ME02093B - Antitijela za humani receptor programirane smrti pd-1 - Google Patents

Description

OSNOVA PRONALASKA

Receptor programirane smrti 1 (PD-1) je imunoinhibitomi receptor koji je primamo eksprimiran na aktiviranim T i B ćelijama. Pokazano je da interakcija sa njegovim ligandima slabi T-ćelijske odgovore kako in vitro tako i in vivo. Pokazano je da blokada interakcije između PD-1 i jednog od njegovih liganada, PD-L1, pojačava tumor-specifičan CD8+ T- ćelijski imunitet i može prema tome biti korisna u klirensu tumorskih ćelija od strane imunog sistema.

PD-1 (kodiran genom Pdcdl) je član porodice imunoglobulina povezan sa CD28, i CTLA-4. Pokazano je da PD-1 negativno reguliše prenos singala preko receptora antigena posle zauzeća njegovih liganada (PD-L1 i/ili PD-L2). Struktura mišjeg PD-1 je određena kao i ko-kristalna struktura mišjeg PD-1 sa humanim PD-L1 (Zhang, X. et al., Immunity 20: 337- 347 (2004); Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 3011-6 (2008)). PD-1 i slični članovi porodice su transmembranski glikoproteini tipa I koji sadrže domen varijabilnog tipa Ig (V- tipa) odgovoran za vezivanje Uganda i citoplazmatični rep koji je odgovoran za vezivanje signalnih molekula. Citoplazmatični rep PD-1 sadrži dva signalna motiva na bazi tirozina, ITIM (inhibitomi motiv imunoreceptora na bazi tirozina) i ITSM (prekidački motiv imunoreceptora na bazi tirozina).

Posle stimulacije T ćelija, PD-1 regrutuje tirozin fosfatazu SHP-2 do ITSM motiva unutar njegovog citoplazmatičnog repa, što dovodi do defosforilacije efektomih molekula kao što su CD3 zeta, PKC teta i ZAP70 koji su uključeni u CD3 T ćelijsku signalnu kaskadu. Mehanizam pomoću koga PD-1 nishodno modulira T ćelijske odgovore je sličan, ali poseban od onog kod CTLA-4, jer oba molekula regulišu preklapajući set signalnih proteina (Parry et al., Mol. Cell Biol. 25: 9543-9553.). Bennett i saradnici su pokazali daje PD-1-posredovana inhibicija T-ćelijskog prenosa efikasna samo kada su i aktivirajući i inhibitomi signal na istoj površini, što ukazuje na to da je mehanizam prenosa signala PD-1 prostorno-vremenski određen (Bennett F. et al., J Immunol. 170:711-8 (2003)).

[0004J Pokazano je daje PD-1 eksprimiran na aktivnim limfocitima (periferne CD4+ i CD8+ T ćelije, B ćelije i monociti) i takođe je pokazano daje eksprimiran u toku timičnog razvoja na CD4 CD8' (dvostruko negativnim) T ćelijama kao i NK-T ćelijama.

Ugandi za PD-1 (PD-L1 i PD-L2) su konstitutivno eksprimirani ili mogu biti indukovani u različitim ćelijskim tipovima, uključujući ne-hematopoetička tkiva kao i različite tipove tumora. PD-L1 je eksprimiran na B, T, mijeloidnim i dendritskim ćelijama (DCs), ali takođe na perifernim ćelijama, kao što su mikrovaksulame endotelijalne ćelije i ne- limfoidnim organima kao što su srce, pluća itd. Nasuprot tome, PD-L2 se nalazi samo na makrofagima i DCs. Ekspresioni obrazac PD-1 liganada je sugestivan za ulogu PD-1 u održavanju periferne tolerancije i može da služi za regulaciju auto-reaktivnih T- i B-ćelijskih odgovora u periferiji. Oba Uganda su transmembranski receptori tipa I koji sadrže i IgV- i IgC-slične domene u ekstracelulamom regionu. Oba Uganda sadrže kratke citoplazmatične domene bez poznatih signalnih motiva.

Do danas, brojne studije su pokazale da interakcija PD-1 sa njegovim ligandima dovodi do inhibicije proliferacije limfocita in vitro i in vivo. Pokazano je da prekid PD-l/PD- L1 interakcije povećava T ćelijsku proliferaciju i proizvodnju citokina i blokira napredovanje ćelijskog ciklusa. Početna analiza Pdcdl'1' miševa nije identifikovala nikakav drastičan imunološki fenotiop. Međutim, stariji miševi su razvili spontane autoimune bolesti koje se razlikuju prema soju na koji je deficijencija Pdcdl povratno ukrštena. One obuhvataju lupusu sličan proliferativni artritis (C57BL/6) (Nishimura H. et al., Int. Immunol. 10: 1563-1572 (1998)), fatalnu kardiomiopatiju (BALB/c) (Nishimura H. et ah, Science 291: 319-322

(2001) ) i dijabetes tipa I (NOD) (Wang J. et ah, Proc. Nath Acad. Sci. U.S.A 102: 11823- 11828 (2005)). Cekopuno, analiza ,,knockout“ životinja dovela je do razumevanja da PD-1 funkcioniše uglavnom u indukciji i regulaciji periferne tolerancije. Na taj način, terapeutska blokada PD-1 puta može biti korisna u prevazilaženju imune tolerancije. Takva selektivna blokada može biti od koristi u lečenju kancera ili infekcije kao i u jačanju imuniteta u toku vakcinacije (profilaktičke ili terapeutske).

Uloga PD-1 kod kancera je ustanovljena u literaturi. Poznato je da mikro-sredina tumora može da štiti ćelije tumora od efikasne imune destrukcije. Nedavno je pokazano daje PD-L1 eksprimiran na određenom broju mišjih i humanih tumora (i inducibilan je pomoću IFN gama na većini PD-L1 negativnih tumorskih ćelijskih linija) i pretpostavljeno je da posreduje u imunom odgovoru (Iwai Y. et ah, Proc. Nath Acad. Sci. U.S.A. 99: 12293-12297

(2002) ; Strome S.E. et ah, Cancer Res., 63: 6501-6505 (2003).

Kod ljudi, ekspresija PD-1 (na limfocitima koji infiltriraju tumor) i/ili PD-Ll (na tumorskim ćelijama) nađena je u određenom broju primarnih biopsija tumora procenjenih pomoću imunohistohemije. Takva tkiva obuhvataju kancere pluća, jetre, jajnika, grlića materice, kože, debelog creva, gliom, bešike, dojke, bubrega, jednjaka, želudca, oralni skvamoznih ćelija, urotelijalnih ćelija i pankreasa kao i tumore glave i vrata (Brown J.A. et al„ J. Immunol. 170: 1257-1266 (2003); Dong H. et al„ Nat. Med. 8: 793-800 (2002); Wintterle et al., Cancer Res. 63: 7462-7467 (2003); Strome S.E. et ah, Cancer Res., 63: 6501- 6505 (2003); Thompson R.H. et ah, Cancer Res. 66: 3381-5 (2006); Thompson et ah, Clin. Cancer Res. 13: 1757-61 (2007); Nomi T. et ah, Clin. Cancer Res. 13: 2151-7. (2007)). Značajnije, ekspresija PD-liganda na ćelijama tumora je korelisana sa slabom prognozom pacijenata sa kancerom kod višestrukih tipova tumora (prikazano u Okazaki and Honjo, Int. Immunol. 19: 813-824 (2007)).

Blokada PD-1/PD-L1 interakcije bi mogla da dovede do pojačanog tumor-specifičnog T-ćelijskog imuniteta i prema tome bi bila korisna u klirensu tumorskih ćelija od strane imunog sistema. Da bi se delovalo na ovo tkivo, izveden je određeni broj studija. U mišjem modelu agresivnog kancera pankreasa, T. Nomi et ah (Clin. Cancer Res. 13: 2151-2157 (2007)) pokazali su terapeutsku efikasnost blokade PD-1/PD-L1. Primena antitela usmerenog na PD-1 ili PD-L1 značajno je inhibirala rast tumora. Blokada antitela je efikasno stimulisala infiltraciju tumorski reaktivnih CD8+ T ćelija u tumor rezultirajući u ushodnojh regulaciji anti-tumorskih efektora uključujući IFN gama, granzim B i perforin. Pored toga, autori su pokazali da blokada PD-1 može biti efikasno kombinovana sa hemoterapijom da bi se proizveo sinergistički efekat. U sledećoj studiji, gde se koristi model karcinoma skvamoznih ćelija kod miševa, blokada PD-1 ili PD-L1 antitelom značajno je inhibirala rast tumora (Tsushima F. et ah, Oral Oncol. 42: 268-274 (2006)).

U drugim studijama, transfekcija linije mišjeg mastocitoma sa PD-L1 dovela je do smanjene liže tumorskih ćelija kada je ko-kultivisana sa tumor-specifičnim CTL klonom. Liza je povraćena kada je dodato anti-PD-Ll mAb (Iwai Y. et ah, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 12293-12297 (2002)). In vivo, pokazano je da blokiranje PD1/PD-L1 interakcije povećava efikasnost terapije adoptivnim T ćelijskim transferom u mišjem modelu tumora (Strome S.E. et ah, Cancer Res. 63: 6501-6505 (2003)). Dodatni dokaz za ulogu PD-1 u lečenju kancera dolazi iz eksperimenata izvedenih sa PD-1 ,,knockout“ miševima. Ćelije mijeloma koje eksprimiraju PD-L1 rasle su samo u životinjama divljeg tipa (rezultirajući u rastu tumora i sa njim povezanom smrću), ali ne i kod miševa deficijentnih u PD-1 (Iwai Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 12293-12297 (2002)).

U humanim studijama, R.M. Wong et al. (Int. Immunol. 19: 1223-1234 (2007)) pokazali su da je blokada PD-1 upotrebom potpuno humanog anti-PD-1 antitela povećala apsolutne brojeve tumor-specifičnih CD8+ T ćelija (CTLs) u ex vivo testovima stimulacije upotrebom antigena vakcine i ćelija iz vakcinisanih individua. U sličnoj studiji, blokada PD- L1 antitelom je rezultirala u pojačanoj citolitičkoj aktivnosti tumor-povezanih antigen- specifičnih citotoksičnih T ćelija i povećala je proizvodnju citokina od strane tumor- specifičnih Th ćelija (Blank C. et al., Int. J. Cancer 119: 317-327 (2006)). Isti autori su pokazali da blokada PD-L1 povećava tumor-specifične T ćelijske odgovore in vitro kada se koristi u kombinaciji sa anti-CTLA-4 blokadom.

Ukupno, PD-1/PD-L1 put je dobro-provereno ciljno mesto za razvoj lekova u vidu antitela za lečenje kancera. Anti-PD-1 antitela takođe mogu biti korisna kod hronične virusne infekcije. Memorijske CD8+ T ćelije generisane posle akutne virusne infekcije su visoko funkcionalne i čine važnu komponentu zaštitnog imuniteta. Nasuprot tome, hronične infekcije su često okarakterisane različitim stepenima funkcionalnog oštećenja (iscrpljenosti) virus- specifičnih T-ćelijskih odgovora, i ovaj nedostatak je glavni razlog za nesposobnost domaćina da eliminiše postojećeg patogena. Iako su funkcionalne efektome T ćelije inicijalno generisane u toku ranih stadijuma infekcije, one postepeno gube funkciju u toku hronične infekcije. Barber et al. (Barber et al., Nature 439: 682-687 (2006)) su pokazali da su miševi inficirani laboratorijskim sojem LCMV razvili hroničnu infekciju koja je rezultirala u visokim nivoima virusa u krvi i drugim tkivima. Ovi miševi su početno razvili snažan T ćelijski odgovor, ali su konačno podlegli infekciji posle iscrpljivanja T ćelija. Autori su našli da je pad u broju i funkciji efektomih T ćelija u hronično inficiranim miševima mogao biti poništen injektiranjem antitela koje je blokiralo interakciju između PD-1 i PD-L1.

Nedavno, pokazano je da je PD-1 visoko eksprimiran na T ćelijama iz individua inficiranih sa HIV i da je ekspresija receptora u korelaciji sa oštećenom T ćelijskom funkcijom i napredovanjem bolesti (Day et al., Nature 443:350-4 (2006).; Trautmann L. et al., Nat. Med. 12: 1198-202 (2006)). U obe studije, blokada Uganda PD-L1 značajno je povećala ekspanziju HIV-specifičnih ćelija koje proizvode IFN-gama.

Druge studije takođe ukazuju na značaj PD-1 puta u kontroli virusne infekcije. PD-1 ,,knockout“ miševi su pokazali bolju kontrolu infekcije adenovirusom od miševa divljeg tipa (Iwai et al., J. Exp. Med. 198:39-50 (2003)). Takođe, adoptivni transfer HBV-specifičnih T ćelija u HBV transgene životinje inicirao je hepatitis (Isogawa M. et al., Immunity 23:53-63 (2005)). Bolest ovih životinja oscilira kao posledica prepoznavanja antigena u jetri i ushodne regulacije PD-1 od strane ćelija jetre.

WO 2006/121 168 navodi monoklonalna antitela, naročito humana monoklonalna antitela, koja se specifično vezuju za PD-1 sa visokim afinitetom i njihovu upotrebu za lečenje bolesti.

Takođe, US 2006/210 567 Al navodi antitela i/ili antagonist PD-1 i njihove kompozicije. U US 2006/210 567 Al navedeno je da takve kompozicije mogu na primer biti korišćene u lečenju autoinflamatomih bolesti.

KRATAK REZIME PRONALASKA

Pronalazak daje izolovana antitela i fragmente antitela koji se vezuju za humani i makaki PD-1. U nekim varijantama, antitelo ili fragment antitela blokira vezivanje humanog PD-L1 i humanog PD-L2 za humani PD-1. PD-1 antitelo ili fragment antitela prema pronalasku obuhvataju CDR regione (regioni antitela koji određuju komplementarnost) iz sekv. id. br.: 15, 16, 17, 18, 19 i 20; ono obuhvata CDR regione teškog lanca iz sekv. id. br.: 18, 19 i 20 i CDR regione lakog lanca iz sekv. id. br.: 15, 16 i 17. U nekim varijantama, antitelo ili fragment antitela je himemo antitelo, humano antitelo, humanizovano antitelo ili njegov fragment.

Navedeno je izolovano antitelo ili fragment antitela koje/koji se vezuje za humani PD- 1 i koje/koji sadrži: laki lanac koji sadrži CDR regione sekv. id. br.: 9. 10 i 11, ili varijante bilo koje od navedenih sekvenci; i/ili težak lanac koji sadrži CDR regione sekv. id. br.: 12, 13 i 14, ili varijante bilo koje od navedenih sekvenci.

U jednoj varijanti, opis daje izolovano antitelo ili fragment antitela koje/koji se vezuje za humani PD-1 i koje/koji sadrži: laki lanac koji sadrži CDR regione sekv. id. br.: 15, 16 i 17 ili varijante bilo koje od navedenih sekvenci; i/ili težak lanac koji sadrži CDR regione sekv. id. br.: 18, 19 i 20, ili varijante bilo koje od navedenih sekvenci.

Takođe, opisano je antitelo ili fragment antitela koji se vezuje za antigen koje/koji sadrži varijabilni region teškog lanca sekv. id. br.: 5 ili njenu varijantu; i/ili varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekv. id. br.: 6 ili njenu varijantu.

U jednoj varijanti, pronalazak sadrži antitelo ili fragment antitela koje/koji se vezuje za antigen i koje/koji sadrži varijabilni region teškog lanca sekv. id. br.: 7 ili njenu varijantu i/ili varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekv. id. br.: 8 ili njenu varijantu.

U jednoj varijanti, pronalazak sadrži antitelo ili fragment antitela koje/koji se vezuje za antigen i koje/koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 139 iz sekv. id. br.: 30 ili njene varijante; i/ili varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 130 iz sekv. id. br.: 32 ili njene varijante.

U jednoj varijanti, pronalazak sadrži antitelo ili fragment antitela koje/koji se vezuje za antigen i koje/koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 139 iz sekv. id. br.: 30 ili njene varijante; i/ili varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 130 iz sekv. id. br.: 33 ili njene varijante.

U jednoj varijanti, pronalazak sadrži antitelo ili fragment antitela koje/koji se vezuje za antigen i koje/koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 139 iz sekv. id. br.: 30 ili njene varijante; i/ili varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 130 iz sekv. id. br.: 34 ili njene varijante.

U jednoj varijanti, pronalazak sadrži antitelo ili fragment antitela koje/koji se vezuje za antigen i koje/koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% homologije sa aminokiselinskim ostacima 20 do 139 iz sekv. id. br.: 30; i/ili varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% homologije sa aminokiselinskim ostacima 20 do 130 iz sekv. id. br.: 32, 33 ili 34.

U jednoj varijanti, pronalazak daje izolovano antitelo ili fragment antitela koje/koji se vezuje za humani PD-1 i koje/koji sadrži: težak lanac koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 466 iz sekv. id. br.: 31 ili njene varijante; i/ili laki lanac koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 237 iz sekv. id. br.: 36 ili njene varijante.

U jednoj varijanti, pronalazak daje izolovano antitelo ili fragment antitela koje/koji se vezuje za humani PD-1 i koje/koji sadrži: težak lanac koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 466 iz sekv. id. br.: 31 ili njene varijante, i/ili laki lanac koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 237 iz sekv. id. br.: 37 ili njene varijante.

