RS58100B1 - Upotreba t ćelija modifikovanih himernim receptorom za antigen za lečenje kancera - Google Patents

Description

Opis

OSNOVA PRONALASKA

[0001] Velika većina pacijenata koji imaju B-ćelijske malignitete, uključujući hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL), će umreti od te bolesti. Jedan pristup u lečenju ovih pacijenata je genetsko modifikovanje T ćelija tako da ciljno deluju na antigene eksprimirane na tumorskim ćelijama putem ekspresije himernih receptora za antigen (CAR). Receptori CAR su receptori za antigen koji su dizajnirani da prepoznaju antigene ćelijske površine na način nezavisan od humanog leukocitnog antigena. Pokušaji upotrebe genetski modifikovanih ćelija koje eksprimiraju receptore CAR u lečenju ovih vrsta pacijenata imali su veoma ograničen uspeh. Videti na primer, Brentjens et al., 2010, Molecular Therapy, 18:4, 666-668; Morgan et al., 2010, Molecular Therapy, objavljene na internetu 23. februara 2010, stranice 1-9; i, Till et al., 2008, Blood, 112:2261-2271.

[0002] Kod većine kancera, tumor-specifični antigeni još uvek nisu dobro definisani, ali kod B-ćelijskih maligniteta, CD 19 je privlačan tumorski ciljni molekul. Ekspresija CD 19 je ograničena na normalne i maligne B ćelije (Uckun, et al. Blood, 1988, 71:13-29), tako da je CD 19 široko prihvaćen ciljni molekul za bezbedno ispitivanje receptora CAR. Dok receptori CAR mogu da pokrenu aktivaciju T-ćelija na način sličan endogenom T-ćelijskom receptoru, ogromna prepreka kliničkoj primeni ove tehnologije do danas je ograničena in vivo ekspanzija CAR+ T ćelija, brzi nestanak ćelija nakon infuzije, i razočaravajuća klinička aktivnost (Jena, et al., Blood, 2010, 116:1035-1044; Uckun, et al. Blood, 1988, 71:13-29).

[0003] Objava SAD patentne prijave br. 20040043401 opisuje himerne T-ćelijske receptore koji kombinuju u jednoj himernoj vrsti, unutarćelijski domen CD3 zeta-lanca, signalni region iz kostimulatornog proteina kao što je CD28, i vezujući element. Milone et al., 2009, Molecular Therapy, 17:8, 1453-1464 opisuje T ćelije sa himernim receptorima za antigen koji sadrže CD137 domene za prenos signala.

[0004] Prema tome, postoji hitna potreba u stanju tehnike za kompozicijama i postupcima za lečenje kancera upotrebom receptora CAR koji mogu da se umnože in vivo. Predmetni pronalazak se bavi ovom potrebom.

REZIME PRONALASKA

[0005] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovanu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni receptor za antigen (CAR), gde CAR sadrži antigen-vezujući domen, transmembranski domen, kostimulatorni signalni region, i CD3 zeta signalni domen, gde CD3 zeta signalni domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24.

[0006] Aspekti pronalaska za koje se traži zaštita su kao što su definisani u patentnim zahtevima.

[0007] U prvom aspektu pronalaska obezbeđena je T ćelija genetski modifikovana da eksprimira CAR gde CAR sadrži (a) antigen-vezujući domen koji je anti-CD 19 scFv, (b) kostimulatorni signalni region 4-1BB, i (c) CD3 zeta signalni domen za upotrebu u postupku za lečenje kancera kod čoveka, pri čemu anti-CD19 scFv sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:20 i/ili CD3 zeta signalni domen sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:24, i pri čemu je čovek otporan na lečenje najmanje jednim hemoterapeutskim sredstvom.

Kancer može da obuhvata nesolidni tumor kao što je hematološki tumor. Kancer može da bude leukemija ili limfom.

Leukemija može da bude:

(i) akutna leukemija ili hronična leukemija; ili

(ii) akutna limfocitna leukemija.

Alternativno, kancer može da bude:

(i) akutna limfocitna leukemija pre-B ćelija (pedijatrijska indikacija), adultna akutna limfocitna leukemija, limfom mantle ćelija ili difuzni limfom krupnih B-ćelija;

(ii) ne-Hodgkinov limfom;

(iii) multipli mijelom; ili

(iv) Hodgkinova bolest.

[0008] U jednom primeru izvođenja ovog aspekta pronalaska kancer je hronična limfocitna leukemija.

[0009] U drugom aspektu pronalaska obezbeđena je T ćelija koja je genetski modifikovana tako da eksprimira CAR gde CAR sadrži (a) antigen-vezujući domen koji predstavlja anti-CD 19 scFv, (b) kostimulatorni signalni region 4-1BB, i (c) signalni domen CD3 zeta za upotrebu u postupku za lečenje kancera koji sadrži primenu navedene T ćelije na čoveka kome je dijagnostifikovan kancer, pri čemu anti-CD19 scFv sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:20 ili signalni domen CD3 zeta sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:24, i pri čemu navedeni postupak stvara populaciju genetski konstruisanih T ćelija koje perzistiraju u čoveku najmanje osam meseci, devet meseci, deset meseci, jedanaest meseci, dvanaest meseci, dve godine ili tri godine posle primene, i gde je čovek rezistentan na najmanje jedno hemoterapeutsko sredstvo.

[0010] Perzistentna populacija genetski modifikovanih T ćelija može da sadrži najmanje jednu ćeliju odabranu iz grupe koja se sastoji od T ćelije koja je primenjena kod čoveka, potomstva T ćelije koja je primenjena kod čoveka, i njihove kombinacije. Perzistentna populacija genetski modifikovanih T ćelija može da sadrži memorijsku T ćeliju.

[0011] U trećem aspektu pronalaska obezbeđena je T ćelija koja je genetski modifikovana tako da eksprimira CAR gde CAR sadrži (a) antigen-vezujući domen koji predstavlja anti-CD 19 scFv, (b) kostimulatorni signalni region 4-1BB, i (c) CD3 zeta signalni domen za upotrebu u postupku za lečenje kancera koji obuhvata primenu pomenute T ćelije kod čoveka kome je dijagnostikovan kancer, pri čemu anti-CD19 scFv sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:20 ili CD3 zeta signalni domen sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:24, i pri čemu pomenuti postupak umnožava populaciju genetski modifikovanih T ćelija kod čoveka, i gde je čovek otporan na lečenje najmanje jednim hemoterapeutskim sredstvom.

[0012] Potomstvo T ćelija u čoveku može da obuhvata memorijsku T ćeliju. Populacija potomstva T ćelija može da opstaje u čoveku najmanje tri meseca, četiri meseca, pet meseci, šest meseci, sedam meseci, osam meseci, devet meseci, deset meseci, jedanaest meseci, dvanaest meseci, dve godine, ili tri godine nakon primene.

[0013] U aspektima pronalaska koji se odnose na T ćeliju za upotrebu kao što je prethodno definisano, kancer može da bude kao što je definisano u prvom aspektu ili kancer može da bude hronična limfocitna leukemija.

[0014] U aspektima pronalaska koji se odnose na T ćeliju za upotrebu kao što je prethodno definisano, čovek može da ima hroničnu limfocitnu leukemiju koja je refraktorna CD19+ leukemija i limfom.

[0015] U bilo kom aspektu pronalaska T ćelija može da bude autologna ili alogena ćelija. Ćelija može da se primeni nakon B-ćelijske ablativne terapije kao što je terapija sredstvima koja reaguju sa CD20, npr. Rituxan.

[0016] U aspektima pronalaska koji se odnose na T ćeliju za upotrebu kao što je prethodno definisano, ćelija može da se primeni u farmaceutskoj kompoziciji u dozi od 10<4>do 10<9>ćelija/kg telesne težine ili 10<5>do 10<6>ćelija/kg telesne težine.

[0017] Prema jednom primeru izvođenja pronalaska, T ćelija za upotrebu može da bude kao što je prethodno definisano, u kojoj:

(i) kostimulatorni signalni region 4-1BB može da sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23;

(ii) CAR može da sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u sekvenci SEQ ID NO:12;

(iii) anti-CD19 scFv može da bude kodiran sekvencom SEQ ID NO: 14;

(iv) signalni region 4-1BB može da bude kodiran sekvencom SEQ ID NO: 17 i CD3 zeta signalni domen može da bude kodiran sekvencom SEQ ID NO:18;

(v) anti-CD 19 scFv može da bude kodiran sekvencom SEQ ID NO: 14, signalni region 4-1BB može da bude kodiran sekvencom SEQ ID NO: 17, i CD3 zeta signalni domen može da bude kodiran sekvencom SEQ ID NO:18; ili

(vi) CAR može da bude kodiran sekvencom nukleinske kiseline navedenom u SEQ ID NO:8.

[0018] Ovde je takođe opisana sekvenca nukleinske kiseline koja kodira CAR koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 8.

[0019] Ovde je takođe opisan CD3 zeta signalni domen u CAR kodiran sekvencom nukleinske kiseline SEQ ID NO: 18.

[0020] Ovde je takođe opisan izolovani CAR koji sadrži antigen-vezujući domen, transmembranski domen, kostimulatorni signalni region, i CD3 zeta signalni domen, pri čemu CD3 zeta signalni domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24.

[0021] Ovde je takođe opisana ćelija koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira CAR, gde CAR sadrži antigen-vezujući domen, transmembranski domen, kostimulatorni signalni region, i CD3 zeta signalni domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24.

[0022] Kao što je ovde opisano, ćelija koja sadrži CAR ispoljava anti-tumorski imunitet kada se antigen-vezujući domen CAR veže za svoj odgovarajući antigen.

[0023] Ovde je takođe opisan vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira CAR, gde CAR sadrži antigen-vezujući domen, kostimulatorni signalni region, i CD3 zeta signalni domen, gde CD3 zeta signalni domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24.

[0024] Ovde je takođe opisan postupak za stimulaciju imunskog odgovora posredovanog T ćelijama na ciljnu ćelijsku populaciju ili tkivo kod sisara. Takođe je opisan postupak koji obuhvata primenu kod sisara efikasne količine ćelija koje su genetski modifikovane tako da eksprimiraju CAR gde CAR sadrži antigen-vezujući domen, kostimulatorni signalni region, i CD3 zeta signalni domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24, pri čemu je antigen-vezujući domen odabran tako da specifično prepoznaje ciljnu ćelijsku populaciju ili tkivo.

[0025] Takođe je opisan postupak za obezbeđivanje anti-tumorskog imuniteta kod sisara. Takođe je opisan postupak koji obuhvata primena kod sisara efikasne količine ćelija koje su genetski modifikovane tako da eksprimiraju CAR gde CAR sadrži antigen-vezujući domen, kostimulatorni signalni region, i CD3 zeta signalni domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24, obezbeđujući na taj način anti-tumorski imunitet kod sisara.

[0026] Takođe je opisan postupak za lečenje sisara koji ima bolest, poremećaj ili stanje povezano sa povišenom ekspresijom tumorskog antigena. Takođe je opisan postupak koji obuhvata primenu kod sisara efikasne količine ćelije koja je genetski modifikovana tako da eksprimira CAR gde CAR sadrži antigen-vezujući domen, kostimulatorni signalni region, i CD3 zeta signalni domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24, lečeći na taj način sisara.

[0027] Kao što je ovde opisano, ćelija je autologna T ćelija.

[0028] Kao što je ovde opisano, tumorski antigeni uključuju CD19, CD20, CD22, ROR1, mezotelin, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, Glikolipid F77, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1 TCR, MAGE A3 TCR, i bilo koju njihovu kombinaciju.

[0029] Ovde je takođe opisan postupak za lečenje čoveka sa hroničnom limfocitnom leukemijom. U jednom primeru izvođenja, postupak obuhvata primenu kod čoveka T ćelije koja je genetski modifikovana tako da eksprimira CAR gde CAR sadrži antigen-vezujući domen, kostimulatorni signalni region, i CD3 zeta signalni domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24.

[0030] Kao što je ovde opisano, čovek je otporan na lečenje najmanje jednim hemoterapeutskim sredstvom.

[0031] Kao što je ovde opisano, hronična limfocitna leukemija je refraktorna CD19+ leukemija i limfom.

[0032] Ovde je takođe opisan postupak za proizvodnju postojane populacije genetski modifikovanih T ćelija kod čoveka kome je dijagnostikovan kancer. Ovde je takođe opisan postupak koji obuhvata primenu kod čoveka T ćelije koja je genetski modifikovana tako da eksprimira CAR, gde CAR sadrži antigen-vezujući domen, kostimulatorni signalni region, i CD3 zeta signalni domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24, gde postojana populacija genetski modifikovanih T ćelija opstaje u čoveku najmanje jedan mesec nakon primene.

[0033] Kao što je ovde opisano, postojana populacija genetski modifikovanih T ćelija sadrži najmanje jednu ćeliju odabranu iz grupe koja se sastoji od T ćelije koja je primenjna kod čoveka, potomstva T ćelije koja je primenjna kod čoveka, i njihove kombinacije.

[0034] Kao što je ovde opisano, postojana populacija genetski modifikovanih T ćelija sadrži memorijsku T ćeliju.

[0035] Kao što je ovde opisano, postojana populacija genetski modifikovanih T ćelija opstaje u čoveku najmanje tri meseca nakon primene. Kao što je ovde opisano, postojana populacija genetski modifikovanih T ćelija opstaje u čoveku najmanje četiri meseca, pet meseci, šest meseci, sedam meseci, osam meseci, devet meseci, deset meseci, jedanaest meseci, dvanaest meseci, dve godine, ili tri godine nakon primene.

[0036] Kao što je ovde opisano, leči se hronična limfocitna leukemija.

[0037] Ovde je takođe opisan postupak za ekspanziju populacije genetski modifikovanih T ćelija kod čoveka kome je dijagnostikovan kancer. Ovde je takođe opisan postupak koji obuhvata primenu kod čoveka T ćelije koja je genetski modifikovana tako da eksprimira CAR gde CAR sadrži antigen-vezujući domen, kostimulatorni signalni region, i CD3 zeta signalni domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24, gde primenjena genetski modifikovana T ćelija proizvodi populaciju potomstva T ćelija u čoveku.

[0038] Kao što je ovde opisano, potomstvo T ćelija u čoveku sadrži memorijsku T ćeliju.

[0039] Kao što je ovde opisano, T ćelija je autologna T ćelija.

[0040] Kao što je ovde opisano, čovek je otporan na lečenje najmanje jednim hemoterapeutskim sredstvom.

[0041] Kao što je ovde opisano, kancer je hronična limfocitna leukemija. U drugom primeru izvođenja, hronična limfocitna leukemija je refraktorna CD19+ leukemija i limfom.

[0042] Kao što je ovde opisano, populacija potomstva T ćelija opstaje u čoveku najmanje tri meseca nakon primene. Kao što je ovde opisano, populacija potomstva T ćelija opstaje u čoveku najmanje četiri meseca, pet meseci, šest meseci, sedam meseci, osam meseci, devet meseci, deset meseci, jedanaest meseci, dvanaest meseci, dve godine, ili tri godine nakon primene.

[0043] Kao što je ovde opisano, leči se kancer.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0044] Detaljan opis poželjnih primera izvođenja pronalaska koji sledi će se bolje razumeti kada se čita u sprezi sa priloženim crtežima. U svrhu ilustrovanja pronalaska, na crtežima su prikazani primeri izvođenja koji su ovde poželjni. Treba razumeti, međutim, da pronalazak nije ograničen na precizne aranžmane i instrumente primera izvođenja prikazanih na crtežima.

Slika 1, koja obuhvata slike 1A do 1C, je niz prikaza šematski predstavljenih vektora za prenos gena i transgena, proizvodnje genski modifikovane T ćelije i dizajna kliničkog protokola. Slika 1A prikazuje lentiviralne vektore i transgen koji pokazuje glavne funkcionalne elemente. Proizveden je lentiviralni vektor kliničkog stepena (označen kao pELPs 19BBz) pseudotipiziran proteinom G virusa vezikularnog stomatitisa, koji upravlja ekspresijom anti-CD19 scFv izvedenog iz FMC63 mišjeg monoklonskog antitela, regiona zgloba i transmembranskog domena humanog CD8α, i humanih signalnih domena 4-1BB i CD3zeta. Konstitutivna ekspresija transgena je bila usmerena ubacivanjem EF-1α (promotor elongacionog faktora-1α); LTR, dugog terminalnog ponovka; RRE, elementa koji odgovara na Rev, (cPPT) i centralne terminacione sekvence (CTS). Slika nije u razmeri. Slika 1B prikazuje proizvodnju T ćelije. Autologne ćelije su dobijene putem afereze, i T ćelije su bile obogaćene elutrijacijom mononuklearnih ćelija, oprane i preostale ćelije leukemije osiromašene dodatkom paramagnetnih perli obloženih sa anti-CD3/CD28 za pozitivnu selekciju i aktivaciju T ćelija. Lentiviralni vektor je dodat u vreme ćelijske aktivacije i ispran 3. dana nakon započinjanja gajenja ćelija. Ćelije su umnožavane na uređaju sa platformom koja se ljulja (WAVE Bioreactor System) tokom 8-12 dana. Poslednjeg dana gajenja, perle su uklonjene propuštanjem kroz magnetno polje i CART19 T ćelije su sakupljene i konzervisane zamrzavanjem u infuzibilnom medijumu. Slika 1C prikazuje dizajn kliničkog protokola. Pacijenti su primili hemoterapiju za smanjenje broja limfocita kao što je opisano, nakon čega su primili infuziju #1 CART19 i.v. putem, gravitacionom infuzijom tokom perioda od 15-20 minuta. Infuzija je data upotrebom pristupa podeljene doze tokom 3 dana (10%, 30%, 60%) počevši 1 do 5 dana po završetku hemoterapije. Procene ciljeva su izvedene u 4. nedelji ispitivanja. Na završetku aktivnog praćenja, ispitanici su prebačeni na destinacijski protokol za dugoročno praćenje prema smernicama FDA.

Slika 2, koja obuhvata slike 2A do 2F, predstavlja niz slika koje prikazuju neprekidnu in vivo ekspanziju i opstajanje CART19 ćelija u krvi i kosnoj srži. DNK izolovana iz pune krvi kao što je prikazano na slikama 2A do 2C ili kosne srži kao što je prikazano na slikama 2D do 2F, uzorci dobijeni od pacijenta UPN 01, kao što je prikazano na slikama 2A i 2D, UPN 02, kao što je prikazano na slikama 2B i 2E i UPN 03, kao što je prikazano na slikama 2C i 2F, podvrgnuti su u balku Q-PCR analizi upotrebom kvalifikovanog testa da bi se detektovale i kvantifikovale CART19 sekvence. Svaka uneta vrednost predstavlja prosek merenja u triplikatu u 100-200 ng genomske DNK, sa maksimalnim % CV manjim od 1.56%. Parametri zadovoljava/ne zadovoljava za test uključivali su unapred određene opsege za nagib i efikasnost amplifikacije, i amplifikaciju referentnog uzorka. Donja granica kvantifikacije za test ustanovljena opsegom standardne krive bila je 2 kopije transgena/mikrogramu genomske DNK; vrednosti za uzorke manje od tog broja smatraju se procenama predstavljaju se ako je najmanje 2/3 replikata dalo Ct vrednost sa % CV za vrednosti od 15%. CART19 ćelije su primenjene infuzijom na dane 0, 1, i 2 kod UPN 01 i UPN 03, na dane 0, 1, 2 i 11 kod UPN 02.

Slika 3, koja obuhvata slike 3A do 3D, predstavlja niz slika koje prikazuju citokine u serumu i kosnoj srži pre i posle infuzije CAR T ćelija; longitudinalna merenja promena citokina seruma, hemokina i citokinskih receptora kod pacijenta UPN 01, kao što je prikazano na slici 3A, UPN 02, kao što je prikazano na slici 3B i UPN 03, kao što je prikazano na slici 3C, naznačenog dana nakon infuzije CAR T ćelija i niz procena istih analita u kosnoj srži kod pacijenta UPN 03 kao što je prikazano na slici 3D. Uzorci su podvrgnuti multipleksnom ispitivanju upotrebom tehnologije sa nizovima mikro-perli Luminex i unapred sastavljenih i validiranih multipleks kitova. Analiti sa promenom >=3-ostrukoj promeni su naznačeni, i postavljeni na grafik kao relativna promena u odnosu na polaznu vrednost kao što je prikazano na slici 3A do 3C, ili kao apsolutne vrednosti kao što je prikazano na slici 3D. Apsolutne vrednosti za svaki analit u svakoj vremenskoj tački izvedene su iz standardne krive bazirane na rekombinantnom proteinu preko serija trostrukih razblaženja u 8 tačaka, sa gornjim i donjim granicama kvantifikacije (ULOQ, LLOQ) određenim pomoću 80-120% primećenih/očekivanih graničnih vrednosti od za standardne krive. Svaki uzorak je ocenjen u duplikatu sa izračunatim prosečnim vrednostima i % CV u većini slučajeva manjim od 10%. Da bi se prilagodili jedinstvenom prikazu podataka u smislu širokog opsega apsolutnih vrednosti, podaci se prikazuju kao umnožak promene u odnosu na polaznu vrednost za svaki analit. U slučajevima kada polazne vrednosti nisu mogle da se detektuju, polovina najniže vrednosti standardne krive korišćena je kao polazna vrednost. Opsezi standardne krive za ispitivanja i polazne (nulti dan) vrednosti (navedene u zagradama redom za UPN01, 02 i 03), sve u pg/ml: IL1-Rα: 35.5-29,318 (689, 301, 287); IL-6: 2.7-4,572 (7, 10.1, 8.7); IFN-γ: 11.2-23,972 (2.8, ND, 4.2); CXCL10: 2.1-5,319 (481, 115, 287); MIP-1β: 3.3-7,233 (99.7, 371, 174); MCP-1: 4.8-3,600 (403, 560, 828); CXCL9: 48.2-3,700 (1,412, 126, 177); IL2-Rα: 13.4-34,210 (4,319, 9,477, 610); IL-8: 2.4-5,278 (15.3, 14.5, 14.6); IL-10: 6.7-13,874 (8.5, 5.4, 0.7); MIP-1α: 7.1-13,778 (57.6, 57.3, 48.1).

Slika 4, koja obuhvata slike 4A do 4D, predstavlja niz slika koje prikazuju produženu površinsku ekspresiju CART19 i uspostavljanje funkcionalnih memorijskih receptora CAR in vivo. Slika 4A prikazuje detekciju CD3+ limfocita koji eksprimiraju CAR i odsustvo B ćelija u perifernoj krvi i kosnoj srži. Kod sveže obrađenih mononuklearnih ćelija periferne krvi ili kosne srži dobijenih od pacijenta UPN 03 na dan 169 nakon infuzije CART19 ćelija, procenjena je pomoću protočne citometrije, površinska ekspresija CAR19 (gore) ili prisustvo B ćelija (dole); kao kontrola, obojene su PBMC dobijene od zdravog davaoca ND365. Strategija odabiranja za populacije CD3+ i B ćelija predstavljena je na slici 9. Za procenu ekspresije CAR19 u CD3+ limfocitima, uzorci su istovremeno obojeni antitelima na CD14-PE-Cy7 i CD16-PE-Cy7 (kanal za odbacivanje) i CD3-FITC, pozitivno odabrani od CD3+, i ekspresija CAR19 u CD8+ i CD8-limfocitnim odeljcima je procenjena istovremenim bojenjem sa CD8a-PE i anti-CAR19 idiotipskim antitelom konjugovanim sa Alexa-647. Podaci na grafikonima su odabrani od ćelijske populacije koja je negativna na kanalu za odbacivanje/CD3-pozitivna. Za procenu prisustva B ćelija, uzorci su istovremeno obojeni antitelima na CD14-APC i CD3-FITC (kanali za odbacivanje) i procenjeno je prisustvo B ćelija u frakciji negativnoj na kanalu za odbacivanje istovremenim bojenjem sa antitelima na CD20-PE i CD19-PE-Cy-7. U svim slučajevima, negativno odabrani kvadranti su uspostavljeni na kontrolama koje nisu obojene kao što je prikazano na slikama 4B i 4C. Prikazana je T ćelijska imunofenotipizacija CD4+ (slika 4B) i CD8+ (slika 4C) T-ćelijskih podsetova. Zamrznuti uzorci periferne krvi pacijenta UPN 03 dobijeni aferezom na dan 56 i 169 nakon infuzije T ćelija ostavljeni su preko noći u medijumu za kulturu bez dodatih faktora, oprani, i podvrgnuti multi-parametarskoj imunofenotipizaciji za ekspresiju markera T ćelijske memorije, aktivaciji, i iscrpljivanju. Strategija odabiranja, kao što je prikazano na slici 8, uključivala je početno odabiranje od ćelija koje su negativne na kanalu za odbacivanje (CD14, CD16, Live/Dead Aqua) i CD3-pozitivne, praćeno pozitivnim odabiranjem od CD4+ i CD8+ ćelija. Okviri i kvadranti su uspostavljeni upotrebom FMO kontrola (CAR, CD45RA, PD-1, CD25, CD127, CCR7) ili odabirom od pozitivnih ćelijskih populacija

1

(CD3, CD4, CD8) i jasno razdvojenih podsetova (CD27, CD28, CD57); podaci su prikazani nakon bieksponencijalne transformacije za objektivnu visuelizaciju događaja. Slika 4D prikazuje funkcionalnu kompetentnost postojanih CAR ćelija. Zamrznuti uzorci periferne krvi pacijenta UPN 03 dobijeni aferezom na dan 56 i 169 nakon infuzije T ćelija ostavljeni su preko noći u medijumu za kulturu bez dodatih faktora, oprani, i procenjena je direktno ex-vivo njihova sposobnost prepoznavanja ciljnih ćelija koje eksprimiraju CD19 upotrebom CD107 testova degranulacije. Nakon inkubacije od 2 časa, u prisustvu anti-CD28, anti-CD49d, i CD107-FITC, mešavine ćelija su sakupljene, oprane, i podvrgnute testu multi-parametarske protočne citometrije za procenu sposobnosti CART19 ćelija da se degranulišu kao odgovor na ciljne ćelije koje eksprimiraju CD19. Strategija odabira je uključivala početni odabir od ćelija koje su negativne na kanalima za odbacivanje (CD14-PE-Cy7, CD16-PE-Cy7, Live/Dead Aqua) i pozitivne na CD3-PE, praćen odabirom od CD8-PE-Texas Red-pozitivnih ćelija; predstavljeni podaci su za populaciju odabranu prema CD8+. U svim slučajevima, negativno odabrani kvadranti su uspostavljeni na neobojenim kontrolama.

Slika 5, koja obuhvata slike 5A do 5C, predstavlja niz slika koje prikazuju rezultate eksperimenata procene kliničkih odgovora nakon infuzije CART19 ćelija. Slika 5A prikazuje da je pacijent UPN 02 bio lečen u dva ciklusa rituksimabom i bendamustinom sa minimalnim odgovorom (R/B, strelica). CART19 T ćelije su primenjene infuzijom počevši od 4 dana nakon samog bendamustina (B, strelica). Leukemija otporna na rituksimab i bendamustin je brzo uklonjena iz krvi, kao što je pokazano smanjenjem apsolutnog broja limfocita (ALC) sa 60 600/µl na 200/µl u okviru 18 dana od infuzije. Lečenje kortikosteroidima je započeto 18. dana nakon infuzije zbog slabosti i neinfektivnog febrilnog sindroma. Referentna linija (tačkasta) označava gornju granicu normale za ALC. Slika 5B prikazuje rezultate primera eksperimenata sekvencijalnog bojenja biopsije kosne srži ili uzoraka tkiva od pacijenta UPN 01 i 03 za CD20. Infiltracija leukemijom prisutna kod oba pacijenta pre lečenja, bila je odsutna u uzorcima nakon lečenja praćena normalizacijom celularnosti i trolinijske hematopoeze. Pacijent UPN 01 nije imao nikakve CLL ćelije detektovane protočnom citometrijom, citogenetskim ispitivanjima i fluorescentnom in-situ hibridizacijom ili normalne B ćelije detektovane protočnom citometrijom u kosnoj srži ili krvi. Pacijent UPN 03 je imao 5% preostalih normalnih CD5-negativnih B ćelija potvrđenih protočnom citometrijom na dan 23, koje su se takođe pokazale kao poliklonalne; normalne B ćelije nisu detektovane na dan 176. Slika 5C prikazuje rezultate eksperimenata upotrebom sekvencijalne CT vizuelizacije za brzu procenu generalizovane limfadenopatije otporne na hemoterapiju. Bilateralne aksilarne mase su se povukle za 83 (UPN 01) i 31 (UPN 03) dan od infuzije, kao što je označeno strelicama i krugom.

Slika 6, koja obuhvata slike 6A do 6C, predstavlja niz slika koje prikazuju apsolutni broj limfocita i ukupan broj CART19+ ćelija u cirkulaciji za UPN 01, 02, 03. Ukupan broj limfocita (zbir normalih i CLL ćelija) nasuprot ukupnom broju CART19+ ćelija u cirkulaciji je grafički prikazan za sva 3 subjekta upotrebom apsolutnog broja limfocita iz CBC vrednosti, i pod pretpostavkom da je zapremina krvi 5.0 L. Ukupan broj CART19 ćelija u cirkulaciji je izračunat upotrebom tandem CBC vrednosti sa apsolutnim brojem limfocita i vrednostima markera za Q-PCR kao što je prikazano na slici 2, pretvaranjem kopija/µg DNK u srednju % vrednost markera, kako je ovde opisano na drugim mestima. Nađeno je da je % vrednosti markera za Q-PCR u bliskoj korelaciji (<2-struke varijacije) sa karakterizacijom proizvoda infuzije pomoću protočne citometrije, i sa podacima iz uzoraka tamo gde su istovremeni podaci protočne citometrije bili dostupni za direktno određivanje broja CART19 ćelija bojenjem.

Slika 7, koja obuhvata slike 7A do 7D predstavlja niz slika koje prikazuju eksperimente koji uključuju direktnu ex vivo detekciju CART19-pozitivnih ćelija u PBMC pacijenta UPN-0171 dan nakon T-ćelijske infuzije. PBMC pacijenta UPN-01 sakupljeni ili sveži posle afereze, 71 dan nakon infuzije, ili zamrznuti u vreme afereze za proizvodnju T-ćelijskog proizvoda (polazna vrednost), i odmrznuti pre bojenja uz očuvanje vijabilnosti, podvrgnuti su protočnoj citometriji za detektovanje prisustva CART19 ćelija koje eksprimiraju fragment CAR 19 na površini. Za procenu ekspresije CAR19 u limfocitu, uzorci su istovremeno obojeni sa CD3-PE i anti-CAR19 idiotipskim antitelom konjugovanim sa Alexa-647, ili istovremeno obojeni samo sa CD3-PE (FMO za CAR19). Slika 7A pokazuje da je početni odabir limfocita uspostavljen na osnovu rasipanja unapred i bočno (FSC nasuprot SSC), praćeno odabirom od CD3+ ćelija. Slika 7B prikazuje okvir za CD3+ limfocite; slika 7C prikazuje CAR idiotipsko bojenje; slika 7D prikazuje CAR idiotipski FMO. CAR19-pozitivni odabir je uspostavljen na CAR19 FMO uzorcima.

Slika 8, koja obuhvata slike 8A do 8C, predstavlja niz slika koje prikazuju strategiju odabira za identifikaciju CART19 ekspresije upotrebom polihromatske protočne citometrije u uzorcima krvi pacijenta UPN 03. Strategiju odabira za sliku 8C je prikazana za uzorak UPN 03, dan 56 i predstavlja strategiju korišćenu za uzorak UPN 03, dan 169. Slika 8A prikazuje primarni odabir: negativno na kanalu za odbacivanje (CD14, CD16, LIVE/dead Aqua), CD3-pozitivno. Slika 8B prikazuje sekundarne odabire: CD4-pozitivno, CD8-pozitivno. Slika 8C prikazuje tercijarne odabire: CAR19-pozitivno i CAR19-negativno, uspostavljene na uzorcima CAR FMO (paneli krajnje desno).

Slika 9 prikazuje strategiju odabira za direktno identifikovanje CART19 ekspresije i B ćelija u uzorcima krvi i kosne srži. Strategiju odabira za sliku 4A, koja prikazuje detekciju CD3+ limfocita koji eksprimiraju CAR i odsustvo B ćelija u perifernoj krvi i kosnoj srži: levi grafik: ćelijski okvir; gornji panel: pozitivni okvir za CD3+ ćelije, donji panel: negativni okvir (CD14-negativno, CD3-negativno) za B ćelije. NC365, kontrolne ćelije periferne krvi zdravog davaoca.

