JP2022537142A - 骨形成タンパク質６に対するヒト抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＢＭＰ６に結合する抗体、および使用方法を提供する。本発明のある特定の実施形態によると、抗体は、ＢＭＰ６に結合する完全ヒト抗体である。本発明の抗体は、ＢＭＰ６のヘモジュベリン受容体への結合を阻害し、それによってヘプシジンの転写および発現を下方制御するのに有用であり、したがって鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害を予防または治療する手段を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害の少なくとも１つの症状または合併症の治療に使用される。
Description
優先権データ
本出願は、「ＨＵＭＡＮ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＴＯ ＢＯＮＥ ＭＯＲＰＨＯＧＥＮＥＴＩＣ ＰＲＯＴＥＩＮ ６」と題される、２０１９年６月１２日に出願された米国仮出願第６２／８６０，５９７号に対する優先権を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、「ＨＵＭＡＮ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＴＯ ＢＯＮＥ ＭＯＲＰＨＯＧＥＮＥＴＩＣ ＰＲＯＴＥＩＮ ６」と題される、２０１９年６月１２日に出願された米国仮出願第６２／８６０，５９７号に対する優先権を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表への参照
本出願は、２０１９年６月５日に作成され、４３．２キロバイトを含むファイル０４３１＿３１ＰＣＴ＿ＳＴ２５としてコンピュータ可読形式で提出された配列表を参照により組み込む。
本出願は、２０１９年６月５日に作成され、４３．２キロバイトを含むファイル０４３１＿３１ＰＣＴ＿ＳＴ２５としてコンピュータ可読形式で提出された配列表を参照により組み込む。
本発明は、骨形成タンパク質６（ＢＭＰ６）に特異的に結合するヒト抗体およびその抗原結合断片、ならびにそのような抗体および断片を使用する治療および診断方法に関する。
ＢＭＰ６は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーの骨形成タンパク質またはＢＭＰのメンバーである。ＢＭＰ６は、特に鉄レベルの調節を含む様々な生理学的プロセスに関与することが示されている。
栄養鉄の取り込みは、三価鉄還元酵素による腸管腔内のＦｅ３＋の還元、ならびにその後の腸細胞の頂端膜を横切るＦｅ２＋の輸送を伴う。腸細胞から血漿へのＦｅ２ ＋のフェロポルチン媒介流出は、全身性鉄ホメオスタシスに重要である。このプロセスは、フェロポルチンに結合し、そのリン酸化、内在化、およびリソソーム分解を促進する肝臓由来ペプチドホルモンであるヘプシジンによって負に調節される。
ヘプシジンの発現は転写制御される。ヘプシジンの鉄依存性誘導には、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）シグナル伝達が必要である。鉄は、肝細胞の表面上のＢＭＰ受容体に結合するために、肝臓類洞内皮細胞におけるＢＭＰ６の発現を引き起こす。ＢＭＰ６シグナル伝達は、ＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化、およびＳＭＡＤ４と共に核への転位をもたらし、そこで、そのプロモーター上の近位および遠位部位への結合時にヘプシジン転写を促進する。
ヘモジュベリン（ＨＪＶ、ＨＦＥ２）は、肝臓におけるＢｍｐ６シグナル伝達を増強して、ヘプシジン発現を誘導するＢＭＰ６の共受容体である。ヘモジュベリン（ＨＪＶ）の変異は、低ヘプシジンレベルおよび過剰な鉄蓄積（肝臓において）につながることが見出されている。
ヘモジュベリンまたはそのＩＩ型Ｂｍｐ受容体へのＢＭＰ６結合を遮断する抗体は、そのような結合の低減が血漿ヘプシジンレベルを低減し、これは、腸細胞から血漿中へのＦｅ２＋のフェロポルチン媒介流出を促進するため、低血漿鉄レベルに関連する状態に対する有望な治療を提供する。
本発明は、骨形成タンパク質６（ＢＭＰ６）に特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびその抗原結合断片を提供する。そのような抗体は、低血漿鉄レベルに関連する状態を治療するのに有用であり得る。抗体は、ヘプシジンの転写を低減するように作用し、次いで、腸細胞から血漿中へのＦｅ２＋のフェロポルチン媒介流出を促進し得る。そのような抗体は、極度の疲労、脱力感、青白い皮膚、胸痛、速い心拍、心臓の動悸、息切れ、頭痛、めまい、意識朦朧、手の冷え、足の冷え、舌の炎症、および下肢静止不能からなる群を含むが、これらに限定されない、低血漿鉄レベルに関連する状態を予防する、その進行を停止させる、もしくはその重症度を軽減するか、またはそのような状態に関連する少なくとも１つの症状を改善することができる。場合によっては、抗体は、鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害などの低血漿鉄レベルに関連する状態または兆候を予防または治療するために使用され得る。そのような抗体は、単独で、または鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害の治療に有用な第２の薬剤と併用することができる。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ６に特異的な抗体は、低血漿鉄レベルに関連する状態を予防する、その進行を停止させる、もしくはその重症度を軽減するために、またはそのような状態に関連する少なくとも１つの症状を改善するために、第２の薬剤と併用して治療的に与えられ得る。ある特定の実施形態では、抗体は、鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害を発症するリスクがある患者を保護するために、単独療法として予防的に使用され得る。例えば、高齢患者または失血を経験した患者を含むある特定の患者集団は、鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害を発症するリスクがあり得る。そのような患者集団のいずれも、単独でまたは第２の薬剤と併用して与えられた場合、本発明の抗体による治療から利益を得ることができる。
本発明の抗体は、患者における鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害を治療するために使用され得る。抗体は、完全長（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体）であり得るか、または抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはｓｃＦｖ断片）のみを含み得、機能性に影響を及ぼすように、例えば、残留エフェクター機能を排除するように（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，（２０００），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５－１９３３）、またはｍＡｂ半減期を増加させるように（Ｚａｌｅｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１０），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８：１５７－１５９）修飾され得る。本発明は、ガンマ（例えば、ガンマ－１、ガンマ－２、ガンマ－３、またはガンマ－４）、デルタ、アルファ、ミュー、もしくはイプシロンなどの重鎖定常領域（例えば、ヒト定常領域）に連結された本明細書で特定されるＶＨ領域のいずれか（例えば、ヒト定常領域）、および／またはラムダもしくはカッパなどの軽鎖定常領域（例えば、ヒト定常領域）に連結された本明細書で特定される任意のＶＬ領域を含む、任意の抗体またはその抗原結合断片を含む。
したがって、第１の態様では、本発明は、ＢＭＰ６に特異的に結合する単離された完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。
一実施形態では、単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、表面プラズモン共鳴により測定された場合、１０－７Ｍ以下のＫＤでＢＭＰ６に結合する。
いくつかの実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）表面プラズモン共鳴により測定された場合、３７℃で、約２ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）でヒトＢＭＰ６に結合する、（ｂ）表面プラズモン共鳴により測定された場合、３７℃で、約１３０分超の解離半減期（ｔ１／２）でヒトＢＭＰ６に結合する、（ｃ）表面プラズモン共鳴により測定された場合、２５℃で、約１ｎＭ未満のＫＤでヒトＢＭＰ６に結合する、（ｄ）表面プラズモン共鳴により測定された場合、２５℃で、約１８０分超のｔ１／２でヒトＢＭＰ６に結合する、（ｅ）表面プラズモン共鳴により測定された場合、３７℃で、約１０ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）でマウスＢＭＰ６に結合する、（ｆ）表面プラズモン共鳴により測定された場合、３７℃で、約７０分超の解離半減期（ｔ１／２）でマウスＢＭＰ６に結合する、（ｇ）表面プラズモン共鳴により測定された場合、２５℃で、約４ｎＭ未満のＫＤでマウスＢＭＰ６に結合する、および（ｈ）表面プラズモン共鳴により測定された場合、２５℃で、約８０分超のｔ１／２でマウスＢＭＰ６に結合する、からなる群から選択される１つ以上の特性を呈する。
場合によっては、ＢＭＰ６に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１および３からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のいずれか１つ内に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）、ならびに／または配列番号２および４からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のいずれか１つ内に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含む。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを特定するための方法および技法は、当該技術分野で周知であり、本明細書に開示される特定の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および／または軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列内のＣＤＲを特定するために使用され得る。ＣＤＲの境界を特定するために使用され得る例示的な規則には、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、およびＡｂＭ定義が含まれる。一般論として、Ｋａｂａｔ定義は配列可変性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は構造ループ領域の位置に基づき、ＡｂＭ定義はＫａｂａｔアプローチとＣｈｏｔｈｉａアプローチとの間の妥協案である。例えば、Ｋａｂａｔ，”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８、およびＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９２６８－９２７２を参照されたい。抗体内のＣＤＲ配列を特定するための公開データベースも利用可能である。
いくつかの実施形態では、ＢＭＰ６に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１および３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。
いくつかの実施形態では、ＢＭＰ６に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２および４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。
場合によっては、ＢＭＰ６に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号１および３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲと、（ｂ）配列番号２および４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲとを含む。
一実施形態では、ＢＭＰ６に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号５および１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン、
（ｂ）配列番号６および１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン、
（ｃ）配列番号７および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン、
（ｄ）配列番号８および１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン、
（ｅ）配列番号９および１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン、ならびに
（ｆ）配列番号１０および１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメインを含む。
（ａ）配列番号５および１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン、
（ｂ）配列番号６および１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン、
（ｃ）配列番号７および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン、
（ｄ）配列番号８および１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン、
（ｅ）配列番号９および１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン、ならびに
（ｆ）配列番号１０および１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメインを含む。
様々な実施形態では、本発明は、ＢＭＰ６に結合する完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体またはその断片は、以下の特徴のうちの１つ以上を呈する：（ｉ）配列番号１および３からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＶＲを含む、（ｉｉ）配列番号２および４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＶＲを含む、（ｉｉｉ）配列番号５および１１からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ１ドメインと、配列番号８および１４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ１ドメインとを含む、（ｉｖ）配列番号６および１２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ２ドメインと、配列番号７および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ３ドメインと、配列番号８および１４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ１ドメインと、配列番号９および１５からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ２ドメインと、配列番号１０および１６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ３ドメインとを含む、ならびに／または（ｖ）表面プラズモン共鳴により測定された場合、１０－７ Ｍ以下のＫＤでＢＭＰ６に結合する。
別の態様では、本発明は、ＢＭＰ６への結合について、配列番号１および３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに配列番号２および４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲを含む参照抗体または抗原結合断片と競合する、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
別の態様では、本発明は、配列番号１および３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）のＣＤＲと、配列番号２および４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲとを含む、参照抗体または抗原結合断片とＢＭＰ６上の同一のエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＢＭＰ６に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体またはその断片は、配列番号１／３および２／４からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
別の態様では、本発明は、抗ＢＭＰ６抗体またはその断片をコードする核酸分子を提供する。本発明の核酸を保有する組換え発現ベクター、およびそのようなベクターが導入された宿主細胞もまた、抗体の産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養し、産生された抗体を回収することによって抗体を産生する方法であるため、本発明により企図される。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１７および１９からなる群から選択される核酸配列、またはその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるＨＣＶＲを含む抗体またはその断片を提供する。
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１８および２０からなる群から選択される核酸配列、またはその少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の相同性を有する実質的に同一の配列によってコードされるＬＣＶＲをさらに含む。
場合によっては、本発明は、配列番号２３および２９からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列によってコードされるＨＣＤＲ３ドメインと、配列番号２６および３２からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列によってコードされるＬＣＤＲ３ドメインとを含む、抗体または抗体の抗原結合断片を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号２１および２７からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列によってコードされるＨＣＤＲ１ドメインと、配列番号２２および２８からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列によってコードされるＨＣＤＲ２ドメインと、配列番号２４および３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列によってコードされるＬＣＤＲ１ドメインと、配列番号２５および３１からなる群から選択されるヌクレオチド配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列によってコードされるＬＣＤＲ２ドメインとをさらに含む、抗体またはその断片を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される、ＢＭＰ６に結合する抗体またはその抗原結合断片は、検出可能な標識、例えば、放射性核種標識またはＭＲＩ検出可能な標識に連結され得る。
