns casos, os análogos de rifamicina e/ou ADCs an- ti-MSR1 dos mesmos são administrados em combinação com um ou mais antibióticos adicionais (por exemplo, antibióticos que podem ser usados para infecções por MRSA) tais como vancomicina, trimetoprim- sulfametoxazol, tetraciclina, doxiciclina/minociclina, clindamicina, cefa- losporinas (por exemplo, cefalexina), naficilina, naficilina, fidaxomicina, linezolida e/ou similar e/ou qualquer outro antibiótico(s) adequado(s). Em alguns casos, os ADCs descritos aqui compreendendo análogos de rifamicina são administrados em combinação com vancomicina e são úteis para prevenção ou tratamento de infecção bacteriana em um indivíduo. Terapias de Combinação e Formulações
[00444] As modalidades incluem composições e formulações tera- pêuticas compreendendo qualquer um dos anticorpos anti-MSR1 des- critos aqui em combinação com um ou mais compostos terapeutica- mente ativos adicionais e métodos de tratamento compreendendo ad- ministrar tais combinações a indivíduos com necessidade dos mes- mos.
[00445] Os anticorpos anti-MSR1 descritos aqui podem ser cofor- mulados com e/ou administrados em combinação com um ou mais componente(s) terapeuticamente ativo(s) adicional(ais) selecionado(s) do grupo consistindo em: inibidores de citocina, incluindo inibidores de citocina de molécula pequena e anticorpos que se ligam a citocinas tais como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13,
IL-17, IL-18 ou a seus respectivos receptores.
[00446] Os anticorpos anti-MSR1 descritos aqui também podem ser administrados e/ou coformulados em combinação com agentes anti- inflamatórios, agentes imunomoduladores, analgésicos, corticosteroi- des, esteroides, antioxidantes, inibidores de COX, carioprotegores, queladores de metal, IFN-gama e/ou NSAIDs. Em algumas modalida- des, os anticorpos anti-MSR1 podem ser administrados e/ou coformu- lados em combinação com anticorpos anti-PCSK9, anticorpos anti- ANGPTL3, estatinas, ezetimibe e outras terapias de diminuição de li- pídeo.
[00447] O(s) componente(s) terapeuticamente ativo(s) adicio- nal(ais), por exemplo, qualquer um dos agentes listados acima ou de- rivados dos mesmos, pode(m) ser administrado(s) um pouco antes, concomitantemente com ou um pouco depois da administração de um anticorpo anti-MSR1 descrito aqui; (para propósitos da presente inven- çao, tais regimes de administração são considerados a administração de um anticorpo anti-MSR1 "em combinação com" um componente terapeuticamente ativo adicional). As modalidades incluem composi- ções farmacêuticas em que um anticorpo anti-MSR1 descrito aqui é coformulados com um ou mais do(s) componente(s) terapeuticamente ativo(s) adicional(ais) como descrito em um outro ponto aqui. Regimes de Administração
[00448] De acordo com certas modalidades, doses múltiplas de um anticorpo anti-MSR1 (ou um ADC ou uma composição farmacêutica compreendendo uma combinação de um anticorpo anti-MSR1 e qual- quer um dos agentes terapeuticamente ativos adicionais mencionados aqui) podem ser administradas a um indivíduo durante um curso de tempo definido. Os métodos compreendem administrar sequencial- mente a um indivíduo múltiplas doses de um anticorpo anti-MSR1 des- crito aqui. Como aqui usado, "administrar sequencialmente" significa que cada dose de anticorpo anti-MSR1 é administrado ao indivíduo em um ponto diferente no tempo, por exemplo, em dias diferentes separa- dos por um intervalo predeterminado (por exemplo, horas, dias, sema- nas ou meses). As modalidades incluem métodos que compreendem administrar sequencialmente ao paciente uma dose inicial única de um anticorpo anti-MSR1, seguido por uma ou mais doses secundárias do anticorpo anti-MSR1 e opcionalmente seguido por uma ou mais doses terciárias do anticorpo anti-MSR1.
[00449] Os termos "dose inicial", "doses secundárias" e "doses ter- ciárias" se referem à sequência temporal de administração do anticor- po anti-MSR1 descrito aqui. Portanto, a "dose inicial" é a dose que é administrada no início do regime de tratamento (também referida como a "dose de linha basal"); as "doses secundárias" são as doses que são administradas após a dose inicial; e as "doses terciárias" são as doses que são administradas após doses secundárias. As doses inicial, se- cundárias e terciárias podem todas conter a mesma quantidade de an- ticorpo anti-MSR1, mas geralmente podem diferir uma da outra em termos de frequência de administração. Em certas modalidades, no entanto, a quantidade de anticorpo anti-MSR1 contida nas doses inici- al, secundárias e/ou terciárias varia uma da outra (por exemplo, ajus- tadas para cima ou para baixo conforme apropriado) durante o curso de tratamento. Em certas modalidades, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4 ou 5) doses são administradas no início do regime de tratamento como "doses de carga" seguido por doses subsequentes que são ad- ministradas em uma base menos frequente (por exemplo, "doses de manutenção").
[00450] Em certas modalidades exemplares, cada dose secundária e/ou terciária é administrada 1 a 26 (por exemplo, 1, 1½, 2, 2½, 3, 3½, 4, 4½, 5, 5½, 6, 6½, 7, 7½, 8, 8½, 9, 9½, 10, 10½, 11, 11½, 12, 12½, 13, 13½, 14, 14½, 15, 15½, 16, 16½, 17, 17½, 18, 18½, 19, 19½, 20,
20½, 21, 21½, 22, 22½, 23, 23½, 24, 24½, 25, 25½, 26, 26½ ou mais) semanas após a dose imediatamente precedente. A expressão "a do- se imediatamente precedente", como aqui usado, significa, em uma sequência de administrações múltiplas, a dose de anticorpo anti-MSR1 que é administrada a um paciente antes da administração da próxima dose na sequência sem nenhuma dose entre elas.
[00451] Os métodos de acordo com esse aspecto da invenção po- dem compreender administrar a um paciente qualquer número de do- ses secundárias e/ou terciárias de um anticorpo anti-MSR1. Por exemplo, em certas modalidades, uma dose secundária única é admi- nistrada ao paciente. Em outras modalidades, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais) doses secundárias são adminis- tradas ao paciente. Da mesma maneira, em certas modalidades, uma dose terciária única é administrada ao paciente. Em outras modalida- des, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais) doses ter- ciárias são administradas ao paciente. O regime de administração po- de ser realizado indefinidamente durante o tempo de vida de um indi- víduo particular ou até tal tratamento não for mais terapeuticamente necessário ou vantajoso.
[00452] Em modalidades envolvendo doses secundárias múltiplas, cada dose secundária pode ser administrada na mesma frequência que as outras doses secundárias. Por exemplo, cada dose secundária pode ser administrada ao paciente 1 a 2 semanas ou 1 a 2 meses após a dose imediatamente precedente. Similarmente, em modalida- des envolvendo doses terciárias múltiplas, cada dose terciária pode ser administrada na mesma frequência que as outras doses terciárias. Por exemplo, cada dose terciaria pode ser administrada ao paciente 2 a 12 semanas após a dose imediatamente precedente. Em certas mo- dalidades, a frequência na qual as doses secundárias e/ou terciárias são administradas a um paciente pode variar durante o curso do regi-
me de tratamento. A frequência de administração pode ser também ajustada durante o curso de tratamento por um médico dependendo das necessidades do paciente individual seguindo exame clínico.
[00453] As modalidades incluem registros de administração em que 2 a 6 doses de carregamento são administradas a um paciente em uma primeira frequência (por exemplo, uma vez por semana, uma vez a cada dois dias, uma vez a cada três dias, uma vez por mês, uma vez a cada dois meses, etc.), seguido pela administração de duas ou mais doses de manutenção ao paciente em uma base menos frequente. Por exemplo, de acordo com esse aspecto da invenção, se as doses de carga forem administradas em uma frequência de uma vez por mês, então as doses de manutenção podem ser administradas ao paciente uma vez a cada seis semanas, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses, etc.
Usos para Diagnóstico dos Anticorpos
[00454] Os anticorpos anti-MSR1 descritos aqui podem ser também usados para detectar e/ou medir MSR1 ou células expressando MSR1 em uma amostra, por exemplo, para propósitos de diagnóstico. Por exemplo, um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento do mesmo pode ser usado para diagnosticar uma condição ou doença caracterizada por expressão aberrante (por exemplo, superexpressão, subexpressão, falta de expressão, etc.) de MSR1. Ensaios de diagnóstico exemplares para MSR1 podem compreender, por exemplo, contato de uma amos- tra, obtida de um paciente, com um anticorpo anti-MSR1 descrito aqui, em que o anticorpo anti-MSR1 é marcado com um marcador detectá- vel ou molécula repórter. Alternativamente, um anticorpo anti-MSR1 não marcado pode ser usado em aplicações de diagnóstico em combi- nação com um anticorpo secundário que é em si detectavelmente marcado. O marcador ou molécula repórter detectável pode ser pode ser um radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S ou 125I; uma porção fluo- rescente ou quimioluminescente tal como fluoresceína ou rodamina; ou uma enzima tal como fosfatase alcalina, beta-galactosidase, pero- xidase de rábano silvestre ou luciferase. Ensaios exemplares específi- cos que podem ser usados para detectar ou medir MSR1 em uma amostra incluem ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), 89 64 radioimunoensaio (RIA), imuno-PET (por exemplo, Zr, Cu, etc.) e classificação de célula ativada por fluorescência (FACS).
[00455] Amostras que podem ser usadas em ensaios de diagnósti- co de MSR1 de acordo com a presente invenção incluem qualquer amostra de tecido ou fluido obtenível de um paciente que contém quantidades detectáveis de proteína MSR1 ou fragmentos da mesma, sob condições normais ou patológicas. Em geral, os níveis de MSR1 em uma amostra particular obtida de um paciente saudável (por exemplo, um paciente não afligido com uma doença ou condição as- sociada com níveis ou atividade de MSR1 anormais) serão medidos para estabelecer inicialmente um nível de MSR1 de linha basal ou pa- drão. Esse nível de linha basal de MSR1 pode então ser comparado com os níveis de MSR1 medidos em amostras obtidas de indivíduos suspeitos ter uma doença ou condição relacionada com MSR1.
EXEMPLOS
[00456] Os exemplos que seguem são mostrados de modo a prover aqueles de habilidade na técnica uma descrição completa de como fazer e usar os métodos e composições providos aqui e não preten- dem limitar o escopo do que os inventores consideram como sua in- venção. Foram feitos esforços para assegurar a precisão com relação a números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser considerados. A me- nos que de outro modo indicado, partes são partes em peso, peso mo- lecular é peso molecular médio, temperatura é em graus Centígrados e pressão é na ou próximo da atmosférica. Os exemplos não devem ser considerados como limitantes, uma vez que os exemplos proveem apenas compreensão específica e prática das modalidades e seus vá- rios aspectos.
[00457] Como aqui usado, os símbolos e convenções usados nos processos e exemplos, aqui, estão de acordo com aqueles usados na literatura científica contemporânea, por exemplo, o Journal of the Ame- rican Chemical Society ou o Journal of Biological Chemistry a menos que especificado de outro modo o contrário. Especificamente, mas sem limitação, as abreviações que seguem podem ser usadas nos Exemplos e em todo o relatório: Abreviação Termo ADC Conjugado anticorpo-fármaco Anticorpo aglicosilado O anticorpo não tem nenhum glicano aq Aquoso BARAC Biarilazaciclo-octinona BCN (1R,8S,9s)-Biciclo[6,1,0]non-4-in-9-ila Boc N-terc-butoxicarbonila BupHTM Thermo Scientific Prod# 28372, contendo fosfato de sódio 100 mM e cloreto de sódio 150 mM, livre de potássio, o pH foi ajustado de 7,2 para 7,6-7,8 MQ, a menos que de ou- tro modo observado CD Ciclodextrina COT Ciclo-octinol Da Dalton DAR Razão fármaco para anticorpo DCM Diclorometano DIBAC Dibenz[b,f]azocina, 11,12-didesidro-5,6-di- hidro- ou Dibenzociclo-octina ou Ácido di- benz[b,f]azocino-5(6H)-butanoico, 11,12- didesidro
Abreviação Termo DIBAC-Suc Ácido dibenz[b,f]azocino-5(6H)-butanoico, 11,12-didesidro DIBACT 3H-Benzo[c]-1,2,3-triazol[4,5- e][1]benzazocina, 8,9-di-hidro- DIBO Dibenzociclo-octina DIFO Ciclo-octina difluorada DIPEA Diisopropiletilamina DMF N,N-dimetilformamida DMSO Sulfóxido de dimetila ESI Ionização por eletropulverização g Grama HATU Hexafluorfosfato de 2-(7-aza-1H- benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônico HC Cadeia pesada de imunoglobulina HEK Rim embriônico humano (células) HPLC Cromatografia Líquida de Alto desempenho hr ou hrs Horas LC Cadeia leve de imunoglobulina LC Cromatografia líquida MC Maleimidocaproíla mg Miligramas min Minutos mL Mililitros mM Milimolar MMAE Monometil auristatina E MS Espectrometria de massa MSD Detector seletivo de massa MTG Transglutaminase microbiana MW Peso molecular ncADC Conjugação de anticorpo-fármaco não cito- tóxica NHS N-hidroxi succinimida
Abreviação Termo nM nanomolar RMN Ressonância magnética nuclear NOESY Espectroscopia de efeito nuclear Overhauser PAB Para-aminobeziloxi(carbonila) PBS Tampão de fosfato de sódio 10 mM e cloreto de sódio 150 mM PBSg Fosfato 10 mM, cloreto de sódio 150 mM, glicerol 5% PEG Polietilenoglicol ppm Partes por milhão (mudança química) RP Fase reversa RT or rt Temperatura ambiente SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio SEC Cromatografia de exclusão de tamanho Suc Ácido succínico TCEP Cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina TEA Trietilamina TFA Ácido trifluoracético TG Transglutaminase THF Tetraidrofurano TOF Tempo-de-voo UPLC Cromatografia Líquida de Alto Desempenho UV Ultravioleta VA Valina-Anilina VC Valina-citrulina µL Microlitros µM micromolar
[00458] Reagentes e solventes foram obtidos de fontes comerciais tais como Sinopharm Chemical Reagent Co. (SCRC), Sigma-Aldrich, Alfa ou outros vendedores, a menos que explicitamente de outro modo declarado.
[00459] H RMN e outros espectros de RMN foram registrados em um Bruker AVIII 400 ou Bruker AVIII 500. Os dados foram processa- dos com software Nuts ou software MestReNova softwsão, medindo deslocamentos de próton em partes por milhão (ppm) no campo a par- tir de um padrão interno tetrametilsilano (TMS).
[00460] Medições de HPLC-MS foram feitas em um Agilent 1200 HPLC/6100 SQ System usando as condições que seguem.
[00461] O método A para medições de HPLC-MS incluía, como a Fase Móvel: A: Água (ácido trifluoracético 0,01% (TFA)), B: acetonitrila (0,01% TFA); Fase de Gradiente: 5% de B aumentado para 95% de B dentro de 15 minutos (min); Taxa de fluxo: 1,0 mL/min; Coluna: Sun- Fire C18, 4,6x50 mm, 3,5 µm; Temperatura da Coluna: 50 ºC. Detecto- res: Conversor Análogo para Digital (ADC) Detector de Dispersão de Luz Evaporativa (ELSD), Detector de matriz de diodo (DAD) (214 nm e 254 nm), ionização por eletropulverização-ionização atmosférica (ES- API).
[00462] O método B para medição de HPLC-MS incluía, como a Fase Móvel: A: Água (10 mM NH4HCO3), B: acetonitrila; Fase de Gra- diente: 5% a 95% de B dentro de 15 min; Taxa de Fluxo: 1,0 mL/min; Coluna: XBridge C18, 4,6x50 mm, 3,5 µm; Temperatura da Coluna: 50 ºC. Detectores: ADC ELSD, DAD (214 nm e 254 nm), detector de massa seletivo (MSD) (ES-API).
[00463] Medições de LC-MS foram realizadas em um Agilent 1200 HPLC/6100 SQ System usando as condições que seguem.
[00464] O método A para medições de LC-MS incluíam, como o Instrumento: WATERS 2767; Coluna: Shimadzu Shim-Pack, PRC- ODS, 20x250mm, 15 µm, duas conectadas em série; Fase Móvel: A: Água (0,01% TFA), B: acetonitrila (0,01% TFA); Fase de Gradiente: 5% de B aumentou para 95% de B dentro de 3 min; Taxa de Fluxo: 1,8 - 2,3 mL/min; Coluna: SunFire C18, 4,6x50 mm, 3,5 µm; Temperatura da Coluna: 50 ºC. Detectores: ADC ELSD, DAD (214 nm e 254 nm), ES-API.
[00465] O Método B para medição de LC-MS incluía, como o Ins- trumento: Gilson GX-281; Coluna: Xbridge Prep C18 10 µm OBD, 19x250 mm; Fase Móvel: A: Água (10 mM NH4HCO3), B: Acetonitrila; Fase de Gradiente: 5% a 95% de B dentro de 3 min; Taxa de Fluxo: 1,8 - 2,3 mL/min; Coluna: XBridge C18, 4,6x50 mm, 3,5 µm; Tempera- tura da Coluna: 50 ºC. Detectores: ADC ELSD, DAD (214 nm e254 nm), MSD (ES-API).
[00466] Cromatografia de alta pressão preparativa (Prep-HPLC) em um sistema solvente ácido ou básico foi utilizada em um instrumento Gilson GX-281. O sistema solvente ácido usou uma coluna Waters SunFire 10 µm C18 (100Å, 250x19 mm) e solvente A para HPLC prep. era água/0,05% TFA e solvente B era acetonitrila. As condições de eluição foram um aumento de gradiente linear de solvente B de 5% para 100% durante um período de tempo de 20 min em uma Taxa de Fluxo de 30 mL/min. O sistema solvente básico incluía uma coluna Waters Xbridge 10 µm C18 (100 Å, 250x19 mm) e solvente A usado para HPLC prep. era água/bicarbonato de amônio 10 mM (NH4HCO3) e solvente B era acetonitrila. As condições de eluição foram um au- mento de gradiente linear de solvente B de 5% para 100% durante um período de tempo de 20 min em uma Taxa de Fluxo de 30 mL/min.
[00467] Cromatografia flash foi realizada em um instrumento Biota- ge, com cartuchos Agela Flash Column silica-CS; Cromatografia flash de fase reversa foi realizada em instrumento Biotage, com cartuchos Boston ODS ou Agela C18. Método de HPLC quiral analítico - condições SFC: a) Instrumento: SFC Method Station (Thar, Waters) b) Coluna: CHIRALPAK AD-H/AS-H/OJ-H/OD-H 4,6×100mm, 5 µm (Daicel)
c) Temperatura da Coluna: 40 ºC d) Fase Móvel: CO2/ IPA(0,1% DEA)= 55/45 e) Fluxo: 4,0 ml/min f) Retropressão: 120 Bar g) Volume de injeção: 2 µL.
[00468] Método de HPLC quiral analítico - condições SFC: a) Instrumento: SFC-80 (Thar, Waters) b) Coluna: CHIRALPAK AD-H/AS-H/OJ-H/OD-H 20×250mm, 10 µm (Daicel) c) Temperatura da Coluna: 35 ºC d) Fase Móvel: CO2/ IPA(0,2% Metanol Amônia)= 30/70 e) Taxa de Fluxo: 80 g/min f) Retropressão: 100 bar g) Comprimento de onda de detecção: 214 nm h) Tempo de ciclo: 6,0 min i) Solução de amostra: 1500 mg dissolvidos em 70 mL de Metanol j) Volume de injeção: 2 mL (carregamento: 42,86 mg/injeção).
[00469] Como aqui usado, os símbolos e convenções usados nes- ses processos, esquemas e exemplos, sem importar se uma abrevia- ção particular é especificamente definida, estão de acordo com aque- les usados na literatura científica contemporânea, por exemplo, o Journal of the American Chemical Society ou o Journal of Biological Chemistry. Exemplo 1. Geração de Anticorpos Anti-MSR1
[00470] Anticorpos anti-MSR1 foram obtidos através de imunização de um camundongo geneticamente engenheirado compreendendo DNA codificando regiões variáveis de cadeia pesada e leve kappa da imunoglobulina humana com um imunógeno compreendendo domínio extracelular de MSR1 humano recombinante fundido a um marcador não histidina N-terminal (R&D Systems, #Catalog 2708-MS-050, Mi- neápolis, MN). Os camundongos usados para as imunizações foram camundongos Velocimmune ou camundongos que expressaram uma "cadeia leve universal" (camundongos "ULC"). Anticorpos produzidos por camundongo ULC têm regiões variáveis de cadeia pesada diferen- tes, mas domínios variáveis de cadeia leve essencialmente idênticos.
[00471] A resposta imune de anticorpo foi monitorada através de um imunoensaio específico de MSR1. Quando uma resposta imune desejada foi obtida, esplenócitos foram coletados e fundidos com célu- las de mieloma de camundongo para preservar sua viabilidade e for- mar linhagens de célula de hibridoma. As linhagens de célula de hibri- doma foram avaliadas e selecionadas para identificar linhagens de cé- lula que produzem anticorpos específicos de MSR1. Usando essa téc- nica, vários anticorpos quiméricos anti-MSR1 (isto é, anticorpos pos- suindo domínios variáveis humanos e domínios constante de camun- dongo) foram obtidos. Ainda, vários anticorpos anti-MSR1 humanos foram isolados diretamente de células B positivas para antígeno sem fusão a células de mieloma, como descrito na US 2007/0280945A1.
[00472] Certas propriedades biológicas dos anticorpos anti-MSR1 exemplares gerados de acordo com os métodos do presente exemplo são descritas em detalhes nos exemplos mostrados abaixo. Exemplo 2. Sequências de Aminoácido e Ácido Nucleico de Regi- ão Variável de Cadeias Pesada e Leve
[00473] A Tabela 4 mostra os identificadores de sequência de ami- noácido das regiões variáveis de cadeias pesada e leve e CDRs de anticorpos anti-MSR1 selecionados descritos aqui. Os identificadores de sequência de ácido nucleico correspondentes são mostrados na Tabela 5.
Tabela 4. Identificadores de Sequência de Aminoácido SEQ ID NOs: Designação do HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3 Anticorpo H1H21227N 2 4 6 8 10 12 14 16 H1H21228N 18 20 22 24 26 28 30 32 H1H21231N 34 36 38 40 42 44 46 48 H1H21234N 50 52 54 56 58 60 62 64 H1H21235N 66 68 70 72 74 76 78 80 H1H25685N 82 84 86 88 90 92 94 96 H1H25690N 98 100 102 104 106 108 110 112 H1H25695N 114 116 118 120 122 124 126 128 H1H25700N 130 132 134 136 138 140 142 144 H1H27729P 146 148 150 152 154 156 158 160 H1H27731P 162 164 166 168 170 172 174 176 H1H27732P 178 180 182 184 186 188 190 192 H1H27734P 194 196 198 200 202 204 206 208 H1H27736P 210 212 214 216 218 220 222 224 H1H27739P 226 228 230 232 234 236 238 240 H1H27747P 242 244 246 248 250 252 254 256 H1H27749P 258 260 262 264 266 268 270 272 H1H27751P 274 276 278 280 282 284 286 288 H1H27754P 290 292 294 296 298 300 302 304 H1H27756P 306 308 310 312 314 316 318 320 H1H27760P2 322 324 326 328 90 92 94 96 H1H27761P2 330 332 334 336 90 92 94 96 H1H27762P2 338 340 342 344 90 92 94 96 H1H27766P2 346 348 350 352 90 92 94 96 H1H27771P2 354 356 358 360 362 364 366 368 H1xH27759P2 370 372 374 376 90 92 94 96 H1xH27773P2 378 380 382 384 362 364 366 368 H1xH27778P2 386 388 390 392 362 364 366 368 H1xH29273P2 394 396 397 400 90 92 94 96 H1xH29282P2 402 404 406 408 90 92 94 96 H1xH29283P2 410 412 414 416 90 92 94 96 H2M21229N 420 422 424 426 428 430 432 434 H2M21230N 436 438 440 442 444 446 448 450 H2M21232N 452 454 456 458 460 462 464 466
Tabela 5. Identificadores de Sequência de Ácido Nucleico SEQ ID NOs: Designação do HCVR HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCVR LCDR1 LCDR2 LCDR3 Anticorpo H1H21227N 1 3 5 7 9 11 13 15 H1H21228N 17 19 21 23 25 27 29 31 H1H21231N 33 35 37 39 41 43 45 47 H1H21234N 49 51 53 55 57 59 61 63 H1H21235N 65 67 69 71 73 75 77 79 H1H25685N 81 83 85 87 89 91 93 95 H1H25690N 97 99 101 103 105 107 109 111 H1H25695N 113 115 117 119 121 123 125 127 H1H25700N 129 131 133 135 137 139 141 143 H1H27729P 145 147 149 151 153 155 157 159 H1H27731P 161 163 165 167 169 171 173 175 H1H27732P 177 179 181 183 185 187 189 191 H1H27734P 193 195 197 199 201 203 205 207 H1H27736P 209 211 213 215 217 219 221 223 H1H27739P 225 227 229 231 233 235 237 239 H1H27747P 241 243 245 247 249 251 253 255 H1H27749P 257 259 261 263 265 267 269 271 H1H27751P 273 275 277 279 281 283 285 287 H1H27754P 289 291 293 295 297 299 301 303 H1H27756P 305 307 309 311 313 315 317 319 H1H27760P2 321 323 325 327 89 91 93 95 H1H27761P2 329 331 333 335 89 91 93 95 H1H27762P2 337 339 341 343 89 91 93 95 H1H27766P2 345 347 349 351 89 91 93 95 H1H27771P2 353 355 357 359 361 363 365 367 H1xH27759P2 369 371 373 375 89 91 93 95 H1xH27773P2 377 379 381 383 361 363 365 367 H1xH27778P2 385 387 389 391 361 363 365 367 H1xH29273P2 393 395 397 399 89 91 93 95 H1xH29282P2 401 403 405 407 89 91 93 95 H1xH29283P2 409 411 413 415 89 91 93 95 H2M21229N 419 421 423 425 427 429 431 433 H2M21230N 435 437 439 441 443 445 447 449 H2M21232N 451 453 455 457 459 461 463 465
[00474] Os anticorpos são tipicamente referidos aqui de acordo com a nomenclatura que segue: prefixo Fc (por exemplo, "H1H," "H2aM," etc.), seguido por um identificador numérico (por exemplo, "21227," "21228," "21231," etc.), seguido por um sufixo "P," "N" ou "P2" como mostrado nas Tabelas 4 e 5. Portanto, de acordo com essa nomencla- tura, um anticorpo pode ser referido aqui como, por exemplo, "H1H21227N," "H2aM21228N," "H1H27729P," "H1H27760P2", etc. O prefixo nas designações de anticorpo usadas aqui indica o isótipo da região Fc particular do anticorpo. Em particular, um anticorpo "H1H" tem um Fc IgG1 humano (todas as regiões variáveis são totalmente humanas como denotado pelo primeiro 'H' na designação de anticor- po), enquanto um anticorpo "H2aM" tem um Fc IgG2a de camundongo. Como será compreendido por um versado de habilidade comum na técnica, um anticorpo tendo um isótipo de Fc particular pode ser con- vertido em um anticorpo com um isótipo de Fc diferente (por exemplo, um anticorpo com um Fc IgG4 de camundongo pode ser convertido em um anticorpo com um IgG1 humano, etc.), mas em qualquer caso, os domínios variáveis (incluindo as CDRs) - que são indicados pelos identificadores numéricos mostrados nas Tabelas 4 e 5 - permanece- rão os mesmos e as propriedades de ligação são esperadas ser idên- ticas ou substancialmente similares sem importa a natureza do domí- nio Fc.
[00475] Modificações de Anticorpo. Três anticorpos anti-MSR1 des- critos no Exemplo 1 (21227N, 21231N, 21234N) foram produzidos com a porção Fcγ humana original, bem como uma versão com uma muta- ção pontual única N297Q para todos os três anticorpos anti-MSR1. Todos os outros anticorpos descritos aqui foram feitos com mutação pontual única N297Q em porção Fcγ humana. Uma terceira versão, uma mutação N297D, foi produzida para o anticorpo 21227N apenas. Exemplo 3. Afinidades de Ligação e Constantes Cinéticas Deriva-
das de Ressonância de Plasmon de Superfície de Anticorpos Anti- MSR1 Monoclonais Humanos
[00476] Afinidades de ligação e constantes cinéticas de anticorpos anti-MSR1 humanos para reagentes de MSR1 diferentes foram deter- minadas através de ressonância de plasmon de superfície em tempo real (Biacore 4000). Todos os estudos foram realizados em HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM e Tensoativo Tween-20 0,05% v/v, tampão contínuo pH 7,4 (HBS-ET) a 25º C e 37º C. A superfície do sensor chip Biacore CM4 foi primeiro derivatizada através de acopla- mento amina com o anticorpo policlonal específico Fcγ anti-humano de cabra (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Cat# BR-1008-39) pa- ra capturar anticorpos monoclonais anti-MSR1. Estudos de ligação fo- ram realizados para capturar anticorpos monoclonais anti-MSR1. Es- tudos de ligação foram realizados em domínio extracelular de MSR1 humano expresso com um marcador não histidina N-terminal (His9- hMSR1; R&D Systems, Cat# 2708-MS) e domínio extracelular de MSR1 de macaco expresso com um marcador myc-myc-hexaistidina- N-terminal (HMM-mfMSR1; SEQ ID NO: 418). Concentrações diferen- tes de His9-hMSR1 e HMM-mfMSR1 (100 nM - 3,7 nM; diluição serial de 3 vezes) foram primeiro preparadas em tampão contínuo HBS-ET e foram injetadas em superfície de anticorpo monoclonal anti-MSR1 cap- turado Fcγ anti-humano por 3 minutos em uma taxa de fluxo de 30 µL/minuto, enquanto a dissociação de reagente de MSR1 ligado a an- ticorpo monoclonal foi monitorada por 10 minutos em tampão contínuo HBS-ET.
[00477] A taxa de associação (ka) e a taxa de dissociação (kd) foram determinadas ajustando os sensorgramas de ligação em tempo real a um modelo de ligação 1:1 com uma limitação de transporte de massa usando software de ajuste de curva Scrubber 2.0c. Constante de dis- sociação de equilíbrio de ligação (KD) e meia-vida dissociativa (t1/2) fo-
ram calculadas a partir das taxas cinéticas como: KD (M) = e t½ (min) =
[00478] Parâmetros cinéticos de ligação para ligação de His9- hMSR1 ou HMM-mfMSR1 a anticorpos monoclonais anti-MSR1 a 25º C e 37º C são mostrados nas Tabelas 6 e 7, respectivamente. Tabela 6. Afinidade de Ligação Biacore de mAbs Anti-MSR1 a 25º
C Ligação a 25 °C / Formato Captura de Anticorpo Anticorpo Analito ka (M-1s-1) kd (s-1) KD (Molar) t½ (min) H1H21227N- His9-hMSR1 1,23E+06 4,89E-05 3,97E-11 236 N297Q HMM-mfMSR1 1,36E+06 7,51E-05 5,53E-11 154 H1H21227N- His9-hMSR1 1,14E+06 3,79E-05 3,33E-11 305 N297D HMM-mfMSR1 1,35E+06 4,03E-05 2,99E-11 287 H1H21231N- His9-hMSR1 3,99E+05 5,88E-05 1,47E-10 196 N297Q HMM-mfMSR1 2,40E+05 9,03E-05 3,76E-10 128 H1H21234N- His9-hMSR1 4,97E+05 1,00E-05* 2,01E-11 1155 N297Q HMM-mfMSR1 4,08E+05 1,95E-05 4,66E-11 593 H1H27729P- His9-hMSR1 1,97E+05 1,07E-03 5,45E-09 11 N297Q HMM-mfMSR1 2,69E+05 2,12E-03 7,90E-09 5 H1H27731P- His9-hMSR1 1,29E+05 2,24E-05 1,74E-10 515 N297Q HMM-mfMSR1 9,82E+04 4,69E-05 4,77E-10 247 H1H27732P- His9-hMSR1 1,25E+05 1,00E-05* 8,01E-11 1155 N297Q HMM-mfMSR1 1,28E+05 3,17E-05 2,48E-10 364 H1H27734P- His9-hMSR1 4,20E+05 1,11E-03 2,64E-09 10 N297Q HMM-mfMSR1 4,23E+05 2,91E-03 6,88E-09 4 H1H27736P- His9-hMSR1 5,15E+05 2,31E-04 4,48E-10 50 N297Q HMM-mfMSR1 4,64E+05 5,87E-04 1,27E-09 20 H1H27739P- His9-hMSR1 3,75E+05 1,03E-03 2,74E-09 11 N297Q HMM-mfMSR1 3,52E+05 1,44E-04 4,10E-10 80 H1H27747P- His9-hMSR1 2,43E+05 6,52E-04 2,69E-09 18 N297Q HMM-mfMSR1 2,31E+05 8,74E-04 3,78E-09 13 H1H27749P- His9-hMSR1 3,18E+05 1,76E-05 5,54E-11 656 N297Q HMM-mfMSR1 2,49E+05 4,27E-05 1,71E-10 271 H1H27751P- His9-hMSR1 1,78E+06 3,05E-04 1,72E-10 38 N297Q HMM-mfMSR1 7,44E+05 7,49E-04 1,01E-09 15 H1H27754P- His9-hMSR1 2,90E+05 1,00E-05* 3,44E-11 1155
Ligação a 25 °C / Formato Captura de Anticorpo Anticorpo Analito ka (M-1s-1) kd (s-1) KD (Molar) t½ (min) N297Q HMM-mfMSR1 2,35E+05 1,76E-05 7,50E-11 657 H1H27756P- His9-hMSR1 3,00E+05 1,22E-04 4,06E-10 94 N297Q HMM-mfMSR1 3,58E+05 2,44E-03 6,81E-09 5 H1H27760P- His9-hMSR1 4,54E+05 9,09E-04 2,00E-09 13 N297Q HMM-mfMSR1 3,63E+05 7,01E-04 1,93E-09 16 H1H27759P- His9-hMSR1 5,99E+05 1,22E-03 2,03E-09 9 N297Q HMM-mfMSR1 4,17E+05 9,19E-04 2,20E-09 13 H1H27761P- His9-hMSR1 3,12E+05 5,10E-04 1,63E-09 23 N297Q HMM-mfMSR1 3,18E+05 5,97E-04 1,88E-09 19 H1H27762P- His9-hMSR1 9,89E+05 1,83E-03 1,85E-09 6 N297Q HMM-mfMSR1 1,25E+06 1,99E-03 1,59E-09 6 H1H27766P- His9-hMSR1 2,34E+05 1,86E-05 7,96E-11 620 N297Q HMM-mfMSR1 1,57E+05 7,94E-05 5,06E-10 145 H1H27771P- His9-hMSR1 6,86E+05 9,58E-04 1,40E-09 12 N297Q HMM-mfMSR1 5,19E+05 5,26E-03 1,01E-08 2,2 H1H27773P- His9-hMSR1 6,58E+05 2,63E-03 3,99E-09 4 N297Q HMM-mfMSR1 6,43E+05 1,96E-03 3,05E-09 6 H1H27778P- His9-hMSR1 5,75E+05 3,94E-04 6,85E-10 29 N297Q HMM-mfMSR1 4,67E+05 1,36E-03 2,91E-09 8 H1H21234N His9-hMSR1 6,04E+05 1,00E-05* 1,66E-11 1155 HMM-mfMSR1 3,36E+05 1,00E-05* 2,98E-11 1155 H1H21231N His9-hMSR1 4,77E+05 1,00E-05* 2,10E-11 1155 HMM-mfMSR1 2,74E+05 6,39E-05 2,33E-10 181 H1H21227N His9-hMSR1 1,20E+06 1,44E-05 1,20E-11 800 HMM-mfMSR1 1,27E+06 4,41E-05 3,48E-11 262 Controle Não His9-hMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ ligação HMM-mfMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ * indica que nenhuma dissociação de His9-hMSR1 ou HMM-mfMSR1 foi observada sob as condições experimentais atuais e o valor de kd foi fixado manualmente em 1,00E-05 enquanto ajustando os dados. $ indica que nenhuma ligação foi observada sob condições experimen- tais atuais.
Tabela 7: Afinidades de Ligação Biacore de mAbs Anti-MSR1 37°C Ligação a 37 °C / Formato Captura de Anticorpo Anticorpo Analito ka (M-1s-1) kd (s-1) KD (Molar) t½ (min) H1H21227N- His9-hMSR1 2,67E+06 1,23E-05 4,60E-12 941 N297Q HMM-mfMSR1 2,74E+06 1,08E-05 3,95E-12 1069 H1H21227N- His9-hMSR1 2,73E+06 1,00E-05* 3,66E-12 1155 N297D HMM-mfMSR1 2,68E+06 2,42E-05 9,03E-12 477 H1H21231N- His9-hMSR1 5,34E+05 1,15E-04 2,15E-10 101 N297Q HMM-mfMSR1 5,87E+05 1,09E-04 1,86E-10 106 H1H21234N- His9-hMSR1 7,87E+05 1,00E-05* 1,27E-11 1155 N297Q HMM-mfMSR1 7,50E+05 1,00E-05* 1,33E-11 1155 H1H27729P- His9-hMSR1 2,39E+05 2,04E-03 8,53E-09 6 N297Q HMM-mfMSR1 4,07E+05 3,49E-03 8,58E-09 3,3 H1H27731P- His9-hMSR1 2,86E+05 1,32E-04 4,62E-10 88 N297Q HMM-mfMSR1 2,78E+05 1,87E-04 6,74E-10 62 H1H27732P- His9-hMSR1 2,81E+05 3,12E-05 1,11E-10 370 N297Q HMM-mfMSR1 3,34E+05 1,06E-04 3,17E-10 109 H1H27734P- His9-hMSR1 1,09E+06 1,90E-03 1,74E-09 6 N297Q HMM-mfMSR1 9,49E+05 3,20E-03 3,37E-09 4 H1H27736P- His9-hMSR1 1,02E+06 7,33E-04 7,17E-10 16 N297Q HMM-mfMSR1 2,01E+06 1,28E-03 6,37E-10 9 H1H27739P- His9-hMSR1 7,76E+05 2,88E-03 3,72E-09 4 N297Q HMM-mfMSR1 2,25E+06 8,42E-04 3,74E-10 14 H1H27747P- His9-hMSR1 5,13E+05 2,76E-03 5,37E-09 4 N297Q HMM-mfMSR1 6,57E+05 2,28E-03 3,47E-09 5 H1H27749P- His9-hMSR1 4,97E+05 2,42E-04 4,86E-10 48 N297Q HMM-mfMSR1 4,77E+05 1,72E-04 3,61E-10 67 H1H27751P- His9-hMSR1 1,45E+06 9,43E-04 6,50E-10 12 N297Q HMM-mfMSR1 1,17E+06 1,80E-03 1,55E-09 6 H1H27754P- His9-hMSR1 6,63E+05 2,53E-05 3,81E-11 457 N297Q HMM-mfMSR1 7,01E+05 3,53E-05 5,04E-11 327 H1H27756P- His9-hMSR1 6,63E+05 7,71E-04 1,16E-09 15 N297Q HMM-mfMSR1 8,02E+05 3,19E-03 3,97E-09 4 H1H27760P- His9-hMSR1 1,08E+06 1,89E-03 1,74E-09 6 N297Q HMM-mfMSR1 1,52E+06 1,59E-03 1,05E-09 7 H1H27759P- His9-hMSR1 1,03E+06 2,30E-03 2,24E-09 5 N297Q HMM-mfMSR1 1,46E+06 1,88E-03 1,28E-09 6 H1H27761P- His9-hMSR1 6,81E+05 2,22E-03 3,26E-09 5
Ligação a 37 °C / Formato Captura de Anticorpo Anticorpo Analito ka (M-1s-1) kd (s-1) KD (Molar) t½ (min) N297Q HMM-mfMSR1 9,20E+05 2,14E-03 2,32E-09 5 H1H27762P- His9-hMSR1 3,06E+06 1,96E-03 6,40E-10 6 N297Q HMM-mfMSR1 2,82E+06 1,97E-03 6,98E-10 6 H1H27766P- His9-hMSR1 3,40E+05 7,72E-05 2,27E-10 150 N297Q HMM-mfMSR1 3,43E+05 5,89E-04 1,72E-09 20 H1H27771P- His9-hMSR1 1,35E+06 2,04E-03 1,51E-09 6 N297Q HMM-mfMSR1 4,94E+05 9,07E-03 1,84E-08 1,3 H1H27773P- His9-hMSR1 9,19E+05 3,07E-03 3,34E-09 4 N297Q HMM-mfMSR1 9,60E+05 5,06E-03 5,27E-09 2,3 H1H27778P- His9-hMSR1 1,19E+06 6,55E-04 5,49E-10 18 N297Q HMM-mfMSR1 1,19E+06 1,25E-03 1,05E-09 9 H1H21234N His9-hMSR1 6,76E+05 1,00E-05* 1,48E-11 1155 HMM-mfMSR1 7,26E+05 1,00E-05* 1,38E-11 1155 H1H21231N His9-hMSR1 7,02E+05 9,09E-05 1,30E-10 127 HMM-mfMSR1 7,12E+05 7,82E-05 1,10E-10 148 H1H21227N His9-hMSR1 2,56E+06 1,85E-05 7,24E-12 624 HMM-mfMSR1 2,76E+06 1,00E-05* 3,62E-12 1155 $ $ $ Controle Não His9-hMSR1 NB NB NB NB$ ligação HMM-mfMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ * indica que nenhuma dissociação de His9-hMSR1 ou HMM-mfMSR1 foi observada sob as condições experimentais atuais e o valor de kd foi fixado manualmente em 1,00E-05 enquanto ajustando os dados. $ indica que nenhuma ligação foi observada sob condições experimen- tais atuais.
[00479] A 25º C, todos dos anticorpos monoclonais anti-MSR1 da invenção se ligaram a His9-hMSR1 com valores KD variando de 12 pM a 5,45 nM, como mostrado na Tabela 6. A 37º C, todos dos anticorpos monoclonais anti-MSR1 da invenção se ligaram a His9-hMSR1 com valores de KD variando de 3,66 pM a 8,53 nM, como mostrado na Ta- bela 7.
[00480] A 25º C, todos dos anticorpos monoclonais anti-MSR1 da invenção se ligaram a HMM-mfMSR1 com valores de KD variando de 29,9 pM a 10,1 nM, como mostrado na Tabela 6. A 37°C, todos os an-
ticorpos monoclonais anti-MSR1 da invenção se ligaram a HMM- mfMSR1 com valores de KD variando de 3,62 pM a 18,4 nM, como mostrado na Tabela 7. Exemplo 4. Afinidades de Ligação e Constantes Cinéticas Deriva- das de Anticorpos Anti-MSR1 Monoclonais Humanos Derivadas de Octet
[00481] Afinidades de ligação e constantes cinéticas de anticorpos anti-MSR1 humanos para reagentes de MSR1 diferentes foram deter- minadas usando um ensaio interferometria de biocamada livre de mar- cador, em tempo real, em uma plataforma biossensora OCTET® HTX (Pall FortéBio Corp., Menlo Park, CA). O experimento foi realizado a 25º C em HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, Tensoativo Tween-20 0,05% v/v e 1 mg/mL de BSA, tampão pH 7,4 (HBS-EBT) com a placa agitando na velocidade de 1000 rpm. Estudos de ligação foram realizados em domínio extracelular de MSR1 humano expresso com um marcador não histidina N-terminal (His9-hMSR1; R&D Sys- tems, Cat # 2708-MS), domínio extracelular de MSR1 de macaco ex- presso com um marcador myc-myc-hexaistidina N-terminal (HMM- mfMSR1; SEQ ID NO: 418) e domínio extracelular MSR1 de camun- dongo expresso com um marcador não histidina N-terminal (His9- mMSR1; R&D Systems, Cat# 1797-MS). Os anticorpos monoclonais anti-MSR1 foram capturados mergulhando biossensores Octet ou Fc anti-humano (AHC) ou Fc anticamundongo (AM) em poços contendo 5 μg/mL ou 10 μg/mL de anticorpo monoclonal anti-MSR1pfor 45-90 se- gundos. Os anticorpos monoclonais anti-MSR1 capturados com AHC foram então mergulhados em poços contendo 50 nM de His9-mMSR1, enquanto os anticorpos monoclonais anti-MSR1 capturados com AMC foram mergulhados em poços contendo concentrações diferentes de His9-hMSR1 ou HMM-mfMSR1 (100 nM, 25 nM) ou 100 nM His9- mMSR1. A ligação de reagentes de MSR1 diferentes a anticorpo mo-
noclonal anti-MSR1 capturado foi medida por 4 minutos e a dissocia- ção de anticorpo monoclonal ligado a reagente de MSR1 foi monitora- da por 8-10 minutos em tampão de HBS-EBT.
[00482] A taxa de associação (ka) e a taxa de dissociação (kd) foram determinadas ajustando os sensorgramas de ligação em tempo real para um modelo de ligação 1:1 com limitação de transporte de massa usando software de ajuste de curva Scrubber 2.0c. Constante de dis- sociação de equilíbrio de ligação (KD) e meia-vida dissociativa (t1/2) fo- ram calculadas a partir das taxas cinéticas como: KD (M) = e t½ (min) =
[00483] Parâmetros cinéticos de ligação para His9-hMSR1, HMM- mfMSR1 ou His9-mMSR1 se ligando a anticorpos monoclonais anti- MSR1 diferentes da invenção a 25º C são mostrados nas Tabelas 8 e
9. Tabela 8: Afinidades de ligação de OCTET® de mAbs Anti-MSR1 a 25 °C Ligação a 25 °C / Formato Captura de Anticorpo Anticorpo Analito ka (M-1s-1) kd (s-1) KD (Molar) t½ (min) H2aM21228N His9-hMSR1 1,22E+05 1,16E-04 9,54E-10 100 HMM-mfMSR1 1,00E+05 1,46E-04 1,45E-09 79 H2aM21229N His9-hMSR1 3,00E+05 2,10E-04 7,00E-10 55 HMM-mfMSR1 1,35E+05 2,22E-03 1,64E-08 5 H2aM21230N His9-hMSR1 6,47E+05 2,87E-04 4,43E-10 40 HMM-mfMSR1 2,37E+05 3,76E-04 1,59E-09 31 H2aM21232N His9-hMSR1 1,30E+05 2,86E-04 2,20E-09 40 HMM-mfMSR1 9,75E+04 3,27E-04 3,35E-09 35 H2aM21235N His9-hMSR1 1,21E+05 4,58E-05 3,78E-10 252 HMM-mfMSR1 1,02E+05 6,27E-05 6,12E-10 184 H2aM25700N His9-hMSR1 5,58E+05 1,14E-04 2,05E-10 101 HMM-mfMSR1 5,53E+05 1,15E-04 2,08E-10 100 H2aM25690N His9-hMSR1 2,29E+05 3,11E-04 1,36E-09 37 HMM-mfMSR1 1,64E+05 5,47E-04 3,35E-09 21 H2aM25695N His9-hMSR1 3,60E+05 5,27E-04 1,46E-09 22 HMM-mfMSR1 3,12E+05 5,71E-04 1,83E-09 20
Ligação a 25 °C / Formato Captura de Anticorpo Anticorpo Analito ka (M-1s-1) kd (s-1) KD (Molar) t½ (min) H2aM25685N His9-hMSR1 2,01E+05 3,97E-04 1,98E-09 29 HMM-mfMSR1 6,49E+04 1,28E-03 1,97E-08 9 $ $ $ Controle Isótipo His9-hMSR1 NB NB NB NB$ mIgG HMM-mfMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ $ Indica que nenhuma ligação foi observada sob as condições experi- mentais atuais.
Tabela 9: Afinidades de Ligação de OCTET® de mAbs Anti-MSR1 a 25 °C Ligação a 25 °C / Formato Captura de Anticorpo Anticorpo Analito ka (M-1s-1) kd (s-1) KD (Molar) t½ (min) $ $ H2aM21228N His9-mMSR1 NB NB NB$ NB$ H2aM21229N His9-mMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ H2aM21230N His9-mMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ H2aM21232N His9-mMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ H2aM21235N His9-mMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ H2aM25700N His9-mMSR1 3,60E+04 1,85E-04 5,20E-09 63 $ $ $ H2aM25690N His9-mMSR1 NB NB NB NB$ H2aM25695N His9-mMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ H2aM25685N His9-mMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ Controle Isótipo His9-mMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ mIgG H1H21227N- His9-mMSR1 3,74E+05 7,08E-04 1,89E-09 16 N297Q H1H21227N- His9-mMSR1 4,61E+05 7,86E-04 1,71E-09 15 N297D H1H21231N- His9-mMSR1 IC# IC# IC# IC# N297Q H1H21234N- His9-mMSR1 3,82E+04 5,00E-05* 1,31E-09 231 N297Q H1H27729P His9-mMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ N297Q H1H27731P- His9-mMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ N297Q H1H27732P- His9-mMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ N297Q
Ligação a 25 °C / Formato Captura de Anticorpo Anticorpo Analito ka (M-1s-1) kd (s-1) KD (Molar) t½ (min) $ $ H1H27734P- His9-mMSR1 NB NB NB$ NB$ N297Q H1H27736P- His9-mMSR1 IC# IC# IC# IC# N297Q H1H27739P- His9-mMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ N297Q H1H27747P- His9-mMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ N297Q H1H27749P- His9-mMSR1 IC# IC# IC# IC# N297Q H1H27751P- His9-mMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ N297Q H1H27754P- His9-mMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ N297Q H1H27756P- His9-mMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ N297Q H1H27760P- His9-mMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ N297Q H1H27759P- His9-mMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ N297Q H1H27761P- His9-mMSR1 IC# IC# IC# IC# N297Q H1H27762P- His9-mMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ N297Q H1H27766P- His9-mMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ N297Q H1H27771P- His9-mMSR1 IC# IC# IC# IC# N297Q H1H27773P- His9-mMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ N297Q H1H27778P- His9-mMSR1 NB$ NB$ NB$ NB$ N297Q H1H21234N His9-mMSR1 4,60E+04 5,00E-05* 1,09E-09 231 # # # H1H21231N His9-mMSR1 IC IC IC IC# H1H21227N His9-mMSR1 4,15E+05 8,16E-04 1,97E-09 14 $ $ $ Controle Não liga- His9-mMSR1 NB NB NB NB$ ção * Indica que nenhuma dissociação de His9-mMSR1 foi observada sob condições experimentais atuais e o valor kd foi manualmente fixado em
5,00E-05 enquanto ajustando os dados. $ Indica que nenhuma ligação foi observada sob condições experimen- tais atuais. # Indica que os dados de ligação são inconclusivos (IC).
[00484] Os anticorpos monoclonais anti-MSR1 se ligaram a His9- hMSR1 com valores de KD variando de 205 pM a 2,2 nM, como mos- trado na Tabela 8. Os anticorpos monoclonais anti-MSR1 se ligaram a HMM-mfMSR1 com valores de KD variando de 208 pM a 19,7 nM, co- mo mostrado na Tabela 8.
[00485] Como mostrado na Tabela 9, 23 de 35 anticorpos monoclo- nais anti-MSR1 não se ligaram a His9-mMSR1, enquanto os dados de ligação para 6 anticorpos monoclonais anti-MSR1 foram inconclusivos. Seis (6) de 35 anticorpos monoclonais anti-MSR1 se ligaram a His9- mMSR1 com valores de KD variando de 1,09 nM a 5,2 nM, como mos- trado na Tabela 9. Exemplo 5. Anticorpos Anti-MSR1 Exibem Ligação Específica a MSR1 de Humano e Macaco Expresso na Superfície Celular
[00486] A habilidade de anticorpos monoclonais anti-MSR1 em se ligar a células expressando MSR1 de humano ou macaco foi determi- nada usando detecção baseada em eletroquimioluminescência (ECL).
[00487] Geração de linhagens de célula expressando MSR1. Duas linhagens de célula superexpressando ou MRS1 de humano ou de macaco foram geradas. Para gerar a linhagem de célula superexpres- são MSR1 humano, células 293 de rim embriônico humano (HEK) fo- ram engenheiradas através de transdução com vetor lentiviral resisten- te à higromicina codificando MSR1 humano de comprimento integral (hMSR1, aminoácidos M1-L451 de número de acesso NP_619729.1) com um marcador Myc C-terminal. A linhagem de célula resultante é referida como HEK293.Myc.hMSR1. Similarmente, para gerar a linha- gem de célula superexpressando MSR1 de macaco, células HEK293 foram engenheiradas através de transfecção com o plasmídeo de ex- pressão resistente à geneticina codificando MSR1 de macaco de com- primento integral (Macaca fascicularis, mfMSR1, aminoácidos M1- L451 de número de acesso XP_005562705,1). A linhagem de célula resultante é referida como células HEK293.mfMSR1. Para medir a ha- bilidade de anticorpos em se ligar a MSR1 humano expresso endoge- namente, células monocíticas humanas THP-1 foram tratadas com 200 nM de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA; Sigma, Cat # P8139) por 72 horas para induzir expressão de MSR1 alta antes da ligação do an- ticorpo. Células HEK293 não transfectadas foram incluídas como con- troles de ligação não específica uma vez que elas não têm nenhuma expressão detectável de MSR1 através de sequenciamento de próxi- ma geração de expressão de gene (dados não mostrados).
[00488] Ensaio de ligação de anticorpo. Para realizar o ensaio de ligação de anticorpo, células de cada uma das linhagens de célula descritas acima foram enxaguadas uma vez em tampão PBS sem Ca2+/Mg2+ e incubadas por 5 minutos a 37°C com Enzyme Free Cell Dissociation Solution (Millipore, Cat. # S-004-C, Burlington, MA) para soltar células de um frasco. Todas as células foram lavadas uma vez com 1xPBS com Ca2+/Mg2+ e contadas com contador de células Cel- lometerTM Auto T4 (Nexcelom Bioscience). Aproximadamente 1,0x104 células foram semeadas separadamente em placas de eletrodo de carbono de 96 poços [MULTI- ARRAY high bind plate, Meso Scale Di- agnostics] e incubadas por 1 hora a 37oC. Sítios de ligação não espe- cífica foram então bloqueados por BSA 2% (p/v) em PBS com Ca2+/Mg2+ por 1 hora em temperatura ambiente. Células THP-1 foram preincubadas por 0,5 hora em temperatura ambiente em tampão de diluição de amostra com: 1) 1 mg/mL de reagentes de bloqueio de re- ceptor de Fc para bloquear receptores gama Fc em superfície de célu- la THP-1 [IgG humano de molécula inteira (Jackson Immunoresearch,
#Cat 009-000-003) para poços sendo testados com anticorpos anti- MSR1-mFC ou 2) mIgG de molécula inteira (Jackson Immunoresearch, Cat #015-000-003) para poços sendo testados com anticorpos anti- MSR1-hFc.
Ligação de anticorpo em células HEK293.Myc.hMSR1, Hde EK293.mfMSR1 e HEK293 foi testada sem reagentes de bloqueio de receptor Fc.
Às células HEK293.Myc.hMSR1, HEK293.mfMSR1 eHEK293 ligadas à placa ou bloqueio de THP-1+Fc, soluções de anti- MSR1 ou anticorpos de controle em diluições seriais variando de 1,7 pM a 100 mM e soluções sem a presença de anticorpos foram adicio- nadas em duplicata e as placas foram incubadas por 1 hora em tempe- ratura ambiente.
As placas foram então lavadas para remover anticor- pos não ligados em uma lavadora de placas AquaMax2000 com um cabeçote de lavagem de célula (MDS Analytical Technologies). Os an- ticorpos ligados à placa foram detectados ou com um SULFO-TAGTM- anticorpo IgG anti-humano policlonal de cabra conjugado específico para fragmento Fc (Jackson Immunoresearch, #Cat 109-005-098) ou um SULFO-TAGTM-anticorpo IgG anticamundongo policlonal de cabra conjugado específico para fragmento Fc (Jackson Immunoresearch, #Cat 115-005-164) por 1 hora em temperatura ambiente.
As placas foram lavadas e desenvolvidas com Tampão de Leitura (Meso Scale Diagnostics, Cat # R92TD-2) de acordo com o procedimento recomen- tado pelo fabricante e sinais luminescente foram registrados com um SECTOR Imager 600 (Meso Scale Diagnostics). A intensidade de lu- minescência, medida em unidades de luz relativa (RLU), foi registrada para indicar a intensidade de ligação de cada anticorpo na faixa de concentrações.
A razão de sinal detectado para ligação de superfície celular de cada anticorpo anti-MSR comparado com anticorpo controle de isótipo (ambos a 11 nM) foi reportada como uma indicação de es- pecificidade de ligação a MSR1. Anticorpos com a razão de ligação em células expressão MSR-1 de mais do que ou igual a 2 vezes compara-
do com a razão em células HEK293 parentais foram classificados co- mo ligantes específicos.
Anticorpos com uma razão de ligação de me- nos do que 2 vezes comparado com a razão de células HEK293 pa- rentais foram classificados como não ligantes como mostrado na (Vide Tabela 10 abaixo). Tabela 10. Ligação de Anticorpos Anti-MSR1 a Células Expres- sando MSR1 Razão de Sinal de Ligação de Anticorpo (RLU) 11 nM em células expressando MSR-1 e HEK293 parental para Anticorpo controle de isótipo HEK293.Myc.hM THP-1 tratada HEK293,mf HEK293 SR1 com PMA MSR1 Ligantes de MSR1 de humano e macaco específicos H1H21227N-N297Q 37 5 23 1 H1H21227N-N297D 34 6 25 1 H1H21227N 37 7 26 1 H1H21231N-N297Q 64 45 69 4 H1H21231N 61 42 75 <1 H1H21234N-N297Q 43 25 35 9 H1H21234N 32 18 31 3 H1H27729P-N297Q 17 8 6 3 H1H27731P-N297Q 48 38 43 7 H1H27732P-N297Q 72 56 46 6 H1H27734P-N297Q 40 21 28 14 H1H27736P-N297Q 58 48 45 12 H1H27739P-N297Q 22 9 20 1 H1H27747P-N297Q 26 13 21 5 H1H27749P-N297Q 27 33 24 3 H1H27751P-N297Q 63 54 49 15 H1H27754P-N297Q 55 66 53 18 H1H27756P-N297Q 38 21 20 6 H1H27759P2-N297Q 23 9 25 2 H1H27760P2-N297Q 29 15 25 3 H1H27761P2-N297Q 23 10 15 3 H1H27762P2-N297Q 33 11 25 3 H1H27771P2-N297Q 42 21 7 2
Razão de Sinal de Ligação de Anticorpo (RLU) 11 nM em células expressando MSR-1 e HEK293 parental para Anticorpo controle de isótipo HEK293.Myc.hM THP-1 tratada HEK293,mf HEK293 H1H27773P2-N297Q SR1 5 com3PMA MSR1 10 2 H1H27778P2-N297Q 51 32 29 4 H1xH27759P2 22 6 21 <1 H1xH29283P2 26 9 24 1 H2aM25685N 75 11 25 2 H2aM25690N 166 25 77 5 H2aM25695N 35 8 45 5 H2aM25700N 46 3 39 1 H2aM21228N 66 16 60 2 H2aM21230N 78 21 55 5 H2aM21232N 86 21 51 1 H2aM21235N 68 20 40 6 Apenas ligantes de MSR1 humano específicos H2aM21229N 78 56 27 36 H1xH29282P2 9 3 1 <1 H1H27766P2-N297Q 20 9 13 8 Ligante não específico H1xH29273P2 20 24 27 Controles Isótipo Controle Isótipo hIgG1 1 1 1 1 Controle Isótipo mIgG 1 1 1 1
[00489] Como ilustrado na Tabela 10, trinta e oito de trinta e nove anticorpos anti-MSR1 testados se ligaram especificamente a células HEK293.Myc.hMSR1 com razões de ligação variando de 5 a 166 ve- zes acima do controle de isótipo em concentração de anticorpo anti- MSR1 de 11 nM. Trinta e três desses anticorpos anti-MSR1 se ligaram especificamente a células THP-1 expressando endogenamente MSR1 humano após diferenciação de célula PMA com razões de ligação de célula variando de 3 a 66 vezes acima do controle de isótipo em 11 nM. Trinta e cinco anticorpos anti-MSR1 que se ligaram a células hMSR1 engenheiradas também se ligaram especificamente a células engenheiradas mfMSR1 com razões de ligação de célula variando de 6 a 77 vezes acima do controle de isótipo a 11 nM. Doze anticorpos anti-MSR1 (H1H21234N-N297Q, H1H27731P-N297Q, H1H27732P- N297Q, H1H27734P-N297Q, H1H27736P-N297Q, H1H27751P- N297Q, H1H27754P-N297Q, H1H27756P-N297Q, H2aM25695N, H2aM21235N, H2aM21229N, H1H27766P2-N297Q) se ligaram a célu- las HEK293 parentais com razões 5 vezes ou mais acima do controle de isótipo. Anticorpos anti-MSR1 produzidos com um IgG1 humano contendo uma mutação pontual única N297Q ou N297D se ligaram a células comparáveis a seus anticorpos parentais não modificados cor- respondentes.
[00490] Um anticorpo anti-MSR1, H1xH29273P2, foi caracterizado como um ligante não específico, uma vez que ele se ligou a células MSR1 com razão de menos de 2 comparado com células HEK293 em concentração de anticorpo de 11 nM. Os controles de isótipo hIgG1 e mIgG1 não eram específicos, como esperado. Exemplo 6. Ligação Relativa de Anticorpos Anti-MSR1 a MSR1 de Camundongo Expresso na Superfície Celular
[00491] Ligação na superfície celular dos anticorpos anti-MSR1 a células expressando MSR1 de camundongo foi determinada através de citometria de fluxo usando células RAW267.4 positivas para MSR1 (ATCC, #CatálogoTIB-71) e células B16F10.9 negativas para MSR1 (Lin e outros, 1998, PNAS 95:8829-8834). Para o ensaio, as células foram plaqueadas em PBS sem cálcio e magnésio (#Cat VWR 45000- 446) e 2% de FBS (#Cat Saradigm 1500-500) (Tampão de Tingimento) em placas de fundo em V de 96 poços (Axygen Scientific, #CatP-96- 450-V-C-S). Para bloquear ligação a receptores de Fc, células RAW264.7 foram incubadas por 30 minutos a 4º C com 500 μg/mL de IgG de camundongo (Jackson ImmunoResearch,Cat# 015-000-003) diluído em tampão de tingimento, enquanto células B16F10.9 perma-
neceram em tampão de tingimento.
Seguindo bloqueio de receptor de Fc, 10 μg/mL de anticorpos anti-MSR1 ou um anticorpo controle de isótipo foram adicionados às células e foram subsequentemente incu- bados por 30 minutos em gelo.
Para controle positivo, um anticorpo MSR1 anticamundongo comercial (Sino Biological, # Cat50129-R004) foi usado, enquanto um anticorpo IgG de coelho (Thermo Scientific, #Cat 26102) foi usado como um controle negativo.
As células foram então lavadas uma vez com tampão de tingimento e foram incubadas ou com um anticorpo secundário Fc anti-humano conjugado a APC (Jackson ImmunoResearch, #Cat 109-136-170) ou um anticorpo se- cundário Fc anticoelho conjugado Alexa-Fluor 647 [Jackson Immuno- Research #Cat111-606-046] a 10 μg/mL por 30 minutos a 4°C.
As cé- lulas foram subsequentemente lavadas e fixadas usando uma solução 50% de Cytofix (BD Biosciences, # Cat554655) diluída em PBS.
As amostras foram administradas em um Beckman Coulter Cytoflex e os resultados foram analisados em software Flowjo 10.2 (BD) para calcu- lar a intensidade fluorescente média (MFI; Tabela 11). O sinal para ru- ído (S/N) foi determinado calculando a razão de MFI dos anticorpos anti-MSR1 ou dos anticorpos controle para a MFI de amostra não tin- gida (Tabela 11). Tabela 11. Ligação de Anticorpos Anti-MSR1 a Células RAW264.7 (Citometria de Fluxo) Anticorpo RAW264.7 B16F10.9 RAW264.7 B16F10.9 MFI MFI S/N S/N Não tingido 2524 3657 1 1 Apenas anticorpo secun- 3095 3174 1 1 dário IgG anti-humano Controle de não ligação 3402 3829 1 1 H1H21227N-N297Q 12810 3287 5 1 H1H21231N-N297Q 3582 3374 1 1 H1H21234N-N297Q 7052 3499 3 1
Anticorpo RAW264.7 B16F10.9 RAW264.7 B16F10.9 MFI MFI S/N S/N Anticorpo para MSR anti- 245149 6161 97 2 camundongo Anticorpo secundário IgG 8720 5389 3 1 anticoelho apenas H1H27729P-N297Q 3484 3459 1 1 H1H27731P-N297Q 3510 3688 1 1 H1H27732P-N297Q 3425 3730 1 1 H1H27734P-N297Q 4783 4505 1 1 H1H27736P-N297Q 3554 3759 1 1 H1H27739P-N297Q 3271 3580 1 1 H1H27747P-N297Q 3630 3875 1 1 H1H27749P-N297Q 3789 3693 1 1 H1H27751P-N297Q 3823 4992 1 1 H1H27754P-N297Q 5406 4091 1 1 H1H27756P-N297Q 4573 3782 1 1 H1H27759P-N297Q 3288 3425 1 1 H1H27760P-N297Q 3429 3521 1 1 H1H27761P-N297Q 3837 3734 1 1 H1H27762P-N297Q 3519 3608 1 1 H1H27766P-N297Q 3812 3793 1 1 H1H27771P-N297Q 4055 3865 1 1 H1H27773P-N297Q 3367 3735 1 1 H1H27778P-N297Q 3648 4138 1 1
[00492] Como ilustrado na Tabela 11, dois anticorpos anti-MSR1 (H1H21227N-N297Q e H1H21234N-N297Q) se ligaram fracamente a células RAW264.7 com valores de S/N de 5 e 3, respectivamente. O anticorpo controle de não ligação não se ligou a células RAW264.7. Nenhum dos 22 anticorpos anti-MSR1 se ligou a células B16F10.9. Um controle positivo de referência (anticorpo MSR1/CD204 de camun- dongo, Sino Biological, #Cat. 50129-R004) se ligou a células Raw264.7 com um S/N de 97.
Exemplo 7. Anticorpos Anti-MSR1 se Ligam a Epitopos Distintos em Receptor de MSR1/Competição Cruzada entre Anticorpos Anti- MSR1
[00493] Competição de ligação entre anticorpos anti-MSR1 diferen- tes foi avaliada usando um ensaio de interferometria de biocamada livre de rótulo, em tempo real, em uma plataforma de biossensor OC- TET® HTX (Pall FortéBio Corp., Menlo Park, CA). O experimento foi realizado a 25º C em HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, Tensoativo Tween-20 0,05 v/v e BSA 1 mg/mL, tampão pH 7,4 (HBS- EBT) com placa agitando na velocidade de 1000 rpm.
[00494] Para avaliar se anticorpos diferentes são capazes de com- petir um com o outro por ligação a seus respectivos epitopos no domí- nio extracelular de MSR1 humano recombinante expresso com um marcador não histidina N-terminal (His9-hMSR1; R&D Systems, #Cat 2708-MS), em torno de 0,59-0,79 nM deHis9-hMSR1 foi primeiro cap- turado em pontas de biossensor OCTET® revestidas com anticorpo anti-Penta-His (Pall FortéBio Corp., # 18-5122) mergulhando as pontas do biossensor por 45 segundos em poços contendo 20 µg/mL de uma solução de His9-hMSR1. As pontas do sensor com antígeno capturado foram então saturadas com um primeiro anticorpo monoclonal anti- MSR1 (subsequentemente referido como "mAb-1") através de imersão em poços contendo 50 µg/mL de uma solução de mAb-1 por 4 minu- tos. As pontas do biossensor foram então mergulhadas em poços con- tendo 50 µg/mL de uma solução de um segundo anticorpo monoclonal anti-MSR1 (subsequentemente referido como "mAb-2") por 4 minutos. Todas as pontas do biossensor foram lavadas em tampão de HBS- EBT entre cada etapa do experimento. A resposta de ligação em tem- po real foi monitorada durante o curso do experimento e a resposta de ligação no final de cada etapa foi registrada. A resposta de mAb-2 se ligando a His9-hMSR1 precomplexado com mAb-1 foi comparada e o comportamento competitivo/não competitivo dos anticorpos monoclo- nais anti-MSR1 diferentes foi determinada usando um liminar de inibi- ção de 50%. A Tabela 12 define explicitamente as relações de anticor- pos competindo em ambas as direções, independente da ordem de ligação.
Tabela 12: Competição cruzada de Anticorpos Anti-MSR1 para Li- gação a His9-hMSR1 Primeiro mAB Primeiro mAB (mAb-1) captu- (mAb-1) captu- Anticorpos mAb-2 Anticorpos mAb-2 rado usando rado usando que competem com que competem com Biossensores Biossensores mAb-1 mAb-1 Octet Anti- Octet Anti- Penta-His Penta-His H1H21231N H1H21234N-N297Q H1H27760P-N297Q H1H27734P-N297Q H1H27756P- H1H27762P-N297Q H1H27732P-N297Q H1H27751P- N297Q H1H21231N-N297Q H1H27731P-N297Q N297Q H1H27747P-N297Q H1H27754P-N297Q H1H27749P-N297Q H1H27766P-N297Q H1H27756P-N297Q H1H21227N-N297D H1H27760P-N297Q H1H27734P-N297Q H1H27762P-N297Q H1H27732P- H1H27751P-N297Q H1H21231N H1H21231N-N297Q N297Q H1H27731P-N297Q H1H27747P-N297Q H1H27754P-N297Q H1H27749P-N297Q H1H27734P-N297Q H1H27756P-N297Q H1H27731P- H1H27751P-N297Q H1H21231N N297Q H1H27732P-N297Q H1H27760P- H1H27762P-N297Q H1H27754P-N297Q N297Q H1H21231N-N297Q H1H27734P-N297Q H1H27747P-N297Q H1H27754P- H1H27751P-N297Q H1H27749P-N297Q N297Q H1H27732P-N297Q H1H27756P-N297Q H1H27731P-N297Q H1H21231N H1H27736P-N297Q H1H27762P- H1H27760P-N297Q H1H27771P-N297Q H1H27761P- N297Q H1H21231N-N297Q H1H27778P-N297Q N297Q H1H27747P-N297Q H1H27773P-N297Q H1H27749P-N297Q H1H27739P-N297Q
Primeiro mAB Primeiro mAB (mAb-1) captu- (mAb-1) captu- Anticorpos mAb-2 Anticorpos mAb-2 rado usando rado usando que competem com que competem com Biossensores Biossensores mAb-1 mAb-1 Octet Anti- Octet Anti- Penta-His Penta-His H1H27766P-N297Q H1H27761P-N297Q H1H27756P-N297Q H1H27771P-N297Q H1H21231N H1H27736P- H1H27778P-N297Q H1H21231N- H1H27760P-N297Q N297Q H1H27759P-N297Q N297Q H1H27762P-N297Q H1H27773P-N297Q H1H27747P-N297Q H1H27773P-N297Q H1H27749P-N297Q H1H27761P-N297Q H1H27760P-N297Q H1H27736P-N297Q H1H27747P- H1H27762P-N297Q H1H27771P- H1H27778P-N297Q N297Q H1H21231N-N297Q N297Q H1H27759P-N297Q H1H27760P-N297Q H1H27773P-N297Q H1H27749P- H1H27762P-N297Q H1H27739P-N297Q N297Q H1H21231N-N297Q H1H27761P-N297Q H1H21234N- H1H21234N H1H27736P-N297Q N297Q H1H27778P- H1H21234N H1H21234N-N297Q H1H27771P-N297Q N297Q H1H21234N-N297Q H1H27759P-N297Q H1H27751P-N297Q H1H27773P-N297Q H1H27732P-N297Q H1H27739P-N297Q H1H27734P- H1H27731P-N297Q H1H27736P-N297Q N297Q H1H27754P-N297Q H1H27771P-N297Q H1H27766P-N297Q H1H27759P- H1H27778P-N297Q H1H21227N-N297D N297Q H1H27773P-N297Q H1H27766P- No mAb* H1H27739P-N297Q N297Q H1H21234N-N297Q H1H27749P-N297Q H1H21227N- H1H27773P- H1H21234N H1H27766P-N297Q N297D N297Q H1H27766P-N297Q H1H21227N-N297D H1H27739P- H1H27729P- H1H27759P-N297Q Dados inconclusivos** N297Q N297Q H1H21227N- H1H21227N Dados inconclusivos ** Dados inconclusivos ** N297Q *Não compete cruzado com nenhum outro mAb para ligação a MSR1 quando capturado como 'mAb-1'. **mAb falhou em saturar a superfície de MSR1 ou não se ligou à su- perfície de MSR1. Exemplo 8. Absorção de Ligantes de Anticorpos Anti-MSR1
[00495] MSR pode se ligar a internalizar moléculas polianiônicas quimicamente modificadas ou alteradas, incluindo lipoproteínas de baixa densidade modificadas (LDL) (Platt, N. e S. Gordon. 2001, J Clin Invest. 108(5):649-654). Foi gerado um bioensaio para avaliar a habili- dade dos anticorpos anti-MSR1 exemplares em regular a absorção de certos ligantes de MSR1.
[00496] Geração de linhagens de célula expressando MSR-1 para ensaio. Células de rim embriônico humanas (HEK293) foram transdu- zidas para expressar estavelmente MRS1 humano (aminoácidos 1-451 de número de acesso UniProtKB NP_619729,1) com um marcador Myc C-terminal. A linhagem de célula resultante, referida aqui como "HEK293,Myc.hMSR1", foi selecionada e mantida em DMEM contendo FBS 10%, NEAA, penicilina/estreptomicina, L-glutamina e 100 g/mL de higromicina.
[00497] Ensaio de absorção de ligante. Para o bioensaio, células HEK293.Myc.hMSR1 foram plaqueadas em placas de ensaio revesti- das com poli-D-lisina de 96 poços (Greiner Bio One, #Cat 655946) a
20.000 células por poço em Opti-MEM contendo FBS 0,1%, penicili- na/estreptomicina e L-Glutamina (meio de ensaio) e incubadas a 37C em CO2 5% de um dia para o outro. No dia seguinte, os anticorpos foram serialmente diluídos de a partir de 300 nM para 5,08 pM (dilui- ção serial 1:3) e preincubados com as células, junto com um controle negativo consistindo em meio de ensaio sozinho, por 30 minutos a 37º C em CO2 5%. Depois de 30 minutos, lipoproteína de baixa densidade (LDL) oxidada ou acetilada marcada com perclorato de 1,1'dioctadecil- 3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina (referida como "DiI-OxLDL" ou "DiI-
AcLDL", respectivamente) foi adicionadas às células em uma concen- tração constante de 10 g/mL. Para determinar a resposta de dose de absorção de ligante, DiI-OxLDL or DiI-AcLDL foi serialmente diluído de 25 g/mL para 24,4 pg/mL (mais meio de ensaio sozinho com LDL) e adicionado a células sem anticorpos. Depois de uma incubação de um dia para o outro a 37º C em CO2 5%, as células foram fixadas com BD CytoFixTM (BD Biosciences, #Cat 554655) por 2 horas a 4C e absor- ção de ligante foi avaliada usando uma leitora de placa Flexstation3 (Molecular Devices) com excitação a 514 nm e emissão em 565 nm. Os resultados foram analisados usando regressão não linear (logística de 4 parâmetros) com o programa Prism 7 para obter valores de EC50 e IC50. A porcentagem de inibição foi calculada com os valores de Uni- dade Fluorescente Relativa (RFU) usando a equação que segue:
[00498] Na equação "RFULinha basal" é o valor de fluorescência das células tradas com 10 μg/mL de ligante sem anticorpos, "RFUInibição" é o valor de fluorescência mínimo para um anticorpo particular com 10 g/mL de ligante e "RFUBackground" é o valor de fluorescência de células sem nenhum ligante ou anticorpos. Os resultados e valores calculados do ensaio de absorção de ligante são providos na Tabela 13. Tabela 13: Inibição por Anticorpo de Absorção de Dil-OxLDL e Dil- AcLDL em Células HEK293.Myc.hMSR1 Oxidada por Dil LDL LDL acetilada por Dil Filei- Anticorpos % Inibição IC50 (M) % Inibição IC50 (M) ra 1 H2aM21227N 90 3,1E-09 62 3,7E-09 2 H2aM21228N 79 3,1E-09 10 >1,0E-07 3 H2aM21229N 26 >1,0E-07 sem inibi- sem inibi- ção ção 4 H2aM21230N 70 2,3E-09 47 >1,0E-08
Oxidada por Dil LDL LDL acetilada por Dil Filei- Anticorpos % Inibição IC50 (M) % Inibição IC50 (M) ra 5 H1M21231N 79 3,7E-09 50 >2,0E-08 6 H2aM21232N 79 4,8E-09 54 >1,0E-08 7 H2bM21234N 61 4,5E-09 19 1,8E-09 8 H2aM21235N 64 3,2E-09 24 >1,0E-07 9 mAb1 controle sem inibi- sem inibi- sem inibi- sem inibi- de Isótipo ção ção ção ção IgG2a de ca- mundongo 10 mAb1 controle sem inibi- sem inibi- sem inibi- sem inibi- de Isótipo ção ção ção ção IgG1 de camun- dongo 11 H2aM25685N 43 >1,0E-07 22 >1,0E-07 12 H2aM25690N 83 1,7E-09 53 2,1E-09 13 H2aM25695N 69 >1,6E-08 40 >1,7E-07 14 H2aM25700N 91 2,2E-09 79 2,4E-09 15 mAb2 controle sem inibi- sem inibi- sem inibi- sem inibi- Isótipo ção ção ção ção IgG2a de ca- mundongo 16 H1H21227N- 94 1,8E-09 65 2,4E-09 N297Q 17 H1H21231N- 88 3,7E-09 62 3,7E-09 N297Q 18 H1H21234N- 52 6,1E-09 34 1,3E-09 N297Q 19 H1H21227N 89 2,0E-09 65 2,1E-09 20 H1H21231N 78 3,6E-09 63 3,5E-09 21 H1H21234N 64 4,3E-09 36 7,1E-10 22 H1H27729P- sem inibi- sem inibi- 28 1,2E-09 N297Q ção ção
Oxidada por Dil LDL LDL acetilada por Dil Filei- Anticorpos % Inibição IC50 (M) % Inibição IC50 (M) ra 23 H1H27731P- 62 >1,0E-08 37 1,8E-09 N297Q 24 H1H27732P- 86 1,7E-09 62 2,2E-09 N297Q 25 H1H27734P- 22 5,5E-09 sem inibi- sem inibi- N297Q ção ção 26 H1H27736P- 83 3,2E-09 49 3,4E-09 N297Q 27 H1H27739P- 55 >1,0E-07 sem inibi- sem inibi- N297Q ção ção 28 H1H27747P- 42 >1,0E-07 26 >1,0E-07 N297Q 29 H1H27749P- 42 1,7E-09 35 4,2E-10 N297Q 30 H1H27751P- 85 2,9E-09 59 1,6E-09 N297Q 31 H1H27754P- 73 4,6E-09 38 1,8E-09 N297Q 32 H1H27756P- 76 3,4E-09 42 >1,0E-07 N297Q 33 H1H27759P- 74 >1,0E-08 48 >1,0E-07 N297Q 34 H1H27760P- 70 4,9E-09 46 2,6E-09 N297Q 35 H1H27761P- 43 9,5E-09 29 >1,0E-07 N297Q 36 H1H27762P- 78 4,0E-09 38 2,9E-09 N297Q 37 H1H27766P- 72 3,7E-09 38 3,5E-09 N297Q 38 H1H27771P- 73 3,0E-09 49 1,9E-09 N297Q
Oxidada por Dil LDL LDL acetilada por Dil Filei- Anticorpos % Inibição IC50 (M) % Inibição IC50 (M) ra 39 H1H27773P- 41 >1,0E-07 31 >1,0E-07 N297Q 40 H1H27778P- 88 2,2E-09 54 1,5E-09 N297Q 41 mAb controle de sem inibi- sem inibi- sem inibi- sem inibi- isótipo, ção ção ção ção IgG1-N297Q humano 42 mAb controle de sem inibi- sem inibi- sem inibi- sem inibi- isótipo IgG1 hu- ção ção ção ção mano
[00499] Candidatos a anticorpo adequados ilustram inibição relati- vamente eficiente (por exemplo, um valor de IC50 de menos do que cerca de 10 nM). Em algumas modalidades, candidatos a anticorpo adequados também ilustram menos do que cerca de 65% de inibição máxima de absorção de ligante.