U jednoj varijanti, pronalazak daje izolovano antitelo ili fragment antitela koje/koji se vezuje za humani PD-1 i koje/koji sadrži: težak lanac koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 466 iz sekv. id. br.: 31 ili njene varijante; i/ili laki lanac koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 237 iz sekv. id. br.: 38 ili njene varijante.

U jednoj varijanti, pronalazak daje izolovano antitelo ili fragment antitela koje/koji se vezuje za humani PD-1 i koje/koji sadrži: težak lanac koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 469 iz sekv. id. br.: 35 ili njene varijante; i/ili laki lanac koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 237 iz sekv. id. br.: 36 ili njene varijante.

U jednoj varijanti, pronalazak daje izolovano antitelo ili fragment antitela koje/koji se vezuje za humani PD-1 koje/koji sadrži: težak lanac koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 469 iz sekv. id. br.: 35 ili njene varijante; i/ili laki lanac koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 237 iz sekv. id. br.: 37 ili njene varijante.

U jednoj varijanti, pronalazak daje izolovano antitelo ili fragment antitela koje/koji se vezuje za humani PD-1 koje/koji sadrži: težak lanac koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 469 iz sekv. id. br.: 35 ili njene varijante; i/ili laki lanac koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 237 iz sekv. id. br.: 38 ili njene varijante.

U svakoj od prethodno navedenih varijanti, varijanta antitela ili fragmenta antitela prema pronalasku može da sadrži jednu, dve ili tri konzervativno modifikovane aminokiselinske supstitucije.

U svakoj od prethodno navedenih varijanti, antitelo ili fragment antitela prema pronalasku može da sadrži konstantni region humanog teškog lanca ili njegovu varijantu, pri čemu varijanta sadrži do 20 konzerativno modifikovanih aminokiselinskih supstitucija; i/ili konstantni region humanog lakog lanca ili njegovu varijantu, pri čemu varijanta sadrži do 20 konzervativno modifikovanih aminokiselinskih supstitucija. U nekim varijantama, varijanta može da sadrži do 10 konzervativno modifikovanih aminokiselinskih supstitucija. U nekim varijantama, varijanta može da sadrži do 5 konzervativno modifikovanih aminokiselinskih supstitucija. U nekim varijantama, varijanta može da sadrži do 3 konzervativne modifikovane aminokiselinske supstitucije. U svakoj od prethodno navedenih varijanti, konstantni region humanog teškog lanca ili njegova varijanta može biti IgGl ili IgG4 izotipa.

U svakoj od prethodno navedenih varijanti, antitelo ili fragment antitela prema pronalasku može da veže humani PD-1 sa Kd od oko 100 pM ili niže. U sledećoj varijanti, antitelo ili fragment antitela može da veže humani PD-1 sa Kd od oko 30 pM ili niže. U sledećoj varijanti, antitelo ili fragment antitela može da veže humani PD-1 sa oko istom Kd vrednošću kao antitelo koje ima težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz sekv. id. br.: 31 i lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz sekv. id. br.: 32. U sledećoj varijanti, antitelo ili fragment antitela može da veže humani PD-1 sa oko istom vrednošću Kd kao antitelo koje ima težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz sekv. id. br.: 31 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz sekv. id. br.: 33.

U svakoj od prethodno opisanih varijanti, antitelo ili fragment antitela prema pronalasku može da veže humani PD-1 sa kasSoc od oko 7.5 x 105 1/M-s ili brže. U jednoj varijanti, antitelo ili fragment antitela može da veže humani PD-1 sa kassoc od oko 1 x 106 1/M-s ili brže.

U svakoj od prethodno opisanih varijanti, antitelo ili fragment antitela može da veže PD-1 sa kdissoc od oko 2 x 10'5 1/s ili sporije. U jednoj varijanti, antitelo ili fragment antitela može da veže PD-1 sa kdjSSoc od oko 2.7 x 10'5 1/s ili sporije. U jednoj varijanti, antitelo ili fragment antitela može da veže PD-1 sa kdiSS0C od oko 3 x 1015 1/s ili sporije.

Vrednosti Kd, kassoc i kdiSS0C mogu biti merene upotrebom bilo kog dostupnog postupka. U poželjnim varijantama, konstanta disocijacije je merena upotrebom ,,bio-light“ interferometrije (na primer, „ForteBio Octet“ postupak opisan u Primeru 2). U drugim poželjnim varijantama, konstanta disocijacije može biti merena upotrebom rezonance površinskih plazmona (npr. Biacore) ili Kinexa.

Pored toga, u svakoj od prethodno opisanih varijanti, antitelo ili fragment antitela prema pronalasku može da blokira vezivanje humanog PD-L1 ili humanog PD-L2 za humani PD-1 sa IC50 od oko 1 nM ili niže. Moguće je meriti blokadu vezivanja Uganda i IC50 je izračunata upotrebom bilo kog postupka poznatog u tehnici, na primer, FACS ili FMAT postupaka opisanih u Primerima koji su ovde opisani.

Pronalazak takođe sadrži antitelo ili fragment antitela koje/koji je u kompeticiji za vezujući epitop na humanom PD-1 sa bilo kojim od antitela opisanih u prethodnom tekstu, i koje/koji blokira vezivanje humanog PD-L1 ili humanog PD-L2 za humani PD-1 sa IC50 od oko 1 nM ili niže.

Pronalazak takođe sadrži antitelo ili fragment antitela koje/koji je u kompeticiji za vezujući epitop na humanom PD-1 sa bilo kojim od antitela opisanih u prethodnom tekstu, i koje/koji se vezuje humani PD-1 sa Kd od oko 100 pM ili niže. U jednoj varijanti, antitelo ili fragment antitela veže humani PD-1 sa Kd od oko 30 pM ili niže.

Pronalazak takođe sadrži antitelo ili fragment antitela koje/koji je u kompeticiji za vezujući epitop na humanom PD-1 sa bilo kojim od antitela opisanih u prethodnom tekstu, i koje/koji se vezuje humani PD-1 sa oko istom vrednošću Kd kao antitelo koje ima težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz sekv. id. br.: 31 i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz sekv. id. br.: 32.

Pronalazak takođe sadrži antitelo ili fragment antitela koje/koji je u kompeticiji za vezujući epitop na humanom PD-1 sa bilo kojim od antitela opisanih u prethodnom tekstu, i koji se vezuje za humani PD-1 sa oko istom vrednošću Kd kao antitelo koje ima težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz sekv. id. br.: 31 i laki lane koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz sekv. id. br.: 33.

Pronalazak takođe sadrži antitelo ili fragment antitela koje/koji je u kompeticiji za vezujući epitop na humanom PD-1 sa bilo kojim od antitela opisanih u prethodnom tekstu, i koje/koji se vezuje za humani PD-1 sa kassoc od oko 7.5 x 105 1/M-s ili brže. U jednoj varijanti, antitelo ili fragment antitela može da veže PD-1 sa kaSsoo od oko 1 x IO6 1/ M-s ili brže.

Pronalazak takođe sadrži antitelo ili fragment antitela koje/koji je u kompeticiji za vezujući epitop na humanom PD-1 sa bilo kojim od antitela opisanih u prethodnom tekstu, i koje/koji se vezuje za humani PD-1 sa kdiSS0C od oko 2 x 10'5 1/s ili sporije. U jednoj varijanti, antitelo ili fragment antitela može da veže PD-1 sa kdissoc od oko 2.7 x IO'5 1/s ili sporije. U jednoj varijanti, antitelo ili fragment antitela može da veže PD-1 sa kdiSSOC od oko 3 x IO'5 1/s ili sporije.

U nekim varijantama, antitelo ili fragmenti antitela prema pronalasku su himema antitela ili fragmenti himemih antitela.

U nekim varijantama, antitelo ili fragmenti antitela prema pronalasku su humana antitela ili fragmenti humanih antitela.

U nekim varijantama, antitelo ili fragmenti antitela prema pronalasku su humanizovana antitela ili fragmenti humanizovanih antitela.

U nekim varijantama, fragmenti antitela prema pronalasku su Fab, Fab’, Fab'-SH, Fv, scFv ili F(ab')2 fragmenti antitela.

U nekim varijantama, fragmenti antitela prema pronalasku su diatela.

Pronalazak takođe sadrži bicpecifična antitela koja sadrže bilo koje od antitela ili fragmenata antitela opisanih u prethodnom tekstu koji se vezuju za humani PD-1.

U nekim varijantama, izolovana anti-PD-1 antitela i fragmenti antitela prema pronalasku povećavaju T ćelijsku aktivaciju kao što je mereno pomoću tipičnih sredstava poznatih stručnjacima iz date oblasti tehnike (uključujući, bez ograničenja, povećanu proliferaciju imunih ćelija, povećano izlučivanje citokina ili ekspresiju aktivacionih markera kao što su CD25 i/ili CD69).

U bilo kojoj od prethodno opisanih varijanti, antitelo ili fragment antitela prema pronalasku može da poveća imuni odgovor posle stimulacije sa enterotoksinom B Staphylococcus-a ili toksoidom Tetanusa ex vivo ili in vivo. Povećana imuna aktivacija može biti određena upotrebom postupaka koji su poznati svakom stručnjaku iz date oblasti tehnike, na primer, kvantitativno određivanje proliferacije imunih ćelija (kao što su T ćelije) ili proizvodnje citokina od strane imunih ćelija (na primer proizvodnje IFNy ili IL-2 od strane T ćelija).

Pronalazak takođe sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju anti-PD-1 antitela i fragmente antitela prema pronalasku. U pronalazak su uključene nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koju od aminokiselinskih sekvenci navedenih u sek. id. br.: 7 do 8, 15 do 20 i 30-38 (sa ili bez liderskih sekvenci). Unutar pronalaska su takođe uključene nukleinske kiseline koje sadrže sekv. id. br.: 3 do 4 i 21 do 29 (sa ili bez nukleinskih kiselina koje kodiraju liderske sekvence).

Pronalazak takođe sadrži ćelije i ekspresione vektore koji sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju antitela ili fragmente antitela prema pronalasku. Pored toga, pronalazak sadrži postupak za proizvodnju antitela ili fragmenta antitela prema pronalasku koji sadrži: (a) kultivaciju ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo ili fragment antitela prema pronalasku u podlozi za kulturu pod uslovima gde je eksprimirana nukleinsko kiselinska sekvenca, na taj način proizvodeći polipeptide koji sadrže varijabilne regione lakog i teškog lanca; i (b) izolaciju polipeptida iz ćelije domaćina ili podloge za kulturu.

Pronalazak takođe sadrži kompozicije koje sadrže antitelo ili fragment antitela prema pronalasku u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili razblaživačem.

Pronalazak takođe sadrži postupak za povećanje aktivnosti imune ćelije, koji sadrži primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tim terapeutski efikasne količine antitela ili fragmenta antitela prema pronalasku. U jednoj varijanti, postupak se može koristiti za lečenje kancera. U sledećoj varijanti, postupak može biti korišćen za lečenje infekcije ili infektivne bolesti. U sledećoj varijanti, postupak se može koristiti kao adjuvant vakcine. U nekim varijantama, postupak sadrži dodatnu primenu drugog terapeutskog sredstva ili modaliteta lečenja.

U nekim varijantama, pronalazak sadrži postupak za povećanje aktivnosti imune ćelije, koji sadrži primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tim terapeutski efikasne količine antitela ili fragmenta antitela prema pronalasku, i dalje sadrži merenje aktivacije T ćelija ex vivo u uzorku poreklom od subjekta, pri čemu povećanje u T ćelijskoj aktivnosti ukazuje na to da bi trebalo nastaviti lečenje. U drugim varijantama, pronalazak sadrži postupak za povećanje aktivnosti imune ćelije, koji sadrži primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tim terapeutski efikasne količine antitela ili fragmenta antitela prema pronalasku, i dalje sadrži merenje T ćelijske aktivacije ex vivo u uzorku poreklom od subjekta, pri čemu povećanje u T ćelijskoj aktivnosti previđa verovatnoću da će tretman biti uspešan. U jednoj varijanti, povećanje u T ćelijskoj aktivnosti je određeno pomoću: (i) merenja SEB indukovane proizvodnje jednog ili više citokina izabranih iz grupe koju čine: IL-2, TNFa, IL- 17, IFNy, GM-CSF, RANTES, IL-6, IL-8, IL-5 i IL-13; ili (ii) merenja TT inudukovane proizvodnje citokina izabranog iz grupe koju čine: IL-2, TNFa, IL-17, IFNy, GM-CSF, RANTES, IL-6, IL-8, IL-5 i IL-13.

Pronalazak takođe sadrži upotrebu anti-PD-1 antitela ili fragmenta antitela prema pronalasku za pripremu leka za povećanje imunog odgovora.

Pronalazak takođe sadrži upotrebu anti-PD-1 antitela ili fragmenta antitela prema pronalasku za pripremu leka za lečenje kancera.

Pronalazak takođe sadrži upotrebu anti-PD-1 antitela ili fragmenta antitela prema pronalasku kao adjuvanta vakcine.

Pronalazak takođe sadrži imunokonjugat koji sadrži anti-PD-1 antitelo ili fragment antitela prema pronalasku, vezan za terapeutsko sredstvo kao što je bakterijski toksin ili radiotoksin. Neograničavajući primeri citotoksičnih sredstava obuhvataju taksol, citohalasin B, mitomicin, etoposid i vinkristin ili druge antimetabolite, alkilujuća sredstva, antibiotike i antimitotike.

Pronalazak takođe sadrži postupak za povećanje aktivnosti, ili smanjenje nishodne modulacije, imune ćelije koji sadrži dovođenje u kontakt imune ćelije sa bilo kojim od antitela ili fragmenata antitela prema pronalasku. Ovaj postupak bi se mogao koristiti za lečenje kancera ili infektivnih bolesti (kao što su hronične virusne infekcije), ili bi se mogao koristiti kao adjuvant za profilaktičku ili terapeutsku vakcinu.

Pronalazak takođe sadrži postupak za povećanje imunog odgovora na antigen, koji sadrži dovođenje u kontakt imune ćelije sa antigenom i anti-PD-1 antitelom ili fragmentom antitela tako da je imuni odgovor na antigen povećan ili pojačan. Ovaj postupak bi se mogao izvesti in vivo (u subjektu) ili ex vivo.

U nekim varijantama, anti-PD-1 antitelo ili fragment antitela može se kombinovati sa drugim terapeutskim sredstvom ili modalitetom lečenja. U jednoj varijanti, anti-PD-1 antitelo ili fragment antitela može se kombinovati sa tretmanima protiv kancera koji uključujuću primenu rekombinantnih citokina ili izlučenih imunih faktora. Neograničavajući primeri kombinacija obuhvataju kombinovanje anti-PD-1 antitela sa rekombinantnim IL-2 ili rekombinantnim IFNa2 za lečenje melanoma ili karcinoma renalnih ćelija. Rekombinantni IL-2 pojačava razvoj T ćelija kod pacijenata koji pate od kancera. Rekombinantni IFNa2 inhibira rast ćelija kancera, ali takođe povećava ekspresiju inhibitomih liganada za PD-1 na ćelijama kancera, antigen-prikazujućim ćelijama i drugim somatskim ćelijama kod lečenih pacijenata. Anti-PD-1 može biti kombinovan sa drugim citokinima koji bi se mogli smatrati korisnim za lečenje kancera ili infektivnih bolesti.

U nekim varijantama, anti-PD-1 antitela ili fragmenti antitela mogu biti kombinovani sa vakcinom za prevenciju ili lečenje kancera ili infektivne bolesti. Kao neograničavajući primer, anti-PD-1 mogao bi se kombinovati sa proteinom, peptidom ili DNK vakcinom koja sadrži jedan ili više antigena koji su relevantni za kancer ili infekciju koji se leče, ili vakcinom koja sadrži dendritske ćelije pulsirane sa takvim a) antigenom. Sledeća varijanta obuhvata upotrebu anti-PD-1 sa (atenuiranim) vakcinama ćelije kancera ili celog virusa. Jedna varijanta obuhvata kombinaciju anti-PD-1 terapije sa vakcinom sa ćelom ćelijom kancera koja je dizajnirana tako da izlučuje GM-CSF.

U nekim varijantama, anti-PD-1 antitela ili fragmenti antitela mogu biti kombinovani sa tretmanom koji se smatra standardom zdravstvene zaštite kod kancera ili infektivne bolesti. Obrazloženje za takve kombinacije je to da će istovremena povećana imuna aktivacija pomoću anti-PD-1 indukovati ili olakšati početni klinički odgovor na standardni tretman zdravstvene zaštite, indukovati dugotrajni klinički odgovor i dugotrajnu imunu kontrolu bolesti.

U jednoj varijanti, lečenje sa anti-PD-1 antitelima ili fragmentima antitela može biti kombinovano sa hemoterapijom. Hemoterapija upotrebom citotoksičnih sredstava rezultiraće u smrti ćelija kancera na taj način povećavajući oslobađanje tumorskih antigena. Takva povećana dostupnost tumorskog antigena može rezultirati u sinergiji sa anti-PD-1 tretmanom. Neograničavajući primer je obezbeđen upotrebom dekarbazina ili temozolomida za lečenje melanoma i gemcitabina za kancer pankreasa.

U jednoj varijanti, lečenje sa anti-PD-1 antitelima ili fragmentima antitela može se kombinovati sa radioterapijom. Radioterapija indukuje smrt ćelija kancera i rastuću dostupnost tumorskih antigena za predstavljanje i aktivaciju imunih ćelija.