別の態様では、本発明は、上記または本明細書に記載されるＢＭＰ６に結合する、単離された完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、薬学的組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、上記または本明細書に記載される特徴のうちのいずれか１つ以上を有するＢＭＰ６に結合する完全ヒトモノクローナル抗体を含む。一実施形態では、抗体は、１０－７Ｍ以下のＫＤでＢＭＰ６に結合する。様々な実施形態では、組成物は、ＢＭＰ６に結合し、配列番号１／３および２／４からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を有する抗体を含む。本発明はまた、単離されたヒト抗体または抗原結合断片を提供し、抗体または抗原結合断片は、（ｉ）配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、（ｉｉ）配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリンを含む。
場合によっては、本発明は、本発明の抗体または抗体の抗原結合断片と、第２の治療剤との組み合わせである、組成物を特徴とする。第２の治療剤は、小分子薬物、タンパク質／ポリペプチド、抗体、核酸分子、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはｓｉＲＮＡであり得る。第２の治療剤は、合成または天然由来であり得る。第２の治療剤は、本発明の抗体またはその断片と有利に組み合わされる任意の薬剤であり得る。
ある特定の実施形態では、第２の治療剤は、本発明の抗体または抗体の抗原結合断片に関連する任意の可能な副作用を相殺または低減するのに役立つ薬剤であり得る（そのような副作用が生じる場合）。
また、本発明の抗体および薬学的に許容される組成物は、組み合わせ療法に用いることができ、すなわち、抗体および薬学的に許容される組成物は、１つ以上の他の所望の治療薬または医療手順と同時に、その前に、またはその後に投与することができることも理解されよう。組み合わせレジメンで用いる療法（治療薬または手順）の特定の組み合わせは、所望の治療薬および／または手順の適合性ならびに達成される所望の治療効果を考慮する。また、用いられる療法は、同じ障害に対して所望の効果を達成し得る（例えば、抗体が同じ障害を治療するために使用される別の薬剤と同時に投与され得る）か、または異なる効果（例えば、任意の有害作用の制御）を達成し得ることも理解されよう。本明細書で使用される場合、特定の疾患または状態を治療または予防するために通常投与される追加の治療剤は、治療される疾患または状態に適切である。複数の治療薬を同時投与する場合、関連技術分野で認識されるように、投与量は、それに応じて調整され得る。
別の態様では、本発明は、鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害を予防、治療、または管理するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害に罹患している患者を治療するための方法を提供し、方法は、ＢＭＰ６に結合する有効量の抗体もしくはその抗原結合断片、またはＢＭＰ６に結合する有効量の抗体もしくはその抗原結合断片を含む薬学的組成物を患者に投与することを含み、その結果、鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害が重症度および／または持続時間において予防または軽減されるか、あるいはその状態または疾患に関連する少なくとも１つの症状または合併症が予防または緩和されるか、あるいは鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害の頻度および／もしくは持続時間、または重症度が低減される。
本方法のいくつかの実施形態では、本発明の抗体を含む薬学的組成物は、第２の治療剤と組み合わせて患者に投与される。
本発明の実施形態では、抗体もしくはその抗原結合断片、または抗体を含む薬学的組成物は、皮下、静脈内、皮内、経口、または筋肉内投与される。
関連する実施形態では、本発明は、鉄欠乏性貧血もしくは鉄欠乏関連障害に関連するか、またはそれによって引き起こされる疾患もしくは障害の予防もしくは治療のための薬剤の製造における本発明の抗体の単離された抗ＢＭＰ６抗体または抗原結合部分の使用を含む。本発明はまた、鉄欠乏性貧血もしくは鉄欠乏関連障害に関連するか、またはそれによって引き起こされる疾患もしくは障害を予防もしくは治療するための、単離された抗ＢＭＰ６抗体またはその抗原結合部分の使用を含む。一実施形態では、本発明は、鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害の治療のための薬剤の製造における単離された抗ＢＭＰ６抗体またはその抗原結合断片の使用を含む。場合によっては、本発明は、鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害に罹患しているか、またはそれを発症するリスクがある患者を治療するための、上記または本明細書で論じられている抗ＢＭＰ６抗体またはその抗原結合断片の使用を含む。
他の実施形態は、後述の発明を実施するための形態の説明から明らかとなるであろう。
本発明の方法を説明する前に、本発明は、そのような方法および条件は変動し得るため、特定の方法および説明される実験条件に制限されないことが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することを企図するものではないことも理解されるべきである。
別段定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に説明されるものと類似のまたは等価の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をここで説明する。本明細書で言及されているすべての刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
定義
「ＢＭＰ６」および「骨形成タンパク質６」という用語は、交換可能に、５７ｋＤａの単量体タンパク質を指す。ＢＭＰ６は、調節分子の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ－ベータ）スーパーファミリーのメンバーである。ヒトＢＭＰ６のアミノ酸配列は、配列番号４０に示される。マウスＢＭＰ６のアミノ酸配列は、配列番号４２に示される。別段の記載がない限り、ＢＭＰ６への言及は、ヒト形態を指す。
「ＢＭＰ６」および「骨形成タンパク質６」という用語は、交換可能に、５７ｋＤａの単量体タンパク質を指す。ＢＭＰ６は、調節分子の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ－ベータ）スーパーファミリーのメンバーである。ヒトＢＭＰ６のアミノ酸配列は、配列番号４０に示される。マウスＢＭＰ６のアミノ酸配列は、配列番号４２に示される。別段の記載がない限り、ＢＭＰ６への言及は、ヒト形態を指す。
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖の４つのポリペプチド鎖で構成される免疫グロブリン分子（すなわち、「完全抗体分子」）、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）またはそれらの抗原結合断片を指すことが意図される。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）および重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３で構成される）で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲまたは「ＶＬ」）および軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域へとさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下の順序で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本発明のある特定の実施形態では、抗体（またはその抗原結合断片）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であり得るか、または天然にもしくは人工的に修飾され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。
１つ以上のＣＤＲ残基の置換、または１つ以上のＣＤＲの省略も可能である。結合のために１つまたは２つのＣＤＲを分配することができる抗体は、科学文献に記載されている。Ｐａｄｌａｎら（ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９９５，９：１３３－１３９）は、公開されている結晶構造に基づいて、抗体とそれらの抗原との間の接触領域を分析し、ＣＤＲ残基の約５分の１～３分の１しか実際に抗原に接触していないと結論付けた。Ｐａｄｌａｎはまた、１つまたは２つのＣＤＲが抗原と接触するアミノ酸を有しない多くの抗体を見出した（Ｖａｊｄｏｓ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２０：４１５－４２８も参照されたい）。
抗原に接触しないＣＤＲ残基は、分子モデリングにより、および／または経験的に、以前の研究に基づいて特定され得る。ＣＤＲまたはその残基が省略される場合、それは通常、別のヒト抗体配列における対応する位置を占めるアミノ酸またはそのような配列のコンセンサスで置換される。ＣＤＲ内の置換のための位置および置換するためのアミノ酸も経験的に選択され得る。経験的置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。
本明細書に開示される完全ヒトＢＭＰ６モノクローナル抗体は、対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域において１つ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含み得る。このような変異は、本明細書において開示されるアミノ酸配列を、例えば公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体およびその抗原結合断片を含み、１つ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基に変異するか、もしくは別のヒト生殖系列配列の対応する残基に変異するか、または対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換に変異する（そのような配列変化は、本明細書ではまとめて、「生殖系列変異」と称される）。当業者は、本明細書に開示される重鎖および軽鎖可変領域配列から出発して、１つ以上の個々の生殖系列変異またはそれらの組み合わせを含む多数の抗体および抗原結合断片を容易に産生することができる。ある特定の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基はすべて、抗体が由来した元の生殖系列配列において見出される残基へと変異し戻される。他の実施形態では、ある特定の残基のみが元の生殖系列配列へと変異し戻され、例えば、変異した残基はＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内に、もしくはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に見出されるか、または変異した残基のみが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３内に見出される。他の実施形態では、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基のうちの１つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が元の由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基へ変異する。さらに、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含み得、例えば、ある特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基へ変異する一方で、元の生殖系列配列とは異なるある特定の他の残基は、維持されるか、または異なる生殖系列配列の対応する残基へ変異する。得られたら、１つ以上の生殖系列変異を含む抗体および抗原結合断片は、結合特異性の改善、結合親和性の増加、アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性の改善または増強（場合によって）、免疫原性の低減などの１つ以上の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的な様式で得られる抗体および抗原結合断片は、本発明の範囲内に包含される。
本発明はまた、１つ以上の保存的置換を有する本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む、完全ヒト抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体を含む。例えば、本発明は、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば、１０個以下、８個以下、６個以下、または４個以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＢＭＰ６抗体を含む。
「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗体を含むことが企図される。本発明のヒトｍＡｂは、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によって、またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異）によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。しかしながら、本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳類種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列上にグラフトされたｍＡｂを含むことを意図しない。
「特異的に結合する」または「～に特異的に結合する」などの用語は、抗体またはその抗原結合断片が、生理学的条件下で比較的安定である抗原と複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約１×１０－６Ｍ以下の平衡解離定数を特徴とし得る（例えば、より小さいＫＤは、より厳密な結合を示す）。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定するための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。本明細書に記載されるように、ＢＭＰ６に特異的に結合する抗体は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）により特定されている。さらに、ＢＭＰ６の１つのドメインに結合する多重特異性抗体、およびＢＭＰ６の２つの異なる領域に結合する１つ以上の追加の抗原または二重特異性はそれでも、本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」抗体とみなされる。
「高親和性」抗体という用語は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）または溶液親和性ＥＬＩＳＡによって測定された場合、ＢＭＰ６に対して少なくとも１０－７Ｍ、好ましくは１０－８Ｍ、より好ましくは１０－９Ｍ、さらに好ましくは１０－１０Ｍ、さらにより好ましくは１０－１１Ｍの結合親和性（ＫＤとして表される）を有するそれらのｍＡｂを指す。
「スローオフレート」、「Ｋｏｆｆ」、または「ｋｄ」という用語は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって決定される場合、１×１０－３ｓ－１以下、好ましくは１×１０－４ｓ－１以下の速度定数でＢＭＰ６から解離する抗体を説明することを意味する。
本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などの用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に得ることができる、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合断片」、または「抗体断片」という用語は、ＢＭＰ６に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。
特定の実施形態では、本発明の抗体または抗体断片は、抗生物質、第２の抗ＢＭＰ６抗体、またはＩＬ－１、ＩＬ－６、もしくはＴＧＦ－βなどのサイトカインに対する抗体などの治療部分（「イムノコンジュゲート」）、または鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害の治療に有用な任意の他の治療部分にコンジュゲートされ得る。
本明細書で使用される場合、「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体（Ａｂ）を実質的に含まない抗体（例えば、ＢＭＰ６に特異的に結合する単離された抗体またはその断片は、ＢＭＰ６以外の抗原に特異的に結合するＡｂを実質的に含まない）を指すことが意図される。
本明細書で使用される場合、「表面プラズモン共鳴」という用語は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ ａｎｄ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによるリアルタイムの生体分子相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。
本明細書で使用される場合、「ＫＤ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の平衡解離定数を指すことが意図される。
「エピトープ」という用語は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は、２つ以上のエピトープを有し得る。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域に結合し得、異なる生物学的効果を有し得る。「エピトープ」という用語は、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位も指す。また、抗体により結合される抗原の領域を指す。エピトープは、構造的または機能的と定義され得る。機能的エピトープは概して、構造エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与するそれらの残基を有する。エピトープはまた、立体構造であってもよい、すなわち、非線状アミノ酸で構成され得る。ある特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面群である決定基を含み得、ある特定の実施形態では、特異的な三次元構造特徴および／または比電荷特徴を有し得る。
「実質的な同一性」または「実質的に同一である」という用語は、核酸またはその断片を指す場合、別の核酸（またはその相補鎖）との適切なヌクレオチド挿入または欠失と最適に整列されたとき、以下に論じるように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧＡＰなどの配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定された場合、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、ある特定の場合では、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。