Slika 10 je slika koja rezimira demograske podatke pacijenta i odgovor na lečenje.

Slika 11 prikazuje postupak za proizvodnju CART-19 ćelija.

Slika 12, koja obuhvata slike 12A do 12D, predstavlja niz slika koje prikazuju klinički odgovor kod pacijenta. Slika 12A prikazuje lentiviralni vektor korišćen za infekciju T ćelija pacijenta. Proizveden je lentiviralni vektor kliničkog stepena pseudotipiziran proteinom G virusa vezikularnog stomatitisa (pELPs 19-BB-z) koji upravlja ekspresijom anti-CD19 scFv izvedenog iz mišjeg monoklonskog antitela FMC63, zglobnog i transmembranskog domena humanog CD8α, i humanih signalnih domena 4-1BB i CD3ζ. Detalji CAR19 transgena, na dnu slike 12A, prikazuju glavne funkcionalne elemente. Slika nije u razmeri. 3’LTR označava 3’ dugi terminalni ponovak; 5’LTR, 5’ dugi terminalni ponovak; Amp R, gen za otpornost na ampicilin; Bovine GH Poly A, goveđi hormon rasta sa poliadenilacionim nizom; cPPT/CTS, centralni polipurinski trakt sa centralnom terminacionom sekvencom; EF-1α, elongacioni faktor 1-alfa; env, omotač; gag, antigen specifičan za grupu; pol, HTV gen koji kodira polimerazu i reverznu transkriptazu; R, ponovak; RRE, element koji odgovara na rev; scFv, jednolančani varijabilni fragment; TM, transmembranski; i WPRE, post-transkripcioni regulatorni element hepatitis virusa mrmota. Slika 12B prikazuje serumske nivoe kreatinina, mokraćne kiseline, i laktat dehidrogenaze (LDH) od dana 1 do dana 28 nakon prve infuzije CART19 ćelija. Vršni nivoi su se podudarali sa hospitalizacijom zbog sindroma lize tumora. Slika 12C prikazuje uzorke biopsije kosne srži dobijene 3 dana nakon hemoterapije (dan -1, pre infuzije CART19 ćelija) i

1

23 dana i 6 meseci nakon infuzije CART19 ćelija (hematoksilin i eozin). Polazni uzorak pokazuje hipercelularnu kosnu srž (60%) sa trolinearnom hematopoezom, infiltriranu pretežno intersticijalnim agregatima malih, zrelih limfocita koji čine 40% ukupne celularnosti. Uzorak dobijen 23. dana pokazuje preostale limfoidne agregate (10%) koji su bili negativni na hroničnu limfoidnu leukemiju (CLL), sa mešavinom T ćelija i CD5-negativnih B ćelija. Uzorak dobijen 6 meseci nakon infuzije pokazuje trolinearnu hematopoezu, bez limfoidnih agregata i produženo odsustvo CLL. Slika 12D prikazuje CT skenove sa pojačanim kontrastom dobijene pre nego što je pacijent bio uključen u ispitivanje i 31 dan i 104 dana posle prve infuzije. CT sken pre infuzije otkriva bilateralne mase veličine od 1 do 3 cm. Povlačenje aksilarne limfadenopatije se dogodilo u okviru 1 meseca posle infuzije i bilo je dugotrajno. Strelice označavaju različite uvećane limfne čvorove pre terapije i odgovore limfnih čvorova na uporednim CT skenovima nakon terapije.

Slika 13, koja obuhvata slike 13A do 13E, predstavlja niz slika koje prikazuju citokine u serumu i kosnoj srži pre i posle infuzija T-ćelija sa himernim receptorom za antigen. Niz merenja citokina interferona-γ (slika 13A), hemokina stimulisanih interferonom-γ, CXC hemokina 10 (CXCL10) (slika 13B) i CXC liganda 9 (CXCL9) (slika 13C), i interleukina-6 (slika 13D) jeizveden u naznačenim vremenskim tačkama. Povećanja nivoa ovih zapaljenskih citokina i hemokina su koincidirala sa početkom sindroma lize tumora. Niski nivoi interleukina-6 su detektovani na polaznoj tački, dok su interferonγ, CXCL9, i CXCL10 bili ispod granica detekcije na polaznoj tački. Opsezi standardne krive za analite i polazne vrednosti kod pacijenta, date u zagradama, bile su kao što sledi: interferon-γ, 11.2 do 23,972 pg po mililitru (1.4 pg po mililitru); CXCL10, 2.1 do 5319 pg po mililitru (274 pg po mililitru); CXCL9, 48.2 do 3700 pg po mililitru (177 pg po mililitru); interleukin-6, 2.7 do 4572 pg po mililitru (8.3 pg po mililitru); faktor nekroze tumora α (TNF-α), 1.9 do 4005 pg po mililitru (nije detektabilan); i rastvorni oblik receptora za interleukin-2, 13.4 to 34,210 pg po mililitru (644 pg po mililitru). Slika 13E prikazuje indukciju imunskog odgovora u kosnoj srži. Citokini TNF-α, interleukin-6, interferon-γ, hemokin CXCL9, i rastvorni oblik receptora za interleukin-2 su mereni u supernatantu fluida dobijenih iz aspirata kosne srži naznačenih dana pre i posle infuzije CART19 ćelija. Povećanja nivoa interleukina-6, interferona-γ, CXCL9, i rastvornog oblika receptora za interleukin-2, koincidirala su sa sindromom lize tumora, vršnom vrednosti infiltracije T-ćelija sa himernim receptorom za antigen, i iskorenjivanjem leukemijskog infiltrata.

Slika 14, koja obuhvata slike 14A do 14C, predstavlja niz slika koje prikazuju ekspanziju i opstanak T ćelija sa himernim receptorom za antigen in vivo. Genomska DNK (gDNK) je izolovana iz uzoraka pacijentove pune krvi (slika 14A) i aspirata kosne srži (slika 14B) sakupljenih u nizu vremenskih tačaka pre i posle infuzije T-ćelija sa himernim receptorom za antigen i korišćena za ispitivanje pomoću kvantitativne lančane reakcije polimeraze u realnom vremenu (PCR). Kako je procenjeno na osnovu transgene DNK i procenta limfocita koji eksprimiraju CAR19, T ćelije sa himernim receptorom za antigen su se umnožile do nivoa koji su bili više od 1000 puta viši od polaznih nivoa pri presađivanju u perifernoj krvi i kosnoj srži. Vršni nivoi T ćelija sa himernim receptorom za antigen su vremenski korelisani sa sindromom lize tumora. Uzorak krvi dobijen nultog dana i uzorak kosne srži dobijen 1. dana nisu imali PCR signal na polaznom nivou. Ispitivanje aspirata kosne srži protočnom citometrijom u polaznoj tački (slika 14C) pokazalo je pretežnu infiltraciju CD19+CD5+ ćelija koje su bile klonalne, što je procenjeno bojenjem imunoglobulinskog kapa lakog lanca, sa nedostatkom T ćelija. Na dan 31 posle infuzije, CD5+ T ćelije su bile prisutne, i ni normalne ni maligne B ćelije nisu detektovane. Brojevi označavaju relativnu učestalost ćelija u svakom kvadrantu. Obe ose, i x i y osa imaju log10 skalu. Strategija odabira je uključivala početni odabir od CD19+ i CD5+ ćelija u kvadratima sa leve strane, i nakon toga, identifikaciju ekspresije kapa i lambda imunoglobulina na podsetu CD19+CD5+ (kvadrati sa desne strane).

DETALJAN OPIS

[0045] Pronalazak se odnosi na kompozicije za lečenje kancera uključujući, ali bez ograničenja, hematološke malignitete i solidne tumore. Predmetni pronalazak se odnosi na strategiju adoptivnog ćelijskog transfera T ćelija transdukovanih tako da eksprimiraju himerni receptor za antigen (CAR). Receptori CAR su molekuli koji kombinuju specifičnost na bazi antitela za željeni antigen (npr., tumor antigen) sa unutarćelijskim domenom koji aktivira T-ćelijski receptor da bi nastao himerni protein koji ispoljava specifičnu antitumorsku ćelijsku imunsku aktivnost.

[0046] Predmetni pronalazak se odnosi uopšteno na upotrebu genetski modifikovanih T ćelija za stabilno eksprimiranje željenog CAR, kao što je dafinisano u patentnim zahtevima. T ćelije koje eksprimiraju CAR su ovde označene kao CAR T ćelije ili CAR modifikovane T ćelije. Poželjno, ćelija može da bude genetski modifikovana tako da stabilno eksprimira vezujući

1

domen antitela na svojoj površini, stvarajući novu antigenu specifičnost koja je nezavisna od MHC. T ćelija je genetski modifikovana tako da stabilno eksprimira CAR koji kombinuje domen za prepoznavanje antigena specifičnog antitela sa unutarćelijskim domenom proteina CD3-zeta lanca u jedinstveni himerni protein.

[0047] Kao što je ovde opisano, ovde opisani CAR sadrži vanćelijski domen koji ima domen za prepoznavanje antigena, transmembranski domen, i citoplazmatski domen. Kao što je ovde opisano, koristi se transmembranski domen koji je prirodno povezan sa jednim od domena u CAR. Takođe kao što je ovde opisano, transmembranski domen može da bude odabran ili modifikovan aminokiselinskom supstitucijom da bi se izbeglo vezivanje takvih domena za transmembranske domene istih ili različitih površinskih membranskih proteina, da bi se smanjile interakcije sa drugim članovima receptorskog kompleksa. Poželjno, transmembranski domen je domen zgloba CD8α.

[0048] Kada je u pitanju citoplazmatski domen, ovde opisani CAR sadrži signalni domen 4-1BB. Citoplazmatski domen CAR može da bude dizajniran da dodatno sadrži signalni domen CD3-zeta. Citoplazmatski domen CAR uključuje signalne module CD3-zeta i 4-1BB. Prema tome, pronalazak obezbeđuje CAR T ćelije i njihovu upotrebu za adoptivnu terapiju.

[0049] Kao što je ovde opisano, ovde opisane CAR T ćelije mogu da budu proizvedene uvođenjem u ćelije lentiviralnog vektora koji sadrži željeni CAR, na primer CAR koji sadrži anti-CD19, CD8α zglobni i transmembranski domen, i humane signalne domene 4-1BB i CD3zeta. CAR T ćelije pronalaska su sposobne da se replikuju in vivo što rezultuje u dugotrajnom opstanku koji može da vodi neprekidnoj kontroli tumora.

[0050] Ovde je takođe opisana primena genetski modifikovane T ćelije koja eksprimira CAR za lečenje pacijenta koji ima kancer, ili postoji rizik da ima kancer, upotrebom limfocitne infuzije. Poželjno, u lečenju se koristi autologna limfocitna infuzija. Autologne ćelije PBMC se sakupljaju od pacijenta kome je potrebno lečenje, i T ćelije se aktiviraju i umnožavaju upotrebom postupaka koji su ovde opisani i poznati u stanju tehnike, i zatim se vraćaju natrag pacijentu infuzijom.

[0051] Ovde je takođe opisano lečenje pacijenta koji ima rizik od razvoja CLL. Ovde je takođe opisano lečenje maligniteta ili autoimunske bolesti kod koje hemoterapija i/ili imunoterapija kod pacijenta rezultuju u značajnoj imunosupresiji kod pacijenta, povećavajući na taj način rizik da pacijent razvije CLL.

[0052] Ovde su obezbeđeni postupci koji koriste T ćelije koje eksprimiraju anti-CD19 CAR uključujući i CD3-zeta i 4-1 BB kostimulatorni domen (takođe označene kao CART19 T ćelije). Ovde opisane CART19 T ćelije mogu da podlegnu snažnoj in vivo T ćelijskoj

1

ekspanziji i mogu da uspostave CD19-specifične memorijske ćelije koje opstaju u velikom broju tokom produženog vremena u krvi i kosnoj srži. U nekim slučajevia, CART19 T ćelije koje su primenjene kod pacijenta infuzijim mogu da eliminišu ćelije leukemije in vivo kod pacijenata sa uznapredovalom CLL otpornom na hemoterapiju.

Definicije

[0053] Osim ako nije dugačije definisano, svi ovde korišćeni tehnički i naučni termini imaju isto značenje kao što obično podrazumeva stručnjak u oblasti na koju se pronalazak odnosi. Iako bilo koji postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu da se koriste u praktičnom ispitivanju predmetnog pronalaska, poželjni materijali i postupci su ovde opisani. U opisu i traženju zaštite za predmetni pronalazak, sledeća terminologija će biti korišćena.

[0054] Treba takođe razumeti da ovde korišćena terminologija služi samo opisivanju određenih primera izvođenja, i nije namenjena da bude ograničavajuća.

[0055] Članovi "a" i "an" su ovde korišćeni da označe jedan ili više od jedan (tj., najmanje jedan) od gramatičkih objekata člana. Na primer, "element" označava jedan element ili više od jednog elementa.

[0056] "Oko", kako se ovde koristi, kada se odnosi na merljivu vrednost kao što je količina, vremensko trajanje, i slično, predviđeno je da obuhvata varijacije od ±20% ili ±10%, poželjnije ±5%, čak poželjnije ±1%, i još poželjnije ±0.1% od specifikovane vrednosti, budući da su takve varijacije odgovarajuće za izvođenje opisanih postupaka.

[0057] "Aktivacija", kako se ovde koristi, odnosi se na stanje T ćelija koje su uspešno stimulisane da indukuju detektabilnu ćelijsku proliferaciju. Aktivacija može takođe da bude povezana sa indukovanom proizvodnjom citokina, i detektablnim efektorskim funkcijama. Termin "aktivirane T ćelije" se odnosi, između ostalog, na T ćelije koje prolaze kroz ćelijsku podelu.

[0058] Termin "antitelo," kako se ovde koristi, odnosi se na molekul imunoglobulina koji se specifično vezuje za antigen. Antitela mogu da budu intaktni imunoglobulini dobijeni iz prirodnih izvora ili iz rekombinantnih izvora i mogu da budu imunoreaktivni delovi intaktnih imunoglobulina. Antitela su obično tetrameri imunoglobulinskih molekula. Antitela u predmetnom pronalasku mogu da postoje u različitim oblicima uključujući, na primer, poliklonska antitela, monoklonska antitela, Fv, Fab i F(ab)2, kao i jednolančana antitela i humanizovana antitela (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory

1

Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).

[0059] Termin "fragment antitela" odnosi se na deo intaktnog antitela i odnosi se na varijabilne regione koji određuju antigenost intaktnog antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab’, F(ab’)2, i Fv fragmente, linearna antitela, scFv antitela, i multispecifična antitela obrazovana od fragmenata antitela.

[0060] "Teški lanac antitela", kako se ovde koristi, odnosi se na veći od dva tipa polipeptidnih lanaca prisutnih u svakom molekulu antitela u njihovim prirodnim konformacijama.

[0061] "Laki lanac antitela", kako se ovde koristi, odnosi se na manji od dva tipa polipeptidnih lanaca prisutnih u svakom molekulu antitela u njihovim prirodnim konformacijama, κ i λ laki lanci se odnosi na dva glavna izotipa lakog lanca antitela.

[0062] Pod terminom "sintetsko antitelo" kako se ovde koristi, podrazumeva se antitelo koje je napravljeno upotrebom tehnologije rekombinantne DNK, kao što je, na primer, antitelo eksprimirano na bakteriofagu kao što je ovde opisano. Termin treba razumeti tako da označava antitelo koje je napravljeno sintezom DNK molekula koji kodira antitelo i DNK molekul eksprimira protein antitela, ili aminokiselinsku sekvencu koja određuje antitelo, gde je DNK ili aminokiselinska sekvenca dobijena upotrebom tehnologije sintetske DNK ili aminokiselinske sekvence koja je odstupna i dobro poznata u stanju tehnike.

[0063] Termin "antigen" ili "Ag", kako se ovde koristi, je definisan kao molekul koji izaziva imunski odgovor. Ovaj imunski odgovor može da uključuje ili proizvodnju antitela, ili aktivaciju specifičnih imunološki-kompetentnih ćelija, ili oba. Stručnjak u oblasti će razumeti da bilo koji makromolekul, uključujući praktično sve proteine ili peptide, može da bude antigen. Osim toga, antigeni mogu da budu izvedeni iz rekombinantne ili genomske DNK. Stručnjak u oblasti će razumeti da bilo koja DNK, koja sadrži nukleotidne sekvence ili deo nukleotidne sekvence koja kodira protein koji izaziva imunski odgovr na taj način kodira "antigen" u smislu u kome se termin ovde koristi. Dalje, stručnjak u oblasti će razumeti da antigen ne mora da bude kodiran samo punom dužinom nukleotidne sekvence gena. Očigledno je da predmetni pronalazak uključuje, ali bez ograničenja, upotrebu dela nukleotidne sekvence više od jednog gena i da su ove nukleotidne sekvence uređene na različite načine da bi izazvale željeni imunski odgovor. Osim toga, stručnjak u oblasti će razumeti da antigen uopšte ne mora da bude kodiran "genom". Očigledno je da antigen može da bude proizveden sintezom ili može da bude izveden iz biološkog uzorka. Takav biološki uzorak može da uključuje, ali bez ograničenja, uzorak tkiva, uzorak tumora, ćeliju ili biološki fluid.

1

[0064] Termin "antitumorsko dejstvo" kako se ovde koristi, odnosi se na biološko dejstvo koje može da se ogleda u smanjenju zapremine tumora, smanjenju brija tumorskih ćelija, smanjenju broja metastaza, povećanju očekivane dužine života, ili poboljšanju različitih fizioloških simptoma povezanih sa kanceroznim stanjem. "Antitumorsko dejstvo" može takođe da se ispoljava kroz sposobnost peptida, polinukleotida, ćelija i antitela pronalaska da spreče pojavu tumora na prvom mestu.

[0065] Termin "autoantigen" označava, u skladu sa predmetnim pronalaskom, bilo koji sopstveni antigen koji imunski sistem greškom prepoznaje kao strani. Autoantigeni sadrže, ali nisu ograničeni na, ćelijske proteine, fosfoproteine, ćelijske površinske proteine, ćelijske lipide, nukleinske kiseline, glikoproteine, uključujući receptore ćelijske površine.

[0066] Termin "autoimuna bolest", kako se ovde koristi, definiše se kao poremećaj koji rezultuje iz autoimunskog odgovora. Autoimuna bolest je rezultat neprimerenog i prekomernog odgovora na sopstveni antigen. Primeri autoimunih bolesti uključuju, ali nisu ograničeni na, Adisionovu bolest, alopeciju greata, ankilozni spondilitis, autoimuni hepatitis, autoimuni parotitis, Kronovu bolest, dijabetes (tipa I), distrofičnu buloznu epidermolizu, epididimitis, glomerulonefritis, Graves-ovu bolest, Gijen-Bareov sindrom, Hašimotovu bolest, hemolitičku anemiju, sistemski lupus eritematosus, multiple sklerozu, mijasteniju gravis, pemfigus vulgaris, psorijazu, reumatsku groznicu, reumatoidni artritis, sarkoidozu, sklerodermu, Sjogren-ov sindrom, spondiloartropatije, tiroiditis, vaskulitis, vitiligo, miksedem, pernicioznu anemiju, ulcerozni kolitis, između ostalih.

[0067] Kako se ovde koristi, termin "autologno" se odnosi na bilo kakav materijal koji potiče od istog pojedinca kome kasnije treba da bude ponovo vraćen.

[0068] "Alogeno" se odnosi na graft koji potiče od druge životinje iste vrste.

[0069] "Ksenogeno" se odnosi na graft koji potiče od životinje različite vrste.

[0070] Termin "kancer", kako se ovde koristi, se definiše kao bolest okarakterisana brzim i nekontrolisnim rastom aberantnih ćelija. Kancerske ćelije mogu da se šire lokalno ili kroz krvotok i limfni sistem u druge delove tela. Primeri različitih kancera uključuju, ali nisu ograničeni na, kancer dojke, kancer prostate, kancer jajnika, kancer grlića materice, kancer kože, kancer pankreasa, kolorektalni kancer, kancer bubrega, kancer jetre, kancer mozga, limfom, leukemiju, kancer pluća, i slično.

[0071] "Kostimulatorni ligand," kako se termin ovde koristi, uključuje molekul na antigen prezentujućoj ćeliji (npr., aAPC, dendritska ćelija, B ćelija, i slično) koji se specifično vezuje za srodni kostimulatorni molekul na T ćeliji, obezbeđujući tako signal koji, uz primarni signal obezbeđen, na primer, vezivanjem TCR/CD3 kompleksa sa MHC molekulom opterećenim

1

peptidom, posreduje u T ćelijskom odgovoru, uključujući, ali bez ograničenja, proliferaciju, aktivaciju, diferencijaciju, i slično. Kostimulatorni ligand može da uključuje, ali bez ograničenja, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, inducibilni kostimulatorni ligand (ICOS-L), intercelularni adhezioni molekul (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, limfotoksinski beta receptor, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, agonist ili antitelo koje se vezuje za Toll ligand receptor i ligand koji se specifično vezuje za B7-H3. Kostimulatorni ligand takođe obuhvata, između ostalog, antitelo koje se specifično vezuje za kostimulatorni molekul prisutan na T ćeliji, kao što je, ali bez ograničenja, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antigen-1 povezan sa funkcijom limfocita (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, i ligand koji se specifično vezuje za CD83.

[0072] "Kostimulatorni molekul" se odnosi na srodni vezujući partnerski mlekul na T ćeliji koji se specifično vezuje za kostimulatorni ligand, posredujući tako u kostimulatornom odgovoru pomoću T ćelija, kao što je, ali bez ograničenja, proliferacija. Kostimulatorni molekuli uključuju, ali nisu ograničeni na MHC molekul klase I, BTLA i Toll ligand receptor.

[0073] "Kostimulatorni signal", kako se ovde koristi, odnosi se na signal, koji u kombinaciji sa primarnim signalom, kao što je ligacija TCR/CD3, vodi T ćelijskoj proliferaciji i/ili ushodnoj ili nishodnoj regulaciji ključnih molekula.

[0074] "Bolest" je zdravstveno stanje životinje gde životinja ne može da održi homeostazu, i gde, ako se bolest ne poboljša, tada zdravlje životinje nastavlja da se narušava. Suprotno, "poremećaj" kod životinje je zdravstveno stanje životinje u kome životinja može da održi homeostazu, ali u kome je zdravstveno stanje životinje manje poželjno nego što bi bilo u odsustvu poremećaja. Ostavljen nelečen, poremećaj ne bi nužno izazvao dalje pogoršanje zdravstvenog stanja životinje.

[0075] "Efikasna količina" kako se ovde koristi, označava količinu koja obezbeđuje terapeutsku ili profilaktičku korist.

[0076] Izraz "kodirajući" se odnosi se na karakteristično svojstvo specifične sekvence nukleotida u polinukleotidu, kao što je gen, cDNK, ili iRNK, da služi kao obrazac za sintezu drugih polimera i makromolekula u biološkim procesima koja imaju ili definisanu sekvencu nukleotida (tj., rRNK, tRNK i iRNK) ili definisanu sekvencu aminokiselina i biološka svojstva koja iz njih proizilaze. Prema tome, gen kodira protein ako transkripcija i translacija iRNK koja odgovara tom genu proizvodi protein u ćeliji ili drugom biološkom sistemu. I kodirajući lanac, čija je nukleotidna sekvenca identična sa sekvencom iRNK i koja je obično prikazana u listama sekvenci, i nekodirajući lanac, koji se koristi kao obrazac za transkripciju

2

gena ili cDNK, mogu da se označe kao kodirajući za protein ili drugi proizvod tog gena ili cDNK.

[0077] Kako se ovde koristi "endogeno" odnosi se na bilo koji materijal iz, ili proizveden u organizmu, ćeliji, tkivu ili sistemu.

[0078] Kako se ovde koristi, termin "egzogeno" odnosi se na bilo koji materijal uveden iz, ili proizveden izvan organizma, ćelije, tkiva ili sistema.

[0079] Termin "ekspresija", kako se ovde koristi, definiše se kao transkripcija i/ili translacija određene nukleotidne sekvence pokrenuta njenim promotorom.

[0080] "Ekspresioni vektor" se odnosi na vektor koji sadrži rekombinantni polinukleotid koji sadrži sekvencu za kontrolu ekspresije operativno povezanu sa nukleotidnom sekvencom koja treba da se eksprimira. Ekspresioni vektor sadrži dovoljno elemenata koji deluju u cis položaju za ekspresiju; druge elemente za ekspresiju može da obezbeđuje ćelija-domaćin ili in vitro ekspresioni sistem. Ekspresioni vektori uključuju sve one poznate u stanju tehnike, kao što su kozmidi, plazmidi (npr., goli ili sadržani u lipozomima) i virusi (npr., lentivirusi, retrovirusi, adenovirusi, i virusi povezani sa adenovirusima) koji obuhvataju rekombinantni polinukleotid.

[0081] "Homologno" se odnosi na sličnost sekvence ili identičnost sekvence između dva polipeptida ili između dva molekula nukleinske kiseline. Kada je na poziciji u obe od dve upoređene sekvence ista baza ili aminokiselinska monomerna subjedinica, npr., ako je na poziciji u svakom od dva molekula DNK adenin, tada su molekuli homologni na toj poziciji. Procenat homologije između dve sekvence je funkcija broja odgovarajućih ili homolognih pozicija koje dele dve sekvence, podeljena brojem upoređenih pozicija X 100. Na primer, ako se 6 od 10 pozicija u dve sekvence podudaraju ili su homologne, tada su dve sekvence 60% homologne. Na primer, DNK sekvence ATTGCC i TATGGC dele 50% homologije. Uopšteno, poređenje se radi kada su dve sekvence poravnate tako da se dobije maksimum homologije.

[0082] Termin "imunoglobulin" ili "Ig", kako se ovde koristi, definiše se kao klasa proteina, koji funkcionišu kao antitela. Antitela koja eksprimiraju B ćelije se ponekad označavaju kao BCR (B ćelijski receptor) ili receptor za antigen. Pet članova, uključenih u ovu klasu proteina su IgA, IgG, IgM, IgD, i IgE. IgA je primarno antitelo prisutno u telesnim sekretima, kao što je saliva, suze, majčino mleko, gastrointestinalni sekreti i mukozni sekreti respiratornog i urogenitalnog trakta. IgG je najčešće antitelo u cirkulaciji. IgM je glavni imunoglobulin proizveden u primarnom imunskom odgovru kod većine subjekata. To je najefikasniji imunoglobulin u aglutinaciji, fiksaciji komplementa, i drugim odgovorima antitela, i značajno je u odbrani od bakterija i virusa. IgD je imunoglobulin koji nema poznatu ulogu antitela, ali može da bude receptor za antigen. IgE je imunoglobulin koji posreduje u neposrednoj preosjetljivosti izazivanjem oslobađanja medijatora iz mast ćelija i bazofila nakon izlaganja alergenu.

[0083] Kako se ovde koristi, "uputstvo" uključuje publikacije, zapise, dijagrame, ili bilo koje druge medijume za izražavanje koji mogu da se koriste za saopštavanje korisnosti kompozicija i postupaka pronalaska. Uputstvo u kitu pronalaska može, na primer, da bude pričvršćeno za kontejner koji sadrži nukleinsku kiselinu, peptid, i/ili kompoziciju pronalaska ili da se isporučuje zajedno sa kontejnerom koji sadrži nukleinsku kiselinu, peptid, i/ili kompoziciju. Alternativno, uputstvo može da se isporučuje odvojeno od kontejnera sa namerom da primalac zajedno koristi uputstvo i jedinjenje.

[0084] "Izolovano" označava izmenjeno ili uklonjeno iz prirodnog okruženja. Na primer, nukleinska kiselina ili peptid prirodno prisutan u živoj životinji nije "izolovan," ali ista nukleinska kiselina ili peptid delimično ili potpuno odvojen od istovremeno postojećeg materijala njegovog prirodnog okruženja je "izolovan." Izolovana nukleinska kiselina ili protein može da postoji u suštinski prečišćenom obliku, ili može da postoji u ne-nativnom okruženju kao što je, na primer, ćelija-domaćin.

[0085] U kontekstu predmetnog pronalaska, koriste se sledeće skraćenice za uobičajene baze nukleinske kiseline. "A" se odnosi na adenozin, "C" se odnosi na citozin, "G" se odnosi na guanozin, "T" se odnosi na timidin, i "U" se odnosi na uridin.

[0086] Osim ako nije drugačije naznačeno, "nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu" uključuje sve nukleotidne sekvence koje su degenerisane verzije jedne drugih i koje kodiraju istu aminokiselinsku sekvencu. izraz nukleotidna sekvenca koja kodira protein ili RNK može takođe da uključuje introne do stepena u kome nukleotidna sekvenca koja kodira protein može u nekoj verziji sa sadrži intron(e).

[0087] "Lentivirus", kako se ovde koristi, odnosi se na rod familije Retroviridae. Lentivirusi su jedinstveni među retrovirusima po tome što mogu da inficiraju ćelije koje se ne dele; oni mogu da dostave značajnu količinu genetske informacije u DNK ćelije-domaćina, tako da oni predstavljaju jedan od najefikasnijih vektora za dostavu gena. HIV, SIV, i FIV su sve primeri lentivirusa. Vektori izvedeni iz lentivirusa obezbeđuju način za postizanje značajnih nivoa transfera gena in vivo.

[0088] Pod terminom "modulacija", kako se ovde koristi, misli se na posredovanje u detektabilnom povećanju ili smanjenju nivoa odgovora kod subjekta, u poređenju sa nivoom odgovora kod subjekta u odsustvu lečenja ili jedinjenja, i/ili u poređenju sa nivoom odgovora kod inače identičnog, ali nelečenog subjekta. Termin obuhvata ometanje i/ili uticanje na nativni signal ili odgovor, posredujući tako u pozitivnom terapijskom odgovoru kod subjekta, poželjno, čoveka.

[0089] Osim ako nije drugačije naznačeno, "nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu" uključuje sve nukleotidne sekvence koje su degenerisane verzije jedna druge i koje kodiraju istu aminokiselinsku sekvencu. Nukleotidne sekvence koje kodiraju proteine i RNK mogu da uključuju introne.

[0090] Termin "operativno vezano" odnosi se na funkcionalnu vezu između regulatorne sekvence i heterologne sekvence nukleinske kiseline koja rezultuje u ekspresiji ove druge. Na primer, prva sekvenca nukleinske kiseline je operativno vezana za drugu sekvencu nukleinske kiseline kada je prva sekvenca nukleinske kiseline pozicionirana u funkcionalnom odnosu prema drugoj sekvenci nukleinske kiseline. Na primer, promotor je operativno vezan za kodirajuću sekvencu ako promotor deluje na transkripciju ili ekspresiju kodirajuće sekvence. Uopšteno, operativno vezane DNK sekvence su susedne i, tamo gde je neophodno da se spoje dva regiona koja kodiraju protein, u istom okviru čitanja.

[0091] Izraz "prekomerno eksprimiran" tumor antigen ili "prekomerna ekspresija" tumor antigena je namenjen da označi abnormalni nivo ekspresije tumor antigena u ćeliji iz oblasti zahvaćene bolešću kao što je solidni tumor u specifičnom tkivu ili organu pacijenta, u odnosu na nivo ekspresije u normalnoj ćeliji iz tog tkiva ili organa. Pacijenti koji imaju solidne tumore ili hematološki malignitet koji karakteriše prekomerna ekspresija tumor antigena mogu da se odrede standardnim ispitivanjima poznatim u stanju tehnike.

[0092] "Parenteralna" primena imunogene kompozicije uključuje, npr., subkutanu (s.c.), intravensku (i.v.), intramuskularnu (i.m.), ili intrasternalnu injekciju, ili tehnike infuzije.

[0093] Termini "pacijent," "subjekat," "pojedinac", i slično, ovde se koriste međusobno zamenljivo, i odnose se na bilo koju životinju, ili njihove ćelije bilo in vitro ili in situ, dostupne za ovde opisane postupke. U određenim neograničavajućim primerima izvođenja, pacijent, subjekat ili pojedinac je čovek.