U sledećoj varijanti, lečenje sa anti-PD-1 antitelima ili fragmentima antitela može se kombinovati sa operacijom da bi se uklonile ćelije kancera iz subjekta.

U drugim varijantama, anti-PD-1 antitela ili fragmenti antitela mogu biti kombinovani sa terapijama koje mogu da rezultiraju u sinergiji sa blokadom PD-1 uključujući ciijana sredstva korišćena za hormonsku deprivaciju ili inhibiciju angiogeneze, ili ciljane proteine aktivne u ćelijama tumora, koji svi imaju za rezultat povećanu smrt tumorskih ćelija i dostupnost antigena tumora koji stimuliši imuninitet. U kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom ili fragmentom antitela, povećana T ćelijska aktivacija može imati za rezultat dugotrajnu imunu kontrolu kancera.

U nekim varijantama, anti-PD-1 antitelo ili fragment antitela može se kombinovati sa drugim terapeutskim antitelom korisnim za lečenje kancera ili infektivne bolesti. Neograničavajući primer je obezbeđen za kombinaciju anti-PD-1 sa antitelom koje ciljno deluje na Her2/neu ili koje ciljno deluje na EGF receptor. U sledećem neograničavajućem primeru, anti-PD-1 antitelo ili fragment antitela se kombinuje sa tretmanom koji ciljno deluje na VEGF ili njegove receptore. U sledećoj varijanti, anti-PD-1 antitelo ili fragment antitela se kombinuje sa anti-CTLA-4. U sledećem neograničavajućem primeru, anti-PD-1 se kombinuje sa antitelom koje ciljno deluje na RSV.

KRATAK OPIS CRTEŽA

Slike 1A i 1B prikazuju rezultate eksperimenata koji pokazuju da su antitela imobilizovana iz supematanata hibridoma takođe sposobna da redukuju izlučivanje IL-2 od strane Jurkat E6.2.11 ćelija stimulisanih imoblizovanim anti-CD3 i rastvorljivim anti-CD28.

Slika 2 prikazuje rezultate eksperimenata koji pokazuju da se antitela protiv humanog PD-1 vezuju za PD-1. Slika 2A je grafikon koji prikazuje od doze zavisno vezivanje anti-PD-1 antitela za prečišćeni PD-l/Fc u proteinskom ELISA. Slika 2B je grafikon koji prikazuje od doze zavisno vezivanje anti PD-1 antitela za PD-1 eksprimiran na površini CHO ćelija transficiranih sa hPD-1 u CELISA.

Slika 3 prikazuje rezultate FMAT eksperimenata koji pokazuju da su antitela protiv PD- 1 u kompeticiji za vezivanje PD-L1 i PD-L2 za CHO ćelije transficirane sa humanim PD-1. Slika 3A je grafikon koji prikazuje od doze zavisnu inhibiciju vezivanja PD-L1 od strane hPD-1.08A i hPD-1.09A i u manjem stepenu od strane JI 16. Slika 3B je grafikon koji prikazuje od doze zavisnu inhibiciju PD-L2.

Slika 4 je histogram koji prikazuje rezultate eksperimenata koji pokazuju da je SEB- stimulisana proizvodnja IL-2 od strane ćelija krvi od zdravog davaoca pojačana u prisustvu anti-PD-1, anti PD-L1 ili anti-CTLA-4 antitela. Histogram pokazuje za koliko puta je prosečno povećan IL-2 kod različitih davaoca (± SEM). Brojevi unutar svakog stupca predstavljaju broj predstavljenih davaoca. Mišji (m)IgGl je izotipska kontrola za anti-PD-1.08A (08A), anti-PD-1.09A (09A) i anti-PD-Ll. Mišji (m) IgG2a je izotipska kontrola za anti-CTLA-4. Svaka IL-2 vrednost se poredi sa svojom kontrolom da bi se odredilo koliko puta je vrednost promenjena (promena IL-2 od 4 označava 400% povećanje u proizvodnji IL-2 u poređenju sa samim SEB). Nijedan = sam SEB.

Slika 5 prikazuje rezultate eksperimenata koji pokazuju da anti-PD-1 antitela stimulišu proliferaciju T ćelija i izlučivanje citokina (IL-2 i IFNy) kada su stimulisani sa memorijskim antigenom toksoida tetanusa. Slika 5 prikazuje izlučivanje IFNy zavisno od koncentracije.

Slika 6 je grafikon koji prikazuje stope kassoc i kdiSS0C za anti-PD-1 antitela kako su merene pomoću ,,bio-light“ interferometrije. Dijagonalne linije označavaju teorijske izračunate KD vrednosti. Antitela su navedena na desnoj strani prema KD u rastućem redosledu.

Slika 7 je histogram koji prikazuje rezultate eksperimenata koji pokazuju da je SEB- stimulisana proizvodnja IL-2 od strane ćelija krvi od zdravog davaoca povećana u prisustvu 25 ug/ml mišjih (09A) ili humanizovanih anti-PD-1 antitela (h409All, h409A16 i h409A17). Stupci prikazuju za koliko je prosečno puta povećan IL-2 kod tri davaoca (+ SEM). Mišji (m) IgGl je izotipska kontrola za anti-PD-1.09A (09A). Humani (h) IgG4 je izotipska kontrola za h409Al 1, h409A16 i h409A17 antitela. Svaka IL-2 vrednost je upoređivana sa svojom kontrolom da bi se odredilo koliko je puta promenjena. Nijedan = sam SEB.

DETALJAN OPIS PRONALASKA Skraćenice i definicije

U detaljnom opisu i primerima prema pronalasku biće korišćene sledeće skraćenice

hPD-1 humani PD-1 protein

CDR Region koji određuje komplementarnost u varijabilnim regionima

imunoglobulina, defmisanim upotrebom Kabat numeričkog sistema EC50 koncentracija koja rezultira u 50% efikasnosti ili vezivanju

ELISA Enzimski vezani imunosorbent test

FW Okvirni region antitela: varijabilni regioni antitela isključujući CDR

regione

HRP Renova peroksidaza

IL-2 interleukin 2

IFN interferon

IC50 koncentracija koja rezultira u 50% inhibiciji

IgG Imunoglobulin G

Kabat Sistem za poravnavanje i numerisanje imunoglobulina koji je dao Elvin

A Kabat

mAb Monoklonalno antitelo

MES 2-(N-morfolino)etansulfonska kiselina

NHS Normalni humani serum

PCR Lančana reakcija polimeraze

SAM ovčje anti-mišje (IgG) poliklonalno antitelo

V region Segment IgG lanaca koji je varijabilan u sekvenci između različitih

antitela. On se proteže do Kabat ostatka 109 u lakom lancu i 113 u teškom lancu.

VH Varijabilni region teškog lanca imunoglobulina

VK Varijabilni region kapa lakog lanca imunoglobulina

"Antitelo" označava bilo koji oblik antitela koji ispoljava željenu biološku aktivnost, kao što je inhibicija vezivanja liganda za njegov receptor, ili putem inhibicije ligandom- indukovanog prenosa signala receptora. Na taj način, "antitelo" se koristi u najširem smislu i posebno pokriva, ali nije ograničeno na, monoklonalna antitela (uključujući monoklonalna antitela pune dužine), poliklonalna antitela i multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela).

"Fragment antitela" i "vezujući fragment antitela" označavaju fragmente koji se vezuju za antigen i analoge antitela, tipično uključujući najmanje deo antigen-vezujućih ili

varijabilnih regiona (npr. jedan ili više CDR) matičnog antitela. Fragment antitela zadržava najmanje nešto od vezujuće specifičnosti matičnog antitela. Tipično, fragment antitela zadržava najmanje 10% od matične vezujuće aktivnosti kada je aktivnost izražena na molamoj osnovi. Poželjno, fragment antitela zadržava najmanje 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ili 100% ili više vezujućeg afiniteta matičnog antitela za ciljno mesto. Primeri fragmenata antitela obuhvataju, ali bez ograničenja na, Fab, Fab', F(ab')2 i Fv fragmente; diatela; linearna antitela; jednolančane molekule antitela, npr., sc-Fv, unitela (tehnologija iz Genmab); nanotela (tehnologija iz Domantis); domen antitela (tehnologija iz Ablynx); i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela. Konstruisane varijante antitela su prikazane u Holliger and Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136.

"Fab fragment" se sastoji od jednog lakog lanca i Ch 1 i varijabinih regiona teškog lanca. Težak lanac Fab molekula ne može da formira disulfidnu vezu sa drugim molekulom teškog lanca.

"Fc" region sadrži dva fragmenta teškog lanca koji sadrže ChI i Ch2 domene antitela. Dva fragmenta teškog lanca se drže zajedno pomoću dve ili više disulfidnih veza i pomoću hidrofobnih interakcija CH3 domena.

"Fab' fragment" sadrži jedan lak lanac i deo jednog teškog lanca koji sadrži VH domen i C h1 domen i takođe region između ChI i C h2 domena, tako da interlančane disulfidne veze mogu biti formirane između dva teška lanca dva Fab' fragmenta da bi se formirao F(ab')2 molekul.

"F(ab')2 fragment" sadrži dva laka lanca i dva teška lanca koji sadrže deo konstantnog regiona između ChI i Ch domena, tako daje interlančana disulfidna veza formirana između dva teška lanca. F(ab')2 fragment je na taj način sastavljen od dva Fab' fragmenta koji se drže zajedno pomoću disulfidne veze između dva teška lanca.

" Fv region" sadrži varijabilne regione i iz teških i iz lakih lanaca, ali nema konstantne regione.

"Jednolančano Fv antitelo" (ili "scFv antitelo") označava fragmente antitela koji sadrže VH i VL domene antitela, pri čemu su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. Generalno, Fv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između Vh i VL domena koji omogućava da scFv formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Za prikaz scFv, videti Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315. Videti takođe, objavu međunarodne patentne prijave br. WO 88/01649 i SAD Pat. br. 4,946,778 i 5,260,203.

" Diatelo" je mali fragment antitela sa dva antigen-vezujuća mesta. Fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (Vh) povezan za varijabilni domen lakog lanca (Vl) u istom polipeptidnom lancu (Vh-Vl ili Vl-Vh). Upotrebom linkera koji je previše kratak da omogući sparivanje između dva domena na istom lancu, domeni su prisiljeni da se sparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvaraju dva antigen-vezujuća mesta. Diatela su potpunije opisana u, npr., EP 404,097; WO 93/11161; i Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448.

"Domen fragment antitela" je imunološki funkcionalan imunoglobulinski fragment koji sadrži samo varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. U nekim slučajevima, dva ili više Vh regiona su kovalentno vezani sa peptidnim linkerom da bi se stvorio bivalentni domen fragment antitela. Dva Vh regiona bivalentnog domena fragmenta antitela mogu ciljno da deluju na iste ili različite antigene.

Fragment antitela prema pronalasku može da sadrži dovoljni deo konstantnog regiona da se omogući dimerizacija (ili multimerizacija) teških lanaca koja je smanjila sposobnost đisulfidnog vezivanja, na primer tamo gde je najmanje jedan od zglobnih cisteina normalno uključen u inter-težak lanac, disulfidna veza je promenjena kao što je ovde opisano. U sledećoj varijanti, fragment antitela, na primer onaj koji sadrži Fc region, zadržava najmanje jednu od bioloških funkcija normalno povezanih sa Fc regionom kada je prisutan u intaktnom antitelu, kao što je vezivanje FcRn, modulacija polu-života antitela, funkcija ADCC i/ili vezivanje komplementa (na primer, gde antitelo ima glikozilacioni profil neophodan za funkciju ADCC ili vezivanje komplementa).

Termin "himemo" antitelo označava antitela u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homolog sa odgovarajućim sekvencama u antitelima poreklom od određene vrste ili koji pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je preostali deo lanca (lanaca) identičan sa ili homolog sa odgovarajućim sekvencama u antitelima poreklom od druge vrste ili koji pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok oni ispoljavaju željenu biološku aktivnost (Videti, na primer, SAD Pat. br. 4,816,567 i Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855).

"Humanizovani" oblici nehumanih (na primer, mišjih) antitela su himema antitela koja sadrže minimalnu sekvencu poreklom od ne-humanog imunoglobulina. Većinom, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antitelo primaoc) u kojima su ostaci iz hipervarijabilnog regiona primaoca zamenjeni ostacima iz hipervarijabinog regiona nehumane vrste (antitelo davaoc) kao što su miš, pacov, zec ili ne-humani primat koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci Fv okvirnog regiona (FR) humanog imunoglobulina su zamenjeni odgovarajućim ne-humanim ostacima. Pored toga, humanizovana antitela mogu da sadrže ostatke koji se ne nalaze u antitelu primaocu ili u antitelu davaocu. Ove modifikacije su napravljene da bi dalje usavršile učinak antitela. Uopšteno, humanizovano antitelo sadržaće uglavnom sve od najmanje jednog, i tipično dva, varijabilna domena, u kojima sve ili uglavnom sve od hipervarijabinih petlji odgovaraju onima iz ne-humanog imunoglobulina i svi ili uglavnom svi od FR regiona su oni od humane imunoglobulinske sekvence. Humanizovano antitelo izborno takođe će sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onaj od humanog imunoglobulina. Za dodatne detalje, videti Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Termin "hipervarijabilni region," kao što je ovde korišćen, označava aminokiselinske ostatke antitela koji su odgovorni za vezivanje antigena. Hipervarijabilni region sadrži aminokiselinske ostatke iz "regiona koji određuje komplementarnost" ili "CDR," defmisane pomoću poravnanja sekvence, na primer ostatke 24-34 (LI), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) u varijabilonom domenu lakog lanca i 31-35 (Hl), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca; videti Kabat et al., 1991, Sequences of proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. i/ili one ostatke iz "hipervarijabilne petlje" (HVL), kao što su definisani strukturno, na primer, ostatke 26-32 (LI), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) u varijabinom domenu lakog lanca i 26-32 (Hl), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca; videti Chothia and Leskl, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917. "Okvirni" ili "FR" ostaci su oni ostaci varijabilnog domena koji se razlikuju od ostataka hipervarijabilnog regiona kao što su ovde definisani.

"Humano antitelo" je antitelo koje poseduje aminokiselinsku sekvencu koja odgovara onoj od antitela koju je proizveo čovek i/ili koja je napravljena upotrebom bilo koje od tehnika za stvaranje humanih antitela koje su ovde navedene. Ova definicija posebno isključuje humanizovano antitelo koje sadrži ne-humane ostatke koji se vezuju za antigen.

"Izolovano" antitelo je ono koje je identifikovano i odvojeno i/ili izolovano iz komponente njegove prirodne sredine. Kontaminirajuće komponente njegove prirodne sredine su materijali koji bi remetili njegove dijagnostičke ili terapeutske upotrebe za antitelo, i mogu da obuhvataju enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske rastvorke. U nekim varijantama, antitelo će biti prečišćeno (1) do više od 95 težinskih % antitela kao što je određeno pomoću Lowry-evog postupka, i najpoželjnije više od 99 težinskih %, (2) do stepena koji je dovoljan da se dobiju najmanje 15 ostataka N-terminalne ili unutrašnje aminokiselinske sekvence upotrebom „spinning cup“ sekvenatora, ili (3) do homogenosti pomoću SDS-PAGE pod redukcionim ili neredukcionim uslovima upotrebom ,,Coomassie“ plave ili, poželjno, srebrne boje. Izolovano antitelo obuhvata antitelo in situ unutar rekobminantnih ćelija s obzirom na to da najmanje jedna komponenta prirodne sredine antitela neće biti prisutna. Obično, međutim, izolovano antitelo će biti pripremljeno pomoću najmanje jednog koraka prečišćavanja.

" Izolovani" molekul nukleinske kiseline je molekul nukleinske kiseline koji je identifikovan i odvojen od najmanje jednog kontaminirajućeg molekula nukleinske kiseline sa kojim je obično povezan u prirodnom izvoru nukleinske kiseline antitela. Izolovani molekul nukleinske kiseline nije u obliku ili okruženju u kome se nalazi u prirodi. Izolovani molekuli nukleinske kiseline prema tome se razlikuju od molekula nukleinske kiseline jer on postoji u prirodnim ćelijama. Međutim, izolovani molekul nukleinske kiseline obuhvata molekul nukleinske kiseline sadržan u ćelijama koje obično eksprimiraju antitelo gde, na primer, molekul nukleinske kiseline je u hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od one kod prirodnih ćelija.

Termin "monoklonalno antitelo" kao stoje ovde korišćen označava antitelo dobijeno iz populacije uglavnom homogenih antitela, tj., pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična, osim mogućih prirodnih mutacija koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonalna antitela su visoko specifična, usmerena su protiv jednog antigenog mesta. Pored toga, nasuprot uobičajenim preparatima (poliklonalnog) antitela koji tipično obuhvataju različita antitela usmerena protiv različitih determinantni (epitopa), svako monoklonalno antitelo je usmereno protiv jedne determinante na antigenu. Modifikator "monoklonalni" označava karakter antitela kao što je dobijeno iz uglavnom homogene populacije antitela, i ne bi ga trebalo tumačiti tako da zahteva proizvodnju antitela pomoću bilo kog određenog postupka. Na primer, monoklonalna antitela za upotrebu prema predstavljenom pronalasku mogu biti napravljena pomoću postupka hibridoma koji su prvi put opisali Kohler et al., 1975, Nature 256:495, ili mogu biti napravljena pomoću postupaka rekombinantne DNK (videti, na primer, SAD Pat. br. 4,816,567). "Monoklonalna antitela" mogu takođe biti izolovana iz biblioteka fagnih antitela upotrebom tehnika koje su opisane u Clackson et al., 1991, Nature 352:624-628 i Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-597, na primer. Monoklonalna antitela ovde posebno obuhvataju "himema" antitela.