ポリペプチドに適用される場合、「実質的な類似性」または「実質的に類似の」という用語は、２つのペプチド配列が、既定のギャップ重みを使用してＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムによって最適に整列された場合、少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換だけ異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換だけ互いに異なる場合、類似性のパーセントまたは程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整され得る。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸基の例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン、３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸、およびアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的な置換は、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３４５（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負でない値を有する任意の変化である。
ポリペプチドの配列類似性は、典型的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失、および他の修飾に割り当てられた類似性の測定値を使用して類似の配列と一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物からの相同ポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその変異タンパク質との間の配列相同性もしくは配列同一性を決定するための既定パラメータと共に使用することができるＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムを含む。例えば、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１のプログラムである、既定または推奨パラメータを備えたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリー配列と検索配列との間の最良重複の領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）、上記）。本発明の配列を、異なる生物からの多数の配列を含むデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメータを使用するコンピュータプログラムであるＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０および（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（その各々は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
特定の実施形態では、本発明の方法で使用するための抗体または抗体断片は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であり得る。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、または２つ以上の標的ポリペプチドのエピトープに特異的な抗原結合ドメインを含み得る。
「治療有効量」という語句は、それが投与される所望の効果をもたらす量を意味する。正確な量は、治療の目的に依存し、既知の技法を使用して当業者によって確認される（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照されたい）。
概要
骨形成タンパク質６（ＢＭＰ６）は、鉄レベルの調節を含む様々な生理学的プロセスに関与することが示されている５７ｋＤａタンパク質である。ＢＭＰ６シグナル伝達は、ＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化およびＳＭＡＤ４の核への転位をもたらし、そこで、そのプロモーター上の近位および遠位部位への結合時にヘプシジン（血清鉄の負の調節因子）転写を促進する。ヘモジュベリン（ＨＪＶ、ＨＦＥ２）は、シグナル伝達を増強するＢＭＰ６の共受容体である。ＢＭＰ６のＨＪＶへの結合の低減は、ヘプシジン転写を低減し、それによって血清鉄レベルを促進する。
骨形成タンパク質６（ＢＭＰ６）は、鉄レベルの調節を含む様々な生理学的プロセスに関与することが示されている５７ｋＤａタンパク質である。ＢＭＰ６シグナル伝達は、ＳＭＡＤ１／５／８のリン酸化およびＳＭＡＤ４の核への転位をもたらし、そこで、そのプロモーター上の近位および遠位部位への結合時にヘプシジン（血清鉄の負の調節因子）転写を促進する。ヘモジュベリン（ＨＪＶ、ＨＦＥ２）は、シグナル伝達を増強するＢＭＰ６の共受容体である。ＢＭＰ６のＨＪＶへの結合の低減は、ヘプシジン転写を低減し、それによって血清鉄レベルを促進する。
本明細書に記載の抗体は、ＢＭＰ６への特異的結合を示し、いくつかの実施形態では、鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害に罹患している患者の治療に有用であり得る。これらは、単独で、または鉄欠乏性貧血もしくは鉄欠乏関連障害を治療するための当該技術分野において既知である他の治療部分またはモダリティ、例えば、限定されないが、鉄サプリメントによる鉄補充、血清鉄および／または鉄の静脈内送達を促進するための食事の変更、輸血、ならびに鉄促進薬剤を用いた補助療法として使用され得る。これらは、ＢＭＰ６以外の抗原に特異的な追加の抗体と併用して使用され得るか、または他の種類の治療と組み合わせることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害の予防、治療、または管理に有用であり得る。
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、天然の完全長ヒトＢＭＰ６（配列番号４０）またはＢＭＰ６断片などの一次免疫原で免疫化し、続いて、二次免疫原で、またはＢＭＰ６の免疫原活性断片で免疫化されたマウスから得られる。
免疫原は、ＢＭＰ６の免疫原性断片またはその断片をコードするＤＮＡであり得る。免疫原は、ヒスチジンタグおよび／または抗体のＦｃ領域の断片に結合されたＢＭＰ６であり得る。
完全長ヒトＢＭＰ６のアミノ酸配列を配列番号４０として示す。マウスＢＭＰ６の完全長アミノ酸配列を配列番号４２として示す。
ある特定の実施形態では、ＢＭＰ６に特異的に結合する抗体は、上記領域の断片、または本明細書に記載の領域のＮもしくはＣ末端のいずれかまたは両方から約５～約２０個のアミノ酸残基だけ指定領域を超えて拡張するペプチドを使用して調製され得る。ある特定の実施形態では、上記領域またはその断片の任意の組み合わせは、ＢＭＰ６特異的抗体の調製に使用され得る。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ６の上記領域またはその断片のうちのいずれか１つ以上が、単一特異性、二重特異性、または多重特異性抗体を調製するために使用され得る。
抗体の抗原結合断片
特に別段の記載がない限り、本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、２本の免疫グロブリン重鎖および２本の免疫グロブリン軽鎖（すなわち、「完全抗体分子」）を含む抗体分子、ならびにそれらの抗原結合断片を包含すると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などの用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に得ることができる、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合断片」、または「抗体断片」という用語は、ＢＭＰ６に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、ＣＤＲを含む断片、または単離されたＣＤＲを含み得る。抗体の抗原結合断片は、例えば、抗体の可変および（任意選択的に）定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現に関与するタンパク質消化または組換え遺伝子操作技法などの任意の好適な標準的な技法を使用して、完全抗体分子から誘導され得る。そのようなＤＮＡは、既知であり、かつ／もしくは例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ－抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であるか、または合成することができる。ＤＮＡは、例えば、１つ以上の可変および／もしくは定常ドメインを好適な立体配置に配置するか、またはコドンを導入し、システイン残基を作製し、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失などするために、化学的に、または分子生物学的技法を使用することによって配列決定および操作され得る。
特に別段の記載がない限り、本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、２本の免疫グロブリン重鎖および２本の免疫グロブリン軽鎖（すなわち、「完全抗体分子」）を含む抗体分子、ならびにそれらの抗原結合断片を包含すると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などの用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に得ることができる、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合断片」、または「抗体断片」という用語は、ＢＭＰ６に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、ＣＤＲを含む断片、または単離されたＣＤＲを含み得る。抗体の抗原結合断片は、例えば、抗体の可変および（任意選択的に）定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現に関与するタンパク質消化または組換え遺伝子操作技法などの任意の好適な標準的な技法を使用して、完全抗体分子から誘導され得る。そのようなＤＮＡは、既知であり、かつ／もしくは例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ－抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であるか、または合成することができる。ＤＮＡは、例えば、１つ以上の可変および／もしくは定常ドメインを好適な立体配置に配置するか、またはコドンを導入し、システイン残基を作製し、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失などするために、化学的に、または分子生物学的技法を使用することによって配列決定および操作され得る。
抗原結合断片の非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基、または限定されたＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小型モジュール型免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作された分子も、本明細書で使用する場合、「抗原結合断片」という表現に包含される。
抗体の抗原結合断片は、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意の大きさまたはアミノ酸組成のものであり得、概して、１つ以上のフレームワーク配列に隣接しているか、またはそれとインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＬドメインと会合したＶＨドメインを有する抗原結合断片において、ＶＨおよびＶＬドメインは、任意の好適な配置で互いに対して配置され得る。例えば、可変領域は二量体であり、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬ、またはＶＬ－ＶＬ二量体を含み得る。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体のＶＨまたはＶＬドメインを含み得る。
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含み得る。本発明の抗体の抗原結合断片内に見出され得る可変および定常ドメインの非限定的な例示的な立体配置には、（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３、および（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬが含まれる。上に列挙される例示的な立体配置のいずれかを含む、可変ドメインおよび定常ドメインの任意の立体配置において、可変および定常ドメインは、互いに直接連結され得るか、または完全もしくは部分的ヒンジ領域もしくはリンカー領域によって連結され得る。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変および／または定常ドメイン間の可撓性または半可撓性の連結をもたらす少なくとも２つ（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０以上）のアミノ酸からなり得る。さらに、本発明の抗体の抗原結合断片は、互いとの、および／または１つ以上の単量体のＶＨもしくはＶＬドメインとの非共有結合性会合において（例えば、ジスルフィド結合により）、上記に列挙される可変および定常ドメイン立体配置のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含み得る。
完全抗体分子と同様に、抗原結合断片は、単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多重特異性抗原結合断片は、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、別個の抗原、または同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体フォーマットを含む任意の多重特異性抗体フォーマットは、当該技術分野で利用可能な通例の技法を使用して、本発明の抗体の抗原結合断片との関連での使用に適している場合がある。
本発明は、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン鎖を有する抗ＢＭＰ６抗体および抗原結合断片、ならびに細胞および／またはインビトロ翻訳後修飾を有するバリアントを含む。例えば、本発明は、本明細書に記載の重鎖および／または軽鎖アミノ酸配列を含むＢＭＰ６に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片（例えば、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、および／またはＣＤＲ－Ｌ３）、ならびに１つ以上のアミノ酸残基がグリコシル化されている抗体および断片、１つ以上のＡｓｎ残基が脱アミド化されている抗体および断片、１つ以上の残基（例えば、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、および／またはＨｉｓ）が酸化されている抗体および断片、Ｎ末端Ｇｌｎがピログルタミン酸（ｐｙｒｏＥ）である抗体および断片、ならびに／またはＣ末端リジンが欠けている抗体および断片を含む。
本発明は、本発明の抗ＢＭＰ６抗体もしくはその抗原結合断片、またはその免疫グロブリン鎖を作製するための組換え方法を含み、方法は、（ｉ）該抗体もしくはその抗原結合断片の免疫グロブリン軽鎖および／もしくは重鎖（例えば、重鎖もしくはそのＶＨ、またはそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン、ならびに／あるいは軽鎖もしくはそのＶＬ、またはそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン）をコードする１つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチドが、ベクター内にあり、かつ／またはプロモーターに作動可能に連結されている）を導入することと、（ｉｉ）ポリヌクレオチドの発現に有利な条件下で、宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＰｉｃｈｉａ細胞もしくはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞）を培養することと、（ｉｉｉ）任意選択的に、抗体または断片もしくは鎖を宿主細胞および／または宿主細胞が成長している培地から単離することと、を含む。２つ以上の免疫グロブリン鎖を含む抗体または抗原結合断片、例えば、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖を含む抗体を作製する場合、単一の宿主細胞において鎖を共発現することにより、例えば、抗体または抗原結合断片分子を形成するように、そのような鎖が分泌される場合、細胞内または細胞表面上または細胞外において鎖の会合がもたらされる。本方法は、免疫グロブリン重鎖のみまたは免疫グロブリン軽鎖のみ（例えば、成熟断片および／またはその可変ドメインを含む本明細書で論じられるもののうちのいずれか）が発現されるものを含む。そのような鎖は、例えば、そのような鎖を含む抗体または抗原結合断片の発現において中間体として有用である。本発明は、そのような発現方法の生成物（例えば、抗体、抗原結合断片、ＶＨ、またはＶＬ）を含む。
ヒト抗体の調製
トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成するための方法は、当該技術分野において既知である。任意のそのような既知の方法は、ＢＭＰ６に特異的に結合するヒト抗体を作製するために、本発明との関連で使用され得る。
トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成するための方法は、当該技術分野において既知である。任意のそのような既知の方法は、ＢＭＰ６に特異的に結合するヒト抗体を作製するために、本発明との関連で使用され得る。
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標））またはモノクローナル抗体を生成するための任意の他の既知の方法を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する、ＢＭＰ６に対する高親和性キメラ抗体が、最初に単離される。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術は、マウスが抗原刺激に対する応答においてヒト可変領域およびマウス定常領域を含む抗体を産生するように、内在性マウス定常領域の遺伝子座に動作可能に連結された、ヒト重鎖および軽鎖可変領域を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスの生成を伴う。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、ヒト重鎖および軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに動作可能に連結する。次いで、完全ヒト抗体を発現することができる細胞においてＤＮＡを発現させる。
概して、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに目的の抗原を接種し、抗体を発現するマウスからリンパ細胞（Ｂ細胞など）を回収する。リンパ細胞を骨髄腫細胞株と融合させて不死化ハイブリドーマ細胞株を調製することができ、そのようなハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択して、目的の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を特定する。重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、重鎖および軽鎖の望ましいアイソタイプ定常領域に連結することができる。そのような抗体タンパク質は、ＣＨＯ細胞などの細胞において産生され得る。あるいは、抗原特異的キメラ抗体または軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡを、抗原特異的リンパ球から直接単離することができる。