[0094] Termin "polinukleotid", kako se ovde koristi, definiše se kao lanac nukleotida. Osim toga, nukleinske kiseline su polimeri nukleotida. Tako, nukleinske kiseline i polinukleotid, kako se ovde koristi, su međusobno zamenljivi termini. Stručnjak u oblasti zna da su nukleinske kiseline polinukleotidi, koji mogu da hidrolizuju na monomerne "nukleotide." Monomerni nukleotidi mogu da hidrolizuju na nukleozide. Kako se ovde koristi, polinukleotidi uključuju, ali nisu ograničeni na sve sekvence nukleinskih kiselina koje se dobijaju na bilo koji način dostupan u stanju tehnike, uključujući, bez ograničenja,

2

rekombinantne načine, tj., kloniranje sekvence nukleinskih kiselina iz rekombinantne biblioteke ili ćelijskog genoma, upotrebom uobičajenih tehnologija kloniranja i PCR™, i slično, i postupcima sinteze.

[0095] Kako se ovde koristi, termini "peptid," "polipeptid" i "protein" su međusobno zamenljivi, i odnose se na jedinjenje sačinjeno od aminokiselinskih ostataka kovalentno vezanih peptidnim vezama. Protein ili peptid mora da sadrži najmanje dve aminokiseline, i maksimalan broj aminokiselina koji može da sadrži proteinska ili peptidna sekvenca nije ograničen. Polipeptidi uključuju bilo koji peptid ili protein koji sadrži dve ili više aminokiselina koje su jedna sa drugom spojene peptidnim vezama. Kako se ovde koristi, termin se odnosi i na kratke lance, koji se takođe često nazivaju u stanju tehnike peptidima, oligopeptidima i oligomerima, na primer, i na duže lance, koji se uopšteno nazivaju u stanju tehnike proteinima, kojih ima mnogo vrsta. "Polipeptidi" uključuju, na primer, biološki aktivne fragmente, suštinski homologne polipeptide, oligopeptide, homodimere, heterodimere, varijante polipeptida, modifikovane polipeptide, derivate, analoge, fuzione proteine, između ostalih. Polipeptidi uključuju prirodne peptide, rekombinantne peptide, sintetske peptide, ili njihovu kombinaciju.

[0096] Termin "promotor", kako se ovde koristi, definiše se kao DNK sekvenca koju prepoznaju komponente sintetskog aparata ćelije, ili komponente uvedenog sintetskog aparata, potrebna za započinjanje specifične transkripcije polinukleotidne sekvence.

[0097] Kako se ovde koristi, termin "promotor/regulatorna sekvenca" označava sekvencu nukleinske kiseline koja je potrebna za ekspresiju genskog proizvoda koji je operativno vezan za promotorsku/regulatornu sekvencu. U nekim slučajevima, ova sekvenca može da bude osnovna promotorska sekvenca, a u drugim slučajevima, ova sekvenca može takođe da uključuje sekvencu za pojačavanje i druge regulatorne elemente koji su potrebni za ekspresiju genskog proizvoda. Promotor/regulatorna sekvenca može, na primer, da bude ona koja eksprimira genski proizvod na tkivno specifičan način.

[0098] "Konstitutivni" promotor je nukleotidna sekvenca koja, kada je operativno vezana za polinukleotid koji kodira ili određuje genski proizvod, izaziva proizvodnju genskog proizvoda u ćeliji u većini ili svim fiziološkim stanjima ćelije.

[0099] "Inducibilan" promotor je nukleotidna sekvenca koja, kada je operativno vezana za polinukleotid koji kodira ili određuje genski proizvod, izaziva proizvodnju genskog proizvoda u ćeliji suštinski samo kada je induktor koji odgovara promotoru prisutan u ćeliji.

[0100] "Tkivno-specifični" promotor je nukleotidna sekvenca koja, kada je operativno vezana za polinukleotid koji kodira ili određuje genski proizvod, izaziva proizvodnju genskog proizvoda u ćeliji suštinski samo ako ćelija pripada onom tipu tkiva koji je odgovarajući za promotor.

[0101] Pod terminom "specifično vezuje", kako se ovde koristi, kada se govori o antitelu, misli se na antitelo koje prepoznaje specifični antigen, ali suštinski ne prepoznaje niti se vezuje za druge molekule u uzorku. Na primer, antitelo koje se specifično vezuje za antigen jedne vrste može takođe da se veže za antigen jedne ili više vrsta. Ali, takva ukrštena reaktivnost između vrsta sama po sebi ne menja klasifikaciju antitela kao specifičnog. U drugom primeru, antitelo koje se specifično vezuje za antigen može takođe da se veže za različite alelne oblike antigena. Međutim, takva ukrštena reaktivnost sama po sebi ne menja klasifikaciju antitela kao specifičnog. U nekim slučajevima, termini "specifično vezivanje" ili "specifično vezuje", mogu da se koriste u odnosu na interakciju antitela, proteina, ili peptida sa drugim hemijskim vrstama, kako bi se naznačilo da je interakcija zavisna od prisustva određene strukture (npr., antigene determinante ili epitopa) na hemijskoj vrsti; na primer, antitelo prepoznaje i vezuje se za specifičnu proteinsku strukturu pre nego za proteine uopšteno. Ako je antitelo specifično za epitop "A", prisustvo molekula koji sadrži epitop A (ili slobodni, neobeleženi A), u reakciji koja sadrži obeleženi "A" i antitelo, smanjiće količinu obeleženog A vezanog za antitelo.

[0102] Pod terminom "stimulacija," misli se na primarni odgovor indukovan vezivanjem stimulatornog molekula (npr., kompleksa TCR/CD3) sa njemu srodnim ligandom, koji tako posreduje u događaju prenosa signala, kao što je, ali bez ograničenja, prenos signala preko TCR/CD3 kompleksa. Stimulacija može da posreduje u izmenjenoj ekspresiji određenih molekula, kao što je nishodna regulacija TGF-β, i/ili reorganizaciji citoskeletnih struktura, i slično.

[0103] "Stimulatorni molekul," kako se termin ovde koristi, označava molekul na T ćeliji koji se specifično vezuje sa srodnim stimulatornim ligandom prisutnim na antigen prezentujućoj ćeliji.

[0104] "Stimulatorni ligand," kako se ovde koristi, označava ligand koji, kada je prisutan na antigen prezentujućoj ćeliji (npr., aAPC, dendritska ćelija, B-ćelija, i slično), može specifično da se veže sa srodnim partnerom u vezivanju (ovde označenim kao "stimulatorni molekul") na T ćeliji, posredujući tako u primarnom odgovoru T ćelije, uključujući, ali bez ograničenja, aktivaciju, započinjanje imunskog odgovora, proliferaciju, i slično. Stimulatorni ligandi su dobro poznati u stanju tehnike i obuhvataju, između ostalog, MHC molekul klase I opterećen peptidom, anti-CD3 antitelo, superagonist anti-CD28 antitela, i superagonist anti-CD2 antitela.

2

[0105] Termin "subjekat" je namenjen da uključuje žive organizme kod kojih može da se izazove imunski odgovor (npr., sisare). Primeri subjekata uključuju ljude, pse, mačke, miševe, pacove, i njihove transgene vrste.

[0106] Kako se ovde koristi, "suštinski prečišćena" ćelija je ćelija koja je suštinski oslobođena drugih vrsta ćelija. Suštinski prečišćena ćelija se takođe odnosi na ćeliju koja je bila odvojena od drugih vrsta ćelija sa kojima je normalno povezana u svom normalnom stanju. U nekim slučajevima, populacija suštinski prečišćenih ćelija se odnosi na homogenu populaciju ćelija. U drugim slučajevima, ovaj termin se jednostavno odnosi na ćeliju koja je odvojena od ćelija sa kojima je normalno povezana u svom prirodnom stanju. U nekim primerima izvođenja, ćelije se gaje in vitro. U drugim primerima izvođenja, ćelije se ne gaje in vitro.

[0107] Termin "terapeutski" kako se ovde koristi, označava lečenje i/ili profilaksu. Terapeutsko dejstvo se dobija supresijom, remisijom, ili iskorenjavanjem stanja bolesti.

[0108] Termin "terapeutski efikasna količina" odnosi se na količinu predmetnog jedinjenja koja će izazvati biološki ili medicinski odgovor tkiva, sistema, ili subjekta koji je primetio istraživač, veterinar, lekar ili drugi kliničar. Termin "terapeutski efikasna količina" uključuje količinu jedinjenja koja je, kada se primeni, dovoljna da spreči razvoj, ili olakša do određenog stepena, jedan ili više znakova ili simptoma poremećaja ili bolesti koja se leči. terapeutski efikasna količina će varirati u zavisnosti od jedinjenja, bolesti i njene ozbiljnosti, i starosti, težine, itd., subjekta koji treba da se leči.

[0109] "Lečiti" bolest kako se termin ovde koristi, znači smanjiti učestalost ili ozbiljnost najmanje jednog znaka ili simptoma bolesti ili poremećaja koje subjekat doživljava.

[0110] Termin "transfekovana" ili "transformisana" ili "transdukovana", kako se ovde koristi odnosi se na postupak kojim se egzogena nukleinska kiselina prenosi ili uvodi u ćeliju domaćina. "Transfekovana" ili "transformisana" ili "transdukovana" ćelija je ćelija koja je transfekovana, transformisana ili transdukovana egzogenom nukleinskom kiselinom. Ćelija uključuje primarnu predmetnu ćeliju i njeno potomstvo.

[0111] Izraz "pod transkripcionom kontrolom" ili "operativno vezan", kako se ovde koristi, znači da se promotor nalazi u odgovarajućem položaju i orijentaciji u odnosu na polinukleotid da bi kontrolisao započinjanje transkripcije RNK polimerazom i ekspresiju polinukleotida.

[0112] "Vektor" je kompozicija od interesa koja sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu i koja može da se koristi za dostavljanje izolovane nukleinske kiseline u unutrašnjost ćelije. Brojni vektori su poznati u stanju tehnike uključujući, ali bez ograničenja, linearne polinukleotide, polinukleotide udružene sa jonskim ili amfifilnim jedinjenjim, plazmide i viruse. Prema tome, termin "vektor" uključuje plazmid koji se samostalno replikuje ili virus. Termin treba takođe

2

razumeti tako da uključuje jedinjenja koja nisu plazmid ili virus, koja olakšavaju prebacivanje nukleinske kiseline u ćelije, kao što su, na primer, polilizinska jedinjenja, lipozomi, i slično. Primeri viralnih vektora uključuju, ali nisu ograničeni na adenovirusne vektore, vektore koji potiču od virusa povezanih sa adenovirusima, retrovirusne vektore, i slično.

[0113] Opsezi: u ovom pronalasku, različiti aspekti pronalaska mogu da budu predstavljeni u formatu opsega. Treba razumeti da je opis u formatu opsega dat samo u cilju pogodnosti i sažetosti i ne treba ga tumačiti kao nefleksibilno ograničenje oblasti pronalaska. Prema tome, treba razumeti da opis opsega obuhvata specifično opisane sve moguće pod-opsege kao i pojedinačne brojčane vrednosti u tom opsegu. Na primer, opis opsega kao što je od 1 do 6, treba razumeti tako da obuhvata specifično opisane pod-opsege kao što je od 1 do 3, od 1 do 4, od 1 do 5, od 2 do 4, od 2 do 6, od 3 do 6 itd., kao i pojedinačne brojeve u tom opsegu, na primer, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, i 6. Ovo važi bez obzira na širinu opsega.

Opis

[0114] Predmetni pronalazak obezbeđuje kompozicije za lečenje kancera. Kancer može da bude hematološki malignitet, solidni tumor, primarni ili metastazirajući tumor. Poželjno, kancer je hematološki malignitet, i poželjnije, kancer je hronična limfocitna leukemija (CLL).

[0115] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje T ćeliju modifikovanu tako da eksprimira CAR gde CAR T ćelija ispoljava antitumorsko svojstvo kao što je ovde definisano. CAR može da bude konstruisan tako da sadrži vanćelijski domen koji ima CD 19 antigenvezujući domen spojen sa CD3 zeta unutarćelijskim signalnim domenom zeta lanca kompleksa T ćelijskog antigenog receptora. Kada je eksprimiran u T ćeliji, CAR može da preusmeri prepoznavanje antigena zasnovano na antigen-vezujućoj specifičnosti. CD19 se eksprimira na malignim B ćelijama. Antigen-vezujući fragment je spojen sa unutarćelijskim domenom iz kostimulatornog molekula i zeta lancem koji predstavljaju CD137 (4-1BB) signalni domen i CD3zeta signalni domen.

[0116] Kao što je ovde opisano, CAR sadrži CD137 (4-1BB) signalni domen. Ovo je zbog toga što se predmetni pronalazak delimično zasniva na otkriću da T-ćelijski odgovori u kojima posreduje CAR mogu dodatno da se pojačaju dodavanjem kostimulatornih domena. Na primer, uključivanje CD137 (4-1BB) signalnog domena je značajno povećalo antitumorsku aktivnost i opstajanje CAR T ćelija in vivo u poređenju sa inače identičnom CAR T ćelijom koja nije konstruisana tako da eksprimira CD137 (4-1BB).

Kompozicija

2

[0117] Predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebe T ćelija koje su genetski modifikovane tako da eksprimiraju himerni receptor za antigen (CAR) koji sadrži vanćelijski i unutarćelijski domen kao što je ovde definisano. Vanćelijski domen sadrži vezujući element specifičan za ciljni molekul drugačije nazvan antigen-vezujući fragment. Unutarćelijski domen, ili drugačije citoplazmatski domen, sadrži kostimulatorni signalni region i deo zeta lanca. Kostimulatorni signalni region se odnosi na deo CAR koji sadrži unutarćelijski domen kostimulatornog molekula. Kostimulatorni molekuli su molekuli površine ćelije koji nisu antigeni receptori ili njihovi ligandi, koji su potrebni za efikasan odgovor limfocita na antigen.

[0118] Između vanćelijskog domena i transmembranskog domena CAR, ili između citoplazmatskog domena i transmembranskog domena CAR, može da bude umetnut spejser domen. Kako se ovde koristi, termin "spejser domen" uopšteno označava bilo koji oligo- ili polipeptid čija je uloga da poveže transmembranski domen ili sa vanćelijskim domenom, ili sa citoplazmatskim domenomom u polipeptidnom lancu. Spejser domen može da sadrži do 300 aminokiselina, poželjno 10 do 100 aminokiselina i najpoželjnije 25 do 50 aminokiselina.

Antigen-vezujući fragment

[0119] CAR koji je ovde opisan sadrži vezujući element specifičan za ciljni molekul drugačije nazvan antigen-vezujući fragment.

[0120] U kontekstu predmetnog pronalaska, "tumorski antigen" ili "antigen hiperporoliferativnog poremećaja" ili "antigen povezan sa hiperporoliferativnim poremećajem", odnosi se na antigene koji su zajednički za specifične hiperporoliferativne poremećaje kao što je kancer. Antigeni koji su ovde razmatrani su uključeni samo u smislu primera. Spisak nije predviđen da bude isključiv i dodatni primeri će biti očigledni stručnjaku u oblasti.

[0121] Tumorski antigeni su proteini koje proizvode tumorske ćelije, koji izazivaju imunski odgovor, naročito imunske odgovore posredovane T-ćelijama. Tumorski antigeni su dobro poznati u stanju tehnike i uključuju, na primer, antigen povezan sa gliomom, karcinoembrionski antigen (CEA), β-humani horionski gonadotropin, alfafetoprotein (AFP), lectinreaktivni AFP, tiroglobulin, RAGE-1, MN-CA IX, humanu telomerazu reverznu transkriptazu, RU1, RU2 (AS), intestinalnu karboksil esterazu, mut hsp70-2, M-CSF, prostazu, antigen specifičan za prostatu (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, prostein, PSMA, Her2/neu, survivin i telomerazu, tumorski antigen-1 karcinoma prostate (PCTA-1), MAGE, ELF2M, neutrofilnu elastazu, efrinB2, CD22, insulinski faktor rasta (IGF)-I, IGF-II, IGF-I receptor i mezotelin.

2

[0122] Maligni tumori eksprimiraju brojne proteine koji mogu da budu ciljni antigeni za napad imunog sistema. Ovi molekuli uključuju, ali nisu ograničeni na tkivno-specifične antigene kao što je MART-1, tirozinaza i GP 100 kod melanoma, i kisela fosfataza prostate (PAP) i antigen specifičan za prostatu (PSA) kod kancera prostate. Drugi ciljni molekuli pripadaju grupi molekula povezanih sa transformacijom kao što je onkogen HER-2/Neu/ErbB-2. Još jedna grupa ciljnih antigena su onko-fetalni antigeni kao što je karcinoembrionski antigen (CEA). U limfomu B-ćelija tumor-specifični idiotipski imunoglobulin sačinjava istinski tumor-specifični imunoglobulinski antigen koji je jedinstven za pojedinačni tumor. Antigeni B-ćelijske diferencijacije kao što su CD19, CD20 i CD37 su drugi kandidati za ciljne antigene u B-ćelijskom limfomu. Neki od ovuh antigena (CEA, HER-2, CD19, CD20, idiotip) su korišćeni kao ciljni molekuli za pasivnu imunoterapiju monoklonskim antitelima sa ograničenim uspehom.

[0123] Vrsta tumorskog antigena o kojoj se govori u opisu može takođe da bude tumorspecifični antigen (TSA) ili antigen povezan sa tumorom (TAA). TSA je jedinstven za tumorske ćelije i ne javlja se u drugim ćelijama u telu. Antigen povezan sa tumorom nije jedinstven za tumorsku ćeliju i umesto toga se eksprimira i na normalnoj ćeliji pod uslovima koji ne indukuju stanje imunološke tolerancije na antigen. Ekspresija antigena na tumoru može da se dogodi pod uslovima koji omogućavaju imunom sistemu da odgovori na antigen. Antigeni TAA mogu da budu antigeni koji se eksprimiraju na normalnim ćelijama tokom fetalnog razvoja kada je imuni sistem nezreo i nesposoban da odgovori, ili mogu da budu antigeni koji su normalno prisutni na izuzetno niskim nivoima na normalnim ćelijama, ali koji se eksprimiraju na mnogo višim nivoima na tumorskim ćelijama.

[0124] Neograničavajući primeri TSA ili TAA antigena uključuju sledeće: diferencijacione antigene kao što su: MART- 1/MelanA (MART-1), gp100 (Pmel 17), tirozinaza, TRP-1, TRP-2 i tumor-specifične multilinijske antigene kao što su MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15; prekomerno eksprimirane embrionske antigene kao što su CEA; prekomerno eksprimirane onkogene i mutirane tumor-supresorske gene kao što su p53, Ras, HER-2/neu; jedinstvene tumorske antigene koji rezultuju iz hromozomskih translokacija; kao što su BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; i viralne antigene, kao što su antigeni Epštajn-Bar virusa EBVA i antigeni E6 i E7 humanog papilomavirusa (HPV). Drugi veliki antigeni na bazi proteina uključuju TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm- 23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-katenin, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, alfa-fetoprotein, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27.29\BCAA, CA 195,

2

CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NYCO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90\Mac-2-vezujući protein\ciklofilin C-povezani protein, TAAL6, TAG72, TLP, i TPS.

[0125] Kao što je ovde opisano, drugi antigeni uključuju CD20, CD22, ROR1, Mezotelin, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, Glikolipid F77, EGFRvIII, GD-2, MY-ESO-1 TCR, MAGE A3 TCR, i slično.

[0126] Kao što je ovde opisano, deo CAR prema pronalasku koji čini antigen-vezujući fragment ciljno deluje na CD19. Poželjno, deo CAR prema pronalasku koji čini antigenvezujući fragment je anti-CD19 scFv, gde sekvenca nukleinske kiseline anti-CD19 scFv sadrži sekvencu naznačenu u SEQ ID: 14. Alternativno, anti-CD19 scFv sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20. U drugom primeru izvođenja, anti-CD19 scFv deo CAR prema pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu naznačenu u SEQ ID NO: 20.

Transmembranski domen

[0127] U odnosu na transmembranski domen, CAR može da bude dizajniran tako da sadrži transmembranski domen koji je spojen sa vanćelijskim domenom CAR. U jednom primeru izvođenja, koristi se transmembranski domen koji je prirodno pvezan sa jednim od domena CAR. U nekim slučajevima, transmembranski domen može da bude odabran ili modifikovan aminokiselinskom supstitucijom da bi se izbeglo vezivanje takvih domena za transmembranske domene istih ili različitih površinskih membranskih proteina, da bi se smanjile interakcije sa drugim članovima receptorskog kompleksa.

[0128] Transmembranski domen može da bude dobijen ili iz prirodnog, ili iz sintetskog izvora. Kada je izvor prirodan, domen može da se dobije od bilo kog proteina vezanog za membranu ili transmembranskog proteina. Transmembranski regioni koji su naročito korisni u ovom pronalasku mogu da budu dobijeni od (tj. da sadrže najmanje transmembranski region(e)) alfa, beta ili zeta lanca T-ćelijskog receptora, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Alternativno transmembranski domen može da bude sintetski, u kom slučaju će pretežno da sadrži hidrofobne rezidue kao što su leucin i valin. Poželjno će se na svakom kraju sintetskog transmembranskog domena naći triplet fenilalanina, triptofana i valina. Izborno, kratki oligoili polipeptidni linker, poželjno dužine između 2 i 10 aminokiselina može da obrazuje sponu između transmembranskog domena i citoplazmatskog signalnog domena CAR. Dublet glicinserin obezbeđuje naročito pogodan linker.

[0129] Poželjno, transmembranski domen u CAR prema pronalasku je CD8 transmembranski domen. U jednom primeru izvođenja, CD8 transmembranski domen sadrži sekvencu nukleinske kiseline označenu kao SEQ ID NO: 16. U jednom primeru izvođenja, CD8 transmembranski domen sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22, U drugom primeru izvođenja, CD8 transmembranski domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 22.

[0130] U nekim slučajevima, transmembranski domen CAR prema pronalasku sadrži domen zgloba CD8α. U jednom primeru izvođenja, domen zgloba CD8α sadrži sekvencu nukleinske kiseline označenu kao SEQ ID NO: 15. U jednom primeru izvođenja, domen zgloba CD8α sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21. U drugom primeru izvođenja, domen zgloba CD8α sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21.

Citoplazmatski domen

[0131] Citoplazmatski domen ili drugačije unutarćelijski signalni domen CAR prema pronalasku je odgovoran za aktivaciju najmanje jedne od normalnih efektorskih funkcija imunske ćelije u koju je ubačen CAR. Termin "efektorska funkcija" se odnosi na specijalizovanu funkciju ćelije. Efektorska funkcija T ćelija, na primer, može da bude citolitička aktivnost ili aktivnost ćelije-pomoćnika uključujući sekreciju citokina. Prema tome, termin "unutarćelijski signalni domen" se odnosi na deo proteina koji prenosi signal za efektorsku funkciju i usmerava ćeliju da ostvari specijalizovanu funkciju. Dok obično ceo unutarćelijski signalni domen može da bude uključen, u mnogim slučajevima nije neophodno koristiti ceo lanac. Do stepena u kome se koristi skraćeni deo unutarćelijskog signalnog domena, takav skraćeni deo može da se koristi umesto intaktnog lanca sve dok prenosi signal za efektorsku funkciju. Termin unutarćelijski signalni domen je prema tome predviđen da uključuje bilo koji skraćeni deo unutarćelijskog signalnog domena dovoljan da prenese signal za efektorsku funkciju.

[0132] Unutarćelijski signalni domeni za upotrebu u CAR pronalaska uključuju citoplazmatske sekvence T-ćelijskog receptora (TCR) i koreceptore koji deluju u saglasnosti da pokrenu prenos signala nakon angažovanja receptora za antigen, kao i bilo koji derivat ili varijantu ovih sekvenci i bilo koju sintetsku sekvencu koja ima istu funkcionalnu sposobnost kao što je ovde definisano.

[0133] Poznato je da signali koje stvaraju sami TCR nisu dovoljni za potpunu aktivaciju T ćelije i da je sekundarni ili kostimulatorni signal takođe potreban. Prema tome, za aktivaciju T

1

ćelije se može reći da je posredovana sa dve odvojene klase citoplazmatskih signalnih sekvenci: onih koje pokreću antigen-zavisnu primarnu aktivaciju preko TCR (primarne citoplazmatske signalne sekvence) i onih koje deluju na način nezavisan od antigena da bi obezbedile sekundarni ili kostimulatorni signal (sekundarne citoplazmatske signalne sekvence).

[0134] Primarne citoplazmatske signalne sekvence regulišu primarnu aktivaciju TCR kompleksa ili stimulatornim putem, ili inhibitornim putem. Primarne citoplazmatske signalne sekvence koje deluju na stimulatorni način mogu da sadrže signalne motive poznate kao imunoreceptorski aktivacioni motivi bazirani na tirozinu ili ITAM.

[0135] Primeri ITAM koji sadrže primarne citoplazmatske signalne sekvence koji su naročito korisni uključuju one izvedene iz TCR zeta, FcR gama, FcR beta, CD3 gama, CD3 delta, CD3 epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, i CD66d. Prema pronalasku, citoplazmatski signalni molekul u CAR pronalaska sadrži citoplazmatsku signalnu sekvencu izvedenu iz CD3 zeta.

[0136] Citoplazmatski domen CAR sadrži CD3-zeta signalni domen kombinovan sa kostimulatornim signalnim regionom koji se odnosi na deo CAR koji sadrži unutarćelijski domen 4-1BB kostimulatornog molekula. Kostimulatorni molekul je molekul ćelijske površine koji nije receptor za antigen ili njegovi ligandi koji je potreban za efikasan odgovor limfocita na antigen. Primeri drugih takvih molekula uključuju CD27, CD28, (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antigen 1 povezan sa limfocitnom funkcijom (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, i ligand koji se specifično vezuje za CD83, i slično.

[0137] Citoplazmatske signalne sekvence u citoplazmatskom signalnom delu CAR prema pronalasku mogu da budu vezane jedna sa drugom slučajnim ili specifičnim redom. Izborno, kratki oligo- ili polipeptidni linker, poželjno dužine između 2 i 10 aminokiselina može da obrazuje sponu. Dublet glicin-serin obezbeđuje naročito pogodan linker.

[0138] Citoplazmatski domen je dizajniran tako da sadrži signalni domen CD3-zeta i signalni domen 4-1BB.

[0139] U jednom primeru izvođenja, citoplazmatski domen u CAR prema pronalasku je dizajniran tako da sadrži signalni domen 4-1BB i signalni domen CD3-zeta, gde signalni domen 4-1BB sadrži sekvencu nukleinske kiseline naznačenu u SEQ ID NO: 17 i signalni domen CD3-zeta sadrži sekvencu nukleinske kiseline naznačenu u SEQ ID NO: 18.

[0140] U jednom primeru izvođenja, citoplazmatski domen u CAR pronalaska je dizajniran tako da sadrži signalni domen 4-1BB i signalni domen CD3-zeta, gde signalni domen 4-1BB sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23 i

2

signalni domen CD3-zeta sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24.

[0141] U jednom primeru izvođenja, citoplazmatski domen u CAR pronalaska je dizajniran tako da sadrži signalni domen 4-1BB i signalni domen of CD3-zeta, gde signalni domen 4-1BB sadrži aminokiselinsku sekvencu naznačenu u SEQ ID NO: 23 i signalni domen CD3-zeta sadrži aminokiselinsku sekvencu naznačenu u SEQ ID NO: 24.

Vektori

[0142] Predmetni pronalazak obuhvata DNK konstrukt koji sadrži sekvencu CAR, gde sekvenca sadrži sekvencu nukleinske kiseline antigen-vezujućeg fragmenta operativno vezanu za sekvencu nukleinske kiseline unutarćelijskog domena, tj. unutarćelijske domene CD3-zeta i 4-1BB.

[0143] U jednom primeru izvođenja, CAR pronalaska sadrži anti-CD19 scFv, region zgloba i transmembranski domen humanog CD8, i humane 4-1BB i CD3zeta signalne domene. U jednom primeru izvođenja, CAR pronalaska sadrži sekvencu nukleinske kiseline naznačenu u SEQ ID NO: 8. U drugom primeru izvođenja, CAR pronalaska sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12. U drugom primeru izvođenja, CAR pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu naznačenu u SEQ ID NO: 12.

[0144] Sekvenca nukleinskih kiselina koja kodira željene molekule može da se dobije upotrebom rekombinantnih postupaka poznatih u stanju tehnike, kao što je, na primer skriningom biblioteka iz ćelija koje eksprimiraju gen, dobijanjem gena iz vektora za koji se zna da uključuje taj gen, ili direktno izolovanjem iz ćelija i tkiva koja sadrže taj gen, upotrebom standardnih tehnika. Alternativno, gen od interesa može da se proizvede sintetski, umesto da se klonira.

[0145] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje vektore u koje je umetnuta DNK predmetnog pronalaska. Vektori izvedeni iz retrovirusa kao što je lentivirus su pogodan instrument za postizanje dugoročnog prenosa gena s obzirom da omogućavaju dugotrajnu, stablnu ugradnju transgena i njegovo umnožavanje u ćerkama-ćelijama. Lentiviralni vektori imaju dodatnu prednost nad vektorima izvedenim iz onko-retrovirusa, kao što su mišji virusi leukemije, koja se sastoji u tome što mogu da transdukuju ćelije koje se ne dele, kao što su hepatociti. Takođe imaju dodatnu prednost niske imunogenosti.

[0146] Ukratko, ekspresija prirodne ili sintetske nukleinske kiseline koja kodira receptore CAR se obično postiže operativnim povezivanjem nukleinske kiseline koja kodira polipeptid CAR ili njegov deo za promotor, i ugradnjom konstrukta u ekspresioni vektor. Vektori mogu da budu pogodni za replikaciju i integraciju u eukariote. Tipični vektori za kloniranje sadrže terminatore transkripcije i translacije, inicijacione sekvence, i promotore korisne za regulaciju ekspresije željene sekvence nukleinske kiseline.

[0147] Ekspresioni konstrukti koji su ovde opisani, mogu takođe da se koriste za imunizaciju nukleinskom kiselinom i gensku terapiju, upotrebom standardnih protokola za dostavu gena. Postupci za dostavu gena su poznati u stanju tehnike. Videti, npr., SAD pat. br. 5,399,346, 5,580,859, 5,589,466. U drugom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje vektor za gensku terapiju.

[0148] Nukleinska kiselina može da se klonira u brojne vrste vektora. Na primer, nukleinska kiselina može da se klonira u vektor uključujući, ali bez ograničenja, plazmid, fagemid, derivat faga, životinjski virus, i kozmid. Vektori od posebnog interesa uključuju ekspresione vektore, replikacione vektore, vektore za stvaranje proba, i vektore za sekvenciranje.

[0149] Dalje, ekspresioni vektor može da se obezbedi ćeliji u obliku virusnog vektora. Tehnologija virusnog vektora je dobro poznata u stanju tehnike i opisana je, na primer, kod Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), i u drugim virusološkim i molekularno-biološkim priručnicima. Virusi, koji su korisni kao vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, retroviruse, adenoviruse, viruse povezane sa adenovirusima, herpes viruse, i lentiviruse. Uopšteno, pogodan vektor sadrži oridžin replikacije koji je funkcionalan u najmanje jednom organizmu, promotorsku sekvencu, pogodna mesta za delovanje restrikcione endonukleaze, i jedan ili više selektabilnih markera, (npr., WO 01/96584; WO 01/29058; i SAD pat. br.6,326,193).

[0150] Brojni sistemi bazirani na virusu su razvijeni za prenos gena u sisarske ćelije. Na primer, retrovirusi obezbeđuju pogodnu platformu za sistem za dostavu gena. Odabrani gen može da se umetne u vektor i spakuje u retrovirusne čestice upotrebom postupaka poznatih u stanju tehnike. Rekombinantni virus može zatim da bude izolovan i dostavljen u ćelije subjekta ili in vivo ili ex vivo. Brojni retrovirusni sistemi su poznati u stanju tehnike. Na primer, koriste se adenovirusni vektori. Brojni adenovirusni vektori su poznati u stanju tehnike. U jednom primeru izvođenja, koriste se lentivirusni vektori.

[0151] Dodatni promotorski elementi, npr., pojačivači, regulišu učestalost započinjanja transkripcije. Tipično, oni su smešteni u regionu 30-110 bp ushodno od mesta početka transkripcije, mada se za brojne promotore nedavno pokazalo da takođe sadrže funkcionalne elemente nishodno od mesta početka transkripcije. Rastojanje između promotorskih elemenata često je fleksibilno, tako da je funkcija promotora očuvana kada se elementi obrnu ili promene položaj jedni u odnosu na druge. U promotoru timidin kinaze (tk), rastojanje

4

između promotorskih elemenata može da se poveća do 50 bp razdvojenosti pre nego što aktivnost počne da opada. U zavisnosti od promotora, izgleda da pojedinačni elementi mogu da deluju na aktivaciju transkripcije ili u saradnji, ili nezavisno.