Kao što je ovde korišćen, termin "imuna ćelija" obuhvata ćelije koje su hematopoetskog porekla i koje imaju ulogu u imunom odgovoru. Imune ćelije obuhvataju limfocite, kao što su B ćelije i T ćelije; ćelije prirodne ubice; mijeloidne ćelije, kao što su monociti, makrofage, eozinofili, mastociti, bazofili i granulociti.

Kao što je ovde korišćen, "imunokonjugat" označava anti-PD-1 antitelo, ili njegov fragment, konjugovano/konjugovan sa terapeutskom grupom, kao što je bakterijski toksin, citotoksični lek ili radiotoksin. Toksične grupe mogu biti konjugovane za antitela prema pronalasku upotrebom postupaka koji su dostupni u tehnici.

Ovde su korišćene sledeće dvoznačne šifre za nukleinske kiseline: R = A ili G; Y = C ili T; M = A ili C; K = G ili T; S = G ili C; i W = A ili T.

Kao što je ovde korišćena, "varijanta" sekvence označava sekvencu koja se razlikuje od navedene sekvence na jednom ili više aminokiselinskih ostataka, ali koja zadržava biološku aktivnost rezultujućeg molekula.

"Konzervativno modifikovane varijante" ili "konzervativna aminokiselinska supstitucija" označava supstitucije aminokiselina koje su poznate stručnjacima iz ove oblasti tehnike i koje mogu biti napravljene generalno bez promene biološke aktivnosti rezultujućeg molekula. Stručnjaci iz date oblasti tehnike priznaju da, uopšteno, pojedinačne aminokiselinske supstitucije u ne-esencijalnim regionima polipeptida ne menjaju značajnije biološku aktivnost (videti, npr., Watson, et al., Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Edition 1987)). Primeri takvih supstitucija su poželjno napravljeni u skladu sa onim navedenim u daljem tekstu kao što sledi:

Kao što je ovde korišćen, "% identičnosti" između dve sekvence označava funkciju broja identičnih položaja koji dele sekvence (tj., % homologije = # identičnih položaja /ukupan # položaja x 100), uzimajući u obzir broj razmaka, i dužinu svakog razmaka, koje je potrebno uvesti radi optimalnog poravnavanja dve sekvence. Poređenje sekvenci i određivanje procenta identičnosti između dve sekvence može se postići upotrebom matematičkog algoritma. Na primer, procenat identičnosti između dve aminokiselinske sekvence može biti određen upotrebom algoritma koji su dali E. Meyers i W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) koji je ugrađen u ALIGN program (verzija 2.0), upotrebom „PAM120 weight residue table“, kazne dužine razmaka od 12 i kazne razmaka od 4. Pored toga, procenat identičnosti između dve aminokiselinske sekvence može biti određen upotrebom algoritma koji su dali Needleman i Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) koji je ugrađen u GAP program u GCG softverskom paketu (dostupan na www.gcg.com), upotrebom ili Blossum 62 matrice ili PAM250 matrice, i mere razmaka od 16, 14, 12, 10, 8, 6 ili 4 i mere dužine od 1,2, 3, 4, 5 ili 6.

Kao stoje ovde korišćen, termin "oko" označava vrednost koja je unutar prihvatljivog opsega greške za određenu vrednost kao što je određen od strane stručnjaka u datoj oblasti tehnike, koji će zavisiti delimično od toga kako je vrednost izmerena ili određena, tj., ograničenja sistema merenja. Na primer, "oko" može da označava unutar 1 ili više od 1 standardne devijacije po izvođenju u tehnici. Alternativno, "oko" ili "koji se uglavnom sastoji od“ mogu da označavaju opseg do 20%. Pored toga, naročito u vezi sa biološkim sistemima ili procesima, ovi termini mogu da označavaju do reda veličine ili do 5-struke vrednosti. Kada su u prijavi i patentnim zahtevima date određene vrednosti, osim ukoliko nije drugačije navedeno, značenje za "oko" ili "koji se uglavnom sastoji od“ trebalo bi pretpostaviti da je unutar prihvatljivog opsega greške za tu određenu vrednost.

"Specifično" se vezuje, kada se odnosi na ligand/receptor, antitelo/antigen, ili drugi vezujući par, označava reakciju vezivanja koja je odlučujuća za prisustvo proteina, npr., PD- 1, u heterogenoj populaciji proteina i/ili drugih bioloških proizvoda. Na taj način, pod naznačenim uslovima, određeni ligand/antigen se vezuje za određeni receptor/antitelo i ne vezuje se u značajnoj količini za druge proteine prisutne u uzorku.

"Primena" i "lečenje/tretman," kao što su primenjuje na životinju, čoveka, eksperimentalnog subjekta, ćeliju, tkivo, organ ili biološku tečnost, označava kontakt egzogenog farmaceutskog, terapeutskog, dijagnostičkog sredstva ili kompozicije sa životinjom, čovekom, subjektom, ćelijom, tkivom, organom ili biološkom tečnošću. "Primena" i "lečenje/tretman" mogu da označavaju, npr., terapeutske, farmakokinetičke, dijagnostičke, istraživačke i eksperimentalne postupke. Tretman ćelije obuhvata kontakt reagensa sa ćelijom, kao i kontakt reagensa sa tečnošću, gde je tečnost u kontaktu sa ćelijom. "Primena" i "lečenje/tretman" takođe označavaju in vitro i ex vivo tretmane, npr., ćelije, pomoću reagensa, dijagnostičke, vezujuće kompozicije ili pomoću druge ćelije.

"Efikasna količina" obuhvata količinu koja je dovoljna da poboljša ili spreči simptom ili znak medicinskog stanja. Efikasna količina takođe označava količinu koja je dovoljna da omogući ili olakša dijagnozu. Efikasna količina za određenog subjekta može da varira u zavisnosti od faktora kao što su stanje koje se leči, ukupno zdravstveno stanje pacijenta, način i doza primene i težina sporednih efekata. Efikasna količina može biti maksimalna doza ili protokol doziranja koji izbegava značajne sporedne efekte ili toksične efekte. Efekat će rezultirati u poboljšanju dijagnostičke mere ili parametra za najmanje 5%, obično za najmanje 10%, uobičajenije najmanje 20%, najčešće najmanje 30%, poželjno najmanje 40%, poželjnije najmanje 50%, najpoželjnije najmanje 60%, idealno najmanje 70%, idealnije najmanje 80% i najidealnije najmanje 90%, gde je 100% definisano kao dijagnostički parametar koji pokazuje normalni subjekat (videti, npr., Maynard, et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch PubL, London, UK).

Monoklonaina antiteia

Monoklonaina antiteia za PD-1 mogu biti napravljena prema znanju i veštini iz date oblasti tehnike injektiranja test subjekata sa PD-1 antigenom i zatim izolacijom hibridoma koji eksprimiraju antiteia koja imaju željenu sekvencu ili funkcionalne karakteristike.

DNK koja kodira monoklonaina antiteia se lako izoluje i sekvencira upotrebom uobičajenih postupaka (npr., upotrebom oligonukleotidnih proba koje su sposobne da se specifično vezuju za gene koji kodiraju teške i lake lance monoklonalnih antiteia). Hibridoma ćelije služe kao poželjan izvor takve DNK. Pošto je izolovana, DNK može biti postavljena u ekspresione vektore, koji su zatim transficirani u ćelije domaćine kao što su E. coli ćelije, simian COS ćelije, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili mijeloma ćelije koje inače ne proizvode protein imunoglobulina, da bi se dobila sinteza monoklonalnih antiteia u rekombinantnim ćelijama domaćinima. Rekombinantna proizvodnja antiteia biće detaljnije opisana u daljem tekstu.

U sledećoj varijanti, antiteia ili fragmenti antiteia mogu biti izolovani iz fagnih biblioteka antiteia generisanih upotrebom tehnika koje su opisane u McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554. Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628, i Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-597 opisuju izolaciju mišjih i humanih antiteia, respektivno, upotrebom fagnih biblioteka. Kasnije publikacije opisuju proizvodnju visoko afinitetnih (nM opseg) humanih antiteia pomoću mešanja lanaca (Marks et al., 1992, Bio/technology, 10:779-783), kao i kombinatomom infekcijom i in vivo rekombinacijom kao strategijom za konstrukciju veoma velikih fagnih biblioteka (Waterhouse et al., 1993, Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266). Na taj način, ove tehnike su održive alternative tradicionalnim tehnikama hibridoma monoklonalnog antiteia za izolaciju monoklonalnih antiteia.

Himerna antitela

DNK antitela takođe može biti modifikovana, na primer, supstitucijom kodirajuće sekvence za konstantne domene humanog teškog i lakog lanca na mesto homologih mišjih sekvenci (SAD Pat. br. 4,816,567; Morrison, et al., 1984, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851), ili kovalentnim vezivanjem za kodirajuću sekvencu imunoglobulina ćele ili dela kodirajuće sekvence za ne-imunoglobulinski materijal (npr., proteinski domeni). Tipično, takav ne-imunoglobulinski materijal je supstituisan za konstantne domene antitela, ili je supstituisan za varijabilne domene jednog antigen-kombinujućeg mesta antitela da bi se stvorilo himemo bivalentno antitelo koje sadrži jedno antigen-kombinujuće mesto koje ima specifičnost za antigen i drugo antigen-kombinujuće mesto koje ima specifičnost za različit antigen.

Humanizovana i humana antitela

Humanizovano antitelo ima jedan ili više aminokiselinskih ostataka iz izvora koji je ne-humani. Ne-humani aminokiselinski ostaci su često označeni kao "uvozni" ostaci, i tipično su uzeti iz "uvoznog" varijabilnog domena. Humanizacija može biti izvedena generalno praćenjem postupka koji su dali Winter i saradnici (Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534- 1536), supstitucijom glodarskih CDR regiona ili CDR sekvenci za odgovarajuće sekvence humanog antitela. Prema tome, takva "humanizovana" antitela su himerna antitela (SAD Pat. br. 4,816,567) gde je uglavnom manje od intaktnog humanog varijabilnog domena supstituisano sa odgovarajućoom sekvencom iz ne-humane vrste. U praksi, humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima su neki CDR ostaci i moguće neki FR ostaci supstituisani ostacima iz analognih mesta u ne-humanim, na primer, antitelima glodara.

Izbor humanih varijabilnih domena, kako lakog tako i teškog, koji će se koristiti u pripremi humanizovanih antitela je veoma važan za redukciju antigenosti. Prema takozvanom postupku "najboljeg uklapanja", izvršen je skrining sekvence varijabilnog domena antitela glodara prema celoj biblioteci poznatih sekvenci humanog varijabilnog domena. Humana sekvenca koja je najbliža onoj od glodara je zatim prihvaćena kao humani okviri (FR) za humanizovano antitelo

Prečišćavanje antitela

(Sims et al., 1987, J. Immunol. 151:2296; Chothia et al., 1987, J. Mol. Biol. 196:901). Sledeći postupak koristi određeni okvir poreklom od koncenzus sekvence od

potpuno humanih antitela određene podgrupe lakih i teških lanaca. Isti okvir se može koristiti za nekoliko različitih humanizovanih antitela (Čarter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285; Presta et al., 1993, J. Immnol. 151:2623).

Dalje je važno da antitela budu humanizovana sa zadržavanjem visokog afiniteta za antigen i drugim povoljnim biološkim osobinama. Da bi se postigao ovaj cilj, prema poželjnom postupku, humanizovana antitela su pripremljena pomoću postupka analize matičnih sekvenci i različitih konceptualnih humanizovanih proizvoda upotrebom trodimenzionalnih modela matičnih i humanizovanih sekvenci. Tro-dimenzionalni modeli imunoglobulina su obično dostupni i poznati su stručnjacima iz date oblasti tehnike. Dostupni su kompjuterski programi koji ilustruju i prikazuju moguće tro-dimenzionalne konformacione strukture izabranih kandidata imunoglobulinskih sekvenci. Ispitivanje ovih prikaza omogućava analizu verovatne uloge ostataka u funkcionisanju kandidata imunoglobulinske sekvence, tj., analizu ostataka koji utiču na sposobnost kandidata imunoglobulina da se vezuju za svoj antigen. Na ovaj način, FR ostaci mogu biti izabrani i kombinovani iz sekvenci primalaca i uvoznih sekvenci tako da se postižu željene karakteristike antitela, kao što je povećani afinitet za ciljni/ciljne antigen(e). Uopšteno, CDR ostaci su direktno i najhitnije uključeni u delovanje na vezivanje antigena.

Humanizacija antitela je jednostavan zadatak konstrukcije proteina. Skoro sva mišja antitela mogu biti humanizovana pomoću CDR graftovanja, rezultirajući u zadržavanju vezivanja antigena. Videti, Lo, Benny, K.C., editor, in Antibođy Engineering: Methods and Protocols, volume 248, Humana Press, New Jersey, 2004.

Alternativno, sada je moguće proizvesti transgene životinje (npr., miševe) koje su sposobne, posle imunizacije, da proizvode ceo repertoar humanih antitela u odsustvu endogene proizvodnje imunoglobulina. Na primer, opisano je da homozigotna delecija gena za spajajući region (JH) teškog lanca antitela u himemim i mutantnim miševima klicine linije ima za rezultat potpunu inhibiciju endogene proizvodnje antitela. Prenos humanog genskog niza imunoglobulina klicine linije u takve mutantne miševe klicine linije imaće za rezultat proizvodnju humanih antitela posle izlaganja antigenu. Videti, npr., Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551; Jakobovits et al, 1993, Nature 362:255-258; Bruggermann et al., 1993, Year in immunology 7:33; i Duchosal et al., 1992, Nature 355:258. Humana antitela takođe mogu biti poreklom iz biblioteka fagnog prikaza (Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222:581-597; Vaughan et al., 1996, Nature Biotech 14:309).

Kada se koriste rekombinantne tehnike, antitelo može biti proizvedeno intracelulamo, u periplazmatičnom prostoru ili direktno izlučeno u podlogu. Ako je antitelo proizvedeno intracelulamo, kao prvi korak, čestični ostaci, bilo ćelije domaćini ili lizirani fragmenti, su uklonjeni, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Čarter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167 opisuju postupak za izolaciju antitela koja se izlučuju u periplazmatičan prostor E. coli. Ukratko, ćelijska pasta je rastopljena u prisustvu natrijum acetata (pH 3.5), EDTA i fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF) tokom oko 30 min. Ćelijski ostaci mogu biti uklonjeni centrifugiranjem. Tamo gde se antitelo izlučuje u podlogu, supematanti iz takvih ekspresionih sistema se generalno prvi koncentruju upotrebom komercijalno dostupnog filtera za koncentrovanje proteina, na primer, Amicon ili Millipore Pellicon ultrafiltracione jedinice. Inhibitor proteaze kao što je PMSF može biti uključen u bilo koji od prethodno navedenih koraka za inhibiciju proteolize i antibiotici mogu biti uključeni za sprečavanje rasta sporednog zagađenja.

Kompozicija antitela pripremljena od ćelija može biti prečišćena upotrebom, na primer, hidroksilapatit hromato grafije, elektroforeze na gelu, dijalize i afinitetne hromatografije, pri čemu je afinitetna hromatografija poželjna tehnika prečišćavanja. Podesnost proteina A kao afinitetnog liganda zavisi od vrste i izotipa svakog imunoglobulinskog Fc regiona koji je prisutan u antitelu. Protein A može biti korišćen za prečišćavanje antitela koja su bazirana na humanim gama 1, gama 2 ili gama 4 teškim lancima (Lindmark et al., 1983, J. Immunol. Meth. 62:1-13). Protein G je preporučen za sve mišje izotipove i za humani gama 3 (Guss et al., 1986, EMBO J 5:15671575). Matriks za koji je afmitetni ligand vezanje najčešće agaroza, ali dostupni su i drugi matriksi. Mehanički stabilni matriksi kao što su staklo sa kontrolisanim otvorima ili poli(stirendivinil)benzen omogućavaju brže stope protoka i kraća vremena obrade nego što bi se to moglo postići sa agarozom. Tamo gde antitelo sadrži CH3 domen, Bakerbond ABX™ smola (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) je korisna za prečišćavanje. Druge tehnike za prečišćavanje proteina kao što su frakcionisanje na jono-izmenjivačkoj koloni, etanolsko taloženje, reverzno fazna HPLC, hromatografija na siliki, hromatografija na heparinu, SEPHAROSETM hromatografija na anjonsko ili katjonsko izmenjivačkoj smoli (kao što je kolona poliasparaginske kiseline), hromatofokusiranje, SDS- PAGE i amonijum sulfatno taloženje takođe su dostupni u zavisnosti od antitela koje se izoluje.

U jednoj varijanti, glikoprotein može biti prečišćen upotrebom adsorpcije na lektinskom supstratu (npr. lektin afmitetna kolona) da bi se uklonio glikoprotein koji sadrži fukozu iz preparata i na taj način obogatio za glikoprotein bez fukoze.