[00500] Como mostrado na Tabela 13 (fileiras 1-10), oito anticorpos mostraram inibição de absorção de Dil-OxLDL nas células HEK293.Myc.hMSR1 com inibição máxima variando de 26% a 90% e valores de IC50 variando de 2,3 nM a >100 nM. Sete dos 8 anticorpos mostraram inibição de absorção de Dil-AcLDL com inibição máxima variando de 10% a 62% e valores de IC50 variando de a partir de 1,8 nM a >100 nM. Anticorpos H2aM21229N não mostraram nenhuma ini- bição de absorção de DiI-AcLDL.
[00501] Como mostrado na Tabela 13 (fileiras 11-15), quatro anti- corpos mostraram inibição de absorção de Dil-OxLDL mediada por MSR1 com inibição máxima variando de 43% a 91% e valores de IC50 variando de a partir de 1,7 nM a >100 nM. Quatro anticorpos da inven- ção mostraram inibição de absorção de Dil-AcLDL mediada por MSR1 com inibição máxima variando de 22% a 79% e valores de IC50 varian- do de 2,1 nM >100 nM.
[00502] Como mostrado na Tabela 13 (fileiras 16-42), vinte e quatro de 25 anticorpos mostraram inibição de absorção de Dil-OxLDL medi- ada por MSR1 com inibição máxima variando de 22% a 94% e valores de IC50 variando de 1,7 nM a >100 nM. Vinte e três dos 25 anticorpos mostraram inibição de absorção de Dil-AcLDL com inibição máxima variando de a partir de 26% a 65% e valores de IC50 variando de a par- tir de 0,42 nM a >100 nM. Anticorpo H1H27729P-N297Q não mostrou nenhuma inibição de absorção de DiI-OxLDL enquanto os anticorpos H1H27739P-N297Q e H1H27734P-N297Q não mostraram nenhuma inibição de DiI-AcLDL em células HEK293.Myc.hMSR1.
[00503] Anticorpo de controle de isótipo humanos e de camundongo não mostraram inibição de absorção de DiI-OxLDL e DiI-AcLDL por células HEK293.Myc.hMSR1 em nenhum dos ensaios. Exemplo 9. Ligação e Internalização de MSR1 Expressão em Su- perfície Celular por Anticorpos Anti-MSR1
[00504] Anticorpos anti-MSR1 exemplares foram avaliados quanto à sua habilidade em se ligar e internalizar MSR1 em células expressan- do MSR1-.
[00505] Para o ensaio, células THP-1 [ATCC, #Cat TIB-202] foram semeadas em placas revestidas com PDL de 96 poços (Perkin Elmer, #Cat 6055500) em RPMI (Irvine Scientific, #Cat 9160) contendo FBS 10% (ATCC, #Cat 30-2020), pencilina/estreptomicina/L-glutamina (Gibco, #Cat 10378-016), 50 μM Beta-Mercaptoetanol (Sigma, #Cat M7522) (meio de crescimento) mais 200 nM de Phorbol Myristate Ace- tate (PMA; Sigma, #Cat P1585). As células THP-1 foram deixadas di- ferenciar por 4 dias a 37º C em CO2 5%. Para tingir, placas em qua- druplicata de células foram incubadas com 10 μg/mL de anticorpos an- ti-MSR1 diluídos em FBS 2% em PBS, sem Cálcio e Magnésio (Irving,
#Cat 9240) (tampão de tingimento) por 30 minutos a 4C. As células foram lavadas duas vezes com tampão de tingimento incubado com um Ab secundário conjugado a Alexa-Fluor 488 (Jackson Immunore- search, #Cat 115-547-003 ou Jackson Immunoresearch, #Cat 109- 547-003) a 10 μg/mL por 30 minutos a 4oC e subsequentemente lava- das duas vezes mais com tampão de tingimento. Duas placas foram imediatamente fixadas e tingidas com paraformaldeído 4% (PFA; ThermoFisher, #Cat 28908) + 5 μM de DRAQ5 (ThermoFisher, #Cat 62251) em PBS por 20 minutos (placas de não internalização). As du- as placas restantes foram incubadas a 37º C por 1 hora, seguido por fixação e tingimento por 20 minutos usando uma solução de PFA 4% + 5 μM de DRAQ5 diluído em PBS (placas de internalização). Após fixa- ção, todas as placas foram lavadas uma vez com PBS. Uma placa de não internalização e uma placa de internalização foram incubadas com um anticorpo anti-Alexa-Fluor 488 (Regeneron) a 50 μg/mL em PBS de um dia para o outro a 4C para extinguir a fluorescência de Alexa Fluor 488 na superfície. As placas restantes foram incubadas com PBS ape- nas. Imagens confocais foram adquiridas no Opera Phenix (Perkin El- mer) em ampliação de 40X. Software de análise Harmony (Perkin El- mer) foi utilizado para identificar células marcadas com DRAQ5 e as unidades fluorescentes relativas (RFU) a Alexa-Fluor 488 totais por célula foram determinadas. A ligação total a 4º C (valores de RFU po- ços não arrefecidos 4º C, ligação total a 37º C (valores de RFU de po- ços não arrefecidos a 37º C), a RFU internalizada total e a Internaliza- ção % foram determinadas para cada anticorpo como mostrado na Tabela 14.
[00506] Para todos os cálculos, fluorescência de background de po- ços não tingidos foi subtraída de cada poço. RFU internalizada total foi calculada como segue: RFU total de amostras não arrefecidas a 37º C - RFU da superfície a 37º C. RFU da superfície é definida como RFU não arrefecida a 37º C - RFU arrefecida a 37º C)/QE.
QE (eficiência de arrefecimento) é definida como: 1-(RFU total de amostra arrefecida a 4º C/RFU total de amostra não arrefecida a 4º C). A internalização % foi determinada a partir da fórmula que segue: (RFU internalizada total a 37º C/RFU total a 37º C)*100. Tabela 14. Internalização e Ligação à Superfície de Anticorpos An- ti-MSR1 em Células THP-1 Diferenciadas Anticorpo Ligação Ligação RFU Inter- % Internali- Total a 4C Total a nalizada zação 37C Total H1H27729P-N297Q 1930685 6607625 3763127 57,0 H1H27731P-N297Q 1215319 1802404 977543 54,2 H1H27732P-N297Q 2513511 4924734 2414132 49,0 H1H27734P-N297Q 482859 1151348 737425 ND* H1H27736P-N297Q 9514681 12267400 14468087 117,9** H1H27739P-N297Q 3702857 5608380 4016378 71,6 H1H27747P-N297Q 2518361 5917858 3444330 58,2 H1H27749P-N297Q 4478384 12799899 5704834 44,6 H1H27751P-N297Q 5831744 7998767 6787876 84,9 H1H27754P-N297Q 3077308 7161570 6446236 90,0 H1H27756P-N297Q 6691792 11904608 9039171 75,9 H1H27759P-N297Q 4028970 2480463 1861578 75,0 H1H27760P-N297Q 1297337 6011876 3707164 61,7 H1H27761P-N297Q 1940392 2764577 1625899 58,8 H1H27762P-N297Q 2529645 3856573 3767717 97,7 H1H27766P-N297Q 1877240 3224247 2062539 64,0 H1H27771P-N297Q 6272656 7535203 6991358 92,8 H1H27773P-N297Q 490905 962752 -67811 ND* H1H27778P-N297Q 9910952 16552831 12518725 75,6 H1H21227N-N297Q 1800012 4110990 3226161 78,5 H1H21234N-N297Q 1953248 5451125 722651 13,3 Controle de isótipo 185971 1087469 1704047 ND* ND*: % de internalização não pôde ser determinada devido à ligação fraca e/ou incapacidade de determinar eficiência de arrefecimento . **: Um valor internalizado % >100% é devido aos valores internaliza- dos totais sendo ligeiramente maiores do que os valores totais a 37º C. Uma internalização de 100% foi confirmada visualmente pelo apareci- mento de toda fluorescência de Alex488 em estruturas vesiculares a 37º C.
[00507] Como mostrado na Tabela 14, 19 de 21 anticorpos anti- MSR ensaiados demonstraram internalização em células THP-1 dife- renciadas variando de 13,3% a 117,9% de internalização. Para dois dos 21 anticorpos anti-MSR1, internalização não pôde ser determinada devido à ligação fraca e/ou incapacidade de determinar eficiência de arrefecimento. Como um controle, o controle de isótipo não demons- trou nenhuma internalização mensurável. Exemplo 10. Avaliação da Habilidade de Bloqueio de Anticorpos Anti-MSR1 para MSR1 Humano
[00508] A habilidade de anticorpos anti-MSR1 descritos aqui em bloquear a ligação de vários ligantes a MSR1 humano foi medida usando três ensaios ELISA sanduíche de competição. Os ligantes usados nos ensaios foram: (1) LDL acetilada (Ac-LDL), (2) LDL oxida- da (Ox-LDL) e (3) produtos finais de glicação avançada de albumina de soro bovino (AGE-BSA).
[00509] Para o ensaio, proteína MSR1 humana monomérica re- combinante compreendida de uma porção do domínio extracelular de MSR1 humana expresso com um marcador 9-Histina N-terminal (His9- hMSR1; R&D Systems, #Cat 2708-MS) foi revestida em uma concen- tração de 2 μg/mL em PBS em uma placa de microtitulação de 96 po- ços de um dia para o outro a 4º C para uso em ensaios ELISA de competição com Ac-LDL, Ox-LDL ou -AGE-BSA biotinilado ("biot-AGE- BSA"). Sítios de ligação não específica foram subsequentemente blo- queados usando uma solução 0,5% (p/v) de albumina de soro bovino
(BSA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Anticorpos anti-MSR1 ou anticorpos de controle de isótipo foram serialmente dilu- ídos conforme apropriado para cada ligante de teste e adicionados em duplicata para cada conjunto de diluição serial a placas de microtitula- ção revestidas com His9-hMSR1. Tampão sozinho foi também adicio- nado às cavidades em cada revestimento. Após 1 hora de incubação em temperatura ambiente, sem lavagem, em uma concentração cons- tante final de 50 pM de Ac-LDL (Life Technologies / ThermoFisher Sci- entific, #Cat L-35354), 5 nM ou 10 nM de Ox-LDL (Alfa Aesar, #Cat J65591) ou 400 pM de biot-AGE-BSA (R&D Systems, #Cat BT4127) foram adicionados às placas com His9-hMSR1 e as placas foram in- cubadas por mais 1 hora em temperatura ambiente. (Concentrações de Ac-LDL, Ox-LDL e biot-AGE-BSA para ensaios de inibição de anti- corpo foram selecionadas do ponto médio aproximado dentro da por- ção linear de curvas de ligação individuais de Ac-LDL, Ox-LDL ou biot- AGE-BSA a His9-hMSR1 revestida na placa). Os poços foram lavados e Ac-LDL ou OX-LDL ligada à placa foi detectada com anticorpo de coelho anti-LDL (Alfa Aesar, # Cat J64398) em combinação com anti- corpos policlonais de burro específicos IgG anticoelho (H+L) conjuga- dos com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (JacksonImmunoRese- arch, #Cat 711-035-152) e biot-AGE-BSA foi detectada com uma es- treptavidina-HRP (ThermoFisher Scientific, #Cat N200). As placas fo- ram desenvolvidas usando solução de substrato TMB (BD Bioscien- ces, #Cat 51-2606KC & #Cat 51-2607KC) de acordo com a recomen- dação do fabricante e absorbância a 450 nm foi medida em uma Vic- tor Multilabel Plate Reader (PerkinElmer). Esse ensaio foi conduzi- do em quatro rodadas de ensaio diferentes.
[00510] Análise de dados foi realizada usando um modelo de res- posta de dose sigmoidal dentro do software Prism® (GraphPad). Blo- queio percentual em concentração máxima do anticorpo testado em cada ensaio foi calculado como um indicador da habilidade dos anti- corpos em bloquear a ligação de Ac-LDL, Ox-LDL ou biot-AGE-BSA a His9-hMSR1 na placa em relação à linha basal do ensaio.
No cálculo, sinal de ligação das mesmas concentrações de Ac-LDL, Ox-LDL ou biot-AGE-BSA usadas para os ensaios na ausência de anticorpo foi referido como 100% de ligação ou 0% de bloqueio, enquanto a linha basal do ensaio, definida como sinal de ligação da amostra de tampão sem ligantes de MSR1 ou anticorpo, foi referida como ligação de 0% ou bloqueio de 100%. O bloqueio percentual máximo na concentração mais alta de anticorpo testado em cada ensaio foi reportado para todos os anticorpos.
Número de bloqueio percentual negativo refletiram liga- ção de ligantes de MSR1 maior a His9-hMSR1 revestido em placa na presença de anticorpos.
Os resultados do bloqueio são sumarizados na Tabela 15. Tabela 15. Habilidade de bloqueio de Anticorpos Anti-MSR1 em Ensaios ELISA de Competição Anticorpo Bloqueio de anticorpo anti-MSR1 de Bloqueio de Bloqueio de Ox-LDL se ligando a His9-hMSR1 anticorpo anticorpo anti-MSR1 anti-MSR1 (100 nM) de (300 nM) de Ac-LDL se biot-AGE- ligando a BSA se li- His9- gando a hMSR1 His9-hMSR1 Concentração Concentra- % Blo- % Bloqueio % Bloqueio de Anticorpo ção de Ox- queio anti-MSR1 LDL Bloqueado>50% em todos os formatos de ensaio H2aM25700N 500 nM 10 nM 98 104 101 H1H21227N- 500 nM 10 nM 97 105 96 N297Q H1H21227N- 500 nM 10 nM 99 101 97 N297D H1H21227N 500 nM 10 nM 100 105 99 Bloqueado>50% em alguns formatos de ensaio H2aM25695N 500 nM 10 nM 96 65 16
Anticorpo Bloqueio de anticorpo anti-MSR1 de Bloqueio de Bloqueio de Ox-LDL se ligando a His9-hMSR1 anticorpo anticorpo anti-MSR1 anti-MSR1 (100 nM) de (300 nM) de Ac-LDL se biot-AGE- ligando a BSA se li- His9- gando a hMSR1 His9-hMSR1 Concentração Concentra- % Blo- % Bloqueio % Bloqueio de Anticorpo ção de Ox- queio anti-MSR1 LDL H1H27766P2- 1 μM 10 nM 54 52 27 N297Q H1H21234N- 500 nM 10 nM 49 75 -27 N297Q H1H21234N 500 nM 10 nM 98 70 21 Bloqueado<50% em todos os formatos de ensaio H2aM21228N 500 nM 5 nM 41 -32 -1 H2aM21229N 500 nM 5 nM 38 -11 3 H2aM21230N 500 nM 5 nM 45 -14 9 H2aM21232N 500 nM 5 nM 16 25 -50 H2aM21235N 500 nM 5 nM -4 24 -24 H2aM25685N 500 nM 10 nM 28 -33 -86 H2aM25690N 500 nM 10 nM 8 -76 -96 H1H21231N- 500 nM 10 nM 26 -60 -50 N297Q H1H21231N 500 nM 10 nM 22 -62 -44 H1H27729P- 1 μM 10 nM 36 8 15 N297Q H1H27731P- 1 μM 10 nM -1 -41 4 N297Q H1H27732P- 1 μM 10 nM -60 -61 -9 N297Q H1H27734P- 1 μM 10 nM -15 -38 -4 N297Q H1H27736P- 1 μM 10 nM 3 -31 -3 N297Q H1H27739P- 1 μM 10 nM -41 -47 -9 N297Q H1H27747P- 1 μM 10 nM -31 -44 -2 N297Q
Anticorpo Bloqueio de anticorpo anti-MSR1 de Bloqueio de Bloqueio de Ox-LDL se ligando a His9-hMSR1 anticorpo anticorpo anti-MSR1 anti-MSR1 (100 nM) de (300 nM) de Ac-LDL se biot-AGE- ligando a BSA se li- His9- gando a hMSR1 His9-hMSR1 Concentração Concentra- % Blo- % Bloqueio % Bloqueio de Anticorpo ção de Ox- queio anti-MSR1 LDL H1H27749P- 1 μM 10 nM -21 -51 -1 N297Q H1H27751P- 1 μM 10 nM -31 -51 -11 N297Q H1H27754P- 1 μM 10 nM -44 -42 -9 N297Q H1H27756P- 1 μM 10 nM -45 -54 -8 N297Q H1H27759P2- 1 μM 10 nM -62 -45 -19 N297Q H1H27760P2- 1 μM 10 nM -47 -43 -4 N297Q H1H27761P2- 1 μM 10 nM -21 -36 -4 N297Q H1H27762P2- 1 μM 10 nM -65 -58 -16 N297Q H1H27771P2- 1 μM 10 nM -23 -21 -1 N297Q H1H27773P2- 1 μM 10 nM 2 -11 1 N297Q H1H27778P2- 1 μM 10 nM -59 -40 -8 N297Q Anticorpos de controle de isótipo Controle de 1 μM 10 nM 3 -8 4 isótipo de hIgG1 Controle de 1 μM 10 nM 16 -4 7 isótipo de mIgG1
[00511] Quatro de 35 anticorpos anti-MSR1 ensaiados foram identi- ficados como bloqueando >50% de Ac-LDL, Ox-LDL e biot-AGE-BSA se ligando a hMSR1. Esses quatro anticorpos anti-MSR1 bloquearam mais do que 95% de 50 pM de Ac-LDL, 10 nM de Ox-LDL e 400 pM de biot-AGE-BSA se ligando a His9-hMSR1.
[00512] Na concentração máxima de anticorpo testado, quatro dos 35 anticorpos anti-MSR1 bloquearam >50% de Ac-LDL e/ou Ox-LDL se ligando a hMSR1, mas não bloquearam biot-AGE-BSA se ligando a hMSR1. Três desses anticorpos bloquearam ambos 50 pM de Ac-LDL e 10 nM de Ox-LDL se ligando a hMSR1 com 52% a 98% de bloqueio. Um anticorpo (H1H21234N-N297Q) bloqueou apenas 50 pM de Ac- LDL se ligando a hMSR1 com 75% de bloqueio.
[00513] Vinte e sete (27) dos 35 anticorpos anti-MSR1 e os anticor- pos de controle de isótipo irrelevantes bloquearam <50% de Ac-LDL, Ox-LDL e biot-AGE-BSA se ligando a hMSR1.
[00514] Três anticorpos anti-MSR1 (21227N, 21231N, 21234N) fo- ram produzidos ambos com a porção Fcγ humana original e uma ver- são com uma mutação pontual única N297Q. O anticorpo 21227N foi também produzido como uma terceira versão com uma mutação N297D. As versões modificadas de anticorpos 21227N (H1H21227N- N297Q e H1H21227N-N297D) e 21231N (H1H21231N-N297Q) an- ti-MSR1 retiveram características parentais. Os anticorpos H1H21227N-N297Q e H1H21227N-N297D bloquearam >50% de Ac- LDL, Ox-LDL e biot-AGE-BSA se ligando a hMSR1, enquanto o anti- corpo H1H21231N-N297Q bloqueou <50% de Ac-LDL, Ox-LDL e biot- AGE-BSA se ligando a hMSR1. Anticorpo modificado anti-MSR1 H1H21234N-N297Q bloqueou apenas 50 pM de Ac-LDL se ligando a hMSR1 em comparação com anticorpo H1H21234N não modificado, que bloqueou >50% para ambas Ac-LDL e Ox-LDL se ligando a hMSR1. Exemplo 11. Síntese de Cargas úteis P1 e P2B (FIG. 1) (1S,4aS,10aR)-6-Hidroxi-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a-
octaidrofenantreno-1-carboxilato de metila (P1-2)
[00515] A uma solução de ácido podocárpico (P1-1, 90 g, 0,33 mol) em metanol (200 mL) e tolueno (600 mL) foi adicionado (trimetilsi- lil)diazometano (2 M em hexano, 200 mL). A mistura de reação foi agi- tada em temperatura ambiente por 2 horas. O ácido podocárpico foi então totalmente consumido de acordo com LCMS. Os voláteis foram removidos in vacuo e o resíduo foi triturado com éter de petróleo (2 L) para dar o composto P1-2 (91 g, 96% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 289 (M + H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 8,95 (s, 1H), 6,79 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,48 (dd, J = 8,2, 2,4 Hz, 1H), 3,58 (s, 3H), 2,80-2,55 (m, 2H), 2,20-2,02 (m, 3H), 1,96- 1,71 (m, 2H), 1,56-1,45 (m, 2H), 1,27 (t, J = 13,5 Hz, 1H), 1,21 (s, 3H), 1,09 (td, J = 13,5, 4,1 Hz, 1H), 0,91 (s, 3H) ppm. (1S,4aS,10aR)-1,4a-dimetil-6-(trifluormetanossulfoniloxi)- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carboxilato de metila (P1- 3)
[00516] A uma solução de composto P1-2 (10 g, 35 mmol) em clo- reto de metileno (200 mL) foram adicionados piridina (3,3 g, 42 mmol) e DMAP (0,84 g, 6,9 mmol) sob atmosfera de nitrogênio. A mistura foi esfriada para -78 oC e foi adicionado anidrido tríflico (12 g, 42 mmol) e a mistura resultante foi deixada aquecer para 25 oC e agitada a 25 oC por mais 4 horas. A mistura de reação foi diluída com DCM (500 mL), lavada com água (100 mL), cloridrato aq. (1 N, 150 mL) e salmoura (100 mL), seca em sulfato de sódio e concentrada in vacuo para dar o composto bruto P1-3 (14 g, 97% de rendimento bruto) como óleo vis- coso, que era puro o suficiente para a próxima etapa. O composto bru- to P1-3 poderia ser purificado através de cromatografia flash (acetato de etila 0-10% em éter de petróleo) para dar produto bruto como óleo viscoso. ESI m/z: 421,2 (M + 1)+. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,12 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 7,10 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,97 (dd, J = 8,5, 2,5 Hz, 1H), 3,67 (s, J = 3,4 Hz, 3H), 2,93 (dd, J = 17,2, 4,4 Hz, 1H), 2,85-2,71 (m, 1H), 2,29 (d, J = 13,5 Hz, 1H), 2,25-2,14 (m, 2H), 2,03-1,89 (m, 2H), 1,71-1,61 (m, 1H), 1,56-1,48 (m, 1H), 1,40 (td, J = 13,4, 4,2 Hz, 1H), 1,30-1,22 (m, 3H), 1,09 (td, J = 13,6, 4,2 Hz, 1H), 1,02 (s, 3H) ppm. (1S,4aS,10aR)-6-((terc-butoxicarbonil)amino)-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carboxilato de metila (P1- 4)
[00517] A uma solução de composto P1-3 (14 g, 34 mmol) e car- bamato de terc-butila (BocNH2, 7,9 g, 68 mmol) em terc-butanol (100 mL) foram adicionados sucessivamente carbonato de césio (22 g, 68 mmol), tris(dibenzilidenoacetona)dipaládio(0) (Pd2(dba)3, 1,8 g, 2,0 mmol) e X-Phos (1,8 g, 4,0 mmol) em temperatura ambiente. A mistura foi desgaseificada e purgada com argônio três vezes e foi então agita- da a 80 oC sob argônio (balão) de um dia para o outro até o composto P1-3 ter sido totalmente consumido, conforme monitorado através de
TLC. Depois de esfriar para a temperatura ambiente, a mistura de rea- ção foi diluída com acetato de etila e filtrada em Celite. O sólido foi la- vado com acetato de etila 3 vezes. O filtrado combinado foi concentra- do in vacuo e o resíduo foi purificado através de cromatografia de co- luna de sílica gel (0-6,25% de acetato de etila em éter de petróleo) pa- ra dar o composto P1-4 (11 g, 82% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 410 (M + 23)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 9,07 (s, 1H), 7,39 (s, 1H), 7,13 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,87 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 3,59 (s, 3H), 2,76 (dd, J = 16,4, 4,5 Hz, 1H), 2,70-2,61 (m, 1H), 2,16- 2,05 (m, 3H), 2,00-1,75 (m, 2H), 1,65-1,50 (m, 2H), 1,45 (s, 9H), 1,31- 1,25 (m, 1H), 1,21 (s, 3H), 1,10 (td, J = 13,5, 4,1 Hz, 1H), 0,92 (s, 3H) ppm. Ácido (1S,4aS,10aR)-6-{[(terc-butoxi)carbonil]amino}-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carboxílico (P1-5)
[00518] A uma solução de composto P1-4 (4,9 g, 13 mmol) em DMSO foi adicionado terc-butóxido de potássio (15 g, 0,13 mol) em uma porção em temperatura ambiente. A mistura de reação foi agitada a 60 oC por 3 horas sob argônio até que a reação estivesse completa de acordo com LCMS. Após esfriar para temperatura ambiente, a mis- tura de reação foi despejada em gelo e acidificada lentamente com cloridrato aq. (0,5 M) para pH 5, durante a qual a temperatura não ex- cedeu 25 oC. Os precipitados foram coletados através de filtragem e lavados com água várias vezes. O produto bruto foi purificado mais através de cromatografia de coluna de sílica gel (0-20% de acetato de etila em éter de petróleo) para dar o composto P1-5 (4,5 g, 93% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 318 (M - 55)+. 1H RMN
(500 MHz, DMSOd6) δ 12,08 (s, 1H), 9,08 (s, 1H), 7,40 (s, 1H), 7,11 (s, 1H), 6,87 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 2,79-2,68 (m, 1H), 2,65 (d, J = 12,6 Hz, 1H), 2,17-2,03 (m, 4H), 1,94-1,76 (m, 2H), 1,53 (d, J = 13,7 Hz, 1H), 1,46 (d, J = 7,4 Hz, 9H), 1,29-1,14 (m, 5H), 1,04 (s, 3H) ppm. N-[(4bS,8S,8aR)-8-carbamoil-4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10- octaidrofenantren-3-il]carbamato de terc-butila (P1-6)
[00519] A uma solução de P1-5 (4,5 g, 12 mmol) e HATU (4,9 g, 13 mmol) em DMF (50 mL) foi adicionada di-isopropiletilamina (20 mL, 0,12 mol) e a mistura foi agitada a 25 oC por uma hora. À mistura foi então adicionado cloreto de amônio (16 g, 0,30 mol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura resultante foi diluída com acetato de etila, lavada com água e salmou- ra, seca em sulfato de sódio e concentrada in vacuo. O resíduo foi pu- rificado através de cromatografia flash (0-20% de acetato de etila em éter de petróleo) para dar o composto P1-6 (4,2 g, 94% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 373,3 (M + 1)+. 1H RMN (500 MHz, metanold4) δ 7,20 (s, 1H), 6,97 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 6,80 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 2,77-2,68 (m, 2H), 2,66-2,55 (m, 1H), 2,20 (d, J = 12,9 Hz, 1H), 2,13 (dd, J = 13,2, 5,3 Hz, 1H), 2,08 (d, J = 14,0 Hz, 1H), 2,03-1,86 (m, 2H), 1,54 (d, J = 11,1 Hz, 1H), 1,40 (s, 9H), 1,26 (t, J = 26,7Hz, 1H), 1,18 (s, 3H), 1,14-1,03 (m, 4H) ppm. Sal do ácido trifluoracético de (1S,4aS,10aR)-6-amino-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carboxilato de metila (P1- 7)
[00520] A uma solução de composto P1-4 (6,0 g, 15 mmol) em DCM (60 mL) foi adicionado TFA (12 mL) em RT. A mistura resultante foi agitada em RT por 2 h até que Boc foi totalmente removido, con- forme monitorado através de TLC. A mistura de reação foi concentrada in vacuo para dar o composto bruto P1-7 como um sal de TFA, que foi usado na etapa seguinte sem purificação adicional. ESI m/z: 288 (M+1)+. (1S,4aS,10aR)-6-(benziloxi)-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantreno-1-carboxilato de metila (P1-8a)
[00521] Uma mistura de composto P1-2 (12 g, 40 mmol) e carbona- to de césio (14 g, 44 mmol) em DMF (100 mL) foi agitada a 20-25 oC por 15 minutos. À mistura foi adicionado brometo de benzila (7,1 mL, 60 mmol) em temperatura ambiente. Após agitar em temperatura am- biente por 4 horas, a mistura resultante foi despejada em água fria e extraída com acetato de etila. A solução orgânica combinada foi lava- da com água e salmoura, seca em sulfato de sódio e concentrada in vacuo. O produto bruto foi purificado através de cromatografia flash (acetato de etila 0-10% em éter de petróleo) para dar o composto título P1-8a (13 g, 89% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 379 (M + H)+. 1H RMN (500 MHz, metanold4) δ 7,60-7,20 (m, 5H), 7,00- 6,82 (m, 2H), 6,73 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 5,03 (s, 2H), 3,66 (s, 3H), 2,95-
2,58 (m, 2H), 2,36-2,10 (m, 3H), 2,10-1,85 (m, 2H), 1,70-1,48 (m, 2H), 1,44-1,21 (m, 4H), 1,15 (t, J = 17,2 Hz, 1H), 1,01 (s, 3H) ppm. (1S,4aS,10aR)-6-(dibenzilamino)-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantreno-1-carboxilato de metila (8b)
[00522] A uma solução do composto bruto P1-7 obtido acima (calc. 15 mmol) em DMF (60 mL) foram adicionados carbonato de potássio (6,4 g, 46 mmol) e brometo de benzila (5,8 g, 34 mmol) em RT. A mis- tura de reação foi agitada a 80 oC de um dia para o outro até que a reação estivesse completa conforme monitorado através de TLC. Após esfriar para RT, a misutra foi despejada em água fria (300 mL) e extra- ída com acetato de etila (x 3). A solução orgânica combinada foi lava- da com água e salmoura, seca em sulfato de sódio e concentrada in vacuo para dar produto bruto 8b, que foi usado na etapa seguinte sem purificação adicional. ESI m/z: 468 (M + 1)+. Ácido (1S,4aS,10aR)-6-(benziloxi)-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantreno-1-carboxílico (P1-9a)
[00523] Uma mistura de composto P1-8a (11 g, 29 mmol) e terc- butóxido de potássio (33 g, 0,29 mol) em DMSO (0,19 L) foi agitada a 100 °C por uma hora até que o grupo metila foi totalmente removido, conforme monitorado através de LCMS e TLC. Após esfriar para 25 °C, a mistura foi arrefecida com cloridrato aquoso (1 N) e extraída com acetato de etila. A solução orgânica combinada foi lavada com salmou- ra, seca em sulfato de sódio e concentrada in vacuo. O resíduo foi pu- rificado através de cromatografia de coluna de sílica gel (0-24% de acetato de etila em éter de petróleo) para dar o composto P1-9a (7,5 g, 71% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 365 (M + H)+. 1H RMN (500 MHz, metanold4) δ 7,42 (d, J = 7,4 Hz, 2H), 7,36 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 7,30 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 6,92 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,87 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,72 (dd, J = 8,4, 2,5 Hz, 1H), 5,02 (s, 2H), 2,82 (dd, J = 16,3, 4,4 Hz, 1H), 2,77-2,65 (m, 1H), 2,24 (d, J = 13,2 Hz, 2H), 2,19 (dd, J = 13,8, 6,0 Hz, 1H), 2,11-1,96 (m, 2H), 1,64-1,56 (m, 1H), 1,53 (d, J = 11,0 Hz, 1H), 1,35 (td, J = 13,3, 3,7 Hz, 1H), 1,30 (s, 3H), 1,13 (s, 3H), 1,11-1,05 (m, 1H) ppm. Ácido (1S,4aS,10aR)-6-(dibenzilamino)-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carboxílico (9b)
[00524] A uma solução do composto bruto 8b obtido acima (calc. 15 mmol) em DMSO (100 mL) foi adicionado terc-butóxido de potássio (17 g, 0,15 mol) em uma porção em RT. A mistura de reação foi agita- da a 100 °C por 2 h sob argônio até a reação estar completa de acordo com LCMS. Após esfriar para RT, a mistura de reação foi despejada em gelo e acidificada lentamente com cloridrato aq. (4 M) para pH 5, durante a qual a temperatura não foi deixada atingir mais do que 25 °C. A mistura foi extraída com acetato de etila e a solução orgânica com- binada foi lavada com água e salmoura, seca em sulfato de sódio e concentrada in vacuo. O produto bruto foi purificado através de croma- tografia de coluna de sílica gel (0-20% de acetato de etila em éter de petróleo) para dar o composto 9b (6,8 g, 99% de rendimento em 3 etapas a partir do composto P1-4) como um sólido branco. ESI m/z: 454 (M + 1)+. (1S,4aS,10aR)-6-(benziloxi)-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantreno-1-carboxilato de pentafluorfenila (P1-10a)
[00525] A uma solução de P1-9a (9,6 g, 26 mmol) em DMF (100 mL) foram adicionados DIPEA (14 mL, 79 mmol) e 2,2,2-trifluoracetato de perfluorfenila (15 g, 53 mmol). Essa mistura foi agitada em tempe- ratura ambiente de um dia para o outro e monitorada através de LCMS. A mistura de reação foi então diluída com éter (200 mL) e lava- da com água (300 mL) e salmoura (200 mL). A solução orgânica foi seca em sulfato de sódio e concentrada in vacuo. O resíduo foi purifi- cado através de cromatografia flash (acetato de etila 0-10% em éter de petróleo) para dar o composto P1-10a (12 g, 88% de rendimento) co- mo um sólido branco. ESI m/z: 531 (M + H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 7,43 (d, J = 7,1 Hz, 2H), 7,38 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 7,31 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 6,93 (dd, J = 10,2, 5,5 Hz, 2H), 6,76 (dd, J = 8,4, 2,5 Hz, 1H), 5,05 (s, 2H), 2,81 (dd, J = 16,3, 4,5 Hz, 1H), 2,77-2,68 (m, 1H), 2,28-2,19 (m, 2H), 2,18 (dd, J = 13,4, 5,6 Hz, 1H), 2,00-1,83 (m, 2H), 1,74 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 1,65 (d, J = 14,1 Hz, 1H), 1,47 (s, 3H), 1,38- 1,27 (m, 2H), 1,08 (s, 3H) ppm. (1S,4aS,10aR)-6-(dibenzilamino)-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantreno-1-carboxilato de pentafluorfenila (10b)
[00526] A uma solução de 9b (6,8 g, 15 mmol) em DMF (100 mL) foram adicionados DIPEA (10 mL, 0,61 mol) e 2,2,2-trifluoracetato de perfluorfenila (10 mL, 58 mmol). Essa mistura foi agitada a 25 °C de um dia para o outro sob nitrogênio e foi então diluída com éter.
Os or- gânicos foram lavados com água e salmoura, secos em sulfato de só- dio e concentrados in vacuo.
O resíduo foi purificado através de cro- matografia de coluna de sílica gel (acetato de etila 0-10% em éter de petróleo) para dar o composto 10b (7,5 g, 81% de rendimento) como um sólido branco.
ESI m/z: 620 (M + 1)+. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,36-7,25 (m, 10H), 6,92 (d, J =8,4 Hz, 1H), 6,67 (d, J =2,8 Hz, 1H), 6,63 (dd, J = 8,4, 2,6 Hz, 1H), 4,63 (m, 4H), 2,85-2,73 (m, 2H), 2,41- 2,37(m, 1H), 2,22-2,20 (m, 1H), 2,15-1,91 (m, 3H), 1,71-1,65 (m, 2H), 1,51 (s, 3H), 1,37-1,19 (m, 2H), 1,10 (s, 3H) ppm.
N-[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-(benziloxi)-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantren-1-il]formamido}carbonil)- 4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamato de terc-butila (P1-11a)
[00527] A uma solução de composto P1-6 (2,3 g, 6,2 mmol) em THF (20 mL) foi adicionado em gotas n-BuLi (2,5 M em hexano, 5,5 mL, 14 mmol) a -78 oC. A reação foi agitada nessa temperatura por 1 hora. À mistura foi adicionada uma solução de P1-10a (3,0 g, 5,6 mmol) em THF (20 mL) e a mistura resultante foi então agitada a 10- 20 oC de um dia para o outro até o composto P1-10a ter sido consumi- do, conforme monitorado através de LCMS. A reação foi arrefecida com cloreto de amônio aquoso saturado e extraída com acetato de eti- la. A solução orgânica combinada foi lavada com água e salmoura, seca em sulfato de sódio e concentrada in vacuo. O resíduo foi purifi- cado através de cromatografia flash (0-30% de acetato de etila em éter de petróleo) para dar o composto P1-11a (1,59 g, 51% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 719 (M + 1)+.
[00528] Comparado com o procedimento de 11b abaixo, n-BuLi foi usado ao invés de LiHMDS. Embora P1-6 não tenha sido completa- mente consumido, esse procedimento levou a menos subproduto e o rendimento de P-11 foi aumentado de a partir de cerca de 40% para 51%. O composto P1-6 não reagido foi recuperado (rendimento recu- perado: 10-20%. N-[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-(dibenzilamino)-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantren-1-il]formamido}carbonil)- 4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamato de terc-butila (11b)
[00529] A uma solução de composto P1-6 (1 g, 2,7 mmol) em THF (15 mL) foi adicionada em gotas bis(trimetilsilil)amida de lítio (1 M em hexano, 8,0 mL) a 0 °C. A reação foi agitada a 0 °C por uma hora. À mistura foi adicionada uma solução de composto 10b (2,5 g, 4,0 mmol) em THF (10 mL) e a mistura resultante foi então agitada a RT de um dia para o outro. A reação foi então arrefecida com cloreto de amônio aquoso saturado e extraída com acetato de etila. A solução orgânica combinada foi lavada com água e salmoura, seca em sulfato de sódio e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromato- grafia flash (0-35% de acetato de etila em éter de petróleo) para dar o composto 11b (0,95 g, 44% de rendimento) como um sólido branco; e recuperado composto P1-6 (recovered Rendimento 37%). ESI m/z: 808 (M + 1)+. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,16 (s, 1H), 7,35-7,24 (m, 10H), 7,12 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,00 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,91 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,62-6,59 (m, 2H), 6,42 (s, 1H), 4,62 (s, 3H), 2,98-2,75 (m, 4H), 2,31-2,22 (m, 5H), 2,10-1,97 (m, 5H), 1,69-1,63 (m, 4H), 1,56 (s, 9H), 1,32-1,27 (m, 9H), 1,43-1,27 (m, 5H), 1,05 (s, 3H) ppm. N-[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-hidroxi-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantren-1-il]formamido}carbonil)- 4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamato de terc-butila (P1-12a)
[00530] A uma solução de P1-11a (2,0 g, 2,78 mmol) em acetato de etila (40 mL) foi adicionado paládio sobre carbono úmido (10% Pd, 0,9 g) sob proteção com nitrogênio. A mistura foi desgaseificada e purga- da com hidrogênio e agitada em temperatura ambiente sob balão de hidrogênio de um dia para o outro até P1-11a ter sido completamente consumido, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura foi filtra- da em Celite e a filtragem foi concentrada in vacuo. O resíduo foi puri- ficado através de cromatografia de coluna de sílica gel (0-55% de ace- tato de etila em éter de petróleo) para dar P1-12a (1,06 g, 61% de ren- dimento) como um sólido branco. ESI m/z: 629 (M + H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 9,10 (s, 1H), 8,98 (s, 1H), 8,11 (s, 1H), 7,40 (s, 1H), 7,15 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,81 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,50 (dd, J = 8,2, 2,4 Hz, 1H), 2,84 (td, J = 16,3, 3,8 Hz, 2H), 2,77-2,64 (m, 2H), 2,30-2,22 (m, 2H), 2,14 (t, J = 10,9 Hz, 4H), 2,00-1,80 (m, 4H), 1,65-1,54 (m, 4H), 1,45 (s, 9H), 1,34- 1,28 (m, 2H), 1,27 (d, J = 2,5 Hz, 6H), 1,15-1,08 (m, 2H), 0,99 (s, 6H) ppm. N-[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-amino-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantren-1-il]formamido}carbonil)- 4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamato de terc-butila (12b)
[00531] A uma solução de 11b (0,45 g, 0,56 mmol) em acetato de etila (5 mL) foi adicionado paládio sobre carbono úmido (10% Pd, 50 mg) sob nitrogênio. A mistura foi desgaseificada, purgada com hidro- gênio 3 vezes e foi agitada em RT sob um balão de hidrogênio de um dia para o outro. A mistura foi filtrada em Celite e o filtrado foi concen- trado in vacuo para dar o composto 12b (0,33 g, 94% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 628 (M + 1)+. (1S,4aS,10aR)-N-[(1S,4aS,10aR)-6-Amino-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carbonil]-6-hidroxi-1,4a-
dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carboxamida (P1)
[00532] A uma solução de composto P1-12a (0,17 g, 0,27 mmol) em DCM (10 mL) foi adicionado em gotas TFA (3 mL) em temperatura ambiente. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por uma hora até Boc ser removido de acordo com LCMS. Os voláteis foram removidos in vacuo e o resíduo foi purificado através de HPLC preparativa (método B) para dar P1 (0,10 g, 70% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 529,3 (M + 1)+. 1 H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,14 (s, 1H), 6,92 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,86 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,73 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,65-6,57 (m, 2H), 6,50 (dd, J = 8,1, 2,3 Hz, 1H), 4,75 (s, 1H), 3,49 (s, 1H), 2,99-2,85 (m, 2H), 2,79 (tt, J = 11,6, 5,8 Hz, 2H), 2,34-2,14 (m, 6H), 2,15-1,95 (m, 4H), 1,74-1,51 (m, 5H), 1,46-1,34 (m, 2H), 1,30 (s, 6H), 1,21-1,06 (m, 8H) ppm. 1 H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 8,99 (s, 1H), 8,09 (s, 1H), 6,81 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,68 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,50 (dd, J = 8,0, 2,5 Hz, 1H), 6,48 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,34 (dd, J = 8,0, 2,5 Hz, 1H), 4,69 (s, 2H), 2,86-2,60 (m, 4H), 2,28-2,10 (m, 6H), 1,94-1,75 (m, 4H), 1,65-1,53 (m, 4H), 1,35-1,20 (m, 8H), 1,20-1,06 (m, 2H), 0,98 (s, 6H) ppm. 13 C RMN (100 MHz, DMSOd6) δ 174,03, 173,92, 155,34, 148,39, 147,63, 146,43, 129,56, 129,09, 124,60, 121,65, 113,23, 112,58, 111,81, 110,77, 52,32, 52,09, 45,56, 45,52, 39,20, 39,36, 38,23, 38,17,
37,18, 37,12, 31,08, 31,00, 27,65, 27,64, 23,08, 23,03, 21,43, 21,27, 19,64, 19,61 ppm. HPLC (método B): Tempo de retenção: 8,92 min, pureza: 99,4%. HPLC quiral: >99,9% (em coluna AD, AS, OD e OJ). Rotação óptica (α): +2,53o (1,7 g/100 mL THF, 25 oC). (1S,4aS,10aR)-6-Amino-N-((1S,4aS,10aR)-6-amino-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carbonil)-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carboxamida (P2B)
[00533] À solução de composto 12b (0,63 g, 1,0 mmol) em DCM (10 mL) foi adicionado em gotas TFA (3 mL) em RT. A mistura de rea- ção foi agitada em RT por 4 h até Boc ser removido de acordo com LCMS. A mistura foi purificada diretamente através de HPLC prepara- tiva (método B) para dar P2B (0,42 g, 79% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 528,2 (M + 1)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 8,28 (s, 1H), 6,67 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 6,47 (d, J = 2,0 Hz, 2H), 6,33 (dd, J = 8,0, 2,0 Hz, 2H), 4,69 (s, 4H), 2,80-2,75 (m, 2H), 2,70-2,60 (m, 2H), 2,26-2,20 (m, 2H), 2,19-2,05 (m, 4H), 1,95-1,75 (m, 4H), 1,62-1,50 (m ,4H), 1,33-1,20 (m, 8H), 1,12 (t, J = 8,8 Hz, 2H), 0,98 (s, 6H) ppm. Exemplo 11-2. Síntese de P3B
[00534] Esse exemplo demonstra métodos gerais para a síntese do derivado de ácido podocárpico P3B na Tabela C, abaixo. Esse exem- plo se refere aos compostos numerados de 11b e P3B na FIG. 23. (3S,8R,9S,10R,13S,14S)-17-imino-10,13-dimetil- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecaidro-1H- ciclopenta[a]fenantren-3-ol, sal do ácido trifluoracético (P3B)
[00535] A uma solução de composto 11b (10 mg, 12 µmol) em DCM (2 mL) foi adicionado TFA (1 mL). A mistura de reação foi agitada em RT por 2 h até Boc ser removido de acordo com LCMS. Os voláteis foram removidos in vacuo e o resíduo foi dissolvido em 5% de acetoni- trila em água. A solução foi liofilizada para dar composto P3B (7 mg, 80% de rendimento) como um sólido amarelo claro. ESI m/z: 354,8 (M/2 + H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 9,38 (br s, 2H), 8,08 (s, 1H), 7,35-7,06 (m, 12H), 6,97 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,73 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,51 (s, 1H), 6,46 (d, J = 6,4 Hz, 1H), 4,68-4,55 (m, 4H), 3,00-2,50 (m, 4H), 2,40-2,00 (m, 6H), 1,94-1,73 (m, 5H), 1,70-1,50 (m, 3H), 1,50-1,00 (m, 11H), 0,98 (s, 3H), 0,83 (s, 3H) ppm. 19F RMN (376 MHz, DMSOd6) δ -74,08 ppm. EXEMPLO 11-3
[00536] Esse exemplo demonstra métodos gerais para a síntese dos derivados de ácido podocárpico P4B-P8B na Tabela C, abaixo. Esse exemplo se refere aos compostos numerados de 12b e P4B-P8B na FIG. 23. Exemplo 11-3a Intermediários 13a-e
Legenda: "aminoácido F-moc", "ou"
[00537] A uma solução de composto 12b (1,0 equiv.) em DMF ou DCM foram adicionados Aminoácido Fmoc (1,1-1,2 equiv.), HATU (1,2-1,5 equiv.) e DIPEA (2,0-3,0 equiv.) sucessivamente. A mistura de reação foi agitada em RT por 4 h, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura foi concentrada in vacuo (quando DCM era solvente) e o resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica gel (0-90% de acetato de etila em éter de petróleo); ou a mistura de reação (quando DMF era solvente) foi diretamente purificada através de cromatografia flash de fase reversa (50-90% de acetonitrila em bi- carbonato de amônio aquoso (10 mM)) para dar o composto 13 como sólidos brancos. 12b Aminoácido Fmoc HATU DIPEA Solven- Produto Tempo Purifica- g g g g te Rendimen- R (h) ção # g (mmol) (mmol) (mmol) (mmol) (mL) to (%) 0,13 0,071 0,11 0,077 DMF H 4 RP-B 13a 0,14 78 (0,20) (0,24) (0,29) (0,60) (10) 0,31 0,18 0,23 0,19 DCM CH2OH 4 SGC 13b 0,39 83 (0,50) (0,55) (0,60) (1,50) (20) 0,20 (CH2)4NHF 0,21 0,15 0,083 DMF 4 RP-B 13c 0,30 78 (0,32) moc (0,35) (0,38) (0,64) (20) 0,31 0,22 0,23 0,19 DCM CH2COOtBu 4 SGC 13d 0,43 85 (0,50) (0,55) (0,60) (1,50) (20) 0,31 (CH2)2COOt 0,23 0,23 0,19 DCM 4 SGC 13e 0,42 82 (0,50) Bu (0,55) (0,60) (1,50) (20) N-({[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-{[(terc-
butoxi)carbonil]amino}-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantren-1-il]formamido}carbonil)-4b,8-dimetil- 4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3- il]carbamoil}metil)carbamato de 9H-fluoren-9-ilmetila (13a)
[00538] Seguindo o procedimento geral para Intermediários 13a-e, composto 13a (0,14 g, 78% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 907 (M + H)+. N-[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-{[(terc- butoxi)carbonil]amino}-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantren-1-il]formamido}carbonil)-4b,8-dimetil- 4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamoil}-2- hidroxietil]carbamato de 9H-fluoren-9-ilmetila (13b)
[00539] Seguindo o procedimento geral para Intermediários 13a-e, composto 13b (0,39 g, 83% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 938 (M + H)+. N-[(5S)-5-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-{[(terc- butoxi)carbonil]amino}-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantren-1-il]formamido}carbonil)-4b,8-dimetil-
4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamoil}-5-{[(9H- fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}pentil]carbamato de 9H-fluoren- 9-ilmetila (13c)
[00540] Seguindo o procedimento geral para Intermediários 13a-e, composto 13c (0,30 g, 78% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 1201 (M + H)+. 3-(((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonilamino)-4-((4bS,8S,8aR)-8- ((1S,4aS,10aR)-6-(terc-butoxicarbonilamino)-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carbonilcarbamoil)-4b,8- dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-ilamino)-4- oxobutanoato de (S)-terc-butila (13)
[00541] Seguindo o procedimento geral para Intermediários 13a-e, composto 13d (0,43 g, 85% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 1021 (M + H)+. 4-(((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonilamino)-5-((4bS,8S,8aR)-8- ((1S,4aS,10aR)-6-(terc-butoxicarbonilamino)-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carbonilcarbamoil)-4b,8- dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-ilamino)-5-
oxopentanoato de (S)-terc-butila (13e)
[00542] Seguindo o procedimento geral para Intermediários 13a-e, composto 13e (0,42 g, 82% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 1036 (M + H)+. Exemplo 11-3b Intermediários 14a-e
[00543] A uma solução de composto 13 (1,0 equiv.) em DCM foi adicionado TFA em RT. A mistura de reação foi agitada em RT por uma hora e concentrada in vacuo para dar produto bruto 14 como óleo incolor, que foi usado para a etapa seguinte sem purificação adicional.
13 TFA DCM Produto Bruto 14 # R g (mL) (mL) # R g (mmol) 13a H 0,14 3 10 14a H 0,13 (0,16) 13b CH2OH 0,10 3 10 14b CH2OH 0,09 (0,11) 13c (CH2)4NHFmoc 0,24 3 10 14c (CH2)4NHFmoc 0,22 (0,20) 13d CH2COOtBu 0,12 3 10 14d CH2COOH 0,10 (0,12) 13e (CH2)2COOtBu 0,10 3 20 14e (CH2)2COOH 0,08 (0,10) N-({[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-amino-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantren-1-il]formamido}carbonil)- 4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3- il]carbamoil}metil)carbamato de 9H-fluoren-9-ilmetila, sal do ácido trifluoracético (14a)
[00544] Seguindo o procedimento geral para Intermediários 14a-e, composto bruto 14a (0,14 g, 99% de rendimento, sal de TFA) foi obtido como óleo incolor. ESI m/z: 807 (M + 1)+. (S)-1-((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-amino-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carbonilcarbamoil)-4b,8- dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-ilamino)-3-hidroxi-1- oxopropan-2-ilcarbamato de 9H-fluoren-9-ilmetila, sal do ácido trifluoracético (14b)
[00545] Seguindo o procedimento geral para Intermediários 14a-e, composto bruto 14b (0,14 g, 99% de rendimento, sal de TFA) foi obtido como óleo incolor. ESI m/z: 837 (M + 1)+. N-[(5S)-5-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-amino-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantren-1-il]formamido}carbonil)- 4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamoil}-5- {[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}pentil]carbamato de 9H- Fluoren-9-ilmetila, sal do ácido trifluoracético (14c)
[00546] Seguindo o procedimento geral para Intermediários 14a-e, composto bruto 14c (0,22 g, 92% de rendimento, sal de TFA) foi obtido como óleo incolor. ESI m/z: 1101 (M + 1)+. Ácido (S)-3-(((9H-Fluoren-9-il)metoxi)carbonilamino)-4- ((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-amino-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carbonilcarbamoil)-4b,8- dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-ilamino)-4- oxobutanoico, sal do ácido trifluoracético (14d)
[00547] Seguindo o procedimento geral para Intermediários 14a-e, composto bruto 14d (0,10 g, 87% de rendimento, sal de TFA) foi obtido como óleo incolor. ESI m/z: 866 (M + 1)+. Ácido (S)-4-(((9H-Fluoren-9-il)metoxi)carbonilamino)-5- ((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-amino-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carbonilcarbamoil)-4b,8- dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-ilamino)-5- oxopentanoicoo, sal do ácido trifluoracético (14e)
O NHFmoc
HN O OH H HN O
H H2N O
TFA
[00548] Seguindo o procedimento geral para Intermediários 14a-e, composto bruto 14e (84 mg, 86% de rendimento, sal de TFA) foi obtido como óleo incolor. ESI m/z: 880 (M + 1)+. Exemplo 11-3c Cargas úteis P4B-P8B
Legenda: "piperidina"
[00549] A uma solução de 14 bruto, obtido acima, em DMF foi adi- cionada piperidina. A mistura foi agitada em RT por meia hora, que foi monitorado através de LCMS. A mistura foi purificada diretamente através de HPLC preparativa (método B) para dar cargas úteis P4-8 como sólidos brancos. 14 bruto pipe- DMF Tem purifi- # R g ridina (mL) po cação # R mg (mmol) (mL) (ho- (Rendi- ra) mento) 14a H 0,066 0,5 3 0,5 Prep-B P4B H 12 (0,073) (28%) 14b CH2OH 0,10 0,5 3 0,5 Prep-B P5B CH2OH 41 (0,11) (67%) 14c (CH2)4NHFmoc 0,050 0,5 5 1 Prep-B P6B (CH2)4NH2 5 (0,045) (17%) 14d CH2COOH 0,10 0,5 3 0,5 Prep-B P7B CH2COOH 39 (0,12) (51%) 14e (CH2)2COOH 0,10 0,5 3 0,5 Prep-B P8B (CH2)2CO 44 (0,12) OH (58%) (1S,4aS,10aR)-N-[(1S,4aS,10aR)-6-(2-Aminoacetamido)-1,4a- dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carbonil]-6-amino- 1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carboxamida (P4B)
[00550] Seguindo o procedimento geral para Cargas úteis P4B-8B, composto P4B (12 mg, 28% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 585 (M + 1)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 9,79 (s, 1H), 8,12 (s, 1H), 7,50 (s, 1H), 7,41 (dd, J = 8,5 Hz, 1,5 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,68 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,48 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 6,34 (dd, J = 7,5 Hz, 1,5 Hz, 1H), 4, 70 (m, 2H), 3,20 (s, 3H), 2,95-2,83 (m, 1H), 2,80-2,70 (m, 2H), 2,70-2,60 (m, 1H), 2,30-2,20 (m, 2H), 2,20- 2,10 (m, 4H), 2,05-1,70 (m, 4H), 1,70-1,50 (m, 4H), 1,31-1,25 (m, 8H), 1,20-1,10 (m, 2H), 1,05 (d, J = 7,5 Hz ,6H) ppm. (1S,4aS,10aR)-6-Amino-N-((1S,4aS,10aR)-6-((S)-2-amino-3- hidroxipropanamido)-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantreno-1-carbonil)-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantreno-1-carboxamida (P5B)
[00551] Seguindo o procedimento geral para Cargas úteis P4B-8B, composto P5B (41 mg, 67% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 615 (M + 1)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 8,09(s, 1H), 7,52 (s, 1H), 7,41 (dd, J = 8,5 Hz, 1,5 Hz, 1H), 6,96(d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,68(d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,48(d, J = 1,5 Hz, 1H), 6,34 (dd, J = 7,5
Hz, 1,5 Hz, 1H), 4,84-4,76 (m, 1H), 4,67 (s, 2H), 3,60-3,45 (m, 2H), 2,95-2,83 (m, 1H), 2,80-2,60 (m, 4H), 2,30-2,20 (m, 3H), 2,20-2,10 (m, 4H), 1,95-1,75 (m, 5H), 1,70-1,50 (m, 4H), 1,40-1,30 (m, 2H), 1,28 (s, 3H), 1,26 (s, 3H), 1,20-1,10 (m, 3H), 1,01 (s, 3H), 0,98 (s, 3H) ppm. (1S,4aS,10aR)-6-Amino-N-((1S,4aS,10aR)-6-((S)-2,6- diaminoexanamido)-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantreno-1-carbonil)-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantreno-1-carboxamida (P6B)
[00552] Seguindo o procedimento geral para Cargas úteis P4B-8B, composto P6B (5 mg, 17% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 656 (M + 1)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 8,09 (s, 1H), 7,52 (s, 1H), 7,41 (dd, J = 8,5 Hz, 1,5 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,68 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,48 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 6,34 (dd, J = 7,5 Hz, 1,5 Hz, 1H), 4, 70 (m, 2H), 3,20 (s, 2H), 2,95-2,83 (m, 2H), 2,80- 2,70 (m, 2H), 2,70-2,60 (m, 2H), 2,37-2,35 (m, 1H), 2,30-2,20 (m, 3H), 2,20-2,10 (m, 5H), 2,05-1,95 (m, 2H), 1,95-1,75 (m, 5H), 1,70-1,50 (m, 6H), 1,31-1,25 (m, 8H), 1,20-1,10 (m, 3H), 1,05 (d, J = 7,5 Hz, 6H), 0,85 (t, J = 6,0 Hz, 1H) ppm. Ácido (S)-3-amino-4-((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-amino-1,4a- dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1- carbonilcarbamoil)-4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10- octaidrofenantren-3-ilamino)-4-oxobutanoico (P7B)
[00553] Seguindo o procedimento geral para Cargas úteis P4B-8B, composto P7B (39 mg, 51% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 643 (M + 1)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 10,5- 10,0 (br, 1H), 8,09 (s, 1H), 7,52 (s, 1H), 7,41 (dd, J = 8,5 Hz, 1,5 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,68 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,48 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 6,34 (dd, J = 7,5 Hz, 1,5 Hz, 1H), 4,84-4,50 (m, 2H), 3,75-3,68 (m, 2H), 2,95-2,83 (m, 1H), 2,80-2,60 (m, 4H), 2,40-2,20 (m, 4H), 2,20- 2,10 (m, 5H), 1,95-1,70 (m, 5H), 1,70-1,50 (m, 5H), 1,27 (d, J = 7,5 Hz, 6H), 1,20-1,10 (m, 2H), 1,01 (s, 3H), 0,98 (s, 3H) ppm. Ácido (S)-4-amino-5-((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-amino-1,4a- dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1- carbonilcarbamoil)-4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10- octaidrofenantren-3-ilamino)-5-oxopentanoico (P8B)
[00554] Seguindo o procedimento geral para Cargas úteis P4B-8B, composto P8B (44 mg, 58% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 657 (M + 1)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 8,09 (s, 1H), 7,52 (s, 1H), 7,41 (dd, J = 8,5 Hz, 1,5 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 8,5 Hz,1H), 6,68 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,48 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 6,34 (dd, J =
7,5 Hz, 1,5 Hz, 1H), 4,70 (m, 2H), 2,95-2,83 (m, 1H), 2,80-2,60 (m, 5H), 2,30-2,20 (m, 4H), 2,20-2,10 (m, 5H), 1,95-1,75 (m, 5H), 1,70-1,50 (m, 5H), 1,50-1,40 (m, 4H), 1,27 (d, J =7,5 Hz, 6H), 1,20-1,10 (m, 2H), 1,01 (s, 3H), 0,98 (s, 3H) ppm. (1S,4aS,10aR)-6-amino-N-((1S,4aS,10aR)-6-((S)-2-amino-3-(1H- imidazol-4-il)propanamido)-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantreno-1-carbonil)-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantreno-1-carboxamida (P9B)
[00555] A uma solução de Fmoc-His-OH (0,38 g, 1,0 mmol) em DCM (5 mL) foram adicionados Fmoc-OSu (0,37 g, 1,1 mmol) e DIPEA (0,26 g, 2,0 mmol). A mistura de reação foi agitada em RT de um dia para o outro. Os voláteis foram removidos in vacuo e o resíduo foi puri- ficado através de cromatografia flash (metanol 5-10% em DM) para dar Fmoc-His(Fmoc)-OH (0,50 g, 84% de rendimento, ESI m/z: 600 (M + 1)+) como um sólido branco.
[00556] A uma solução de composto 12b (0,31 g, 0,50 mmol) em DCM (20 mL) foram adicionados o Fmoc-His(Fmoc)-OH (0,33 g, 0,55 mmol), obtido acima, HATU (0,23 g, 0,60 mmol) e DIPEA (0,19 g, 1,5 mmol) sucessivamente. A mistura resultante foi agitada em RT por 4 h, o que foi monitorado através de através de LCMS. À mistura de reação foi adicionada piperidina (0,5 mL) e a mistura foi agitada em RT por uma hora até que Fmoc foi totalmente removido, conforme monitorado através de LCMS. A mistura foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado através de cromatografia flash de fase reversa (acetonitrila
50-80% em água) para dar Boc-P9B (0,15 g) como um sólido branco, metade do qual foi dissolvida em DCM (20 mL). À solução foi adicio- nado TFA (3 mL). A mistura foi agitada em RT por uma hora até Boc ser removido de acordo com LCMS. Os voláteis foram removidos in vacuo e o resíduo foi purificado através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto P9B (17 mg, 12% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 665 (M + 1)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 11,82 (s, 1H), 9,75 (s, 1H), 8,09 (s, 1H), 7,52-7,50 (m, 2H), 7,41 (dd, J = 8,5 Hz, 1,5 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,90-6,80 (m, 1H), 6,68 (d, J = 8,5 Hz,1H), 6,48 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 6,34 (dd, J = 7,5 Hz, 1,5 Hz, 1H), 4,84-4,50 (m, 2H), 3,60-3,45 (m, 2H), 2,95-2,83 (m, 2H), 2,80- 2,70 (m, 2H), 2,70-2,60 (m, 2H), 2,40-2,10 (m, 8H), 1,95-1,70 (m, 5H), 1,70-1,50 (m, 4H), 1,27 (d, J = 7,5 Hz, 6H), 1,20-1,10 (m, 2H), 1,01 (s, 3H), 0,98 (s, 3H) ppm. EXEMPLO 11-4
[00557] Esse exemplo demonstra métodos gerais para a síntese dos derivados de ácido podocárpico P10B e P11B na Tabela C, abai- xo. Esse exemplo se refere aos compostos numerados de 14a, 15a-b e P10B e P11B na FIG. 24. 4-amino-5-((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-(2-aminoacetamido)- 1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1- carbonilcarbamoil)-4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10- octaidrofenantren-3-ilamino)-5-oxopentanoato de (S)-terc-butila, di-sal do ácido trifluoracético (15a)
[00558] A uma solução de Fmoc-Glu(OtBu)-OH (74 mg, 0,17 mmol)
e DIPEA (55 µL, 0,32 mmol) em DMF (5,0 mL) foi adicionado HATU (91 mg, 0,24 mmol). A mistura foi agitada em RT por 15 min antes da adição de composto 14a (0,14 g, 0,16 mmol). A mistura de reação foi agitada em RT de um dia para o outro, o que foi monitorado através de LCMS. À mistura de reação foi então adicionada piperidina (1 mL) em gotas. A mistura de reação foi agitada em RT por uma hora até que Fmoc foi totalmente removido de acordo com LCMS. A mistura resul- tante foi separada diretamente através de cromatografia flash de fase reversa (acetonitrila 0-100% em TFA aquoso (0,01%)) para dar o com- posto 15a (0,13 g, 80% de rendimento) como um sólido amarelo. ESI m/z: 770,5 (M + 1)+. di-sal do ácido trifluoracético de 5,5'-(4bS,4b'S,8S,8aR,8'S,8a'R)- 8,8'-(azanodi-ilbis(oxometileno))bis(4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10- octaidrofenantreno-8,3-di-il)bis(azanedi-il)bis(4-amino-5- oxopentanoato) de (4S,4'S)-terc-butila (15b)
[00559] A uma solução de Fmoc-Glu(OtBu)-OH (0,15 g, 0,35 mmol) e DIPEA (83 µL, 0,48 mmol) em DMF (5,0 mL) foi adicionado HATU (0,15 g, 0,40 mmol). A mistura foi agitada em RT por 30 min antes da adição de composto P2B (0,10 g, 0,16 mmol). A mistura de reação foi agitada em RT de um dia para o outro, o que foi monitorado através de LCMS. À mistura de reação foi então adicionada piperidina (1 mL) em gotas. A mistura de reação foi agitada em RT por 3 h até que Fmoc foi totalmente removido de acordo com LCMS. A mistura resultante foi separada diretamente através de cromatografia flash de fase reversa (acetonitrila 0-100% em TFA aquoso (0,01%)) para dar o composto
15b (0,14 g, 78% de rendimento) como um sólido amarelo. ESI m/z: 899 (M + 1)+. Ácido (S)-4-amino-5-((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-(2- aminoacetamido)-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantreno-1-carbonilcarbamoil)-4b,8-dimetil- 4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-ilamino)-5-oxopentanoico (P10B)
[00560] Uma mistura de composto 15a (0,13 g, 0,13 mmol) em TFA puro (2,0 mL) foi agitada em RT por uma hora, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura resultante foi diluída com DCM (20 mL) e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatogra- fia flash de fase reversa (acetonitrila 0-100% em bicarbonato de sódio aquoso (10 mM)) para dar P10B (20 mg, 22% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 358 (M/2 + 1)+; 714,5 (M + 1)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 9,85 (br s, 1H), 8,12 (s, 1H), 7,51 (s, 2H), 7,42- 7,36 (m, 2H), 6,96 (dd, J = 8,0 Hz e 3,0 Hz, 2H), 3,67 (br s, 8H), 3,36- 3,33 (m, 1H), 3,22 (s, 2H), 2,91-2,87 (m, 2H), 2,80-2,71 (m, 2H), 2,31- 2,28 (m, 4H), 2,17-2,14 (m, 4H), 1,91-1,82 (m, 5H), 1,69-1,58 (m, 5H), 1,34-1,23 (m, 6H), 1,19-1,12 (m, 2H), 1,01 (s, 6H) ppm. Ácido (4S,4'S)-5,5'-(4bS,4b'S,8S,8aR,8'S,8a'R)-8,8'-(azanodi- ilbis(oxometileno))bis(4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10- octaidrofenantreno-8,3-di-il)bis(azanedi-il)bis(4-amino-5- oxopentanoico) (P11B)
[00561] Uma mistura de composto 15b (0,14 g, 0,14 mmol) em TFA puro (3,0 mL) foi agitada em RT por uma hora, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura resultante foi diluída com DCM (30 mL) e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatogra- fia flash de fase reversa (acetonitrila 0-100% em bicarbonato de sódio aquoso (10 mM)) para dar P11B (20 mg, 18% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 394 (M/2 + 1)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 9,85 (br s, 2H), 8,12 (s, 1H), 7,51 (s, 2H), 7,9 (dd, J = 8,4 Hz e 1,6 Hz, 2H), 6,97 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 3,5 (br s, 6H), 3,40-3,37 (m, 2H), 3,16 (s, 1H), 2,91-2,88 (m, 2H), 2,79-2,66 (m, 2H), 2,33-2,29 (m, 7H), 2,18-2,15 (m, 4H), 1,91-1,84 (m, 6H), 1,71-1,59 (m, 6H), 1,35-1,23 (m, 6H), 1,18-1,12 (m, 2H), 1,01 (s, 6H) ppm. EXEMPLO 11-5
[00562] Esse exemplo demonstra métodos para a síntese dos LP1B-LP5B na Tabela 3, acima. Esse exemplo se refere aos compos- tos numerados 12b e de 102a-b a 106a-e e ligador-cargas úteis LP1B- LP5B na FIG. 25. Exemplo 5a Intermediários 102a-b
Legenda: "piperidina", "ou"
[00563] A uma solução de ácido (Fmoc-Val-Ala-OH (101a, 1,2 equiv.) ou Fmoc-Val-Cit-OH (101b, 1,2 equiv.) em DMF foram adicio- nados HATU (1,2 equiv.) e DIPEA (2,0-3,0 equiv.) em RT. Após a mis- tura ter sido agitada em RT por 5 min, composto 12b (1,0 equiv.) foi adicionado. A mistura resultante foi agitada em RT por 4-20 h até que a amina foi consumida de acordo com LCMS. À mistura foi então adi- cionada piperidina (excesso) e a mistura foi agitada em RT por 1-6 h até que Fmoc foi totalmente removido, conforme monitorado através de LCMS. A mistura de reação foi filtrada através de uma membrana e o filtrado foi diretamente purificado através de HPLC preparativa (mé- todo B) ou cromatografia flash de fase reversa para dar o composto 102 (38-72% de rendimento) como um sólido branco. Amina Ácido Etapa 1 Etapa 2 Puri- Produto g (mmoL) g (mmoL) HATU DIPEA DMF Tem- Piperi- Tem- fica- # g g g (mL) po dina po ção (Rendi- (mmol) (mmol) (hr) (mL) (hr) mento) 12b 0,31 101a 0,25 0,23 0,19 20 4 0,5 1 RP 102a 0,29 (0,50) (0,60) (0,60) (1,5) (72%) 12b 0,50 101b 0,48 0,36 0,28 mL 6 20 0,5 6 Prep- 102b 0,27 (0,80) (0,96) (0,96) (1,6) B (38%) N-[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-[(2S)-2-[(2S)-2-amino-3- metilbutanamido]propanamido]-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantren-1-il]carbonil}carbamoil)-4b,8-dimetil- 4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamato de terc-butila (102a)
[00564] Seguindo o procedimento geral para Intermediários 102a,b,
composto 102a (0,29 g, 72% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 799 (M + 1)+. N-[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-[(2S)-2-[(2S)-2-amino-3- metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantren-1-il]carbonil}carbamoil)-4b,8- dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamato terc- butila (102b)
[00565] Seguindo o procedimento geral para Intermediários 102a,b, composto 102b (0,27 g, 38% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 885 (M + 1)+. Exemplo 5b Intermediários 104a-b N-[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-[(2S)-2-[(2S)-2-{2-amino-6-[2- (ciclooct-2-in-1-iloxi)acetamido]hexanamido}-3- metilbutanamido]propanamido]-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantren-1-il]carbonil}carbamoil)-4b,8-dimetil- 4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamato de terc-butila (104a)
[00566] A uma solução de composto 103 (70 mg, 0,13 mmol) em DMF (2 mL) foram adicionados HATU (68 mg, 0,18 mmol) e DIPEA (44 µL, 0,24 mmol) em RT. A mistura foi agitada em RT por 5 min antes da adição de composto 102a (95 mg, 0,12 mmol). A mistura de reação foi então agitada em RT por 2 horas até o composto 102a ter sido total- mente consumido, conforme monitorado através de LCMS. À mistura de reação foi então adicionada piperidina (0,5 mL, excesso). A mistura foi agitada em RT por 2 h. A mistura foi então filtrada e o filtrado foi concentrado. O resíduo foi purificado através de cromatografia flash de fase reversa (acetonitrila 0-100% em bicarbonato de amônio aquoso (10 mM)) para dar o composto 104a (0,13 g, 96% de rendimento) co- mo um sólido branco. ESI m/z: 518,0 ((M-55)/2)+. N-[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-[(2S)-2-[(2S)-2-{2-amino-6-[2- (ciclo-oct-2-in-1-iloxi)acetamido]hexanamido}-3-metilbutanamido]- 5-(carbamoilamino)pentanamido]-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantren-1-il]carbonil}carbamoil)-4b,8-dimetil- 4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamato de terc-butila (104b)
[00567] A uma solução de composto 103 (0,27 g, 0,31 mmol) e DI- PEA (0,11 mL, 0,61 mmol) em DMF (6 mL) foi adicionado composto 102b (0,18 g, 0,34 mmol) seguido pela adição de HATU (0,14 g, 0,37 mmol). A mistura de reação foi agitada em RT por 3 h, o que foi moni- torado através de LCMS. A solução resultante foi diretamente purifica- da através de cromatografia flash de fase reversa para dar o composto Fmoc-104b (0,30 g, ESI m/z: 711 ((M + Na)/2 +1)+) como um sólido amarelo pálido, que foi dissolvido em DCM (6,0 mL). À solução foi adi- cionada piperidina (0,5 mL) e a mistura de reação foi agitada em RT por 2 h até que Fmoc foi totalmente removido de acordo com LCMS. Os voláteis foram removidos in vacuo e o resíduo foi triturado com éter de petróleo para dar o composto 104b (0,26 g, 65% de rendimento) como um sólido amarelo claro. ESI m/z: 1177,6 ((M + H)+. Exemplo 5c Intermediários 105a-c
[00568] Intermediário azido α-CD-N3 (105a) foi sintetizado de acor- do com J. Am. Chem. Soc., 2012, 134(46), 19108-19117 (FIG. 32). Ácido azido-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxa-16-azaoctadecano-18- sulfônico (105b), FIG. 33
[00569] A uma solução de 1-azido-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15- oato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila (N3-PEG4-OSu, 0,10 g, 0,26 mmol) e taurina (39 mg, 0,31 mmol) em DMF anidro (4 mL) foi adicionado DI- PEA (15 mg, 0,52 mmol). A mistura foi agitada em RT de um dia para o outro. A mistura de reação foi filtrada e a solução foi purificada atra- vés de HPLC preparativa (método A) para dar intermediário 105b (0,80 g, Rendimento 78%) como óleo incolor. ESI m/z: 399,1 (M + H)+. 1H RMN (500 MHz, D2O) δ 3,69 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 3,64-3,59 (m, 14H), 3,49 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 3,41 (t, J = 4,5 Hz, 2H), 3,00 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 2,45 (t, J = 6,0 Hz, 2H) ppm.
[00570] Intermediário azido maltose-N3 (105c) foi sintetizado de acordo com Tetrahedron Letters, 2001, 42 (7), 1325-1328 (FIG. 34). Exemplo 5d Intermediários 106a-e Legenda: "taurino"
[00571] A uma solução de composto 104 em DMF foi adicionado Intermediário azido 105 em RT.
A reação foi agitada em RT por 3-48 h até que LCMS mostrou reação completa.
A mistura de reação foi puri- ficada diretamente através de HPLC preparativa para dar o composto Boc-106 como um sólido branco, que foi dissolvido em solução de TFA (ou TFA puro). A solução foi agitada em RT por 0,5-20 h até Boc ser removido de acordo com LCMS.
A solução foi concentrada para dar 106 (como o sal de TFA). Alcina Azida Etapa 1 Etapa 2 Produto g (mmoL) g (mmoL) DMF T Tem- Purifi- TFA sol- Tem- # g o (mL) ( C) po cação (mL) vente po (Rendi- (hr) (mL) (hr) mento) 104a 0,050 105a 0,11 4 RT 48 RP-A 1 DCM (3 1 106a 0,019* (0,045) (0,12) mL) (69%) 104b 0,050 105a 0,085 4 RT 20 RP 2 / 0,5 106b 0,076 (0,042) (0,085) (87%) 104a 0,17 105b 0,12 6 RT 20 RP-A 2 / 1 106c 0,090 (0,16) (0,31) (39%) 104b 0,050 105b 0,034 2 RT 3 RP 1 MeOH 20 106d 0,022 (0,042) (0,084) (2 mL) (36%) 104a 0,035 105c 0,024 DMSO RT 4 RP 3 / 2 106e 0,034 (0,032) (0,064) 5 mL (77%) *nem todo Boc-106a foi usado para de-Boc. (1S,4aS,10aR)-N-[(1S,4aS,10aR)-6-Amino-1,4a-dimetil- 2,3,4,9,10,10a-hexaidrofenantreno-1-carbonil]-6-[(2S)-2-[(2S)-2- [(2R)-2-amino-6-{2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42- dodecaidroxi-10,15,20,25,30-pentacis(hidroximetil)- 2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29- dodecaoxaeptaciclo[26,2,2,23,6,28,11,213,16,218,21,223,26]dotetracontan- 5-il]metil}-4H,5H,6H,7H,8H,9H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-4- il)oxi]acetamido}hexanamido]-3-metilbutanamido]propanamido]- 1,4a-dimetil-2,3,4,9,10,10a-hexaidrofenantreno-1-carboxamida sal do ácido trifluoracético (106a)
[00572] Seguindo o procedimento geral para Intermediários 106a-e, composto Boc-106a (72 mg, 76% de rendimento, como uma mistura de regioisômeros de triazol) foi obtido como um sólido branco (ESI m/z: 1045 (M/2 + 1)+). Uma quantidade pequena do isômero principal puro (7 mg) pôde ser obtida após purificação adicional através de cro- matografia flash de fase reversa (acetonitrila 0-60% em TFA aquoso (0,01%)), que foi determinado através de 1H RMN (500MHz, DMSOd6) ((com regioisômeros) δ 9,92 (s, 0,5H ), 9,82 (s, 0,5H), 9,10 (s, 1H), 8,58-8,53 (m, 1H), 8,50-8,35 (m, 1H), 8,12 (s, 1H), 8,04 (s, 3H), 7,88- 7,82 (m, 1H), 7,55 (s, 0,5H), 7,46 (s, 0,5H), 7,41 (s, 1H), 7,40-7,26 (m, 1H), 7,14 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 6,97 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 5,51 (br, 12H), 4,83-4,70 (m, 8H), 4,57-4,51 (m, 3H), 4,44- 4,36 (m, 4H), 4,00-3,98 (m, 1H), 3,88-3,55 (m, 27H), 3,26-3,09 (m, 6H), 2,91-2,85 (m, 4H), 2,76-2,63 (m, 3H), 2,29-2,25 (m, 2H), 2,17-1,99 (m, 4H), 1,96-1,93 (m, 6H), 1,88-1,63 (m, 9H), 1,56-1,54 (m, 15H), 1,33- 1,28 (m, 15H), 1,18-1,13 (m, 3H), 1,01-0,99 (m, 6H), 0,89-0,83 (m, 7H) ppm.). A uma mistura de Boc-106a (como uma mistura de regioisôme- ros) (20 mg, 9,6 µmol) em DCM (3 mL) foi adicionado TFA (1 mL). A mistura resultante foi agitada em RT por uma hora até que Boc foi re-
movido, conforme monitorado através de LCMS. Os voláteis foram re- movidos in vacuo para dar o composto 106a (19 mg, 69% de rendi- mento de 104a) como um sólido amarelo pálido, que foi usado para a etapa seguinte sem purificação adicional. ESI m/z: 995 (M/2 + 1)+. (1S,4aS,10aR)-N-{[(1S,4aS,10aR)-6-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-Amino-6- {2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-dodecaidroxi- 10,15,20,25,30-pentacis(hidroximetil)- 2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29- dodecaoxaeptaciclo[26,2,2,23,6,28,11,213,16,218,21,223,26]dotetracontan- 5-il]metil}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-4- il)oxi]acetamido}hexanamido]-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantren-1-il]carbonil}-6-amino-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carboxamida sal do ácido trifluoracético (106b)
[00573] Seguindo o procedimento geral para Intermediários 106a-e, composto 106b (76 mg, 87% de rendimento a partir de 104b) foi obtido como um sólido amarelo. ESI m/z: 692 (M/3 + 1)+. Ácido 1-(4-(2-(((R)-5-amino-6-(((S)-1-(((S)-1-(((4bS,8S,8aR)-8- (((1S,4aS,10aR)-6-amino-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantreno-1-carbonil)carbamoil)-4b,8-dimetil-
4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il)amino)-1-oxopropan-2- il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-6-oxoexil)amino)-2- oxoetoxi))-4,5,6,7,8,9-hexaidro-1H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-1-il)- 15-oxo-3,6,9,12-tetraoxa-16-azaoctadecano-18-sulfônico (106c)
[00574] Seguindo o procedimento geral para Intermediários 106a-e, composto 106c (90 mg, 39% de rendimento a partir de 104c) foi obtido como um sólido amarelo. ESI m/z: 463,8 (M/3 + 1)+. Ácido 1-(4-(((6S,9S,12R)-1,12-Diamino-6-(((4bS,8S,8aR)-8- (((1S,4aS,10aR)-6-amino-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantreno-1-carbonil)carbamoil)-4b,8-dimetil- 4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il)carbamoil)-9-isopropil- 1,8,11,18-tetraoxo-2,7,10,17-tetraazanonadecan-19-il)oxi)- 4,5,6,7,8,9-hexaidro-1H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-1-il)-15-oxo- 3,6,9,12-tetraoxa-16-azaoctadecano-18-sulfônico (106d)
[00575] Seguindo o procedimento geral para Intermediários 106a-e, composto 106d como seu sal de TFA (22 mg, 36% de rendimento) foi obtido como um sólido branco após purificação através de cromatogra- fia flash de fase reversa (acetonitrila 0-80% em água durante 25 minu- tos). ESI m/z: 788 (M/2 + H)+.