[0152] Jedan primer pogodnog promotora je neposredno-rana promotorska sekvenca citomegalovirusa (CMV). Ova promotorska sekvenca je jaka konstitutivna promotorska sekvenca sposobna da dovede do visokih nivoa ekspresije bilo koje polinukleotidne sekvence koja je za nju operativno vezana. Još jedan primer pogodnog promotora je elongacioni faktor rasta -1α (EF-1α). Međutim, druge konstitutivne promotorske sekvence mogu takođe da se koriste, uključujući, ali bez ograničenja, rani promotor simian virusa 40 (SV40), virusa mišjeg tumora mlečne žlezde (MMTV), promotor dugog terminalnog ponovka (LTR) humanog virusa imunodeficijencije (HIV), MoMuLV promotor, promotor virusa ptičje leukemije, neposredno-rani promotor Epštajn-Bar virusa, promotor Rouz sarkoma virusa, kao i promotori humanih gena kao što su, ali bez ograničenja, aktinski promotor, miozinski promotor, hemoglobinski promotor, i promotor kreatin kinaze. Dalje, pronalazak ne treba da bude ograničen na upotrebu konstitutivnih promotora. Inducibilni promotori su takođe razmatrani kao deo pronalaska. Upotreba inducibilnog promotora obezbeđuje molekularni prekidač sposoban da pokrene ekspresiju polinukleotidne sekvence koja je operativno vezana, kada je takva ekspresija poželjna, ili da prekine ekspresiju kada ekspresija nije poželjna. Primeri inducibilnih promotora uključuju, ali nisu ograničeni na metalotioninski promotor, glukokortikoidni promotor, progesteronski promotor, i tetraciklinski promotor.

[0153] U cilju procene ekspresije CAR polipeptida ili njegovog dela, ekspresioni vektor koji treba da se uvede u ćeliju može takođe da sadrži ili selektabilni marker gen, ili reporter gen, ili oba kako bi se olakšala identifikacija i odabir ćelija koje ih eksprimiraju iz populacije ćelija koje su transfekovane ili inficirane viralnim vektorima. U drugim aspektima, selektabilni marker može da se nalazi na odvojenom delu DNK i koristi u kotransfekcionom postupku. I selektabilni markeri i reporter geni mogu da budu oivičeni pogodnim regulatornim sekvencama da bi se omogućila njihova ekspresija u ćelijama-domaćinima. Korisni selektabilni markeri uključuju, na primer, gene za otpornost na antibiotike, kao što je neo i slično.

[0154] Reporter geni se koriste za identifikaciju potencijalno transfekovanih ćelija i za procenu funkcionalnosti regulatornih sekvenci. Uopšteno, reporter gen je gen koji nije prisutan ili eksprimiran u recipijentnom organizmu ili tkivu, i koji kodira polipeptid čija ekspresija se iskazuje nekim lako detektabilnim svojstvom, npr., enzimskom aktivnošću. Ekspresija reporter gena se ispituje u pogodnom trenutku nakon uvođenja DNK u recipijentne ćelije. Pogodni reporter geni mogu da uključuju gene koji kodiraju luciferazu, betagalaktozidazu, hloramfenikol acetil transferazu, sekretovanu alkalnu fosfatazu, ili gen za zeleni fluorescentni protein (npr., Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Pogodni ekspresioni sistemi su dobro poznati i mogu da se pripreme upotrebom poznatih tehnika ili nabave iz komercijalnih izvora. Uopšteno, konstrukt sa minimalnim 5’ uokvirujućim regionom koji pokazuje najviši nivo ekspresije reporter gena se identifikuje kao promotor. Takvi promotorski regioni mogu da budu vezani za reporter gen i korišćeni za procenu sposobnosti sredstava da moduliraju transkripciju pokrenutu promotorom.

[0155] Postupci za uvođenje i eksprimiranje gena u ćeliji su poznati u stanju tehnike. U kontekstu ekspresionog vektora, vektor može lako da se uvede u ćeliju-domaćina, npr., sisarsku, bakterijsku, ćeliju kvasca, ili insekatsku ćeliju bilo kojim postupkom u stanju tehnike. Na primer, ekspresioni vektor može da se prebaci u ćeliju-domaćina fizičkim, hemijskim, ili biološkim sredstvima.

[0156] Fizički postupci za uvođenje polinukleotida u ćeliju-domaćina uključuju kalcijum fosfatnu precipitaciju, lipofekciju, bombardovanje česticama, mikroinjekciju, elektroporaciju, i slično. Postupci za proizvodnju ćelija koje sadrže vektore i/ili egzogene nukleinske kiseline su dobro poznati u stanju tehnike. Videti, na primer, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Poželjni postupak za uvođenje polinukleotida u ćeliju-domaćina je transfekcija kalcijum fosfatom.

[0157] Biološki postupci za uvođenje polinukleotida od interesa u ćeliju-domaćina uključuju upotrebu DNK i RNK vektora. Viralni vektori, i posebno retroviralni vektori, postali su najšire korišćen postupak za umetanje gena u sisarske, npr., humane ćelije. Drugi virusni vektori mogu da budu izvedeni iz lentivirusa, poksvirusa, herpes simpleks virusa I, adenovirusa i virusa povezanih sa adenovirusima, i slično. Videti, na primer, SAD pat. br.

5,350,674 i 5,585,362.

[0158] Hemijski načini za uvođenje polinukleotida u ćeliju-domaćina uključuju koloidne disperzione sisteme, kao što su makromolekulski kompleksi, nanokapsule, mikrosfere, perle, i sisteme na bazi lipida uključujući emulzije ulje-u-vodi, micele, mešane micele, i lipozome. Primer koloidnih sistema za upotrebu kao vehikuluma za dostavu in vitro i in vivo je lipozom (npr., veštačka membranska vezikula).

[0159] U slučaju kada se koristi sistem za dostavu koji ne potiče od virusa, primer vehikuluma za dostavu je lipozom. Upotreba lipidnih formulacija se razmatra za uvođenje nukleinske kiseline u ćeliju-domaćina (in vitro, ex vivo ili in vivo). U drugom aspektu, nukleinska kiselina može da bude povezana sa lipidom. Nukleinska kiselina povezana sa lipidom može da bude inkapsulirana u vodenoj unutrašnjosti lipozoma, razasuta u lipidnom dvosloju lipozoma, vezana za lipozom preko povezujućeg molekula koji je povezan sa lipozomom i oligonukleotidom, obuhvaćena lipozomom, u kompleksu sa lipozomom, raspršena u rastvoru koji sadrži lipid, pomešana sa lipidom, kombinovana sa lipidom, sadržana kao suspenzija u lipidu, sadržana u ili obrazuje kompleks sa micelom, ili drugačije povezana sa lipidom. Kompozicije udružene sa lipidom, lipidom/DNK ili lipid/ekspresionim vektorom nisu ograničene na bilo koju određenu strukturu u rastvoru. Na primer, mogu da budu prisutne u dvoslojnoj strukturi, kao micele, ili sa "spljoštenom" strukturom. Takođe mogu da budu jednostavno razasute u rastvoru, po mogućstvu obrazujući agregate koji nisu ujednačene veličine ili oblika. Lipidi su masne supstance koje mogu da budu prirodni ili sintetski lipidi. Na primer, lipidi uključuju masne kapljice koje se prirodno javljaju u citoplazmi, kao i klasu jedinjenja koja sadrže alifatične ugljovodonike dugog-lanca i njihove derivate, kao što su masne kiseline, alkoholi, amini, amino alkoholi, i aldehidi.

[0160] Lipidi pogodni za upotrebu mogu da se nabave iz komercijalnih izvora. Na primer, dimiristil fosfatidilholin ("DMPC") može da se nabavi kod Sigma, St. Louis, MO; dicetil fosfat ("DCP") može da se nabavi kod K & K Laboratories (Plainview, NY); holesterol ("Choi") može da se nabavi kod Calbiochem-Behring; dimiristil fosfatidilglicerol ("DMPG") i drugi lipidi mogu da se nabave kod Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL). Stok rastvri lipida u hloroformu ili smeši hloroform/metanol mogu da se skladište na oko -20°C. Hloroform se koristi kao jedini rastvarač budući da lakše isparava nego metanol. "Lipozom" je generički termin koji obuhvata različite jednostruke i multilamelarne lipidne vehikulume obrazovane stvaranjem zatvorenih lipidnih dvosloja ili agregata. Lipozomi mogu da se karakterišu time što imaju vezikularne strukture sa fosfolipidnom dvoslojnom membranom i unutrašnji vodeni medijum. Multilamelarni lipozomi imaju više lipidnih slojeva odvojenih vodenim medijumom. Oni se obrazuju spontano kada se fosfolipidi suspenduju u višku vodenog rastvora. Lipidne komponente podležu samo-rearanžmanu pre obrazovanja zatvorenih struktura i zarobljavanja vode i rastvorenih supstanci između lipidnih dvosloja (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). Međutim, kompozicije koje imaju drugačije strukture u rastvoru nego što je normalna vezikularna struktura su takođe obuhvaćene. Na primer, lipidi mogu da zadobiju micelarnu strukturu, ili samo da postoje kao neujednačeni agregati lipidnih molekula. Takođe su obuhvaćeni kompleksi lipofektamin-nukleinska kiselina.

[0161] Bez obzira na postupak koji se koristi za uvođenje egzogene nukleinske kiseline u ćeliju-domaćina, ili za drugačije izlaganje ćelije inhibitoru predmetnog pronalaska, u cilju potvrđivanja prisustva rekombinantne DNK sekvence u ćeliji-domaćinu, različita ispitivanja mogu da se sprovedu. Takva ispitivanja uključuju, na primer, "molekularno-biološke" testove dobro poznate stručnjacima u oblasti, kao što su Southern i Northern blotting, RT-PCR i PCR; "biohemijske" testove, kao što je detekcija prisustva ili odsustva određenog peptida, npr., imunološkim sredstvima (ELISAs i Western blots) ili testovima koji su ovde opisani za identifikovanje sredstava koja pripadaju oblasti pronalaska.

Izvori T ćelija

[0162] Pre ekspanzije i genetske modifikacije T ćelija kao što je ovde opisano, izvor T ćelija se dobija iz subjekta. T ćelije mogu da se dobiju iz brojnih izvora, uključujući mononuklearne ćelije periferne krvi, kosnu srž, tkivo limfnog čvora, krv iz pupčane vrpce, tkivo timusa, tkivo sa mesta infekcije, ascite, pleuralni izliv, tkivo slezine, i tumore. Kao što je ovde opisano, bilo koji broj T-ćelijskih linija dostupnih u stanju tehnike, može da se koristi. T ćelije mogu da se dobiju iz jedinice krvi sakupljene od subjekta upotrebom bilo kog broja tehnika poznatih stručnjaku u oblasti, kao što je razdvajane pomoću Ficoll™. Ćelije iz cirkulišuće krvi pojedinca se dobijaju aferezom. Proizvod afereze tipično sadrži limfocite, uključujući T ćelije, monocite, granulocite, B ćelije, druge bele krvne ćelije sa jedrom, crvene krvne ćelije, i trombocite. Ćelije sakupljene aferezom mogu da se operu da bi se uklonila frakcija plazme i ćelije smeste u pogodan pufer ili medijum za korake obrade koji slede. Ćelije se peru fosfatno puferisanim fiziološkim rastvorom (PBS). Alternativno, rastvor za pranje je bez kalcijuma i može da bude bez magnezijuma ili može da bude bez mnogih, ako ne svih divalentnih katjona. Ponovo, iznenađujuće, početni koraci aktivacije u odsustvu kalcijuma vode pojačanoj aktivaciji. Kao što će oni sa uobičajenim znanjem u oblasti lako zaključiti, korak pranja može da se postigne postupcima poznatim stručnjacima u oblasti, kao što je upotrebom poluautomatske "protočne" centrifuge (na primer, Cobe 2991 cell processor, Baxter CytoMate, ili Haemonetics Cell Saver 5) prema uputstvima proizvođača. Nakon pranja, ćelije mogu da se resuspenduju u različitim biokompatibilnim puferima, kao što je, na primer, PBS bez Ca<2+>, PBS bez Mg<2+>, PlasmaLyte A, ili drugi rastvori soli sa ili bez pufera. Alternativno, nepoželjne komponente uzorka afereze mogu da se uklone i ćelije direktno resuspenduju u medijumu za kulturu.

[0163] Kao što je ovde opisano, T ćelije se izoluju iz limfocita periferne krvi liziranjem crvenih krvnih ćelija i smanjenjem broja monocita, na primer, centrifugiranjem kroz gradijent PERCOLL™ ili elutrijacijom centrifugiranjem sa suprotnim protokom. Specifična subpopulacija T ćelija, kao što je CD3<+>, CD28<+>, CD4<+>, CD8<+>, CD45RA<+>, i CD45RO<+>T ćelija, može dalje da se izoluje tehnikama pozitivne ili negativne selekcije. Na primer, T ćelije se izoluju inkubacijom sa anti-CD3/anti-CD28 (tj., 3x28)-konjugovanim perlama, kao što je DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, tokom vremena dovoljnog za pozitivnu selekciju željenih T ćelija, npr. vremenski period je oko 30 minuta, vremenski period je u opsegu od 30 minuta do 36 sati ili duži uključujući sve vrednosti celih brojeva između, vremenski period je najmanje 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 časova, vremenski period je 10 do 24 časova, ili je vremenski period inkubacije 24 časa. Kod izolacije T ćelija pacijenata sa leukemijom, upotreba dužih vremena inkubacije, kao što je 24 časa, može da poveća ćelijski prinos. Duža vremena inkubacije mogu da se koriste za izolovanje T ćelija u bilo kojoj situaciji kada ima malo T ćelija u odnosu na druge vrste ćelija, kao kod izolovanja tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) iz tumorskog tkiva, ili kod imuno-kompromitovanih pojedinaca. Dalje, upotreba dužih vremena incubacije može da poveća efikasnost izdvajanja CD8+ T ćelija. Tako, jednostavnim skraćivanjem ili produžavanjem vremena tokom koga su T ćelije ostavljene da se vežu za CD3/CD28 perle i/ili povećanjm ili smanjenjem odnosa perli prema T ćelijama (kao što je ovde kasnije opisano), subpopulacije T ćelija mogu da se selektuju u pozitivnom ili negativnom smeru na početku gajenja, ili u drugim vremenskim tačkama tokom postupka. Dodatno, povećanjem ili smanjenjem odnosa anti-CD3 i/ili anti-CD28 antitela na perlama ili drugoj površini, subpopulacije T ćelija mogu da se selektuju u pozitivnom ili negativnom smeru na početku gajenja, ili u drugim vremenskim tačkama tokom postupka. Stručnjak u oblasti će prepoznati da mogu da se koriste i ponovljeni ciklusi selekcije. Može da bude poželjno izvođenje postupka selekcije i upotreba "neselektovanih" ćelija u postupku aktivacije i ekspanzije. "Neselektovane" ćelije mogu takođe da se podvrgnu dodatnim ciklusima selekcije.

[0164] Obogaćivanje T-ćelijske populacije negativnom selekcijom može da se postigne kombinacijom antitela usmerenih na površinske markere jedinstvene za negativno odabrane ćelije. Jedan postupak je ćelijsko sortiranje i/ili selekcija putem negativne magnetne imunoadherencije ili protočne citometrije koja koristi koktel monoklonskih antitela usmerenih na markere ćelijske površine prisutne na negativno selektovanim ćelijama. Na primer, za obogaćivanje CD4<+>ćelija negativnom selekcijom, koktel monoklonskih antitela tipično uključuje antitela na CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, i CD8. Može da bude poželjno obogaćivanje ili pozitivna selekcija regulatornih T ćelija koje tipično eksprimiraju CD4<+>, CD25+ , CD62Lhi , GITR+ , i FoxP3+ . Alternativno, zastupljenost T regulatornih ćelija se smanjuje perlama konjugovanim sa anti-C25 ili drugim sličnim postupkom za selekciju.

[0165] Za izdvajanje željene populacije ćelija pozitivnom ili negativnom selekcijom, koncentracija ćelija i veličina površine (npr., čestica kao što su perle) može da se varira. Može da bude poželjno da se značajno smanji zapremina u kojoj se perle i ćelije mešaju (tj., da se poveća koncentracija ćelija), da bi se osigurao maksimalni kontakt ćelija i perli. Na primer, koristi se koncentracija od 2 milijarde ćelija/ml, koristi se koncentracija od 1 milijardu ćelija /ml, koristi se više od 100 miliona ćelija /ml, koristi se koncentracija ćelija od 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ili 50 miliona ćelija /ml, koristi se koncentracija ćelija od 75, 80, 85, 90, 95, ili 100 miliona ćelija /ml, ili mogu da se koriste koncentracije od 125 ili 150 miliona ćelija /ml. Upotreba visokih koncentracija može da rezultuje u povećanom ćelijskom prinosu, ćelijskoj aktivaciji, i ćelijskoj ekspanziji. Dalje, upotreba visokih koncentracija ćelija omogućava efikasnije izdvajanje ćelija koje mogu slabo da eksprimiraju ciljne antigene od interesa, kao što su CD28-negativne T ćelije, ili iz uzoraka u kojima je prisutno mnogo tumorskih ćelija (tj., leukemična krv, tumorsko tkivo, itd.). Takve populacije ćelija mogu da imaju terapeutsku vrednost i bilo bi ih poželjno dobiti. Na primer, upotreba visoke koncentracije ćelija omogućava efikasniju selekciju CD8<+>T ćelija koje normalno imaju slabiju ekspresiju CD28.

[0166] Može da bude poželjno korišćenje nižih koncentracija ćelija. Značajnim razblaživanjem smeše T ćelija i veličine površina (npr., čestica kao što su perle), interakcije između čestica i ćelija se umanjuju. Ovo selektuje ćelije koje eksprimiraju velike količine željenih antigena za vezivanje za čestice. Na primer, CD4<+>T ćelije ispoljavaju više nivoe CD28 i i efikasnije se izdvajaju nego CD8+ T ćelije u razblaženim koncentracijama, npr. korišćena koncentracija ćelija je 5 X 10<6>/ml, ili korišćena koncentracija ćelija može da bude od oko 1 X 105/ml do 1 X 10<6>/ml, i bilo koji ceo broj između.

[0167] U drugim primerima izvođenja, ćelije mogu da se inkubiraju na rotatoru tokom različitih vremenskih perioda, na različitim brzinama, na 2-10°C ili na sobnoj temperaturi.

[0168] T ćelije za stimulaciju mogu i da se zamrznu posle koraka pranja. Bez pozivanja na teoriju, korak zamrzavanja i odmrzavanja nakon toga obezbeđuje ujednačeniji proizvod uklanjanjem granulocita i u izvesnom stepenu monocita u ćelijskoj populaciji. Nakon koraka pranja koji uklanja plazmu i trombocite, ćelije mogu da se suspenduju u rastvoru za zamrzavanje. Dok su mnogi rastvori za zamrzavanje i parametri poznati u stanju tehnike i biće korisni u ovom kontekstu, jedan postupak uključuje upotrebu PBS koji sadrži 20% DMSO i 8% humanog serum albumina, ili medijuma za kulturu koji sadrži 10% dekstrana 40 i 5% dekstroze, 20% humanog serum albumina i 7.5% DMSO, ili 31.25% PlasmaLyte-A, 31.25% dekstroze 5%, 0.45% NaCl, 10% dekstrana 40 i 5% dekstroze, 20% humanog serum albumina, i 7.5% DMSO ili drugog pogodnog medijuma za zamrzavanje ćelija koji sadrži na

4

primer, Hespan i PlasmaLyte A, ćelije se zatim zamrzavaju do -80°C brzinom od 1° po minutu i skladište u fazi pare tanka za skladištenje sa tečnim azotom. Drugi postupci kontrolisanog zamrzavanja mogu da se koriste kao i nekontrolisano zamrzavanje odmah na -20°C ili u tečnom azotu.

[0169] Kriokonzervisane ćelije se odmrzavaju i peru kao što je ovde opisano i ostavljaju da odstoje na sobnoj temperaturi pre aktivacije upotrebom postupaka predmetnog pronalaska. Kao što je ovde opisano, T ćelije mogu da budu umnožene, zamrznute, i kasnije korišćene. Kao što je ovde opisano, uzorci se sakupljaju od pacijenta kratko nakon dijagnoze određene bolesti kao što je ovde opisano, ali pre bilo kakvih lečenja. Ćelije se izoluju iz uzorka krvi ili afereze subjekta pre bilo kakvih relevantnih modaliteta lečenja, uključujući, ali bez ograničenja, lečenje sredstvima kao što je natalizumab, efalizumab, antivirusna sredstva, hemoterapija, zračenje, imunosupresivna sredstva, kao što je ciklosporin, azatioprin, metotreksat, mikofenolat, i FK506, antitela, ili druga imunoablativna sredstva kao što je CAMPATH, anti-CD3 antitela, citoksan, fludarabin, ciklosporin, FK506, rapamicin, mikofenolna kiselina, steroidi, FR901228, i zračenje. Ovi lekovi inhibiraju ili fosfatazu kalcineurin zavisnu od kalcijuma (ciklosporin i FK506) ili inhibiraju p70S6 kinazu koja je značajna za signalizaciju indukovanu faktorom rasta (rapamicin) (Liu et al., Ćelija 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun.

5:763-773, 1993). Ćelije se izoluju iz pacijenta i zamrzavaju za kasniju upotrebu zajedno sa (npr., pre, istovremeno ili nakon) transplantacijom kosne srži ili stem ćelija, ablativnom terapijom T ćelija upotrebom hemoterapijskih sredstava kao što je fludarabin, radijacione terapije spoljnim zrakom (XRT), ciklofosfamida, ili antitela kao što je OKT3 ili CAMPATH. Kao što je ovde opisano, ćelije se izoluju pre, i mogu da se zamrznu za kasniju upotrebu za lečenje nakon ablativne terapije B-ćelija kao što terapija sredstvima koja reaguju sa CD20, npr., Rituxan.

[0170] Kao što je takođe ovde opisano, T ćelije se dobijaju od pacijenta odmah nakon lečenja. U tom pogledu, primećeno je da nakon određenih lečenja kancera, posebno lečenja lekovima koji oštećuju imunski sistem, kratko nakon lečenja tokom perioda kada bi se pacijenti normalno oporavljali od lečenja, kvalitet dobijenih T ćelija može da bude optimalan ili poboljšan u smislu njihove sposobnosti da se umnožavaju ex vivo. Slično, nakon ex vivo manipulacije upotrebom postupaka koji su ovde opisani, ove ćelije mogu da budu u poželjnom stanju za pojačano usađivanje i in vivo ekspanziju. Tako, u kontekstu predmetnog pronalaska je razmatrano sakupljanje ćelija krvi, uključujući T ćelije, dendritske ćelije, ili druge ćelije hematopoezne linije, tokom faze oporavka. Dalje, mobilizacija (na primer, mobilizacija sa GM-CSF) i kondicioni režimi mogu da se koriste da bi se stvorilo stanje subjekta u kome je repopulacija, recirkulacija, regeneracija, i/ili ekspanzija određenih ćelijskih vrsta favorizovana, posebno tokom definisanog perioda vremena nakon terapije. Ilustrativne ćelijske vrste uključuju T ćelije, B ćelije, dendritske ćelije, i druge ćelije imunskog sistema.

Aktivacija i ekspanzija T ćelija

[0171] Pre ili nakon što se T ćelije genetski modifikuju tako da eksprimiraju željeni CAR, T ćelije mogu da se aktiviraju i umnože uopšteno upotrebom postupaka opisanih, na primer, u SAD patentima 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; i objavi SAD patentne prijave br..20060121005.

[0172] Uopšteno, ovde opisane T ćelije se umnožavaju dovođenjem u kontakt sa površinom za koju je vezano sredstvo koje stimuliše signal povezan sa kompleksom CD3/TCR i ligand koji stimuliše kostimulatorni molekul na površini T ćelija. Naročito, populacije T ćelija mogu da budu stimulisane kao što je ovde opisano, kao što je dovođenjem u kontakt sa anti-CD3 antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, anti-CD2 antitelom imobilisanim na površini, ili dovođenjem u kontakt sa aktivatorom protein kinaze C (npr., briostatinom) zajedno sa kalcijumskim jonoforom. Za kostimulaciju dodatnog molekula na površini T ćelija, koristi se ligand koji se vezuje za dodatni molekul. Na primer, populacija T ćelija može da se dovede u kontakt sa anti-CD3 antitelom i anti-CD28 antitelom, pod odgovarajućim uslovima za stimulaciju proliferacije T ćelija. Da bi se stimulisala proliferacija CD4<+>T ćelija ili CD8+ T ćelija, može da se upotrebi anti- CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo. Primeri anti-CD28 antitela koja mogu da se koriste uključuju 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besançon, France), kao što mogu da se koriste i drugi postupci uobičajeno poznati u stanju tehnike (Berg et al., Transplant Proc.30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med.190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth.227(1-2):53-63, 1999).

[0173] Primarni stimulatorni signal i kostimulatorni signal za T ćeliju može da se obezbedi različitim postupcima. Na primer, sredstvo koje obezbeđuje svaki signal može da bude u rastvoru ili kuplovano sa površinom. Kada su kuplovana sa površinom, sredstva mogu da budu kuplovana sa istom površinom (tj., u "cis" formaciji) ili sa različitim površinama (tj., u "trans" formaciji). Alternativno, jedno sredstvo može da bude kuplovano sa površinom, a drugo sredstvo može da bude u rastvoru. Na primer, sredstvo koje obezbeđuje kostimulatorni signal je vezano za ćelijsku površinu, a sredstvo koje obezbeđuje primarni aktivacioni signal je u rastvoru, ili kuplovano sa površinom, ili oba sredstva mogu da budu u rastvoru. Alternativno, sredstva mogu da budu u rastvornom obliku, i zatim unakrsno vezana za površinu, kao što je ćelija koja eksprimira Fc receptore, ili antitelo, ili drugo vezujuće sredstvo koje će vezati ta sredstva. U tom smislu, videti na primer, objavu SAD patentne prijave br.20040101519 i 20060034810 za veštačke antigen prezentujuće ćelije (aAPCs) koje se razmatraju za upotrebu u aktivaciji i umnožavanju T ćelija.

[0174] Kao što je ovde opisano, dva sredstva se imobilišu na perlama, ili na istim perlama, tj., "cis," ili na odvojenim perlama, tj., "trans." Na primer, sredstvo koje obezbeđuje primarni aktivacioni signal je anti-CD3 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, a sredstvo koje obezbeđuje kostimulatorni signal je anti-CD28 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment; i oba sredstva su ko-imobilisana na istim perlama u ekvivalentnim molekularnim količinama. Na primer, koristi se odnos od 1:1 svakog antitela vezanog za perle za umnožavanje CD4<+>T ćelija i rast T ćelija. U određenim slučajevima, koristi se odnos antitela CD3:CD28 vezanih za perle pri kome je primetno povećanje ekspanzije T ćelija u poređenju sa ekspanzijom primećenom pri upotrebi odnosa od 1:1. Primećuje se povećanje od oko 1 do oko 3 puta, u poređenju sa ekspanzijom primećenom pri upotrebi odnosa od 1:1. Odnos antitela CD3:CD28 vezanih za perle nalazi se u opsegu 100:1 do 1:100 i obuhvata sve cele brojeve između. U jednom slučaju, više anti-CD28 antitela je vezano za čestice nego anti-CD3 antitela, tj., odnos CD3:CD28 je manji od jedan. U određenim slučajevima, odnos CD28 antitela prema anti CD3 antitelu vezanom za perle je veći od 2:1. Na primer, koristi se odnos od 1:100 antitela CD3:CD28 vezanih za perle, koristi se odnos od 1:75 CD3:CD28 vezanih za perle, koristi se odnos od 1:50 CD3:CD28 vezanih za perle, koristi se odnos od 1:30 CD3:CD28 vezanih za perle, koristi se odnos od 1:10 CD3 :CD28 vezanih za perle, ili se koristi odnos od 1:3 CD3:CD28 vezanih za perle. Alternativno, koristi se odnos od 3:1 CD3:CD28 vezanih za perle.

[0175] Odnosi čestica prema ćelijama od 1:500 do 500:1, uključujući bilo koje cele brojeve između ovih vrednosti, mogu da se koriste za stimulaciju T ćelija ili drugih ciljnih ćelija. Kao što će stručnjaci sa uobičajenim znanjem u oblasti lako shvatiti, odnos čestica prema ćelijama može da zavisi od veličine čestice u odnosu na ciljnu ćeliju. Na primer, male perle moglu da vežu samo nekoliko ćelija, dok veće mogu da vežu mnogo njih. Odnos ćelija prema česticama se nalazi u opsegu 1:100 do 100:1, uključujući bilo koje cele brojeve između ovih vrednosti, i u dodatnim primerima izvođenja odnos koji obuhvata 1:9 do 9:1, uključujući bilo koje cele brojeve između ovih vrednosti, može takođe da se koristi za stimulaciju T ćelija. Odnos čestica kuplovanih sa anti-CD3 i anti-CD28 prema T ćelijama koji rezultuje u stimulaciji T

4

ćelija može da varira kao što je prethodno navedeno, međutim određene poželjne vrednosti uključuju 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, i 15:1, sa jednim poželjnim odnosom koji je najmanje 1:1 čestica po T ćeliji. Alternativno, koristi se odnos čestica prema ćelijama od 1:1 ili manje. Poželjni odnos čestica:ćelija je 1:5. Odnos čestica prema ćelijama može da se varira u zavisnosti od dana stimulacije. Na primer, odnos čestica prema ćelijama je od 1:1 do 10:1 prvog dana, i dodatne čestice se dodaju ćelijama svakog dana ili svakog drugog dana nakon toga, sve do 10 dana, i finalni odnosi iznose od 1:1 do 1:10 (na osnovu broja ćelija na dan dodavanja). Alternativno, odnos čestica prema ćelijama je 1:1 prvog dana stimulacije i podešava se na 1:5 trećeg i petog dana stimulacije. U drugom slučaju, čestice se dodaju na dnevnoj bazi ili svakog drugog dana do finalnog odnosa od 1:1 prvog dana, i 1:5 trećeg i petog dana stimulacije. U drugom slučaju, odnos čestica prema ćelijama je 2:1 prvog dana stimulacije i podešava se na 1:10 trećeg i petog dana stimulacije. U drugom slučaju, čestice se dodaju na dnevnoj bazi ili svakog drugog dana do finalnog odnosa od 1:1 prvog dana, i 1:10 trećeg i petog dana stimulacije. Stručnjak u stanju tehnike će shvatiti da različiti drugi odnosi mogu da budu pogodni za upotrebu u predmetnom pronalasku. Naročito, odnosi će varirati u zavisnosti od veličine čestice i veličine i vrste ćelije.

[0176] Kao što je ovde takođe opisano, ćelije, kao što su T ćelije, kombinuju se sa perlama obloženim sredstvom, perle i ćelije se zatim razdvajaju, i ćelije se zatim gaje. Druga mogućnost je da se perle obložene sredstvom i ćelije ne razdvoje pre kultivacije, već da se gaje zajedno. U sledećem slučaju, perle i ćelije se prvo koncentruju pod dejstvom sile, kao što je magnetna sila, što rezultuje u povećanom ligaciji markera ćelijske površine, čime se indukuje ćelijska stimulacija.