Farmaceutske formulacije

Pronalazak sadrži farmaceutske formulacije PD-1 antitela ili fragmenta antitela prema pronalasku. Da bi se pripremile farmaceutske ili sterilne kompozicije, antitelo ili njegov fragment se mesa sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili inertnim puniocem, videti, npr., Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984). Formulacije terapeutskih i dijagnostičkih sredstava mogu biti pripremljene mešanjem sa fiziološki prihvatljivim nosačima, inertnim puniocima ili stabilizatorima u obliku, npr., liofilizovanih praškova, smeša tvrdih čestica u tečnosti, vodenih rastvora ili suspenzija (videti, npr., Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990} Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety; Marcel Dekker, Ine., New York, NY).

Toksičnost i terapeutska efikasnost kompozicija antitela, primenjenih pojedinačno ili u kombinaciji sa imunosupresivnim sredstvom, mogu se odrediti pomoću standardnih farmaceutskih postupaka u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama, npr., za određivanje LD50 (doza letalna za 50% populacije) i ED5o (doza koja je tarapeustki efikasna kod 50% populacije). Odnos doze između toksičnih i terapeutskih efekata je terapeutski indeks i on može biti izražen kao odnos između ID50 i ED50. Rezultati dobijeni iz ovih testova ćelijske kulture i studija na životinjama mogu se koristiti u formulaciji opsega doza za upotrebu kod ljudi. Doza takvih jedinjenja leži poželjno unutar opsega koncentracija u cirkulaciji koje obuhvataju ED5o sa malo ili bez toksičnosti. Doza može da varira unutar ovog opsega u zavisnosti od oblika doze koji je korišćen i korišćenog načina primene.

Pogodni načini primene obuhvataju parenteralnu primenu, kao stoje intramuskulama, intravenska ili subkutana primena i oralnu primenu. Primena antitela korišćenog u farmaceutskoj kompoziciji ili za izvođenje postupka prema predstavljenom pronalasku može se izvesti na niz različitih konvencionalnih načina, kao što je oralno ingestijom, inhalacijom, topikalnom primenom ili kutano, subkutano, intraperitonealno, parenteralno, intraarterijskom ili intravenskom injekcijom. U jednoj varijanti, vezujuće jedinjenje prema pronalasku se primenjuje intravenski. U sledećoj varijanti, vezujuće jedinjenje prema pronalasku primenjuje se subkutano.

Alternativno, moguće je primenjivati antitelo pre na lokalni nego na sistemski način, na primer, preko injekcije antitela direktno u mesto delovanja, često u depo formulaciji ili formulaciji sa produženim oslobađanjem. Pored toga, moguće je primeniti antitelo u ciljanom sistemu za primenu leka.

Dostupni su vodiči u izboru odgovarajućih doza antitela, citokina i malih molekula (videti, npr., Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert, et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom, et al. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon, et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz, et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh, et al. (2003) New Engl. J. Med 348:24-32; Lipsky, et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602).

Određivanje odgovarajuće doze vrši lekar, npr., upotrebom parametara ili faktora za koje je u tehnici poznato ili se sumnja da utiču na lečenje ili za koje se predviđa da utiču na lečenje. Generalno, doza počinje sa količinom nešto manje od optimalne doze i ona se povećava za mala povećanja sve dok se željeni ili optimalni efekat ne postigne u odnosu na sve negativne sporedne efekte. Značajne dijagnostičke mere obuhvataju one od simptoma od npr., inflamacije ili nivoa proizvedenih inflamatomih citokina.

Antitela, fragmenti antitela i citokini mogu biti obezbeđeni kontinuiranom infuzijom, ili sa dozama u intervalima od, npr., jednom dnevno, jednom nedeljno ili 1-7 puta nedeljno. Doze mogu biti obezbeđene intravenski, subkutano, intraperitonealno, kutano, topikalno, oralno, nazalno, rektalno, intramuskulamo, intracerebralno, intraspinalno ili inhalacijom. Poželjan protokol doziranja je onaj koji uključuje maksimalnu dozu ili učestalost doze koji izbegava značajne neželjene sporedne efekte. Ukupna nedeljna doza je uopšteno najmanje 0.05 pg/kg telesne težine, uopštenije najmanje 0.2 pg/kg, najuopštenije najmanje 0.5 pg/kg, tipično najmanje 1 pg/kg, tipičnije najmanje 10 pg/kg, najtipičnije najmanje 100 pg/kg, poželjno najmanje 0.2 mg/kg, poželjnije najmanje 1.0 mg/kg, najpoželjnije najmanje 2.0 mg/kg, optimalno najmanje 10 mg/kg, optimalnije najmanje 25 mg/kg i najoptimalnije najmanje 50 mg/kg (videti, npr., Yang, et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold, et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu, et al. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji, et al. (20003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144). Željena doza leka malog molekula, npr., peptidnog mimetika, prirodnog proizvoda ili organske hemikalije, je oko iste kao za antitelo ili polipeptid, na bazi mola/kg.

Kao što je ovde korišćeno, "inhibira" ili "leči" ili "lečenje/tretman" obuhvataju odlaganje razvoja simptoma povezanih sa bolešću i/ili redukciju u težini takvih simptoma koji će se ili se očekuje da će se razviti sa navedenom bolešću. Ovi termini dalje obuhvataju poboljšanje postojećih simptoma, prevenciju dodatnih simptoma i poboljšanje ili prevenciju osnovnih uzroka takvih simptoma. Na taj način, ovi termini označavaju da je koristan rezultat obezbeđen kičmenjačkom subjektu sa bolešću.

Kao što je ovde korišćen, termin "terapeutski efikasna količina" ili "efikasna količina" označava količinu anti-PD-1 antitela ili njegovog fragmenta, koja kada se primenjuje pojedinačno ili u kombinaciji sa dodatnim terapeutskim sredstvom na ćeliju, tkivo ili subjekat je efikasna u prevenciji ili poboljšanju bolesti ili stanja koja/koje se leči. Terapeutski efikasna količina dalje označava onu količinu jedinjenja koja je dovoljna da rezultira u poboljšanju simptoma, npr., lečenju, isceljenju, prevenciji ili poboljšanju relevantnog medicinskog stanja, ili povećanju stope lečenja, isceljenja, prevencije ili poboljšanja takvih stanja. Kada se primenjuje na individuu aktivni sastojak primenjen pojedinačno, terapeutski efikasna doza se odnosi na taj sastojak pojedinačno. Kada se primenjuje u kombinaciji, terapeutski efikasna doza se odnosi na kombinovane količine aktivnih sastojaka koja rezultira u terapeutskom efektu, bilo primenjena u kombinaciji, serijski ili istovremeno. Efikasna količina leka će smanjiti simptome tipično za najmanje 10%; obično za najmanje 20%; poželjno najmanje oko 30%; poželjnije najmanje 40%, i najpoželjnije za najmanje 50%.

Postupci za ko-primenu ili lečenje sa drugim terapeutskim sredstvom su dobro poznati u tehnici, videti, npr., Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, NY; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA.

Farmaceutska kompozicija prema pronalasku može takođe da sadrži drugo sredstvo, uključujući ali bez ograničenja na citotoksično, citostatičko, anti-angiogeno ili antimetaboličko sredstvo, sredstvo usmereno na tumor, imuno stimulirajuće ili imuno modulirajuće sredstvo ili antitelo konjugovano sa citotoksičnim, citostatičkim ili inače toksičnim sredstvom. Farmaceutska kompozicija takođe može biti korišćena sa drugim terapeutskim modalitetima kao što su operacija, hemoterapija i zračenje.

Tipični veterinarski, eksperimentalni ili istraživački subjekti obuhvataju majmune, pse, mačke, pacove, miševe, zečeve, zamorčiće, konje i ljude.

Terapeutske upotrebe za antitelo i fragmente antitela prema pronalasku

Antitelo ili fragmenti koji se vezuju za antigen prema pronalasku, koji se specifično vezuju za humani PD-1, mogu se koristiti za povećanje, pojačanje, stimulaciju i ushodnu regulaciju imunog odgovora. Antitela i fragmenti antitela prema pronalasku su naročito pogodni za lečenje subjekata koji imaju poremećaj koji se može lečiti povećanjem T-ćelijski posredovanog imunog odgovora. Poželjni subjekti obuhvataju humane pacijente kod kojih postoji potreba za pojačanjem imunog odgovora.

Kancer

Antitelo ili fragmenti koji se vezuju za antigen prema pronalasku mogu se koristiti za lečenje kancera (tj., za inhibiciju rasta ili preživljavanja tumorskih ćelija). Poželjni kanceri čiji rast može biti inhibiran upotrebom antitela prema pronalasku obuhvataju kancere koji tipično imaju odgovor na imunotrerapiju, ali takođe kancere koji do sada nisu bili povezani sa imunoterapijom. Neograničavajući primeri poželjnih kancera za lečenje obuhvataju melanom (npr., metastazirajući maligni melanom), renalni kancer (npr. svetloćelijski karcinom), kancer prostate (npr. hormonski reffaktomi adenokarcinom prostate), adenokarcinom pankreasa, kancer dojke, kancer debelog creva, kancer pluća (npr. nesitnoćelijski kancer pluća), kancer jednjaka, karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata, kancer jetre, kancer jajnika, kancer grlića materice, kancer tireoidee, glioblastom, gliom, leukemiju, limfom i druge neoplastične malignitete. Pored toga, pronalazak obuhvata refraktome ili povratne malignitete čiji rast može biti inhibiran upotrebom antitela prema pronalasku.

Antitelo ili fragmenti antitela prema pronalasku mogu se koristiti pojedinačno ili u kombinaciji sa: drugim anti-neoplastičnim sredstvima ili imunogenim sredstvima (na primer, atenuirane ćelije kancera, tumorski antigeni (uključujući rekombinantne molekule proteina, peptida i ugljenih hidrata), antigen prikazujuće ćelije kao što su dendritske ćelije pulsirane sa antigenom ili nukleinskim kiselinama poreklom od tumora, imuno stimulirajući citokini (na primer, IL-2, IFNa2, GM-CSF_), i ćelije transficirane sa genima koji kodiraju imune stimulirajuće citokine kao što su, ali bez ograničenja na GM-CSF); standardni tretmani protiv kancera (na primer, hemoterapija, radioterapija ili operacija); ili druga antitela (uključujući, ali bez ograničenja na, antitela za VEGF, EGFR, Her2/neu, VEGF receptore, receptore drugih faktora rasta, CD20, CD40, CTLA-4, OX-40, 4- IBB i ICOS).

Infektivne bolesti

Antitelo ili fragmenti antitela prema pronalasku takođe se mogu koristiti za prevenciju ili lečenje infekcija i infektivnih bolesti. Antitelo ili fragmenti antitela mogu se koristiti pojedinačno, ili u kombinaciji sa vakcinama, za stimulaciju imunog odgovora na patogene, toksine i auto-antigene. Antitela ili njihov fragment koji se vezuje za antigen mogu se koristiti za stimulaciju imunog odgovora na virusne infekcije kod ljudi, kao što su, ali bez ograničenja na, virusi humane imunodeficijencije, virusi hepatitisa klase A, B i C, Eppstein Barr virus, humani citomegalovirus, humani papiloma virusi, herpes virusi. Antitela ili njihov fragment koji se vezuje za antigen mogu se koristiti za stiumulaciju imunog odgovora na infekciju sa bakterijskim ili gljivičnim parazitima, i drugim patogenima.

Adjuvant za vakcinaciju

Antitelo ili fragmenti antitela prema pronalasku mogu se koristiti zajedno sa drugim rekombinantnim proteinima i/ili peptidima (kao što su tumorski antigeni ili ćelije kancera) u cilju povećanja imunog odgovora na ove proteine (tj., u vakcionacionom protokolu).

Na primer, anti-PD-1 antitela i njegovi fragmenti mogu se koristiti za stimulaciju antigen-specifičnih imunih odgovora putem istovremene primene anti-PD-1 antitela sa antigenom od interesa (npr., vakcina). Prema tome, u sledećem aspektu pronalazak daje postupak za pojačanje imunog odgovora na antigen kod subjekta, koji sadrži primenu na subjekta: (i) antigena; i (ii) anti-PD-1 antitela prema pronalasku ili njegovog dela koji se vezuje za antigen, tako daje imuni odgovor na antigen u subjektu pojačan. Antigen može biti, na primer, tumorski antigen, virusni antigen, bakterijski antigen ili antigen od patogena. Neograničavajući primeri takvih antigena obuhvataju, bez ograničenja, tumorske antigene ili antigene od virusa, bakterija ili drugih patogena.

Th2 posredovane bolesti

Anti-PD-1 antitela i fragmenti antitela prema pronalasku takođe se mogu koristiti za lečenje Th2 posredovanih bolesti, kao što su astma i alergija. Ovo je zasnovano na nalazu da antitela prema pronalasku mogu da pomognu u indukciji Th2 odgovora. Na taj način, antitela prema pronalasku mogu biti korišćena kod Th2 posredovanih bolesti da bi se generisao uravnoteženiji imuni odgovor.

Ex vivo aktivacija T ćelija

Antitela i fragmenti antigena prema pronalasku takođe se mogu koristiti za ex vivo aktivaciju i širenje antigen specifičnih T ćelija i adoptivni transfer ovih ćelija u primaoce u cilju povećanja antigen-specifičnih T ćelija protiv tumora. Ovi postupci takođe se mogu koristiti za aktivaciju T ćelijskih odgovora na infektivne agense kao što je CMV. Može se očekivati da ex vivo aktivacija u prisustvu anti-PD-1 antitela povećava učestalost i aktivnost adoptivno prenetih T ćelija.

Druge kombinovane terapije

Kao što je prethodno opisano, anti-PD-1 antitela prema pronalasku mogu biti ko- primenjivana sa jednim ili više drugih terapeutskih sredstava, npr., citotoksičnim sredstvom, radiotoksičnim sredstvom ili imunosupresivnim sredstvom. Antitelo može biti vezano za sredstvo (kao imunokompleks) ili se može primenjivati odvojeno od sredstva. U posledenjm slučaju (posebna primena), antitelo može biti primenjivano pre, posle ili istovremeno sa sredstvom ili može biti ko-primenjivano sa drugim poznatim terapijama.

Antitela i fragmenti koji se vezuju za antigen prema pronalasku takođe se mogu koristiti za povećanje efikasnosti specifičnih T ćelija iz tumora graftovanih iz davaoca.

Ne-terapeutske upotrebe za antitelo i fragmente antitela prema pronalasku

Tržište za anti-PD-1 antitela za ne-terapeutske upotrebe već postoji, kao što je pokazano komercijalnim prodajama JI 16, i J105 monoklonalnih anti-hPD-1 antitela koje prodaje eBioscience iz San Diego, Califomia, USA, za upotrebu u protočno citometrijskim analizama, imunohistohemiji i in vitro funkcionalnim testovima; i mabl086, monoklonalnog anti-hPD-1 antitela koje prodaje R&D Systems of Minneapolis, MN, USA, za upotrebu u protočnoj citometriji, Westem blot-ovima i ELISA. Antitela prema pronalasku mogu biti korišćena za bilo koju ne-terapeutsku namenu za koju se sada koristi JI 16, JI05 i/ili Mabl086.

Antitelo prema pronalasku može se koristiti kao sredstvo za afinitetno prečišćavanje.

Antitelo takođe može biti korisno u dijagnostičkim testovima, npr., za detekciju ekspresije PD-1 u specifičnim ćelijama, tkivima ili serumu. Za dijagnostičke primene, antitelo tipično će biti obeleženo (bilo direktno ili indirektno) sa detektabilnom grupom. Dostupni su brojni obeleživači koji mogu biti generalno grupisani u sledeće kategorije: biotin, fluorohromi, radionukleotidi, enzimi, jod i biosintetički obeleživači.

Antitelo prema predstavljenom pronalasku može biti korišćeno u bilo kom poznatom postupku testa, kao što su testovi kompetitivnog vezivanja, direktni i indirektni ,,sendvič“ testovi i imunoprecipitacioni testovi. Zola, Monoclonal Antibodies. A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Ine. 1987).

Antitelo se takođe može koristiti za in vivo dijagnostičke testove. Generalno, antitelo je obeleženo sa radionuklidom (kao što je mIn, 99Tc, °C,311, l251,3H, 32P, 35S ili 18F) tako da se antigen ili ćelije koje ga eksprimiraju mogu lokalizovati upotrebom imunoscintiografije ili pozitronske emisione tomografije.

Deponovanje materijala

DNK konstrukti koji kodiraju varijabilne regione teških i lakih lanaca humanizovanih antitela h409All, h409A16 i h409A17 đeponovani su u American Type Culture Collection Patent Depository (10801 University Blvd., Manassas, VA). Plazmid koji sadrži DNK koja kodira težak lanac h409A-l 1, h409A-16 i h409A-17 deponovanje 09.06.2008. i identifikovan kao 081469_SPD-H. Plazmid koji sadrži DNK koja kodira laki lanac h409All deponovan je 09.06.2008. i identifikovan kao 0801470 SPD-L-11. Plazmid koji sadrži DNK koja kodira laki lanac h409A16 deponovan je 09.06.2008. i identifikovan kao 0801471 SPD-L-16. Plazmid koji sadrži DNK koja kodira laki lanac h409A17 deponovan je 09.06.2008. i označen je kao 0801472_SPD-L-17. Deponovanje je izvedeno prema odredbama Budampeštanskog ugovora o međunarodnom priznavanju depozita mikroorganizama za potrebe patentnog postupka i Regulativama ispod toga (Budampšetaski Ugovor).