まず、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する高親和性キメラ抗体を単離する。抗体は、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について特徴付けられ、選択される。マウス定常領域を所望のヒト定常領域と置き換えて、本発明の完全ヒト抗体、例えば、野生型または修飾されたＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４を生成する。選択された定常領域は、特定の用途に応じて変動し得るが、高親和性抗原結合および標的特異性の特徴は、可変領域に存在する。
一般に、本発明の抗体は、固相上に固定化された、または溶液相中のいずれかの抗原への結合によって測定された場合、非常に高い親和性を有し、典型的には、約１０－１２～約１０－７ＭのＫＤを有する。マウス定常領域は、本発明の完全ヒト抗体を生成するために所望のヒト定常領域で置き換えられる。選択された定常領域は、特定の用途に応じて変動し得るが、高親和性抗原結合および標的特異性の特徴は、可変領域に存在する。
生物学的等価物
本発明の抗ＢＭＰ６抗体および抗体断片は、記載される抗体のものとは異なるが、ＢＭＰ６に結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。そのようなバリアント抗体および抗体断片は、親配列と比較した場合、アミノ酸の１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、記載された抗体のものと本質的に同等である生物学的活性を呈する。同様に、本発明の抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示された配列と比較した場合、ヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、本発明の抗体または抗体断片と本質的に生物学的に等価である抗体または抗体断片をコードする配列を包含する。
本発明の抗ＢＭＰ６抗体および抗体断片は、記載される抗体のものとは異なるが、ＢＭＰ６に結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。そのようなバリアント抗体および抗体断片は、親配列と比較した場合、アミノ酸の１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、記載された抗体のものと本質的に同等である生物学的活性を呈する。同様に、本発明の抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示された配列と比較した場合、ヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、本発明の抗体または抗体断片と本質的に生物学的に等価である抗体または抗体断片をコードする配列を包含する。
２つの抗原結合タンパク質または抗体は、例えば、それらが類似の実験条件下で単回用量または複数回用量のいずれかで、同じモル用量で投与された場合に、吸収の速度および程度が有意差を示さない薬学的等価物または薬学的代替物である場合、生物学的等価物とみなされる。いくつかの抗体は、それらの吸収の程度は等価であるが吸収速度は等価ではなく、それでも吸収速度のそのような差は意図的であり、標識することに反映されており、例えば長期使用に関する有効な身体薬物濃度の達成に必須ではなく、研究される特定の薬物製品にとって医学的に有意ではないとみなされるため、生物学的に等価とみなされ得る場合、等価物または薬学的代替物とみなされる。
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、それらの安全性、純度、および効力において臨床的に意味のある差がない場合、生物学的に等価である。
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、患者が、切り替えなしの持続的療法と比較して、免疫原性の臨床的に有意な変化または有効性の減少を含む有害作用のリスクにおける予想される増加なしで、参照生成物と生物学的生成物との間で１回以上切り替えることができる場合、生物学的に等価である。
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、それらが両方とも、使用条件（複数可）についての共通の機序または作用機序によって、そのような機序が既知である程度まで作用する場合、生物学的に等価である。
生物学的等価性は、インビボおよび／またはインビトロ方法によって示され得る。生物学的等価性の測定法には、例えば、（ａ）抗体またはその代謝産物の濃度が時間の関数として血液、血漿、血清、または他の生物学的流体において測定される、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ試験、（ｂ）ヒトのインビボ生物学的利用能データと相関しており、それを合理的に予測する、インビトロ試験、（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理学的効果が時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ試験、および（ｄ）抗体の安全性、有効性、または生物学的利用能もしくは生物学的等価性を確立する、十分に制御された臨床試験が含まれる。
本発明の抗体の生物学的に等価なバリアントは、例えば、残基もしくは配列の様々な置換、または生物学的活性に必要ではない末端もしくは内部残基もしくは配列の欠失を行うことによって構築され得る。例えば、生物学的活性に必須ではないシステイン残基は、再生の際の不必要または不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために、欠失されるか、または他のアミノ酸で置き換えられ得る。他の文脈では、生物学的に等価な抗体は、抗体のグリコシル化の特徴を修飾するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を排除または除去する変異を含む抗体バリアントを含み得る。
Ｆｃバリアントを含む抗ＢＭＰ６抗体
本発明のある特定の実施形態によると、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を増強または減少させる１つ以上の変異を含むＦｃドメインを含む、抗ＢＭＰ６抗体が提供される。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣＨ２またはＣＨ３領域に変異を含む抗ＢＭＰ６抗体を含み、変異は、酸性環境において（例えば、ｐＨが約５．５～約６．０の範囲のエンドソームにおいて）、ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増加させる。そのような変異は、動物に投与したときに抗体の血清半減期の増加をもたらし得る。そのようなＦｃ修飾の非限定的な例としては、例えば、２５０位（例えば、ＥまたはＱ）、２５０位および４２８位（例えば、ＬまたはＦ）、２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）での修飾、または４２８位および／もしくは４３３位（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／もしくは４３４位（例えば、Ａ、Ｗ、Ｈ、Ｆ、またはＹ［Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４Ｆ、またはＮ４３４Ｙ］）での修飾、または２５０位および／もしくは４２８位での修飾、または３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、および４３４位での修飾が挙げられる。一実施形態では、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）修飾、４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）修飾、４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）修飾、２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）修飾、２５０Ｑおよび４２８Ｌ修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）、ならびに３０７および／または３０８修飾（例えば、３０８Ｆおよび／または３０８Ｐ）を含む。さらに別の実施形態では、修飾は、２６５Ａ（例えば、Ｄ２６５Ａ）および／または２９７Ａ（例えば、Ｎ２９７Ａ）修飾を含む。
本発明のある特定の実施形態によると、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を増強または減少させる１つ以上の変異を含むＦｃドメインを含む、抗ＢＭＰ６抗体が提供される。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣＨ２またはＣＨ３領域に変異を含む抗ＢＭＰ６抗体を含み、変異は、酸性環境において（例えば、ｐＨが約５．５～約６．０の範囲のエンドソームにおいて）、ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増加させる。そのような変異は、動物に投与したときに抗体の血清半減期の増加をもたらし得る。そのようなＦｃ修飾の非限定的な例としては、例えば、２５０位（例えば、ＥまたはＱ）、２５０位および４２８位（例えば、ＬまたはＦ）、２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）での修飾、または４２８位および／もしくは４３３位（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／もしくは４３４位（例えば、Ａ、Ｗ、Ｈ、Ｆ、またはＹ［Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４Ｆ、またはＮ４３４Ｙ］）での修飾、または２５０位および／もしくは４２８位での修飾、または３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、および４３４位での修飾が挙げられる。一実施形態では、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）修飾、４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）修飾、４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）修飾、２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）修飾、２５０Ｑおよび４２８Ｌ修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）、ならびに３０７および／または３０８修飾（例えば、３０８Ｆおよび／または３０８Ｐ）を含む。さらに別の実施形態では、修飾は、２６５Ａ（例えば、Ｄ２６５Ａ）および／または２９７Ａ（例えば、Ｎ２９７Ａ）修飾を含む。
例えば、本発明は、２５０Ｑおよび２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ２４８Ｌ）、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅ）、４２８Ｌおよび４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）、２５７Ｉおよび３１１Ｉ（例えば、Ｐ２５７ＩおよびＱ３１１Ｉ）、２５７Ｉおよび４３４Ｈ（例えば、Ｐ２５７ＩおよびＮ４３４Ｈ）、３７６Ｖおよび４３４Ｈ（例えば、Ｄ３７６ＶおよびＮ４３４Ｈ）、３０７Ａ、３８０Ａ、および４３４Ａ（例えば、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａ）、ならびに４３３Ｋおよび４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ）からなる群から選択される１つ以上の変異の対または群を含むＦｃドメインを含む、抗ＢＭＰ６抗体を含む。前述のＦｃドメイン変異、および本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の他の変異のすべての可能な組み合わせが、本発明の範囲内に企図される。
本発明はまた、キメラ重鎖定常（ＣＨ）領域を含む抗ＢＭＰ６抗体を含み、キメラＣＨ領域は、２つ以上の免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ領域に由来するセグメントを含む。例えば、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ３ドメインの一部または全部と組み合わされた、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ２ドメインの一部または全部を含む、キメラＣＨ領域を含み得る。ある特定の実施形態によると、本発明の抗体は、キメラヒンジ領域を有するキメラＣＨ領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列（ＥＵ番号付けによる２２８～２３６位のアミノ酸残基）と組み合わされた、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」アミノ酸配列（ＥＵ番号付けによる２１６～２２７位のアミノ酸残基）を含み得る。ある特定の実施形態によると、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４上部ヒンジに由来するアミノ酸残基と、ヒトＩｇＧ２下部ヒンジに由来するアミノ酸残基と、を含む。本明細書に記載されるキメラＣＨ領域を含む抗体は、ある特定の実施形態では、抗体の治療特性または薬物動態学的特性に悪影響を与えることなく、修飾されたＦｃエフェクター機能を呈し得る。（例えば、２０１３年２月１日に出願された、米国仮出願第６１／７５９，５７８号（その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
抗体の生物学的特徴
概して、本発明の抗体は、ＢＭＰ６に結合することによって機能し得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、別の抗原（交差反応性抗体）に結合し得る。
概して、本発明の抗体は、ＢＭＰ６に結合することによって機能し得る。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、別の抗原（交差反応性抗体）に結合し得る。
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、二重特異性抗体であり得る。本発明の二重特異性抗体は、１つのドメインの１つのエピトープに結合し得、ＢＭＰ６の第２のドメインの１つのエピトープにも結合し得る。ある特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、同じドメインの２つの異なるエピトープに結合し得る。
一実施形態では、本発明は、ＢＭＰ６に結合する完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体またはその断片は、以下の特徴のうちの１つ以上を呈する：（ｉ）配列番号１および３からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＶＲを含む、（ｉｉ）配列番号２および４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＶＲを含む、（ｉｉｉ）配列番号７および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ３ドメインと、配列番号１０および１６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ３ドメインとを含む、（ｉｖ）配列番号５および１１からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ１ドメインと、配列番号６および１２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ２ドメインと、配列番号８および１４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ１ドメインと、配列番号９および１５からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ２ドメインとを含む、ならびに（ｖ）１０－７以下のＫＤでＢＭＰ６に結合する。
本発明のある特定の抗ＢＭＰ６抗体は、インビトロまたはインビボアッセイによって決定されるように、ＢＭＰ６に結合し、その活性を中和することができる。本発明の抗体がＢＭＰ６に結合し、その活性を中和する能力は、本明細書に記載される結合アッセイまたは活性アッセイを含む、当業者に既知の任意の標準的な方法を使用して測定され得る。
ペプチドは、タグ付けのため、または、ＫＬＨなどの担体分子へのコンジュゲーションの目的のために、ある特定の残基の付加もしくは置換を含むように修飾され得る。例えば、システインは、ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端のいずれかに付加され得るか、またはリンカー配列を付加して、例えば、免疫化のためのＫＬＨへのコンジュゲーションのためにペプチドを調製することができる。
ＢＭＰ６に特異的な抗体は、追加の標識または部分を含まない場合があるか、あるいは、それらは、Ｎ末端もしくはＣ末端標識もしくは部分を含む場合がある。一実施形態では、標識または部分は、ビオチンである。結合アッセイにおいて、標識の位置（存在する場合）は、ペプチドが結合する表面に対するペプチドの配向を決定し得る。例えば、表面がアビジンでコーティングされている場合、Ｎ末端ビオチンを含むペプチドは、ペプチドのＣ末端部分が表面に対して遠位になるように配向される。一実施形態では、標識は、放射性核種、蛍光色素、またはＭＲＩ検出可能な標識であり得る。ある特定の実施形態では、そのような標識抗体は、イメージングアッセイを含む診断アッセイで使用され得る。
エピトープマッピングおよび関連技術
本発明は、ＢＭＰ６の１つ以上の領域内に見られる１つ以上のアミノ酸と相互作用する抗ＢＭＰ６抗体を含む。抗体が結合するエピトープは、ＢＭＰ６分子の前述の領域のいずれか内に位置する、３つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）のアミノ酸の単一の連続した配列（例えば、ドメイン内の線状エピトープ）からなり得る。あるいは、エピトープは、ＢＭＰ６分子の前述の領域のいずれかまたは両方内に位置する複数の非連続アミノ酸（またはアミノ酸配列）（例えば、立体構造エピトープ）からなり得る。
本発明は、ＢＭＰ６の１つ以上の領域内に見られる１つ以上のアミノ酸と相互作用する抗ＢＭＰ６抗体を含む。抗体が結合するエピトープは、ＢＭＰ６分子の前述の領域のいずれか内に位置する、３つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上）のアミノ酸の単一の連続した配列（例えば、ドメイン内の線状エピトープ）からなり得る。あるいは、エピトープは、ＢＭＰ６分子の前述の領域のいずれかまたは両方内に位置する複数の非連続アミノ酸（またはアミノ酸配列）（例えば、立体構造エピトープ）からなり得る。
当業者に既知の様々な技法を使用して、抗体がポリペプチドまたはタンパク質内の「１つ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを決定することができる。例示的な技法には、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）などに記載されている通例の交差ブロッキングアッセイが含まれる。他の方法には、アラニン走査変異分析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３－６３）、ペプチド切断分析、結晶学的研究、およびＮＭＲ分析が含まれる。加えて、エピトープ切除、エピトープ抽出、および抗原の化学修飾などの方法を用いることができる（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ９：４８７－４９６）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を特定するために使用することができる別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。一般論として、水素／重水素交換法は、目的のタンパク質を重水素標識し、続いて抗体を重水素標識したタンパク質に結合させることを伴う。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移し、抗体複合体によって保護されているアミノ酸内の交換可能なプロトンは、界面の一部ではないアミノ酸内の交換可能なプロトンよりも遅い速度で重水素－水素逆交換を受ける。結果として、タンパク質／抗体界面の一部を形成するアミノ酸は、重水素を保持し得るため、界面に含まれていないアミノ酸と比較して比較的高い質量を呈する。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断および質量分析に供し、それにより、抗体が相互作用する特定のアミノ酸を含む重水素標識された残基を含むペプチドを明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９、Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａを参照されたい。