[0177] Na primer, proteini ćelijske površine mogu da se ligiraju omogućavajući paramagnetskim perlama za koje su vezana anti-CD3 i anti-CD28 antitela (3x28 perli) da dođu u kontakt sa T ćelijama. U jednom primeru izvođenja ćelije (na primer, 10<4>do 10<9>T ćelija) i perle (na primer, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T paramagnetske perle u odnosu 1:1) kombinuju se u puferu, poželjno PBS (bez dvovalentnih katjona kao što su kalcijum i magnezijum). Ponovo, oni sa uobičajenim znanjem u oblasti će lako zaključiti da bilo koja ćelijska koncentracija može da se koristi. Na primer, ciljna ćelija može da bude vrlo retka u uzorku i da sačinjava samo 0.01% uzorka ili ceo uzorak (tj., 100%) može da sadrži ciljnu ćeliju od interesa. Prema tome, bilo koji broj ćelija je obuhvaćen kontekstom predmetnog pronalaska. Može da bude poželjno da se značajno smanji zapremina u kojoj su čestice i ćelije pomešane (tj., da se poveća koncentracija ćelija), da bi se osigurao najveći kontakt između ćelija i čestica. Na primer, koristi se koncentracija od oko 2 milijarde ćelija/ml. U drugom slučaju, koristi se više od 100 miliona ćelija/ml. U sledećem slučaju, koristi se koncentracija ćelija od 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ili 50 miliona ćelija/ml. U još jednom slučaju, koristi se koncentracija ćelija od 75, 80, 85, 90, 95, ili 100 miliona ćelija/ml. U sledećim slučajevima, mogu da se koriste koncentracije od 125 ili 150 miliona ćelija/ml. Upotreba visokih koncentracija može da rezultuje u povećanim ćelijskom prinosu, ćelijskoj aktivaciji, i ćelijskoj ekspanziji. Dalje, upotreba visokih koncentracija omogućava efikasnije izdvajanje ćelija koje mogu slabo da ispoljavaju antigene od interesa, kao što su CD28-negativne T ćelije. Takve populacije ćelija mogu da imaju terapeutsku vrednost i bilo bi ih poželjno dobiti. Na primer, upotreba visoke koncentracije ćelija omogućava efikasniju selekciju CD8+ T ćelija koje normalno imaju slabiju ekspresiju CD28.

[0178] Smeša može da se gaji nekoliko časova (oko 3 časa) do oko 14 dana ili tokom svake cele vrednosti sata između ovih vrednosti. Smeša može da se gaji 21 dan. U jednom slučaju perle i T ćelije se gaje zajedno oko osam dana. U drugom slučaju, perle i T ćelije se gaje zajedno 2-3 dana. Može takođe da bude poželjno izvođenje nekoliko ciklusa stimulacije tako da vreme gajenja T ćelija može da bude 60 dana ili više. Uslovi pogodni za T-ćelijsku kulturu uključuju pogodan medijum (npr., minimalni esencijalni medijum ili RPMI medijum 1640 ili, X-vivo 15, (Lonza)) koji može da sadrži neophodne faktore za proliferaciju i vijabilnost, uključujući serum (npr., fetalni goveđi ili humani serum), interleukin-2 (IL-2), insulin, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ, i TNF-α ili bilo koje druge dodatke za rast ćelija poznate stručnjaku. Drugi dodaci za rast ćelija uključuju, ali nisu ograničeni na surfaktant, plazmanat i redukujuća sredstva kao što su N-acetil-cistein i 2-merkaptoetanol. Medijum može da uključuje RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, i X-Vivo 20, Optimizer, sa dodatim aminokiselinama, natrijum piruvatom i vitaminima, ili bez seruma ili obogaćen odgovarajućom količinom seruma (ili plazme) ili definisanim setom hormona, i/ili količinom citokina dovoljnom za rast i umnožavanje T ćelija. Antibiotici, npr., penicilin i streptomicin, su uključeni samo u eksperimentalne kulture, ne i u kulture ćelija koje treba da budu primenjene infuzijom kod subjekta. Ciljne ćelije se održavaju pod uslovima neophodnim da podrže rast, na primer, na odgovarajućoj temperaturi (npr., 37°C) i atmosferi (npr., vazduh sa 5% CO2).

[0179] T ćelije koje su bile izložene različitim vremenima stimulacije ispoljavaju različita svojstva. Na primer, proizvodi tipične mononuklearne ćelije periferne krvi dobijene iz krvi ili aferezom, imaju populaciju helper T ćelija (TH, CD4<+>) koja je veća od populacije citotoksičnih ili supresorskih T ćelija (TC, CD8+). Ex vivo ekspanzija T ćelija stimulacijom

4

CD3 i CD28 receptora proizvodi populaciju T ćelija koja se pre oko 8-9. dana sastoji pretežno od THćelija, dok posle 8-9. dana, populacija T ćelija sadrži sve veću populaciju TC ćelija. Prema tome, u zavisnosti od svrhe lečenja, davanje infuzije populacije T ćelija koja sadrži pretežno THćelije subjektu može da bude pogodno. Slično, ako je antigen-specifični podset TCćelija bio izolovan može da bude korisno da se taj podset umnoži u većem stepenu.

[0180] Dalje, pored CD4 i CD8 markera, drugi fenotipski markeri značajno variraju, ali velikim delom ponovljivo, tokom procesa ćelijske ekspanzije. Prema tome, takva ponovljivost omogućava da se proizvod koji predstavljaju aktivirane T ćelije prilagodi specifičnim namenama.

Terapeutska primena

[0181] Ovde je opisana ćelija (npr., T ćelija) transdukovana lentiviralnim vektorom (LV). Na primer, LV kodira CAR koji kombinuje domen za prepoznavanje antigena specifičnog antitela sa unutarćelijskim domenom CD3-zeta i 4-1BB. Zbog toga, u nekim slučajevima, transdukovana T ćelija može da izazove T-ćelijski odgovor posredovan sa CAR.

[0182] Pronalazak obezbeđuje upotrebu CAR, kao što je definisano u patentnim zahtevima, u preusmeravanju specifičnosti primarne T ćelije na tumorski antigen. Tako, ovde je takođe opisan postupak za stimulaciju imunskog odgovora posredovanog T ćelijom na ciljnu populaciju ćelija ili tkivo kod sisara koji obuhvata korak primene kod sisara T ćelije koja eksprimira CAR, gde CAR sadrži vezujući fragment koji specifično interaguje sa unapred određenim ciljem, deo zeta lanca koji sadrži na primer unutarćelijski domen humanog CD3zeta, i kostimulatorni signalni region.

[0183] Ovde je opisana vrsta ćelijske terapije u kojoj su T ćelije genetski modifikovane tako da eksprimiraju CAR i CAR T ćelija se primenjuje infuzijom kod primaoca kome je to potrebno. Ćelija data infuzijom je sposobna da ubije tumorske ćelije kod primaoca. Za razliku od terapija antitelom, ćelije CAR T su sposobne da se umnožavaju in vivo što rezultuje u njihovom dugotrajnom opstanku koje može da vodi neprekidnoj kontroli tumora.

[0184] Ćelije CAR T koje su ovde opisane, mogu da podlegnu snažnoj T ćelijskoj ekspanziji in vivo i mogu da opstanu tokom produženog perioda vremena. U drugom primeru izvođenja, ćelije CAR T koje su ovde opisane, evoluiraju u specifične memorijske T ćelije koje mogu ponovo da se aktiviraju u smislu inhibicije bilo kakvog dodatnog obrazovanja ili rasta tumora. Na primer, bilo je neočekivano da ćelije CAR T koje su ovde opisane mogu da podlegnu snažnoj T ćelijskoj ekspanziji in vivo i mogu da opstanu na visokim nivoima tokom produženog perioda vremena u krvi i kosnoj srži i obrazuju specifične memorijske T ćelije.

4

Bez želje da se vezuje za neku posebnu teoriju, CAR T ćelije mogu da diferenciraju in vivo u stanje slično centralnoj memoriji nakon susreta sa ciljnim ćelijama koje eksprimiraju zamenski antigen i njihove naknadne eliminacije.

[0185] Bez želje da se vezuje za neku posebnu teoriju, anti-tumorski imuni odgovor izazvan T ćelijama koje su modifikovane pomoću CAR može da bude aktivan ili pasivan imunski odgovor. Pored toga, imunski odgovor modifikovan pomoću CAR može da bude deo pristupa adoptivne imunoterapije u kojoj T ćelije modifikovane pomoću CAR indukuju imunski odgovor specifičan za antigen-vezujući fragment u CAR. Na primer, CART19 ćelije pokreću imunski odgovor specifičan za ćelije koje eksprimiraju CD19.

[0186] Dok ovde opisani podaci specifično opisuju lentiviralni vektor koji sadrži anti-CD19 scFv izveden iz mišjeg monoklonalnog antitela FMC63, domen zgloba i transmembranski domen humanog CD8α, i humane signalne domene4-1BB i CD3zeta, pronalazak treba interpretirati tako da uključuje bilo koji broj varijacija za svaku od komponenti konstrukta kako je ovde opisano na drugim mestima.

[0187] Kanceri koji mogu da se leče uključuju tumore koji nisu vaskularizovani, ili još nisu suštinski vaskularizovani, kao i vaskularizovane tumore. Kanceri mogu da sadrže nesolidne tumore (kao što su hematološki tumori, na primer, leukemije i limfomi) ili mogu da sadrže solidne tumore. Vrste kancera koji treba da se leče receptorima CAR prema pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na karcinom, blastom i sarkom, i određene leukemje ili limfoidne malignitete, benigne i maligne tumore, i malignanitete npr., sarkom, karcinom i melanom. Tumori/kanceri odraslih, i pedijatrijski tumori/kanceri su takođe uključeni.

[0188] Hematološki kanceri su kanceri krvi ili kosne srži. Primeri hematoloških (ili hematogenih) kancera uključuju leukemije, uključujući akutne leukemije (kao što je akutna limfocitna leukemija, akutna mijelocitna leukemija, akutna mijelogena leukemija i mijeloblastna, promijelocitna, mijelomonocitna, monocitna i eritroleukemija), hronične leukemije (kao što je hronična mijelocitna (granulocitna) leukemija, hronična mijelogena leukemija i hronična limfocitna leukemija), policitemija vera, limfom, Hodgkinovu bolest, ne-Hodgkinov limfom (indolentni i oblici visokog stepena), multipli mijelom, Waldenstrom-ovu makroglobulinemiju, bolest teškog lanca, mijelodisplastični sindrom, leukemiju vlasastih ćelija i mijelodisplaziju.

[0189] Solidni tumori su abnormalne mase tkiva koje obično ne sadrže ciste ili oblasti sa tečnošću. Solidni tumori mogu da budu benigni ili maligni. Različiti tipovi solidnih tumora se imenuji prema tipu ćelija koje ih obrazuju (kao što su sarkomi, karcinomi i limfomi). Primeri solidnih tumora, kao što su sarkomi i karcinomi, uključuju fibrosarkom, miksosarkom,

4

liposarkom, hondrosarkom, osteosarkom, i druge sarkome, sinoviom, mezoteliom, Ewing-ov tumor, leiomiosarkom, rabdomiosarkom, karcinom debelog creva, limfoidni malignitet, kancer pankreasa, kancer dojke, kancere pluća, kancer jajnika, kancer prostate, hepatocelularni karcinom, karcinom skvamoznih ćelija, karcinom bazalnih ćelija, adenokarcinom, karcinom znojne žlezde, medularni tiroidni karcinom, papilarni tiroidni karcinom, feohromocitom karcinom lojne žlezde, papilarni karcinom, papilarne adenokarcinome, medularni karcinom, bronhogeni karcinom, karcinom renalnih ćelija, hepatom, karcinom žučnog kanala, horiokarcinom, Wilms-ov tumor, kancer grlića materice, tumor testisa, seminom, karcinom mokraćne bešike, melanom, i tumore CNS-a (kao što je gliom (kao što je gliom moždanog stabla i mešoviti gliomi), glioblastom (takođe poznat kao multiformni glioblastom) astrocitom, limfom CNS-a, germinom, meduloblastom, Švanom kraniofaringiom, ependimom, pinealom, hemangioblastom, akustični neurom, oligodendrogliom, menangiom, neuroblastom, retinoblastom i metastaze mozga).

[0190] CAR koji je dizajniran da ciljno deluje na CD 19 može da se koristi za lečenje kancera i poremećaja uključujući, ali bez ograničenja pre-B ALL (pedijatrijska indikacija), adultnu ALL, limfom mantle ćelija, difuzni limfom krupnih B-ćelija, poboljšano preživljavanje nakon alogene transplantacije kosne srži, i slično.

[0191] T ćelije modifikovane pomoću CAR koje su ovde opisane mogu takođe da služe kao vrsta vakcine za ex vivo imunizaciju i/ili in vivo terapiju kod sisara. Poželjno, sisar je čovek.

[0192] Kada je u pitanju ex vivo imunizacija, najmanje jedno od sledećeg se događa in vitro pre primene ćelije kod sisara: i) ekspanzija ćelija, ii) uvođenje nukleinske kiseline koja kodira CAR u ćelije, i/ili iii) kriokonzervacija ćelija.

[0193] Ex vivo postupci su dobro poznati u stanju tehnike i potpunije razmatrani u nastavku teksta. Ukratko, ćelije se izoluju iz sisara (poželjno čoveka) i genetski modifikuju (tj., transdukuju ili transfekuju in vitro) vektorom koje eksprimira ovde opisani CAR. Ćelija modifikovana pomoću CAR može da se primeni kod primaoca koji je sisar da bi obezbedila terapeutski efekat. Primalac koji je sisar može da bude čovek i ćelija modifikovana pomoću CAR može da bude autologna u odnosu na primaoca. Alternativno, ćelije mogu da budu alogene, singene ili ksenogene u odnosu na primaoca.

[0194] Postupak za ex vivo ekspanziju hematopoeznih stem i progenitorskih ćelija opisan u SAD pat. br.5,199,942, može da se primeni na ćelije predmetnog pronalaska. Drugi pogodni postupci su poznati u stanju tehnike, prema tome predmetni pronalazak nije ograničen ni na jedan određeni postupak za ex vivo ekspanziju ćelija. Ukratko, ex vivo gajenje i ekspanzija T ćelija obuhvata: (1) sakupljanje CD34+ hematopoeznih stem i progenitorskih ćelija sisara iz

4

sakupljene periferne krvi ili eksplanata kosne srži; i (2) umnožavanje takvih ćelija ex vivo. Pored faktora rasta ćelija opisanih u SAD pat. br. 5,199,942, drugi faktori kao što su flt3-L, IL-1, IL-3 i c-kit ligand, mogu da se koriste za gajenje i umnožavanje ćelija.

[0195] Pored upotrebe vakcine na bazi ćelija u smislu ex vivo imunizacije, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje kompozicije i postupke za in vivo imunizaciju u cilju izazvanja imunskog odgovora usmerenog protiv antigena kod pacijenta.

[0196] Uopšteno, ćelije koje se aktiviraju i umnožavaju kao što je ovde opisano mogu da se koriste u lečenju i prevenciji bolesti koje nastaju kod pojedinaca koji su imunokompromitovani. Naročito, u lečenju CCL se koriste T ćelije modifikovane pomoću CAR koje su ovde opisane. U određenim primerima izvođenja, ćelije koje su ovde opisane se koriste u lečenju pacijenata koji imaju rizik od razvoja CCL. Na taj način, predmetni pronalazak obezbeđuje lečenje ili prevenciju CCL koje obuhvata primenu kod subjekta kome je to potrebno, terapeutski efikasne količine T ćelija modifikovanih pomoću CAR prema pronalasku.

[0197] T ćelije modifikovane pomoću CAR koje su ovde opisane mogu da se primene ili same, ili kao farmaceutska kompozicija u kombinaciji sa diluentima i/ili sa drugim komponentama kao što je IL-2 ili drugi citokini ili ćelijske populacije. Ukratko, farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane mogu da sadrže ciljnu ćelijsku populaciju kao što je ovde opisano, u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski ili fiziološki prihvatljivih nosača, diluenata ili ekscipijenasa. Takve kompozicije mogu da sadrže pufere kao što je neutralni puferisani rastvor soli, fosfatno puferisani rastvor soli i slično; ugljovodonike kao što je glukoza, manoza, saharoza ili dekstrani, manitol; proteine; polipeptide ili aminokiseline kao što je glicin; antioksidanse; sredstva za heliranje kao što je EDTA ili glutation; adjuvanse (npr., aluminijum hidroksid); i konzervanse. Kompozicije koje su ovde opisane su poželjno formulisane za intravensku primenu.

[0198] Farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane mogu da se primene na način koji je pogodan za bolest koja treba da se leči (ili spreči). Količina i učestalost primene će biti određene faktorima kao što su stanje pacijenta, i vrsta i ozbiljnost pacijentove bolesti, mada odgovarajuće doze mogu da se odrede u kliničkim ispitivanjima.

[0199] Kada je "imunološki efikasna količina", "anti-tumorski efikasna količina", "količina efikasna u inhibiciji tumora", ili "terapeutska količina" naznačena, preciznu količinu kompozicija predmetnog pronalaska koja treba da se primeni može da odredi lekar uzimajući u obzir individualne razlike u godinama, težini, veličini tumora, stepenu infekcije ili metastaze, i stanje pacijenta (subjekta). Uopšteno se može navesti da farmaceutska

4

kompozicija koja sadrži T ćelije koje su ovde opisane može da se primeni u dozi od 10<4>do 109 ćelija/kg telesne težine, poželjno 10<5>do 10<6>ćelija/kg telesne težine, uključujući sve cele brojeve unutar ovih opsega. T ćelijske kompozicije mogu tkođe da se primene više puta u ovim dozama. Ćelije mogu da se primene upotrebom tehnika infuzije koje su opšte poznate u imunoterapiji (videti, npr., Rosenberg et al., New Eng. J. of Med.319:1676, 1988). Optimalni režim doziranja i lečenja za određenog pacijenta može lako da odredi stručnjak u medicinskoj oblasti praćenjem znakova bolesti kod pacijenta i prilagođavanjem lečenja tome.

[0200] Može da bude poželjno primeniti aktivirane T ćelije kod subjekta i zatim naknadno ponovo izvaditi krv (ili izvesti aferezu), aktivirati T ćelije iz nje u skladu sa predmetnim pronalaskom, i infuzijom dati pacijentu ove aktivirane i umnožene T ćelije. Ovaj postupak može da se izvede više puta svakih nekoliko nedelja. T ćelije mogu da se aktiviraju iz izvađene krvi od oko 10 cm<3>do 400 cm<3>, na primer, T ćelije se aktiviraju iz izvađene krvi od 20 cm3, 30 cm3, 40 cm3, 50 cm3, 60 cm3, 70 cm3, 80 cm3, 90 cm3, ili 100 cm3. Bez pozivanja na teoriju, upotreba ovog protokola višestrukih vađenja krvi/višestrukih ponavljanja infuzije može da posluži za selekciju određenih populacija T ćelija.

[0201] Primena predmetnih kompozicija može da se izvede na bilo koji pogodan način, uključujući inhalaciju aerosola, injekciju, ingestiju, transfuziju, implantaciju ili transplantaciju. Kompozicije koje su ovde opisane mogu da se primene kod pacijenta subkutano, intradermalno, intratumoralno, intranodalno, intramedularno, intramuskularno, intravenskom (i.v.) injekcijom, ili intraperitonealno. Na primer, T-ćelijske kompozicije koje su ovde opisane se primenjuju kod pacijenta intradermalnom ili subkutanom injekcijom. U drugom primeru, T-ćelijske kompozicije koje su ovde opisane se poželjno primenjuju i.v. injekcijom. Kompozicije T ćelija mogu da se injektuju direktno u tumor, limfni čvor, ili mesto infekcije.

[0202] U određenim slučajevima, ćelije koje su aktivirane i umnožene upotrebom postupaka koji su ovde opisani, ili drugih postupaka poznatih u stanju tehnike u kojima su T ćelije umnožene do terapeutskih nivoa, primenjuju se kod pacijenta zajedno sa (npr., pre, istovremeno ili nakon) bilo kog broja relevantnih modaliteta lečenja, uključujući ali bez ograničenja, lečenje sredstvima kao što je antiviralna terapija, cidofovir i interleukin-2, citarabin (takođe poznat kao ARA-C) ili lečenje natalizumabom za MS pacijente ili lečenje efalizumabom za pacijente sa psorijazom ili druga lečenja za PML pacijente. Kako je ovde takođe opisano, T ćelije pronalaska mogu da se koriste u kombinaciji sa hemoterapijom, zračenjem, imunosupresivnim sredstvima, kao što su ciklosporin, azatioprin, metotreksat, mikofenolat, i FK506, antitela, ili drugim imunoablativnim sredstvima kao što su CAM PATH, anti-CD3 antitela ili terapije drugim antitelom, citoksin, fludaribin, ciklosporin, FK506, rapamicin, mikofenolna kiselina, steroidi, FR901228, citokini, i zračenje. Ovi lekovi inhibiraju ili fosfatazu kalcineurin zavisnu od kalcijuma (ciklosporin i FK506) ili inhibiraju p70S6 kinazu koja je značajna za signalizaciju indukovanu faktorom rasta (rapamicin) (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). Kako je ovde takođe opisano, ćelijske kompozicije predmetnog pronalaska se primenjuju kod pacijenta zajedno sa (npr., pre, istovremeno ili nakon) transplantacijom kosne srži, T ćelijskom ablativnom terapijom upotrebom hemoterapijskih sredstava kao što su fludarabin, radijacionom terapijom spoljnim zrakom (XRT), ciklofosfamidom, ili antitelima kao što su OKT3 ili CAMPATH. Kako je ovde takođe opisano, ćelijske kompozicije predmetnog pronalaska se primenjuju nakon B-ćelijske ablativne terapije kao što je terapija sredstvima koja reaguju sa CD20, npr., Rituxan. Na primer, subjekti mogu da se podvrgnu standardnom lečenju visoko-doznom hemoterapijom praćenom transplantacijom stem ćelija periferne krvi. U određenim slučajevima, nakon transplanta, subjekti primaju infuziju umnoženih imunskih ćelija predmetnog pronalaska, ili se umnožene ćelije primenjuju pre ili nakon hirurške intervencije.

[0203] Doziranje prethodno navedenih lečenja koja treba da se primene kod pacijenta će varirati sa tačnom prirodom stanja koje se leči i primaocem lečenja. Skaliranje doziranja za primenu kod čoveka može da se izvede prema praksi uobičajenoj u ovoj oblasti. Doza za CAMPATH, na primer, će uopšteno biti u opsegu 1 do oko 100 mg za odraslog pacijenta, obično primenjena dnevno u periodu između 1 i 30 dana. Poželjna dnevna doza je 1 do 10 mg dnevno mada u nekim slučajevima veće doze sve do 40 mg dnevno mogu da se koriste (opisano u SAD patentu br.6,120,766).

EKSPERIMENTALNI PRIMERI

[0204] Pronalazak je u nastavku detaljno opisan po referenci na eksperimentalne primere koji slede. Ovi primeri su obezbeđeni samo u ilustrativne svrhe, i nisu namenjeni da budu ograničavajući osim ako nije drugačije naznačeno. Tako, pronalazak ne treba ni na koji način tumačiti kao ograničen na sledeće primere, već pre treba tumačiti tako da obuhvata bilo koje, i sve varijacije koje će biti očigledne kao rezultat ovde navedenog opisa.

[0205] Bez daljeg opisivanja, smatra se da će stručnjak u oblasti moći, upotrebom prethodnog opisa i ilustrativnih primera koji slede, da napravi i koristi jedinjenja predmetnog pronalaska i praktikuje postupke za koje se traži zaštita. Prema tome radni primeri koji slede, posebno

1

ističu poželjne primere izvođenja predmetnog pronalaska, i ne treba ih smatrati ograničavajućim ni na koji način za ostatak opisa.

Primer 1: T ćelije koje eksprimiraju himerne receptore uspostavljaju memoriju i snažna antitumorska dejstva kod pacijenata sa uznapredovalom leukemijom

[0206] Limfociti modifikovani tako da eksprimiraju himerne receptore za antigen (CAR) su pokazali minimalnu in vivo ekspanziju i antitumorska dejstva u prethodnim kliničkim ispitivanjima. Ovde prikazani rezultati pokazuju da CAR T ćelije koje sadrže CD137 imaju snažnu kliničku aktivnost bez unakrsne rezistencije nakon infuzije kod tri od tri pacijenta lečena od uznapredovale hronične limfocitne leukemije (CLL). Modifikovane T ćelije su se umnožile više od hiljdu puta in vivo, premestile u kosnu srž i nastavile da eksprimiraju funkcionalne CAR na visokim nivoima tokom najmanje 6 meseci. U proseku, svaka CAR+ T ćelija primenjena infuzijom iskorenila je najmanje 1000 CLL ćelija. Imunski odgovor specifičan za CD19 je pokazan u krvi i kosnoj srži, praćen potpunom remisijom kod dva od tri pacijenta. Deo ćelija opstaje kao memorijske CAR+ T ćelije, ukazujući na potencijal ovog pristupa koji nije ograničen na MHC za efikasno lečenje B-ćelijskih maligniteta.

[0207] U nastavku teksta su opisani materijali i postupci korišćeni u ovim eksperimentima.

Materijali i postupci

Opšti laboratorijski izveštaj

[0208] Obrada uzoraka za istraživanje, zamrzavanje, i laboratorijska ispitivanja su izvedena u laboratoriji Translational and Correlative Studies Laboratory Univerziteta Pensilvanije koja radi u skladu sa principima dobre laboratorijske prakse sa uspostavljenim SOP i/ili protokolima za prijem uzoraka, obradu, zamrzavanje, i ispitivanje. Izvođenje testova i prikazivanje podataka su usklađeni sa smernicama MIATA (Janetzki et al., 2009, Immunity 31:527-528).

Dizajn protokola

[0209] Kliničko ispitivanje (NCT01029366) je sprovedeno kao što je prikazano dijagramom na slici 1. Pacijenti sa hematološkim malignitetom pozitivnim na CD19 sa perzistentnom bolešću nakon najmanje dva prethodna režima lečenja i koji nisu bili kvalifikovani za transplantaciju alogenih stem ćelija bili su kvalifikovani za ispitivanje. Nakon ponovnog određivanja stadijuma tumora, T ćelije periferne krvi za proizvodnju CART19 su sakupljene aferezom i subjektima je jednokratno data hemoterapija kao što je naznačeno na slici 10

2

tokom nedelje pre infuzije. CART19 ćelije su primenjene intravenskom infuzijom upotrebom režima doziranja podeljenog na tri dana (10%, 30% i 60%) u dozi naznačenoj na slici 10 i ako je moguće, druga doza je primenjena 10. dana; samo pacijent UPN 02 je imao dovoljno ćelija za drugu infuziju. Procenjena je toksičnost kod subjekata i odgovor u čestim intervalima tokom najmanje 6 meseci. Protokol je odobren od strane Administracije za hranu i lekove SAD, Savetodavnog komiteta za rekombinantnu DNK i Nadzornog odbora Univerziteta Pensilvanije. Prvi dan infuzije je označen kao nulti dan ispitivanja.

Subjekti: sažetak kliničkih podataka

[0210] Sažetak kliničkih podataka dat je na slici 10 i detaljne istorije su obezbeđene na drugom mestu. Pacijentu UPN 01 je prvo dijagnostikovan stadijum II B-ćelijske CLL sa 55 godina starosti. Pacijent nije imao simptome i posmatran je otprilike 1 - 1/2 godine do pojave potrebe za terapijom za progresivnu limfocitozu, trombocitopeniju, adenopatiju i splenomegaliju. Tokom vremena, pacijent je primio terapiju prve linije. Najskorija terapija je bila 2 ciklusa pentostatina, ciklofosfamida i rituksimaba, 2 meseca pre infuzije CART19 ćelija, sa minimalnim odgovorom. Pacijent je primio jedan ciklus bendamustina kao hemoterapiju za smanjenje broja limfocita pre infuzije CART-19 ćelija.

[0211] Pacijentu UPN 02 je prvo dijagnostikovana CLL sa 68 godina, kada je pacijent pokazao zamor i leukocitozu. Pacijent je bio relativno stabilan 4 godine, kada je razvio progresivnu leukocitozu (195 000/µl), anemiju i trombocitopeniju koje su zahtevale terapiju. Kariotypsko ispitivanje je pokazalo da ćelije CLL imaju deleciju hromozoma 17p. Zbog progresivne bolesti, pacijent je lečen alemtuzumabom sa delimičnim odgovorom ali u okviru jedne ipo godine pacijent je imao progresivnu bolest. Pacijent je ponovo lečen alemtuzumabom tokom 18 nedelja sa delimičnim odgovorom i interval bez progresije bolesti od 1 godine. Pacijent je tada primio 2 ciklusa bendamustina sa rituksimabom bez značajnog odgovora (slika 5A). Pacijent je primio samo sredstvo bendamustin kao hemoterapiju za smanjenje broja limfocita pre infuzije CART-19 ćelija.

[0212] Kod pacijenta UPN 03 je u uzrastu od 50 godina otkrivena asimptomatska CLL u stadijumu I i praćen je godinama. Pacijent je imao progresivnu leukocitozu (bela krvna slika 92 000/µl) i progresivnu adenopatiju koja zahteva terapiju. Pacijent je primio 2 ciklusa rituksimaba sa fludarabinom što je rezultovalo normalizacijom krvne slike i značajnim poboljšanjem mada ne i potpunim povlačenjem adenopatije. Pacijent je imao približno 3 godine dug period bez progresije. Kariotipsko ispitivanje je pokazalo da ćelije sadrže deleciju hromozoma 17p, pomoću FISH pokazana je delecija TP53 u 170 od 200 ćelija. Tokom narednih godina pacijentu su bile potrebne 3 različite linije terapije (slika 10) za progresivnu leukocitozu i adenopatiju, poslednje primanje alemtuzumaba sa delimičnim odgovorom 6 meseci pre infuzije CART19 ćelija. Pacijent je primio pentostatin i ciklofosfamid kao hemoterapiju za smanjenje broja limfocita pre infuzije CART-19 ćelija.

Proizvodnja vektora

[0213] Transgen CD19-BB-z (GeMCRIS 0607-793) je dizajniran i konstruisan kao što je opisano u (Milone et al., 2009, Mol Ther.17:1453-1464). Lentiviralni vektor je proizveden u skladu sa aktuelnom dobrom proizvođačkom praksom upotrebom proizvodnog pristupa sa tri plazmida u Lentigen Corporation kao što je opisano (Zufferey et al., 1997, Nature biotechnol 15:871-875).

Priprema CART19-ćelijskog proizvoda

[0214] Postupci pripreme T ćelija upotrebom paramagnetskih polistirenskih perli obloženih anti-CD3 i anti-CD28 monoklonskim antitelima su opisani (Laport et al., 2003, Blood 102: 2004-2013). Lentiviralna transdukcija je izvedena kao što je opisano (Levine et al., 2006, Proc Natl Acad Sci U S A 103:17372-17377).

Postupci za izračunavanje tumorskog opterećenja

[0215] Polazna vrednost CLL opterećenja je procenjena kao što je prikazano na slici 10. Količina CLL ćelija je izračunata u kosnoj srži, krvi, i sekundarnim limfnim tkivima kao što je dole opisano.

[0216] Kosna srž: Kod odraslih zdravih osoba, kosna srž predstavlja približno 5% ukupne telesne težine (Woodard et al., 1960, Phys Med Biol, 5:57-59; Bigler et al., 1976, Health Phys 31:213-218). Uzorci kosne srži u ilijačnoj kresti pokazuju rastući procenat neaktivne (masne) kosne srži sa starenjem, koji raste od 20% ukupne kosne srži u dobu od 5 godina do oko 50% do doba od 35 godina, kada ostaje stabilan do 65 godina, i tada raste do oko 67% neaktivne kosne srži do doba od 75 godina (Hartsock et al., 1965, Am J Clin Path 43:326-331). Međunarodna referentna vrednost ukupne težine u skeletu aktivne (crvene) i neaktivne (masne) kosne srži za muškarce od 35 godina je trenutno 1170g i 2480g, redom (Basic anatomical and physiological data for use in radiological protection: The Skeleton in Annals of the ICRP, Vol. 25 (ed. Smith, H.) 58-68 (A report of a Task Group of Committee 2 of the International Commission on Radiological Protection, Oxford, 1995)). Odrasli muškarci starosti između 35 i 65 godina imaju kosnu srž koja predstavlja 5.0% ukupne telesne težine, sastavljenu od 1.6% aktivne (crvene) kosne srži i 3.4% neaktivne (masne) kosne srži (Basic

4

anatomical and physiological data for use in radiological protection: The Skeleton in Annals of the TCRP, Vol.25 (ed. Smith, H.) 58-68 (A report of a Task Group of Committee 2 of the International Commission on Radiological Protection, Oxford, 1995)). Na osnovu uzoraka biopsije kosne srži i aspirata, polazna vrednost težine ćelija CLL za tri pacijenta izračunata je kao što je prikazano u tabli 1. Ove procenjene ukupne mase CLL kosne srži su zatim pretvorene u ukupan broj CLL ćelija u kosnoj srži upotrebom jednakosti 1Kg = 10<12>ćelija, i rezultujući brojevi su prikazani na slici 10. Ovi proračuni se zasnivaju na pretpostavci da CLL ima ravnomernu raspodelu u kosnoj srži. Za pacijenta UPN 01, proračuni su prikazani za biopsiju kosne srži dobijenu pre hemoterapije bendamustinom, i za aspirat dobijen nakon bendamustina i pre CART19 infuzije. Brojevi su manje precizni za aspirat na dan-1 u poređenju sa uzorkom biopsije na dan-14 zbog tehničkih ograničenja aspirata na dan-1. Pacijent UPN 02 je imao jedan uzorak biopsije pre lečenja koji pokazuje potpunu zamenu kosne srži sa CLL. Ovaj pacijent je imao neizmenjen uzorak na dan 30 nakon CART19. Opterećenje kosne srži za pacijenta UPN 03 je izračunato na osnovu biopsije posle hemoterapije i pre CART19.