(1S,4aS,10aR)-6-Amino-N-((1S,4aS,10aR)-6-((2S)-2-((2S)-2-((2R)-2- amino-6-(2-((1-((2S,3R,4R,5S,6R)-3,4-di-hidroxi-6-(hidroximetil)-5- (((2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-tri-hidroxi-6-(hidroximetil)tetraidro-2H- piran-2-il)oxi)tetraidro-2H-piran-2-il)-3a,4,5,6,7,8,9,9a-octaidro-1H- ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-4-il)oxi)acetamido)hexanamido)-3- metilbutanamido)propanamido)-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantreno-1-carbonil)-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantreno-1-carboxamida (106e)
[00576] Seguindo o procedimento geral para Intermediários 106a-e, composto 106e como seu sal de TFA (34 mg, 77% de rendimento) foi obtido como óleo incolor. ESI m/z: 1358 (M + H)+. Exemplo 5e Ligador-Cargas úteis LP1B-LP5B Legenda: "taurino"
[00577] A uma solução de composto 106 em DMF foram adiciona- dos composto DIBAC-PEG4-NHS 107 e DIPEA em RT.
A mistura de reação foi agitada em RT por 3 h.
A mistura de reação foi purificada diretamente através de HPLC preparativa (método B) ou cromatografia flash de fase reversa (método B) para dar o composto LP1B-5B.
Amina 106 Éster de DIPEA DMF Tem- Purificação Produto LP # mg NHS 107 (mmol) (mL) po # mg (Ren- (µmol) mg (hr) dimento) (µmol) 106a 19 (8,7) 7,0 (11) 4,0 mg 1,5 1,5 RP-B (duas LP1B 8 (36%)* (0,031) vezes) 106b 76 (37) 24 (37) 12 µL 5 1,5 Prep-B (du- LP2B 20 (21%) (0,073) as vezes) 106c 90 (65) 39 (60) 0,02 mL 5 1,5 Prep-B LP3B 60 (52%) (0,12) 106d 22 (15) 9,7 (15) 5 µL 2 1,5 Prep-B LP4B 6 (20%) (0,030) 106e 40 (29) 23 (35) 7,6 mg 5 4 Prep-B LP5B 15 (27%) (59) *7 mg de composto 106a como base livre foram reciclados. 1-(4-{2-Azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen- 10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-N-[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1- {[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-amino-1,4a-dimetil- 2,3,4,9,10,10a-hexaidrofenantreno-1-carbonil]carbamoil}-4b,8- dimetil-5,6,7,8a,9,10-hexaidrofenantren-3- il]carbamoil}etil]carbamoil}-2-metilpropil]carbamoil}-5-{2-[(1- {[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-dodecaidroxi-10,15,20,25,30- pentacis(hidroximetil)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29- dodecaoxaeptaciclo[26,2,2,23,6,28,11,213,16,218,21,223,26]dotetracontan- 5-il]metil}-4H,5H,6H,7H,8H,9H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-4- il)oxi]acetamido}pentil]-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida (LP1B)
[00578] Seguindo o procedimento geral para Ligador-cargas úteis LP1-5, ligador-carga útil LP1B (8 mg, 36% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 842 (M/3 + 1)+; 1262 (M/2 + 1)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 9,69 (s, 0,5H), 9,28 (s, 0,5H), 8,20-8,00 (m, 5H), 7,81-7,75 (m, 2H), 7,66 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,60 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,53-7,27 (m, 9H), 6,96-6,92 (m, 1H), 6,67 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,47 (s, 1H), 6,32 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 5,57-5,47 (m, 14H), 5,13-4,99 (m, 2H), 4,81-4,68 (m, 11H), 4,59-4,52 (m, 5H), 4,36-4,29 (m, 3H), 4,16- 4,08 (m, 1H), 3,99-3,98 (m, 1H), 3,84-3,53 (m, 30H), 3,45-3,38 (m, 12H), 3,13-3,03 (m, 4H), 2,90-2,66 (m, 5H), 2,36-2,32 (m, 1H), 2,26- 2,20 (m, 3H), 2,15-2,12 (m, 4H), 2,00-1,99 (m, 2H), 1,88-1,72 (m, 6H), 1,64-1,40 (m, 14H), 1,33-1,24 (m, 17H), 1,14-1,09 (m, 3H), 1,00-0,97 (m, 7H), 0,89-0,81 (m, 8H) ppm.
[00579] HPLC Anal.: 95%. Tempo de retenção: 7,93 min (método B). 1-(4-{2-Azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen- 10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-N-[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1- {[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-amino-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantren-1-il]formamido}carbonil)- 4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamoil}-4- (carbamoilamino)butil]carbamoil}-2-metilpropil]carbamoil}-5-{2-
[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-dodecaidroxi- 10,15,20,25,30-pentacis(hidroximetil)- 2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29- dodecaoxaeptaciclo[26,2,2,23,6,28,11,213,16,218,21,223,26]dotetracontan- 5-il]metil}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-4- il)oxi]acetamido}pentil]-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida (LP2B)
[00580] Seguindo o procedimento geral para Ligador-cargas úteis LP1-5, ligador-carga útil LP2B (20 mg, 21% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 870 (M/3 + H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 9,76 (s, 1H), 9,31 (s, 1H), 8,26-8,16 (m, 1H), 8,11-8,07 (m, 1H), 8,03-7,98 (m, 1H), 7,78-7,75 (m, 1H), 7,68-7,66 (m, 1H), 7,62-7,60 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 7,55-7,52 (m, 1H), 7,48-7,44 (m, 4H), 7,39-7,30 (m, 4H), 6,96-6,93 (m, 1H), 6,68-6,77 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,47 (m, 1H), 6,34-6,32 (dd, J = 8,0 Hz, 1,6 Hz, 1H), 5,96 (br s, 1H), 5,59-5,56 (m, 5H), 5,52-5,45 (m, 7H), 5,38 (s, 2H), 5,13 (br s, 1H), 5,04-5,00 (d, J = 14,0 Hz, 1H), 4,81-4,69 (m, 10H), 4,60-4,51 (m, 5H), 4,36-4,11 (m, 5H), 3,98 (br s, 2H), 3,85-3,77 (m, 11H), 3,70-3,58 (m, 10H), 3,45-3,40 (m, 20H), 3,30-3,27 (m, 4H), 3,12-3,04 (m, 5H), 2,98-2,86 (m, 4H), 2,77-2,67 (m, 4H), 2,27-2,19 (m, 4H), 2,16-2,10 (m, 4H), 2,02-1,96 (m,
2H), 1,89-1,73 (m, 8H), 1,64-1,57 (m, 11H), 1,50-1,43 (m, 7H), 1,26- 1,20 (m, 12H), 1,15-1,10 (m, 4H), 1,01-0,97 (m, 6H), 0,89-0,82 (m, 6H) ppm. HPLC Anal.: 100%. Tempo de retenção: 7,35 min (método B). Solubilidade: < 0,1 mg/mL de água. Ácido 2-{1-[4-({[(5R)-5-[1-(4-{2-azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca- 1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-amido]-5-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8- ({[(1S,4aS,10aR)-6-amino-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantren-1-il]carbonil}carbamoil)-4b,8-dimetil- 4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamoil}etil]carbamoil}- 2-metilpropil]carbamoil}pentil]carbamoil}metoxi)- 1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-1-il]-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-amido}etano-1-sulfônico (LP3B)
[00581] Seguindo o procedimento geral para Ligador-cargas úteis LP1-5, ligador-carga útil LP3B (60 mg, 52% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 642 (M/3 + H)+. 1H RMN (500 MHz, CDCl3) δ 9,68 (s, 0,6H), 9,25 (s, 0,4H), 8,22-8,07 (m, 3H), 8,02-7,86 (m, 2H), 7,77-7,72 (m, 2H), 7,68-7,60 (m, 2H), 7,54-7,52 (m, 1H), 7,50- 7,42 (m, 4H), 7,39-7,27 (m, 4H), 7,22 (s, 1H), 7,08 (s, 1H), 6,97-6,94 (m, 2H), 6,74 (d, J = 10,5 Hz, 1H), 6,58 (s, 1H), 6,43 (dd, J = 10,0 Hz, 2,0 Hz, 1H), 5,62 (br s, 1H), 5,04-5,00 (m, 1H), 4,93-4,90 (m, 0,4H), 4,76-4,72 (m, 0,6H), 4,52-4,26 (m, 4H), 4,16-4,08 (m, 1H), 3,81-3,75 (m, 4H), 3,61-3,55 (m, 4H), 3,46-3,44 (m, 24H), 3,30-3,27 (m, 5H), 3,08-3,06 (m, 5H), 2,97-2,89 (m, 2H), 2,80-2,74 (m, 4H), 2,54-2,52 (m, 2H), 2,40-2,31 (m, 2H), 2,27-2,22 (m, 4H), 2,16-2,13 (m, 4H), 2,02-1,71 (m, 8H), 1,69-1,45 (m, 10H), 1,40-1,21 (m, 14H), 1,17-1,08 (m, 4H),
1,01-0,98 (m, 6H), 0,89-0,82 (m, 6H) ppm. Ácido 2-{1-[4-({[(5R)-5-[1-(4-{2-azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca- 1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-amido]-5-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8- ({[(1S,4aS,10aR)-6-amino-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantren-1-il]carbonil}carbamoil)-4b,8-dimetil- 4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamoil}-4- (carbamoilamino)butil]carbamoil}-2- metilpropil]carbamoil}pentil]carbamoil}metoxi)- 1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-1-il]-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-amido}etano-1-sulfônico (LP4B )
[00582] Seguindo o procedimento geral para Ligador-cargas úteis LP1-5, composto LP4B (6,0 mg, 20% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 671 (M/3 + H)+. 1H RMN (500 MHz, CDCl3) δ 9,37 (s, 1H), 9,29 (s, 1H), 8,24-8,22 (m, 1H), 8,18-8,17 (m, 2H), 8,09 (s, 2H), 8,01-7,99 (m, 1H), 7,97-7,94 (m, 2H), 7,89-7,84 (m, 1H), 7,76 (m, 5H), 7,68 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,62 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,55 (m, 2H), 7,51-7,43 (m, 7H), 7,39-7,28 (m, 7H), 7,08 (m, 4H), 6,96-6,93 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 6,68 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 6,48 (s, 2H), 6,35-6,33 (m, 2H), 5,97- 5,95 (m, 2H), 5,37 (s, 4H), 5,04-5,01 (m, 2H), 4,74-4,69 (m, 5H), 4,52 (m, 1H), 4,42 (t, J = 5,5 Hz, 2H), 4,34-4,27 (m, 4H), 4,18 (m, 1H), 4,13- 4,11 (m, 1H), 3,82-3,77 (m, 5H), 3,58-3,55 (m, 6H), 3,49-3,44 (m, 14H), 3,10-3,05 (m, 4H), 2,98-2,93 (m, 4H), 2,77-2,75 (m, 4H), 2,28-2,25 (m, 4H), 2,03-1,99 (m, 2H), 1,64-1,51 (m, 6H), 1,27-1,24 (m, 11H), 1,01- 0,98 (m, 11H), 0,89-0,82 (m, 8H) ppm. 1-(4-{2-Azatriciclo[10,4,0,0⁴,⁹]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-
10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-N-[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1- {[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-amino-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carbonil]carbamoil}-4b,8- dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3- il]carbamoil}etil]carbamoil}-2-metilpropil]carbamoil}-5-[2-({1- [(2S,3R,4R,5S,6R)-3,4-di-hidroxi-6-(hidroximetil)-5- {[(2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-tri-hidroxi-6-(hidroximetil)oxan-2- il]oxi}oxan-2-il]-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-4- il}oxi)acetamido]pentil]-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida (LP5B)
[00583] Seguindo o procedimento geral para Ligador-cargas úteis LP1-5, composto LP5B (15 mg, 27% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 947 (M/2 + H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 9,69 (s, 0,55H), 9,27 (s, 0,45H), 8,25-8,15 (m, 2H), 8,15- 8,05 (m, 2H), 8,05-7,90 (m, 1H), 7,90-7,80 (m, 1H), 7,76 (t, J = 6,4 Hz, 1H), 7,66 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,60 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 7,55-7,40 (m, 4H), 7,40-7,25 (m, 3H), 7,00-6,90 (m, 1H), 6,67 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,47 (s, 1H), 6,32 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 5,75-5,70 (m, 1H), 5,56 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,50-5,40 (m, 2H), 5,20-4,92 (m, 4H), 4,80-4,70 (m, 1H), 4,70-4,65 (m, 2H), 4,65-4,55 (m, 2H), 4,40-4,25 (m, 2H), 4,20-3,95 (m, 2H), 3,80-3,75 (m, 2H), 3,75-3,45 (m, 23H), 3,30-3,20 (m, 3H), 3,20- 2,90 (m, 5H), 2,90-2,65 (m, 3H), 2,60-2,55 (m, 1H), 2,40-1,95 (m, 12H), 1,90-1,70 (m, 5H), 1,70-1,35 (m, 14H), 1,35-1,20 (m, 15H), 1,15-1,05 (m, 3H), 1,00-0,90 (m, 7H), 0,90-0,80 (m, 7H) ppm. EXEMPLO 11-6 Ligador-Carga útil LP6B
[00584] Esse exemplo demonstra métodos para a síntese do liga- dor-carga útil LP6B na Tabela 3, acima. Esse exemplo se refere aos compostos numerados de 109 a 113 e ligador-carga útil LP6B na FIG.
26. 1-(4-{2-Azatriciclo[10,4,0,0⁴,⁹]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen- 10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(carbamoilamino)- 1-{[4-(hidroximetil)fenil]carbamoil}butil]carbamoil}-2-metilpropil]- 3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida (110)
[00585] A uma solução de composto 108 (0,30 g, 0,54 mmol) em DMF (10 mL) foram adicionados HATU (0,31 g, 0,81 mmol) e DIPEA (0,14 g, 1,1 mmol) sucessivamente em RT. A mistura foi agitada em RT por 15 min. À solução de reação foi então adicionado VC-PAB-OH 109 (CAS: 159857-79-1, 0,21 g, 0,54 mmol) em RT e a mistura resul- tante foi agitada em RT por 3 h até 108 ou 109 ter sido consumido, conforme monitorado através de LCMS. A mistura de reação foi então filtrada através de uma membrana de filtragem e o filtrado foi concen- trado e diretamente purificado através de cromatografia flash de fase reversa (acetonitrila 0-100% em água (com 10 mmol/L de bicarbonato de amônio)) para dar o composto 110 (0,30 g, 60% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 617 (M + H)+. 4-nitrofenil carbonato de {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2- Azatriciclo[10,4,0,0⁴,⁹]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2- il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido]-3- metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (112)
[00586] A uma solução de composto 110 (0,15 g, 0,16 mmol) em DMF (10 mL) foram adicionados carbonato de bis(4-nitrofenila) 111 (0,15 g, 0,49 mmol) e DIPEA (63 mg, 0,49 mmol) sucessivamente a 0 o C.
A mistura foi então agitada em RT por 3 h até que 110 foi consu- mido, conforme monitorado através de LCMS.
A mistura de reação foi filtrada através de uma membrana de filtragem e o filtrado foi concen- trado e diretamente purificado através de cromatografia flash de fase reversa (acetonitrila 0-100% em água (com 10 mmol/L de bicarbonato de amônio)) para dar o composto 112 (50 mg, 28% de rendimento) como um sólido branco.
ESI m/z: 1079 (M + H)+. N-({[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2- Azatriciclo[10,4,0,0⁴,⁹]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in- 2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido]-3- metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metoxi)carbonil]amino}-1,4a- dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantren-1- il]formamido}carbonil)-4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10- octaidrofenantren-3-il]carbamoil}metil)carbamato de 9H-fluoren-9- ilmetila (113)
[00587] A uma mistura de composto 14a (0,10 g, 0,12 mmol) e composto 112 (0,15 g, 0,14 mmol) em DMF (5 mL) foram adicionados HOBt (20 mg, 0,15 mmol) e DIPEA (48 mg, 0,37 mmol) e a mistura foi agitada em RT por 4 h, o que foi monitorado através de LCMS. A mis- tura de reação foi purificada através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto 113 (0,16 g, 72% de rendimento) como um sólido amarelo claro. ESI m/z: 874 (M/2 + 1)+. N-[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-(2-aminoacetamido)-1,4a- dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1- carbonil]carbamoil}-4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10- octaidrofenantren-3-il]carbamato de {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2- Azatriciclo[10,4,0,0⁴,⁹]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in- 2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido]-3- metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (LP6B)
[00588] A uma solução de composto 113 (0,10 g, 0,057 mmol) em DMF (5 mL) foi adicionada piperidina (1 mL) e a mistura foi agitada em RT por meia hora até que Fmoc foi totalmente removido de acordo com LCMS. A mistura de reação foi purificada diretamente através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto LP6B (35 mg, 23% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 763 (M/2 + 1)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 10,0 (s, 1H), 9,51 (s, 1H), 8,15-8,08 (m, 2H), 7,87 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,76 (t, J = 5,0 Hz, 1H), 7,70-7,65 (m,
1H), 7,61 (t, J = 8,5 Hz, 3H), 7,51-7,42 (m, 4H), 7,41-7,30 (m, 8H), 7,20-7,10 (m, 1H), 7,00-6,90 (m, 2H), 6,00-5,95 (m, 1H), 5,40 (s, 2H), 5,35-5,30 (m, 1H), 5,10-5,00 (m, 3H), 4,40-4,35 (m, 1H), 4,25-4,20 (m, 1H), 3,65-3,55 (m, 3H), 3,50-3,40 (m, 14H), 3,25 (s, 3H), 3,10-3,00 (m, 4H), 3,00-2,85 (m, 4H), 2,80-2,70 (m, 2H), 2,63-2,61 (m, 1H), 2,60-2,55 (m, 1H),2,45-2,35 (m, 3H), 2,31-2,20 (m, 3H), 2,20-2,10 (m,4H), 2,10- 1,92 (m, 5H), 1,90-1,82 (m, 4H), 1,68-1,53 (m, 6H), 1,50-1,40 (m, 2H), 1,20-1,10 (m, 2H), 1,02-0,96 (m, 6H), 0,90-0,80 (m, 8H) ppm. EXEMPLO 11-7 Ligador-Carga útil LP7B
[00589] Esse exemplo demonstra métodos para a síntese do liga- dor-carga útil LP7B na Tabela 2, acima. Esse exemplo se refere aos compostos numerados 14a, 107, 114 e 115 e ligador-carga útil LP7B na FIG. 27. N-({[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-[(2S)-2-[(2S)-2-{[(terc- Butoxi)carbonil]amino}-3-metilbutanamido]propanamido]-1,4a- dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantren-1- il]formamido}carbonil)-4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10- octaidrofenantren-3-il]carbamoil}metil)carbamato de 9H-fluoren-9- ilmetila (114)
[00590] A uma solução de composto 14a (66 mg, 0,082 mmol) em DMF (10 mL) foram adicionados Boc-Val-Ala-OH 101c (28mg, 0,098mmol), DIPEA (32 mg, 0,25 mmol) e HATU (47 mg, 0,12 mmol). A mistura de reação foi agitada em RT por 4 h e monitorada através de
LCMS. A mistura foi diretamente purificada através de cromatografia flash de fase reversa (acetonitrila 50-90% em bicarbonato de amônio aquoso (10 mM)) para dar o composto 114 (74 mg, 84% de rendimen- to) como um sólido branco. ESI m/z: 978 (M - Boc + 1)+. N-({[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-[(2S)-2-[(2S)-2-Amino-3- metilbutanamido]propanamido]-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantren-1-il]formamido}carbonil)-4b,8-dimetil- 4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3- il]carbamoil}metil)carbamato de 9H-fluoren-9-ilmetila sal do ácido trifluoracético (115)
[00591] A uma solução de composto 114 (74 mg, 0,069 mmol) em DCM (3 mL) foi adicionado TFA (1 mL). A mistura de reação foi agita- da em RT por uma hora até Boc ter sido totalmente removido de acor- do com LCMS. Os voláteis foram removidos in vacuo para dar produto bruto 115 (66 mg, 97% de rendimento como sal de TFA) como óleo incolor. ESI m/z: 978 (M + 1)+. 1-(4-{2-Azatriciclo[10,4,0,0⁴,⁹]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen- 10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8- {[(1S,4aS,10aR)-6-(2-aminoacetamido)-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carbonil]carbamoil}-4b,8- dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3- il]carbamoil}etil]carbamoil}-2-metilpropil]-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-amida (LP7B)
[00592] A uma solução de composto 115 (60 mg, 61 µmol) em DMF (5 mL) foram adicionados DIBAC-suc-PEG4-OSu 107 (48 mg, 74 µmol) e DIPEA (24 mg, 0,18 mmol). A mistura de reação foi agitada em RT por 4 h e monitorada através de LCMS. À reação foi então adi- cionada piperidina (0,2 mL, excesso). A mistura de reação foi agitada em RT por 30 min até que Fmoc foi totalmente removido de acordo com LCMS. A mistura de reação foi purificada diretamente através de HPLC preparativa (método B) para dar LP7B (22 mg, 28% de rendi- mento) como um sólido branco. ESI m/z: 1292 (M + H)+. 1H RMN (500MHz, DMSOd6) (com regioisômeros) δ 9,66 (s, 0,5H), 9,51(s, 0,5H), 8,43 (d, J = 7,5 Hz, 0,5H), 8,15-8,10 (m, 1,5H), 8,05 (d, J = 7,5 Hz, 0,5H), 7,90 (d, J = 7,5 Hz, 0,5H), 7,77 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 7,70-7,65 (m, 1H), 7,65-7,60 (m, 1H), 7,55-7,25 (m, 11H), 6,97 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 5,02 (d, J = 14,5 Hz, 1H), 4,40-4,35 (m, 1H), 4,18 (t, J = 7,5 Hz, 0,5H), 4,04 (t, J = 7,5 Hz, 0,5H), 3,65-3,50 (m, 3H), 3,50-3,40 (m, 14H), 3,23 (s, 3H), 3,15-3,05 (m, 3H), 2,95-2,85 (m, 3H), 2,80-2,70 (m, 3H), 2,60-2,55 (m, 1H), 2,40-2,10 (m, 12H), 2,00-1,80 (m, 5H), 1,80-1,70 (m, 1H), 1,70-1,55 (m, 5H), 1,24 (s, 1H), 1,20-1,10 (m, 3H), 1,10-0,90 (m, 8H), 0,90-0,80 (m, 8H) ppm. EXEMPLO 11-8 Ligador-Carga útil LP8B
[00593] Esse exemplo demonstra métodos para a síntese do liga- dor-carga útil LP8B na Tabela 3, acima. Esse exemplo se refere aos compostos numerados P4B, 117-120 e ligador-carga útil LP8B na FIG.
28. N-({[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-Amino-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carbonil]carbamoil}-4b,8- dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3- il]carbamoil}metil)carbamato de {4-[(2S)-2-[(2S)-2-Amino-3- metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (117)
[00594] A uma solução de Fmoc-vc-PAB-PNP 116 (0,14 g, 0,18 mmol) e carga útil P4B (0,11 g, 0,18 mmol) em DMF (2 mL) foram adi- cionados HOBt (24 mg, 0,18 mmol) e DIPEA (70 mg, 0,54 mmol) em RT através de seringa. A mistura foi agitada em RT por 2 h e compos- to P4B foi consumido de acordo com LCMS. À mistura resultante foi adicionada piperidina (42 mg, 0,50 mmol) e a reação foi agitada em RT por 2 h até que Fmoc foi totalmente removido, conforme monitorado através de LCMS. Após filtragem através de uma membrana, o filtrado foi concentrado e purificado diretamente através de HPLC preparativa (método B) para dar a composto 117 (45 mg, 27% de rendimento) co- mo um sólido branco. ESI m/z: 991 (M + 1)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 10,11 (s, 1H), 9,80 (s, 1H), 8,20-8,04 (m, 2H), 7,60 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,52-7,44 (m, 2H), 7,36-7,20 (m, 3H), 6,96 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,68 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,48 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,36-6,29 (m, 1H), 5,98 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 5,41 (s, 2H), 4,97 (s, 2H), 4,70 (s, 2H), 4,52-4,42 (m, 1H), 3,75 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 3,07-2,85 (m, 4H), 2,82- 2,61 (m, 3H), 2,31-2,06 (m, 6H), 2,00-1,78 (m, 6H), 1,72-1,52 (m, 6H), 1,44-1,09 (m, 13H), 0,99 (d, J = 8,5 Hz, 6H), 0,87 (d, J = 8,1 Hz, 3H), 0,78 (d, J = 6,8 Hz, 3H) ppm.
(2R)-6-[2-(Ciclo-oct-2-in-1-iloxi)acetamido]-2-{[(9H-fluoren-9- ilmetoxi)carbonil]amino}hexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila (118)
[00595] Uma mistura de composto 103 (0,10 g, 0,19 mmol), EDCI (72 mg, 0,38 mmol) e HOSu (43 mg, 0,38 mmol) em DCM (3 mL) foi agitada em RT por 3 h. A mistura de reação foi concentrada e o resí- duo foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica gel (70% de acetato de etila em éter de petróleo) para dar intermediário 118 (55 mg, 47% de rendimento) como um sólido branco, que foi usa- do na etapa seguinte sem purificação. ESI m/z: 630 (M + 1)+. N-({[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-Amino-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carbonil]carbamoil}-4b,8- dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3- il]carbamoil}metil)carbamato de {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-amino-6- [2-(ciclo-oct-2-in-1-iloxi)acetamido]hexanamido]-3- metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (119)
[00596] A uma solução de composto 117 (55 mg, 56 µmol) e DIPEA (24 mg, 0,19 mmol) em DMF (1,5 mL) foi adicionado o intermediário bruto 118 (40 mg, 63 µmol). A mistura de reação foi agitada em RT por 2 h até que 118 foi consumido de acordo com LCMS. A mistura de re- ação foi diretamente purificada através de cromatografia flash de fase reversa (acetonitrila 0-100% em água) para dar Fmoc-119 (60 mg, ESI m/z: 753 (M/2 + 1)+) como um sólido branco, que foi dissolvido em DMF (1,5 mL). À solução foi adicionada dietilamina (24 mg, 0,33 mmol) e a solução foi agitada em RT por 2 h até que Fmoc foi totalmente re- movido de acordo com LCMS. A mistura de reação foi diretamente pu- rificada através de cromatografia flash de fase reversa (acetonitrila 0- 100% em bicarbonato de amônio aquoso) para dar o composto 119 (35 mg, 50% de rendimento a partir do composto 117) como um sólido branco. ESI m/z: 1282 (M + H)+. N-({[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-Amino-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carbonil]carbamoil}-4b,8- dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3- il]carbamoil}metil)carbamato de {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-amino-6- {2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-dodecaidroxi- 10,15,20,25,30-pentacis(hidroximetil)- 2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29- dodecaoxaeptaciclo[26,2,2,23,6,28,11,213,16,218,21,223,26]dotetracontan- 5-il]metil}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-4- il)oxi]acetamido}hexanamido]-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (120)
[00597] A uma solução de composto 119 (70 mg, 54 µmol) em DMF
(3 mL) foi adicionado α-CD-N3 105a (0,16 g, 0,16 mmol). A mistura de reação foi agitada a 50 oC por 3 dias, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura resultante foi então diretamente purificada através de cromatografia flash de fase reversa (acetonitrila 0-100% em bicarbona- to de amônio aquoso (10 mM) para dar o composto 120 (20 mg, 16% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 1141 (M/2 + 1)+. N-({[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-Amino-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carbonil]carbamoil}-4b,8- dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3- il]carbamoil}metil)carbamato de {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(4-{2- Azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in- 2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido]-6- {2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-dodecaidroxi- 10,15,20,25,30-pentacis(hidroximetil)- 2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29- dodecaoxaeptaciclo[26,2,2,23,6,28,11,213,16,218,21,223,26]dotetracontan- 5-il]metil}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-4- il)oxi]acetamido}hexanamido]-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (LP8B)
[00598] A uma solução de composto 120 (10 mg, 4,4 µmol) e inter- mediário 107 (5 mg, 7,7 µmol) em DMF (2 mL) foi adicionado DIPEA (16 mg, 0,12 mmol) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 16 h. A mistura de reação foi purificada diretamente através de HPLC preparativa (método B) duas vezes para dar LP8B (1,5 mg, 12% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 939 (M/3 + H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 9,87-9,66 (m, 1H), 8,22-8,08 (m, 4H), 7,91-7,76 (m, 2H), 7,71-7,61 (m, 4H), 7,56-7,45 (m, 4H), 7,40-7,28 (m, 5H), 6,96 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,68 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,48 (s, 1H), 6,34 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,03-5,96 (m, 1H), 5,67-5,31 (m, 12H), 5,06- 4,95 (m, 3H), 4,87-4,66 (m, 7H), 4,63-4,50 (m, 3H), 4,38-4,29 (m, 3H), 4,22-4,13 (m, 1H), 4,06-3,93 (m, 1H), 3,86-3,40 (m, 54H), 3,30-3,19 (m, 4H), 3,17-2,85 (m, 4H), 2,81-2,62 (m, 2H), 2,60-2,54 (m, 3H), 2,41- 1,95 (m, 11H), 1,92-1,71 (m, 5H), 1,68-1,40 (m, 13H), 1,33-1,09 (m, 22H), 1,02-0,93 (m, 10H), 0,89-0,78 (m, 9H) ppm. Anal. HPLC (como uma mistura de regioisômeros de triazol): 63%. Tempo de retenção: 6,03 min; 36%. Tempo de retenção: 6,13 min (método B). EXEMPLO 11-9 Ligador-Carga útil LP9B
[00599] Esse exemplo demonstra métodos para a síntese do liga- dor-carga útil LP9B na Tabela 3, acima. Esse exemplo se refere aos compostos numerados 12b, 15, 112, 121 e 122 e ligador-carga útil LP9B na FIG. 29, N-[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-amino-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantren-1-il]formamido}carbonil)- 4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamato de 9H-Fluoren-9-ilmetila, sal do ácido trifluoracético (15)
[00600] A uma solução de composto 12b (0,63 g, 1,0 mmol) em
DCM (50 mL) foram adicionados Fmoc-OSu (0,40 g, 1,2 mmol) e DI- PEA (0,26 g, 2,0 mmol). A mistura foi agitada em RT por 16 h, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica gel (50-80% de acetato de etila em éter de petróleo) para dar Boc-15 (0,71 g) como um sólido branco, que foi dissolvido em DCM (10 mL). À solução foi adicionado TFA (3 mL) em RT. A mistura de reação foi agi- tada em RT por 4 h até Boc ter sido totalmente removido de acordo com LCMS. Os voláteis foram removidos in vacuo para dar o compos- to 15 como um sal de TFA (0,62 g, 74% de rendimento) e óleo incolor. ESI m/z: 751 (M + H)+. N-[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-[(2S)-6-amino-2-{[(9H-fluoren- 9-ilmetoxi)carbonil]amino}hexanamido]-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantren-1-il]formamido}carbonil)- 4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamato de 9H-Fluoren-9-ilmetila, sal do ácido trifluoracético (122)
[00601] A uma solução de composto 15 (0,30 g, 0,40 mmol) em DMF (20 mL) foram adicionados Fmoc-Lys(Boc)-OH 121 (0,23 g, 0,48 mmol), HATU (228 mg, 0,60mmol) e DIPEA (0,16 g, 1,2 mmol) suces- sivamente em RT. A mistura de reação foi agitada em RT por 4 h e monitorada através de LCMS. A mistura resultante foi diretamente pu- rificada através de cromatografia flash de fase reversa (acetonitrila 50- 90% em bicarbonato de amônio aquoso (10 mM)) para dar Boc-122 (0,41 g) como um sólido branco, 0,24 g do que foi dissolvido em DCM (20 mL). À solução foi adicionado TFA (3 mL) e a mistura de reação foi agitada em RT por uma hora até Boc ter sido totalmente removido de acordo com LCMS. Os voláteis foram removidos in vacuo para dar o composto 122 como um sal de TFA (0,22 g, 79% de rendimento) e óleo incolor. ESI m/z: 1101 (M + H)+. N-[(5S)-5-Amino-5-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-amino-1,4a- dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1- carbonil]carbamoil}-4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10- octaidrofenantren-3-il]carbamoil}pentil]carbamato de {4-[(2S)-2- [(2S)-2-[1-(4-{2-azatriciclo[10,4,0,0⁴,⁹]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15- hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan- 15-amido]-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (LP9B)
[00602] A uma mistura de composto 122 (14 mg, 12 µmol) e com- posto 112 (15 mg, 14 µmol) em DMF (5 mL) foram adicionados HOBt (2 mg, 15 µmol) e DIPEA (5 mg, 37 µmol) e a mistura foi agitada em RT por 4 h, o que foi monitorado através de LCMS. À mistura de rea- ção foi então adicionada piperidina (0,5 mL) e a mistura foi agitada em RT por 0,5 h até que Fmoc foi totalmente removido de acordo com LCMS. A mistura de reação foi filtrada em uma membrana e o filtrado foi concentrado e diretamente purificado através de HPLC preparativa (método B) para dar LP9B (6 mg, 31% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 798 (M/2 + H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 10,0 (s, 1H), 8,15-8,08 (m, 2H), 7,87 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,76 (t, J = 5,0 Hz, 1H), 7,67 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 7,61 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 7,60-7,56 (m, 2H), 7,51-7,42 (m, 4H), 7,41-7,24 (m, 6H), 7,20-7,16 (m, 1H), 6,95 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,68 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,50-6,46 (m, 1H), 6,36-6,32
(m, 1H), 6,00-5,96 (m, 1H), 5,40 (s, 2H), 5,02 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 4,91 (s, 2H), 4,69 (s, 2H), 4,40-4,35 (m, 1H), 4,25-4,20 (m, 1H), 3,65-3,55 (m, 3H), 3,50-3,40 (m, 14H), 3,24-3,20 (m, 2H), 3,10-3,05 (m, 2H), 3,00-2,92 (m, 3H), 2,92-2,85 (m, 1H), 2,80-2,70 (m, 2H), 2,65-2,55 (m, 2H), 2,45-2,35 (m, 2H), 2,31-2,20 (m, 4H), 2,20-2,10 (m,4H), 2,10-1,92 (m, 3H), 1,90-1,70 (m, 6H), 1,68-1,53 (m, 6H), 1,50-1,30 (m, 8H), 1,25- 1,20 (m, 7H), 1,20-1,10 (m, 3H), 1,02-0,96 (m, 6H), 0,90-0,80 (m, 6H) ppm. EXEMPLO 11-10 Ligador-Cargas úteis LP10B e LP11B
[00603] Esse exemplo demonstra métodos para a síntese dos LP10B-LP11B na Tabela 3, acima. Esse exemplo se refere aos com- postos numerados P7B, P8B, 116, 123a-b, ligador-cargas úteis LP10B e LP11B na FIG. 30. Ácido (S)-4-((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-Amino-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carbonilcarbamoil)-4b,8- dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-ilamino)-3-((4-((S)-2- ((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-5- ureidopentanamido)benziloxi)carbonilamino)-4-oxobutanoico (123a)
[00604] A uma solução de carga útil P7 (64 mg, 0,10 mmol) em DMF (5 mL) foram adicionados intermediário 116 (92 mg, 0,12 mmol) e DIPEA (26 mg, 0,20 mmol) sucessivamente em RT. A mistura de rea- ção foi agitada em RT por 4 h e monitorada através de LCMS. À mistu- ra foi então adicionada piperidina (0,5 mL) e a mistura de reação foi agitada em RT por 10 min até que Fmoc foi totalmente removido de acordo com LCMS. A mistura foi diretamente purificada através de cromatografia flash de fase reversa (40-70% acetonitrila em bicarbona- to de amônio aquoso (10 mM)) para dar o composto 123a (41 mg, 39% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 1049 (M + H)+. Ácido (S)-5-((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-Amino-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carbonilcarbamoil)-4b,8- dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-ilamino)-4-((4-((S)-2- ((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-5- ureidopentanamido)benziloxi)carbonilamino)-5-oxopentanoico (123b)
[00605] Seguindo um procedimento similar para 123a exceto pela substituição de P7 por P8 (0,53 g, 0,81 mmol) provê o composto 123b (0,61 g, 71% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 1063 (M + H)+. Ácido (3S)-3-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2- azatriciclo[10,4,0,0⁴,⁹]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2- il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido]-3- metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metoxi)carbonil]amino}-3- {[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-amino-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carbonil]carbamoil}-4b,8- dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3- il]carbamoil}propanoico (LP10B)
[00606] A uma solução de composto 123 (21 mg, 20 µmol) em DMF (2 mL) foi adicionado intermediário 107 (16 mg, 24 µmol) e DIPEA (5 mg, 40 µmol) sucessivamente em RT.
A mistura de reação foi agitada em RT por 4 h e monitorada através de LCMS.
A mistura resultante foi diretamente purificada através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto LP10B (12 mg, 38% de rendimento) como um sólido branco.
ESI m/z: 792 (M/2 + H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 10,0 (s,1H), 8,14 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 8,09 (s, 1H), 7,90 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,85-7,75 (m, 1H), 7,68 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,65-7,55 (m, 3H), 7,55- 7,40 (m, 4H), 7,40-7,25 (m, 5H), 6,95 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,67 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,47 (s, 1H), 6,32 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,05-5,95 (m, 1H), 5,43 (s, 2H), 5,05-4,90 (m, 3H), 4,80-4,60 (m, 1H), 4,40-4,35 (m, 2H), 4,25-4,20 (m, 1H), 3,65-3,55 (m, 3H), 3,50-3,40 (m, 25H), 3,20-2,85 (m, 4H), 2,80-2,55 (m, 3H), 2,40-2,30 (m, 3H), 2,30-2,20 (m, 3H), 2,20- 2,05 (m, 4H), 2,0-1,50 (m, 12H), 1,50-1,30 (m, 3H), 1,30-1,20 (m, 6H), 1,20-1,05 (m, 2H), 1,05-0,90 (m, 5H), 0,90-0,80 (m, 6H) ppm.
Ácido (4S)-4-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2- azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2- il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido]-3- metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metoxi)carbonil]amino}-4- {[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-amino-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carbonil]carbamoil}-4b,8- dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3- il]carbamoil}butanoico (LP11B)
[00607] Seguindo um procedimento similar para LP10B exceto pela substituição de 123a por 123b (0,10 g, 94 µmol) provê o composto LP11B (50 mg, 33% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 799 (M/2 + H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 10,0 (s, 1H), 9,91 (s, 1H), 8,14 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 8,09 (s, 1H), 7,90 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,85-7,75 (m, 1H), 7,68 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,65-7,55 (m, 3H), 7,55- 7,40 (m, 4H), 7,40-7,25 (m, 6H), 6,95 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,67 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,47 (s, 1H), 6,32 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,05-5,95 (m, 1H), 5,43 (s, 2H), 5,05-4,90 (m, 3H), 4,40-4,35 (m, 2H), 4,25-4,20 (m, 1H), 3,65-3,55 (m, 4H), 3,50-3,40 (m, 25H), 3,20-2,85 (m, 4H), 2,80-2,55 (m, 3H), 2,40-2,30 (m, 3H), 2,30-2,20 (m, 3H), 2,20-2,05 (m, 4H), 2,00- 1,50 (m, 12H), 1,50-1,30 (m, 3H), 1,30-1,20 (m, 6H), 1,20-1,05 (m, 2H), 1,05-0,90 (m, 5H), 0,90-0,80 (m, 6H) ppm. EXEMPLO 11-11 Carga útil P12B e Ligador-Carga útil LP12B
[00608] Esse exemplo demonstra métodos para a síntese da carga útil P12B na Tabela C, abaixo e o ligador-carga útil LP12B na Tabela C, acima. Esse exemplo se refere aos compostos numerados 12b, 107, 124, 125 e 126 e carga útil P12B ligador-carga útil LP12B na FIG.
31. ((S)-2-((((9H-Fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-5-(terc-butoxi)-5- oxopentanoil)-L-alanina (125)
[00609] A uma solução de Fmoc-Glu(OtBu)-OH (6,0 g, 14 mmol) em DCM (300 mL) foram adicionados HOSu (3,2 g, 28 mmol) e EDCI (5,4 g, 28 mmol). A mistura de reação foi agitada em RT de um dia para o outro e monitorada através de LCMS. A mistura resultante foi diluída com DCM (200 mL) e lavada com água (100 mL x 2) e salmoura (100 mL). A solução orgânica foi seca em sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada in vacuo para dar o composto bruto 124 (8,5 g, ESI m/z: 545 (M + 23)+), que foi dissolvido em DMF (10 mL). À solução foram adicionados alanina (4,2 g, 48 mmol) e DIPEA (6,2 g, 48 mmol). A mis- tura de reação foi agitada em RT de um dia para o outro e monitorada através de LCMS. A mistura resultante foi despejada em água (100 mL) e acidificada com ácido acético para pH 5-6. A mistura foi extraída com acetato de etila e a solução orgânica combinada foi concentrada in vacuo. O produto bruto foi purificado através de cromatografia flash de fase reversa (0-60% acetonitrila em TFA aq. (0,01%)) para dar o composto 125 (1 g, 15% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 497 (M + H)+. 4-amino-5-((S)-1-((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-(terc- butoxicarbonilamino)-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantreno-1-carbonilcarbamoil)-4b,8-dimetil- 4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-ilamino)-1-oxopropan-2- ilamino)-5-oxopentanoato de (S)-terc-butila (126)
[00610] Uma mistura de composto 126 (57 mg, 64 µmol) em TFA puro (2,0 mL) foi agitada em A uma solução de composto 125 (42 mg, 84 µmol) e DIPEA (28 µl, 0,16 mmol) em DMF (3,0 mL) foi adicionado HATU (36 mg, 95 µmol). A mistura de reação foi agitada em RT por 10 min antes da adição de composto 12b (50 mg, 80 µmol) e a mistura foi agitada em RT de um dia para o outro, o que foi monitorado através de LCMS. À mistura de reação foi então adicionada piperidina (1,0 mL) e a mistura foi agitada em RT por 3 h até que Fmoc foi totalmente remo- vido de acordo com LCMS. A mistura resultante foi diretamente purifi- cada através de cromatografia flash de fase reversa (0-100% acetoni- trila em TFA aq. (0,01%)) para dar o composto 126 (20 mg, 28% de rendimento) como um sólido amarelo. ESI m/z: 885 (M + H)+. Ácido (S)-4-Amino-5-((S)-1-((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6- amino-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1- carbonilcarbamoil)-4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10- octaidrofenantren-3-ilamino)-1-oxopropan-2-ilamino)-5- oxopentanoico (P12B)
[00611] Uma mistura de composto 126 (57 mg, 64 μmol) em TFA puro (2,0 mL) foi agitada em RT por uma hora e monitorada através de LCMS. A mistura resultante foi diluída com DCM (20 mL) e concentra- da in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatografia flash de fase reversa (0-100% acetonitrila em bicarbonato de sódio aq. (10 mM)) para dar P12B (20 mg, 43% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 365 (M/2 + H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 9,90 (s, 1H), 8,30 (br s, 1H), 8,09 (s, 1H), 7,50 (s, 1H), 7,33 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,67 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,46(s, 1H), 6,33 (dd, J = 7,6 Hz e 2,0 Hz, 1H), 4,70 (br s, 1H), 4,41-4,36 (m, 1H), 3,42- 3,30 (m, 6H), 2,91-2,85 (m, 1H), 2,78-2,75 (m, 2H), 2,67-2,61 (m, 1H), 2,32-2,27 (m, 4H), 2,16-2,13 (m, 4H), 1,88-1,77 (m, 4H), 1,65-1,58 (m, 4H), 1,29-1,23 (m, 12H), 1,14-1,11 (m, 2H), 1,01 (d, J = 7,6 Hz, 6H)
ppm. Ácido (4S)-4-[1-(4-{2-azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca- 1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-amido]-4-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8- ({[(1S,4aS,10aR)-6-amino-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantren-1-il]formamido}carbonil)-4b,8-dimetil- 4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3- il]carbamoil}etil]carbamoil}butanoico (LP12B)
[00612] A uma solução de composto P12B (10 mg, 14 µmol) em DMF (2,0 ml) foram adicionados DIPEA (6 µl, 21 µmol) e composto 107 (11 mg, 16 µmol). A mistura de reação foi agitada em RT por 3 h e monitorada através de LCMS. A mistura resultante foi diretamente pu- rificada através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto LP12B (3,5 mg, 20% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 632 (M/2 + H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 9,64 (s, 1H), 9,49 (s, 1H), 8,41-8,39 (m, 1H), 8,12-8,09 (m, 1H), 7,79 (br s, 1H), 7,67 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 7,61 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 7,60 (br s, 1H), 7,52-7,27 (m, 8H), 6,95 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,67 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,47 (s, 1H), 6,33 (dd, J = 8,4 Hz e 1,6 Hz, 1H), 5,02 (d, J = 14,0 Hz, 1H), 4,70-4,67 (br s, 1H), 4,36-4,30 (m, 1H), 4,21-4,14 (m, 1H), 3,61-3,58 (m, 3H), 3,46-3,45 (m, 15H), 3,08-3,06 (m, 2H), 2,90-2,55 (m, 5H), 2,42-2,09 (m, 12H), 1,98-1,73 (m, 7H), 1,65-1,54 (m, 3H), 1,29-1,25 (m, 12H), 1,17-1,11 (m, 2H), 0,99-0,97 (m, 6H) ppm.
Tabela C.
Cargas úteis de modulador de LXR Códi- Estruturas MF FW Massa go Exata cpd P1 C34H44N2O3 528,72 528,72
P2B C34H45N3O2 527,74 527,74
P3B C48H57N3O2 707,99 707,45
P4B C36H48N4O3 584,79 584,37
P5B C37H50N4O4 614,82 614,38
P6B C40H57N5O3 655,91 655,45
Códi- Estruturas MF FW Massa go Exata cpd P7B C38H50N4O5 642,83 642,38 P8B C39H52N4O5 656,85 656,39 P9B C40H52N6O3 664,88 664,41 P10B C41H55N5O6 713,91 713,42 P11B C44H59N5O8 785,97 785,44 P12B C42H57N5O6 727,93 727,43
[00613] As estruturas, valores LogP calculados, resultados de MS e
HPLC para os compostos de carga útil acima são sumarizados na Ta- bela D. Tabela D. Propriedades Físico-Químicas de Cargas úteis Cpd R1 R2 cLogP MS HPLC (M+H) Pure- RT za (%) (min) P1 OH NH2 +++ 529,3 95 8,66 P2B NH2 NH2 +++ 528,2 95 9,11 P3B NH2 NBn2 +++ 354,8 95 8,87 (M/2+H) P4B NH2 NHC(O)CH2NH2 ++ 585,4 98 8,20 (Gly) P5B NH2 NHC(O)(S)- ++ 615,4 100 7,86 CH(CH2OH)NH2 (Ser) P6B NH2 NHC(O)CH((CH2)4N +++ 656,5 100 8,89 H2)NH2 (Lys) P7B NH2 NHC(O)CH(CH2CO2 + 643,4 100 6,64 H)NH2 (Asp) P8B NH2 NHC(O)CH(CH2CH2 + 657,4 97 6,69 COOH)NH2 (Glu) P9B NH2 NHC(O)CH(CH2- ++ 665,3 97 5,94 imidazole)NH2 (His) P10B NHC(O)CH2NH2 NHC(O)CH(CH2CH2 + 714,5 100 6,12 (Gly) COOH)NH2 (Glu) P11B NHC(O)CH(CH2CH2 NHC(O)CH(CH2CH2 + 393,8 100 5,45 COOH)NH2 (Glu) COOH)NH2 (Glu) (M/2+H) P12B NH2 NHC(O)CH(CH3)NH + 728,5 100 6,61, C(O)CH(CH2CH2CO 6,67 OH)NH2 (AlaGlu) 6 < +++ < 12; 4 < ++ < 6; 0 < + < 4
[00614] As fórmulas moleculares, pesos moleculares, valores de
LogP calculados, resultados de MS e HPLC para os compostos de li- gador-carga útil acima são sumarizados na Tabela E.
Tabela E.
Propriedades Físico-Químicas de Cargas úteis Cpd MF MW cLogP Pureza MS m/z MS mais HPLC RT (%) (100%) alta m/z (min) LP1 C124H176N12O43 2522,81 + 95 841,7 1262,0 7,93 (B) [M/3+H] [M/2+H] LP2B C127H182N14O44 2608,87 + 100 870,3 870,3 7,35 (B) [M/3+H] [M/3+H] LP3B C101H143N13O22S 1923,36 +++ 100 641,8 962,5 6,20 (B) [M/3+H] [M/2+H] LP4B C104H149N15O23S 2009,45 ++ 99 670,5 1004,9 5,94 (B) [M/3+H] [M/2+H] LP5B C100H138N12O24 1892,23 ++ 95 631,5 946,6 6,94 (B) [M/3+H] [M/2+H] LP6B C85H109N11O15 1524,84 +++ 96 763,0 763,0 8,63 (B) [M/2+H] [M/2+H] LP7B C74H96N8O12 1289,60 +++ 97 645,4 1290,7 8,67 (B) [M/2+H] [M+H] (23%) LP8B C137H192N16O47 2815,07 + 99 939,2 939,2 7,60 (B) [M/2+H] [M/2+H] LP9B C89H118N12O15 1595,96 +++ 100 798,3 798,3 8,58 (B) [M/2+H] [M/2+H] LP10B C87H111N11O17 1582,88 +++ 97 528,4 792,0 7,11 (B) [M/3+H] [M/2+H] LP11B C88H113N11O17 1596,90 +++ 96 799,2 799,2 7,10 (B) [M/2+H] [M/2+H] LP12B C72H91N7O13 1262,53 +++ 100 631,8 631,8 7,51 (B) [M/2+H] [M/2+H] 6 < +++ < 12; 4 < ++ < 6; -2 < + < 4 Exemplo 12. Síntese de LP1 (FIG. 2) (1S,4aS,10aR)-6-((S)-2-((S)-2-Amino-3- metilbutanamido)propanamido)-N-((1S,4aS,10aR)-6-hidroxi-1,4a- dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carbonil)-1,4a- dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carboxamida (LP1-2)
[00615] A uma solução de P1 (53 mg, 0,10 mmol) em DMF (1 mL) foram adicionados Fmoc-Val-Ala-OH (41 mg, 0,10 mmol), HATU (38 mg, 0,1 mmol) e di-isopropiletilamina (26 mg, 0,20 mmol) sucessiva- mente.
Depois de agitar a 25 oC por 24 horas até P1 ter sido consumi- do de acordo com LCMS, à mistura foi adicionada piperidina (0,1 mL) e a solução resultante foi agitada a 25 oC por mais 3 horas.
Após filtra- gem, o filtrado foi diretamente purificado através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto LP1-2 (45 mg, 64% de rendimento) como um sólido branco.
ESI m/z: 699 (M + 1)+. 1H RMN (500 MHz, me- tanold4) δ 8,40 (s, 1H), 7,47 (s, 1H), 7,32 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,03 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,88 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,72 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,56 (dd, J = 8,3, 2,4 Hz, 1H), 4,60-4,48 (m, 1H), 3,22-3,11 (m, 1H), 3,02- 2,93 (m, 1H), 2,92-2,76 (m, 3H), 2,74-2,70 (m, 1H), 2,43-2,31 (m, 3H), 2,28 (d, J = 14,1 Hz, 3H), 2,16-1,96 (m, 3H), 1,81 (s, 1H), 1,78-1,65 (m, 4H), 1,53-1,42 (m, 4H), 1,38 (d, J = 5,3 Hz, 6H), 1,33-1,22 (m, 2H), 1,14 (d, J = 6,6 Hz, 6H), 1,09 (d, J = 18,6 Hz, 6H) ppm. (1S,4aS,10aR)-6-((2S)-2-((2S)-2-((2R)-2-Amino-6-(2-(ciclo-oct-2- iniloxi)acetamido)hexanamido)-3-metilbutanamido)propanamido)- N-((1S,4aS,10aR)-6-hidroxi-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantreno-1-carbonil)-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantreno-1-carboxamida (LP1-4)
[00616] A uma solução de composto LP1-3 (35 mg, 0,064 mmol) em DMF (1 mL) foram adicionados HATU (24 mg, 0,064 mmol) e com- posto LP1-2 (45 mg, 0,064 mmol) em sucessão em temperatura ambi- ente.
A mistura foi agitada por alguns minutos em temperatura ambien- te até a mistura ficar homogênea.
A essa mistura foi adicionada di- isopropiletilamina (41 mg, 0,32 mmol) em temperatura ambiente com seringa.
A mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro (16 horas) até LP1-2 ser consumido a maior parte de acordo com LCMS.
A essa mistura de reação foi então adicionada piperidina (0,1 mL, excesso) em gotas em temperatura ambiente e a mistura foi agitada por mais 3 horas até Fmoc ter sido removido, con- forme monitorado através de LCMS.
A mistura de reação foi direta- mente purificada através de cromatografia flash de fase reversa ou HPLC preparativa (método B, condição básica) para dar o composto LP1-4 (30 mg, 47% de rendimento) como um sólido branco.
ESI m/z: 991 (M + 1)+. 1H RMN (500 MHz, metanold4) δ 7,51 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 7,37 (dd, J = 8,3, 2,0 Hz, 1H), 7,02 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,72 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,56 (dd, J = 8,3, 2,5 Hz, 1H), 4,64- 4,57 (m, 1H), 4,48 (q, J = 7,1 Hz, 1H), 4,33-4,27 (m, 1H), 4,20 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 3,93 (m, 2H), 3,43 (t, J = 6,6 Hz, 1H), 3,24 (t, J = 6,9 Hz, 2H), 3,02-2,93 (m, 2H), 2,92-2,76 (m, 3H), 2,40-2,32 (m, 2H), 2,33-2,23 (m, 4H), 2,22-2,12 (m, 3H), 2,12-2,00 (m, 5H), 1,99-1,91 (m, 1H), 1,91- 1,81 (m, 2H), 1,78-1,66 (m, 6H), 1,66-1,58 (m, 1H), 1,58-1,49 (m, 2H), 1,45 (d, J = 7,1 Hz, 6H), 1,38 (d, J = 4,0 Hz, 6H), 1,34-1,22 (m, 4H),
1,14 (d, J = 7,0 Hz, 6H), 1,06-0,98 (m, 6H) ppm. (1S,4aS,10aR)-N-{[(1S,4aS,10aR)-6-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-Amino-6- {2-[(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-dodecaidroxi- 10,15,20,25,30-pentacis(hidroximetil)- 2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29- dodecaoxaeptaciclo[26,2,2,23,6,28,11,213,16,218,21,223,26]dotetracontan- 5-il]metil}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-4- il)oxi]acetamido}hexanamido]-3-metilbutanamido]propanamido]- 1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantren-1-il]carbonil}-6- hidroxi-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1- carboxamida (LP1-5)
[00617] A uma solução de composto LP1-4 (30 mg, 30 µmol) em DMF (0,5 mL) foi adicionada uma solução de CD-N3 (60 mg, 60 µmol) em DMF (0,5 mL) em temperatura ambiente com seringa. A mistura foi agitada a 20-25 oC por 3 dias. Composto LP1-4 tinha sido consumido a maior parte de acordo com LCMS. A mistura de reação foi purificada diretamente através de HPLC preparativa (método B) para dar o com- posto LP1-5 (14 mg, 23% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 995 (M/2 + 1)+. 1H RMN (500 MHz, metanold4) δ 8,40 (s, 1H),
7,56-7,52 (m, 1H), 7,32 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 7,03 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,88 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,72 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,56 (dd, J = 8,2, 2,3 Hz, 1H), 5,24-5,16 (m, 1H), 5,01-4,95 (m, 6H), 4,65-4,59 (m, 1H), 4,52- 4,44 (m, 1H), 4,31-4,22 (m, 2H), 4,13-3,73 (m, 22H), 3,63-3,43 (m, 14H), 3,14-2,72 (m, 7H), 2,45-2,32 (m, 3H), 2,28 (d, J = 13,8 Hz, 3H), 2,22-1,85 (m, 11H), 1,82-1,59 (m, 9H), 1,55-1,41 (m, 8H), 1,38 (d, J = 5,3 Hz, 6H), 1,31-1,26 (m, 3H), 1,14 (d, J = 7,2 Hz, 6H), 1,06-0,93 (m, 6H) ppm. 1-(4-{2-Azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen- 10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-N-[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1- {[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-hidroxi-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantren-1-il]formamido}carbonil)- 4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3- il]carbamoil}etil]carbamoil}-2-metilpropil]carbamoil}-5-{2-[(1- {[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-dodecaidroxi-10,15,20,25,30- pentacis(hidroximetil)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29- dodecaoxaeptaciclo[26,2,2,23,6,28,11,213,16,218,21,223,26]dotetracontan- 5-il]metil}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-4- il)oxi]acetamido}pentil]-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida (LP1)
[00618] A uma solução de composto LP1-5 (14 mg, 7,4 µmol) e DI-
BAC-Suc-PEG4-OSu (6,5 mg, 10 µmol) em DMF (1mL) foi adicionada trietilamina (2,0 mg, 20 µmol) e a mistura foi agitada a 20-25 oC por 16 horas.
A maioria dos voláteis foi removida in vacuo e o resíduo foi puri- ficado através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto LP1 (5,0 mg, 27% de rendimento) como um sólido branco.
ESI m/z: 1261 (M/2 + 1)+. 1H RMN (500 MHz, metanold4) δ 7,69-7,44 (m, 6H), 7,41-7,30 (m, 3H), 7,26 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 7,04-6,96 (m, 1H), 6,88 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,72 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,56 (dd, J = 8,3, 2,4 Hz, 1H), 5,25-5,18 (m, 1H), 5,17-5,08 (m, 1H), 5,01-4,94 (m, 4H), 4,61 (s, 16H), 4,53-4,13 (m, 5H), 4,03-3,80 (m, 18H), 3,74-3,64 (m, 3H), 3,63-3,41 (m, 23H), 3,28-2,76 (m, 12H), 2,76-2,65 (m, 1H), 2,56-2,44 (m, 2H), 2,42-2,31 (m, 4H), 2,30-2,23 (m,4H), 2,18-1,92 (m, 9H), 1,79-1,55 (m, 9H), 1,49-1,34 (m, 9H), 1,33-1,22 (m, 3H), 1,18-1,10 (m, 6H), 1,06-0,94 (m, 6H) ppm.
Exemplo 13. Síntese de LP2 (FIG. 3) (1S,4aS,10aR)-N-{[(1S,4aS,10aR)-6-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-Amino-6- {2-[(1-{[41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56- hexadecaidro-10,15,20,25,30,35,40-heptacis(hidroximetil)- 2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29,32,34,37,39- hexadecaoxanonaci- clo[36,2,2,23,6,28,11,213,16,218,21,223,26,228,31,233,36]hexapentacontan-5- il]metil}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-4- il)oxi]acetamido}hexanamido]-3-metilbutanamido]propanamido]- 1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantren-1-il]carbonil}-6- hidroxi-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1- carboxamida (LP2-5)
[00619] A uma solução de composto LP1-4 (30 mg, 0,030 mmol) em DMF (2 mL) foi adicionado CD-N3 (0,12 mg, 0,091 mmol). A mistu- ra foi agitada em RT por 16 horas, o que foi monitorado através de LCMS.
A mistura foi filtrada em membrana e o filtrado foi então purifi- cado através de HPLC preparativa (método A) para dar o composto LP2-5 (40 mg, 57% de rendimento) como um sólido branco.
ESI m/z: 1157,6 (M/2 + 1)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 9,82 (s, 1H), 9,00 (s, 1H), 8,55 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 8,39 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 8,11-8,04 (m, 4H), 7,93-7,88 (m, 1H), 7,45 (s, 1H), 7,35 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,97 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,81 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,63 (s, 1H), 6,50 (d, J = 11 Hz, 1H), 5,89-5,68 (m, 16H), 5,16-4,32 (m, 19H), 3,94-3,80 (m, 4H), 3,69- 3,51 (m, 50H), 3,18-2,64 (m, 8H), 2,33-1,85 (m, 12H), 1,65-1,11 (m, 25H), 0,99 (d, J = 9,5 Hz, 6H), 0,89-0,83 (m, 6H) ppm. 1-(4-{2-Azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen- 10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-N-[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-1- {[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-hidroxi-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantren-1-il]formamido}carbonil)- 4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-
il]carbamoil}etil]carbamoil}-2-metilpropil]carbamoil}-5-{2-[(1- {[41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56-hexadecaidro- 10,15,20,25,30,35,40-heptacis(hidroximetil)- 2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29,32,34,37,39- hexadecaoxanonaci- clo[36,2,2,23,6,28,11,213,16,218,21,223,26,228,31,233,36]hexapentacontan-5- il]metil}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-4- il)oxi]acetamido}pentil]-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida (LP2)
[00620] A uma solução de composto LP2-6 (4,3 mg, 7,8 µmol) em DMF anidro (1 mL) foi adicionado HATU (3,0 mg, 7,8 µmol). A mistura foi agitada a 10 oC por 10 minutos antes do composto LP2-5 (15 mg, 6,5 µmol) e DIPEA (1,7 mg, 13 µmol) terem sido adicionados. A mistu- ra foi agitada em RT por 2 horas até LP2-5 ter sido totalmente consu- mido, conforme monitorado através de LCMS. A mistura foi filtrada através de uma membrana e o filtrado foi purificado através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto LP3 (6,0 mg, 32% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 1424,2 (M/2 + 1)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 9,26 (s, 1H), 8,95 (s, 1H), 8,24-7,98 (m,
4H), 7,81 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 7,72 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 7,67 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,61 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 7,55 (s, 1H), 7,53-7,25 (m, 7H), 6,95 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,81 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 6,50 (dd, J = 8,2, 2,1 Hz, 1H), 5,94-5,58 (m, 15H), 5,39-4,43 (m, 17H), 4,37-4,24 (m, 3H), 4,13-4,08 (m, 1H), 3,98-3,33 (m, 52H), 3,26-2,52 (m, 18H), 2,40-1,18 (m, 48H), 1,18-0,63 (m, 19H) ppm. Solubilidade: 0,075 mg/mL H2O. Exemplo 14. Síntese de LP5 (FIG. 4) N-[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-Hidroxi-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantren-1-il]formamido}carbonil)- 4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamoil}-2- hidroxietil]carbamato de {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-Amino-6-{2-[(1- {[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-dodecaidroxi-10,15,20,25,30- pentacis(hidroximetil)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29- dodecaoxaeptaciclo[26,2,2,23,6,28,11,213,16,218,21,223,26]dotetracontan- 5-il]metil}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-4- il)oxi]acetamido}hexanamido]-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (LP5-1)
[00621] A uma solução de composto LP4 (20 mg, 15 µmol) em DMF
(1 mL) foi adicionada uma solução de CD-N3 (46 mg, 45 µmol) em ace- tonitrila (2 mL) e água (2 mL) em RT. A mistura foi agitada a 30 oC por 16 horas. Composto LP4 tinha sido consumido a maior parte de acor- do com LCMS. A mistura de reação foi purificada diretamente através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto LP5-1 (20 mg, 57% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 1156,0 (M/2 + 1)+. N-[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-Hidroxi-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantren-1-il]formamido}carbonil)- 4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamoil}-2- hidroxietil]carbamato de {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(4-{2- azatriciclo[10,4,0,0⁴,⁹]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2- il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido]-6-{2- [(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-dodecaidroxi- 10,15,20,25,30-pentacis(hidroximetil)- 2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29- dodecaoxaeptaciclo[26,2,2,2³,⁶.2⁸,¹¹.2¹³,¹⁶.2¹⁸,²¹.2²³,²⁶]dotetracontan- 5-il]metil}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-4- il)oxi]acetamido}hexanamido]-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (LP5)
[00622] A uma solução de DIBAC-PEG4-ácido LP5-2 (4,3 mg, 7,8 µmol) em DMF (1 mL) foram adicionados HATU (3,0 mg, 3,6 µmol) e DIPEA (1,7 mg, 13 µmol) em RT. A mistura resultante foi agitada em RT por 10 minutos. À mistura foi então adicionada LP5-1 (15 mg, 6,5 µmol). A mistura de reação foi agitada a 30 oC por 2 horas até a rea- ção ser terminada, conforme monitorado através de LCMS. A mistura de reação foi filtrada e purificada através de HPLC preparativa (méto- do B) para dar LP5 (10 mg, 42% de rendimento) como um sólido bran- co. ESI m/z: 1424,3 (M/2 + 1)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 9,81- 9,67 (m, 2H), 8,99 (s, 1H), 8,20-8,06 (m, 5H), 7,85-7,22 (m, 18H), 6,97- 6,49 (m, 2H), 5,98 (s, 1H), 5,65-5,33 (m, 15H), 5,14-4,92 (m, 5H), 4,82- 4,72 (m, 6H), 4,60-4,54 (m, 4H), 4,36-4,28 (m, 3H), 4,18-3,96 (m, 3H), 3,85-3,55 (m, 27H), 3,49-3,39 (m, 23H), 3,28-3,08 (m, 8H), 2,94-2,57 (m, 4H), 2,42-2,07 (m, 8H), 1,99-1,45 (m, 22H), 1,28-1,11 (m, 23H), 1,05-0,95 (m, 6H), 0,89-0,79 (m, 7H) ppm. Exemplo 15. Síntese de LP6 (FIG. 5) Ácido 1-azido-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxa-16-azaoctadecano-18- sulfônico (L6-2)
[00623] A uma solução de azido-PEG4-NHS (L6-1, 0,10 g, 0,26 mmol) em DMF anidro (4 mL) foram adicionados taurina (39 mg, 0,31 mmol) e DIPEA (15 mg, 0,52 mmol). A mistura foi agitada a 25 oC de um dia para o outro. A mistura foi filtrada e o filtrado foi purificado atra- vés de HPLC preparativa (método A) para dar o composto LP6-2 (80 mg, 78% de rendimento) como óleo incolor. ESI m/z: 399,1 (M + H)+. 1 H RMN (500 MHz, D2O) δ 3,69 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 3,64-3,59 (m, 14H), 3,49 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 3,41 (t, J = 4,5 Hz, 2H), 3,00 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 2,45 (t, J = 6,0 Hz, 2H) ppm. Ácido 2-{1-[4-({[(5R)-5-Amino-5-{[(1S)-1-{[(1S)-1-({4-[({[(1S)-1- {[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-hidroxi-1,4a-dimetil-
1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantren-1-il]formamido}carbonil)- 4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamoil}-2- hidroxietil]carbamoil}oxi)metil]fenil}carbamoil)-4- (carbamoilamino)butil]carbamoil}-2- metilpropil]carbamoil}pentil]carbamoil}metoxi)- 1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-1-il]-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-amido}etano-1-sulfônico (LP6-3)
[00624] A uma solução de composto LP6-2 (20 mg, 50 µmol) em água (1 mL) foi adicionado em gotas solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada a 0 oC até pH ~ 7. À solução agitada foi então adicio- nada uma solução de composto LP4 (28 mg, 21 µmol) em acetonitrila (1 mL) com seringa. A mistura foi agitada a 25 oC de um dia para o ou- tro. A mistura de reação foi monitorada através de LCMS até composto LP4 ter sido totalmente consumido. A mistura de reação foi filtrada e purificada através de HPLC preparativa (método A) para dar o com- posto LP6-3 (15 mg, 41% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 856,5 (M/2 + 1)+. Ácido 2-{1-[4-({[(5R)-5-[1-(4-{2-azatriciclo[10,4,0,0⁴,⁹]hexadeca- 1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-amido]-5-{[(1S)-1-{[(1S)-1-({4-[({[(1S)-1- {[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-hidroxi-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantren-1-il]formamido}carbonil)-
4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamoil}-2- hidroxietil]carbamoil}oxi)metil]fenil}carbamoil)-4- (carbamoilamino)butil]carbamoil}-2- metilpropil]carbamoil}pentil]carbamoil}metoxi)- 1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-1-il]-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-amido}etano-1-sulfônico (LP6)
[00625] A uma solução de composto LP6-3 (15 mg, 8,8 µmol) e DI- BAC-Suc-PEG4-OSu LP6-4 comercialmente disponível (5,7 mg, 8,8 µmol, CAS 1427004-19-0) em DMF (1 mL) foi adicionado DIPEA (2,3 mg, 18 µmol) e a mistura foi agitada em RT por 2 horas. A maioria dos voláteis foi removida in vacuo e o resíduo foi purificado através de HPLC preparativa (método B) para dar LP6 (6,0 mg, 30% de rendi- mento) como um sólido branco. ESI m/z: 1123,8 (M/2 + H)+, 749,5 (M/3 + H)+. 1H RMN (500 MHz, metanold4) δ 7,76-7,16 (m, 14H), 7,06-7,00 (m, 1H), 6,88 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,72-6,71 (m, 1H), 6,56-6,55 (m, 1H), 5,39-5,33 (m, 1H), 5,14-5,09 (m, 5H), 4,61 (s, 18H), 4,50-4,43 (m, 2H), 4,33-4,30 (m, 1H), 3,99 (s, 2H), 3,89-3,85 (m, 3H), 3,73-3,42 (m, 28H), 3,25-2,72 (m, 8H), 2,45 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,36-1,96 (m, 18H), 1,81- 1,51 (m, 12H), 1,45-1,32 (m, 15H), 1,12-0,89 (m, 12H) ppm. Exemplo 16. Síntese de LP18 (FIG. 6) Ácido 1-azido-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxa-16-azaoctadecano-18- sulfônico (L18-2)
[00626] A uma solução de azido-PEG4-NHS (L18-1, 0,10 g, 0,26 mmol) em DMF anidro (4 mL) foram adicionados taurina (39 mg, 0,31 mmol) e DIPEA (15 mg, 0,52 mmol). A mistura foi agitada a 25 oC de um dia para o outro. A mistura foi filtrada e o filtrado foi purificado atra- vés de HPLC preparativa (método A) para dar o composto LP18-2 (80 mg, 78% de rendimento) como óleo incolor. ESI m/z: 399,1 (M + H)+. 1 H RMN (500 MHz, D2O) δ 3,69 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 3,64-3,59 (m, 14H), 3,49 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 3,41 (t, J = 4,5 Hz, 2H), 3,00 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 2,45 (t, J = 6,0 Hz, 2H) ppm. Ácido 1-(4-(2-((R)-5-Amino-6-((S)-1-((S)-1-((4bS,8S,8aR)-8- ((1S,4aS,10aR)-6-hidroxi-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantreno-1-carbonilcarbamoil)-4b,8-dimetil- 4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-ilamino)-1-oxopropan-2- ilamino)-3-metil-1-oxobutan-2-ilamino)-6-oxohexilamino)-2- oxoetoxi))-4,5,6,7,8,9-hexaidro-1H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-1-il)- 15-oxo-3,6,9,12-tetraoxa-16-azaoctadecano-18-sulfônico (LP18-3)
[00627] A uma solução de composto LP1-4 (40 mg, 40 μmol) em DMF (1 mL) foi adicionada azida LP18-2 (40 mg, 0,10 mmol) em RT. A reação foi agitada em RT por 16 horas, até que LCMS mostrou reação completa. A mistura de reação foi purificada diretamente através de HPLC preparativa para dar o composto LP18-3 (43 mg, 77% de ren- dimento) como um sólido branco. ESI m/z: 695,4 (M/2 + H)+. Ácido 2-{1-[4-({[(5R)-5-[1-(4-{2-azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca-
1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-amido]-5-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8- ({[(1S,4aS,10aR)-6-hidroxi-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantren-1-il]formamido}carbonil)-4b,8-dimetil- 4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamoil}etil]carbamoil}- 2-metilpropil]carbamoil}pentil]carbamoil}metoxi)- 1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-1-il]-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-amido}etano-1-sulfônico (LP18)
[00628] A uma solução de composto LP18-3 (30 mg, 22 µmol) em DMF (1 mL) foram adicionados uma solução de DIBAC-suc-PEG4-OSu (LP18-4, 14 mg, 22 µmol) em DMF (1 mL) e DIPEA (4 mg, 32 µmol) sucessivamente em RT. A mistura de reação foi agitada em RT por 2 horas. A mistura de reação foi purificada diretamente através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto LP18 (15 mg, 37% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 642 (M/3 + H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 9,68-9,27 (m, 1H), 8,99 (s, 1H), 8,23-7,85 (m, 4H), 7,79-7,71 (m, 2H), 7,76-7,42 (m ,6H), 7,39-7,28 (m, 3H), 7,21 (s, 1H), 7,09 (s, 1H), 6,96-6,93 (m, 2H), 6,81 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,50 (dd, J = 8,4 Hz, 2,4 Hz, 1H), 5,02 (d, J = 14,0 Hz, 1H), 4,93-4,72 (m, 1H), 4,53-4,09 (m, 5H), 3,82-3,75 (m, 4H), 3,62-3,53 (m, 3H), 3,51-3,38 (m, 23H), 3,30-3,27 (m, 6H), 3,12-2,67 (m, 10H), 2,61-2,54 (m, 4H), 2,39-1,52 (m, 31H), 1,45-1,08 (m, 18H), 1,01-0,98 (m, 6H), 0,90-0,82 (m, 6H) ppm. Exemplo 17. Síntese de Carga útil P5, Carga útil P6 e Carga útil P7
.
OH OH 1) protected amino-acid (1.5-2.0 equiv.), HATU (1.5-2.0 equiv.), DIPEA (4-5 equiv.), DMF, rt., 16 hrs.