Prethodno navedena pisana specifikacija se smatra dovoljnom da omogući stručnjaku iz date oblasti tehnike da izvede pronalazak. Predstavljeni pronalazak nije ograničen u obimu deponovanom kulturom, s obzirom na to da je deponovana varijanta namenjena kao jedna ilustracija jednog aspekta pronalaska i svaka kultura koja je funkcionalno ekvivalentna je unutar obima ovog pronalaska. Depozit materijala ovde ne čini priznanje da je ovde sadržani pisani opis nedovoljan da omogući izvođenje bilo kog aspekta pronalaska, uključujući njegov najbolji modalitet, niti bi ga trebalo tumačiti kao da ograničava obim patentnih zahteva na specifičnu ilustraciju koju on predstavlja. Zaista, različite modifikacije pronalaska pored onih prikazanih i opisanih ovde postaće jasne stručnjacima iz date oblasti tehnike iz prethodnog opisa i one spadaju unutar obima priloženih patentnih zahteva.

Pronalazak će biti potpunije shvaćen u vezi sa sledećim primerima. Njih, međutim, ne bi trebalo tumačiti kao da ograničavaju obim ovog pronalaska.

PRIMERI

Primer 1: Imunizacija I selekcija anti-PD-1 antitela Imunizacija miševa sa hPD-1 cDNK

Da bi se generisala antitela protiv humanog PD-1 ('hPD-l') receptora, cDNK koja kodira otvoreni okvir čitanja hPD-1 receptora dobijena je pomoću PCR-a i sub-klonirana u vektor pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad; CA). Zatim, CHO-K1 ćelije su stabilno transficirane sa hPD-1, i ekspresija je praćena upotrebom protočne citometrije. Izolovani su CHO-K1 klonovi koji eksprimiraju humani PD-1 na njihovim membranama i označeni su kao CHO- hPDl.

Miševi su imunizovani imunizacijom sa genskim pištoljem upotrebom Helios genskog pištolja (BioRad) i zlatnih metaka obloženih sa DNK (BioRad) praćenjem uputstava proizvođača. Ukratko, 1 pm zlatnih čestica obloženo je sa hPD-1 cDNK (klonirana u pcDNA3.1) i, gde je naznačeno, komercijalni ekspresioni vektori za mišji Flt3L i mišji GM- CSF u odnosu 2:1:1 (oba iz Aldevron, Fargo ND). Ukupno 1 pg plazmidne DNK je korišćeno za oblaganje 500 pg zlatnih metaka.

Posebno, 7-8 nedelja stare ženke BALB/C miševa su imunozovane na uvu pomoću genskog pištolja primajući 2, 3 ili 4 ciklusa pucanja na oba uva (videti Tabelu I). Jedan mišje primio krajnju revakcinaciju sa 5 x IO6 CHO-hPDl ćelija u peritonealnu šupljinu. Približno, 1:1000 anti-hPD-1 titar je bio detektabilan u mišjem serumu posle dve DNK imunizacije pomoću ćelijske ELISA upotrebom CHO-hPD-1 naspram CHO-K1 matičnih ćelija. Četiri dana posle krajnje imunizacije, miševi su žrtvovani, i ćelijske populacije slezine sa depletiranim eritrocitima pripremljene su kao što je prethodno opisano (Steenbakkers et al., 1992, J. Immunol. Meth. 152:69-77; Steenbakkers et al., 1994, Mol. Biol. Rep. 19:125-134) i zamrznute na -140°C.

Selekcija B ćelija koje proizvode anti-PD-1 antitelo

Da bi se selekcionisali B ćelijski klonovi koji proizvode anti-humana-PD-1 antitela, 2 x IO7 ćelija slezine sa depletiranim eritrocitima iz miševa imunizovanih sa hPD-1 DNK, tj., iz miša 730, 731 i 738 (videti Tabelu I), su sakupljene za B-ćelijsku kulturu. Ćelije slezine su inkubirane u DMEM/HAM's F12/10% telećem serumu (Hyclone, Logan, UT, USA) u trajanju od jednog časa na 37°C u plastičnoj posudi za kulturu da bi se uklonili monociti. Ćelije koje ne prijanjaju podvrgnute su jednom ciklusu negativnog paninga na CHO-K1 ćelijama, a zatim pozitivnom paningu na CHO-hPDl ćelijama. Oba selekciona postupka su izvedena za jedan čas na 37°C na konfluentno izraslim kulturama u Petrijevim posudama od 21 cm ili T25 bočicama za kulturu (ćelijske kulture su zračene pre upotrebe, do ukupne doze od 2000 RAD). Posle pozitivnog paninga, nevezane ćelije su uklonjene ispiranjem deset puta sa PBS dopunjenim sa 0.132% CaCl2.2H20 i 0.1% MgCb.ćFhO. Konačno, vezane B-ćelije su sakupljene pomoću tretmana sa tripsinom.

Selekcionisane B-ćelije su kultivisane i imortalizovane kao što je opisano u Steenbakkers et al., 1994, Mol. Biol. Rep. 19:125-134. Ukratko, selekcionisane B ćelije su mešane sa 7.5% (zapr./zapr.) T-ćelijskim supematantom i 50,000 ozračenih (2,500 RAD) EL- 4 B5 ćelija dadilja u krajnoj zapremini od 200 pL DMEM/HAM's F12/10% telećeg seruma, u 96-komomim pločama sa ravnim dnom za kulturu tkiva. Na dan osam, supematanti su ispitivani za njihovu anti-hPD-1 reaktivnost pomoću CHO-hPD-1 ćelijske ELISA upotrebom sledećeg postupka. CHO-K1 i CHO-hPDl I ćelije su kultivisane do konfluentnosti u 96- komomim pločama sa ravnim dnom u 50 pL DMEM/HAM'S F12, 10% FBS. Sledeće, 50 pL supematanta koji sadrži imunoglobulin je dodavano u trajanju od 1 časa na 37°C. Posle tri ispiranja sa PBS-Tween, 100 pL (1:1000 razblažena) kozje-anti-mišje-renove peroksidaze (HRP, Southern, Birmingham, AL, USA) u DMEM/HAM'S F12/10% FBS je dodavano u trajanju od 1 časa na 37°C. Posle tri ispiranja sa PBS-Tween, imobilizovani imunoglobulini su vizualizovani sa UPO/TMB (Biomerieux, Boxtel, Netherlands).

Iz ove B-ćelijske kulture, identifikovano je 13 hPD-1 reaktivnih supematanata i pokazano je da inhibiraju Jurkat T ćelijsku aktivaciju kada su imobilizovani na plastici, i B- ćelijski klonovi iz pozitivnih ćelija su imortalizovani pomoću mini-elektrofuzije praćenjem objavljenih postupaka (Steenbakkers et al., 1992, J. Immunol. Meth. 152:69-77; Steenbakkers et al., 1994, Mol. Biol. Rep. 19:125-134). Posebno, B-ćelije su mešane sa IO6 NS-1 mijeloma ćelija, i serum je uklonjen ispiranjem sa DMEM/HAM's F12. Sledeće, ćelije su tretirane rastvorom pronaze u trajanju od tri minuta i zatim isprane fuzionom podlogom. Elektrofuzija je izvedena u 50 pL fuzinoj komori pomoću naizmeničnog električnog polja od 30 s, 2 MHz, 400 V/cm nakon čega sledi kvadratni puls polja visokog intenziteta od 10 ps, 3 kV/cm i ponovo naizmenično električno polje od 30 s, 2 MHz, 400 V/cm. Konačno, sadržaj fuzione komore je prebačen u podlogu za selekciju hibridoma i postavljen u 96-komomu ploču pod uslovima ograničenog razblaženja. Na dan 14 posle fuzije, kulture su ispitane za rast hibridoma i ispitivane za prisustvo reaktivnosti antitela za hPD-1. Ovaj postupak je proizveo pet različitih anti-hPD-1 hibridoma, pod nazivom hPD-1.05A, hPD-1.06B, hPD-1.08A, hPD- 1.09A i hPD-1.13A, koji su subklonirani pomoću ograničavajućeg razblaženja da bi se zaštitila njihova celovitost i dalje su kultivisani da bi proizveli antitelo. Supematanti dobijeni iz ovih hibridoma snažno su inhibirali proizvodnju IL-2 iz Jurkat E6.2.11 ćelija posle stimulacije sa anti-CD3/anti~CD28 (videti Sliku 1 i dalji tekst).

Jurkat E6.1 ćelije (American Type Culture Collection) su subklonirane ograničenim razblaženjem upotrebom standardne metodologije i subklonovi su testirani za pojačani kapacitet da proizvode IL-2 posle unakrsnog vezivanja CD3 i CD28. Subklon sa visokom proizvodnjom IL-2 je dobijen i kasnije označenim kao Jurkat E6.2.1 i korišćen u daljim testovima. Costar 3370 96-komome test ploče su obložene preko noći na 4°C sa 5 pg/mL ovčjeg anti-mišjeg Ig (SAM). Višak SAM je uklonjen i ploče su blokirane u trajanju od 1 časa na sobnoj temperaturi sa 200 pL/kornorici PBS/10% fetusnog goveđeg seruma. Posle tri ispiranja sa PBS, komorice su obložene sa 100 pL/komorici anti-CD3 (OKT3; 10 ili 60 ng/mL) u trajanju od 1 časa na 37°C. Posle tri ispiranja sa PBS, 50 pL/komorici PBS/10% fetusnog goveđeg seruma i 50 pL/komorici supematna B-ćelija ili hibridoma je dodavano u trajanju od 30 min na 37°C. Posle tri ispiranja sa PBS, dodato je 120 pL/komorici ćelijske suspenzije, Jurkat E6.2.11 ćelija (2xl65 ćelija/komorici + 0.5 pg/mL anti-CD28 (Sanquin #M1650, Central Laboratory for Bloodtransfusion, Amsterdam, NL) u DMEM/F12/10% fetusnog goveđeg seruma). Posle 6 časova kulture, supematant je ispitivan za proizvodnju IL- 2 upotrebom standardne „sendvič44 ELISA sa hvatanjem anti-hIL-2 i botinilovanim detekcionim parovima antitela iz Pharmingen and Streptavidin-Horse Radish Peroxidase (Southern Biotech) kao detekcionim reagensom. Da bi se odredila potencija ovih antitela u poređenju sa PD-L1, mala grupa mAb antitela je proizvedena u velikim razmerama. mAb antitela su prečišćena upotrebom protein G afinitetne hromatografije (videti Primer 2). Prečišćena antitela, hPD-Ll/Fc (rekombinantna humana B7-Hl/Fc himera, R&D systems) ili mišji IgGl kapa (iz Sigma) kao negativna kontrola obložena su u istim koncentracijama na pločama sa anti-CD3 kao što je opisano u prethodnom tekstu. Jurkat E6.2.11 ćelije i anti- CD28 dodavani su šest časova, i T-ćelijska aktivacija je merena pomoću IL-2 proizvedenog u supematantu. Dva od antitela (hPD1.08A i hPD1.09A) pokazala su 8-10 struko potentniju inhibiciju u poređenju sa imobilizovanim PD-Ll/Fc.

Primer 2: Prečišćavanje i karakterizacija mišjih anti-PD-1 antitela

Stabilizacija hibridoma koji proizvode anti-PD-1 i prečišćavanje anti-PD-1 antitela

Populacije klonalnih ćelija dobijene su za svaki od hibridoma njihovim podvrgavanjem višestrukim ciklusima (>4) ograničenog razblaženja. Stabilne hibridoma ćelije su zatim kultivisane pod uslovima bez seruma upotrebom CELLine bioreaktora (Integra-biosciences) u trajanju od šest do osam dana. Ćelije su zasejane u unutrašnju komoru u podlozi bez seruma u gustini od 3 x 10 c/mL u 15 mL i proširene do probližno 4x10 c/mL tokom osam dana. Spoljašnja komora je napunjena podlogom dopunjenom sa do 10% BCS (telećeg seruma). Na dan šest do osam, sakupljena je kultura unutrašnje komore, isprana je sa 15 mL SF podloge i ponovo inokulisana sa hibridoma ćelijama. Supematant iz bioreaktora i tečni ostatak od ispiranja su spojeni i razbistreni centri fugiranj em. Dobijeni supematant je filtriran kroz 0.22 pM filtersku membranu. Za prečišćavanje antitela, supematanti su razblaženi 1:1 u vezujućem puferu sa visokom koncentracijom soli (IM Glicin/2M NaCl, pH 9.0), i mAb antitela su prečišćena upotrebom Protein G HiTrap 5 mL kolone (GE healthcare). Posle ispiranja sa PBS, vezana antitela su eluirana upotrebom 0.1 M Glicina pH = 2.7, nakon čega sledi pH neutralizacija upotrebom 3 M Tris. Konačno, pufer je izmenjen za PBS upotrebom PD-10 gel-filtracionih kolona (GE healthcare), i antitela su koncentrovana upotrebom Ultra-15 centrifugalnih koncentratora (Amicon) i kvantitativno određena upotrebom spektrofotometrije.

Komercijalna antitela

Sledeća komercijalna antitela su korišćena u različitim studijama koje su ovde opisane: Klon anti-PD-1 antitela JI 16 (#14-9989) je kupljen iz eBioscience. Anti-CTLA-4 klon 14D3 (mAb 16-1529) je kupljen iz eBioscience. Anti-PD-1 klon 192106 (mAbl086) je kupljen iz R&D systems (#mAb!086). Izotipska kontrola antitelo mlgGl, kapa, klon MOPC21 je kupljena iz Sigma (#M9269). Izotipska kontrola mlgGl kapa (mAb 16-4714) i IgG2a kapa (mAb 16-4724) kupljene su iz eBioscience.

Analiza vezivanja

ELISA eksperimenti na bazi proteina i na bazi ćelija ('CELISA') korišćeni su za određivanje vidljivih afiniteta vezivanja (objavljeni kao EC50 vrednosti). U nekim slučajevima, vezivanje anti-PD-1 antitela je poređeno sa onim kod komercijalnih anti-PD-1 antitela JI 16 (eBiosciences) i Mabl086 (R&D systems).

Proteinska ELISA je korišćena za određivanje relativnog vezivanja antitela za humani PD-l/Fc. hPD-l/Fc (R&D Systems) je imobilizovan na Maxisorp 96-komome ploče (Nunc) inkubacijom u trajanju od 4 časa na sobnoj temperaturi (ili preko noći na 4°C). Nespecifična vezujuća mesta su blokirana inkubacijom sa 3% BSA u PBST u trajanju od jednog časa na sobnoj temperaturi. Posle oblaganja, ploče su isprane tri puta sa PBST. Razblaženja anti-PD-1 antitela su pripremljena u vezujućem puferu (PBS koji sadrži 0.1% Tween 20 i 0.3% BSA) i inkubirana sa imobilizovanim fuzionim proteinom u trajanju od jednog časa na 25°C. Posle vezivanja, ploče su isprane tri puta sa PBST, inkubirane jedan čas na 25°C sa kozjim anti- mišjim IgG obeleženim peroksidazom (Southern Biotech) razblaženim 1/4,000 u vezujućem puferu, ponovo isprane i razvijene upotrebom TMB. Rezultati ELISA-e su prikazani na Slici 2. Koncentracija polu-maksimalnog vezivanja je objavljena kao mera relativnog afiniteta vezivanja (Tabela II).

Vezivanje za CHO-hPD-1 ćelije takođe je procenjeno pomoću CELISA. Za CELISA, CHO-hPD-1 ćelije su kultivisane do 80 do 100 procenata konfluentnosti u 50 pL podloge za kulturu (DMEM/HAM'S F12, 10% FBS). Sledeće, 50 pL podloge koja sadrži različite koncentracije prečišćenog mAb dodavano je u trajanju od jednog časa na 37°C. Posle tri ispiranja sa PBS-Tween, 100 pL kozjeg-anti-mišjeg-HRP (Southern Biotech cat #1030-05) (razblaženog 1:1000 u podlozi za kulturu) dodavano je u trajanju od jednog časa na 37°C. Posle tri dodatna ispiranja sa PBS-Tween, imobilizovani imunoglobulini su vizualizovani sa kolorimetrijskim supstratom peroksidaze TMB (BD Biosciences). Povećanje apsorbance kao posledica aktivnosti peroksidaze (450 nm) mereno je u mikrolitarskom uređaju za očitavanje ploče. Slika 2 prikazuje vezu doze i odgovora između koncentracije i vezivanja za antitela hPD-1.08A i hPD-1.09A. Rezultati studija vezivanja ćelije i proteina su rezimirani u Tabeli II.