「エピトープ」という用語は、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、タンパク質の三次折り畳みによって並置された連続したアミノ酸または非連続アミノ酸の両方から形成することができる。連続したアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露時に保持されるが、三次折り畳みによって形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒による処理で失われる。エピトープは、典型的には、固有の空間立体構造において、少なくとも３個、より通常は少なくとも５個または８～１０個のアミノ酸を含む。
修飾補助されたプロファイリング（ＭＡＰ）、別名抗原構造に基づく抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）は、化学的または酵素的に修飾された抗原表面に対する各抗体の結合プロファイルの類似性に従って、同じ抗原に対して指向される多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分類する方法である（参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれるＵＳ２００４／０１０１９２０を参照されたい）。各カテゴリーは、別のカテゴリーによって表されるエピトープと明らかに異なるか、または部分的に重複するいずれかの独特のエピトープを反映し得る。この技術は、遺伝的に同一の抗体の迅速なフィルタリングを可能にし、その結果、特徴付けは遺伝的に異なる抗体に焦点を当てることができる。ハイブリドーマスクリーニングに適用される場合、ＭＡＰは、所望の特徴を有するｍＡｂを産生する希少なハイブリドーマクローンの特定を容易にし得る。ＭＡＰを使用して、本発明の抗体を、異なるエピトープに結合する抗体の群に選別することができる。
ある特定の実施形態では、抗ＢＭＰ６抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４０に例示されるヒトＢＭＰ６に例示される領域のうちのいずれか１つ以上内のエピトープに結合するか、またはその断片に結合する。
本発明は、本明細書に記載の特定の例示的な抗体のいずれかと同じエピトープまたはエピトープの一部に結合するヒト抗ＢＭＰ６抗体、または本明細書に記載の例示的な抗体のいずれかのＣＤＲ配列を有する抗体を含む。同様に、本発明はまた、ＢＭＰ６またはＢＭＰ６断片への結合について、本明細書に記載の特定の例示的な抗体のいずれか、または本明細書に記載の例示的な抗体のいずれかのＣＤＲ配列を有する抗体と競合する抗ＢＭＰ６抗体を含む。
抗体が参照抗ＢＭＰ６抗体と同じエピトープに結合するか、または参照抗ＢＭＰ６抗体との結合について競合するかどうかは、当技術分野で既知の通例の方法を使用して容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗ＢＭＰ６抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体を、飽和条件下でＢＭＰ６タンパク質またはペプチドに結合させる。次に、ＢＭＰ６分子に結合する試験抗体の能力を評価する。試験抗体が、参照抗ＢＭＰ６抗体との飽和結合後にＢＭＰ６に結合することができる場合、試験抗体は、参照抗ＢＭＰ６抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。その一方で、試験抗体が、参照抗ＢＭＰ６抗体との飽和結合後にＢＭＰ６タンパク質に結合することができない場合、試験抗体は、本発明の参照抗ＢＭＰ６抗体によって結合されたエピトープと同じエピトープに結合し得る。
抗体が、結合について参照抗ＢＭＰ６抗体と競合するかどうかを決定するために、上記の結合方法を２つの配向で実施する。第１の配向において、参照抗体を飽和条件下でＢＭＰ６タンパク質に結合させ、続いて試験抗体のＢＭＰ６分子への結合を評価する。第２の配向において、試験抗体を飽和条件下でＢＭＰ６分子に結合させ、続いて参照抗体のＢＭＰ６分子への結合を評価する。両方の配向において、第１の（飽和）抗体のみがＢＭＰ６分子に結合することができる場合、試験抗体および参照抗体は、ＢＭＰ６への結合について競合すると結論付けられる。当業者によって理解されるように、結合について参照抗体と競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープに結合するわけではないが、重複しているまたは隣接するエピトープに結合することによって参照抗体の結合を立体的に遮断し得る。
各々が、もう一方の抗原への結合を競合的に阻害（遮断）する場合、２つの抗体は、同じまたは重複するエピトープに結合する。すなわち、１、５、１０、２０、または１００倍過剰の一方の抗体は、競合結合アッセイで測定した場合、少なくとも５０％、しかし、好ましくは７５％、９０％、またはさらには９９％他方の結合を阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０ ５０：１４９５－１５０２を参照されたい）。あるいは、一方の抗体の結合を低減または排除する抗原における本質的にすべてのアミノ酸変異が、もう一方の結合を低減または排除する場合、２つの抗体は同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を低減または排除するいくつかのアミノ酸変異がもう一方の結合を低減または排除する場合、２つの抗体は重複するエピトープを有する。
次に、試験抗体の結合の観察された欠如が、実際に、参照抗体と同じエピトープへの結合によるものであるか、または立体遮断（または別の現象）が、観察された結合の欠如の原因であるのかを確認するために、さらなる通例の実験（例えば、ペプチド変異および結合分析）を実施することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、または当該技術分野で利用可能な任意の他の定量的もしくは定性的な抗体結合アッセイを使用して実施することができる。
イムノコンジュゲート
本発明は、鉄欠乏性貧血もしくは鉄欠乏関連障害の重症度を低減することができる、または鉄欠乏性貧血もしくは鉄欠乏関連障害に関連する少なくとも１つの症状を改善することができる薬剤などの治療部分（「イムノコンジュゲート」）にコンジュゲートされたヒト抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体を包含する。本明細書で使用される場合、「イムノコンジュゲート」という用語は、放射性剤、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター部分、酵素、毒素、または治療剤に化学的または生物学的に連結される抗体を指す。抗体は、その標的に結合することができる限り、分子に沿った任意の位置で、放射性剤、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター部分、酵素、毒素、または治療剤に連結され得る。イムノコンジュゲートの例は、抗体薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＢＭＰ６、またはＩＬ－１、ＩＬ－６などのサイトカイン、もしくはＴＧＦ－βなどのケモカインに対する、第２の異なる抗体であってもよい。抗ＢＭＰ６抗体にコンジュゲートされ得る治療部分の種類は、治療される状態および達成される所望の治療効果を考慮する。イムノコンジュゲートを形成するのに好適な薬剤の例は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＷＯ０５／１０３０８１を参照されたい。イムノコンジュゲートおよび免疫毒素の調製は、一般に、当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第４３４０５３５を参照されたい）。イムノコンジュゲートは、例えば、ＵＳ７２５０４９２、ＵＳ７４２００４０、およびＵＳ７４１１０４６に詳細に記載されており、その各々はそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、鉄欠乏性貧血もしくは鉄欠乏関連障害の重症度を低減することができる、または鉄欠乏性貧血もしくは鉄欠乏関連障害に関連する少なくとも１つの症状を改善することができる薬剤などの治療部分（「イムノコンジュゲート」）にコンジュゲートされたヒト抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体を包含する。本明細書で使用される場合、「イムノコンジュゲート」という用語は、放射性剤、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター部分、酵素、毒素、または治療剤に化学的または生物学的に連結される抗体を指す。抗体は、その標的に結合することができる限り、分子に沿った任意の位置で、放射性剤、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター部分、酵素、毒素、または治療剤に連結され得る。イムノコンジュゲートの例は、抗体薬物コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＢＭＰ６、またはＩＬ－１、ＩＬ－６などのサイトカイン、もしくはＴＧＦ－βなどのケモカインに対する、第２の異なる抗体であってもよい。抗ＢＭＰ６抗体にコンジュゲートされ得る治療部分の種類は、治療される状態および達成される所望の治療効果を考慮する。イムノコンジュゲートを形成するのに好適な薬剤の例は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＷＯ０５／１０３０８１を参照されたい。イムノコンジュゲートおよび免疫毒素の調製は、一般に、当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第４３４０５３５を参照されたい）。イムノコンジュゲートは、例えば、ＵＳ７２５０４９２、ＵＳ７４２００４０、およびＵＳ７４１１０４６に詳細に記載されており、その各々はそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
多重特異性抗体
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であり得る。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、または２つ以上の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含み得る。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９、Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８－２４４を参照されたい。本発明の抗体は、別の機能分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質に連結されるか、またはそれと共発現され得る。例えば、抗体またはその断片は、別の抗体または抗体断片などの１つ以上の他の分子実体に（例えば、化学結合、遺伝的融合、非共有結合性会合、もしくは他の方法により）機能的に連結されて、第２の結合特異性を有する二重特異性または多重特異性抗体を産生することができる。例えば、本発明は、免疫グロブリンの一方のアームがＢＭＰ６のＮ末端領域もしくはその断片に特異的であり、免疫グロブリンのもう一方のアームが、ＢＭＰ６のＣ末端領域もしくは第２の治療標的に特異的であるか、または治療部分にコンジュゲートされる、二重特異性抗体を含む。本発明との関連で使用され得る例示的な二重特異性抗体フォーマットは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇ ＣＨ３ドメインの使用を伴い、第１および第２のＩｇ ＣＨ３ドメインは、互いに少なくとも１つのアミノ酸だけ異なり、少なくとも１つのアミノ酸の相違は、アミノ酸の相違がない二重特異性抗体と比較して、ＢＭＰ６への二重特異性抗体の結合を低減する。一実施形態では、第１のＩｇＣＨ３ドメインはＢＭＰ６に結合し、第２のＩｇＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる、ＥＵ番号付けではＨ４３５Ｒ）などのＢＭＰ６結合を低減または消失させる変異を含む。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる、ＥＵではＹ４３６Ｆ）をさらに含み得る。第２のＣＨ３内に見出され得るさらなる修飾としては、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、ＥＵでは、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）、ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、ＥＵでは、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）、ならびにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、Ｑ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）が挙げられる。上記の二重特異性抗体フォーマットの変形は、本発明の範囲内に企図される。
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であり得る。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、または２つ以上の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含み得る。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９、Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８－２４４を参照されたい。本発明の抗体は、別の機能分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質に連結されるか、またはそれと共発現され得る。例えば、抗体またはその断片は、別の抗体または抗体断片などの１つ以上の他の分子実体に（例えば、化学結合、遺伝的融合、非共有結合性会合、もしくは他の方法により）機能的に連結されて、第２の結合特異性を有する二重特異性または多重特異性抗体を産生することができる。例えば、本発明は、免疫グロブリンの一方のアームがＢＭＰ６のＮ末端領域もしくはその断片に特異的であり、免疫グロブリンのもう一方のアームが、ＢＭＰ６のＣ末端領域もしくは第２の治療標的に特異的であるか、または治療部分にコンジュゲートされる、二重特異性抗体を含む。本発明との関連で使用され得る例示的な二重特異性抗体フォーマットは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇ ＣＨ３ドメインの使用を伴い、第１および第２のＩｇ ＣＨ３ドメインは、互いに少なくとも１つのアミノ酸だけ異なり、少なくとも１つのアミノ酸の相違は、アミノ酸の相違がない二重特異性抗体と比較して、ＢＭＰ６への二重特異性抗体の結合を低減する。一実施形態では、第１のＩｇＣＨ３ドメインはＢＭＰ６に結合し、第２のＩｇＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる、ＥＵ番号付けではＨ４３５Ｒ）などのＢＭＰ６結合を低減または消失させる変異を含む。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる、ＥＵではＹ４３６Ｆ）をさらに含み得る。第２のＣＨ３内に見出され得るさらなる修飾としては、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、ＥＵでは、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）、ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、ＥＵでは、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）、ならびにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる、Ｑ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）が挙げられる。上記の二重特異性抗体フォーマットの変形は、本発明の範囲内に企図される。
本発明との関連で使用され得る他の例示的な二重特異性フォーマットには、例えば、ｓｃＦｖに基づくまたはダイアボディ二重特異性フォーマット、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ、クアドローマ、ノブズ－イントゥ－ホールズ、共通の軽鎖（例えば、ノブズ－イントゥ－ホールズを有する共通の軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用型Ｆａｂ（ＤＡＦ）－ＩｇＧ、およびＭａｂ２二重特異性フォーマットが含まれる（前述のフォーマットの概要については、例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２，ｍＡｂｓ ４：６，１－１１、およびそこに引用されている参考文献を参照されたい）。二重特異性抗体は、ペプチド／核酸コンジュゲートを使用して構築することもでき、例えば、直交化学反応性を有する非天然アミノ酸を使用して、部位特異的抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲートを生成し、次に、これを、定義された組成物、原子価、および形状を有する多量体複合体に自己組織化させる。（例えば、Ｋａｚａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［Ｅｐｕｂ：Ｄｅｃ．４，２０１２］を参照されたい）。
治療的投与および製剤
本発明は、本明細書で論じる抗ＢＭＰ６抗体またはその抗原結合断片を含む治療用組成物を提供する。本発明による治療用組成物は、好適な担体、賦形剤、および製剤に組み込まれ、改善された移動、送達、耐性などをもたらす他の薬剤と共に投与され得る。多くの適切な製剤は、全薬剤師に既知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見出すことができる。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、小胞を含む脂質（カチオン性またはアニオン性）（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）など）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型エマルション、エマルションカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカーボワックスを含む半固体混合物が含まれる。Ｓｅｅ ａｌｓｏ Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．”Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１も参照されたい。