H H 2a) TFA, DCM, rt. for PG = Boc; or HN O 2b) piperidine (excess.), DMF, rt. for PG = Fmoc HN O
H H H2N O R O P1 P5-P7 Legenda: "aminoácido protegido", "piperidina", "para" Cpd R PG Rendimento P5 NHC(O)(S)-CH(CH2OH)NH2 (Ser) Fmoc 51% P6 NHC(O)(S)-CH(CH2CH2COOH)NH2 (Glu) tBu, Boc 46% P7 NHC(O)(S)-CH((CH2)4NH2)NH2 (Lys) Boc, Boc 49% Carga útil P5 (1S,4aS,10aR)-6-((S)-2-Amino-3-hidroxipropanamido)-N- ((1S,4aS,10aR)-6-hidroxi-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantreno-1-carbonil)-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantreno-1-carboxamida (P5)
[00629] A uma solução de Fmoc-Ser-OH (33 mg, 0,1 mmol) em DMF (1 mL) foram adicionados HATU (38 mg, 0,1 mmol) e DIPEA (39 mg, 0,3 mmol) a 25 oC. A mistura resultante foi agitada nessa tempera- tura por uma hora. À mistura foi então adicionada P1 (30 mg, 0,06 mmol). Depois da mistura de reação ter sido agitada a 25 oC por 16 horas e P1 ter sido totalmente consumido (monitorado através de LCMS), piperidina (0,2 mL) foi adicionada à mistura, que foi agitada por mais 30 min em temperatura ambiente. O resíduo foi diretamente purificado através de HPLC preparativa (método B) para dar P5 (18 mg, 51% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 616 (M +
1)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 9,74 (br s, 1H), 9,00 (s, 1H), 8,11 (s, 1H,), 7,58 (s, 1H), 7,41 (dd, J = 8,2, 2,0 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,82 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,50 (dd, J = 8,2, 2,4 Hz, 1H), 4,82 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 3,62-3,45 (m, 2H), 2,97-2,67 (m, 4H), 2,67-2,61 (m, 2H), 2,33-2,21 (m, 2H), 2,21-2,03 (m, 4H), 1,96-1,77 (m, 4H), 1,70-1,50 (m, 4H), 1,43-1,37 (m, 1H), 1,36-1,20 (m, 8H), 1,23- 1,06 (m, 2H), 1,06-0,93 (m, 6H) ppm. Carga útil P6 Ácido (4S)-4-Amino-4-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-hidroxi- 1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1- carbonil]carbamoil}-4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10- octaidrofenantren-3-il]carbamoil}butanoico; sal do ácido trifluora- cético (P6)
[00630] A uma solução de OtBu-N-Boc-Glu-OH (15 mg, 0,05 mmol) em DMF (1 mL) foram adicionados HATU (19 mg, 0,05 mmol) e DIPEA (13 mg, 0,1 mmol) a 25 oC. A mistura resultante foi agitada nessa tem- peratura por uma hora. À mistura foi então adicionada P1 (14 mg, 0,026 mmol). Depois de agitar a 25 oC por 16 horas e P1 ter sido to- talmente consumido (monitorado através de LCMS), a mistura de rea- ção foi diluída com acetato de etila e lavada com água e salmoura. A solução orgânica foi seca em sulfato de sódio e concentrada in vacuo. O resíduo foi dissolvido em DCM (1 mL) e à solução foi adicionado TFA (0,1 mL) lentamente em temperatura ambiente. A mistura foi agi- tada em temperatura ambiente por 2 horas. Os voláteis foram removi-
dos in vacuo e o resíduo foi purificado através de HPLC preparativa (método A) para dar P6 (8 mg, 46% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 658,3 (M + 1)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 10,32 (s, 1H), 9,00 (s, 1H), 8,12 (s, 1H), 7,48 (s, 1H), 7,35 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 7,02 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,82 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 6,50 (dd, J = 8,2, 2,3 Hz, 1H), 3,87 (t, J = 6,5 Hz, 1H), 2,97-2,67 (m, 4H), 2,41-2,22 (m, 4H), 2,22-2,08 (m, 4H), 2,05-1,97 (m, 2H), 1,94- 1,80 (m, 4H), 1,69-1,52 (m, 4H), 1,42-1,22 (m, 8H), 1,22-1,06 (m, 2H), 19 1,02 (s, 3H), 0,99 (s, 3H) ppm. F RMN (376 MHz, DMSOd6) δ -73,50 ppm. Carga útil P7 (1S,4aS,10aR)-N-[(1S,4aS,10aR)-6-Hidroxi-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carbonil]-6-[(2S)-2,6- diaminoexanamido]-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a- octaidrofenantreno-1-carboxamida; sal do ácido trifluoracético (P7)
[00631] A uma solução de Boc-Lys-OH (15 mg, 0,05 mmol) em DMF (1 mL) foram adicionados HATU (19 mg, 0,05 mmol) e DIPEA (13 mg, 0,1 mmol) a 25 oC. A mistura resultante foi agitada nessa tempera- tura por uma hora. À mistura foi então adicionada P1 (15 mg, 0,028 mmol). Depois de agitar a 25 oC por 16 horas e P1 ter sido totalmente consumido (monitorado através de LCMS), a mistura de reação foi di- luída com acetato de etila e lavada com água e salmoura. A solução orgânica foi seca em sulfato de sódio e concentrada in vacuo. O resí-
duo (Boc-P7) foi dissolvido em DCM (1 mL) e à solução foi adicionado TFA (0,1 mL) lentamente em temperatura ambiente. A mistura foi agi- tada em temperatura ambiente por 2 horas. Os voláteis foram removi- dos in vacuo e o resíduo foi purificado através de HPLC preparativa (método A) para dar P7 (9 mg, 49% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 657,5 (M + 1)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 10,33 (s, 1H), 9,01 (s, 1H), 8,13 (s, 1H), 7,78 (br s, 6H), 7,51 (s, 1H), 7,34 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,02 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,82 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,63 (s, 1H), 6,51 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 3,82 (s, 1H), 2,89 (s, 1H), 2,82-2,67 (m, 5H), 2,29 (s, 2H), 2,15 (s, 4H), 1,85 (s, 6H), 1,64-1,51 (m, 6H), 1,28 19 (d, J = 6,8 Hz, 10H), 1,13 (s, 2H), 1,01 (s, 3H), 0,99 (s, 3H) ppm. F RMN (376 MHz, DMSO d6) δ -73,53 ppm. Exemplo 18. Síntese de LP4 (FIG. 7) N-[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-hidroxi-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantren-1-il]formamido}carbonil)- 4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamoil}-2- hidroxietil]carbamato de {4-[(2S)-2-[(2S)-2-Amino-3- metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (LP4-2)
[00632] A uma solução de Fmoc-vc-PAB-PNP (LP4-1, 58 mg, 76 µmol) e P5 (36 mg, 58 µmol) em DMF (3 mL) foram adicionados HOBt (7,9 mg, 58 µmol) e DIPEA (15 mg, 0,12 mmol) e a mistura foi agitada a 30 oC por 16 horas. Composto P5 foi então totalmente consumido de acordo com LCMS. À mistura resultante foi adicionada dietilamina (0,1 mL) e a reação foi agitada em RT por uma hora até Fmoc ter sido re-
movido, conforme monitorado através de LCMS. Após a reação ter si- do filtrada, o filtrado foi diretamente purificado através de HPLC prepa- rativa (método B) para dar o composto LP4-2 (36 mg, 48% de rendi- mento) como um sólido amarelo claro. ESI m/z: 1021 (M + 1)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 10,02 (s, 1H), 9,82 (s, 1H), 9,00 (s, 1H), 8,69- 8,65 (m, 1H), 8,11-8,00 (m, 4H), 7,65-7,53 (m, 3H), 7,40-7,30 (m, 3H), 7,30-7,20 (m, 1H), 6,96 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,81 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,65-6,61 (m, 1H), 6,50 (dd, J = 8,0 Hz, 2,0 Hz, 1H), 6,00-5,95 (m, 1H), 5,48 (s, 2H), 5,00-4,95 (m, 3H), 4,60-4,40 (m, 1H), 4,25-4,20 (m, 1H), 3,65-3,55 (m, 4H), 3,15-2,55 (m, 10H), 2,40-2,20 (m, 3H), 2,20-2,00 (m, 5H), 2,00-1,80 (m, 4H), 1,86-1,55 (m, 6H), 1,27 (d, J = 4,8 Hz, 9H), 1,20-1,10 (m, 2H), 0,97-0,90 (m, 6H) ppm. N-[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-Hidroxi-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantren-1-il]formamido}carbonil)- 4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamoil}-2- hidroxietil]carbamato de {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-amino-6-[2- (ciclo-oct-2-in-1-iloxi)acetamido]hexanamido]-3-metilbutanamido]- 5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (LP4)
[00633] A uma solução de composto LP4-3 (24 mg, 44 µmol) em DMF (2 mL) foram adicionados HATU (17 mg, 44 µmol) e composto LP4-2 (35 mg, 34 µmol) em sucessão em RT. A mistura foi agitada por alguns minutos em RT até a mistura ficar homogênea. A essa mistura foi adicionado DIPEA (8,8 mg, 68 µmol) em RT com seringa. A mistura resultante foi agitada em RT por 2 horas até o LP4-2 ter sido consumi-
do na maior parte de acordo com LCMS. A essa mistura de reação foi então adicionada dietilamina ou piperidina (0,1 mL, excesso) em gotas em RT e a mistura foi agitada por uma hora até grupo Fmoc ter sido removido, conforme monitorado através de LCMS. (Nota: ambas dieti- lamina e piperidina eram igualmente eficazes.) A mistura de reação foi purificada diretamente através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto LP4 (15 mg, 33% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 1313,6 (M + H)+. 1H RMN (500 MHz, metanold4) δ 7,59 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,51 (s, 1H), 7,36-7,26 (m, 3H), 7,01 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,88 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,72-6,71 (m, 1H), 6,57-6,54 (m, 1H), 5,09 (s, 2H), 4,64-4,52 (m, 1H), 4,35-4,28 (m, 2H), 4,21 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 4,01-3,98 (m, 1H), 3,88-3,84 (m, 3H), 3,43 (t, J = 6,5 Hz, 1H), 3,26-3,10 (m, 4H), 3,00-2,76 (m, 3H), 2,38-2,24 (m, 7H), 2,19-2,02 (m, 9H), 1,98-1,78 (m, 4H), 1,74-1,54 (m, 12H), 1,45-1,26 (m, 14H), 1,13 (s, 6H), 1,00 (t, J = 7,5 Hz, 6H) ppm. Exemplo 19. Síntese de LP11 (FIG. 8) N-[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-Hidroxi-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10, 10a-octaidrofenantreno-1-carbonil]carbamoil}-4b,8- dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamoil}-5- {[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}pentil] carbamato de terc- butila (LP11-1)
[00634] A uma solução de N-Boc-N'-Fmoc-L-Lisina (0,21 g, 0,45 mmol) em DMF (2 mL) foram adicionados HATU (0,24 g, 0,64 mmol) e DIPEA (0,15 g, 1,1 mmol) em RT. A mistura resultante foi agitada em RT por 3 minutos. À mistura foi então adicionada carga útil P1 (0,20 g, 0,38 mmol). A mistura de reação foi agitada em RT por 15 minutos até a reação ser terminada, conforme monitorado através de LCMS. A mistura de reação foi filtrada e purificada através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto LP11-1 (0,10 g, 27% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 979 (M + 1)+. N-[(5S)-5-amino-5-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-hidroxi-1,4a- dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1- carbonil]carbamoil}-4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10- octaidrofenantren-3-il]carbamoil}pentil]carbamato de 9H-Fluoren- 9-ilmetila (LP11-2)
[00635] A uma solução de composto LP11-1 (0,10 g, 0,10 mmol) em DCM foi adicionado TFA (2 mL) em RT. A mistura resultante foi agitada em RT por uma hora até Boc ter sido totalmente removido de acordo com LCMS. Os voláteis foram removidos in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatografia flash de fase reversa (acetonitri- la 0-100% em bicarbonato de amônio aquoso (10 mM)) para dar o composto LP11-2 (77 mg, 86% de rendimento) como um sólido bran- co. ESI m/z: 879 (M + 1)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 9,87-9,52 (m, 1H), 9,00 (s, 1H), 8,11 (s, 1H), 7,92-7,81 (m, 2H), 7,71-7,48 (m, 3H), 7,44-7,22 (m, 6H), 7,00-6,90 (m, 1H), 6,82 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,66-6,60 (m, 1H), 6,54-6,47 (m, 1H), 4,38-4,14 (m, 3H), 3,27-3,17 (m, 1H), 3,01-2,93 (m, 2H), 2,90-2,66 (m, 4H), 2,33-2,06 (m, 7H), 1,94-1,78 (m, 4H), 1,67-1,51 (m, 5H), 1,48-1,07 (m, 16H), 1,03-0,92 (m, 6H) ppm. N-[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-Hidroxi-1,4a-dimetil- 1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carbonil]carbamoil}-4b,8- dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3-il]carbamoil}-5- {[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}pentil]carbamato de {4-
[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-azatriciclo[10,4,0,0⁴,⁹]hexadeca- 1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-amido]-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (LP11-3)
[00636] A uma mistura de composto LP11-2 (57 mg, 65 µmol) e composto LP9-5 (0,10 g, 96 µmol) em DMF (3 mL) foram adicionados HOBt (30 mg, 0,22 mmol) e DIPEA (0,11 g, 0,81 mmol) e a mistura foi agitada em RT por uma hora, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura de reação foi purificada através de cromatografia flash de fase reversa (acetonitrila 0-100% em bicarbonato de amônio aquoso (10 mM)) para dar o composto LP11-3 (97 mg, 81% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 909 (M/2 + 1)+. N-[(1S)-5-Amino-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-hidroxi-1,4a- dimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1- carbonil]carbamoil}-4b,8-dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10- octaidrofenantren-3-il]carbamoil}pentil]carbamato de {4-[(2S)-2- [(2S)-2-[1-(4-{2-Azatriciclo[10,4,0,0⁴,⁹]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15- hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan- 15-amido]-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (LP11)
[00637] A uma solução de composto LP11-3 (97 mg, 53 µmol) em DMF (3 mL) foi adicionada dietilamina (45 mg, 0,62 mmol). A mistura foi agitada em RT por 2 horas até que Fmoc foi totalmente removido de acordo com LCMS. A mistura de reação foi purificada diretamente através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto LP11 (40 mg, 47% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 798 (M/2 + 1)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 9,99 (s, 1H), 9,85 (s, 1H), 9,00 (s, 1H), 8,21-8,10 (m, 2H), 7,88 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,82-7,59 (m, 6H), 7,55-7,43 (m, 5H), 7,41-7,29 (m, 5H), 6,98 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,84 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,66 (s, 1H), 6,53 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,06- 5,96 (m, 1H), 5,50-5,38 (m, 2H), 5,09-4,92 (m, 3H), 4,45-4,35 (m, 1H), 4,28-4,21 (m, 1H), 4,14-4,04 (m, 1H), 3,67-3,58 (m, 4H), 3,52-3,45 (m, 13H), 3,14-2,69 (m, 9H), 2,63-2,56 (m, 1H), 2,50-2,44 (m, 1H), 2,43- 2,37 (m, 1H), 2,33-2,13 (m, 7H), 2,06-1,85 (m, 6H), 1,82-1,56 (m, 9H), 1,51-1,23 (m, 17H), 1,21-1,13 (m, 2H), 1,10-0,80 (m, 12H) ppm. Exemplo 20. Síntese de LP9 (FIG. 9) 1-(4-{2-Azatriciclo[10,4,0,0⁴,⁹]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen- 10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(carbamoilamino)- 1-{[4-(hidroximetil)fenil]carbamoil}butil]carbamoil}-2-metilpropil]- 3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida (LP9-3)
[00638] A uma solução de composto LP9-2 (0,30 g, 0,54 mmol) em DMF (10 mL) foram adicionados HATU (0,31 g, 0,81 mmol) e DIPEA (0,14 g, 1,1 mmol) sucessivamente em temperatura ambiente. A mistu- ra foi agitada em temperatura ambiente por 15 minutos. À solução de reação foi adicionado VC-PAB-OH (LP9-1, CAS: 159857-79-1, 0,21 g, 0,54 mmol) em RT e a mistura resultante foi agitada em RT por 3 ho- ras até LP9-2 ter sido consumida, conforme monitorado através de
LCMS. A mistura de reação foi filtrada através de filtragem em uma membrana e o filtrado foi diretamente purificado através de cromato- grafia flash reversa (acetonitrila 0-100% em água (com 10 mmol/L de bicarbonato de amônio)) para dar o composto LP9-2 (0,30 g, 60% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 617 (M + H)+. 4-Nitrofenil carbonato de {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2- azatriciclo[10,4,0,0⁴,⁹]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2- il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido]-3- metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (LP9-5)
[00639] A uma solução de composto LP9-3 (0,15 g, 0,16 mmol) em DMF (10 mL) foram adicionados carbonato de bis(4-nitrofenila) (LP9-4, 0,15 g, 0,49 mmol) e DIPEA (63 mg, 0,49 mmol) sucessivamente a 0 o C. A mistura foi então agitada em RT por 3 horas até LP9-3 ter sido consumida na maior parte, conforme monitorado através de LCMS. A mistura de reação foi filtrada através de uma membrana de filtragem e o filtrado foi diretamente purificado através de cromatografia flash re- versa (acetonitrila 0-100% em água (com 10 mmol/L de bicarbonato de amônio)) para dar o composto LP9-5 (50 mg, 28% de rendimento) co- mo um sólido branco. ESI m/z: 1079 (M + H)+. Ácido (4S)-4-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2- azatriciclo[10,4,0,0⁴,⁹]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2- il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido]-3- metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metoxi)carbonil]amino}-4- {[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-hidroxi-1,4a-dimetil-
1,2,3,4,4a,9,10,10a-octaidrofenantreno-1-carbonil] carbamoil}-4b,8- dimetil-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octaidrofenantren-3- il]carbamoil}butanoico (LP9)
[00640] A uma mistura de composto P6 (50 mg, 76 µmol) e com- posto LP9-5 (0,10 g, 96 µmol) em DMF (1 mL) foram adicionados HOBt (16 mg, 0,12 mmol) e DIPEA (39 mg, 0,31 mmol) e a mistura foi agitada em RT por uma hora, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura de reação foi purificada através de HPLC preparativa (méto- do B) para dar o composto LP9 (40 mg, 33% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 799 (M/2 + 1)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 10,02 (s, 1H), 9,03 (s, 1H), 8,20-8,07 (m, 2H), 7,94-7,87 (m, 1H), 7,82- 7,76 (m, 1H), 7,70-7,57 (m, 4H), 7,54-7,42 (m, 4H), 7,40-7,26 (m, 6H), 6,99-6,91 (m, 1H), 6,85-6,79 (m, 1H), 6,63 (s, 1H), 6,53-6,47 (m, 1H), 6,03 (s, 1H), 5,44 (s, 2H), 5,07-4,88 (m, 3H), 4,42-4,32 (m, 1H), 4,27- 4,20 (m, 1H), 4,11-4,02 (m, 1H), 3,63-3,55 (m, 3H), 3,51-3,41 (m, 13H), 3,11-2,58 (m, 10H), 2,40-2,10 (m, 11H), 2,00-1,55 (m, 15H), 1,46-1,09 (m, 14H), 1,05-0,94 (m, 6H), 0,99-0,77 (m, 7H) ppm. Exemplo 21. Síntese de Cargas úteis P9 e ligador-carga útil LP12 (FIG. 10) Carga útil P9
[00641] A síntese de cargas úteis P9 é baseada, pelo menos em parte, na U.S. 2015/0291563A1, incorporada aqui a título de referência em sua totalidade. Ácido 4-(4-bromofenil)-2-oxobut-3-enoico (P9-3)
[00642] A uma solução de 4-bromobenzaldeído P9-2 (5,5 g, 30 mmol) e ácido pirúvico P9-1 (2,8 g, 32 mmol) em metanol (100 mL) foi adicionada uma solução de hidróxido de potássio (2,5 g, 45 mmol) em metanol (100 mL) a 0 oC. Precipitação ocorreu durante adição da base e a mistura foi deixada atingir RT por uma hora. A mistura foi deixada agitar em RT por 16 horas e então concentrada in vacuo para remover voláteis. O resíduo foi diluído com água (200 mL) e acidificado com HCl aq. (1 M) para pH 3. A mistura foi extraída com acetato de etila (100 mL x 3). A solução orgânica combinada foi seca em sulfato de sódio e concentrada in vacuo para dar o composto P9-3 (7,1 g, 93% de rendimento) como óleo viscoso. ESI m/z: 255 (M + 1)+. Ácido 5-(4-bromofenil)-1-(2,6-diclorofenil)-4,5-di-hidro-1H-pirazol- 3-carboxílico (P9-5)
[00643] Uma mistura de composto P9-3 (5,1 g, 20 mmol) e cloridra- to de (2,6-diclorofenil)hidrazina P9-4 (4,1 g, 20 mmol) em ácido acético glacial (100 mL) foi refluxada sob uma atmosfera de nitrogênio por 4 horas. Após esfriar para 25 °C, a mistura de reação foi despejada em água gelada, onde uma massa espessa foi obtida, a qual foi extraída com DCM. A solução orgânica combinada foi lavada com água, seca com sulfato de sódio e concentrada. O resíduo foi seco ao ar para dar o composto P9-5 (5,4 g, 65% de rendimento) como um sólido amarelo pálido. ESI m/z: 413 (M + 1)+. 5-(4-Bromofenil)-1-(2,6-diclorofenil)-4,5-di-hidro-1H-pirazol-3- carboxilato de metila (P9-6)
[00644] A uma solução de composto P9-5 (8,2 g, 20 mmol) em me- tanol (200 mL) foi adicionado ácido sulfúrico (0,5 mL) em gotas. A mis- tura foi refluxada por 4 horas, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura de reação foi esfriada para RT e os voláteis foram removidos in vacuo. O resíduo foi extraído com acetato de etila (300 mL) e sub- sequentemente lavada com cloreto de amônio aquoso saturado e água. A camada orgânica foi seca em sulfato de sódio e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica gel (acetato de etila/n-hexano = 1/4) para dar o composto P9- 6 (2,1 g, 25% de rendimento) como óleo amarelo. ESI m/z 429 (M + 1)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 7,50-7,45 (m, 4H), 7,35-7,25 (m, 3H), 5,70-5,52 (m, 1H), 3,77 (s, 3H), 1,75-1,65 (m, 1H), 3,32-3,24 (m, 1H) ppm. 2-(5-(4-Bromofenil)-1-(2,6-diclorofenil)-4,5-di-hidro-1H-pirazol-3-il)- 1,1,1,3,3,3-hexafluorpropan-2-ol (P9-7)
[00645] A uma mistura de composto P9-6 (0,49 g, 1,2 mmol) em tolueno (20 mL) foram adicionados (trifluormetil)trimetilsilano (0,68 mL, 4,6 mmol), peneiras moleculares de 4 Å (100 mg) e TBAF (1 M em THF, 4,6 mL) lentamente sob atmosfera de nitrogênio. A mistura resul- tante foi agitada a 46 oC por 16 horas. A mistura resultante foi filtrada através de uma almofada de celite e o filtrado foi diluído com DCM. A solução foi lavada com água destilada e salmoura, seca em sulfato de magnésio anidro e concentrada in vacuo. O resíduo amarelo foi purifi-
cado através de cromatografia de coluna de sílica gel (acetato de eti- la/n-hexano = 1/8) para dar o composto P9-7 (0,15 g, 25% de rendi- mento) como óleo marrom. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,43-7,38 (m, 2H), 7,25 (s, 1H), 7,24 (s, 1H), 7,22-7,17 (m, 2H), 7,12-7,06 (m, 1H), 5,75-5,95 (m, 1H), 4,88 (s, 1H), 3,65-3,55 (m, 1H), 3,26-3,16 (m, 1H) ppm. 3-(3-Bromofeniltio)propil(metil)carbamato de terc-butila (P9-11)
[00646] A uma solução de 3-hidroxipropil(metil)carbamato de terc- butila P9-8 (1,9 g, 10 mmol) em piridina (5 mL) foi adicionado cloreto de tosila (2,1 g, 11 mmol) em gotas a 0 oC. A mistura foi agitada em RT por 2 horas, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura foi concentrada in vacuo para remover piridina para dar produto bruto P9- 9 (ESI m/z: 244 (M - Boc + 1)+), que foi dissolvido em acetonitrila (100 mL). À solução foram adicionados 3-bromobenzenetiol P9-10 (1,9 g, 10 mmol) e carbonato de césio (6,5 g, 20 mmol). A mistura foi refluxa- da por 4 horas, o que foi monitorado através de LCMS. Após esfriar para RT, a mistura de reação foi filtrada e o filtrado foi concentrado in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica gel (8-acetato de etila 10% em éter de petróleo) para dar o com- posto P9-11 (2,2 g, 61% de rendimento) óleo amarelo claro. ESI m/z: 260 (M - Boc + 1)+. 3-(3-Bromofenilsulfonil)propil(metil)carbamato de terc-butila (P9- 12)
[00647] A uma solução de composto P9-11 (0,36 g, 1,0 mmol) em DCM (20 mL) foi adicionado mCPBA (1,0 g, 0,4 mmol) lentamente a 0 o C. A mistura foi agitada em RT por 4 horas, o que foi monitorado atra-
vés de LCMS. A mistura de reação foi lavada com carbonato de sódio aq. saturado (20 mL x 3) e salmoura. A solução orgânica foi seca em sulfato de sódio, filtrada e concentrada in vacuo. O produto bruto foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica gel (8-acetato de etila 10% em éter de petróleo) para dar o composto P9-12 (0,22 g, 56% de rendimento) como óleo amarelo claro. ESI m/z: 294 (M - Boc + 1)+. Metil (3-(3-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2- il)fenilsulfonil)propil)carbamato de terc-butila (P9-13)
[00648] A uma solução de composto P9-12 (0,20 g, 0,51 mmol) em 1,4-dioxana (20 mL) foram adicionados bis(pinacolato)diboro (0,26 g, 1,0 mmol), Pd(dppf)Cl2 (37 mg, 0,051 mmol) e acetato de potássio (0,20 g, 2,0 mmol) sob atmosfera de nitrogênio. A mistura de reação foi agitada a 80 °C por 16 horas sob atmosfera de nitrogênio. Depois de ser esfriada para RT, a mistura foi filtrada através de almofada de celite. Ao filtrado foi adicionada água destilada e a mistura foi extraída com éter de dietila três vezes. Os extratos combinados foram lavados com água destilada e salmoura, secos em sulfato de magnésio anidro e concentrados in vacuo para dar um resíduo líquido amarelo. O resí- duo foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica gel (8- acetato de etila 10% em éter de petróleo) para dar o composto P9-13 (0,20 g, 87% de rendimento) como óleo incolor. ESI m/z: 340 (M - Boc + 1)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 8,10 (s, 1H), 8,05-8,0 (m, 2H), 7,70 (t, J =7,5 Hz, 1H), 3,30-3,25 (m, 2H), 3,20-3,14 (m, 2H), 2,70 (s, 3H), 1,75-1,67 (m, 2H), 1,32 (s, 9H), 1,16 (s, 12H) ppm. 3-(4'-(1-(2,6-Diclorofenil)-3-(1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-hidroxipropan- 2-il)-4,5-di-hidro-1H-pirazol-5-il)bifenil-3-
ilsulfonil)propil(metil)carbamato de terc-butila (P9-14)
[00649] A uma mistura de composto P9-13 (0,20 g, 0,51 mmol) e composto P9-7 (0,27 g, 0,51 mmol) em 1,4-dioxana (20 mL) e água (3 mL) foram adicionados Pd(dppf)Cl2 (37 mg, 0,051 mmol) e carbonato de potássio (0,28 g, 2,0 mmol) sob proteção com nitrogênio. A mistura de reação foi trocada com nitrogênio 3 vezes e foi agitada a 80 °C sob atmosfera de nitrogênio por 16 horas. Depois de esfriada para RT, a mistura de reação foi filtrada através de almofada de celite. O filtrado foi diluído com água destilada e extraído com éter de dietila três vezes. Os extratos combinados foram lavados com água destilada e salmou- ra, secos em sulfato de magnésio anidro e concentrados in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica gel (8-acetato de etila 10% em éter de petróleo) para dar o composto P9- 14 (0,33 g, 84% de rendimento) como óleo incolor. ESI m/z: 667 (M - Boc + 1)+. 2-(1-(2,6-Diclorofenil)-5-(3'-(3-(metilamino)propilsulfonil)bifenil-4- il)-4,5-di-hidro-1H-pirazol-3-il)-1,1,1,3,3,3-hexafluorpropan-2-ol, sal do ácido trifluoracético (P9)
[00650] A uma solução de composto P9-14 (0,20 g, 0,26 mmol) em DCM (10 mL) foi adicionado TFA (3 mL). A mistura de reação foi agi- tada em RT por uma hora, o que foi monitorado através de LCMS. Os voláteis foram removidos in vacuo. O resíduo amarelo resultante fio purificado através de HPLC preparativa (método A) para dar o com- posto P9 (55 mg, 32% de rendimento como seu sal de TFA) como um sólido branco. ESI m/z: 667 (M + 1)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 8,77 (s, 1H), 8,34 (s, 2H), 8,10-8,00 (m, 2H), 7,90-7,83 (m, 1H), 7,80- 7,77 (m, 3H), 7,50-7,40 (m, 4H), 7,30-7,20 (m, 1H), 5,58 (t, J = 10,4 Hz, 1H), 3,80-3,66 (m, 1H), 3,52 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 3,26-3,18 (m, 1H), 3,00-2,90 (m, 2H), 2,56-2,52(m, 3H), 1,92-1,82 (m, 2H) ppm. (H de TFA não foi revelado). Ligador-carga útil LP12 3-(4'-(1-(2,6-Diclorofenil)-3-(1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-hidroxipropan- 2-il)-4,5-di-hidro-1H-pirazol-5-il)bifenil-3- ilsulfonil)propil(metil)carbamato de 4-((S)-2-((S)-2-Amino-3- metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzila (LP12-2)
[00651] A uma solução de composto P9 (50 mg, 0,075 mmol) em DMF (5 mL) foram adicionados Fmoc-VC-PAB-PNP P12-1 (63 mg, 0,083 mmol), DIPEA (19 mg, 0,15 mmol) e HOBt (15 mg, 0,11 mmol). A mistura de reação foi agitada em RT por 4 horas, o que foi monitora- do através de LCMS. Piperidina (1 mL, excesso) foi então adicionada à mistura de reação. A mistura foi agitada em RT por uma hora até que Fmoc foi totalmente removido de acordo com LCMS. A mistura foi dire- tamente purificada através de cromatografia flash de fase reversa (0- 50% acetonitrila em bicarbonato de amônio aquoso (10 mM)) para dar o composto LP12-2 (48 mg, 60% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 1073 (M + 1)+. N-[3-(3-{4-[1-(2,6-Diclorofenil)-3-(1,1,1,3,3,3-hexafluor-2- hidroxipropan-2-il)-4,5-di-hidro-1H-pirazol-5-
il]fenil}benzenesulfonil)propil]-N-metilcarbamato de {4-[(2S)-2- [(2S)-2-[1-(4-{2-Azatriciclo[10,4,0,0⁴,⁹]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15- hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan- 15-amido]-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (LP12)
[00652] A uma solução de DIBAC-PEG4-ácido LP12-3 (18 mg, 32 µmol) em DMF (5 mL) foram adicionados HATU (15 mg, 39 µmol) e DIPEA (14 mg, 0,11 mmol) em RT. A mistura resultante foi agitada em RT por 30 minutos. À mistura foi então adicionada LP12-2 (29 mg, 27 µmol). A mistura de reação foi agitada em RT por uma hora até a rea- ção ser terminada, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura de reação foi filtrada e purificada através de HPLC preparativa (méto- do B) para dar LP12 (25 mg, 58% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 805 (M/2 + 1)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 9,99 (s, 1H), 8,75 (s, 1H), 8,13 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 8,09 (s, 1H), 8,03 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 7,90-7,80 (m, 2H), 7,80-7,65 (m, 5H), 7,65-7,60 (m, 1H), 7,60-7,52 (m, 2H), 7,52-7,43 (m, 5H), 7,43-7,39 (m, 2H), 7,39-7,31 (m, 2H), 7,31-7,20 (m, 4H), 5,98 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 5,57 (t, J = 10,5 Hz, 1H), 5,41 (s, 2H), 5,03 (d, J = 14,0Hz, 1H), 5,0-4,90 (m, 2H), 4,43-4,34 (m, 1H), 4,23 (t, J = 7,0 Hz, 1H), 3,75-3,65 (m, 1H), 3,65-3,53 (m, 3H), 3,53-3,40 (m, 12H), 3,32-3,20 (m, 6H), 3,10-3,05 (m, 2H), 3,05-3,00 (m, 1H), 3,00-2,90 (m, 1H), 2,80-2,70 (m, 3H), 2,60-2,53 (m, 1H), 2,49- 2,42 (m, 1H), 2,40-2,30 (m, 1H), 2,30-2,20 (m, 1H), 2,04-1,90 (m, 2H), 1,80-1,65 (m, 4H), 1,65-1,50 (m, 1H), 1,50-1,30 (m, 2H), 1,23 (s, 1H), 0,90-0,80 (m, 6H) ppm.
Exemplo 22. Síntese de Carga útil P3 e Carga útil P4 (FIG. 11)
[00653] Esse exemplo se refere a FIG. 11. Certas cargas úteis este- roidais foram preparadas a partir de fluocinolona acetonida comercial P3-1 (CAS: 67-73-2). Composto P3-2, obtido a partir de P3-1 através de troca cetal com butiraldeído na presença de ácido perclórico, foi convertido em mesilato P3-3 seguido pela substituição do grupo mesi- lato com porção azida para formar P4-4 que foi reduzido para P4. Se não, a porção mesilato P3-3 foi também substituída por 4-amino-fenol para dar anilina P3. Carga útil P3 (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluor-11-hidroxi-8-(2- hidroxiacetil)-9,13-dimetil-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,0²,⁹.0⁴,⁸.0¹³,¹⁸]icosa-14,17-dien-16-ona (P3-2)
[00654] A uma mistura de fluocinolona acetonida (P3-1, 0,90 g, 2,0 mmol) e sílica gel (18 g) em heptano (90 mL) foi adicionado butiraldeí- do (0,27 mL, 3,0 mmol) a 10 oC e a suspensão foi agitada a 10-20 oC por 10 minutos. À mistura foi adicionado ácido perclórico (70%, 0,68 mL, 8,3 mmol) em gotas a 0 oC. A mistura de reação foi então agitada a 10-20 oC de um dia para o outro. A maior parte da fluocinolona ace- tonida P3-1 foi consumida de acordo com TLC e LCMS. A mistura de reação foi diluída com éter de petróleo e arrefecida com Na2CO3 aquo- so saturado. A suspensão foi filtrada e o sólido foi lavado com DCM/metanol (v/v = 1). O filtrado combinado foi concentrado in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatografia flash em sílica gel (0- 100% de acetato de etila em éter de petróleo) para dar o composto P3- 2 (0,15 g, 16% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 467,1
(M + H)+. Metanossulfonato de 2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19- Difluor-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,0²,⁹.0⁴,⁸.0¹³,¹⁸]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetila (P3-3)
[00655] A uma solução de composto P3-2 (0,28 g, 0,65 mmol)) e trietilamina (0,13 g, 1,3 mmol) em DCM (3 mL) foi adicionado cloreto de metanossulfonila (89 mg, 0,78 mmol) a 0 oC. Depois de ser agitada a 0 oC por 0,5 h, a mistura de reação foi diluída com DCM (20 mL). A mistura foi lavada com H2O (20 mL×2), seca em Na2SO4 anidro, filtra- da e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de croma- tografia de coluna de sílica gel em sílica gel (0-50% de acetato de etila em éter de petróleo) para dar o composto P3-3 (0,26 g, >99% de ren- dimento) como um sólido branco. ESI m/z: 545 (M + H)+. (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-[2-(4-Aminofenoxi)acetil]- 12,19-difluor-11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,0²,⁹.0⁴,⁸.0¹³,¹⁸]icosa-14,17-dien-16-ona (P3) NH2
O O O HO H O H F H O F
[00656] Uma mistura de composto P3-3 (93 mg, 0,17 mmol), 4- aminofenol (37 mg, 0,34 mmol) e carbonato de césio (0,11 g, 0,34 mmol) em acetona (0,5 mL) foi refluxada por 2 horas. A mistura foi es- friada para RT e diluída com H2O (10 mL). A mistura foi extraída com acetato de etila (10 mL×3). A camada orgânica combinada foi lavada com água (20 mL) e salmoura (20 mL), seca em Na2SO4, filtrada e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de HPLC prepa- rativa para dar carga útil P3 (6,0 mg, 6,3% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 298 (M/2 + H)+, 558 (M + H)+ (10%). 1H RMN (500 MHz, MeODd4) δ 7,34 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 6,78-6,71 (m, 4H), 6,37-6,33 (m, 2H), 5,63-5,49 (m, 1H), 5,10-4,99 (m, 1H), 4,77-4,63 (m, 2H), 4,33 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 2,74-2,57 (m, 1H), 2,39-2,13 (m, 3H), 1,98-1,31 (m, 12H), 1,03-0,93 (m, 6H) ppm. Anal. HPLC: pureza 97,4%. Tempo de retenção: 7,55 min (método B). Carga útil P4 (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-(2-Azidoacetil)-12,19-difluor- 11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,0²,⁹.0⁴,⁸.0¹³,¹⁸]icosa-14,17-dien-16-ona (P4-4)
[00657] Uma suspensão de composto P3-3 (1,0 g, 1,8 mmol) e azi- da de sódio (1,2 g, 18 mmol) em acetona (15 mL) foi agitada a 50 oC de um dia para o outro. A mistura foi esfriada para RT e despejada em água (80 mL). A mistura aquosa foi extraída com acetato de etila (50 mL x 3). A camada orgânica combinada foi lavada com salmoura (30 mL), seca em Na2SO4 anidro, filtrada e concentrada in vacuo para dar composto P4-4 precursor de azido bruto (0,90 g, > 99% de rendimen- to) como um sólido amarelo, que foi usado para a etapa seguinte sem purificação adicional. ESI m/z: 492 (M + H)+. (1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-(2-Aminoacetil)-12,19-
difluor-11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,0²,⁹.0⁴,⁸.0¹³,¹⁸]icosa-14,17-dien-16-one; sal do ácido trifluoracético (P4) H2N O
O HO H O H F H O F
[00658] A uma solução de composto P4-4 (0,85 g, 1,7 mmol) em THF (20 mL) foi adicionado cloridrato aq. (1 N, 10 mL). A mistura foi agitada a 28-32 oC até se tornar transparente, à mistura foi então adi- cionada trifenilfosfina (0,68 g, 2,6 mmol). A solução amarela transpa- rente resultante foi agitada em RT por 18 h. A mistura foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado através de cromatografia flash de fase reversa (0-50% acetonitrila em TFA aq. (0,05%)) para dar o com- posto P4 (R/S) (0,56 g, 57% de rendimento, sal de TFA) como um só- lido esbranquiçado. ESI m/z: 466 (M + H)+. 1H RMN (400 MHz, Me- ODd4) δ 7,33 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 6,40-6,29 (m, 2H), 5,69-5,45 (m, 1H), 4,93-4,92 (m, 1H), 4,71 (t, J = 4,3 Hz, 1H), 4,35-4,27 (m, 2H), 3,90- 3,84 (m, 1H), 2,81-2,54 (m, 1H), 2,42-2,06 (m, 3H), 1,82-1,32 (m, 11H), 1,09-0,87 (m, 6H) ppm. 19F RMN (376 MHz, CD3OD) δ -77,01, -166,24, -166,92, -188,81, -188,83 ppm. Anal. HPLC: 100%. Tempo de reten- ção: 6,86 min (método A).
[00659] A carga útil P4 é opcionalmente submetida à separação quiral através de HPLC e/ou cromatografia de fluido supercrítico (SFC). Epímeros estereoquimicamente puros de P4, i.e., P4-1 (R) e P4-2 (S) ou misturas enriquecidas dos mesmos, P4-3, foram obtidos através de separação quiral a partir de uma mistura de seus isômeros R/S correspondentes. A estereoquímica absoluta para cada composto foi determinada através de 2D-NOESY. Referência é feita à Publica- ção do Pedido US Número US 2018/0155389, que mostra que nos es-
pectros de 2D-NOESY para composto 11-5R/S lá, H22 e H18 estavam relacionados ao composto 11-5R e que não havia nenhuma correlação entre H22 e H18 em 11-5S. Usando uma análise similar como mostrado na US 2018/0155389 para os compostos 11-5R/S, os centros quirais na posição C22- são identificados para os compostos P4-1 e P4-2 aqui através de 2D-NOESY.
. Legenda: "isômero R", "isômero S" Síntese alternativa (1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-(2- aminoacetil)-12,19-difluor-11-hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,0²,9,04,8,0¹³,¹8]icosa-14,17-dien-16-one; sal do ácido trifluoracético P4-1 (R)
[00660] Etapa 1: usando o mesmo procedimento descrito acima, o precursor de azido P4-4 (R) (0,12 g, 87% de rendimento) foi obtido a partir do composto (P3-3R) como um sólido branco após purificação através de cromatografia flash (0-50% de acetato de etila em éter de petróleo). ESI m/z: 492 (M + H)+. 1H RMN (500 MHz, CDCl3) δ 7,10 (dd, J = 10,2, 1,3 Hz, 1H), 6,44 (s, 1H), 6,38 (dd, J = 10,2, 1,8 Hz, 1H), 5,48-5,31 (m, 1H), 4,92 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,62 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,43 (dd, J = 5,6, 2,7 Hz, 1H), 4,22 (d, J = 18,7 Hz, 1H), 3,94 (d, J = 18,7 Hz, 1H), 2,56-2,39 (m, 2H), 2,32-2,18 (m, 2H), 1,85-1,71 (m, 3H), 1,67-1,54 (m, 7H), 1,46-1,37 (m, 2H), 0,97-0,90 (m, 6H) ppm.
[00661] Etapa 2: usando o mesmo procedimento descrito acima, composto P4-1 (R) (30 mg, 66% de rendimento) foi obtido como um sólido branco após purificação através de HPLC preparativa (método A). ESI m/z: 466 (M + H)+. 1H RMN (500 MHz, MeODd4) δ 7,34 (d, J =
10,0 Hz, 1H), 6,40-6,30 (m, 2H), 5,65-5,46 (m, 1H), 4,94-4,91 (m, 1H), 4,72 (t, J = 4,3 Hz, 1H), 4,34-4,28 (m, 2H), 3,88 (d, J = 18,8 Hz, 1H), 2,78-2,60 (m, 1H), 2,39-2,34 (m, 1H), 2,33-2,18 (m, 2H), 1,77-1,54 (m, 9H), 1,53-1,40 (m, 2H), 0,99-0,95 (m, 6H) ppm. Anal. HPLC: 100%. Tempo de retenção: 6,85 min (método A).
[00662] P4-2 (S) é obtido usando um procedimento similar.
[00663] A Tabela abaixo provê uma comparação de mudanças químicas de 1H RMN (ppm em d6-DMSO) de R-P4 (P4-1 aqui) e S-P4 (P4-2 aqui) isolado através de SFC de P4 (R/S).
# Pró- P4 (rac-) em DMSO- P4-1 (R) em DMSO- P4-2 (S)-em DMSO- ton d6 d6 d6 8,14 (s, 3H) 8,14 (s, 3H) 8,12 (brs, 3H), C1-H 7,31 (d, J = 10,2 Hz, 7,30 (d, J = 10,0 Hz, 7,30 (d, J = 10,0 Hz, 1H) 1H) 1H), C2-H 6,31 (dd, J = 10,1 Hz, 6,31 (dd, J = 10,0 Hz, 6,30 (dd, J = 1,6 Hz, 1,6 Hz, 1H) 1,6 Hz, 1H) 10,0 Hz, 1H), C4-H 6,11 (s, 1H) 6,11 (s, 1H) 6,11 (s, 1H), C6-H 5,71-5,54 (m, 1H) 5,71-5,55 (m, 1H) 5,71-5,54 (m, 1H), 7 C -H2 2,28-2,26 (m, 1H), 2,28-2,26 (m, 1H), 2,25-2,22 (m, 1H), 1,68-1,56 (m, 1H) 1,68-1,56 (m, 1H) 1,72-1,52 (m, 1H) 8 C -H 1,87-1,79 (m, 1H) 1,44-1,31 (m, 1H) 1,87-1,79 (m, 1H) C11-H 4,18 (m, 1H) 4,22 (m, 1H) 4,18 (m, 1H) 12 C -H2 2,09-2,01 (m, 1H), 2,09-2,01 (m, 1H), 2,03-1,97 (m, 1H), 1,68-1,56 (m, 1H) 1,68-1,56 (m, 1H) 1,72-1,52 (m, 1H) 14 C -H 2,09-2,01 (m, 1H) 2,09-2,01 (m, 1H) 2,03-1,97 (m, 1H) C15-H2 2,67-2,50 (m, 1H), 2,67-2,50 (m, 1H), 2,58-2,53 (m, 1H), 1,68-1,56 (m, 1H) 1,68-1,56 (m, 1H) 1,72-1,52 (m, 1H)
# Pró- P4 (rac-) em DMSO- P4-1 (R) em DMSO- P4-2 (S)-em DMSO- ton d6 d6 d6 C16-H 4,78 (m, 0,6H) 4,78 (m, 1H) 5,15 (d, J=7,6 Hz, 1 5,15 (d, J=7,6 Hz, 0,4 H) H), C18-H3 0,85 (s, 3H) 0,85 (s, 3H) 0,91 (s, 3H) 19 C -H3 1,48 (s, 3H) 1,48 (s, 3H) 1,48 (s, 3H) C21-H2 4,20 (m, 1H), 4,20 (d, J=19 Hz, 1H), 4,15 (d, J=19 Hz, 1H), 3,77 (m, 1H) 3,77 (d, J=19 Hz, 1H) 3,74 (d, J=19 Hz, 1H) C22-H 4,67 (t, J = 4,4 Hz, 4,67 (t, J = 4,4 Hz, 5,22 (t, J=4,8 Hz, , 0,6H) 1H) 1H) 5,22 (t, J=4,8 Hz, , 0,4H), C23-H2 1,68-1,56 (m, 2H) 1,68-1,56 (m, 2H) 1,48 (m, 2H) C24-H2 1,44-1,31 (m, 2H) 1,44-1,31 (m, 2H) 1,34-1,28 (m, 1H) C25-H3 0,87 (t, J=7,2 Hz, 3H) 0,87 (t, J=7,2 Hz, 3H) 0,88 (t, J=7,6 Hz, 3 H) Isômero S: ESI m/z: 522 (M+H)+; SFC quiral (CC4): 99,5 d.e.%; 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,21 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 6,77 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,63 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,24 (dd, J = 10,1, 1,6 Hz, 1H), 6,02 (s, 1H), 5,20 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 5,18 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 4,99 (d, J = -17,9 Hz, 1H), 4,61 (d, J = -17,9 Hz, 1H), 4,43 (s, 1H), 3,46 (s, 2H), 2,57 (td, J = 13,2, 4,4 Hz, 1H), 2,34 (dd, J = 13,4, 3,2 Hz, 1H), 2,16-2,01 (m, 4H), 1,85-1,68 (m, 3H), 1,59-1,49 (m, 3H), 1,44 (s, 3H), 1,44- 1,26 (m, 2H), 1,18-1,09 (m, 2H), 1,00 (s, 3H), 0,91 (t, J = 7,3 Hz, 3H) ppm. Isômero R: ESI m/z: 522 (M+H)+; SFC quiral (CC4): 98,1 d.e.%; 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,23 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 6,79 (dd, J = 8,8 Hz, 2H), 6,65 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,27 (dd, J = 10,1, 1,7 Hz, 1H), 6,04 (s, 1H), 4,94 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 4,89 (d, J = 18,0 Hz, 1H), 4,65 (d, J = 18,0 Hz, 1H), 4,61 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,48 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 3,51 (s, 2H), 2,58 (td, J = 13,3 Hz, 4,9 Hz, 1H), 2,35 (dd, J = 13,4 Hz, 2,8 Hz, 1H), 2,23-1,99 (m, 4H), 1,79-1,61 (m, 6H), 1,46-1,38 (m, 2H), 1,44 (s, 3H), 1,23-1,09 (m, 2H), 0,95 (s, 3H), 0,93 (t, J = 7,3 Hz, 3H) ppm.
Exemplo 23. Síntese de Ligador-carga útil LP3 (FIG. 12) N-(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor-11- hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetoxi}fenil)carbamato de {4-[(2S)-2-[(2S)-2-amino-3- metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (LP3-2)
[00664] A uma solução de Fmoc-vc-PAB-PNP (LP3-1, 100 mg, 0,13 mmol) e composto P3 (87 mg, 0,15 mmol) em DMF (5 mL) foi adicio- nado DIPEA (67 mg, 0,52 mmol) em RT com seringa.
A mistura foi agi- tada em RT por 3 horas e a maior parte da LP3-1 foi consumida de acordo com LCMS.
À mistura resultante foi adicionada piperidina (1 mL, excesso) e ela foi agitada a 25 oC por 2 horas até que Fmoc foi totalmente removido, o que foi monitorado através de LCMS.
Após fil- tragem através de uma membrana, o filtrado foi diretamente purificado através de HPLC preparativa (método B) para dar a composto LP3-2 (80 mg, 64% de rendimento) como um sólido branco.
ESI m/z: 963 (M + 1)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 10,22 (s, 1H), 9,57 (s, 1H), 8,69 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 8,08 (s, 3H), 7,61 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 7,36 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 7,27 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,22-7,00 (m, 1H), 6,84 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 6,30 (dd, J = 8,0 Hz, 1,6Hz, 1H), 6,11 (s, 1H), 6,10-6,00 (m, 1H), 5,72-5,55 (m, 1H), 5,52 (s, 1H), 5,48 (s, 1H), 5,16-5,05 (m, 3H), 4,88-4,80 (m, 1H), 4,80-4,76 (m, 1H), 4,75-4,70 (m, 1H), 4,55-4,48 (m, 1H), 4,25-4,20 (m, 1H), 3,70-3,60 (m, 1H), 3,12-2,90 (m, 2H), 2,70- 2,55 (m, 1H), 2,40-2,20 (m, 1H), 2,15-2,00 (m, 3H), 1,86-1,75 (m, 1H), 1,75-1,65 (m, 1H), 1,64-1,54 (m, 5H), 1,49 (s, 4H), 1,46-1,34 (m, 4H), 0,97-0,91 (m,5H), 0,90-0,85 (m, 4H), 0,85-0,80 (m, 3H) ppm.
N-(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor-11- hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,⁸.013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetoxi}fenil)carbamato de {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-
Azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in- 2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido]-3- metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (LP3)
[00665] A uma solução de ácido LP3-3 (37 mg, 67 µmol) em DMF (5 mL) foram adicionados DIPEA (15 mg, 0,12 mmol) e HATU (34 mg, 90 µmol) em RT sucessivamente. A mistura resultante foi agitada nes- sa temperatura por 0,5 hora antes da amina LP3-2 (58 mg, 60 µmol) ter sido adicionada. A mistura de reação foi agitada em RT por 3 horas até a amina ter sido totalmente consumida, o que foi monitorado atra- vés de LCMS. A mistura de reação foi filtrada em membrana e o filtra- do foi então separado através de HPLC preparativa para dar o com- posto LP3 (20 mg, 22% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 1499 (M + H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 10,02 (s, 1H), 9,59 (s, 1H), 8,14 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,88 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,80-7,75 (m, 1H), 7,70-7,66 (m, 1H), 7,65-7,60 (m, 3H), 7,53-7,45 (m, 3H), 7,40-7,28 (m, 7H), 6,84 (d, J = 9,2 Hz, 2H), 6,30 (dd, J = 10,4 Hz, 1,6 Hz, 1H), 6,11 (s, 1H), 6,10-6,00 (m, 1H), 5,72-5,55 (m,1H), 5,52 (s, 1H), 5,43 (s, 2H), 5,16-5,05 (m, 4H), 4,88-4,70 (m, 3H), 4,43-4,33 (m, 1H), 4,25-4,20 (m, 2H), 3,65-3,55 (m, 3H), 3,50-3,40 (m, 12H), 3,30-3,25 (m, 2H), 3,12-2,90 (m, 4H), 2,70-2,55 (m, 2H), 2,48-2,43 (m, 1H), 2,40-2,35 (m, 1H), 2,30-2,20 (m, 2H), 2,15-1,95 (m, 4H), 1,86-1,75 (m, 2H), 1,64-1,54 (m, 5H), 1,49 (s, 4H), 1,46-1,34 (m, 4H), 1,23 (s, 2H), 0,90-0,80 (m, 12H) ppm. HPLC Anal.: 100%. Tempo de retenção: 7,99 min (método
B). Solubilidade: <0,01 mg/mL de água. Exemplo 24. Síntese de Ligador-carga útil LP13 (FIG. 13) N-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor-11-hidroxi- 9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetil}carbamato de {4-[(2S)-2-[(2S)-2-Amino-3-metilbutanamido]- 5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (LP13-1)
[00666] A uma solução de Fmoc-VC-PAB-PNP (LP3-1, 0,17 g, 0,22 mmol) e composto P4 (93 mg, 0,20 mmol) em DMF (3 mL) foi adicio- nado DIPEA (51 mg, 0,40 mmol) em RT com seringa. A mistura foi agi- tada em RT por 3 horas e a maior parte dos materiais foi consumida de acordo com LCMS. À mistura resultante foi adicionada piperidina (0,3 mL, excesso) e ela foi agitada em RT por uma hora até que Fmoc foi totalmente removido, o que foi monitorado através de LCMS. Após filtragem através de uma membrana, o filtrado foi diretamente purifica- do através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto LP13-1 (0,13 g, 73% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 871 (M + 1)+. N-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor-11-hidroxi- 9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetil}carbamato de {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2- Azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in- 2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido]-3- metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila
(LP13)
[00667] A uma solução de ácido LP3-3 (30 mg, 54 µmol) em DMF (5 mL) foram adicionados DIPEA (13 mg, 0,10 mmol) e HATU (31 mg, 81 µmol) em RT sucessivamente. A mistura resultante foi agitada nes- sa temperatura por 0,5 hora antes da amina LP13-1 (43 mg, 50 µmol) ter sido adicionada. A mistura de reação foi agitada em RT por 3 horas até a amina ter sido totalmente consumida, o que foi monitorado atra- vés de LCMS. A mistura de reação foi filtrada em membrana e o filtra- do foi então separado através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto LP13 (16 mg, 23% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 1406 (M + H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 9,99 (s, 1H), 8,11 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,88 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,80-7,75 (m, 1H), 7,70-7,66 (m, 1H), 7,65-7,60 (m, 3H), 7,53-7,33 (m, 6H), 7,33-7,28 (m, 3H), 6,30 (dd, J = 10,0 Hz, 1,5 Hz, 1H), 6,11 (s, 1H),6,10-6,00 (m, 1H), 5,72-5,55 (m, 2H), 5,41 (s, 2H), 5,05-5,01 (m, 1H), 4,97 (s, 2H), 4,80-4,72 (m, 1H), 4,60-4,58 (m, 1H), 4,43-4,33 (m, 1H), 4,25-4,10 (m,3H), 3,88-3,80 (m,1H), 3,65-3,55 (m, 3H), 3,50-3,40 (m, 12H), 3,30- 3,25 (m, 2H), 3,12-2,90 (m, 4H), 2,70-2,55 (m, 2H), 2,48-2,35 (m, 2H), 2,30-2,20 (m, 2H),2,15-1,95 (m, 4H), 1,86-1,65 (m, 3H), 1,64-1,54 (m, 5H), 1,49 (s, 4H), 1,46-1,34 (m, 5H), 0,90-0,80 (m, 12H) ppm. HPLC Anal.: 100%. Tempo de retenção: 7,40 min (método B). Solubilidade: 0,02 mg/mL de água. Exemplo 25. Síntese de Ligador-carga útil LP14 (FIG. 14) [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluor-11-hidroxi-9,13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-
dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetil}carbamato de {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-amino-6-[2-(ciclo- oct-2-in-1-iloxi)acetamido]hexanamido]-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila N-{2- (LP14-1)
[00668] A uma solução de ácido LP1-3 (0,12 g, 0,22 mmol) em DMF (5 mL) foram adicionados HATU (0,11 g, 0,30 mmol) e DIPEA (77 mg, 0,60 mmol) em RT. Após a mistura ter sido agitada em RT por 30 minutos, uma solução de amina LP13-1 (0,17 g, 0,20 mmol) em DMF (5 mL) foi adicionada com seringa. A mistura resultante foi agitada em RT por 3 horas até a amina ter sido consumido na maior parte de acordo com LCMS. À mistura foi então adicionada piperidina (1 mL, excesso) e a mistura foi agitada em RT por meia hora até que Fmoc foi totalmente removido, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura de reação foi filtrada através de uma membrana e o filtrado foi direta- mente purificado através de cromatografia flash de fase reversa (ace- tonitrila 0-100% em bicarbonato de amônio aquoso (10 mM)) para dar o composto LP14-1 (0,12 g, 52% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 1163 (M + 1)+. 1H RMN (400 MHz, MeODd4) δ 7,65- 7,55 (m, 2H), 7,40-7,26 (m, 3H), 6,39-6,27 (m, 2H), 5,65-5,45 (m, 1H), 5,13-5,01 (m, 2H), 4,71-4,50 (m, 2H), 4,40-4,14 (m, 4H), 4,11-3,82 (m, 3H), 3,46-3,39 (m, 1H), 3,29-3,09 (m, 4H), 2,76-2,54 (m, 1H), 2,41-2,10 (m, 7H), 2,09-1,99 (m, 1H), 1,96-1,80 (m, 5H), 1,78-1,21 (m, 23H), 1,06-0,82 (m, 12H) ppm. N-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluor-11-hidroxi-
9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetil}carbamato de {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-amino-6-{2-[(1- {[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-dodecaidroxi-10,15,20,25,30- pentacis(hidroximetil)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29- dodecaoxaeptaciclo[26,2,2,23,6,28,11,213,16,218,21,223,26]dotetracontan- 5-il]metil}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-4- il)oxi]acetamido}hexanamido]-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (LP14-2)
[00669] A uma solução de alcina LP14-1 (0,12 g, 0,10 mmol) em DMF (5 mL) foi adicionada α-ciclodextrino-azida (0,30 g, 0,30 mmol). A mistura resultante foi então agitada a 50 oC por 3 horas até o compos- to LP14-1 ter sido consumido na maior parte e a massa desejada foi detectada, o que foi monitorado através de LCMS. Depois de ser filtra- da, mistura resultante foi diretamente purificada através de cromato- grafia flash de fase reversa (acetonitrila 0-100% em bicarbonato de amônio aquoso (10 mM)) para dar o composto LP14-2 (0,11 g, 51% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 1081 (M/2 + 1)+. 1H RMN (500MHz, DMSOd6) δ 10,05 (s, 1H), 8,30-7,80 (m, 3H), 7,80-7,55
(m, 2H), 7,50-7,40 (m, 1H), 7,40-7,25 (m, 3H), 6,30 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 6,11 (s, 1H), 6,00 (s, 1H), 5,80-5,35 (m, 16H), 5,25-5,05 (m, 1H), 4,97 (s, 2H), 4,90-4,50 (m, 13H), 4,50-4,00 (m, 5H), 3,95-3,55 (m, 22H), 3,30-3,20 (m, 8H), 3,20-3,00 (m, 4H), 3,00-2,85 (m, 5H), 2,25- 2,20 (m, 2H), 2,10-1,95 (m, 4H), 1,80-1,00 (m, 30H), 1,00-0,90 (m, 4H),0,90-0,80 (m, 14H) ppm. N-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluor-11-hidroxi- 9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetil}carbamato de {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(4-{2- azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2- il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido]-6-{2- [(1-{[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-dodecaidroxi- 10,15,20,25,30-pentacis(hidroximetil)- 2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29- dodecaoxaeptaciclo[26,2,2,23,6,28,11,213,16,218,21,223,26]dotetracontan- 5-il]metil}-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-4- il)oxi]acetamido}hexanamido]-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (LP14)
[00670] A uma solução de ácido LP14-3 (30 mg, 54 µmol) em DMF (5 mL) foram adicionados DIPEA (18 mg, 0,14 mmol) e HATU (26 mg,
69 µmol) em RT sucessivamente.
A mistura resultante foi agitada nes- sa temperatura por 0,5 hora antes da amina LP14-2 (0,10 g, 46 µmol) ter sido adicionada.
A mistura de reação foi agitada em RT por 4 horas até a amina ter sido totalmente consumida, o que foi monitorado atra- vés de LCMS.
A mistura de reação foi filtrada em membrana e o filtra- do foi então separado através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto LP14 (26 mg, 22% de rendimento) como um sólido branco.
ESI m/z: 1349 (M + H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 9,71 (s, 1H), 8,30-8,00 (m, 3H), 8,00-7,74 (m, 2H), 7,70-7,58 (m, 5H), 7,52- 7,20 (m, 12H), 6,35-6,20 (m, 2H), 6,15-5,85 (m, 3H), 5,80-5,35 (m, 18H), 5,25-4,90 (m, 6H), 4,90-4,50 (m, 14H), 4,40-4,25 (m, 4H), 4,25- 4,10 (m, 3H), 4,10-3,95 (m, 2H), 3,95-3,55 (m, 22H), 3,55-3,40 (m, 22H), 3,20-3,00 (m, 6H), 3,00-2,85 (m, 3H), 2,65-2,55 (m, 1H), 2,25- 2,20 (m, 4H), 2,10-1,95 (m, 6H), 1,80-1,70 (m, 5H), 1,70-1,50 (m, 10H), 1,50-1,45 (m, 9H), 0,90-0,80 (m, 14H) ppm.
HPLC Anal.: 100%. Tempo de retenção: 6,23 min (método B). Solubilidade: 0,026 mg/mL de água.
Exemplo 26. Síntese de Ligador-carga útil LP15 (FIG. 15) Ácido 2-{1-[4-({[(5R)-5-Amino-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(carbamoilamino)- 1-[(4-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor-11- hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,0²,⁹.0⁴,⁸.0¹³,¹⁸]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetil}carbamoil)oxi]metil}fenil)carbamoil]butil]carbamoil}-2- metilpropil]carbamoil}pentil]carbamoil}metoxi)- 1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-1-il]-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-amido}etano-1-sulfônico (LP15-2)
[00671] A uma solução de composto LP14-1 (60 mg, 52 μmol) em DMF (2 mL) foi adicionado composto azido LP15-1 (62 mg, 0,16 mmol). A reação foi agitada a 30 oC de um dia para o outro.
LCMS mostrou o término da reação.
A mistura de reação foi purificada dire- tamente através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto LP15-2 (60 mg, 74% de rendimento) como um sólido branco.
ESI m/z: 781 (M/2 + H)+. 1H RMN (400 MHz, MeODd4) δ 7,61 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,39-7,28 (m, 3H), 6,39-6,30 (m, 2H), 5,66-5,46 (m, 1H), 5,29-5,13 (m, 1H), 5,12-5,04 (m, 3H), 4,72-4,60 (m, 2H), 4,56-4,49 (m, 2H), 4,36-3,84 (m, 8H), 3,76-3,70 (m, 2H), 3,66-3,54 (m, 14H), 3,30-3,23 (m, 2H), 3,21-3,04 (m, 3H), 3,03-2,97 (m, 2H), 2,96-2,84 (m, 1H), 2,75-2,52 (m, 1H), 2,50-2,42 (m, 2H), 2,39-2,01 (m, 6H), 1,99-1,78 (m, 6H), 1,74- 1,22(m, 22H), 1,03-0,87 (m, 12H) ppm.
Ácido 2-{1-[4-({[(5R)-5-[1-(4-{2-Azatriciclo[10,4,0,0⁴,⁹]hexadeca- 1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-amido]-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4- (carbamoilamino)-1-[(4-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)- 12,19-difluor-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,0²,⁹.0⁴,⁸.0¹³,¹⁸]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetil}carbamoil)oxi]metil}fenil)carbamoil]butil]carbamoil}-2- metilpropil]carbamoil}pentil]carbamoil}metoxi)- 1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-ciclo-octa[d][1,2,3]triazol-1-il]-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-amido}etano-1-sulfônico (LP15)
[00672] A uma solução de composto LP15-2 (47 mg, 30 µmol) em DMF (1 mL) foram adicionados composto LP15-3 (21 mg, 33 µmol) e DIPEA (19 mg, 0,15 mmol) em RT. A mistura de reação foi agitada em RT por 3 horas. A mistura de reação foi purificada diretamente através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto LP15 (28 mg, 45% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 1049 (M/2 + H)+. 1H RMN (500 MHz, MeODd4) δ 7,75-7,57 (m, 4H), 7,48-7,43 (m, 3H), 7,38-7,23 (m, 6H), 6,37-6,28 (m, 2H), 5,65-5,43 (m, 1H), 5,17-5,03 (m, 3H), 4,69-4,59 (m, 2H), 4,52-4,47 (m, 1H), 4,45-4,41 (m, 1H), 4,34- 4,25(m, 2H), 4,23-4,13 (m, 2H), 4,07-3,86 (m, 5H), 3,77-3,68 (m, 4H), 3,64-3,54 (m, 22H), 3,52-3,47 (s, 3H), 3,46-3,40 (m, 4H), 3,29-3,21 (m, 4H), 3,20-3,14 (m, 2H), 3,10-3,01 (m, 1H), 3,00-2,95 (m, 2H), 2,92-2,84 (m, 1H), 2,76-2,60 (m, 2H), 2,47-2,42 (m, 2H), 2,40-2,25 (m, 5H), 2,23- 2,13 (m, 3H), 2,07-1,97 (m, 3H), 1,90-1,79 (m, 4H), 1,71-1,55 (m, 14H), 1,52-1,42 (m, 3H), 1,40-1,29 (m, 8H), 1,07-0,85 (m, 12H) ppm. Anal. HPLC: 98%. Tempo de retenção: 5,88 min (método B). Exemplo 26A: síntese de espaçadores de Budenosida (Vide FIG. 22)
[00673] A FIG. 22 mostra o Esquema 1 para a síntese de espaça- dores de Budenosida contendo os grupos reativos, ácido suc. (com- posto 1c), análogos de carbamato (1d, 1e), análogos de THP (1g e 1h), análogos de glicose (1i e 1j), análogos de fosfato (1k e 1l) e um análogo de fosfato comercial (1m). Intermediário 3a 1-[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-Hidroxi-9,13-dimetil-16-
oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17- dien-8-il]-2-oxoetoxi}carbonil)oxi]pirrolidino-2,5-diona (3a)
[00674] A uma solução de budesonida 1a (0,10 g, 0,26 mmol) em DCM (1 mL) foram adicionados bis(2,5-dioxopirrolidin-1-il) carbonato (71 mg, 0,30 mmol), trietilamina (47 mg, 0,52 mmol) e DMAP (3,0 mg, cat.). A mistura de reação foi agitada a 15-25 oC por 12 horas até a budesonida ter sido consumida, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura de reação foi então diluída com DCM e lavada com água. A solução orgânica foi seca em sulfato de sódio. Depois de ser filtrada, a solução foi concentrada in vacuo e o resíduo (3a bruto) foi usado para a próxima etapa diretamente sem purificação. (93 mg, Rendimento 71%). ESI m/z: 572,2 (M + H)+. Exemplo 1c Ácido 4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil- 16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa- 14,17-dien-8-il]-2-oxoetoxi}-4-oxobutanoico (1c)
[00675] Vide WO2015005459; WO2013074988; Research in Phar- maceutical Science, 2011, 6(2), 107-116; e International Journal of Pharmaceutics, 2009, 365(1-2), 69-76.
[00676] A uma solução de budesonida (1a, 0,10 g, 0,26 mmol) em DCM (1 mL) foram adicionados anidrido succínico (30 mg, 0,30 mmol),
trietilamina (47 mg, 0,52 mmol) e DMAP (3 mg, catalisador, 0,02 mmol). A mistura foi agitada em RT por 12 horas até a budenosida ter sido consumida, o que foi monitorado através de TLC e LCMS. A mis- tura de reação foi então diluída com DCM e lavada com água. A solu- ção orgânica foi seca em sulfato de sódio. Depois de ser filtrada, a so- lução foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado através de HPLC preparativa para dar o composto título 1c (22 mg, Rendimento 18%) como um sólido branco. ESI m/z: 531,3 (M + H)+. 1H RMN (500 MHz, CDCl3) δ 7,48 (d, J = 10 Hz, 1H), 6,28-6,26 (m, 1H), 6,04-6,02 (m, 1H), 5,23-5,11 (m, 1H), 5,06-4,99 (m, 1H), 4,83-4,68 (m, 1H), 4,45- 4,43 (m, 1H), 2,76-2,63 (m, 5H), 2,41-2,39 (m, 1H), 2,26-2,12 (m, 2H), 1,99-1,66 (m, 6H), 1,57-1,38 (m, 6H), 1,32 (s, 1H), 1,16-0,94 (m, 8H) ppm. Exemplo 1d N-metil-N-[2-(metilamino)etil]carbamato de (1d)2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-Hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6- propil-5,7-dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8- il]-2-oxoetila
[00677] A uma solução de intermediário bruto 3a (63 mg, 0,11 mmol) em DCM (5 mL) foram adicionados N,N'-dimetiletano-1,2- diamina (28 mg, 0,32 mmol) e trietilamina (38 mg, 0,38 mmol) em RT. A mistura resultante foi agitada em RT por 2 horas até a maior parte da 3a ter sido consumida, o que foi monitorado através de LCMS. Os voláteis foram removidos in vacuo e o resíduo foi purificado através de HPLC preparativa (método B) para dar 1d (4 mg, Rendimento 4,5%)
como um sólido branco. ESI m/z: 545,3 (M + H)+. 1H RMN (500 MHz, CDCl3) δ 7,32-7,30 (m, 1H), 6,28-6,25 (m,1H), 6,02-6,01 (m, 1H), 4,42 (br s, 1H), 3,50-3,23 (m, 3H), 3,10-3,02 (m, 3H), 2,82-2,71 (m, 3H), 2,57-2,55 (m, 1H), 2,35-2,33 (m, 1H), 2,15-2,06 (m, 2H), 1,96-1,79 (m, 12H), 1,60-1,56 (m, 3H), 1,46 (m, 3H), 1,37-1,33 (m, 2H), 1,23-1,04 (m, 4H), 0,92-0,86 (m, 3H) ppm. Exemplo 1e N-[(Hidrazinocarbonil)metil]carbamato de 2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,13R)-11-Hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil- 5,7-dioxapenta ciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (1e)
[00678] A uma mistura de 3a bruto (0,16 g, 0,28 mmol) em DMF (3 mL) foram adicionados Boc-2-(2-aminoacetil)hidrazina (80 mg, 0,42 mmol) e trietilamina (85 mg, 0,84 mmol). A mistura de reação foi agita- da a 25 oC por 16 horas e intermediário 3a foi consumido, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura foi então arrefecida com água e extraída com acetato de etila. A solução orgânica combinada foi se- ca em sulfato de sódio anidro. Depois de ser filtrada, a solução foi concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatogra- fia de coluna de sílica gel (30-50% de acetato de etila em éter de pe- tróleo) para dar Boc-1e (70 mg) como um sólido branco (ESI m/z: 646 (M + H)+), que foi dissolvido em DCM (2 mL). À solução foi adicionado em gotas TFA (1 mL) a 0 oC. A mistura foi agitada a 25C por 2 horas até Boc-1e ter sido consumido, o que foi monitorado através de LCMS. Os voláteis foram removidos in vacuo e o resíduo foi purificado através de HPLC preparativa para dar o composto título 1e (7 mg, Rendimento 12%) como um sólido branco. ESI m/z: 546 (M + H)+. Exemplo 1g (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-Hidroxi-8-(2-{[6- (hidroximetil)oxan-2-il]oxi}acetil)-9,13-dimetil-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-16-ona (1g)
[00679] A uma solução de budesonida (1a, 50 mg, 0,12 mmol) em DCM anidro (4 mL) foram adicionados (3,4-di-hidro-2H-piran-2- il)metanol (0,11 g, 0,93 mmol) e ácido p-toluenossulfônico (31 mg, 0,18 mmol) a 0 oC. A mistura de reação foi agitada em RT por 4 dias, o que foi monitorado através de LCMS. Os voláteis foram removidos in vacuo e o resíduo foi dissolvido em DMF e separado através de HPLC prepa- rativa (método B) para dar o composto título 1g (13 mg, Rendimento 20%) como um sólido branco. ESI m/z: 545 (M + H)+. Exemplo 1h 2-[(6-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-Hidroxi-9,13-dimetil-16- oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17- dien-8-il]-2-oxoetoxi}oxan-2-il)metoxi]acetato de metila (1h)
[00680] A uma solução de (3,4-di-hidro-2H-piran-2-il)metanol (2,0 g,
18 mmol) em THF (30 mL) foi adicionado hidreto de sódio (60% em óleo mineral, 0,88 g, 22 mmol) em porções a 0 oC sob proteção com nitrogênio. A suspensão foi agitada a 0 oC até o final da evolução de hidrogênio. À mistura resultante foi então adicionada uma solução de 2-bromoacetato de etila (4,0 g, 26 mmol) em THF (18 mL). A mistura foi agitada em RT de um dia para o outro até o material inicial ter sido consumido na maior parte de acordo com LCMS. Depois de esfriada para 0 oC, a reação foi arrefecida com água sob proteção com nitrogê- nio e extraída com acetato de etila. A solução orgânica combinada foi lavada com água e salmoura, seca em sulfato de sódio e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatografia flash (0-8% de acetato de etila em éter de petróleo) para dar 2-((3,4-di-hidro-2H- piran-2-il)metoxi)acetato de etila (0,70 g, 21% de rendimento) como óleo incolor. (1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 6,36 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 4,67 (m, 1H), 4,16 (s, 2H), 3,92 (m, 1H), 3,65 (s, 3H), 3,57 (d, J = 5,5 Hz, 2H), 2,50-1,99 (m, 1H), 1,93-1,82 (m, 1H), 1,80 (m, 1H), 1,60 (m, 1H) ppm.)
[00681] A uma solução de budesonida (1a, 0,11 g, 0,25 mmol) em DCM anidro (8 mL) foram adicionados 2-((3,4-di-hidro-2H-piran-2- il)metoxi)acetato de etila (0,35 g, 1,9 mmol) obtido acima e ácido p- toluenossulfônico (66 mg, 0,35 mmol) a 0 oC. A mistura de reação foi agitada em RT por 4 horas, o que foi monitorado através de LCMS. Os voláteis foram removidos in vacuo e o resíduo foi dissolvido em DMF e separado através de HPLC preparativa (método A) para dar o compos- to título 1h (46 mg, Rendimento 29%) como um sólido branco. ESI m/z: 617 (M + H)+. Exemplo 1i (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-Hidroxi-9,13-dimetil-6-propil-8- (2-{[(2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-tri-hidroxi-6-(hidroximetil)oxan-2- il]oxi}acetil)-5,7-dioxapentaciclo[10,8,002,9,04,8,013,18]icosa-14,17-
dien-16-ona (1i, com epímeros)
[00682] A uma mistura de budesonida (1a, 0,22 g, 0,50 mmol) e acetobromo-α-D-Glicose (0,33 g, 0,80 mmol) em DCM (15 mL) foram adicionadas peneiras moleculares 4 Å (1,0 g) e a mistura foi agitada em RT por meia hora seguido pela adição de trifluormetanossulfonato de prata (0,19 g, 0,75 mmol) a 0 oC. A suspensão foi agitada no escuro em RT durante o final de semana (72 horas) sob proteção com nitro- gênio. A mistura foi filtrada em Celite e o filtrado foi concentrado in va- cuo. O resíduo foi purificado através de HPLC preparativa (método B) para dar Ac-1i (25 mg, Rendimento 9,2%) como um sólido branco. ESI m/z: 761 (M + H)+. 1H RMN (DMSOd6, 400 MHz) (com epímeros) δ 7,34-7,30 (m, 1H), 6,19-6,14 (m, 1H), 5,91 (s, 1H), 5,29 (t, J = 9,2 Hz, 1H), 5,17-5,15 (m, 0,5H), 5,03-5,01 (m, 0,5H), 4,96-4,90 (m, 1H), 4,85- 4,74 (m, 3H), 4,70-4,67 (m, 1H), 4,64-4,63 (m, 0,5H), 4,59-4,56 (m, 0,5H), 4,39-4,28 (m, 2H), 4,20-4,16 (m, 1H), 4,05-3,99 (m, 2H), 2,56- 2,40 (m, 1H), 2,32-2,26 (m, 1H), 2,13-1,89 (m, 14H), 1,83-1,63 (m, 3H), 1,59-1,48 (m, 3H), 1,44-1,21 (m, 6H), 1,15-0,91 (m, 2H), 0,86-0,81 (m, 6H) ppm.
[00683] A uma solução do composto Ac-1i (30 mg, 39 µmol) obtido acima em água (1 mL) e metanol (3 mL) foi adicionado monoidrato de hidróxido de lítio (17 mg, 0,40 mmol) a 0 oC. Depois de agitada a 0 oC por uma hora, a mistura foi purificada diretamente através de HPLC preparativa (método B) para dar 1i (24 mg, 98% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 593 (M + H)+. 1H RMN (MeODd4, 400 MHz) (com epímeros) δ 7,46 (t, J = 10,4 Hz, 1H), 6,26 (dt, J = 10,0 e 2,0 Hz, 1H), 6,02 (s, 1H), 5,21 e 4,64 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 5,16 (t, J = 7,2 Hz,
0,5H), 4,94-4,80 (m, 2,5H), 4,57-4,47 (m, 1H), 4,44-4,41 (m, 1H), 4,34- 4,31 (m, 1H), 3,90-3,87 (m, 1H), 3,70-3,64 (m, 1H), 3,39-3,24 (m, 4H), 2,70-2,62 (m, 1H), 2,41-2,36 (m, 1H), 2,27-2,08 (m, 2H), 2,00-1,93 (m, 1H), 1,88-1,81 (m, 1H), 1,74-1,32 (m, 9H), 1,22-0,90 (m, 8H) ppm. Exemplo 1j Ácido (2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-Tri-hidroxi-6-{2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6- propil-5,7-dioxapentaciclo[10,8,002,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]- 2-oxoetoxi}oxano-2-carboxílico (1j, com epímeros)
[00684] Seguindo os procedimentos similares a 1i exceto pela subs- tituição de acetobromo-α-D-Glicose por metil éster do ácido acetobro- mo-α-D-glucurônico, o composto 1j (24 mg, 9,2% de rendimento em 2 etapas) como um sólido branco foi obtido. ESI m/z: 607 (M + H)+. 1H RMN (MeODd4, 400 MHz) δ 7,48 (t, J = 10,0 Hz, 1H), 6,28-6,24 (m, 1H), 6,02 (s, 1H), 5,22-5,15 (m, 1H), 4,98-4,81 (m, 2,5H), 4,65-4,56 (m, 1,5H), 4,45-4,39 (m, 2H), 3,62-3,59 (m, 1H), 3,52-3,46 (m, 1H), 3,41 (t, J = 8,8 Hz, 1H), 3,30-3,28 (m, 1H), 2,70-2,62 (m, 1H), 2,40-2,36 (m, 1H), 2,27-2,10 (m, 2H), 1,95-1,92 (m, 2H), 1,75-1,54 (m, 3H), 1,50 (s, 3H), 1,51-1,32 (m, 3H), 1,12-0,90 (m, 8H) ppm. Exemplo 1k Ácido (2, 2113-etoxi)({2 1H)S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)13oxi)({2 1H), 3,30-3,28 (m, 1H), 2,70-2,62 (m, 1H), 2,40-2,36 (m, 1H)2,9,04,8,013,18]icosa)({2 1H), 3,30-3,28 oxoetoxi})fosfínico (1k)
[00685] A uma solução de trietilamina (0,67 g, 6,6 mmol) em cloro- fórmio (4 mL) foi adicionado oxicloreto fosforoso (0,51 mg, 3,3 mmol) a 0 oC, seguido pela adição de uma solução de budesonida (1a, 1,3 g, 3,0 mmol) em clorofórmio (4 mL). Depois de ser agitada a 20 oC por 2 horas, a mistura foi esfriada para 0 oC e foi adicionada uma solução de Boc-etanolamina (0,41 mg, 2,6 mmol) em clorofórmio (4 mL) e piridina (3 mL). Depois de ser agitada a 20 oC por uma hora até que a reação estivesse completa de acordo com LCMS, a mistura de reação foi arre- fecida através da adição de água (2 mL) a 0 oC. A mistura foi agitada a 20 oC de um dia para o outro. Os voláteis foram removidos in vacuo e o resíduo foi purificado através de HPLC preparativa (método B) para dar Boc-1k bruto (330 mg, 17%) como película amarela. ESI m/z: 676 (M + Na)+.
[00686] A uma solução de Boc-1k (0,18 g, 0,28 mmol) em DCM (5 mL) foi adicionado ácido trifluoracético (0,5 mL) a 0 oC. A mistura re- sultante foi agitada a 23 oC por 2 horas até Boc ter sido totalmente re- movido de acordo com LCMS. Os voláteis foram removidos in vacuo. O resíduo foi purificado através de HPLC preparativa (método B) para dar 1k como um sólido branco (90 mg, 59% de rendimento). ESI m/z: 554 (M + H)+. 1H RMN (500 MHz, MeODd4) δ 7,49 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 6,28 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 6,03 (s, 1H), 5,24-5,15 (m, 1H), 4,87-4,62 (m, 3H), 4,45 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 4,18-4,15 (m, 2H), 3,22-3,20 (m, 2H), 2,71-2,64 (m, 1H), 2,40 (d, J = 13,4 Hz, 1H), 2,29-1,71 (m, 6H), 1,65- 1,32 (m, 9H), 1,22-0,91 (m, 7H) ppm. HPLC Anal.: > 99,9%. Tempo de retenção: 3,90 min (método B). Exemplo 1l
Ácido (2-{[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}etoxi)fosfônico
[00687] Vide J. Am. Chem. Soc., 2016, 138(4), 1430-1445; WO2015153401; e Phosphorus, Sulfur and Silicon and the Related Elements, 2000, 165, 83-90.
[00688] A uma mistura de Fmoc-etanolamina (1,1 g, 3,9 mmol) em THF (16 mL) foi adicionado cloreto de difosforila (2,2 g, 8,8 mmol) com seringa a -40 oC. Depois de ser agitada a -40 oC por uma hora até o material de partida ter sido totalmente consumido, o que foi monitorado através de LCMS, a mistura de reação foi arrefecida com água (1 mL) a -40 oC, tratada com solução de bicarbonato de sódio aquosa satura- da (200 mL) e mantida a 10-20 oC de um dia para o outro. A mistura resultante foi acidificada com HCl concentrado para pH 2 e foi então extraída com acetato de etila. A solução orgânica combinada foi seca em sulfato de sódio e concentrada para dar o composto título bruto (1,6 g, bruto) como um sólido branco, que foi usado para a próxima etapa sem purificação. ESI m/z: 364 (M + H)+. Ácido (2-{[(9H-Fluoren-9- ilmetoxi)carbonil]amino}etoxi)({[hidroxi({2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6- propil-5,7-dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8- il]-2-oxoetoxi})fosforil]oxi})fosfínico (Fmoc-1l)
[00689] Seguindo o procedimento acima exceto pela substituição de
Fmoc-etanolamina com budenosina (1a, 0,86 g, 20 mmol), o interme- diário budenosina fosfônica 1a-PO3H2 (1,1 g, crude) como um sólido branco (ESI m/z: 551 (M + H)+) foi obtido.
[00690] A uma solução de ácido (2-{[(9H-fluoren-9- ilmetoxi)carbonil]amino}etoxi)fosfônico bruto (0,29 g, 0,80 mmol) em DMF (5 mL) foram adicionados trietilamina (81 mg, 0,80 mmol) e 1,1'- carbonildi-imidazol (CDI, 0,32 g, 2,0 mmol) a 10 oC. A mistura foi agi- tada a 10-20 oC por 30 minutos antes do intermediário budenosida fos- fônica 1a-PO3H2 obtida acima (0,41 g, 0,80 mmol) e cloreto de zinco (0,87 g, 6,4 mmol) terem sidos adicionados à mistura de reação. A mistura resultante foi agitada a 10-20 oC de um dia para o outro e ma- terial de partida foi totalmente consumido de acordo com LCMS. A re- ação foi então arrefecida com HCl aq. diluído (1 N, 50 mL) e extraída com acetato de etila. A solução orgânica combinada foi concentrada e o resíduo foi purificado através de HPLC preparativa (método B) para dar Fmoc-1l (0,32 g, Rendimento 47%) como um sólido branco. ESI m/z: 856 (M + H)+. Ácido (2-aminoetoxi)({[hidroxi({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)- 11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetoxi})fosforil]oxi})fosfínico (1l) Vide WO2015153401.
[00691] A uma solução de Fmoc-1l (0,10 g, 0,12 mmol) em DCM (2 mL) foi adicionada piperidina (67 mg, 0,79 mmol) a 10 oC. A mistura de reação foi agitada a 10-20 oC por 16 horas. Composto Fmoc-1l foi to- talmente consumido de acordo com LCMS. Os voláteis foram removi- dos in vacuo e o resíduo foi purificado através de HPLC preparativa (método B) para dar 1l (50 mg, Rendimento 68%) como um sólido branco. ESI m/z: 634 (M + H)+. 1H RMN (500 MHz, MeODd4) δ 7,50 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 6,28 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 6,03 (s, 1H), 5,23-5,16 (m, 1H), 5,02-4,97 (m, 1H), 4,88-4,67 (m, 1H), 4,45 (d, J = 3,4 Hz, 1H), 4,23 (s, 2H), 3,24 (s, 2H), 2,67 (dd, J = 13,5, 8,3 Hz, 1H), 2,40 (d, J = 11,3 Hz, 1H), 2,28-1,32 (m, 15H), 1,23-0,92 (m, 8H) ppm. HPLC Anal.: > 99,9%. Tempo de retenção: 2,74 min (método B).