Kinetička analiza pomoću ,,bio-light“ interferometrije (ForteBio)

Da bi dalje okarakterisali karakteristike vezivanja antitela, svako je profilisano upotrebom ,,bio-light“ interferometrije na Octet system (ForteBio, Menlo Park, CA) da bi se razjasnila kinetika vezivanja i da bi se izračunale ravnotežne konstante vezivanja. Ovaj test je izveden spajanjem PD-l-Fc fuzionog proteina (R&D Systems) sa amin-reaktivnim biosenzorima (Fortebio) upotrebom standardnih hemijskih postupaka vezanih za amine. Vezivanje za i odvajanje anti-PD-1 mAb od biosenzora je zatim posmatrano na različitim koncentracijama antitela. Posebno, amin-reaktivni biosenzori su prethodno navlaženi njihovim potapanjem u komorice koje sadrže 0.1M MES pH = 5.5 u trajanju od 5 minuta. Biosenzori su zatim aktivirani upotrebom 0.1M NHS / 0.4M EDO smeše u trajanju od 5 minuta. PD-l/Fc fuzioni protein (R&D systems) je spojen potapanjem biosenzora u rastvor od 12 ug/mL PD-l/Fc u 0.1M MES u trajanju od 7.5 minuta. Površina biosenzora je ugašena upotrebom rastvora od IM etanolamina u trajanju od 5 minuta. Biosenzori su ekvilibrisani u PBS u trajanju od 5 minuta. Vezivanje anti-PD-1 mAb antitela je zabeleženo postavljanjem biosenzora u komorice koje sadrže različite koncentracije antitela (10-80 nM prečišćeno antitelo >99% pomoću SDS-PAGE u PBS) i praćenjem interferometrije u trajanju od 30 minuta. Odvajanje je mereno posle prenosa biosenzora u PBS i praćenjem signala interferometrije u trajanju od 60 minuta. Zabeležene konstantne disocijacije i afiniteta (kobs i kd) su fitovane upotrebom 1:1 vezujućeg globalnog prikaldnog modela koji sadrži sve testirane koncentracije, i izračunata je ravnotežna konstanta vezivanja Kd- Rezultati iz kinetičkih studija su prikazani u Tabeli II, i Slici 6 u daljem tekstu.

Dva od monoklonalnih antitela, hPD-1.08A i hPD-1.09A, vezuju se znatno čvršće od bilo kog drugog mAb testiranog upotrebom ovog testa, pri čemu je Kd određena da je 24 i 22 pM za hPD-1.08A i hPD-1.09 A, respektivno. U poređenju sa drugim testiranim anti-PD-1 antitelima, povećani afinitet je posledica sporije konstante disocijacije i značajno brže konstante afiniteta izmerenih za hPD-1.08A i hPD-1.09A.

Blokada Uganda

Blokada vezivanja liganda je ispitivana upotrebom protočne citometrije. CHO ćelije koje eksprimiraju humani PD-1 odvojene su od bočica za kulturu za koje su prilepljene i mešane su sa različitim koncentracijama anti-PD-1 antitela i konstantnom koncentracijom (600 ng/mL) neobeleženog hPD-Ll/Fc ili rekombinantnog humanog PD-L2/Fc fuzionog proteina (oba iz R&D Systems) u 96-komomoj ploči. Smeša je ekvilibrisana u trajanju od 30 minuta na ledu, isprana tri puta sa FACS puferom (PBS koji sadrži 1% BCS i 0.1% natrijum azid), i inkubirana sa FITC obeleženim kozjim anti-humanim Fc dodatnih 15 minuta na ledu. Ćelije su ponovo isprane sa FACS puferom i analizirane pomoću protočne citometrije. Rezultati su analizirani sa Prism (GraphPad Software, San Diego, CA) upotrebom nelinearne regresije, i izračunate su IC50 vrednosti.

Izračunate IC50 vrednosti su rezimirane u Tabeli II. Antitela 05A, 06B i 13A su određena tako da pokazuju Kd između 600 pM i 3nM za vezivanje hPD-1. Uprkos čvrstom vezivanju, svako od ovih antitela pokazuje IC5o> 10 nM za blokadu vezivanja hPD-Ll za hPD-1. Komercijalno dostupno anti-PD-1 antitelo JI 16 (eBiosciences) je u slaboj kompeticiji

sa PD-L1 za vezivanje, i ima izračunatu IC50 vrednost izvan opsega ovog eksperimenta (>100, nM). Kontrolni mišji IgGl nije u kompeticiji sa PD-L1 za vezivanje za PD-1. Nasuprot tome, visoko afmitetna antitela hPD-1.08A i hPD-1.09A inhibirala su vezivanje PD- L1 sa IC50 vrednostima ispod 1 nM, dok je vezivanje PD-L2 bilo blokirano sa IC50 vrednostima oko 1-2 nM (Tabela II). Ranije je objavljeno da se PD-L2 vezuje za PD-1 sa dva- do šest-puta većim afinitetom od PD-L1 (Youngnak P. et al., 2003, Biochem. Biophys. Res. Commun. 307, 672-677).

Blokada liganda je potvrđena upotrebom homogenog testa kompeticije i detekcijom upotrebom tehnologije fluorimetrijskog mikrozapreminskog testa (FMAT). Ukratko, CHO.hPD-1 odvojene su od bočica za kulturu za koju su prilepljene, mešane sa različitim koncentracijama anti-PD-1 antitela i sa konstantnom koncentracijom (600 ng/mL) hPD-Ll/Fc ili hPD-L2/Fc fuzionog proteina (oba iz R&D Systems), obeleženog fluorescentnom bojom (AlexaFluor 647, Invitrogen) u 96-komomoj ploči. Smeša je ekvilibrisana u trajanju od 90 minuta na 37°C i očitavana korišćenjem AB8200 Cellular Detection Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). Rezultati su analizirani sa Prism (GraphPad Software, San Diego, CA) upotrebom nelinearne regresije, i izračunavane su IC50 vrednosti. Slika 3 prikazuje rezultate eksperimenta doze-odgovora koji ukazuju na to da veličinu blokade liganda određuje koncentracija antitela. Vezivanje i hPD-Ll/Fc i hPD-L2/Fc za CHO-hPD-1 ćelije može biti potpuno inhibirano sa hPD-1.08A, hPD-1.09A i (u manjem stepenu) sa 1116 na način zavistan od doze. Izračunate IC50 vrednosti su rezimirane u Tabeli II. Potvrđujući rezultate dobijene upotrebom protočne citometrije, visoko afinitetna antitela hPD-1.08A i hPD-1.09A inhibirala su vezivanje PD-L1 sa IC50 vrednostima ispod 1 nM.

Interspecijska unakrsna reaktivnost

Da bi se procenila interspecijska unakrsna reaktivnost antitela, PD-1 receptori miša i makaki majmuna su klonirani pomoću PCR-a i generisane su stabilno transficirane CHO-K1 ćelije. Antitela su testirana za vezivanje za makaki receptor upotrebom CELISA. Nađeno je da se komercijalna antitela JI 16, hPD-1.08A i hPD-1.09A vezuju sa istim afinitetom za humani i makaki PD-1 i blokiraju vezivanje hPD-Ll/Fc i hPD-L2/Fc za makaki PD-1 sa sličnom efikasnošću u poređenju sa humanim PD-1. Ovo nije iznenađujuće zbog toga što je nađeno daje aminokiselinska sekvenca ekstracelulamog dela makaki PD-1 97% identična sa onom od humanog PD-1. Pored PD-1 iz makakija, hPD-1.08A i hPD-1.09A su takođe funkcionalno blokirali PD-1 iz rezus makakija u kulturama SEB stimulisanih krvnih ćelija opisanih u Primeru 3. Nijedno od testiranih antitela nije vezalo mišji PD-1 sa detektabilnim afinitetom u bilo kom od korišćenih testova.

Ukratko, prečišćeno je i okarakterisano pet anti-PD-1 monoklonalnih antitela, koja su izolovana na bazi njihove sposobnosti da moduliraju Jurkat funkciju. Ova antitela se čvrsto vezuju za PD-1 (sa konstantama disocijacije u opsegu od 20 pM do 3 nM) i bila su sposobna da blokiraju interakciju sa oba PD-L1 i PD-L2 sa različitim 1C50 vrednostima. Četiri od ovih anti-hPD-1 mAb antitela su bila značajno bolja od najboljih dostupnih komercijalnih anti-PD- 1 mAb antitela. Svako od antitela, kada se doda u rastvor delovalo je kao antagonisti receptora, konačno pojačavajući T ćelijske odgovore (videti Primer 3).

Primer3: Funkcionalno profilisanje anti-PD-1 antitela

Odgovor humanih T ćelija na SEB je pojačan sa hPD~1.08A i hPĐ-1.09A

Anti-PD-1 antitela su testirana za njihov kapacitet da pojačaju T ćelijsku aktivnost in vitro upotrebom ćelija krvi od zdravih dobrovoljaca. Jedan test korišćen za karakterizaciju funkcionalne posledice blokiranja humanog PD-1 receptora koristio je enterotoksin B Staphylococcus-a (SEB) da zauzme i aktivira sve T ćelije koje eksprimiraju V[33 i Vp8 T ćelijski receptomi lanac. Krv od zdravog humanog davaoca je dobijena i razblažena 1:10 u podlozi za kulturu. Razblažena ćela krv je postavljena (150 pl po komoric) u 96-komome ploče sa okruglim dnom i preinkubirana u trajanju od 30-60 min sa mAb i različitim koncentracijama. Zatim je dodat SEB u različitim koncentracijama u opsegu od 10 ng/mL do 10 pg/mL. Supematanti su sakupljeni posle 2 do 4 dana kulture i količina proizvedenog IL-2 je kvantitativno određena upotrebom ELISA (opisano u Primeru 1) ili upotrebom standardne ,,multiplex“ tehnologije (Luminex platform-Biosource kompleti za detekciju citokina). Titracija SEB od 100 ng/mL do 10 pg/mL značajno je stimulisala proizvodnju IL-2 od strane ćelija ćele krvi. Obično, u zavisnosti od davaoca, 100 do 1000 pg/mL IL-2 je moglo da se detektuje pomoću ELISA 2-4 dana posle stimulacije sa 1 pg/mL SEB. Dodavanje hPD-1.08A i hPD-1.09A pojačalo je proizvodnju IL-2 u odnosu na kontrolni mišji IgGl, u prošeku 2 do 4 puta na najvišoj testiranoj koncentraciji antitela (25 pg/mL). Izračunata je srednja vrednost indeksa stimulacije za eksperimente izvedene sa grupom nezavisnih zdravih dobrovoljaca (Slika 4). Ovi eksperimenti su pokazali da su oba hPD-1.08A i hPD-1.09A pojačali proizvodnju IL-2 posle SEB stimulacije razblaženih ćelija ćele krvi. Ekspresioni nivoi PD-1 i PD-L1 (ali ne i PD-L2) ushodno su regulisani (kvantitativno određeni pomoću protočne citometrije) tokom vremena posle SEB stimulacije ćelija ćele krvi. Anti-PD-Ll monoklonalno antitelo (klon MIH5, Ebiosciences #16-5982) i anti-CTLA-4 (klon 14D3, eBiosciences #16- 1529) takođe su indukovali povećanje u proizvodnji IL-2 pod sličnim uslovima, što predstavlja nalaz koji je dodatno potvrdio upotrebu testa SEB stimulacije za kvantitativno određivanje aktivnosti T ćelija posle manipulacije kostimulatomih puteva (Slika 4). Nađeno je daje pojačana proizvodnja pojačala proizvodnju IL-2 pomoću anti-PD-1 antitela zavisna od doze. Pored IL-2, pomoću Luminex tehnologije takođe je nađeno da su nivoi TNFa, IL-17, IL-7, IL-6 i IFNy značajno modulirani sa hPD-1.08A i hPD-1.09A. Rezultati ovih eksperimenata pokazuju da se hPD-1.08A i hPD-1.09 mogu koristiti za stimulaciju humanih T ćelijskih odgovora.

Anti-PD-1 antitelo, hPD-1.09A, je dalje testirano za njegov kapacitet da pojača T ćelijsku aktivnost in vitro upotrebom ćelija krvi poreklom od pacijenata koji pate od kancera. Krv od pacijenata sa uznapredovalim melanomom (1 pacijent) ili kancerom prostate (3 pacijenta) testirana je praćenjem gore navedenog protokola. Rezultati kvantitativnog određivanja citokina su prikazani u Tabeli III kao povećanje od n puta citokina proizvedenog kada su ćelije stimulisane u prisustvu 25 ug/mL hPD-1.09A u poređenju sa SEB stimulacijom u odsustvu antitela. Ukratko, nađeno je da hod-1.09A povećava SEB indukovanu proizvodnju IL-2 2 do 3.5 puta za svakog od 4 pacijenta. Slično, proizvodnja TNFa, IL-17 i IFNy je pojačana, i proizvodnja IL-5 i IL-13 je smanjena. Ovi eksperimenti pokazuju da hPD-1.09A ima sposobnost da stimuliše T ćelijske odgovore kod pacijenata sa kancerom. Pored toga, ovi eksperimenti sugerišu prednost prema Th 1 odgovorima.

Odgovor humanih memorijskih T ćelija na izlaganje TT je pojačan sa I1PD-I.O8A i hPD- 1.09 A

Sledeći test korišćen za profilisanje funkcionalnog efekta anti-humanih PD-1 antitela koja blokiraju interakciju receptora sa njegovim prirodnim ligandima koristio je antigen toksoida tetanusa (TT) za stimulaciju prethodno postojećih memorijskih T ćelija u krvi zdravog davaoca. U ovom cilju, sveže pripremljene PBMC (2 x 105 ćelija) su postavljene u 96-komome ploče sa okruglim dnom u kompletnoj RPMI 1640 podlozi (koja sadrži 5% humani serum inaktiviran toplotom), pre-inkubirane sa test antitelima u različitoj koncentraciji i stimulisane sa TT (Astarte Biologics) u koncentraciji od 100 ng/mL. Ćelije su inkubirane u trajanju od 3-7 dana na 37°C, 5% CO2 nakon čega su supematanti sakupljeni. Koncentracije citokina su određene pomoću ELISA (IL-2 i IFN-y ELISA detekcioni setovi parova antitela iz eBioscience) i ,,multiplex“ analize (Luminex platform - Biosource kompleti za detekciju citokina). Blokada PD-1 pojačala je proliferaciju i značajno je pojačala proizvodnju citokina (Slika 5) uključujući IFNy i IL-2 u poređenju sa samo antigenom. Luminex analiza je otkrila da je proizvodnja citokina GM-CSF, RANTES i IL-6 povećana posle blokade PD-1.

Bojenje humanog PD-1 na humanim ćelijama koje su fiksirane u formalinu i ukalupljene u parafinu

S obzirom na to da su SEB-stimulisane ćelije krvi pokazale pojačanu ekspresiju PD-1 pomoću protočne citometrije, ove ćelije su korišćene za određivanje da li bi hPD-1.09A mogao da detektuje PD-1 u tkivu koje je fiksirano u formalinu i ukalupljeno u parafinu za histološku upotrebu. Mononukleame ćelije periferne krvi od humanog davaoca stimulisane su sa 0.1 pg/mL SEB u trajanju od 3 dana, nakon čega su sakupljene neprilepljene ćelije (uglavnom limfociti), isprane dva puta sa PBS i centrifugirane (1100 rpm u trajanju od 5 min.). Ćelije su fiksirane u trajanju od 10 min u 4% formaldehidu, ćelijski talog je ukalupljen u agarozi, dehidratisan u etanolu (zatim 70%, 80%, 96% i 100%) i ksilenu, i nakon toga ukalupljene u parafinu. Isečci (4 pm) su montirani na staklene mikroskopske pločice i hidratisani (ksilen, etanol 100%, 96%, 80%, 70%, PBS pufer), nakon čega je izvedena izolacija antigena u zagrevanom citratnom puferu upotrebom standardne metodologije. Aktivnost peroksidaze je blokirana upotrebom 100% metanola uključujući 0.3% H2O2 i pločice su isprane u vodi i PBS, Tween 0.1%. Isečci su inkubirani sa hPD-1.09A u trajanju od 1.5 časa na sobnoj temperaturi, isprani sa PBS-Tween, nakon čega slede standardni detekcioni postupci. Mikroskopske pločice su kontrastno obojene sa hematoksilinom u trajanju od 30 sekundi na sobnoj temperaturi, dehidratisane sa ksilenom i montirane za mikroskopsko ispitivanje. Ovi eksperimenti su pokazali da su limfociti poreklom od PBMC kultura stimulisanih sa SEB snažno obojeni (u poređenju sa izotipskom kontrolom) sa hPD-1.09A, nasuprot nestimulisanim PBMC kulturama, što ukazuje na to da je hPD-1.09A korisno kao dijagnostičko sredstvo.

Primer 4: Sekvence anti-PD-1 antitela i kasnija humanizacija Kloniranje cDNK-a imunoglobulina

Upotrebom postupaka na bazi PCR-a sa degenerisanim prajmerom, određene su DNK sekvence koje kodiraju varijabilne regione mišjih antitela koji su eksprimirani od strane hibridoma hPD-1.08A i hPD-1.09A. Ukratko, cDNK-e specifične za gen za teški i laki lanac generisane su upotrebom iScript Select kompleta za sintezu cDNK (Biorad # 1708896) prema uputstvima proizvođača. Korišćeni PCR prajmeri su zasnovani na setu Ig-prajmera (Novagen # 69831-3). Degenerisane PCR reakcije su izvedene upotrebom Taq polimeraze prema protokolu Novagen seta prajmera. Proizvodi PCR-a su analizirani pomoću elektroforeze na agaroznom gelu. Očekivana veličina amplikona za varijabilni region i teškog i lakog lanca je oko 500 baznih parova. Dva pl Taq-amplifikovanog PCR proizvoda iz reakcija koje su proizvele odgovarajuću traku su klonirani u pCR4 TOPO vektor (Invitrogen #K4595-40) i transformisani u DH5-alpha E. coli prema uputstvu proizvođača. Klonovi su ispitivani pomoću PCR-a kolonije upotrebom univerzalnih M13 „fonvard44 i „reverse44 prajmera i dva do tri klona iz svake reakcije izabrana su za analizu DNK sekvenciranja.