本発明は、本明細書で論じる抗ＢＭＰ６抗体またはその抗原結合断片を含む治療用組成物を提供する。本発明による治療用組成物は、好適な担体、賦形剤、および製剤に組み込まれ、改善された移動、送達、耐性などをもたらす他の薬剤と共に投与され得る。多くの適切な製剤は、全薬剤師に既知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見出すことができる。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、小胞を含む脂質（カチオン性またはアニオン性）（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）など）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型エマルション、エマルションカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカーボワックスを含む半固体混合物が含まれる。Ｓｅｅ ａｌｓｏ Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．”Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１も参照されたい。
抗体の用量は、投与される対象の年齢および大きさ、標的疾患、状態、投与経路などによって変動し得る。本発明の抗体が鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害を予防または治療するために使用される場合、本発明の抗体を、通常約０．１～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約５～約１００、約１０～約９０、または約２０～約７０ｍｇ／ｋｇ体重の単回投与で静脈内投与することが有利である。状態の重症度に応じて、治療の頻度および期間を調整することができる。ある特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、少なくとも約０．１ｍｇ～約８００ｍｇ、約１～約５００ｍｇ、約５～約３００ｍｇ、または約１０～約２００ｍｇ、約１００ｍｇ、または約５０ｍｇの初期用量として投与され得る。ある特定の実施形態では、初期用量に続いて、初期用量とほぼ同じか、またはそれ未満であり得る量で、抗体またはその抗原結合断片の２回目または複数の後続用量の投与が行われ得、後続用量は、少なくとも１日～３日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、または少なくとも１４週間離れている。
様々な送達系、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルにおける封入、変異ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスが既知であり、本発明の薬学的組成物を投与するために使用することができる（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２を参照されたい）。導入方法には、皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。組成物は、例えば、注入もしくはボーラス注射、上皮または皮膚粘膜内層（ｌｉｎｉｎｇ）（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収による任意の簡便な経路によって投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することができる。投与は全身または局所であり得る。薬学的組成物は、小胞、特にリポソームにおいて送達することもできる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３を参照されたい）。
本発明の抗体を送達するためのナノ粒子の使用も本明細書で企図される。抗体コンジュゲートされたナノ粒子は、治療および診断用途の両方に使用され得る。抗体コンジュゲートされたナノ粒子ならびに調製および使用方法は、Ａｒｒｕｅｂｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．２００９（“Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”ｉｎ Ｊ．Ｎａｎｏｍａｔ．Ｖｏｌｕｍｅ ２００９，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４３９３８９，２４ ｐａｇｅｓ，ｄｏｉ：１０．１１５５／２００９／４３９３８９）（参照により本明細書に組み込まれる）により詳細に記載されている。薬物送達のためのナノ粒子は、例えば、ＵＳ８２７７８１２、ＵＳ８２５８２５６、ＵＳ ８２５７７４０、ＵＳ ８２４６９９５、ＵＳ ８２３６３３０（各々その全体が本明細書に組み込まれる）にも記載されている。
ある特定の状況では、薬学的組成物は、徐放系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。さらに別の実施形態では、徐放系を組成物の標的の近位に配置することができ、したがって、全身用量の一部しか必要としない。
注射可能な調製物には、静脈内、皮下、皮内、および筋肉内注射、点滴注入などのための剤形が含まれ得る。これらの注射可能な調製物は、公に知られている方法によって調製され得る。例えば、注射可能な調製物は、例えば、注射用に従来使用される滅菌水性媒体または油性媒体中に上記の抗体またはその塩を溶解、懸濁、または乳化することによって調製され得る。注射用水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコース含有等張液、および他の補助剤などがあり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用され得る。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが用いられ、これらは、ベンジルベンゾエート、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用され得る。このように調製された注射剤は、好ましくは適切なアンプルに充填される。
本発明の薬学的組成物は、標準的な針および注射器を用いて皮下または静脈内に送達することができる。加えて、皮下送達に関して、ペン送達デバイスは、本発明の薬学的組成物を送達する際に容易に適用される。そのようなペン送達デバイスは、再利用可能であるか、または使い捨てであり得る。再利用可能なペン送達デバイスは、概して、薬学的組成物を含む交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内の薬学的組成物がすべて投与され、カートリッジが空になると、空のカートリッジは容易に廃棄することができ、薬学的組成物を含む新しいカートリッジと交換することができる。次に、ペン送達デバイスは再利用することができる。使い捨てのペン送達デバイスにおいて、交換可能なカートリッジは存在しない。むしろ、使い捨てペン送達デバイスは、デバイス内のリザーバに保持された薬学的組成物が事前に充填されている。リザーバに薬学的組成物がなくなると、デバイス全体が廃棄される。
数多くの再利用可能なペンおよび自己注射器送達デバイスが、本発明の薬学的組成物の皮下送達に適用される。例としては、いくつか挙げると、ＡＵＴＯＰＥＮ（登録商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｒｇｈｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（登録商標）Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（登録商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ（登録商標）ＰＲＯ、ＯＰＴＩＰＥＮ（登録商標）ＳＴＡＲＬＥＴ、ならびにＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の薬学的組成物の皮下送達に適用される使い捨てペン送達デバイスの例としては、いくつか挙げると、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（登録商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（登録商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（登録商標）（ＨＵＭＡＬＯＧ（登録商標））、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（登録商標）自己注射器（ＰＥＮＬＥＴ （Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（登録商標）（Ｍｙｌａｎ（登録商標）およびＨＵＭＩＲＡ（登録商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。
有利に、上記の経口または非経口での使用のための薬学的組成物は、活性成分の用量に適合するのに適した単位用量の剤形に調製される。そのような単位用量の剤形には、例えば、錠剤、ピル、カプセル、注射剤（アンプル）、坐薬などが含まれる。含まれる前述の抗体の量は概して、単位用量の剤形あたり約５～約５００ｍｇであり、特に注射剤の形態では、前述の抗体は、約５～約１００ｍｇで、他の剤形については約１０～約２５０ｍｇで含まれることが好ましい。本発明は、本発明の抗体もしくは抗原結合断片、または薬学的に許容される担体を含むその薬学的組成物を含む注射デバイス（例えば、予め充填された注射器または予め充填された自己注射器）またはバイアル（例えば、ガラスまたはプラスチックバイアル）を含む。
抗体の治療的使用
本発明のある特定の実施形態では、本抗体は、鉄欠乏性貧血もしくは鉄欠乏関連障害、または鉄欠乏性貧血もしくは鉄欠乏関連障害に関連する少なくとも１つの症状を治療するのに有用である。本発明の抗体はまた、鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害を発症するリスクがある患者における予防的使用のために企図される。これらの患者には、高齢者、または疾病もしくは免疫抑制治療薬での治療による免疫不全の患者が含まれる。本発明の抗体は、鉄欠乏性貧血もしくは鉄欠乏関連障害を治療するため、または鉄欠乏性貧血もしくは鉄欠乏関連障害に関連する少なくとも１つの症状もしくは合併症を緩和するために、単独で、または第２の薬剤もしくは第３の薬剤と併用して使用され得ることが企図される。第２または第３の薬剤は、本発明の抗体と同時に送達され得るか、またはそれらは、本発明の抗体の前または後のいずれかで別個に投与され得る。本発明の抗体もしくは抗原結合断片またはその薬学的組成物を受容し得る患者には、例えば、ヒト（例えば、高齢のヒト、例えば、６５歳以上）、ウサギ、マウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌ、霊長類、ウマ、またはヒツジなどの哺乳動物などの動物が含まれる。
本発明のある特定の実施形態では、本抗体は、鉄欠乏性貧血もしくは鉄欠乏関連障害、または鉄欠乏性貧血もしくは鉄欠乏関連障害に関連する少なくとも１つの症状を治療するのに有用である。本発明の抗体はまた、鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害を発症するリスクがある患者における予防的使用のために企図される。これらの患者には、高齢者、または疾病もしくは免疫抑制治療薬での治療による免疫不全の患者が含まれる。本発明の抗体は、鉄欠乏性貧血もしくは鉄欠乏関連障害を治療するため、または鉄欠乏性貧血もしくは鉄欠乏関連障害に関連する少なくとも１つの症状もしくは合併症を緩和するために、単独で、または第２の薬剤もしくは第３の薬剤と併用して使用され得ることが企図される。第２または第３の薬剤は、本発明の抗体と同時に送達され得るか、またはそれらは、本発明の抗体の前または後のいずれかで別個に投与され得る。本発明の抗体もしくは抗原結合断片またはその薬学的組成物を受容し得る患者には、例えば、ヒト（例えば、高齢のヒト、例えば、６５歳以上）、ウサギ、マウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌ、霊長類、ウマ、またはヒツジなどの哺乳動物などの動物が含まれる。
本発明のさらなる実施形態では、本抗体は、鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害に罹患している患者を治療するための薬学的組成物の調製に使用される。
併用療法
併用療法は、本発明の抗ＢＭＰ６抗体、および本発明の抗体または本発明の抗体の生物学的に活性な断片と有利に組み合わされ得る任意の追加の治療剤を含み得る。
併用療法は、本発明の抗ＢＭＰ６抗体、および本発明の抗体または本発明の抗体の生物学的に活性な断片と有利に組み合わされ得る任意の追加の治療剤を含み得る。
抗体は、鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害を治療するための当該技術分野において既知である部分またはモダリティ、例えば、限定されないが、鉄サプリメントによる鉄の補充、血清鉄および／または鉄の静脈内送達を促進するための食事の変更、輸血、ならびに鉄促進薬剤などの他の療法と併用して使用され得る。
追加の治療的に活性な構成要素は、本発明の抗ＢＭＰ６抗体の投与の前に、同時に、または投与後に投与され得る。本開示の目的のために、そのような投与レジメンは、１つ以上の追加の治療的に活性な構成要素「と組み合わせて」抗ＢＭＰ６抗体の投与が考慮される。
抗体の診断的使用
本発明の抗ＢＭＰ６抗体はまた、例えば、診断目的のために、試料中のＢＭＰ６を検出および／または測定するために使用され得る。ＢＭＰ６についての例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を本発明の抗ＢＭＰ６抗体と接触させることを含み得、抗ＢＭＰ６抗体は、検出可能な標識もしくはレポーター分子で標識されるか、または患者試料からＢＭＰ６を選択的に単離するための捕捉リガンドとして使用される。あるいは、標識されていない抗ＢＭＰ６抗体は、それ自体が検出可能に標識される二次抗体と組み合わせて診断用途において使用することができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉなどの放射性同位体、フルオレセインイソチオシアナートもしくはローダミンなどの蛍光部分もしくは化学発光部分、またはアルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素であり得る。試料中のＢＭＰ６を検出または測定するために使用することができる具体的な例示的アッセイとしては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
本発明の抗ＢＭＰ６抗体はまた、例えば、診断目的のために、試料中のＢＭＰ６を検出および／または測定するために使用され得る。ＢＭＰ６についての例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を本発明の抗ＢＭＰ６抗体と接触させることを含み得、抗ＢＭＰ６抗体は、検出可能な標識もしくはレポーター分子で標識されるか、または患者試料からＢＭＰ６を選択的に単離するための捕捉リガンドとして使用される。あるいは、標識されていない抗ＢＭＰ６抗体は、それ自体が検出可能に標識される二次抗体と組み合わせて診断用途において使用することができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉなどの放射性同位体、フルオレセインイソチオシアナートもしくはローダミンなどの蛍光部分もしくは化学発光部分、またはアルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素であり得る。試料中のＢＭＰ６を検出または測定するために使用することができる具体的な例示的アッセイとしては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
本発明によるＢＭＰ６診断アッセイにおいて使用することができる試料には、正常なまたは病理学的条件下で、検出可能な量のＢＭＰ６またはその断片のいずれかを含む、患者から得ることのできる任意の組織または体液試料が含まれる。一般に、健康な患者（例えば、鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害に罹患していない患者）から得られた特定の試料中のＢＭＰ６のレベルを測定して、ＢＭＰ６のベースラインまたは標準レベルを最初に確立する。次に、このＢＭＰ６のベースラインレベルを、鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害に関連する状態、またはそのような状態に関連する症状を有することが疑われる個体から得られた試料において測定されたＢＭＰ６のレベルと比較することができる。
ＢＭＰ６に特異的な抗体は、追加の標識または部分を含まない場合があるか、あるいはそれらは、Ｎ末端もしくはＣ末端標識もしくは部分を含む場合がある。一実施形態では、標識または部分は、ビオチンである。結合アッセイにおいて、標識の位置（存在する場合）は、ペプチドが結合する表面に対するペプチドの配向を決定し得る。例えば、表面がアビジンでコーティングされている場合、Ｎ末端ビオチンを含むペプチドは、ペプチドのＣ末端部分が表面に対して遠位になるように配向される。いくつかの実施形態では、標識は、放射性核種、蛍光色素、またはＭＲＩ検出可能な標識などの検出可能な標識であり得る。検出可能な標識は、抗体に連結され得、そのような抗体は、イメージングアッセイで使用され得る。
以下の実施例は、本発明の方法および組成物を作製および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが本発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。別段示されない限り、部分は重量部分であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧またはそれに近い。
実施例１．ＢＭＰ６に対するヒト抗体の生成
ＢＭＰ６に対するヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおいて生成された。マウスを、安定化された完全長ＢＭＰ６タンパク質で免疫化した。
ＢＭＰ６に対するヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスにおいて生成された。マウスを、安定化された完全長ＢＭＰ６タンパク質で免疫化した。
抗体免疫応答を、ＢＭＰ６特異的イムノアッセイにより監視した。所望の免疫応答が達成されたとき、脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、それらの生存能を維持し、ハイブリドーマ細胞株を形成した。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択して、ＢＭＰ６特異的抗体を産生する細胞株を特定した。細胞株を使用して、いくつかの抗ＢＭＰ６キメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを有する抗体）を得た。
上記に開示されるように生成された例示的な抗体は、Ｈ４Ｈ１７８５５ＰおよびＨ４Ｈ１７８７１Ｐと指定した。この実施例の方法によって生成された例示的な抗体の生物学的特性を、以下の実施例においてさらに記載する。
実施例２．重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列
表１は、ＢＭＰ６に特異的な選択された抗体の重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列対、ならびにそれらの対応する抗体識別子を示す。抗体は、典型的には、本明細書において、以下の命名法に従って参照される：Ｆｃ接頭辞（例えば「Ｈ４Ｈ」）、続いて数値識別子（例えば表１に示す「７８５５」）、続いて接尾辞「Ｐ」。したがって、この命名法によれば、抗体は、例えば、「Ｈ４Ｈ１７８５５Ｐ」と称され得る。本明細書で使用される抗体名称のＨ４Ｈ接頭辞は、抗体の特定のＦｃ領域を示す。例えば、「Ｈ４Ｈ」抗体は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを有する。
表１は、ＢＭＰ６に特異的な選択された抗体の重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列対、ならびにそれらの対応する抗体識別子を示す。抗体は、典型的には、本明細書において、以下の命名法に従って参照される：Ｆｃ接頭辞（例えば「Ｈ４Ｈ」）、続いて数値識別子（例えば表１に示す「７８５５」）、続いて接尾辞「Ｐ」。したがって、この命名法によれば、抗体は、例えば、「Ｈ４Ｈ１７８５５Ｐ」と称され得る。本明細書で使用される抗体名称のＨ４Ｈ接頭辞は、抗体の特定のＦｃ領域を示す。例えば、「Ｈ４Ｈ」抗体は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを有する。