[0217] Krv: Samo pacijent UPN 02 je imao značajno tumorsko opterećenje CLL u krvi pre CART19 infuzije. Protočna citometrija je pokazala da ćelije imaju tipičan fenotip klonalne populacije kapa-ograničene CD5+ CD10- CD19+ CD20(dim)+ CD23(promenljivo)+ IgM-B ćelijske populacije sa dim površinom. Približno 35% CLL ćelija koeksprimira CD38. Opterećenje CLL nije nestalo posle 3 ciklusa hemoterapije bendamustinom i bilo je prisutno u vreme CART19 infuzija. U vreme CART 19 infuzije, broj CLL u krvi je bio 55000 ćelija/µL.

Predpostavljajući da je zapremina krvi 5.0 L, pacijent UPN 02 je imao 2.75x10<11>CLL ćelija u krvi nultog dana. S obzirom na normalni ukupni broj belih krvnih ćelija kod pacijenata UPN 01 i 03, opterećenje bolesti u cirkulatornom sistemu kod ovih pacijenata nije računato, što bi vodilo blagom podcenjivanju ukupnog opterećenja u telu.

[0218] Sekundarna limfna tkiva: Volumen limfadenopatije i splenomegalije je kvantifikovan na aksijalnim CT skenovima upotrebom kompjuterskog programa koji je odobrila FDA. Volumeni su samo za grudni koš, abdomen i pelvis. Mase od nivoa T1 kičmenog pršljena do nivoa račvanja opšte femoralne arterije su merene kod svih pacijenata, i kod nekih, čvorovi u preponskoj oblasti su takođe bili uključeni. Čvorovi u glavi/vratu i ekstremitetima su bili isključeni iz ispitivanja i isključeni iz polaznog broja ciljnih ćelija CLL, što bi takođe vodilo blagom podcenjivanju ukupnog opterećenja u telu. Pacijenti UPN 01 i 03 su održali kompletnu remisiju duže od 6 meseci, i stoga, za određivanje smanjenja tumorskog opterećenja u odnosu na polaznu vrednost korišćena je formula (polazni volumen – volumen kroz 3 meseca); pacijent UPN 02 je imao stabilnu adenopatiju, i stoga je polazna masa tumora procenjena oduzimanjem referentne vrednosti za volumen slezine zdravih muškaraca istih godina (Harris et al., 2010, Eur J Radiol 75:e97-e101). Polazna masa tumora je pretvorena u broj CLL ćelija upotrebom gustine (1 Kg/L gustine, i 1 Kg = 10<12>ćelija) ili volumena (CLL ćelije imaju prečnik od 10 µM ili 600 fL, pretpostavljajući loptsati oblik), i obe vrednosti su predstavljene na slici 10. Volumeni tumora u sekundarnim limfoidnim tkivima kod tri pacijenta su prikazani dole u tabeli 2, kako je izračunato iz dostupnih CT skenova.

[0219] Polazni CT sken za pacijenta UPN 01 je izveden 8 dana nakon 2 ciklusa pentostatina/ ciklofosfamida/rituksimaba, i nije pokazao odgovor na ovaj hemoterapijski režim u poređenju sa prethodnim CT skenom. Pacijent je imao jedan ciklus bendamustina pre CART 19, i stoga, promena u volumenu tumora od dana - 37 do dana 31 za UPN 01 ne može da isključi mogući doprinos bendamustina kao i CART19. Slično, promena u volumenu tumora za UPN 03 odražava kombinovano dejstvo 1 ciklusa pentastatin/ ciklofosfamida i CART19.

Postupak za procenjivanje efektivnog odnosa E:T in vivo kod pacijenata

[0220] Odnos E:T CAR T ćelija primenjenih infuzijom prema broju ubijenih tumorskih ćelija je izračunat upotrebom broja tumorskih ćelija prisutnih u vreme injektovanja CAR T ćelija i broja injektovanih CAR T ćelija (Carpenito et al., 2009, Proc. Natl Acad Sci U S A 106:3360-3365). Za predmetni pronalazak korišćen je broj injektovanih CART19+ T ćelija kao što je prikazano na slici 10, jer nije moguće odrediti apsolutni broj CART19+ T ćelija prisutnih in vivo sa dovoljnom tačnošću ili preciznošću. Dostupni podaci o ekspanziji CART19 u krvi i kosnoj srži pokazuju da je snažna kao što je prikazano na slici 2 i slici 6. Međutim, nije moguće odrediti migraciju CART19 na druga mesta kao što su sekundarna limfoidna tkiva, što stvara značajnu nesigurnost u određivanju ukupnog broja CART19 ćelija dostupnih in vivo u vreme maksimalnog smanjena tumora. Izračunate vrednosti iz tabele 3 korišćene su za dobijanje efektivnih odnosa E:T.

Obrada uzoraka i zamrzavanje

[0221] Uzorci (periferna krv, kosna srž) su sakupljeni u vakutajner epruvete (Becton Dickinson) sa poklopcem boje lavande (K2EDTA) ili crvenim poklopcem (bez dodataka) i dostavljene u TCSL unutar 2 časa od uzimanja. Uzorci su obrađeni u okviru 30 minuta od prijema prema uspostavljenom laboratorijskom SOP-u. Mononuklearne ćelije periferne krvi i kosne srži su prečišćene putem centrifugiranja u gradijentu gustine Ficoll, upotrebom Ficoll-Paque (GE Health care, 17-1440-03) i zamrznute u RPMI (Gibco 11875-135) obogaćenom sa 4% humanim serum albuminom (Gemini Bio-Products, 800-120), 2% Hetastarch (Novaplus, NDC0409-7248-49), i 10% DMSO (Sigma, D2650) upotrebom kontejnera za zamrzavanje 5100 Cryo 1°; nakon 24-72 časa na -80°C, ćelije su premeštene u tečni azot za dugotrajno skladištenje. Uzorci afereze su dobijeni preko Banke krvi bolnice Univerziteta Pensilvanje i obrađeni u CVPF prečišćavanjem u gradijentu Ficoll i zamrzavanjem kao što je prethodno opisano. Vijabilnost odmah nakon odmrzavanja bila je veća od 85% kada je procenjena. Za izdvajanje seruma, uzorci su ostavljeni da koagulišu 1.5-2 časa na sobnoj temperaturi; serum je izdvojen centrifugiranjem, i alikvoti za pojedinačnu upotrebu od 100 ml zamrznuti na -80°C.

Ćelijske linije

[0222] Ćelijska linija K562 (CML, CD19-negativna) je dobijena iz ATCC (CCL-243). K562/CD19, kao poklon Carmine Carpenito, i K562 je lentiviralno transdukovana pri učestalosti od 100% tako da eksprimira molekul CD19. NALM-6, CD19-pozitivna ne-T, ne-B ALL prekursorska B ćelijska linija (Hurwitz et al., 1979, Int J Cancer 23:174-180), za koju je potvrđeno da eksprimira CD19 antigen bila je poklon Laurence Cooper. Gore pomenute ćelijske linije su održavane u medijumu R10 (RPMI 1640 (Gibco, 11875) obogaćenom sa 10% fetalnog goveđeg seruma (Hyclone), i 1% Pen-Strep (Gibco, 15140-122). Periferne mononuklearne ćelije (ND365) zdravog davaoca su dobijene aferezom u Human Immunology Core na Univerzitetu Pensilvanije, obrađene i zamrznute kao što je gore opisano.

Izdvajanje DNK i analiza pomoću Q-PCR

[0223] Uzorci pune krvi ili kosne srži su sakupljeni u vakutajner epruvete (Becton Dickinson) sa poklopcem boje lavande (K2EDTA). Genomska DNK je izolovana direktno iz pune krvi upotrebom QIAamp DNK midi kitova za krv (Qiagen) i uspostavljenog laboratorijskog SOP-a, kvantifikovana spektrofotometrom, i čuvana na -80°C. Q-PCR analize na uzorcima genomske DNK su izvedene u balku upotrebom 123-200 ng genomske DNK/vremenskoj tački, ABI Taqman tehnologijom i validiranim testom za detektovanje integrisane CD19 CAR transgene sekvence. Opsezi parametra zadovoljava/ne zadovoljava, uključujući nagib standardne krive i ponovne procene, sposobnost preciznog kvantifikovanja referentnog uzorka (dodavanje 1000 kopija/plazmidu) i odsustvo amplifikacije u uzorku DNK zdravog davaoca, izračunati su na osnovu kvalifikovanih ispitivanja i unapred određenih opsega prihvatljivosti. Prajmer/probe za CD19 CAR transgen su opisane (Milone et al., 2009, Mol Ther 17:1453-1464). Za određivanje broja kopija/jedinici DNK izrađena je standardna kriva sa 8 tačaka koja se sastoji od 106-5 kopija lentivirusnog plazmida dodatog u 100 ng netransdukovane kontrolne genomske DNK. Svaki podatak (uzorci, standardna kriva, referentni uzorci) je procenjen u triplikatu sa prikazanim srednjim vrednostima. Za pacijenta UPN 01, sve prijavljene vrednosti su dobijene iz pozitivne Ct vrednosti u 3/3 ponavljanja sa % CV manjim od 0.46%. Za pacijenta UPN 02, sa izuzetkom uzorka za dan 177 (2/3 ponavljanja pozitivna, visok % CV), sve prijavljene vrednosti su dobijene iz pozitivne Ct vrednosti u 3/3 ponavljanja sa % CV manjim od 0.72%. Za pacijenta UPN 03, sa izuzetkom uzorka za dan 1 (2/3 ponavljanja pozitivna, 0.8% CV) i uzorka za dan 3 (2/3 ponavljanja pozitivna, 0.67% CV), sve prijavljene vrednosti su dobijene iz pozitivne Ct vrednosti u 3/3 ponavljanja sa % CV manjim od 1.56%. Donja granica kvantifikacije (LLOQ) za test je određena iz standardne krive sa 2 kopije/mikrogramu DNK (10 kopija/200 ng ulazne DNK); srednje vrednosti ispod LLOQ (tj. prijavljene, ali ne podležu kvantifikaciji) smatraju se približnim. Paralelna reakcija amplifikacije za kontrolu kvaliteta ispitivane DNK je izvedena upotrebom 12-20 ng ulazne genomske DNK, sa kombinacijom prajmer/proba specifičnom za netranskribujuću genomsku sekvencu ushodno od gena CDKN1A (GENEBANK: Z85996) (sens prajmer: GAAAGCTGACTGCCCCTATTTG; SEQ ID NO. 25, antisens prajmer: GAGAGGAAGTGCTGGGAACAAT; SEQ ID NO. 26, proba: VIC- CTC CCC AGT CTC TTT; SEQ ID NO. 27), i standardne krive sa 8 tačaka dobijene razblaživanjem kontrolne genomske DNK; ove reakcija amplifikacije su proizvele faktor korekcije (CF) (ng detektovano/ng ulazno). Kopije transgen /mikrogramu DNK su izračunate prema formuli: kopije izračunate iz CD19 standardne krive/ulazna DNK (ng) x CF x 1000 ng. Tačnost ovog testa je određena prema sposobnosti da se kvantifikuje marker ćelijskog prizvoda datog infuzijom pomoću Q-PCR prema formuli: Srednji marker = detektovane kopije/ulazna DNK x 6.3 pg DNK/odgovarajućoj somatskoj ćeliji x CF u odnosu na pozitivni rezultat na transgen dobijen pomoću protočne citometrije upotrebom CAR-specifičnih reagenasa za detekciju. „Slepa“ određivanja su dala 22.68% markera za proizvod infuzije UPN01 (22.6% pomoću protočne citometrije), 32.33% markera za proizvod infuzije UPN 02 (23% pomoću protočne citometrije), i 4.3% markera za proizvod infuzije UPN03 (4.7% markera pomoću protočne citometrije).

Ispitivanja citokina

[0224] Kvantifikacija rastvornih faktora citokina sprovedena je upotrebom tehnologije nizova mikroperli Luminex i kitova nabavljenih od Life technologies (Invitrogen). Testovi su izvedeni prema protokolu proizvođača sa standardnom krivom u 8 tačaka dobijenom upotrebom serije trostrukih razređenja. Svaka standardna tačka i uzorak su procenjivani u duplikatu pri razblaženju 1:3; izračunati % CV za merenja u duplikatu bio je manji od 15%. Podaci su dobijeni na Bioplex 200 i analizirani pomoću programa Bioplex Manager verzije 5.0 upotrebom 5-parameterske logističke regresione analize. Opsezi kvantifikacije standardne krive su određeni opsegom 80-120% (primećena/očekivana vrednost). Opsezi kvantifikacije pojedinačnih analita su prikazani na legendama slika.

Ćelijski test za detekciju funkcije CAR

[0225] Funkcionalnost ćelija je procenjena nakon odmrzavanja i odmaranja preko noći u TCM merenjem degranulacije CD107 kao odgovor na ciljne ćelije. Testovi degranulacije su izvedeni upotrebom 1 x 106 PBMC i 0.25 x 106 ciljnih ćelija u finalnoj zapremini od 500 µl u pločama sa 48 bunarčića tokom 2 časa na 37°C u prisustvu CD49d (Becton Dickinson), anti-CD28, monenzin (e-Bioscience) i CD107a-FITC antitela (eBiosciences) suštinski kao što je opisano (Betts et al., 2003, J Immunol Methods 281:6578).

Antitela- reagensi

[0226] Sledeća antitela su korišćena u ovim ispitivanjima: MDA-CAR, mišje anti CD 19 CAR antitelo konjugovano sa Alexa647 je bilo poklon Drs. Bipulendu Jena i Laurence Cooper (MD Anderson Cancer Center). Za multiparametarsku imunofenotipizaciju i testove funkcionalnosti: anti-CD3-A700, anti-CD8-PE-Cy7, anti-PD-1-FITC anti-CD25-AF488, anti-CD28-PercP-Cy5.5, anti-CD57-eF450, anti-CD27-APC-eF780, anti-CD17-APC-eF780, anti-CD45RAeF605NC, CD107a-FITC (sve od e-Bioscience), anti-CD4-PE-Texas Red i Live/Dead Aqua (Life Technologies) i anti-CD14-V500, anti-CD16-V500 (Becton Dickinson). Za opštu imunofenotipizaciju: CD3-PE, CD14-APC, CD14-PE-Cy7, CD16-FITC, CD16PE-Cy7, CD19-PE-Cy7, CD20-PE, sve od Becton Dickinson.

Multi-parametarska protočna citometrija

[0227] Ćelije su procenjene pomoću protočne citometrije ili sveže nakon obrade sa Ficoll-Paque ili, ako su bile zamrznute, nakon odmaranja preko noći pri gustini od 2 x 10<6>ćelija/ml u T-ćelijskom medijumu (TCM) (X-vivo 15 (Lonza, 04-418Q) obogaćenom sa 5% humanog AB seruma (GemCall, 100-512), 1% Hepes (Gibco, 15630-080), 1% Pen-Strep (Gibco, 15140-122), 1% Glutamax (Gibco, 35050-061), i 0.2% N-acetil cisteina (American Regent, NDC0517-7610-03). Multiparametarska imunofenotipizacija je izvedena na 4 x 106 ukupnih ćelija/uslovu, upotrebom FMO boja kao što je opisano u tekstu. Ćelije su obojene pri gustini od 1 x 106 ćelija/100 µl PBS, 30 minuta na ledu upotrebom antitela i koncentracije reagensa preporučene od strane proizvođača, oprane, resuspendovane u 0.5% paraformaldehida i opredeljene upotrebom modifikovanog LSRII (BD Immunocytometry systems) opremljenog plavim (488 nm), ljubičastim (405 nm), zelenim (532), i crvenim (633 nm) laserom i odgovarajućim setom filtera za detekciju i razdvajanje gore pomenutih kombinacija antitela. Minimum od 100 000 CD3+ ćelija je opredeljen) za svako bojenje. Za ispitivanja funkcionalnosti, ćelije su oprane, obojene za površinske markere, resuspendovane u 0.5% paraformaldehida i opredeljene kao gore; minimum od 50000 CD3+ događaja je sakupljeno za svaki uslov bojenja. Kompenzacione vrednosti su uspostavljene upotrebom pojedinačnog bojenja antitela i BD kompenzacionih perli (Becton Dickinson) i izračunate i automatski primenjene pomoću instrumenta. Podaci su analizirani upotrebom programa FlowJo (verzija 8.8.4, Treestar). Za opštu imunofenotipizaciju ćelije su opredeljene upotrebom citometra Accuri C6 opremljenog plavim (488) i crvenim (633 nm) laserom. Kompenzacione vrednosti su uspostavljene upotrebom pojedinačnog bojenja antitela i BD kompenzacionih perli (Becton Dickinson) i izračunate ručno. Podaci su analizirani upotrebom programskog paketa C-Flow (verzija 1.0,264.9, Accuri citometri).

Medicinska istorija pacijenta i odgovor na terapiju

[0228] Rezimei kliničkog lečenja su prikazani na slici 10. Pacijentu UPN 01 je prvo dijagnostikovan stadijum II B-ćelijske CLL u dobu od 55 godina. Pacijent nije imao simptome i posmatran je otprilike 1 - 1/2 godinu do pojave potrebe za terapijom za progresivnu limfocitozu, trombocitopeniju, adenopatiju i splenomegaliju. Nakon 4 ciklusa fludarabina pacijent je postigao normalizaciju krvne slike i postigao odgovor prema CT skenovima. Progresija je primećena u okviru 5 meseci sa asimptomatskom limfocitozom, trombocitopenijom, i rastućom adenopatijom. Pacijent je posmatran bez simptoma približno 3 godine, i kasnije mu je bilo potrebno lečenje rituksimabom i fludarabinom zbog progresivne leukocitoze, anemije, i trombocitopenije. Pacijent je lečen sa 4 ciklusa rituksimaba sa fludarabinom sa delimičnim poboljšanjem krvne slike. Pacijent je ponovo pokazao progresiju koja zahteva terapiju u okviru jedne godine, koja se manifestuje leukocitozom (bele krvne ćelije 150 000/µl) i trombocitopenijom (trombociti 30 000/µl) i lečen alemtuzumabom sa normalizacijom krvne slike. Progresija je primećena u okviru 13 meseci. Pacijent je zatim

1

primio pojedinačno sredstvo rituksimab bez značajnog odgovora i nakon toga rituksimab, ciklofosfamid, vinkristin, i prednizon (R-CVP), u 2 ciklusa sa minimalnim odgovorom i nakon toga lenalidomid. Primena lenalidomida je prekinuta zbog toksičnosti. Pacijent je primio 2 ciklusa pentostatina, ciklofosfamida i rituksimaba sa minimalnim odgovorom.

[0229] Kasnije, pacijent je primio bendamustin kao hemoterapiju za smanjenje broja limfocita 4 dana pre infuzije CART-19 ćelija. Pre terapije, belih krvnih ćelija je bilo 14 200/µl, hemoglobina 11.4 gm/dl, broj trombocita je bio 78000/µl i ALC je bilo 8000/µl. CT sken je pokazao difuznu adenopatiju i kosna srž je bila ekstenzivno infiltrirana sa CLL (67% ćelija). Pacijent je primio 1.6 x 107 CART-19 ćelija/kg (1.13 x 10<9>ukupno CART19 ćelija procenjeno pomoću FACS). Nije bilo toksičnosti povezanih sa infuzijom, pacijent je postao neutropeničan približno 10 dana nakon bendamustina i 6 dana nakon infuzije CART19 ćelija, i počevši od 10 dana nakon prve infuzije CART19, kod pacijenta se razvila groznica, rigor i prolazna hipotenzija. U isto vreme, snimanje grudnog koša X-zracima i CT sken su pokazali pneumoniju gornjeg levog lobusa lečenu antibioticima. Povišena temperatura je opstala približno 2 nedelje i povukla sa kada je došlo do oporavka neutrofila. Pacijent više nije imao infekcije ili konstitucionalne simptome.

[0230] Pacijent je postigao brz i kompletan odgovor kao što je prikazano na slici 5. Između 1 i 6 meseci nakon infuzije cirkulišuće CLL ćelije nisu detektovane u krvi pomoću protočne citometrije. Kosna srž je na 1, 3 i 6 meseci nakon infuzija CART-19 ćelija pokazala trajno odsustvo limfocitne infiltracije prema ispitivanju morfologije i protočnoj citometriji. CT skenovi na 1 i 3 meseca nakon infuzije pokazali su potpuno povlačenje abnormalne adenopatije. Pacijent je imao perzistentnu leukopeniju (bele krvne ćelije 1000-3900/ul) i trombocitopeniju (trombociti ~100 000/ul), i blagu hipogamaglobuliniju (IgG 525 mg/dL, normalno 650-2000 mg/dL) ali bez komplikacija infekcije.

[0231] Pacijent UPN 02 je lečen CART19 ćelijama u dobu od 77 godina. Pacijent je imao relevantnu istoriju bolesti koronarne arterije i prvi put mu je dijagnostikovana CLL 2000. godine u dobu od 68 godina kada je pacijent pokazao zamor i leukocitozu. Pacijent je bio relativno stabilan 4 godine kada se kod pacijenta razvila progresivna leukocitoza (195 000/µl), anemija i trombocitopenija koja zahteva terapiju. Genetsko ispitivanje u isto vreme je pokazalo da CLL ćelije imaju deleciju hromozoma 17p. Zbog progresivne bolesti, pacijent je lečen 12-nedeljnim kursom alemtuzumaba sa delimičnim odgovorom i poboljšanjem krvne slike. U okviru jedne ipo godine, pacijent je imao progresivnu leukocitozu, anemiju, trombocitopeniju, i splenomegaliju. Kariotipska ispitivanja su potvrdila deleciju hromozoma 17p sada sa delecijom hromozoma 13q. Pacijent je lečen alemtuzumabom 18 nedelja sa

2

poboljšanjem leukocitoze i stabilizacijom anemije i splenomegalije. Pacijent je imao dokaz progresivne leukocitoze, anemije, i trombocitopenije u okviru jedne godine. Lečenje je uključivalo 2 ciklusa bendamustina sa rituksimabom i rezultovalo u stablnoj bolesti, ali bez značajnog poboljšanja, kao što je prikazano na slici 5A.

[0232] Pacijent je primio samo bendamustin kao hemoterapiju za smanjenje broja limfocita pre infuzije CART-19 ćelija. Pacijent je primio 4.3 x 10<6>CART 19 ćelija/kg (4.1 x 10<8>ćelija ukupno) u 3 odvojene infuzije komplikovane prolaznom povišenom temperaturom od 38,9°C tokom 24 časa. 11. dana nakon prve infuzije, pacijent je primio ponovljenu infuziju od 4.1x108 (4.3x10<6>/kg) CART19 ćelija i ova infuzija je bila komplikovana groznicom, rigorom i kratkim dahom bez hipoksije što je zahtevalo hospitalizaciju na 24 časa. Nije bilo dokaza srčane ishemije, i simptomi su se povukli. 15. dana nakon prve infuzije CART-19 i 4. dana nakon ponovljene infuzije CART19 ćelija, pacijent je primljen u bolnicu sa visokom temperaturom (do 40°C), drhtavicom i rigorom. Ekstenzivno ispitivanje sa kulturama krvi i urina i CXR nije identifikovao izvor infekcije. Pacijent se žalio na kratak dah ali nije imao hipoksiju. Ehokardiogram je pokazao ozbiljnu hipokinezu. Frakcija odbacivanja je bila 20%, pacijent je primio prednizon 1 mg po kilogramu jednog dana i 0.3 mg po kilogramu tokom približno jedne nedelje. Ovo je dovelo do brzog povlačenja groznice i srčane disfunkcije.

[0233] Istovremeno sa pojavom visoke temperature, pacijent je imao nagli pad limfocita periferne krvi kao što je prikazano na slici 5A. Iako je pacijent ima normalizaciju bele krvne slike, pacijent je imao perzistentnu cirkulišuću CLL, stabilnu umerenu anemiju i trombocitopeniju. Kosna srž je pokazala perzistentnu ekstenzivnu infiltraciju CLL mesec dana nakon terapije uprkos dramatičnom smanjenju broja ćelija periferne krvi, i CT skenovi su pokazali delimično smanjenje adenopatije i splenomegalije. Pet meseci nakon infuzije CART19 ćelija pacijent je razvio progresivnu limfocitozu. Devet meseci nakon infuzija pacijent je imao limfocitozu (16 500/µl) sa stabilnom umerenom anemijom i trombocitopenijom sa stabilnom adenopatijom. Pacijent ne pokazuje simptome i nije imao dodatnu terapiju.

[0234] Pacijentu UPN 03 je dijagnostikovana asimptomatska CLL stadijum I u dobu od 50 godina i njegovo praćenje je nastavljeno 6 godina. Kasnije, pacijent je imao progresivnu leukocitozu (bela krvna slika 92 000/µl) i progresivnu adenopatiju koja zahteva terapiju. Pacijent je primio 2 ciklusa rituksimaba sa fludarabinom što je dovelo do normalizacije krvne slike i značajnog poboljšanja, mada ne i potpunog povlačenja adenopatije. Pacijent je imao period od približno 3 godine bez progresije, praćen tokom narednih 6 meseci naglom progresijom leukocitoze (bele krvne ćelije 165 000/µl) i progresivne adenopatije koja zahteva terapiju. Pacijent je primio jedan ciklus fludarabina i 3 ciklusa rituksimaba sa fludarabinom sa normalizacijom krvne slike i povlačenjem palpabilne adenopatije. Pacijent je imao period od približno 20 meseci bez progresije dok nije ponovo naglo razvio progresivnu leukocitozu i adenopatiju. U to vreme, kosna srž je bila ekstenzivno infiltrirana sa CLL i kariotipsko ispitivanje je pokazalo da ćelije sadrže deleciju hromozoma 17p sa FISH koja pokazuje TP53 deleciju u 170/200 ćelija. Pacijent je primio jedan ciklus rituksimaba sa bendamustinom praćen sa 4 ciklusa samog bendamustina (zbog ozbiljne alergijske reakcije na rituksimab). Pacijent je imao početnu normalizaciju krvne slike ali ubrzo nakon prestanka terapije imao je progresivnu leukocitozu i adenopatiju.

[0235] Autologne T ćelije su sakupljene afarezom od pacijenta UPN3 i kriokonzervisane. Pacijent je zatim lečen alemtuzumabom 11 nedelja sa odličnim hematološkim odgovorom. Javilo se poboljšanje, mada ne i potpuno povlačenje adenopatije. Pacijent je imao aktivnu ali stabilnu bolest tokom sledećih 6 meseci. Kasnije, pacijent je primio pentostatin i ciklofosfamid kao hemoterapiju sa smanjenje limfocita pre infuzije CART19 ćelija.

[0236] Tri dana nakon hemoterapije ali pre ćelijske infuzije, kosna srž je bila hipercelularna (60%) sa približno 40% zastupljenosti CLL. Zbog ograničenja u proizvodnji neodvojivih od postupaka prikupljanja ćelija aferezom, od CLL pacijenata, kao što je prikazano u tabeli 3, i (Bonyhadi et al., 2005, J Immunol 174:2366-2375), pacijent je primio infuziju sa ukupno 1.46 x 105 CART19+ ćelija po kg (1.42 x 10<7>CART19+ ćelija ukupno) tokom 3 dana. Nije bilo toksičnosti povezane sa infuzijom. Četrnaest dana nakon prve infuzije, pacijent je počeo da ima drhtavice, groznicu do 38,8°C, rigor, mučninu i dijareju koje su lečene simptomatski. Pacijent nije imao respiratorne ili srčane simptome. Do 22. dana nakon infuzije, dijagnostikovan mu je sindrom lize tumora koji se ispoljava povišenim LDH, mokraćnom kiselinom, i komplikovan je renalnom insuficijencijom. Pacijent je hospitalizovan i lečen zamenom fluida i razburikazom sa brzom normalizacijom mokraćne kiseline i renalne funkcije. Detaljna klinička procena sa CXR, kulturama krvi, urina i stolice je sprovedena i svi rezultati su bili negativni ili normalni.

[0237] U toku 1 meseca od CART-19 infuzija, kod pacijenta je primećeno izlučivanje cirkulišućih CLL iz krvi i kosne srži prema morfološkim ispitivanjima, protočnoj citometriji, citogenetskim ispitivanjima, i FISH analizi, i CT skenovi su pokazali povlačenje abnormalne adenopatije (slika 5C). Remisija je kod pacijenta bila neprekidna preko 8 meseci od početne infuzije CART19 ćelija.

[0238] Rezultati eksperimenata slede.

4

Klinički protokol

[0239] Tri pacijenta sa uznapredovalom CLL, otpornom na hemoterapiju uključena su u pilot kliničko ispitivanje kao što je prikazano na slici 1. Svi pacijenti su ekstenzivno prethodno lečeni različitim hemoterapijama i biološkim režimima kao što je pokazano na slici 10. Dva od pacijenata su imala p53-deficijentnu CLL, deleciju koja dovodi do slabog odgovora na uobičajenu terapiju i brze progresije bolesti (Dohner et al., 1995, Blood, 851580-1589). Svaki od pacijenata je imao velika tumorska opterećenja nakon preparativne hemoterapije, uključujući ekstenzivnu infiltraciju kosne srži (40 do 95%) i limfadenopatiju; pacijent UPN 02 je takođe imao značajnu perifernu limfocitozu. CART19 T ćelije su pripremljene kao što je prikazano na slici 1B i detalji proizvodnje ćelija i karakterizacije proizvoda za svakog pacijenta prikazani su u tabeli 4. Svi pacijenti su prethodno lečeni 1-4 dana pre CART19 T ćelijskih infuzija hemoterapijom za smanjenje broja limfocita. Raspored sa podeljenom dozom ćelijske infuzije je korišćen zbog probnog ispitivanja CAR koji uključuje kostimulatorni signalni domen 4-1BB kao što je prikazano na slici 1A.

T l 4 Kri ri mi z iz n r iz f r z i ART1 r iz

In vivo ekspanzija i održavanje CART19 i migracija u kosnu srž

[0240] Smatra se da su CAR+ T ćelije umnožene upotrebom perli sa CD3/CD28 koje eksprimiraju signalni domen 4-1BB poboljšane u odnosu na receptore CAR kojima nedostaje 4-1BB. Q-PCR test je razvijen da omogući kvantitativno praćenje CART 19 ćelija u krvi i kosnoj srži. Svi pacijenti su imali ekspanziju i opstajanje CART19-ćelija u krvi najmanje 6 meseci kao što je prikazano na slikama 2A i 2C. Primetno, pacijenti UPN 01 i UPN 03 su imali povećanje od 1000 do 10000 puta CAR+ T ćelija u krvi tokom prvog meseca posle infuzije. Vršni nivoi ekspanzije koincidirali su sa nastupanjem kliničkih simptoma posle infuzije kod pacijenta UPN 01 (dan 15) i pacijenta UPN 03 (dan 23). Osim toga, nakon početnog opadanja koje može da se predstavi kinetikom prvog reda, nivoi CART19 T ćelija su se stabilizovali kod sva 3 pacijenta od 90. dana do 180. dana nakon infuzije. Značajno, ćelije CART19 T su takođe migrirale u kosnu srž kod svih pacijenata, iako na 5 do 10 puta nižim nivoima nego što je to primećeno u krvi kao što je prikazano na slikama 2D do 2F. Pacijenti UPN 01 i 03 su imali log-linearni pad u kosnoj srži, sa nestankom T1⁄2 od ~35 dana.