Klonovi su sekvencirani u oba smera upotrebom univerzalnih prajmera Ml3 ,,forward“, Ml3 „reverse44, T3 i T7. Rezultati svake reakcije sekvenciranja za svaki klon analizirani su upotrebom Seqman. Koncenzus sekvence su pretraživane prema bazama podataka klicine linije i preuređene sekvence varijabilnog regiona Ig upotrebom NCBI Ig- Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projectsligblast/). Blast rezultati za hPD-1.08A identifikovali su produktivno (u okviru) preuređeni težak lanac bez uvedenih stop kodona. Identifikovani su klonovi lakog lanca koji kodiraju dve različite sekvence; jedna je produktivno (u okviru) preuređeni lak lanac bez uvedenih stop kodona, a drugi je neproduktivno preuređena sekvenca koja sadrži pomeranje okvira koje dovodi do stop kodona u FR4 regionu. Zabeleženi neproduktivni sterilni transkript verovatno potiče od mijeloma fuzionog partnera (Carroll W. L. et al., Mol. Immunol. 25:991-995 (1988) i on se isključuje.

Blast rezultati za hPD-1.09A identifikovali su produktivno (u okviru) preuređene teške i lake lance bez uvedenih stop kodona. Aminokiselinske sekvence eksprimiranih proteina potvrđene su pomoću masene spektrometrije. Sekvence su navedene u priloženom Listingu sekvenci i navedene u tabeli IV.

CDR i okvirni regioni su protumačeni prema Kabat E. A., et al., 1991, Sequences of proteins of Immunological interest, In: NIH Publication No. 91-3242, US Department of Health and Human Services, Bethesda, MD.

Konstrukcija i ekspresija himernog cl09A antitela

Himemi laki i teški lanci su konstruisani vezivanjem PCR-om kloniranih cDNK-a mišjih hPD-1.09A VL i VH regiona za humane kapa i IgGl konstantne regione, respektivno. 5' i 3' krajevi mišjih cDNK sekvenci su modifikovani upotrebom PCR prajmera dizajniranih za dodavanje pogodne lider sekvence svakom lancu, i restrikcionih mesta da bi se omogućilo kloniranje u postojeće ekspresione vektore rekobminantnog antitela.

COS-7 ćelije (0.7 mL u 107/mL) elektroporisane su sa po 10 pg ekspresionih plazmida himernog teškog i lakog lanca. Ove ćelije su zatim kultivisane u 8 mL podloge za rast u trajanju od tri dana. ,,Sendvič“ ELISA je korišćena za merenje koncentracija antitela u supematantima iz COS-7 transfekcija. Ovo je pokazalo da su transficirane COS-7 ćelije izlučile oko 295 ng/mL himernog IgGi-kapa antitela u tri posebne transfekcije.

Vezivanje himernog antitela proizvedenog od strane transficiranih COS-7 ćelija je mereno upotrebom PD-1 vezujuće ELISA i CELISA (videti Primer 2) i pokazano je da se ono vezuje za PD-1 sa afinitetom koji je sličan onom kod mišjeg antitela.

Dizajn humanizovanog antitela

hPD-1.09A antitelo je humanizovano pomoću MRCT (Cambridge UK) upotrebom tehnologije CDR graftovanja (videti, npr., SAD Patent br. 5,225,539). Ukratko, sekvence varijabilnog lanca mišjeg antitela hPD-1.09A upoređivane su sa onima koje su dostupne u bazi podataka proteina Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB). Model homologije hPD-1.09A generisan je na osnovu najbližih VH i VK struktura. Humane sekvence sa najvećom identičnošću sa hPD-1.09A identifikovane su i analizirane. (Foote and Winter, J. Mol. Biol. 224:487-499 (1992); Morea V. et al., Methods 20:267-279 (2000); Chothia C. et al., J. Mol. Biol. 186:651-663 (1985).) Identifikovani su najpogodniji humani okviri na kojima će se graditi CDR graftovani teški i laki lanci.

Za težak lanac, okvir kodiran preko pristupnog broja banke gena AB063829 određeno je daje najpogodniji. Analiza hPD-1.09A VK sekvence pokazuje da dužina njegovog CDR1 (15 ostataka) nije nađena ni u jednom humanom VK. Iz ovog razloga, okviri tri različite dužine CDR1 (11, 16 i 17 ostataka) analizirani su u cilju testiranja koja dužina CDR1 bi reprodukovala ponašanje hPD-1.09A VK. Identifikovane su humane VK sekvence sa najvećom identičnošću sa hPD-1.09A VK na izabranim ostacima značajnim u strukturi i sa dužinama CDR1 od 11, 16 i 17. Izabran je okvir sa pristupnim brojem banke gena M29469 na kome je baziran K109A-L-11. Izabran je okvir sa pristupnim brojem banke gena AB064135 na kome je baziran K09A-L-16 i izabran je okvir sa pristupnim brojem banke gena X72431 na kome je baziran K09A-L-17.

Direktni graftovi su izvedeni da bi se generisali ekspresioni konstrukti za svaki lanac. DNK i proteinske sekvence 109A-H, K09A-L-11, K09A-L-16 i K09A-L-17 su navedene u priloženom listingu sekvenci (Tabela IV).

Proizvedena je IgG4 verzija humanizovanog hl09A antitela, sa stabilizujućom Adair mutacijom (Angal S. et al., Mol. Immuol. 30:105-108 (1993)), gde je serin 241 (Kabat numeracija) preveden u prolin. Ova sekvenca je navedena u sekv. id. br.: 23 i 31.

Primer 5: Karakteristike vezivanja i funkcionalne osobine humanizovanih anti-PD-1 antitela

Proizvodnja i prečišćavanje

Humanizovana antitela h409All, h409A16 i h409A17 proizvedena su prolaznom transfekcijom CHO - S ćelija. Ćelije su uzgajane u CD-CHO (Gibco) i C5467 podlogama (Sigma) u trajanju od 8 dana u bočicama za mućkanje. Antitela su prečišćena iz ćelijskih supematanata pomoću Protein A hromatografije, isprana, eluirana upotrebom 1 M sirćetne kiseline i neutralizovana upotrebom 3 M Tris. Konačno, pufer je izmenjen za 100 mM sirćetnu kiselinu koja je podešena do pH 5.5 sa 1 M Tris bazom.

Vezivanje i kinetička analiza

ELISA testovi na bazi proteina i na bazi ćelija za određivanje vidljivih afiniteta vezivanja (objavljeni kao EC50 vrednosti) izvedeni su kao stoje opisano u Primeru 2. Svako od humanizovanih anti-PD-1 antitela vezuje se za PD-l/Fc i celulamo eksprimira PD-1 sa EC50 vrednostima sličnim mišjem matičnom antitelu (Tabela V).

Kinetička analiza vezivanja antitela takođe je izvedena upotrebom ,,bio-light“ interferometrije kao što je opisano u Primeru 2 (Slika 6). Dva od humanizovanih antitela, h409All i h409A16, vezuju se značajno čvršće nego bilo koje drugo mAb testirano upotrebom ovog testa, sa Kd koja je određena da je 29 i 27 pM za h409All i h409A16, respektivno (Tabela V). U poređenju sa drugim testiranim anti-PD-1 antitelima, povećni afinitet je uglavnom posledica sporije konstante disocijacije. Slično mišjim matičnim antitelima, humanizovana anti-PD-1 antitela h409All, h409A16 pokazala su vezivanje za makaki PD-1 sa Kd koja je određena daje ispod 120 pM.

Blokada iiganda

Sposobnost humanizovanih antitela da blokiraju vezivanje PD-L1 i PD-L2 za PD-1 je merena upotrebom testa homogene kompeticije i detekcijom upotrebom FMAT kompetitivnog testa kao što je opisano u Primeru 2.

Vezivanje hPD-Ll/Fc i hPD-L2/Fc za CHO-hPD-1 ćelije može biti potpuno inhibirano na način zavistan od doze pomoću bilo kog od testiranih humanizovanih antitela. Izračunati IC50 rezultati su rezimirani u Tabeli V. Slično matičnom mišjem antitelu hPD-1.09A, svako od humanizovanih mAb antitela, h409Al 1, h409A16 i h409A17 inhibiralo je vezivanje PD- L1 i PD-L2 sa IC50 vrednostima ispod 1 nM. Slično mišjim matičnim antitelima, humanizovana anti-PD-1 antitela h409All, h409A16 i h409A17 pokazala su inhibiciju vezivanja Iiganda za makaki PD-1 sa izračunatim IC50 vrednostima ispod oko 1 nM.

Odgovor humanih T ćelija na SEB je pojačan sa humanizovanim mAb antitelima

Humanizovana anti-PD-1 antitela su testirana za njihov kapacitet da pojačaju aktivnost T ćelija in vitro upotrebom ćelija krvi od zdravih dobrovoljaca kao stoje opisano u Primeru 3. Supematanti su sakupljeni posle 4 dana kulture i količina proizvedenog IL-2 je kvantitativno određena upotrebom ELISA. Humanizovana PD-1 antitela su pokazala kapacitet da povećaju proizvodnju IL-2 stimulisanu sa SEB (Slika 7). Pored toga, humanizovana PD-1 antitela su povećala proizvodnju IL-2 indukovanu sa SEB u krvi pacijenta koji pati od kancera, slično onome staje opisano u Primeru 3.

Ukratko, humanizovana mAb antitela h409All, h409A16 i h409A17 zadržala su svu funkcionalnu aktivnost u toku postupka humanizacije. h409All i h409A16 mAb antitela su potpuno zadržala afinitet mišjeg matičnog antitela hPD109A posle humanizacije.

Claims (21)

1.Antitelo ili fragment antitela koje/koji se vezuje za humani PD-1, koji sadrži: CDR regione lakog lanca sekv. id.br.: 15, 16 i 17 i CDR regione teškog lanca sekv. id. br.: 18, 19i20; gde navedeno antitelo ili fragment antitela blokira vezivanje humanog PD-L1 i humanog PD-L2 za humani PD-1.

2.Antitelo ili fragment antitela prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što navedeno antitelo ili fragment antitela blokira vezivanje humanog PD-L1 i/ili humanog PD- L2 za humani PD-1 sa IC50 od oko 1 nM ili niže.

3.Antitelo ili fragment antitela prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačeno time što sadrži: a.varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine: i.sekv. id. br.: 7 ili njena varijanta, pri čemu navedena varijanta sadrži jednu, dve ili tri konzervativno modifikovane aminokiselinske supstitucije; ii.aminokiselinski ostaci 20 do 139 iz sekv. id. br.: 30 ili njene varijante, pri čemu navedena varijanta sadrži jednu, dve ili tri konzervativno modifikovane aminokiselinske supstitucije; i iii.aminokiselinska sekvenca koja ima najmanje 90% homologije sa aminokiselinskim ostacima 20 do 139 iz sekv. id. br.: 30; i dalje sadrži b.varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine: i.sekv. id. br.: 8 ili njena varijanta, pri čemu navedena varijanta sadrži jednu, dve ili tri konzervativno modifikovane aminokiselinske supstitucije; ii.aminokiselinski ostaci 20 do 130 iz sekv. id. br.: 32 ili njene varijante, pri čemu navedena varijanta sadrži jednu, dve ili tri konzervativno modifikovane aminokiselinske supstitucije; iii.aminokiselinski ostaci 20 do 130 iz sekv. id. br.: 33 ili njene varijante, pri čemu navedena varijanta sadrži jednu, dve ili tri konzervativno modifikovane supstitucije; iv.aminokiselinski ostaci 20 do 130 iz sekv. id. br.: 34 ili njene varijante, pri čemu navedena varijanta sadrži jednu, dve ili tri konzervativno modifikovane aminokiselinske supstitucije; i v.aminokiselinska sekvenca koja ima najmanje 90% homologije sa aminokiselinskim ostacima 20 do 130 iz sekv. id. br.: 32, 33 ili 34.

4. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačeno time što sadrži: a.težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine: i.aminokiselinski ostaci 20 do 466 iz sekv. id. br.: 31 ili njene varijante, pri čemu navedena varijanta sadrži sadrži jednu, dve ili tri konzervativno modifikovane aminokiselinske supstitucije, i ii.aminokiselinski ostaci 20 do 469 iz sekv. id. br.: 35 ili njene varijante, pri čemu navedena varijanta sadrži jednu, dve ili tri konzervativno modifikovane aminokiselinske supstitucije; i b.lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine: i. aminokiselinski ostaci 20 do 237 iz sekv. id. br.: 36 ili njene varijante, pri čemu navedena varijanta sadrži jednu, dve ili tri konzervativno modifikovane aminokiselinske supstitucije; ii.aminokiselinski ostaci 20 do 237 iz sekv. id. br.:37 ili njene varijante, pri čemu navedena varijanta sadrži jednu, dve ili tri konzervativno modifikovane aminokiselinske supstitucije, i iii.aminokiselinski ostaci 20 do 237 iz sekv. id. br.: 38 ili njene varijante, pri čemu navedena varijanta sadrži jednu, dve ili tri konzervativno modifikovane aminokiselinske supstitucije.

5.Antitelo ili fragment antitela koje/koji se vezuje za humani PD-1, naznačeno time što sadrži a.varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 139 iz sekv. id. br.: 30, i b.varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine: i.aminokiselinski ostaci 20 do 130 iz sekv. id. br.:32; ii.aminokiselinski ostaci 20 do 130 iz sekv. id. br.: 33; i iii.aminokiselinski ostaci 20 do 130 iz sekv. id. br.: 34.

6.Antitelo koje se vezuje za humani PD-1, koje sadrži a.težak lanac koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 466 iz sekv. id. br.: 31, i b.laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine: i.aminokiselinski ostaci 20 do 237 iz sekv. id. br.: 36; ii.aminokiselinski ostaci 20 do 237 iz sekv. id. br.:37, i iii.aminokiselinski ostaci 20 do 237 iz sekv. id. br.: 38.

7.Antitelo prema patentnom zahtevu 6, naznačeno time što težak lanac sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 466 iz sekv. id. br.: 31 i laki lanac sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 237 iz sekv. id. br.: 36.

8.Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3 i 5, naznačen time što dalje sadrži konstatni region teškog lanca koji sadrži y4 ili yl konstantni region humanog teškog lanca.

9.Antitelo ili fragment antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time što antitelo ili fragment antitela: a.vezuje humani PD-1 sa Kd od oko 100 pM ili niže; b.vezuje humani PD-1 sa KD od oko 30 pM ili niže; c.vezuje se za humani PD-1 sa oko istim KD kao antitelo koje ima težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz sekv. id. br.: 31 i lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz sekv. id. br.: 32; d.vezuje se za humani PD-1 sa oko istim KD kao antitelo koje ima težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz sekv. id. br.: 31 i lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz sekv. id. br.: 33; e.vezuje se za humani PD-1 sa kasSoc od oko 7.5 x 1051/M-s ili brže; f.vezuje se za humani PD-1 sa kasSoc od oko 1 x IO6 1/M-s ili brže; g.vezuje se za humani PD-1 sa kdissoc od oko 2 x 10‘51/s ili sporije; h.vezuje se za humani PD-1 sa kdissoc od oko 2.7 x IO'51/s ili sporije; i.vezuje se za humani PD-1 sa kdissoc od oko 3 x 10'51/s ili sporije; ili j.blokira vezivanje humanog PD-L1 i/ili humanog PD-L2 za humani PD-1 sa IC50 od oko 1 nM ili niže.

10.Antitelo ili fragment antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time što je antitelo ili fragment antitela: a.himemo antitelo ili njegov fragment; b.humano antitelo ili njegov fragment; ili c.humanizovano antitelo ili njegov fragment.

11.Fragment antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je izabran iz grupe koju čine Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(aV)2 i diatelo.

12.Antitelo ili fragment antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time što antitelo ili fragment antitela povećava aktivaciju T ćelija.

13.Izolovani polinukleotid koji kodira antitelo ili fragment antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12.

14.Izolovani polinukleotid prema patentnom zahtevu 13, naznačen time što antitelo sadrži težak lanac koji sadrži aminokiselinske ostatke 20 do 466 iz sekv. id. br.: 31 i laki lanac koji sadrži aminokiselinske ostatke od 20-237 iz sekv. id. br.: 36.

15.Izolovani polinukleotid prema patentnom zahtevu 13, naznačen time što sadrži sekv. id. br.: 23 i sekv. id. br.: 27 ili sekv. id. br.: 22 i sekv. id. br.: 27.

16.Ekspresioni vektor koji sadrži izolovani polinukleotid prema bilo kom od patentnih zahteva 13 do 15.

17.Ćelija domaćin koja sadrži ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 16.

18.Postupak za proizvodnju antitela ili fragmenta antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12 naznačen time što sadrži: a.kultivaciju ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 17 u podlozi za kulturu pod uslovima gde je nukleinsko kiselinska sekvenca eksprimirana, na taj način proizvodeći polipeptide koji sadrže varijabilne regione lakog i teškog lanca; i b.izolaciju polipeptida iz ćelije domaćina ili podloge za kulturu.

19.Kompozicija koja sadrži antitelo ili fragment antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12 ili koje/koji se može dobiti pomoću postupka prema patentnom zahtevu 18 u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili razblaživačem.

20.Antitelo ili fragment antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12 ili koje/koji se može dobiti pomoću postupka prema patentnom zahtevu 18 za upotrebu u lečenju kancera ili infekcije ili infektivne bolesti.

21.Antitelo ili fragment antitela prema patentnim zahtevima 1 do 12 za upotrebu u postupku za lečenje kancera.