[00692] A Tabela 1a abaixo apresenta esteroides feitos usando os métodos descritos aqui. Tabela 1a - Estrutura e Propriedades Físico-Químicas de Compos- tos # Estrutura HPLC cLogP MF MW MS pure- (Cal.) (M+H) za 1a 95 2,73 C25H34O6 430,55 431,3 1c 98 3,00 C29H38O9 530,25 531,2 1d 93 2,92 C30H44N2O7 544,69 545,3 1e 100 1,44 C28H39N3O8 545,62 546,2 1g 92 3,65 C31H44O8 544,68 545,3
# Estrutura HPLC cLogP MF MW MS pure- (Cal.) (M+H) za 1h 98 3,19 C34H48O10 616,32 616,32 1i O H HH 100 0,96 C31H44O11 592,67 593,4
O O O O H O OH HO HO OH OH
H 1j O HH 98 1,28 C31H42O12 606,66 607,3
O O O H O O O OH HO HO OH
OH 1k O
H HH 100 1,18 C27H40NO9P 553,58 554,1
O O O
O O H H 2N P O OH
OH 1l H HH 100 0,55 C27H41NO12P2 633,56 634,0
O O O O H O P O OH O OH O P O
OH H 2N 1m H 100 1,15 C21H27Na2O8P 484,39 590,3
H HO H O
O O OH Na+ - -O P O Na+
O 100 100 2,44 C25H32F2O6 466,51 467 101a >95 2,40 C29H40F2N2O7, 663,66 567 C2HF3O2 101b >95 2,63 C30H42F2N2O7, 678,69 581 C2HF3O2
# Estrutura HPLC cLogP MF MW MS pure- (Cal.) (M+H) za 101c 100 3,34 C32H46F2N2O7, 722,74 609 C2HF3O2
101d 100 2,46 C30H40F2N2O7 578,64 579
102c >95 3,47 C28H39NO7S 533,68 531
102d >95 3,69 C29H41NO7S 547,71 548
102e >95 3,17 C28H37F2NO7S 569,66 570
102f >95 3,40 C29H39F2NO7S 583,69 584
103a 98 1,58 C28H40N2O7 516,64 517
103b 98 1,29 C28H38F2N2O7 552,62 553
# Estrutura HPLC cLogP MF MW MS pure- (Cal.) (M+H) za 104a >90 3,67 C35H50F2N2O8 664,79 665 104b >95 2,19 C34H48F2N2O9 666,76 667 Esquema 2. Síntese de VC-PAB Espaçador -Budesonida Legenda: "durante a noite", piperidina", "ou" Procedimento geral para síntese de MC- Espaçador-Budenosida (2a e 2c)
[00693] A uma solução de vcPAB-Budesonida (4a A = CO, 1,0 equiv.) ou amina9 (1,0 equiv.) no Esquema 2 em DMF (ca. 1 mL por 10 mg de amina) foram adicionados éster de NHS ativado 5 (1,5-3,0 equiv.) na tabela abaixo e DIPEA (2,0 equiv.) em RT.
A mistura de re- ação foi agitada em RT de um dia para o outro éster de NHS e a maior parte da amina foram consumidos de acordo com espectros de LCMS.
Depois da filtragem, a solução de reação foi diretamente purificada através de HPLC preparativa ou cromatografia flash de fase reversa para dar a amida 2 desejada (ca. 17% de rendimento) como um sólido branco.
Aminas Éster ativa- Ba- Sol- Tem- Purifica- Produ- do 5 se/reagent vente po (hr) ção to 2 es 4ac 50 mg, 5a 28 mg, DIPEA (23 DMF 16 Prep- 2a (10 56 µmol 91 mg, 0,18 (3 mL) HPLC mg, µmol mmol) (método 17%) A) Solução de 5b 8,8 DIPEA (4,0 DMF 16 Prep- 2d (3,5 rxn 9 mg, 20 mg, 31 (1 mL) HPLC mg, µmol µmol) (método 4%) A) c.
Sal de TFA Procedimento geral B para síntese de amidas 2b, 2l, 2m-precursor a partir de ácido
Produ- Aminas Áci- A R tos dos 2b 4a 5c 2l 4c 5d 2m - 4c 5e precur- sor
[00694] A uma solução de ácido 5 (1,0-1,5 equiv.) em DMF ou DCM ou THF (1 mL por 5 mg de 5) foram adicionados DIPEA (2,0-5,0 equiv.) e HATU (1,4-2,2 equiv.) em RT. A mistura resultante foi agitada nessa temperatura por 0,5-1 hora antes da vcPAB-Budesonida (4, 1,0 equiv.) ter sido adicionada. A mistura de reação foi agitada em RT por 3-16 horas até a amina ter sido totalmente consumida, o que foi moni- torado através de LCMS. A mistura de reação foi filtrada através de uma membrana e a filtragem foi então separada através de HPLC pre- parativa ou cromatografia de fase reversa para dar amida 2 (21-54%
de rendimento) como um sólido branco. Na tabela abaixo estão deta- lhes adicionais. Aminas ácido Base/reagentes Solven- Tempo Purifica- Produto 2 te (hr) ção 4b 10 mg, 5c 10 mg, DIPEA (6,2 mg, DMF (1 16 Prep- 2b (3,0 mg, 11 µmol 18 µmol 48 µmol) mL) HPLC 21%) HATU (9,0 mg, (método 24 µmol) B) 4c 58 mg, 5c 37 mg, DIPEA (15 mg, DMF (5 3 Prep- 2i (21 mg, 61 µmol 67 µmol 0,12 mmol) mL) HPLC 24%) HATU (34 mg, (método 89 µmol) B) 4c 8,9 mg, 5d 6,3 mg, DIPEA (3,6 mg, DMF (1 16 Prep- 2l (7 mg, 9,4 14 µmol 27 µmol) mL) HPLC 54%) µmol HATU (8,0 mg, (método 20 µmol) B) 4c 20 mg, 5e 13 mg, DIPEA (8,0 mg, THF (5 16 Prep- 2m - pre- 21 µmol 21 µmol 62 µmol) mL) HPLC cursor (5 HATU (12 mg, (método mg) 31 µmol) A) Procedimento geral C para síntese de intermediários 7 e 10 Aminoácido Fmoc 6 Produto R 6a 7 6b 10
[00695] A uma solução de intermediário 6 (1,2-1,4 equiv.) em DMF foi adicionado HATU (1,5-1,7 equiv.) em RT. A solução obtida foi agi- tada em RT por uma hora. A essa suspensão foram adicionados uma solução de vcPAB-budesonida (4a, 1,0 equiv.) em DMF (0,10 mL por mg de4a) e subsequentemente NMM (2,3-3,0 equiv.). A mistura de re- ação foi agitada em RT por 16 horas e ficou transparente. A reação foi monitorada através de LCMS até composto 4a ter sido totalmente con- sumido. À mistura de reação foi então adicionada dietilamina (exces- so) e a mistura resultante foi então agitada a RT por 1-3 horas até Fmoc ter sido removido de acordo com LCMS. Os voláteis foram re- movidos in vacuo e o resíduo foi purificado através de HPLC preparati- va (método A) para dar o composto 7 (18% de rendimento a partir do composto 4a) ou purificado através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto 10 (5-% de rendimento) como um sólido branco. Na tabela abaixo estão detalhes adicionais. Aminas Intermediá- Base/reagentes Solven- Tempo Purifica- Produto rio 6 te ção 4a 60 mg, 6a 46 mg, NMM (15 mg, 0,15 DMF (3 16 hrs Prep- 7 (13 mg, 64 µmol 86 µmol mmol) mL) então 3 HPLC 18%) HATU (41 mg, hrs (método 0,11 mmol) A) então Et2NH (0,5 mL) 4a 0,19 g, 6b 0,15 g, NMM (61 mg, 0,60 DMF (5 16 hrs Prep- 10 (13 0,20 0,24 mmol) mL) então 1 HPLC mg, 5%) mmol mmol HATU (0,11 g, hr (método 0,29 mmol) B) então Et2NH (1 mL) Procedimento geral D para síntese de carbamatos 2j, 2k, 2r e 2s
[00696] A mistura foi agitada em RT por 3-24 horas até éster ativa- do PNP ter sido totalmente consumido, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura de reação foi filtrada em membrana e o filtrado foi separado diretamente através de HPLC preparativa para dar o com- posto 2 (com ou sem diastereoisômeros, 11-63% de rendimento) como um sólido branco(s). Na tabela abaixo estão detalhes adicionais. Espaçador- Éster ati- Ba- SolventeTempo Purifica- Produto 2 budesonida vado 23 se/reagentes (hr) ção 21 1e 15 mg, 11a 15 mg, DIPEA (12 DMF (1 12 Prep-HPLC 2j (3,0 mg, 28 µmol 20 µmol mg, 93 µmol) mL) (método A) 13%) HOBt (4,0 mg, 30 µmol) 1d 20 mg, 11a 22 mg, DIPEA (12 DMF (1 12 Prep-HPLC 2k-A (3,3 mg, 37 µmol 30 µmol mg, 93 µmol) mL) (método A) 10%) HOBt (6,0 2k-B (4,1 mg, mg, 44 µmol) 12%) 1k 50 mg, 11c 30 mg, DIPEA (50 DMF (1 3 Prep-HPLC 2r (40 mg, 90 µmol 95 µmol mg, 0,39 mL) (método B) Rendimento mmol) 61%) Síntese de 2a-d
[00697] Ligadores Budesonida 2a-d foram preparados a partir de três abordagens de acordo com o Esquema 2. A primeira abordagem foi por meio reações de acoplamento de amida diretamente a partir de vcPAB-Budesonida (4a), que foi obtida a partir do éster ativado de bu- denosida 3a com ligadores 5. A segunda abordagem foi por meio de reações de acoplamento de amida iniciais a partir de PAB-Budesonida (4a) com intermediário 6a para gerar Ligadores Budesonida 7, seguido por ciclização 3+2 com galactose-azida (8a) para gerar Intermediários 9 e finalmente através de reações de acoplamento de amida secundá- rias com 5. A terceira abordagem foi por meio de primeiras reações de acoplamento amida de 4 com intermediário 6b, seguido por formação de amida com 5b e sequencialmente desproteção de acetona para dar 2d. Intermediário 4a
[00698] 1,4 mmol) em DMF seco (10 mL) foram adicionados Boc- vc-PAB (12a) [WO2008/34124 A2] (0,59 g, 1,2 mmol), DMAP (0,30 g, 2,4 mmol) e piridina (0,29 g, 3,7 mmol). A mistura foi agitada em RT por 16 horas até 3a ter sido totalmente consumido de acordo com LCMS.
A mistura de reação foi diretamente purificada através de cro- matografia flash de fase reversa (acetonitrila 50-80% em água) para dar intermediário Boc-4a (0,74 g, Rendimento 38%, ESI m/z: 936 (M + H)+) como um sólido branco, que foi dissolvido em DCM (40 mL). A 5 mL da solução de DCM (contendo 94 mg Boc-4a) foi adicionado TFA (0,5 mL) em gotas a 0 oC.
Depois de ser agitada em RT por 1,5 hora até a Boc-4a ter sido consumida, o que foi monitorado através de LCMS, a mistura resultante foi concentrada in vacuo para dar produto título bruto 4a (83 mg, Rendimento 34% a partir de budesonida) como seu sal de TFA como óleo incolor, que pode ser usado sem purificação para a síntese da etapa seguinte. 20 mg do 4a bruto foram purificados através de HPLC preparativa (método B) para dar 4a puro (8 mg) co- mo base livre para teste de estabilidade no plasma.
ESI m/z: 836 (M + H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 10,17 (s, 1H), 8,12 (br s, 1H), 7,62 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,31 (d, J = 10,2 Hz, 3H), 6,17 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 5,97 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 5,92 (s, 1H), 5,40 (s, 2H), 5,22-5,01 (m, 4H), 4,89-4,62 (m, 3H), 4,53-4,40 (m, 1H), 4,30 (s, 1H), 3,09-2,87 (m, 3H),
2,36-2,22 (m, 1H), 2,14-1,87 (m, 4H), 1,81 (d, J = 5,6 Hz, 2H), 1,75 (s, 2H), 1,62-1,52 (m, 4H), 1,51-1,41 (m, 2H), 1,40-1,19 (m, 8H), 1,18-0,92 (m, 2H), 0,92-0,82 (m, 9H), 0,78 (d, J = 6,8 Hz, 3H) ppm. Exemplo 2a N‐[(1S)‐1‐{[(1S)‐4‐(Carbamoilamino)‐1‐[(4‐{[({2‐[(1S,2S,4R,8S,9S,11 S,12S,13R)‐11‐hidroxi‐9,13‐dimetil‐16‐oxo‐6‐propil‐5,7‐dioxapentac iclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa‐14,17‐dien‐8‐il]‐2‐oxoetoxi}carbonil)o xi]metil}fenil)carbamoil]butil]carbamoil}‐2‐metilpropil]‐6‐(2,5‐dioxo ‐2,5‐di-hidro-1H‐pirrol‐1‐il)hexanamida (2a)
[00699] Seguindo o procedimento geral A, o composto título 2a (10 mg, 17% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 1029 (M + H)+. HPLC Anal.: 92,5%. Tempo de retenção: 7,66 min (mé- todo A). Exemplo 2b 1‐(4‐{2‐Azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca‐1(12),4(9),5,7,13,15‐hexaen‐ 10‐in‐2‐il}‐4‐oxobutanam‐[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)‐11‐hidroxi ‐9,13‐dimetil‐16‐oxo‐6‐propil‐5,7‐ido)‐N‐[(1S)‐1‐{[(1S)‐4‐(carbamoila mino)‐1‐[(4‐{[({2- dioxapentaci- clo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa‐14,17‐dien‐8‐il]‐2‐oxoetoxi}carbonil)ox i]metil}fenil)carbamoil]butil]carbamoil}‐2‐metilpropil]‐3,6,9,12‐tetra oxapentadecan‐15‐amida (2b)
[00700] Seguindo o procedimento geral B, o composto título 2b (3,0 mg, 21% de rendimento) foi obtido como um sólido branco.
ESI m/z: 686 (M/2 + H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 10,05 (s, 1H), 8,15 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,88 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,77 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 7,71- 7,66 (m, 1H), 7,66-7,59 (m, 3H), 7,52-7,27 (m, 9H), 6,17 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 6,03-5,95 (m, 1H), 5,92 (s, 1H), 5,79-5,74 (m, 1H), 5,43 (s, 2H), 5,22-4,99 (m, 6H), 4,88-4,84 (m, 1H), 4,84-4,60 (m, 2H), 4,42-4,34 (m, 1H), 4,33-4,26 (m, 1H), 4,26-4,20 (m, 1H), 3,65-3,55 (m, 3H), 3,48- 3,44 (m, 12H), 3,32-3,26 (m, 2H), 3,12-2,91 (m, 4H), 2,63-2,54 (m, 1H), 2,41-2,19 (m, 3H), 2,03-1,94 (m, 4H), 1,84-1,78 (m, 2H), 1,63-1,22 (m, 14H), 1,03-0,82 (m, 15H) ppm.
HPLC Anal.: 96,9%. Tempo de reten- ção: 8,10 min (método B). Exemplo 2c (2R)-2-Amino-N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(carbamoilamino)-1-[(4-{[({2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6- propil-5,7-dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8- il]-2-oxoetoxi}carbonil)oxi]metil}fenil)carbamoil]butil]carbamoil}-2- metilpropil]-6-[2-(ciclo-oct-2-in-1-iloxi)acetamido]hexanamida (7)
ESI m/z: 565 (M/2 + H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 10,17-10,00
(m, 1H), 8,47-7,73 (m, 2H), 7,69-7,57 (m, 3H), 7,38-7,26 (m, 3H), 6,17 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 5,99 (s, 1H), 5,92 (s, 1H), 5,76 (s, 1H), 5,42 (s, 2H), 5,23-5,01 (m, 4H), 4,88-4,61 (m, 3,4H), 4,43-4,16 (m, 4,6H), 3,85 (d, J = 14,7 Hz, 1H), 3,73 (d, J = 14,5 Hz, 1H), 3,23-3,18 (m, 1H), 3,09- 2,90 (m, 4H), 2,33-2,18 (m, 3H), 2,18-2,04 (m, 3H), 2,03-1,66 (m, 10H), 1,64-1,50 (m, 7H), 1,49-1,22 (m, 13H), 1,17-0,90 (m, 4H), 0,90-0,79 (m, 12H) ppm. (2R)-2-Amino-N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(carbamoilamino)-1-[(4-{[({2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6- propil-5,7-dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8- il]-2-oxoetoxi}carbonil)oxi]metil}fenil)carbamoil]butil]carbamoil}-2- metilpropil]-6-[2-({1-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-tri-hidroxi-6- (hidroximetil)oxan-2-il]-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-ciclo- octa[d][1,2,3]triazol-4-il}oxi)acetamido]hexanamida (9)
[00701] Depois da filtragem, a solução resultante de 9 foi usada di- retamente para a etapa seguinte. ESI m/z: 667 (M/2 + H)+ N-[(1R)-1-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(Carbamoilamino)-1-[(4-{[({2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo- 6‐propil-5,7-dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8- il]-2-oxoetoxi}carbonil)oxi]metil}fenil)carbamoil]butil]carbamoil}-2- metilpropil]carbamoil}-5-[2-({1-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-tri-hidroxi- 6-(hidroximetil)oxan-2-il]-4H,5H,6H,7H,8H,9H-ciclo- octa[d][1,2,3]triazol-4-il}oxi)acetamido]pentil]-1-(2,5-dioxopirrol-1-
il)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida (Mc-PEG4-N(açúcar- COT)Lys-vc-PAB-Budesonida) (2c)
ESI m/z: 831 (M/2 + H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 9,73 (s, 1H), 8,21-8,07 (m, 3H), 7,94-7,82 (m, 1H), 7,71-7,59 (m, 3H), 7,39-7,26 (m, 4H), 7,02 (s, 1H), 6,17 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 6,09-5,98 (m, 1H), 5,92 (s, 1H), 5,56-5,28 (m, 4H), 5,25-5,01 (m, 4H),4,90-4,62 (m, 5H), 4,39-4,13 (m, 5H), 3,84-3,69 (m, 4H), 3,59-3,40 (m, 16H), 3,17-2,79 (m, 9H), 2,43-1,71 (m, 13H), 1,71-1,42 (m, 15H), 1,40-1,19 (m, 11H), 1,04-0,77 (m, 15H) ppm.
HPLC Anal.: 97,6%. Tempo de retenção: 7,63 min (mé- todo A). Exemplo 2d (2R)-2-Amino-N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(carbamoilamino)-1-[(4-{[({2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6- propil-5,7-dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8- il]-2-oxoetoxi}carbonil)oxi]metil}fenil)carbamoil]butil]carbamoil}-2- metilpropil]-N'-[(2S)-2-[(4R,5R)-5-[(4R)-2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4- il]-2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-il]-2-hidroxietil]pentanodiamida (10)
[00702] Seguindo o procedimento geral C, o composto 10 (13 mg, 5% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 605 (M/2 + H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 10,08 (s, 1H), 8,34-8,17 (m, 1H), 7,98 (s, 1H), 7,93-7,81 (m, 1H), 7,62 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,42-7,26 (m, 3H), 6,17 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 5,99 (s, 1H), 5,92 (s, 1H), 5,76 (s, 1H), 5,42 (s, 2H), 5,23-5,01 (m, 4H), 4,91-4,61 (m, 4H), 4,43-4,20 (m, 3H), 4,10-3,72 (m, 6H), 3,60-3,54 (m, 1H), 3,24-3,09 (m, 2H), 3,07-2,91 (m, 2H), 2,32-2,25 (m, 1H), 2,22-2,10 (m, 2H), 2,04-1,93 (m, 2H), 1,88- 1,67 (m, 5H), 1,64-1,22 (m, 27H), 1,17-0,93 (m, 3H), 0,91-0,81 (m, 12H) ppm. (2R)-2-Amino-N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(carbamoilamino)-1-[(4-{[({2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6- propil-5,7-dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8- il]-2-oxoetoxi}carbonil)oxi]metil}fenil)carbamoil]butil]carbamoil}-2- metilpropil]-N'-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6- pentaidroxiexil]pentanodiamida (10A)
[00703] A uma mistura de composto 10 (13 mg, 11 µmol) em DCM (1 mL) foi adicionado TFA (1 mL) em gotas. A mistura foi agitada em RT por uma hora, o que foi monitorado através de LCMS. Os voláteis foram removidos in vacuo para dar produto de desproteção bruto 10A (13 mg) como um óleo amarelo claro, que foi usado para a etapa se- guinte sem purificação adicional. ESI m/z: 565 (M/2 + H)+. (2R)-N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(Carbamoilamino)-1-[(4-{[({2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-
propil-5,7-dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8- il]-2-oxoetoxi}carbonil)oxi]metil}fenil)carbamoil]butil]carbamoil}-2- metilpropil]-2-[1-(2,5-dioxopirrol-1-il)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan- 15-amido]-N'-[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6- pentaidroxiexil]pentanodiamida (2d)
[00704] Seguindo o procedimento geral A, o composto título2d (3,5 mg, 1% de rendimento total a partir de 4a) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 829,7 (M/2 + H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 10,10 (s, 0,25H), 9,79 (s, 0,75H), 8,22 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 8,12 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 8,07 (d, J = 7,8 Hz, 1H),7,79-7,71 (m, 1H), 7,69-7,60 (m, 2H), 7,38-7,27 (m, 4H), 7,02 (d, J = 1,4 Hz, 2H), 6,17 (dt, J = 7,6, 1,6 Hz, 1H), 6,03-5,97 (m, 1H), 5,92 (s, 1H), 5,46-5,40 (m, 2H), 5,35-5,02 (m, 4H), 4,89-4,61 (m, 4H), 4,50-4,45 (m, 1H), 4,40-4,16 (m, 7H), 3,65- 3,37 (m, 21H), 3,07-2,90 (m, 3H), 2,44-2,23 (m, 4H), 2,17-1,93 (m, 6H), 1,90-1,71 (m, 4H), 1,62-1,20 (m, 15H), 1,06-0,76 (m, 15H) ppm. HPLC Anal.: >99%. Tempo de retenção: 6,40 min (método A). Esquema 3. Síntese de 2e
Legenda: "durante a noite" Exemplo 2e N-[(4-Aminofenil)metil]carbamato de 2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-Hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6- propil-5,7-dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8- il]-2-oxoetila (13)
[00705] A uma solução de 4-aminobenzilamina (9,7 mg, 79 µmol) e DIPEA (12 mg, 93 µmol) em THF (10 mL) foi adicionada uma solução de 3a (24 mg, 44 µmol) em THF (5,0 mL) em gotas em RT. A mistura foi agitada em RT por 3 horas até 3a ter sido totalmente consumido, o que foi monitorado através de LCMS. Os voláteis foram removidos in vacuo e resíduo foi purificado através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto 13 (5,6 mg, Rendimento 22%) como um sólido branco. ESI m/z: 579,2 (M + H)+. 1H RMN (400 MHz, MeODd4) δ 7,48- 7,45 (m, 3H), 7,31-7,28 (m, 2H), 6,27-6,24 (m, 1H), 6,02 (s, 1H), 5,22 (m, 1H), 5,12-5,11 ( m, 1 H), 4,96 (m, 1 H), 4,86-4,81 (m, 2 H), 4,66 (m, 1 H), 4,44-4,35 (m, 3 H), 2,66-2,65 (m, 1H), 2,40-2,36 (m, 1 H), 2,15- 2,10 (m, 2 H), 1,97-1,60 (m, 6H), 1,53-1,36 (m, 6H), 1,09-0,92 (m, 7H) ppm.
N-({4-[(2S)-5-(Carbamoilamino)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro- 1H-pirrol-1-il)hexanamido]-3- metilbutanamido]pentanamido]fenil}metil)carbamato de 2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-Hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6- propil-5,7-dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8- il]-2-oxoetila (2e)
[00706] A uma mistura de MC-VC-OH 5f (WO2014/191578 A1) (5,7 mg, 12 µmol) em DMF seco (1,5 mL) foram adicionados HATU (4,6 mg, 12 µmol) e NMM (4,0 mg, 40 µmol) em RT. A mistura foi agitada em RT por 10 minutos antes do composto 13 (4,7 mg, 8,1 µmol) ter sido adicionado à mistura de reação. A mistura resultante foi agitada em RT de um dia para o outro. Composto 13 foi totalmente consumido e o produto desejado foi detectado como produto principal de acordo com LCMS. A mistura foi purificada diretamente através de HPLC pre- parativa para dar o composto título 2e (2,9 mg, Rendimento 35%) co- mo um sólido branco. ES m/z: 1029,1 (M + H)+, 514,7 (M/2 + H)+. HPLC Anal.: >99%. Tempo de retenção: 7,54 min (método A). Esquema 4. Síntese de ligador-espaçador-budesonida (por meio de éster) 2f e 2g
# Comp R 2f MC 2g DIBAC-suc-PEG4 Exemplo 2f 4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-Hidroxi-9,13-dimetil-16- oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17- dien-8-il]-2-oxoetil} butanodioato de 1-{4-[(2S)-5-(carbamoilamino)- 2-[(2S)-2-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido]-3- metilbutanamido]pentanamido]fenil}metila (2f)
[00707] A uma solução de 1c (20 mg, 38 µmol) em DMF (2 mL) fo- ram adicionados MC-VCPAB (12b, 0,11 g, 0,19 mmol), TBTU (63 mg, 0,19 mmol), HOBt (26 mg, 0,19 mmol) e DIPEA (41 mg, 0,19 mmol) em RT. A mistura resultante foi agitada a 70 oC por 12 horas. Produto 2f não foi mais formado, o que foi monitorado através de LCMS. A mis- tura de reação foi purificada diretamente através de HPLC preparativa (método A) para dar o composto título 2f (2,6 mg, Rendimento 6%)
como um sólido branco. ESI m/z: 1085,3 (M + H)+. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 7,55-7,52 (m, 1H), 7,34-7,30 (m,1H), 6,67 (br s, 1H), 6,30- 6,27 (m, 1H), 6,03 (br s, 1H), 5,16-5,11 (m, 2H), 5,09-4,87 (m, 2H), 4,80-4,61 (m, 1H), 4,60-4,30 (m, 2H), 3,47-3,44 (m, 1H), 3,21-3,10 (m, 1H), 3,03-2,96 (m, 2H), 2,79-2,55 (m, 4H), 2,35-1,73 (m, 28H), 1,71- 1,32 (m, 15H), 1,29-1,07 (m, 4H), 0,99-0,85 (m, 9H) ppm. Exemplo 2g 4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-Hidroxi-9,13-dimetil-16- oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17- dien-8-il]-2-oxoetil} butanodioato de 1-{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2- azatriciclo[10,4,0,0⁴,⁹]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2- il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido]-3- metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (2g)
[00708] Seguindo os procedimentos do exemplo 2f exceto pela substituição de 12b por DIBAC-suc-PEG4-vc-PAB (12c), o composto título 2g (15 mg, Rendimento 19%) como um sólido branco. ESI m/z: 714 (M/2 + H)+. 1H RMN (500 MHz, MeODd4) δ 7,67-7,60 (m, 4H), 7,48-7,46 (m, 4H), 7,38-7,32 (m, 4H), 7,26 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 6,27 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 6,03 (s, 1H), 5,24-5,10 (m, 4H), 5,02-4,97 (m, 1H), 4,85-4,66 (m, 2H), 4,61 (s, 1H), 4,53 (dd, J = 9,1, 4,9 Hz, 1H), 4,45- 4,43 (m, 1H), 4,22 (dd, J = 6,7, 4,7 Hz, 1H), 3,78-3,69 (m, 3H), 3,60- 3,55 (m, 11H), 3,47-3,40 (m, 2H), 3,26-3,10 (m, 4H), 2,78-2,54 (m, 8H), 2,41-2,35 (m, 2H), 2,25-2,11 (m, 4H), 2,02-1,31 (m, 17H), 1,21-0,92 (m, 14H) ppm. HPLC Anal.: 99,5%. Tempo de retenção: 7,86 min (mé-
todo B). Esquema 5. Síntese de ligante-espaçador-budesonida 2j-2n (por meio de amida ou carbamato) Legenda: "durante a noite", "NHS heptanoico-MAL", "ou", "piperidina", "então", "ácido BCN-PEG4 (5d)
[00709] No Esquema 5, Bud se refere à budesonida.
[00710] A maior parte dos Ligadores Budesonida(2) tendo porção VC-PAB foi sintetizada a partir de três abordagens por meio de amida ou carbamato (Esquema 5). Os compostos 1d, 1e foram separada- mente conjugados com ligadores através de acoplamento amida para dar amida ou carbamato (Esquema 5). Na tabela abaixo estão deta- lhes adicionais. No Rq1 em, 2j, 2k, 2l, 2m, 2n n em 2j-n Rq-NH- Comp Espaçador- Budesonida 2j 1 1e
No Rq1 em, 2j, 2k, 2l, 2m, 2n n em 2j-n Rq-NH- Comp Espaçador- Budesonida 2k 1 1d
2l 1 1d
2m 1 1d
2n 1 1d
Intermediário 4c N-(2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-Amino-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilami- no)pentanamido]fenil}metoxi)carbonil](metil)amino}etil)-N- metilcarbamato de 2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi- 9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (4c)
[00711] A uma solução de composto 1d (40 mg, 73 µmol) em DMF (3 mL) foram adicionados Fmoc-vcPAB-PNP (11d, 60 mg, 78 µmol), DMAP (9,0 mg, 74 µmol) e DIPEA (20 mg, 0,16 mmol) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 3 horas até a maior parte dos materiais de partida terem sido consumidos, o que foi monitorado através de LCMS. À mistura de reação foi então adicionada piperidina (1 mL). Depois de ser agitada em temperatura ambiente por uma hora até a reação de-Fmoc ter sido terminada, o que foi monitorado através de LCMS, a mistura de reação foi purifica- da diretamente através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto 4c (9,0 mg, Rendimento 13%, o 2º pico em LC) como um sólido branco. ESI m/z: 951 (M + H)+, 973 (M + Na)+. Exemplo 2j N-({N'-[({4-[(2S)-5-(carbamoilamino)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido]-3- metilbutanami- do]pentanamido]fenil}metoxi)carbonil]hidrazinocarbonil}metil)car bamato de 2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-Hidroxi-9,13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (2j)
[00712] ESI m/z: 1144,3 (M + H)+. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 10,02 (s, 1H), 9,77 (s, 1H), 9,18 (s, 1H), 8,12 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 7,83 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,73-7,70 (m, 1H), 7,61-7,59 (m, 2H), 7,32-7,29 (m,
3H), 7,01 (s, 2H), 6,19-6,16 (m, 1H), 6,00-5,92 (m, 2H), 5,05-5,00 (m, 2H), 4,95-4,85 (m, 2H), 4,71-4,62 (m, 2H), 4,40-4,17 (m, 3H), 3,71-3,58 (m, 2H), 3,45-3,39 (m, 2H), 3,06-2,89 (m, 3H), 2,33-2,28 (m, 2H), 2,20- 2,07 (m, 3H), 2,02-1,91 (m, 3H), 1,81-1,75 (m, 2H), 1,75-1,62 (m, 2H), 1,60-1,44 (m, 11H), 1,42-1,20 (m, 6H), 1,19-1,12 (m, 4H), 1,00-0,92 (m, 2H), 0,88-0,81 (m, 10H) ppm. Exemplo 2k N-(2-{[({4-[(2S)-5-(Carbamoilamino)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-dioxo-2,5-di- hidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido]-3- metilbutanami- do]pentanamido]fenil}metoxi)carbonil](metil)amino}etil)-N- metilcarbamato de 2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi- 9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (2k-A e 2k-B)
[00713] Seguindo o procedimento geral D, os compostos títulos 2k- A (3,3 mg, Rendimento 10%, o segundo pico em LC) e 2k-B (4,1 mg, Rendimento 12%, o primeiro pico em LC) como diastereômeros foram obtidos como sólidos brancos. 2k-A: ESI m/z: 1143,4 (M + H)+. Tempo de retenção: 1,70 min (método A). 2k-B : ESI m/z: 1143,4 (M + H)+. Tempo de retenção: 1,65 min (méto- do A). Exemplo 2l
N-(14-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(Carbamoilamino)-1-[(4-{[({2-[({2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6- propil-5,7-dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8- il]-2- oxoeto- xi}carbonil)(metil)amino]etil}(metil)carbamoil)oxi]metil}fenil)carba moil]butil]carbamoil}-2-metilpropil]carbamoil}-3,6,9,12- tetraoxatetradecan-1-il)carbamato de biciclo[6,1,0]non-4-in-9- ilmetila (2l)
[00714] ESI m/z: 687,5 (M/2 + H)+, 1396,8 (M + Na)+ (50%), 1H RMN (500 MHz, MeODd4) δ 7,66 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,50 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 7,36 (d, J = 7,0 Hz, 2H), 6,28 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 6,04 (s, 1H), 5,15-5,05 (m, 2H), 4,87-4,62 (m, 4H), 4,53(s, 1H), 4,46(s, 1H), 4,21 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 4,16 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 3,83-3,72 (m, 2H), 3,66-3,60 (m, 12H), 3,56-3,52 (m, 3H), 3,49-3,42 (m, 1H), 3,30 (s, 3H), 3,25-3,09 (m, 3H), 3,02-2,96 (m, 4H), 2,87 (dd, J = 16,6, 4,8 Hz, 2H), 2,72-2,64 (m, 1H), 2,58 (t, J = 6,0 Hz, 2H), 2,40 (d, J = 13,1 Hz, 1H), 2,31-2,10 (m, 9H), 2,01-1,91 (m, 3H), 1,81-1,70 (m, 2H), 1,63 (s, 7H), 1,51 (s, 3H), 1,48-1,30 (m, 4H), 1,11 (s, 1H), 1,02-0,91 (m, 15H) ppm. HPLC Anal.: > 99,9%. Tempo de retenção: 9,40 min (método A). Exemplo 2m N-(2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-6-(4-{2- Azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in- 2-il}-4-oxobutanamido)-2-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanamido]hexanamido]-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metoxi)carbonil](metil) ami-
no}etil)-N-metilcarbamato de 2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11- hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (2m-precursor)
[00715] Seguindo o procedimento geral B, o composto bruto 2m- precursor (o precursor de 2m) (5 mg) foi obtido como óleo amarelo claro, que foi usado diretamente para a etapa seguinte. ESI m/z: 780 (M/2 + H)+ N-(2-{[({4-[(2S)-5-(Carbamoilamino)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[6-(2,5-dioxo- 2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido]-6-[4-(3- {[31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42-dodecaidroxi-10,15,20,25,30- pentacis(hidroximetil)-2,4,7,9,12,14,17,19,22,24,27,29- dodecaoxaeptaciclo[26,2,2,23,6,28,11,213,16,218,21,223,26]dotetracontan- 5-il]metil}-3,4,5,13-tetraazatetraciclo[13,4,0,02,6,07,12]nonadeca- 1(15),2(6),4,7(12),8,10,16,18-octaen-13-il)-4- oxobutanamido]hexanamido]-3- metilbutanamido]pentanamido]fenil}metoxi) carbo- nil](metil)amino}etil)-N-metilcarbamato de 2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6- propil-5,7-dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8- il]-2-oxoetila (2m)
[00716] A uma solução de 2m bruto (5 mg) em DMF (1 mL) foi adi- cionado CD-N3 (8b, 63 mg, 63 µmol). A mistura resultante foi agitada em RT por 72 horas, o que foi monitorado através de LCMS.
A mistura resultante foi diretamente purificada através de HPLC preparativa (mé- todo A) para dar o composto 2m (2 mg, 4% de rendimento de 4c) co- mo um sólido branco.
ESI m/z: 1278,8 (M/2 + H)+. HPLC Anal.: 97,9%. Tempo de retenção: 6,49 min (método A). Exemplo 2n N-(2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(4R)-4-Amino-4-[(2- azidoetil)carbamoil]butanamido]-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilami- no)pentanamido]fenil}metoxi)carbonil](metil)amino}etil)-N- metilcarbamato de 2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-Hidroxi- 9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (2n)
[00717] A mistura de reação foi então agitada em RT de um dia pa- ra o outro.
Composto 4c foi totalmente consumido de acordo com LCMS.
A mistura foi separada através de HPLC preparativa (método A) e pós liofilização, Fmoc-2n foi obtido (20 mg), que foi dissolvido em DMF (2 mL). À solução de DMF foi adicionada dietilamina (4 gotas, c.a. 0,08 mL). A mistura de reação foi agitada em RT por 2 horas até reação de de-Fmoc ter sido terminada, o que foi monitorado através de LCMS.
A mistura foi filtrada através de membrana de filtro e uma solu- ção foi purificada através de HPLC preparativa (método A) para dar o composto título 2n (10 mg, Rendimento 8,4%) como um sólido branco.
ESI m/z: 1147 (M + H)+. HPLC Anal.: 99,6%. Tempo de retenção: 5,67 min (método A); 7,72 min (método B). Esquema 6. Síntese de Ligador-Budesonida 2q (análogo de THP)
Legenda: "budesonida", "L-valina" Exemplo 2q 2-(((9H-Fluoren-9-il)metoxi)carbonilamino)-5-ureidopentanoato de (2S)-(3,4-di-hidro-2H-piran-2-il)metila (15)
[00718] A uma mistura de Fmoc-Cit-OH (14, 0,29 g, 0,73 mmol) em DMF (5 mL) foram adicionados DHP (0,10 mg, 0,88 mmol), TBTU (0,70 g, 2,2 mmol) e trietilamina (0,37 g, 3,7 mmol) em RT. A mistura resultante foi agitada em RT por 24 horas. 15% de massa desejada foram detectados através de LCMS. A reação foi arrefecida com água (30 mL) e extraída com acetato de etila (10 mL x 3). A solução orgâni- ca combinada foi lavada com água e salmoura, seca em sulfato de só- dio e concentrada in vacuo. O produto bruto foi purificado através de cromatografia flash de fase reversa (acetonitrila 0-100% em água) pa- ra dar o composto título 15 (110 mg, Rendimento 30%) como óleo in- color. ESI m/z: 494 (M + H)+. (2S)-2-Amino-5-(carbamoilamino)pentanoato de (6-{2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-Hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6- propil-5,7-dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8- il]-2-oxoetoxi}oxan-2-il)metila (16)
[00719] A uma solução de composto 15 (80 mg, 0,16 mmol) em DCM anidro (3 mL) foi adicionada uma solução de budesonida (1a, 70 mg, 0,16 mmol) e ácido p-toluenossulfônico (42 mg, 0,24 mmol) em DCM anidro (2 mL) com seringa sob proteção de balão de argônio em RT. A mistura de reação foi agitada a 30 oC sob balão de argônio por 12 horas. A maior parte do composto 15 foi consumida de acordo com LCMS. A mistura de reação foi esfriada para RT e à mistura de reação foi adicionada dietilamina (1 mL). A mistura de reação foi agitada em RT por 1 hora até reação de de-Fmoc ter sido terminada, o que foi monitorado através de LCMS. Os voláteis foram removidos in vacuo e o resíduo foi purificado através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto título 16(17 mg, Rendimento 31%) como um sólido branco. ESI m/z: 702 (M + H)+. Ácido (S)-2-(6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido)-3- metilbutanoico (5i)
[00720] A uma solução de L-valina (0,12 g, 1,0 mmol) em DMF ani- dro (2 mL) foram adicionados composto 5a (0,31 g, 1,0 mmol) e trieti- lamina (0,51 g, 5,0 mmol) em RT. A mistura de reação foi agitada em RT por 8 horas até o composto 5a ter sido totalmente consumido, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura de reação foi filtrada através de membrana de filtragem e o filtrado foi diretamente purifica- do através de HPLC preparativa (método A) para dar o composto título
5i (0,14 g, Rendimento 46%) como óleo incolor. ESI m/z: 311 (M + H)+. (2S)-5-(Carbamoilamino)-2-[(2S)-2-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)hexanamido]-3-metilbutanamido]pentanoato de 6-{2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6- propil-5,7-dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8- il]-2-oxoetoxi}oxan-2-il)metila (2q)
[00721] A uma solução de composto 5i (5,8 mg, 19 µmol) em DMF (1 mL) foram adicionados HATU (10 mg, 26 µmol) e DIPEA (6,6 mg, 51 µmol) em RT. A mistura foi agitada em RT por 15 minutos e à solu- ção foi então adicionado composto 16 (12 mg, 17 µmol) em RT. A mis- tura resultante foi agitada em RT por 4 horas até composto 5i ter sido totalmente consumido, o que foi monitorado através de LCMS. A mis- tura de reação foi então filtrada através de membrana de filtragem e o filtrado foi diretamente purificado através de HPLC preparativa (méto- do A) duas vezes para dar o composto título 2q (2 mg, Rendimento 12%) como um sólido branco. ESI m/z: 995,3 (M + H)+. HPLC Anal.: 83,5%. Tempo de retenção: 10,36 min (método B). Esquema 7. Síntese de ligador-fosfato-budesonida 2r e 2s
[00722] Fosfato-budesonidas foram acoplados com BCN-PNP (11c) para dar BCN-fosfato-Budesonidas (composto 2r e 2s) (esquema 7). Exemplo 2r
Ácido {2-[({Biciclo[6,1,0]non-4-in-9- ilmetoxi}carbonil)amino]etoxi}({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)- 11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetoxi})fosfínico (2r)
[00723] Seguindo o procedimento geral D, composto 2r (40 mg, 61% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 730 (M + H)+. 1H RMN (500 MHz, MeODd4) δ 7,49 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 6,29-6,26 (m, 1H), 6,03 (s, 1H), 5,23-5,16 (m, 1H), 4,88-4,64 (m, 3H), 4,45 (dd, J = 8,0, 3,1 Hz, 1H), 4,23-4,13 (m, 2H), 3,97 (dd, J = 11,9, 5,7 Hz, 2H), 3,36 (t, J = 4,7 Hz, 2H), 2,67 (td, J = 13,4, 5,3 Hz, 1H), 2,40 (d, J = 9,6 Hz, 1H), 2,30-1,34 (m, 23H), 1,21-0,92 (m, 10H) ppm. HPLC Anal.: > 99,9%. Tempo de retenção: 5,26 min (método B). Exemplo 2s Ácido {2-[({biciclo[6,1,0]non-4-in-9- ilmetoxi}carbonil)amino]etoxi}({[hidroxi({2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6- propil-5,7-dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8- il]-2-oxoetoxi})fosforil]oxi})fosfínico (2s)
[00724] ESI m/z: 810 (M + H)+. 1H RMN (500 MHz, MeODd4) δ 7,51 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 6,28 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 6,03 (s, 1H), 5,22-5,16 (m, 1H), 4,98-4,66 (m, 3H), 4,46 (s, 1H), 4,12 (dt, J = 45,0, 13,0 Hz,
4H), 3,39 (t, J = 11,9 Hz, 2H), 2,67 (dd, J = 13,3, 8,0 Hz, 1H), 2,40 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 2,30-1,32 (m, 23H), 1,22-0,92 (m, 10H) ppm.
HPLC Anal.: > 99,9%. Tempo de retenção: 4,03 min (método B). Procedimentos experimentais para Intermediários Tabela 4. Intermediários-chave e materiais de partida Estruturas Nº Referências ou Sín- Intermediário teses 1a (budesoni- Comercialmente dis- da) ponível (51333-22-3)
4a (vcPAB- Vide esquema 2 budesonida)
4c (vcPAB-1d) Vide esquema 5
5a (mc-NHS) Comercialmente dis- ponível (55750-63-5)
5b (MAL- Comercialmente dis- PEG4-NHS) ponível (1325208-25-0)
5c Comercialmente dis- (DIBAC-suc- ponível PEG4-acid) (1537170-85-6)
5d (BCN- Comercialmente dis- PEG4-acid) ponível (1421932-54-8)
Estruturas Nº Referências ou Sín- Intermediário teses 5e Esquema 8
5f WO2014/191578 A1 (mc-Val-Cit- OH)
5g (DIBAC- Esquema 9 suc-PEG4-Val- Cit-OH)
5h Esquema 10
5i Vide esquema 6
6a Esquema 11
6b J.
Org.
Chem. 2010, 75, 3685-3691
Estruturas Nº Referências ou Sín- Intermediário teses 8a Comercialmente dis- ponível (35899-89-9)
8b Synth.
Commun., 2002, 32(21), 3367- 3372 J.
Am.
Chem.
Soc., 2012, 134(46), 19108-19117 J.
Med.
Chem., 1997, 40(17), 2755-2761 J.
Am.
Chem.
Soc., 1993, 115(12), 5035- 5040 11a (MC-VC- Comercialmente dis- PAB-PNP) ponível (159857-81-5) WO2014/191578 A1
11b (DIBAC- Esquema 12 suc-PEG4-vc- PAB-PNP)
11c (BCN- WO2013/181697A1 PNP) Angew.
Chem.
Int.
Ed., 2010, 49 (49), 9422-9425 11d (Fmoc-vc- Comercialmente dis- PAB-PNP) ponível 863971-53-3
12a (Boc-vc- Comercialmente dis- PAB) ponível (870487-09-5) WO2008/34124 A2
Estruturas Nº Referências ou Sín- Intermediário teses 12b (MC-VC- Comercialmente dis- PAB) ponível 159857-80-4 12c (DIBAC- Esquema 12 suc-PEG4-vc- PAB) Esquema 8. Síntese de 5e Ácido (2R)-6-(4-{2-Azatriciclo[10,4,0,0⁴,⁹]hexadeca- 1(12),4,6,8,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-2-[6-(2,5- dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)hexanamido]hexanoico (5e)
[00725] A uma mistura de H-D-Lys(Boc)-OH (17, 0,25 g, 1,0 mmol) em DMF (10 mL) foram adicionados ácido 6-maleimidocaproico-NHS (5a, 0,31 g, 1,0 mmol) e di-isopropiletilamina (DIPEA, 0,26 g, 2,0 mmol) em RT. Depois da reação ter sido agitada em RT de um dia pa- ra o outro, composto 5a foi totalmente consumido. A mistura foi sepa-
rada diretamente através de cromatografia flash de fase reversa (ace- tonitrila 0-100% em água (0,05% TFA)) para dar intermediário Boc-18 (ESI m/z: 440 (M + H)+) como óleo incolor, que foi dissolvido em DCM (5 mL). À solução foi adicionado TFA (0,5 mL) em gotas a 0 oC e a mistura foi agitada em RT por uma hora.
A reação foi monitorada atra- vés de LCMS e intermediário Boc-18 foi totalmente consumido.
Os voláteis foram removidos in vacuo para dar 18 bruto (ESI m/z: 340 (M/2 + H)+), que foi usado para a etapa seguinte sem purificação adici- onal.
À mistura de composto bruto 18 (0,21 g, 0,62 mmol) em DMF (5 mL) foram adicionados éster ativado 19 (0,20 g, 0,50 mmol) e DIPEA (50 mg, 0,39 mmol) em RT.
Depois da mistura de reação ter sido agi- tada em RT de um dia para o outro, composto 19 foi totalmente con- sumido, o que foi monitorado através de LCMS.
A mistura de reação foi então separada diretamente através de cromatografia flash de fase reversa (acetonitrila 0-100% em água) para dar o composto título 5e (0,10 g, 20% de rendimento em 3 etapas a partir de 5a) como um sóli- do branco.
ESI m/z: 627 (M + H)+. 1H RMN (DMSOd6, 400 MHz): δ 7,89 (d, J = 13,2 Hz, 1H), 7,69-7,62 (m, 3H), 7,48-7,47 (m, 3H), 7,36-7,28 (m, 3H), 6,99 (s, 2H), 5,03 (d, J = 13,6 Hz, 1H), 4,09-4,04 (m, 1H), 3,60 (d, J = 13,6 Hz, 1H), 3,38-3,34 (m, 1H), 2,90-2,87 (m, 2H), 2,61-2,55 (m, 1H), 2,25-2,17 (m, 1H), 2,08-1,51 (m, 5H), 1,46-1,15 (m, 12H) ppm.
Esquema 9. Síntese de 5g
Ácido (2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-Azatriciclo[10,4,0,0⁴,⁹]hexadeca- 1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-amido]-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanoico (5g)
[00726] A uma solução de composto 5c (0,30 g, 0,54 mmol) em DMF (10 mL) foram adicionados HATU (0,31 g, 0,81 mmol) e DIPEA (0,14 g, 1,1 mmol) em RT. A mistura foi agitada em RT por 15 minutos. À solução de reação foi adicionado Val-Cit-OH (20 (CAS# 159858-33- 0), 0,21 g, 0,76 mmol) em RT e a mistura resultante foi agitada em RT por 3 horas até a maior parte dos materiais ter sido consumida, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura de reação foi filtrada atra- vés de membrana de filtragem e o filtrado foi purificado diretamente através de cromatografia flash de fase reversa (acetonitrila 0-100% em água (com 10 mmol/L de bicarbonato de amônio)) para dar intermediá- rio título 5g (0,25 g, Rendimento 57%) como um sólido branco. ESI m/z: 809,5 (M + H)+. Esquema 10. Síntese de intermediários 5h (4R)-4-[(2-Azidoetil)carbamoil]-4-{[(9H-fluoren-9- ilmetoxi)carbonil]amino}butanoato de terc-butila (22)
[00727] A uma mistura de Fmoc-D-Glu(OTBU)-OH (21, (104091-08- 9), 0,30 g, 0,71 mmol) e 2-azidoetanamina (87156-40-9, 73 mg, 0,85 mmol) em DCM (50 mL) foram adicionados HATU (0,41 g, 1,1 mmol) e trietilamina (0,3 mL) em RT. A mistura de reação foi agitada em RT de um dia para o outro. A maior parte do composto 21 foi então consumi- da de acordo com TLC e LCMS. Depois da mistura de reação ter sido arrefecida com água (50 mL) em RT, a solução orgânica foi lavada com água e salmoura, seca em sulfato de sódio e concentrada in va- cuo. O resíduo foi purificado através de TLC preparativa (sílica gel, eluindo com éter de petróleo / acetato de etila (v/v = 1)) para dar o composto título 22 (0,30 g, Rendimento 76%) como óleo viscoso ama- relo. ESI m/z: 494 (M + H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6): δ 8,09 (m, 1H), 7,84-7,90 (m, 4H), 7,33-7,44 (m, 4H), 6,28 (s, 2H), 3,35 (m, 6H), 3,26 (m, 1H), 2,50 (m, 2H), 2,25 (m, 1H), 1,80 (m, 1H), 1,39 (s, 9H) ppm. Ácido (4R)-4-[(2-azidoetil)carbamoil]-4-{[(9H-fluoren-9- ilmetoxi)carbonil]amino}butanoico (5h)
[00728] A mistura resultante foi agitada em RT por 2 horas até composto 22 ter sido totalmente consumido, o que foi monitorado atra- vés de TLC e LCMS. Os voláteis foram removidos in vacuo para dar o composto bruto 5h (17 mg, Rendimento 96%) como óleo amarelo, que foi usado para a etapa seguinte sem purificação adicional. ESI m/z: 438 (M + H)+. Esquema 11. Síntese de Intermediários 6a Ácido (2R)-6-[2-(Ciclo-oct-2-in-1-iloxi)acetamido]-2-{[(9H-fluoren-9- ilmetoxi)carbonil]amino}hexanoico (6a)
[00729] A uma mistura de composto comercial 23 (65 mg, 0,23 mmol, CAS: 1425803-45-7) em DMF (2 mL) foram adicionados Fmoc- D-Lys-OH (85 mg, 0,23 mmol) e trietilamina (52 mg, 0,51 mmol). A mistura de reação foi agitada em RT por 30 minutos.
A mistura foi se- parada diretamente através de cromatografia flash de fase reversa (acetonitrila 0-100% em água (0,05% TFA)) para dar intermediário 6a (85 mg, Rendimento 70%) como um sólido branco.
ESI m/z: 533 (M + H)+. 1H RMN (MeODd4, 500 MHz): δ 7,70 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,59 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 7,30 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 7,22 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 4,35- 4,22 (m, 2H), 4,22-4,09 (m, 2H), 4,09-3,99 (m, 1H), 3,94-3,81 (m, 1H), 3,79-3,67 (m, 1H), 3,15 (t, J = 6,9 Hz, 2H), 2,17-1,96 (m, 3H), 1,96- 1,86 (m, 1H), 1,85-1,66 (m, 4H), 1,66-1,41 (m, 5H), 1,41-1,25 (m, 3H) ppm.
Esquema 12. Síntese de intermediários 11b e 12c
1-(4-{2-Azatriciclo[10,4,0,0⁴,⁹]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen- 10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(carbamoilamino)- 1-{[4-(hidroximetil)fenil]carbamoil}butil]carbamoil}-2-metilpropil]- 3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida (12c)
[00730] A mistura foi agitada em RT por 15 minutos. à solução de reação foi adicionado vc-PAB (24 (159857-79-1), 0,21 g, 0,54 mmol) em RT e a mistura resultante foi agitada em RT por 3 horas até a mai- or parte dos materiais ter sido consumida, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura de reação foi filtrada através de membrana de fil- tragem e o filtrado foi purificado diretamente através de cromatografia flash de fase reversa (acetonitrila 0-100% em água (com 10 mmol/L de bicarbonato de amônio)) para dar intermediário título 12c (0,30 g, Rendimento 60%) como um sólido branco. ESI m/z: 617 (M + H)+. 4-Nitrofenil carbonato de {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2- Azatriciclo[10,4,0,0⁴,⁹]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2- il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido]-3- metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (11b)
[00731] A uma solução de composto 12c (0,15 g, 0,16 mmol) em DMF (10 mL) foram adicionados bis(4-nitrofenil) carbonato(0,15 g, 0,49 mmol) e DIPEA (63 mg, 0,49 mmol) a 0 oC. A mistura foi então agitada em RT por 3 horas até 12c ter sido consumido na maior parte, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura de reação foi filtrada atra- vés de membrana de filtragem e o filtrado foi purificado diretamente através de cromatografia flash de fase reversa (acetonitrila 0-100% em água (com 10 mmol/L de bicarbonato de amônio)) para dar intermediá-
rio título 11b (50 mg, Rendimento 28%) como um sólido branco. ESI m/z: 1079 (M + H)+.
[00732] A Tabela 5A abaixo apresenta ligador cargas úteis feitos usando os métodos descritos aqui. Tabela 5A. Exemplos de Ligador-Cargas úteis LP Carga Nome do Estruturas útil ligador 2a 1a MC-VC-
O H PAB O O O H H O O O O H N N O N N O H H H O HO O
O N NH 2
H 2b 1a DIBAC- O
O H
O H suc-vc-
H O O O O O H N O O N O N O O N N H H H H PAB O O HO O
NH O NH 2 2c 1a mc- O
O PEG4- O
H O H O O O O H N O O N N
O O N N H (açúcar- O O
H O H O O H
HO H COT)dLy HN O
N
H NH 2 s-vc-PAB O
O OH O N N N OH HO
OH 2d 1a mc-
O PEG4- O
O O H H O O O O
H H H (açú- O
N O O O O N N H O N N H O
O HO H car2)dGl O NH NH
HO O u-vc-PAB HO
OH H 2N O
OH
OH 2e 1a MC-VC-
O H PABA O O O H N O H O O H H N N O N N H H H O O HO O
NH O NH2
LP Carga Nome do Estruturas útil ligador
HH 2f 1c MC-VC- O O
H O O PAB N O O O O O O H OH H O O N N H N O H
NH O NH 2
HH 2g 1c DIBAC- O
H O
O O suc-vc- O H
O O O O O OH H N O O N O N O O N N H H H PAB O O
NH O NH 2 2j 1e MC-VC-
PAB O H O O O O N O O O N N O H H H H N N O O H N N O H H H O HO
NH O NH 2 O O NH 2 2k 1d MC-VC- NH
PAB O H O H N N O N N O H O H O O O N H O N O O O H HO O
H HH 2l 1d BCN- O
O O O H
N O PEG4- O
O N O O O O O N H N O N O N O O OH
H H H vc-PAB O
NH O NH 2
H HH 2m 1d mc- O
O O
O N5(CD- O H
N O H N O O N N O O O H OH N N N DIBAC- O O H O H
O N NH 2 suc)Lys- HN O
H HO
O OH vc-PAB O N HO
O OH OHO O OH O OH HO N O N N O OH OH HO O O HO OH OH OHO O HO O OH
LP Carga Nome do Estruturas útil ligador
H H H 2n 1d azidoetil- O
O
O GLu-vc- O
H O O N N O O O H
OH H 2N N O
N N PAB N3
N O H O H O
H N NH 2
H 2q 1g MC-VC H
HH O O O O O H H OH N N O O O N O O H O O
O N NH2
H
H 2r 1k BCN O
HH O O O O O O H O N P O OH H
OH 2s 1l BCN H
O O H O O H O P O O O N P OH H O O HO H HO
O Tabela 6A. Dados de Caracterização para Ligador-Cargas úteis LP cLog MF MW Pureza HPLC MS Pico m/z P HPLC RT (m/z) mais alto (%) (min) 100% 2a 4,18 C54H72N6O14 1029,2 92 7,6 (A) 1029 1029 (M+H) (M+H) 2b 5,42 C74H95N7O18 1370,6 97 8,1 (B) 685,8 685,8 (M/2+H) (M/2+H) 2c 1,03 C81H117N11O26 1660,9 97 7,0 (A) 830,8 830,8 (M/2+H) (M/2+H) 2d -1,87 C70H102N8O25 1455,6 100 6,48 (A) 728 1456 (M+H) (M/2+H) (10%) 2e 3,45 C54H73N7O13 1028,2 100 7,54 (A) 1028,3 1028,3 (M+H) (M+H) 2f 3,54 C57H76N6O15 1085,2 98 1,71 1085,3 1085,3 (LCMS) (M+H) (M+H)
LP cLog MF MW Pureza HPLC MS Pico m/z P HPLC RT (m/z) mais alto (%) (min) 100% 2g 4,77 C77H99N7O19 1426,7 > 99 7,86 (B) 714,0 1427 (M+H) (M/2+H) (15%) 2j 2,16 C57H77N9O16 1144,3 98 1,57 1144,3 1144,3 (LCMS) (M+H) (M+H) 2k 3,54 C59H82N8O15 1143,3 98 1,70 1143,4 1143,4 (LCMS) (M+H) (M+H) 2l 4,66 C71H104N8O19 1373,6 100 9,40 (A) 687,5 1396,8 (M/2+H) (M+Na) (50%) 2m -4,89 C120H166N14O47 2556,7 100 6,49 (A) 1278,8 1278,8 (M/2+H) (M/2+H) 2n 1,68 C56H82N12O14 1147,3 100 7,72 (B) 1147,5 1147,5 (M+H) (M+H) 2q 3,52 C52H75N5O14 994,2 79 10,36 995,3 995,3 (B) (M+H) (M+H) 2r 4,88 C38H52NO11P 729,8 100 5,26 (B) 686,2 1459,1 (massa (2M+H) fraca) 2s 0,55 C38H53NO14P2 809,8 100 4,03 (B) 766,1 810,1 (M-44) (M+H) (70%) Síntese de Ligador-cargas úteis LP1A-4A Esquema 101. Síntese de Carga útil 100, espaçador-carga útil 101a-d e ligador-cargas úteis LP1A-4A
Legenda: "durante a noite", acetonida fluoconolona", "piperidina", "pi- perazina-boc", "juntos", "formando piperazina" (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluor-11-hidroxi-8-(2- hidroxiacetil)-9,13-dimetil-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-16-ona (100)
[00733] A uma mistura de fluocinolona acetonida (10 g, 22 mmol) e sílica gel (100 g) em heptano (900 mL) foi adicionado butiraldeído (3,0 mL, 33 mmol) abaixo de 10 oC e a suspensão foi agitada a 10-20 oC por 30 minutos. À mistura foi adicionado ácido perclórico (70%, 7,6 mL, 91 mmol) em gotas a 0 oC. A mistura de reação foi então agitada em RT de um dia para o outro. A maior parte da fluocinolona acetonida foi consumida de acordo com TLC e LCMS. A mistura de reação foi diluída com éter de petróleo e arrefecida com carbonato de sódio aquoso saturado. A suspensão foi filtrada e o sólido foi lavado com DCM/metanol (v/v = 1:1). O filtrado combinado foi concentrado in va- cuo. O resíduo foi purificado através de cromatografia flash (0-1,5% metanol em DCM) para dar o composto 100 (8,0 g, Rendimento: 78%) como um sólido branco. ESI m/z: 467,1 (M + H)+. 1-[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluor-11-hidroxi- 9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetoxi}carbonil)oxi]pirrolidino-2,5-diona (101-1a)
[00734] A uma solução de composto 100 (0,47 g, 1,0 mmol) em DCM (20 mL) foram adicionados bis(2,5-dioxopirrolidin-1-il) carbonato (0,28 g, 1,1 mmol), trietilamina (0,40 g, 4,0 mmol) e DMAP (3,0 mg, cat.). A mistura de reação foi agitada em RT por 4 horas até composto 100 ter sido consumido, o que foi monitorado através de LCMS. A mis- tura de reação foi então diluída com DCM e lavada com água. A solu- ção orgânica foi seca em sulfato de sódio. Depois de ser filtrada, a so- lução foi concentrada in vacuo e o resíduo (101-1a bruto) foi usado para a etapa seguinte diretamente sem purificação. ESI m/z: 608,2 (M
+ H)+. (1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluor-11-hidroxi-9,13- dimetil-8-{2-[(4-nitrofenoxicarbonil)oxi]acetil}-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-16-ona (101- 1b)
[00735] Uma mistura de composto 100 (0,80 g, 1,7 mmol), bis(4- nitrofenil) carbonato (1,6 g, 5,2 mmol) e DIPEA (1,1 g, 8,6 mmol) em THF (20 mL) foi agitada em RT por 4 horas, o que foi monitorado atra- vés de LCMS. A mistura foi concentrada in vacuo. O produto bruto foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica gel (50% de acetato de etila em éter de petróleo) para dar o composto 101-1b (0,75 g, 69 % de rendimento) como óleo incolor. ESI m/z: 632 (M + H)+. Procedimento geral para o composto 101 Legenda: "piperazina", "juntos", "formando piperazina"
[00736] A uma solução de composto 101-1a ou 101-1b (bruto, cal- culado como 1,0 mmol) em DCM (20 mL) foram adicionados diamina 101-2 (a, b, c ou d) (1,1 mmol) e DMAP (0,1 mmol). A mistura de rea- ção foi agitada em RT por 4 horas antes de TFA (1 mL) ter sido adicio- nado. A mistura foi agitada em RT por meia hora (para R13 = Boc, a reação foi agitada até Boc ter sido totalmente removido, o que foi mo- nitorado através de LCMS). A mistura resultante foi concentrada in va- cuo e o resíduo foi purificado através de cromatografia flash de fase reversa (50-80% acetonitrila em TFA aq. (0,5%)) para dar o composto 101(a, b, c ou d) como óleo incolor. N-[2-(Metilamino)etil]carbamato de 2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluor-11-hidroxi-9,13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (101a)
[00737] Seguindo o procedimento geral e usando composto 101-1a com Boc-diamina 101-2a, composto 101a (0,38 g, 57% em 2 etapas, sal de TFA) foi obtido como óleo incolor. ESI m/z: 567 (M + H)+. N-Metil-N-[2-(metilamino)etil]carbamato de 2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluor-11-hidroxi-9,13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (101b)
[00738] Seguindo o procedimento geral e usando composto 101-1a com diamina 101-2b, composto 101b (0,45 g, 66% de rendimento em 2 etapas, sal de TFA) foi obtido como óleo incolor. ESI m/z: 581 (M + H)+.
N-etil-N-[2-(etilamino)etil]carbamato de 2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluor-11-hidroxi-9,13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (101c)
[00739] Seguindo o procedimento geral e usando composto 101-1b com diamina 101-2c, composto 101c (24 mg, 18% de rendimento em 2 etapas, sal de TFA) foi obtido como óleo incolor. ESI m/z: 609 (M + H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 8,38 (s, 2H), 7,30 (d, J = 10,5 Hz, 1H), 6,24 (dd, J = 10,5 Hz, 2,0 Hz, 1H), 6,11 (s, 1H), 5,70-5,54 (m, 2H), 5,10-4,91 (m, 1H), 4,85-4,65 (m, 3H), 4,25-4,16 (m, 1H), 3,60-3,40 (m, 2H), 3,33-3,20 (m, 4H), 3,20-2,90 (m, 4H), 2,67-2,53 (m, 1H), 2,30-2,20 (m, 1H), 2,10-2,00 (m, 2H), 1,80-1,70 (m, 1H), 1,64-1,51 (m, 4H), 1,49 (s, 3H), 1,40-1,30 (m, 2H), 1,20-1,10 (m, 4H), 1,10-1,00 (m, 1H), 0,90- 0,80 (m, 6H) ppm. Piperazino-1-carboxilato de 2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)- 12,19-Difluor-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (101d)
[00740] Seguindo o procedimento geral e usando composto 101-1b com piperazina (101-2d) sem tratamento com TFA e purificada através de cromatografia de coluna de sílica gel (metanol 0-10% em DCM), composto 101d (0,21 g, 49% de rendimento em 2 etapas, base livre) foi obtido como óleo incolor. ESI m/z: 579 (M + H)+. Procedimento Geral para o composto 101-3 Legenda: "piperazina", "juntos", "formando piperazina"
[00741] A uma solução de composto 101a, b ou d (0,20 mmol) em DMF (3 mL) foram adicionados Fmoc-VC-PAB-PNP 11d (0,17 g, 0,22 mmol), HOBT (41 mg, 0,30 mmol) e DIPEA (77 mg, 0,60 mmol). A mis- tura foi agitada em RT por 3 horas, o que foi monitorado através de LCMS. À mistura foi então adicionada piperidina (0,3 mL). A mistura de reação foi agitada em RT por uma hora até que Fmoc foi totalmente removido de acordo com LCMS. A mistura resultante foi diretamente purificada através de cromatografia flash de fase reversa (acetonitrila 50-80% em NH4HCO3 aq. (10 mM)) para dar o composto 101-3a, b ou d como um sólido branco. N-(2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-Amino-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilami-
no)pentanamido]fenil}metoxi)carbonil](metil)amino}etil)carbamato de 2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor-11-hidroxi- 9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (101-3a)
[00742] Seguindo o procedimento geral e usando composto 101a, composto 101-3a (0,11 g, 57% de rendimento) foi obtido como um só- lido branco. ESI m/z: 972 (M + H)+. N-Metil-N-[2-(metilamino)etil]carbamato de 2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor-11-hidroxi-9,13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (101-3b)
[00743] Seguindo o procedimento geral e usando composto 101b, composto 101-3b (0,13 g, 65% de rendimento) foi obtido como um só- lido branco. ESI m/z: 986 (M + H)+.
4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluor-11-hidroxi- 9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetil} piperazino-1,4-dicarboxilato de 1-{4-[(2S)-2-[(2S)-2-amino- 3-metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (101-3d)
[00744] Seguindo o procedimento geral e usando composto 101d (58 mg, 0,10 mmol), composto 101-3d (52 mg, 53% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 984 (M + H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 10,0 (s, 1H), 8,14 (d, J = 7,5 Hz, 1H),7,60 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,31 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,26 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,30 (dd, J = 1,5 Hz, 10,5 Hz, 1H), 6,11 (s, 1H), 6,02-5,88 (m, 1H), 5,70-5,50 (m, 2H), 5,42 (s, 2H), 5,20-4,92 (m, 3H), 4,80-4,62 (m, 3H), 4,50-4,45 (m, 1H), 4,25-4,15 (m, 1H), 3,50-3,35 (m, 8H), 3,05-2,90 (m, 3H), 2,70-2,54 (m, 2H), 2,32-2,20 (m, 1H), 2,10-1,50 (m, 10H), 1,46 (s, 3H), 1,45-1,30 (m, 5H), 0,95 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 0,90-0,80 (m, 9H), 0,77 (d, J = 7,0 Hz, 3H) ppm. Procedimento Geral para os Compostos LP1A, LP2A e LP4A
Legenda: "piperazina", "juntos", "formando piperazina"
[00745] A uma solução de composto 5c (34 mg, 60 µmol) em DMF (1 mL) foram adicionados HATU (27 mg, 71 µmol) e DIPEA (20 mg, 0,15 mmol). A mistura foi agitada em RT por 5 minutos antes do com- posto 101-3a, b ou d (50 µmol) ter sido adicionado à mistura. A mistu- ra foi agitada em RT por 2 horas, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura resultante foi diretamente purificada através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto LP1A, 2A ou 4A como um sólido branco. N-(2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-Azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca- 1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-amido]-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metoxi)carbonil](metil)- amino}etil)carbamato de 2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)- 12,19-difluor-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (LP1A)
[00746] Seguindo o procedimento geral e usando composto 101-3a, ligante-carga útil LP1A (20 mg, 26% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 754 (M/2 + H)+. N-(2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-Azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca- 1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-amido]-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metoxi)carbonil](metil)- amino}etil)-N-metilcarbamato de 2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor-11-hidroxi-9,13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo- [10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2-oxoetila (LP2A)
[00747] Seguindo o procedimento geral e usando composto 101-3b, ligante-carga útil LP2A (20 mg, 26% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 761 (M/2 + H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 9,98 (s, 1H), 8,12 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 7,87 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,76 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 7,69-7,66 (m, 1H), 7,64-7,57 (m, 3H), 7,51-7,44 (m, 3H), 7,40-7,33 (m, 2H), 7,32-7,25 (m, 4H), 6,33-6,27 (m, 1H), 6,11 (s, 1H), 5,98 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 5,70-5,55 (m, 2H), 5,41 (s, 2H), 5,08-4,91 (m, 4H), 4,79-4,66 (m, 2H), 4,41-4,35 m, 1H), 4,25-4,17 (m, 2H), 3,64-3,56 (m, 3H), 3,49-3,41 (m, 15H), 3,30-3,27 (m, 2H),
3,13-3,00 (m, 3H), 2,98-2,75 (m, 8H), 2,65-2,54 (m, 2H), 2,48-2,43 (m, 1H), 2,41-2,34 (m, 1H), 2,28-2,19 (m, 2H), 2,07-1,94 (m, 4H), 1,81-1,67 (m, 3H), 1,63-1,53 (m, 5H), 1,48 (s, 3H), 1,45-1,31 (m, 5H), 0,88-0,82 (m, 13H) ppm. 4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluor-11-hidroxi- 9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetil} piperazino-1,4-dicarboxilato de 1-{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4- {2-azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10- in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido]- 3-metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (LP4A)
[00748] Seguindo o procedimento geral e usando composto 101-3d, ligante-carga útil LP4A (35 mg, 44% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 760 (M/2 + H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 10,0 (s, 1H), 8,14 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,88 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,77 (t, J = 5,0 Hz, 1H), 7,70-7,66 (m, 1H), 7,63-7,55 (m, 3H), 7,52-7,43 (m, 3H), 7,40-7,27 (m, 6H), 6,30 (d, J = 10,5 Hz, 1H), 6,11 (s, 1H), 6,02-5,88 (m, 1H), 5,70-5,50 (m, 2H), 5,42 (s, 2H), 5,20-4,92 (m, 4H), 4,80-4,62 (m, 3H), 4,40-4,35 (m, 1H), 4,26-4,20 (m, 2H), 3,64-3,55 (m, 3H), 3,50-3,35 (m, 17H), 3,30-3,25 (m, 3H), 3,15-2,90 (m, 4H), 2,64-2,54 (m, 2H), 2,50-2,45 (m, 1H), 2,41-2,34 (m,1H), 2,32-2,20 (m, 2H), 2,10-1,92 (m, 4H), 1,80-1,68 (m, 3H), 1,62-1,50 (m, 5H), 1,46 (s, 3H), 1,45-1,40 (m, 2H), 1,40-1,30 (m, 3H), 1,22-1,20 (m, 1H), 0,90-0,80 (m, 13H) ppm. N-Etil-N-[2-(etilamino)etil]carbamato de {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-
azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2- il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido]-3- metilbutanamido]-5-(carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (101-4)
[00749] A uma solução de DIBAC-suc-PEG4-vcPAB-PNP 11b (0,11 g, 0,10 mmol) em DMF (5 mL) foram adicionados N,N'- dietiletilenodiamina (58 mg, 0,50 mmol) e DMAP (1 mg, 0,01 mmol). A mistura de reação foi agitada em RT por 4 horas, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura resultante foi diretamente purificada atra- vés de HPLC preparativa (método B) para dar o composto 101-4 como óleo incolor. ESI m/z: 1056,6 (M + H)+, 529 (M/2 + H)+. N-(2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-Azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca- 1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-amido]-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilami- no)pentanamido]fenil}metoxi)carbonil](etil)amino}etil)-N- ethilcarbamato de 2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19- difluor-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (LP3A)
[00750] Uma mistura de composto 101-4 (16 mg, 15 µmol), 101-1b (11 mg, 17 µmol) e DIPEA (4,0 mg, 31 µmol) em DMF (5 mL) foi agita- da em RT por 4 horas, o que foi monitorado através de LCMS. A mis- tura de reação foi purificada diretamente através de HPLC preparativa (método B) para dar ligante-carga útil LP3A (3 mg, 13% de rendimen- to) como um sólido branco. ESI m/z: 775 (M/2 + H)+. 1H RMN (500 MHz, DMSOd6) δ 10,0 (s, 1H), 8,14 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,88 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,77 (t, J = 5,0 Hz, 1H), 7,70-7,66 (m, 1H), 7,63-7,55 (m, 3H), 7,52-7,43 (m, 3H), 7,40-7,27 (m, 7H), 6,30 (d, J = 10,5 Hz, 1H), 6,11 (s, 1H), 6,02-5,88 (m, 1H), 5,70-5,50 (m, 2H), 5,42 (s, 2H), 5,20-4,92 (m, 4H), 4,80-4,62 (m, 3H), 4,40-4,35 (m, 1H), 4,26-4,20 (m, 2H), 3,64-3,55 (m, 4H), 3,50-3,35 (m, 18H), 3,12-2,90 (m, 7H), 2,64-2,54 (m, 3H), 2,41-2,34 (m, 2H), 2,32-2,20 (m, 3H), 2,10-1,92 (m, 5H), 1,88-1,68 (m, 3H), 1,62-1,50 (m, 6H), 1,50-1,40 (m, 6H), 1,40-1,30 (m, 4H), 1,22-1,20 (m, 1H), 1,02-0,90 (m, 4H), 0,90-0,78 (m, 6H) ppm. Síntese de Profármacos de Cisteamina: Ligador-cargas úteis LP5A, 6A, 7A e LP8A
[00751] Cloridrato de 2-(piridin-2-ildissulfanil)etanamina (102-
1e) estava comercialmente disponível com CAS 83578-21-6, (2- mercaptoetil)(metil)carbamato de terc-butila (102-1f) foi sintetizado de acordo com Eur. J. Med. Chem., 2015, 95, 483-491.
[00752] N-(2-{2-[2-(2-Aminoetoxi)etoxi]etoxi}etil)carbamato de endo-biciclo[6,1,0]non-4-in-9-ilmetila (5f) foi sintetizado de acordo com WO2016168769, N-[2-(Piridin-2-ildissulfanil)etil]carbamato de 2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor-11-hidroxi-9,13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (102-3e)
[00753] A uma solução de composto 101-1b (0,54 g, 0,86 mmol) em acetonitrila (10 mL) foram adicionados DIPEA (0,22 g, 1,7 mmol), 102- 1e (0,19 g, 0,86 mmol) e DMAP (10 mg, 86 µmol). A mistura de reação foi agitada em RT por 48 horas até 101-1b ter sido totalmente consu- mido de acordo com LCMS. A mistura foi então filtrada e o filtrado foi concentrado in vacuo. O óleo residual foi purificado através de croma- tografia de coluna de sílica gel (20-50% acetato de etila em hexano) para dar o composto 102-3e (0,47 g, 80% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 679,2 (M + H)+. N-Metil-N-[2-(piridin-2-ildissulfanil)etil]carbamato 2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluor-11-hidroxi-9,13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (102-3f)
[00754] Seguindo o procedimento similar a 102-3e exceto pela substituição de 102-1e por 102-1f, composto 102-3f (0,45 g, 75% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 693,2 (M + H)+. N-(2-Sulfaniletil)carbamato de 2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluor-11-hidroxi-9,13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (102e)
[00755] A uma solução de composto 102-3e (1,4 g, 2,1 mmol) em clorofórmio (30 mL) foram adicionados trietilamina (0,82 mL, 5,9 mmol) e 1,4-ditiotreitol (reagente de Cleland, DTT) (1,2 g, 7,8 mmol). A mistu- ra de reação foi agitada em RT sob nitrogênio por 4 horas, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura resultante foi concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica gel (50-70% acetato de etila em hexano) para dar o composto 102e (0,95 g, 83% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 570,2 (M + H)+. N-Metil-N-(2-sulfaniletil)carbamato de 2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor-11-hidroxi-9,13-
dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (102f)
[00756] Seguindo o procedimento similar a 102e exceto pela substi- tuição de 102-3e por 102-3f, composto 102f (0,97 g, 83% de rendi- mento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 584,3 (M + H)+. Ácido 3-({2-[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor- 11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetoxi}carbonil)amino]etil}dissulfanil)-3-metilbutanoico (102-5e)
[00757] A uma solução de composto 102-3e (0,68 g, 1,0 mmol) em metanol (5 mL) foi adicionado composto 102-4 (0,13 g, 1,0 mmol). A mistura de reação foi agitada em RT por 18 horas, o que foi monitora- do através de LCMS. A mistura resultante foi então diretamente purifi- cada através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto 102-5e (0,39 g, 55% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 702,2 (M + H)+. Ácido 3-({2-[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor- 11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-
dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetoxi}carbonil)(metil)amino]etil}dissulfanil)-3-metilbutanoico (102-5f)
[00758] Seguindo o procedimento similar a 102-5e exceto pela substituição de 102-3e por 102-3f, composto 102-5f (0,29 g, 40% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 716,3 (M + H)+. 3-({2-[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluor-11- hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetoxi}carbonil)amino]etil}dissulfanil)-3-metilbutanoato de 2,5- dioxopirrolidin-1-ila (LP5A)
[00759] A uma solução de composto 102-5e (0,20 g, 0,29 mmol) em DCM (10 mL) foram adicionados HOSu (73 mg, 0,64 mmol) e EDCI (0,12 g, 0,64 mmol) e a mistura foi agitada em RT por 24 horas, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura resultante foi diluída com DCM (50 mL) e a solução orgânica foi lavada com água e salmoura, seca em sulfato de sódio anidro e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de HPLC preparativa (método A) para dar LP5A (85 mg, 37% de rendimento) como óleo incolor. ESI m/z: 799,3 (M + H)+. 3-({2-[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluor-11- hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetoxi}carbonil)(metil)amino]etil}dissulfanil)-3-metilbutanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila (LP6A)
[00760] Seguindo o procedimento similar a LP5A exceto pela subs- tituição de 102-5e por 102-5f, composto LP6A (86 mg, 36% de rendi- mento) foi obtido como óleo incolor. ESI m/z: 813,3 (M + H)+. N-{2-[2-(2-{2-[3-({2-[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19- Difluor-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetoxi}carbonil)amino]etil}dissulfanil)-3- metilbutanamido]etoxi}etoxi)etoxi]etil}carbamato de endo- biciclo[6,1,0]non-4-in-9-ilmetila (LP7A)
[00761] A uma solução de composto 102-5e (0,20 g, 0,29 mmol) em DMF (10 mL) foram adicionados HATU (0,11 g, 0,29 mmol) e DIPEA (75 mg, 0,58 mmol). A mistura de reação foi agitada em RT por 10 mi- nutos antes do composto 5f (0,11 g, 0,29 mmol) ter sido adicionado. A mistura de reação foi agitada em RT por 18 horas, o que foi monitora-
do através de LCMS. A mistura resultante foi então diretamente purifi- cada através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto LP7A (0,16 g, 55% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 526,7 (M/2 + H)+. N-{2-[2-(2-{2-[3-({2-[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19- Difluor-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetoxi}carbonil)(metil)amino]etil}dissulfanil)-3- metilbutanamido]etoxi}etoxi)etoxi]etil}carbamato de endo- biciclo[6,1,0]non-4-in-9-ilmetila (LP8A)
[00762] Seguindo o procedimento similar a LP7A exceto pela subs- tituição de 102-5e por 102-5f for, composto LP8A (0,13 g, 41% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 533,8 (M/2 + H)+. Síntese de ligador-cargas úteis AMO LP9A-11A Esquema 103A. Síntese de Cargas úteis 103a,b e Ligador-cargas úteis LP9A-10A
Legenda: "tolueno", "refluxo", "piperidina" Acetato de (2-(((9H-fluoren-9- il)metoxi)carbonilamino)acetamido)metila (103-1)
[00763] A uma mistura de Fmoc-Gly-Gly-OH (4,3 g, 12 mmol) em THF (0,12 L) e tolueno (40 mL) foram adicionados piridina (1,2 mL, 15 mmol) e tetraacetato de chumbo (6,8 g, 15 mmol). A mistura de reação foi refluxada por 5 horas, o que foi monitorado através de LCMS. De- pois de esfriada para RT, A mistura de reação foi filtrada através de Celite para remover o material insolúvel e o filtrado foi concentrado in vacuo. O resíduo foi dissolvido em acetato de etila e a solução foi la- vada com água e salmoura. A solução orgânica foi seca em sulfato de sódio e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de cro- matografia de coluna de sílica gel (acetato de etila 10% em éter de pe- tróleo) para prover composto 103-1 (3,0 g, 67% de rendimento) como um sólido incolor. ESI m/z: 391 (M + Na)+. N-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-Hidroxi-9,13-dimetil-16-
oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17- dien-8-il]-2-oxoetoxi}metil)carbamoil]metil}carbamato de 9H- fluoren-9-ilmetila (103-2a)
[00764] A uma solução de composto 103-1 (0,37 g, 1,0 mmol) e bu- desonida 1a (1,3 g, 3,0 mmol) em THF (4 mL) foi adicionado terc- butóxido de potássio (0,22 g, 2,0 mmol) a 0 oC. A mistura de reação foi agitada em RT por 15 minutos, o que foi monitorado através de TLC. A solução de reação foi carregada com acetato de etila e água a 0 oC e extraída com acetato de etila e clorofórmio. A solução orgânica combi- nada foi seca em sulfato de sódio e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica gel (30-35% de acetato de etila em éter de petróleo) para dar o composto 103-2a (0,19 g, 40% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 739 (M + H)+. N-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluor-11- hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetoxi}metil)carbamoil]metil}carbamato de 9H-fluoren-9-ilmetila (103-2b)
[00765] A um tubo selado foram adicionados uma solução de com- posto 103-1 (0,30 g, 0,81 mmol) e composto 100 (0,38 g, 0,81 mmol) em DCM (4 mL) e p-toluenossulfonato de piridínio (21 mg, 81 µmol) em RT. O tubo de reação foi selado e agitado a 50º C por 24 horas, o que foi monitorado através de LCMS. Depois de ser esfriada, a mistura de reação foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado através de HPLC preparativa (método A) para dar o composto 103-2b (0,23 g, 37% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 775 (M + H)+. 2-Amino-N-({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-hidroxi-9,13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetoxi}metil)acetamida (103a)
[00766] A uma solução de composto 103-2a (0,10 g, 0,14 mmol) em DMF (2 mL) foi adicionada piperidina (35 mg, 0,41 mmol). A mistura de reação foi agitada em RT por 2 horas até que Fmoc foi totalmente re- movido, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura resultante foi diretamente purificada através de cromatografia flash de fase rever- sa (0-100% acetonitrila em TFA aq. (0,05%)) para dar o composto 103a (50 mg, 70% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 517,6 (M + H)+. 2-Amino-N-({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor- 11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetoxi}metil)acetamida (103b)
[00767] Seguindo o procedimento similar a 103a exceto pela substi- tuição de 103-2a por 103-2b, composto 103b (0,26 g, 65% de rendi-
mento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 553,2 (M/2 + H)+.