実施例３．ＢＭＰ６に対するヒトモノクローナル抗体の結合速度
本発明の精製された抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体に結合するヒトおよびマウスＢＭＰ６の平衡解離定数（ＫＤ値）は、リアルタイム表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー装置ＭＡＳＳ－１を使用して決定された。すべての結合研究は、２５℃および３７℃で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、１μｇ／ｍＬのヘパリン、および０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＨＴ）泳動用緩衝液中で実施した。ＨＣＡセンサー表面は、まず、モノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ、＃ＢＲ１００８３９）をアミン結合することによって誘導体化され、抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体が個別に捕捉された。異なる濃度のヒトＢＭＰ６試薬（ｈＢＭＰ６；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号５０７－ＢＰ；６０ｎＭ～０．９４ｎＭ；４倍連続希釈）またはＨＢＳ－ＥＨＴ泳動用緩衝液中で調製されたマウスＢＭＰ６（ｍＢＭＰ６；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号６３２５－ＢＭ；６０ｎＭおよび１５ｎＭ）を、３０μＬ／分の流量で４分間、捕捉された抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体上に注入する一方で、捕捉された抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体に結合されたＢＭＰ６試薬の解離を、ＨＢＳ－ＥＨＴ泳動用緩衝液中で１０分間監視した。Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０ｃソフトウェアを使用して、リアルタイム結合センサーグラムを、質量移動制限（ｍａｓｓ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）を伴う１：１結合モデルにあてはめることによって、動的会合（ｋａ）および解離（ｋｄ）速度定数を決定した。異なる抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体の結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を、動的速度定数から以下のように計算した：
本発明の精製された抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体に結合するヒトおよびマウスＢＭＰ６の平衡解離定数（ＫＤ値）は、リアルタイム表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー装置ＭＡＳＳ－１を使用して決定された。すべての結合研究は、２５℃および３７℃で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、１μｇ／ｍＬのヘパリン、および０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＨＴ）泳動用緩衝液中で実施した。ＨＣＡセンサー表面は、まず、モノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ、＃ＢＲ１００８３９）をアミン結合することによって誘導体化され、抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体が個別に捕捉された。異なる濃度のヒトＢＭＰ６試薬（ｈＢＭＰ６；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号５０７－ＢＰ；６０ｎＭ～０．９４ｎＭ；４倍連続希釈）またはＨＢＳ－ＥＨＴ泳動用緩衝液中で調製されたマウスＢＭＰ６（ｍＢＭＰ６；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号６３２５－ＢＭ；６０ｎＭおよび１５ｎＭ）を、３０μＬ／分の流量で４分間、捕捉された抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体上に注入する一方で、捕捉された抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体に結合されたＢＭＰ６試薬の解離を、ＨＢＳ－ＥＨＴ泳動用緩衝液中で１０分間監視した。Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０ｃソフトウェアを使用して、リアルタイム結合センサーグラムを、質量移動制限（ｍａｓｓ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）を伴う１：１結合モデルにあてはめることによって、動的会合（ｋａ）および解離（ｋｄ）速度定数を決定した。異なる抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体の結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を、動的速度定数から以下のように計算した：
２５℃および３７℃で本発明の異なる抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体に結合するｈＢＭＰ６またはｍＢＭＰ６の結合速度パラメータを、表２～５に示す。
表２に示すように、２５℃で、本発明の両方の抗体は、ヒトＢＭＰ６に結合し、ＫＤ値は１９５ｐＭおよび３５５ｐＭであった。表３に示すように、３７℃で、本発明の両方の抗体は、ヒトＢＭＰ６に結合し、ＫＤ値は２４０ｐＭおよび１．３４ｎＭであった。表４に示すように、２５℃で、本発明の両方の抗体は、マウスＢＭＰ６に結合し、ＫＤ値は３．３９ｎＭおよび３．５５ｎＭであった。表５に示すように、３７℃で、本発明の両方の抗体は、マウスＢＭＰ６に結合し、ＫＤ値は４．０ｎＭおよび６．４６ｎＭであった。
ＮＢ：現在の実験条件下で結合は観察されなかった。
ＮＢ：現在の実験条件下で結合は観察されなかった。
＃現在の実験条件下では、捕捉された抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体からｈＢＭＰ６の解離は観察されず、ｋｄ
値は、リアルタイム結合センサーグラムをあてはめる場合、手動で１．００Ｅ－０５に固定された。
ＮＢ：現在の実験条件下で結合は観察されなかった。
＊ＮＢは、現在の実験条件下で結合が観察されなかったことを示す。
＃現在の実験条件下では、捕捉された抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体からｈＢＭＰ６の解離は観察されず、ｋｄ
値は、リアルタイム結合センサーグラムをあてはめる場合、手動で１．００Ｅ－０５に固定された。
実施例４．抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体によるＢＭＰ６受容体結合の遮断
抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によるＢＭＰ６の、その受容体、ヘモジュベリン、ＡｃｔＲ２Ａ、またはＡｃｔＲ２Ｂへの結合の遮断を、リアルタイム表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー装置Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００を使用して決定した。すべての結合研究は、２５℃で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、１μｇ／ｍＬのヘパリン、および０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＨＴ）緩衝液中で実施した。
抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によるＢＭＰ６の、その受容体、ヘモジュベリン、ＡｃｔＲ２Ａ、またはＡｃｔＲ２Ｂへの結合の遮断を、リアルタイム表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー装置Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００を使用して決定した。すべての結合研究は、２５℃で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、１μｇ／ｍＬのヘパリン、および０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＨＴ）緩衝液中で実施した。
約１０５００、５０００、および５０００ＲＵの、ヒトＦｃタグ（ｈＨＪＶ－ｈＦｃ；配列番号３７）と共に発現されるヒトヘモジュベリン、Ｃ末端ヒトＦｃタグ（ｈＡｃｔＲ２Ａ－ｈＦｃ；配列番号３８）と共に発現されるヒトＡｃｔＲ２Ａ細胞外ドメイン、Ｃ末端ヒトＦｃタグ（ｈＡｃｔＲ２Ｂ－ｈＦｃ；配列番号３９）と共に発現されるヒトＡｃｔＲ２Ｂ細胞外ドメインを、それぞれ、ＥＤＣ／ＮＨＳ表面化学を使用して、ＣＭ４センサー表面の異なるフローセル上に個別に固定した一方で、活性化／非活性化表面を参照対照表面として使用した。１０ｎＭのヒトＢＭＰ－６の濃度を、実験開始前の少なくとも２時間、４００ｎＭの抗ＢＭＰ－６ｍＡｂと予め混合した。ＢＭＰ６および抗ＢＭＰ６ ｍＡｂの混合物を、５μＬ／分の流量で１０分間、異なる固定化センサー表面上に注入した。固定化された表面への１０ｎＭのＢＭＰ６の結合を使用して、遮断率を評価する一方で、ＢＭＰ６を含まない抗ＢＭＰ６ ｍＡｂの非特異的結合も試験した。
表６に示すように、本発明の抗ＢＭＰ６抗体は、ｈＨＪＶ－ｈＦｃに結合するＢＭＰ６の部分的な遮断を示した。本発明の抗ＢＭＰ６抗体は、ｈＡｃｔＲ２Ａ－ｈＦｃおよびｈＡｃｔＲ２Ｂ－ｈＦｃ表面へのＢＭＰ６の増強された結合を示した。
実施例５．ヘモジュベリンおよびアクチビンＲ２ＡへのＢＭＰ６結合を遮断する抗ＢＭＰ６抗体
ヒトＢＭＰ６の、２つの天然結合パートナー、共受容体ヘモジュベリン（ＨＪＶ）、およびＩＩ型結合受容体、アクチビン受容体２ａ（ＡｃｔＲ２ａ）への結合を遮断する抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体の能力を、２つの競合サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定した。
ヒトＢＭＰ６の、２つの天然結合パートナー、共受容体ヘモジュベリン（ＨＪＶ）、およびＩＩ型結合受容体、アクチビン受容体２ａ（ＡｃｔＲ２ａ）への結合を遮断する抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体の能力を、２つの競合サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定した。
実験で使用したヒトＢＭＰ６タンパク質は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（ｈＢＭＰ６；カタログ番号５０７－ＢＰ／ＣＦ）から購入し、検出目的でビオチン化し（ｂｉｏｔ－ｈＢＭＰ６）、ＢＭＰ６タンパク質は天然に二量体であるため、３０ｋＤａの分子量を計算に使用した。実験で使用されるＨＪＶタンパク質は、リンカー配列で発現されるヒトＨＪＶ細胞外ドメイン（ａａ Ｇｌｎ３６－Ｓｅｒ３９９）の一部分、およびＣ末端におけるヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（ｈＨＪＶ－ｈＦｃ；配列番号３７）で構成された。アクチビンＲ２ａタンパク質は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ｈＡｃｔＲ２ａ－ｈＦｃ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３４０－ＲＣ２）から購入した。アイソタイプ抗体対照は、市販のヤギ抗ｈＢＭＰ６陽性遮断対照抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＡＦ５０７）と共に含まれた。
実験は、次の手順を使用して行った。受容体を、９６ウェルマイクロタイタープレート上で、４℃で一晩、ｈＨＪＶ－ｈＦｃについては５μｇ／ｍＬ、ｈＡｃｔＲ２ａ－ｈＦｃについては２．５μｇ／ｍＬの濃度で、ハンクの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で別個にコーティングした。続いて、ＨＢＳＳ中のＢＳＡの１．０％（ｗ／ｖ）溶液を使用して、非特異的結合部位を遮断した。他のマイクロタイタープレートでは、一定量の２．５ｎＭのｂｉｏｔ－ＢＭＰ６（ＨＪＶ捕捉用）または１．５ｎＭのｂｉｏｔ－ＢＭＰ６（ＡｃｔＲ２ａ捕捉用）タンパク質を、１．０％のＢＳＡおよび３．３３μｇ／ｍＬのヘパリンを含むＨＢＳＳ中の連続希釈において、５．１ｐＭ～３００ｎＭの範囲の抗ＢＭＰ６抗体またはアイソタイプ対照抗体で滴定した。これらの抗体－タンパク質複合体を、１時間のインキュベーション後、ｈＨＪＶ－ｈＦｃまたはｈＡｃｔＲ２ａ－ｈＦｃでコーティングされたマイクロタイタープレートに移した。室温で２時間インキュベートした後、ウェルを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたニュートラビジンでプレートに結合したｂｉｏｔ－ＢＭＰ６を検出した（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３１０３０）。次に、プレートを、製造業者の推奨に従ってＴＭＢ基質溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５２１４）を使用して展開し、４５０ｎｍでの吸光度を、Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ５プレートリーダーで測定した。
データ分析を、Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）内のＳ字状用量応答モデルを使用して実施した。ｈＨＪＶ－ｈＦｃまたはｈＡｃｔＲ２ａ－ｈＦｃへのｂｉｏｔ－ＢＭＰ６結合の５０％を減少させるために必要な抗体の濃度として定義される計算されたＩＣ５０値は、遮断効力の指標として使用された。試験された抗体の示される濃度での遮断率を、それぞれ、プレート上のｈＨＪＶ－ｈＦｃまたはｈＡｃｔＲ２ａ－ｈＦｃへの２．５ｎＭまたは１．５ｎＭのｂｉｏｔ－ＢＭＰ６の結合を遮断する抗体の能力の指標として計算した。計算において、各アッセイの抗体が存在しない一定のｂｉｏｔ－ＢＭＰ６の試料の結合シグナルは、１００％結合または０％遮断として参照され、ｂｉｏｔ－ＢＭＰ６が存在しない緩衝液のみの試料のベースラインシグナルは、０％結合または１００％遮断として参照された。
最大濃度の３００ｎＭの抗体における各抗体の遮断を計算し、比較した。加えて、ＡｃｔＲ２ａへのＢＭＰ６結合の遮断に関して、１１．１ｎＭでの各抗体の遮断が計算され、このアッセイにおけるいくつかの抗体の存在下でのｂｉｏｔ－ＢＭＰ６の増強された結合シグナルを反映するように報告された。
２つのアッセイの遮断結果を表７に要約する。本発明の２つの抗体は、３００ｎＭの抗体でｈＨＪＶ－ｈＦｃに結合する２．５ｎＭのｂｉｏｔ－ＢＭＰ６タンパク質の＞９０％遮断した。Ｈ４Ｈ１７８５５Ｐの遮断効力（ＩＣ５０値）を０．５２２ｎＭで計算し、これは、アッセイの定量の下限の１．２５ｎＭを下回った。ｈＨＪＶ－ｈＦｃに結合するＢＭＰ６タンパク質を遮断するＨ４Ｈ１７８７１ＰのＩＣ５０値は、１．６１ｎＭであった。陽性対照抗ＢＭＰ６商業用Ａｂの効力は２．３２ｎＭであり、９３％が３００ｎＭの抗体で遮断された。比較基準のＡｂは、２．９９ｎＭのＩＣ５０値で遮断され、最大遮断率は８８％であった。予想どおり、アイソタイプ対照抗体は、最大３００ｎＭの抗体濃度で＜３０％遮断した。
Ｈ４Ｈ１７８５５ＰおよびＨ４Ｈ１７８７１Ｐの２つの試験抗体は、それぞれ、１１．１ｎＭで、ｈＡｃｔＲ２ａ－ｈＦｃへのｂｉｏｔ－ＢＭＰ６タンパク質結合を２９．８％および１５．５％増強した一方で、３００ｎＭの抗体で１９．５％および３７．３％遮断した。陽性対照抗ＢＭＰ６商業用Ａｂは、１１．８ｎＭのＩＣ５０で、９２．８％遮断した。比較基準のＡｂは、３００ｎＭで＞３０％遮断したが、Ｓ字状曲線を有さなかったため、ＩＣ５０値は報告されなかった。予想どおり、アイソタイプ対照抗体は、＜３０％遮断した。
ＩＣは、非Ｓ字状遮断曲線に起因する不確定なＩＣ５０値を示す
ＮＢは非遮断（＜３０％）を示した
＊は、ＢＭＰ６遮断ＨＪＶアッセイの定量下限の１．２５Ｅ－０９Ｍを下回る値を示す。
ＮＢは非遮断（＜３０％）を示した
＊は、ＢＭＰ６遮断ＨＪＶアッセイの定量下限の１．２５Ｅ－０９Ｍを下回る値を示す。
実施例６．抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体の結合交差反応性。
抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体のＢＭＰ６ファミリーメンバー（ヒト：ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８Ａ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１２、ＢＭＰ１４、ＢＭＰ３ｂ、アクチビンＡ、およびＧＤＦ３、ならびにマウス：ＢＭＰ６およびＧＤＦ６）への結合交差反応性を、Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸ装置を使用して、リアルタイムバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）バイオセンサーを使用して決定した。すべての結合研究は、プレートを１０００ｒｐｍの速度で振盪しながら、２５℃で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、５０μｇ／ｍＬのヘパリン、および０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＢＨＴ）緩衝液中で実施された。結合交差反応性を評価するために、まず、プロテインＡでコーティングされたＯｃｔｅｔバイオセンサー（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．、＃１８－５０１０）を、２０μｇ／ｍＬの抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体を含むウェルに４分間浸漬し、続いて、１００ｎＭの異なるＢＭＰ６ファミリーメンバーを含むウェルに４分間浸漬した。バイオセンサーは、実験の各ステップ間にＨＢＳ－ＥＢＨＴ緩衝液中で洗浄された。各サイクルの終わりに、プロテインＡバイオセンサーを、１０ｍＭのグリシンｐＨ２．０への５秒間の浸漬、およびＨＢＳ－ＥＢＨＴ緩衝液への１０秒間の浸漬を交互に３回使用して再生した。リアルタイム結合応答を実験の過程の間監視し、各ステップの終了時の結合応答を記録し、表８Ａおよび８Ｂに示されるように表にした。
抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体のＢＭＰ６ファミリーメンバー（ヒト：ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８Ａ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１２、ＢＭＰ１４、ＢＭＰ３ｂ、アクチビンＡ、およびＧＤＦ３、ならびにマウス：ＢＭＰ６およびＧＤＦ６）への結合交差反応性を、Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸ装置を使用して、リアルタイムバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）バイオセンサーを使用して決定した。すべての結合研究は、プレートを１０００ｒｐｍの速度で振盪しながら、２５℃で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、５０μｇ／ｍＬのヘパリン、および０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４（ＨＢＳ－ＥＢＨＴ）緩衝液中で実施された。結合交差反応性を評価するために、まず、プロテインＡでコーティングされたＯｃｔｅｔバイオセンサー（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．、＃１８－５０１０）を、２０μｇ／ｍＬの抗ＢＭＰ６モノクローナル抗体を含むウェルに４分間浸漬し、続いて、１００ｎＭの異なるＢＭＰ６ファミリーメンバーを含むウェルに４分間浸漬した。バイオセンサーは、実験の各ステップ間にＨＢＳ－ＥＢＨＴ緩衝液中で洗浄された。各サイクルの終わりに、プロテインＡバイオセンサーを、１０ｍＭのグリシンｐＨ２．０への５秒間の浸漬、およびＨＢＳ－ＥＢＨＴ緩衝液への１０秒間の浸漬を交互に３回使用して再生した。リアルタイム結合応答を実験の過程の間監視し、各ステップの終了時の結合応答を記録し、表８Ａおよび８Ｂに示されるように表にした。