Indukcija specifičnih imunskih odgovora u odeljcima krvi i kosne srži nakon infuzije CART19

[0241] Uzorci seruma svih pacijenata su sakupljeni i ispitivani po serijama da bi se kvantitativno odredili nivoi citokina, procenjujući panel citokina, hemokina, i drugih pogodnih faktora za procenu moguih toksičnosti i da bi se obezbedio dokaz uloge CART19 ćelije kao što je prikazano na slici 3. Od trideset ispitanih analita, jedanaest je imalo 3-struku ili veću promenu u odnosu na polaznu vrednost, uključujući 4 citokina (IL-6, INF-γ, IL-8 i IL-10), 5 hemokina (MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, CXCL9, CXCL10) i rastvorne receptore za IL-1Rα i IL-2Rα. Od njih, interferon-γ je imao najveću relativnu promenu u odnosu na polaznu vrednost. Zanimljivo, vreme postizanja vršne vrednosti porasta citokina kod UPN 01 i UPN 03 bilo je u vremenskoj korelaciji sa prethodno opisanim kliničkim simptomima i vršnim vrednostima CART19 ćelija u krvi kod svakog pacijenta. Samo umerene promene su primećene kod pacijenta UPN 02, moguće kao rezultat lečenja kortikosteroidima datim ovom pacijentu. Porast rastvornog IL-2 nije detektovan u serumu pacijenata, iako je jedan od predkliničkih razloga za razvoj CAR+ T ćelija sa 4-1BB signalnim domenima bila smanjena sklonost ka pokretanju sekrecije IL-2 u poređenju sa CD28 signalnim domenima (Milone et al., 2009, Mol Ther. 17:1453-1464). Ovo može da bude značajno za dugoročnu kliničku aktivnost, s obzirom da su prethodna ispitivanja pokazala da CAR+ T ćelije potencijalno podležu supresiji regulatornim T ćelijama (Lee et al., 2011, Cancer Res 71:2871-2881), ćelijama koje bi mogle biti izazvane receptorima CAR da sekretuju značajne količine IL-2, ili obezbeđivanjem egzogenog IL-2 posle infuzije. Konačno, snažna indukcija sekrecije citokina u supernatantima aspirata kosne srži kod UPN 03 primećena je kao što je prikazano na slici 3D koja je takođe koincidirala sa razvojem sindroma lezije tumora i potpune remisije.

Produžena ekspresija i uspostavljanje populacije memorijskih CART19 ćelija u krvi [0242] Centralno pitanje u imunoterapiji kancera posredovanoj sa CAR je da li optimizovana proizvodnja ćelija i kostimulacioni domeni produžavaju opstajanje genetski modifikovanih T ćelija i omogućavaju uspostavljanje CAR+ memorijskih T ćelija kod pacijenata. Prethodna ispitivanja nisu pokazala snažnu ekspanziju, produženo opstajanje i/ili ekspresiju receptora CAR na T ćelijama nakon infuzije (Kershaw et al., 2006, Clin Cancer Res 12:6106-6115; Lamers et al., 2006, J Clin Oncol 24:e20-e22; Till et al., 2008, Blood, 112, 2261-2271; Savoldo et al., 2011, J Clin Invest doi:10.1172/JC146110). Ispitivanja uzoraka i iz krvi i iz kosne srži protočnom citometrijom za 169 dana posle infuzije otkrila su prisustvo CAR19 koje eksprimiraju ćelije kod UPN 03 (slike 4A i 4B), i odsustvo B ćelija kao što je prikazano na slici 4A. Značajno, prema testu QPCR, sva tri pacijenta imaju perzistentne CAR+ ćelije 4 meseca i duže, kao što je prikazano na slici 2 i slici 6. In vivo učestalost CAR+ ćelija određena protočnom citometrijom dobro odgovara vrednostima dobijenim PCR testom za CART19 transgen. Značajno, kod pacijenta UPN 03, samo CD3+ ćelije su eksprimirale CAR19, budući da CAR 19+ ćelije nisu bile detektabilne u podsetovima pozitivnim na CD16 ili CD14 kao što je prikazano na slici 4A. Ekspresija CAR je takođe detektovana na površini 4.2% T ćelija u krvi pacijenta UPN 0171. dana posle infuzije kao što je prikazano na slici 7.

[0243] Dalje, polihromatska protočna citometrija je korišćena za izvođenje detaljnih ispitivanja za dalju karakterizaciju ekspresije, fenotipa, i funkcije CART19 ćelija kod UPN 03 upotrebom anti-CAR idiotipskog antitela (MDA-647) i strategijom odabira prikazanom na slici 8. Značajne razlike u ekspresiji memorijskih i aktivacionih markera kod CD8+ i CD4+ ćelija na osnovu ekspresije CAR 19 su primećene. Na dan 56, CART 19 CD8+ ćelije su prikazivale primarno efektorski memorijski fenotip (CCR7-CD27-CD28-) dosledno sa produženim i intenzivnim izlaganjem antigenu kao što je prikazano na slici 4C. Nasuprot, CAR-negativne CD8+ ćelije su se sastojale od mešavine ćelija sa efektorskom i centralnom memorijom, sa ekspresijom CCR7 u podsetu ćelija, i znatnim brojem u frakcijama CD27+/CD28-i CD27+/CD28+. Dok su i CART19 i CAR-negativne ćelijske populacije značajno ispoljavale CD57, ovaj molekul je bio podjednako koeksprimiran sa PD-1 u CART19 ćelijama, što je mogući odraz ekstenzivne replikativne prošlosti ovih ćelija. Nasuprot CAR-negativnoj ćelijskoj populaciji, kod ukupne CART19 CD8+ populacije nedostajala je ekspresija i CD25 i CD127. Do 169. dana, dok je fenotip CAR-negativne ćelijske populacije ostao sličan uzorku od 56. dana, CART19 populacija je evoluirala tako da sadrži manjinu populacije sa osobinama ćelija sa centralnom memorijom, značajnom ekspresijom CCR7, višim nivoima CD27 i CD28, kao i CAR+ ćelija koje su bile PD-1-negativne, CD57-negativne i CD 127- pozitivne.

[0244] U odeljku CD4+, 56. dana CART 19 ćelije su se karakterisale ravnomernim nedostatkom CCR7 i dominancijom CD27+/CD28+/PD-1+ ćelija raspoređenih u oba odeljka CD57+ i -, i suštinskim odsustvom ekspresije CD25 i CD127 kao što je prikazano na slici 4B. Nasuprot tome, CAR-negativne ćelije u ovom vremenskom trenutku su bile heterogene prema ekspresiji CCR7, CD27 i PD-1, eksprimirale su CD127 i takođe sadržale značajnu populaciju CD25+/CD127-(potencijalno regulatorna T ćelija). Do dana 169, dok je ekspresija CD28 ostala ravnomerno pozitivna kod svih CAR+CD4+ćelija, frakcija CART19 CD4+ ćelija je evoluirala ka fenotipu centralne memorije sa ekspresijom CCR7, višim procentom CD27-ćelija, pojavom PD-1-negativnog podseta, i sticanjem ekspresije CD127. CAR-negativne ćelije su ostale prilično konzistentne sa njihovim odeljcima na dan 56, sa izuzetkom smanjenja ekspresije CD27 i smanjenja procenta CD25+/CD127-ćelija.

CART19 ćelije mogu da zadrže efektorsku funkciju nakon 6 meseci u krvi

[0245] Pored kratkog održavanja i neadekvatne proliferacije in vivo, ograničenja prethodnih ispitivanja sa CAR+ T ćelijama su bila brzi gubitak funkcionalne aktivnosti T ćelija primenjenih infuzijom in vivo. Visok nivo održavanja CART19 ćelija i površinska ekspresija CAR19 molekula kod pacijenta UPN 01 i 03 pružila je mogućnost da se direktno ispitaju anti-CD 19-specifične efektorske funkcije u ćelijama dobijenim iz kriokonzervisanih uzoraka periferne krvi. PBMC pacijenta UPN 03 su gajeni sa ciljnim ćelijama koje su bile ili pozitivne ili negativne za ekspresiju CD 19 (slika 4d). Snažna CD19-specifična efektorska funkcija CART19 T ćelija je pokazana specifičnom degranulacijom protiv CD19-pozitivnih, ali ne i protiv CD19-negativnih ciljnih ćelija, kao što je procenjeno površinskom ekspresijom CD107a. Značajno, izlaganje CART19 populacije CD19-pozitivnim ciljnim ćelijama indukovalo je brzu internalizaciju površinskog CAR-19, kao što je prikazano na slici 8 za površinsku ekspresiju CAR 19 u istim efektorskim ćelijama pomoću standardnog bojenja protočne citometrije. Prisustvo kostimulatornih molekula na ciljnim ćelijama nije bilo potrebno za pokretanje degranulacije CART19 ćelija jer NALM-6 linija ne eksprimira CD80 ili CD86 (Brentjens et al., 2007, Clin Cancer Res 13:5426-5435). Efektorska funkcija je bila očigledna 56. dana posle infuzije i očuvana je u vremenskoj tački 169. dan. Snažna efektorska funkcija CAR+ i CAR-T ćelija takođe može da se pokaže farmakološkom stimulacijom.

Klinička aktivnost CART19 ćelija

[0246] Tokom četiri dana nakon infuzije nije primećena značajna toksičnost ni kod jednog pacijenta, osim prolaznih febrilnih reakcija. Međutim, svi pacijenti su naknadno razvili značajnu kliničku i laboratorijsku toksičnost između 7. i 21. dana nakon prve infuzije. Ove toksičnosti su bile kratkotrajne i reverzibilne. Od tri pacijenta lečena do danas, prema standardnom kriterijumu bilo je 2 CRs i 1 PR za >6 meseci nakon CART19 infuzije (Hallek et al., 2008, Blood 111:5446). Detalji anamneze i odgovora na terapiju za svakog pacijenta opisani su na slici 10.

[0247] Ukratko, pacijent UPN 01 je razvio febrilni sindrom, sa rigorom i prolaznom hipotenzijom počevši od 10 dana nakon infuzije. Groznica je trajala približno 2 nedelje i povukla se; pacijent nije imao dodatne konstitucionalne simptome. Pacijent je postigao brz i potpun odgovor kao što je prikazano na slici 5. Između 1 i 6 meseci nakon infuzije, nisu detektovane cirkulišuće CLL ćelije u krvi pomoću protočne citometrije. Kosna srž 1, 3, i 6 meseci nakon infuzije CART19 ćelija pokazuje produženo odsustvo limfocitne infiltracije prema morfološkom, i prema ispitivanju protočnom citometrijom kao što je prikazano na slici 5B. CT skenovi posle 1 i 3 meseca nakon infuzije pokazuju povlačenje adenopatije kao što je prikazano na slici 5C. Potpuna remisija je bila neprekidna više od 10 meseci u vreme izrade ovog izveštaja.

[0248] Pacijent UPN 02 je lečen sa 2 ciklusa bendamustina sa rituksimabom što je rezultovalo u stabilnoj bolesti kao što je prikazano na slici 5A. Pacijent je primio treću dozu bendamustina kao hemoterapiju za smanjenje broja limfocita pre infuzije CART19 T ćelija. Pacijent je razvio povišenu temperaturu do 40°C, rigor i dispneju koja je zahtevala hospitalizaciju od 24 časa 11. dana nakon prve infuzije i na dan druge infuzije CART19 ćelija. Groznica i konstitucionalni simptomi su postojali i 15. dana, pacijent je imao prolaznu srčanu disfunkciju; svi simptomi su se povukli nakon što je kortikosteroidna terapija započeta 18. dana. Nakon infuzije CART 19, i koincidencije sa početkom jake groznice, kod pacijenta je primećeno brzo izlučivanje p53-deficitarnih CLL ćelija iz periferne krv kao što je prikazano na slici 5A i delimično smanjenje adenopatije, kosna srž je pokazala perzistentnu ekstenzivnu infiltraciju ćelijama CLL mesec dana nakon terapija, uprkos dramatičnom smanjenju broja ćelija periferne krvi. Pacijent i dalje nije ispoljavao simptome.

[0249] Pacijent UPN 03 je primio pentostatin i ciklofosfamid kao hemoterapiju za smanjenje brija limfocita pre infuzije CART19 T ćelija. Tri dana nakon hemoterapije, ali pre infuzije ćelija, kosna srž je bila hipercelularna (60%) sa zastupljenošću CLL od približno 50%. Pacijent je primio nisku dozu CART19 ćelija (1.5x10<5>CAR+ T ćelija/kg podeljenu na 3 dana). Ponovo, nije bilo akutne toksičnosti povezane sa infuzijom. Međutim, 14 dana nakon prve infuzije, pacijent je počeo da ispoljava rigor, groznicu, mučninu i dijareju. Do dana 22 nakon infuzije, sindrom lezije tumora je dijagnostikovan i zahtevao je hospitalizaciju. Kod pacijenta su se povukli konstitucionalni simptomi, i u okviru 1 meseca od infuzija CART19, kod pacijenta je primećeno izlučivanje cirkulišuće CLL iz krvi i kosne srži pomoću morfološkog ispitivanja, protočne citometrije, citogenetske, i FISH analize. CT skenovi su pokazali povlačenje abnormalne adenopatije kao što je prikazano na slikama 5B i 5C. Potpuna remisija se održala više od 8 meseci od početne infuzije CART19 ćelija.

Razmatranja in vivo odnosa CART19 efektorskih ćelija prema CLL ciljnoj ćelijami [0250] Predklinička ispitivanja su pokazala da veliki tumori mogu da se otklone, i da infuzija 2.2x10<7>CARs može da iskoreni tumore sačinjene od 1x10<9>ćelija, pri in vivo E:T odnosu od 1:42 u humanizovanim miševima (Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci U S A 106:3360-3365), mada ova izračunavanja nisu uzela u obzir ekspanziju T ćelija nakon injekcje. Procena CLL tumorskog opterećenja tokom vremena omogućila je izračunavanje smanjenja tumora i procenu odnosa CART19 E:T postignutih in vivo kod tri subjekta na osnovu broja CAR+ T ćelija primenjenih infuzijom. Tumorska opterećenja su izračunata merenjem CLL opterećenja u kosnoj srži, krvi i sekundarnim limfoidnim tkivima. Polazna tumorska opterećenja kao što je pokazano na slici 10 ukazuju na to da je svaki pacijent imao red veličine od 10<12>CLL ćelija (tj.1 kilogram tumorskog opterećenja) pre infuzije CART19. Pacijent UPN 03 je imao procenjeno polazno tumorsko opterećenje 8.8x10<11>CLL ćelija u kosnoj srži na dan -1 (tj. posle hemoterapije i pre infuzije CART19), i izmerenu masu tumora u sekundarnim limfoidnim tkivima od 3.3 -5.5x10<11>CLL ćelija, u zavisnosti od postupka volumetrijske CT sken analize. S obzirom da je kod UPN 03 primenjena infuzija sa samo 1.4x107 CART19 ćelija, upotrebom procene početnog ukupnog tumorskog opterećenja (1.3x1012 CLL ćelija), i toga da CLL ćelije nisu detektabilne posle lečenja, postignut je upečatljiv odnos E:T od 1:93000. Sličnim izračunavanjima, efektivan odnos E:T in vivo od 1:2200 i 1:1000 je izračunat za UPN 01 i UPN 02 kao što je prikazano u tabeli 3). Na kraju, verovatno je serija uništavanja CART19 T ćelijama, kombinovana sa in vivo ekspanzijom CART19 od >1 000 puta, doprinela snažnom anti-leukemijskom dejstvu posredovanom CART19 ćelijama.

T ćelije koje eksprimiraju himerne receptore uspostavljaju memoriju i snažno anti-tumorsko dejstvo kod pacijenata sa uznapredovalom leukemijom

[0251] Ograničena in vivo ekspresija i efektorska funkcija receptora CAR bila je centralno ograničenje u probnim ispitivanjima prve generacije receptora CAR (Kershaw et al., 2006, Clin Cancer Res 12:6106-6115; Lamers et al., 2006, J Clin Oncol 24:e20-e22; Till et al., 2008, Blood, 112, 2261-2271; Park et al., 2007, Mol Ther 15:825833; Pule et al., 2008, Nat Med 14:1264-1270). Zasnovani na predkliničkom modelu koji pokazuje produženo održavanje receptora CAR koji sadrže signalni modul 4-1BB (Milone et al., 2009, Mol Ther.

17:1453-1464; Carpenito et al., 2009, Proc Natl Acad Sci U S A 106:3360-3365), eksperimenti su dizajnirani da razviju drugu generaciju receptora CAR modifikovanih tehnologijom lentiviralnog vektora. Nađeno je da je ova druga generacija receptora CAR bezbedna u okruženju hronične HIV infekcije (Levine et al., 2006, Proc Natl Acad Sci U S A 103:17372-17377). Prikazani rezultati pokazuju da kada je ova druga generacija CAR bila eksprimirana u T ćelijama i gajena pod uslovima dizajniranim da promovišu usađivanje centralne memorije T ćelija (Rapoport et al., 2005, Nat Med 11:1230-1237; Bondanza et al., 2006, Blood 107:1828-1836), primećena je poboljšana ekspanziju CAR T ćelija nakon infuzije u odnosu na prethodne izveštaje. CART 19 ćelije su uspostavile CD19-specifičnu ćelijsku memoriju, i ubile tumorske ćelije pri odnosu E:T in vivo koji ranije nije postignut.

1

[0252] CART 19 je prvi pokušaj ugradnje 4-1BB signalnog domena u CAR i prva upotreba tehnologije lentiviralnog vektora. Prikazani rezultati pokazuju efikasan prelazak receptora CAR na pozicije tumora, sa de facto uspostavljanjem "limfocita koji infiltriraju tumor" koji ispoljavaju specifičnost za CD19. Izražena in vivo ekspanzija omogućila je da se prvi put pokaže da receptori CAR direktno izdvojeni iz organizma pacijenta mogu da zadrže efektorsku funkciju in vivo mesecima. Prethodno ispitivanje je sugerisalo da je uvođenje prve generacije CAR u virus specifične T ćelije poželjnije od uvođenja u primarne T ćelije (Pule et al., 2008, Nat Med 14:1264-1270), međutim rezultati sa drugom generacijom receptora CAR uvedenih u optimalno kostimulisane primarne T ćelije dovode ovaj zaključak u pitanje. Bez želje za vezivanjem za određenu teoriju, pojavljuje se upozorenje da su klinička dejstva bila potpuna i bez presedana sa lizom tumorskih opterećenja težine izražene u kilogramima, kod sva tri pacijenta praćenom odloženim oslobađanjem potencijalno opasno visokih nivoa citokina kod dva pacijenta. Dejstva klasične citokinske oluje nisu primećena. Međutim, predmetno ispitivanje je dizajnirano da ovu mogućnost ublaži promišljenom infuzijom CART19 tokom perioda od tri dana.

[0253] Nađeno je da veoma niske doze receptora CAR mogu da izazovu snažne kliničke odgovore. Pilot ispitivanje je pokazalo bezbednost dizajna CART19 vektora. Zapažanje da doze CART19 ćelija nekoliko redova veličina manje od onih koje su ispitivane u prethodnim ispitivanjima mogu da imaju klinički efekat može da ima značajne implikacije na buduću primenu CAR terapije na široj skali, i na dizajn ispitivanja receptora CAR usmerenih protiv ciljeva koji nisu CD19.

[0254] Predmetna ispitivanja dodatno ukazuju da je CART19 eksprimiran i u T ćelijama sa centralnom memorijom i u efektorskim T ćelijama, i ovo verovatno doprinosi njihovom dugotrajnom preživljavanju u poređenju sa prethodnim izveštajima. Bez želje da se vezuje za neku posebnu teoriju, CAR T ćelije mogu da diferenciraju in vivo u stanje slično centralnoj memoriji nakon susreta i naknadne eliminacije ciljnih ćelija (npr. tumorskih ćelija CLL ili normalnih B ćelija) koje eksprimiraju zamenski antigen. Zaista, objavljeno je da signal koji potiče od 4-1BB promoviše razvoj memorije u kontekstu prenosa signala putem TCR (Sabbagh et al., 2007, Trends Immunol 28:333-339).

[0255] Produžena proliferacija i preživljavanje CART19 otkrilo je aspekte farmakokinetike CAR T ćelija koji nisu ranije bili objavljeni. Primećeno je da je kinetika oslobađanja citokina u serumu i kosnoj srži u korelaciji sa vršnim nivoima CART19, tako da je moguće da je propadanje inicirano kada ciljne ćelije koje eksprimiraju CD19 postanu ograničene. Mehanizam produženog preživljavanja CART19 može da se poveže sa gorepomenutom

2

ugradnjom 4-1BB domena ili sa prenosom signala preko prirodnog TCR i/ili CAR. Zanimljiva mogućnost je to da je produženo preživljavanje povezano sa populacijom CART19 koja je identifikovana u uzorcima kosne srži, stvarajući pretpostavku da CD19 CAR može da se održava posredstvom susreta sa progenitorskim B ćelijama u kosnoj srži. U vezi sa ovim, postavlja se pitanje šta pokreće početnu ekspanziju CART 19 ćelija in vivo? Sa retkim izuzecima (Savoldo et al., 2011, J Clin Invest doi:10.1172/JCI46110; Pule et al., 2008, Nat Med 14:1264-1270), ovo ispitivanje je jedino ispitivanje koje je izostavilo infuzije IL-2, tako da se CART19 ćelije verovatno ili umnožavaju kao odgovor na homeostatičke citokine ili verovatnije, na CD19 eksprimiran na leukemijskim ciljnim ćelijama i/ili normalnim B ćelijama. U drugom slučaju, ovo bi mogla da bude privlačna osobina receptora CAR usmerenih protiv ciljeva na normalnim APCs kao što su CD19 i CD20, budući da je moguće da se samo-obnova CART19 događa na normalnim ćelijama, obezbeđujući mehanizam memorije CAR putem "samo-vakcinacije/pojačavanja" i time, dugotrajan imunološki nadzor nad tumorom. Mehanizmi homeostaze CART19 mogu da zahtevaju dodatno ispitivanje za razjašnjavanje unutrašnjih i spoljašnjih mehanizama održavanja ćelija. Pre ovih rezultata, većina istraživača je videla terapiju upotrebom CAR kao prelazni oblik imunoterapije, međutim receptori CAR sa optimizovanim signalnim domenima mogu da imaju ulogu i u indukciji i obrazovanju remisije, kao i u dugotrajnom imunološkom nadzoru.

[0256] Snažna anti-leukemijska dejstva su primećena kod sva tri pacijenta, uključujući dva pacijenta sa leukemijom u kojoj se javlja nedostatak p53. Prethodna ispitivanja sa CAR receptorima su imala teškoću u razdvajanju antitumorskih dejstava od hemoterapije za smanjenje broja limfocita. Međutim, odloženo oslobađane citokina kombinovano sa kinetikom lize tumora kod pacijenata otpornih na fludarabin koje koincidira, i moguće zavisi od in vivo ekspanzije CAR u predmetnom ispitivanju, ukazuje na to da CART19 posreduje u snažnim antitumorskim dejstvima. Prikazani rezultati ne isključuju ulogu hemoterapije u potenciranju dejstva CAR receptora.

[0257] Temeljno poređenje vektora, transgena i postupaka za proizvodnju ćelija sa rezultatima tekućih ispitivanja u drugim centrima će možda biti potrebno da bi se postiglo potpuno razumevanje ključnih karakteristika potrebnih za dobijanje neprekidne funkcije CAR T ćelija in vivo. Za razliku od terapija antitelom, T ćelije modifikovane pomoću CAR imaju mogućnost da se repliciraju in vivo, i njihov dugotrajni opstanak bi mogao da vodi dugotrajnoj kontroli tumora. Dostupnost gotove terapije sačinjene od T ćelija-ubica bez unakrsne rezistencije ima mogućnost da poboljša izglede pacijenata sa B ćelijskim malignitetima. Ograničenje terapije antitelom, kao na primer, sredstvima kao što je rituksimab i bevicizumab, je to što terapija zahteva ponovljene infuzije antitela, što je neugodno i skupo. Uvođenje produžene terapije antitelom (u ovom slučaju najmanje 6 meseci kod 3 od 3 do danas lečena pacijenta) sa anti-CD19 scFv eksprimiranim na T ćelijama nakon jednokratne infuzije CART19 ćelija ima brojne praktične prednosti, uključujući veću udobnost za pacijenta i manje troškove.

Primer 2: T ćelije modifikovane himernim receptorom za antigen u hroničnoj limfoidnoj leukemiji

[0258] Dizajniran je lentiviralni vektor koji eksprimira himerni receptor za antigen sa specifičnošću za B-ćelijski antigen CD19, kuplovan sa CD137 (kostimulatornim receptorom u T ćelijama [4-1BB]) i signalnim domenima CD3-zeta (komponenta T-ćelijskog receptora za antigen koja prenosi signal). Primećeno je da se niska doza (približno 1.5x10<5>ćelija po kilogramu telesne težine) autolognih T ćelija modifikovanih himernim receptorom za antigen primenjena ponovnom infuzijom kod pacijenta sa refraktornom hroničnom limfocitnom leukemijom (CLL) umnožava in vivo do nivoa koji je više od 1000 viši od polaznog nivoa usađenih ćelija. Takođe je primećeno da pacijent ispoljava odloženi razvoj sindroma lize tumora i potpunu remisiju.

[0259] Pored sindroma lize tumora, jedini drugi toksični efekat stepena 3/4 povezan sa T ćelijama sa himernim receptorom za antigen bio je limfopenija. Modifikovane ćelije su ostajale na visokim nivoima najmanje 6 meseci u krvi i kosnoj srži i nastavljale da eksprimiraju himerni receptor za antigen. Specifični imunski odgovor je detektovan u kosnoj srži, praćen gubitkom normalnih B ćelija i leukemijskih ćelija koje eksprimiraju CD19. Remisija se nastavila u toku 10 meseci nakon lečenja. Hipogamaglobulinemija je bila očekivani hronični toksični efekat.

[0260] Materijali i postupci uključeni u ove eksperimente su opisani u nastavku.

Materijali i postupci

Postupci ispitivanja

[0261] Dizajniran je samoinaktivirajući lentiviralni vektor (GeMCRIS 0607-793), koji je podvrgnut predkliničkom ispitivanju bezbednosti, kao što je prethodno objavljeno (Milone et al., 2009, Mol Ther, 17: 1453-64). Postupci za pripremu T-ćelija su takođe prethodno opisani (Porter et al, 2006, Blood, 107:1325-31). Da bi se detektovale T ćelije sa himernim receptorom za antigen u krvi i kosnoj srži izvedena je kvantitativna reakcija lančane polimeraze (PCR). Donja granica kvantifikacije je određena iz standardne krive; srednje

4

vrednosti ispod donje granice kvantifikacije (tj., određene, ali ne podležu kvantifikaciji) smatrane su približnim. Donja granica kvantifikacije testa bila je 25 kopija po mikrogramu genomiske DNK.

[0262] Ispitivanje rastvornih faktora izvedeno je upotrebom seruma iz pune krvi i kosne srži koja je bila odvojena u alikvote za jednokratnu upotrebu i skladištena na -80°C. Kvantifikacija rastvornih citokinskih faktora izvedena je upotrebom tehnologije i reagenasa Luminex nizova mikroperli (Life Technologies).

Afereza #1

[0263] Postupak za aferezu od 12-15 litara sproveden je u centru za aferezu. Tokom ovog postupka, dobijene su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) za proizvodnju CART-19 T ćelija. Iz jedne leukafereze, sakupleno je najmanje 50 x 10<9>belih krvnih ćelija za proizvodnju CART-19 T ćelija. Polazni leukociti krvi su takođe dobijeni i kriokonzervisani.

Hemoterapija za smanjenje broja ćelija

[0264] Hemoterapija je započeta približno 5-10 dana pre infuzije tako da CART-19 ćelije mogu da se daju 1-2 dana nakon završetka hemoterapije. Vreme započinjanja hemoterapije stoga zavisi od dužine režima. Svrha hemoterapije je da indukuje limfopeniju u cilju olakšavanja usađivanja i homeostatske ekspanzije CART-19 ćelija. Hemoterapija može takođe da bude izabrana da smanji tumorsko opterećenje bolesti. Hemoterapiju za smanjenje broja ćelija biraju i primenjuju nadležni onkolozi. Izbor hemoterapije zavisi od osnovne bolesti pacijenata i prethodnih terapija koje su primali. Fludarabin (30 mg/m2/dan x 3 dana) i ciklofosfamid (300 mg/m2/dan x 3 dana) su sredstva izbora, s obzirom da u toj oblasti najviše iskustva ima sa korišćenjem ovih sredstava u olakšavanju adoptivne imunoterapije. Nekoliko drugih prihvatljivih režima koji obuhvataju primenu lekova odobrenih od strane FDA su pogodni, uključujući CHOP, HyperCVAD, EPOCH, DHAP, ICE ili druge režime.

Ponovna procena

[0265] Na kraju hemoterapije izvodi se ograničena ponovna procena stadijuma u cilju obezbeđivanja mera polaznog tumorskog opterećenja. Ovo uključuje snimanje, medicinski pregled, i procene minimalne preostale bolesti (MRD). Subjekti prolaze sledeće u cilju ispitivanja pre infuzije: medicinski pregled, dokumentovanje neželjenih događaja i vađenje krvi za hematološko, hemijsko ispitivanje i test za utvrđivanje trudnoće (ako je primenljivo).

Priprema CART-19 T ćelija

[0266] Autologne T ćelije su modifikovane tako da eksprimiraju vanćelijsko jednolančano antitelo (scFv) sa specifičnošću za CD19. Vanćelijski scFv može da preusmeri specifičnost transdukovanih T ćelija prema ćelijama koje eksprimiraju CD19, molekul koji se ograničeno eksprimira na površini malignih ćelija i na normalnim B ćelijama. Pored CD19 scFv, ćelije su transdukovane da eksprimiraju unutarćelijski signalni molekul sačinjen od TCRζ lanca ili tandem signalnog domena sačinjenog od signalnih modula 4-1BB i TCRζ. scFv je izveden iz mišjeg monoklonskog antitela, i stoga sadrži mišje sekvence, a signalni domeni imaju u potpunosti prirodne humane sekvence. CART-19 T ćelije se proizvode izolovanjem T ćelija aferezom, i upotrebom tehnologije lentiviralnog vektora (Dropulic et al., 2006, Human Gene Therapy, 17: 577-88; Naldini et al., 1996, Science, 272: 263-7; Dull et al., 1998, J Virol, 72: 8463-71) za uvođenje scFv:TCRζ:4-1BB u CD4 i CD8 T ćelije. Kod nekih pacijenata, kontrolna scFv:TCRζ: se uvodi u deo ćelija za eksperiment kompetitivne repopulacije. Ovi receptori su "univerzalni" po tome što mogu da vežu antigen na način nezavisan od MHC, stoga, jedan receptorski konstrukt može da se koristi za lečenje populacije pacijenata sa CD19 antigen-pozitivnim tumorima.

[0267] CAR konstrukti su razvijeni na Univerzitetu Pensilvanije i vektor kliničkog stepena je proizveden u Lentigen Corporation. CART-19 ćelije su proizvedene u Clinical Cell and Vaccine Production Facility Univerziteta Pensilvanije prema postupku opisanom na slici 11. Po završetku gajenja ćelija, ćelije su kriokonzervisane u infuzibilnom kriomedijumu. Jedna doza T ćelija transdukovanih sa CART-19 koja sačinjava infuziju od 2.5 x 10<9>do 5 x 10<9>ćelija ukupno, primenjuje se u 1 ili 2 kese. Svaka kesa sadrži alikvot (zapremina zavisi od upotrebe) kriomedijuma koji sadrže sledeće sastojke odgovarajućeg stepena za infuziju (% zapr/zapr): 31.25 plasmalyte-A, 31.25 dekstrozu (5%), 0.45 NaCl, do 7.50 DMSO, 1.00 dekstran 40, 5.00 humani serum albumin sa približno 2.5-5 x 10<9>autolognih T ćelija po kesi. Zbog povećane bezbednosti, prva doza se daje kao podeljena doza nultog, 1. i 2. dana sa ~10% ćelija nultog dana, 30% 1. dana, i 60% 2. dana.

Skladištenje

[0268] Kese (kapaciteta 10 do 100 ml) koje sadrže T ćelije transdukovane sa CART-19 se skladište u uslovima banke krvi u zamrzivaču na -135°C čiji se uslovi prate. Infuzijske kese se skladište u zamrzivaču do upotrebe.