Legenda: "seco", piperidina"
[00768] O Composto 105(b) foi preparado de acordo com o proce- dimento acima. N-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12S,13R)-11-Hidroxi-9,13-dimetil-16- oxo-6-propil-5,7-dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17- dien-8-il]-2-oxoetoxi}metil)carbamoil]metil}carbamato de {4-[(2S)- 2-[(2S)-2-[1-(4-{2-azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca- 1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-amido]-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (LP9A)
[00769] A uma solução de composto 103a (15 mg, 29 µmol) em DMF (1,0 mL) foram adicionados composto 11b (30 mg, 28 µmol),
HOBT (2,0 mg, 15 µmol) e DIPEA (7,7 mg, 60 µmol). A mistura de rea- ção foi agitada em RT por 2 horas, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura foi purificada diretamente através de HPLC prepara- tiva (método B) para dar ligante-carga útil LP9A (5,0 mg, 11% de ren- dimento) como um sólido branco. ESI m/z: 729 (M/2 + H)+. N-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluor-11- hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetoxi}metil)carbamoil]metil}carbamato de {4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1- (4-{2-azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen- 10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15- amido]-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (LP10A)
[00770] Seguindo o procedimento similar a LP9A exceto pela subs- tituição de 103a por 103b, ligante-carga útil LP10A (23 mg, 58% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 747,0 (M/2 + H)+; 513,8 (fragmento clivado através de LCMS, pedaço clivado em NHCH2-O) 1HRMN (400 MHz, DMSOd6) δ 10,02 (s, 1H), 8,80-8,72 (m, 1H), 8,15 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 7,89 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,80-7,75 (m, 1H), 7,68 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,64-7,58 (m, 3H), 7,54-7,22 (m, 9H), 6,29 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 6,10 (s, 1H), 6,04-5,96 (m, 1H), 5,78-4,10 (m, 15H), 3,66-3,54 (m, 5H), 3,54-3,42 (m, 13H), 3,32-3,26 (m, 2H), 3,20- 2,50 (m, 7H), 2,42-2,20 (m, 4H), 2,05-1,90 (m, 4H), 1,85-1,25 (m, 15H), 0,90-0,80 (m, 13H) ppm. Esquema 103B. Síntese de Ligador-carga útil LP11A
O O O O O H 1) HOSu, EDCI, DCM H H N 2) H-Gly-Gly-Phe-OH , DIPEA, DMF N N OH
N O OH N O N N 4 4 H H
O O O O 5c 103-3
O O
O H H2N H
N O H F O O O O O O F H H H O H HO N N N H
N O N N N O 103b O 4 H H H F
O O O O HATU, DIPEA, DMF
F LP11A HO
O Ácido (2S)-2-(2-{2-[1-(4-{2-Azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca- 1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-amido]acetamido}acetamido)-3- fenilpropanoico (103-3)
[00771] A uma solução de composto 5c (0,16 g, 0,29 mmol) em DCM (20 mL) foram adicionados HOSu (73 mg, 0,64 mmol) e EDCI (0,12 g, 0,64 mmol). A mistura foi agitada em RT por 24 horas até composto 5c ter sido totalmente consumido de acordo com LCMS. A mistura resultante foi diluída com DCM (50 mL) e a solução orgânica foi lavada com água (50 mL) e salmoura (50 mL), seca com sulfato de sódio anidro e concentrada in vacuo para dar o éster ativo OSu (0,16 g, 84% de rendimento) como óleo incolor, que foi usado para a etapa seguinte diretamente.
[00772] A uma solução de H-Gly-Gly-Phe-OH (10 mg, 36 µmol) em DMF (0,5 mL) foram adicionados o éster ativo OSu (23 mg, 36 µmol) obtido acima e DIPEA (9,0 mg, 72 µmol). A mistura de reação foi agi- tada em RT de um dia para o outro. A mistura foi purificada diretamen- te através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto 103-3 (15 mg, 51% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 408,2
(M/2 + H)+. 1-(4-{2-Azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen- 10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-N-{[({[(1S)-1-({[({2-[(19S)-12,19- difluor-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetoxi}metil)carbamoil]metil}carbamoil)-2- feniletil]carbamoil}metil)carbamoil]metil}-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-amida (LP11A)
[00773] A uma solução de composto 103-3 (15 mg, 18 µmol) em DMF (0,5 mL) foram adicionados HATU (14 mg, 36 µmol) e DIPEA (9,3 mg, 72 µmol). A mistura de reação foi agitada em RT por 10 min antes do composto 103b (10 mg, 18 µmol) ter sido adicionado à mistura. A mistura de reação foi então agitada em RT de um dia para o outro. A mistura resultante foi diretamente purificada através de HPLC prepara- tiva (método B) para dar ligante-carga útil LP11A (5,0 mg, 20% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 420,2 (M/3 + H)+. Síntese de profármaco de dipeptídeo: Ligador-carga útil LP12A Esquema 104A. Síntese de carga útil 104a
[00774] Ácido Alfa-Azidoisobutírico 104-1 foi sintetizado de acordo com Org. Lett., 2001, 3(5), 781-783.
2-Azido-2-metilpropanoato de 2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluor-11-hidroxi-9,13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (104-2a)
[00775] A uma solução de composto 100 (0,10 g, 0,21 mmol) em DCM (30 mL) foram adicionados composto 104-1 (52 mg, 0,40 mmol), DCC (90 mg, 0,44 mmol) e DMAP (10 mg) e a mistura foi agitada em RT de um dia para o outro, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura resultante foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado através de HPLC preparativa (método A) para dar o composto 104-2a (80 mg, 70% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 578,3 (M + H)+. 2-Amino-2-metilpropanoato de 2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor-11-hidroxi-9,13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (104-3a)
[00776] A uma solução de composto 104-2a (75 mg, 0,15 mmol) em THF (5 mL) foram adicionados PPh3 (0,15 g, 0,57 mmol), água (5 mL) e HCl conc. (1 gota) e a mistura de reação foi agitada em RT de um dia para o outro. A mistura foi concentrada in vacuo e diluída com
DMF. O precipitado foi removido através de filtragem. O filtrado foi pu- rificado através de HPLC preparativa (método A) para dar o composto 104-3a (45 mg, 54% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 552,3 (M + H)+. 2-[(2S)-2-{[(terc-Butoxi)carbonil]amino}-4-metilpentanamido]-2- metilpropanoato de 2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19- difluor-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (104-4a)
[00777] A uma mistura de Boc-Leu-OH (20 mg, 87 µmol) e HATU (50 mg, 0,13 mmol) em DMF (3 mL) foram adicionados DIPEA (30 mg, 0,23 mmol), DMAP (2 mg) e composto 104-3a (30 mg, 54 µmol). A mistura foi agitada em RT por uma hora, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura foi purificada diretamente através de HPLC prepa- rativa (método A) para dar o composto 104-4a (25 mg, 55% de rendi- mento) como um sólido branco. ESI m/z: 787,4 (M + Na)+. 2-[(2S)-2-Amino-4-metilpentanamido]-2-metilpropanoato de 2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluor-11-hidroxi-9,13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (104a)
[00778] A uma mistura de composto 104-4a (25 mg, 33 µmol) em DCM (1,5 mL) foi adicionado TFA (0,15 mL) e a mistura foi agitada em RT por uma hora até Boc ter sido totalmente removido de acordo com LCMS.
A mistura de reação foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado através de HPLC preparativa (método A) para dar o com- posto 104a (13 mg, 61% de rendimento) como um sólido branco.
ESI m/z: 665,4 (M + H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 8,39 (s, 1H), 8,26 (s, 1H), 7,27 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 6,31 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 6,11 (s, 1H), 5,63 (t, J = 24,2 Hz, 2H), 5,30-5,05 (m, 1H), 4,96 (d, J = 17,7 Hz, 1H), 4,81-4,65 (m, 2H), 4,20 (s, 1H), 2,69-2,54 (m, 1H), 2,36-2,15 (m, 1H), 2,12-1,94 (m, 2H), 1,85-1,63 (m, 2H), 1,63-1,53 (m, 3H), 1,52-1,41 (m, 11H), 1,41-1,10 (m, 6H), 0,97-0,76 (m, 12H) ppm.
Esquema 104B.
Síntese de Ligador-carga útil LP12A
Legenda: leucina, piperidina (2S)-2-{[({4-[(2S)-5-(Carbamoilamino)-2-[(2S)-2-{[(9H-fluoren-9-
ilmetoxi)carbonil]amino}-3- metilbutanamido]pentanamido]fenil}metoxi)carbonil]amino}-4- metilpentanoato de terc-butila (104-5)
[00779] A uma solução de composto 11b (0,30 g, 0,39 mmol) e H- Leu-OTBU-OH (0,14 g, 0,63 mmol) em DMF (3 mL) foi adicionado DI- PEA (0,26 g, 2,0 mmol) e a mistura de reação foi agitada em RT por 2 horas. A mistura resultante foi diretamente purificada através de HPLC preparativa (método A) para dar o composto 104-5 (0,11 g, 35% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 815,4 (M + H)+. Ácido (2S)-2-{[({4-[(2S)-5-(Carbamoilamino)-2-[(2S)-2-{[(9H-fluoren- 9-ilmetoxi)carbonil]amino}-3- metilbutanamido]pentanamido]fenil}metoxi)carbonil]amino}-4- metilpentanoico (104-6)
[00780] A uma solução de composto 104-5 (25 mg, 31 µmol) em DCM (4 mL) foi adicionado TFA (0,8 mL) e a mistura foi agitada em RT por 2 horas. A mistura resultante foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado através de HPLC preparativa (método A) para dar o composto 104-6 (15 mg, 67% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 759,3 (M + H)+. 2-[(2S)-2-{[({4-[(2S)-5-(Carbamoilamino)-2-[(2S)-2-{[(9H-fluoren-9- ilmetoxi)carbonil]amino}-3- metilbutanamido]pentanamido]fenil}metoxi)carbonil]amino}-4- metilpentanamido]-2-metilpropanoato de 2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor-11-hidroxi-9,13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (104-7a)
[00781] A uma solução de composto 104-5 (20 mg, 26 µmol) e composto 104-3 (17 mg, 32 µmol) em DMF (2 mL) foram adicionados HATU (20 mg, 52 µmol), DIPEA (13 mg, 0,10 mmol) e DMAP (1 mg) e a mistura de reação foi agitada em RT por uma hora, o que foi monito- rado através de LCMS. A mistura resultante foi diretamente purificada através de HPLC preparativa (método A) para dar o composto 104-7a (30 mg, 89% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 1293 (M + H)+. 2-[(2S)-2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-Amino-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metoxi)carbonil]amino}-4- metilpentanamido]-2-metilpropanoato de 2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor-11-hidroxi-9,13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7-
dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (104-8a)
[00782] A uma solução de composto 104-7a (25 mg, 19 µmol) em DMF (2 mL) foi adicionada piperidina (0,2 mL) e a mistura foi agitada em RT por meia hora até que Fmoc foi totalmente removido de acordo com LCMS. A mistura de reação foi imediatamente purificada através de cromatografia flash de fase reversa (0-50% acetonitrila em TFA aq. (0,03%)) para dar o composto 104-8a (20 mg, 95% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 1070,5 (M + H)+. 2-[(2S)-2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-({[endo-Biciclo[6,1,0]non-4-in-9- ilmetoxi]carbonil}amino)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido]- 3-metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metoxi)carbonil]amino}-4- metilpentanamido]-2-metilpropanoato de 2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor-11-hidroxi-9,13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (LP12A)
[00783] A uma solução de composto 104-8a (20 mg, 26 µmol) e composto 5d (14 mg, 32 µmol) em DMF (2 mL) foram adicionados HATU (22 mg, 58 µmol), DIPEA (15 mg, 0,12 mmol) e DMAP (1 mg) e a mistura de reação foi agitada em RT por 2 horas, o que foi monitora- do através de LCMS.
A mistura resultante foi diretamente purificada através de HPLC preparativa (método A) para dar ligante-carga útil LP12A (10 mg, 21% de rendimento) como um sólido branco.
ESI m/z: 747,6 (M/2 + H)+. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6) δ 9,97 (s, 1H), 8,35- 8,25 (m, 1H), 8,11 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 7,87 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,58 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,34-7,18 (m, 4H), 7,17-7,04 (m, 1H), 6,30 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 6,11 (s, 1H), 6,03-5,90 (s, 1H), 5,72-5,50 (m, 2H), 5,41 (s, 2H), 5,34-3,91 (m, 12H), 3,66-3,38 (m, 15H), 3,15-2,88 (m, 4H), 2,73- 2,53 (m, 1H), 2,50-2,45 (m, 1H), 2,41-2,31 (m, 1H), 2,30-1,90 (m, 9H), 1,83-1,62 (m, 2H), 1,63-1,17 (m, 27H), 0,92-0,77 (m, 20H) ppm.
Esquema 104C.
Síntese de Carga útil 104b e seu ligador-carga útil LP13A
Legenda: piperidina (2S)-2-{[(9H-Fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]amino}-4-metilpentanoato de 2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor-11-hidroxi- 9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (104-2b)
[00784] A uma solução de composto 100 (0,47 g, 1,0 mmol) e Fmoc-Leu-OH (0,39 g, 1,1 mmol) em DCM (10 mL) foram adicionados EDCI (0,23 g, 1,2 mmol) e DMAP (12 mg, 0,10 mmol). A mistura foi agitada em RT por 16 horas, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura resultante foi diluída com água (50 mL) e extraída com DCM (50 mL x 2). A solução orgânica combinada foi seca em sulfato de só- dio e concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de croma- tografia de coluna de sílica gel (10-50% de acetato de etila em éter de petróleo) para dar o composto 104-2b (0,52 g, 65% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 802,4 (M + H)+. (2S)-2-Amino-4-metilpentanoato de 2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor-11-hidroxi-9,13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (104-3b)
[00785] A uma solução de composto 104-2b (0,50 g, 0,62 mmol) em DCM (9 mL) foi adicionada piperidina (1 mL) e a mistura de reação foi agitada em RT por 30 minutos até que Fmoc foi totalmente removido de acordo com LCMS. A mistura resultante foi concentrada in vacuo. O resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica gel (metanol 5-10% em DM) para dar o composto 104-3b (0,32 g, 90% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 580,3 (M + H)+. (2S)-2-[(2S)-2-{[(terc-Butoxi)carbonil]amino}-3- hidroxipropanamido]-4-metilpentanoato de 2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor-11-hidroxi-9,13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (104-4b)
[00786] A uma mistura de composto 104-3b (0,32 g, 0,55 mmol) e Boc-Ser-OH (0,14 g, 0,66 mmol) em DMF (3 mL) foram adicionados HATU (0,25 g, 0,66 mmol) e DIPEA (0,21 g, 1,6 mmol) em RT. A mis- tura foi agitada em RT por 6 horas, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura resultante foi concentrada in vacuo e o resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica gel (10-50% de acetato de etila em éter de petróleo) para dar o composto 104-4b (0,34 mg, 80% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 767,4 (M + H)+. (2S)-2-[(2S)-2-Amino-3-hidroxipropanamido]-4-metilpentanoato de 2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor-11-hidroxi-9,13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila sal do ácido trifluoracético (104b)
[00787] A uma solução de composto 104-4b (0,34 g, 0,44 mmol) em DCM (5 mL) foi adicionado TFA (1 mL). A mistura de reação foi agita- da em RT por 2 horas até Boc ter sido totalmente removido de acordo com LCMS. A mistura resultante foi concentrada e o resíduo (0,33 g, 95% de rendimento) era puro o suficiente para a próxima etapa. 100 mg de produto bruto foram adicionalmente purificados através de HPLC preparativa (método A) para dar o composto 104b (80 mg, 80% de rendimento) como um sólido amarelo. ESI m/z: 667,3 (M + H)+. (2S)-2-[(2S)-2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-Amino-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metoxi)carbonil]amino}-3- hidroxipropanamido]-4-metilpentanoato de 2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor-11-hidroxi-9,13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (104-8b)
[00788] A uma solução de composto bruto 104b (0,10 g, 0,13 mmol) recém-obtido acima em DMF (3 mL) foram adicionados Fmoc-vcPAB- PNP (11d) (0,12 g, 0,16 mmol), DMAP (16 mg, 0,13 mmol) e DIPEA (50 mg, 0,39 mmol) em RT.
A mistura foi agitada em RT por 3 horas até a maior parte dos materiais de partida ter sido consumida, o que foi monitorado através de LCMS.
À mistura de reação foi então adiciona- da piperidina (1 mL). Depois de ser agitada em temperatura ambiente por uma hora até o Fmoc ter sido totalmente removido de acordo com LCMS.
A mistura de reação foi purificada diretamente através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto 104-8b (28 mg, 20% de rendimento) como um sólido branco.
ESI m/z: 536,8 (M/2 + H)+. (2S)-2-[(2S)-2-{[({4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-({[endo-Biciclo[6,1,0]non-4-in- 9-ilmetoxi]carbonil}amino)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15- amido]-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metoxi)carbonil]amino}-3- hidroxipropanamido]-4-metilpentanoato de 2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor-11-hidroxi-9,13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetila (LP13A)
[00789] A uma solução de composto 5d (10 mg, 22 µmol) em DMF (1 mL) foram adicionados HATU (9 mg, 22 µmol) e DIPEA (8,0 mg, 62 µmol) sucessivamente em RT.
A mistura foi agitada em RT por meia hora seguido pela adição de uma solução de composto 104-8b (20 mg, 19 µmol) em DMF (1 mL). A mistura resultante foi agitada em RT por 2 horas até composto 104-8b ter sido consumido, o que foi monito- rado através de LCMS.
Depois de ser filtrado através da membrana, o filtrado foi diretamente purificada através de HPLC preparativa (méto- do B) para dar ligante-carga útil LP13A (10 mg, 35% de rendimento) como um sólido branco.
ESI m/z: 748,4 (M/2 + H)+. Esquema 105. Síntese de LP18A-21A
Legenda: piperidina, ou, continua na próxima página 1-(4-{2-Azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen- 10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila (5-1c)
[00790] A uma solução de composto 5c (160 mg, 0,290 mmol) em DCM (20 mL) foram adicionados HOSu (73,3 mg, 0,637 mmol) e EDCI (122 mg, 0,637 mmol) e a mistura foi agitada em RT por 24 horas, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura de reação foi diluída com DCM (50 mL) e a camada orgânica foi lavada com água (50mL) e salmoura, seca com Na2SO4 anidro e concentrada in vacuo para dar o composto 5-1c (159 mg, 84% de rendimento) como óleo incolor, que foi usado para a etapa seguinte diretamente. ESI m/z: 650 (M + H)+. 1-[({endo-Biciclo[6,1,0]non-4-in-9-ilmetoxi}carbonil)amino]- 3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila (5- 1d)
[00791] Seguindo o procedimento similar a 5-1c exceto pela substi- tuição de 5c por 5d, composto 5-1d (150 mg, 54% de rendimento) foi obtido como óleo incolor, que foi usado para a etapa seguinte direta- mente sem purificação adicional. ESI m/z: 539 (M + H)+. N-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-Difluor-11- hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetoxi}metil)carbamoil]metil}carbamato de {4-[(2S)-2-[(2S)-2- amino-3-metilbutanamido]-5- (carbamoilamino)pentanamido]fenil}metila (103-8b)
F HH O O F O OH O O H N O O O N H H
N O H2N N
H O
HN H2N O
[00792] Seguindo o procedimento similar a 104-8b (vide esquema 104C) exceto pela substituição de 104b for 103b, composto 103-8b (28 mg, 20% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 480 (M/2 + H)+. Ácido (4S)-4-amino-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(carbamoilamino)-1-[(4- {[({[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor-11- hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoeto- xi}metil)carbamoil]metil}carbamoil)oxi]metil}fenil)carbamoil]butil] carbamoil}-2-metilpropil]carbamoil}butanoico (103-9a)
[00793] A uma solução de composto Boc-L-Glu(OTBU)-OH (0,15 g, 0,50 mmol) em DMF (5 mL) foram adicionados HATU (0,19 g, 0,50 mmol) e DIPEA (0,13 g, 1,0 mmol). A mistura de reação foi agitada em RT por 10 minutos, antes do composto 103-8b (0,48 g, 0,50 mmol) ter sido adicionado à mistura de reação.
A mistura de reação foi então agitada em RT por 3 horas até 103-8b ter sido totalmente consumido de acordo com LCMS.
A mistura foi extraída com EtOAc e a solução orgânica combinada foi lavada com água, seca em sulfato de sódio anidro e concentrada in vacuo.
O resíduo foi dissolvido em DCM (10 mL). À solução foi adicionado TFA (2 mL) e a mistura de reação foi agitada em RT por 3 horas, o que foi monitorado através de LCMS.
A mistura de reação foi concentrada e o resíduo foi diretamente purifica- do através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto 103- 9a (0,41 g, 75% de rendimento) como um sólido branco.
ESI m/z: 536,8 (M/2 + H)+. Ácido (4R)-4-amino-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(carbamoilamino)-1-[(4- {[({[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor-11- hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetoxi}metil)carbamoil]metil}carbamoil)oxi]metil}fenil) carba- moil]butil]carbamoil}-2-metilpropil]carbamoil}butanoico (103-9b)
[00794] Seguindo o procedimento similar a 103-9a exceto pela substituição de Boc-L-Glu(OTBU)-OH por Boc-D-Glu(OTBU)-OH, composto 103-9b (0,40 g, 74% de rendimento) foi obtido como um só- lido branco. ESI m/z: 536,8 (M/2 + H)+. Ácido (4S)-4-amino-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(carbamoilamino)-1-({4- [({[(1S)-1-{[(2S)-1-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19- difluor-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetoxi}-4-metil-1-oxopentan-2-il]carbamoil}-2- hidroxietil]carbamoil}oxi)metil]fenil}carbamoil)butil]carbamoil}-2- metilpropil]carbamoil}butanoico (104-9a)
[00795] Seguindo o procedimento similar a 103-9a exceto pela substituição de 103-8b por 104-8b, composto 104-9a (0,39 g, 65% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 601,3 (M/2 + H)+. Ácido (4R)-4-amino-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(carbamoilamino)-1-({4- [({[(1S)-1-{[(2S)-1-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19- difluor-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2-
oxoetoxi}-4-metil-1-oxopentan-2-il]carbamoil}-2- hidroxietil]carbamoil}oxi)metil]fenil}carbamoil)butil]carbamoil}-2- metilpropil]carbamoil}butanoico (104-9b)
[00796] Seguindo o procedimento similar a 103-9a exceto pela substituição de 103-8b por 104-8b, Boc-L-Glu(OTBU)-OH por Boc-D- Glu(OTBU)-OH, foi obtido composto 104-9b (0,39 g, 65% de rendi- mento) como um sólido branco. ESI m/z: 601,3 (M/2 + H)+. Ácido (4S)-4-[1-(4-{2-Azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca- 1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-amido]-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4- (carbamoilamino)-1-[(4-{[({[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)- 12,19-difluor-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoeto- xi}metil)carbamoil]metil}carbamoil)oxi]metil}fenil)carbamoil]butil] carbamoil}-2-metilpropil]carbamoil}butanoico (LP18A)
[00797] A uma solução de composto 103-9a (57 mg, 53 µmol) em DMF (1 mL) foram adicionados composto 5-1c (36 mg, 56 µmol) e DI- PEA (27 mg, 0,21 mmol). A mistura de reação foi agitada em RT por 4 horas, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura resultante foi então diretamente purificada através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto LP18A (12 mg, 15% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 811,4 (M/2 + H)+. Ácido (4R)-4-[1-(4-{2-azatriciclo[10,4,0,04,9]hexadeca- 1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-in-2-il}-4-oxobutanamido)-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-amido]-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4- (carbamoilamino)-1-[(4-{[({[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)- 12,19-difluor-11-hidroxi-9,13-dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoeto- xi}metil)carbamoil]metil}carbamoil)oxi]metil}fenil)carbamoil]butil] carbamoil}-2-metilpropil]carbamoil}butanoico (LP19A)
[00798] Seguindo o procedimento similar a LP18A exceto pela substituição de 103-9a por 103-9b, composto LP19A (14 mg, 17% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 811,4 (M/2 + H)+. Ácido (4S)-4-{1-[({endo-Biciclo[6,1,0]non-4-in-9- ilmetoxi}carbonil)amino]-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido}- 4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(carbamoilamino)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(2S)-1-{2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor-11-hidroxi-9,13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetoxi}-4-metil-1-oxopentan-2-il]carbamoil}-2- hidroxietil]carbamoil}oxi)metil]fenil}carbamoil)butil]carbamoil}-2-
metilpropil]carbamoil}butanoico (LP20A)
[00799] A uma solução de composto 104-9a (64 mg, 53 µmol) em DMF (1 mL) foram adicionados composto 5-1d (30 mg, 56 µmol) e DI- PEA (27 mg, 0,21 mmol). A mistura de reação foi agitada em RT por 4 horas, o que foi monitorado através de LCMS. A mistura resultante foi então diretamente purificada através de HPLC preparativa (método B) para dar o composto LP20A (17 mg, 20% de rendimento) como um sólido branco. ESI m/z: 813,0 (M/2 + H)+. Ácido (4R)-4-{1-[({endo-biciclo[6,1,0]non-4-in-9- ilmetoxi}carbonil)amino]-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amido}- 4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(carbamoilamino)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(2S)-1-{2- [(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-difluor-11-hidroxi-9,13- dimetil-16-oxo-6-propil-5,7- dioxapentaciclo[10,8,0,02,9,04,8,013,18]icosa-14,17-dien-8-il]-2- oxoetoxi}-4-metil-1-oxopentan-2-il]carbamoil}-2- hidroxietil]carbamoil}oxi)metil]fenil}carbamoil)butil]carbamoil}-2- metilpropil]carbamoil}butanoico (LP21A)
[00800] Seguindo o procedimento similar a LP20A exceto pela substituição de 104-9a por 104-9b, composto LP21A (14 mg, 17% de rendimento) foi obtido como um sólido branco. ESI m/z: 813,0 (M/2 + H)+.
[00801] A Tabela 5B abaixo apresenta ligador-cargas úteis feitos usando os métodos descritos aqui.
Tabela 5B.
Exemplos de Ligador-Cargas úteis LP Carga Nome do Estruturas útil Ligador LP1A 101a DIBAC-suc- PEG4- vcPAB- MEDA-100
LP2A 101b DIBAC-suc- PEG4- vcPAB- DMEDA-100
LP3A 101c DIBAC-suc- PEG4- vcPAB- DEEDA-100
LP4A 101d DIBAC-suc- PEG4- vcPAB-Pip- 100 LP5A 102e NHS- dissulfeto- SEA-100
LP6A 102f NHS- dissulfeto- SEMA-100
LP7A 102e BCN-PEG3- dissulfeto - SEA-100
LP8A 102f BCN-PEG3- dissulfeto - SEMA-100
LP Carga Nome do Estruturas útil Ligador LP9A 103a DIBAC-suc- PEG4- vcPAB-Gly- AMO-Bud LP10A 103b DIBAC-suc- PEG4- vcPAB-Gly- AMO-100 LP11A 103b DIBAC-suc- PEG4- GGFG- AMO-100 LP12A 104a BCN-PEG4- vcPAB-Leu- Aib-100 LP13A 104b BCN-PEG4- vcPAB-Ser- Leu-100 LP18A 103b DIBAC-suc- PEG4-EVC- PAB-Gly- AMO-100 LP19A 103b DIBAC-suc- PEG4- dEVC-PAB- Gly-AMO- 100 LP20A 104b BCN-PEG4- EVC-PAB- Ser-Leu-100 LP21A 104b BCN-PEG4- dEVC-PAB- Ser-Leu-100 Exemplo 27. Caracterização de Ligador-cargas úteis
[00802] A Tabela 16 sumariza os resultados de pureza de HPLC e o tempo de retenção LC de Ligador-Cargas úteis em HPLC, M/Z de es-
pectros de massa.
Os métodos de HPLC e MS analíticos foram descri- tos em procedimentos gerais como aqui descrito.
Tabela 16. Propriedade Físico-Química de Ligador-cargas úteis LP cLogP MF MW pureza HPLC MS Pico m/z HPLC RT (m/z) mais alto (%) (min)1 100% 13 4,39 C74H94F2N8O17 1405,60 >99 7,401 703,5 703,5 (M/2+H) (M/2+H) 15 2,98 C103H144F2N14O28S 2096,38 98 5,88 699,6 1049,0 (M/3+H) (M/2+H) (67%) 3 6,25 C80H98F2N8O18 1497,70 99 7,991 1498,7 1498,7 (M/2+H) (M+H) (10%) 6 6,59 C115H160N16O28S 2245,13 99 7,24 749,5 1123,8 (M/2 (M/3+H) + H)+ 1 Método B para HPLC-MS Tabela 17. Propriedades de Ligador-Carga útil LP cLog MF MW pu- HPL MS Pico P reza C RT (m/z) m/z HPL (min) 100% mais C (%) alto LP1 -0,38 C124H175N11O44 2523,76 98 6,45, 841,8 1262,4 6,55 [M/3+H] [M/2+H] (B) (30%) LP2 -3,92 C136H195N11O54 2848,04 96 7,48 955,0 1424,2 (B) [(M+18)/ (M/2+H) 3] (30%) 949,5 (M/3+H) LP3 6,25 C80H98F2N8O18 1497,67 100 7,99 749,5 1497,7 (B) (M/2+H) (M+H) (5%) LP4 7,53 C72H100N10O13 1313,62 96 8,16 657,5 1313,6 (B) (M/2+H) (M+H) (5%) LP5 -1,48 C138H193N15O49 2846,08 100 6,11, 949,0 1423,3 6,21 (M/3+H) (M/2+H) (B) (5%)
LP cLog MF MW pu- HPL MS Pico P reza C RT (m/z) m/z HPL (min) 100% mais C (%) alto LP6 6,59 C115H160N16O28S 2246,66 100 7,24 749,5 1123,8 (B) (M/3+H) (M/2+H) (5%) LP9 8,70 C88H112N10O18 1597,89 95 5,67 799,0 799,0 (B) (M/2+H) (M/2+H) LP1 8,17 C89H117N11O16 1596,95 95 8,51 798,5 798,5 1 (B) (M/2+H) (M/2+H) LP1 8,77 C77H86Cl2F6N10O1 1608,53 99 9,36 804,2 804,2 2 5S (B) (M/2+H) (M/2+H) LP1 4,39 C74H94F2N8O17 1405,58 100 7,40 703,5 1405,7 3 (B) (M/2+H) (M+H) (5%) LP1 -5,09 C126H177F2N13O49 2695,81 100 6,23 899,2 1348,6 4 (B) (M/3+H) (M/2+H) (40%) LP1 2,98 C103H144F2N14O28 2096,38 98 5,88 699,6 1049,0 5 S (B) (M/3+H) (M/2+H) (67%) LP1 6,49 C101H142N12O23S 1924,34 97 7,57 642,2 962,5 8 (B) (M/3+H) (M/2+H) (70%)
Tabela 17A.
Dados de Caracterização para Ligador-Cargas úteis LP cLogP MF MW pureza HPLC MS (m/z) Pico m/z HPLC RT 100% mais alto (%) (min) LP1A 4,26 C78H101F2N9O19 1506,71 95 753,9 753,9 (m/2+H) (m/2+H) LP2A 4,48 C79H103F2N9O19 1520,71 97 761,0 761,0 (m/2+H) (m/2+H) LP3A 5,20 C81H107F2N9O19 1548,76 95 775,0 775,0 (m/2+H) (m/2+H) LP4A 4,31 C79H101F2N9O19 1518,69 99 760,0 760,0 (m/2+H) (m/2+H) LP5A 3,40 C37H48F2N2O11S2 798,91 99 799,3 799,3 (m+H) (m+H)
LP cLogP MF MW pureza HPLC MS (m/z) Pico m/z HPLC RT 100% mais alto (%) (min) LP6A 3,62 C38H50F2N2O11S2 812,94 97 813,3 813,3 (m+H) (m+H) LP7A 5,20 C52H75F2N3O 1052,29 97 526,7 526,7 13S2 (m/2+H) (m/2+H) LP8A 5,42 C53H77F2N3O 1066,32 98 533,8 533,8 13S2 (m/2+H) (m/2+H) LP9A 3,65 C77H101N9O19 1456,70 96 729,0 729,0 (m/2+H) (m/2+H) LP10A 3,35 C77H99F2N9O19 1492,68 95 513,8 (fra- 747,0 gmento) (m/2+H) LP11A 1,96 C71H87F2N7O17 1348,51 95 450,2 675,2 (m/3+H) (m/2+H) LP12A 5,61 C76H110F2N8O20 1493,75 90 747,6 747,6 (m/2+H) (m/2+H) LP13A 4,13 C75H108F2N8O21 1495,70 95 748,4 748,4 (m/2+H) (m/2+H) LP18A 2,46 C82H106F2N10O22 1621,77 95 811 811 (m/2+H) (m/2+H) LP19A 2,46 C82H106F2N10O22 1621,77 95 811 811 (m/2+H) (m/2+H) LP20A 3,25 C80H115F2N9O24 1624,81 95 813 813 (m/2+H) (m/2+H) LP21A 3,25 C80H115F2N9O24 1624,81 95 813 813 (m/2+H) (m/2+H) Exemplo 28. Conjugação de ADC
[00803] Esse exemplo demonstra um método para conjugação es- pecífica a sítio, de um modo geral, de uma carga útil a um anticorpo ou antígeno-fragmento de ligação do mesmo. Vide FIG. 16.
[00804] Anticorpos anti-MSR1 gerados (Tabela 4) foram mutados (N297Q) para incorporar um sítio de transglutaminase para conjuga- ção com uma carga útil terapêutica. Os anticorpos aglicosilados espe- cíficos de sítio conapresentando uma mutação N297Q foram conjuga- dos com amina-PEG3-N3 para gerar os conjugados de anticorpo funci- onalizados com azido (mAb-N3), incluindo MSR1 Ab-PEG3-N3.
[00805] O presente exemplo demonstra um método para fabricação dos conjugados. Anticorpo aglicosilado com um isótipo de IgG1 huma- no em BupHTM (pH 7-8) foi misturado com ≥200 equivalentes molares de azido-dPEG3-amina (MW. 218,26 g/mol). A solução resultante foi misturada com transglutaminase (25 U/mL; 5U MTG por mg de anti- corpo) resultando em uma concentração final do anticorpo a 0,5-10 mg/mL e a solução foi então incubada a 37º C por 4-24 horas enquan- to agitando suavemente. A reação foi monitorada através de SDS- PAGE ou ESI-MS. Quando o término, a amina em excesso e MTG fo- ram removidos através de Cromatografia de Exclusão de Tamanho (SEC) para gerar o anticorpo funcionalizado com azido (mAb-N3). Esse produto foi analisado em SDS-PAGE e ESI-MS. A azido-dPEG3-amina adicionada a dois sítios - Q295 e Q297- do anticorpo resultando em um aumento de 804 Da para o conjugado anticorpo-PEG3-Azida agli- cosilado. Os sítios de conjugação foram identificados e confirmados em EEQLinkerYQLinkerSTYR para o anticorpo funcionalizado com azido 4DAR por meio do mapeamento da sequência de peptídeo de cadeias pesadas digeridas com tripsina.
[00806] Os conjugados de anticorpo-fármaco aglicosilados específi- cos de sítio (ADCs) com um IgG1 humano conapresentando uma mu- tação N297Q foram preparados através de uma reação click [2+3] en- tre o anticorpo funcionalizado com azido (mAb-N3) com ligador-carga útil (LP) conapresentando alcina.
[00807] Um conjugado de anticorpo específico de sítio com ligador- carga útil (LP) foi preparado incubando mAb-PEG3-N3 (1-12 mg / mL) em um meio aquoso (por exemplo, PBS, PBS conapresentando glice- rol 5%, HBS) com ≥6 equivalentes molares de um LP dissolvido em um solvente orgânico adequado, tal como DMSO, DMF ou DMA (isto é, a mistura de reação contém 5-20% de solvente orgânico, v/v) a 24º C até 37º C por 30 min a 24 hr. O progresso da reação foi monitorado através de ESI-MS e a ausência de mAb-PEG3-N3 indicou o término da conjugação. A quantidade em excesso do LP e solvente orgânico foi removida através de SEC por meio de eluição com PBS ou por meio de cromatografia de coluna de proteína A por meio de eluição com tampão ácido seguido por neutralização com Tris (pH 8,0). Os conjugados purificados foram analisados através de SEC, SDS-PAGE e ESI-MS. É mostrada na Tabela 19 uma lista de conjugados de MMAE anticorpo, conjugados de esteroide anticorpo e conjugados de agonista de LXR anticorpo das LPs correspondentes, seus pesos mo- leculares e valores de ESI-DAR.
[00808] Em um exemplo específico, o anticorpo funcionalizado com azido (1 mg) em 0,800 mL de PBSg (PBS, glicerol 5%, pH 7,4) foi tra- tado com seis equivalentes molares de ligador carga útil (LP) na Tabe- la 1 (conc. 10 mg/mL em DMSO) por 2 horas em RT e o ligador carga útil (LP) em excesso foi removido através de cromatografia de exclu- são de tamanho (SEC, Superdex 200 HR, GE Healthcare). O produto final foi concentrado através de ultracentrifugação e caracterizado por UV, SEC, SDS-PAGE e ESI-MS. Exemplo 28a. Conjugação de ADC
[00809] Esse exemplo demonstra um método para fabricação de um conjugado não específico de sítio de um fármaco com um anticor- po usando uma reação tiol-maleimida.
[00810] Conjugação através de cisteínas de anticorpo é realizada em duas etapas usando os métodos descritos similares àqueles des- critos em Mol Pharm. 2015 Jun 1;12(6):1863-71.
[00811] Um anticorpo monoclonal (mAb, 10 mg/ml em HEPES 50 mM, NaCl 150 mM) em pH 7,5 é reduzido com ditiotreitol 1 mM (0,006 mg por mg de anticorpo) ou TCEP (2,5 equivalentes molares para an- ticorpo) a 37º C por 30 minutos. A concentração do anticorpo foi calcu- lada com base na absorbância a 280 nm em Nanodrop (ThermoFisher Scientific) e um coeficiente de extinção do anticorpo. Após filtragem em gel (G-25, acetato de sódio pH 4,5), o composto LP em DMSO (10 mg/mL) é adicionado ao anticorpo reduzido e a mistura foi ajustada para pH 7,0 com HEPES 1 M (pH 7,4). A reação é deixada reagir para 3-14 horas. O conjugado resultante foi purificado através de SEC. Os valores de DAR (UV) são determinados usando as absorbâncias me- didas do ncADC e os coeficientes de extinção do anticorpo e composto Exemplo 29. Caracterização de ADCs através de LC-ESI-MS
[00812] Medição de massa intacta para as amostras de ADC atra- vés de LC-ESI-MS foi realizada para determinar o perfil de distribuição de fármaco-carga útil e calcular a DAR média. Cada amostra de teste (20-50 ng, 5ul) foi carregada em uma coluna Acquity UPLC Protein BEH C4 (10K psi, 300 Å, 1,7 μm, 75μm × 100 mm; Nº Cat. 186003810). Depois de 3 minutos de dessalinização, a proteína foi elu- ída e espectros de massa foram adquiridos através de um espectrô- metro de massa Waters Synapt G2-Si. Como sumarizado na Tabela 18, a maior parte dos ADCs específicos de sítio têm 3,9 - 4 DAR para os conjugados específicos de sítio. Tabela 18. Propriedades de ADC # LP MW (LP) Ab, Ab-N3 ou ncADC MS m/z DAR (ESI- (ncADC) MS) H1H27729P H1H27729P-N3 144166 4 1 2523,8 H1H27729P-LP1 H1H27731P 144620 4 H1H27731P-N3 1 2523,8 H1H27731P-LP1 H1H27732P 144176 5,7 H1H27732P-N3 1 2523,8 H1H27732P-LP1 H1H27734P 145110 4,4 H1H27734P-N3
# LP MW (LP) Ab, Ab-N3 ou ncADC MS m/z DAR (ESI- (ncADC) MS) 1 2523,8 H1H27734P-LP1 H1H27736P 145940 4 H1H27736P-N3 1 2523,8 H1H27736P-LP1 H1H27739P 145251 4 H1H27739P-N3 1 2523,8 H1H27739P-LP1 H1H27747P 145214 5,3 H1H27747P-N3 1 2523,8 H1H27747P-LP1 H1H27749P 143441 4 H1H27749P-N3 1 2523,8 H1H27749P-LP1 H1H17751P 146092 3,8 H1H17751P-N3 1 2523,8 H1H17751P-LP1 H1H27754P 145477 4,2 H1H27754P-N3 1 2523,8 H1H27754P-LP1 H1H27756P 145503 H1H27756P-N3 146310 4 1 2523,8 H1H27756P-LP1 156424 4 H1H17759P2 145126 H1H17759P2-N3 145930 4 1 2523,8 H1H17759P2-LP1 156046 4 H1H17760P 145611 H1H17760P2-N3 146431 4 1 2523,8 H1H17760P2-LP1 156533 4 H1H17761P2 145508 H1H17761P2-N3 146717 6
# LP MW (LP) Ab, Ab-N3 ou ncADC MS m/z DAR (ESI- (ncADC) MS) 1 2523,8 H1H17761P-LP1 161884 5,34 159158 H1H27762P2 144371 H1H27762P2-N3 145177 4 1 2523,8 H1H27762P2-LP1 155294 4 H1H27766P2 146314 H1H27766P2-N3 147121 4 1 2523,8 H1H27766P2-LP1 157236 4 H1H27771P2 145966 H1H27771P2-N3 146774 4 1 2523,8 H1H27771P2-LP1 156890 4 H1H27773P2 145533 H1H27773P2-N3 146337 4 1 2523,8 H1H27773P2-LP1 156453 4 H1H27778P2 145310 H1H27778P2-N3 146115 4 1 2523,8 H1H27778P2-LP1 156227 4 H1H21231N H1H21231N-N3 Lot2 2 1 2523,8 H1H21231N-LP1 Lot4 1,9 H1H21227N H1H21227N -N3 Lot2 4 1 2523,8 H1H21227N -LP1 Lot3 3,7 H1H21231N H1H21231N -N3 Lot2 6 1 2523,8 H1H21231N -LP1 Lot3 5,9 H1H21235N 145487 H1H21235N -N3 146288 4 1 2523,8 H1H21235N -LP1 156390 4,1 H1H25700N 145484 H1H25700N -N3 146688 6
# LP MW (LP) Ab, Ab-N3 ou ncADC MS m/z DAR (ESI- (ncADC) MS) 1 2523,8 H1H25700N -LP1 161873 6 H1H25690N 145157 H1H25690N -N3 145969 4 1 2523,8 H1H25690N -LP1 156060 4,1 H1H25695N 145736 H1H25695N -N3 146537 4 1 2523,8 H1H25695N -LP1 156637 3,9 H1H25685N 145380 H1H25685N -N3 146582 6 1 2523,8 H1H25685N -LP1 161767 5,8 H1H21228N 144830 H1H21228N -N3 145631 4 1 2523,8 H1H21228N -LP1 155732 4,2 H1H21234N 145790 H1H21234N -N3 146583 4 1 2523,8 H1H21234N -LP1 156691 4 2 2848,1 H1H21234N -LP2 157983 3,9 4 1313,7 H1H21234N -LP4 151841 3,9 5 2846,2 H1H21234N -LP5 157963 3,9 6 2246,7 H1H21234N -LP6 155570 3,9 9 1597,9 H1H21234N -LP9 152975 3,9 11 1597,0 H1H21234N -LP11 152979 3,9 12 1608,6 H1H21234N -LP12 153019 3,9 13 1405,6 H1H21234N -LP13 152218 3,9 14 2695,9 H1H21234N -LP14 157369 3,6 15 2096,4 H1H21234N -LP15 154964 3,9 3 1497,7 H1H21234N -LP3 152568 3,9
Fel D1 Controle Isótipo- N297Q
# LP MW (LP) Ab, Ab-N3 ou ncADC MS m/z DAR (ESI- (ncADC) MS) Controle Isótipo- 146251 4 N297Q-N3 1 2523,8 Controle Isótipo- 156352 3,9 N297Q-LP1 13 1405,6 Controle Isótipo- 152218 3,9 N297Q-LP13 14 2695,9 Controle Isótipo- 157369 3,6 N297Q-LP14 15 2096,4 Controle Isótipo- 154964 3,9 N297Q-LP15 3 1496,7 Controle Isótipo- 152568 4 N297Q-LP3 Exemplo 30. Cinética de Ligação Derivada de Ressonância de Plasmons de Superfície Biacore de Conjugados de Anticorpo An- ti-MSR1-Fármaco
[00813] Os anticorpos para MSR1 descritos aqui foram conjugados a vários receptor de fígado X (LXR) cargas úteis ou vários esteroides cargas úteis. Esse exemplo descreve como valores de constante de dissociação de equilíbrio (KD) para reagentes de MSR1 humano se ligam a conjugados anticorpo anti-MSR1 humano-fármaco e seus anti- corpos parentais não conjugados correspondentes foram determina- dos usando um biossensor Biacore T200 baseado em ressonância de plasmons de superfície em tempo real.
[00814] Todos os estudos de ligação foram realizados em HEPES 10 mM, NaCl 300 mM, EDTA 3 mM e Tensoativo Tween-20 0,05 v/v, tampão contínuo pH 7,4 (HBS-ET) a 25º C. A superfície do sensor chip Biacore CM4 foi primeiro derivatizada através de acoplamento amina com o anticorpo policlonal específico de Fcγ anti-humano de cabra (Jackson ImmunoResearch Laboratories, #Cat BR-1008-39) para cap- turar anticorpos monoclonais anti-MSR1. Estudos de ligação foram re-
alizados em domínio extracelular de MSR1 humano expresso com marcador não histidina N-terminal (His9-hMSR1; R&D Systems, #Cat 2708-MS). Concentrações diferentes de His9-hMSR1 (100 nM - 3,7 nM ou 30 nM - 3,33 nM; diluição seria 3 vezes) foram primeiro preparadas em tampão contínuo HBS-ET e foram injetadas na superfície de anti- corpo monoclonal anti-MSR1 capturado com Fcγ anti-humano por 3 minutos em uma taxa de fluxo de 50 µL/minuto, enquanto a dissocia- ção de reagente de MSR1 ligado a anticorpo monoclonal foi monitora- da por cerca de 8-10 minutos em tampão contínuo HBS-ET.
[00815] A taxa de associação (ka) e a taxa de dissociação (kd) foram determinadas através de ajuste dos sensorgramas de ligação em tem- po real a um modelo de ligação 1:1 com limitação de transporte de massa usando software de ajuste de curva Scrubber 2.0c. Constante de equilíbrio de dissociação de ligação (KD) e meia-vida dissociativa (t1/2) foram calculadas a partir das taxas cinéticas como: KD (M) = e t½ (min) =
[00816] Parâmetros de cinética de ligação para His9-hMSR1 se li- gando a ADCs anticorpo anti-MSR1-LXR diferentes e seus anticorpos parentais não conjugados a 25º C são mostrados na Tabela 19. "LP1" representa um ligador-carga útil para o qual a estrutura de carga útil é provida no Exemplo 11. Tabela 19. Cinética de ligação de ligação de His-hMSR1 se ligando a ADCs Anticorpo para MSR1-LXR e Anticorpos Não conjugados Correspondentes a 25º C Anticorpo Capturado ka (M-1s-1) kd (s-1) KD (Molar) t½ (min) H1H27729P-N297Q 1,05E+05 9,06E-04 8,67E-09 12,8 H1H27729P-N297Q-LP1 5,47E+04 7,18E-04 1,31E-08 16,1 H1H27731P-N297Q 1,17E+05 1,00E-05 8,55E-11 1155,2 H1H27731P-N297Q-LP1 1,28E+05 1,00E-05* 7,80E-11 1155,2 H1H27732P-N297Q 2,20E+05 1,00E-05* 4,50E-11 1155,2
Anticorpo Capturado ka (M-1s-1) kd (s-1) KD (Molar) t½ (min) H1H27732P-N297Q-LP1 1,50E+05 1,00E-05* 6,60E-11 1155,2 H1H27734P-N297Q 7,72E+04 5,96E-04 7,72E-09 19,4 H1H27734P-N297Q-LP1 6,93E+04 4,49E-04 6,49E-09 25,7 H1H27736P-N297Q 1,14E+05 1,47E-04 1,29E-09 78,7 H1H27736P-N297Q-LP1 9,59E+04 1,21E-04 1,26E-09 95,5 H1H27739P-N297Q 1,19E+05 5,55E-04 4,68E-09 20,8 H1H27739P-N297Q-LP1 8,88E+04 7,22E-04 8,14E-09 16,0 H1H27747P-N297Q 1,17E+05 2,62E-04 2,24E-09 44,1 H1H27747P-N297Q-LP1 1,36E+05 2,03E-04 1,49E-09 56,9 H1H27749P-N297Q 1,43E+05 1,00E-05* 6,99E-11 1155,2 H1H27749P-N297Q-LP1 1,40E+05 1,00E-05* 7,16E-11 1155,2 H1H27751P-N297Q 2,10E+05 1,75E-04 8,33E-10 66,1 H1H27751P-N297Q-LP1 2,29E+05 1,52E-04 6,64E-10 76,1 H1H27754P-N297Q 2,00E+05 1,00E-05* 4,99E-11 1155,2 H1H27754P-N297Q-LP1 1,77E+05 1,00E-05* 5,64E-11 1155,2 H1H27756P-N297Q 7,21E+04 1,19E-04 1,65E-09 97,4 H1H27756P-N297Q-LP1 6,27E+04 1,10E-04 1,76E-09 104,7 H1H27759P-N297Q 1,03E+05 4,35E-04 4,23E-09 26,6 H1H27759P-N297Q-LP1 1,30E+05 5,95E-04 4,57E-09 19,4 H1H27760P-N297Q 2,31E+05 3,83E-04 1,66E-09 30,2 H1H27760P-N297Q-LP1 2,59E+05 4,34E-04 1,67E-09 26,6 H1H27761P-N297Q 5,95E+05 3,62E-04 6,09E-10 31,9 H1H27761P-N297Q-LP1 2,53E+05 5,11E-04 2,02E-09 22,6 H1H27762P-N297Q 4,05E+05 5,60E-04 1,38E-09 20,6 H1H27762P-N297Q-LP1 4,83E+05 6,23E-04 1,29E-09 18,5 H1H27766P-N297Q 1,72E+05 1,00E-05* 5,83E-11 1155,2 H1H27766P-N297Q-LP1 4,16E+05 2,70E-05 6,49E-11 427,4 H1H27771P-N297Q 3,83E+05 3,55E-04 9,26E-10 32,6 H1H27771P-N297Q-LP1 3,38E+05 4,42E-04 1,31E-09 26,1 H1H27773P-N297Q 5,49E+04 7,52E-04 1,37E-08 15,4 H1H27773P-N297Q-LP1 2,72E+04 9,47E-04 3,48E-08 12,2
Anticorpo Capturado ka (M-1s-1) kd (s-1) KD (Molar) t½ (min) H1H27778P-N297Q 1,66E+05 2,71E-04 1,63E-09 42,6 H1H27778P-N297Q-LP1 2,85E+05 2,76E-04 9,70E-10 41,8 H1H21234N-N297Q 2,20E+05 1,00E-05* 4,54E-11 1155,2 H1H21234N-N297Q-LP1 4,90E+05 1,00E-05* 2,04E-11 1155,2 H1xH29273P2 8,20E+04 7,63E-03 9,30E-08 1,5 H1xH29282P2 8,28E+04 3,62E-03 4,37E-08 3,2 H1xH29283P2 1,39E+05 1,85E-03 1,34E-08 6,2 * indica que nenhuma dissociação de His9-hMSR1 foi observada sob as condições experimentais atuais e o valor de kd foi manualmente fi- xado em 1,00E-05 enquanto ajustando os dados $ indica que nenhuma ligação foi observada sob as condições experi- mentais atuais
[00817] A 25º C, conjugados de anticorpo anti-MSR1-LXR diferen- tes se ligaram a 9xHis-hMSR1 com valores de KD variando de menos do que ou igual a 0,6 pM a 34,8 nM, enquanto os anticorpos parentais não conjugados se ligaram a 9xHis-hMSR1 com valores de KD varian- do de menos do que ou igual a 0,6 pM a 13,7 nM como mostrado na Tabela 19.
[00818] Os estudos de ligação foram repetidos com anticorpo anti- MSR1 H1H21234-N297Q e esteroide ligador cargas úteis (LPs). Pa- râmetros de cinética de ligação para ligação de His9-hMSR1 a 25°C são mostrados na Tabela 20. "LP3" representa um ligador-carga útil para o qual a estrutura é provida no Exemplo 23 e "LP13" representa um ligador-carga útil para o qual a estrutura é provida no Exemplo 24.
Tabela 20. Cinética de ligação de His-hMSR1 se ligando a ADCs de Anticorpo MSR1-Esteroie e Anticorpo Não conjugado corres- pondente a 25º C Anticorpo Capturado ka (M-1s-1) kd (s-1) KD (Molar) t½ (min) H1H21234N-N297Q * 3,00E+05 1,00E-05 3,33E-11 1155,2 H1H21234N-N297Q-LP3 * 4,17E+05 1,00E-05 2,40E-11 1155,2 H1H21234N-N297Q-LP13 * 4,00E+05 1,00E-05 2,50E-11 1155,2 * indica que nenhuma dissociação de His9-hMSR1 foi observada sob as condições experimentais atuais e o valor de kd foi manualmente fi- xado em 1,00E-05 enquanto ajustando os dados $ indica que nenhuma ligação foi observada sob as condições experi- mentais atuais
[00819] A 25º C, um anticorpo monoclonal anti-MSR1 conjugado com LP3 e LP12 se ligou a His9-hMSR1 com valores de KD variando de 25,0 pM e 24,0 pM, respectivamente, como mostrado na Tabela 20. Em comparação, o anticorpo monoclonal anti-MSR1 não conjugado correspondente esse ligou a His9-hMSR1 com um valor de KD de 33,3 pM. Exemplo 31. Conjugados de Anticorpo Anti-MSR1-LXR Ativam Si- nalização de LXR em um Bioensaio de LXR-Repórter de Lucifera- se
[00820] Geração de linhagem de célula de ensaio. Para testar a efi- cácia de conjugados de anticorpo anti-MSR1-LXR in vitro, um ensaio de repórter da luciferase responsivo de LXR baseado em célula foi de- senvolvido. Para gerar a linhagem de célula de ensaio, um estojo de gene repórter da luciferase regulado por LXR [Cignal Lenti LXR Repor- ter (luc) (Qiagen, # CatCLS-001L)] foi transduzido em células THP1 e as células foram selecionadas por duas semanas em puromicina. Os lentivírus expressa o gene da luciferase de gafanhoto sob o controle de um promotor de CMV mínimo e repetições em tandem do elemento de resposta transcripcional a LXR. A linhagem de célula resultante é referida como células THP1/LXR-Luc.
[00821] Protocolo de ensaio. Células THP1/LXR-Luc foram semea- das em placas de 96 poços a 40.000 células/poço em meio conapre- sentando RPMI suplementado com FBS 10% e penicili- na/estreptomicina e subsequentemente diferenciadas com Phorbol Myristate Acetate (PMA) 200 nM por 3 dias. Depois do período de dife- renciação de 3 dias, diluições seriais de 3 vezes de conjugados de an- ticorpo fármaco, anticorpos não conjugados ou cargas úteis em meios frescos foram adicionadas às células em concentração final variando de 100 nM a 0,01 nM. Meio sozinho serviu como um controle vazio. Quarenta e oito horas depois, atividade de luciferase foi determinada após a adição de reagente One-Glo™ (Promega, #Cat E6130) a cada poço. Unidades de luz relativas (RLUs) foram medidas em um lumi- nômetro Victor (PerkinElmer) e valores de EC50 foram determinados usando uma equação logística de quatro parâmetros em uma curva de dose-resposta de 10 pontos (GraphPad Prism). O valor de EC50 de ca- da reagente testado é mostrado na Tabela 21. O sinal para ruído (S/N) foi determinado calculando a razão de RLU do padrão um com relação ao RLU do padrão oito para cada um dos anticorpos anti-MSR1 não conjugados ou cargas úteis livres. "LP#" representa um ligador-carga útil ao qual as estruturas correspondentes são providas em um outro local aqui e "P#" representa uma carga útil para a qual as estruturas correspondentes são providas em um outro local aqui. Tabela 21. Atividade Agonista de Conjugados Anticorpo Anti- MSR2-LXR, Cargas úteis e Anticorpos Não conjugados Molécula testada EC50 (M) S/N H1H21231N-N297Q-LP1 8,6E-10 14,5 H1H21227N-N297Q-LP1 8,9E-10 31,0 H1H21231N-N297Q-LP1 1,73E-09 38,6 H1H21234N-N297Q-LP1 3,65E-09 18,4
Molécula testada EC50 (M) S/N H1H21234N-N297Q-LP4 6,3E-10 9,0 H1H21234N-N297Q-LP5 9,8E-10 9,6 H1H21234N-N297Q-LP6 1,02E-09 9,2 H1H21234N-N297Q-LP12 Nenhuma ativação 1,5 H1H21234N-N297Q-LP9 1,12E-09 8,3 H1H21234N-N297Q-LP11 8,1E-10 10,0 H1H21234N-N297Q-LP2 8,7E-10 9,1 H1H27729P-N297Q-LP1 1,64E-09 14,5 H1H27731P-N297Q-LP1 1,46E-09 15,5 H1H27732P-N297Q-LP1 8,2E-10 19,1 H1H27734P-N297Q-LP1 5,19E-09 17,8 H1H27736P-N297Q-LP1 1,01E-09 16,4 H1H27739P-N297Q-LP1 1,60E-09 21,0 H1H27747P-N297Q-LP1 4,77E-09 20,6 H1H27749P-N297Q-LP1 1,46E-09 13,1 H1H27751P-N297Q-LP1 1,54E-09 17,9 H1H27754P-N297Q-LP1 1,30E-09 17,3 H1H27756P-N297Q-LP1 1,61E-09 18,6 H1H27759P-N297Q-LP1 5,94E-09 18,9 H1H27760P-N297Q-LP1 6,34E-09 21,5 H1H27761P-N297Q-LP1 5,72E-09 20,7 H1H27762P-N297Q-LP1 7,02E-09 16,4 H1H27766P-N297Q-LP1 1,277E-08 11,3 H1H27771P-N297Q-LP1 2,41E-09 17,3 H1H27773P-N297Q-LP1 >4,05E-08 12,9 H1H27778P-N297Q-LP1 1,51E-09 16,1 H1H21235N-N297Q-LP1 8,3E-10 8,2 H1H25700N-N297Q-LP1 1,13E-09 7,4 H1H25690N-N297Q-LP1 2,5E-10 8,0 H1H25695N-N297Q-LP1 1,87E-09 9,8 H1H25685N-N297Q-LP1 7,8E-10 8,3 H1H21228N-N297Q-LP1 1,8E-09 8,6
Molécula testada EC50 (M) S/N Controle de Isótipo-N297Q-LP1 >6,6E-08 2,7 H1H21234N-N297Q Nenhuma ativação Nenhuma ativação P1 1,14E-09 15,9 P5 4,6E-10 5,7 P7 2,09E-09 8,9 P6 3,7E-10 8,3
[00822] Como mostrado na Tabela 21, no ponto de tempo de 48 horas, todos os anticorpos anti-MSR1 conjugados com LP1 demons- traram estimulação das células THP1/Luc com valores de EC50 varian- do de 0,2 nM a mais do que 140,5 nM com valores de EC50 variando de 0,2 nM a maios do que 140,5 nM com valores S/N variando de 7,4 a 38,6. Um conjugado de anticorpo anti-MSR1-LXR exemplar (H1H21234N-N297Q-LP1) demonstrou estimulação das células THP1/Luc com um valor de EC50 de 3,7 nM e S/N de 18,4. A carga li- vre útil, P1, demonstrou estimulação das células THP1/Luc com uma EC50 média de 15,9 nM. O anticorpo de controle de isótipo conjugado com LP1 (Controle de isótipo-LP1) tinha um valor de EC50 média de >66 nM e S/N de 2,7. Adicionalmente, H1H21234N-N297Q com ligador agonista de LXR/cargas úteis adicionais (H1H21234N-N297Q-LP4, H1H21234N-N297Q-LP5, H1H21234N-N297Q-LP6, H1H21234N- N297Q-LP12, H1H21234N-N297Q-LP9, H1H21234N-N297Q-LP11 e H1H21234N-N297Q-LP2) demonstraram estimulação das células THP1/Luc com valores de EC50 variando de 0,63 nM a mais de 73 nM e S/N variando de 1,4 a 10. Em contraste, um anticorpo anti-MSR1 conjugado a um ligador agonista de LXR-carga útil (H1H21234N- N297Q-LP12), que agiu como comparadores no ensaio, não demons- trou nenhuma ativação das células THP1/Luc. Agonista de LXR cargas úteis adicionais testadas (P5, P7 e P6) demonstraram estimulação das células THP1/Luc com valores de EC50 variando de 0,37 nM a 2,09 nM e S/N variando de 5,7 a 8,9. Um anticorpo anti-MSR1 não conju-
gado (H1H21234N) sozinho não teve nenhum impacto sobre estimula- ção das células THP/Luc. Exemplo 32. Conjugados Anticorpo Anti-MSR1-Esteroide Inibem a Liberação de IL-1β Mediada por LPS In vitro
[00823] Para testar as propriedades anti-inflamatórias de conjuga- dos de anticorpo anti-MSR1-esteroide in vitro, um ensaio de liberação de IL-1β mediada por lipopolissacarídeo (LPS) foi realizado. Para o ensaio, células THP-1 foram semeadas em placas de 96 poços a
40.000 células/poço em meio conapresentando RPMI suplementado com FBS 10% e penicilina/estreptomicina e diferenciadas com Phorbol Myristate Acetate (PMA) 200 nM por 3 dias. Após um período de dife- renciação de 3 dias, diluições seriais de 3 vezes de conjugados de an- ticorpo fármaco, anticorpos não conjugados ou cargas úteis livres em meios frescos foram adicionadas às células em concentração final va- riando de 100 nM a 0,01 nM. Meio sozinho serviu como um controle vazio. Subsequentemente em 24, 48 e 72 horas depois, as células fo- ram tratadas com 100 ng/mL de LPS (InVivoGen, #Cat tlrl-eklps) por 5 horas. Os meios celulares foram então coletados e níveis de IL-1β foram medidos usando um estojo humano V-PLEX Proinflammatory Panel 1 (Meso Scale Diagnostics, Cat # 15049D-2) de acordo com as instruções do fabricante. Subsequentemente, a placa foi lida em um instrumento Meso Scale Diagnostics.
[00824] Os valores de IC50 foram determinados a partir de uma equação logística de quatro parâmetros em uma curva de dose- respostas de 10 pontos (GraphPad Prism). Todos os valores de IC50 são expressos em concentração M (molar). Os valores de IC50 e quan- tidade de IL-1β na concentração máxima de conjugados de anticorpo- esteroide ou controles são mostrados na Tabela 22 cada uma do pon- to de tempo testado. Tabela 22. Liberação de IL-1β Induzida por LPS de Conjugados
Anticorpo anti-MSR1-Esteroide 24 horas 48 horas 72 horas Molécula EC50 Liberação EC50 (M) Liberação EC50 (M) Liberação de (M) de IL1beta de IL1beta IL1beta em em concen- em concen- concentração tração má- tração má- máxima testa- xima testa- xima testa- da (pg/mL) da (pg/mL) da (pg/mL) H1H21234N- 6,287E- 119,43 3,586E- 69,3 1,7E-09 70,31 N297Q-LP13 09 09 Controle isóti- NA 209,6 NA 279,4 NA 276,27 po-N297Q- LP13 H1H21234N- NA 234,21 NA 267,7 NA 355,76 N297Q P4 8,486E- 43,39 1,017E- 9,3 1,199E- 12,95 10 09 09 Dexametasona 4,199E- 45,33 7,941E- 11,8 5,433E- 13,34 10 10 10
[00825] Como mostrado na Tabela 22, no ponto de tempo de 24 horas, o conjugado de anticorpo anti-MSR1-esteroide (H1H21234N- N297Q-LP13) inibiu secreção de IL-1β induzida por LPS com uma IC50 de 6,287 nM. A carga útil P4 livre e o controle de carga útil livre De- xametasona inibiram secreção de IL-1β induzida por LPS com valores de IC50 de 0,8486 nM e 0,4199, respectivamente. Nem o anticorpo de controle de isótipo conjugado com LP12 (controle de isótipo N297Q- LP13) nem o anticorpo anti-MSR1 não conjugado (H1H21234N- N297Q) teve qualquer impacto sobre liberação de IL-1β induzida por LPS.
[00826] Como mostrado na Tabela 22, no ponto de tempo de 48 horas, o conjugado de anticorpo anti-MSR1-esteroide (H1H21234N- N297Q-LP13) inibiu secreção de IL-1β induzida por LPS com uma IC50 de 3,586 nM. A carga útil P4 livre e o controle de carga útil livre De- xametasona inibiram secreção de IL-1β induzida por LPS com valores de IC50 de 1,017 nM e 0,7941 nM, respectivamente. Nem o anticorpo de controle de isótipo conjugado com LP13 (controle de isótipo- N297Q-LP13) nem o anticorpo anti-MSR1 não conjugado (H1H21234N-N297Q) teve qualquer impacto sobre liberação de IL-1β induzida por LPS.
[00827] Como mostrado na Tabela 22, no ponto de tempo de 72 horas, o conjugado de anticorpo anti-MSR1-esteroide (H1H21234N- N297Q-LP13) inibiu secreção de IL-1β induzida por LPS com uma IC50 de 1,7 nM. A carga útil P4 livre e o controle de carga útil livre Dexame- tasona inibiram secreção de IL-1β induzida por LPS com valores de IC50 de 1,199 nM e 0,5433 nM, respectivamente. Nem o anticorpo de controle de isótipo conjugado com LP13 (controle de isótipo-N297Q- LP13) nem o anticorpo anti-MSR1 não conjugado (H1H21234N- N297Q) teve qualquer impacto sobre liberação de IL-1β induzida por LPS. Exemplo 33. Conjugados Anticorpo Anti-MSR1-Esteroide Inibem Liberação de Respostas Inflamatórias Mediadas por LPS In Vivo
[00828] Para examinar o efeito anti-inflamatório dos conjugados an- ticorpo anti-MSR1-esteroide, um modelo de resposta imune inflamató- ria induzida por LPS ex vivo e in vivo foi realizado.
[00829] Geração de um modelo de resposta imune inflamatória de camundongo. Camundongos expressando homoziguamente domínio extracelular de MSR1 humano no lugar do domínio extracelular de MSR1 de camundongo e com uma deleção homozigota do gene ApoE foram utilizados (camundongos resultantes referidos como camundon- gos Msr1hu/hu ApoE-/-).
[00830] Protocolo de ensaio para respostas induzidas por LPS ex vivo. Em experimentos de provocação de LPS ex vivo, os camundon- gos foram administrados intraperitonealmente com 10 μL/g de conju- gados de anticorpo anti-MSR1-esteroide (H1H21234N-N297Q-LP13), conjugado de controle de isótipo esteroide (Controle de isótipo-LP12),
anticorpo anti-MSR1 não conjugado (H1H21234N-N297Q) e anticor- pos de controle de isótipo em pontos de tempo diferentes (24, 48 e 72 horas) antes da coleta das células peritoneais a partir da cavidade pe- ritoneal.
PBS e esteroides livres P4 e Dexametasona (Henry Schein Animal Health, #Cat NDC#11695-4017-1) foram injetados intraperito- nealmente em 2 horas antes do isolamento da célula peritoneal.
Proto- colo de dosagem e tratamento experimental para grupos de camun- dongos são mostrados na Tabela 23. Todos os camundongos foram sacrificados no ponto de tempo de 0 hora e células peritoneais foram obtidas a partir do peritônio através da técnica de lavagem peritoneal.
Em suma, 5 mL de 1xPBS gelado (ThermoFisher Scientific, #Cat 20012027) conapresentando BSA 25 (Gibco, #Cat A9576) e 0,6mM de EDTA (ThermoFisher Scientific, #Cat 15575020) foram injetados na cavidade peritoneal usando agulha de 27g.
Células peritoneais foram coletadas em tubos de 15 mL com agulha de 20g acoplada à seringa de 5 mL, centrifugadas a 300xg por 8 minutos e ajustadas para 1x106 células/mL em RPMI-1640 (ThermoFisher Scientific, #15140122) co- napresentando 10% de FBS (ThermoFisher Scientific, Cat #10082147) e 1% de penicilina-estreptomicina (ThermoFisher Scientific, #Cat 11875093). As células ressuspensas foram plaqueadas a 500.000 cé- lulas por poço em placas de cultura de tecido de 24 poços e incubadas com ou sem 10 ng/mL de LPS por 18 horas.
Tabela 23. Protocolo de Projeto, Dosagem e Tratamento de Expe- rimento para Experimento de Provocação com LPS Ex Vivo In vivo Ex vivo Camun- Provocação Dose Grupo dongos Molécula Testada com LPS (10 (mg/kg) (n) ng/mL) 1 3 H1H21234N-N297Q-LP13 96,08 +/- LPS 72 ho- 2 3 Controle Isótipo-N297Q-LP13 97,07 +/- LPS ras 3 3 H1H21234N-N297Q 96,08 +/- LPS 4 3 Controle Isótipo -N297Q 97,07 +/- LPS
In vivo Ex vivo Camun- Provocação Dose Grupo dongos Molécula Testada com LPS (10 (mg/kg) (n) ng/mL) 5 3 H1H21234N-N297Q-LP13 96,08 +/- LPS 48 ho- 6 3 Controle Isótipo -N297Q-LP13 97,07 +/- LPS ras 7 3 H1H21234N-N297Q 96,08 +/- LPS 8 3 Controle Isótipo -N297Q 97,07 +/- LPS 9 3 H1H21234N-N297Q-LP13 96,08 +/- LPS 24 ho- 10 3 Controle Isótipo-N297Q-LP13 97,07 +/- LPS ras 11 3 H1H21234N-N297Q 96,08 +/- LPS 12 3 Controle Isótipo-N297Q 97,07 +/- LPS 13 3 PBS - +/- LPS 2 horas 14 3 Dexametasona 1 +/- LPS 15 3 P4 1,48 +/- LPS
[00831] Protocolo de ensaio para respostas induzidas por LPS in vivo. Em experimentos de provocação com LPS in vivo, os camundon- gos foram administrados intraperitonealmente com 10 μL/g de concen- trações decrescentes de conjugados de anticorpo anti-MSR1-esteroide (H1H21234N-N297Q-LP13) e conjugado de controle de isótipo este- roide (Controle de isótipo-N297Q-LP13) em 24 horas antes da provo- cação com LPS in vivo. PBS e esteroide P4 livre foram injetados intra- peritonealmente em 2 horas antes da provocação com LPS in vivo. Protocolos de dosagem e tratamento experimental para grupos de ca- mundongos são mostrados na Tabela 24. No ponto de tempo de 0 ho- ra, três gotas grandes de sangue (volume ~100 μL) foram coletadas da veia maxilar de cada camundongo para tubos separadores de gel de soro. Os tubos foram centrifugados a 2200-2500 rpm por 15 minutos e o soro foi coletado em placas de 96 poços para medição de citocinas subsequentes. Em 18 horas pós-provocação com LPS in vivo, as célu- las peritoneais foram obtidas a partir da cavidade peritoneal como mencionado antes para análise de citometria de fluxo subsequente.
Tabela 24. Protocolo de Projeto, Dosagem e Tratamento de Expe- rimento para Experimento de Provocação com LPS Ex Vivo In vivo In vivo Camun- Provocação com Dose Grupo dongos Molécula Testada LPS (mg/kg) (n) (1μg/camundongo) 1 5 H1H21234N-N297Q-LP13 96,08 + 2 5 Controle isótipo-N297Q-LP13 97,07 + 24 3 5 H1H21234N-N297Q-LP13 32,03 + horas 4 5 Controle isótipo-N297Q-LP13 32,36 + 5 5 H1H21234N-N297Q-LP13 10,67 + 6 5 Controle isótipo-N297Q-LP13 10,79 + 7 3 PBS - - 8 5 PBS - + 2 ho- 9 P4 1,48 + ras 10 5 P4 0,49 + 11 5 P4 0,16 +
[00832] Medição de citocinas em 18 horas pós-provocação ex vivo com LPS. Os sobrenadantes foram coletados em placas de cultura de tecido de fundo redondo de 96 poços em 18 horas pós-provocação com LPS ex vivo e armazenados a 20º C até análise adicional. As concentrações de citocina nos sobrenadantes foram medidas usando um estojo de imunoensaio multiplex Proinflammatory Panel 1 (camun- dongo) (MesoScale Diagnostics, #Cat K15048D) de acordo com as instruções do fabricante. Eletroquimioluminescência foi lida em um ins- trumento Meso Scale Diagnostics SECTOR®. Análise de dados foi rea- lizada usando software GraphPad Prism software. Significância esta- tística dentro dos grupos foi determinada através de um Anova de uma via com pós-teste de comparação múltipla de Turkey (*p<0,01; **p<0,001; ***p<0,0001).
[00833] Análise de expressão de marcadores de ativação em ma- crófagos peritoneais após provocação ex vivo com LPS. Quando da coleta de sobrenadantes para análise de citocina, as placas foram la- vadas duas vezes com 1xPBS sem Ca++/Mg2++ (ThermoFisher Scienti-
fic, #Cat 14190144) e as células peritoneais aderentes foram coletadas através da adição de 250-300 μL de Macrophage Detachment Solution DXF fria (PromoCell, #Cat C41330) por 40 minutos.
As células soltas foram coletadas em tubos de 50 mL e centrifugadas a a 350xg por 15 minutos.
Após duas lavagens com 1xPBS suplementado com EDTA 2 mM, as células foram ressuspensas em Cell Staining Buffer (Biole- gend, #420201) e plaqueadas a 1x106 células por poço em uma placa de fundo em V de 96 poços.
As células foram centrifugadas e os pele- tes de célula foram ressuspensos em 100 μL de LIVE/DEAD Blue Flu- orescent Reactive Dye (Life Technologies, #Cat L34962) diluído a 1:600 em 1xPBS para determinar a viabilidade celular.
As células fo- ram incubadas em temperatura ambiente por 20 minutos no escuro.
Após uma lavagem com 1xPBS, as células foram incubadas em Cell Staining Buffer conapresentando 10g/mL de CD16/CD32 Fc Block anticamundongo de rato purificado (Clone: 2,4G2; BD Biosciences, #Cat 553142) por 10 minutos a 4oC.
As células foram lavadas uma vez e incubadas na mistura de anticorpo apropriada diluída em Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences, #Cat 566345) por 30 minutos a 4oC no escuro.