実施例７．Ｈｅｐ３Ｂ／ＢＲＥ－ｌｕｃ細胞（ヒトＢＭＰ６）またはＷ－２０－１７／ＢＲＥ－ｌｕｃ細胞（マウスＢＭＰ６）を用いたバイオアッセイにおけるＢＭＰ６活性化の抗体阻害試験
細胞株を操作して、ルシフェラーゼレポーター［ＢＭＰ応答性エレメント（ＢＲＥ（２×）－ルシフェラーゼ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ）］を安定して発現させ、ＧＦＰの高発現について選別して、ＢＭＰ６シグナル伝達の調節を検出した。ヒトＢＭＰ６（ｈＢＭＰ６）を試験するために、ヒト肝細胞癌腫細胞株であるＨｅｐ３Ｂ２．１－７細胞（以下、Ｈｅｐ３Ｂ細胞と称する）を使用し、マウスＢＭＰ６（ｍＢＭＰ６）を試験するために、以前にＢＭＰ２に応答性であることが示されたマウス骨髄間質細胞株であるＷ－２０－１７細胞（Ｔｈｉｅｓら、１９９２）を使用した。得られたレポーター細胞株は、Ｈｅｐ３Ｂ／ＢＲＥ－ｌｕｃ細胞およびＷ－２０－１７／ＢＲＥ－ｌｕｃ細胞と称される。Ｈｅｐ３Ｂ／ＢＲＥ－ｌｕｃ細胞を、ＭＥＭ、１０％のＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ－グルタミン、ＮＥＡＡ、およびピルビン酸ナトリウムで構成される培地中に維持し（この培地はＨｅｐ３Ｂ培地と称される）、Ｗ－２０－１７／ＢＲＥ－ｌｕｃ細胞を、１０％のＦＢＳ、ＤＭＥＭ、ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミン、および２００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８で構成される培地中に維持した（この培地はＷ－２０－１７培地と称される）。
細胞株を操作して、ルシフェラーゼレポーター［ＢＭＰ応答性エレメント（ＢＲＥ（２×）－ルシフェラーゼ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ）］を安定して発現させ、ＧＦＰの高発現について選別して、ＢＭＰ６シグナル伝達の調節を検出した。ヒトＢＭＰ６（ｈＢＭＰ６）を試験するために、ヒト肝細胞癌腫細胞株であるＨｅｐ３Ｂ２．１－７細胞（以下、Ｈｅｐ３Ｂ細胞と称する）を使用し、マウスＢＭＰ６（ｍＢＭＰ６）を試験するために、以前にＢＭＰ２に応答性であることが示されたマウス骨髄間質細胞株であるＷ－２０－１７細胞（Ｔｈｉｅｓら、１９９２）を使用した。得られたレポーター細胞株は、Ｈｅｐ３Ｂ／ＢＲＥ－ｌｕｃ細胞およびＷ－２０－１７／ＢＲＥ－ｌｕｃ細胞と称される。Ｈｅｐ３Ｂ／ＢＲＥ－ｌｕｃ細胞を、ＭＥＭ、１０％のＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ－グルタミン、ＮＥＡＡ、およびピルビン酸ナトリウムで構成される培地中に維持し（この培地はＨｅｐ３Ｂ培地と称される）、Ｗ－２０－１７／ＢＲＥ－ｌｕｃ細胞を、１０％のＦＢＳ、ＤＭＥＭ、ペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミン、および２００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８で構成される培地中に維持した（この培地はＷ－２０－１７培地と称される）。
ｈＢＭＰ６バイオアッセイについては、Ｈｅｐ３Ｂ／ＢＲＥ－ｌｕｃ細胞を、１０，０００細胞／ウェルでＨｅｐ３Ｂ培地中の９６ウェルアッセイプレートに播種し、５％のＣＯ２中で３７℃で一晩インキュベートした。翌日、Ｈｅｐ３Ｂ培地をＨｅｐ３Ｂ細胞から除去し、ＭＥＭ、１％のＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ－グルタミン、ＮＥＡＡ、およびピルビン酸ナトリウムで構成される培地に置き換え、次いで５％のＣＯ２中で３７℃でさらに６時間インキュベートした後、ＢＭＰ６およびアッセイ培地（ＭＥＭ、０．１％のＢＳＡ、ペニシリン／ストレプトマイシン＋Ｌ－グルタミンで構成される培地）中に希釈した抗体を細胞に添加した。ｍＢＭＰ６バイオアッセイについては、Ｗ－２０－１７／ＢＲＥ－ｌｕｃ細胞を、１０，０００細胞／ウェルでＷ－２０－１７培地中の９６ウェルアッセイプレートに播種し、５％のＣＯ２中で３７℃で一晩インキュベートした。ＤＭＥＭ、０．１％のＢＳＡ、およびペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ－グルタミンで構成されるアッセイ培地中で、ＢＭＰ６および抗体を翌日細胞に添加した。
ＢＭＰ６活性化のために、ヒトＢＭＰ６（ｈＢＭＰ６；Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号５０７－ＢＰ／ＣＦ）またはマウスＢＭＰ６（ｍＢＭＰ６；Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号６３２５－ＢＭ／ＣＦ）を、３００ｎＭ～０．００５ｎＭに１：３で連続希釈し、用量応答のためのＢＭＰ６対照を含まない細胞に添加した。ＢＭＰ６の抗体阻害については、抗体は、１０００ｎＭ～０．０２ｎＭまたは１００ｎＭ～０．００２ｎＭのいずれかに１：３で段階希釈し、１ｎＭのｈＢＭＰ６または５ｎＭのｍＢＭＰ６のいずれかと混合した。すべての抗体用量応答に、抗体対照は含まれなかった。次に、これらの抗体／ＢＭＰ６混合物を、２５℃で３０分間インキュベートし、細胞に添加した。細胞を、Ｈｅｐ３Ｂ／ＢＲＥ－ｌｕｃ細胞については３７℃および５％のＣＯ２で一晩、またはＷ－２０－１７／ＢＲＥ－ｌｕｃ細胞については５．５時間インキュベートした。これらのインキュベーションの終了時に、細胞を２５℃で１５分間インキュベートし、続いてＯｎｅＧｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ６１３０）を添加して、細胞に存在するルシフェラーゼの量を測定した。プレートを、ＯｎｅＧｌｏ（商標）の添加の４分後に、Ｖｉｃｔｏｒ（商標）Ｘ装置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により、発光について読み取り、結果を、Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて非線形回帰（４パラメータロジスティクス）を使用して分析して、ＥＣ５０およびＩＣ５０値を得た。０～１００％の阻害が、阻害剤を含まない１～１ｎＭのｈＢＭＰ６または０～５ｎＭのｍＢＭＰ６のいずれかの阻害範囲であるように、抗体の阻害を計算した。
表９に示すように、本発明の抗ＢＭＰ６抗体の両方は、Ｈｅｐ３Ｂ／ＢＲＥ－ｌｕｃ細胞の１ｎＭのｈＢＭＰ６媒介性活性化の完全な阻害を示した。ｈＢＭＰ６阻害のＩＣ５０値は、０．２５ｎＭ～１．６ｎＭの範囲であった。比較基準Ａｂは、０．５３ｎＭのＩＣ５０値で、１ｎＭのｈＢＭＰ６の完全な阻害を示した。０．９４ｎＭおよび０．３３ｎＭのＥＣ５０値を有する、ｈＢＭＰ６活性化Ｈｅｐ３Ｂ／ＢＲＥ－ｌｕｃ細胞の用量応答。
表９に示すように、本発明の抗ＢＭＰ６抗体の両方は、Ｗ－２０－１７／ＢＲＥ－ｌｕｃ細胞の５ｎＭのｍＢＭＰ６媒介性活性化の完全な阻害を示した。ｍＢＭＰ６阻害のＩＣ５０値は、１．９ｎＭ～１１ｎＭの範囲であった。比較基準Ａｂは、１．９ｎＭのＩＣ５０で、５ｎＭのｍＢＭＰ６の完全な阻害を示した。１．２ｎＭおよび１．３ｎＭのＥＣ５０値を有する、ｍＢＭＰ６活性化Ｗ－２０－１７／ＢＲＥ－ｌｕｃ細胞の用量応答。
アイソタイプ対照抗体は、ヒトＢＭＰ６またはマウスＢＭＰ６のいずれの阻害も示さなかった。
実施例８．インビボでのマウス実験、Ｂｍｐ６抗体処置（Ｈ４Ｈ１７８５５Ｐ）後の血清ヘプシジンおよび鉄レベル
血清の増加および血清ヘプシジンの減少における本発明のＢＭＰ６抗体の有効性を決定するために、マウスＢＭＰ６およびＨＪＶの代わりにヒトＢＭＰ６およびＨＪＶの発現についてホモ接合のマウスにおいてインビボ実験を実施した。研究のため、１群あたり５または６匹のマウスは、１および３日目に１０または２０ｍｇ／ｋｇのいずれかで２用量の抗体を受容した。５日目にマウスを屠殺し、血清を採取して、ヘプシジンおよび鉄レベルを測定した。
血清の増加および血清ヘプシジンの減少における本発明のＢＭＰ６抗体の有効性を決定するために、マウスＢＭＰ６およびＨＪＶの代わりにヒトＢＭＰ６およびＨＪＶの発現についてホモ接合のマウスにおいてインビボ実験を実施した。研究のため、１群あたり５または６匹のマウスは、１および３日目に１０または２０ｍｇ／ｋｇのいずれかで２用量の抗体を受容した。５日目にマウスを屠殺し、血清を採取して、ヘプシジンおよび鉄レベルを測定した。
表１０ならびに図１および２に示すように、本発明のＢＭＰ６抗体であるＨ４Ｈ１７８５５Ｐを受容したマウスは、１０ｍｇ／ｋｇでアイソタイプ対照抗体を受容したマウスと比較して、血清鉄が増加し、血清ヘプシジンが減少した。ＢＭＰ６抗体の用量依存効果があり、１０ｍｇ／ｋｇと比較して、２０ｍｇ／ｋｇで血清鉄の増加およびヘプシジンの減少を示した。
実施例９．インビボでのマウス実験、Ｂｍｐ６抗体処置（Ｈ４Ｈ１７８７１Ｐ）後の血清ヘプシジンおよび鉄レベル
血清の増加および血清ヘプシジンの減少における本発明のＢＭＰ６抗体の有効性を決定するために、マウスＢＭＰ６およびＨＪＶの代わりにヒトＢＭＰ６およびＨＪＶの発現についてホモ接合のマウスにおいてインビボ実験を実施した。研究のため、１群あたり７匹のマウスは、１日目に５ｍｇ／ｋｇの抗体の１ｓ．ｃ．用量を受容した。５日目にマウスを屠殺し、血清を採取して、ヘプシジンおよび鉄レベルを測定した。
血清の増加および血清ヘプシジンの減少における本発明のＢＭＰ６抗体の有効性を決定するために、マウスＢＭＰ６およびＨＪＶの代わりにヒトＢＭＰ６およびＨＪＶの発現についてホモ接合のマウスにおいてインビボ実験を実施した。研究のため、１群あたり７匹のマウスは、１日目に５ｍｇ／ｋｇの抗体の１ｓ．ｃ．用量を受容した。５日目にマウスを屠殺し、血清を採取して、ヘプシジンおよび鉄レベルを測定した。
血清鉄レベルは、ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ鉄アッセイキット（ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＤＩＦＥ－２５０）を使用して測定した。血清ヘプシジンは、Ｈｅｐｃｉｄｉｎ Ｍｕｒｉｎｅ－Ｃｏｍｐｅｔｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ ＨＭＣ－００１）を使用して測定した。
表１１ならびに図３および４に示すように、本発明のＢＭＰ６抗体であるＨ４Ｈ１７８７１Ｐを受容したマウスは、アイソタイプ対照抗体を受容したマウスと比較して、血清鉄が増加し、血清ヘプシジンが減少した。
Claims (22)
- ヒト骨形成タンパク質６（ＢＭＰ６）に特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体または抗原結合断片が、
（ａ）表面プラズモン共鳴により測定された場合、３７℃で、約２ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）でヒトＢＭＰ６に結合する、
（ｂ）表面プラズモン共鳴により測定された場合、３７℃で、約１３０分超の解離半減期（ｔ１／２）でヒトＢＭＰ６に結合する、
（ｃ）表面プラズモン共鳴により測定された場合、２５℃で、約０．４ｎＭ未満のＫＤでヒトＢＭＰ６に結合する、
（ｄ）表面プラズモン共鳴により測定された場合、２５℃で、約１８０分超のｔ１／２で、ヒトＢＭＰ６に結合する、および
（ｅ）ヒトＢＭＰ６とヒトヘモジュベリン（ＨＪＶ）との間の相互作用を遮断する、からなる群から選択される１つ以上の特性を呈する、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。 - ヒトＢＭＰ６に特異的に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体または抗原結合断片が、配列番号１および３からなる群から選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のいずれか１つ内に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、配列番号２および４からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のいずれか１つ内に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）と、を含む、単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体または抗原結合断片が、配列番号１および３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを含む、請求項１または２に記載の単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体または抗原結合断片が、配列番号２および４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号１および３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、（ｂ）配列番号２および４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体または抗原結合断片が、
（ａ）配列番号５および１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１ドメイン、
（ｂ）配列番号６および１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２ドメイン、
（ｃ）配列番号７および１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３ドメイン、
（ｄ）配列番号８および１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１ドメイン、
（ｅ）配列番号９および１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２ドメイン、ならびに／または
（ｆ）配列番号１０および１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３ドメインを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片。 - 前記抗体または抗原結合断片が、配列番号１／３および２／４からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体または抗原結合断片。
- 前記抗体または抗原結合断片が、
（ｉ）配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および
配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリン、ならびに／または
（ｉｉ）配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖免疫グロブリン、および
配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖免疫グロブリンを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離されたヒト抗体または抗原結合断片。 - 前記抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、またはｄＡｂ断片である、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗原結合断片。
- 参照抗体とヒトＢＭＰ６上の同一のエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１および３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号２および４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲと、を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
- ヒトＢＭＰ６への結合について参照抗体と競合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１および３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、ならびに配列番号２および４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
- 請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片を作製するための方法であって、
（ｉ）前記抗体または断片の免疫グロブリン軽鎖および前記抗体または断片の免疫グロブリン重鎖をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することと、
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドの発現に有利な条件下で、成長培地中で前記宿主細胞を培養することと、
（ｉｉｉ）任意選択的に、前記宿主細胞および／または前記宿主細胞が成長している培地から前記抗体または断片を単離することと、を含む、方法。 - 請求項１２に記載の方法の生成物である、抗体または抗原結合断片。
- 請求項１～１１および１３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片を含む、注射デバイスまたは容器。
- 請求項１～１１および１３のいずれか一項に記載のヒトＢＭＰ６に結合する単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体または希釈剤と、任意選択的に、１つ以上の追加の治療剤と、を含む、薬学的組成物。
- 鉄サプリメントである前記追加の治療剤を含む、請求項１５に記載の薬学的組成物。
- 鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害の予防または治療を必要とする患者において鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害を予防または治療するための方法であって、有効量の、請求項１～１１および１３のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項１５もしくは１６に記載の薬学的組成物を前記患者に投与することを含む、方法。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、皮下、静脈内、皮内、経口、または筋肉内に投与される、請求項１７に記載の方法。
- 前記鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害が、極度の疲労、脱力感、青白い皮膚、胸痛、速い心拍、心臓の動悸、息切れ、頭痛、めまい、意識朦朧、手の冷え、足の冷え、舌の炎症、および下肢静止不能からなる群から選択される状態をもたらし、
前記抗体または抗原結合断片の投与が、前記状態を治療するか、または前記状態のうちの１つ以上の症状の重症度を低減する、請求項１７または１８に記載の方法。 - 鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害を有する患者の治療に使用するための、請求項１～１１および１３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害の治療に使用するための、請求項１～１１および１３のいずれか一項に記載の１つ以上の抗体またはその抗原結合断片を含む、組成物。
- 鉄欠乏性貧血または鉄欠乏関連障害を有する患者を治療するための薬剤の製造における、請求項１～１１および１３のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片の使用。
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