Odmrzavanje ćelija

[0269] Nakon registracije ćelija u istraživačkoj apoteci, zamrznute ćelije se transportuju na suvom ledu do postelje subjekta. Ćelije se odmrzavaju pored postelje jedna po jedna upotrebom vodenog kupatila koje se održava na 36°C do 38°C. Kesa se blago masira dok se ćelije ne odmrznu. U kontejneru ne treba da ostanu smrznute grudvice. Ako proizvod CART-19 ćelija izgleda kao da ima oštećenu kesu ili kesu koja curi, ili izgleda narušeno na drugi način, ne treba da se upotrebi za infuziju.

Premedikacija

[0270] Sporedna dejstva koja prate infuzije T ćelija mogu da uključuju prolaznu groznicu, drhtavice, i/ili mučninu. Preporučljivo je da subjekat dobije premedikaciju acetaminofenom od 650 mg oralno i difenhidramin hidrohloridom od 25-50 mg oralno ili IV, pre infuzije CART-19 ćelija. Ovi lekovi mogu da se ponavljaju svakih šest časova po potrebi. Kura nesteroidnog antiinflamatornog lečenja može da bude prepisana ako pacijent nastavlja da ima groznicu koju ne otklanja acetaminofen. Preporučljivo je da pacijenti ne primaju sistemske kortikosteroide kao što je hidrokortizon, prednizon, prednizolon (Solu-Medrol) ili deksametazon (Decadron) u bilo kom trenutku, osim u slučaju opasnosti po život, jer to može negativno da utiče na T ćelije. Ako su kortikosteroidi potrebni zbog akutne reakcije na infuziju, preporučuje se početna doza hidrokortizona od 100 mg.

Primena/infuzija

[0271] Infuzije počinju 1 do 2 dana nakon završetka hemoterapije. Na dan prvih infuzija, pacijentima se radi kompletna krvna slika sa leukocitarnom formulom, i procena količine CD3, CD4 i CD8 budući da se hemoterapija daje delimično da bi indukovala limfopeniju. Bez želje da se vezuje za neku posebnu teoriju, veruje se da je početna i.v. doza od 2.5-5x10<9>CART-19 ćelija optimalna za ovaj protokol, jer zdrava odrasla osoba ima oko 1 x 10<12>T ćelija, predložena ukupna doza je ekvivalentna oko 0.5% ukupne telesne mase T ćelija (Roedere, 1995, Nat Med, 1: 621-7; Macallan et al., 2003, Eur J Immunol, 33; 2316-26). Prva doza se primenjuje upotrebom podeljene doze nultog (10%), 1. (30%) i 2. (60%) dana. Subjekti primaju infuziju u izolovanoj prostoriji. Ćelije se odmrzavaju pored postelje pacijenta kao što je ovde opisano na drugom mestu. Odmrznute ćelije se daju kroz infuziju onolikom brzinom koliko pacijent podnosi tako da je trajanje infuzije približno 10-15 minuta. Transdukovane T ćelije se primenjuju brzom intravenskom infuzijom brzinom od približno 10 mL do 20 mL po minutu kroz sistem za krv Y-tipa od 18 godža bez lateksa sa trokrakim sigurnosnim ventilom. Trajanje infuzije je približno 15 minuta. Jedna ili dve kese ćelija modifikovanih sa CART-19 se dostavljaju na ledu, i ćelije se primenjuju kod subjekta dok su hladne. Kod subjekata koji primaju mešavine CART-19 ćelija, u cilju olakšanog mešanja, ćelije se primenjuju istovremeno upotrebom Y-adaptera. Subjekti primaju infuziju i premedikaciju kao što je ovde opisano na drugom mestu. Vitalni znaci subjekata se prate i pulsna oksimetrija se radi pre doziranja, na kraju infuzije i svakih 15 minuta nakon nje tokom 1 časa i sve dok ovi parametri ne budu stabilni i zadovoljavajući. Uzorak krvi za određivanje polaznog nivoa CART-19 se dobijaju pre infuzije i 20 minuta posle infuzije. Kod pacijenata kod kojih se javila toksičnost kod prethodnih hemoterapija za smanjenje broja ćelija odlože se raspored infuzija dok se ova toksičnost ne povuče. Konkretni toksični fenomeni zbog kojih se odlaže infuzija T ćelija uključuju: 1) plućni: potreba za dodatnim kiseonikom za održavanje zasićenja većeg od 95% ili prisustvo radiografskih abnormalnosti na snimku grudnog koša xzracima koje su progresivne; 2) srčani: nova srčana aritmija koja nije medicinski kontrolisana, 3) hipotenzija koja zahteva podršku pritiska; 4) aktivna infekcija: pozitivne kulture krvi na bakterje, gljive, ili viruse u okviru 48-časova od T ćelijske infuzije. Uzorak seruma za kalijum i mokraćnu kiselinu se uzima pre prve infuzije kao i dva časa nakon svake sledeće infuzije.

Laboratorijska ispitivanja posle infuzije za procenu usađivanja i perzistentnosti

[0272] Subjekti se vraćaju 4. i 10. dana nakon početne infuzije CART-19 ćelija da bi im se izvadila krv za određivanje nivoa serumskih citokina, i PCR CART-19 u cilju procene prisustva CART-19 ćelija. Subjekti se vraćaju jednom nedeljno tokom tri nedelje da bi prošli sledeće: medicinski pregled, dokumentovanje neželjenih događaja i vađenje krvi za hematološko, hemijsko, i ispitivanje usađivanja i perzistencije CART-19 ćelija, i laboratorijska ispitivanja.

Druga infuzija

[0273] Bez želje da se vezuje za neku posebnu teoriju, smatra se da druga doza CART-19 ćelija može da se da pacijentima11. dana, pod uslovom da nisu ispoljili odgovarajuću toleranciju na prvu dozu i da je proizvedeno dovoljno CART-19 ćelija. Doza je 2-5 x 10<9>ćelija ukupno. Uzorak seruma za kalijum i mokraćnu kiselinu može da se uzme dva časa nakon infuzije.

Druga afereza

[0274] Postupak za aferezu od 2 litara sproveden je u centru za aferezu, PBMC za istraživanje su dobijene i kriokonzervisane. Subjekti prolaze sledeće: medicinski pregled, dokumentovanje neželjenih događaja i vađenje krvi za hematološko, hemijsko, i ispitivanje usađivanja i perzistencije CART-19 ćelija, i laboratorijska ispitivanja. Dodatno se radi ponovna procena stadijuma u cilju obezbeđivanja obima tumorskog opterećenja. Testovi za ponovnu procenu stadijuma se određuju prema vrsti bolesti i uključuju snimanje, procene MRD, aspirat kosne srži i biopsiju i/ili biopsiju limfnog čvora.

Mesečne procene od 2 do 6 meseci nakon infuzije

[0275] Subjekti se vraćaju na mesečnoj bazi od 2 do 6 meseci posle CART-19 ćelijske infuzije. U ovim posetama u okviru ispitivanja, subjekti prolaze sledeće: medicinski pregled, dokumentovanje neželjenih događaja i vađenje krvi za hematološko, hemijsko, i ispitivanje usađivanja i perzistencije CART-19 ćelija, i laboratorijska ispitivanja. DNK test na HIV se izvodi u mesecima 2-6 posle CART-19 ćelijske infuzije da bi se isključilo prisustvo detektabilne RCL.

Tromesečne procene do 2 godine posle infuzije

[0276] Subjekti se procenjuju na tromesečnoj bazi do 2 godine posle infuzije. U ovim posetama u okviru ispitivanja, subjekti prolaze sledeće: medicinski pregled, dokumentovanje neželjenih događaja i vađenje krvi za hematološko, hemijsko, i ispitivanje usađivanja i perzistencije CART-19 ćelija, i laboratorijska ispitivanja. DNK test na HIV se izvodi 3 i 6 meseci posle CART-19 ćelijske infuzije da bi se isključilo prisustvo detektabilne RCL.

[0277] U nastavku su opisani rezultati eksperimenata.

Anamneza pacijenta

[0278] Pacijent je dobio dijagnozu CLL stadijuma I 1996. godine. Prvi put mu je bilo potrebno lečenje nakon 6 godina posmatranja zbog progresivne leukocitoze i adenopatije. Godine 2002, lečen je sa dva ciklusa rituksimaba plus fludarabina; ovo lečenje je rezultovalo u normalizaciji krvne slike i delimičnom povlačenju adenopatije. Godine 2006, primio je četiri ciklusa rituksimaba i fludarabina zbog progresije bolesti, ponovo sa normalizacijom krvne slike i delimičnom regresijom adenopatije. Ovaj odgovor je bio praćen 20-mesečnim intervalom bez progresije i intervalom od 2 godine bez lečenja. U februaru 2009, imao je naglo progresivnu leukocitozu i rekurentnu adenopatiju. Njegova kosna srž je bila ekstenzivno infiltrirana sa CLL. Citogenetska analiza je pokazala da je 3 od 15 ćelija sadržalo deleciju hromozoma 17p, i ispitivanje fluorescentnom in situ hibridizacijom (FISH) je pokazalo da 170 od 200 ćelija ima deleciju uključujući TP53 na hromozomu 17p. Pacijent je primio rituksimab sa bendamustinom u jednom ciklusu i tri dodatna ciklusa bendamastina bez rituksimaba (zbog ozbiljne alergijske reakcije). Ovo lečenje je rezultovalo samo u prolaznom poboljšanju limfocitoze. Progresivna adenopatija je dokumentovana pomoću kompjuterske tomografije (CT) nakon terapije.

[0279] Autologne T ćelije su sakupljene pomoću leukafereze i kriokonzervisane. Pacijent je zatim primao alemtuzumab (anti-CD52, zreli limfociti, površinski antigen) tokom 11 nedelja, sa poboljšanom hematopoezom i delimičnim povlačenjem adenopatije. Tokom sledećih 6 meseci, imao je stabilnu bolest sa perzistentnim, ekstenzivnim učešćem kosne srži i difuznom adenopatijom sa višestrukim limfnim čvorovima veličine 1 do 3 cm. U julu 2010, pacijent je uključen u fazu 1 kliničkog ispitivanja T ćelija modifikovanih himernim receptorom za antigen.

Infuzije ćelija

[0280] Autologne T ćelije dobijene od pacijenta su bile odmrznute i transdukovane lentivirusom tako da eksprimiraju CD19-specifični himerni receptor za antigen (slika 12A); identifikatori sekvence za lentiviralni vektor i relevantne sekvence su prikazane u tabeli 5. Četiri dana pre infuzije ćelija, pacijent je primio hemoterapiju namenjenu smanjenju broja limfocita (pentostatin u dozi od 4 mg po kvadratnom metru površine tela i ciklofosfamid u dozi od 600 mg po kvadratnom metru) bez rituksimaba (Lamanna et al,, 2006, J Clin Oncol, 24: 1575-81). Tri dana nakon hemoterapije ali pre infuzije ćelija, kosna srž je bila hipercelularna sa približno 40% učešća CLL. Leukemijske ćelije su eksprimirale kapa laki lanac i CD5, CD19, CD20, i CD23. Citogenetska analiza je pokazala dva odvojena klona, gde oba rezultuju gubitkom hromozoma 17p i lokusa TP53 (46,XY,del(17)(p12)[5]/46,XY,der(17)t(17;21)(q10;q10)[5]/46,XY[14]). Četiri dana nakon hemoterapije, pacijent je primio ukupno 3x108 T ćelija, od kojih je 5% bilo transdukovano, što je ukupno 1,42x10<7>transdukovanih ćelija (1,46x10<5>ćelija po kilogramu) podeljenu u tri konsekutivne dnevne intravenske infuzije (10% 1. dana, 30% 2. dana, i 60% 3. dana). Citokini nisu primenjeni posle infuzije. Nisu zabeležena nikakva toksična dejstva infuzija.

Klinički odgovor i procena

[0281] Četrnaest dana nakon prve infuzije, pacijent je počeo da ima drhtavice i povišenu temperaturu manjeg stepena udruženu sa zamorom 2. stepena. Tokom sledećih 5 dana, drhtavice su se intenzivirale, i njegova temperatura se povećala do 39.2°C (102.5°F), udružena sa rigorom, preznojavanjem, anoreksijom, mučninom, i dijarejom. Nije imao respiratorne ili srčane simptome. Zbog groznice je urađena radiografija grudnog koša i kulture krvi, urina i stolice, i sve su bile negativne ili normalne. Sindrom lize tumora je dijagnostikovan 22. dana nakon infuzije (slika 12B). Nivo mokraćne kiseline bio je 10.6 mg po decilitru (630.5 µmol po litru), nivo fosfora je bio 4.7 mg po decilitru (1.5 mmol po litru) (normalni opseg, 2.4 do 4.7 mg po decilitru [0.8 do 1.5 mmol po litru]), i nivo laktat dehidrogenaze je bio 1130 U po litru (normalni opseg, 98 do 192). Postojao je dokaz akutnog oštećenja bubrega, sa nivoom kreatinina od 2.60 mg po decilitru (229.8 µmol po litru) (polazni nivo, <1.0 mg po decilitru [<88.4 µmol po litru]). Pacijent je hospitalizovan i lečen zamenom fluida i razburikazom. Nivo mokraćne kiseline se vratio u normalni opseg u okviru

1

24 časa, a nivo kreatinina u okviru 3 dana; otpušten je iz bolnice 4. dana. Nivo laktat dehidrogenaze je postepeno opadao, postajući normalan tokom narednih meseci.

[0282] Do 28 dana nakon infuzije CART19-ćelija, adenopatija više nije bila palpabilna, i 23. dana, nije bilo dokaza CLL u kosnoj srži (slika 12C). Kariotip je sada bio normalan u 15 od 15 ćelija (46,XY), i ispitivanje pomoću FISH metode ja bilo negativno za deleciju TP53 u 198 od 200 ispitanih ćelija; što se smatra nalazom u granicama normale u negativnim kontrolama. Ispitivanje protočnom citometrijom nije pokazalo rezidualnu CLL, i B ćelije nisu bile detektabilne (<1% ćelija unutar prozora za razdvajanje za CD5+CD10-CD19+CD23+ limfocita). CT skeniranje sprovedeno 31. dana nakon infuzije pokazalo je povlačenje adenopatije (slika 12D).

[0283] Tri i šest meseci nakon infuzije CART19 ćelija, medicinski pregled je ostao nepromenjen, bez palpabilne adenopatije, i CT skeniranje izvedeno 3 meseca nakon infuzije CART19 ćelija pokazalo je trajnu remisiju (slika 12D). Ispitivanja kosne srži na 3 i 6 meseci takođe nisu dala dokaze CLL ispitivanjem morfologije, kariotipa (46,XY), ili pomoću protočne citometrije, sa produženim nedostatkom normalnih B ćelija takođe. Remisija je bila neprekinuta tokom najmanje 10 meseci.

Toksičnost CART 19 ćelija

[0284] Infuzije ćelija nisu imale nikakva akutna toksična dejstva. Jedini ozbiljni (stepena 3 ili 4) zabeleženi neželjeni događaj bio je sindrom lize tumora stadijuma 3, opisan gore u tekstu. Pacijent je imao limfopeniju stepena 1 na početku, i limfopeniju stepena 2 ili 3 počevši od 1. dana, koja se nastavila najmanje 10 meseci nakon terapije. Limfopenija stepena 4, sa apsolutnim brojem limfocita od 140 ćelija po kubnom milimetru, zabeležena je 19. dana, ali od 22. dana tokom najmanje 10 meseci, apsolutni broj limfocita je bio u opsegu između 390 i 780 ćelija po kubnom milimetru (stepen 2 ili 3 limfopenije). Pacijent je imao prolaznu trombocitopeniju stepena 1 (broj trombocita, 98000 do 131000 po kubnom milimetru) od 19. dana do 26. dana i stepen 1 ili 2 neutropenije (apsolutni broj neutrofila, 1090 do 1630 po kubnom milimetru) od 17. dana do 33. dana. Drugi znakovi i simptomi koji su možda bili vezani za lečenje u okviru ispitivanja uključuju stepen 1 i 2 porasta nivoa aminotransferaze i alkalne fosfataze, koji su se razvili 17 dana nakon prve infuzije i povukli do 33. dana. stepen 1 i 2 konstitucionalnih simptoma koji su se sastojali od groznice, drhtavice, preznojavanja, mijalgije, glavobolje i zamora. Stepen 2 hipogamaglobulinemije je popravljen infuzijama intravenskog imunoglobulina.

Ispitivanje citokina seruma i kosne srži

2

[0285] Pacijentov klinički odgovor bio je praćen odloženim povećanjem nivoa inflamatornih citokina (slika 13A do slike 13D), sa nivoima interferona-γ, hemokina koji odgovaraju na interferon-γ CXCL9 i CXCL10, i interleukina-6 koji su bili 160 puta viši od polaznih nivoa. Vremenski porast nivoa citokina paralelno je pratio kliničke simptome, sa vršnim vrednostima na 17 do 23 dana nakon prve infuzije CART19 ćelija.

[0286] U supernatantima serije aspirata kosne srži mereni su citokini i pruženi su dokazi imunološke aktivacije (slika 13E). Zabeleženi su značajni porasti interferona-γ, CXCL9, interleukina-6, i rastvornog receptora za interleukin-2, u poređenju sa polaznim nivoima na dan pre T-ćelijske infuzije; vrednosti su postigle vrhunac 23. dana nakon prve infuzije CART19-ćelija. Porast citokina u kosnoj srži koincidirao je sa eliminacijom ćelija leukemije iz kosne srži. Faktor nekroze tumora α u serumu i kosnoj srži ostao je nepromenjen.

Ekspanzija i perzistencija T ćelija sa himernim receptorom za antigen

[0287] Metodom PCR u realnom vremenu detektovana je DNK koja kodira anti-CD 19 himerni receptor za antigen (CAR19) počevši od 1. dana nakon prve infuzije (slika 14A). Ekspanzija veća od 3-log ćelija in vivo primećena je do 21. dana nakon infuzije. Na vršnim nivoima, CART19 ćelije u krvi činile su više od 20% cirkulišućih limfocita; ovi vršni nivoi koincidirali su sa pojavom konstitucionalnih simptoma, sindromom lize tumora (slika 12B), i porastom nivoa citokina u serumu (slika 13A do slike 13D). CART19 ćelije su ostale detektabilne na visokim nivoima 6 meseci nakon infuzija, mada su vrednosti opale za faktor 10 u odnosu na vršne nivoe. Vreme dupliranja T ćelija sa himernim antigenim receptorom u krvi bilo je približno 1.2 dana, sa poluvremenom eliminacije od 31 dan.

T ćelije sa himernim receptorom za antigen u kosnoj srži

[0288] CART 19 ćelije su identifikovane u uzorcima kosne srži počevši od 23. dana nakon prve infuzije (slika 14B) i perzistirale su najmanje 6 meseci, sa poluvremenom propadanja od 34 dana. Najviši nivoi CART19 ćelija u kosnoj srži su identifikovani pri prvoj proceni 23 dana nakon prve infuzije i koincidirali su sa indukcijom imunskog odgovora, na šta ukazuju profili sekrecije citokina (slika 13E). Ispitivanja aspirata kosne srži protočnom citometrijom pokazala su klonalnu ekspanziju CD5+CD19+ ćelija na polaznom nivou koja je bila odsutna 1 mesec nakon infuzije i u uzorku dobijenom 3 meseca nakon infuzije (podaci nisu prikazani). Normalne B ćelije nisu detektovane nakon lečenja (slika 14C).

Lečenje autolognim genetski modifikovanim CART19 ćelijama

[0289] Ovde je opisan odloženi razvoj sindroma lize tumora i potpuni odgovor 3 nedelje nakon lečenja autolognim T ćelijama koje su genetski modifikovane tako da ciljno deluju na CD 19 putem transdukcije lentivirusnim vektorom koji eksprimira anti-CD19 vezan za signalne domene CD3-zeta i CD137 (4-1BB). Genetski modifikovane ćelije su bile prisutne na visokim nivoima u kosnoj srži tokom najmanje 6 meseci nakon infuzije. Stvaranje CD19-specifičnog imunskog odgovora u kosnoj srži je pokazano posredstvom vremenske dinamike oslobađanja citokina i ablacije ćelija leukemije koja je koincidirala sa vršnom infiltracijom T ćelija sa himernim receptorom za antigen. Razvoj sindroma lize tumora nakon ćelijske imunoterapije nije prethodno objavljen (Baeksgaard et al., 2003, Cancer Chemother Pharacol, 51: 187-92).

[0290] Genetska manipulacija autolognim T ćelijama tako da ciljno deluju na specifične tumorske antigene je privlačna strategija za terapiju kancera (Sadelain et al., 2009, Curr Opin Immunol, 21: 215-23; Jena et al., 2010, Blood, 116: 1035-44). Važna karakteristika ovde opisanog pristupa je to što T ćelije sa himernim receptorom za antigen mogu da prepoznaju tumorske ciljeve na način koji nije ograničen na HLA, tako da gotovi himerni receptori za antigen mogu da budu konstruisani za tumore sa različitim histološkim svojstvima. Lentiviralni vektori izvedeni iz HIV-a su korišćeni za terapiju kancera, ovaj pristup može da ima neke prednosti u odnosu na upotrebu retroviralnih vektora (June et al., 2009, Nat Rev Immunol, 9: 704-16).

[0291] U prethodnim ispitivanjima T ćelija sa himernim receptorom za antigen, objektivni tumorski odgovori su bili umereni, i in vivo proliferacija modifikovanih ćelija nije bila neprekidna (Kershaw et al., 2006, Clin Cancer Res, 12: 6106-15; Till et al., 2008, Blood, 112: 2261-71; Pule et al., 2008, Nat Med, 14: 1264-70). Brentjens i kolege su objavili preliminarne rezultate kliničkog ispitivanja himernih receptora za antigen koji ciljno deluju na CD19, vezanih za CD28 signalni domen i našli prolazne tumorske odgovore kod dva od tri pacijenta sa uznapredovalom CLL (Brentjens et al., 2010, Mol Ther, 18: 666-8); međutim, himerni receptori za antigen su brzo nestajali iz cirkulacije.

[0292] Bilo je neočekivano da će veoma niska doza T ćelija sa himernim receptorom za antigen koje su primenjene infuzijom rezultovati u klinički evidentnom antitumorskom odgovoru. Zaista, doza od 1.5x105 T ćelija sa himernim receptorom za antigen po kilogramu primenjena infuzijom bila je nekoliko redova veličine ispod doza korišćenih u prethodnim ispitivanjima T ćelija modifikovanih tako da eksprimiraju himerne receptore za antigen ili transgene T-ćelijske receptore (Kershaw et al., 2006, Clin Cancer Res, 12: 6106-15; Brentjens et al., 2010, Mol Ther, 18: 666-8; Morgan et al., 2010, Mol Ther, 18: 843-51; Johnson et al.,

4

2009, Blood, 114: 535-46). Bez vezivanja za neku određenu teoriju, predpostavlja se da hemoterapija može da pojača dejstva himernog receptora za antigen.

[0293] Produžena perzistencija CART19 ćelija u krvi i kosnoj srži pacijenta rezultat je uključivanja signalnog domena 4-1BB. Verovatno je da je eliminacija normalnih B ćelija posredovana CART19-ćelijama olakšala indukciju imunološke tolerancije na himerni receptor za antigen, budući da CART 19 ćelije koje eksprimiraju jednolančani Fv fragment antitela koji sadrži mišje sekvence nisu odbačene. S obzirom na odsustvo detektabilnihe CD19-pozitivnih leukemijskih ćelija kod pacijenta, i bez vezivanja za neku određenu teoriju, može se predpostaviti da je homeostaza T ćelija sa himernim receptorom za antigen postignuta najmanje delom kao rezultat stimulacije delovanjem ranih progenitora B-ćelija njihovim pojavljivanjem u kosnoj srži. Pronalazak se odnosi na otkriće da može da postoji novi mehanizam za održavanje "memorijskih" T ćelija sa himernim receptorom za antigen.

[0294] Mada je CD19 privlačan tumorski cilj, sa ekspresijom ograničenom na normalne i maligne B ćelije, postoji briga da perzistencija T ćelija sa himernim receptorom za antigen može da posreduje u dugotrajnoj deficijenciji B-ćelija. U stvari, kod pacijenta, B ćelije su bile odsutne iz krvi i kosne srži tokom najmanje 6 meseci nakon infuzije. Ovaj pacijent nije imao rekurentne infekcije. Ciljno delovanje na B ćelije preko CD20 sa rituksimabom je efikasna i relativno bezbedna strategija za pacijente sa B-ćelijskim neoplazmama, i dugotrajna B-ćelijska limfopenija podložna lečenju (Molina, 2008, Ann Rev Med, 59: 237-50). Objavljeno je da kod pacijenata lečenih rituksimabom ponovno pojavljivanje B ćelija tokom meseci nakon prekida terapije. Još uvek nije jasno da li se takav oporavak događa kod pacijenata čije T ćelije usmerene protiv B-ćelija perzistiraju in vivo.

[0295] Pacijenti koji imaju CLL sa delecijama TP53 imaju kratku remisju nakon standardnih terapija (Dohner et al., 1995, Blood, 85: 1580-9). Alogena transplantacija kosne srži bila je jedini pristup koji je indukovao dugotrajnu remisiju kod pacijenata sa uznapredovalom CLL (Gribben et al., 2011, Biol Blood Marrow Transplant, 17: Suppl:S63-S70). Međutim, rezultujući snažno izražen efekat graft-protiv-tumora povezano je sa značajnim morbiditetom zbog visoke učestalosti hronične bolesti graft-protiv-domaćina, koja je često posebno ozbiljna kod starijih pacijenata – onih koji su tipično pogođeni CLL (Gribben et al., 2011, Biol Blood Marrow Transplant, 17: Suppl:S63-S70; Sorror et al., 2008, Blood, 111: 446-52). Ovde prikazani podaci sugerišu da genetski modifikovana autologna T ćelija može da prevaziđe ovo ograničenje.

[0296] Odloženo započinjanje sindroma lize tumora i sekrecije citokina, kombinovano sa snažnom in vivo ekspanzijom T-ćelija sa himernim receptorom za antigen i značajnom antileukemijskom aktivnošću, ukazuje na značajne i neprekidne efektorske funkcije CART19 ćelija. Ovde opisani eksperimenti ističu potencijal ovih terapija i obezbeđuju podrške za detaljno ispitivanje autolognih T ćelija genetski modifikovanih da ciljno deluju na CD 19 (i druge ciljne molekule) putem transdukcije himernog receptora za antigen vezanog za snažne signalne domene. Za razliku od terapije posredovane antitelom, T ćelije modifikovane himernim receptorom za antigen imaju potencijal da se replikuju in vivo, i njihova dugotrajna perzistencija bi mogla da vodi dugoročnoj kontroli tumora. Druga dva pacijenta sa uznapredovalom CLL takođe su primila CART 19 infuzije prema ovom protokolu, i sva tri su pokazala tumorske odgovore. Ovi nalazi garantuju nastavak ispitivanja T ćelija preusmerenih na CD19 za B-ćelijske neoplazme.

�

2

4

1

11

12

1

14

1

Claims (18)

Patentni zahtevi

1. T ćelija koja je genetski modifikovana tako da eksprimira CAR, naznačena time što CAR sadrži (a) antigen-vezujući domen koji je anti-CD19 scFv, (b) kostimulatorni signalni region 4-1BB, i (c) signalni domen CD3 zeta za upotrebu u postupku za lečenje kancera kod čoveka, pri čemu anti-CD19 scFv sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:20 i/ili signalni domen CD3 zeta sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:24, i pri čemu je čovek otporan na lečenje najmanje jednim hemoterapeutskim sredstvom.

2. T ćelija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što kancer sadrži nesolidni tumor kao što je hematološki tumor.

3. T ćelija za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, naznačena time što je kancer leukemija ili limfom.

4. T ćelija za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, naznačena time što je leukemija:

(i) akutna leukemija ili hronična leukemija; ili

(ii) akutna limfocitna leukemija.

5. T ćelija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što je kancer:

(i) akutna limfocitna leukemija pre-B ćelija (pedijatrijska indikacija), adultna akutna limfocitna leukemija, limfom mantle ćelija ili difuzni limfom krupnih B ćelija;

(ii) ne-Hodgkin-ov limfom;

(iii) multipli mijelom; ili

(iv) Hodgkin-ova bolest.

6. T ćelija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što je kancer hronična limfocitna leukemija.

7. T ćelija koja je genetski konstruisana tako da eksprimira CAR, naznačena time što CAR sadrži (a) antigen-vezujući domen koji je anti-CD19 scFv, (b) kostimulatorni signalni region 4-1BB, i (c) signalni domen CD3 zeta za upotrebu u postupku za lečenje kancera koji obuhvata primenu pomenute T ćelije kod čoveka kome je dijagnostikovan kancer, pri čemu anti-CD19 scFv sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:20 ili signalni domen CD3 zeta sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:24, i pri čemu pomenuti postupak stvara populaciju genetski konstruisanih T ćelija koje perzistiraju u čoveku najmanje osam meseci, devet meseci, deset meseci, jedanaest meseci, dvanaest meseci, dve godine, ili tri godine nakon primene, i pri čemu je čovek otporan na lečenje najmanje jednim hemoterapeutskim sredstvom.

8. T ćelija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, naznačena time što perzistentna populacija genetski konstruisanih T ćelija sadrži najmanje jednu ćeliju odabranu iz grupe koja se sastoji od T ćelije koja je bila primenjena kod čoveka, potomstva T ćelije koja je bila primenjena kod čoveka, i njihove kombinacije.

9. T ćelija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, naznačena time što perzistentna populacija genetski modifikovanih T ćelija sadrži memorijsku T ćeliju.

10. T ćelija koja je genetski konstruisana tako da eksprimira CAR, naznačena time što CAR sadrži (a) antigen-vezujući domen koji je anti-CD19 scFv, (b) kostimulatorni signalni region 4-1BB, i (c) signalni domen CD3 zeta za upotrebu u postupku za lečenje kancera koji obuhvata primenu pomenute T ćelije kod čoveka kome je dijagnostikovan kancer, pri čemu anti-CD19 scFv sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:20 ili signalni domen CD3 zeta sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:24 i pri čemu pomenuti postupak umnožava populaciju genetski konstruisanih T ćelija u čoveku, i pri čemu je čovek otporan na lečenje najmanje jednim hemoterapeutskim sredstvom.

11. T ćelija za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, naznačena time što primenjena genetički konstruisana T ćelija proizvodi potomstvo T ćelija u čoveku koje sadrži sadrži memorijsku T ćeliju.

12. T ćelija za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, naznačena time što primenjena genetički konstruisana T ćelija proizvodi populaciju potomstva T ćelija koja perzistira u čoveku najmanje tri meseca, četiri meseca, pet meseci, šest meseci, sedam meseci, osam meseci, devet meseci, deset meseci, jedanaest meseci, dvanaest meseci, dve godine, ili tri godine nakon primene.

1

13. T ćelija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 7-12, naznačena time što je kancer kao što je definisan u bilo kom od patentnih zahteva 2-5, ili naznačena time što je kancer hronična limfocitna leukemija.

14. T ćelija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 6, 7 ili 10, naznačena time što čovek ima hroničnu limfocitnu leukemiju koja je refraktorna CD19+ leukemija i limfom.

15. T ćelija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-14, naznačena time što je T ćelija autologna ili alogena ćelija.

16. T ćelija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-15, naznačena time što se pomenuta ćelija primenjuje nakon ablativne terapije B ćelija kao što je terapija sredstvima koja reaguju sa CD20, npr. Rituxan-om.

17. T ćelija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-16, naznačena time što se pomenuta ćelija primenjuje u farmaceutskoj kompoziciji u dozi od 10<4>do 10<9>ćelija/kg telesne težine ili 10<5>do 10<6>ćelija/kg telesne težine.

18. T ćelija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1-17, naznačena time što:

(i) kostimulatorni signalni region 4-1 BB sadrži aminokiselinsku sekvencu naznačenu u SEQ ID NO: 23;

(ii) CAR sadrži aminokiselinsku sekvencu naznačenu u SEQ ID NO:12;

(iii) anti-CD19 scFv je kodiran sekvencom SEQ ID NO: 14;

(iv) signalni region 4-1BB je kodiran sekvencom SEQ ID NO: 17 i signalni domen CD3 zeta je kodiran sekvencom SEQ ID NO:18;

(v) anti-CD19 scFv je kodiran sekvencom SEQ ID NO: 14, signalni region 4-1BB je kodiran sekvencom SEQ ID NO: 17 i signalni domen CD3 zeta je kodiran sekvencom SEQ ID NO:18; ili

(vi) CAR je kodiran sekvencom nukleinske kiseline naznačenom u sekvenci SEQ ID NO:8.

1