O painel de anticorpo usado para análise de citometria de fluxo é mostrado na Tabela 25. As células foram subsequentemente lavadas com 1xPBS, ressuspensas em Cell Staining Buffer e obtidas em citô- metro de fluxo FACS LSRFortessa X-20 (Becton Dickinson). Os dados foram analisados usando FlowJo (Tree Star). Tabela 25. Anticorpos usados em análise de citometria de fluxo Anticorpo Fluorcro- Fabricante Número Diluição mo Catálogo Final CD45 anticamundongo BV510 Biolegend 103138 1/200 B220 anticamundongo APC-Cy7 Biolegend 103224 1/200 TCRβ anticamundongo BV711 Biolegend 109243 1/200 CD11b anticamundongo PercP- Biolegend 101228 1/300 Cy5,5
Anticorpo Fluorcro- Fabricante Número Diluição mo Catálogo Final F4/80 anticamundongo FITC Biolegend 123108 1/200 SR-AI/MSR1 anti- PE R&D Sys- FAB2708P 1/30 humano tems TLR4 anticamundongo APC Biolegend 145405 1/200 MHCII anticamundongo BV421 Biolegend 107631 1/200 CD80 anticamundongo PE-Cy7 Biolegend 104733 1/200
[00834] Os resultados providos nas Tabelas 26 a 28, análise de ci- tometria de fluxo de células peritoneais derivadas de camundongos Msr1hu/hu ApoE-/-, revelaram que hMSR1 e TLR4 são predominante- mente expressos na superfície de macrófagos peritoneais F4/80+CD11b+ sugerindo que células MSR1+ são os principais respon- dedores à estimulação com LPS. Tabela 26. Produção de Citocina Induzida por LPS Ex Vivo para Conjugados Anticorpo Anti-MSR1-Esteroide e Controles Anticorpo/Reagente Tempo Citocina [ng/mL] IL-6 KC-GRO TNF-α PBS 2 horas 224,8 ± 11,04 26,4 ± 2,1 1,8 ± 0,3 Dexametasona 134,5 ± 18,2* 19,9 ± 1,5 0,63 ± 0,11* P4 12,98 ± 5,8**** 2,6 ± 1,3** 0,43 ± 0,06** H1H21234N-N297Q- 24 horas 21,1 ± 1,38**** 9,3 ± 1,7 0,26 ± 0,08*** LP13 Controle Isótipo-N297Q- 165,6 ± 20,7 17,8 ± 1,7 0,96 ± 0,14 LP13 H1H21234N-N297Q 261,9 ± 18,3 36,4 ± 2,9 2,02 ± 0,4 Controle Isótipo-N297Q 215,8 ± 40,1 21,9 ± 5,2 1,9 ± 0,1 H1H21234N-N297Q- 48 horas 34,02 ± 7,8** 6,3 ± 2,3* 0,58 ± 0,06* LP13 Controle Isótipo-N297Q- 113,4 ± 11,3 22,2 ± 4,2 1,2 ± 0,2 LP13 H1H21234N-N297Q 158,3 ± 11,6 15,2 ± 0,8 1,6 ± 0,3 Controle Isótipo-N297Q 143,4 ± 12,4 18,8 ± 1,8 1,12 ± 0,1 H1H21234N-N297Q- 72 horas 50,7 ± 14,1* 13,1 ± 1,1 0,47 ± 0,1** LP13
Anticorpo/Reagente Tempo Citocina [ng/mL] IL-6 KC-GRO TNF-α Controle Isótipo-N297Q- 132,1 ± 18,9 20,8 ± 2,7 0,92 ± 0,07 LP13 H1H21234N-N297Q 228,6 ± 19,7 27,1 ± 3,5 1,09 ± 0,2 Controle Isótipo-N297Q 284,5 ± 14,9 29,4 ± 8,2 1,2 ± 0,2
[00835] Como mostrado na Tabela 26, provocação com LPS ex vivo induziu produção robusta de IL-6, KC-GRO e TNF-α por células perito- neais derivadas de camundongos Msr1hu/hu ApoE-/- pretratados com PBS. Ao contrário, administração in vivo de conjugados de MSR1- ncADC (H1H21234N-N297Q-LP13) na dose equivalente a 1 mg/kg de Dexametasona foi eficaz na inibição de produção de citocina induzida por LPS por células peritoneais de uma maneira dependente do tem- po. Inibição comparável de respostas imunes induzidas por LPS foi observada entre administração de conjugados de anticorpo-esteroide em 24, 48 e 72 horas e administração de carga útil P4 livre em 2 horas (Tabela 26). Um efeito similar de inibição de respostas imune induzida por LPS foi observado entre administração de conjugados de controle de isótipo-esteroide em 24, 48 e 72 horas e Dexametasona em 2 horas (Tabela 26). Nenhum efeito sobre produção de citocina induzida por LPS foi observado com conjugado de controle de isótipo-esteroide (Controle de isótipo-N297Q-LP13), anticorpo anti-MSR1 não conjuga- do (H1H21234N-N297Q) e anticorpos de controle de isótipo adminis- trados em pontos de tempo diferentes (Tabela 26). Tabela 27. Produção de Citocina Induzida por LPS In vivo em Soro para Conjugados de Anticorpo Anti-MSR1-Esteroide e Controles Anticor- Concentração Tempo Citocina [ng/mL] po/Reagente Administração IL-6 KC-GRO TNF-α (mg/kg) PBS - 2 horas 56,94 ± 9,3 13,97 ± 1,7 1,7 ± 0,3 P4 1,48 3,51 ± 0,7*** 4,1 ± 1,5* 0,09 ± 0,02*** P4 0,49 11,89 ± 7,7** 6,7 ± 2,3 0,2 ± 0,04*** P4 0,16 19,15 ± 1,1* 15,1 ± 1,2 0,6 ± 0,05***
Anticor- Concentração Tempo Citocina [ng/mL] po/Reagente Administração IL-6 KC-GRO TNF-α (mg/kg) H1H21234N- 96,08 24 horas 7,7 ± 3,1*** 5,1 ± 1,5* 0,42 ± 0,14*** N297Q-LP13 32,03 15,34 ± 5,2*** 10,6 ± 2,8 0,48 ± 0,18*** 10,67 33 ± 8,1 13,3 ± 1,2 0,51 ± 0,08*** Controle Isó- 97,07 24 horas 33,6 ± 4,1 19,2 ± 0,6 2,6 ± 0,92 tipo-N297Q- 32,36 65,9 ± 7,8 18,2 ± 1,7 2 ± 0,67 LP13 10,79 76,3 ± 9,9 19,9 ± 2,1 1,9 ± 0,62
[00836] Administração in vivo de conjugados de MSR1-esteroide (H1H21234N-N297Q-LP13) foi também eficaz na inibição de produção de citocina induzida por LPS in vivo de uma maneira dependente da dose em camundongos Msr1hu/hu ApoE-/- 2 horas pós-provocação com LPS (Tabela 27). Nenhum efeito de produção de citocina induzida por LPS in vivo foi observado com controle de isótipo-ncADC (Controle de isótipo-N297Q-LP13, Tabela 27). Tabela 28. Produção de Citocina Induzida por LPS Ex Vivo para Conjugados de Anticorpo Anti-MSR1-Esteroide e Controles Anticorpo/Reagente Tempo Expressão de CD80 mediada por LPC [% em relação a tratamento com PBS/LPS] Células pMΦ Células não pMΦ Dexametasona 2 horas 77,69 ± 2,6 99,6 ± 5,8 P4 54,7 ± 3,8**** 93,02 ± 4,4 H1H21234N-N297Q- 24 horas 61,1 ± 1,3*** 95,5 ± 2,6 LP13 Controle Isótipo- 94,9 ±7,2 90,22 ± 5,2 N297Q-LP13 H1H21234N-N297Q 76,8 ± 2,3 98,9 ± 3,1 Controle Isótipo- 75,6 ± 4 100,8 ± 8,5 N297Q H1H21234N-N297Q- 48 horas 58,7 ± 4,2**** 99 ± 1,8 LP13
Anticorpo/Reagente Tempo Expressão de CD80 mediada por LPC [% em relação a tratamento com PBS/LPS] Células pMΦ Células não pMΦ Controle Isótipo - 75,9 ± 3,8 95,4 ± 5,2 N297Q-LP13 H1H21234N-N297Q 81,9 ± 2 100,4 ± 3,3 Controle Isótipo- 87,4 ± 0,6 107,7 ± 6,7 N297Q H1H21234N-N297Q- 72 horas 63,9 ± 1,01*** 102,3 ± 0,14 LP13 Controle Isótipo- 85,3 ± 12,04 95,6 ± 2,2 N297Q-LP13 H1H21234N-N297Q 82,9 ± 5,9 96,3 ± 3,3 Controle Isótipo- 86,4 ± 4,3 96,8 ± 8,8 N297Q
[00837] Ainda, como ilustrado na Tabela 28, administração in vivo de conjugado de anticorpo anti-MSR1-esteroide (H1H21234N-N297Q- LP13) levou a uma redução significante de expressão de CD80 medi- ada por LPS em macrófagos peritoneais hMSR1+F4/80+CD11b+ (pMΦ), mas não em células hMSR1-F4/80-CD11b- (não pMΦ). Ne- nhum efeito sobre expressão de CD80 foi observado com anticorpos de controle de isótipo (Tabela 28). Exemplo 34. Conjugados de Anticorpo Anti-MSR1-LXR Ativam Efluxo de Colesterol em Células THP-1
[00838] A habilidade de conjugados de anticorpo anti-MSR1-LXR em ativar efluxo de colesterol em uma linhagem de célula de macrófa- go humana (THP-1; ATCC #Catálogo TIB-202) foi avaliada usando um análogo de colesterol fluorescente.
[00839] Em suma, células THP-1 foram semeadas em placas reves- tidas com poli-lisina de 96 poços (Corning, #Catálogo 354640) a
100.000 células / poço em meio RPMI 1640 (Irvine Scientific, #Catálo-
go 9160) conapresentando 10% de FBS (Gibco, #Catálogo 1043010), 10 μg/mL de penicilina-estreptomicina (Gibco, #Catálogo 15140122) e incubadas a 5% de CO2 a 37 °C. As células foram diferenciadas em macrófagos através da adição de 100 nM de Phorbol-12 miristato 13- acetato (Sigma, #Catálogo P8139) ao meio e submetidas à incubação adicional por 96 horas. Macrófagos diferenciados foram então incuba- dos em meio RPMI 1640 livre de vermelho de fenol (Gibco, #Catálogo 32404-014) conapresentando 25 μM de BODIPY-colesterol (Avanti Po- lar Lipids, #Catálogo 810255P), 0,2% de albumina de soro bovino (BSA; Sigma, #Catálogo A7211) e 10 μg/mL de penicilina- estreptomicina por 24 horas, seguido por um tratamento de 24 horas com diluições seriais variando de 1x 107 M a 5 x 10-14 M ou de carga útil livre, conjugado de anticorpo anti-MSR1-LXR (H1H21234N-N297Q- LP1), conjugado de Controle de isótipo-LXR (Controle de Isótipo- N297Q-LP1) e anticorpo anti-MSR1 não conjugado (H1H21234N- N297Q) em meio RPMI 1640 livre de vermelho de fenol conapresen- tando 0,2% de BSA. As células foram lavadas com meio RPMI 1640 de vermelho de fenol e incubadas com 100 μL de meio aceitador co- napresentando 50 μg/mL de lipoproteína de alta densidade (Millipore, #Catálogo 437641), 10 μg/mL de apolipoproteína A1 (Millipore, #Catá- logo ALP10) em meio RPMI 1640 livre de vermelho de fenol por 5 ho- ras, após o que, o meio aceitador foi coletado e as células foram lisa- das em 100 μL de tampão RIPA (Millipore, #Catálogo 20-188) por 2 horas com agitação suave em temperatura ambiente. Fluorescência foi medida nessas frações em excitação de 482 nm, emissão de 515 nm em leitora de placa SpectraMax i3 (Molecular Devices).
[00840] A porcentagem de efluxo de BODIPY-colesterol foi calcula- da usando a fórmula que segue: [fluorescência em meio aceitador / (fluorescência em meio aceitador + fluorescência em lisato celular)] x
100. A Tabela 29 provê efluxo de colesterol ativado para os artigos testados e a FIG. 17 ilustra dos dados em forma de gráfico. Tabela 29. Ativação de efluxo de colesterol por conjugados de an- ticorpo-LXR e comparadores Molécula testada Ativação de Efluxo de Efluxo Máximo Colesterol (%) EC50 (M) P1 1,5E-10 36,7 H1H21234N-N297Q-LP1 5,0E-11 36,7 Controle Isótipo-N297Q- > 6,4E-8 30,3 LP1 H1H21234N-N297Q N/A 18,7
[00841] Como mostrado na Tabela 29, após 24 horas, conjugado de H1H21234N-N297Q-LP1 demonstrou a maior quantidade de efluxo de colesterol com um efluxo percentual máximo de 36,6% e um valor de EC50 de 50 pM. A carga útil P1 livre demonstrou a segunda maior quantidade de efluxo de colesterol com um efluxo percentual máximo de 36,6% e um valor de EC50 de 150 pM. O conjugado de controle de isótipo-N297Q-LP1 demonstrou uma quantidade mínima de efluxo de colesterol com um efluxo percentual máximo de 30,3%. O anticorpo não conjugado, H1H21234N-N297Q, não demonstrou qualquer efluxo de colesterol mensurável. Exemplo 34A. Atividade de Cargas Úteis de Agonista de LXR em um Ensaio Repórter da Luciferase Responsivo a LXR com Base em Célula
[00842] A atividade de certas cargas úteis de agonista de LXR des- critas aqui foi avaliada em um ensaio de repórter de luciferase respon- sivo a LXR com base em célula. Para gerar a linhagem de célula de ensaio, um estojo de gene repórter da luciferase regulado por LXR (Cignal Lenti LXR Reporter (luc) (Qiagen, #Cat CLS-001L)) foi trans- duzido em células THP1 e as células foram selecionadas por duas semanas em puromicina. O lentivírus expressa o gene da luciferase de gafanhoto sob o controle de promotor de CMV mínimo e repetições em tandem do elemento de resposta transcripcional de LXR.
A linhagem de célula resultante é referida como celulasTHP1/LXR-Luc.
Para o en- saio, células THP1/LXR-Luc foram semeadas em placas de 96 poços a 40.000 células/poço em meio conapresentando RPMI suplementado com 10% de FBS e penicilina/estreptomicina e foram então diferencia- das com Phorbol Myristate Acetate (PMA) 200 nM por 3 dias.
O meio foi subsequentemente removido e substituído com 80 μL de meio fres- co sem PMA.
Diluições seriais 3 vezes de cargas úteis livres foram preparadas em 100% de DMSO, transferidas para meio fresco e 20 uL foram adicionados às células em uma concentração de DMSO cons- tante final de 0,2% e cargas úteis livres em concentrações finais vari- ando de 100 nM a 0,015 nM.
O último poço na placa serviu como um controle vazio conapresentando apenas o meio de 0,2% de DMSO (poço não tratado) e foi representado em gráfico como uma continua- ção da diluição serial de 3 vezes.
Quarenta e oito horas depois, ativi- dade da luciferase foi determinada após a adição de reagente One- Glo™ (Promega, #Cat E6130) a cada poço.
Unidades de luz relativas (RLUs) foram medidas em um luminômetro Victor (PerkinElmer) e va- lores de EC50 foram determinados usando uma equação logística de quatro parâmetros em uma curva de dose-resposta de 10 pontos (GraphPad Prism). O valor de EC50 de cada molécula testada é mos- trado na Tabela 1. O sinal para ruído (S/N) foi determinado conside- rando a razão da RLU mais alta na curva de dose-resposta para a RLU nos poços não tratados.
Como mostrado na Tabela 5, todos dos compostos de carga útil testados aumentaram a atividade de luciferase dependente de LXR em células THP1/LXR-Luc com valores de EC50 variando de 112 pM a 3,51 nM e valores de S/N variando de 10,4 a 13,8.
Tabela 30. Atividade de LXR-Repórter por Compostos de Carga útil em Células THP-1/LXR-Luc Diferenciadas Composto Carga útil EC50 (M) S/N P1 1,14E-09 11,4 P2B 2,92E-10 11,3 P4B 1,25E-10 10,4 P6B 3,34E-09 10,9 P5B 1,74E-10 13,8 P7B 2,53E-10 12,5 P9B 2,34E-10 12,8 P8B 3,51E-09 10,8 P10B 2,22E-10 11,1 P12B 2,96E-10 11,4 P11B 1,12E-10 10,7 Exemplo 34B. Conjugação de Anticorpo
[00843] Conjugação através de cisteínas de anticorpo é realizada em duas etapas usando métodos similares àqueles descritos em Mol. Pharm. 2015, 12(6), 1863-71. Em um procedimento exemplar, um an- ticorpo monoclonal (mAb) é reduzido com ditiotreitol ou TCEP. Após filtragem em gel, o ligador-carga útil apropriado em solução de DMSO é adicionado ao anticorpo reduzido, e a mistura é ajustada para o pH apropriado. A reação é deixada agitar. O conjugado resultante é purifi- cado através de SEC. Os valores de DAR (UV) são determinados usando as absorbâncias medidas do ADC e os coeficientes de extin- ção do ligador de anticorpo-carga útil.
[00844] Conjugação de anticorpo específica de sítio pode ser reali- zada, por exemplo, em duas etapas: (1) transglutaminase microbiana, por exemplo, ligação enzimática baseada em (MTG EC 2,3,2,13, Zedi- ra, Darmstadt, Alemanha) de uma azido-PEG-amina a um anticorpo mutado especificamente em sítio e (2) ligação de um ligador-carga útil apropriado ao anticorpo funcionalizado com azido-PEG-amina por meio de cicloadição [2+3], por exemplo, cicloadição 1,3-dipolar entre a porção azido do corpo funcionalizado e porção ciclo-octina apropriada do ligador-carga útil, por exemplo, química click livre de cobre. Vide Baskin, J. M.; Prescher, J. A.; Laughlin, S. T.; Agard, N. J.; Chang, P. V.; Miller, I. A.; Lo, A.; Codelli, J. A.; Bertozzi, C. R. PNAS 2007, 104 (43), 16793-7. Por exemplo, IgG de anticorpo humano aglicosilado (IgG1, IgG4, etc.) ou um isótipo de IgG1 humano em BupHTM (pH 6,5- 8,0) é misturado com ≥200 equivalentes molares de azido-dPEG3- amina (MW= 218,26 g/mol). A solução resultante é misturada com transglutaminase (25 U/mL; 5U MTG por mg de anticorpo, da Zedira, Darmstadt, Germany ou Ajinomoto, Japão) resultando em uma con- centração final do anticorpo a 0,5-5 mg/mL e a solução é mantida em pH 6,5-8,0 e então incubada a 37º C por 4-24 h enquanto agitando su- avemente. A reação é monitorada através de ESI-MS. Quando do tér- mino da reação, excesso de amina e MTG é removido por SEQ ou co- luna de proteína A eluindo com tampão ácido e então neutralizando com tampão Tris (pH 8) para gerar o anticorpo funcionalizado com azi- do. Esse produto é analisado através de SDS-PAGE e ESI. O azido- dPEG3-amina adiciona dois sítios -Q295 e Q297 - do anticorpo resul- tando em um aumento de 804 Da para o conjugado de anticorpo agli- cosilado-PEG3-Azida de 4DAR. Os sítios de conjugação são identifica- dos e confirmados em EEQLinkerYQLinkerSTYR para o azido-anticorpo funcionalizado de 4DAR por meio de mapeamento de sequência de peptídeo de cadeias pesadas digeridas com tripsina.
[00845] Em um outro exemplo, conjugados de anticorpo aglicosila- do fármaco específicos de sítio com um IgG humano (IgG1, IgG4, etc.) conapresentando uma mutação N297Q (numeração EU) são prepara- dos através de uma reação click [2+3] entre anticorpos funcionalizados com azido com um ligador conapresentando alcina-carga útil. Especifi- camente, um anticorpo IgG1 humano aglicosilado funcionalizado com azido (mAb-PEG3-N3) é conjugado a uma carga útil de ligador apropri- ada através de incubação de mAb-PEG3-N3 (1-3 mg / mL) em um meio aquoso (por exemplo, PBS, PBS conapresentando 5% de glicerol, HBS) com equivalentes molares ≥6 de uma carga útil de ligador dis- solvida em um solvente orgânico adequado, tal como DMSO, DMF ou DMA (isto é, a mistura de reação contém 5-20% de solvente orgânico, v/v) a 24º C até 37º C por mais de 6 h. O progresso da reação é moni- torado através de ESI-MS e a ausência de mAb-PEG3-N3 indicou o término da conjugação. A quantidade em excesso da carga útil de li- gador e solvente orgânico é removida através de SEC por meio de eluição com PBS, ou por meio de coluna de proteína A eluindo com tampão ácido seguido por neutralização com Tris (pH 8). Os conjuga- dos purificados são analisados através de SEC, SDS-PAGE e ESI-MS.
[00846] O anticorpo e conjugados de anticorpo-fármaco podem ser caracterizados através de SDS-PAGE, SEC e MS (ESI). Em um méto- do, condições de SDS-PAGE incluindo amostras não reduzidas e re- duzidas (2-4 μg) junto com BenchMark Pre-Stained Protein Ladder (In- vitrogen, #cat 10748-010; L# 1671922.) são carregados por faixa (1,0 mm x 10 poço) de Novex 4-20% Tris-Glycine Gel e são administradas a 180 V, 300 mA, por 80 min. Uma amostra analítica é preparada usando tampão Novex Tris-Glycine SDS (2X) (Invitrogen, # Ca- tLC2676) e a amostra de redução é preparada com tampão de amos- tra de SDS (2X) conapresentando 10% de 2-mercaptoetanol. Exemplo 34C
[00847] Vários ligadores-cargas úteis (LPs) foram derivados dos compostos de carga útil na Tabela C e conjugados a um anticorpo an- ti-MSR1 (H1H21234N-N297Q) ou um controle de não ligação usando as técnicas descritas no exemplo anterior. Os conjugados de anticorpo agonista de LXR anti-MSR1 fármaco (ADCs) resultantes foram testa- dos quanto à atividade no ensaio de repórter de THP1/LXRLuc como acima descrito para os compostos de carga útil. Como mostrado na Tabela 31, todos dos ADCs de agonista de LXR anti-MSR1 testados demonstraram estimulação das células THP1/LXR-Luc com valores de EC50 variando de 414 pM a 2,11 nM e valores de S/N variando de 9,4 a 13,7. O anti-MSR1 não conjugado não teve nenhum impacto sobre atividade de LXR-Luc e um anticorpo de controle de não ligação con- jugado a LP1 (ADC-LP1 de controle) tinha valores de EC50 de >100 nM e valores de S/N máximos <5,0.
[00848] O anticorpo anti-MSR1 H1H21234N tem a HCVR de acordo com a SEQ ID NO: 50 e a LCVR de acordo com a SEQ ID NO: 58. Ele compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de acordo com SEQ ID NOS:52, 54, 56, 60, 62 e 64, respectivamente. As sequências de polipeptídeo podem ser codificadas pelas sequências de nucleotídeos SEQ ID NOS: 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 e 63. N297Q indica que o resíduo 297 é mutado de asparagina (N) para glutamina (Q). Toda a numeração é de acordo com o sistema de numeração EU. Tabela 31. Atividade de Conjugado Anti-MSR1-Agonista de LXR em células THP-1/LXR-Luc Diferenciadas ADC Anti-MSR1-agonista LP de Carga útil EC50 (M) S/N de LXR agonista de agonis- de LXR ta de LXR H1H21234N-N297Q-LP1 LP1 P2B 7,38E-10 11,8 H1H21234N-N297Q- LP4B LP4B P2B 9,23E-10 11,9 H1H21234N-N297Q-LP5B LP5B P2B 1,20E-09 11,0 H1H21234N-N297Q-LP2B LP2B P2B 8,68E-10 13,7 H1H21234N-N297Q-LP12B LP12B P2B 1,30E-09 11,6 H1H21234N-N297Q-LP6B LP6B P4B 6,85E-10 12,5 H1H21234N-N297Q-LP7B LP7B P4B 5,60E-10 11,6 H1H21234N-N297Q-LP8B LP8B P4B 6,19E-10 12,5 H1H21234N-N297Q-LP9B LP9B P6B 4,14E-10 11,2 H1H21234N-N297Q-LP10B LP10B P6B 9,60E-10 12,5 H1H21234N-N297Q-LP11B LP11B P8B 9,78E-10 12,4
ADC Anti-MSR1-agonista LP de Carga útil EC50 (M) S/N de LXR agonista de agonis- de LXR ta de LXR anti-MSR1 não conjugado NA NA >1,00E-07 0,8 Control ADC-LP1 LP1 P2 >1,00E-07 4,4 Exemplo 35. Efeito In vivo de Conjugados de Anticorpo Anti- MSR1/LXR sobre Aterosclerose em um Modelo de Camundongo
[00849] O efeito de um conjugado de anticorpo anti-MSR1-agonista de LXR, H1H21234N-N297Q-LP1, sobre desenvolvimento de ateros- clerose foi avaliado in vivo em camundongos homozigotos quanto à expressão de domínio extracelular de MSR1 humano no lugar do do- mínio extracelular de MSR1 de camundongo e homozigoto para dele- ção do gene apoE (referido aqui como camundongos Msr1hu/hu ApoE-/-).
[00850] Os camundongos Msr1hu/hu ApoE-/- sofreram pré-sangria 6 dias antes do início do experimento após jejum de 4 horas e foram en- tão postos em uma dieta ocidental aterogênica (Research Diets, #Cat 106452). Os camundongos foram classificados em grupos (n=7-9 cada um) com base em seus valores de triglicerídeos de linha basal (TG) e colesterol lipoproteína de baixa densidade (LDL-C). Um anticorpo para MSR1 (H1H21234N-N297Q) ou conjugado de anticorpo para MSR1- agonista de LXR (H1H21234N-N297Q-LP1) foram administrados se- manalmente através de injeções subcutâneas em dose de 25 mg/kg (com base na concentração de anticorpo) começando no dia 0 por 16 semanas. Soro foi coletado em 4, 8 e 16 semanas do estudo após je- jum de 4 horas para avaliar lipídeos no soro usando AdviaXPT Che- mistry System (Siemens). Valores médios de lipídeo no soro foram calculados para cada ponto de tempo. Os resultados, expressos como (média ± SEM) são mostrados na FIG. 18. A FIG. 18 ilustra que admi- nistração do conjugado anticorpo de MSR1-agonista de LXR H1H21234N-N297Q-LP1 não teve um efeito sobre os níveis de lipídeo no soro.
[00851] Os camundongos foram sacrificados no final do estudo sob condições não jejum 6 dias após a última injeção de anticorpo anti- MSR1 ou ncADC anticorpo para MSR1-agonista de LXR, e seus cora- ções e fígados foram coletados. Os corações foram mergulhados em Composto de temperatura de corta ótima (OCT) e seccionados per- pendicular ao eixo da aorta, começando com o coração e trabalhando na direção do arco aórtico. Uma vez a raiz aórtica apresentando sido identificada pelo aparecimento de folhetos da válvula aórtica, seções cruzadas seriais (12 μm de espessura) foram pegas e montadas em lâminas consecutivas (VWR International, #Cat 16004-406). Essas se- ções foram tingidas com corante de hematoxilina e eosina (H&E stain), corante lipídico Oil Red O e anticorpo de rato-anti-CD68, (Abcam, #Cat ab201844) para marcar macrófagos para análise. Um scanner de lâ- mina Aperio AT2 (Leica Biosystems, Illinois) foi usado para fazer uma varredura das lâminas e gerar imagens. Para cada camundongo, a área de lipídeo foi medida usando software HALO (Indica Labs, New Mexico) em 7 seções cruzadas subsequentes com base em tingimento com Oil Red O e subsequentemente a média de área de lipídeo de le- são total por camundongo foi calculada usando essas medições. To- das as medições foram conduzidas por um analista que era cego para os grupos de tratamento. Os resultados, expressos como (média ± SEM) são mostrados na FIG. 19A. Aa FIG. 19A ilustra que administra- ção do conjugado de anticorpo para MSR1-agonista de LXR H1H21234N-N297Q-LP1 levou à redução em área de lesão ateroscle- rótica.
[00852] Ainda, lâminas tingidas com H&E foram usadas para calcu- lar a razão de Íntima/Meio, que representa o valor normalizado de ta- manho de placa. As lâminas elásticas interna e externa de meio arteri- al e áreas de lúmen foram medidas em 7 seções cruzadas subsequen-
tes para cada camundongo usando as seções tingidas com H&E e os valores médios foram calculados por camundongo. Razões de Inti- ma/Meio foram calculadas usando a equação: Razão de íntima-meio = (Área da lâmina elástica interna - Área do lú- men) / (Área de lâmina elástica externa - área de lâmina elástica inter- na) Resultados, expressos como (média ± SEM) são mostrados na FIG. 19B.
[00853] O teor de macrófago nas seções foi medido usando lâminas tingidas com anticorpo anti-CD68 de rato. Para cada camundongo, área positiva para macrófago foi medida usando um software HALO em pelo menos 5 seções cruzadas subsequentes e a média de teor de macrófago total por camundongo foi calculada usando essas medi- ções. Os resultados, expressos (como média ± SEM) são mostrados na FIG. 19C. A FIG. 19C ilustra que administração do conjugado de anticorpo para MSR1-agonista de LXR H1H21234N-N297Q-LP1 levou à redução em teor de macrófago.
[00854] Os fígados coletados no sacrifício foram usados para qRT- PCR e extração de lipídeo. Um pedaço de fígado de cada camundon- go foi posto em RNAlader (Invitrogen, #Cat AM7023) para extração de RNA e então a expressão de genes lipogênicos (Srebf1, Acc, Fasn) para avaliar a lipogênese de novo foi avaliada através de qRT-PCR usando métodos padrão. Os resultados, expressos como (média ± SEM) são mostrados na FIG. 21. A FIG. 21 ilustra que administração do conjugado anticorpo para MSR1-agonista de LXR H1H21234N- N297Q-LP1 não tem nenhum efeito sobre nível de triglicerídeo ou co- lesterol hepático.
[00855] Os lipídeos foram extraídos do segundo pedaço de fígado de cada camundongo através do método de Folch e solubilizado atra- vés do método de Carr. Os níveis de TG, colesterol total e livre, foram medidos usando ensaios enzimáticos para detecção (Teco Diagnos- tics, # CatT532-480 (TG); Thermo Fisher Scientific, #CatTR13421 (co- lesterol total); Waco Diagnostics, #Cat 993-02501 (colesterol livre)) e normalizados para peso de tecido úmido. Os resultados, expresso co- mo (média ± SEM) são mostrados na FIG. 20. A FIG. 20 ilustra que administração do conjugado anticorpo para MSR1-agonista de LXR H1H21234N-N297Q-LP1 não tem nenhum efeito sobre lipogênese he- pática de novo. General Métodos para os Exemplos 36-41:
[00856] Todos os solventes usados foram comprados ou da Sigma Aldrich ou Fisher Scientific e foram usados como é. Rifamicina S foi comprada da Bosche Scientific. Espectros de 1H-RMN foram registra- dos em instrumentos de RMN Varian Inova de 300 MHz e 500 MHz. As mudanças químicas (δ) são reportadas em ppm com relação aos solventes de RMN usados para análise e são reportadas como s - sin- gleto, d - dupleto, t - tripleto, q - quarteto, dd - dupleto de dupletos, dt - dupleto de tripletos, dq - dupleto de quartetos e m - multipleto. Cons- tantes de acoplamento (J) são reportadas em hertz (Hz). Purezas cro- matográficas foram determinadas em um sistema Agilent 1100, 1260 Infinity ou 1200 Series LC/MS usando colunas analíticas Chromolith® FastGradient RP-18e (50 × 2 mm, Merck KGaA, P/N 1,52007,0001) e o método de HPLC analítica que segue: volume de injeção 5 ou 10 L; taxa de fluxo de 1 mL/min; 5-95% de acetonitrila em água durante 4 min; detector de arranjo de diodo Agilent a  = 254 nm; temperatura ambiente. Espectrometria de massa de baixa resolução foi realizada em um sistema Agilent usando fontes de ionização por eletropulveriza- ção e analisada ou com detectores de massa de quadrupolo ou de aprisionamento de íons. Exemplo 36. Síntese de análogos R1a-R1d
[00857] O Esquema R1, abaixo, mostra a síntese de compostos exemplares 1a-1d de acordo com a descrição a partir de materiais de partida comercialmente disponíveis. Esquema R1 Legenda: "rifamicina S" EXEMPLO 36A: Análogo de Rifamicina 4-MeO-Fenol (R1a):
[00858] O procedimento de acoplamento geral do Exemplo 36 é usado para preparar o composto título: a uma solução em agitação sob argônio de rifamicina S (200 mg, 0,287 mmol) em 15 mL de tolue- no em temperatura ambiente foi adicionado 2-amino-5-metoxifenol (44 mg, 0,316 mmol). A solução de mistura foi agitada por 3 dias em tem- peratura ambiente. O progresso de reação foi monitorado através de LC/MS, então a mistura foi evaporada até secagem. O resíduo escuro foi dissolvido em 10 mL de etanol e 100 mg (1,14 mmol) de óxido de manganês (MnO2) foram adicionados em uma porção à solução de etanol. A mistura lenta foi agitada por 15 h em temperatura ambiente. Após filtrada de materiais insolúveis usando uma almofada de Celite, o filtrado foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo escuro foi puri- ficado em uma coluna Gold RediSep de sílica gel HP 40 g por meio de ISCO (eluição de gradiente: EA 5 → 95% em hexanos) e as frações puras evaporadas e secas in vacuo dando o composto título R1a como um sólido avermelhado escuro (85 mg, 37%). MS (ESI, pos.): calc. pa- ra C44H50N2O13, 814,33; encontrado 815,3 (M+H), 837,3 (M+Na). 1H RMN (500 MHz; CDCl3) δ 7,96 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 7,47 (s, 1H), 7,05 - 7,01 (m, 2H), 6,86 (s, 1H), 5,99 (s, 2H), 4,97 (dd, J = 12,4, 7,4 Hz, 2H),
3,93 (s, 3H), 3,08 (s, 3H), 3,00 - 2,99 (m, 1H), 2,30 (s, 3H), 2,13 (s, 3H), 2,03 (d, J = 18,1 Hz, 3H), 1,81 (s, 3H), 1,70 - 1,67 (m, 1H), 1,59 - 1,54 (m, 16H), 1,53 (s, 3H), 0,96 - 0,95 (m, 3H). EXEMPLO 36B: análogo de Rifamicina 4-BnO-Fenol (R1b):
[00859] O análogo R1b foi preparado usando intermediário R2, cuja síntese é mostrada no Esquema R2, abaixo. Esquema R2
[00860] Síntese do composto R2. A mistura de 6- (benziloxi)benzo[d]oxazol-2(3H)-ona (500 mg, 2,07 mmol) e metanol (6 mL) foi tratada com uma solução de 1,2 g de NaOH emn 6 mL de água. A suspensão foi aquecida a 90º C de um dia para o outro. Após esfriar para temperatura ambiente, a mistura foi tratada com HCl 6N (5 mL), então filtrada. O filtrado foi ajustado para dar pH = 8-9 com NaHCO3 aq. sat. e o precipitado foi filtrado, lavado com água para dar um sólido escuro, que foi purificado por coluna Gold RediSep de sílica gel HP 40 g (EA 0 → 90% em hexanos) para dar 220 mg (49%) de composto R2. MS (ESI, pos.): calc. para C13H13NO2, 215,09; encontra- do: 216,1 (M+H). 1H RMN (500 MHz; DMSO-d6) δ 7,39 - 7,37 (m, 5H), 7,31 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 6,49 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,37 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 6,25 (dd, J = 8,4, 2,7 Hz, 1H), 4,91 (s, 2H).
[00861] Síntese de análogo R1b. A uma solução agitada de rifami- cina S (20 mg, 0,0287 mmol) sob argônio em 1 mL de tolueno em temperatura ambiente foi tratada com 2-amino-5-(benziloxi)fenol R2 (6,8 mg, 0,0316 mmol). A solução foi agitada por 3 dias em temperatu- ra ambiente e mais 2-amino-5-(benziloxi)fenol (6,8 mg) foi adicionado. O progresso da reação foi monitorado através de LC/MS. Após 5 dias, a mistura foi evaporada até secagem. O resíduo escuro foi dissolvido em 3,5 mL de etanol e 10 mg (0,11 mmol) de óxido manganês (MnO2) foram adicionados em uma porção à solução de etanol. A mistura lenta foi agitada por 3 h em temperatura ambiente. Após filtragem de mate- riais insolúveis usando uma almofada de Celite, o filtrado foi evapora- do sob pressão reduzida. O resíduo escuro foi purificado em uma co- luna Gold RediSep de sílica gel HP 24 g por meio de ISCO (eluição de gradiente: EA 5 → 98% em hexanos) e as frações pruas evaporadas e secas in vacuo dando o composto título R1b como um sólido averme- lhado escuro (8,5 mg, 33%). MS (ESI, pos.): calc. para C50H54N2O13, 890,36; encontrado: 891,3 (M+H). 1H RMN (500 MHz; CDCl3) δ 7,97 (s, 1H), 7,49 (s, 1H), 7,44 - 7,41 (m, 5H), 7,14 - 7,11 (m, 2H), 7,07 (s, 1H), 6,94 (s, 1H), 5,32 (s, 1H), 5,23 (s, 1H), 5,18 (d, J = 11,9 Hz, 2H), 4,99 (s, 2H), 3,11 (s, 3H), 3,04 (dd, J = 2,0, 0,6 Hz, 1H), 2,32 (s, 3H), 2,07 (s, 6H), 1,83 (s, 3H), 1,71 - 1,69 (m, 1H), 1,61 (d, J = 0,4 Hz, 9H), 1,58—1,52 (m, 6H), 1,28 (s, 1H), 0,97 (td, J = 1,9, 1,2 Hz, 3H), 0,79 (t, J = 0,8 Hz, 1H). EXEMPLO 36C: análogo de Rifamicina 4-OH-Fenol (36c):
[00862] Análogo R1c foi preparado usando intermediário R4, cuja síntese é mostrada no Esquema R3, abaixo. Esquema R3
[00863] 2-amino-5-((terc-butildimetilsilil) oxi)fenol (R4).
[00864] Síntese de composto R3. O composto R8 foi preparado a partir do produto no Exemplo 36B. À solução de 3-benziloxi-4- nitrofenol R8 (400 mg, 1,63 mmol) sob argônio em DMF (2 mL) foram adicionados TBSCl (0,247 mL, 2,44 mmol), imidazol (222 mg, 3,26 mmol) e DMAP (0,5 mg). A mistura foi agitada em temperatura ambi- ente de um dia para o outro, então diluída com acetato de etila (25 mL), lavada com água (2 x 10 mL), solução de salmoura (10 mL) e se- ca em sulfato de sódio. O bruto foi purificado através de coluna Gold RediSep de sílica gel HP 40 g por meio de ISCO (eluição de gradiente: EA 0 → 20 % em hexanos) e as frações puras evaporadas para dar o composto desejado R3 (540 mg, 92%). MS (ESI, pos.): calc. para C19H25N2O4Si, 359,16; encontrado: 382,1 (M+Na).
[00865] Síntese de composto R4. À solução sob argônio de com- posto R3 (120 mg, 0,33 mmol) em 3 mL de metanol (desgaseificada com argônio 3 vezes) foi adicionado Pd/C 10% (10 mg). A mistura foi novamente desgaseificada e borbulhada com hidrogênio de um balão. Um balão de hidrogênio foi inserido através do septo e a mistura foi envelhecida de um dia para o outro. A mistura foi filtrada em Celite e concentrada para dar um sólido esverdeado escuro (71 mg, 90%). MS (ESI, pos.): calc. para C12H21NO2Si, 239,13; encontrado: 240,2 (M+H).
[00866] Síntese de análogo R1c. A uma solução em agitação sob argônio de rifamicina S (120 mg, 0,172 mmol) em 10 mL de tolueno em temperatura ambiente foi adicionado composto R4 (46 mg, 0,192 mmol). A solução de mistura foi agitada por 3 dias em temperatura ambiente. O progresso da reação foi monitorado através de LC/MS, então a mistura foi evaporada até secagem. O resíduo escuro foi dis- solvido em 10 mL de etanol e 50 mg (0,6 mmol) de óxido de manganês (MnO2) foi adicionado em uma porção à solução de etanol. A mistura lenta foi agitada por 12 h em temperatura ambiente. Após filtragem de materiais insolúveis usando uma almofada de Celite, o filtrado foi eva- porado sob pressão reduzida. O resíduo escuro foi purificado em uma coluna Gold RediSep de sílica gel HP 24 g por meio de ISCO (eluição de gradiente: EA 5 → 95% em hexanos). As frações puras foram eva- poradas e secas in vacuo dando o composto título R1c como um sóli- do avermelhado escuro (48 mg, 35%). MS: calc. para C43H48N2O13, 800,32; encontrado: 801,3 (M+H), 799,2 (M-H). 1H RMN (500 MHz;
DMSO-d6) δ 11,43 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 9,33 - 9,32 (m, 1H), 7,82 (dt, J = 2,0, 1,0 Hz, 1H), 7,02 - 7,01 (m, 1H), 6,89 (t, J = 1,3 Hz, 1H), 6,04 (dd, J = 2,5, 0,9 Hz, 1H), 5,83 (dt, J = 1,9, 1,0 Hz, 1H), 5,25 - 5,24 (m, 1H), 4,78 - 4,77 (m, 1H), 4,14 - 4,14 (m, 1H), 3,52 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 3,07 (d, J = 0,7 Hz, 1H), 3,03 (t, J = 0,6 Hz, 3H), 2,89 (s, 1H), 2,78 (t, J = 2,7 Hz, 1H), 2,19 (d, J = 16,7 Hz, 3H), 1,99 (d, J = 12,2 Hz, 4H), 1,95 (t, J = 0,5 Hz, 4H), 1,67 (d, J = 1,9 Hz, 3H), 1,24 (s, 2H), 0,89 (dd, J = 2,5, 1,1 Hz, 2H), 0,85 (d, J = 6,5 Hz, 6H), 0,69 (d, J = 1,5 Hz, 3H).
Legenda: desililação EXEMPLO 36D: análogos de Rifamicina 4-OH-Fenol N-Metila (36d):
[00867] O análogo 36d foi preparado usando intermediário R7, cuja síntese é mostrada no Esquema R4, abaixo. Esquema R4
[00868] 5-((terc-butildimetilsilil)oxi)-N1-metilbenzeno-1,2-diamina (R7).
[00869] Síntese de composto R5. O composto título foi preparado usando o método descrito no Pedido de Patente Int. PCT 2008051805. Em um tubo selado foi posta uma mistura de 3-fluor-4-nitrofenila (1 g, 6,36 mmol) e 2 mL de uma solução aquosa de metilamina 40%. O frasco foi selado por meio de septo, purgado com argônio e aquecido a 80º C em um banho de óleo por 18 h. A reação foi terminada através de análise de LCMS e esfriada para temperatura ambiente. A solução foi dissolvida através da adição de agua (15-20 mL) e extraída usando acetato de etila (3 x 30 mL). A camada orgânica combinada foi então lavada com água, salmoura, seca (Na2SO4) e então concentrada para dar produto bruto, sólido marrom branco (900 mg, 84%) de R5, que foi usado na etapa seguinte sem purificação adicional. MS (ESI, pos.): calc. para C7H8N2O3, 168,05; encontrado: 169,1 (M+H).
[00870] Síntese de composto R6. Sob argônio 3-(metilamino)-4- nitrofenol R5 (200 mg, 1,19 mmol) e imidazol (162 mg, 2,38 mmol) fo- ram dissolvidos em DMF anidro na presença de DMAP catalítico (0,7 mg). A solução amarela agitada foi esfriada em um banho gelado e TBSCI (269 mg, 1,79 mmol) foi adicionado em uma porção à solução amarela. Após 5 min, o banho foi removido e a solução foi deixada aquecer para a temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistu- ra foi arrefecida por solução saturada de NaHCO3 e extraída com ace- tato de etila (2 x 25 mL). Os orgânicos combinados foram secos atra- vés da adição de Na2SO4 e então concentrados para dar o produto bruto. O resíduo foi purificado em uma coluna Gold RediSep de sílica gel HP 24 g por meio de ISCO (eluição de gradiente: EA 0 → 90% em hexanos) e as frações puras evaporadas então secas in vacuo dando o composto título R6 como um sólido amarelo (220 mg, 66%). MS: calc. para C13H22N2O3Si, 282,14; encontrado: 283,1 (M+H).
[00871] Síntese de composto R7. Sob argônio 5-((terc- butildimetilsilil)oxi)-N1-metilbenzeno-1,2-diamina 6 (50 mg, 0,177 mmol) foi dissolvida em 2 mL de metanol. A solução foi desgaseificada com argônio três vezes seguido pela adição de Pd/C (5 mg). A mistura foi desgaseificada mais com argônio e conectada a um balão de hidro- gênio por meio de septo. Após 2,5 hora, a análise através de LC/MS de uma alíquota de processo indicou que a reação estava completa. A mistura foi filtrada em Celite e concentrada para dar 46 mg de compos-
to R7 quantitativamente, que foram usados na etapa seguinte instan- taneamente sem purificação adicional. MS: calc. para C13H24N2OSi, 252,17; encontrado: 253,2 (M+H).
[00872] Síntese de análogo R1d. A uma solução em agitação sob argônio de rifamicina S (58 mg, 0,083 mmol) em 3 mL de tolueno em temperatura ambiente foi adicionado composto R7 (21 mg, 0,083 mmol). A solução foi agitada por 2 dias em temperatura ambiente. O progresso da reação foi monitorado através de LC/MS, então a solu- ção foi evaporada até secagem. O resíduo escuro foi dissolvido em 5 mL de etanol e 10 mg de óxido de manganês (MnO2) foi adicionado em uma porção à solução de etanol. A mistura lenta foi agitada por 12 h em temperatura ambiente. Após filtragem de materiais insolúveis usando uma almofada de Celite, o filtrado foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo escuro foi purificado em uma coluna Gold Redi- Sep de sílica gel HP 12 g por meio de ISCO (eluição de gradiente: EA 5 → 95% em hexanos) e as frações puras evaporadas então secas in vacuo dando o composto título R1d como um sólido avermelhado es- curo (22,3 mg, 33%). Isso foi verificado ser impuro através de LC/MS, então ele foi dissolvido em MeCN/água e repurificado em uma coluna Aq Gold C18 15,5 g (eluição de gradiente: MeCN 10 - 95% em água, ácido acético 0,05% em ambos, durante 20 min). As frações de produ- to foram combinadas, congeladas em gelo seco e liofilizadas dando o composto título R1d como um sólido branco (13,5 mg, 20%). MS: calc. para C44H51N3O12, 813,35; encontrado: 814,3 (M+H), 812,3 (M-H). 1 H RMN (500 MHz; DMSO-d6) δ 11,31 (b, J = 0,8 Hz, 2H), 9,41 (s, 1H), 9,22 (s, 1H), 8,86 (s, 1H), 8,01 - 7,95 (m, 2H), 7,19 - 7,13 (m, 2H), 7,04 (s, 2H), 6,79 - 6,74 (m, 1H), 6,39 - 6,37 (m, 1H ), 6,19 (t, J = 11,4 Hz, 2H), 6,08 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 6,02 - 5,92 (m, 1H), 5,73 (d, J = 26,4 Hz, 1H), 5,49 (d, J = 11,2 Hz, 1H ), 5,28 (d, J = 0,6 Hz, 1H ), 5,09 - 5,02 (m, 2H), 4,82 (dd, J = 11,5, 10,2 Hz, 1H), 4,54 (d, J = 6,6 Hz, 1H),
4,36 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 3,96 (d, J = 4,4 Hz, 1H ), 3,88 (s, 1H), 3,83 (s, 1H), 3,79 (s, 1H), 3,70 (s, 1H), 3,09 (s, 1H), 2,91 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,15 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 1,97 (s, 2H), 1,72 (s, 2H), 1,64 (s, 2H), 1,59 (s, 2H), 0,90 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 0,70 (d, J = 6,6 Hz, 1H), 0,62 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 0,20 - 0,18 (m, 1H), 0,07 (d, J = 0,7 Hz, 1H).
Legenda: desililação EXEMPLO 37: Síntese de análogo R14
[00873] Análogo de rifamicina R14 foi sintetizado a partir de rifami- cina S como mostrado no Esquema R5, abaixo e como descrito abai- xo. Esquema R5 Legenda: "rifamicina S, piperidina EXEMPLO 37A: Preparação de compostos (R10 e R13):
[00874] Os Intermediários R10 e R13 foram preparados de acordo com Esquema R6, mostrado abaixo.
[00875] Síntese de composto R8. O composto título foi preparado usando um método ligeiramente modificado de Otten e outros, (Bio- conjugate Chem. 2001, 12, 76−83). A uma solução de 3-fluor-4- nitrofenila (2,09 g, 8,45 mmol) em DMSO (10 mL) foi adicionado NaOH 1M (10 mL) e aquecido para 80º C em um bloco de aquecimento por 18 h. A reação foi completada através de LCMS e esfriada para a tem- peratura ambiente. A reação foi acidificada com HCl 1 M (15-20 mL) até o pH = 3-4 e a solução resultante foi extraída usando acetato de etila (3 x 30 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água, salmoura, secas (Na2SO4) e concentradas in vacuo. O óleo bruto foi então purificado em uma coluna Gold RediSep de sílica gel HP 80 g por meio de ISCO (eluição de gradiente: acetato de etila 0 → 100% em hexanos) e as frações puras evaporadas então secas in va- cuo dando o composto título R8 como um sólido branco amarelado (1,51 g, 73%). MS (ESI, pos.): calc. para C13H11NO4, 245,1; encontra- do: 268,1 (M+Na), 244,1 (M-H).
[00876] Síntese de composto R9. A uma solução em agitação sob argônio de composto R8 (1,51 g, 6,157 mmol) em THF (16 mL) em temperatura ambiente foram adicionados o BOC-piperidin-4-ol (1,61 g, 8,005 mmol) e o PPh3 (2,91 g, 11,083 mmol). Uma solução de DBAD (2,55 g, 11,083 mmol) em THF (9 mL) foi adicionada à mistura de rea- ção em gotas. Após agitar por 16 h, a mistura foi evaporada até seca- gem e o resíduo foi purificado em uma coluna Gold RediSep de sílica gel HP 40 g por meio de ISCO (eluição de gradiente: acetato de etila 0
→ 100% em hexanos) e as frações puras evaporadas então secas in vacuo dando o composto título R9 como um sólido branco amarelado (2,41 g, 91%). MS: calc. para C23H28N2O6, 428,2; encontrado: 451,1 (M+Na).
[00877] Síntese de composto R10. A uma solução desgaseificada sob argônio de composto R9 (100 mg, 0,233 mmol) em 3 mL de meta- nol foram adicionados 5 mg de Pd/C 10%. A mistura foi desgaseificada mais e conectada a um balão de hidrogênio. Após 2,5 h, a análise através de LC/MS de alíquota de processo indicou que a reação esta- va completa. A mistura foi filtrada em Celite e concentrada para dar 75 mg de composto R10 quantitativamente, que foi usado na etapa se- guinte instantaneamente sem purificação adicional. MS: calc. para C16H24N2O4, 308,17; encontrado: 331,2 (M+Na), 307,1 (M-H).
[00878] Síntese de composto R11. A uma solução de composto R9 (1100 mg, 2,561 mmol) em 1,4-dioxana (15 mL) foi adicionado HCl 4 M em 1,4-dioxana (5 mL). Depois de agitar por 15 h, uma alíquota do processo indicou que a reação estava completa. A uma solução foi adicionado éter de dietila (50 mL), então a mistura foi agitada vigoro- samente por 1 h até que um precipitado branco se formou. O sólido foi filtrado e lavado com éter para dar o sal de HCl de R11. Ao sólido branco foram adicionados EtOAc (10 mL) e NaHCO3 sat. (15 mL) até pH = 8-9 e agitados por 15 min. As duas camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 30 mL). As camadas orgânicas combinadas foram secas (Na2SO4) e concentradas in vacuo para dar o composto R11 (372 mg, 44%) que foi usado na etapa se- guinte instantaneamente sem purificação adicional. MS: calc. para C18H21N2O4, 328,1; encontrado: 329,1 (M+H).
[00879] Síntese de composto R12. A uma solução sob argônio de composto R11 (372 mg, 1,128 mmol) em 1,4-dioxana/água (v/v, 10:1, 11 mL) foi adicionado Fmoc-OSu (399 mg, 1,184 mmol). Depois de agitar por 15 h uma análise LC/MS de processo indicou que a reação estava completa. A mistura de reação foi concentrada in vacuo para dar o composto R12 que foi usado na etapa seguinte instantaneamen- te sem purificação adicional. MS: calc. para C33H30N2O6, 550,2; encon- trado: 551,2 (M+H).
[00880] Síntese de composto R13. A uma solução sob argônio de composto R12 (72 mg, 0,131 mmol) em 2 mL de metanol e desgaseifi- cada com argônio foram adicionados 9 mg de Pd/C 10%. A mistura foi desgaseificada mais com argônio e conectada a um balão de hidrogê- nio. Após 45 min, análise através de LC/MS de uma alíquota de pro- cesso indicou que a reação estava completa. A mistura foi filtrada em Celite e concentrada in vacuo para dar 55 mg de composto R13 quan- titativamente, que foi usada na etapa seguinte instantaneamente sem purificação adicional. MS: calc. para C26H26N2O4, 430,1; encontrado: 431,2 (M+H). EXEMPLO 37B: Preparação de análogo R14 a partir de intermediá- rio R10
[00881] Síntese de composto R14-Boc. A uma solução em agitação de rifamicina (100 mg, 0,143 mmol) em 5 mL de tolueno em tempera- tura ambiente foi adicionado composto R10 (44 mg, 0,143 mmol). A solução de mistura foi agitada por 4 dias em temperatura ambiente. O progresso da reação foi monitorado através de LC/MS até completa, então a mistura foi evaporada até secagem. O resíduo escuro foi dis- solvido em 10 mL de etanol e 62 mg (0,715 mmol) de óxido de man- ganês (MnO2) foram adicionados em uma porção à solução de etanol. A mistura lenta foi agitada por 15 h em temperatura ambiente. Após filtragem de materiais insolúveis usando almofada de Celite, o filtrado foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo escuro foi purificado em uma coluna Gold RediSep de sílica gel HP 12 g por meio de ISCO (eluição de gradiente: acetato de etila 5% → 95% em hexanos). Após concentração sob pressão reduzida, o produto bruto (ca. 85% puro) foi repurificado em uma coluna Gold Aq C18 (eluição de gradiente: MeCN 10 - 95% em água, ácido acético 0,05% em ambos). As frações puras foram combinadas, congeladas em gelo seco e liofilizadas para dar R14-Boc como um sólido avermelhado escuro (36 mg, 26%). MS: calc. para C53H65N3O15, 983,44; encontrado: 984,4 (M+H).
[00882] Síntese de composto R14. R14-Boc (30 mg, 0,03 mmol) foi tratado com uma mistura de TFA/acetonitrila/água (0,25 mL/5 mL/5 mL) em temperatura ambiente for 20 h para dar composto R14. A mis- tura de reação foi purificada em uma coluna Gold A. C18 15,5 g por meio de sistema ISCO (eluição de gradiente: MeCN 10% - 100% em água, ácido acético 0,05% em ambos, durante 30 min). As frações co- napresentando produto foram combinadas, congeladas em gelo seco e liofilizadas de um dia para o outro dando o composto título R14 (10 mg, 37%) como um sólido avermelhado escuro. MS: calc. para C48H57N3O13, 883,4; encontrado: 884,3 (M+H). EXEMPLO 37C: Preparação de análogo R14 a partir de intermediá- rio R13
[00883] Síntese de composto R14. A um frasco de fundo redondo com hidroxianilina R13 (55 mg, 0,1278 mmol) foram adicionados tolu- eno (1,5 mL) e rifamicina S (67 mg, 0,0956 mmol). A mistura de reação foi sonificada por 1 min para dissolver a mistura de reação, selada por um septo de borracha, purgada com argônio e a reação agitada em temperatura ambiente. Após 2 dias, uma outra porção de hidroxianilina (45 mg, 0,1045 mmol) foi adicionada e agitada por 1 d. A reação foi concentrada in vacuo para remover tolueno, dissolvida em EtOH (6 mL) e MnO2 (20 mg) foi adicionado. Após agitar por 3 d, a reação foi concentrada in vacuo e purificada através de cromatografia em uma coluna Gold RediSep de sílica gel HP 40 g por meio de ISCO (eluição de gradiente: acetato de etila 0 → 100% em hexanos). As frações pu- ras foram evaporadas e secas in vacuo dando o composto título R14- Fmoc como um sólido avermelhado escuro (35 mg, 33%). MS (ESI, pos.): calc. para C63H67N3O15, 1105,4; encontrado: 1106,5 (M+H), 1128,5 (M+Na).
[00884] Uma solução agitada sob argônio de Fmoc-rifamicina- piperidina-O-fenol R14-Fmoc da etapa anterior (35 mg, 0.0361 mmol) em N,N-dimetilformamida (DMF, 1 mL) foi tratada com uma solução de piperidina 2% (3,5 mg, 0,2 mL, 0,0411 mmol) em DMF e a reação agi- tada em temperatura ambiente. Depois de 2 h, a reação foi purificada diretamente em uma coluna RediSep Gold C18 5 g por meio do siste- ma ISCO (eluição de gradiente: MeCN 0 - 100% em água, ácido acéti- co 0.05% em ambos, durante 30 min). As frações conapresentando produto foram combinadas, congeladas em gelo seco e liofilizadas de um dia para o outro dando o composto título R14 como um sólido avermelhado escuro (12 mg, 43%). MS: calc. para C48H57N3O13,
883.4; encontrado: 884.3 (M+H). 1H RMN (500 MHz; DMSO-d6) δ
9.40 (s, 1H), 7.87 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.16 - 7.23 (m, 4H), 5.99 - 6.05 (m, 2H), 5.76 - 5.85 (m, 2H), 5.18 - 5.23 (m, 2H), 4.83 - 4.95 (m, 2H),
4.80 (br. s, 2H), 4.12 (br. S., 1H), 2.91 - 3.18 (m, 13H), 2.88 (s, 1H),
2.78 (t, J = 0.9 Hz, 2H), 2.67 (s, 2H), 2.22 (d, J = 3.7 Hz, 4H), 2.15 (s,
2H), 2.02 (s, 2H), 1.96 (d, J = 1.2 Hz, 2H), 1.90 (s, 1H), 1.68 (s, 2H),
0.85 - 0.92 (m, 12H), 0.69 (br. s, 9H). EXEMPLO 38: síntese de análogos R16a-R16e
[00885] Análogos de rifamicina R16a-R16e foram sintetizados a partir de rifamicina S como mostrado no Esquema R7, abaixo, e como descrito abaixo.
Legenda: rifamicina S, dioxano, piperidina EXEMPLO 38A: O-alquilação catalisada por Pd (R16a-R16c):
[00886] Síntese de composto R15. A uma solução em agitação sob argônio de rifamicina S (2,0 g, 2,87 mmol) em 80 mL de tolueno em temperatura ambiente foi adicionado 2-amino-5-bromofenol (0,54 g, 2,87 mmol). A solução foi agitada por 2 dias em temperatura ambiente. A mistura de reação foi então evaporada até secagem e o resíduo es- curo dissolvido em 20 mL de etanol e 300 mg de óxido de manganês (MnO2) foram adicionados em uma porção à solução de etanol. A mis- tura lenta foi agitada sob argônio por 15 h em temperatura ambiente. Após filtragem de materiais insolúveis usando uma almofada de Celite, o filtrado foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo escuro foi pu- rificado em uma coluna Gold RediSep de sílica gel HP 120 g por meio de ISCO (eluição de gradiente: EA 5 → 95% em hexanos). As frações puras foram evaporadas e secas in vacuo dando o composto título R15 como um sólido avermelhado escuro (1,6 g, 65%). MS (ESI, pos.): calc. para C43H47BrN2O13, 862,23; encontrado: 863,1 e 865,1 (M+H), 885,1 e 888,0 (M+Na). 1H RMN (500 MHz; DMSO-d6): δ 9,49 (d, J =
6,0 Hz, 1H), 7,92 (ddd, J = 3,6, 2,9, 1,8 Hz, 1H), 7,86 - 7,85 (m, 1H), 7,75 - 7,74 (m, 1H), 6,06 - 6,05 (m, 1H), 5,84 (dt, J = 2,6, 1,4 Hz, 2H), 5,25 - 5,23 (m, 2H), 4,80 (dt, J = 2,5, 1,0 Hz, 1H), 4,23 (td, J = 2,4, 1,0 Hz, 1H), 3,49 (d, J = 1,1 Hz, 1H), 3,10 - 3,09 (m, 2H), 3,03 (s, 3H), 2,79 (s, 1H), 2,19 (s, 3H), 2,01 (s, 4H), 1,96 (s, 4H), 1,81 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 1,68 (s, 3H), 1,60 (dq, J = 2,8, 0,9 Hz, 1H), 1,48 (t, J = 1,4 Hz, 1H), 0,90 (dt, J = 2,1, 1,1 Hz, 2H), 0,84 (d, J = 7,1 Hz, 4H), 0,69 (dd, J = 2,2, 1,2 Hz, 5H).
[00887] Síntese de composto R16a. Usando um método similar re- portado por Buchwald S. L. e outros (Org. Lett. 2018, 20, 1580), um acoplamento C-O catalisado por paládio de álcoois primários com composto R15 foi empregado para compostos títulos R16a-R16c. A um tubo de teste seco ao forno de rosca na parte superior de 2 gram, equipado com uma barra de agitação e selado com uma tampa de rosca foi carregado composto R15 (40 mg, 0,0463 mmol, 1,00 eq.), 2- (dimetilamino)etan-1-ol (42 mg, 0,462 mmol, 10 eq.), tBuBrettPhos Pd G3-paladaciclo (11,8 mg, 30 mol%) e NaOt-Bu (5 mg, 0,051 mmol, 1,1 eq.). O tubo de reação foi novamente tampado com um septo e perfu- rado com uma agulha presa para evacuar e retrocheio com argônio (esse processo foi repetido duas vezes) seguido pela adição de 1,4- dioxana (2,0 mL) por meio de seringa. A reação foi aquecida a 55oC ± 5 em um banho de óleo sob pressão de argônio por 15 h. A reação foi deixada esfriar para a temperatura ambiente antes da filtragem através de uma almofada de Celite® e enxaguada com EtOAc. O material bruto foi concentrado in vacuo e purificado em uma coluna Gold Aq C18 15,5 g (eluição de gradiente: MeCN 10 - 95% em água, ácido acético 0,05% em ambos). As frações de produto foram combinadas, congela- das em gelo seco e liofilizadas dando o composto título R16a como um sólido avermelhado escuro (12,5 mg, 32%). MS: calc. para C47H57N3O13, 871,39; encontrado: 872,3 (M+H), 870,2 (M-H). 1H RMN
(300 MHz; DMSO-d6) δ 9,40 (s, 1H), 7,87 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,23— 7,16 (m, 2H), 6,83 (dt, J = 2,3, 1,1 Hz, 1H), 6,23 (d, J = 4,6 Hz, 1H), 6,06 (dd, J = 5,9, 1,1 Hz, 1H), 5,82 (dd, J = 2,3, 1,5 Hz, 2H), 5,24 (dt, J = 1,4, 0,7 Hz, 1H), 4,83—4,75 (m, 1H), 4,24 (d, J = 29,9 Hz, 3H), 3,80 (d, J = 1,3 Hz, 1H), 3,03 (t, J = 0,5 Hz, 3H), 2,88 (s, 1H), 2,78 (t, J = 0,9 Hz, 2H), 2,67 (s, 2H), 2,22 (d, J = 3,7 Hz, 4H), 2,15 (s, 2H), 2,02 (s, 2H), 1,96 (d, J = 1,2 Hz, 2H), 1,90 (s, 1H), 1,68 (s, 2H), 0,85 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,69 (t, J = 1,2 Hz, 3H).
[00888] Síntese de composto R16b. A um frasco seco ao forno de tampa na parte superior de 8 mL, equipado com uma barra de agita- ção e selado com uma tampa de rosca foram carregados composto R15 (40 mg, 0,0463 mmol, 1,00 eq.), Fmoc-glicinol (131 mg, 0,463 mmol, 10 eq.), t-BuBrettPhos-Pd-G3-paladaciclo (16 mg, 0,4 eq.) e K3PO4 (20 mg, 0,0942 mmol, 2,0 eq.). O frasco de reação foi tampado com um septo de borracha, perfurado com uma agulha presa para evacuar e retrocheio com argônio (esse processo foi repetido duas ve- zes), seguido pela adição de 1,4-dioxana (2,0 mL). A reação foi aque- cida a 60º C em um bloco de aquecimento sob pressão de argônio por 15 h. A reação foi deixada esfriar para a temperatura ambiente antes da filtragem em uma almofada de Celite® e enxaguada com MeOH. O material bruto foi concentrado in vacuo e purificado em uma coluna Gold Aq C18 50 g (eluição de gradiente: MeCN 5 - 100% em água, ácido acético 0,05% em ambos). As frações de produto foram combi- nadas, congeladas em gelo seco e liofilizadas dando o composto título R16b como um sólido avermelhado escuro (19 mg, 38%). MS (ESI, pos.): calc. para C60H63N3O15, 1065,4; encontrado: 1066,4 (M+H).
[00889] Síntese de composto R16d. O composto R16b da etapa anterior (26 mg, 0,0244 mmol) foi dissolvido em DMF (1 mL), tratado com uma solução de piperidina 2% (3,1 mg, 0,2 mL, 0,0366 mmol) em DMFe a reação agitada sob argônio em temperatura ambiente. Depois de 2 h, a reação foi purificada diretamente em uma coluna Gold Aq C18 50 g por meio de sistema ISCO (eluição de gradiente: MeCN 0 - 100%em água, ácido acético 0,05% em ambos, durante 30 min). As frações conapresentando produto foram combinadas, congeladas em gelo seco e liofilizadas de um dia para o outro dando o composto título R16d como sólido azul escuro (9 mg, 44%). MS: calc. para C45H53N3O13, 843,4; encontrado: 844,4 (M+H), 842,3 (M-H). 1H RMN (500 MHz; CD3OD): δ 7,83 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,91 - 7,03 (m, 2H), 6,55 (s, 1H), 6,43 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 6,21 - 6,30 (m, 2H), 4,98 - 5,08 (m, 2H), 3,76 (br. s, 3H), 3,43 - 3,47 (m, 1H), 3,41 (d, J = 5,37 Hz, 2H), 3,12 (br. s, 1H), 2,97 - 3,04 (m, 4H), 2,39 (br. s, 1H), 2,19 - 2,32 (m, 4H), 2,09 - 2,14 (m, 4H), 1,95 - 2,07 (m, 4H), 1,78 (s, 4H), 1,67 (d, J = 6,84 Hz, 1H), 1,31 (br. s., 2H), 0,97 (br. s, 8H), 0,66 - 0,85 (m, 4H), 0,08 (d, J = 5,5 Hz, 3H), -0,26 (d, J = 6,5 Hz, 3H).
[00890] Síntese de composto R16c. A um frasco seco ao forno com rosca na parte superior de 8 mL, equipado com uma barra de agitação e selado com uma tampa de rosco foram carregados R15 (80 mg, 0,0926 mmol, 1,00 eq.), Fmoc-sarcosinol (275 mg, 0,9262 mmol, 10 eq.), t-BuBrettPhos-Pd-G3-paladaciclo (40 mg, 0,5 eq.) e K3PO4 (39 mg, 0,1852 mmol, 2 eq.). A reação foi aquecida a 60º C em um bloco de aquecimento sob pressão de argônio por 15 g, a reação foi deixada esfriar para temperatura ambiente antes da filtragem através de uma almofada de Celite e enxaguada com MeOH. O material bruto foi con- centrado in vacuo e purificado em uma coluna Gold Aq C18 50 g (elui- ção de gradiente: MeCN 5 - 100%em água, ácido acético 0,05% em ambos). As frações de produto foram combinadas, congeladas em ge- lo seco e liofilizadas para dar o composto título R16c como um sólido avermelhado escuro (49 mg, 49%). MS: calc. para C61H65N3O15, 1079,4; encontrado: 1080,5 (M+H).
[00891] Síntese de composto R16e. O composto R16c da etapa anterior (49 mg, 0,045 mmol) foi dissolvido em DMF (1 mL), tratado com uma solução de piperidina 2% (7,7 mg, 0,45 mL, 0,091 mmol) em DMF e a reação agitada sob argônio em temperatura ambiente. De- pois de 2 h, a reação foi purificada diretamente em uma coluna Gold Aq C18 50 g por meio de sistema ISCO (eluição de gradiente: MeCN 0 - 100% em água, ácido acético 0,05% em ambos, durante 30 min). As frações conapresentando produto foram combinadas, congeladas em gelo seco e liofilizadas de um dia para o outro dando o composto título R16e como um sólido azul escuro (18 mg, 46%). MS: calc. para C46H55N3O13, 857,3; encontrado: 858,3 (M+H). 1H RMN (500 MHz; CD3OD): δ 7,84 (d, J = 8,79 Hz, 1H), 7,11 - 7,20 (m, 1H), 6,88 - 6,96 (m, 1H), 6,64 ( s, 1H), 6,42 (d, J = 10,26 Hz, 1H), 6,17 - 6,28 (m, 2H), 4,93 - 5,06 (m, 2H), 3,86 (br. s, 1H), 3,66 - 3,84 (m, 8H), 3,18 - 3,31 (m, 7H), 3,10 (br. s, 2H), 2,94 - 3,05 (m, 6H), 2,37 (br. s, 1H), 2,25 (d, J = 4,88 Hz, 4H), 2,05 - 2,22 (m, 7H), 1,85 - 2,05 (m, 7H), 1,78 (s, 6H), 1,65 (br. s, 1H), 1,30 (br. s., 2H), 0,95 (br. s, 8H), 0,82 - 0,92 (m, 4H), 0,78 (br. s., 1H), 0,70 (br. s, 1H), 0,03 (d, J = 5,86 Hz, 3H), -0,28 (d, J = 5,86 Hz, 3H). EXEMPLO 39: síntese de análogos de Rifamicina R17
[00892] Análogos de rifamicina (R17) foram sintetizados a partir do composto R14 através do uso de aminação redutiva. A uma solução de composto R14 (9 mg, 0,0102 mmol) e paraformaldeído (1,52 mg, 0,051 mmol) em 1,0 mL de DCM anidro em temperatura ambiente foi adicionado NaBH(OAc)3 (4,3 mmol, 0,0204 mmol). A mistura foi agita- da for 1 h. O progresso da reação foi monitorado através de LC/MS para da o produto desejado. A mistura de reação bruta foi arrefecida pela adição de 2-3 gotas de água. Todos os voláteis foram removidos sob pressão reduzida, então diluídos com DMS O (0,5 mL). A mistura bruta foi purificada através de HPLC preparativa (Gemini, 5µm, 150 mm x 30 mm, eluentes: 10 - 95% MeCN em água, 0,05% AcOH) fra-
ções puras combinadas e liofilizadas para dar 6 mg (66%) de R17 co- mo um sólido avermelhado. MS (ESI, pos.): calc. para C49H59N3O13, 897,40; encontrado: 898,4 (M+H). 1H RMN (500 MHz; DMSO-d6): δ 9,38 (br. s., 1H), 7,86 (br. s., 1H), 7,17 - 7,25 (m, 4H), 6,04 (d, J = 6,35 Hz, 1H), 5,81 (br. s., 2H), 4,79 (br. s., 2H), 4,70 (br. s., 2H), 4,15 (br. s., 1H), 3,53 (br. s., 1H), 3,30 (br. s., 5H), 3,09 (br. s., 3H), 3,03 (br. s., 4H), 2,87 (s, 1H), 2,78 (br. s., 2H), 2,58 - 2,66 (m, 6H), 2,54 (br. s., 8H), 2,37 (d, J = 1,47 Hz, 2H), 2,15 - 2,27 (m, 20H), 2,12 (br. s., 1H), 2,03 - 2,09 (m, 3H), 2,00 (s, 9H), 1,95 (br. s., 10H), 1,91 (s, 3H), 1,72 (br. s., 3H), 1,67 (br. s., 8H), 1,58 (s, 1H), 1,50 (br. s., 1H), 1,24 (br. s., 2H), 0,81 - 0,94 (m, 15H), 0,78 (d, J = 6,84 Hz, 3H), 0,69 (br. s., 9H).
Legenda: paraformaldeído EXEMPLO 40
[00893] Esse exemplo descreve química de carga de ligador que é usada para preparar o composto título R20.
[00894] Composto R18: o composto título foi preparado usando um procedimento no Pedido de Patente Int. PCT 2014145090, ((S)-1-(((S)- 1-((4-(hidroximetil)fenil)amino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-il)amino)-3- metil-1-oxobutan-2-il)carbamato de terc-butila R18a, (500 mg, 1,04 mmol) foi dissolvido em uma mistura de CH3CN/H2O/TFA (3:1:1 = v/v/v, 12 mL/4 mL/4 mL). A mistura de reação foi agitada em tempera- tura ambiente por 48 h. O progresso da reação foi determinado estar completo através de LCMS. Após concentração in vacuo, o produto bruto R18b (0,9 g úmido) foi usado diretamente para a etapa seguinte sem purificação adicional. MS (ESI, pos.): calc. para C18H29N5O4, 379,22; encontrado: 380,2 (M+H).
[00895] Uma solução de R18b (700 mg, 1,47 mmol, 1,0 eq) em água (8 mL) foi diluída com 2 mL de solução de NaHCO3 aquosa a 4o C e a mistura (pH = 8,0) foi tratada com 6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H- pirrol-1-il)hexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila (408 mg, 0,9 eq) co- mercialmente disponível em 10 mL de acetonitrila. A suspensão foi agitada em temperatura ambiente por 16 h até a reação estar comple- ta. O produto bruto foi concentrado sob pressão reduzida e diluído com DMSO (5 mL). O produto bruto foi purificado através de uma coluna C18 150 g ISCO (eluentes: MeCN 10 - 95% em água, 0,05 % em AcOH). Frações puras foram combinadas e liofilizadas para dar 368 mg (44%) de composto R18 como um sólido branco. MS (ESI, pos.): calc. para C28H40N6O7, 572,30; encontrado: 573,6 (M+H), (2M+H), 1145,9, 1H RMN (500 MHz; DMSO-d6): δ 9,89 (s, 1H), 8,05 (d, J = 7,33 Hz, 1H), 7,81 (d, J = 8,79 Hz, 1H), 7,52 - 7,57 (m, J = 8,79 Hz, 2H), 7,21 - 7,26 (m, J = 8,79 Hz, 2H), 6,99 - 7,02 (m, 2H), 5,98 (br. s., 1H), 5,40 (s, 2H), 5,10 (t, J = 5,62 Hz, 1H), 4,35 - 4,45 (m, 3H), 4,18 (dd, J = 6,84, 8,30 Hz, 1H), 3,26 - 3,33 (m, 2H), 2,91 - 3,06 (m, 2H), 2,08 - 2,22 (m, 2H), 1,93 - 2,01 (m, 1H), 1,66 - 1,74 (m, 1H), 1,59 (dd, J = 4,40, 9,28 Hz, 1H), 1,43 - 1,55 (m, 5H), 1,32 - 1,43 (m, 1H), 1,19 (quin, J = 7,57 Hz, 2H), 0,84 (d, J = 8,30 Hz, 3H), 0,80 - 0,89 (m, 3H).
[00896] Composto R19: a uma suspensão agitada de R18 (100 mg, 0,174 mmol, 1,0 eq) em temperatura ambiente foi lentamente adicio- nado SOCl2 (14 µL, 0,192 mmol, 1,1 eq) usando uma microsseringa. A mistura de reação em pasta fluida foi agitada por 1,5 h e uma alíquota analisada através de LC/MS indicou a formação do desejado. A mistu- ra bruta foi concentrada para remover todos os voláteis sob pressão reduzida. A mistura foi diluída com 2 mL de DMSO e carregada em uma coluna Aq C18 ISCO 50 g para purificação (10 - 95% MeCN em água, AcOH 0,05%). As frações puras foram combinadas e liofilizadas para dar 72 mg (71%) de R19 como um sólido esbranquiçado. MS (ESI, pos.): calc. para C28H39ClN6O6, 590,26; encontrado: 591,3 (M+H), 1181,5 (2M+H). 1H RMN (500 MHz; DMSO-d6) δ 10,03 (s, 1H), 8,03 - 8,11 (m, 1H), 7,79 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 7,57 - 7,63 (m, J = 8,79 Hz, 2H), 7,34 - 7,38 (m, J = 8,79 Hz, 2H), 6,99 - 7,02 (m, 2H), 5,97 (br. s., 1H), 5,40 (br. s., 2H), 4,71 (s, 2H), 4,34 - 4,43 (m, 2H), 4,16 - 4,21 (m, 1H), 3,36 - 3,42 (m, 3H), 2,90 - 3,06 (m, 3H), 2,07 - 2,22 (m, 3H), 1,91 - 2,00 (m, 1H), 1,66 - 1,73 (m, 1H), 1,31 - 1,41 (m, 1H), 1,18 (quin, J = 7,69 Hz, 3H), 0,79 - 0,89 (m, 7H).
[00897] Composto R20: a mistura de R19 (13,5 mg, 0,0228 mmol, 1,2 eq), R16a (16,6 mg, 0,0190 mmol, 1,0 eq) e NaI (14,2 mg, 0,095 mmol) em um frasco de 2 dram foi dissolvida em 1 mL de DMF anidro. Uma quantidade catalítica (10 µL) de solução de DIPEA 0,5 M em DMF foi adicionada com seringa. A mistura foi aquecida a 55º C em um banho de óleo de um dia para o outro. A reação estava completa através de LC/MS para dar o produto desejado. A mistura foi esfriada para 4º C e diluída com 1 mL de água. Após filtragem, a mistura bruta escura foi purificada através de uma coluna de HPLC preparativa EZ (Gemini, 5µm, 150 mm x 30 mm, eluentes: MeCN 10 - 95% em água, AcOH 0,05%). Frações puras foram combinadas e liofilizadas para dar 14,6 mg (55%) de R20 como um sólido vermelho escuro. MS (ESI, pos.): calc. para C75H96N9O19+, 1426,68; encontrado: 1427,3 (M+1) e 1425,5 (M-1). 1H RMN (500 MHz; DMSO-d6) δ 10,25 (s, 1H), 8,19 (d, J = 6,84 Hz, 1H), 7,82 (d, J = 8,30 Hz, 2H), 7,76 (d, J = 8,79 Hz, 3H),
7,50 (d, J = 8,30 Hz, 3H), 7,00 (s, 2H), 6,12 (d, J = 12,70 Hz, 1H), 6,03 (br. s., 1H), 5,43 (s, 2H), 4,70 - 4,80 (m, 2H), 4,58 (br. s., 3H), 4,36 - 4,41 (m, 1H), 4,18 (t, J = 7,82 Hz, 1H), 3,77 (br. s., 2H), 3,36 - 3,45 (m, 8H), 3,13 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 2,89 - 3,06 (m, 12H), 2,78 (t, J = 9,04 Hz, 1H), 2,06 - 2,22 (m, 3H), 2,03 (br. s., 1H), 1,91 - 2,00 (m, 10H), 1,85 (s, 3H), 1,66 - 1,74 (m, 1H), 1,56 - 1,64 (m, 6H), 1,42 - 1,56 (m, 8H), 1,38 (d, J = 6,84 Hz, 2H), 1,15 - 1,25 (m, 3H), 0,75 - 0,88 (m, 14H), 0,07 (s, 1H).
[00898] Composto R21: uma mistura de R19 (20 mg, 0,0349 mmol, 1,0 eq), rifampicina (25,8 mg, 0,0314 mmol, 0,9 eq) e NaI (39 mg, 0,261 mmol) em frasco de 2 dram foi dissolvida em 1 mL de DMF ani- dro. A mistura foi aquecida a 55º C em um banho de óleo de um dia para o outro. A reação foi determinada estar completa através de LC/MS. A mistura foi esfriada para 4º C e diluída com 1 mL de água. Após filtragem, a mistura bruta escura foi purificada através de uma coluna de HPLC preparativa EZ (Gemini, 5µm, 150 mm x 30 mm, elu- entes: MeCN 10 - 95% em água, AcOH 0,05%). Frações puras foram combinadas e liofilizadas por 30 h para dar 22 mg (51%) de R21 como um sólido amarelo avermelhado. MS (ESI, pos.): calc. para C71H97N10O18+, 1377,70; encontrado: 1377,6 (M+H). 1 H RMN (500 MHz; DMSO-d6) δ 12,55 (s, 1H), 10,20 (s, 1H), 8,81 (s, 1H), 8,13 (s, 2H), 7,77 (dd, J = 23,3, 8,4 Hz, 4H), 7,47 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,13 - 7,07 (m, 1H), 7,00 (s, 2H), 6,25 - 6,20 (m, 2H), 5,98 (d, J = 0,4 Hz, 1H), 5,90 (dd, J = 15,9, 6,9 Hz, 1H), 5,42 (s, 2H), 5,08 - 5,06 (m, 1H), 5,02 - 5,02 (m, 1H), 4,95 - 4,91 (m, 1H), 4,58 (dd, J = 1,0, 0,4 Hz, 2H), 4,39 - 4,38 (m, 1H), 4,20 - 4,15 (m, 2H), 3,74 - 3,73 (m, 1H), 3,56 - 3,54 (m,
3H), 3,03 - 3,01 (m, 2H), 2,96 - 2,93 (m, 6H), 2,90 (s, 5H), 2,81 - 2,81 (m, 1H), 2,17 (dd, J = 9,5, 5,3 Hz, 3H), 1,97 (s, 5H), 1,91(d, J = 11,0 Hz, 8H), 1,63 (s, 6H), 1,58 (dd, J = 6,5, 0,8 Hz, 2H), 1,48 (t, J = 7,4 Hz, 8H), 1,37 - 1,32 (m, 2H), 1,20 - 1,17 (m, 2H), 1,04 (dd, J = 6,1, 0,6 Hz, 1H), 0,86 (td, J = 12,9, 6,9 Hz, 14H), 0,77 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 0,43 (d, J = 6,5 Hz, 3H).
[00899] Composto R23: a uma mistura de R22 (100 mg, 0,144 mmol) e R18b (82 mg, 0,217 mmol) em DMF anidro (1,5 mL) foi então tratada com DIEA (50 µL, 0,288 mmol) por meio de microsseringa. A mistura de reação foi agitada por 2 h em temperatura ambiente e de- terminada dar R23 através de LC/MS. A mistura bruta foi purificada através de uma coluna Aq C18 100 g ISCO (eluentes: MeCN 10 - 95% em água, 0,05 % em AcOH), as frações puras combinadas e liofiliza- das para dar 84,4 mg (62%) de 23. MS (ESI, pos.): calc. para C44H71N7O16, 953,50; encontrado: 954,4 (M+H), 976,4 (M+Na), 952,4 (M-H). 1H RMN (500 MHz; DMSO-d6) δ 9,88 (s, 1H), 8,08 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 8,00 (s, 1H), 7,86 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,55 (d, J = 8,4 Hz, 2H),
7,23 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,00 (s, 2H), 5,98 (s, 1H), 5,40 (s, 1H), 4,43 (s, 2H), 4,39 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,23 (dd, J = 8,3, 6,8 Hz, 2H), 3,60 (d, J = 6,9 Hz, 6H), 3,44 - 3,54 (m, 30H), 3,37 (t, J = 5,8 Hz, 3H), 3,15 (d, J = 5,7 Hz, 2H), 2,99 (d, J = 29,6 Hz, 2H), 2,33 (t, J = 7,3 Hz, 3H), 1,98 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 1,71 - 1,70 (m, 1H), 1,61 - 1,58 (m, 1H), 1,44 - 1,36 (m, 2H), 0,85 (dd, J = 15,5, 6,7 Hz, 7H).
[00900] Composto R24: a uma suspensão agitada de R23 (15 mg, 0,0157 mmol, 1,0 eq) em um frasco em temperatura ambiente foi len- tamente adicionado SOCl2 (1,3 µL, 0,0173 mmol, 1,1 eq) por meio de uma microsseringa. Após 1 h, uma alíquota analisada através de LC/MS indicou a formação do produto desejado. A mistura bruta foi concentrada para remover todos os voláteis sob pressão reduzida. A mistura bruta foi diluída com 0,8 mL de MeCN e carregada em uma coluna de HPLC preparativa EZ e eluída (Gemini, 5µm, 150 mm x 30 mm, eluentes: MeCN 10 - 95%em água, AcOH 0,05%). Frações puras foram combinadas e liofilizadas para dar 9,5 mg (63%) de R24 como um sólido esbranquiçado. MS (ESI, pos.): calc. para C44H70ClN7O15, 971,46; encontrado: 972,4 (M+H), 994,4 (M+Na), 970,3 (M-1).
[00901] Composto R25: a uma mistura de R24 (9,5 mg, 0,00976 mmol, 1,0 eq), R16a (8,51 mg, 0,00976 mmol, 1,0 eq) e NaI (7,3 mg, 0,0488 mmol) em um frasco de 1 dram foi dissolvida em 1 mL de DMF anidro. Uma quantidade catalítica (20 µL) de solução de DIEA 0,5M em DMF foi adicionada com seringa. A mistura foi aquecida a 55º C em um banho de óleo de um dia para o outro. A reação estava termi- nada através de LC/MS para dar o produto desejado. A mistura foi es- friada em um banho gelado e diluída com 1 mL de água. Após filtra- gem, a mistura bruta escura foi purificada através de uma coluna de HPLC preparativa (Gemini, 5µm, 150 mm x 30 mm, eluentes: MeCN 10 - 95% em água, AcOH 0,05%). Frações puras foram combinadas e liofilizadas para dar 7,4 mg (42%) de R25 como um sólido vermelho escuro. MS (ESI, pos.): calc. para C91H127N10O28+, 1807,88; encontra- do: 1808,8 (M+H) e 1806,5 (M-1). 1H RMN (500 MHz; DMSO-d6) δ 10,23 (s, 1H ), 8,22—8,17 (m, 1H), 8,03—7,98 (m, 1H), 7,86 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,75 (d, J = 8,2 Hz, 4H), 7,50 (d, J = 8,3 Hz, 3H), 7,00 (s, 2H), 6,01 (s, 1H), 5,76 (s, 1H ), 5,43 (s, 1H), 4,80—4,80 (m, 1H), 4,58 (s, 1H), 4,43—4,41 (m, 1H), 4,27—4,23 (m, 1H), 3,76 (t, J = 0,6 Hz, 2H), 3,59 (t, J = 7,3 Hz, 5H), 3,49 (d, J = 2,9 Hz, 54H), 3,14 (d, J = 5,8 Hz, 4H), 3,03 (s, 8H), 2,90 (t, J = 0,7 Hz, 3H), 2,77 (d, J = 0,7 Hz, 1H), 2,33 (t, J = 7,3 Hz, 4H), 2,08 (d, J = 6,1 Hz, 4H), 1,94 (d, J = 18,9 Hz, 10H), 1,83 (s, 5H), 1,59 (s, 8H), 0,85 (dd, J = 16,1, 6,7 Hz, 8H). EXEMPLO 41 Legenda: paladaciclo, dioxano
[00902] Composto R26: a uma solução agitada de 2,6- dimetoxianilina (9,0 g, 58,7 mmol, 1,0 eq) em 350 mL de DCM anidro foi adicionada em gotas durante 30 min uma solução de Br2 em 50 mL de DCM anidro a 40º C. Mais 200 mL foram adicionados à pasta fluida para obter uma solução semi-homogênea. A mistura de reação foi agi- tada de um dia para o outro em temperatura ambiente. A mistura mar- rom escuro foi esfriada para 4º C e basificada através da adição de solução de NaOH 1,0 M (ca. 100 mL) para pH = 10-11. A mistura foi diluída com 200 mL de DCM e as camadas são separadas. A camada aquosa foi extraída com DCM (200 mL no total). As camadas de DCM combinadas foram lavadas com água, salmoura e secas em Na2SO4. Após concentração in vacuo, o produto bruto foi obtido como um sólido ligeiramente avermelhado. Após concentração in vacuo, o produto bru- to foi obtido como um sólido ligeiramente avermelhado. O resíduo foi dissolvido em DCM (8 mL) e carregado em uma coluna Gold RediSep de sílica gel HP 220 g e purificado por meio de ISCO (eluição de gra- diente: EA 5 - 95% em hexanos), as frações puras combinadas e o solvente evaporado in vacuo. O sólido foi triturado com DCM e hexa- nos e filtrado. O sólido esbranquiçado foi seco in vacuo dando o com- posto título R26 como um sólido esbranquiçado (9,4 g, 70%). MS (ESI, pos.): calc. para C8H10BrNO2, 230,99; encontrado: 231,9 e 234,0 (M+H). 1H RMN (500 MHz; CDCl3) δ 6,66 (s, 2H), 3,84 (s, 6H)
[00903] Composto R27: o composto R26 (2,2 g, 9,47 mmol, 1,0 eq) foi dissolvido em 10 mL de DCM anidro e uma solução de BBr3 foi adi- cionada em gotas durante 10 min (10 mL, solução 1,0 M em DCM) a 4º C. A reação era exotérmica e produziu um precipitado. Uma quantida- de adicional de BBr3 (9 mL, 94,7 mmol, 10 eq) foi adicionada e a mistu- ra de reação foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. A suspensão avermelhada foi checada através de LC/MS para confirmar o produto desejado. A mistura de reação foi transferida para um frasco de 250 mL e esfriada para 4º C. A mistura foi cuidadosa- mente arrefecida com água seguido por tratamento com solução de NaHCO3 aquosa saturada para dar um pH = 7-8. A mistura foi extraída com DCM e a camada aquosa esfriada para 4º C para dar um precipi- tado marrom escuro. A mistura foi filtrada e o sólido marrom foi dissol- vido em 10 mL de metanol e seca em Na2SO4 para prover o produto desejado R27 (1,9 g, 100%). MS (ESI, pos.): calc. para C6H6BrNO2, 202,96; encontrado: 204,0 e 206,1 (M+H). 1H RMN (500 MHz; CD3OD)
δ 6,45 (s, 2H), 4,87 (s, 2H).
[00904] Composto R28: a uma solução agitada de composto R27 (0,146 g, 0,72 mmol) em uma mistura de tolueno (20 mL) e THF (20 mL) em temperatura ambiente foi adicionada rifamicina S (0,5 g, 0,72 mmol). A solução foi agitada por 3 dias em temperatura ambiente para dar o produto desejado. Os solventes foram removidos a vácuo, o re- síduo escuro foi dissolvido em 10 mL de etanol seguido por 100 mg de dióxido de manganês (MnO2). A mistura lenta foi agitada por 5 h em temperatura ambiente. Após filtragem de materiais insolúveis usando uma almofada de Celite, o filtrado foi evaporado in vacuo. O resíduo escuro foi purificado em uma coluna Gold RediSep de sílica gel HP 120 g por meio de ISCO (eluição de gradiente: EA 5 - 95% em hexa- nos). As frações puras combinadas e evaporadas in vacuo dando o composto título R28 como um sólido avermelhado escuro (270 mg, 43%). MS (ESI, pos.): calc. para C43H47BrN2O13, 878,23; encontrado: 879,2 e 880,2 (M+H), 878,1 e 879,1 (M-1). 1H RMN (500 MHz; DMSO- d6) δ 10,22 (br. s., 1H), 9,52 (br. s., 1H), 7,43 (br. s., 1H), 7,35 (br. s., 1H), 6,04 (br. s., 1H), 5,83 (br. s., 2H), 5,21 (d, J = 6,35 Hz, 2H), 4,89 (t, J = 10,50 Hz, 1H), 4,16 (br. s., 1H), 3,51 (br. s., 1H), 3,15 (br. s., 2H), 3,02 (br. s., 4H), 2,80 (t, J = 8,55 Hz, 1H), 2,21 (br. s., 3H), 2,08 (br. s., 1H), 1,96 (s, 4H), 1,99 (s, 4H), 1,78 (br. s., 1H), 1,71 (br. s., 3H), 1,60 (br. s., 1H), 1,47 (br. s., 1H), 0,84 (d, J = 6,84 Hz, 6H), 0,69 (br. s., 6H).
[00905] Composto R29: a um frasco seco ao forno de rosca na par- te superior de 8 mL, equipado com uma barra de agitação foi carrega- do composto R15 (60 mg, 0,069 mmol, 1,00 eq), 2-(dimetilamino)etan- 1-ol (61 mg, 0,69 mmol, 10 eq), t-BuBrettPhos-Pd-G3-paladaciclo (31 mg, 0,0345 mmol, 0,5 eq) e K3PO4 (30 mg, 0,141 mmol, 2,0 eq.). O frasco de reação foi tampado com um septo de borracha. O septo foi perfurado com uma agulha presa para evacuar e retrocheio com argô-
nio (esse processo foi repetido duas vezes) seguido pela adição de 1,4-dioxana (1,5 mL). A reação foi aquecida a 60 oC sob pressão de argônio por 15 h. A reação foi deixada esfriar para temperatura ambi- ente, filtrada em uma almofada de Celite® e enxaguada com MeOH. O material bruto foi concentrado in vacuo e purificado em uma coluna Aq C18 50 g (eluição de gradiente: MeCN 10 - 95% em água, ácido acéti- co 0,05% em ambos). As frações de produto foram combinadas e liofi- lizadas dando o composto título R29 como um sólido avermelhado es- curo (21 mg, 35%). MS (ESI, pos.): calc. para C47H57N3O14, 887,38; encontrado: 888,3 (M+H). 1H RMN (500 MHz; DMSO-d6) δ 10,12 (br. s., 1H), 9,39 (br. s., 1H), 6,75 (br. s., 1H), 6,70 (br. s., 1H), 6,03 (br. s., 1H), 5,77 (d, J = 15,14 Hz, 1H), 5,21 (br. s., 1H), 4,83 - 4,90 (m, 1H), 4,15 - 4,30 (m, 2H), 4,08 (br. s., 1H), 3,53 (br. s., 1H), 3,29 (s, 1H), 3,16 (br. s., 1H), 3,03 (br. s., 3H), 2,87 (br. s., 1H), 2,79 (br. s., 1H), 2,62 - 2,71 (m, 2H), 2,36 (s, 1H), 2,23 (s, 6H), 2,19 (br. s., 3H), 1,93 - 2,11 (m, 7H), 1,91 (s, 1H), 1,76 (br. s., 1H), 1,69 (br. s., 3H), 1,53 - 1,65 (m, 1H), 1,50 (br. s., 1H), 1,32 - 1,45 (m, 1H), 0,76 - 0,94 (m, 6H), 0,68 (br. s., 5H). EXEMPLO 42: Síntese de análogo de rifamicina R35
[00906] Análogo de rifamicina R35 foi sintetizado a partir de rifami- cina como descrito abaixo.
Legenda: dioxano
[00907] Composto R31: a uma solução de composto R30 (200 mg, 1,920 mmol) sob argônio em 1,4-dioxana/água (v/v, 10:1, 11 mL) foi adicionado Fmoc-OSu (1360 mg, 4,032 mmol). Depois de agitar por 5 h uma análise de LC/MS indicou que a reação estava completa. A mis- tura de reação foi tratada com NaHCO3 sat. (5 mL) e extraída com EtOAc (3 X 15 mL). A camada orgânica combinada foi então tratada com salmoura (10 mL), seca (Na2SO4) e concentrada in vacuo para dar o composto bruto R31 como uma espuma branca (800 mg, 76%), que foi usada na etapa seguinte instantaneamente sem purificação adicional. MS: calc. para C34H32N2O5, 548,2; encontrado: 549,2 (M+H).
[00908] Composto R32: A uma solução em agitação de composto R8 (160 mg, 0,652 mmol) sob argônio em THF (2 mL) em temperatura ambiente foram adicionados o álcool R31 (432 mg, 0,788 mmol) r PPh3 (308 mg, 1,174 mmol). Então uma solução de DBAD (270 mg, 1,174 mmol) em THF (1 mL) foi adicionada à mistura de reação em gotas. Após agitar por 15 h, a mistura foi evaporada até secagem e o resíduo foi purificado em uma coluna RediSep Gold de sílica gel HP 40 g por meio do e ISCO (eluição de gradiente: acetato de etila 0 - 100% em hexanos) e as frações puras evaporadas e secas in vacuo dando o composto título R32 como um sólido branco amarelado (286 mg, 56%). MS: calc. para C47H41N3O8, 775,3; encontrado: 776,3 (M+H), 798,2 (M+Na).
[00909] Composto R33: a uma solução sob argônio de composto R32 (220 mg, 0,284 mmol) em 5 mL de metanol/EtOAc (2:3) e desga- seificada com argônio foram adicionados 31 mg de Pd/C 10%. A mis- tura foi desgaseificada mais com argônio e conectada a um balão de hidrogênio. Após 2 h, análise através de LC/MS a partir de uma alíquo- ta de processo indicou que a reação estava completa. A mistura foi filtrada através de Celite e concentrada para dar 150 mg de composto R33 (85% puro através de LC/MS) como óleo amarelado, que foi usa-
do na etapa seguinte instantaneamente sem purificação adicional. MS: calc. para C40H37N3O6, 655,3; encontrado: 656,3 (M+H).
[00910] Composto R34: a um frasco de fundo redondo com hidroxi- anilina R33 (150 mg, 0,194 mmol, 85% puro), foram adicionados tolu- eno (2 mL) e rifamicina S (129 mg, 0,185 mmol). A mistura de reação foi sonificada por 1 min para dissolver a mistura de reação, selada por meio de um septo de borracha, purgada com argônio e a reação agita- da em temperatura ambiente. Depois de 1 dia uma outra porção de hidroxianilina R33 (45 mg, 0,059 mmol, 86% pura, sintetizada usando o mesmo procedimento descrito antes) em tolueno (2 mL) foi adiciona- da e agitada por 5 d. A reação foi concentrada in vacuo para remover tolueno, dissolvida em EtOH (4 mL) e MnO2 (20 mg) foi adicionado. Depois de agitar por 4 d, a reação foi concentrada in vacuo e purifica- da através de cromatografia em uma coluna RediSep Gold de sílica gel HP 40 g por meio de ISCO (eluição de gradiente acetato de etila : 0 - 100% em hexanos). As frações puras foram evaporadas e secas in vacuo dando o composto título R34 como um sólido avermelhado es- curo (65 mg, 26%). MS (ESI, pos.): calc. para C77H78N4O17. 1330,5; encontrado: 1353,5 (M+Na).
[00911] Composto R35: uma solução agitada de composto R34 (28 mg, 0,021 mmol) sob argônio em THF (1 mL) foi tratada com uma so- lução de TBAF (13 mg, 0,05 mL, 0,050 mmol, 1M em THF) e a reação foi agitada em temperatura ambiente. Depois de 2 h, a reação foi puri- ficada diretamente em uma coluna RediSep Gold C18 50 g por meios de sistema ISCO (eluição de gradiente: MeCN 0 - 100% em água, áci- do acético 0,05% em ambos, durante 30 min). As frações conapresen- tando produto goram combinadas, congeladas em gelo seco e liofiliza- das de um dia para o outro dando o composto título 35 como sólido avermelhado escuro (9 mg, 48%). MS: calc. para C47H58N4O13, 886,4; encontrado: 887,3 (M+H). 1H-RMN (500 MHz; CD3OD): δ 7,86-7,74 (m,
1H), 7,18-7,08 (m, 1H), 6,98-6,84 (m, 1H), 6,78-6,68 (m, 1H), 6,53-6,40 (m, 1H), 6,23-6,15 (m, 1H), 6,23-6,15 (m, 1H), 6,00-5,79 (m, 1H), 6,00- 5,79 (m, 1H), 5,30-4,95 (m, 2H), 3,81-3,65 (m, 6H), 3,35 (s, 3H), 3,09- 2,93 (m, 7H), 2,25-2,20 (m, 2H), 2,17-2,03 (m, 4H), 2,00-1,87 (m, 5H), 1,76-1,68 (m, 4H), 1,03-0,85 (m, 7H), 0,78-0,65 (m, 2H), 0,14-0,03 (m, 4H), 0,13-0,00 (m, 3H), -0,30 (m, 2H). EXEMPLO 43: ensaio de concentração inibidora mínima (MIC) do caldo
[00912] Para testar a eficácia de análogos de rifamicina da inven- ção in vitro, um ensaio de inibição de crescimento em caldo foi desen- volvido. Para o ensaio S. aureus NRS384 foi cultivado em Caldo de Soja Tríptico (TSB) de um dia para o outro, então subculturado 1:50 em TSB fresco e cultivado por mais duas horas. A cultura foi então pe- letizada através de centrifugação e lavada duas vezes em PBS. A cul- tura foi então diluída para 1x104 cfu/mL em TSB e 50 µL de uma sus- pensão foram adicionados por poço a uma placa de microtitulação de 96 poços em duplicata. Uma série de diluição do antibiótico indicado (um análogo de acordo com a invenção ou um análogo anteriormente conhecido Rifampicina) foi adicionado 1:1 para uma concentração ini- cial final de 1x10-5 M com diluições 1:3. As placas foram incubadas a 37º C com agitação por 24 horas e então o OD600 nm foi lido em um Spectramax i3 Minimax 300.
[00913] Os reagentes usados e os números de lote são mostrados na Tabela R2, abaixo. Tabela R2. Reagentes e Números de Lote para Ensaio MIC Reagente Vendedor # Catálogo Lote PBS Gibco 20012-043 2003838 S. aureus NRS384 BEI resources NR-46070 Tryptic Soy Broth (TSB) Teknova T1525 T014420G1801 Placas de diliução Greiner Bio one 780261 B17073CP
[00914] As concentrações mais baixas que inibiram o crescimento de S. aureus (Concentração Inibidora Mínima, MIC) são listados na Tabela R3. Um gráfico do ensaio de inibição de S. aureus conduzido com análogos de rifamicina de acordo com a invenção é mostrado na Figura 35. Tabela R3. Concentração Inibidora Mínima (MIC) de antibióticos em um ensaio de inibição de crescimento em caldo Análogo de rifamicina Peso Mol. (Da) MIC de Caldo de S. testado aureus (M) Rifampicina 823 4,6E-09 R1a 815 1,4E-08 R1b 890 1,2E-07 R1d 813 3,7E-07 R14 883 4,1E-08 R16a 823 1,5E-09 R16d 843 4,1E-08 R16e 858 4,6E-09
[00915] Como mostrado na Tabela R3, todos os análogos de rifami- cina de acordo com a invenção são eficazes na inibição de crescimen- to de S. aureus em concentrações submicromolares a nanomolares. O análogo 16a inibiu crescimento de S. aureus mais potentemente do que rifampicina com uma MIC de 1,5 x 10-9M. EXEMPLO 44: ensaio intracelular
[00916] A atividade do composto análogo de rifamicina contra S. aureus foi testada em um ensaio de "morte" intracelular.
[00917] Os reagentes usados e números de lote são mostrados na Tabela R4, abaixo. Tabela R4: Reagentes e Números de Lote para Ensaio Intracelular Reagente Vendedor # Catálogo Lote TSB Teknova T1525 T152517E1701 PBS Gibco 20012-043 1951145 Triton X-100 Sigma TX1568-1
Reagente Vendedor # Catálogo Lote RPMI Gibco 11875-093 1989237 FBS Gibco 172667 138252-100 PMA Sigma P8139 MkBV849TV Placa 96 poços Costa Corning 3904 16618025 Placas TSA Teknova T0144 T014420G1801 Pen/Strep Gibco 15140-122 1953095 Placas de Diluição Greiner Bio 780261 B17073CP one Gentamicina Gibco 10131-035 1729122
[00918] A linhagem de célula monocítica THP-1 foi cultivada em meio (RPMI + FBS 10% + Penicilina/Estreptomicina 1%), então seme- ada em uma densidade de 1e5 células/poço em uma placa de 96 po- ços e diferenciada em macrófagos por três dias antes da infecção usando PMA 200 nM. Uma cultura de um dia para o outro de S. aureus NRS384 foi cultivada em RPMI, lavada duas vezes com PBS e res- suspensa a 1e7 cfu/mL em PBS. THP-1 foi lavada com meio morno (RPMI sem FBS) para remover a Penicilina/Estreptomicina e então in- fectada com a suspensão de S. aureus em uma multiplicidade de in- fecção de 10:1 (S. aureus:macrófagos). As placas foram giradas a 300 xg por 5 minutos para sincronizar adesão das bactérias, então incuba- das a 37º C por 2 horas. Bactérias de flutuação livre foram removidas através de lavagem 2x com meio morno e S. aureus extracelulares remanescentes foram mortos através da adição de meio conapresen- tando gentamincina (50 ug/mL). Depois de 1 h, meio foi aspirado e o composto indicado foi adicionado a macrófagos infectados em meio conapresentando 50 µg/mL de gentamicina para evitar crescimento extracelular de S. aureus. Depois de 2 h, as placas foram lavadas 2x com RPMI morno sem FBS e 100 ul de tampão de lise THP-1 (Triton 0,1% em PBS) foram adicionados a cada poço. Sobrevivência de S. aureus foi enumerada através de unidades de formação de colônia através de diluição serial e plaqueamento em TSA.
[00919] Os resultados do ensaio de morte intracelular são mostra- dos na Tabela R5 e Figuras 36 e 37. A concentração inibidora mínima (MIC) corresponde à concentração mais baixa de cada composto que resultou em erradicação de S. aureus intracelular. Tabela R5 Análogo de Rifamicina Testado MIC de Morte Intracelular Rifampicina >1,0E-06 R1a 1,0E-06 R1b >1,0E-06 R1d >1,0E-06 R14 1,0E-06 R16a 4,0E-08 R16d 1,0E-06 R16e 1,0E-06
[00920] A Tabela R5 e as Figuras 36 e 37 demonstram que os compostos R1a, R14, R16a, R16d e R16e tinham capacidade de mor- te de S. aureus intracelular aumentada comparado com rifampicina, com composto R16a apresentando a atividade mais alta. EXEMPLO 45: métodos de conjugação para maleimidas
[00921] O anticorpo (1-10 mg/ml) em 50 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, pH 7,5, foi tratado com 1 mM de ditiotreitol a 37º C por 30 min. Após filtragem em gel (G-25, acetato de sódio pH 4,5), o compos- to derivado de carga útil de ligador maleimido R25 (1,2 equivalen- te/grupo SH) em DMSO (10 mg/ml) foi adicionado ao anticorpo reduzi- do e a mistura ajustada para pH 7,0 com HEPES 1 M (pH 7,4). Após 1 hora a reação foi arrefecida com N-etil maleimida em excesso. Os con- jugados foram purificados usando PBS com glicerol 5% através de cromatografia de exclusão de tamanho e filtrados estéreis. Concentra- ções de proteína e razões de carga útil para anticorpo foram determi- nadas através de análise espectral UV. HPLC de exclusão de tamanho estabeleceu que todos os conjugados usados eram >90% monoméri- cos e RP-HPLC estabeleceu que havia <1% de carga de ligador não conjugada. Todos os anticorpos conjugados foram analisados através de HIC para valores de carregamento de carga útil de ligador.
[00922] Caracterização de Conjugados através de Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC).
[00923] Para determinar o carregamento do ligador-cargas úteis no anticorpo, os conjugados foram administrados em Agilent 1260 usando uma coluna TSK-NPR Butyl HIC usando um gradiente linear de fosfato de potássio 1 M pH 8,5 para água durante 60 min. O carregamento de carga útil foi determinado através de integração de áreas de pico cor- respondendo às espécies de anticorpo conjugado e não conjugado. Razões de carga útil para anticorpo são reportadas na Tabela R6. Tabela R6 Rendimento percentual e razões de carga útil para anticorpo para cada um dos conjugados de anticorpo fármaco Anticorpo Rendimento (%) DAR (HIC) H1H21234N-Composto R25 50 3 Controle de Isótipo -Composto R25 50 2 EXEMPLO 46:
[00924] Um conjugado de anticorpo fármaco não citotóxico-MSR1 (ncADC) foi testado em artrite induzida por anticorpo anticolágeno tipo I (CAIA) in vivo; detecção de citocina em articulações inflamadas usando Proinflammatory Panel 1 (mouse) Multiplex Immunoassay kit (MSD).
[00925] Lipopolissacarídeo (LPS; 0111:B4) (Chondrex, #Cat 53100, #Lote 180141). Concentração de estoque: 2,5mg/ml; concen- tração de trabalho: 0,5mg/ml.
[00926] Para examinar mais o efeito anti-inflamatório do ncADC an- ti-MSR1 Ab-esteroide, o ncADC foi avaliado em um modelo de artrite induzida por colágeno-anticorpo (CAIA) in vivo. Para o modelo, ca-
mundongos expressando homoziguamente domínio extracelular e do- mínio de transmembrana de MSR1 humano no lugar de domínios ex- tracelular e de transmembrana de MSR1 de camundongo (MSR1 hu- manizado) e com uma deleção homozigua do gene ApoE (ApoE-KO) foram utilizados (camundongos resultantes referidos como camundon- gos hMSR1/ApoE-KO). Testes de ncADC em CAIA in vivo:
[00927] Para induzir CAIA, camundongos hMSR1/ApoE-KO foram injetados intraperitonealmente com uma mistura de 8 mg/kg de cinco mAbs de colágeno anti-tipo II (Chondrex, #Cat 53100, #Lote 180140) no dia 0, seguido por administração intraperitoneal com 50 g de lipo- polissacarídeo (LPS; 0111:B4; Chondrex, #Cat 53100, #Lote 180141) no dia 3. A severidade dos níveis microscópicos de artrite foi graduada até 13 dias após injeção de mAb em cada um dos quatro membros por camundongo em uma escala 1-4. Os critérios para graduação foram como segue: 0, normal; 1, vermelhidão e inchaço leves do tornoze- lo/pulso ou dedos individuais; 2, vermelhidão e inchaço moderados de tornozelo/pulso; 3, vermelhidão e inchaço severos da pata inteira inclu- indo os dedos; 4, inchaço máximo nos membros envolvendo múltiplas articulações. O valor máximo da soma dos scores obtidos dos quatro membros de cada camundongo foi 16. Os camundongos desenvolve- ram primeiros sinais de artrite no dia 5 e foram tratados intraperitone- almente dia sim dia não com 20 L/g de concentrações decrescentes (21 mg/kg, 63 mg/kg e 191 mg/kg) de conjugados ncADC anti-MSR1 Ab-esteroide (H1H21234N-N297Q-P4-3) e ncADC controle de isotpo esteroide (Controle de Isótipo-N297Q-P4-3) partindo do dia 6, PBS, anti-MSR1 Ab não conjugado (H1H21234N-N297Q) e carga útil de es- teroide livre (P4-1), foram injetados intraperitonealmente dia sim dia não ou diariamente (referido como P4-1ED). Protocolo de dosagem e tratamento experimental para grupos de camundongos são mostrados na Tabela 32. Todos os camundongos foram sacrificados no dia 13 e patelas inflamadas foram coletadas para homogeneização subsequen- te e detecção de citocina. Medição de citocinas em homogenatos de articulação:
[00928] Patelas do joelho inflamadas foram coletadas em tubos de microcentrífuga de 2 mL conapresentando duas esferas de carbida de tungstênio (Qiagen, #Cat 69997) e 500 L de T por tampão (Thermo Scientific, #Cat 78510, #Lote QF217759) conapresentando coquetel inibidor de protease e EDTA 0,5M (Thermo Scientific, #Cat 78444, #Lote RF231047). Os tecidos foram rompidos em uma frequência de 30s-1 por 10 minutos usando Qiagen Tissue Lyser II, centrifugados a
14.000 rpm por 7 minutos e então os sobrenadantes foram coletados sem perturbar o pelete. As concentrações de citocina nos sobrenadan- tes foram medidas usando um Proinflammatory Panel 1 (camundongo) multiplex immunoassay kit (MesoScale Discovery, #Cat K15048D) de acordo com as instruções do fabricante. Em suma, 50 L/poço de cali- bradores e amostras (diluídas em Diluent 41) foram adicionados às placas pré-revestidas com anticorpos de captura e incubados em tem- peratura ambiente enquanto agitando a 700 rpm por 2 horas. As pla- cas foram então lavadas 3 vezes com 1xPBS conapresentando Tween-20 0,05% (p/v), seguido pela adição de 25 μL de Detection An- tibody Solution diluída em Diluent 45. Depois de 2 horas de incubação em temperatura ambiente enquanto agitando, as placas foram lavadas 3 vezes e 150 μL de 2x Read Buffer foram adicionados a cada poço. Eletroquimioluminescência foi imediatamente lida em instrumento MSD Spector®. As concentrações de citocina foram normalizadas por teor de proteína total em homogenatos de tecido medidos usando ensaio de proteína Bradford (BioRad, #Cat 5000006, #Lote 64144266). Análi- se de dados foi realizada usando software GraphPad Prism. Signifi- cância estatística dentro dos grupos foi determinada através de Anova de uma via com pós-teste de comparação múltipla de Turkey (*p<0,01; **p<0,001; ***p<0,0001). Tabela 32: protocolo de projeto, dosagem e tratamento de experimen- to para camundongo hMSR1/ApoE-KO CAIA Grupo Camun- Molécula Testa- Dose Frequência (d=dia) dongos (n) da (mg/kg) 1 5 PBS - a cada 2 dias: d6, d8, d10, d12 2 5 P4-1ED 2,95 todos os dias: d6, d7, d8, d9, d10, d11, d12 3 5 P4-1 2,95 a cada 2 dias: d6, d8, d10, d12 4 3 H1H21234N- 191 a cada 2 dias: d6, d8, N297Q d10, d12 5 5 H1H21234N- 191 a cada 2 dias: d6, d8, N297Q-P4-3 d10, d12 6 5 H1H21234N- 63 a cada 2 dias: d6, d8, N297Q-P4-3 d10, d12 7 5 H1H21234N- 21 a cada 2 dias: d6, d8, N297Q-P4-3 d10, d12 8 5 Controle de Isóti- 191 a cada 2 dias: d6, d8, po-N297Q-P4-3 d10, d12 9 5 Controle de Isóti- 63 a cada 2 dias: d6, d8, po-N297Q-P4-3 d10, d12 10 5 Controle de Isóti- 21 a cada 2 dias: d6, d8, po-N297Q-P4-3 d10, d12
[00929] Como mostrado na Tabela 33, uma mistura de mAbs anti- colágeno tipo II induziu CAIA robusta em camundongos hMSR1/ApoE- KO tratados com PBS. Administração terapêutica de ncADC anti- MSR1 Ab-esteroide (H1H21234N-N297Q-P4-3) in vivo foi eficaz na inibição da progressão e melhora da severidade de CAIA de uma ma- neira dependente da dose com todas as doses demonstrando um efei- to significante. Inibição comparável de CAIA foi observada entre o ncADC anti-MSR1 Ab-esteroide (H1H21234N-N297Q-P4-3) dosado a
21 mg/kg e a P4-1 livre dosada todos os dias (P4-1ED). O ncADC anti- MSR1 Ab-esteroide (H1H21234N-N297Q-P4-3) dosado a 191 mg/kg e 63 mg/kg demonstrou eficácia maior do que a carga útil dosada todos os dias. Administração terapêutica de 63 mg/kg e 21 mg/kg de controle de isótipo-ncADC (Controle de Isótipo-P4-3), anti-MSR1 Ab não conju- gado (H1H21234N) e P4-1 livre dia sim dia não não atenuou CAIA em camundongos hMSR1/ApoE-KO. A dose mais alta do controle de isóti- po cnADC demonstrou eficácia na melhora da severidade de CAIA.
[00930] Como mostrado na Tabela 34, administração terapêutica in vivo de ncADC anti-MSR1 Ab-esteroide (H1H21234N-N297Q-P4-3) foi também eficaz na inibição de produção de citocina proinflamatórias em camundongos hMSR1/ApoE-KO de uma maneira dependente da dose com todas as doses testadas demonstrando um efeito significante so- bre IL-6, IL-1beta e KC-GRO; no entanto, apenas a dose mais alta ti- nha um efeito significante sobre TNF-alfa. Nenhum efeito sobre níveis de citocina proinflamatórias em articulações inflamadas foi observado com anti-MSR1 Ab não conjugado (H1H21234N-N297Q) e P4-1 livre administrada dia sim dia não. O ncADC controle de isótipo demonstrou efeitos sobre citocinas proinflamatórias nas doses mais altas testadas.
[00931] Tabela 33. ncADC anti-MSR1 Ab-esteroide melhora os sco- res clínicos de CAIA em camundongos hMSR1/ApoE-KO in vivo de uma maneira dependente da dose. Significância estatística para gru- pos tratados com PBS e Controle de Isótipo-P4-3 foi determinada atra- vés de um Anova de uma via com pós-teste de comparação múltipla de Turkey e erro padrão de média (SEM±) calculado.
Tabela 33 Molécula PBS P4- P4-1 H1H2123 H1H21234N- Controle de Isóti- Testada 1ED 4N- N297Q-P4-3 po-N297Q-P4-3 N297Q Dose N/A 2,95 2,95 191 191 63 21 191 63 21 (mg/kg) Score 11,3± 5± 9,4± 13,67± 0,5± 2,3± 5,1± 3,2± 7,5± 9,6± Clínico 2,36 1,54 2,46 2,02 0,35** 0,84** 2,1* 0,84 0,94 3,96 *p<0,05, **p<0,005, ***p<0,0005, ****p<0,00001
[00932] Tabela 34. Tratamento terapêutico com ncADC anti-MSR1 Ab-esteroide inibe produção de citocina proinflamatória induzida por CAIA em camundongos hMSR1/ApoE-KO. Significância estatística pa- ra grupos tratados com PBS e Controle de Isótipo-P4-3 foi determina- da através de um Anova de uma via com pós-teste de comparação múltipla de Turkey e erro padrão de média (SEM±) calculado. Tabela 34 PBS P4- P4-1 H1H21 H1H21234N- Isotype Ctrl- 1ED 234N N297Q-P4-3 N297Q-P4-3 Dose 2,95 2,95 191 191 63 21 191 63 21 (mg/kg) Cito- IL-6 155,4 22,8± 131,4± 116,3± 18,8± 23,5± 51,9± 40,3± 75,2± 99,1± cinas ± 5,2**** 40,9 23,8 3,7**** 4,2**** 27,8**** 15,5**** 24,3*** 25,5 [pg 41 por IL-1 23,1± 1,1± 20,6± 23,7± 0,5± 1,6± 12,8± 6,3± 13,7± 17,3± mg de 6,1 0,6**** 4,3 7,9 0,2**** 1,3**** 2,2** 2,1**** 7,3* 2,9 prote- KC- 16,6± 8± 8,9± 7,8± 5,9± 10,8± 9,9± 11,7± 18,2± 15± ína GRO 6,8 4,4**** 9 16 1,5**** 6,9**** 13* 2,7**** 8,6 10 total] TNF- 7,9± 3,5± 8,3± 10,2± 1,9± 3,8± 7,9± 4,3± 9,3± 9,5± 2,8 1,4 1,9 5 0,8* 1,9 3,5 2 4,3 1,6 *p<0,05, **p<0,005, ***p<0,0005, ****p<0,00001 EXEMPLO 47: Ensaio de morte de S. aureus intracelular
[00933] Os ncADcs anti-MSR1 foram testados. H1H21234N-N297Q-R25 Anticorpo controle de isótipo-N297Q-R25
[00934] Para testar a eficácia de um ncADC anti-MSR1 Ab-
antibiótico da invenção in vitro, um ensaio de morte de S. aureus intra- celular foi utilizado. Para o ensaio, uma linhagem de célula monocítica THP-1 foi cultivada em meio compreendido de RPMI conapresentando FBS 10% e Penicilina/Estreptomicina 1%, então foi semeada em uma densidade de 1x105 células/poço em uma placa de 96 poços e diferen- ciada em macrófagos por três dias antes da infecção usando Phorbol Myristate Acetate 200 nM (PMA). Uma cultura de um dia para o outro de cepa MRSA de S. aureus NRS384 foi cultivada em RPMI, lavada duas vezes com PBS e subsequentemente ressuspensa a 1x107 cfu/mL em PBS. Células THP-1 foram lavadas com meio morno (RPMI sem FBS) para remover a Penicilina/Estreptomicina e então infectadas com a suspensão de S. aureus em uma multiplicidade de infecção de 10:1 (S. aureus:macrófagos). As placas foram giradas a 300 xg por 5 minutos para sincronizar adesão das bactérias, então incubadas a 37º C por 2 horas. Bactérias de flutuação livre foram removidas através de lavagem 2x com meio morno e S. aureus extracelulares remanescen- tes foram mortos através da adição de meio conapresentando 1000 ug/mL de gentamicina. Depois de 1 h, meio foi aspirado e o ncADC anti-MSR1 Ab-antibiótico (H1H21234N-N297Q-R25) em doses diferen- tes (10ug/mL, 3,3ug/mL, 1,1ug/mL, 0,4ug/mL, 0,1ug/mL) e o ndADC de controle de isótipo-antibiótico (Controle de Isótipo-N297Q-R25) a 10ug/mL foram adicionados a macrófagos infectados em meio cona- presentando 50 ug/mL de gentamicina para evitar crescimento celular de S. aureus. Uma amostra sem nenhum ncADC foi também incluído para referência. Após 24 horas, as placas foram lavadas duas vezes com RPMI morno sem FBS e então 100 uL de Triton X-100 0,1% em PBS foram adicionados e incubados por 10 minutos para lisar a THP-
1. Sobrevivência de S. aureus foi enumerada através de unidades de formação de colônia através da diluição serial em BPS e plaqueamen- to em placas de ágar triptona de soja.
[00935] Como mostrado na Tabela R7, o ncADC anti-MSR1 Ab- antibiótico (H1H21234N-N297Q-R25) em concentrações de 10, 3,3 e 1,1 ug/mL demonstrou a habilidade em erradicar S. aureus intracelular de macrófagos infectados in vitro. As doses menores do ncADC anti- MSR1 Ab-antibiótico de 0,4 ug/mL e 0,1 ug/mL demonstraram a habili- dade em reduzir S. aureus intracelular de macrófagos infectados in vitro, mas não o limite de detecção como as doses maiores fizeram. Macrófagos tratados com o ncADC controle de isótipo-antibiótico (Con- trole de Isótipo-N297Q-R25) a 10 ug/mL carregavam S. aureus em um nível similar a controle não tratado. Esses dados demonstram que um ncADC anti-MSR1 Ab-antibiótico pode ser usado para matar efetiva- mente patógenos residindo dentro de um reservatório de macrófago. Tabela R7: unidades de formação de colônia médias de anti-MSR1 Ab-Antibiótico dose ncADC Desvio Pa- cfu/mL média (ug/mL) drão S. aureus controle nenhuma 275,000 0 Controle de Isóti- 10 200,000 35,355 po-N297Q-R25 10 50 (limite de detecção) 0 MSR1 ncADC 3,3 50 (limite de detecção) 0 H1H21234N- 1,1 50 (limite de detecção) 0 N297Q-R25 0,4 663 124 0,1 33,750 1,768 EXEMPLO 48:
[00936] Modelo de camundongo de infecção disseminada IV por S. aureus
[00937] Os ADCs que seguem foram usados nesse experimento:
Anticorpo MSR1 ncADC H1H21234N-N297Q-R25 Controle de Isótipo-N297Q-R25 MSR1 ncADC H1H21234N 3-N297Q Controle de Isótipo-N297Q
[00938] Para testar a eficácia de um ncADC anti-MSR1 Ab- antibiótico da invenção in vivo, um modelo de infecção disseminada intravenosa foi utilizado. A cepa de MSRA de S. aureus NRS384 foi cultivada de um dia para o outro em caldo de soja tríptico (TSB) e sub- culturada para fase logarítmica média. As bactérias foram então lava- das duas vezes com PBS e ressuspensas em PBS em uma concen- tração de 1,2x10^8 cfu/mL. Os camundongos expressando homozi- guamente domínio extracelular e domínio de transmembrana de MSR1 humano no lugar de domínios extracelular e de transmembrana de MSR1 (MSR humanizado, MAID 7343-MSR1 HumIn delHyg) foram então infectados intravenosamente através da veia da cauda com 100 uL de suspensão bacteriana, para uma fosse infecciosa final de 1,2x10^7 cfu/camundongo. De um a três dias pós-infecção, os camun- dongos foram tratados com 110 mg/kg de vancomicina subcutanea- mente duas vezes ao dia onde indicado. Ou o anticorpo monoclonal anti-MSR1 (H1H21234N-N297Q), ncADC anti-MSR1 Ab-antibiótico (H1H21234N-N297Q-R25), o Ab controle de isótipo ou o ncADC con- trole de isótipo (Controle de Isótipo-R25) foi administrado subcutane- amente na dose indicada, como descrito na Tabela R8, um dia após a infecção. Os camundongos foram monitorados quanto à perda de peso e score de condicionamento do corpo durante a infecção. No dia qua- tro pós-infecção, os camundongos foram eutanizados e a carga renal de S. aureus foi quantificada através de homogeneização de tecido seguido por enumeração de unidades de formação de colônia através da diluição serial em PBS e plaqueamento em placas de ágar triptona de soja.
Os dados desse experimento são mostrados na Tabela R8. Tabela R8 Carga renal de S. aureus média em camundongos tratados com ncADC anti-MSR1 Ab-Antibiótico em combinação com vancomicina Tratamento Trata- Dose de Cfu mé- Nº de ca- Desvio mento mAb dia/par mundongos Padrão com conju- de rim com S. au- vanco- gado reus abaixo micina (mg/kg) do limite de detecção Controle Infec- - (-) 4,33E+08 0/5 2,32E+08 tado Vancomicina + (-) 2,07E+06 0/6 2,76E+06 Controle de Isó- + 1 2,44E+06 0/4 1,51E+06 tipo 1mg/kg ncADC Controle + 1 4,01E+05 1/5 6,49E+05 de Isótipo (Con- trole de Isótipo- N297Q-R25) anti-MSR1 Ab + 1 1,55E+05 4/8 2,72E+05 (H1H21234N- N297Q) anti-MSR1 Ab + 0,1 2,43E+05 0/6 2,64E+05 (H1H21234N- N297Q ) anti-MSR1 Ab- + 1 6,17E+03 7/9 1,69E+04 antibiótico ncADC (H1H21234N- N297Q-R25) anti-MSR1 Ab- + 0,1 1,16E+03 6/8 1,78E+03 antibiótico ncADC (H1H21234N- N297Q-R25) Limite de detecção = 250 unidades de formação de colônia (cfu)
[00939] Como mostrado na Tabela R8, infecção intravenosa com cepa MRSA de S. aureus NRS384 resulta em carga bacteriana alta nos rins e tratamento de camundongos com o padrão de cuidado anti- biótico vancomicina reduz a carga renal de S. aureus em aproximada- mente 2 logs, mas nenhum dos camundongos tinha níveis de S. au- reus reduzidos abaixo do limite de detecção (LOD). O ncADC anti- MSR1 Ab-antibiótico (H1H21234N-N297Q-R25) em doses de 1 e 0,1 mg/kg em combinação com vancomicina resultou em 77% e 75% de camundongos com níveis de S. aureus abaixo do LOD, demonstrando melhoria em eliminação de S. aureus em camundongos tratados com a terapia de combinação ncADC Ab-antibiótico. Eliminação de S. au- reus foi menos acentuada em camundongos tratados com o conjugado ncADC controle de isótipo (Controle de Isótipo-N297Q-R25) mais van- comicina, demonstrando o benefício de carga útil se direcionando a macrófagos.
[00940] A presente invenção não deve ser limitada em escopo pe- las modalidades específicas descritas aqui. Na verdade, várias modifi- cações da invenção em adição àquelas descritas aqui se tornarão apa- rentes àqueles versados na técnica a partir da descrição acima e das figuras acompanhantes. Tais modificações pretendem se encaixar no escopo das reivindicações apensas.

Claims (69)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a receptor sequestrante de macrófagos 1 (MSR1), caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo exibe uma ou mais propriedades selecionadas do grupo consistindo em: (i) se liga a MSR1 humano a 37º C com uma KD de menos do que cerca de 1,4 nM conforme medido através de ressonância de plasmons de superfície; (ii) se liga a MSR1 humano a 37º C com uma t1/2 maior do que cerca de 4 minutos conforme medido através de ressonância de plasmons de superfície; (iii) exibe inibição máxima de absorção de LDL modificada por MSR1 humano de menos do que cerca de 90% com uma IC50 de menos do que cerca de 10 nM conforme medido através de ensaio de absorção de ligante; (iv) bloqueia <50% de LDL modificada se ligando a MSR1 humano conforme medido através de ensaio ELISA de competição; e (v) exibe ligação de MSR1 humano e internalização do complexo ligado de mais do que cerca de 10% conforme ensaiado pe- la ligação em células THP-1.
2. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a receptor sequestrante de macrófagos 1 (MSR1), caracterizado pelo fato de que é expresso na superfície e bloqueia a inibição de absorção de LDL modificada por MSR1 em menos do que 80% com uma IC50 de menos do que 3,5 nM.
3. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o an- ticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo bloqueia inibi- ção de absorção de LDL modificada por MSR1 em menos do que 60%
com uma IC50 de menos do que 1,5 nM.
4. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a receptor sequestrante de macrófago 1 (MSR1), caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende: (a) as regiões de determinação de complemen- taridade (CDRs) de uma região variável de cadeia pesada (HCVR) apresentando uma sequência de aminoácido como mostrado na Tabe- la 4; e (b) as CDRs de uma região variável de cadeia leve (LCVR) apresentando uma sequência de aminoácido como mostrado na Tabe- la 4.
5. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o an- ticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende uma HCVR apresentando uma sequência de aminoácido como mostrado na Tabe- la 4 e uma LCVR apresentando uma sequência de aminoácido como mostrado na Tabela 4.
6. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o an- ticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende: (i) um domínio HCDR1 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 36, 52, 92 e 284; (ii) um domínio HCDR2 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6, 38, 54, 94 e 286; (iii) um domínio HCDR3 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 8, 40, 56, 96 e 288; (iv) um domínio LCDR1 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12, 44,
60, 100 e 292; (v) um domínio LCDR2 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 14, 46, 62, 102 e 294; (vi) um domínio LCDR3 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 16, 48, 64, 104 e 296.
7. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o an- ticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende: (i) uma região de determinação de complementaridade de cadeia pesada (HCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 52; uma HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 54; uma HCDR3 compreenden- do SEQ ID NO: 56; uma região de determinação de complementarida- de de cadeia leve (LCDR)-1 compreendendo SEQ ID NO: 60; uma LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 62; e uma LCDR3 compreen- dendo SEQ ID NO: 64; (ii) uma HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 4; uma HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 6; uma HCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 8; uma LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 12; uma LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 14; e uma LCDR3 compreen- dendo SEQ ID NO: 16; (iii) uma HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 36; uma HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 38; uma HCDR3 compreenden- do SEQ ID NO: 40; uma LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 44; uma LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 46; e uma LCDR3 compreen- dendo SEQ ID NO: 48; (iv) uma HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 92; uma HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 94; uma HCDR3 compreenden- do SEQ ID NO: 96; uma LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 100;
uma LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 102; e uma LCDR3 com- preendendo SEQ ID NO: 104; (v) uma HCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 284; uma HCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 286; uma HCDR3 compreen- dendo SEQ ID NO: 288; uma LCDR1 compreendendo SEQ ID NO: 292; uma LCDR2 compreendendo SEQ ID NO: 294; e uma LCDR3 compreendendo SEQ ID NO: 296.
8. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compete por ligação a MSR1 humano com um anticorpo de referência compreendendo um par de sequência de aminoácido de HCVR/LCVR selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 2/10, 23/42, 50/58; 90/98 e 282/290,
9. Conjugado anticorpo-fármaco, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, conjugado a um resíduo de carga útil opcionalmente através de um ligador ou através de um ligador-espaçador.
10. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivin- dicação 9, caracterizado pelo fato de que apresenta a estrutura de Fórmula (I): Fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato, forma estereoisoméri- ca do mesmo, um regioisômero do mesmo ou misturas de regioisôme- ros do mesmo; em que: BA é um agente de ligação; L é um ligador;
PA é uma porção de carga útil selecionado do grupo con- sistindo em um resíduo de esteroide, um resíduo de modulador de LXR ou um resíduo de análogo de rifamicina; e o subscrito n é um inteiro de a partir de 1 a 30.
11. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivin- dicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que apresenta a estrutura de Fórmula (IA): Fórmula (IA) em que SP1 está ausente ou é um espaçador; RG1 é um resíduo de grupo reativo; AA1 está ausente ou é um ligador divalente ou trivalente compreendendo um resíduo de aminoácido que é opcionalmente liga- do diretamente ou indiretamente a um grupo HG; AA2 está ausente ou é um resíduo de dipeptídeo, tripeptí- deo ou tetrapeptídeo; Q, quando presente, é um resíduo de grupo conector; SP está ausente ou é um espaçador; e HG, quando presente, é um grupo hidrofílico.
12. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que apre- senta a estrutura de Fórmula (IB-1): Fórmula (IB-1) em que SP1 está ausente ou é um espaçador; RG1 é um resíduo de grupo reativo; Q, quando presente, é
, , ; ou ;e SP está ausente ou é um espaçador; em que a indica os átomos através dos quais o grupo de referência é ligado aos grupos adjacentes na fórmula.
13. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que apre- senta a estrutura de Fórmula (IB-2): Fórmula (IB-2) em que SP1 está ausente ou é um espaçador; RG1 é um resíduo de grupo reativo; AA1 está ausente ou é um ligador divalente ou trivalente compreendendo um resíduo de aminoácido que é opcionalmente liga- do diretamente ou indiretamente a um grupo HG; AA2 está ausente ou é um resíduo de dipeptídeo, tripeptí- deo ou tetrapeptídeo; Q, quando presente, é , ou ; SP está ausente ou é um espaçador; e HG, quando presente, é
, , , ou , em que a indica os átomos através do qual o grupo de referência é ligado aos grupos adjacentes na fórmula.
14. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11 e 13, caracterizado pelo fato de que apresenta a estrutura de Fórmula (IC), Fórmula (ID) ou Fórmula (IE): Fórmula (IC) Fórmula (ID) Fórmula (IE) em que SP1 está ausente ou é um espaçador; RG1 é um resíduo de grupo reativo; SP2 está ausente ou é um espaçador;
RG2 é um resíduo de grupo reativo; AA1 é um ligador divalente ou trivalente compreendendo um resíduo de aminoácido; AA2 é um resíduo de dipeptídeo, tripeptídeo ou tetrapeptí- deo; Q, quando presente, é , ou ; SP está ausente ou é um espaçador; e HG é , , , ou , em que a indica os átomos através do qual o grupo de referência é ligado aos grupos adjacentes na fórmula.
15. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 e 13 a 14, caracterizado pelo fato de que AA1-AA2 é de acordo com a Fórmula (LL1):
(LL1) em que RAA1, RAA2 e RAA3 são, cada um, independentemente, cadeias laterais de aminoácido, pelo menos uma das quais é ligada a -(RG2)- SP2-HG, -(RG2)-HG ou HG; em que a indica os átomos através dos quais AA1-AA2 é ligado aos grupos adjacentes na fórmula.
16. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivin- dicação 15, caracterizado pelo fato de que RAA1 é uma cadeia lateral de lisina, glutamina, ácido glutâmico ou ácido aspártico ligada direta- mente a HG e RAA2 e RAA3 são cadeias laterais ou de valina e alanina ou valina e citrulina, respectivamente.
17. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 e 13 a 16, caracterizado pelo fato de que AA1-AA2 é ou , em que indica os átomos através dos quais AA1-AA2 é ligado aos grupos adjacentes na fórmula.
18. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 17, caracterizado pelo fato de que os re- síduos RG1 e RG2 são independentemente, em cada caso, seleciona- dos do grupo consistindo em:
, , , ,
N
N
N , , , , , ,
N
N N ou , , , , , , , , , e ; em que a indica o átomo através do qual o resíduo RG1 ou RG2 é ligado aos grupos adjacentes na fórmula.
19. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 18, caracterizado pelo fato de que SP, SP1 e SP2 estão independentemente, em cada caso, ausentes ou são selecionados do grupo consistindo em C1-6 alquileno, -NH-, -S-, -O-, -
C(O)-, (-CH2-CH2-O)e, -NH-CH2-CH2-(-O-CH2-CH2)e-C(O)-, -C(O)- (CH2)u-C(O)-, -C(O)-NH-(CH2)v-, (glicina)4-serina e combinações dos mesmos, em que o subscrito e é um inteiro de a partir de 0 a 4, o subscrito u é um inteiro de a partir de 1 a 8 e o subscrito v é um inteiro de a partir de 1 a 8.
20. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 19, caracterizado pelo fato de que n é 1, 2, 3 ou 4.
21. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 20, caracterizado pelo fato de que é
O
O O O O
H
O O N
N O O N N
H H H
O O
NH O NH2
O
S
O S
O
S
S
S
S
O O
O O S
O N O N S
H H
O H H O H O O
N O O N N
O O N N
O O H O H
O N NH2
HN O H
O HO O
O O S
O N
N N O O O
N H ou .
22. Molécula de anticorpo-fármaco como definida na reivin- dicação 9, caracterizada pelo fato de que o anticorpo, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, é conjugado a uma carga útil de este-
roide através de um ligador ou um ligador-espaçador.
23. Molécula de anticorpo-fármaco como definida na reivin- dicação 9, caracterizada pelo fato de que o anticorpo, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, é conjugado a uma carga útil de modu- lador de LXR através de um ligador.
24. Molécula de anticorpo-fármaco como definida na reivin- dicação 9, caracterizada pelo fato de que o anticorpo, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, é conjugado a uma carga útil de rifami- cina através de um ligador.
25. Molécula de anticorpo-fármaco, de acordo com a reivin- dicação 22, caracterizada pelo fato de que o esteroide conjugado ao anticorpo, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, através de um ligador ou um ligador-espaçador é um composto de Fórmula (A-1) Fórmula (A-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoiso- mérica do mesmo; em que R1 e R2 são, independentemente, -H, alquila, alquil-C(O)-O- , -OH ou halo; ou R1 e R2 juntos formam , em que R4 é alquila, arila, arilalquila ou uma heterocicloal- quila contendo N, em que a alquila, arila, arilalquila e heterocicloalquila con- tendo N são, independentemente em cada caso, opcionalmente substi- tuídas com -NRAaRAb; R3 é -O, RZ-C(O)-X-, -heteroalquila, -piperidinila, -NRAaRAb,
-oxiaril-NRAaRAb ou -Z-A'(RP)t; RZ é alquila; X é O ou NRAa; Z é S, S(O), S(O)2, SO2NRAa, O, C(O)NRAa, C(O) ou NRAa; A' é arila, arilalquila ou heteroarila; RP é, independentemente em cada caso, halo, alquila opci- onalmente substituída, -OH ou -NRAaRAb; RAa e RAb são, independentemente em cada caso, -H, alqui- la opcionalmente substituída ou arila opcionalmente substituída; o subscrito a é um inteiro de a partir de 0-19; e t é um inteiro de a partir de 1-3; e R5A e R5B são, cada um, independentemente, halo ou um átomo de hidrogênio; em que o grupo R3 ou R4 é ligado ao ligante.
26. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivin- dicação 22, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula (3000): BA-(L'-SP-D)n Fórmula (3000) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoisomérica do mesmo; em que D é selecionado de a) Fórmula (a), onde ambos Rx na Fórmula (a) são hidrogênio; R34 é alqui- la, arila, arilalquila ou uma heterocicloalquila contendo N; e SP é - C(O)-C1-C10-alquileno-C(O)-, -C(O)-N(C1-6alquila)-C1-C10-alquileno-X1- onde X1 é ligado a L' na Fórmula (3000), -C(O)-N(H)-(C1-C10-
alquileno)-S- onde S é ligado a L' na Fórmula (3000), -C(O)-N(C1- 6alquila)-(C1-C10-alquileno)-S- onde S é ligado a L' na Fórmula (3000),
onde o ponto de ligação no lado direito (i.e. em N) é para L' na Fórmula (3000), -CH2-NH- onde o N é ligado a L' na Fórmula
(3000), onde o N é ligado a L' na Fórmula (3000) e onde Ar é arileno opcionalmente substituído (em algumas modalidades
) ou heteroarileno opcionalmente substituído, -(C1-C10- alquileno)-NR50C(O)-(C1-C10-alquileno)-NR50a- onde NR50a é ligado a L' na Fórmula (3000), -C(O)-(C1-C10-alquileno)-NR50C(O)-(C1-C10- alquileno)-NR50a- onde NR50a é ligado a L' na Fórmula (3000) e onde cada C1-C10-alquileno é independentemente opcionalmente substituído com um ou mais hidróxi, -C(O)-N(R35)-C1-C10-alquileno-C(O)NH-X2-
onde X2 é ligado a L' na Fórmula (3000) ou onde X4 é ligado a L' na Fórmula (3000); ou onde ambos Rx na Fórmula (a) são flúor; R34 é alquila, arila, arilalquila ou uma heterocicloalquila contendo N; e SP é -C(O)-C1-C10- alquileno-C(O)-, -C(O)-N(C1-6alquila)-C1-C10-alquileno-X1b- onde X1b é ligado a L' na Fórmula (3000), -C(O)-N(H)-(C1-C10-alquileno)-X1b- onde
X1b é ligado a L' na Fórmula (3000), onde o ponto de liga- ção no lado direito (i.e. em N) é para L' na Fórmula (3000), -CH2-NH-
onde o N é ligado a L' na Fórmula (3000), onde o N é li- gado a L' na Fórmula (3000) e onde Ar é arileno opcionalmente substi-
tuído (em algumas modalidades ) ou heteroarileno opcio- nalmente substituído, -(C1-C10-alquileno)-NR50C(O)-(C1-C10-alquileno)- NR50a- onde NR50a é ligado a L' na Fórmula (3000), -C(O)-(C1-C10- alquileno)-NR50C(O)-(C1-C10-alquileno)-NR50a- onde NR50a é ligado a L' na Fórmula (3000) e onde cada C1-C10-alquileno é independentemente opcionalmente substituído com um ou mais hidróxi, -C(O)-N(R35)-(C1- C10-alquileno)-C(O)NH-X2- onde X2 é ligado a L' na Fórmula (3000) ou onde X4 é ligado a L' na Fórmula (3000); e/ou b) os compostos na Tabela A, onde os compostos na Ta- bela A são ligados a BA do Composto de Fórmula (III) através do hi- dróxi do grupo -C(O)CH2OH, ou através do hidróxi de Mapracorat; X1 é -N(C1-6alquila)-; X1b é -S-, -NH- ou -N(C1-6alquila)-; X2 é -NH-; X3 é -CH2-, X3 é -CH2-O-(C1-C10-alquileno)-C(O)- onde o C(O) é ligado a X4 ou X3 é -C(O)-; X4 é -O-; R35 é H, -OH, -OCH3 ou C1-6alquila; R50 e R50a são independentemente hidrogênio ou C1-C6- alquila; Rd, Re e Rf são independentemente -H, -OH, hidroxialquila, alcoxicarbonila, -C(O)OH ou -CH2ORg, onde cada Rg é independente- mente -CH2C(O)OH or -CH2C(O)O(alquila); e mm é 0 ou 1; n é um inteiro selecionado de 1-30, inclusivo; L' é um ligador; e BA é um agente de ligação.
27. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivin- dicação 22, caracterizado pelo fato de que a carga útil do esteroide é selecionada do grupo consistindo em: , , , , , , , , ,
, ,
, ,
, ,
, ,
,
, ,
e , , em que a é a ligação ao ligador.
28. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivin- dicação 22, caracterizado pelo fato de que a carga útil do esteroide é selecionada do grupo consistindo em: e ou uma mistura dos mesmos.
29. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivin- dicação 23, caracterizado pelo fato de que o modulador de LXR conju- gado ao anticorpo, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, através de um ligador é um composto de Fórmula (B): Fórmula (B) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoiso- mérica do mesmo, em que
W é -CH2-, -N(H)- ou -O-; RB1 é -H, -OH, -NH2, alquila ou -OP(O)(OR6)2; RB2 é -H, -OH, -CH2NH2, RB3, RB4, RB5 ou -O-RB5, em que RB1 e RB2 não são simultaneamente -H; RB3 é -N(R6)2; RB4 é -X-Y-Z; X é selecionado do grupo consistindo em -O- e -N(H)-; Y é selecionado do grupo consistindo em alquileno, alquile- no substituído (incluindo, sem limitação, substituição oxo, i.e., =O)), heteroalquileno e heteroalquileno substituído (incluindo, sem limitação, substituição oxo (i.e., =O)); Z é selecionado do grupo consistindo em -OH e -NH2; RB5 é alquila, heterocicloalquila ou heterocicloalquila substi- tuída, em que cada heterocicloalquila ou heterocicloalquila substituída inclui um, dois ou três heteroátomos selecionados de nitrogênio e oxi- gênio e inclui pelo menos um de um substituinte -OH e -CH2OH, ou pelo menos um nitrogênio primário ou secundário, por exemplo, O- glicose; cada R6 é, em cada caso, -H, um resíduo de aminoácido, um resíduo de aminoácido N-alquila, um peptídeo ou alquila; e cada R7 é, independentemente, halo, C1-6 alquila, C1-6 alcó- xi, -CN, O-glicose, resíduo de O-aminoácido e O-PEGb, em que cada subscrito b é um inteiro de a partir de 0-3; em que o grupo RB1 ou RB2 é ligado ao ligante.
30. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivin- dicação 23, caracterizado pelo fato de que o modulador de LXR conju- gado ao anticorpo, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, através de um ligador é um composto de Fórmula (B-1):
Fórmula (B-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoiso- mérica do mesmo; em que: RB1 é -N(H)R8 ou -N(R9)2; RB2 é -N(H)R8; cada R8 é, independentemente em cada caso, hidrogênio, um resíduo de aminoácido, um resíduo de aminoácido N-alquila, um resíduo de peptídeo, uma porção biodegradável ou alquila; R9 é alquila, arila, arilalquila, heterocicloalquila ou heteroci- cloalquila substituída, em que cada heterocicloalquila ou heterocicloal- quila substituída compreende um, dois ou três heteroátomos selecio- nados de nitrogênio e oxigênio, e quando substituída inclui pelo menos um -OH e -CH2OH ou pelo menos um nitrogênio primário ou secundá- rio; cada R7 é independentemente halo, C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, -CN, O-glicose, resíduo de O-aminoácido ou O-PEGb, em que cada subscrito b é um inteiro de a partir de 0-3; em que o grupo RB1 ou RB2 é ligado ao ligante.
31. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 21, 23 e 29 a 30, caracterizado pelo fato de que apresenta a estrutura de Fórmula (6005)
Fórmula (6005).
32. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivin- dicação 23, caracterizado pelo fato de que o modulador de LXR é se- lecionado do grupo consistindo em: , , e , em que a é a ligação ao ligador.
33. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivin- dicação 23, caracterizado pelo fato de que o modulador de LXR é se- lecionado do grupo consistindo em:
P4B;
P5B;
P6B;
P7B;
P8B;
P9B;
P12B;
P2B;
ou ou
P10B;
ou
P11B; e
P3B; em que a é a ligação ao ligador.
34. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivin- dicação 23, caracterizado pelo fato de que o modulador de LXR é ou ; em que a é a ligação ao ligador.
35. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivin- dicação 24, caracterizado pelo fato de que o análogo de rifamicina é um composto de Fórmula (C-1): Fórmula (C-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoiso-
mérica do mesmo; em que: X1c é selecionado de -S-; -O- e -NR5c; R1c é amino-C1-6alquila; C1-6alquilaminoC1-6alquila; di-C1- 6alquilaminoC1-6alquila; hidroxi-C1-6alquila; HS-C1-6alquila; (R5c)2N-C1- 5c 6alquileno-N(R )-C1-6alquila; (R5c)2N-C1-6alquileno-O-C1-6alquila; (R5c)2N-C1-6alquileno-S-C1-6alquila; heterocicloalquila ou heterocicloal- quil-C1-6alquila; em que a heterocicloalquila inclui um, dois ou três he- teroátomos selecionados de O, N e S; e em que heterocicloalquila é opcionalmente substituída com halo, C1-6alquila, -OH, =O ou -N(R5c)2; R2c, R3c e R4c são independentemente selecionados de hi- drogênio, C1-6alquila e -(C=O)-R5c; cada Rac, quando presente, é independentemente selecio- nado de -F; -Cl; -Br; -I; -OH; -NH2; e C1-6alcóxi; e R5c é independentemente, em cada ocorrência, selecionado de hidrogênio; e C1-6alquila; em que o grupo R1c é ligado ao ligante.
36. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivin- dicação 24, caracterizado pelo fato de que o análogo de rifamicina é um composto de Fórmula (C-2): Fórmula (C-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoiso- mérica do mesmo;
em que: X1c é selecionado de -S-; -O- e -NR5c; R1c é amino-C1-6alquila; C1-6alquilaminoC1-6alquila; di-C1- 6alquilaminoC1-6alquila; hidroxi-C1-6alquila; HS-C1-6alquila; (R5c)2N-C1- 5c 6alquileno-N(R )-C1-6alquila; (R5c)2N-C1-6alquileno-O-C1-6alquila; (R5c)2N-C1-6alquileno-S-C1-6alquila; heterocicloalquila ou heterocicloal- quil-C1-6alquila; em que a heterocicloalquila inclui um, dois ou três he- teroátomos selecionados de O, N e S; e em que heterocicloalquila é opcionalmente substituída com halo, C1-6alquila, -OH, =O ou -N(R5c)2; R2c, R3c e R4c são independentemente selecionados de hi- drogênio, C1-6alquila e -(C=O)-R5c; Rac e Rbc são independentemente selecionados de -F; -Cl; - Br; -I; -OH; -NH2; e C1-6alcóxi; e R5c é independentemente, em cada ocorrência, selecionado de hidrogênio; e C1-6alquila; em que o grupo R1c é ligado ao ligante.
37. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivin- dicação 24, caracterizado pelo fato de que o análogo de rifamicina é um composto de Fórmula (C-3): Fórmula (C-3) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoiso- mérica do mesmo; em que:
R1c é di-C1-6alquilaminoC1-6alquila; (R5c)2N-C1-6alquileno- N(R5c)-C1-6alquila; heterocicloalquila ou heterocicloalquil-C1-6alquila; em que a heterocicloalquila inclui um, dois ou três heteroátomos sele- cionados de O, N e S; e em que heterocicloalquila é opcionalmente substituída com halo, C1-6alquila, -OH, =O ou -N(R5c)2; e R2c, R3c e R4c são independentemente selecionados de hi- drogênio, C1-6alquila e -(C=O)-R5c; e R5c é selecionado de hidrogênio e C1-6alquila; em que o grupo R1c é ligado ao ligante.
38. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivin- dicação 24, caracterizado pelo fato de que o análogo de rifamicina é um composto de Fórmula (C-4): Fórmula (C-4) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoiso- mérica do mesmo; em que: R1c é , ; ou ; em que Y é C ou N; R2c, R3c e R4c são independentemente selecionados de hi- drogênio, C1-6alquila e -(C=O)-R5c; e R5c está independentemente, em cada ocorrência, ausente ou é selecionado de hidrogênio e C1-6alquila;
em que o grupo R1c é ligado ao ligante por meio de um átomo de nitrogênio como indicado pela linha ondulada .
39. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, 13, 17 a 21, 24 e 35 a 38, caracteriza- do pelo fato de que apresenta a estrutura de Fórmula (7002): Fórmula (7002).
40. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, 13, 17 a 21, 24 e 35 a 39, caracteriza- do pelo fato de que o análogo de rifamicina é selecionado do grupo consistindo em: , ,
, , , , , e , em que a é a ligação ao ligador.
41. Conjugado anticorpo-análogo de rifamicina, caracteriza- do pelo fato de que apresenta a estrutura de Fórmula (7003):
Fórmula (7003) ou um sal farmaceuticamente aceitável, solvato ou forma estereoiso- mérica do mesmo; em que: X1c é selecionado de -S-; -O- e -NR5c; R1c é , ; ou ; em que Y é C ou N; R2c, R3c e R4c são independentemente selecionados de hi- drogênio, C1-6alquila e -(C=O)-R5c; R5c está independentemente, em cada ocorrência, ausente ou é selecionado de hidrogênio; e C1-6alquila; cada AA é um aminoácido independentemente seleciona- do; SP1 está ausente ou é um espaçador; RG1 é um resíduo de grupo reativo; BA é um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo; o subscrito n é um inteiro de a partir de 1 a 30; o subscrito w é 2, 3 ou 4; em que R1c é ligado ao ligante por meio de um átomo de ni- trogênio como indicado pela linha ondulada .
42. Conjugado anticorpo-análogo de rifamicina, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que X1c é O.
43. Conjugado anticorpo-análogo de rifamicina, de acordo com a reivindicação 41 ou 42, caracterizado pelo fato de que BA é um anticorpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo; compreendendo uma mutação N297Q.
44. Conjugado anticorpo-análogo de rifamicina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 43, caracterizado pelo fato de que o subscrito w é 2.
45. Conjugado anticorpo-análogo de rifamicina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 44, caracterizado pelo fato de que (AA)2 é valina-citrulina.
46. Conjugado anticorpo-análogo de rifamicina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 45, caracterizado pelo fato de que SP1 compreende .
47. Conjugado anticorpo-análogo de rifamicina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 45, caracterizado pelo fato de que SP1 compreende .
48. Conjugado anticorpo-análogo de rifamicina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 47, caracterizado pelo fato de que RG1 compreende .
49. Conjugado anticorpo-análogo de rifamicina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 47, caracterizado pelo fato de que X1c é O;
R1c é , ; ou ; em que Y é C ou N; em que R1c é ligado ao ligante por meio do átomo de nitrogênio quaternário de R1c; R5c é C1-6alquila; e R6c é um contraíon.
50. Conjugado anticorpo-análogo de rifamicina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 49, caracterizado pelo fato de que o análogo de rifamicina é: ou .
51. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 24, caracterizado pelo fato de que é sele- cionado do grupo consistindo em:
e
.
,
ou uma mistura do mesmo;
ou um estereoisômero ou mistura de estereoisômero do mesmo;
,
ou uma mistura do mesmo;
ou um estereoisômero ou mistura de estereoisômero do mesmo;
ou um estereoisômero ou mistura de estereoisômero do mesmo;
ou uma mistura do mesmo onde L1A é um resíduo de grupo reativo compreendendo uma porção triazol ou uma mistura do mesmo ou um estereoisômero ou mistura de estereoisômeros do mesmo ou uma mistura do mesmo ou uma mistura do mesmo ou uma mistura do mesmo ou uma mistura do mesmo ou uma mistura do mesmo ou uma mistura do mesmo ou uma mistura do mesmo
,
ou uma mistura do mesmo;
O NH2
H
N O
O
N N O O
N
N H Ab N O
O O HN O
H H H H
O N N
O N N O
H H
O O
O
HO
HN O
O
O O
HO OH HO OH
O
O
N N
N OH OH
O
O HO
OH O
O
HO HO OH
O
OH
HO OH HO
O O
O
OH n ou uma forma estereoisomérica do mesmo ou um regioisômero do mesmo ou uma mistura de regioisômeros do mesmo, em que cada Ab é um anticorpo anti-MSR1 ou um fragmento de li- gação a antígeno do mesmo; cada BA é onde Ab1 é um anticorpo anti-MSR1 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo; R é C2- 4-alquileno; e nn é um inteiro selecionado de 2 a 4, inclusivo; e cada n é um inteiro de a partir de 1 a 4.
52. Conjugado anticorpo-fármaco, caracterizado pelo fato de que é selecionado dentre , e ou uma mistura do mesmo; ou uma forma estereoisomérica do mesmo ou um regioisômero do mesmo ou uma mistura de regioisômeros do mesmo, em que cada Ab é um anticorpo anti-MSR1 ou um fragmento de li- gação a antígeno do mesmo; e cada n é um inteiro de a partir de 1 a 4.
53. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das fórmulas que seguem:
;
ou uma mistura do mesmo;
;
;
;
ou uma mistura do mesmo,
ou uma mistura do mesmo,
ou uma mistura do mesmo,
ou uma mistura do mesmo, ou uma forma estereoisomérica do mesmo ou um regioisô- mero do mesmo ou uma mistura de regioisômeros do mesmo, caracte- rizado pelo fato de que cada Ab é um anticorpo anti-MSR1 ou um fragmento de li- gação a antígeno do mesmo; cada BA é onde Ab1 é um anticorpo anti-MSR1 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo; R é C2- 4-alquileno; e nn é um inteiro selecionado de 2 a 4, inclusivo; e cada n é um inteiro de a partir de 1 a 4.
54. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10 e 24, caracterizado pelo fato de ser de acordo com a Fórmula (7004):
Fórmula (7004).
55. Conjugado anticorpo-fármaco preparado através da conjugação de um anticorpo anti-MSR1 ou um anticorpo anti-MSR1 modificado com PEG, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com uma carga útil de ligante, ou uma forma estereoisomérica do mesmo ou um regioisômero do mesmo ou uma mistura de regioi- sômeros do mesmo, caracterizado pelo fato de ser selecionado do grupo consistindo em: LP1 LP2
LP5
LP6
LP18
LP4
LP11
LP9
LP12
LP3
LP13
LP14
LP15 2a
O H
O
O O H
H
O O O O
H
N N O
N N
O H H H
O HO
O
O N NH 2
H 2b O H
O
O H
H
O O O O O
H
N O O N O
N O O N N
H H H H
O O HO
O
NH O NH 2 2f H HH
O O
O
O
O O O H
O OH
N O O
H O
O N N
H N
O H
NH O NH 2 2g 2j
O
O O O
H
O N
O O O N N O
H H H H
N N O O H
N N
O H H H
O
HO
NH O NH 2 O
O NH 2 2k
NH
O O
H H
N N O
N N O
H O H
O O O N H
O N O
O O
H
HO
O 2l
H 2m O
HH
O O
O
N O H
O O O O N O OH
H H
N N O
N N N
H H
O O
O O N NH 2
H
HN O HO
O OH
O OHO
OH
O N HO
O OH
O
OH HO
N O
N N
O OH
OH HO
O O
HO OH
OH OHO O
HO O
OH 2n ou uma mistura do mesmo 2q HH
O
H
O O
O O H
H OH
N N O O O
N O O
H
O O
O N NH2 H .
LP1A LP2A LP3A LP4A LP5A
O O H
O O
O H
N S H
O S N O
H F
O O
F
HO
O LP6A LP7A
LP8A
LP9A
LP10A
LP11A
LP12A
LP13A
LP18A
LP19A
LP20A
LP21A
LP22A
LP23A
LP24A
LP25A
LP26A
LP27A
LP28A
LP29A
LP30A
LP31A
LP1B
LP2B
LP3B
LP4B
LP5B
LP6B
LP7B
LP8B
LP9B
LP10B
LP11B
LP12B
R20 and
R25 .
56. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivin- dicação 9, caracterizado pelo fato de que é preparado através do con- tato de um anticorpo anti-MSR1 ou um anticorpo anti-MSR1 modifica- do com PEG, ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, com uma carga útil de ligador, ou uma forma estereoisomérica do mesmo ou um regioisômero do mesmo, de acordo com a Fórmula (D): Fórmula (D) sob condições adequadas para formação de uma ligação entre anti- corpo anti-MSR1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
57. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e um carreador farmaceuticamente aceitável.
58. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o conjugado anticorpo-fármaco como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 54 e um carreador farmaceutica- mente aceitável.
59. Método de tratamento de uma doença proliferativa, uma doença metabólica, inflamação, uma doença neurodegenerativa ou doença, distúrbio ou condição associado com sinalização de recep- tor de glucocorticoide em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade de tratamento eficaz de um conjugado anticorpo-fármaco como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, 25 a 34, 51 a 53 ou uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 47 ou 48.
60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracteriza- do pelo fato de que é para tratamento de aterosclerose.
61. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracteriza- do pelo fato de que a doença, distúrbio ou condição associado com a sinalização do receptor de glucocorticoide é uma doença, distúrbio ou condição inflamatória.
62. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracteriza- do pelo fato de que é para tratamento de artrite.
63. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracteriza- do pelo fato de que os efeitos colaterais associados com administra- ção da carga útil de esteroide não conjugada do dito composto são reduzidos.
64. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracteriza- do pelo fato de que a doença metabólica é dislipidemia.
65. Método de prevenção ou tratamento de infecção bacte- riana em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade de tratamento eficaz de um conjugado anticorpo-fármaco como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 21, 24, 35 a 50 e 54 ou uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 57 ou 58.
66. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracteriza- do pelo fato de que a bactéria é uma bactéria gram positiva, bactéria Staphylococcus aureus resistente à penicilina, Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) ou Staphylococcus aureus suscetível à meticilina (MSSA) ou Staphylococcus aureus resistente à vancomicina (VRSA) ou Mycobacterium tuberculosis resistente a múltiplos fárma-
cos.
67. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracteriza- do pelo fato de que o conjugado anticorpo-fármaco como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, 24, 35 a 50 e 54, ou uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 57 ou 58, são administrados em combinação com vancomicina.
68. Método de prevenção ou tratamento de celulite, bacte- remia, dermonecrose, infecção da pálpebra, infecção do olho, conjun- tivite neonatal, osteomielite, impetigo, furúnculos, síndrome da pele escaldada, envenenamento de alimento, pneumonia, infecção cirúrgi- ca, infecção do trato urinário, infecção de queimadura, meningite, en- docardite, septicemia, síndrome do choque séptico, artrite séptica, mastite, infecção associada com uma articulação com prótese, infec- ção associada com um cateter ou infecção associada com um implan- te em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende admi- nistrar ao indivíduo uma quantidade de tratamento eficaz de um conju- gado anticorpo-fármaco como definido em qualquer uma das reivindi- cações 11 a 21, 24, 35 a 50 e 54 ou uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 57 ou 58.
69. Método de prevenção ou tratamento de uma infecção bacteriana intracelular em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade de tratamento eficaz de um conjugado anticorpo-fármaco como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 21, 24, 35 a 50 e 54 ou uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 57 ou 58.
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